MX2008015314A

MX2008015314A - Fundamentos, metodos y analisis para identificar nuevos genes de celulas del gusto y objetivos de receptores del sabor salado, y analisis que utilizan estos genes o productos genicos identificados.

Info

Publication number: MX2008015314A
Application number: MX2008015314A
Authority: MX
Inventors: Fernando Echeverri; Bryan Moyer; Min Lu; Dalia Kalabat; Na Gao; Peter Hevezi
Original assignee: Senomyx Inc
Priority date: 2006-06-08
Filing date: 2007-06-08
Publication date: 2008-12-12
Also published as: TW200813232A; WO2007146120A2; JP2009539377A; IL195205A0; EP2024518A2; CA2654552A1; US20080261824A1; EP2024518A4; NO20084993L; WO2007146120A3; AU2007258511A1

Abstract

La presente invención se refiere a nuevos fundamentos y métodos para identificar genes específicos del gusto, incluso de genes que intervienen en la percepción del sabor salado, especialmente en la percepción humana del sabor salado, pero también de genes que intervienen en la percepción de sabor dulce, amargo, sabroso y ácido, y de genes que intervienen en otras actividades de las células del gusto o de receptores de sabores, tales como la función digestiva y enfermedades relacionadas con la digestión, el ciclo de la células del gusto, la inmunorregulación del tracto oral y digestivo y la regulación metabólica, por ejemplo en la diabetes y la obesidad, los genes detectados mediante el uso de estos métodos, y análisis para identificar moduladores del gusto (mejoradores o bloqueadoras) y posibles agentes terapéuticos que utilizan estos genes. Estos compuestos tienen potencial aplicación en la modulación (mejoramiento o bloqueo) de la percepción del gusto, especialmente la percepción del sabor salado y como posibles agentes terapéuticos. Además, la presente invención se refiere a nuevos métodos para identificar genes específicos del gusto que se pueden usar como marcadores para diferentes tipos de células del gusto, incluso las células del gusto dulce, amargo, sabroso, ácido, salados y de otro tipo en mamíferos, así como análisis para medir la actividad de los receptores de sabor dulce, amargo, sabroso o ácido en presencia de estos genes, a fin de identificar moduladores de sabor dulce, amargo, sabroso y ácido, e identificar agentes terapéuticos especialmente para el tratamiento de trastornos digestivos o metabólicos, pérdida del gusto e infecciones orales. Además, la invención provee métodos específicos para purificar, enriquecer, aislar o marcar subtipos o linajes deseados de las células del gusto, por ejemplo células para el sabor dulce, sabroso, amargo, salado, ácido, graso, o células madre, por ejemplo mediante el uso de FACS, perlas magnéticas u otros métodos de selección que las purifiquen, enriquezcan, marquen o eliminen, por ejemplo mediante el uso de citotoxinas marcadas, o células que expresen o no expresen uno o más genes específicos para el gusto.

Description

FUNDAMENTOS, METODOS Y ANALISIS PARA IDENTIFICAR NUEVOS GENES DE CELULAS DEL GUSTO Y OBJETIVOS DE RECEPTORES DEL SABOR SALADO, Y ANALISIS QUE UTILIZAN ESTOS GENES O PRODUCTOS GENICOS IDENTIFICADOS Campo de la Invención La presente invención identifica, en su modalidad más amplia, un nuevo conjunto de genes que se expresan específicamente en células quimiosensoriales o más específicamente células del gusto, por ejemplo células del gusto circunvaladas murinas y probablemente células del gusto (por ejemplo circunvaladas) derivadas de otros mamíferos tales como humanos y primates no humanos . Estos genes se refieren en la presente como genes "específicos del gusto" porque se expresan específicamente en las células del gusto. Sin embargo, estos genes específicos del gusto incluyen genes que intervienen en forma directa o indirecta en la detección y la modulación del gusto, por ejemplo la transducción del sabor salado, sabroso, dulce, ácido, graso, metálico o amargo, además de incluir los genes que intervienen en funciones biológicas no relacionadas directamente con la detección del sabor, tales como la modulación de la digestión, el ciclo de las células del gusto, la regulación del sistema inmunitario, en particular de la cavidad oral, y la regulación del metabolismo, por ejemplo del metabolismo de los hidratos de Ref . : 198114 carbono, de la diabetes, la obesidad, la caquexia, la detección de alimentos durante la digestión, et al. Respecto de lo anterior, la presente invención provee un nuevo conjunto de genes que se expresan específicamente en células guimiosensoriales murinas, por ejemplo las células del gusto circunvaladas murinas que no se expresan o se expresan en grado significativamente menor en las células linguales de utilidad en análisis de selección, de preferencia análisis de selección de alto rendimiento, a fin de identificar compuestos que de manera directa o indirecta modulan diferentes modalidades del gusto, por ejemplo el gusto salado, dulce, sabroso, amargo, ácido, graso o metálico. También en referencia a lo anterior, la presente invención provee un nuevo conjunto de genes y los correspondientes productos génicos o células que los expresan, de utilidad en análisis de selección, de preferencia análisis de selección de alto rendimiento, para identificar compuestos que son útiles, por ejemplo como terapéutica en el tratamiento de trastornos del aparato digestivo tales como cánceres y trastornos autoinmunitarros, para modular la apoptosis de las células del gusto o el ciclo de las células del gusto, para inducir la regeneración de las células del gusto, para afectar la regulación de la inmunidad de la cavidad oral, y la regulación del metabolismo, por ejemplo, en el tratamiento de diabetes, obesidad, trastornos de la alimentación y otros trastornos metabólicos . También en relación con lo anterior la invención provee un nuevo conjunto de genes que son de utilidad en la identificación y/o el aislamiento y/o enriquecimiento de tipos o linajes específicos de células del gusto o quimiosensoriales, por ejemplo, células del gusto o quimiosensoriales que intervienen en modalidades específicas del gusto, la regulación del sistema inmunitario en la cavidad oral, la apoptosis de las células del gusto o el ciclo de las células del gusto, la regeneración de las células del gusto, la regulación del aparato digestivo, y la regulación del metabolismo, por ejemplo de las células que contribuyen a la detección del alimento, la secreción de las hormonas o enzimas que intervienen en el hambre y la digestión, y similares. Además, la invención se refiere al uso de estas células quimiosensoriales ó del gusto en análisis de selección para la identificación de compuestos que modulan el sabor, así como en la identificación de terapéuticas para modular el sistema inmunitaria, particularmente la regulación de la homeostasis inmunitaria en la cavidad oral, la regulación de la apoptosis de las células del gusto, el ciclo, la regeneración y la proliferación de las células del gusto, la regulación de las hormonas o enzimas que intervienen en la digestión y otras funciones de las células del gusto, el tratamiento de trastornos del aparato digestivo tales como cánceres bucales o del aparato digestivo, trastornos digestivos autoinmunitarios o inflamatorios, tratamiento de diabetes, obesidad, trastornos de la alimentación, u otros trastornos metabólicos, y similares . Más específicamente, la presente invención provee métodos para aislar, purificar y marcar tipos deseados de células del gusto y linaje celular del gusto que incluyen por ejemplo, sabroso, dulce, salado, amargo, graso, ácido, metálico así como células madre del gusto y otros linajes de células del gusto que incluyen las células que se diferencian en las células germinativas de las papilas gustativas, las neuronas del gusto, las células inmunitarias del gusto, etc., sobre la base de la expresión de uno o más de los genes específicos del gusto provistos en la presente. Estos métodos de aislamiento y purificación incluyen métodos de separación celular positiva y negativa. Por ejemplo, se pueden aislar los linajes o tipos de las células del gusto deseadas mediante métodos de selección celular positivos, por ejemplo mediante el uso de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) , selección celular por perlas magnéticas tales como por identificación visual de las células deseadas, tales como células individuales transfectadas por electrofisiología mediante el uso de perlas recubiertas por anticuerpo. Alternativamente, los linajes o tipos de las células del gusto deseadas se pueden recuperar o purificar mediante métodos de purificación y aislamiento de células negativas en donde los tipos celulares deseados se enriquecen o purifican de una población celular mixta por extracción de uno o más linajes de células no deseadas, por ejemplo al poner en contacto una población mixta de células que contiene las células del gusto deseadas y células no deseadas con anticuerpos citotóxicos específicos para un gen o genes objetivos expresados en el/los tipo(s) de células del gusto no deseadas que se extraen. La invención también se refiere al uso de marcadores por ejemplo, anticuerpos u oligonucleótidos específicos para uno o más de los genes objeto específicos del- gusto en regiones cartografiadas de la lengua y la cavidad oral que intervienen en las funciones específicas del gusto y no específicas del gusto, el cartografía de regiones específicas del tracto gastrointestinal y los órganos asociados que expresan genes específicos de gustos específicos y que en consecuencia intervienen en una o más de las funciones específicas de las células del gusto descritas en la presente, y/o al uso de los genes objeto de los estudios de diferenciación de las células del gusto, por ejemplo para la identificación de compuestos que inducen la diferenciación de las células madre del gusto y otros tipos celulares pluripotenciales o inmaduros en los linajes de las células del gusto y los tipos de las células del gusto deseados. La presente invención se refiere más específicamente a nuevos fundamentos, métodos y análisis que incluyen análisis electrofisiológicos para identificar y caracterizar nuevos genes específicos del gusto, que incluyen los que funcionan como objetivos de los receptores del gusto salado. La invención también se refiere a su uso para identificar sus moduladores, por ejemplo, los mej oradores del gusto salado y su uso para modular la percepción humana del gusto salado y para el tratamiento o la prevención de padecimientos relacionados con el transporte y la absorción del sodio tales como hipertensión, hipotensión, retención de líquidos, ataque cardiaco y apoplejía. Antecedentes de la Invención Los canales de sodio epiteliales (E aC) son miembros de la familia ENaC/degenerina de canales iónicos que incluye canales iónicos sensibles a ácido (ASIC) en mamíferos, canales mecanosensibles a la degenerina en vermes, y canales de FMRF-amida regulados por péptidos en moluscos (Kellenger, S. y Schild, L. (2002) Physiol Rev. 82:735-767). La ENaC media el transporte de Na+ en la membrana apical sensible a amilorida a través de epitelios de alta resistencia en numerosos tejidos que incluyen riñon, colon y pulmón. Se sabe que ENaC es un canal heterotrimérico compuesto por subunidades alfa, beta y gamma, o subunidades delta, beta y gamma. Se ha propuesto que este canal heterotrimérico interviene en la percepción humana del gusto salado.

