MX2008015726A - Polipeptidos de factor de crecimiento de tipo insulina estabilizada. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a polipéptidos estabilizados que tienen una secuencia de IGF-1 o IGF-2 y una secuencia de péptido E, en donde la escisión fisiológica natural del péptido E a partir de IGF es evitada.

Description

POLIPÉPTIDOS DE FACTOR DE CRECIMIENTO DE TIPO INSULINA ESTABILIZADA ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los factores de crecimiento de tipo insulina (IGFs) son parte de un sistema complejo que las células utilizan para comunicarse con su ambiente fisiológico. Este sistema complejo (por lo general denominado como el eje de factor de crecimiento de tipo insulina) consiste de dos receptores de célula-superficie (IGF-IR e IGF-2R), y enzimas de degradación IGFBP asociadas (proteasas). Este sistema es importante no solo para la regulación de fisiología normal sino también para un número de estados patológicos (Glass, Nat Cell Biol 5:89-90, 2003). Se ha mostrado que el eje IGF juega papeles importantes en la promoción de proliferación de célula y la inhibición de muerte de célula (apoptosis). El IGF-1 principalmente es secretado por el hígado como resultado de la estimulación por la hormona de crecimiento humana (hGH). Casi cada célula en el cuerpo humano es afectada por IGF-1 , especialmente células en músculos, cartílagos, huesos, hígado, riñon, nervios, piel y pulmones. Además de los efectos de tipo insulina, el IGF-1 también puede regular el crecimiento de célula. Los IGF-1 y IGF-2 son regulados por una familia de productos de gen conocidos como las proteínas de unión del IGF. Estas proteínas ayudan a modular la acción del IGF en formas complejas que involucran tanto la acción de inhibición de IGF evitando la unión a los receptores de IGF como a la acción promotora de IGF a través de la ayuda al suministro a los receptores e incrementar la vida medica del IGF en la corriente sanguínea. Existen por lo menos seis proteínas de unión caracterizadas (IGFBP-6). En su forma madura, el IGF-1 humano (gpetjcgaelvdalqfvcg drgfyfnkptgygsssrrapqtgivdeccfrscdlrremycaplkpaksa; SEC ID NO: 1), también denominado somatomedina, es una proteína pequeña de 70 aminoácidos que mostrado estimular el crecimiento de una amplia escala de células en el cultivo. La proteína madura es inicialmente codificada por tres ARNms de variante de empalme conocidos. El marco de lectura abierto de cada ARNm codifica una proteína precursora conteniendo los 70 aminoácidos de IGF-1 y péptido E particular en el término C, dependiendo del ARNm de IGF-1 particular. Estos péptidos E han sido denominados los péptidos Ea (rsvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm; SEC ID NO:2, Eb (rsvraqrhtdmpktqkyqqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrr eigsrnaecrgkkgk; SEC ID NO:3), y Ec (rsvraqqrhtdmpktqkyqppstnknt ksqrrkgstfeerk; SEC ID NO: 4) y varían de 35 a 87 aminoácidos en longitud y abarcan una región de secuencia común en el término N y una región de secuencia variable en el término C. Por ejemplo, el marco de lectura abierto de tipo silvestre para el IGF-1-Ea codifica un polipéptido de 105 aminoácidos (gpetlcgaelvdalqfvcgdrgfy fnkptgygsssrrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa J rsvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm; SEC ID N0:5). En una expresión fisiológica, los péptidos E son cortados del precursor a través de proteasas endógenas para producir el IGF-1 de 70 aminoácidos maduro conocido por ser bioactivo. En ciertos contextos, se sabe que de uno a tres de los aminoácidos N-terminales de IGF-1 se separan bajo condiciones fisiológicas, produciendo IGF-1 activo teniendo de entre 67-70 aminoácidos. La expresión y procesamiento del gen IGF-2 se caracteriza por atributos similares excepto que solo un péptido E (rdvstpptvipdnfprypvgkffqyd twkqstqrlrrglpallrarrghvlakeleafreakrhrplialptqdpahggappemasnrk; SEC ID NO:6) para IGF-2 ha sido identificado para el precursor de 156 aminoácidos (ay rpsetlcggelvdtlqfvcgdrgfyfsrpasrvsrrsrgiv eeccf rscdlalletycatpakserdvstpptvlpdnf prypvgkffqydtwkqstqrlrrglpallra rrghvlakeleafreakrhrplialptqdpahggappemasnrk; SEC ID NO:7). Parece que tanto IGF-1 como IGF-2 son pobres candidatos a fármacos, ya que estas proteínas son rápidamente degradadas por proteasas endógenas en el suero de pacientes. Una estrategia que ha sido contemplada es estabilizar IGF-1 como un fármaco formando un complejo con una de sus proteínas de unión.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención se basa en el descubrimiento de que una proteína de precursor IGF-1 o IGF-2 que contiene substancialmente su péptido E es bioactiva y se estabiliza en presencia de suero, dando como resultado un polipéptido de IGF-1 o IGF-2 que es útil como un farmacéutico. En las composiciones de la invención, el corte o escisión del péptido E a partir del IGF-1 es evitado, por ejemplo, mutando o eliminando ya sea la arginina en la posición 1 o la serina en la posición 2 de los péptidos E (que corresponde a las posiciones 71 y 71 en el IGF-1 precursor de tipo silvestre). En IGF-2, el corte o escisión es evitado, por ejemplo, mutando o eliminando ya sea la arginina en la posición 1 o el ácido aspártico en la posición 2 del péptido E (que corresponde a las posiciones 68 y 69 en IGF-2 precursor de tipo silvestre). Otras modificaciones de una proteína de precursor IGF pueden evitarse o reducir este corte o escisión. Además, otras modificaciones de la secuencia de aminoácido de precursor IGF-1 pueden conferir beneficios farmacéuticos adicionales. Por ejemplo, los polipéptidos de la invención pueden exhibir afinidad incrementada para el receptor IGF-1 o habilidad de unión reducida a una proteína de unión IGF-1 o IGF-2 inhibidora. Por claridad y consistencia, la numeración de residuos de aminoácidos en el precursor IGF-1 o IGF-2 o proteínas maduras a través de esta solicitud y en las reivindicaciones se basa en la numeración de secuencia de proteína de precursor de tipo silvestre sin el péptido de señal. Por consiguiente, la invención incluye un polipéptido que contiene una proteína de precursor IGF-1 humana, en donde la escisión o corte del péptido E a partir de IGF-1 a través de una proteasa se reduce mediante la modificación de la proteina de precursor. El péptido E puede ser el péptido Ea, Eb o Ec. En el término N del precursor, los aminoácidos G1, P2 o E3 de la proteína de precursor pueden ser eliminados o mutados, como lo puede el R36 (por ejemplo, R36A (y R37 (por ejemplo R37A). La proteína de precursor además puede incluir la secuencia de consenso de glicosilación N-enlazada NXS/T, por ejemplo, a través de la inserción de los aminoácidos 93-102 de Ea entre los aminoácidos N95 y T96 de Eb. En general, la proteína de precursor puede incluir un oligosacárido covalentemente unido a una cadena lateral de aminoácido de la proteína de precursor, tal como una cadena lateral de arginina de la proteína de precursor. Además, un residuo de la proteína de precursor puede ser reemplazado por un aminoácido no natural (por ejemplo, uno que incluye un grupo acetileno o azido). Dichos aminoácidos no naturales pueden facilitar el enlazamiento de una porción de glicol polietilénico a una cadena lateral de la proteína de precursor, a través de estrategias de pegílación de proteina típicas, que son bien conocidas en la técnica. La proteína de precursor además puede incluir uno o más péptidos E adicionales enlazados al término C de la proteína de precursor. Por ejemplo, un polipéptido puede incluir, del término N al término C, (1) una proteína de precursor IGF-1 teniendo un primer péptido Eb, en donde G1, P1 y E1 son eliminados, ya sea R36 o R37 o ambos, son mutados, R71 y S72 son eliminados, y los últimos siete aminoácidos C-terminales del primer péptido Eb son eliminados; (2) un segundo péptido Eb, en donde R71 , S72, y los últimos siete aminoácidos C-terminales del segundo péptido Eb son eliminados; (3) un tercer péptido Eb, en donde R71, S72, y los últimos siete aminoácidos C-terminales del tercer péptido Eb son eliminados; y (4) un cuarto péptido Eb, en donde R71 y S72 son eliminados. Un medio efectivo para prevenir la escisión o corte del Péptido E a partir del IGF-1 es la eliminación o mutación de R71 o S72. Similarmente, la invención incluye una proteína de precursor IGF-2 humana, en donde la escisión del péptido E a partir del IGF-2a través de una proteasa se reduce por la modificación de la proteína de precursor. En particular, la eliminación o mutación de R68 o D69 puede ser un medio efectivo para evitar la digestión de la proteasa de la proteína de precursor IGF-2. Además, cualquier péptido E de IGF-1 puede ser combinado con un IGF-2 y cualquier péptido E de IGF-2 puede ser combinado con IGF-1 para proporcionar los beneficios descritos aquí. La invención además incluye un método para el tratamiento de una enfermedad músculo-esquelética, diabetes, muerte celular neuronal, administrando una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la invención. Asimismo, la invención incluye el uso de un polipéptido de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad músculo-esquelética, diabetes, muerte celular neuronal, o anemia. En otra modalidad, la invención incluye un IGF-1 pegilado sin un péptido E pero que tienen introducido en él un aminoácido no natural como el sitio de pegilación. Cualquier IGF-1 modificado, pegilado, que contiene un aminoácido no natural como se describe aquí, sin un péptido E, también se incluye en la invención. La invención también incluye métodos veterinarios y usos para la administración de una cantidad efectiva del polipéptido de la invención para obtener un efecto deseado. Los usos veterinarios incluyen (i) mejorar al velocidad y/ grado de crecimiento en un animal, (ii) mejorar la eficiencia de su conversión de alimentación en el tejido del cuerpo, (iii) mejorar la producción de leche en animales lactantes, (iv) tratar síntomas de desperdicio de animal asociados con caquexia, trauma, u otras enfermedades de consumo, y (v) tratar animales lactantes para mejorar la salud neonatal. Todas las referencias o documentos citados se incorporan aquí por referencia.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1A-1C son tinciones Western de polipéptidos de la invención y precursor IGF-1 de tipo silvestre después de cero ó 16 horas de incubación en presencia o ausencia de 10% de suero humano a 37°C. Se transfectaron vectores de expresión que codifican varias construcciones IGF-1 en células Cos, y se obtuvo el medio de cultivo acondicionado. El "3mut" se refiere a un precursor del péptido E teniendo los siguientes tres grupos de modificaciones: eliminación de G1, P2 y E3; mutación de Arg 37 a Ala (R37A); y la eliminación de R71 y S72. La Figura 1A muestra los resultados de tinción Western (utilizando el anticuerpo para IGF-1) para el tipo silvestre y el precursor 3mut conteniendo Ea. La Figura 1B muestras los resultados de tinción Western (utilizando el anticuerpo para hlGF-1) para el tipo silvestre y el precursor 3mut conteniendo Eb. La Figura 1C muestra los resultados de tinción Western (utilizando el anticuerpo para hlGF-1) para el tipo silvestre y el precursor 3mut conteniendo Ec. Las Figuras 2A-2D son gráficas lineales mostrando la actividad biológica de varios polipéptidos ("Mgandos"). La actividad biológica se midió a través de la estimulación de mioblastos C2C12 con polipéptidos Cos7-expresados. Las células C2C12 estimuladas después fueron analizadas para cantidades relativas de AKT total y AKT fosforilado. El R3-IGF-1 largo es un reactivo comercialmente disponible (Sigma Product No. 1-1271) que consiste de la secuencia de aminoácido de IGF-1 humano maduro, con una mutación E3R y un polipéptido de extensión N-terminal de 13 aminoácidos. La Figura 2A muestra la actividad de IGF-1 -Ea3mut. La Figura 2B muestra la actividad de IGF-1 -Eb3mut. La Figura 2C muestra la actividad de IGF-1 -Eab3mut, que es una construcción 3mut en donde los aminoácidos 92 a 102 de Ea fueron insertados entre los aminoácidos 95 y 96 de Eb. La Figura 2D muestra la actividad de IGF-1 -Ec3mut. Las Figuras 3A-3D y 4A-4D son gráficas lineales que muestran si los polipéptidos del precursor IGF-1 de la invención mantienen selectividad al receptor apropiado analizando la fosforilación del receptor en respuesta a la unión de ligando. Las Figuras 3A y 3B prueban la selectividad de receptor de IGF-1 -Ea3mut contra el receptor IGF-1 (Figura 3A) y el receptor de insulina (Figura 3B). Las Figuras 3C y 3D prueban la selectividad de receptor de IGF-1-Eb3mut contra el receptor IGF-1 (Figura 3C) y el receptor de insulina (Figura 3D). Las Figuras 4A y 4B prueban la selectividad de receptor de IGF-1-Ec3mut contra el receptor IGF-1 (Figura 4A) y el receptor de insulina (Figura 4B). Las Figuras 4C y 4D prueba la selectividad de receptor de IGF-1 -Eab3mut contra el receptor IGF-1 (Figura 4C) y el receptor de insulina (Figura 4D). "IGF-R3" se refiere a R3-IGF-1 largo descrito anteriormente. El polipéptido listado como "IGFIEab" se refiere a una construcción en donde los aminoácidos 93 a 102 de Ea fueron insertados entre los aminoácidos 95 y 96 de Eb. La Figura 5 es una tinción Western que muestra la fosforilación de AKT relativa después de la estimulación de miotubos C2C12 (como resultado de 3 a 4 días de diferenciación de miocitos C2C12) a través de diferentes ligandos. El multímero IGF-1Eb se refiere a la construcción esquemáticamente mostrada en la Figura 6A. Las Figuras 6A y 6B son representaciones esquemáticas de dos de los polipéptidos de la invención. La Figura 6A muestra un polipéptido de precursor IGF-1-Eb con cuatro grupos de modificaciones: eliminación de G1, P2 y E3; mutación de R37 a A; eliminación de R71 y S72; y eliminación de los últimos siete aminoácidos C-term ¡nales. Además, el polipéptido es alargado a través de la adición de dos más péptidos Eb (pero sin R71 y S72 y sin los últimos siete aminoácidos C-terminales) y la adición de un péptido Eb final (pero sin R71 y S72) en el término C del polipéptido. Esta construcción por lo regular es denominada como el multímero IGF-1-Eb. La Figura 6B muestra un polipéptido de precursor IGF-1-Eab con cuatro grupos de modificaciones: eliminación de G1, P2 y E3; mutación de R37 a A; eliminación de R71 a S72; e inserción de los aminoácidos 93 a 102 de Ea entre los aminoácidos 95 y 96 de Eb. La Figura 7A es una alineación de secuencia de IGF-1 humano (SEC ID No:1) con el IGF-1 de animal correspondiente. Todas las especies de animal se analizaron y se les proporcionaron números de acceso de Genbank correspondientes para la secuencia. G1, P3, E3 se conservaron en todas las especies analizadas, excepto Sterlet (en donde S reemplaza a P2). R36 y R37 se conservaron en todas las especies analizadas. La Figura 7B es una gráfica que muestra la filogenia de las secuencias de aminoácido analizadas comparada con IGF-1 humano (SEC ID NO:1). Abajo de árbol está una escala indicando el número de "Substituciones de Aminoácido" por 100 residuos para secuencias de proteína. La fórmula de distancia de Kimura se utiliza para calcular valores de distancia, derivados del número de incompatibilidades sin hueco y corregidos para substituciones mudas. Los valores calculados son el número medio de diferencias por sitio y caen entre cero y 1. El cero representa identidad completa y el 1 representa sin identidad. La escala de árbol filogenético utiliza estos valores multiplicados por 100. La Figura 8A es una alineación de secuencia del péptido Ea humano (SEC ID NO:2) con varios péptidos Ea de animal. Se proporcionan todas las especies de animal analizadas y sus números de acceso de GenBak correspondientes para la secuencia. R71 y S72 se conservan en todas las especies analizadas. La Figura 8B es una gráfica que muestra la filogenia de las secuencias de aminoácido analizadas comparada con la del péptido IGF-1 Ea humano (SEC ID NO:2). La Figura 9A es una alineación de secuencia para el péptido Eb humano (SEC ID NO:3) con varios péptidos Eb de animal. Se proporcionan todas las especies de animal analizadas y sus números de acceso de Genbank correspondientes para la secuencia. R71 y S72 se conservan en todas las especies analizadas. La Figura 9B es una gráfica que muestra la filogenia de las secuencias de aminoácido analizadas comparada con el péptido IGF-1 Eb humano (SEC ID NO:3). La Figura 10A es una alineación de secuencia del péptido Ec humano (SEC ID NO:4) con varios péptidos Ec de animal. Se proporcionan todas las especies analizadas y sus números de acceso de Genbank correspondientes para la secuencia. R71 y S72 se conservan en todas las especies analizadas. La Figura 10B es una gráfica que muestra la filogenia e las secuencias de aminoácido analizadas comparadas con el péptido IGF-1 Ec humano (SEC ID NO:4). La Figura 11A es una alineación de secuencia del IGF-2 humano (SEC ID NO:7) con IGF-2 de animal correspondiente. Se proporcionan todas las especies de animales analizadas y sus números de acceso de Genbank correspondientes para la secuencia. R68 se conserva en todas las especies analizadas; D9 se conserva, excepto para el chimpancé, en donde una histidina reside en esa posición. La Figura 11 B es una gráfica que muestra la filogenia de las secuencias de aminoácido analizadas comparada con IGF-2 humano (SEC ID NO:7). La Figura 12A es una alineación de secuencia del péptido IGF-2 E humano (SEC ID NO:6) con varios péptidos IGF-2 E de animal. Se proporcionan todas las especies de animal analizadas y sus números de acceso de Genbank correspondientes para la secuencia. R68 se conserva en todas las especies analizadas; D69 se conserva, excepto para el chimpancé, en donde una histidina reside en esa posición. La Figura 12B es una gráfica que muestra la filogenia de las secuencias de aminoácidos analizadas comparado con el péptido IGF-2 E humano (SEC ID NO:6).

