PREPARACIONES DE FOSFOLÍPIDOS Y COMPONENTES FARMACÉUTICOS QUE CONTIENEN ÁCIDO 5-AMINO SALICÍLICO PARA EL TRATAMIENTO DE UNA ENFERMEDAD INFLAMATORIA DEL INTESTINO DELGADO
SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reclama la prioridad provisional de la Solicitud de Patente Provisional Norteamericana No. 60/831,843 presentada el 07/19/2006 (19 de Julio del 2006), cuyo contenido total está incorporado a la presente descripción como referencia. Campo de la Invención La presente invención se refiere a formulaciones únicas para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria del intestino delgado (IBD), tal como la colitis ulcerativa, que incluyen ácido 5-amino salicílico (5ASA) y un fosfolípido. La presente invención se refiere a composiciones únicas de materias que incluyen 5ASA y fosfolípido adaptado para liberar el 5ASA en el intestino delgado distante y/o colon, en donde las lesiones debidas a la colitis o la Enfermedad Inflamatoria del Intestino Delgado (IBD) están presentes, con el objeto de mejorar la eficacia anti-inflamatoria del 5ASA. En ciertas modalidades, la composición del fosfolípido que incluye de aproximadamente el 15% en peso hasta aproximadamente el 95% en peso de fosfatidilcolina (PC) en un vehículo bio-
compatible y/o resina. La presente invención también se refiere a métodos para elaborar y administrar las composiciones de la presente invención oralmente, de manera entérica y/o de manera rectal. Antecedentes de la Invención Para los antecedentes de los fosfolípidos y las composiciones farmacéuticas anti-inflamatorias, el lector puede referirse a las Patentes Norteamericanas Nos. 4,918,063; 5,043,329; 4,950,656; 5,032,585; 5,763,422; y 5,955,451 y el Documento PCT/US01/51605, incorporados a la presente descripción como referencia. La Enfermedad Inflamatoria del Intestino Delgado (IBD) representa una familia de enfermedades ulcerativas que incluyen Colitis Ulcerativa y la Enfermedad de Crohn que afecta el colon y el intestino delgado distante. Estas enfermedades son manifestadas por episodios de sangrado Gl, diarrea, fiebre, infección y en los casos más avanzados, la formación de fístulas de Gl que son manifestadas mediante la perforación y el cáncer. El 5ASA ha sido utilizado médicamente para administrarlo a los pacientes con IBD, aunque su efectividad para mantener a los pacientes en remisión ha sido limitada. Aunque el 5ASA es un tratamiento efectivo, existe la necesidad en la técnica de preparaciones de 5ASA que tengan una eficacia mejorada para tratar la IBD y para mantener a los pacientes en remisión.
Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona composiciones que incluyen un fosfolípido (PL) y ácido 5-amino salicílico (5ASA). La presente invención también proporciona composiciones que incluyen un componente fosfolípido derivado de soya y un ácido 5-amino salicílico (5ASA) que contiene componentes tales como Mesalamina, Sulfsalazina, Olsalazina, Balsalazida, o mezclas de los mismos. Las composiciones también pueden incluir componentes adicionales, tales como una resina (por ejemplo, Eudragrit®S) para facilitar la liberación del componente que contiene el 5ASA en el intestino distante. La presente invención también proporciona composiciones que incluyen un componente de fosfatidilcolina derivada de soya (PC) y un ácido 5-amino salicílico (5ASA) que contiene un componente tal como Mesalamina, Sulfsalazina, Olsalazina, Balsalazida, o mezclas de los mismos, en donde la PC y los componentes que contienen 5ASA están rodeados o son encapsulados o incrustados en una resina (por ejemplo, Eudragrit®S) para facilitar la liberación de los componentes en el intestino distante. La presente invención proporciona un método para elaborar formulaciones que incluyen un componente 5ASA y un componente fosfolípido. La presente invención también proporciona un método para elaborar las formulaciones que incluyen 5ASA y un
componente fosfolípido enriquecido con PC. La presente invención proporciona métodos para administrar oralmente, entéricamente o rectalmente formulaciones de 5ASA/PL, en donde la administración puede ser una sola administración, una administración periódica, una administración intermitente, o administración de acuerdo con cualquier protocolo de administración (la administración de acuerdo a un programa prescrito, por ejemplo, una vez al día, dos veces al día, etc.). La presente invención proporciona métodos para el tratamiento de pacientes con IBD mediante la administración de una composición de esta invención directamente en una lesión de IBD para reducir la inflamación, mientras: (1) se reduce o previene la ulceración de la lesión, (2) se reduce o previene la ulceración adicional de la lesión, (3) se reduce o cura la ulceración de la lesión, (4) o se mantiene la integridad de las membranas hidrofóbicas y/o las capas asociadas con el intestino delgado distante. Breve Descripción de los Dibujos La presente invención puede ser entendida mejor haciendo referencia a la siguiente descripción detallada junto con los dibujos ilustrativos adjuntos, en los cuales los elementos similares son numerados igual. La figura 1 ilustra una gráfica que demuestra que dándoles a los ratones en el agua para beber concentraciones