Previamente, el presente cesionario desarrolló análisis mediante el uso de secuencias de ENaC para identificar compuestos que modulan el ENaC delta beta gamma y alfa beta gamma humano a fin de examinar si estos compuestos potencialmente podrían modular la percepción humana del gusto salado. Además, estos compuestos potencialmente se podrían usar para tratar patologías humanas que incluyen una función aberrante de ENaC . A diferencia de otros mamíferos, se ha informado que la amilorida reduce sólo ligeramente la intensidad del sabor de cloruro de sodio, es decir, en aproximadamente 15-20% cuando se usa en concentraciones que modulan específicamente la función de ENaC (Halpern, B.P. (1998 ) Neuroscience and Behavioral Revie s. 23 : 5-47 ) . Los experimentos conducidos por los inventores demostraron que la amilorida, o el derivado de amilorida más potente fenamilo no induce un efecto significativo sobre la intensidad de sal percibida por humanos cuando se analiza en niveles de 300 veces (para amilorida) y 3000 veces (para benzamilo) por encima de los valores de IC50 para alfa beta gamma ENaC (equivalente a 10 veces para amilorida y 100 veces para benzamilo, respecto de los valores de IC50 para delta beta gamma ENaC) . En consecuencia, es probable que intervengan otros genes distintos de ENaC en el gusto salado humano. Además, recientemente se informó que los receptores del gusto pueden ser expresados por tejidos no orales, por ejemplo, en el aparato digestivo y posiblemente en otros órganos tales como el riñon. Particularmente se ha informado que los receptores del gusto dulce, amargo y sabroso se expresan en células distintas de las de la cavidad oral tales como células gastrointestinales (ver, por ejemplo, Sternini et al., Amer J Physiol. Gastrointestinal and Liver Physiology, 292 :G457-G461, 2007; Mace, O.J. et al., J. Physiology, 10:1113/J. Physiol. 2007.130906. Publicado online el 10 de mayo de 2007) . Además, es probable que se expresen receptores de salado en ¿1 tracto urinario. Sobre esta base, se ha propuesto la hipótesis de que los receptores del gusto intervienen en funciones no relacionadas directamente con el gusto tales como funciones digestivas tales como la motilidad gástrica, la absorción, la detección de alimentos, el metabolismo y la regulación inmunitaria del tracto oral o digestivo, y también puede afectar funciones en relación con la absorción, la excreción y el transporte de sodio tales como la presión arterial y la retención de líquidos. En consecuencia, la identificación de genes específicos de las células del gusto y la identificación de las células específicas en las cuales se expresan específicamente estos genes deberían facilitar el mejor conocimiento de otras funciones distintas del gusto de estos receptores del gusto y también facilitar el uso de estos genes, productos génicos y células que los expresan en análisis para la identificación de nuevas terapéuticas, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades digestivas tales como enfermedades autoiniriunitarias, inflamatorias y cánceres, del metabolismo, diabetes, trastornos de la alimentación, obesidad, del ciclo de las células del gusto, hipertensión, retención de líquidos y la regulación inmunitaria del aparato digestivo. Breve Descripción de la Invención En una modalidad, la presente invención se refiere a la identificación de un nuevo conjunto de genes que se expresan específicamente en células quimiosensoriales o del gusto, particularmente células en empalizada murinas y probablemente en células del gusto de otros mamíferos tales como humanos y primates no humanos . Estos genes incluyen genes que intervienen en forma directa o indirecta en la detección de modalidades específicas del gusto tales como gusto salado, dulce, amargo, sabroso, ácido, graso y metálico y/o en la modulación de la intensidad y duración del gusto. En otra modalidad, la presente invención se refiere a la identificación de un nuevo conjunto de genes que se expresan específicamente en las células quimiosensoriales o del gusto particularmente células en empalizada murinas y probablemente en otras células quimiosensoriales o del gusto, y células similares derivadas de otros mamíferos tales como humanos y primates no humanos que intervienen en otras funciones de las células del gusto que incluyen, a modo de ejemplo la apoptosis de las células del gusto o el ciclo de las células del gusto, la regeneración de las células del gusto, la digestión, la regulación del sistema inmunitario en la cavidad oral, la regulación de los hidratos de carbono u otras funciones metabólicas relacionadas con la digestión, la detección de alimentos, el tráfico de las células del gusto y similares. En otra modalidad, la invención también se refiere a la identificación de genes específicos y productos génicos expresados específicamente en las células del gusto murinas o de otros mamíferos que se pueden usar como marcadores para la identificación, el aislamiento o el enriquecimiento de subtipos de las células del gusto específicas o linajes de las células del gusto que incluyen, a modo de ejemplo las células del gusto dulce, sabroso, ácido, amargo, salado, graso y metálico, y para aislar las células del gusto que intervienen en funciones distintas del gusto tales como la regulación de la inmunidad, por ejemplo, en la cavidad oral, la regulación de la digestión o el metabolismo, la regulación de la apoptosis de las células del gusto, el ciclo, la diferenciación y la proliferación de las células del gusto, y la regulación de la excreción, el transporte y la absorción de sodio . En otra modalidad, la invención también se refiere al uso de estos genes específicos de las células del gusto o productos génicos, o los linajes o tipos aislados o enriquecidos de las células del gusto que expresan los genes específicos de las células del gusto para su uso en análisis de selección, por ejemplo para la identificación de compuestos que inducen o modulan el gusto dulce, ácido, sabroso, salado, amargo, graso o metálico, así como el uso de estos genes, productos génicos, o las células del gusto aisladas o enriquecidas para la identificación de posibles compuestos terapéuticos, por ejemplo, terapéuticos para el tratamiento de diversos trastornos del aparato digestivo tales como colitis ulcerada, enfermedad de Crohn, enfermedad celíaca, dispepsia, cánceres del aparato digestivo, compuestos para modular el ciclo y la apoptosis de las células del gusto o para regular la diferenciación y la regeneración de las células del gusto, por ejemplo, en sujetos geriátricos o en individuos con cáncer, o sometidos a quimioterapia, o radiación, compuestos para modular o mejorar el sistema inmunitario de la cavidad oral, compuestos para la regulación de la digestión y el metabolismo, por ejemplo, compuestos que afectan la producción de fluidos digestivos, hormonas o enzimas tales como la saliva, los fluidos estomacales e intestinales, GLP-1 (péptido símil glucagón 1) , GP (polipéptido insulinotrófico dependiente de glucosa), secretina, amilasa et al., compuestos que afectan la motilidad digestiva, compuestos para tratar diabetes, para modular la detección de alimentos y compuestos para tratar obesidad. o trastornos de la alimentación, caquexia y similares . La presente invención también provee métodos para aislar, purificar y marcar tipos de las células del gusto y linajes de las células del gusto deseados que incluyen por ejemplo, el gusto sabroso, dulce, salado, amargo, graso, ácido, metálico, así como las células madre del gusto y otros linajes de las células del gusto inmaduras y maduras, incluso células que se diferencian en células de las papilas gustativas, neuronas de las células del gusto, células del gusto inmunitarias, et al., sobre la base de la expresión o ausencia de expresión de uno o más de los genes específicos del gusto provistos en la presente. Estos métodos de aislamiento y purificación incluyen métodos de separación de células positivos y negativos. Por ejemplo se pueden aislar los linajes o tipos deseados de las células del gusto por métodos de selección de células positivos por ejemplo, mediante el uso de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) , selección de células por perlas magnéticas, por ejemplo, por identificación visual de las células deseadas tales como células individuales transfectadas por electrofisiología mediante el uso de perlas recubiertas por anticuerpos. Alternativamente, los linajes o tipos de las células del gusto deseadas se pueden recuperar o purificar por métodos de purificación y aislamiento de células negativos, en donde los tipos de células deseados son enriquecidos o purificados a partir de una población mixta de células, por extracción de uno o varios linajes de las células no deseadas por ejemplo, al poner en contacto una suspensión mixta de células que contiene las células del gusto deseadas y células no deseadas, por ejemplo, derivadas de la lengua, la cavidad oral o el tracto gastrointestinal y órganos asociados con anticuerpos citotóxicos específicos para un gen o genes objetivos expresados en el/los tipo(s) de las células del gusto no deseadas, que se extraen. La invención también se refiere al uso de marcadores por ejemplo, anticuerpos u oligonucleótidos , que son específicos para uno o más de los genes específicos del gusto provistos en la presente en' regiones de cartografía de la lengua y la cavidad oral que intervienen en la función específica del gusto y en funciones no específicas del gusto, el cartografía de las células comprendidas en regiones específicas del tracto gastrointestinal y órganos asociados tales como el epitelio intestinal o el tracto urinario que expresan genes específicos del gusto específico y que en consecuencia intervienen en una o más de las funciones específicas de las células del gusto descritas en la presente, y/o el uso de los genes y marcadores específicos objeto en estudios de diferenciación de las células del gusto, por ejemplo para la identificación de compuestos que inducen la diferenciación o desdiferenciación de las células del gusto, por ejemplo, células madre adultas o embrionarias y otros tipos celulares pluripotenciales o inmaduros en linajes de las células del gusto y tipos de las células del gusto . La invención en sus formas de realización más específicas se refiere a nuevos fundamentos y métodos, y los resultados hasta la fecha mediante el uso de estos fundamentos y métodos para la identificación y la caracterización de nuevos genes específicos del gusto que constituyen objetivos de receptores salinos sobre la base de diversos parámetros. Los objetivos mediante el uso de estos protocolos son objetivos de utilidad en los esfuerzos de selección de alto rendimiento para identificar mejoradores del gusto salado en humanos. Estos objetivos se identificaron mediante el uso de dos técnicas diferentes, chip génicos y un análisis de reacción en cadena de polimerasa (PCR) , a fin de identificar nuevos genes objetivo de receptores salados. Primero, se usan chip génicos Affymetrix que contienen la mayoría de los genes murinos conocidos a fin de determinar cuáles genes están específicame te expresados en las células de las papilas gustativas en empalizada murinas en la parte posterior de la lengua y no en las células epiteliales linguales aisladas por micro microdisección por captura láser. Segundo, se usa PCR para determinar cuáles canales iónicos, de 339 canales catalogados en los genomas humanos/murinos , se expresan específicamente en las células de las papilas gustativas en empalizada humanas /murirías (CV) pero no en las células epiteliales linguales aisladas por microdisección de captura láser. La expresión específica del gusto de los genes identificados por cualquiera de los métodos se confirma mediante el uso de un método histológico independiente tal como hibridación in situ o inmunohistoquímica, a fin de determinar cuáles genes se expresan en las células del gusto. Mediante el uso de métodos histológicos de doble marcado, se determina cuáles nuevos genes específicos del gusto se expresan en las células del gusto dulce, amargo y sabroso que expresan el canal iónico específico del gusto TRPM5, las células del gusto ácido que expresan el canal iónico específico de gusto PKD2L1/PKD1L3 , o un tipo celular exclusivo que no expresa TRPM5 o PKD2L1/PKD1L3. Un gen específico del gusto, de preferencia un canal iónico, que conduce o es activado por el sodio y está expresado en la población de células negativas para TRPM5 y PKD2L1/PKD1L3 es un probable candidato para los esfuerzos de selección por identificar el /los gen (es) que codifican los receptores de gusto salado en mamíferos, así como los tipos celulares específicos en los cuales se expresan estos genes del receptor de gusto salado, tales como en la cavidad oral y el tracto urinario, y también para el uso en análisis de alto rendimiento diseñados para identificar mej oradores del sabor salado en humanos. Si bien los esfuerzos de los autores se han focalizado en la identificación de nuevos canales iónicos que puedan constituir objetivos de receptores de sal, reconocen el hecho de que un objetivo de receptor de sal puede comprender otro tipo de proteína tal como un transportador, un receptor acoplado a proteína G (GFCR) , o una proteína transmembrana no caracterizada. En consecuencia, también incluyeron proteínas de membrana con más de un dominio transmembrana en sus análisis. Dado que los receptores de sabor dulce, amargo, sabroso y ácido son todas proteínas transmembrana con múltiples dominios transmembrana, dedujeron que otros receptores del gusto, incluso el receptor de sal, también sería una proteína con múltiples dominios transmembrana. Además, si bien el enfoque de los presentes experimentos consiste en identificar nuevos objetivos de receptores de sal, tal como se analizó con anterioridad, es razonable suponer que durante el curso de las investigaciones se identificaron genes específicos del gusto adicionales que intervienen en otras modalidades del gusto (por ejemplo sabor ácido, astringencia, sensación al paladar, sabor graso, sabor metálico, etc. En consecuencia, los nuevos genes específicos del gusto identificados en la presente, además de afectar la percepción salada (y otras actividades biológicas probablemente afectadas por ellos tales como absorción, transporte y excreción del sodio, y sus efectos, tales como retención de líquidos y regulación de la presión arterial) pueden afectar alternativamente otras modalidades de la percepción del gusto y el sabor en general. Además, aunque el enfoque de estos experimentos consiste en detectar nuevos objetivos de receptores de sal, es probable que durante el curso de las investigaciones se identifiquen otros genes específicos del gusto adicionales. En consecuencia, los nuevos