DESCRIPCION DETALLADA DE INVENCION La invención se refiere a nuevos polipéptidos de precursor IGF-1 e IGF-2 conteniendo substancialmente un péptido E que ha sido modificado para prevenir, reducir, o evitar la escisión de proteasa típica responsable de la liberación del IGF-1 o IGF-2 activo a partir de sus péptidos E. La utilidad de los polipéptidos de la invención se basa en el descubrimiento sorprendente de que dichos polipéptidos de precursor son biológicamente activos, estables y benéficos como farmacéuticos.

Clasificación para Polipéptidos de Precursor IGF Activos La utilidad de cualquier polipéptido de la invención puede ser analizada utilizando los siguientes ensayos.

Estabilidad. Un polipéptido de la invención debe tener suficiente estabilidad en presencia de proteasas endógenas, tales como en suero humano, para ser un fármaco efectivo. Para evaluar la estabilidad, un vector de expresión que codifica el polipéptido puede ser transfectado a células Cos7 (ATCC) en un medio DMEM conteniendo 10% de suero de bovino fetal, 100 U/ml de penicilina, y 100 µg ml de estreptomicina. El medio de cultivo conteniendo polipéptidos secretados, puede ser aplicado a otro análisis, o en forma alternativa, el vector de expresión puede codificar fácilmente etiquetas disponibles, tales como una etiqueta de hexa-histidina, en el polipéptido para facilitar la purificación eficiente de los polipéptidos expresados en los cultivos de Cos7. Sin embargo, la muestra de polipéptido preparada se incubó en suero humano normal (Sigma) o en PBS durante varios tiempos (por ejemplo, 0, 1, 5, 10 y 16 horas), se sometió a electroforesis de gel de poliacrilamida, se tiñó en nitrocelulosa, y las proteínas pertinentes se visualizaron utilizando un anticuerpo primario contra IGF-1 o IGF-2 humano y un anticuerpo secundario, por ejemplo, conjugado a peroxidasa de rábano. Cualquier número técnicas de tinción y detección similares, algunas utilizando colorantes fluorescentes o aún radionúclidos, puede se ser utilizado. La intensidad de la banda de precursor contra la intensidad de la banda de IGF-1 o IGF-2 debe indicar el grado al cual el polipéptido de precursor es cortado bajo varias condiciones. Un polipéptido de la invención que se expone a suero humano durante 16 horas a 37°C puede exhibir una relación de precursor no cortado a IGF madura cortado de aproximadamente 1:2 a 1:01, por ejemplo, aproximadamente de 1:1 a 1:0.5, en particular una relación de aproximadamente 1:1 o una relación de aproximadamente 1:0.5. Típicamente, el precursor debe exhibir una relación de por lo menos 1:1. Fosforilación de AKT. Un polipéptido de la invención debe mantener la habilidad de señalar a través del receptor IGF-1. (Tanto IGF-1 como IGF-2 señalan a través del receptor IGF-1). Para determinar esta habilidad de señalización, se puede valorar si un objetivo intracelular corriente abajo, AKT, es fosforilado en respuesta a la unión de ligando en la superficie de la célula. Para el análisis de fosforilación AKT, los mioblastos C2C12 se privaron de medio libre de suero y después se estimularon con diferentes ligandos. Las células se Usaron y se limpiaron a través de centrifugación. La fosforilación AKT y los niveles totales de AKT se analizaron a través de ELISA utilizando el equipo ELISA de emparedado de fosfo AKT (Ser473) PathScan y el equipo ELISA de emparedado de AKT PathScan (Cell Signaling), respectivamente.

Carácter Especifico del Recepto IGF-1. Un polipéptido de la invención de preferencia mantiene el carácter específico para el receptor IGF-1 y se debe unir al receptor de insulina relacionado con baja afinidad. Para valorar el carácter específico, se agregaron muestras de polipéptido a células NIH3T3 privadas de suero, sobre-expresando el receptor IGF-1 o el receptor de insulina, y el nivel de fosforilación del receptor IGF-1 o fosforilación de receptor de insulina se determinó a través de lisis de las células y sometiendo los lisatos a ELISA utilizando el equipo ELISA del receptor fósforo-IGF-1 humano y receptor de insulina DuoSet IC (R&D Systems).

Prueba In Vitro en Modelos de Ratón de Hipertrofia. Para determinar si un polipéptido de la invención puede actuar para incrementar la masa músculo-esquelética bajo un contexto que ya conduce a hipertrofia muscular, se pueden someter animales tratados y no tratados, a ejercicio y determinar si los animales que reciben el potipéptido desarrollan músculos más grandes que los animales no tratados.