aumentadas (del 0% al 4%), de sulfato de sodio dextrano (DSS) durante 4 días, se tiene como resultado una inflamación del colon aumentada como lo indica el peso aumentado del tejido del colon por unidad de longitud. La figura 2 ilustra que las concentraciones crecientes de
DSS en el agua para beber por un período de 4 días induce un aumento dependiente de la dosis en el sangrado del Gl de los ratones medido por la concentración de la hemoglobina fecal. La figura 3 demuestra el consumo de alimentos de los ratones que comen dietas que contienen solamente 5ASA (100 mg/kg de peso corporal) o 5ASA en combinación con preparaciones de 1:1 de PC de soya en tres diferentes bases de peso, P35, P53 ó P75, contienen el 35%, 53% ó 75% de PC, respectivamente. Pero todos menos un grupo marcados con Sal/Sal tenían acceso a agua para beber con un contenido del 3% de DSS para inducir la colitis. La figura 4 demuestra cambios en la inflamación del colon, indicados por el peso aumentado del tejido por unidad de longitud en los ratones alimentados con las dietas experimentales y se les administra un 3% de DSS en el agua de beber para inducir la colitis. La figura 5 demuestra cambios en la pérdida de sangre fecal en ratones alimentados con dietas experimentales con el 3% de DSS en el agua para tomar o inducir la colitis. La figura 6 demuestra los cambios en la mieloperoxidasa
del colon (MPO) en los ratones alimentados por las dietas experimentales en las que se les agregó el 3% de DSS en el agua para beber para inducir la colitis. La figura 7 demuestra cambios en la histología de la mucosa del colon, utilizando una calificación de 0 (normal) a 4 (ausencia completa de estructura glandular de la mucosa) en los ratones alimentados con las dietas experimentales a las que se les agregó el 3% de DSS en el agua para beber para inducir la colitis. La figura 8 ilustra los cambios en los niveles de hematocritos en los ratones machos Sprague Dawley durante un período de recuperación de 6 días después de que el DSS en la solución salina indujo la colitis, en las formulaciones de 5ASA y dos PC:5ASA. La figura 9 ilustra los cambios en la pérdida de sangre fecal en los ratones machos Sprague Dawley durante el período de recuperación de 6 días después de la colitis inducida por el DSS en la solución salina, 5ASA y dos formulaciones PC.5ASA. La figura 10 ilustra cambios en el edema del tejido del colon en los ratones machos Sprague Dawley durante un período de recuperación de 6 días después de la colitis inducida por DSS en la solución salina, y formulaciones de 5ASA y dos PC:5ASA. La figura 11 ilustra los cambios en la actividad del MPO del colon en los ratones machos Sprague Dawley durante el
período de recuperación de 6 días después de la colitis inducida por la solución salina, 5ASA y dos formulaciones PC:5ASA. La figura 12 ilustra cambios en el número de células inflamatorias en la lámina propia de la submucosa del colon en los ratones machos Sprague Dawley durante el período de recuperación de 6 días después de la colitis inducida por el DSS en la solución salina y las formulaciones de 5ASA y dos PC:5ASA. La figura 13 ilustra cambios en la lesión de la mucosa del colon en los ratones machos Sprague Dawley como fueron evaluados histológicamente durante el período de recuperación de 6 días después de la colitis inducida por DSS en la solución salina y formulaciones de 5ASA y dos PC:5ASA. La figura 14 demuestra los cambios en el peso del tejido del colon por unidad de longitud en los ratones machos Sprague Dawley durante un período de recuperación después de la colitis inducida por DSS por la solución salina, sin DSS en el agua para beber y en la solución salina, la formulación 5ASA y un PC:5ASA con DSS en el agua para beber. La figura 15 ilustra los cambios en la actividad del MPO del colon en los ratones machos Sprague Dawley durante un período de recuperación después de la colitis inducida por DSS en la solución salina, sin DSS en el agua para beber y la solución salina, una formulación de 5ASA y un PC:5ASA con