genes específicos del gusto identificados en la presente se podrían usar como marcadores específicos de las papilas gustativas o de los tipos de células receptoras del gusto que incluyen las células del sabor dulce, amargo, sabroso, ácido, así como salado y los genes específico del gusto identificados podrían ser objetivos para la modulación de los sabores dulce, amargo, sabroso, ácido y salado. Además, aunque los análisis objetos han sido diseñados para identificar los posibles objetivos de receptores de sal, también es probable que estos métodos puedan identificar genes específicos del gusto que intervienen en funciones biológicas distintas del gusto, por ejemplo como las antes analizadas. En consecuencia, estos nuevos genes específicos del gusto y sus correspondientes productos génicos serían de utilidad para aislar nuevos subtipos de las células del gusto o de los linajes de las células del gusto. Además, estos genes específicos del gusto o los correspondientes productos génicos o células que expresan tales las células del gusto del gusto o quimiosensoriales endógenos aislados o enriquecidos que expresan estos genes específicos de las células del gusto son útiles para análisis de selección terapéutica, por ejemplo para identificar terapéuticas para el tratamiento de trastornos del aparato digestivo tales como cánceres digestivos, trastornos digestivos inmunitarios o inflamatorios tales como colitis ulcerada, dispepsia, enfermedad de Crohn, enfermedad celíaca, síndrome inflamatorio intestinal, diverticulitis , et al., para regula la apoptosis de las células del gusto o el ciclo de las células del gusto, para inducir la regeneración de las células del gusto, por ejemplo en pacientes geriátricos, cancerosos o individuos sometidos a quimioterapia o radiaciones, para modular el sistema inmunitario de la cavidad oral, para la regulación de la mucosidad y los líquidos digestivos, enzimas u hormonas tales como GLP-1 (péptido símil glucagón 1) , GIP (polipéptido insulinotrófico dependiente de glucosa) , amilasa, saliva, ácidos estomacales, líquidos intestinales, pepsina, secretina y similares; para el tratamiento de diabetes, trastornos de la alimentación, caquexia y otros trastornos metabólicos que afectan estos genes y/o las células del gusto aisladas o enriquecidas . Más particularmente, la presente invención se refiere al descubrimiento de genes específicos del gusto que pueden jugar un papel importante en el desarrollo y la apoptosis de las células del gusto, la regeneración de las células del gusto, la modulación de factores de la transcripción que modulan la expresión del receptor de las células del gusto, el tráfico del receptor del gusto desde y hacia la membrana apical/la región del poro gustativo, la regulación de la frecuencia de desencadenamiento del potencial de acción de las células del gusto/el potencial de membrana para controlar la intensidad y/o modular los gustos específicos-, la liberación de neurotransmisores hacia los nervios aferentes que regulan la intensidad del gusto o los sabores específico y las señales de las células del gusto hacia las fibras nerviosas, et al. La presente invención también se refiere al descubrimiento de genes específicos del gusto expresados específicamente células del gusto (en donde las células del gusto están por ejemplo, en el tracto digestivo y la cavidad oral, la lengua, et al.), por ejemplo, las células gastrointestinales o las células de la cavidad oral, o el uso de los genes , productos génicos o las células que los expresan para identificar compuestos que se fijan específicamente o que modulan la actividad de estos genes, cuyos compuestos se pueden usar para tratar o prevenir padecimientos patológicas que afectan la función digestiva. Estas padecimientos incluyen a modo de ejemplo dispepsia funcional (mala digestión) y otras dispepsias que pueden o no estar derivadas o relacionadas con úlceras y pueden afectar diferentes zonas del tracto digestivo tales como el tracto abdominal superior, el tracto abdominal medio o el tracto abdominal inferior. Además, la invención provee genes que se expresan específicamente en las células del gusto tales como las células del gusto salado o sabroso cuyos genes, productos génicos o las células que los expresan por ejemplo, las células del gusto derivadas del tracto gastrointestinal o la cavidad oral, se pueden usar en análisis de selección para identificar compuestos que se pueden usar para tratar o prevenir padecimientos patológicas que afectan los líquidos gastrointestinales, mucus, enzimas o hormonas que intervienen en la digestión o el hambre, tales como gastrina, secretina, pepsina, colecistoquinina, péptido símil glucagón 1 (GLP-1), amilasa, grelina, leptina y similares. Además, estos compuestos pueden mejorar la producción de saliva u otras secreciones y líquidos mucosos digestivos. Estos compuestos posiblemente se puedan usar para suprimir o inducir hambre y/o modular la digestión en sujetos que lo necesiten. Además, dado que la invención identifica genes específicamente expresados en las células del gusto tales como las células del gusto salado, dulce, amargo, ácido o sabroso, la invención también se refiere al uso de estos genes, productos génicos ó las células que los expresan, pero sin estar restringida a las células del gusto, por ejemplo, células gastrointestinales o derivadas de la cavidad oral, para análisis de selección con el fin de identificar compuestos que fijan o modulan la actividad o la cantidad de estos compuestos de genes o productos génicos que potencialmente se pueden usar para tratar o prevenir padecimientos gastrointestinales patológicas o inflamatorias crónicas o autoinmunitarias tales como enfermedad de Crohn, síndrome inflamatorio intestinal (IBD) , enfermedad celíaca, colitis ulcerada, di erticulitis , gastritis, esofagitis por reflujo y similares. Estos compuestos potencialmente se podrían usar para tratar o prevenir enfermedades inmunitarios o inflamatorias del aparato digestivo . Además, dado que la invención provee genes que se expresan específicamente en las células del gusto tales como las células del gusto sabroso, dulce, salado, amargo, o ácido, la invención también se refiere al uso de estos genes, productos génicos o células que los expresan tales como las células del gusto, por ejemplo, las células del gusto gastrointestinales o derivadas de la cavidad oral en análisis de selección para identificar compuestos que fijen o modulen la actividad de estos genes o productos génicos, en donde los compuestos potencialmente se pueden usar para modular el reflujo gástrico y enfermedades o padecimientos asociados con estos, tales como enfermedad por reflujo gastroesofágico, cardialgía, esófago de Barrett y esofagitis. También debido a que la invención identifica genes que se expresan específicamente en las células del gusto, por ejemplo, las células del gusto sabroso, salado, dulce, amargo o ácido de la invención también se refieren al uso de estos genes, productos génicos o células que los expresan en análisis de selección para identificar compuestos gue fijen o que modulan la actividad de estos genes o productos génicos, y que en consecuencia potencial ente se pueden usar para tratar o prevenir cánceres o enfermedades malignas asociadas con el aparato digestivo tales como a modo de ejemplo cánceres de la lengua y de la cavidad oral tales como cánceres de las papilas gustativas y cánceres de glándulas salivales, estómago, esófago, intestino delgado y grueso, ano o recto, páncreas, vesícula biliar, hígado, colorrectal o colon. También debido a que la invención identifica genes que se expresan específicamente en las células del gusto, por ejemplo, las células del gusto sabroso, dulce, ácido u otros gustos, las células de la invención también se refieren al uso de estos genes, productos génicos o células que los expresan en análisis de selección para identificar los compuestos que se fijan o que modulan la actividad de genes o productos génicos, en donde los compuestos potencialmente se pueden usar para tratar o prevenir la disfunción del apetito y padecimientos asociadas con esta tales como obesidad, anorexia, bulimia y caquexia asociadas con la misma. La invención también se refiere al uso de los genes identificados en la presente que se expresan específicamente en las células del gusto para el aislamiento o el enriquecimiento de linajes o subtipos específicos de las células del gusto, particularmente las células del gusto derivadas por ejemplo de la lengua, la cavidad oral o el aparato gastrointestinal, las cuales expresan uno o varios de los genes específicos de las células del gusto. También debido a que la invención identifica genes que se expresan específicamente en las células del gusto (por ejemplo las células del gusto sabroso, dulce, ácido, amargo o de otro tipo y dado que las células del gusto están en el tracto digestivo y la cavidad oral, y la lengua, la invención también se refiere la uso de los genes, productos génicos y células que los expresan tales como pero sin restricciones las células del gusto, por ejemplo, las células gastrointestinales o las células de la cavidad, para identificar compuestos que se fijan o que modulan la actividad de estos genes o productos génicos, los cuales se pueden usar para tratar o prevenir padecimientos patológicas que intervienen en la función digestiva. Estos padecimientos incluyen a modo de ejemplo dispepsia funcional (mala digestión) y otras dispepsias que pueden estar o no derivadas o relacionadas con úlcera y que pueden incluir diferentes zonas del tracto digestivo tales como el tracto abdominal superior, el tracto abdominal medio o el tracto abdominal inferior. Además, dado que la invención identifica genes que se expresan específicamente en las células del gusto tales como las células del gusto sabroso, dulce, ácido, amargo, salado o de otro tipo, la invención también se refiere al uso de estos genes, productos génicos y las células que los expresan, tales como sin restricciones las células del gusto, por ejemplo, las células gastrointestinales o de la cavidad oral, para identificar compuestos que se pueden usar para tratar o prevenir padecimientos patológicos que afectan hormonas gastrointestinales, enzimas o fluidos relacionados con la digestión o el hambre tales como saliva, líquidos digestivos, gastrina, secretina, colecistoquinina, péptido insulinotrófico dependiente de glucosa símil glucagón 1, amilasa o grelina, leptina o similares. Estos compuestos potencialmente se pueden usar para suprimir o inducir hambre o modular la digestión en sujetos que lo necesitan. Además, dado que la invención provee genes que se expresan específicamente en las células del gusto tales como las células del gusto sabroso, dulce, ácido, salado, amargo o de otro tipo, la invención también se refiere al uso de estos genes, productos génicos y las células que los expresan tales como, sin restricciones las células del gusto, por ejemplo, las células gastrointestinales o derivadas de la cavidad oral, en análisis de selección para identificar compuestos que fijan o modulan la actividad de estos genes o productos génicos, en donde los compuestos potencialmente se pueden usar para tratar o prevenir padecimientos gastrointestinales patológicos o inflamatorios crónicos o inmunitarios tales como enfermedad de Crohn, síndrome inflamatorio intestinal (IBD) , enfermedad celíaca, colitis ulcerada, di erticulitis, gastritis, esofagitis por reflujo y similares. Estos compuestos potencialmente se pueden usar para tratar o prevenir enfermedades inmunitarios o inflamatorias que afectan * el aparato digestivo . Además, dado que la invención identifica genes que están expresadas específicamente en las células del gusto, por ejemplo, las células del gusto sabroso, dulce, salado, ácido o de otro tipo, la invención también se refiere al uso de estos genes, productos génicos o las células que los expresan, tales como las células del gusto, por ejemplo, las células gastrointestinales o derivadas de la cavidad oral en análisis de selección para identificar compuestos que fijan o modulan la actividad de estos genes, en donde los compuestos potencialmente se pueden usar para modular el reflujo gástrico y enfermedades o padecimientos asociados con este tales como enfermedad por reflujo gastroesofágico, cardialgia, esófago de Barrett y esofagitis . Además, debido a que la invención provee genes que se expresan específicamente en las células del gusto, por ejemplo, las células del gusto sabroso, dulce, salado, amargo, ácido o de otro tipo, la invención también se refiere al uso de estos genes, productos génicos o células que los expresan en análisis de selección para identificar compuestos que fijan o modulan la actividad de estos genes y cuyos compuestos potencialmente se pueden usar para tratar o prevenir cánceres o enfermedades malignas asociados con el aparato digestivo tales como, a modo de ejemplo cánceres de las glándulas salivales y las papilas gustativas, la lengua, la cavidad oral, el estómago, el esófago, el intestino delgado o grueso, el ano, el páncreas, la vesícula biliar, el hígado, colorrectal o colon. Además, debido a que la invención identifica genes que se expresan específicamente en las células del gusto, por ejemplo, las células del gusto dulce, sabroso, amargo, ácido, salado o de otro tipo que intervienen en el transporte de sodio, estos genes, productos génicos y las células que los expresan se pueden usar en análisis de selección para la identificación de compuestos que regulan el transporte de iones o el flujo de iones, particularmente iones sodio, a fin de identificar compuestos terapéuticos que se pueden usar, por ejemplo para modular la presión arterial y la retención de líquido, y padecimientos y enfermedades que afectan la absorción, excreción y transporte aberrante de sodio. Además, debido a que la invención identifica genes que se expresan específicamente en las células del gusto, por ejemplo, las células del gusto dulce, sabroso, amargo, ácido, salado o de otro tipo, estos genes, productos génicos y las células que los expresan se pueden usar en análisis de selección para la identificación de compuestos que regulan la apoptosis selectiva de las células del gusto, la modulación de los factores de transcripción que controlan la expresión del receptor del gusto, la modulación autocrina/paracrina del desarrollo de las células del gusto, la vida media de las papilas gustativas, análisis que usan genes para obtener fenotipos con gustos superlativos, compuestos que activan las células madre del gusto, compuestos que afectan el tránsito de los receptores de las células del gusto, desde la membrana apical/la región del poro gustativo, compuestos que afectan la intensidad del gusto al modular la regulación de la acción de las células del