MX2009012635A - Vectores multicistronicos y metodos para su diseño. - Google Patents

Abstract

La invención revelada en la presente es concerniente en general con vectores multicistrónicos y métodos para su diseño y construcción para uso como inmunoterapéuticos aptos de inducir una respuesta inmune en un sujeto o aptos de suprimir un gen u objetivo que expresa un antígeno.

Description

VECTORES MULTICISTRONICOS Y METODOS PARA SU DISEÑO j inducción de una respuesta inmune a un antigeno de' protéína expresado in vivo enseguida de la introducción de ADN' de ¦ plásmido a la célula huésped. En muchas instancias, el¦ diseño de vacunas, de ADN es relativamente simple. Aunque han sido promisorias én ratones, su eficacia en siendo una cuestión ya que se pueden requerir dosis más altas de la vacuna con el fin de producir una respuesta inmune detectable en humanos en comparación con aquellas requeridas en ratones BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION ¡ . Modalidades de la presente invención · '¡ son concernientes con vectores multicistrónicos y métodos para .su diseño. Los métodos y composiciones de la invención incluyen un vector que incluye por lo un primer cistrón incluye un primer promotor y una primera secuencia- de ácido nucleico que codifica uno o más age tes terapéuticos, y en donde un segundo cistrón comprende un segundo promotor y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una o más moléculas de ARN que interfieren con' la expresión de un modificador de respuesta biológica o el agente terapéutico, en donde la expresión de la primera secuencia está bajo el control del primer promotor y la expresión de; la segunda secuencia está bajo el control del. segundo promotor! En i algunas modalidades de la invención, el vector es un vector de plásmido q vector viral. En algunas modalidades, el primer promotor es' una secuencia de promotor/me orador enlazada operativamente es una secuencia de promotor/mejorador enlazada operativamente . En algunas modalidades, la secuencia ' de promotor/mejorador es una secuencia de promotor/mejorador, de CMV. ;> En algunas modalidades de la invención, la una o, más moléculas de ARN que interfieren con la expresión de, un modificador de respuesta biológica es un ARNi. En algunas modalidades, la una o más moléculas de ARN que interfieren ; con la expresión de un modificador de respuesta biológica es: un siARN o un shARN. ; En algunas modalidades de Ta invención, · el modificador .de respuesta biológica está involucrado ' en controlar o regular una respuesta ' inmune, procesamiento y presentación de antígeno o silenciamiento genético. En algunas modalidades, el modificador de respuesta biológica involucrado en controlar o regular una respuesta inmune es- seleccionado ¡del grupo que consiste de-: una citocina, una quimiocina, ;una molécula co-estimulatoria, una proteína de punto , de i verificación, un factor de transcripción y una moléculal de i' ' transducción de señal. - I En algunas modalidades de la invención, [ el modificador de respuesta biológica involucrado en procesamiento i i y presentación de antigeno es seleccionado del grupo 'que consiste de: una proteina de TAP, una proteasoma inmune, proteasomas estándar, una f>z microglobulina, una molécula] de I HC Clase I y una molécula - de ¦ MHC Clase II. En algunas modalidades, el módificador de respuesta biológica involucrado en el silenciamiento genético es. seleccionado del grupo ¡que consiste de un agente de metil.ación de ADN, una molécula ique controla la cromatina y una molécula- reguladora de ARN. ' En algunas modalidades . de la invención, ;: el modificador de respuesta biológica involucrado en | el i procesamiento y presentación de antígeno es ' el factor ' de transcripción T-bet, STAT-1, STAT-4 ó STAT-6.

En algunas modalidades de la invención, ; el modificador de respuesta biológica involucrado en : el procesamiento y presentación de antígeno es la citocina IF - , IFN-?, IL-10, IL-18m, IL-12 ó TGF- . " En algunas · modalidades de la invención, modificador de respuesta biológica involucrado en procesamiento y presentación de antigeno es el factor estimulatorio CD40, B .1 ó B7.2.

En algunas . modalidades de la invención, modificadpr de respuesta biológica involucrado en procesamiento y' presentación de antigeno es la proteína; de i-punto de verificación F0Xp3 ó una molécula semejante a B7. ! En algunas modalidades de la invención, la molécula i de procesamiento y presentación de antígeno es una molécula de i HC Clase I, una molécula de MHC Clase I o una proteína de AP .

En algunas modalidades de la invención, el modificador de respuesta biológica involucrado en ; el ¡ procesamiento y presentación de antígeno es una TLR o ¡ una I molécula de señalización de TLR corriente abajo.

En algunas modalidades de la invención, el modificador de respuesta biológica involucrado en el procesamiento y presentación de antígeno es la molécula' de señalización corriente debajo de TLR MyD88 ó NFK-B.

En algunas modalidades de la invención, . el modificador de , respuesta biológica involucrado en : el procesamiento y presentación de antígeno es un ligando de LAG- En algunas modalidades de la invención, el modificador. de respuesta biológica involucrado en el I procesamiento y presentación de antigeno es eí supresor de activación de célula dendrítica S0CS1.

I En algunas modalidades de la invención, 1 el modificador de respuesta biológica' , · involucrado en , el ! procesamiento y · presentación de ántigeno es el agente de metilación de ADN DMNT1. ! En algunas modalidades de la invención, el uno más agentes terapéuticos incluyen un agente inmunoterapéutico o inmunógeno. En algunas modalidades de la invención, el uno o más agentes terapéuticos incluyen un gen terapéutico. ;' • i En algunas modalidades de la invención, el uno o más agentes terapéuticos consisten de un inmunógeno seleccionado del grupo que consiste de antigenos asociados a tumor, ' I antígenos específicos de tumor, antígenos de diferenciación, antígenos embriónicos, antígenos de cáncer-testículos, i antígenos de oncógenos, genes tumor-supresor mutados, antígenos de tumor únicos resultantes de translocaciones cromosomales , antígenos virales y fragmentos de los mismos. En algunas . ¦ . . i modalidades, el inmunógeno incluye un antígeno específico de ' tumor o fragmento del mismo. En modalidades adicionales, el agente terapéutico es un antígeno de tumor seleccionado' del grupo que consiste de Melan-A, tirosinasa, ERAME, PSMA, NYESO-1 y SSX-2. En algunas modalidades, él inmunógeno consiste i esencialmente de Melan-A26-3s o su¦ análogo de A27L ELAGIGILTV (SEQ ID NO: 1) . ' ' En algunas modalidades de la invención, el vector incluye por lo menos dos cistrones, en donde un primer cistrón incluye .un primer promotor y una primera secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más epitopos de Melan-A, y en donde un segundo cistrón incluye un segundo promotor y un segundo ácido nucleico que codifica una o más moléculas de ARN que interfieren con la expresión ' de un modificador de respuesta i biológica, en donde la expresión de la primera secuencia está bajo el control del primer promotor y la expresión de; la segunda secuencia está bajo el control del segundo promotor! En algunas modalidades, la una o más moléculas de ARN j que ¦ interfieren con la expresión de un modificador de respuesta biológica es Melan-A siARN. ¡ En algunas modalidades de la invención, el vector es pSEM-U6-Melan-A (SEQ ID NO: 6) . : Modalidades de la invención incluyen un método para diseñar un vector que comprende dos cistrones que incluye¦ las etapas de colocar un primer promotor, una primera secuencia que codifica uno o más agentes terapéuticos, un segundo promotor y una segunda secuencia que codifica una o' más moléculas de 1 ARN que interfieren con la- expresión de un modificador de respuesta biológica dentro del mismo vector, en donde la expresión de la primera secuencia está bajo el control del primer promotor y la j expresión de la segunda secuencia está bajo control del segundo promotor. ! En algunas modalidades de la invención, el método para diseñar un vector incluye colocar un primer promotor , ¡ una primera secuencia que codifica uno o más agentes terapéuticos, un segundo promotor y una segunda secuencia que codifica uno' o más agentes que interfieren con la expresión de un modificador de respuesta biológica dentro del mismo vector, en donde la expresión de la primera secuencia está bajo el control del primer promotor y la expresión de la segunda secuencia está bajo control del segundo promotor, y en donde el primero y segundo promotor son .seleccionados del grupo que consiste dé un promotor sensible a tetraciclina , un promotor de probasina, un promotor de CMV y un promotor de SV40. En algunas modalidades, el vector es un vector de plásmido. En modalidades adicionales, el vector es un vector viral. En algunas modalidades, el vector es un vector de plásmido seleccionado del grupo que consiste de pSEM (SEQ ID NO: 5 ó SEQ ID NO: 6), pBPL (SEO" ID NO: 7) y pROC (SEQ ID NO: 8) . En algunas modalidades, el vector es! un 1 plásmido de pSEM.

En algunas modalidades de la invención, el método para diseñar- un vector incluye además la etapa de colocar : una secuencia de promotor/mej'orador enlazada operativamente en el vector. En algunas modalidades, la secuencia ' de promotor/mej orador es un promotor de CMV.

'En algunas modalidades de la invención, el -método para ..diseñar un vector' incluye colocar un primer promotor, , una primera secuencia que, codifica uno o más agentes terapéuticos, un segundo promotor y. una segunda, secuencia que codifica una o más moléculas de ARN que interfieren con la expresión' de! un modificador de respuesta biológica dentro del mismo vector,; en donde la expresión de la primera' secuencia está bajo el control del primer promotor y la expresión de la segunda secuencia está bajo el control del segundo promotor, y en donde la segunda secuencia es una secuencia de ARNi de horquilla.

En algunas modalidades de la invención, el método I para diseñar un vector incluye además la etapa de colocar ;por lo menos uno del grupo que consiste de un gen reportero, ,un marcador seleccionable y un agente con actividad inmunomoduladora o. inmunoestimulante en el vector. ' Modalidades de la invención incluyen una-, célula mamifera transformada con un vector 'que incluye por lo ménos dos cistrones, en donde un primer cistrón incluye un primer i promotor y una primera secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más agentes terapéuticos, y en donde un segundo cistrón ¦ incluye un segundo promotor y un segundo ácido nucleico ¡que. codifica una o más moléculas de ARN que interfieren - coni la expresión de un modificador de respuesta- biológica o el agente terapéutico, en donde la expresión de la primera secuencia está bajo el control del primer promotor y la expresión de ! la segunda secuencia está bajo el control del segundo promotor.

Modalidades de la invención incluyen una composición terapéutica que incluye un vector que incluye por lo menos dos i cistrones, en donde un primer cistrón incluye un primer i i promotor y una primera secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más agentes terapéuticos, y en donde un segundo cistrón incluye un segundo promotor y un segundo ácido nucleico i que codifica una o más moléculas de ARN que interfieren con, la expresión de un modificador de respuesta biológica o el. agente i terapéutico, en donde la expresión de la primera secuencia está bajo el control del primer promotor y la expresión de! la segunda secuencia está bajo el control del segundo promotor. En i algunas modalidades, la composición terapéutica incluye además i un portador aceptable farmacéuticamente. ' ; BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Aquellos de habilidad en el arte entenderán que ¡las figuras, descritas posteriormente en la presente, son ;por propósitos ilustrativos solamente. Las figuras no se proponen limitar el alcance de las enseñanzas presentes de ninguna manera. ¦ La Figura 1 ilustra una modalidad de la estructura y construcción de un vector bicistrónico, en el cual el fragmento que comprende el promotor U6 y la secuencia de ADN de horquilla I correspondiente a GFP siARN fue insertado en sitios | de restricción en el extremo distante del promotor de CMV para -generar pSEM-U6-GFP. : La Figura 2 muestra un gel que ilustra los efectos de desactivación de varias combinaciones de siARN y plásmidos i bicistrónicos .

La Figura 3 ilustra el montaje experimental para un protocolo de inmunización que involucra cinco grupos de ratones transgénicos HHD (n=10/grupo) en el cual varios vectores (pSEM, pSEM-U6-GFP, pSEM-U6-Melan-A) fueron administrados mediante inyección directa a nodos linfáticos inguinales (25 ugj de vector en 25µ1 de PBS a cada nodo linfático en el día 1 y 4, seguido por un segundo grupo de inyecciones de vector administradas el día 11 y día 14, seguido por la inyección de 1 mg/ml de péptido de Melan-A26-35 A27L en el, día 34 y 37) . 1 La Figura 4 ilustra los resultados del . experimento de inmunización (ilustrado en la Figura 3) como una gráfica; de barras, que muestra que la inmunización de ratones con) el I plásmido padre (pSEM) dio como resultado una respuesta detectable en . ratones (7% de respuesta de célula T CD8+ Melan-A26-35-especifica medida después de la inmunización cort solamente plásmido) .

La Figura 5 muestra una gráfica de barras que ilustra el conteo de puntos de IFN-? promedio para cada uno de , los cinco grupos de ratones transgénicos de HHD (n=10/grupo) ¡que fueron administrados con vectores (pSEM, pSEM-U6-GFP, Melan-A) mediante inyección directa a los nodos linfáticos inguinales como se ilustra en la Figura 3 y se describe en el Ejemplo 3.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Définiciones ! i A no ser que se indique de otra manera, se comprenderá que los términos de acuerdo con el uso convencional por aquellos de habilidad ordinaria en el arte relevante. ! .Como se usa en la presente, el término "vector multicistrónico" o un "constructo multicistrónico" abarca juna secuencia de ADN transformable que tiene por lo- menos dos secuencias de promotor. En un constructo multicistrónico, cada secuencia de promotor es enlazada! operativamente a juna secuencia de codificación para formar un gene cassette-, de ' tal manera que la expresión de cada caset genético da como resultado la producción de un ácido ribonucleico correspondiente. Asi, los constructos multicistrónicos pueden incluir múltiples casets genéticos. Modalidades preferidas de la invención incluyen vector bicistrónicos o constructos bicistrónicos . Además, las referencias a vectores o constructos "bicistrónicos" son ejemplares de vectores o constructos "multicistrónicos" y son en, algunas. .instancias, intercambiables.

Como se usa en la presente, el término "promotor'! se refiere' a una secuencia de ácido nucleico, que regula la expresión de un ácido nucleico, enlazado operativamente a la misma. Tales promotores son conocidos por ser elementos de , sec de acción cis requerida para la transcripción ya que sirven ' j para enlazar ARN polimerasa dependiente de ADN, que transcribe secuencias presentes corriente abajo de la misma.

' Como se usa en la presente, . el término "enlazada i operativamente" se refiere a una primera molécula de^ ácido nucleico unida a una segunda molécula de ácido nucleico,, en donde las moléculas de ácido nucleico son dispuestas de tal manera que la primera molécula de ácido nucleico .afecta1 la i función y/o expresión de' la segunda molécula de ácido nucleico. Las dos moléculas de ácido nucleico pueden ser parte de una sola molécula de polinucleótido contigua y pueden estar adyacentes. Por ejemplo, un promotor es enlazado operativamente a un polinucleótido de interés si el promotor modula' la transcripción de la molécula de polinucleótido enlazada; de interés .