DSS en el agua para beber. La figura 16 ilustra cambios en los ángulos de contacto del colon en las ratas machos Sprague Dawley durante un período de recuperación después de la colitis inducida por DSS en la solución salina, sin DSS en el agua para beber y la solución salina, la formulación de 5ASA y PC:5ASA con DSS en el agua para beber. La figura 17 ilustra los cambios en los niveles de hematocritos en las ratas machos Sprague Dawley durante un período de recuperación después de la colitis inducida por DSS para la solución salina sin DSS en el agua para beber y la solución salina, una formulación de 5ASA y un PC.5ASA con DSS en el agua para beber. La figura 18 ilustra los cambios en la hemoglobina fecal en las ratas machos Sprague Dawley durante un período de recuperación después de la colitis inducida por DSS en la solución salina, sin DSS en el agua para beber y la solución salina, y la formulación de 5ASA y un PC:5ASA con DSS en el agua para beber. Descripción Detallada de la Invención El inventor ha descubierto que las composiciones de ácido 5-amino salicílico (5ASA) y composiciones farmacéuticas basadas en 5ASA y fosfolípidos tienen una actividad mejorada para reducir la colitis en los roedores que utilizan los modelos de colitis de roedores. En ciertas modalidades, los fosfolípidos
son fosfolípidos derivados de fríjol soya y otras fuentes. En otras modalidades, los fosfolípidos son fosfolípidos enriquecidos con fosfatidilcolina (PC) o un derivado de fosfatidilcolina. Estas formulaciones de 5ASA/PC tienen la capacidad de ser administradas oralmente, entéricamente o rectalmente (enema) para el tratamiento o alivio de la inflamación del Gl, ulceración, sangrado y otros síntomas asociados con la enfermedad inflamatoria del intestino delgado (IBD), y sus secuelas asociadas de diarrea, fiebre y dolor. Las composiciones de la presente invención incluyen 5ASA y un fosfolípido que mejora los beneficios anti-inflamatorios del 5ASA y fortifica las propiedades de la barrera hidrofóbica de la mucosa afectada, y atenúan las secuelas en el IBD. La presente invención se refiere a un método para preparar una composición que incluye un fosfolípido, en ciertas modalidades un fosfolípido enriquecido en fosfatidilcolina (PC), y 5ASA o formulaciones farmacéuticas que incluyen 5ASA para el tratamiento de IBD. Estas formulaciones pueden ser preparadas tomando un polvo que contiene 5ASA (por ejemplo, Mesalamina, Sulfsalazina, Olsalazina, Balsalazida, o mezclas de los mismos) o una molécula más grande enlazada de manera covalente al activo 5ASA por medio de un enlace diazo y simplemente mezclándolo con un fosfolípido. En ciertas modalidades, el componente que contiene 5ASA es simplemente mezclado con un componente fosfolípido basado en aceite, tal
como un aceite de lecitina de soya que contiene PC, por ejemplo, Fosfal 35 SB (P35). Generalmente, la proporción en peso de 5ASA a fosfolípido es entre aproximadamente 1:10 y aproximadamente 10:1. En ciertas modalidades, la proporción en peso es entre aproximadamente 1:5 y aproximadamente 5:1. En otras modalidades, la proporción en peso se encuentra entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 1:2. Todavía en otras modalidades, la proporción en peso es de aproximadamente 1:1. En algunas modalidades, las composiciones son preparadas calentando los componentes juntos mezclándolos para facilitar la preparación de la formulación. Un método alternativo es calentar el fosfolípido y el 5ASA a una temperatura suficiente para que derrita el 5ASA en el fosfolípido, generalmente con una buena mezcla para permitir la mezcla íntima y la formación de complejos asociados entre 5ASA y el fosfolípido en el nivel molecular. El proceso puede ser realizado en un solvente de temperatura alta o un aceite bio-compatible en la ausencia de aire para facilitar la formación de los complejos asociados de 5ASA/fosfolípido con la degradación oxidativa. Un método alternativo para elaborar la formulación es hacer una formulación acuosa que incluye 5ASA y luego agregar la solución acuosa a un recipiente recubierto con una película seca de lípido de PC, la cual entonces será mezclada de manera vigorosa, sometida al batido en forma de remolinos (hacia un solo lado), sonicada y sometida a otros