Modelos de Ejercicio Un modelo conocido en la técnica se basa en el uso de un voluntario que corre una rueda con cargas de usuario variables (ver, por ejemplo, Am J Physiol Heart Circ Physiol 289:H455-H465, 2005). La rueda de caja de voluntario elimina agravios físicos y fisiológicos que son comunes en modelos de ejercicio forzado, y, por lo tanto, son más apropiados para evaluar fármacos candidatos y que se utilizan en individuos relativamente saludables para quienes es deseable la masa muscular. Se puede utilizar cualquier raza de ratón adecuada. Por ejemplo, se pueden asignar aleatoriamente ratones C57B1/6J machos a grupos experimental (por ejemplo, que reciben el polipéptido del precursor IGF) y de control. Los animales se alojaron individualmente en una jaula conteniendo una rueda de ejercicio; los animales de control sedentarios se alojaron en jaulas idénticas sin la rueda. Las ruedas de ejercicio se describen por Alien y otros, J Appl Physiol 90:1900-1908, 2001. En resumen, el sistema consiste de una rueda con un diámetro de 11.5 cm con una superficie para correr de 5.0 cm (modelo 6208, Petsmart, Phoenix, AZ) equipado con un contador magnético digital (modelo BC 600, Sigma Sport, Olney, IL) que se activa a través de la rotación de la rueda. Además, cada rueda está diseñada por ingeniería con un mecanismo de resistencia que permite el ajuste de la carga. Esto se logra uniendo una linea, de acabado de acero inoxidable, a la parte superior de la jaula y envolviendo el cable alrededor de una polea inmóvil que está asegurada a la rueda de la jaula en el eje de rotación para no contribuir a la carga de la rueda. El cable otra vez se asegura a la parte superior de la jaula con resorte y tornillo. Este diseño permite hacer ajustes finos a la carga de la rueda, la cual finalmente se distribuye a través de la rotación de la rueda. Los valores de ejercicio diarios para tiempo y distancia de carrera se registran para cada animal ejercitado a través de la duración del período de ejercicio. A todos los animales se les dio agua y comida dura estándar para roedor, como se desee. La carrera voluntaria (exposición a la rueda de la jaula) puede empezar a una edad promedio de 12 semanas para todos los grupos. Cada grupo continúa corriendo bajo resistencia variable, dependiendo del grupo experimental, durante 50 días hasta que los animales tienen una edad de aproximadamente 19 semanas. La carga sobre la rueda se determinó colgando pesos conocidos en la rueda hasta que la rueda se desplazó ligeramente. Todos los grupos de ejercicio comienzan sin ninguna carga en la rueda de la jaula durante la primera semana. Sin embargo, la condición de "sin carga" es en realidad de 2 g, la cual se determina como la carga necesaria para mantener la inercia de la rueda y la carga friccional. Considerando un período de aclimatación de rueda durante 1 semana, las cargas de rueda pueden ser cambiadas a intervalos de una semana, excepto para cargas más alta, las cuales pueden ser cambiadas después de 2 semanas. El rango de cargas puede ser cualquiera de 2 g hasta 12 g. Los animales con ejercicio y los de control sedentarios se sacrificaron (eutanasia) a través de dislocación cervical bajo anestesia inhalada, inmediatamente después del término del período específico de ejercicio. Se midió la masa corporal, y músculos específicos se ejercitaron rápidamente, se lavaron y se congelaron para ensayos histológicos o bioquímicos para un futuro. También están disponibles modelos de hipertrofia de ejercicio alternativos, para aquellos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, el modelo de ejercicio de rueda de molino descrito por Lerman y otros, J Appl Physiol 92:2245-2255, 2002.

Modelo de Inyección de Clenbuterol El clenbuterol es un agonista 2-adrenérgico con propiedades promotoras de crecimiento que ocasionan un incremento documentado en la masa muscular. El mecanismo preciso de la acción del clenbuterol permanece turbio, aunque se ha propuesto una reducción en la degradación de la proteína del músculo. Clínicamente, el clenbuterol se usa como un fármaco antí-asma, pero parece ser muy mal usado como un agente de construcción de cuerpo para incrementar la masa muscular tanto en seres humanos como en animales de muestra. A cinco ratones se les dio diariamente una inyección de clenbuterol (3 mg/kg, subcutánea (s.c.)) durante 3, 7, ó 14 días para inducir hipertrofia muscular. Los ratones inyectados con PBS sirvieron como control negativo. Los animales se verificaron diariamente (inspección visual) para cualesquiera reacciones adversas (es decir, pelaje desgreñado, letárgico) al tratamiento. El tratamiento con clenbuterol tiene el potencial de hacer ratones más atemorizados o agresivos, por lo que los ratones deben se especialmente verificados en cuanto a peleas si está alojados en grupos. Los ratones se mueven y pueden comer y beber normalmente. Los ratones se inspeccionaron diariamente hasta que fueron sacrificados (eutanasia) en el día 3, 7 ó 14, y el tejido se recogió para otro análisis.

Prueba In Vivo en Modelos de Atrofia Muscular. En varios modelos de atrofia músculo-esquelética, un polipéptido del precursor IGF de la invención puede ser probado para la habilidad para mantener la masa muscular bajo condiciones que generalmente reducen la masa muscular. Con los modelos ilustrativos descritos más adelante, el experto en la técnica puede fácilmente diseñar e implementar experimentos controlados involucrando la administración y el uso de polipéptidos del precursor IGF para determinar si dichos polipéptidos pueden incrementar la masa muscular. Por ejemplo, los ratones C57B16/2 machos se compraron en The Jackson Laboratories. Los ratones se compraron de manera que tuvieran una edad de aproximadamente 9 semanas al inicio de cada experimento. Generalmente, los ratones se alojaron en jaulas microaislantes con comida normal para roedor. Al inicio de cada experimento, los ratones se pesaron. Al final de cada experimento, los ratones generalmente se sacrificaron (eutanasia) a través de inhalación de C02 seguido por dislocación cervical, y los tejidos musculares se cosecharon para procesamiento adicional. Los ratones se pesaron para proporcionar el "peso corporal final". Los músculos esqueléticos que pueden ser cosechados son músculo tibial anterior, digitorum longus extensor, soleo, y músculos gastrocnemio (músculo de pantorri lia). Otros tejidos cosechados ocasionalmente son: corazón, hígado, bazo, ríñones, testículos y cerebro. Todos los músculos y tejidos son completamente disectados (cortados en pequeños pedazos) y pesados en una pesa capaz de medir a 0.0001 g. Después, los tejidos son congelados en nitrógeno líquido para extracción posterior de ARN y proteína, o congelados y embebidos en OCT sobre un disco de corcho. Los músculos congelados sobre un disco de corcho, para un crio-seccionamiento posterior, se sumergieron en isopentano frío a un lodo espeso a través de nitrógeno líquido. Todas las muestras se almacenaron a -80°C.

Tratamiento de Dexametasona Un método farmacológico para inducir el lavado de músculo en ratones es una inyección intraperitoneal diaria con dexametasona a 20 mg/kg. La dexametasona es un miembro sintético de la clase de glucocorticoide de hormonas. Actúa como un anti-inf lamatorio e inmunosupresor, con una potencia de aproximadamente 40 veces aquella de la hidrocortisona. La dexametasona se utiliza para tratar muchas condiciones inflamatorias y autoinmunes, por ejemplo, artritis reumatoide. También se da a pacientes con cáncer que experimentar quimioterapia, para contrarrestar ciertos efectos laterales de su tratamiento anti-tumoral . La dexametasona ocasiona atrofia muscular tanto en ratones como en pacientes seres humanos.

Los ratones se inyectaron intraperitonealmente (ip) con dexametasona durante 3, 7 ó 14 días. En los sujetos de día terminal se sacrificaron (eutanasia) utilizando C02 y se cosecharon los músculos de las patas. Los animales se verificaron diariamente (inspección visual) para cualesquiera reacciones adversas (es decir, pelaje desgreñado, letárgico) al tratamiento. Los ratones usualmente se mueven, y pueden comer y beber agua normalmente. Los ratones inyectados con PBS son el control negativo.

Inmovilización con Yeso El desuso físico de varios grupos de músculos da como resultado atrofia de esos músculos. La sujeción de la articulación del tobillo ("talón inmovilizado" o enyesado) ha probado ser una forma altamente útil y reproducible para inducir inmovilización física de la musculatura de la extremidad trasera de rata y ratón. Los ratones se anestesiaron con isofluorano para inmovilización. Las articulaciones del tobillo y rodilla se fijaron a 90 grados con un material de yeso de peso ligero (VET-LITE) alrededor de las articulaciones. El material se sumergió en agua caliente y después se envolvió alrededor de la extremidad, dejando los dedos de la pata y articulación de la cadera, libres. Las articulaciones se mantienen a posiciones de 90° hasta que el material de yeso se seca. La extremidad contra-lateral sirve como control. Los ratones después se dejaron recuperar de la anestesia y se alojaron en jaulas de micro-aislamiento normales. No se ha observado que la colocación deceso ocasione tensión excesiva, y los animales se movieron libremente en la jaula para comer y tomar agua. Los ratones, sin embargo, se verificaron diariamente para cualquier evento adverso que afectara el peso del cuerpo, actividad e irritaciones. Una ves que se aplica el yeso a un ratón, el animal es verificado diariamente para asegurarse de que el yeso permanece en su lugar, ya puede presentarse el mascado. Los animales pueden moverse, tomar agua y comer después de la recuperación de la anestesia, y no requieren de reposo especial, estar en la jaula u otra asistencia.

Desnerviación En general, los ratones se anestesiaron con gas isofluorano para la desnerviación. Utilizando procedimientos quirúrgicos asépticos (tres lavados de betadina con un lavado final con etanol), el nervio ciático derecho se aisló en el muslo medio y un corte de 2 a 5 mm. La extremidad contra-lateral sirvió como control. Más específicamente, la incisión en la piel se cerró con un sujetador de sutura, y los animales se inyectaron con una dosis individual de buprenorfina que permitió su recuperación de la anestesia. Después de tres, siete o catorce días de la cirugía, los animales fueron sacrificados (eutanasia) a través de inhalación de C02 seguido por dislocación cervical, y se removieron los músculos (gastrocnem io complejo, tibial anterior, digitorum longus extensor, soleo) para análisis histológicos y bioquímicos. Dado que el nervio ciático se cortó transversalmente, la extremidad afectada queda inmóvil para inducir atrofia músculo esquelética de los músculos involucrados. El animal. De otra manera, puede moverse, beber agua, y comer después de la recuperación de la anestesia y no requiere de reposo especial, estar en jaula u otra asistencia. Sin embargo, los animales se verificaron inmediatamente después de la cirugía y durante la recuperación (1-2 horas). Además, los sitios de incisión y salud en general del animal se verificaron durante 3 días después de la cirugía. El sujetador de sutura se removió a los 7 a 10 días después de la cirugía.