gusto a través de la frecuencia de desencadenamiento del potencial/potencial de membrana, compuestos que regulan la liberación de neurotransmisores a los nervios aferentes que controlan la intensidad general o específica del gusto, y la modulación autocrina/paracrina de la función del receptor del gusto. Además, debido a que la invención identifica los genes que se expresan específicamente en las células del gusto, por ejemplo, las células del gusto dulce, sabroso, amargo, ácido, salado o de otro tipo, estos genes, productos génicos y las células que los expresan se pueden usar en análisis de selección para la identificación de compuestos que afectan la regeneración de las células del gusto o las papilas gustativas, por ejemplo, en individuos enfermos o geriátricos, o después de una lesión o cirugía, en sujetos sometidos a quimioterapia u otra lesión, compuestos para modular disgeustia inducida por fármacos, ageustia, pérdida de las papilas gustativas, sequedad de boca o xerostomía, tal como se encuentra por ejemplo en el síndrome de Sjógren, compuestos que son útiles para mantener la higiene oral, el tratamiento o la prevención de la halitosis, microbios orales lesivos tales como virus y bacterias, y similares. Además, debido a que la presente invención identifica genes que se expresan específicamente en las células del gusto, por ejemplo, las células del gusto sabroso, dulce, amargo, salado, ácido, graso, metálico, et al., y otros linajes de las células del gusto tales como células madre del gusto, células neuronales, células inmunitarias , et al., la presente invención también provee métodos para aislar, purificar, enriquecer y marcar los tipos de las células del gusto deseadas y los linajes de las células del gusto, incluso por ejemplo, las células del gusto sabroso, dulce, salado, amargo, graso, ácido, metálico, así las células madre del gusto y otros linajes de las células del gusto incluso las células que se diferencian en células de la papila gustativa, neuronas de las células del gusto, las células del gusto inmunitarias, et al., sobre la base de la expresión de uno o más de los genes específicos del gusto provistos en la presente. Estos métodos de aislamiento y purificación incluyen métodos de separación positivos y negativos. Por ejemplo, los linajes o tipos de las células del gusto deseados se pueden aislar mediante métodos de selección celular positivos, por ejemplo, mediante el uso de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) , selección de células por perlas magnéticas, por ejemplo, por identificación visual de las células deseadas tales como células individuales transíectadas por- electrofisiología mediante perlas recubiertas por anticuerpo. Alternativamente, se pueden recuperar o purificar los linajes o tipos de las células del gusto deseadas por métodos de purificación y aislamiento celulares negativos, en dónde los tipos de células deseados son enriquecidos o purificados de una población mixta de células por extracción de los linajes de células no deseados, por ejemplo, al poner en contacto una población mixta de células que contienen las células del gusto deseadas y las células no deseadas con anticuerpos citotoxicos específicos para el gen objetivo o los genes expresados en el/los tipos de las células del gusto no deseadas que se extraen. Además, debido a que la presente invención identifica genes que se expresan específicamente en las células del gusto, por ejemplo las células del gusto sabroso, dulce, amargo, salado, ácido, graso, metálico, et al., y otros linajes y tipos de las células del gusto tales como células madre del gusto, neuronas del gusto y células inmunitarias del gusto, la invención también se refiere al uso de marcadores por ejemplo, anticuerpos u oligonucleótidos , específicos para uno o más de los genes específicos del gusto objetivo en el cartografía de regiones de la lengua y la cavidad oral que intervienen en las funciones específicas del gusto y distintas del gusto, el cartografía de las regiones específicas del tracto gastrointestinal y órganos asociados que expresan genes específicos del gusto específico y que en consecuencia intervienen en una o más de las funciones específicas de las células del gusto descritas en la presente, y/o el uso de los genes objeto en estudios de diferenciación de las células del gusto, por ejemplo para la identificación de compuestos que inducen la diferenciación de las células madre del gusto y otros tipos de células pluripotenciales o inmaduras en los linajes de las células del gusto y los tipos de las células del gusto deseados. Más específicamente, tal como se describe en detalle más adelante, la invención provee fundamentos y criterios para un candidato a gen del gusto salado, preferiblemente un canal iónico que exhibe: a) la expresión específica de las células del gusto y células no linguales OR la expresión en niveles superiores en las células del gusto que las células linguales b) La expresión en una célula del gusto mediante métodos histológicos. Específicamente, la expresión en un exclusivo tipo de las células del gusto que no expresa los marcadores de sabor dulce, amargo y sabroso TRPM5 o los marcadores de' células de sabor ácido PKD2L1/PKD1L3. Este tipo celular exclusivo podría ser una célula dedicada a la percepción de lo salado . c) la expresión funcional como canal de sodio o un receptor activado por sodio con función constitutiva basal (es decir, una fracción de la población del canal está abierta y pasa sodio en reposo) en sistemas de expresión heterólogos (tales como ovocitos de Xenopus y células de mamíferos) o neuronas primarias (tales como las neuronas de los ganglios de la raíz dorsal) . Los genes que cumplen con estos criterios son adelantados para su uso en trabajos de selección de alto rendimiento para identificar compuestos que mejoren la percepción humana de lo salado. Además, los genes específicos del gusto informados en la presente, por ejemplo, en las Tablas 1, 2 y 3 anteriores serán de utilidad en los análisis terapéuticos de selección antes mencionados . En consecuencia, en la presente solicitud de patente, los autores describen análisis de selección para identificar genes presuntamente incluidos en la percepción del gusto salado, así como el gusto y otras actividades mediadas por las células del gusto en general . Es un objetivo específico identificar genes específicos del gusto que codifican proteínas de membrana expresadas específicamente en las células del gusto y en células no linguales, con mayor nivel en las células del gusto que en las células epiteliales linguales mediante un chip génico y/o metodologías de PCR y su uso como objetivos de receptores de sal en análisis para identificar los moduladores del gusto salado, así como compuestos que afectan otras modalidades del gusto y la percepción del gusto y las funciones biológicas y celulares relacionadas con las células del gusto, y los fenotipos relacionados con las células del gusto en general . Es un objeto más específico de la invención determinar cuáles genes específicos del gusto están expresados en las células del gusto y especialmente las células del gusto dulce, amargo y/o sabroso (TRPM5 positivos) , ácido (PKD2L1/PKD1L3 positivos) o un tipo celular exclusivo (TRPM5 negativo) . Estos tipos celulares exclusivos probablemente comprendan células dedicadas a la percepción del gusto salado. Es otro objeto de la invención el uso de estos genes en análisis específicos para identificar moduladores (mej oradores) de canales iónicos específicos del gusto o genes específicos del gusto, dado i que estos compuestos pueden modular la percepción humana del gusto salado. Es un particular objeto de la invención proveer análisis electrofisiológicos gue miden la conductancia de los presuntos canales iónicos . del gusto identificados en la presente en presencia y ausencia de presuntos mejoradores. Es otro objeto específico de la invención identificar mejoradores de los canales iónicos presuntamente relacionados con el gusto salado objetivo y otros genes relacionados con el gusto en un sistema de expresión de ovocitos . Es un objeto más específico de la invención proveer análisis de estrechamientos de parches o de estrechamientos de voltaje de dos electrodos mediante el uso de ovocitos que expresan un presunto canal iónico receptor del gusto salado para identificar compuestos que modulan la actividad de este canal y en consecuencia modulan el gusto salado. Estos y otros objetos de la presente invención se cumplen mediante una o más de las formas de realización descritas a continuación. En su modalidad más amplia, la presente invención identifica un conjunto de genes que se expresan específicamente en las células del gusto quimiosensoriales, por ejemplo, las células en empalizada murinas, y probablemente en las células del gusto (por ejemplo, en empalizada) derivadas de mamíferos tales como humanos y primates no humanos . Estos genes incluyen genes que intervienen en forma directa o indirecta en la detección del gusto y la modulación del gusto por ejemplo la transducción del gusto salado, sabroso, dulce, ácido, graso, metálico o amargo, así como las funciones no relacionadas directamente con la detección del gusto y la modulación del gusto, tales como los genes que intervienen en la modulación de la digestión y la producción y la composición de los líquidos digestivos, mucus, enzimas y hormonas tales como saliva, fluidos estomacales e intestinales, GLP-1 (péptido símil glucagón 1) , GIP (polipéptidos insulinotrofico dependiente de glucosa) , secretina, pepsina y similares; genes que intervienen en la regulación de la presión arterial y la retención de líquidos, genes que intervienen en el tránsito del receptor del gusto, el ciclo de las células del gusto y la regeneración de las células del gusto, genes que intervienen en la regulación del sistema inmunitario de la cavidad oral y el sistema gastrointestinal, genes que intervienen en la prevención o el inicio de enfermedades relacionadas con el tracto gastrointestinal tales como cánceres, enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias que afectan la cavidad oral y el aparato digestivo, genes que intervienen en la regulación del metabolismo, por ejemplo el metabolismo de hidratos de carbono, obesidad, trastornos de la alimentación, genes que intervienen en la detección de alimentos durante la digestión, et al . En relación con lo anterior, la presente invención provee un nuevo conjunto de genes que se expresan específicamente en las células del gusto quimiosensoriales murinas, por ejemplo, las células del gusto en empalizada murinas que no se expresan, o que se expresan en niveles significativamente inferiores en las células linguales, que son útiles para análisis de selección, de preferencia análisis de selección de alto rendimiento, para identificar compuestos que modulan de manera directa o indirecta diferentes modalidades del gusto, por ejemplo, salado, dulce, sabroso, amargo, ácido, graso o metálico . También en relación con lo anterior, la presente invención provee un nuevo conjunto de genes que son de utilidad en análisis de selección, preferentemente análisis de selección de alto rendimiento para identificar compuestos que son de utilidad como terapéuticas en el tratamiento de trastornos del aparato digestivo, para modular la apoptosis de las células del gusto o el ciclo de las células del gusto, para inducir la regeneración de las células del gusto, para efectuar la regulación de la inmunidad en la cavidad oral o el aparato digestivo, y para el tratamiento de diabetes, obesidad, trastornos de la alimentación, y otros trastornos metabólicos. También en relación con lo anterior, la invención provee un nuevo conjunto de genes que son de utilidad en la identificación y/o el aislamiento y/o enriquecimiento de tipos o linajes específicos de células del gusto o quimiosensoriales , por ejemplo, las células del gusto o quimiosensoriales que intervienen en modalidades específicas del gusto, la regulación del sistema inmunitario de la cavidad oral, la apoptosis de las células del gusto o el ciclo de las células del gusto, la regeneración de las células del gusto, la regulación del aparato digestivo, y la regulación del metabolismo tal como contribuir a la detección de alimento, la secreción de hormonas o enzimas que intervienen en el hambre y la digestión, y similares. Además, la invención se refiere al uso de las células quimiosensoriales o del gusto aisladas en análisis de selección para identificar compuestos que modulan el gusto, así como en la identificación de terapéuticas para modular la regulación del sistema inmunitario de la cavidad oral, la apoptosis de las células del gusto, el ciclo de las células del gusto, la regeneración de las células del gusto, la regulación de las hormonas o enzimas o los fluidos y mucus que intervienen en la digestión y otras funciones de las células del gusto, el tratamiento de trastornos del aparato digestivo, el tratamiento de diabetes, obesidad, trastornos de la alimentación u otros trastornos metabólicos , y similares. Además, la presente invención se refiere a métodos para aislar, purificar y marcar los tipos de las células del gusto y los linajes de las células del gusto deseados que incluyen por ejemplo, las células del gusto sabroso, dulce, salado, amargo, graso, ácido, metálico, así como células madre del gusto y otros linajes de las células del gusto que incluyen células que se diferencian a la papila gustativa, las neuronas de las células del gusto, las células inmunitarias del gusto et al., sobre la base de la expresión de uno o más de los genes específicos del gusto provistos en la presente. Estos métodos de aislamiento y purificación incluyen métodos de separación celular positiva y negativa. Por ejemplo, los linajes o tipos de las células del gusto deseados se pueden aislar mediante métodos de selección celular positivos por ejemplo,' mediante el uso de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) , selección celular mediante perlas magnéticas, por ejemplo, por identificación visual de las células deseadas tales como células individuales transfectadas por electrofisiología mediante perlas recubiertas por anticuerpos. Alternativamente, los linajes o tipos de las células del gusto deseadas se pueden recuperar o purificar mediante métodos de purificación y aislamiento celular negativos, en donde los tipos celulares deseados son enriquecidos o purificados de una población celular mixta por extracción de los linajes celulares no deseados por ejemplo, al poner en contacto una población celular mixta que contiene las células del gusto deseadas y células no deseadas con anticuerpos citotóxicos específicos para un gen o genes objetivo expresados o el/los tipo(s) de las células del gusto no deseadas que se extraen.