medios de agitación para hacer una suspensión de lípidos de 5ASA/PC. Otro método es disolver el 5ASA y el fosfolípido en solvente que disuelve ambos materiales. La mezcla de la solución con o sin calentamiento y luego evaporar el solvente. El material resultante puede ser molido y encapsulado con una resina para la liberación demorada en el intestino distante. Todavía otro método de combinar el 5ASA y el fosfolípido (PL) es enlazar de manera covalente las moléculas juntas por medio de un enlace diazo entre el grupo amino de 5ASA y un fosfolípido reactivo (PL), por ejemplo, fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina u otros fosfolípidos reactivos, utilizando técnicas estándar para formar el enlace diazo. Similar a los otros precursores 5ASA, tales como sulfsalazina, osalazina, y basalazida, las enzimas de las bacterias en el colon hidrolizan el enlace diazo, liberando el 5ASA y el PL reactivo tal como PE. El 5ASA liberado entonces puede ocasionar su efecto terapéutico pretendido, mientras que el fosfolípido liberado ayuda a mantener o restaurar la barrera hidrofóbica de la mucosa afectada en el intestino delgado distante, inhibir la inflamación y promover la curación. Los estudios pre-clínicos hasta la fecha muestran que los fosfolípidos tales como el PC aumentan la eficacia del 5ASA para tratar la colitis. Reactivos Adecuados Los fosfolípidos adecuados para utilizarse en la presente
invención incluyen, sin limitación, un fosfolípido de la fórmula general:
I fp I I ? ? I i - I I * II I
en donde Rt y R2 son substituciones saturadas y/o insaturadas de 8 a 32 átomos de carbono, en donde uno o más de los átomos de carbono pueden ser reemplazados por átomos 0 de oxígeno, un átomo de azufre, un átomo de nitrógeno, u otro elemento principal del grupo, tal como B, C, Si, P, S, Ge, y Ga; R3 es H ó CH3, y X es H ó COOH; y R4 es =0 ó H2. Mezclas y combinaciones de los fosfolípidos zwiteriónicos de la fórmula general. 5 Los ejemplos de los fosfolípidos zwiteriónicos de la fórmula (II) incluyen, sin limitación, fosfatidilcolinas, tales como fosfatidilcolina (PC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), otras fosfatidilcolinas disaturadas o fosfatidilcolinas insaturadas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilinositol, fosfatidil serinas 0 esfingomielina u otras ceramidas, o varios otros fosfolípidos zwiteriónicos, fosfolípidos que contienen aceites tales como aceite marino y/o de pescados enriquecidos con ácidos grasos Omega-3, aceites de lecitina derivados de fríjol soya, dimiristoil fosfatidilcolina, distearoilfosfatidilcolina, 5 dilinoleoilfosfatidilcolina (DLL-PC), dipalmitoilfosfatidilcolina
(DPPC), fosfatidilcolina de soya (Soya-PC ó PCS) y fosfatidilcolina de huevo (Huevo-PC ó PCE). En la DPPC, un fosfolípido saturado, la substitución alifática saturada de R y R2 son CH3- (CH2)14, R3 es CH3 y X es H. En la DLL-PC, un fosfolípido insaturado, Ri y R2 son CH3- (CH2)4-CH = = CH-CH2-CH = = CH-(CH2)7, R3 es CH3 y X es H. La PC de Huevo, la cual es una mezcla de fosfolípidos insaturados, R1 principalmente contiene una substitución alifática saturada (por ejemplo, ácido palmítico o esteárico), y R2 es principalmente una substitución alifática insaturada (por ejemplo, ácido oleico o araquidónico). En la PC de soya, la cual además de un fosfolípido saturado (ácido palmítico y ácido esteárico) es una mezcla de fosfolípidos insaturados, (ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico). En la PC derivada de animales marinos, (por ejemplo, krill, salmón) los grupos Ri y R2 pueden constituir ácidos grasos Omega -3: ácido eicosapentaenoico (EPA) y ácido docosahexaenoico (DHA). Los fosfolípidos zwiteriónicos preferidos incluyen, sin limitación, dipalmitoil fosfatidilcolina, fosfatidil colina, o una mezcla de los mismos. EJEMPLOS Preparación de las Composiciones Fue colocado el Phosal 35 SB, un aceite de lecitina de soya que contiene aproximadamente 35% en peso de fosfatidilcolina (PC), en un vaso de precipitación de vidrio al cual se le agregó 5ASA (o un componente farmacéutico que
contiene 5ASA), bajo calor moderado de aproximadamente 40°C, y agitación hasta que se obtuvo una proporción en peso de 1:1. La formulación basada en aceite resultante fue recubierta con un polímero sensible al pH, por ejemplo, MultiSal™ ó Eudragrit®-S, para formar micro-esferas encapsuladas de polímero de la composición 5ASA/PC. Estas micro-esferas encapsuladas son formadas de modo que el 5ASA y la PC son liberados solamente cuando el fármaco alcanza el intestino delgado distante, en donde el pH es de 7 o superior y se degrada el recubrimiento de polímero. Esta formulación entonces fue agregada a la dieta de los ratones o ratas para la evaluación. Los ratones o ratas fueron colocados en sulfato de sodio dextrano al 3% en solución (DSS) incluido con el agua de beber para inducir la colitis. Un método alternativo para la formulación basada en aceites descrita anteriormente, es suspender el 5ASA o un componente farmacéutico que contiene 5ASA en agua o una solución acuosa apropiada. La solución acuosa es entonces agregada a un segundo contenedor recubierto con una película seca de lípido de PC. La mezcla resultante entonces es sometida a mezcla vigorosa, agitación en forma de remolino, sonicación y otros medios de agitación para formar una suspensión acuosa de lípidos para la administración oral, entérica o rectal (enema).