Modelos Genéticos También se pueden utilizar ratones transgénicos genéticamente manipulados como móldeos de atrofia muscular. Por ejemplo, los así llamados Mini Ratones (The Jackson Laboratory, existencia No. 003258) contienen una mutación de ataque en el gen IGF- que da como resultado un crecimiento pos-natal anormalmente reducido, así como bajo peso corporal y tamaño. Para información adicional, ver Powell-Braxton y otros, Genes Dev 7:2609-2617, 1993. Además, los así llamados Mini Ratones (The Jackson Laboratory, existencia No. 003259) contiene una mutación diferente en el gen IGF-1 que da como resultado un hipomorfo exhibiendo bajo peso corporal en adultos y otros fenotipos cardiovasculares. Para información adicional, ver Lembo y otros, J Clin Invest 98:2648-2655, 1996.

Mutaciones o Modificaciones Críticas y Opcionales en ios Precursores IGF Mutaciones Críticas. La invención se basa en parte en la observación de que un polipéptido de precursor IGF que contiene substancialmente su péptido E, permanece bioactivo y estable en presencia de suero. Para asegurar que el péptido E no se corta a través de proteasas endógenas que tienen como objetivo el sitio de proteasa dibásica, en general cualquiera de los dos aminoácidos dibásicos N-terminal del péptido E en el precursor en eliminado, mutado, o de otra manera enmascarado. En el caso de hlGF-1, estos dos aminoácidos son R71 y S72, mientras en el caso de hlGF-2, estos dos primeros aminoácidos son R68 y D69. Una variedad de modificaciones permite es prevención de escisión: (1) Eliminación de uno o ambos residuos dibásicos (2) Mutar uno ambos residuos dibásicos a un aminoácido no básico, tal como alanina (3) Insertar uno o más aminoácidos no básicos entre los residuos dibásicos (4) Colocar un sitio de glicosilación cerca de los residuos dibásicos suficientes para enmascarar el sitio de proteasa (5) Pegilacion dirigida al sitio utilizando el reemplazo de cualquier residuo dibásico, o inserción cerca de o entre los residuos dibásicos, con un aminoácido no natural, como se describe más adelante. Además, los residuos K68 y K65 parece que juegan un papel importante en la escisión de IGF-1 /péptido E; por consiguiente, las mutaciones o eliminaciones de estos residuos pueden ser incorporadas en cualquiera de los aminoácidos tácticos dirigidos a los aminoácidos dibásicos, como se describió anteriormente.

Mutaciones en el Término N ríe IGF Maduro. En ciertas modalidades de la invención, los polipéptidos de precursor IGF tienen eliminaciones o mutaciones de los primeros pocos aminoácidos N-terminales. En el caso de IGF-1, cualquiera de los tres primeros aminoácidos N-terminales puede ser eliminado o mutado, mientras que en el caso de IGF-2, cualquiera de los primeros seis aminoácidos N-terminales puede ser eliminado o mutado. Se ha observado que ciertos aminoácidos N-terminales son naturalmente cortados in vivo, y la introducción de estas mutaciones o eliminaciones reduce al mínimo las asociaciones ¡n vivo de los polipéptidos de la invención con proteinas de unión IGF (IGFBPs). La interacción de IGF-1 e IGF-2 con el receptor de IGF-1 se regula a través-de IGFBPs. Los seis IGFBPs han mostrado inhibir la acción de IGF (particularmente, IGFBP5), pero en algunos casos se ha observado un efecto estimulante. Por lo menos un 99% del IGF en la circulación está normalmente unido a IGFBPs. El IGFBP más abundante en la circulación después de período neonatal es IGFBP3, el cual puede unir tanto IGF-1 como IGF-2 con afinidades similares. El IGF-1 truncado de existencia natural (llevando eliminación de G1, P2 y E3) se une a IGFBP3 con varias veces más baja afinidad que el IGF-1 natural. Además, G3 es importante para la unión de IGFBP, y G6 juega un papel similar en el péptido IGF-2. Por consiguiente, en el caso del precursor hlGF-1, cualquiera de G1, P2 o E3 puede ser eliminado o mutado ya sea solo o en combinación. Cuando se desea una mutación, se puede introducir una mutación a alanina. En otro ejemplo, en el caso del precursor hlGF-2, cualquiera de P4, S5 y E6 puede ser eliminado o mutado ya sea solo o en combinación. Cuando se desea una mutación, se pueden introducir una mutación a alanina.

Mutaciones en los Residuos 36 y 37. El IGF-1 puede ser cortado a través de proteasas de serina presentes en el suero humano. La mutación ya sea de R36 o R37 a A puede evitar la escisión de IGF-1 en este sitio de escisión pronosticado entre R36 y R37. En el caso de hlGF-2, R28 puede ser mutado o eliminado para prevenir esta escisión destructiva.

Uso de Glicosilación. La vida media in vivo de los polipéptidos de la presente invención puede ser mejorada a través de la adición de sitios de glicosilación N-enlazados ya sea al IGF o a las porciones del péptido E del precursor cuando se expresa en células de mamífero u otras células eucarióticas capaces de glicosilación N-enlazada. Se ha mostrado in vitro que el IGF-1 Ea humano es glicosilado en N92 y N100, ya que estas porciones de Ea adecúan la secuencia de glicosilación N-enlazada de consenso de N-X-S/T, en donde X puede ser cualquier aminoácido y el tercer aminoácido del triplete es ya sea S o T. también se sabe que el contexto de aminoácido adyacente del consenso afectará que tan fuerte se glicosila la asparagina. Por lo tanto, una estrategia para introducir un sitio de glicosilación en Eb o Ec es insertar aminoácidos Ea alrededor de la secuencia de consenso en aproximadamente la misma parte de Eb o Ec. Una implementación particular de esta estrategia se ilustra en los Ejemplos más adelante. En cualquier caso, cualquier sitio de glicosilación N-enlazado de consenso, incluyendo aminoácidos de contexto circundantes, conocido por aquellos expertos en la técnica, puede ser insertado en un polipéptido precursor de la invención. Además, la glicosilación O-enlazada de un polipéptido de la invención puede ser lograda eligiendo el huésped particular usado para la producción del polipéptido. Por ejemplo, el uso de ciertas cepas de levadura para la expresión de IGF-1 da como resultado la adición de oligosacáridos en una serina o treonina. Ver, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,272,966.

Adición de Glicol Polietilénico. La conjugación a glicol polietilénico (PEG; pegilación) ha probado ser benéfica para prolongar la vida media de fármacos de proteínas terapéuticos. Se espera que la pegilación de los polipéptidos del precursor IGF de la invención pueda dar como resultado ventajas farmacéuticas similares. En la técnica, se conocen muy bien métodos de pegilación de IGF-1. ver, por ejemplo, la publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. 2006/0154865, que describe las propiedades benéficas de IGF-1 monopegilada con lisina. Dicha monopegilación con lisina puede ser adaptada para los polipéptidos del precursor IGF de la invención. Además, la pegilación puede lograrse en cualquier parte de un polipéptido de la invención a través de la introducción de un aminoácido no natural. Ciertos aminoácidos no naturales pueden ser introducidos a través de la tecnología descrita por Deiters y otros, J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003; Wang y Schultz, Science 301:964-967, 2003; Wang y otros, Science 292:498-500, 2001; Zhang y otros, Science 303:371-372, 2004 o en la patente de E.U.A. No. 7,083,970. En resumen, algunos de estos sistemas de expresión involucran mutagénesis dirigida al sitio para introducir un codón de no sentido, tal como TAG ámbar, en el marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de la invención. Dichos vectores de expresión después son introducidos en un huésped que puede utilizar ARNt específico para el codón de no sentido introducido y cargado con el aminoácido no natural de elección. Los aminoácidos no naturales particulares que son benéficos para propósitos de conjugar porciones a los polipéptidos de la invención, incluyen aquellos con cadenas laterales de acetileno y azido. Los polipéptidos del precursor IGF que contienen estos aminoácidos novedosos después pueden ser pegilados en estos sitios de elección en la proteína. Además, dichas moléculas IGF pegiladas sin los péptidos E también son útiles como terapéuticos.

Mutaciones de Péptidos E. En ciertos contextos farmacológicos, es benéfico incrementar el tamaño de un fármaco de péptido o proteína para asegurar que el fármaco permanece sobre el lado de la barrera hemato-encefálica o el otro. Ya que las moléculas de IGF maduras son péptidos relativamente cortos, aún si el péptido E permanece unido, puede ser benéfico incrementar el tamaño de los polipéptidos de la invención. Un medio para hacer esto e proporcionar multímeros de péptidos E en el término C del polipéptido de precursor IGF, como se ilustra en ciertos de los Ejemplos descritos más adelante.

Eliminación C-Terminal ríe Péptidos E. Se sospecha que la cisteína libre en la posición 81 de Eb puede dar como resultado la homodimerización u otros efectos que, cuando están presentes en los polipéptidos de la invención, puede conducir a fármacos de actividad inferior. De esta manera, la eliminación o mutación de C81 en Eb puede optimizar la actividad del fármaco. En un ejemplo particular, la eliminación de por los menos siete aminoácidos de Eb (es decir, los aminoácidos 81-87) es benéfica.

Otras Mutaciones o Modificaciones. Las mutaciones o modificaciones adicionales de IGF que se pueden incorporar en los polipéptidos del precursor IGF de la invención se describen en la patente de E.U.A. No. 5,077,276; y las Publicaciones de Solicitud de Patente de E.U.A. Nos. 2005/0287151, 2006/0211606, y 2006/0166328. La invención debe ser construida, además de IGF-1 e IGF-2 humanos, para incluir todas las secuencias de IGF-1 o IGF-2 precursor de animal que no es un ser humano conocidas y desconocidas, que contienen substancialmente su péptido E, en donde la escisión normal del péptido E es evitada o reducida de acuerdo con las modificaciones de la presente invención. El tipo preferido de IGF que se utilizará depende de la especie del sujeto que va a ser tratado. Se prefiere que el IGF sea de una especie coincidente, por ejemplo, cuando se va a tratar una vaca, el tipo preferido de IGF es IGF de bovino. Aunque todas las formas de IGF probablemente tienen un efecto en diferentes sujetos debido a las altas homologías de secuencia, las especies coincidentes evitarán complicaciones inmunológicas adversas potenciales que descienden de la inducción de una respuesta inmune a un IGF de una especie diferente. En una modalidad de la invención, se proporcionan secuencias de IGF-1 precursor de animal, que no es un ser humano, modificadas.

Se prefieren las secuencia del precursor IGF-1 que contienen su péptido E, en donde la escisión normal del péptido E es evitada o reducida de acuerdo con las modificaciones de la presente invención de un animal vertebrado. Por ejemplo, dichas secuencias incluyen, pero no se limitan a, secuencias de un ratón, rata, vaca, cerdo, caballo, oveja, cabra, ave, perro, gato, pez, y similares, de cualquier fuente, ya sea natural, sintética o recombinante. En otra modalidad de la invención, se proporcionan secuencias de precursor IGF-2 de animal, que no es un ser humano, modificadas. Se prefieren secuencias de precursor IGF-2, que contienen substancialmente su péptido E, en donde la escisión normal del péptido E es evitada o reducida de acuerdo con modificaciones de la presente invención de un animal vertebrado. Por ejemplo, dichas secuencias incluyen, pero no se limitan a, secuencias de un ratón, rata, vaca, cerdo, caballo, oveja, cabra, ave, perro, gato, pez, y similares, de cualquier fuente, ya sea natural, sintética o recombinante.