J El término "epitopo" se refiere a un sitio un antigeno reconocido por un anticuerpo o un receptor ; de f I antigeno. Un epitopo de célula T es un péptido corto derivado de un antigeno de proteína. Los epítopos se enlazan a moléculas de HC y son reconocidos por una célula T particular. Epítopos como, se describen en modalidades de la invención revelada en la I presente son moléculas o sustancias capaces de estimular !una respuesta inmune. , Un epitopo puede incluir, pero no está limitado a, un polipéptido o un ácido nucleico que codifica un polipéptido, en donde el polipéptido es capaz de estimular una respuesta inmune. En algunas modalidades, un epitopo puede incluir, pero no está limitado a ', pépti'dos' presentados sobrei' la superficie de células, los ': péptidos son enlazados > no covalentemente al enlace dividido de MHC de Clase I, de ; tal manera que puede intéractuar con receptores ' de célula T (TCR!)'.

Como se usa en la . presente, el término "epitopo inmune" se refiere a un fragmento, de polipéptido que es- un epitopo de MHC, y que es desplegado sobre una célula en la cual ' ' ' I1, * ' ' I las inmunoproteasomas · son. predominantemente activas. Erí algunas modalidades, "epitopo inmune" sé refiere a un polipéptido que contiene un epitopo inmune de acuerdo con la definición I I anterior que está también flanqueado por de uno a 'varios aminoácidos, adicionales. En álgunas modalidades, un "epitopo inmune" se refiere a un polipéptido que incluye una secuencia de grupos de epitopo' que tiene por lo menos dos secuencia' de polipéptidos que tienen una .afinidad conocida o predicha para un MHC de Clase I. En algunas modalidades, un "epitopo inmune" se refiere a un ácido nucleico que codifica un epitopo inmune de acuerdo. con cualquiera de las definiciones- anteriores. ! Como se usa en la presente, el término "epitopo; de mantenimiento" se refiere a un fragmento de polipéptido que es ·' ' . . · ' i un epitopo de MHC, y que es desplegado sobre "una célula erí la í cual proteasomas de mantenimiento (también conocidas como I "proteasomas estándar") son predominantemente activas. ·, En algunas modalidades, "epítopo de mantenimiento" se refiere a un I ' . ' '. polipéptido que contiene un epitopo de mantenimiento de acuerdo con la definición anterior que está también flanqueado por de i uno a varios aminoácidos adicionales. En algunas modalidades, un "epitopo de mantenimiento" se refiere a un polipéptido I que incluye una secuencia de grupos de epitopo que tiene por ,1o menos dos secuencias de polipéptidos que tiene una afinidad conocida o predicha para un MHC de Clase I. En algunas i modalidades, un "epitopo de mantenimiento" se refiere a| un ácido nucleico que codifica, un epitopo de " mantenimiento'' de acuerdo con cualquiera de las definiciones anteriores.

Como se usa en la presente, el término "secuencia de liberación" se refiere a un péptidó que comprende o codifica un epitopo o un análogo de epítopo, que está incrustado en una secuencia más grande que proporciona un contexto que permite que el epítopo' o análogo de epítopo sea liberado ¡.por actividades de procesamiento, en las que se incluye, jpor ejemplo, procesamiento inmunoproteasomal y procesamiento proteasomal de mantenimiento, directamente o en combinación i con el recorte N-terminal u otros procesos fisiológicos. ' · Como se usa en la presente, el término "similaridad funcional" se refiere a secuencias que difieren de ;una secuencia de ' referencia de manera inconsecuencial como.se juzga por el examen de una propiedad biológica o bioquímica, aunque las secuencias pueden no ser sustancialmente similares. ; Por ejemplo, dos ácidos nucleicos pueden ser útiles como sondas de I · hibridización para la misma secuencia pero codifican secuencias de aminoácidos diferentes. Dos péptidos que inducen respuésta de* CTL reactivas cruzadas son funcionalmente similares aún si difieren por sustituciones de aminoácidos no conservadoras (y asi pueden no estar dentro de la definición, de similaridad ? sustancia) . Pares de anticuerpos o TCR, que reconocen el mismo • i epitopo pueden ser funcionalmente similares entre si a pesar de que existan cualesquier diferencias estructurales. Pruebas para similaridad funcionalidad de inmunogenicidad se pueden llevar a I cabo mediante inmunización con el antigeno "alterado" y prueba de la habilidad de una respuesta producida, en los que1 se incluye pero no limitados a una respuesta de anticuerpo, una respuesta de. 'CTL, producción de citocina y los semejantes, para reconocer el antigeno objetivo. Asi, dos secuencias pueden ser diseñadas o bosquejadas para diferir en ciertos aspectos; en tanto que retienen la misma función. Tales variantes ] de secuencias diseñadas o bosquejadas de las secuencias reveladas o reivindicadas están' entre las modalidades de la presente invención. ¡ Como se usa en la presente, el término "codifica" es . i un término de extremos abiertos, de tal manera que un ácido, nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos particular puede consistir de -codones que especifican un polipéptidó o puede también comprender secuencias adicionales que 'son traducibles o cuya presencia es útil para el control: de transcripción, traducción o replicación o para facilitar; la manipulación de algún constructo de ácido nucleico huésped, Como se usa en la presente, el término "fragmento", cuando es usado en el contexto de antigenos, se refiere a 1 una porción del antigeno que es de 10% a aproximadamente 99%; la longitud del antigeno completo, en donde la porción ;del antigeno incluye un epitopo que se enlaza a moléculas de MHC y es reconocido por una célula T particular. Por ejemplo,! un fragmento de un antigeno puede ser por lo menos aproximadamente 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, '24% o 25% de la longitud del antigeno completo. Un fragmento de un antigeno puede también ser por lo menos aproximadamente 25% 26%, 27%, 28%, 29% , ' 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41% , 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, .51%, 52%, .53% , 54%, 55% , 56%, .57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63% , - 64%, 65% , 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77% , 78% , 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%,. 85%, 86%, 87%, 88%, 89% , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99? ; de la longitud' del antigeno completo.

Como se usa en la presente, el término "casetj de expresión" se refiere .a una secuencia de polinucleótidos ique codifica, un polipéptido, enlazado operativamente a un promotor y otros elementos de control de transcripción y traducción, en los que se incluye pero no limitados a mejoradorés, codones de terminación, sitios de entrada de ribosoma internos o sitios de poliadenilació . El caset puede también incluir secuencias que facilitan moverlo de una molécula huésped a otra.

Como se usa 'en la presente, el término "grupo! de epitopos" se refiere a un polipéptido o una secuencia de ácido nucleico que lo codifica, que es un segmento de una secuencia de proteina natural que comprende dos o más epitopos conocidos ! o predichos con afinidadi de enlace por un elemento ! de - restricción de MHC compartido, en donde la densidad de epitopos dentro del grupo es mayor que la densidad de todos los epitopos conocidos o predichos con afinidad de enlace para el eleménto de restricción de MHC compartido dentro de la secuencia' de proteina completa. Grupos de epitopos y sus usos son descritos en la solicitud de patente estadounidense No. 09/561,571, intitulada "EPITOPE CLUSTERS", presentada el 28 de abril de 2000; 10/005,905, presentada el ,7 de noviembre de 2001; 10/026,066 (publicación de solicitud de patente estadounidense No. 2003-0215425), presentada el 7 de diciembre de 2001; 10/895,523 (publicación de solicitud de patente estadounidense G No. 2005-0130920), -presentada el 20 de. julio de 2004 y 10/896,325 presentada el 20 de julio de 2004, todas intitulaidas "Epitope Synchronization in Antigen Presenting Cells", cada una . 1 de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad.

Como se usa en la presente, un "minigen" se refiere a epitopo codificado dentro de la secuencia de' ácido nucleico para disparar' una . respuesta inmune. El fragmento de¦ polipéptido puede ser una disposición ' de "cadena de perlas" (esto es,' dos o i más epitopos o por lo menos un epitopo y por lo 'menos un grupo de epitopos) como se revela en la solicitud de patente estadounidense No .10 /777., 053 - (publicación de solicitud j( de patente estadounidense No. 2004 -0132088 ) intitulada "EXPRESSION VECTORS ENCODING. EPITOPES OF TÁRGET-ASSOCIATED ANTIGENS' AND ' METHODS FOR THEIR DESIGN" presentada el 10 de febrero de ' 2004 / ' ' ! que es incorporado en la ' presente por referencia, en ¡ su ¡ totalidad; o " un grupo de epitopos (como ' se describe anteriormente) . ¦ ; Como se usa en la presente, una "célula objetivo" se ¦ refiere a una célula asociada con una condición patógena sobre la que se puede actuar por los componentes del sistema inmune, tales como por ejemplo, una célula infectada con un virus u . I otro parásito intracelular ó una célula neoplásica. En :una modalidad, una célula objetivo es una célula a ser apuntada por las vacunas y métodos revelados en la presente. Una célula objetivo de acuerdo con esta definición incluye, pero no está limitada a, una célula neoplásica.

Como se usa en la presente, un "antigeno objetivo-asociado (TAA)" se refiere a 'una proteina o un polipéptido presente en una célula objetivo. i Como se usa en la presente, un "antigeno tumor-asociado (TuAA)" se refiere a un TAA, en donde la célula i objetivo es una célula neoplásica. En algunas modalidades,', un TuAA es un antigeno asociado con células no cancerosas ¡del tumor, tales como neovasculatura de tumor u otras células estromales dentro del micro-medio ambiente de tumor. j Hay ' necesidad de- la generación de nuevas vacunas que I I puedan optimizar la inmunogenicidad y mejorar la eficacia. Antes de las modalidades de la invención . revelada en . la presente, las terapias de vacuna de ADN se enfocaban en el uso de vectores bicistrónicoss que expresaban dos o más péptidos terapéuticos o proteínas o . alternativamente, vectores t I bicistrónicos que codifican un péptido/proteína terapéutico y I un agente de mejora inmune. Consecuentemente, los vectores bicistrónicos estaban diseñados para elevar respuestas inmune al proporcionar nivéles mayores de expresión de péptidos terapéuticos administrados y/o proveer regulación positiva de respuesta inmune al péptido administrado mediante expresión de un agente de mejora inmune. En contraste, las modalidades de, la invención reveladas en la presente proporcionan una nueva clase de vectores genéticos, y métodos para el diseño de plásmidos multicistrónicos que co-expresan agentes profilácticos y/o péptidos terapéuticos con agentes que interfieren con la expresión de un modificador de respuesta biológica. La nueva clase de vectores está diseñada para mejorar la inmunogénicidad I de vacunas de ADN y su aplicación como terapéuticos en¡ el tratamiento de una enfermedad o condición.

En modalidades preferidas, el agente interferente codificado por las modalidades de vector multicistrónico es un ARN interferente. Modalidades de ARN interferentes, tales cómo, por ejemplo, ARNi, no han sido previamente, usados componente en vacunas de ADN y composiciones de vacuna de Asi, el uso de ARNi como agente interferente en los vectores y composiciones revelados en la presente representa un nuevo uso que no era considerado previamente en el campo. Los vectores y composiciones revelados en la presente, proporciona una ventaja ¦ significativa en que eliminan la necesidad para co-inyección í del agente interferente (tal como, por ejemplo, siARN) . separadamente a una célula. Además, los vectores! y I composiciones revelados en la presente pueden también apuntar I específicamente células que presentan antígeno (APC) ¡que expresan un antígeno de interés. En tanto que no se désea limitar la invención revelada en la presente, se cree que los vectores bicistrónicos revelados en la presente pueden \ funcionar- como un inmunoterapéutico al interferir con i reguladores de la respuesta inmune _ y/o como un terapéutico genético al inhibir o regular descendentemente componentes celulares que son responsables por la expresión genéiica I silente o inducir apóptosis.

Vectores/Plásmidos I Como se discute en cualquier parte en la presente, modalidades de la invención proporcionan una nueva clase; de vectores que comprenden una primera secuencia que codifica í uno o más agentes terapéuticos y una segunda secuencia de la cual uno o más agentes que interfieren con la expresión deí un modificador de respuesta biológica (BRM) es expresada.] En modalidades preferidas, el agente interférente puede ser ¡una í molécula dé ARNi . Un vector de ácido nucleico que dirige1 la I expresión de más de una proteína a partir de un solo vector es i conocido en el arte como vector bicistrónico o vector multicistrónico . Un cistrón . es definido como una unidad genética que codifica un solo polipéptido. Un cistrón como se usa en la presente -es activo en un huésped mamífero, y i sus productos están involucrados directamente en inmunoterapia o terapia genética. En algunas modalidades, el agente terapéutico i puede ser uno ,o más agentes inmunogénicos, para uso| en G I I inmunoterapia . El uno o más agentes inmunogénicos pueden ser, por ejemplo, pero no limitados a un antígeno, tal como! un I antígeno asociado al tumor. Así, en algunas modalidades,! el '' I¦ agente terapéutico puede ser uno o más agentes terapéuticos para uso en terapia genética. j En algunas modalidades, Un cistrón puede codificar un agente terapéutico que es un péptido y puede ser, por ejemplo, pero no limitado a un minigen de elan-A. \ modalidades, un segundo cistron puede ser un interfiere' con la expresión dé un i BRM o un agente terapéutico tal como, por ejemplo, una molécula de ARNi . Por consiguiente1, en modalidades de la invención, se proporcionan vectores bicistrónicos para el tratamiento de una enfermedad o condición i tal como por ejemplo, pero no limitado a, cáncer, enfermedades crónicas y enfermedades inflamatorias. ' : ( Al diseñar las varias mo.dalidades de vector i bicistrónico de la invención (véase, por ejemplo Figura 1), la secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, cADN) que codificá el agente terapéutico en el plásmido es colocada bajo el control de una secuencia de promotor/mejorador que permite j la transcripción eficiente de ARN mensajero para el polipéptido después de la absorción por una célula, tal como por «ejemplo, una célula que presenta antigeno (APC) . Promotores que pueden ser empleados en modalidades de la invención son bien conocidos para aquel de habilidad ordinaria en el arte. Tales promotores incluyen, por ejemplo, "promotores virales y celulares. ^Los promotores virales pueden incluir, ' por ejemplo, pero:, no limitados al, promotor de citomegalovirus (CMV) , el promotor tradio mayor de a-de.novirus 2 y el promotor SV40. Ejemplos de I promotores celulares incluyen, por ejemplo, pero no están limitados al promotor 1 de metalotioneina de ratón, factor 1 alfa de alargamiento (EF1) , promotor HC Clase ? y Clase . II y ¦ ¦ ' i promotor de CD3 para expresión especifica de célula T. ; En algunas modalidades, el control de la secuencia de ácido nucleico de la cual uno o más agentes que interfieren! con la expresión de modificadores de respuesta biológica (BRM)^ es expresada, es modelada sobre promotores usados para caset de expresión de ARN de Horquilla corta '(shARN) . Los casets' de ' i expresión de vectores de administración de shRNA aprovechan comúnmente los promotores de ARN polimerasa III (Pol III) y en algunas modalidades, se puede usar un promotor Pol II. i Sin embargo, el uso de promotores de Pol II para la producción de ¦ i ' shRNA está sujeta a' ciertas consideraciones, tales como j por ejemplo, la necesidad tanto de una distancia muy corta I (aproximadamente 6 bp) entre el promotor de Pol II y la sec de shARN, también como una señal de poliadenilacióri corta (Zhou et ' i al. 2005. Nucleic Acids Res. 33, e62, que es incorporado en la •presente por referencia en su totalidad); y la necesidad dé un' intron entre el promotor de Pol II y la secuencia de shARN para la producci]ón eficiente (Yang et al. 2004. FEBS Lett. 576: 221- '- ' I 225, que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad) Preferiblemente, los promotores usados para dirigir la expresión de shRNA son promotores Hl, promotores U6 o promotores C V. Otros promotores que pueden ser empleados en el. diseño de os vectores bicistrónicos revelados en la presente pueden ser determinados fácilmente por el técnico producto coloreado, luminiscente o fluorescente que : es I fácilmente detectable a simple vista o mediante detector, con o I sin microscopía. Ejemplos de genes reportero incluyen genes ¡ que I codifican ß-galactosidasa, luciferasa de ' luciérnaga, proteína fluorescente verde (GFP) o la proteína fluorescente roja de ¡especie de Discosoma (DsRed)..' En modalidades particulare's, se usa la proteína fluorescente verde (GFP) como el gen reportero. ¡ La utilización de los componentes de .vector discutidos |en la presente, algunas modalidades de la invención incluyen ell diseño y construcción de una variedad de vectores bicistrónicos que comprenden ' AR i tal como por ejemplo: pSEM- U6-Melan-A, pSEM-U6-T-bet, pSEM-U6-MyD88 , pSEM-U6-SOCSl , pSE - U6-DMNT1, pSEM-U6-HLA, pSEM-U6-TAPs y pSEM-U6-FoxP3. En algunas modalidades I, se proporciona un vector bicistrónico de pSEM†U6- para uso como un terapéutico. En algunas modalidades, una vacuna de plásmido de ADN recombinante que comprende'' un vector de pSEM, un vector de pROC o un vector de pBPL (descrito en detalle y al que se hace referencia como pMA2M én la publicación de patente estadounidense No. 20030228634, que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad; y revelado en lá solicitud de patente estadounidense provisional No.- 60/691)579 y publicación de patente estadounidense 'No. 20030220634, cada una de las cuales es incorporado en; la presente por referencia en su totalidad) es empleado. El están. limi|tados . a, plásmidos que corexpresan un antígeno inmunizantel o tolerabilizante y uno o más siARN que bloquean rutas pro-ihflamatorias (STATs, T-bet, NF-??, TLRs, IFN-a, IFN-?) . Tales vectores pueden habilitar la inducción de respuestas terapéuticas/regulatorias o tolerancia contra proteínas asociadas a la enfermedad, tales como, por ejemplo, aquellas involucradaL en enfermedades autoinmunes . En algúnas modalidades I, plásmidos u otros vectores pueden co-exprésar proteínas i nmunizantes y siARN que inhiben específicamente la expresión dé proteasomas inmunes, de tal manera- que'; la actividad de proteasomas estándar para el procesamiento, de antígeno se convierte dominante en el APC- Tales vectores pueden permitir la expresión de dos o más epítopos mediante APC que imitan a una extensión mayor, el. espectro dé .epítopos ¡ expresados por células de tumor y obtienen sincronización' de epítopo sin requerir diseño de ' la . secuencia de antígeno natural. Estos tipos de vectores pueden ser usados para identificar epítopos que son útiles para profilaxis o terapia de cáncer y otros 'tipos de enfermedades. Este tipo; de estrategia de vector' puede también evitar el uso de métodos de inmunología inversa molestos que involucran la elución; de epítopo de células objetivos o métodos similares. Además, tales vectores incluyen la necesidad de usar ratones desactivados de proteasoma que tienen defectos ontológicos' más profundos, Vectores adicionales' provistos .por modalidades reveladas en la células infectadas que conducen a control inmune efectivo .' Sin embargo, los datos preliminares también sugieren que j las I células no expresan estrictamente inmunoprofeasoma y que' un nivel basal de proteasoma de mantenimiento de aproximadamente 10-20% de proteasoma total está comúnmente presente en células.