Ejemplo Utilizando Ratones C57BL/6 en el Modelo de Colitis de Roedores Los grupos de cuatro ratones C57BL/6 fueron expuestos a diferentes cantidades de sulfato de sodio dextrano (DSS), en su agua para beber por un período de tiempo de cuatro días. Los ratones entonces fueron eutanizados y fue medido el peso del tejido del colon por longitud por cada grupo. Haciendo referencia ahora a la figura 1, el tratamiento de DSS dio como resultado la inflamación del colon o edema medido mediante el peso del tejido del intestino aumentado por longitud, en donde se mostró que el 3% de DSS ocasiona el mayor aumento en la medida del peso a longitud. Los grupos de ratones de C57BL/6 fueron expuestos a diferentes cantidades de sulfato de sodio de dextrano (DSS) en su agua para beber por un período de cuatro días. Se hicieron mediciones de la hemoglobina fecal de los ratones al final del período de cuatro días. Haciendo referencia ahora a la figura 2, el tratamiento de DSS dio como resultado una hemoglobina fecal aumentada con concentración creciente de DSS en su agua para beber, mostrando el 4% de DSS la más alta hemoglobina fecal. Los grupos de ratones C57BL/6 fueron expuestos a dietas diferentes y su consumo de alimentación diaria (gramos/día) fue medido durante un período de cuatro días. El grupo 1 representó el grupo de control que recibe la solución salina sin
DSS y la alimentación regular sin formulación alguna que contenga 5ASA. El grupo 2 representó un control de DSS que recibe una solución salina con el 3% de DSS, y alimentación regular sin formulación alguna que contiene 5ASA. El grupo 3 representó un grupo tratado con 5ASA que recibe solución salina con un contenido del 3% de DSS y una dieta que incluye micro-esferas encapsuladas de 5ASA MultiSal™. Los grupos del 4 al 6 son designados para comparar en las formulaciones del 5ASA/PC tres basadas en aceites. El grupo 4 representó una administración de 5ASA/P35 (un 1:1 de proporción en peso de 5ASA y Phosphal® 35SB, un producto de lecitina de soya basado en aceite con un contenido de aproximadamente 35% en peso de PC) un grupo tratado que recibe solución salina que contiene el 3% de DSS y una dieta que incluye micro-esferas encapsuladas de 5ASA/P35 MultiSal™. El grupo 5 representó un grupo tratado con 5ASA/P35 (una proporción en peso de 1:1 de 5ASA y Phosal® 53 MCT, un producto de lecitina de soya basado en aceite con un contenido de aproximadamente 53% en peso de PC) el grupo es tratado recibiendo la solución salina que contiene el 3% de DSS y una dieta que incluye micro-esferas encapsuladas de 5ASA/P53 MultiSal™. El grupo 6 representó un grupo de 5ASA/P35 (una proporción en peso de 1:1 de 5ASA y Phosal® 75 SA, un producto de lecitina de soya basado en aceite que contiene aproximadamente 75% en peso de PC) y un grupo tratado que recibe solución salina con un
contenido del 3% de DSS y una dieta que incluye micro-esferas encapsuladas de 5ASA/P75 MultiSal™. Haciendo referencia ahora a la figura 3, el consumo de alimento (gramos/día) de los ratones sometidos a en las dietas descritas anteriormente. Las primeras tres barras evidencian los patrones de alimentación de ratones normales en la ausencia y presencia de 5ASA, en el alimento, mientras que las últimas tres barras representan los patrones de alimentación de los ratones en la presencia de las formulaciones de 5ASA/PC. La figura 3 indica que los materiales activos no afectan de manera importante los patrones de alimentación de los ratones. Datos de las Ratas Comparando las Formulaciones de 5ASA v 5ASA:PL en el Tratamiento de la Colitis Inducida Los ejemplos anteriores muestran que el agua para beber que comprende solución salina que contiene el 3% de sulfato de sodio dextrano (DSS) tiene la capacidad de inducir una enfermedad de tipo de colitis en los ratones. Ahora, las formulaciones de 5ASA:PL pueden ser comparadas con el 5ASA en el tratamiento de la enfermedad de tipo de colitis en los ratones. Los grupos de ratones fueron colocados con agua para beber que comprende una solución salina en un contenido del 3% de DSS durante cuatro días para inducir una enfermedad de tipo de colitis y luego fueron tratados con las composiciones de la presente invención. La eficacia de las composiciones del tratamiento fue determinada midiendo el peso del tejido del