Además, la invención se refiere al uso de marcadores o sondas por ejemplo, anticuerpos u oligonucleótidos , los cuales se pueden marcar con marcadores detectables tales como radionucleidos , fluoróforos, enzimas y similares, en donde los marcadores o sondas son específicos para uno o más de los genes específicos del gusto objeto, por ejemplo, en regiones de cartografía de la lengua y la cavidad oral, que comprenden células que intervienen en modalidades específicas del gusto tales como sabroso, dulce, amargo, salado, ácido, graso, metálico, et al., así como células que intervienen en funciones no específicas del gusto tales como las identificadas en la presente, el cartografía de regiones específicas del tracto gastrointestinal y los órganos asociados que contienen células que expresan genes específicos del gusto específico y que en consecuencia intervienen en una o más de las funciones específicas de las células del gusto descritas en la presente, y/o el uso de los genes objeto en estudios de diferenciación de las células del gusto, por ejemplo para la identificación de compuestos que inducen la diferenciación o desdiferenciación de las células del gusto, por ejemplo, células madre del adulto o embrionarias y otros tipos celulares pluripotenciales o inmaduros en los linajes de las células del gusto y los tipos de las células del gusto deseados . La presente invención se refiere más específicamente a nuevos fundamentos, métodos y análisis, que incluyen análisis electrofisiológicos que identifican y caracterizan nuevos genes específicos del gusto, incluso los que actúan como receptores del gusto salado. Se cree que el gusto salado humano puede ser mediado, en parte, por un canal iónico de sodio o de otro tipo, así como transportadores y GPCR expresados específicamente en las células del gusto. En consecuencia, la invención provee métodos para identificar genes específicos del gusto, incluso genes que pueden regular el sabor salado, así como otras modalidades del gusto y funciones mediadas por las células del gusto y fenotipos que utilizan chip génicos y metodologías de PCR. Los compuestos identificados y sus derivados que modulan la actividad de estos genes objetivos se pueden usar potencialmente como moduladores del gusto salado humano en alimentos, bebidas y medicinas para consumo humano. Además, los compuestos y sus derivados potencialmente se pueden usar para tratar enfermedades que incluyen una función aberrante del canal iónico. Otros compuestos identificados mediante el uso de los genes identificados en la presente y las células que los expresan son de utilidad en análisis de selección terapéutica tal como se analizó en la presente para la identificación de potenciales terapéuticas y modular otras funciones y fenotipos relacionados con las células del gusto. En un modo, la presente invención provee un método para la identificación de un gen codificador de un polipéptido en las células del gusto de un mamífero. Una modalidad de este método comprende las etapas de (i) identificar un conjunto de genes que incluye los genes que se expresan en las células del gusto, pero que no se expresan en las células linguales y/o los genes que se expresan en las células del gusto sustancialmente en niveles más elevados que en las células linguales; (ii) identificar un subconjunto de genes dentro del conjunto de genes identificados en (i) que no se expresan en las células del gusto que expresan receptores del gusto sabroso, dulce o amargo (TlR o T2R) o receptores de gusto ácido (PKD2L1/PKD1L3 ) ; y (iii) expresar funcionalmente uno o más genes en el subconjunto identificado de conformidad con (ii) y determinar cuál de estos genes funciona como canal iónico que responde al sodio o receptor que responde a sodio o transportador y así identificar este gen o genes como presunto gen que modula el sabor salado. Generalmente, los tejidos del gusto para este método derivan de una fuente humana o de roedor. En una modalidad preferida del método, los genes en la etapa (iii) actúan como canales iónicos que responden a sodio, y con mayor preferencia, cuando se expresan los genes, una fracción de la población del canal se abre y pasa sodio en reposo . En una forma preferida de realización, la etapa (i) comprende el uso de microdisección por captura láser (LCM) para disecar y purificar tejidos del gusto a partir de tejidos distintos de los del gusto. En un modo de esta modalidad, la etapa (i) comprende la amplificación de AKN de genes de las células del gusto y las células linguales, y los genes amplificados se analizan respecto de un chip génico que contiene una muestra de genes específicos para el mamífero particular del cual se obtienen los tejidos del gusto y linguales, y con preferencia el chip génico incluye un conjunto de genes anotados de mamífero. En un modo alternativo de esta modalidad, la etapa (i) comprende PCR de alto rendimiento que usa cebadores para cada canal iónico en un genoma de mamífero. En otra modalidad preferida, la etapa (ii) se efectúa mediante hibridación in situ que usa sondas AKN antisentido específicas para el conjunto de genes identificado en la etapa (i) a fin de determinar el nivel de expresión en las células del gusto versus las células linguales. En una modalidad preferida alternativa, la etapa (ii) se efectúa mediante el uso de detección inmunoquímica con un anticuerpo marcado específico para la proteína codificada por el gen o los genes identificados en la etapa (i) . En otra modalidad del método para identificar un gen que codifica un polipéptido que interviene en la percepción del gusto salado en un mamífero, el método de la presente invención comprende las etapas de (i) identificar un conjunto de genes que incluye los genes que se expresan en las células del gusto pero que no se expresan en las células linguales y/o los genes que se expresan en las células del gusto en niveles sustancialmente superiores que en las células linguales; (ii) identificar un subconjunto de genes dentro del conjunto de genes identificado en (i) que no se expresan en las células del gusto que expresan los receptores del gusto sabroso, dulce o amargo (TlR o T2R) o los receptores del gusto ácido (PKD2L1/PKD1L3 ) ; y (iii) determinar en una neurona primaria que expresa uno o más genes en el subconjunto identificado de conformidad con (ii) , en donde los genes actúan como canal iónico que responde al sodio o receptor que responde al sodio o transportador y así identificar este gen o genes como presunto gen que modula el sabor salado. En un modo de esta modalidad, la etapa (iii) comprende poner en contacto la neurona con un anticuerpo que fija específicamente el gen e inhibe su función. Los genes identificados de conformidad con cualquiera de los métodos descritos más adelante pueden ser característicos de las células que no expresan TRPM5 y PKD2L1/P D1L3. En otro modo, la presente invención provee un método para contribuir en la selección de células que no expresan TRPM5 y P D2L1/ KD1L3 al determinar si una célula expresa un gen identificado de conformidad con los métodos anteriores. De preferencia, el gen usado en el método' de este párrafo es uno de los genes enumerados en las Tablas 1-3 , que enumera los genes específicos del gusto que codifican proteínas transmembrana en las células del gusto . Los esfuerzos se centraron en los genes transmembrana, dado que todos los genes receptores del gusto conocidos para el sabor dulce, amargo, sabroso y ácido codifican proteínas transmembrana. En otro modo, la presente invención provee una prueba para identificar un compuesto que tiene potencial para la aplicación in vivo para modular el sabor salado humano. El presente método comprende las etapas de (i) poner en contacto una célula que expresa un gen que codifica un canal iónico, receptor o transportador identificado como presunto gusto salado que afecta el gen de conformidad con uno de los métodos anteriores, o un gen que codifica un polipéptido que posee al menos 90% de identidad de secuencia con el polipéptido que lo codifica, con al menos un presunto compuesto mej orador; (ii) prueba de la conductancia de sodio, la actividad de receptor o de transporte de sodio en presencia y ausencia del presunto mej orador; y (iii) identificar el compuesto como potencial mej orador del gusto salado basado en si incrementa la conductancia del sodio, la actividad del receptor o transporte de sodio. En diversas formas de realización, el gen codifica un canal iónico o el gen codifica un GPCR. De preferencia, el gen es un gen humano. Con mayor preferencia, el método también incluye probar el efecto del compuesto o uno de sus derivados en una prueba del gusto humano. De preferencia, el compuesto seleccionado promueve el transporte iónico de sodio hacia el interior de las células de la papila gustativa. El presunto gen que afecta el gusto salado se puede expresar en un ovocito de anfibio, o en una célula de mamífero, con preferencia un ovocito de Xenopus o una célula de mamífero seleccionada del grupo que consiste en HEK293, HEK293T, Swiss3T3 , CHO, BHK, NIH3T3, célula L de mono, célula renal de mono verde africano, célula Ltk y célula COS. De preferencia, el presunto gen que afecta el gusto salado se expresa bajo el control de un promotor regulable. El presunto gen que afecta el gusto salado se puede expresar en forma estable o transitoria. En un modo preferido, el presunto gen que afecta el gusto salado se selecciona de los genes contenidos en las tablas 1-3 y sus ortólogos y variantes. En un modo preferido, el prueba de la etapa (ii) es un prueba electrofisiológico que utiliza un colorante sensible a sodio, y los colorantes preferidos incluyen colorantes de potencial de membrana seleccionados del grupo que consiste de Molecular Devices Membrana Potential it (Cat#R8034) , Di-4-ANEPPS sal interna de (4- (2- (6- (dibutilamino) -2-naftalen-il) etenil) -1- (3-sulfopropil)hidróxido de piridinio, DÍSBACC4 (2) (bis- (ácido 1, 2-dibarbitúrico) -trietinoxanol) , Cc-2-DMPE (Pacific Blue sal de trietilamonio de 1,2-dietradecanoíl-sn-glicerol-3-fosfoetanolamina) y SBFI-AM (ácido 1 , 3-bencenodicarboxílico, bis-tetrakis ( (acetiloxi)metil}éster de 4 , 4- [1, 4, 10-trioxa-7 , 13-diazacilopentadecan-7 , 13-diil-bis (5-metoxi-6 ,1,2-benzofurandiilo) } (Molecular Probes), con' mayor preferencia, el colorante sensible a sodio es tetraacetato verde de sodio (Molecular Probes) o Kit de colorante sensible a Na (Molecular Devices) . En otro modo preferido, la prueba de la etapa (ii) es una prueba de estrechamiento de voltaje de dos electrodos en ovocitos de Xenopus , o la prueba es una prueba de estrechamiento de parche en células de mamífero. De preferencia, la prueba mide la actividad por una prueba de flujo iónico, incluso el uso de espectroscopia de absorción atómica para detectar el flujo iónico. Alternativamente, la prueba puede usar un lector de placa de fluorescencia (FLIPR) o un lector de placa de imagen de voltaje (VIPR) , que se utiliza para incrementar la absorción de sodio o de fluido dependiente del canal iónico. En una modalidad preferida del presente método, se analiza la actividad del presunto gen que afecta el gusto salado en un ovocito de rana electrofisiológicamente mediante estrechamiento de parche o estrechamiento de voltaje de dos electrodos, de preferencia mediante el uso de un instrumento automático de formación de imágenes, el cual puede ser un lector de placa de fluorescencia (FLIPR) o un lector de placa de imagen de voltaje (VIPR) .

En aún otro modo, la presente invención provee un prueba para identificar un compuesto que tiene potencial aplicación in vivo para modular el sabor dulce, amargo, sabroso o ácido humano. El presente método comprende las etapas de (i) poner en contacto una célula que expresa un gen de las Tablas 2-3 o un ortólogo o variante con al menos un presunto compuesto mejorador o bloqueador; (ii) analizar la conductancia del sodio, la actividad de receptor o la función del producto del gen del gusto en presencia y ausencia del presunto mejorador o bloqueador; e (iii) identificar el compuesto como potencial me orador o bloqueador del gusto dulce, amargo o sabroso sobre la base de si modula la conductancia de sodio, la actividad del receptor o la función del producto génico. En aún otro modo, la presente invención provee un prueba para identificar un compuesto que tiene potencial aplicación in vivo como posible agente terapéutico. El presente método comprende las etapas de (i) poner en contacto un célula que expresa un gen de las Tablas 1-3 o un ortólogo o variante con al menos un presunto compuesto mejorador o bloqueador; ' (ii) ensayar la conductancia de sodio, la actividad de receptor o la función del producto génico del gusto en presencia y ausencia del presunto me orador o bloqueador e (iii) identificar el compuesto como potencial agente terapéutico que se puede usar para modular una función relacionada con las células del gusto o que no incluye directamente el gusto, tal como un trastorno o enfermedad digestiva, ciclo o regeneración de las células del gusto o las papilas gustativas, regulación inmunitaria del sistema oral o el aparato digestivo, o tratamiento de un trastorno metabólico tal como diabetes, obesidad, trastornos alimenticios et al., sobre la base de si modula la conductancia de sodio, la actividad del receptor o la función del producto génico del gusto . Breve Descripción de las Figuras Las Figuras 1A - 1F contienen un ejemplo de LCM que usa tejidos del gusto humanos. La Figura 2 contiene un ejemplo de control de calidad por PCR de las células del gusto y las células linguales humanas.