Para dirigir, promover o forzar un desplazamiento de la actividad de inmunoproteasoma a aquella del proteasoma de mantenimiento, se puede usar un vector bicistrónico de¡ la t invención. Un pAPC, que expresa principalmente actividad inmunoproteasomal en lugar de la actividad proteasomal! de mantenimiento, puede ser transfectado con un vector bicistrónico de la invención que co-expresa ún antigeno asociado al tumor y un ARNi que inhibe, disminuye o abroga la actividad de inmunoproteasoma. Mediante esto, las pAPC despliegan el epitopo de · mantenimiento e inducen una respuesta de CTL basada en. la expresión predominante del proteasoma de mantenimiento. Asi, en algunas modalidades, un vector bicistrónico. que ¦ co-expresa un antigeno y un agente interferente que inhibe la actividad inmunoprotesomal es provisto. Modalidades, de inhibidores de inmunoproteasoma pueden incluir, pero no están limitados a la proteina X ¡del virus de hepatitis B y los anticuerpos de una sola cadena ' sin líder dirigidos contra la sub-unidad inmunoproteasoma-específica.. ; La inmunización con un- péptido puede generar 'una respuesta de célula T citotóxica/citolitica (CTL) e intentos para amplificar adicionalmente esta respuesta (por ejemplo, i . mediante inyecciones adicionales) pueden conducir en lugar de esto a la expansión de una población de célula T réguladora y una disminución subsecuente de actividad de CTL observable. Para controlar el efecto de células reguladoras T sóbre la actividad de CTL, en algunas modalidades, se puede usar un i vector bicistrónico para controlar o inhibir la generación ¡ y/o ' · ' I t expansión de estas células y promover mediante esto o habilitar la respuesta inmune deseada. Al- introducir a pAPC un vector * I bicistrónico que co-expresa un antígeno asociado al tumor y un I ARNi que agota o regula descendentemente células reguladoras T, la actividad de célula T dentro de un tumor o cáncer puede ¡ ser ¦ - ¦· ¦ i inducida, promovida o mejorada. ¡ Las modalidades de vector multicistrónico también ser usadas para inducir' población de3 célula T tolerabilizada y/o células reguladoras T para el control:, de autoinmunidad . .En tales modalidades, un vector bicistrónico que co-expresa un antigeno y un ARNi que reduce ? o .regula descendentemente una señal coestimulatoria, (señal 3) o 'una molécula pro-inflamatoria puede ser usada para atenuar la activación de célula T. Esto se puede obtener por medioj de I interferencia con la sinapsis inmunológica, conduciendo a1 la I generación de células T reguladoras y/o células.: T tolerabilizadas y/o células T en estado de anergia.

Además de las enfermedades y .condiciones anteriormente, las composiciones multicistrónicas inmunógenas pueden ser administradas en el tratamiento de otras enfermedades - y/o condiciones en un sujeto. Tales enfermedades y/o condiciones pueden incluir, por ejemplo, una enfermedad proliferativa celular tal como cáncer. Cánceres que pueden j ser tratados utilizando las modalidades de composición de vector bicistrónico inmunógeno .de la invención incluyen, por ejemplo y ? de manera no limitante: melanoma, cáncer de pulmón en los ;'que se incluyen: cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC) o cáncer de pulmón de célula pequeña (SCLC) , hepatocarcinoma, retinoblastoma, astrocitoma, glioblastoma, leucemia, neuroblastoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pecho, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer . de hueso, cáncer testicular, cáncer de ovarios, mesotelioma, cáncer cervical, cáncer gastrointestinal, l'infoma, cáncer de colon, cáncer; de vejiga y/o cánceres de la sangre, cerebro, piel, ojos, lengua, o encía.

Las composiciones de vector ' multicistrónico i inmunógenas . reveladas en la presente' pueden ser usadas ]¿ara tratar enfermedades proliferativas celulares di.ferentes ; al cáncer. Otras enfermedades proliferativas celulares incluyen, i por. ejemplo, pero no están limitadas a, displasias, lesiones pre-neoplásicas (por ejemplo, hiperplasia adenomatosa, neplásia intraepitelial . prostética, displasia cervical, poliposis : de colon) o carcinoma in situ, pero no está limitado a tales. En algunas modalidades de la invención, las composiciones1 de neovasculatura y/o de células estromales. , i ·¦ Procedimientos de terapia genética En algunas modalidades, los vectores multicistrónicos revelados en la presente tienen aplicación en terapia genética. Tales vectores de terapia genética son aplicables en ' la supresión de un gen o genes en una célula objetivo que expresa el antigeno, utilizando, por ejemplo, tecnología de !ARN I i interférente . Vectores multicistrónicos terapéuticos genéticos ! como se revela en la presente permiten la expresión eficiente, estable de proteínas térapéuticas co-expresadas con uno o imás I agentes que interfieren con la expresión de modificadoresj.de respuesta biológica dentro del mismo vector pero bajo! el control de promotores diferentes. La interferencia dé- la expresión de BRM puede conducir a la inhibición o regulación descendente de componentes celulares que son responsables 'por la expresión genética silenciosa o inducir apóptosis.

En algunas modalidades, se provee un vector multicistrónico, que comprende un plásmido que co-expresa !una proteína inmunizante y un ARN interférente que suprime directa o indirectamente la actividad de enzimas metilantes de ADN. ¡Las diferentes clases de genes que son silenciados mediante metilación de . ADN incluyen por ejemplo, pero no están limitados a, genes tumor-supresores, genes que suprimen la invasión de tumor y metástasis; genes de reparación de ADN; genes para receptores de hormona; y genes que inhiben la angiogénesis .

Tales vectores de terapia -genética pueden dar como resultado un nivel de expresión estable, de duración más larga, de nivel ¡más ' · , i alto. del transgen .' Modalidades de la invención también incluyen vectores que co-expr.esan un antigeno terapéutico y uno o más siARN que inhiben, reducen o suprimen proteínas en la ruta apoptótica. Por ejemplo, tales vectores pueden prolongar, la vida media de APC que expresa un antígeno de interés. ¡ Adicionalmenté, en algunas modalidades^ se provee un i plásmido o vector viral para co-expresión de 'un transgen y 'uno o más elementos inhibidores (por ejemplo, a shARN) que interfieren con la maquinaria R de cinasa de proteína dsARN-dependiente ( PKR-dependiente ) que juega un papel central en la inducción de inmunidad innata: Tales vectores pueden dar como I resultado en un nivel más alto y/o expresión a un plazo ,más largo del transgen. 'similarmente, vectores de plásmido o vector virales que co-expresan siARN que interfieren con la expresión de MHC Clase I o Clase II, expresión de p2-microglobulina, TAP o expresión de proteasoma son provistos por modalidades reveladas en la presente. Tales vectores que expresan transgenes terapéuticos, especialmente vectores virales ¡ no replicantes con altas proporciones de transducción in pueden ser herramientas efectivas para terapia genética, pueden superar mecanismos de eliminación celular por el sistema inmune.'- ! En algunas modalidades, los vectores de terapia genética bicistrónicos revelados en ía presente pueden ,:ser ¡ usados para tratar enfermedades y condiciones discutidas I anteriormente, tales como, por ejemplo, pero no limitados' a, I por ejemplo cánceres y enfermedades inflamatorias.' ¡ i Interferencia de ARN (ARNi) i Modalidades de la invención reveladas en la presente proveen vectores bicistrónicos o multicistrónicos 'que comprenden un cistrón que incluye, uno o más agentes l que interfieren con la expresión de modi icadores de respuésta biológica. En modalidades en donde el vector actúa como un agente inmunoterapéutico, ' el uno o más agentes interferentes pueden ser dirigidos contra la expresión de moléculas ¦ que regulan la respuesta inmune (en los que se incluye, pero: no I limitados a, IL-10, TGF-ß y FoxP3) . En algunas modalidades,, el uno o más agentes interferentes pueden bloquear rutas pro-inflamatorias, por ejemplo, al bloquear la expresión! de moléculas en las que se. incluye, pero no limitadas a, STATs,; T-bet, NF- ?, TLRS, IFN-a, IFN-?. En algunas modalidades, el uno o más agentes interferentes pueden inhibir específicamente! la expresión de proteasomas inmunes, de tal manera que la actividad de proteasomas estándar para el procesamiento de antigeno se vuelve dominante en la APC. En modalidades en dónde el vector actúa como un agente terapéutico genético, el uno o más agentes interferentes pueden ser usados para inhibir o regular descendentemente la expresión de componentes celulares i que son responsables por silenciar la expresión genética o inducir apóptosis.( Tales agentes pueden ser por ejemplo, ¡ARN 1 1 interferentes.. ! La interferencia de ARN (también denominada come • _ I "interferencia ARN-moderada" o ARNi) es u mecanismo, bien I conocido para aquel de habilidad ordinaria en el arte, mediante el cual se puede obtener la. supresión de expresión genética especifica en células mamiferas. El ARNi es un proceso conservado en el cual ARN interferentes pequeños (siARN) forman estructuras de doble hebra con moléculas de ARN complementarias y moderan su degradación . Una ventaja principal de ,ARNi contra otros procedimientos a base de antisentido para aplicaciones' terapéuticas es que utiliza la maquinaria celular que permite eficientemente el apuntamiento de transcritos complementarios, dando como resultado frecuentemente la regulación descendentemente altamente potente de expresión genética.

Desventajas de ARNi incluyen la activación de respuestas' de interferón tipo I y administración ineficiente in vivo. Los procedimientos a base de vector de ADN para obtener ARNi en células mamíferas pueden servir para superar los obstáculos de la administración in vivo. Los vectores de ARNi a base de j ADN ! pueden ser incorporados a sistemas de administración virales o no virales.. · En algunas · modalidades, los AR ' interferentes o shARN que codifican ARN interferentes pueden ser empleados para I modular la expresión de modificadores de respuesta biológica (modificadores de respuesta biológica son discutidos ¡ en i cualquier parte en la presente en mayor detalle) . Así, modalidades particulares proveen elementos, tales como uno o más shARN, siARN, moléculas de ARNi de horquilla y · los semejantes, que pueden modular o regular la expresión: de I modificadores de. respuesta biológica al inhibir, silenciar, reducir, regular descendentemente o eliminar su expresión. Tales moléculas de ARN, en un aspecto de la invención, son i ' dirigidas contra antígenos, por ejemplo, antígenos asociados al tumor, como se .revela en cualquier parte en la presente.; En algunas modalidades, se proporciona shARN que abarca .ARN interferentes contra un profiláctico y/o terapéutico tal por ejemplo, MART-l/ elan-A, .pero no .está limitado a tal.

Los siARN pueden ser diseñados de tal manera que son específicos y efectivos en la supresión de la expresión de ¡los ! ·. genes de interés. Métodos para seleccionar las secuencias objetivo, esto es, aquellas secuencias presentes en los genes de interés a los cuales los siARN guían la maquinaria degradante, son dirigidos para evitar secuencias i que interfieren con la función de guía de los siARN, en tanto , que incluyen secuencias que son específicas al gen. o genes. Comúnmente, secuencias objetivo de siARN de aproximadamente 19 a 23 nucleótidos de longitud son altamente efectivos. Esta longitud refleja las longitudes de productos de digestión resultantes del procesamiento ; de ARN mucho. - más largos (Montgomery et al., 1998 ) . i I- Los siARN pueden ser elaborados por medio de síntesis química directa; por medio de procesamiento de ARN de doble hebra más largos por medio de exposición a Usados de embrión I de Drosophila; o por medio de un sistema ih vitro derivado de células S2. El uso de lisados .celulares o procesamiento in ¦ ¦ , 1 vitro puede involucrar además el aislamiento subsecuente de los siARN cortos (de aproximadamente 21-23 nucleótidos) del lisado, etc., haciendo el proceso un tanto molesto y caro. La síntesis química procede mediante la elaboración y. recocido de :los oligómerps de ARN de doble hebra a un ARN de doble hebra. Métodos de tal síntesis química son diversos y bien conocidos en el arte. Ejemplos no limitantes de esta metodología >son i provistos en las patentes estadounidenses Nos. 5 , 889 , 136 ; 4 , 415 , 732 ; 4 , 458 , 066 y en Wincott et al. ( 1995 ) , cada una; de ' r I las cuales es incorporada por referencia en su totalidad.