Uso Terapéutico de Polipéptidos del Precursor IGF Indicaciones. La invención también incluye el uso de un polipéptido del precursor IGF de la invención en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad músculo-esquelético. Además, la invención incluye el uso de polipéptidos del precursor IGF para incrementar la masa muscular u ósea en un individuo, si dicho individuo está o no en riesgo de o tener una enfermedad músculo-esquelética. En particular, la enfermedad músculo-esquelética puede ser atrofia muscular. Existen muchas causas de la atrofia muscular, incluyendo como resultado de un tratamiento con glucocorticoides, tales como cortisol, dexametasona, betametasona , prednisona, metilprednisolina, o prednisolona. La atrofia muscular también puede ser el resultado de desnerviación debido a trauma nervioso o como resultado de neuropatía degenerativa, metabólica o inflamatoria (por ejemplo, síndrome de Guillian-Barré, neuropatía periférica, o exposición a toxinas o fármacos ambientales). Además, la atrofia muscular puede ser el resultado de una enfermedad de neuronas motoras en adultos, atrofia muscular espinal infantil, atrofia muscular espinal juvenil, neuropatía de motor autoinmune con bloqueo conductor multifocal, parálisis debido a ataque o daño de médula espinal, inmovilización del esqueleto debido a trauma, reposo prolongado en cama, inactividad voluntaria, inactividad involuntaria, tensión metabólica o insuficiencia nutricional, cáncer, SIDA, ayuno, rabdomiolisís, un trastorno de la glándula tiroides, diabetes, hipotonía congénita benigna, enfermedad del núcleo central, miopatía de nemaleno, miopatía miotubular (centronuclear), daño por quemaduras, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad del hígado, sepsis, falla renal, falla cardiaca congestiva, o envejecimiento.

La enfermedad músculo-esquelética también puede ser un síndrome de distrofia muscular, tal como Duchenne, Becker, miotónica, facioescalpopulmonar, Emery-Deifuss, oculofanringea, escalpulohumeral, arco de extremidad, una distrofia muscular congénita, o miopatía distal hereditaria. La enfermedad músculo-esquelética también puede ser osteoporosis, una fractura de hueso, talla corta, o enanismo. El IGF-1 se sugiere como un tratamiento para diabetes insensible a insulina, ya que IGF-1 también puede unir heterodimeros del receptor de IGF-1 y receptor de insulina. Por consiguiente, los polipéptidos de la invención pueden ser usados para tratar diabetes.

El IGF-1 es neurotrófico e incrementa la supervivencia de neuronas. Se ha sugerido que IGF-1 sea utilizado para tratar casos de muerte de motor-neurona tal como se ve en esclerosis lateral amiotrófica (ALS), atrofia cerebral, envejecimiento y demencia. Por consiguiente, los polipéptidos de la invención pueden ser utilizados para tratar condiciones asociadas con muerte neuronal, tal como ALS, atrofia cerebral, o demencia. El IGF-1 incrementa las poblaciones tanto de glóbulos blancos como de rojos y tiene un efecto aditivo a la administración de eritropoyetina. Por consiguiente, los polipéptidos de la invención pueden ser utilizados para tratar demencia. Ya que IGF-1 e IGF-2 son reguladores ubicuos y esenciales de la división celular y crecimiento de vertebrados, ventajosamente pueden ser utilizados en una variedad de métodos veterinarios para mejorar exógenamente o mantener el crecimiento en un animal. Algunos ejemplos incluyen, pero no se limitan a: (i) mejorar la velocidad y/o grado de crecimiento en un animal, por ejemplo, mejorando el crecimiento de músculo en cerdos, ganado, aves de corral y peces; (¡i) mejorar la eficiencia de su conversión de alimento en el tejido del cuerpo (relación de magro a grasa), por ejemplo, en cerdos, ganado, ovejas, aves de corral y peces; y (iii) mejorar la producción de lecha en animales lactantes, por ejemplo, vacas lecheras, ovejas, cabras. Otras aplicaciones terapéuticas veterinarias incluyen, pero no se limitan a: (iv) tratar síntomas de desperdicio en animales asociados con caquexia, trauma u otras enfermedades de consumo, por ejemplo, en animales domésticos tales como perros, gatos, y caballos; y (v) tratar animales lactantes para mejorar la salud neonatal, por ejemplo, cerdas lactantes, para mejorar el rendimiento neonatal.

Métodos de Administración. Los polipéptidos de la invención pueden ser suministrados en una variedad de formas, incluyendo el uso de vehículos de suministro de gen. Se pueden utilizar métodos conocidos en la técnica para el suministro terapéutico de agentes tales como proteínas o ácidos nucleicos para el suministro terapéutico de un polipéptído de la invención, por ejemplo, transfección celular, terapia e gen, administración directa con un vehículo de suministro, o vehículo farmacéuticamente aceptable, suministro indirecto proporcionando células recombinantes que contienen un ácido nucleico que codifica el polipéptido. Se varios sistemas de suministro y se pueden utilizar para administrar el polipéptido de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar la proteína, endocitosis mediada por receptor (ver, por ejemplo, Wu y Wu, J Biol Chem 262:4429-4432, 1987), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral, viral adeno-asociado, adenoviral, viruela viral (por ejemplo, viruela de aves viral, particularmente viruela de aves de corral viral) u otro vector, etc. Los métodos para la introducción pueden se entérales o parenterales e incluyen, pero no se limitan a, ¡ntradérmica, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, pulmonar, ¡ntranasal, infraocular, epidural, y rutas orales. Los polipéptidos pueden ser administrados a través de cualquier ruta conveniente, por ejemplo, a través de infusión o inyección de bolo, a través de absorción mediante forros epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y se pueden administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, puede ser deseable introducir las composiciones farmacéuticas de la invención en el sistema nervioso central a través de cualquier ruta adecuada, incluyendo inyección intraventricular e intratecal; la inyección intraventricular puede ser facilitada a través de un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un depósito, tal como un depósito de Ommaya. También se puede emplear la administración pulmonar, por ejemplo, a través del uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente de aerosolización . En una modalidad específica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención localmente al área que necesita el tratamiento; esto puede lograrse, por ejemplo, y no en forma de limitación, a través de infusión local durante cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, a través de inyección, a través de un catéter, o a través de un implante, el implante siendo un material poroso, no poroso, o gelatinoso, incluyendo membranas tales como membranas sialásticas, fibras, o substitutos comerciales de piel. En otra modalidad, el agente activo puede ser suministrado en una vesícula, en particular un liposoma (ver, Langer, Science 249:1527-1533, 1990). En otra modalidad más, el agente activo puede ser suministrado en un sistema de liberación controlada. En una modalidad, se puede utilizar una bomba. En otra modalidad, se pueden utilizar materiales poliméricos (ver, Howard et al., J Neurosurg 71:105, 1989). En otra modalidad, en donde el agente activo de la invención es un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención, el ácido nucleico puede ser administrado in vivo para promover la expresión de su proteína codificada, construyéndolo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándolo de manera que se vuelve intracelular, por ejemplo, a través del uso de un vector retroviral (ver, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 4,980,286), o a través de inyección directa, o a través del uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola de gen; Biolistic, DuPont), o cubriendo con lípidos o receptores de superficie de célula o agentes de transfección, o administrándolo en unión a un péptido de tipo homeocaja (homeobox) que es conocido por entrar al núcleo (ver, por ejemplo, Joliot y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:1864-1868, 1991), etc. Alternativamente, un ácido nucleico puede ser introducido intracelularmente e incorporarse dentro del ADN de la célula huésped para expresión, a través de recombinación homologa.

Transfección Celular y Terapia de Gen. La presente invención abarca el uso de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de la invención para la transfección de células in vitro e in vivo. Estos ácidos nucleicos pueden ser insertados en cualquier número de vectores bien conocidos para la transfección de células y organismos objetivo. Los ácidos nucleicos son transfectados en células ex vivo e in vivo, a través de la interacción del vector y la célula objetivo. Las composiciones se administran (por ejemplo, a través de inyección a un músculo) a un sujeto en una cantidad suficiente para producir una respuesta terapéutica. En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar un sitio objetivo, es decir, una célula o tejido objetivo, en un ser humano u otro animal, que incluye transfectar una célula con un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención, en donde el ácido nucleico incluye un promotor inducible operablemente enlazado al ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión objetivo. Para procedimientos de terapia de gen en el tratamiento o prevención de enfermedad de seres humanos, ver por ejemplo, Van Brunt Biotechnology 6:1149-1154, 1998.

Terapias de Combinación. En numerosas modalidades, los polipéptidos de la presente invención pueden ser administrados en combinación con uno o más compuestos o terapias adicionales. Por ejemplo, se pueden co-administrar múltiples polipéptidos junto con uno o más compuestos terapéuticos. La terapia de combinación puede abarcar administración simultánea o alterna. Además, la combinación puede abarcar administración aguda o crónica. Los polipéptidos de la invención pueden ser administrados en combinación con agentes anabólicos tales como testosterona o moduladores de receptor de andrógeno específicos (SARMs). Otros agentes anabólicos adicionales incluyen hormona de crecimiento (GH) o moléculas que inducen la liberación de GH. La Ghrelin (hormona producida por células del estómago) es particularmente útil en una terapia de combinación para caquexia, ya que la Ghrelin puede ocasionar un incremento en el apetito. En una vena similar, los polipéptidos de la invención pueden ser combinados con suplementos proteinicos para incrementar el anabolismo, o combinarse con terapia física o ejercicio para incrementar el peso del cuerpo. Cualquier molécula que inhiba miostatina también es un candidato para terapia de combinación.

Composiciones Farmacéuticas. La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de precursor IGF de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno Federal o Estatal o listado en U.S. Pharmacopeia u otra farmacopea generalmente reconocida para usarse en animales o seres humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, auxiliar, excipiente, o portador, con el cual se administra el terapéutico. Dichos vehículos o portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, aceite de ajonjolí y similares. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, greda, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada seca, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsificantes, o agentes reguladores de pH. Estas composiciones pueden tener la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida, y similares. La composición puede ser formulada como un supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir vehículos estándares tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin. En algunas modalidades, la composición se formula de acuerdo con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a seres humanos. Cuando es necesario, la composición también puede incluir un agente solubilización y un anestésico local tal como lidocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. Cuando la composición va a ser administrada a través de infusión, ésta puede ser surtida con una botella de infusión conteniendo agua o salida de grado farmacéutico estéril. Cuando la composición se administra a través de inyección se puede proporcionar una ampolla de agua o salina estéril para inyección, de manera que los ingredientes pueden ser mezclados antes de la administración. Los polipéptidos de la invención pueden ser formulados como formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con grupos amino libres tales como aquellos derivados de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y aquellos formados con grupos carboxilo libres tales como aquellos derivados de hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilam ¡no etanol, histidina, procaína, etc. La cantidad de un polipéptido de la invención que será efectiva en el tratamiento de una condición o enfermedad puede ser determinada a través de técnicas clínicas estándares basándose en la presente descripción. Además, opcionalmente se pueden emplear ensayos in vitro para ayudar a identificar escalas óptimas de dosis. La dosis precisa que será empleada en la formulación también dependerá de la ruta de administración, y la seriedad de la condición, y debe ser decidida de acuerdo con el juicio del practicante y circunstancias de cada sujeto. Sin embargo, las escalas adecuadas de dosis para administración intravenosa son en general de aproximadamente 20-5000 microgramos del compuesto activo por kilogramo del peso del cuerpo. Las escalas adecuadas de dosis para administración ¡ntranasal son en general de aproximadamente 0.01 pg/kg del peso del cuerpo a 1 mg/kg del peso del cuerpo. Las dosis efectivas pueden ser extrapoladas a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba de modelo de animal o in vitro. En particular, un posible régimen de dosis puede ser de aproximadamente 60 a 120 µg/kg del peso del cuerpo, de inyección subcutánea, dos veces al día.