La Figura 3 contiene un . ejemplo de análisis por PCR de alto rendimiento para identificar nuevos canales iónicos específicos para el gusto. La Figura 4 contiene un ejemplo de métodos histológicos de hibridación in situ e inmunoquímicos para visualizar la expresión del gen del gusto conocido gustducina en cortes de tejidos del gusto murinos o humanos. La Figura 5 contiene un ejemplo de métodos histológicos de hibridación in situ e inmunoquímicos para visualizar la expresión del gen TRPM5 del gusto en cortes de tejidos del gusto múranos o humanos . Figura 6: Ejemplo de inmunohistoquímica para visualizar la expresión del gen TRPM5 del gusto en tejido del gusto murino . Figura 7: Ejemplo de método histológico de irimunohistoquímica para visualizar la expresión del gen de canal iónico de sodio SCN3A/Navl.3 el tejido del gusto murino Figura 8: Ejemplo de inmunohistoquímica de doble marcado que ilustra la coexpresión de SCN3A y TRPM5 en las mismas células del gusto. Figura 9: Ejemplo de inmunohistoquímica para visualizar la expresión del gen del gusto PKD2L1 del gusto en tejido del gusto murino. Figura 10: Ejemplo de inmunohistoquímica de doble marcado que ilustra la expresión de PKD2L1 y TRPM5 en diferentes células del gusto. La Figura 11 contiene un experimento de marcado doble que visualiza la expresión de HCN4 y TRPM5 en distintas células CV murinas . La Figura 12 contiene un experimento de inmunoquímica de marcado doble que visualiza la expresión de HCN4 y PKD2L1 en las mismas células CV del gusto murinas . La Figura 13 contiene un experimento de marcado doble que demuestra la exclusión de HCN4 del poro del gusto en las células del gusto CV murinas . Descripción Detallada de la Invención La invención se refiere a la identificación de genes expresados específicamente en tejidos del gusto que presuntamente intervienen en el gusto salado u otras modalidades del gusto o del gusto en general; o que intervienen en funciones relacionadas con las células del gusto y los fenotipos que no incluyen directamente el gusto tales como la regeneración y el ciclo de las células del gusto o la papila gustativa, la inmunorregulación de la cavidad oral o el aparato digestivo, la regulación de la digestión o el metabolismo, el inicio o la prevención de trastornos del aparato digestivo tales como cánceres, enfermedades inmunitarios y padecimientos inflamatorias tales como IBU, colitis ulcerada, síndrome de Sjógren, enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn y similares, y su uso en análisis de selección para identificar compuestos que modulan la percepción del gusto salado u otras modalidades del gusto o del gusto en general o para la identificación de potenciales terapéuticas para usar en humanos. En particular, la invención incluye el uso de las siguientes metodologías para identificar nuevos genes específicos del gusto: 1) Microdisección por captura láser (LCM) y amplificación de A . En la microdisección por captura láser, se usa un fino haz láser para disecar y purificar las células del gusto de los cortes histológicos. Este método aisla las células del gusto sin contaminación de células epiteliales linguales y tejido conectivo, y permite la ejecución de experimentos de biología molecular en una población de las células del gusto altamente enriquecida. En paralelo, las células epiteliales linguales se aislan por LCM y se usan como control negativo carente de las células del gusto. LCM es ventajosa para la disección manual o enzimática de las papilas gustativas, dadas que estas técnicas sin tratamiento produce una mezcla heterogénea de las células del gusto y linguales, en la cual las células del gusto comprenden 1-20% del material recolectado. La amplificación por ARN amplifica el total de ARN de las células del gusto y células linguales aisladas por LCM hasta 1 millón de veces en forma no sesgada, para generar suficiente material genético para realizar estudios de biología molecular (c ip génicos o PCR) . Los autores hallaron que 1300-2000 células del gusto son suficientes para experimentos con chip génicos de tejido del gusto murino, y más de 5 , 000 células del gusto son suficientes para experimentos de PCR con tejido humano del gusto. 2 ) Chip génicos. Los chip génicos contienen casi todos los genes anotados en un pequeño chip. Se híbrida ARN aislado y amplificado de las células del gusto y linguales a chip génicos, que se pueden usar para determinar cuáles genes específicos se expresan en las células del gusto y no en las células linguales, y cuáles genes específicos se expresan con mayor nivel en las células del gusto, comparadas con las células linguales . 3 ) PCR. Se realiza PCR de alto rendimiento en placas de 96 cavidades mediante el uso de cebadores específicos para cada canal iónico en el genoma humano/murino y ARN amplificado proveniente de las células del gusto y linguales humanas/murinas aisladas por LCM. La detección de productos del tamaño adecuado en las células del gusto, pero no en las células linguales y la determinación de la secuencia de ADN de los productos para confirmar la identidad génica indica que el canal iónico de interés es un gen específico del gusto. 4) Hibridación in situ. Sondas antisentido ARN específicas para un gen individual (identificado por chip génicos o PCR) se hibridan a cortes de tejido que contienen las células del gusto, a fin de determinar si la transcripción de ARNm para el gen de interés se expresa en las células del gusto, específicamente en las células del gusto ácido, dulce, amargo y/o sabroso o en un tipo celular exclusivo que puede intervenir en la detección del gusto salado. 5) Inmunohistoquímica. Se aplicaron anticuerpos específicos para una proteína individual (cuyo gen se identificó por chip génicos o PCR) a cortes de tejido que contienen las células del gusto, a fin de determinar si la proteína de interés se expresa en las células del gusto, específicamente en las células del gusto ácido, dulce, amargo y/o sabroso o en un tipo celular exclusivo que puede intervenir en la detección del gusto salado.

Control de calidad del ARN La integridad del ARN se calibra mediante el uso de dos métodos . La calidad del ARN se determina mediante el uso de un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) con un Series II RNA 6000 Pico Assay (Cat # 5067-1514) . Se cuantifica la relación entre las abundantes bandas de ARN 28S ribosomal (ARNr) y ARNr 18S. Una relación de 2 indica ARN de alta calidad sin degradación. Una relación -1 indica degradación parcial de ARN. Las relaciones entre 0.5-1.0 son comunes para las muestras de LCM debido a la degradación parcial de ARN que ocurre cuanto se tiñen las muestras y se procesan para LCM a temperatura ambiente. Además, se determina el número de integridad de ARN (RIN) . Un valor de RIN de 10 indica ARN de alta calidad sin degradación. Un valor RIN de 5 indica degradación parcial de ARN y un RIN de 1 indica degradación masiva de ARN. Valores de RIN > 5 son aceptables para el análisis por chip génico y son comunes para muestras de LCM. Generalmente, las relaciones 28S/18S de ARNr son de -1.0 y los valores de RIN son de 7-8 para muestras de tejido del gusto murino, mientras que las relaciones de 28S/18S de ARNr son de 0.5-1.0 y los valores de RIN son de 5-6 para muestras de tejido del gusto humano. Segundo, se determina la cantidad de ARN con el Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit (Molecular Probes, Cat # R11490) . Se usa un colorante fluorescente fijador de AR , con sensibilidad de hasta apenas 1 pg/ul, para cuantificar la cantidad total de ARN en muestras de las células del gusto y linguales. Es importante la cuantificación precisa de ARN para agregar cantidades iguales de ARN del gusto y lingual a los experimentos de chip génico y PCR. 2 ) Chip génicos: Se realizaron experimentos con chip génicos en 5 muestras apareadas de células CV del gusto y linguales murinas mediante el uso de disposiciones Affymetrix 430 2 . 0 y se analizaron mediante el uso de software GeneSpring GX v7 . 3 (Agilent Technologies) . Por separado se aislaron entre 1300-2000 células CV del gusto y linguales por LCM y se purificó el total de ARN para cada muestra. Luego se amplificó el ARN y se hibridó a los chip génicos . Se realizó el análisis de los datos usando dos algoritmos diferentes: Affymetrix Microarray Suite 5 (MAS 5) , el cual tiene en cuenta las sondas con coincidencias perfectas y sin coincidencia en los chip génicos, y el fuerte algoritmo multichip (RMA) , que sólo tiene en cuenta las sondas con coincidencias perfectas con los chip génicos. En este análisis se detectaron los genes específicos del gusto que codifican proteínas transmembrana. 3 ) PCR: Previo a PCR de alto rendimiento mediante el uso de cebadores contra la totalidad de los 339 canales iónicos identificados en los genomas humanos/murinos , se realizaron reacciones de control de PCR sobre hasta 4 genes específicos del gusto conocidos y 2 genes organizadores domésticos a fin de asegurar que los ARN del gusto y linguales son de buena calidad. Los 4 genes específicos del gusto examinados son la G alfa proteína gustducina, el componente del receptor dulce T1R2, el canal iónico TRPM5 y la enzima fosfolipasa C de isoforma beta; los dos genes organizadores domésticos examinados eran beta-actina y GAPDH. La expresión específica de los genes del gusto por las células del gusto pero no por las células linguales, más la expresión de los genes organizadores domésticos ubicuos por parte de las células del gusto y linguales indica material de ARN de alta calidad. Los productos de PCR se analizaron en genes de agarosa para determinar la presencia de las bandas de tamaño adecuado en las células del gusto y no en las células linguales. Los genes con este patrón de expresión son presuntos genes específicos del gusto. Todos los genes específicos del gusto se clonaron y se determinó su secuencia, a fin de confirmar la identidad de los genes . 4) Hibridación in situ: En la hibridación in situ con doble marcado, se generan dos sondas ARN diferentes para marcar dos genes diferentes, específicamente dos genes diferentes específicos del gusto identificados por método por chip génico y/o PCR. Alternativamente, se puede generar una sonda para marcar un único gen a fin de determinar si el gen se expresa en las células del gusto. Para los estudios de doble marcado, el primer gen se rotula con una sonda FITC que genera un color en un microscopio fluorescente, mientras que el segundo gen es marcado con una sonda de digoxigenina (DIG) , que genera un color diferente en un microscopio fluorescente. La superposición de la sonda 1 y la sonda 2 revela si los genes están expresados en los mismos tipos celulares o en tipos celulares diferente. Por ejemplo, si un canal iónico singular identificado mediante los métodos de chip génico o PCR se colocaliza sobre las células que expresan TRPM5, el canal iónico singular está expresado en las células responsables del sabor dulce, amargo y/o sabroso. En cambio, si un canal iónico singular identificado mediante los métodos de chip génico o PCR no se co-localiza sobre las células que expresan TRPM5, el canal iónico singular se expresa en un tipo celular diferente, que puede ser responsable del gusto salado (u otra modalidad del gusto) y el canal iónico singular puede intervenir directamente en la detección de sodio . 