La publicación internacional Nos. WO . 99/32619 y O 01 / 68836 , cada una.de las cuales es incorporada en la presente por referencia en. su totalidad, sugiere que el RNA para uso en siARN puede ser sintetizado química o enzimáticamente . ; La síntesis enzimática revelada en estas referencias es mediánte i una ARN polimerasa celular o una ARN polimerasa de bacteriófago (por ejemplo, T3, T7, SP6) vía el uso y producción de> un constructo de expresión como es conocido en el arte (véase, jpor ejemplo, patente estadounidense No. 5,795,715, que ! es incorporada en la presente por referencia en su totalidad)'. ¡Los ! constructos revelados en la presente, proporcionan plantillas f . que producen ARN que contienen secuencias de nucleótidos - idénticas a una porción del gen objetivo. La longitud! de secuencias genéticas provistas por estas referencias es de ¡por lo menos aproximadamente 25 bases y puede ser de tantas como aproximadamente 400 o más bases de longitud. Un aspecto importante de esta referencia es que los autores revelan dsARN más ' largos de digestión a secuencias más cortas : de aproximadamente 21-25 nucleótidos de longitud con el complejo de nucleasa endógeno que convierte dsARN largos a SÍARN in vivo. Sin embargo, no describen o presentan datos para sintetizar y usar los dsARN de 21-25meros transcritos in vitro. No se hace ninguna distinción entre las propiedades esperadas de los dsARN sintetizados química' o enzimáticamente y su uso en la interferencia de ARN. : Similarmente, WO 00/44914, que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad, sugiere que hebras individuales de ARN pueden ser producidas enzimáticamente o mediante síntesis orgánica' parcial/total. Preferiblemente,! el ARN de una sola hebra es sintetizado enzimáticamente1 de productos de PCR de una plantilla de ADN, preferiblemente ' una plantilla de cADN clonada y el producto de ARN es ' un transcripto completo del cADN, que puede comprender cientos de nucleótidos. WO 01/36646, que es también incorporado' en' la i presente por referencia en su totalidad, no coloca ninguna i limitación de la manera en la- cual el siARN es sintetizado, i i · estipulando que el ARN puede ser sintetizado in vitro ó in vivo, utilizando procedimientos manuales y/o automatizados. ' Esta referencia también estipula que la síntesis in vitro púede ser química o enzimática, por ejemplo utilizando ARN polimerasa clonada (por ejemplo, T3, T7, SP6) para transcripción de la plantilla de ADN endógena (o cADN) o una mezcla de ambos. Otra i vez, no se hace ninguna distinción en las propiedades deseables para uso en interferencia de ARN entre el siARN sintetizado química o enzimáticamente. ' Un desafío a ser satisfecho en el empleo ; de aplicaciones terapéuticas de tecnologías de ARNi es ' el desarrollo de sistemas para administrar siARN eficientemente a células mamíferas. Para aquel fin, plásmidos han sido diseñados que expresan ARN de horquilla cortos o estructuras de ARN de tallo-bucle, impulsados por promotores de polimerasa III de ¡ARN ' (pol III) (Brummelkamp et al. 2002. Science 296: 550-553; Paddison et al. 2002 . Genes Dev. 16 : 948-958 , cada una de las cuales e's incorporada en la presente por referencia en; su l totalidad) . Los ARN de horquilla son procesados para generar siARN en células e inducir mediante esto la silenciación genética. Los promotores de Pol III son ventajosos debido a que sus transcriptos no son necesariamente modificados póst-transcripc'ionalmente y debido a que son altamente activos cuando son introducidps en células mamíferas. Un promotor! de j polimerasa III ejemplar (pol III) empleado en modalidades dé la invención revelada en la presente es el promotor U 61 de i' pólimerasa III .de- ARÑ.

Modificadores de respuesta biológica ! Modalidades de plásmidos bicistrónicos revelados; en la presente, incluyen uno o más agentes que interfieren corl la ! expresión de un modificador de respuesta biológica. En general, modalidades de la invención proporcionan el uso de proteínas 1 que constituyen ya sea objetivos inmunológicos u obstáculos de la respuesta inmune. Los modificadores de respuesta biológica pueden actuar de una manera inmunosupresora o inmunoestimulante para modular una. respuesta inmune, por ejemplo pero nó limitado a, al promover una respuesta de regulatoria ' T . Los modificadores de respuesta biológica como se i revean para uso en la presente pueden incluir además moléculas orgánicas pequeñas naturales o sintéticas que ejercen efectos moduladores inmunes mediante rutas estimulantes de inmunidad innata.

Modificadores de respuesta biológica usados ; en modalidades reveladas en la presente, incluyen, por ejemplo y · de. manera no limitante: agentes que están involucrados en el control de una respuesta inmune tales como por ejemplo, citocinas, quimiocinas, moléculas co-estimulatorias , proteínas i de punto de verificación, factores de transcripción y elementos de transducción de señal y los semejantes; agentes que están involucrados en el procesamiento y presentación de antigeno, tales como, por ejemplo, ??? 1 y TAP 2 proteínas, proteasoma inmune o estándar, p2-microglobulina y moléculas MHC Clase j I o • . i' Clase II y los semejantes; agentes que están involucrados en la regulación de rutas apoptóticas; agentes que están involucrados i en el control genético o silenciación, tal como por ejemplo, enzimas metilantes de ADN, moléculas que controlan cromatinas y . moléculas reguladoras de ARN y los semejantes. Por ejemplo, receptores celulares, receptores de citocina, receptores de quimiocina, elementos de transducción de señal o reguladores de transcripción pueden ser usados como BRM en el cont'exto descrito en la presente. ! ¦ En algunas modalidades , los modificadores ¡ de respuesta biológica pueden incluir, por ejemplo y de manera no limitante, moléculas que activan la producción de citocina o quimiocina, tales como ligandos para receptores semejantes a Toll (TLR) , peptidoglicanas, LPS o análogos, imiquimodos , ¦ · ; I oligodesoxinucleótidos de CpG sin metilar ' (CpG ODN) ; dsARN tales como dsARN bacteriano (,que ¦ dsARN sintético (polylrC) sobre que se enlazan a TLR9 y TLR3, respectivamente.

Una clase de modificadores de respuesta biológica considerados útiles en modalidades de 1-a invención revelada en i : la presente, incluyen moléculas naturales o sintéticas orgánicas pequeñas que ejércen efectos moduladores inmune ¦ I mediante rutas estimulantes de inmunidad innata. Se ! ha demostrado ' los macrófagos, célula dendriticas y otras células que portan los llamados receptores semejantes a Toll (TLR), 'que reconocen patrones moleculares- patógenó-asociados (PAMP) sobre microorganismos (Thoma-Uszynski, S. et al., Science 291:1544- 1547, 2001; Akira, S., Curr. Opin. Immunol., 15: 5-11, 2Ó03; cada una de las cuales ¦ es incorporada en la presente jpor referencia en su .totalidad) . Además, en algunas modalidades, las moléculas pequeñas que se enlazan a TLR pueden ser usadas, tales como una nueva generación de imidazoquinolinas anti- virales puramente sintéticas, por ejemplo, imiquimod; y resiquimod, que se ha encontrado que estimulan la ruta celular de inmunidad mediante el enlace de TLR 7 y 8 (Hemmi, H. et a . , Nat Immunol 3: 196-200, 2002; Dummer, R. et al., Dermatology 207: 116-118, 2003; cada, una de las. cuales es incorporada en la • . i presente por referencia en su totalidad) . '.

I Los modificadores de respuesta biológica que interactúan directamente con receptores' que detectan i I componentes microbianos pueden también ser usados en el diseño de un vector bicistrónico de la invención. Adicionalmente, moléculas que actúan córriente abajo en la ruta de señalización pueden ser usadas. Los anticuerpos que se enlazan a molécúlas co-estimulatorias (tales como, por ejemplo, anti-CD40, CTLA-4, anti-OX40 y los semejantes) son también útiles en modalidades de la invención. En algunas modalidades, los modificadores de respuesta biológica empleados pueden incluir., por ejemplo, pero no están limitados a, IL-2, IL-4, TGF-ß, IL-10, IFN-? y los semejantes; o moléculas que activan su producción. Otros modificadores de respuesta biológica, pueden incluir, !por ejemplo, pero no están limitados a, citocinas tales como IL-^12, IL-18, GM-CSF, ligando flt3 (flt3L), interferones , TNF-a y ', los semejantes. Adicionalmente, quimiocinas, tales como, ¡por ejemplo, pero no limitados a, IL-8, ???-3a, MIP-la, MCP-1, í¾CP-3, RANTES y los semejantes pueden' también ser empleadasr en modalidades de la invención revelada en la presente.

Además, los modificadores de respuesta biológica pueden incluir moléculas co-estimulatorias tales como, pero nó limitadas a moléculas B7 que estimulan la proliferación; de células T. El agente interferente (por ejemplo, ARNi) puede interferir con citocinas proinflamatorias tales como IL-6, 'IL-12, IL-18, IFN-alfa e IFN-gamma y los semejantes. ' i I En algunas modalidades, los modificadores' de respuesta biológica pueden incluir una señal co-estimulatoria, I (señal 3) o una molécula pro-inflamatoria que afecta; la activación de células T. Un agente interférente dirigido contra tales BRM puede 'interferir con la sinapsis inmunológica, conduciendo a la generación de células regulatorias T , y/o células T tolerabilizadas y/o células T en estado de anergia. i Agentes terapéuticos I Al utilizar vacunas de ADN terapéuticas para el i tratamiento o erradicación de una enfermedad o condición un antigeno es preferiblemente adquirido y procesado a péptidos que son presentados subsecuentemente a complejos de MHC Glasé I-péptido localizado sobre la superficie de las pAPC con el fin de estimular una respuesta de CTL. Mediante esto los CTL son incluidos a proliferar y recircular a través del cuerpo en búsqueda de las células enfermas objetivo con complejos de MHC Clase I-péptido similares sobre su superficie. Luego' las células que presentan estos complejos son destruidas por la actividad citolitica de los CTL. Si la célula enferma objetivo no expresa el proteasoma predominantemente expresado por una pAPC, entonces los epitopos pueden no ser ' "sincronizados" y CTL puede fallar en · encontrar el objetivo de péptido deseado sobre la superficie de la célula enferma. ! ¡ Por consiguiente , es deseable considerar y tomar en cuenta, el complejo de MHC- Clase : I-péptido presente sobré el tejido objetivo cuando se diseñan vacunas de ADN efectivas. Esto es, los antigenos efectivos usados para estimular CTL para atacar el tejido enfermo objetivo son aquellos que son procesados y presentados naturalmente sobre la superficie i del tejido enfermo. Para tumores e infección crónica, esto significa en general que los epitopos de CTL son aquellos; que I han sido procesados por el proteasoma de mantenimiento. Para generar una vacuna terapéutica efectiva, los epitopos de i CTL ' ' ! son identificados en base al conocimiento de que tales epitopos son producidos por el proteasoma de mantenimiento. Una | vez identificados, estos epitopos, implementados como péptidós o productos expresados mediante vectores de ácido nucleico codificados apropiadamente pueden ser usados para inmunizar o inducir respuestas de CTL terapéuticas contra células objetivo que expresan proteasoma de mantenimiento en el huésped. | ' · I I Al diseñar vacunas de ADN, un aspecto adicional 'para I considerar es que' la inmunización con ADN requiere que las APC absorban el ADN y expresen las proteínas o péptidos codificados. Por. consiguiente, después de la inmunización;' con un vector generado, las APC pueden ser estimuladas para expresar un epítopo que es luego desplegado sobre MHC de Clase I sobre la superficie de- la célula para estimular una respuesta de CTL apropiada.

Para evaluar la importancia de la¦ expresión de antígeno impulsada por plásmido dentro del nodo linfático y para estudiar si el cebado es provocado exclusivamente por la activación de inmunidad innata vía interacción de plásmido-TLR, se llevaron a cabo estudios experimentales para examinar el i efecto, si lo hay, de la interferencia ARN especifica" de expresión de MART-l/Melan-A sobre la¦ inducción de la respuesta inmune. Asi, una modalidad del nuevo vector bicistrónico ; que co-expresa' el antígeno y un shARN que abarca ARNi contra MART-l/Melan-A ha sido diseñado y administrado. ¡ i Al diseñar un vector bicistrónico como se revela en la presente, modalidades de la invención también proporcionan proteínas profilácticas o terapéuticas co-expresadas · con agentes qué interfieren con la expresión de modificadores de respuesta biológica. En algunas modalidades, los antígenos pueden ser usados como agentes terapéuticos y pueden ser j co-expresados con agentes que interfieren con la expresión de modificadores de respuesta biológica. Los antígenos usados' en modalidades de la. invención puede incluir, pero no están limitados a proteínas, péptidos, polipéptidos y derivados de los mismos y pueden también ser macromoléculas sin péptido.