Usos Veterinarios Además de los métodos antes mencionados de administración en seres humanos, existen consideraciones adicionales para la administración veterinaria. La dosis puede diferir cuando se administra a un animal saludable contra aquellos animales que padecen una enfermedad. Una evaluación de la dosis apropiada se puede hacer fácilmente por aquellos expertos en la técnica utilizando ensayos conocidos e el campo, por ejemplo, el ensayo de proliferación de mioblasto (Ejemplo 79) o el ensayo de tejido epitelial mamario (Ejemplo 80) como se describe más adelante. En la técnica, también son conocidos ensayos generales para medir el IGF, tales como aquellos del Ejemplo 81. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que algunas especies de animal exhiben fertilidad de temporada influenciada por la duración del fotoperiodo. Cualquier modalidad de un método o uso veterinario opcionalmente puede incluir empezar el método de tratamiento en un tiempo especifico dentro del ciclo reproductivo del animal con el fin de obtener el efecto deseado. Aquellos expertos en la técnica conocerán que el estado y ciclo reproductivos pueden ser fácilmente determinados, y, si se desea, sincronizarse a través del uso de un régimen apropiado. Cuando se usan para indicaciones veterinarias, además de los métodos previamente mencionados para uso humano, el péptido IGF-1 o IGF-2 de la presente invención también puede ser utilizado como una dosis purgativa oral, o suplemento para alimentos orales o sólidos para animales. La invención además se describe, pero no se limita a través de los siguientes Ejemplos EJEMPLOS EJEMPLO 1 Se construyó un vector de expresión de ADN que codifica el polipéptido de precursor hlGF-1-Ea conteniendo las siguientes modificaciones: eliminación de G1, eliminación de P2 y eliminación de E3; mutación de R37 a A; y eliminación de R71 y eliminación de S72. Estas mutaciones son algunas veces denominadas como "3mut" a través de la presente descripción. Esto da como resultado la siguiente secuencia de proteína secretada: tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa vraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEC ID NO:8) Se mantuvieron células Cos7 (disponibles de ATCC) en medio DMEM conteniendo 10% de suero de bovino fetal, 100 U/ml penicilina, y 100 pg/ml estreptomicina y se colocaron en placas a una densidad de 1 x 106 células por placa de 10 cm. Estos cultivos de células fueron transf ectados con 8 pg de plásmido de expresión utilizando Fungene (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 24 horas de la transfección , las células se lavaron una vez y se cultivaron en un medio libre de suero durante 48 horas. Los sobrenadantes se recogieron y se almacenaron a - 80°C. Con el fin de evaluar la estabilidad del polipéptido en el suero humano, los sobrenadantes recogidos de las células Cos7 transfectados con hlGF-1Ea de tipo silvestre (wt), y hlGF-1 Ea3mut, se incubaron durante 16 horas a 37°C ya sea en ausencia o presencia de 10% de suero humano (Sigma). Las muestras se separaron a través de 18% de SDS-PAGE, y se realizó la inmunotinción utilizando anticuerpo policlonal de cabra para IGF-1 humano. Los resultados en la Figura 1A indican que, aunque hlGF-1Ea de tipo silvestre fue substancialmente degradado después de la incubación con suero durante 16 horas, el hlGF-1Ea3mut se estabilizó. La densitometría indicó que la relación de IGF-1 no cortado a cortado fue de aproximadamente 1:6.2, mientras que la relación para hlGF-1Ea3mut fue de aproximadamente 1:0.68, mostrando que estas mutaciones dan como resultado un polipéptido estabilizado. Para confirmar que hlGF-1Ea3mut fue capaz de dar señal a través del IGF-IR, se midió la fosforilación de AKT de células en contacto con el polipéptido. C2C12 se compró en ATCC y se mantuvo en un medio de Eagle modificado con Dulbecco (DMEM) con alta concentración de azúcar (Invitrogen) conteniendo 10% de suero de bovino fetal (AMIMED), 100 U/ml penicilina (Invitrogen), 100 pg/ml estreptomicina (Invitrogen) y 2 mM glutamina (Invitrogen). Para análisis fosforilación de AKT, las células C2C12 se colocaron en placas a una densidad de 0.15 x 106 células por cavidad de una placa de 6 cavidades y se cultivaron en un medio de crecimiento durante 72 horas. Las células se privaron de alimento durante cuatro horas en un medio libre de suero y después se estimularon con diferentes ligandos a 37°C durante 30 minutos. Las células se Usaron con regulador de pH PhosphoSafe (Cell Signaling) conteniendo varios inhibidores de proteasa y se lavaron a través de centrifugación a 14,000 x g durante 15 minutos a 14°C. La fosforilación de AKT y los niveles totales de AKT se analizaron a través de ELISA utilizando el equipo de ELISA de emparedado PathScan phospho AKT (Ser473) y el equipo de ELISA de emparedado PathScan AKT (Cell Singnalling), respectivamente. Los resultados de la fosforilación de AKT se resumen en la Figura 2A, los cuales indican que hlGF-1Ea3mut fue capaz de activar la trayectoria celular de IGF-IR a un grado similar al reactivo de control positivo largo-R3-IGF-1 y el IGF-1 recombinante. Además, los datos en la Figura 5 directamente muestran que hlGF-1Ea3mut conduce ala fosforilación de AKT. Después, para asegurar que el carácter especifico de receptor del hlGF-1Ea3mut permaneció con el IGF-1R, se agregaron varios ligandos a los cultivos de NIH3T3 sobre-expresando ya sea IGR-1R o receptor de insulina (InsR). Estas células se cultivaron bajo las mismas condiciones como las descritas anteriormente para las células Cos7. Para el análisis de la fosforilación IGF-1R e InsR, se colocaron en placas células NIH3T3-IGF1R y NIH3T3-lnsR a una densidad de 0.2 x 106 células por cavidad de una placa de 6 cavidades y se cultivaron en un medio de crecimiento durante 24 horas. Las células se privaron de alimento durante 48 horas en un medio libre de suero y después se estimularon con diferentes ligandos a 37°C durante 10 minutos. Las células se Usaron como se describió anteriormente para el experimento de AKT, y se analizaron los niveles de fosforilación de IGF-1R e InsR a través de ELISA utilizando el equipo DuoSet IC human phosphor-IGF1 R y -InsR ELISA (R&D Systems). Los resultados resumidos en las Figuras 3A y 3B indican que este polipéptido del precursor IGF-1 retiene el carácter específico para el receptor IGF-1 y se debe unir al receptor de insulina relacionado con baja afinidad.

EJEMPLO 2 Se construyó un vector de expresión de ADN que codifica el polipéptido del precursor hlGF-1-Eb conteniendo las siguientes mutaciones: eliminación de G1, eliminación de P2, y eliminación de E3; mutación de R37 a A; y eliminación de R71 y eliminación de S72 (es decir, el "3mut"). Esto da como resultado la siguiente secuencia de proteína secretada: tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgi deccfrscdlrrlemycaplkpaksa vraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsr naecrgkkgk (SEC ID NO:9) El polipéptido se analizó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 1 anterior. La Figura 1B y el uso de densitometría indicaron que la relación de IGF-1 no cortado y cortado fue de aproximadamente 1:9, mientras que la relación para hlGF-1Eb3mut fue de aproximadamente 1:1, mostrando que estas modificaciones dan como resultado un polipéptido estabilizado. La Figura 2B indica que el hlGF-1Eb3mut fue capaz de activar la trayectoria celular de IGF-1R a un grado similar como el reactivo de control positivo R3-IGF-1 -largo y el IGF-1 recombinante. Además, los datos en la Figura 5 directamente muestran que hlGF-1Eb3mut conduce a la fosforilación de AKT. Los resultados resumidos en las Figuras 3C y 3D indican que este polipéptido del precursor IGF-1 retiene el carácter específico para el receptor de IGF-1 y se debe unir al receptor de insulina relacionado con baja afinidad.

EJEMPLO 3 Se construyó un vector de expresión de ADN que codifica el polipéptido del precursor hlGF-1-Ec conteniendo las siguientes mutaciones: eliminación de G1, eliminación de P2 y eliminación de E3; mutación de R37 a A; y eliminación de R71 y eliminación de S72 (es decir, el "3mut"). Esto da como resultado la siguiente secuencia de proteína secretada: tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksav raqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEC ID NO:10) El polipéptido se analizó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 1 anterior. La Figura 1C y el uso de densitometria indicaron que la relación de IGF-1 no cortado y cortado fue de aproximadamente 1:5, mientras que la relación para hlGF-1 Ec3mut fue de aproximadamente 1:0.96, mostrando que estas modificaciones dan como resultado un polipéptido estabilizado. La Figura 2D indica que el hlGF-1Ec3mut fue capaz de activar la trayectoria celular de IGF-1R a un grado similar como el reactivo de control positivo R3-IGF-1 -largo y el IGF-1 recombinante. Además, los datos en la Figura 5 directamente muestran que hlGF-1Ec3mut conduce a la fosforilación de AKT. Los resultados resumidos en las Figuras 4A y 4B indican que este polipéptido del precursor IGF-1 retiene el carácter específico para el receptor de IGF-1 y se debe unir al receptor de insulina relacionado con baja afinidad.

EJEMPLO 4 Se construyó un vector de expresión de ADN que codifica el polipéptido del precursor quimérico hlGF-1-Eab conteniendo las siguientes modificaciones: eliminación de G1, eliminación de P2, y eliminación de E3; mutación de R37 a A; eliminación de R71 y eliminación de S72 (es decir, el "3mut"); e inserción de aminoácidos Ea 93 a 102 entre los aminoácidos 95 a 96 de Eb. La inserción crea una señal de glicosilación N-enlazada putativa en N92. Esto da como resultado la siguiente secuencia de proteína secretada: tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa vraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirg kkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEC ID N0:11) El polipéptido se analizó de acuerdo con algunos de los procedimientos descritos en el Ejemplo 1 anterior. La Figura 2C indica que el hlGF-1 -Eab3mut fue capaz de activar la trayectoria de IGF-1R celular a un grado similar como el reactivo de control positivo R3-IGF-1 -largo y el IGF-1 recombinante. Los resultados resumidos en las Figuras 4C y 4D indican que este polipéptido del precursor IGF-1 retiene el carácter específico para el receptor IGF-1 y no activa el receptor de insulina.

EJEMPLO 5 Se construyó un vector de expresión de ADN que codifica el polipéptido del precursor multímero hlGF-1-Eb conteniendo las siguientes modificaciones: eliminación de G1, eliminación de P2, eliminación de E3, eliminación de R36, eliminación de R37, eliminación de R71, eliminación de S72, eliminación de los últimos siete aminoácidos C-terminales de Eb; y la inserción al término C de este precursor de dos péptidos Eb adicionales tanto sin el R71 como el S72 y los últimos siete aminoácidos C-terminales y un cuarto y último péptido Eb sin el R71 y S72. La Figura 6A muestra una ilustración esquemática de esta construcción. Esto da como resultado la siguiente secuencia de proteína secretada: tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavr aqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrn aersvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrr eigsrnaersvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgk kkeqrreigsrnaersvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteas Iqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEC ID NO:12) Este polipéptido se sometió a un ensayo de fosforilación de AKT como se describió en el Ejemplo 1. La Figura 5 indica que este multímero hlGF-1-Eb fue capaz de dar señal a través de la trayectoria de IGF-1R.