5) Inmunohistoquimica: En la inmunohistoquimica de doble marcado, se usan dos sondas de anticuerpo diferentes para marcar dos proteínas diferentes, específicamente dos proteínas específicas del gusto diferentes, cuyos genes se identificaron mediante los métodos de chip génico y/o PCR. Alternativamente, se puede usar una sonda de anticuerpo para marcar una misma proteína, a fin de determinar si la proteína se expresa en las células del gusto. Mediante estudios de doble marcado, se rotula la primera proteína con un anticuerpo en concentración muy diluida, que sólo se puede detectar mediante un método de detección sensible denominado amplificación de señal de tiramina (TSA) . Luego se rotula la segunda proteína con otro anticuerpo y se detecta mediante el uso de un método distinto de TSA. El primer anticuerpo diluido no se puede detectar mediante el método TSA distinto de TSA; en consecuencia, dos anticuerpos diferentes provenientes de la misma especie (por ejemplo anticuerpos policlonales de conejo) no forman reacciones cruzadas y, en consecuencia, se pueden usar experimentos de doble marcado. La superposición de la marcación proteico 1 y la marcación proteico 2 revela si las proteínas se expresan en tipos celulares iguales o diferentes . Por ejemplo, si un canal iónico singular identificado mediante los enfoques de chip génico o PCR se colocaliza en las células que expresan TRPM5, el canal iónico singular se expresa en las células responsables de los sabores dulce, amargo y sabroso. En cambio, si un canal iónico singular identificado mediante los enfoques de chip génico o PCR no se colocaliza en las células que expresan TRPM5, el canal iónico singular se expresa en un tipo celular diferente, que puede ser responsable del gusto salado (u otra modalidad del gusto) y el canal iónico singular puede intervenir directamente en la detección de sodio. Usando los fundamentos, métodos y protocolos se identificaron los siguientes genes, los cuales están contenidos en las Tablas de la presente. Estas Tablas se describen brevemente como sigue. Tabla 1: Síntesis de genes murinos específicos del gusto que codifican proteínas transmembrana a partir de microdisposiciones Affymetrix 430 2.0/chip génicos . Tabla 2: Síntesis de canales iónicos específicos del gusto de humano y murino provenientes de análisis por PCR. Tabla 3: Síntesis de co-localización de genes específicos del gusto en TRPM5 (dulce, amargo, sabroso) y células PKD2L1/PKD1L3 (ácido) . En consecuencia, sobre la base de lo anterior, el objeto de la invención se refiere en general a métodos para identificar los genes del gusto, incluso los genes que intervienen en la percepción del gusto salado y el uso en análisis de selección para la identificación de compuestos mej oradores del gusto salado humano y otros moduladores del gusto, y para la identificación de posibles terapéuticas que modulen otras funciones relacionadas con las células del gusto • y fenotipos que incluyen enfermedades y padecimientos no relacionadas directamente con la transduccion del gusto. En particular, la presente invención incluye el uso de análisis celulares para identificar moduladores del gusto salado (mejoradores) . Estos compuestos tienen potencial aplicación en la modulación de la percepción humana del gusto salado. Los compuestos identificados, por ejemplo mediante análisis electrofisiológicos , y sus derivados biológicamente aceptables deben ser analizados en análisis del gusto en humanos mediante voluntarios humanos, a fin de confirmar su efecto sobre la precepción humana del gusto salado. Además, los compuestos identificados como potenciales agentes terapéuticos deberán ser evaluados en modelos in vitro e in vivo adecuados según la naturaleza de la aplicación pretendida. Por ejemplo, los compuestos identificados como potenciales agentes terapéuticos para diabetes pueden ser evaluados en modelos animales diabéticos bien conocidos tales como el modelo murino NOD o el modelo de rata BB. De modo similar, los compuestos identificados como potenciales agentes terapéuticos para IBD o enfermedad de Crohn se pueden analizar en modelos de animales roedores para IBD o enfermedad de Crohn. Tal como se analiza más adelante, los análisis celulares usados para identificar el gusto, por ejemplo, los compuestos moduladores del gusto salado o terapéuticos de preferencia comprenden plataformas de análisis de alto rendimiento para identificar compuestos que modulan (mejoran) la actividad de los genes que intervienen en la percepción del gusto salado mediante el uso de células que expresan los genes descritos en la presente o sus combinaciones. Además, estas secuencias se pueden modificar para introducir mutaciones silenciosas o mutaciones con un efecto funcional tales como las mutaciones definidas que afectan el influjo de iones (sodio) . Tal como se observó con anterioridad, los análisis de preferencia comprenden análisis electrofisiologicos efectuados en ovocitos de anfibios o análisis que utilizan células de mamíferos que expresan un canal aniónico de conformidad con la invención mediante colorantes fluorescentes sensibles a iones o colorantes de potencial de membrana, por ejemplo, colorantes sensibles a sodio. De preferencia, los compuestos que modulan los canales iónicos se identifican mediante análisis con análisis electrofisiologicos efectuados con ovocitos que expresan un canal iónico identificado en la presente (por ejemplo, estrechamiento de parche o estrechamiento de voltaje de dos electrodos) . También alternativamente, los compuestos que modulan canal iónico objetivo presuntamente incluido en el gusto salado se puede detectar mediante análisis de flujo iónico, por ejemplo, análisis de flujo iónico con marca radiactiva o análisis de flujo iónico acoplados a espectroscopia de absorción atómica. Tal como se describió con anterioridad, estos compuestos tienen posible aplicación para modular la percepción del gusto salado humano o para modular otros procesos biológicos que incluyen funciones aberrantes o normales de los canales iónicos . Los análisis celulares objetivo usan secuencias mutantes de ácidos nucleicos que se expresan en las células deseadas, de preferencia ovocitos o células humanas tales como células HEK-293, u otras células humanas o de mamífero usadas convencionalmente en análisis para identificar compuestos moduladores de canales iónicos o GFC . Estas células también se pueden someter a ingeniería para expresar otras secuencias, por ejemplo, otros GPCR del gusto, es decir TlR o T2R tales como las que se describen en otras solicitudes de patente del presente cesionario Senomyx así como proteínas G adecuadas. El sistema de ovocitos es ventajoso dado que permite la inyección directa de múltiples especies de ARNm, provee elevada expresión proteica y puede acomodar los efectos deletéreos inherentes a la expresión excesiva de los canales iónicos . Sin embargo, los inconvenientes consisten en que el análisis electrofisiológico mediante el uso de ovocitos de anfibios no permite el análisis con alto rendimiento de gran cantidad de compuestos y no es un sistema de mamífero. Tal como se destacó, la presente invención abarca análisis que utilizan células de mamífero, de preferencia análisis de alto rendimiento . Algunos canales iónicos presuntamente incluidos en las proteínas de gusto salado (ENaC) son conocidas por formar canales heteroméricos que comprenden tres subunidades, una subunidad alfa, beta y una subunidad gamma o delta. Las secuencias de estas respectivas subunidades de ENaC han sido descritas por una solicitud de patente anterior del presente cesionario, el documento US serie No. 10/133.573 que se incorpora a la presente por referencia en su totalidad. Ante la co-expresión en una célula adecuada, estas subunidades producen un canal heterotrimérico que tiene actividad de canal iónico catiónico; en particular responde a sodio y, de modo similar, debería responder a iones litio en análisis celulares tales como los descritos en la presente y en la solicitud previa de Senomyx a que se hizo referencia con anterioridad. Las solicitudes de Senomyx incorporadas por referencia proveen alto rendimiento en los análisis de selección que utilizan células de mamíferos transfectadas o sembradas en cavidades o placas de cultivo en las cuales se permite que proceda la expresión funcional en presencia de los compuestos y se detecta la actividad mediante colorante fluorescente de potencial de membrana o fluorescentes iónicos (sodio) . Tal como se analizó con anterioridad, la invención específicamente provee métodos de selección de moduladores del gusto salado humano, por ejemplo, activadores, inhibidores, estimuladores, mej oradores, etc., u otras modalidades del gusto y potenciales terapéuticos dirigidos a otras funciones o fenotipos de las células del gusto mediante el uso de ácidos nucleicos y proteínas, cuyas secuencias se proveen en la presente. Los moduladores pueden afectar el gusto salado o otras modalidades del gusto o funciones y fenotipos relacionados con las células del gusto, por ejemplo, al modular la transcripción, la traducción, el ARNm o la estabilidad de las proteínas; al alterar la interacción del canal iónico con la membrana plasmática, u otras moléculas, o al afectar la actividad de la proteína del canal iónico. Los compuestos son analizados, por ejemplo, mediante el uso de análisis de alto rendimiento (BES) , a fin de identificar los compuestos capaces de fijarse y/o modular la actividad de un receptor del gusto o polipéptido de canal iónico del gusto o transportador o sus fragmentos. En la presente invención, las proteínas se expresan en forma recombinante en las células, por ejemplo, células humanas u ovocitos de rana y la modulación de la actividad se analiza mediante el uso de cualquier medida de la función del canal iónico, receptor o transportados , tales como la medición del potencial de membrana, o medidas de los cambios de los niveles intracelulares de sodio o litio. Los métodos de prueba de la función de . los canales iónicos, por ejemplo, los canales catiónicos incluyen por ejemplo, técnicas de estrechamiento de parche, estrechamiento de voltaje de dos electrodos, medición de corrientes en células enteras, y técnicas de imágenes fluorescentes que utilizan colorantes fluorescentes sensibles a iones y análisis de flujo iónico, por ejemplo, análisis de flujo iónico con marca radiactiva análisis de flujo iónico. Además, tal como se mencionó con anterioridad, la presente invención también provee métodos para aislar, purificar y marcar los tipos de las células del gusto y los linajes de las células del gusto deseados que incluyen por ejemplo, células del gusto sabroso, dulce, salado, amargo, graso, ácido, metálico, así como células madre del gusto y otros linajes de las células del gusto que incluyen las células que se diferencian a las células de la papila gustativa, neuronas de las células del gusto, células inmunitarias del gusto et al . , sobre la base de la expresión de uno o más de los genes específicos del gusto provistos en la presente. Estos métodos de aislamiento y purificación incluyen métodos de separación de células positivos y negativos. Por ejemplo, se pueden aislar los linajes o tipos de las células del gusto deseadas por métodos de selección celular positivos, por ejemplo mediante el uso de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) , selección de células por perlas magnéticas, por ejemplo, mediante la identificación visual de las células deseadas tales como células individuales transíectadas por electrofisiología mediante el uso de perlas recubiertas por anticuerpo. Alternativamente, se pueden recuperar o purificar los linajes o tipos de las células del gusto deseadas mediante métodos negativos de purificación y aislamiento, en los cuales los tipos de células deseadas se enriquecen o purifican a partir de una población celular mixta al extraer los linajes de células no deseadas por ejemplo, al poner en contacto una población mixta de células que contiene las células del gusto deseadas y las células no deseadas con anticuerpos citotóxicos específicos para un gen o genes objetivo expresados en el/los tipo(s) de las células del gusto no deseadas, las cuales son extraídas . Por ejemplo, los genes específicos del gusto identificados en la presente informados en las Tablas 1, 2 y 3 se pueden usar como marcadores para can identificar y/o purificar células del gusto específicas que incluyen, a modo de ejemplo las células del gusto dulce, sabroso, ácido, amargo, salado, graso y otras células del gusto que incluyen células madre. En una modalidad, se pueden usar anticuerpos dirigidos contra al menos una de las proteínas codificadas por un gen contenido en una de las Tablas 1, 2 ó 3, o uno de sus ortólogos o variantes, por ejemplo una variante que codifica una proteína con al menos 90% de identidad con él, para marcar las células contenidas en una suspensión de las células del gusto, por ejemplo, las células de la papila gustativa, una suspensión de células derivadas del tracto gastrointestinal, incluso las células del gusto producidas por ejemplo por digestión enzimática, desagregación tisular (ver por ejemplo, Herness ??. , Neuroscience Letters 106:60-64 (1989) et al., gue enseña un procedimiento de disociación para aislar papilas gustativas de mamíferos) . Además, la separación de los linajes o subtipos de las células del gusto deseadas se puede lograr mediante el uso de un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) (ver por ejemplo, Beavis, AJ y Pennline KJ Biotechniques 21:498-503 (1996)), o mediante el uso de técnicas de separación de células por perlas magnéticas (ver por ejemplo Jurman et al., Biotechniques 17:887-881 (1994), cuya referencia informa la identificación visual de células transfectadas mediante el uso de perlas recubiertas por anticuerpo) o mediante el uso de otros métodos generalmente conocidos en la técnica para aislar, purificar, marcar y/o enriquecer las células deseadas contenidas en una población celular mixta sobre la base de la expresión de uno o varios genes marcadores. Además, las células pertenecientes a un subconjunto específico de células se pueden purificar o enriquecer mediante procedimientos de selección celular negativos que eliminan las células no deseadas, por ejemplo las que representan subconjuntos de las células del gusto que no son del objetivo, mediante el uso de métodos que eliminan las células no deseadas, por ejemplo, al poner en contacto la población celular mixta con anticuerpos citotóxicos específicos para uno o varios subtipos de las células del gusto no deseadas .