En modalidades de la invención, un antígeno es 1 uno que estimula el sistema inmune de un sujeto que tiene un tumor maligno o enfermedad infecciosa para atacar el tumor o i patógeno, inhibiendo mediante esto su crecimiento o eliminarlo y de aquí tratando o curando la enfermedad. El antígeno,¡ en algunas instancias, se puede hacer corresponder con la enfermedad especifica encontrada en el sujeto que es tratado, para inducir una respuesta de CTL (también denominada como respuesta inmune moderada por la célula), produciendo mediante esto una reacción citotóxica por el sistema inmune . que da como resultado la lisis de- células objetivo (por ejemplo, -las células de tumor malignas o células patógeno-infectadas) . |. í Modalidades de la invención pueden también utilizar antigenos de péptido de aproximadamente 8-15 aminoácidos; de i longitud. Tal péptido puede ser un epitopo de un antigeno¦ más grande, esto es, un péptido que tiene una secuencia! de aminoácidos correspondiente a un sitio sobre el antigeno ¦ más grande que es presentado por las moléculas de MHC/HLA y puede ser reconocida, por ejemplo, mediante un receptor de antigeno o receptor de célula T. Tales 'antigenos de disponibles para aquel de habilidad en el arte y son revelados, I por' ejemplo, en las patentes estadounidenses Nos. 5,747,269 y '5,698,396; solicitud internacional No. PCT/EP95/02593, presentada el 4 de julio de 1995; y solicitud internacional ; No . PCT/DE96/00351, presentada el 26 de febrero de 1996, cada : una de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Epitopos adicionales, también como métodosj de descubrimiento de epitopos, son descritos , por ejemplo, en las patentes estadounidenses Nos. 6,037,135 y 6,861, 234, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia1 en su totalidad. ¡ En tanto que en el caso general, el antígeno finalmente reconocido por una célula T es un péptido, la forma de antigeno administrado realmente como la preparación inmunógena no necesita ser un péptido per se. Cuando son administrados, el péptido o péptidos epitópicos pueden estar i incluidos dentro de un. polipéptido más largo, que puede ser, I por ejemplo, un antigeno de proteina completo o un segmento del i mismo o una sec diseñada que tiene funcionalidad similaridad a tal. Secuencias diseñadas pueden incluir, por ejemplo, poliepitopos y epitopos incorporados a una secuencia portadora, i tal como un anticuerpo o proteina de cápsido viral. Tales polipéptidos más largos pueden incluir grupos de epitopos, tales como, por ejemplo, aquellos descritos en la solicitud de patente estadounidense No. 09/561,571 intitulada "EPITOPE CLUSTERS", que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. El péptido epitópico o el polipéptido más largo i en el cual está incluido, puede ser un componente de! un microorganismo (por ejemplo,, un virus, bacteria, protozoario etc.) o una célula mamifera (por ejemplo, una célula de tumor o célula que presenta antigeno) o un lisado, en los qué; se incluyen Usados purificados parcialmente o enteros, ¡ de cualquiera de los anteriores. ?1 péptido epitópico o1 el polipéptido más largo en el cuál está incluido, puede ser usado como complejos con otras proteínas, por ejemplo, proteínas; de choque térmico. En algunas modalidades, el péptido epitópico o e-1 polipéptido más largo en el cual está incluido, puede ' ser modificado covalentemente, tal como por ejemplo, mediante lipidación. Alternativamente, el péptido epitópico o' el polipéptido más largo en el cual está incluido, puede ¡ ser elaborado como un componente de un compuesto sintético, tales como, por ejemplo, dendrímeros , „· sistemas de péptidos; de antígeno múltiples (MAPS) y polioximas. En algunas modalidades , el péptido epitópico o el polipéptido más largo en el cual ¡está incluido, puede ser incorporado a liposomas o microesferas , etc. Como se usa en la presente, el término "antígeno de polipéptido" abarca todas de . tales posibilidades' . y combinaciones . , , ¡ Modalidades de la invención proveen que el antigeno puede ser un componente natural del microorganismo o cé'lula mamífera. El antígeno puede también ser expresado ' mediant;e el microorganismo o célula mamífera por medio de tecnología de ADN recombinante o, en el caso de células que presentan antigeno (APC) , mediante pulsación o carga.de la célula con el antígeno de polipéptido antes de la administración. Adicionalmente^ el antígeno puede ser administrado como un ácido nucleico que codifica el antígeno, de tal manera que el antígeno es expresado subsecuentemente por una célula después de- la administración del ácido nucleico a ¦ la célula. Finalmente, mientras que las moléculas de MHC de Clase I clásicas presentan antígenos de péptido, las moléculas de Clase I adicionales pueden ser adaptadas para presentar mácromoléculas sin péptido.

Macromoléculas sin péptido ejemplares incluyen, pero no e'stán limitadas a lipidos y gllcolípi'dos . Como se usa en la prese'nte, el término "antigeno" incluye tales macromoléculas tamtJién. Además, una vacuna a base de ácido nucleico puede codificar' una o más enzimas para la síntesis de tal macromolécula . y facilitar 1 mediante esto la expresión de antígeno de la macromolécula sobre una APC. En algunas modalidades, la vacuna a base de ácido nucleico puede codificar dos, tres, cuatro o cinco enzimas para síntesis y expresión de antígeno dej la macromolécula sobre APC. ; í Otras proteínas terapéuticas o profilácticas útiles en modalidades de la invención incluyen, por ejemplo: antígenos específicos de tumor, .antígenos de diferenciación, antígenos embriónicos, antígenos de cáncer-testículo, antígenos de oncógenos, genes tumor-supresor mutados, antígenos de tumor únicos resultantes dé translocaciones cromosomales , antígenos virales y cualquier- otro antígeno que está evidentemente presente o estará en el futuro para aquel de habilidad- én el arte . \ Antígenos adicionales que pueden ser empleadds en modalidades de la invención incluyen por ejemplo aquellos encontrados en organismos enfermos con enfermedad infecciosa, tal como proteínas virales estructurales y no estructurales.

A la luz de lo mencionado anteriormente, ¡ los antigenos útiles en modalidades de la invención, incluyen anticuerpos tumor-especificos (TSA) o antigenos tumor-asoci dos (TuAA) . Un TSA es único a células de tumor y no se presenta sobre otras células en el cuerpo. Los TuAA son TAA, en dondé la ¦célula objetivo es una . célula neoplásica. Los TuAA pueden ¡ser antigenos que son expresados sobre célul.as normales durante el desarrollo fetal cuando el sistema inmune está inmaduro y no es apto para responder o pueden ser antigenos que están I normalmente presentes a niveles extremadamente bajos eri clase normales pero son expresados a niveles mucho más altos sobre i células de tumor. En algunas modalidades, un TuAA es I un antigeno asociado con células no cancerosas de tumor, tales como, por ejemplo, . neovasculatura de tumor estromales dentro del micro-medio ambiente del En algunas modalidades, el antigeno puede ser, un auto-antígeno, tal como por ejemplo, pero no limitado! a', insulina, GAD65 ó HSP para el tratamiento de diabetes Tipo 1.

En algunas modalidades, el auto-antigeno puede ser, pero; no I está limitado a, proteina básica de mielina (MBP) , protéina proteolipida (PLP) o glicoproteina oligodendrocito de mielina (MOG) para el tratamiento de esclerosis múltiple. . i En algunas modalidades de la invención, el TuAA Melan,-A, también conocido . como ART-1 (antigeno de melarioma reconocido por' células T) es empleado. Melan-A/MART-1 es luna proteina biosintética de melanina expresada a altos niveles en melanomas. Melan-A/MART-1 es bien conocido en- el arte y es i- revelado en las patentes estadounidenses Nos. 5,994,523; 5, 874, 560; y 5,620,886, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Una modalidad preferida estipula que , Melan-A TuAA, Melan-A26-35, representada i en la presente mediante SEQ ID NO: í. Ejemplos no limitantes de otros TuAA que son útiles en modalidades de la invención incluyen tirosinasa, SSX-2, NY-ESO-1, PRAME y PSMA (antigeno de membrana próstata-especifico) . Lo_s TuAA. útiles en modalidades, de la invención revelada en la presente pueden comprender la secuencia natural o análogos de la misma, tales como aquellos revelados en la solicitud de patente estadounidense provisional No. 60/691,889; solicitud de patente estadounidense Nos. 11/455,278, 11/454,633 y 11/454,300; y Solicitud de patente ¡ PCT No. ' PCT/US2006/023489; y publicación de solicitud de patente estadounidense Nos. 20060057673 y 20060063913; cada una de 'las cuales es incorporada en la presente por referencia en- su totalidad.

' Péptidos adicionales y análogos de péptido que pueden ser empleados en modalidades de la invención son revelados' en la solicitud de patente estadounidense Nos. 60/581,001, presentada el 17 de junio de 2004 intitulada SSX-2 PEPTIDE ANALOGS;- y 60/580,962 intitulada NY-ESO PEPTIDE ANALÓGS; solicitud de patente estadounidense No. 09/999,186, presentada el 7 de noviembre de 2001, intitulada METHODS ; OF COMMERCIALIZING AN ANTIGEN; solicitud de patenté estadounidense ¡ No. 11/323, 572 presentada el 29 de diciembre de 2005, intitulada, METHODS TO ELICIT, ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNE RESPONSES AGAINST MHC CLASS I-RESTRICTED EPITOPES, :FOR PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC PURPÓSES; y solicitud de patente estadounidense No. 11/323,520 presentada el 29 de diciembre de ¦2005, intitulada METHODS TO BYPASS CD4+ CELLS IN THE INDUCTION OF AN IMMUNE RESPONSE, cada una de las cuales es incorporada I por medio de la presente por referencia en su totalidad. i Principios benéficos de selección de epitopo para inmunoterapéut'icos son revelados en la solicitud de patente estadounidense No. 09/560,465 (presentada el 28 de abril; de 2000), 10/026,066 (presentada el 7 de diciembre de 2001; publicación No. 20030215425 de noviembre de 2001) todas IN ANT I GEN PRESENTING CELLS; 09/561,571 (presentada el 28: de abril de 2000). intitulada EPITOPE CLUSTERS; 10/094,699 (presentada el ,7 de marzo de 2002; Publicación No. 20030046714 Al) intitulada ANTI-NEOVASCULATURE PREPARATIONS FOR CANCER; y i 10/117, 937 (presentada el 4 de abril de 2002; Publicación o . 20030220239 Al) y 10/657,022 (presentada el 5 de septiembre de i 2003; publicación No. 20040180354 Al) y solicitud de PCT iNo. Í PCT/US2003/027706 (Publicación 1 No. WO/04022709A2) todas i intitulada EPITOPE SEQUÉNCES y patente · estadounidense !NO . i 6,851,234; cada una de las cuales es incorporada en la por referencia en su totalidad. .

En algunas modalidades, se pueden emplear antigenos adicionales que incluyen, por ejemplo y de manera no limitante: . i gplOO (Pmel 17), TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, CEA, RAGE,' SCP-1, Hom/ el-40, p53, H-Ras, HER-2/¡neu, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, YL-RAR, antigenos de yirus de Epstein Barr, EBNA,. ' antigenos E6 y E7 de papilloma irus humano (HPV) , TSP-180, MAGE-4, AGE-5, MAGE-6, pl85erbB2, I pl80erbB-3, c-met, nm-23Hl, PSA, TAG-72-4, CAM 17.1, NuMa1, K- 1 1 ras, ß-Catenina, CDK4, Mum-1, pl6, pl5, .43-9F, 5T4, 791Tgp72, ¡ alfa-fetoproteina, ß-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15^3\CA 27.29NBCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, COT029, l FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MÓV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, PLA2 , proteina de enlace de TA-90/Mac-2 proteina/ciclofilina C- asociada, TAAL6, TÁG72, TLP, y TPS . Estos antigenos a base de proteina son conocidos y están disponibles para el técnico · experimentado, tanto en la literatura como comercialmente . ¦ '' Moléculas terapéuticas adicionales útiles en algunas modalidades de la invención incluyen, pero no están limitadas a, factores de transcripción tales como T-bet, STAT-1 STAT-4 y ¡ STAT-6. En algunas modalidades de la invención, las moléculas apuntadas pueden incluir TLR y sus moléculas de señalización corriente abajo, tales como, por ejemplo, pero no limitados a, MyD88,.NFK-B y los semejantes. Las citocinas son también útiles en modalidades de la invención, tales como, por ejemplo, pero no limitados a, G-CSF, GM-CSF, IFN, IFN-a, IFN-ß, IFN-?, lL-2, IL-3, IL-4, IL-8, IL-9, . I.L-10', IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, | IL-18, TNF, GF-OÍ, TGF-ß y los semejantes. Factores j co-estimulatorios tales como, CD40 B7.1 y,B7.2 son también útiles en algunas modalidades. En algunas modalidades, proteínas de punto de verificación, tales como, por ejemplo, peroi' no i limitados a, F0Xp3, moléculas semejante a B7, ligandos de L'AG-3 y tales moléculas pueden ser usados. Las proteínas presentes en i ¦ la ruta de presentación de antígeno tales como, por ejemplo, ' . i pero no limitados a, HLA y TAP (transportadores asociados! con el procesamiento-1 y -2 de antígeno (TAP1 y TAP2)) pueden también ser usadas en modalidades de la invención. El supr'esor de activación de célula dendrítica SOCSl y proteínas en la ruta i de metilación de ADN tales como DMNTl pueden también ser usíadas í en modalidades reveladas en la presente. Las prote'ín'as presentes en la ruta apoptótica pueden también ser usadas en modalidades reveladas en la presente. Modalidades de la invención pueden emplear una o más de las moléculas reveladas en la presente, solas o en varias combinaciones, cuando se diseña un vector bicistrónicó de la invención. · Cualquier antígeno revelado en la presente, puede ser enlazado como una disposición- de cadena de perlas o poliepítopos para uso en · el diseño de un vector bicistrónicó.

Disposiciones de cadena de perlas o poliepitopos son bien j conocidos en el arte,¦ como se revela, por ejemplo, eri la publicación internacional No. WO 01/19408A1; WO 99/5573j0A2 ; O 00/40261A2; WO 96/03144A1; WO 01/23577A3; WO 97/4144'pAl; WO 98/40500A1, 'WO 01/18035A2, WO 02 /O 68654A2 ; WO 1/58478?; ! WO 01/1104.0A1; WO 01/89281A2; WO 00/73438A1; WO 00/71158A1; WO 00/52451A1; WO ?0/52157?1; WO 00/29008A2; WO 00/06723A1 y ! ' patentes estadounidenses Nos . ^ 6, 07 , 817; 5,965,381; 6,130,066; 6,004,777; 5,990,091; cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad.

En algunas , modalidades, los nuevos péptidos I •identificados por el método revelado en la patente estadounidense No. 6,861,234, intitulada "METHOD OF EPI OPE DISCOVERY" y solicitud de patente estadounidense No. de serie 10/026,066 (Publicación No. 2003-0215425) presentada el 7 de ¦ diciembre de 2000 e intitulada "EPITOPE SYNCHRONIZATIOH IN ANTIGEN PRESENTING CELLS", · (cada una de las cuales i es incorporada en la presente por referencia en 1 su totalidad) que son actualmente evidentes o serán evidentes en el futuro para aquel de habilidad ordinaria en el arte, pueden ser usados en modalidades reveladas en la presente.

Péptidos ejemplares adicionales puede pueden ; ser usados como péptidos terapéuticos' incluyen aquellos revelados en las Tablas 1A-1C de WO 02/081646 (que es incorporada eri la presente por referencia en su totalidad) también como aquellos revelados en las Tablas 1A y IB de WO 04/022709 (que! es incorporada en la presente por referencia en su. totalidad) .

Métodos de Administración de Composiciones En algunas modalidades, la administración preferida de los vectores bicistrónicos, · que comprenden una o 'más proteínas terapéuticas co-expresadas con uno o más agentes ¡que 1 interfieren con la expresión de modificadores de respuesta . . ' · ' ' i-biológica, es vía inyección de nodo linfático. La inyección de nodo linfático es preferida ya que permite la administración directa- a los órganos, en donde las respuestas inmunes 'son iniciadas y amplificadas de acuerdo con un programa de inmunización optimizado.

Para introducir una composición de vector bicistrónico inmunógeno como se revela en la presente ¡ al sistema .linfático del paciente, la composición | es preferiblemente dirigida a un vaso linfático, nodo linfático, el bazo, u otra porción apropiada del sistema linfático. Una ventaja de los vectores bicistrónicos revelados en la presente es que estos vectores pueden eliminar la necesidad de inyecciones separadas de las moléculas terapéuticas de interés.