EJEMPLO 6 Se puede expresar un polipéptido del precursor hlGF-1-Eb de la invención como se muestra esquemáticamente en la Figura 6B. Esta construcción contiene las siguientes modificaciones: eliminación de G1, eliminación de P2, eliminación de E3, eliminación de R36, eliminación de R37, eliminación de R71, eliminación de S72; y la inserción de Ea aminoácidos 93-102 entre los aminoácidos 95 y 96 de Eb, creando así un sitio de glicosilación N-enlazado en la posición N92 y N100. Esto da como resultado la siguiente secuencia de proteína secretada: tlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavr aqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkk keqrreigsrnaecrgkkgk (SEC ID N0:13) EJEMPLO 7 Se puede expresar un polipéptido del precursor hlGF-2-? de la invención teniendo las siguientes modificaciones: eliminación de P4, eliminación de S5, y eliminación de E6; mutación de R38 a A; y eliminación de R68 y eliminación de D69. Esto da como resultado la siguiente secuencia de proteina secretada: ayrtlcggelvdtlqfvcgdrgfyfsrpasrvsrasrgiveeccfrscdlalletycatpaksevstpp tvlpdnfprypvgkffqydtwkqstqrlrrglpallrarrghvlakeleafreakrhrplialptqdpa hggappemasnrk (SEC ID NO:14) EJEMPLO 8 Se puede expresar un polipéptido del precursor hlGF-2-Ea de la invención teniendo las siguientes mutaciones: eliminación de G1, y eliminación de P2; mutación de E3 a X, en donde X es un aminoácido no natural que es pegilado; mutación de R37 a A; y eliminación de R71 y eliminación de S72. Esto da como resultado la siguiente secuencia de proteína secretada: Xtlcgael dalqfvcgdrgfyf nkptg y gsssraapqtg i vdeccfrscdl rrlem y cap Ikpak savraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEC ID NO:15) Ejemplos 9-78 (? = eliminación) 9) hlGF-1-Ea: ?T1, ??2 , ??3; R36A; AR71 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa svraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEC ID NO:16) 10) hlGF-1-Ea: ?T1, ??2, ??3; R36A; AS72 tlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa rvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEC ID N0:17) 10) hlGF-1-Ea: ?T1, ??2 , ??3; R36A; AR71, AS72 tlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa vraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEC ID NO:18) 11) hlGF-1-Ea: AG1, ??2, ??3; R37A; AR71 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa svraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEC ID NO:19) 12) hlGF-1-Ea: AG1, ??2 , ??3; R37A; AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa rvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEC ID NO:20) 13) hlGF-1-Ea: AG1, ??2, ??3, AR37; AR71 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrr!emycaplkpaksas vraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEC ID N0:21) 14) hlGF-1-Ea: AG1, ??2, ??3, AR37; AS72 tlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksar vraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEC ID NO:22) 15) hlGF-1-Ea: AG1, ??2, ??3; AR37; AR71, AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksav raqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEC ID NO:23) 16) hlGF-1-Eb: AG1, ??2, ??3; R36A; ??71 tlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa svraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreig srnaecrgkkgk (SEC ID NO:24) 17) hlGF-1-Eb: ?ß*\, ??2, ??3; R36A; ?ß72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa rvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigs rnaecrgkkgk (SEC ID NO:25) 18) hlGF-1-Eb: AG1, ??2 , ??3; R37A; AR71 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccf rscdlrrlemycaplkpaksa svraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreig srnaecrgkkgk (SEC ID NO:26) 19) hlGF-1-Eb: ?T1, ??2, ??3; R37A; AS72 t lcgaelvd a Iqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtg i vdeccf rscdlrrlemycaplkpaksa rvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigs rnaecrgkkgk (SEC ID NO:27) 20) hlGF-1-Eb: AG1, ??2 , ??3; R37A; AR71. AS72 tlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa vraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsr naecrgkkgk (SEC ID NO:28) 21) hlGF-1-Eb: AG1, ??2, ??3, AR37; AR71 tlcgael dalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccf rscdlrrlemycaplkpaksas vraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsr naecrgkkgk (SEC ID NO:29) 22) hlGF-1-Eb: ?T1, ??2, ??3, AR37; AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksar vraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsr naecrgkkgk (SEC ID NO:30) 23) hlGF-1-Eb: AG1, ??2, ??3, ???37; AR71, ?ß72 tlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksav raqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrn aecrgkkgk (SEC ID NO:31) 24) hlGF-1-Ec: AG1, ??2, ??3; R36A; AR71 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa svraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEC ID NO:32) 25) hlGF-1-Ec: ?ß*\, ??2, ??3; R36A; AS72 tlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa rvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEC ID NO:33) 26) hlGF-1-Ec: AG1, ??2, ??3; R36A; AR71, AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa vraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEC ID NO:34) 27) hlGF-1-Ec: AG1, ??2, ??2; R37A; AR71 tlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa svraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEC ID NO:35) 28) hlGF-1-Ec: ?T1, ??2, ??3; R37A; AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa rvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEC ID N0.36) 29) hlGF-1-Ec: ?T1 , ??2, ??3; R37A; AR71, AS72 tlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa vraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEC ID NO:37) 30) hlGF-1-Ec: AG1, ??2, ??3, AR37, AR71 tlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksas vraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEC ID NO:38) 31) hlGF-1-Ec: AG1, ??2 , ??3, AR37, AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksar vraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEC ID NO:39) 32) hlGF-1-Eab: AG1 , ??2, ??3; R36A; AR71 ; inserción de Ea aa 93-102 entre aa 95 y 96 de Eb (i.e., "Eab") tlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa svraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqir gkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEC ID NO:40) 33) hlGF-1-Eab: ?T1 , ??2, ??3; R37A; AR71 tlcgae Ivd a Iqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtg i vdeccf rscdlrrlemycaplkpaksa svraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqir gkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEC ID N0:41) 34) hlGF-1-Eab: AG1 , ??2, ??3, AR37, ¿ R7 ^ tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksas vraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirg kkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEC ID NO:42) 35) hlGF-1-Eab: AG1 , ??2 , ??3; R36A; AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa rvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirg kkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEC ID NO:43) 36) hlGF-1-Eab: AG1, ??2, ??3; R37A; AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa rvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirg kkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEC ID N0.44) 37) hlGF-1-Eab: AG1, ??2, ??3, AR37, AS72 tlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksar vraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirg kkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEC ID NO:45) 38) hlGF-1-Eab: ?T1, ??2, ??3; R36A; AR71, AS72 tlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa vraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirg kkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEC ID NO:46) 39) hlGF-1-Eab: AG1, ??2, ??3, AR37, AR71, AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksav raqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgk kkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEC ID NO:47) 40) hlGF-1-Ea: ??2, ??3; R37A; AR71 , AS72 gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaks avraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEC ID NO:48) 41) hlGF-1-Eb: ??2, ??3; R37A; AR71 , AS72 gtlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaks avraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreig srnaecrgkkgk (SEC ID NO:49) 42) hlGF-1-Eb multimero: (?T1 , ??2, ??3; R37A)-3xEb(AR71 , AS72, AC-término 7 aa)-Eb(AR71 , AS72) tlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa vraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsr naevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrre igsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkke qrreigsrnae raqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirg kkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEC ID NO:50) 43) hlGF-1-Eb multimero: (??2 , ??3; R37A)-3xEb(AR71 , AS72, ??-término 7 aa)-Eb(AR71 , AS72) gtlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaks avraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreig srnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqr reigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkk keqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkt pggeqkegteaslqi rgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEC ID NO:51) 44) hlGF-1-Ec: ??2, ??3; R37A; AR71, AS72 gtlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaks avraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEC ID NO:52) 45) hlGF-1-Ea: ??3; R37A; AR71, AS72 gptlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpa ksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEC ID N0.53) 46) hlGF-1-Eb: ??3; R37A; AR71, AS72 gptlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpa ksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrre igsrnaecrgkkgk (SEC ID NO:54) 47) hlGF-1-Eb multímero: (AG1, ??2, ??3; R37A)-3xEb(AR71 , AS72, AC-término 7 aa)-Eb(AR71, AS72) tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa vraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsr naevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrre igsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkke qrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteasl irg kkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEC ID NO:55) 48) hlGF-1-Eb multimero: (??3; R37A)-3xEb(AR71 , AS72, ??-término 7 aa)-Eb(AR71, AS72) gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpa ksa raqrhtdmpkt kyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrre igsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkke qrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirg kkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteasl qirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEC ID NO:56) 49) hlGF-1-Ec: ??3; R37A; AR71, AS72 gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpa ksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEC ID NO:57) 50) hlGF-1-Ea: ??3; R37A; AR71, AS72 gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpa ksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEC ID NO:58) 51) hlGF-1 -Eb: ??3; R37A; AR71, AS72 gptlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpa ksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrre igsrnaecrgkkgk (SEC ID NO:59) 52) hlGF-1-Ec: ??3; R37A; AR71, AS72 gptlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpa ksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEC ID NO:60) 53) hlGF-1-Eab: ??3; R37A; ? R71, AS72 gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpa ksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslq irgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEC ID NO:61) 54) hlGF-1-Eb multimero: (??3; R37A)-3xEb(AR71 , AS72, ??-término 7 aa)-Eb(AR71, AS72) gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpa ksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrre igsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkke qrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirg kkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteasl qirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEC ID NO:62) 55) hlGF-1-Ea: E3A; R37A; AR71, AS72 gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkp aksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEC ID NO:63) 56) hlGF-1-Eb: E3A; R37A; AR71, AS72 gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkp aksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrr eigsrnaecrgkkgk (SEC ID NO:64) 57) hlGF-1-Ec: E3A; R37A; AR71, AS72 gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkp aksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEC ID N0.65) 58) hlGF-1-Eab: E3A; R37A; AR71, AS72 gpatlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkp aksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteasl qirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEC ID NO:66) 59) hlGF-1-Eb multímero: (E3A; R37 A)-3xEb(AR71 , AS72, AC-término 7 aa)-Eb(AR71 , AS72) gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkp aksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrr eigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkk eqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqir gkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegtea slqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEC ID NO:67) 60) hlGF-1-Ea: ??2 , ??3; R37A; AR71, AS72 gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaks avraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnkny rm (SEC ID NO:68) 61) hlGF-1-Eb: ??2, ??3; R37A; AR71, AS72 gtlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaks avraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreig srnaecrgkkgk (SEC ID NO:69) 62) hlGF-1-Ec: ??2, ??3; R37A; AR71, AS72 gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaks avraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEC ID NO:69) 63) hlGF-1-Eab: ??2 , ??3; R37A; AR71, AS72 gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaks avraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqir gkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEC ID NO:70) 64) hlGF-1-Eb multimero: (??2, ??3; R37 A)-3xEb(AR71 , ?372, ??-término 7 aa)-Eb(AR71, AS72) gtlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaks avraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreig srnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqr reigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkk keqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqi rgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEC ID NO:71) 65) hlGF-1-Eb: ?T1, ??2; E3X; R37A; AR71, ?572 Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpak savraqrhtdmpktqkyqppstnkntks rrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrrei gsrnaecrgkkgk (SEC ID NO:72) 66) hlGF-1-Ec: AG1, ??2; E3X; R37A; AR71, AS72 Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpak savraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEC ID NO:73) 67) hlGF-1-Eab: AG1, ??2; E3X; 37A; AR71, AS72 Xtlcgaetvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrtemycaplkpak savraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqi rgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEC ID NO:74) 68) hlGF-1-Eb multímero: (AG1, ??2; E3X; R37A)-3xEb(AR71 , AS72, AC-término 7 aa)-Eb(AR71 , AS72) Xtlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpak savraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrrei gsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkke qrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirg kkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteasl qirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEC ID NO:75) 69) hlGF-1-Ea: AG1, ??2, ??3; R37A; AR71; S72X tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa Xvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEC ID NO:76) 70) hlGF-1-Eb: AG1, ??2 , ??3; R37A; AR71; S72X tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa Xvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreig srnaecrgkkgk (SEC ID NO:77) 71) hlGF-1-Ec: AG1, ??2, ??3; R37A; AR71; S72X tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa Xvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEC ID NO:78) 72) hlGF-1-Eab: ?T1, ??2, ??3; R37A; AR71; S72X tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa Xvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqir gkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEC ID NO:79) 73) hlGF-1-Eb multimero: (AG1, ??2, ??3; R37 A)-Eb(AR71 ; S72X; AC-término 7 aa)-2xEb(AR71 , AS72, AC-término 7 aa)-Eb(AR71, AS72) tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpakX savraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrrei gsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkke qrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirg kkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteasl qirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEC ID NO:80) 74) hlGF-1-Ea: AG1, ??2, ??3; R37A; AR71, AS72; N92X tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa vraqrhtdmpktqkevhlkXasrgsagnknyrm (SEC ID N0:81) 75) hlGF-1-Eb: AG 1 , ??2, ??3; R37A; AR71, AS72; C142X tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa vraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsr naeXrgkkgk (SEC ID NO:82) 76) hlGF-1-Eab: AG1, ??2 , ??3; R37A; AR71, AS72; C151X tlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa vraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirg kkkeqrreigsrnaeXrgkkgk (SEC ID NO:83) 78) hlGF-1-Eb multímero (AG1, ??2, ??3; R37A)-3xEb(AR71 , AS72, AC-término 7 aa)-Eb(AR71, AS72; C71X) tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgi vdeccf rscdlrrlemycaplkpaksa vraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsr naevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrre igsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkke qrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirg kkkeqrreigsrnaeXrgkkgk (SEC ID NO:84) EJEMPLO 79 Ensayo de Proliferación de Rflioblasto El ensayo de proliferación de mioblasto proporciona un indicador confiable in vitro de la actividad de IGF y se utiliza como un modelo para factores que afectan miobiastos embriónicos y células de satélite adultas. Los factores activos en este sistema se comportan similarmente en cultivos primarios de miobiastos. El mejoramiento de la proliferación del mioblasto in vitro a través de un péptido de esta invención indica su actividad para ocasionar una proliferación incrementada de miobiastos y, por lo tanto, un incremento en el número final de miofibras en el útero. Además, un mejoramiento similar de la proliferación de miobiastos indica que se pueden utilizar los péptidos de esta invención para mejorar hipertrofia muscular en adultos, por ejemplo, a través de la estimulación de la proliferación de células de músculo de satélite.