colon por longitud. Haciendo referencia ahora a la figura 4, la inflamación del colon medida por un peso aumentado del tejido del colon por una longitud determinada mostraron la reversa parcial cuando fueron tratados con solución salina, 5ASA, 5ASA.P35, 5ASA:P53 y 5ASA:P75 combinado con DSS y se les administró a los ratones en su dieta con un grupo de ratones no tratados con DSS y dieta normal. Los datos mostraron que las tres formulaciones 5ASA:PL son superiores al 5ASA solo para revertir la inflamación del tejido medido por una proporción de peso a longitud aumentada en el tejido del colon. A los grupos de ratones se les administró agua para beber que comprende solución salina con un contenido del 3% de DSS por cuatro días para inducir una enfermedad de tipo de colitis y luego fueron tratados con las composiciones de la presente invención. La aparición de la sangre indicada por un contenido aumentado de hemoglobina en la materia fecal fue medida para determinar la eficacia del 5ASA contra las formulaciones de 5ASA:PL. Haciendo referencia ahora a la figura 5, el contenido de hemoglobina en la materia fecal de los ratones fue significativamente reducido para los ratones colocados en una dieta que contenían una formulación de 5ASA.P35 y 5ASA.P75 comparados con la solución salina/DSS y 5ASA/DSS. A los grupos de ratones se les dio agua para beber que comprende una solución salina con un contenido del 3% de DSS durante cuatro días para inducir una enfermedad de tipo de
colitis y luego fueron tratados con las composiciones de la presente invención. La inflamación del colon indicada por una mieloperoxidasa de tejido aumentada (MPO) fue medida para determinar la eficacia de la solución salina, 5ASA y 5ASA:PC35. Haciendo referencia ahora a la figura 6, la inflamación del colon fue reducida en los ratones con dietas que contienen la formulación de 5ASA:P35. Los grupos de ratones fueron colocados con agua para beber que comprende solución salina con un contenido del 3% de DSS durante cuatro días para inducir una enfermedad de tipo de colitis y luego tratados con las composiciones de la presente invención. La mucosa del colon fue vista a través del microscopio de luz y calificada de manera histológica utilizando un sistema de calificación, en donde 0 representa la mucosa del colon normal y 4 representa la pérdida total de la estructura glandular del colon. Haciendo referencia ahora a la figura 7, la formulación de 5ASA/P35 redujo de manera significativa la lesión microscópica para la mucosa del colon en los ratones colocados en una dieta con un contenido de 5ASA:P35. Los datos de los roedores muestran claramente una mejora positiva de la eficacia de 5ASA en el intestino delgado distante cuando es administrado en la formulación que incluye un fosfolípido. Datos de Ratones que Comparan el 5ASA y Formulaciones de 5ASA:PL en el Tratamiento de la Colitis Inducida
A los ratones se les dio agua para beber con un contenido del 4% de sulfato de sodio de dextrano (DSS) durante 5 días y 20 horas para inducir colitis después de que fueron regresados al agua normal. A los animales entonces se les administró de una manera intragástrica dos veces al día durante los 6 días siguientes: (a) solución salina (control DSS); (b) 5ASA en una dosis de 100 mg/kg, (c) una proporción en peso de 1:1 de 5ASA y Phosal 35 SB (una formulación basada en aceite), o (d) una proporción de peso de 1:2 de 5ASA y Phospholipon 90G (una suspensión acuosa de lípidos) en la misma dosis de 5ASA, 100 mg/kg, sin limitación. Las formulaciones (c) y (d) están asociadas con formulaciones de 5ASA con fosfatidilcolina (PC), en donde la PC y el 5ASA están asociados en el nivel molecular. Estos tratamientos están diseñados para comparar la eficacia del 5ASA y dos diferentes formulaciones de PC:5ASA. En los días 1, 3 y 6, las ratas fueron eutanizadas y el tejido del colon, la sangre y la materia fecal fueron recolectados para los análisis bioquímicos e histológicos para evaluar la inflamación del colon y el sangrado del Gl. Un grupo separado de ratas no fueron colocados en DSS y sirvieron como "controles normales". Haciendo referencia ahora a la figura 8, los cambios en los hematocritos durante el período de recuperación de 6 días fueron medidos a partir de las ratas eutanizadas. Los cambios en los niveles de hematocritos representan un estimado
indirecto de anemia y sangrado interno (Gl) entre los grupos por un período de recuperación de 6 días. Se puede apreciar que aunque fue observada una disminución modesta de <10% en el nivel de hematocritos en todos los grupos posteriores a la exposición de DSS comparados con los grupos que se expusieron al DSS o los niveles de hematocritos de "control normal", no hubo una diferencia importante en este parámetro entre los grupos de prueba durante el período de recuperación de 6 días. El cambio en la hemoglobina fecal se muestra en la figura