En modalidades de la invención, el vector bicistrónico puede i ser usado en un protocolo de cebado/refuerzo (como se revela en r solicitud de patente estadounidense 60/831,256 intitulada "METHOD TO ELICIT, ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNE RÉSPONSES AGAINST MHC CLASS-I RESTRICTED EPITOPES, FOR PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC PURPOSES", que es incorporada en la ' presente j por referencia en su totalidad) en donde la composición de vector bicistrónico es inyectada al nodo linfático inguinal seguido por una administración subsecuente de un antigeno de péptido como un bolo. En algunas modalidades, uno o más componentes pueden ser administrados mediante infusión, en" general durante , 1 varias horas a varios días. Preferiblemente, la composición es' dirigida a un nodo linfático, tal o axilar al insertar ' un catéter o aguja al nodo y mantener el catéter o aguja en toda la administración. Agujas o apropiados están disponibles que son fabricados de plástico (por ejemplo, poliur.etano, cloruro de poliviriilo (PVC) , TEFLON, polietileno y los semejantes). Al .insertar el catéter o aguja al nodo inguinal, por ejemplo el nodo inguinal es perforado bajo control ultrasonográfico utilizando una cánula Vialon™ Insyte W™ y catéter de 24G3/ (Becton Dickinson, USA) que es fija utilizando un aposito transparente de Tegaderm™ (Tegaderm™, St. Paul, MN, USA); este procedimiento es efectuado en general por. un radiólogo experimentado. ! La · ' .' ' ' i ubicación de la punta del catéter al interior del nodc linfático inguinal es confirmada mediante inyección de, un volumen mínimo de solución salina, que inmediata y visiblemente incrementa el tamaño del nodo linfático. El último , · i - i procedimiento permite la confirmación de que la punta está en el interior del nodo. Este procedimiento puede ser efectuado para asegurar que la punta no se desliza hacia fuera del nodo linfático y puede ser repetido en varios días después del • implante del catéter. En el caso de que la punta se resbale fuera del sitio* al interior del nodo linfático, un nuevo catéter puede ser implantado.

Las composiciones terapéuticas revelada en ¡ la' i ' presente pueden ser administradas a un paciente de manera I consistente con protocolos de administración dé vacunas i ' estándar que son bien conocidos para aquel de habilidad ordinaria en el arte. Métodos de administración de modalidades de de composición de vector bicistrónico inmunógenas dé la presente invención comprenden uno o más agentes profilácticas o i terapéuticos con uno o más agentes ' que interfieren con la expresión de modificadores de respuesta biológica incluyen,! sin limitación: administración transdérmica, intranodal, perinodal, I oral, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, muco'sal y .administración mediante inyección o instilación o inhalación. Métodos particularmente útiles de administración de vacunas para producir una respuesta de! CTL son revelados en la patente Autraliana No. 739189; patentes estadounidenses Nos. 6., 994, 851 y 6,977, 074 ambas intituladajs "A METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE", cada una. de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad.

Es útil considerar varios- parámetros en : la i administración o administración de composición inmunógena de vector bicistrónico a un sujeto. Además, -se. puede empl programa de régimen de dosificación y programa de inmunización.

En general, la cantidad de los componentes en la composición terapéutica variará de paciente a paciente, de agente terapéutico a agente terapéutico y de modificador de respuesta biológica a modificador de respuesta biológica, dependiendo de factores tales como: la actividad . del agente terapéutico o modificador de respuesta biológica para inducir una respuesta; la velocidad de flujo de la linfa a través del sistema ¡ del paciente; el peso y edad del sujeto; el tipo de enfermedad ! y/ó condición que es tratada; la severidad de la enfermedad o condición; intervenciones terapéuticas previas o concurrentes;. la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos; el grado de protección deseada; la maneraj de administración y los semejantes, todos-, los cuales pueden rser determinados fácilmente por el técnico experimentado. ' • En general, las composiciones terapéuticas de' la invención pueden ser administradas a una velocidad de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 microlitros/hora o de aproximadamente- 24 a aproximadamente 12,000 microlitros/dia . La concentración de la composición terapéutica es de tal manera que aproximadamente 0.1 microgramos a aproximadamente 10^ 000. microgramos de la composición terapéutica serán administrados durante un periodo de 24 horas. La velocidad de flujo éstá basada en el conocimiento de que, en cada minuto, aproximadamente 100 a fluido linfático .fluye a adulto. Un objetivo es maximizar la concentración local de la formulación de vacuna .en el sistema linfático. Una cierta cantidad de investigación empírica en pacientes. se lleva a cabó para determinar el nivel más eficaz o' nivel óptimo de infusión ' para una preparación de vacuna dada en humanos . · En "una modalidad, la composición inmunogénica revelada en la presente puede ser administrada como una pluralidad de dosis secuenciales . Tal pluralidad de dosis puede ser de 2, 3, 4, 5, 6 o más dosis como se encuentre efectiva^. En I algunas modalidades, las dosis de las composiciones bicistrónicas inmunógenas reveladas · en la presente son administradas en el transcurso de aproximadamente días entré sí y/o de un' refuerzo de péptido a linfáticos inguinales 'derecho o izquierdo. Puede ser deseable administrar la pluralidad de dosis de la composición de vector bi.cistrónico inmunógeno y/o de un. refuerzo de péptido de la invención a un intervalo dé días, en donde un lapso de varios días (?,' 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 o más días) entre administraciones subsecuentes. En otras instancias, puede ser deseable ¡,que administraciones subsecuentes de las composiciones de ' la invención sean administradas vía inyección- de nodo linfático inguinal bilateral en el transcurso de aproximadamente 1, 2, 3, , I ' o más semanas o en el transcurso dé aproximadamente 1, 2, 3 o más meses enseguida de la administración de dosis inicial, i La administración puede ser de cualquier manera compatible con la formulación de dosificación y en tal cantidad como será terapéuticamente efectiva. Una cantidad efectiva o dosis dé' modalidades de composición inmunogénica de la presente invención es aquella cantidad que se encuentra que proporciona una respuesta deseada en el sujeto a ser tratado. ·,.

Kits ! Cualquiera de las composiciones descritas en la presente pueden ser ensambladas conjuntamente en un kit. Más en particular, todos o un subconjunto de los componentes para diseñar y construir modalidades de vector bicistróríico de la presente invención pueden ser empacados conjuntamente en un i kit. El uno o más agentes terapéuticos y el uno o más agentes co-expresados que interfieren con la expresión de modificadores i de respuesta biológica pueden ser empacados separadamente o conjuntamente. En algunas modalidades, es preferible empacar el plásmido junto con el uno o más. agentes terapéuticos o el urio o más agentes co-expresados que interfieren con la éxpresión de modificadores de respuesta biológica. En modalidades de¡ la invención, las proteínas terapéuticas, péptidos, polipéptidos, epítopos o ácido nucleico que codifica tales pueden, jser empacados conjuntamente o como moléculas individuales o como un ? conjunto de moléculas. En algunas modalidades, el uno o más agentes co-expresados que interfieren con la expresión! de modificadores de respuesta biológica pueden ser empacados conjuntamente o como moléculas individuales o como un conjunto i i de moléculas. En algunas modalidades, la una o más moléculas terapéuticas y el uno o más ' agentes co-expresados ¡ que interfieren con la expresión de modificadores de respuesta biológica' pueden ser empacados conjuntamente en un kit. Alternativamente, las composiciones reveladas en la presente I pueden ser empacadas y vendidas individualmente junto 1 con instrucciones en forma impresa o en medios que- se pueden leer por máquina, que describen como pueden ser usadas en conjunción entre si para diseñar y construir un vector bicistrónico, como se revela en la presente, para uso como un terapéutico.

En un ejemplo no limitante, uno o más agentes o reactivos para diseñar o construir un vector de terapia genética como se revela en la presente pueden ser provistos en un kit solo o en combinación con agentes o reactivos adicionales para el tratamiento de una enfermedad o condición, tal cómo cáncer. Sin embargo, estos componentes no se proponen ser limitantes. En algunas modalidades, · los equipos proporcionarán un medio de recipiente apropiado para almacenar y distribuir los agentes o reactivos.

En algunas modalidades, el equipo puede contener,' en un medio de recipiente apropiado, ; una o más moléculas terapéuticas y/o. uno o más agentes que interfieren corí la expresión de modificadores de- respuesta biológica y un vector 1 tal como, por ejemplo, un plásmido de pSEM e instrucciones para diseñar y construir un vector bicistrónico.' En una modalidad-, el equipo puede tener un solo medio de recipiente y/o puede tener distintos medios de recipiente para compuestos adicionales tales como una formulación inmunológica/terapéutica I efectiva de uno o más agentes terapéuticos para el tratamiento de una enfermedad o condición debido por ejemplo a j , una enfermedad proliferativa tal como cáncer. En algunas modalidades, el equipo puede contener además, en medios de recipiente apropiados, el uno o más agentes co-expresados que interfieren con la expresión de modificadores de respuesta, biológica, cada uno en un medio de recipiente separado o 'como un conjunto en un solo medio de recipiente. i 'En donde los componentes del kit son provistos .en una o más soluciones liquidas, la solución liquida es una solución acuosa, cori una solución acuosa estéril que es particularmente preferida. Las composiciones pueden también ser formuladas i como una composición administrable y/o inyectable. En tales modalidades, los medios de recipiente pueden ser por si mismos ser una jeringa, pipeta . y/u otros de tales aparatos, de los cuales la formulación puede ser administrada o inyectada ' a un , Í sujeto y/o aun aplicada a y/o mezclada cori los otros componentes del kit. En algunas modalidades, los componentes ! I ' . ¦ i del kit pueden ser provistos como polvos secos. Cuando i los componentes (por ' ejemplo, reactivos) son provistos como un polvo' seco, el polvo puede ser reconstituido mediante la adición de un solvente apropiado. Se contempla que el solvente puede también ser provisto en otro medio de recipiente. ¡ En algunas modalidades, el plásmido puede ser vendido junto con la proteina profiláctica o terapéutica, péptlido., i epitopo o ácido nucleico que codifica tal y/o el (los) agente (s) que interfiere (n) con la expresión de modificadores i de respuesta biológica. En algunas modalidades, conjunto's de i I proteínas profilácticas o terapéuticas, péptidos, epítopbs o I ácidos nucleicos que codifican tales pueden"* ser vendidos conjuntamente sin el. plásmido. Conjuntos de una molécula correspondiente al agente que interfiere con la expresión de modificadores de respuesta biológica pueden ser venclidos conjuntamente sin el plásmido.- ' '¦ Los medios de recipiente incluirán en general por lo menos un frasco, tubo de ensayo, matraz, botella, jeringá y/u i . ¦ otros medios de recipiente, a los cuales el vector bicistrpnico i que comprende: uno o más agentes profilácticos o terapéuticos y uno o más agentes que interfieren con . la expresión de modificadores de respuesta biológica pueden ser colocados. El kit puede también comprender segundos medios de recipiente' para contener una solución reguladora del pH estéril, aceptablé farmacéuticamente y/u otro' diluyente.' En algunas modalidades, el kit puede ¦ también, incluir medios para contener ; los . ' I materiales para llevar a la práctica los métodos revelados' en la presente y cualesquier otros recipientes de reactivo: en confinamiento estrecho para venta comercial. Tales recipientes pueden incluir, por ejemplo, .recipientes de plástico moldeados por inyección o moldeados ' por soplado a los cuales los frascos deseados son retenidos. Sin consideración del número o tipo de recipientes, el (los) kit(s) de la invención puede (n) también I comprender o ser empacados con un instrumento .para ayudar : con la inyección/administración del vector bicistrónico ; que comprende: uno o más agentes profilácticos o terapéuticos . y , uno o más agentes que interfieren con la expresión de modificadores de respuesta biológica,- dentro del cuerpo de un sujeto. ¡Tal instrumento puede ser, por ejemplo, pero no limitado a -una jeringa, bomba y/o cualquiera de tales' vehículos de administración aprobados médicamente.

Habiendo descrito la invención en detalle, será evidente que son posibles, modificaciones, variaciones y modalidades equivalentés son desviarse del alcance de j la : l invención definidos en las reivindicaciones adjuntas. Además, se debe apreciar que todos los ejemplos en la presente revelación son provistos como ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos no limitantes son provistos ¦ para ilustrar adicionalmente modalidades de l revelada en la presente. ' Se debe apreciar por habilidad en el arte que las técnicas reveladas en los ejemplos que siguen representan procedimientos que se -ha encontrado que funcionan bien en la práctica de . la invención y considerar que constituyen ejemplos de modos para Sin embargo, aquellos de habilidad en el arte, a presente revelación, apreciarán que se pueden efectuar : muchos cambios en las modalidades especificas que son reveladaL y todavía obtener un resultado semejante o similar sin desviarse del espíritu y alcance de la invención.

INMUNÓGENO Y ARNi j La estructura y construcción- del plásmidoj y construcción del plásmidp de pSEM (también conocido como pMÁ2M ) han sido previamente reveladas1 (patente de solicitud de patente estadounidense 20030228634 y publicación de patente ! PCT WO 03/063770) . Brevemente, el plásm.ido pSEM codifica j un polipéptido con un epítopo de CTL A2-específico de -JHLA ELAGIGILTV ( SEQ ID NO.'' 1) de Melan-A26-35 A27L y una porción (aminoácidos 31-96) de Melan-A ( SEQ ID- O . 2 ) que incluyen ! los grupos de epítopos en los aminoácidos 31-48 y 56-69. Estos grupos fueron revelados previamente en la solicitud de patente ¦ estadounidense No. 09/561,571, presentada el 28 de abril de 2000 intitulada EPITOPE CLUSTERS, que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad.. Flanqueando el epitopo , s de CTL de elan-A definido se encuentran secuencias j de aminoácidos cortas derivadas de tirosinasa humana (SEQ ID NOs : 3 y 4) para facilitar la liberación del epitopo j de mantenimiento de Melan-A mediante procesamiento mediante el inmunoproteasoma . Además,, estas secuencias de aminoácidos representan epitopos de CTL potenciales por si mismas.¡ La secuencia de 'ADN para el polipéptido en el plásmido está bajo el control de la secuencia de promotor/mejorador ' del citomegalovirus (CMVp) , que permite la transcripción eficiente del mensajero para el polipéptido después de la absorción! por. las APC. La señal de poliadenilación de hormona de crecimiento bovino . (BGH polyA) en el extremo 3' de la secuencia^ de codificación proporciona una señal para la poliadenilaciónj del mensajero para incrementar su estabilidad, también como para translocación fuera del núcleo al citoplasma para traducción.