EJEMPLO 80 Ensayo de Tejido Epiteiial Mamario En animales lactantes, la cantidad de tejido epitelial mamario es un factor limitante en la producción de leche, ya son células que producen y secretan leche. Al emplear sistemas in vitro, las células epiteliales obtenidas de glándulas mamarias de animales pueden ser estimuladas por el IGF-1 o IGF-2 modificado de la presente invención para proliferar y producir cantidades en incremento de constituyentes de leche. Además, se puede demostrar que las células epiteliales mamarias estimuladas para proliferar en dicho sistema de célula in vitro pueden se re-implantadas en depósitos de grasa mamarios descongestionados y ser estimuladas para proliferar y/o producir leche en animales hembra lactantes.

EJEMPLO 81 Medición de IGF-1 o IGF-2 en Sangre u Otros Fluidos del Cuerpo La cantidad efectiva del péptido administrado parenteralmente por dosis puede ser medida a través de una curva de dosis-respuesta. Por ejemplo, los péptidos IGF modificados de la invención pueden ser medidos en la sangre o fluidos del cuerpo del sujeto que será tratado para determinar la dosificación. Alternativamente, se pueden administrar cantidades en incremento del péptido al sujeto y verificar los niveles, en el suero del sujeto, del IGF-1 e IGF-2 modificados. La cantidad del péptido que se empleará puede ser calculada en una base molar sobre estos niveles, en el suero, de IGF-1 e IGF-2 modificados. Un método para determinar la dosificación apropiada del péptido implica medir un péptido IGF de la invención en un fluido biológico, tal como un fluido del cuerpo o sangre. La medición de dichos niveles puede realizarse a través de cualquier medio, incluyendo RIA y ELISA. Después de medir los niveles de IGF, el fluido se pone en contacto con el péptido utilizando dosis individuales o múltiples. Después de este paso de hacer contacto, los niveles de IGF se vuelven a medir en el fluido. Si los niveles de IGF en el fluido han caído una cantidad suficiente para producir la eficacia deseada para la cual se va administrar la molécula, entonces la dosis de la molécula puede ser ajustada para producir la eficacia máxima. Este método puede ser realizado in vitro o in vivo. Preferiblemente, este método se realiza in vivo, es decir, después de que el fluido es extraído de un sujeto y los niveles de IGF se han medido, el péptido aquí es administrado al mamífero utilizando dosis individuales o múltiples (es decir, el paso de poner en contacto se realiza a través de la administración a un animal), y después los niveles de IGF se vuelven a medir a partir del fluido extraído del animal. Otro método para determinar la dosificación es utilizar anticuerpos para el péptido u otro método de detección para el péptido en el formato LIFA.

EJEMPLO 82 Farmacocinéíica In Vivo de hlGF-1-Ec 3mut Ratones macho adultos (n = 3/grupo) recibieron una inyección de bolo intravenosa (i,v,) de rhlGF-1 a 1 mg/kg, y hlGF-1-Ec 3mut (descrito en el Ejemplo 3) a 1.55 mg/kg. Se recogieron especímenes de sangre en serie a 5, 15, 30 y 60 minutos después de la administración del material de prueba. Las concentraciones de rhlGF-1 y hlGF-1-Ec 3mut, en el suero, se determinaron mediante ELISA. Este ensayo es especifico para hlGF-1. Se administraron, i.v. en ratones, dosis equimolares de rhlGF-1 y hlGF-1-Ec 3mut. Los resultados muestran niveles significativamente más altos de la proteína hlGF-1-Ec 3mut según comparado con rhlGF-1 en todos los puntos de tiempo examinados, indicando que el hlGF-1-Ec 3mut es metabólicamente más estable que el IGF-1 con una longitud de 70 aminoácidos.

Tiempo (min) IGF-1-Ec 3mut (nftfl) IGF-1 (nftfl) 5 201.4 54 7 15 65.3 14 3 30 12 2 4 60 0.76 0 2

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. - Un polipéptido que comprende una proteina de precursor IGF-1 humana, en donde la escisión del péptido E a parir de IGF-1 mediante una proteasa se reduce a través de la modificación de la proteína de precursor. 2. - El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína de precursor comprende el péptido Ea. 3. - El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína de precursor comprende el péptido Eb. 4. - El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3, en donde los últimos siete aminoácidos C-terminales de Eb son eliminados. 5. - El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína de precursor comprende el péptido Ec. 6. - El polipéptido de acuerdo con cualquier de las reivindicaciones precedentes, en donde G1 de la proteína de precursor es eliminado o mutado. 7. - El polipéptido de acuerdo con cualquier de las reivindicaciones precedentes, en donde P2 de la proteína de precursor es eliminado o mutado. 8. - El polipéptido de acuerdo con cualquier de las reivindicaciones precedentes, en donde E3 de la proteina de precursor es eliminado o mutado. 9.- El polipéptido de acuerdo con cualquier de las reivindicaciones precedentes, en donde R36 de la proteína de precursor es eliminado o mutado. 10.- El polipéptido de acuerdo con cualquier de las reivindicaciones precedentes, en donde R36 es mutado a alanina. 5 11.- El polipéptido de acuerdo con cualquier de las reivindicaciones precedentes, en donde R37 de la proteína de precursor es eliminado o mutado. 12 - El polipéptido de acuerdo con cualquier de las reivindicaciones precedentes, en donde R37 es mutado a alanina. I0 13.- El polipéptido de acuerdo con cualquier de las reivindicaciones precedentes, que además comprende la secuencia de consenso de glicosilación N-enlazada, NXS/T. 14. - El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3, que además comprende los aminoácidos 93-102 de Ea insertado entre los 15 aminoácidos N95 y T96 de Eb. 15. - El polipéptido de acuerdo con cualquier de las reivindicaciones precedentes, que además comprende un oligosacárido covalentemente enlazado a una cadena lateral de aminoácido de la proteína de precursor. 20 16.- El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el oligosacárido está covalentemente enlazado a una cadena lateral de arginina de la proteína de precursor. 17.- El polipéptido de acuerdo con cualquier de las reivindicaciones precedentes, en donde un residuo de la proteína de 25 precursor se reemplaza por un aminoácido no natural. 18. - El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el aminoácido no natural comprende un grupo acetileno o azido. 19. - El polipéptido de acuerdo con cualquier de las reivindicaciones precedentes, que además comprende una porción de glicol etilénico covalentemente unida a una cadena lateral de la proteína de precursor. 20. - El polipéptido de acuerdo con cualquier de las reivindicaciones precedentes, que además comprende un péptido E adicional enlazado al término C de la proteína de precursor. 21. - Un polipéptido que comprende, a partir del término N al término C, una proteína de precursor IGF-1 que comprende un primer péptido Eb, en donde: G1, P1 y E1 son eliminados, R36 y R37 son eliminados, R71 y S72 son eliminados, y los últimos siete aminoácidos C-terminales del primer péptido Eb son eliminados; un segundo péptido Eb, en donde R71, S72, y los últimos siete aminoácidos C-terminales del segundo péptido Eb son eliminados; un tercer péptido Eb, en donde R71, S72 y los últimos siete aminoácidos C-terminales del tercer péptido Eb son eliminados; y un cuarto péptido Eb, en donde R71 y S72 son eliminados. 22. - El polipéptido de acuerdo con cualquier de las reivindicaciones 1 a 20, en donde R71 o S72 de la proteína de precursor es eliminado o mutado. 23. - Un polipéptido que comprende una proteína de precursor IGF-1 humana, en donde la escisión del péptido E a partir de IGF-1 a través de una proteasa se reduce a través de la modificación de la proteína de precursor. 24.- El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 23, en donde R68 o D69 de la proteína de precursor es eliminado o mutado. 25. - Un método para tratar una enfermedad músculo-esquelética, diabetes, muerte de célula neuronal, o anemia, el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes a un sujeto. 26. - El uso del polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad músculo-esquelética, diabetes, muerte de célula neuronal, o anemia.