9. Se puede observar que la sangre fecal fue detectada durante el primer día del período de recuperación en la mayor parte de los grupos de prueba (contra los valores de control normales) con la sugerencia de que el 5ASA ± 90G puede haber tenido un efecto benéfico en la reducción de la pérdida de sangre fecal. La inflamación y la lesión del colon fueron evaluadas midiendo un número de índices bioquímicos e histológicos. Primero, el edema del tejido fue evaluado midiendo el peso húmedo del tejido/longitud de la unidad. Estos resultados que se presentan en la figura 10, demuestran que el edema intestinal fue máximo 3 días posteriores a los controles tratados con solución salina de DSS, y este cambio inflamatorio fue reducido por el 5ASA (de manera no importante), y adicionalmente disminuyó (de manera importante) en las ratas tratadas con las dos formulaciones de PC-[5ASA]. No existen
diferencias importantes entre los grupos en este parámetro de 6 días posteriores a la administración de DSS, con alguna indicación de que los animales tratados con 5ASA en combinación con 90G tenían un episodio de rebote de la inflamación. La actividad de la mieloperoxidasa del colon (MPO), un marcador bioquímico de infiltración del neutrófilo en los tejidos, fue medida como otro marcador de inflamación. Los resultados presentados en la figura 11 demuestran cambios similares pero no más dramáticos a los descritos anteriormente, mostrando el 5ASA una reducción en el día 3 y ambas formulaciones PC-[5ASA] disminuyeron adicionalmente la actividad de MPO a niveles que casi no se podían detectar. La actividad de MPO regresó a los niveles de control normales para el día 6 en todos los grupos, excepto para el grupo tratado con 5ASA en combinación con 90G. La histología del tejido fue calificada (bajo condiciones ciegas) por los signos de lesión e inflamación. Para evaluar la inflamación calificamos el número de células inflamatorias en la lámina propia de la submucosa del colon utilizando un sistema de calificación de 1 (normal) a 4 (altamente inflamado). Estos resultados, mostrados en la figura 12, demuestran que las ratas tratadas con 5ASA tenían un número reducido de células inflamatorias, mostrando el tratamiento de 5ASA/P35 una actividad anti-inflamatoria comparable o superior en los días 3 y
6 y ocasionando nuevamente el 90G en combinación con 5ASA un rebote de la inflamación en el día 6. Para evaluar la lesión de la mucosa del colon, se utilizó un sistema de calificación histológica, en donde: 0 = mucosa normal; 1 = lesión de la superficie; 2 = lesión que se extiende dentro de la región glandular media; 3 = lesión que se extiende dentro de la región glandular profunda; y 4 = lesión que se extiende dentro de la capa serosal (músculo). La figura 13 muestra que la lesión de la mucosa fue aumentada en todos los grupos en el día 1 posterior al DSS, y para el día 3 hubo una recuperación en las ratas tratadas con 5 ASA ± PC mostrando con el 5ASA/P35 una evidencia más consistente de la protección de la mucosa que con el 90G. Conclusiones El protocolo utilizado anteriormente de la serie de experimentos, prueba ser un sistema de modelo de roedor muy útil para evaluar la eficacia terapéutica del 5ASA y las formulaciones de PC-5ASA para asegurar la recuperación de la colitis inducida por (DSS) de manera experimental. De manera interesante, parece que la inflamación progresa para el día 3 después del retiro del DSS, el agente inductor de la colitis, y cede para el día 6. Utilizando un número de marcadores bioquímicos e histológicos, parece que el 5ASA en una dosis de 100 mg/kg reduce de manera importante la inflamación del colon y la lesión del tejido 3 días después del DSS en
comparación con los valores de control de las ratas tratadas con solución salina. La formulación de 5ASA/P35SB basada en aceite mostró una mejora adicional en la recuperación de la colitis (contra el 5ASA solo) en 2 de cada 4 marcadores de inflamación. En contraste, la formulación de 5ASA/90G tuvo un efecto bifásico con un rebote de la inflamación que ocurre 6 días posteriores al DSS. Es nuestra recomendación que este experimento de recuperación, utilizando el sistema de modelo anterior, sea repetido utilizando una dosis efectiva más baja de 5ASA (50 mg/kg b.i.d.), y que enfoquemos nuestros esfuerzos en la formulación de 5ASA/P35, basada en aceite, para determinar si se puede demostrar una eficacia más clara y convincente en el anti-inflamatorio de nuestra formulación de prueba de PC-5ASA en comparación con el 5ASA solo. Datos de las Ratas que Comparan las Formulaciones de 5ASA y 5ASA:PL en el Tratamiento de Colitis Inducida Los siguientes experimentos fueron diseñados para comparar la eficacia de las formulaciones de 5ASA contra 5ASA:PC en el tratamiento de ratas que habían sido sometidas a colitis inducida mediante la adición de sulfato de sodio de dextrano al 4% (DSS) en su agua para beber por un período de 5 días (5 días, 20 horas) y luego regresaron al agua de beber. Las ratas entonces fueron tratadas con 5ASA, en este experimento en una dosis inferior (50 mg/kg, BID) que la que se había estudiado anteriormente, en la ausencia o presencia del