Para ' facilitar el transporte del plásmido al núcleo después de la absorción, una secuencia de importación nuclear (NIS) de virus 40. de simio (SV40) ha sido insertado en la cadena fundamental del plásmido. El plásmido porta dos copias de; una porción inmunoestimulatoria CpG, una en la secuencia de NÍS y una en la cadena fundamental del plásmido. Finalmente, ' dos elementos genéticos procariónticos en el plásmido ; son responsables para amplificación en E. tcoli, el gen · de resistencia a kanamicina (Kan R) y el origen de replicación bacteriano pMBl . j / La reacción de PCR fue efectuada para amplificar el fragmento para el promotor de U6 y la secuencia de AD de orquilla correspondiente a siARN de GFP utilizando' un pSilencer (Invitrogen) como la plantilla. El fragmento resultante fue ligado entre los sitios BspH. y BstE I en el j extremo distante del promotor de CMV para generar pSEM-U6fGFP para ser usado como testigo para el efecto lejos del objetivo de ARNi (fig. 1). Subsecuentemente, la secuencia correspondiente a siRNA para' Melan-A y otras moléculas I sepultadas fue usada para sustituir la sexcuencia correspondiente a la orquilla. para siARN GFP, dando pomo resultado la generación del plásmido pSEM-U6-Melan-A a | ser usado como control interno para AR i. Las secuencias de los; dos plásmidos mencionados anteriormente pSEM-U6-GFP y pSEM-U6-Melan-A son reveladas como SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente. · '. i I EJEMPLO 2 DESACTIVACIÓN IÑ VITRO EN UN SISTEMA DE SOBREEXPRESIÓN Células 293T HEK fueron trasfectadas con un que expresa totalmente pcDNA-Malan-A - son solo o cotransfectadas con pSEM-U6-Melan-A, pSE -U6-GFP, siARN para Melan A o siARN de control, respectivamente. Cuarenta y ocho ' i · horas post-transfección, las células fueron, cosechadas y se prepararon Usados celulares y fueron sometidos a SDS-PAGE e inmunoabsorción . Los efectos de desactivación de varios siARN y plásmidos bicitrónicos fueron evaluados (fig. 2). La ¡ co-transfección de siARN específicos para Melan-A dio 'como resultado una 'disminución significativa en el nivel! de expresión de Melan-A en células transfectadas, con el efecto de desactivación siendo de- más del 90%. En células transfectadas con pcDNA-Melan-A y pSEM-U6-Melan-A, se estima que el efecto de desactivación sobre la expresión Melan-A es del 80 - ! 90% .

También se observó una ligera reducción en el nivel de expresión de Melan-A en muestras de células co-transfectadas con plásmidos que expresan a Mela-A y pSEM-U6-GFP o siARN de control, respectivamente. , EJEMPLO 3 DESACTIVACIÓN ?? VIVO DE EXPRESIÓN DE ANTÍGENO CONDUCE A UNA RESPUESTA INMUNE ABOLIDA r Cinco grupos de ratones transgénicos HHD (n=10/grupo) fueron inmunizados con plásmidos (pSEM, pSEM—U6—GFP, pSEM—U6— Melan-A) mediante inyección directa a los nodos linfácticos inguinales de 25µg en 25µ1 de PBS a cada nodo linfático en el día 1 y 4. Ratones recibieron un segundo grup.o de inyecciones de ADN diez días después, 'en el día 11 y día 14 e inyección del péptido de A27L de Melan-A26-3s .(1 mg/ml) en el día 24 y 37 (fig. 3). Se aisló sangre periférica de ratones individuales vía sangrado retro-orbital y las células mononucleares fueron · separadas de las células de sangre roja enseguida, de / centrifugación de densidad (Lympholyte ammal, Cedarlane Latos) .

La respuesta de CTL específica en animales inmunizados , fue cuantificada mediante co-teñido de células mononucleares! con HLA-A2.1 MART-I26-35 (ELAGIGILTV) -APC, y FITC anticuerpo monóclonal CD8a' anti-ratón de rata FITC conjugado (Ly-2) j (BD Biosciences) por 1 hora á 40°C. Los datos fueron recolectados utilizando un citómetro de flujo FACS Calibur ( BD Biosciences ) y analizados utilizando elemento de programación de CellQue.st mediante compuertas sobre la población de linfocitos y cálcalos I del porciento de células de tetrámero+ dentro de la pobla'ción de CD8+. Los valores representan el promedio de tetrámero+ +/-SEM dentro de cada grupo y fueron comparados con controles de carnada naturales (fig. 4) . ¡ EJEMPLO 4 DESACTIVACIÓN IN VIVO DE EXPRESIÓN DE ANTÍGENO EN RATONES DE i CONTROL NATURALES Como se ilustra en la fig. 4, la inmunización con el I plásmido padre, pSEM, dio' como resultado una respuesta detectable en ratones demostrado por la presencia de células CD8+ T Melan-A 26-35-especí ficas al .7% después dej la inmunización del plásmido' solamente. El porcentaje de1 tales células se implemento significativamente en ratones después: del refuerzo con la inyección de péptido , de Melan-A, a más del! 40% de células de CD8 totales. En contraste, las células 1 CD8 positivas de tetrámero de referencia ' fueron detectablésj en- ratones inmunizados con plásmido, pSEM-U6-Melan-A, pre- y pbst- refuerzo de péptido. Esto indica que la expresión de inhibida en células que presentan antigeno que han pSEM-U6-Melan-A y que tal expresión antigeno inmunizada por plásmido es esencial para la inducción de respuesta inmune en un régimen de cebado-refuerzo. En ratones inmunizados con pSEM- posiblemente debido a la activación de la ruta a¡ de MAK/interferón asociada con dsARN. Sin embargo, una respuesta significativa (20% de células de CD8 positivas de tetrámero') de estos ratones después del refuerzo del péptido verijfica adicionalmente la importancia de la expresión antigeno ! del plásmido durante el evento de cebado. i , I EJEMPLO 5 ANALISIS DE ELISPOT DE LA DESACTIVACIÓN IN VIVO DE ANTÍGENO EN RATONES En lugar de medir la citotoxicidad, la respuesta de ¦ CTL de CD8+ puede ser brindada al medir la producción de. IFN-? mediante células efectoras especificas en un análisis de ELISPOT. En este análisis, células que presentan, antigeno (APC) son inmovilizadas sobre la superficie de plástico de una cavidad de microtitulo y se agregan células efectoras a varias ' i ¦ proporciones de efector : objetivo . El enlace- de las APCs mediante células efectoras antigeno-especificas disparani la , I producción de citocinas que incluyen IFN-? por las células efectoras . Las células pueden ser teñidas para detectarj la ¦ presencia de IFN-? intracelular y el número de focos (puntos) teñidos positivamente contados bajo un microscopio. j Para · análisis de ELISPOT, todos los animales inmunizados fueron sacrificados 7 días después de inyección final del péptido. El análisis de ELISPOT fue llevado a cab al medir la frecuencia de colonias que forman puntos que producen IFN-? (SFC). Brevemente, los vasos fueron aislados de animales i sometidos a eutanacia y las células mononucleares, después de centrifugación por densidad .(Lympholyte Mammal, Cedar'lane Labs), fueron resuspendidas en un medio de HL-1. ; Los esplenocltos (5 xlO5 o 2.5xl05 células por cavidad) fueron incubadas con 10 g del péptido A27L de Melan-A26-35¡ en cavidades por triplicado de placas de membrana de filtro de 96 cavidades (placa de 96 cavidades de membrana IP de Mujlti- ! tamizada, Millipore) . Las muestras fueron incubadas durante 42 hours a 37°C con 5% de C02 y 100% de humedad antes ¡ del revelado. El anticuerpo de' recubrimiento de IFN-? (para de anticuerpo de IFN-?, U-CyTech Biosciences) fue usado antes de ¦ I la incubación con esplenocitos, seguido por anticuerposj de I detección biotinilados acompañante. El conjugado de GABA y substratos patentados de U-CyTech Biosciences fueron usados para el revelado de la mancha de IFN-?. La respuesta de CTL' en animales inmunizados fue medida 24 horas después del revelado i sobre un lector de places AID International utilizado ¡ los, elementos de programación ELISpot Reader versión 3'.2.3 calibrada para el análisis 'de punto de IFN-?. . !¦ Los resultados . como se ilustra en la figura 5 muestran el conteo promedio de. puntos IFN-? para cada grupo experimental. Se observó una disminución de tres veces en el c'onteo de puntos en las muestras de ratones inmunizados | con pSEM-U6-Melan-A en comparación con aquellos ratjones inmunizados con' pSEM-U6-GFP (p=0.002) . Este resultado] se 1 j correlaciona con aquel análisis de tetrámero, sugiriendo que, carentes de expresión de antígeno. durante el cebado ¡ del plásmido elimina significativ antigeno-especifica, cuanti cualitativamente.

EJEMPL CONTROL DE AUTOINMÜNIDAD UTILIZAN Al formar la sinapsis célula T reconoce complejos de superficie de APC. La activación de célula T también requiere una señal co-simulatoria que involucra interacción de células T con genes de la familia de B7 sobre las APC. Además, | las citoqu nas de señal 3 recién definidas (IL12 o IL-lb) pu!eden ser útiles para la función efectora de células T.

Un vector bicistrónico r población de células T tolerizadas y/o células reguladoras T para el control de autoinmunidad . Al transíectado. pAPC con un vector bicistrónico que co-expresa un autoantigeno y in ARNi que reduce o regula descendentemente una señal co-estimülat'oria (señal 3) o molécula pro-inflamatoria, la atenuación' de activación de célula T puede ser obtenida por medioj de interferencia con la sinapsis inmunológica, conduciendo a la i activación de células T reguladoras y/o células T tolerizadas y/o células T en estado de anergía. ' ; • ' i Un vector bicistrónico es diseñado e incluye ¡ una i secuencia de cADN para un autoantigeno que es colocado bajo el control de la secuencia .de promotor/mej orador ¦¦ del citomegalovirus (CMVp) , que permite la transcripción eficiente del mensajero para el autoantigeno después de la absorció por células tales como APCs .. Además, el vector bicistrónico incluye una secuencia correspondiente a un silenciar, inhibir o regular descendentemente la una molécula de. B7, que es colocada bajo el control de un promotor U6. · ' j I ! j La administración del vector bicistrónico es usado para tratar enfermedades o aflicciones tales como diabetes tipo 1 y esclerosis múltiple.

EJEMPLO 7 PROMOCIÓN DE ACTIVIDADES CTL AL REGULAR LA RUTA REGULATORIA j T Un vector bicistrónico es diseñado e incluye j una una secuencia correspondiente a un siARN dirigido contra j una molécula de B7, que es colocada bajo el control de un promotor de"U6. ; El vector bicistrónico es administrado como ' una composición farmacéutica a uria población de pacientes diagnosticados con cáncer. Un segundo vector que contiene, una secuencia de ácido nucléico que codifica elan-A26-35 qué no contiene siARN para silencia las células reguladoras de T es administrado como una composición farmacéutica a una segunda i población de pacientes diagnosticados con cáncer. Un tercer vector que no contiene no cistrón (Melan-A26-35 y siARN contra células reguladoras T) es administrado como una composición I farmacéutica a una tercera población de pacientes diagnosticados' con cáncer. Se observa que la población á la cual el vector bicistrónico fue administrado exhibe ¡una i i respuesta de CTL contra Melan-A26-35 que es significativamente mayor que aquella observada en las otras poblaciones j de pacientes. !' i EJEMPLO 8 i i citomegalovirus (CMVp) . Además, el vector bicistrónico incluye una secuencia correspondiente a un siARN para silenciar, I inhibir ¦ o regular ' descendentemente la .actividad inmunoproteasomal en células que presentan antigeno (APCs), que es colocado bajo el control de un promotor de ué. La señaJj de poliadenilación de hormona de crecimiento bovino (BGH polyA) en el extremo 3' de la secuencia para el antigeno de péptido Melan-A26-35 A27L proporciona una señal para poliadenilación i del mensajero para incrementar su estabilidad, también como para traslocaciórt fuera del núcleo al citoplasma para traslación. Para facilitar el transporte del plásmido al núcleo después de la absorción, una secuencia de importación nuclear (NIS)Í de virus 40 simio (SV40) ha sido insertada en la cadena fundamental del plásmido. El plásmido porta dos copias de una porción inmunoestimuladora de CpG una en la secuencia de NIS y una en la cadena fundamental del plásmido. Finalmente, ! dos elementos genéticos procariónticos . en el plásmido j son I responsables para amplificación en E. coli, el gen, de i resistencia a canamicina (Kan R) y el origen de replicación bacteriano pMBl . , I ' El vector bicistrónico es administrado como ¦ una composición farmacéutica ' a una población de pacientes diagnosticados con cáncer. Un. segundo vector que contiene i una secuencia contiene e es administrado como una composición farmacéutica a una segunda í población de pacientes diagnosticados con cáncer. Un" tercer i vector que no contiene ni el cistrón (Melan-A26-35 y siARN contra actividad inmunoproteasomal) es administrado como ; una I composición farmacéutica a una tercera población de . pacientes diagnosticados con cáncer. Se observa que la población a¡ la^ cual el vector bicistrónico fue administrado exhibe ; una respuesta de CTL contra Melan-A26-35 que es significativamente mayor que aquella observada en las otras poblaciones ¡ de pacientes.

EJEMPLO 9 USO DE UN VECTOR bicistrOnicO PARA APLICACIONES DE TERAPIA GENÉTICA Un vector bicistrónico es diseñado e incluye secuencia para el antigeno del péptido Melan-A26-35 A27L colocado bajo el control de la secuencia del promotor/mejorjador de citomegalovirus (CMVp) . Además, el vector bicistrónico incluye una secuencia correspondiente a un siARN para silenciar, inhibir o regular descendentemente ! ADN metiltranferasa en células objetivo a las cuales el vector es suministrado, colocado bajo control de un promotor U6. La s,eñal de poliadenilación de hormona de crecimiento bovino (BGH po'lyA) I en el extremo 3 ' de la secuencia para el antigeno del péptido Melan-A26-35 A27L proporciona una señal para poliadenilación! del i mensajero par incrementar su estabilidad, también como para ! traslocación fuera del núcleo al citoplasma para traducción. Para, facilitar, el transporte del plásmido al núcleo despuéjs de la absorción, se ha insertado una secuencia de importación nuclear (NIS) de virus 40 simio (SV40) en la cadena fundamental i del plásmido. El plásmido porta dos copias de una porción inmunoestimuladora de CpG, una en la secuencia de NIS y una en la cadena fundamental del plásmido. Finalmente, dos elementos ! genéticos procariónticos son responsables para amplificación en i E. coli,' el gen de resistencia a canamicina (Kan R) y el origen de replicación bacterianos' pMBl El vector bicistrónico es administrado como | una i composición farmacéutica a una población de pacientes diagnosticados con cáncer.. Un segundo vector que contiene una secuencia de ácido hucléico que> codifica Melan-A2s-35 que no contiene, el siARN para inhibir la actividad de la ADN metiltranferasa es administrado como una composición farmacéutica a una segunda población de pacientes diagnosticados con cáncer. Un tercer vector que no contiené ni el cistrón (Melan-A26-35 y siARN contra la actividad de : ADN metiltranferasa ) es administrado como una composición farmacéutica a . una tercera población de pacientes '. . ?· diagnosticados con cáncer. Se observa que la población á la cual el vector bicistrónico fue administrado exhibe ; una respuesta para CTL sostenida y persistente contra Melan-A I26-35 que es significativamente mayor que aquella observada enj las otras poblaciones de pacientes. J I Todas las referencias mencionadas en la presente l son incorporadas por referencia en su totalidad. Además, modalidades de la presente invención pueden utilizar varios aspectos de la siguiente, que son todos incorporados ¡ por referencia en su totalidad: solicitud de patente estadounidense No. 09/380,534, presentada el , 1 de Septiembre de 1999, intitulada A METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE; 09/776,232, presentada el 2 de Febrero ' de 2001, intitulada METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE; 09/715,835, presentada el 16¡' de ' i Noviembre de · 2000, intitulada AVOIDANCE OF UNDESIRABLE REPLICATION INTERMEDIATES IN PLASMID PROPOGATION; 09/999,186, presentada el 7 de Noviembre de 2001, intitulada METHODS OF COMMERCIALIZING AN ANTIGEN; y solicitud de patente estadounidense provisional No 60/274,063, presentada el 7 de Marzo de 2001, intitulada ANTI-NEOVASCULAR VACCINES FOR CANCER.