componente PL durante 3 días posteriores a la colitis inducida por DSS. Treinta y dos ratas macho saludables utilizadas en el estudio. Las ratas comparables con respecto al protocolo, proveedor, sexo y peso fueron divididas a manera de serie en 4 grupos. Al Grupo I se le administró agua para beber sin DSS agregado. Los Grupos del 2 al 4 recibieron agua para beber con un contenido del 4% del DSS durante 6 días. En el día 6, el Grupo 2 recibió intra gástricamente 1 mL de solución salina BID. El Grupo 3 recibió intra gástricamente 5ASA (50mg/Kg) BID. El Grupo 4 recibió 5ASA(50mg/Kg): Phosal 35SB:MCT aceite (1:1:0.3), al que nos referimos en lo sucesivo como 5ASA:PC BIS intra gástricamente, en donde el MCT = Triglicérido de Cadena Media. En día 9, las ratas fueron eutanizadas y después fueron medidas: (a) hematocrito, (b) hemoglobina fecal, (c) peso / longitud del colon, (d) mieloperoxidasa del colon (MPO), (e) hidrofobicidad de la superficie del colon y (f) histología del colon. En este estudio a las ratas se les colocó agua regular para beber (Grupo 1) o un agua con un contenido del 4% de DSS y luego se les administró de manera intragástrica: solución salina (Grupo 2); 5ASA (Grupo 3) en una dosis de 50 mg/kg BID); ó 5ASA:PC (P35SB en una proporción en peso de 1:1) (Grupo 4) por 3 días en cuyo tiempo se observaron los siguientes
cambios. Haciendo referencia ahora a la figura 14, se muestran los datos de peso/longitud del colon. Esta medida de la edema de la mucosa demostró un aumento importante cuando se compara con el grupo tratado con solución salina DSS (Grupo 2) con el control absoluto (sin DSS, Grupo 1). Este edema de la mucosa inducido por el DSS fue invertido de manera parcial por el 5ASA en una dosis de 50 mg/kg BID (Grupo 3), y completamente invertido en el grupo de 5ASA:PC (Grupo 4), con diferencias importantes observadas entre las ratas del Grupo 4 contra las ratas de los Grupos 2 y 3, pero no con las ratas del Grupo 1. Haciendo referencia ahora a la figura 15, se muestran los datos de la Proteína del PO. Esta medida biológica de la inflamación mostró el mismo patrón que se observó anteriormente, induciendo el DSS en un momento importante en la actividad del MPO contra el Grupo de control 1 (sin DSS), y esta inflamación fue invertida parcial y completamente por el compuesto de 5ASA y 5ASA:PC, respectivamente. Se observaron diferencias importantes (p<0.05) entre las ratas del Grupo 4 contra las ratas de los Grupos 2 y 3, pero no las ratas del Grupo 1. Haciendo referencia ahora a la figura 16, se muestran los datos del análisis del ángulo de contacto del colon. No se observó diferencia alguna en la hidrofobicidad de la superficie de la mucosa del colon entre los grupos, posiblemente debido a
que esta propiedad de la superficie se había recuperado completamente por 3 días de la colitis inducida posteriores al del DSS. Haciendo referencia ahora a la figura 17, se muestran los datos del hematocrito. Esta medida de la anemia debida al sangrado por Gl no fue significativamente diferente entre los grupos experimentales tratados con DSS contra el control (sin DSS), pero tendió a ser inferior en los grupos tratados con DSS excepto por aquellos con una dosis de 5ASA:PC (Grupo 4), en donde fue significativamente superior. Haciendo referencia ahora a la figura 18, se muestran los datos de la hemoglobina fecal. Esta medida directa del sangrado Gl activo demostró un aumento en el grupo de DSS tratado con solución salina (Grupo 2) contra el grupo de control (sin DSS) (Grupo 1). Este aumento inducido por el DSS en la pérdida de la sangre fecal de Gl fue parcialmente invertido por la administración de 5ASA y completamente invertido por la administración de 5ASA:PC. Se observaron diferencias importantes (p<0.05) entre el Grupo 4 contra los Grupos 2 y 3, pero no el Grupo 1. La inflamación y sangrado del colon inducido por el DSS en las ratas es todavía evidente 3 días posteriores al DSS. El 5ASA solo en una dosis de 50 mg/kg administrado dos veces al día de manera intragástrica promueve la recuperación del tejido de la colitis inducida por DSS y reduce el sangrado del Gl. El
PC-5ASA cuando fue adminstrado intragástricamente en la misma dosis del 5ASA activo indujo la recuperación completa de la mucosa de la colitis inducida por DSS con poca o ninguna evidencia de sangrado Gl. Todas las referencias aquí citadas están incorporadas a la presente descripción como referencia. Aunque la presente invención ha sido descrita haciendo referencia a sus modalidades preferidas, a partir de la lectura de la presente descripción, aquellos expertos en la técnica pueden apreciar que se le pueden hacer cambios y modificaciones los cuales no se salen del alcance y espíritu de la presente invención tal y como se describieron anteriormente y como se reivindicarán a continuación.