En varios métodos y técnicas descritos anteriormente proporcionan un número de maneras para llevar a caboj la i invención. Por supuesto, se comprenderá que no necesariamente i i todos los objetivos b ventajas descritos pueden ser obtenidos de acuerdo con cualquier modalidad la presente. Asi, por ejemplo, aquellos experimentados en el arte reconocerán que los métodos pueden ser mostrados de una manera que obtiene u optimiza una ventaja o grupo de ventajas como se I ¦ enseñan en la presente, sin obtener necesariamente otros objetivos o ventajas como se pueden enseñar o sugerir en la I presente. Una variedad de atractivas ventajosas.; y desventajosas, como se menciona en la presente. Se comprenderá que algunas modalidades preferidas incluyen específicamente una, otras o varios elementos ventajosos, mientras excluyen específicamente uno,. otros o varios desventajosos, en' tanto que todavía otros mitigan . . . i específicamente un elemento deventajosos presente mediante inclusión de uno, otro o varios elementos ventajosos. j i Además,. el técnico experimentado reconocerá j la aplicación de varios elementos de diferentes modalidades . ¦ í Similarmente, los varios' elementos, aspectos y 'etapas discutidos anteriormente, también como otros conocidos para cada uno de los elementos, aspectos o etapas, pueden ¡ser mezclados y hacerse coincidir por aquel de habilidad ordinaria en al arte para efectuar métodos de acuerdo con los principios descritos en la presente. Entre los varios elementos, aspectos y etapas algunos estarán específicamente incluidos y ' otros específicamente excluidos en diversas modalidades.

Aunque la invención ha sido revelada en el contexto de ciertas modalidades y ejemplos, se comprenderá por aquellos experimentados en el arte que las modalidades de ' la inven'ción se extienden más ' allá de las modalidades revéijadas específicamente a otras modalidades alternativas y/o usos y modificaciones y equivalentes de los mismos. , Muchas variaciones y elementos alternativas han .sido revelados en modalidades de la presente invención. Todavía variaciones adicionales y elementos alternativos serán evidentes para aquel de habilidad en el arte. Entre estás variaciones, sin limitación, están el número específico de antígenos en un panel de de selección o apuntados por un producto terapéutico, el tipo de antígeno, el tipo de cáncer y ' | el (los) antígeno (s) particular (es) especificado (s) . Varias ¦ t i modalidades de la invención pueden incluir o excluir específicamente cualquiera de estas variaciones o elementos!.

En algunas modalidades, ' los números que expresan cantidades de ingredientes, propiedades tales como ipeso molecular, condiciones de reacción y así selectivamente, usados •para describir y reivindicar ciertas modalidades de la invención, se comprenderá que son modificados en algunas i . instancias por el término "aproximadamente". Asi, en algunas modalidades, los parámetros numéricos resumidos en la descripción escrita y reivindicaciones adjuntas ¡ son aproximaciones que ¦ pueden cambiar dependiendo de las propiedades y a las que se busca obtener por una modalidad particular. En algunas modalidades, · los parámetros numéricos deben ser interpretados a la luz del número de dígitos significativos reportados y mediante la , aplicación de técnicas de redondeo' ordinarias. A ' pesar de que los intervalos fijos t parámetros resumen el amplio alcance de algunas modalidades de la invención . son aproximaciones, 1 los valores numéricos resumidos en los ejemplos, específicos son reportados J tan precisamente como sea practicable. Los presentados en algunas modalidades de la contener ciertos errores resultantes necesariamente mediante la desviación estándar encontrada en sus respectivas medicione's de prueba. . j i En algunas modalidades, los términos "uno" y "un" y "el" y referencias similares usados en el contexto de describir una modalidad , particular de la invención (especialmente . en el contexto de ciertas de las siguientes reivindicaciones) pueden ser interpretados para cubrir tanto el¦ singular como el plural. i i Las citas de intervalos de valores en la presente solamente se propone servir como un método corto para referirse I 85 • ' ! individualmente a cada valor separado que- cae dentro , del intervalo. A no ser que se indique de otra manera la presente, cada valor individual es incorporado la especificación como si se sintetizara individualmente en la ' claramente por el contexto. El uso de cualquiera y todos! los 1 ! ejemplos o lenguaje ejemplar (por ejemplo, "tal como") provisto con respecto a ciertas modalidades en la presente se proponen solamente iluminar mejor la invención y no plantea una I ' . I limitación en cuanto al alcance de la invención reivindicada de i otra manera. Ningún lenguaje en. la especificación debe | ser estructurado que indica cualquier elemento no reivindicado i esencial para la práctica de la invención. ¦ j El agrupamiento de elementos o modalidades alternativas de la invención revelada en la presente no serán, "interpretados como limitaciones. Cada miembro del grupo óuede ser designado y reivindicado individualmente o en cualquier \ combinación con otros elementos del grupo u otros elementos encontrados en la presente. Uno o más miembros de un grupo pueden estar incluidos en o cancelados de un grupo por razones de conveniencia' y/o patentabilidad . Cuando cualquiera de tal inclusión o cancelación ocurra, la especificación es juzgada en i la presente que contiene grupos tal como es modificado' que I. satisface asi la descripción escrita de todos los grupos de Markush usados en las reivindicaciones adjuntas.

Modalidades preferidas de la invención son descritas en la presente, en las que se incluyen el mejor modo conocido para los inventores para llevar a cabo la invención. Variaciones en aquellas modalidades preferidas se harán evidentes para aquellos de habilidad ordinaria en el arte en la lectura de la descripción anterior. El técnico experimentado puede emplear tales variaciones como sea apropiado yj la invención se puede llevar a la práctica .de otra manera que jcomo se describe específicamente en la presente. Asi, muchas modalidades de esta invención incluyen todas las modificaciones y equivalentes dé la materia citada en las reivindicacijones adjuntas a- la presente como es permitido por la ley aplicable. Además, cualquier combinación de los elementos · descritos anteriormente en todas las variaciones posibles de las mismas es abarcada por la invención a no ser que se indique de 'otra manera en la presente o de otra manera sea contradicho claramente por . el contexto. ¦ Además, numerosas referencias se han hecho a patentes ¦ ¦ - I . y publicaciones impresas en toda esta especificación. Cada una de las referencias citadas anteriormente y publicaciones impresas son incorporadas individualmente en la presentej por referencia en su totalidad. j ' En el cierre, se comprenderá que las modalidades de la invención reveladas en la presente son ilustrativas de j los principios de la presente invención. Otras modificaciones . que pueden ser empleadas pueden estar dentro del alcance de la invención. Asi, a manera de ejemplo, pero no limitación, configuraciones alternativas de ' la presente invención pujeden ser utilizadas de acuerdo' con las enseñanzas de la presente. Asi, las modalidades de, la presente invención no ejstán • ! i limitadas a aquellas precisamente como se muestra o describ .

Claims (41)

REIVINDICACIONES

1. Un vector que comprende por' lo menos j dos cistrones, caracterizado porque un primer cistrón comprende un primer promotor y una primera secuencia de ácidos nucleicos | que i codifica uno más agentes terapéuticos y en donde un segundo cistrón comprende un segundo promotor y una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica una- o más moléculas de ARN; que interfieren con ,1a expresión de un modificador de respuesta biológica o el agente terapéutico, en donde la expresión de la primera secuencia está bajo el control del primer promotor la expresión de la segunda secuencia está bajo el control ¡ del segundo promotor.

2. El vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el vector es un vector de plásmido ó un vector virañl.' 1 | I

3. El vector de conformidad con la reivindicación! 1 o 2, caracterizado porque ' el promotor, es una secuencia! de i promotor/mej orador enlazada operativamente. . !

4. El vector de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el promotor/mejórador es una secuencia de promotor/mej orador de CMV.

5. El vector de conformidad con cualquiera las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la una más moléculas de ARN que interfieren con la expresión un modificador de respuesta biológica es una ARNi/ una siARN o¡ una shARN . vector de conformidad con .cualquiera de reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el segundo promotor es una secuencia de promotor U6. i

I

7. El vector de conformidad con cualquiera de 1 las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el modificador de i respuesta biológica está involucrado en el control o regulación I: de una respuesta inmune, procesamiento y presentación' de antigeno o silenciamiento genético. !

8. El vector de conformidad con la reivindicación 7, i caracterizado porque el modificador de respuesta biológica involucrado en controlar o regular una respuesta inmune es seleccionado del grupo que consiste de.: una citoquina, j¦ una quimiocina, una molécula co-estimuladora, una proteina de punto i de verificación, un factor de transcripción y una molécula de transducción de. señal. ; j

9. El vector de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el modificador de respuesta biológica involucrado en el procesamiento y presentación' de antigen es seleccionado del grupo que consiste de: una proteina de TAEj, un proteasoma inmune, proteasomas convencionales, [ una i ' ' microglobulina ß2, una molécula de MHC clase I y una molécula de MHC clase II.

10. El vector de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el modificador de respuesta biológica involucrado en el silenciamiento genético es seleccionado ¡ del i grupo que consiste de agente de metilación- de ADN, una molécula de control de cromatina y una molécula reguladora de ARN.

11. El vector de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el factor de transcripción es T-bet, STAT- 1, STAT-4 o STAT-6. I

12. El veqtor de conformidad con la' reivindicación 8,

I caracterizado porque la citóquina es IFN-OÍ, IFN-?, IL-10, , IL-18m, IL-12 o TGF-ß . . ¡- 13. El vector de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el factor de coestimulación es CD40, jB7.1 o B7.2. ' I

14. El vector .de conformidad con la reivindicación 8,' caracterizado porque la proteína de punto de verificación es ¦ · I F0Xp3 o moléculas semejantes a B7. · .

15. El vector de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque las moléculas de procesamiento y i presentación de antígenos es una molécula de MHC clase I,j una molécula de MHC clase II o una proteína de TAP. i

16. El vector de conformidad con cualquiera de las ¡ . reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque el modificador de respuesta biológica es un TLR o una molécula de señalización corriente abajo de TLR. !

17. El vector de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la molécula de señalización corr'iente debajo de TLR es MyD88 o NFK-B. . . ' ; '

18. El vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque el modificador de respuesta biológica es un ligando de LAG-3. ;, 5 -

19. El vector de conformidad con cualquiera de' las •reivindicaciones- 1 a 18, caracterizado porque el modificador de respuesta biológica es el supresor de activación . de célula dendritica S0CS1.

20.. El vector de conformidad con la reivindicajción 10. 10, caracterizado porque el agente de metilación de ADN es DMNT1.

' 21. El vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el uno o | más agentes terapéuticos comprenden un inmunógeno. ' 15- 22. El vector de conformidad con la reivindicación 1 I 21, caracterizado porque el inmunógeno es seleccionado i del grupo que consiste de antigenos asociados al tumor, antigenos específicos del tumor, antígenos de diferenciación, antígenos embriónicos, antígenos de cáncer-testículo, antígenos; de 20 oncógenos, genes tumor-supresor mutados, antígenos de tumor

I únicos resultantes de translocaciones cromosomales , antígenos t i virales y fragmentos de los mismos. · ¦ ¦ !

23. El vector de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el inmunógeno comprende un antigeno i 25 específico de tumor o fragmento del mismo. ¡ • i ¦ . . i " ' . i i

24. El vector de conformidad 22, caracterizado porque el inmunógeno asociado al tumor o fragmento del mismo. . I

25. El vector de conformidad con cualquiera ' de | las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado porque el uno, o i'más agentes' terapéuticos es un antigeno de tumor seleccionado del grupo que consiste de Melan-A, tirosinasa, PRA E, PSMA, NT-ESO y SSX-2.

' 26. El vector de conformidad con la reivindicación 21, _ caracterizado porque el inmunógeno consiste esencialmente de Melan-A26-35 o su análogo ELAGIGILTV.

27. Un vector que comprende por lo menos I dos cistroríés, caracterizado porque un primer cistrón comprende un primer promotor y una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica uno o. más ^e ítopos de Melan-A y en donde un segundo cistrón comprende un segundo promotor y una segunda secuencia de ácidos nucleicos que. codifica una o más moléculas de ARN¡ que ¦ I interfieren' con la expresión de un modificador de respuesta ¦ ¦ ' i biológica, en donde la expresión de la primera secuencia está bajo el control del primer promotor y la expresión dej la segunda secuencia está bajo el . control del segundo promotor:'

28. El vector de conformidad con la reivindicación 1 ¦ · ¦ ·' ' ¦ ' ' I' 27, caracterizado porque la una o más moléculas de ARB j que interfieren con la expresión de. un' modificador de respuesta biológica es un siARN de Melan-A. ¡

29. El vector de conformidad con la reivindicación 27 o 28, caracterizado porque el vector es pSEM-U6-Melan-A (SEQ ID NO: 6) . II

30. Un método para diseñar un véctor que comprende : ! por lo menos dos cistrones, < caracterizado porque comprende j colocar un primer promotor, una primera secuencia que codifica uno o más agentes terapéuticos, un segundo promotor y | una i segunda secuencia que codifica una o más moléculas de ARN, que i interfieren con la expresión de un modificador de respuesta i biológica o- agente terapéutico dentro del mismo vector,! en donde la expresión de la primera secuencia está bajo el conjtrol del primer promotor y la expresión de la segunda secuencia bajo el control del segundo promotor. i

31. El método de conformidad con la reivindicajción 30, caracterizado porque el primero y segundo promotorj son seleccionados del grupo que consiste de un promotor sensibjle a tetraciclina, un promotor dé probasina, un promotor de CMV ¡y un promotor de SV40. j

32. El. método de conformidad con la reivindicación 30 o 31, caracterizado porque el vector es un vector de plásmido o un vector viral. j

33. El método de conformidad con la reivindicación i i 32, caracterizado porque el plásmido es seleccionado del grupo que consiste de pSEM, pBPL (SEQID NO: 7) y Proc (SEQ ID NO:! 8) .

34. El método de conformidad - con' la reivindicáción 32 , caracterizado porque el plásmido es el plásmido de

35 . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 34 , caracterizado porque comprende además colocar bajo una secuencia de promotor/mejorados enlazado . ¦¦. i ' operativamente en el vector. ! i

36 . El método de conformidad con la reivindicación 35 , caracterizado porque la secuencia de promotor/mejorador es un promotor de CMV. ¡

37 . El método de conformidad con cualquiera de j las I reivindicaciones . 30-36 , caracterizado porque la segunda secuencia es una secuencia de horquilla de ARNi . v j

38 . El método de conformidad con cualquiera de J las reivindicaciones 30 a 37 , caracterizado porque comprende además colocar por , lo menos un gen reportero, un marcador selecciónatele y un agente con activida inmunomoduladora o inmunoestimulante en el vector. , . '

39 . Una célula mamifera caracterizada porque es transformada con un vector bicistrónico de conformidad con la I reivindicación 1 . i

40 . Una composición terapéutica caracterizada porque ' i i ¦ comprende la composición de vector bicistrónico de conformidad con la reivindicación 1 .

41 . La composición terapéutica de conformidad la reivindicación 40 , ' caracterizada porque comprende además un portador aceptable farmacéuticamente. !.