Además, la invención provee métodos para usar los genes específicos del gusto objetivos contenidos en las Tabla 1, 2 ó 3 , o sus ortólogos y variantes y el uso de marcadores o sus sondas específicas, por ejemplo, anticuerpos u oligonucleótidos , los cuales se pueden marcar con marcadores detectables tales como radionucleidos , fluoróforos, enzimas y similares, en donde los marcadores o las sondas son específicos para uno o más de los genes específicos del gusto objetivos, para cartografiar regiones específicas de la lengua y la cavidad oral que comprenden células que intervienen en modalidades específicas del gusto tales como sabroso, dulce, amargo, salado, ácido, graso, metálico, et al., así como para cartografiar las células que intervienen en funciones específicas distintas del gusto tales como las identificadas en la presente y para cartografiar regiones específicas del tracto gastrointestinal y órganos asociados que contienen células que expresan específicamente los genes específicos del gusto y los cuales en consecuencia intervienen en una o más de las funciones específicas de las células del gusto descritas en la presente, y/o el uso de los genes de las células del gusto objetivo en estudios de diferenciación de las células del gusto, por ejemplo para la identificación de compuestos que inducen la diferenciación o desdifereneiación de las células del gusto, por ejemplo, células madre de adultos o embrionarias, y otros tipos celulares pluripotenciales o en tipos celulares inmaduros en los tipos y linajes de las células del gusto deseadas. La presente invención se refiere más específicamente a nuevos fundamentos, métodos y análisis que incluyen análisis electrofisiológicos que identifican y caracterizan nuevos genes específicos del gusto, incluso los que actúan como receptores de gusto salado. Se cree que el gusto salado humano puede ser mediado, en parte, por un canal iónico de sodio o de otro tipo, así como por transportadores y GPCR expresados específicamente en las células del gusto. En consecuencia, la invención provee métodos para identificar genes específicos del gusto, incluso genes que pueden regular el gusto salado, así como otras modalidades del gusto y funciones mediadas por las células del gusto y fenotipos que usan metodologías de chip génico y PCR. Los compuestos identificados en la presente y sus derivados que se fijan y/o modulan la función de los genes específicos del gusto provistos en la presente son útiles como moduladores del gusto y también como agentes terapéuticos, por ejemplo, para tratar trastornos gastrointestinales y metabólicos tales como diabetes, obesidad, caquexia y similares. Definiciones "Presunto receptor o gen de canal iónico de gusto salado" se refiere a un gen expresado específicamente en las células del gusto que no se expresa en las células linguales o que se expresa sustancialmente menos en las células linguales, además con preferencia no se expresa en las células del gusto que expresan un gen TlR, T2R, TRPM5 o P D2L1/PKD2L3. "Célula del gusto" se refiere a una célula que cuando madura expresa al menos un receptor, transportador o canal iónico que regula en forma directa indirecta o modula una modalidad específica del gusto, tal como la percepción del gusto dulce, ácido, sabroso, salado, amargo, graso, metálico o de otro tipo o la percepción general del gusto tal como la intensidad del gusto o la duración de 'una respuesta del gusto. Las células del gusto expresan ARNm y/o una proteína para el gen C6orfl5 (marco de lectura de cromosoma 15) también denominado STG. Este gen ha sido descrito como gen específico del gusto (M. Neira et al., A New gen (mSTG) specific for taste buds is found by láser capture microdissection. Mammalian Genome 12:60-66 (2001)) y se encuentra entre los genes específicos del gusto murinos informados en la presente. Además, un receptor del gusto maduro generalmente expresa ARNm y/o la proteína de alfa ENAC. Los autores disponen de datos (no mostrados en la presente) que revelan que alfa ENaC se expresa en al menos las células del gusto dulce, amargo, sabroso, ácido y más probablemente del gusto salado. Además, una célula del gusto madura generalmente expresa ARNm y/o la proteína para citoqueratina 19. Esta proteína sólo se expresa en las células del gusto maduras y no se encuentra en células básales o madre. (L. Wong et aL, "Keratin-like immunoreactivity in receptor cells of mammalian taste buds" . Chemical Senses 19 (3 ): 251-264 (1994)). Además, las células del gusto pueden ser identificadas por los expertos en la técnica sobre la base de su morfología característica. En particular, las células del receptor del gusto maduras son alargadas y ahusadas. Además, una célula del receptor del gusto madura tiene el ápice de la célula (membrana apical) que penetra en el interior del poro gustativo, por lo que accede o se expone a la saliva. En cambio, una célula del gusto inmadura, por ejemplo una célula basal o madre es redondeada y no está expuesta al poro gustativo y la saliva. Además, a diferencia de las células del gusto maduras, las células básales y madre tienden a estar ubicadas hacia la base de las papilas gustativas. Las "células quimiosensoriales" son células que intervienen en la percepción de estimulantes químicos tales como saborizantes y otros estímulos sensoriales químicos tales como aromatizantes . Las células quimiosensoriales en la presente incluyen en particular las células del receptor del gusto y las células comprendidas en los tractos digestivo o urinario, u otros órganos que cuando están maduras expresan uno o más receptores del gusto. Por ejemplo, se conocen células quimiosensoriales gastrointestinales que expresan TlR o T2R y cuyas células probablemente intervienen en la sensación de los alimentos, el metabolismo, la digestión, diabetes, la absorción de alimentos, la motilidad gástrica, et al. Además, es probable que células halladas en el tracto urinario expresen receptores del gusto salado e intervengan en el transporte, la excreción del sodio y las funciones asociadas con él, tales como la presión arterial y la retención de líquidos. Además, en el aparato digestivo las células quimiosensoriales que expresan receptores del gusto también pueden expresar cromogranina A, el cual es un marcador de gránulos secretores. (C. Sternini, "Taste Receptors in the Gastrointestinal Tract. IV. Functional lmplications of Bitter Taste Receptors in Gastrointestinal Chemosensing" . American Journal of Physiology, Gastrointestinal and Liver Physiology" , 292:G457-G461, 2007) . El "gen específico de las células del gusto" se refiere en la presente a un gen específicamente expresado por las células del gusto, por ejemplo, una célula del gusto en empalizada que no se expresa específicamente en las células linguales que intervienen en una función celular relacionada con las células del gusto o el fenotipo. Las células del gusto incluyen las células de la cavidad oral que expresan los receptores del gusto tales como las células de la lengua y las células del gusto en otras zonas del organismo que expresan receptores del gusto tales como el aparato digestivo y el tracto urinario. Los genes incluyen los que comprenden los números de acceso contenidos en las Tablas 1 , 2 y 3 , así como sus ortólogos, variantes alélicas, quimeras y los genes que se hibridan a esta en condiciones de hibridación rigurosa, y/o los genes que codifican una proteína que posee al menos 80% , con mayor preferencia al menos 90% , y con mayor preferencia aún al menos 95% de cualquiera de los anteriores. Estos genes específicos de las células del gusto incluyen los genes que intervienen en funciones relacionadas y no relacionadas con el gusto tales como el ciclo de las células del gusto, enfermedades que afectan el aparato digestivo o la cavidad oral, la inmunorregulación de la cavidad oral y/o el aparato digestivo, funciones digestivas y metabólicas que incluyen las células del gusto tales como diabetes, obesidad, presión arterial, retención de fluidos et al. En referencia a los genes particulares específicos del gusto identificado en la presente tal como se destacó, estos genes incluyen las secuencias de ácidos nucleicos correspondientes a los números de acceso contenidos en las Tablas 1 , 2 y 3 'así como sus ortólogos y quimeras y variantes que incluyen sus variantes alélicas. En particular, las variantes incluyen secuencias que codifican polipéptidos que tienen al menos 80 % de identidad, con mayor preferencia al menos 90% o 95% de identidad con los polipéptidos codificados por los genes correspondientes a los citados números de acceso o sus ortólogos, especialmente ortólogos humanos y de primates no humanos. Además, los genes incluyen las secuencias de ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones de hibridación rigurosas a una secuencia de ácido nucleico correspondiente a una de las secuencias génicas correspondientes a los números de acceso génico citados en las Tablas de la presente. Los "canales catiónicos" son un grupo diversos de proteínas que regulan el flujo de los cationes a través de las membranas celulares . La capacidad de un canal catiónico específico para transportar cationes particulares varía según la valencia de los cationes, así como la especificidad del canal en cuestión para un catión particular. Un "canal homomérico" se refiere a un canal catiónico compuesto por subunidades alfa idénticas, mientras que "canal heteromérico" se refiere a canal catiónico compuesto por dos o más tipos diferentes de subunidades alfa. Los canales homoméricos y heteroméricos pueden incluir subunidades beta auxiliares . Una "subunidad beta" es un monómero de polipéptido que es una subunidad auxiliar de un canal catiónico compuesto de subunidades alfa; sin embargo, las subunidades beta solas no pueden formar un canal (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos de América No. 5,776,734). Es sabido, por ejemplo, que las subunidades beta incrementan la cantidad de canales al ayudar a la subunidad alfa a alcanzar la celular, cambiar la cinética de activación y cambiar la sensibilidad de los ligandos naturales que se fijan a los canales. Las subunidades beta pueden estar en la parte externa de la región del poro y asociarse con subunidades alfa que comprenden la región del poro . También pueden contribuir a la boca externa de la región del poro El término "auténtico" o "de tipo silvestre" o "nativo" referido a secuencias de ácidos nucleicos se refiere a las secuencias de ácidos nucleicos de tipo silvestre contenidas en las Tablas de la presente asi como las variantes de empalme y otras secuencias de ácidos nucleicos generalmente conocidas en la técnica. El término polipéptidos "auténticos" o "de tipo silvestre" o "nativos" se refiere al polipéptido codificado por los genes y la secuencia de ácidos nucleicos contenida en las Tablas. El término "secuencia modificada de ácido nucleico mejorador del receptor" o "secuencia optimizada de ácido nucleico" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que contiene una mutación, particularmente la que afecta (inhibe o mejora) la actividad génica en células hospedoras recombinantes , y muy especialmente ovocitos o células humanas tales como células HEK -293 . En particular, estas mutaciones incluyen las que afectan la regulación del portal debido al canal iónico resultante que contiene la secuencia de la subunidad mutada. El canal iónico puede comprender las mutaciones en una o varias de las tres subunidades que constituyen el canal iónico particular. La secuencia de ácido nucleico modificada, por ejemplo, puede contener mutaciones por sustitución en una subunidad que afectan (deterioran) la función de portal o generan un defecto de la expresión de superficie. La invención abarca el uso de otras secuencias génicas mutadas, es decir variantes de empalme, las que contienen eliminaciones o adiciones, quimeras de las secuencias objeto y similares. Además, la invención puede usar secuencias que se pueden modificar para introducir codones preferidos de células hospedoras, particularmente codones preferidos de células hospedoras de anfibios o humanos . El término receptor o proteína de canal iónico o transportador o su fragmento, o un ácido nucleico que codifica un receptor del gusto particular o canal iónico o transportador o uno de sus fragmentos de conformidad con la invención se refiere a ácido nucleicos y variantes, alelos, mutantes polimórficos de polipéptidos , y los homólogos interespecies que: (1) tienen una secuencia de aminoácidos que tiene más de aproximadamente 60% identidad de secuencia de aminoácidos, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, de preferencia 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más identidad de secuencia de aminoácidos, de preferencia en una región de al menos aproximadamente 25, 50, 100, 200, 500, 1000 o más aminoácidos, respecto de una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácidos nucleicos de tipo silvestre o la secuencia de aminoácidos de la proteina del gusto, por ejemplo, las proteínas codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos génicas contenidas en las Tablas de la presente así como sus fragmentos, y sus variantes modificadas conservadoramente; (3) polipéptidos codificados por secuencias de ácidos nucleicos que se hibridan específicamente en condiciones de hibridación rigurosas a una cadena antisentido correspondiente a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un gen codificado por uno de los genes, y sus variantes modificadas conservadoramente; (4) tienen una secuencia de ácidos nucleicos que tiene más de aproximadamente 60% de identidad de secuencia, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, de preferencia 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, o mayor identidad de secuencia de nucleótidos, de preferencia en una región de al menos aproximadamente 25, 50, 100, 200, 500, 1000, o más nucleótidos, respecto de un ácido nucleico, por ejemplo, los descritos en la presente. Un presunto gen específico de gusto salado o de otro gusto o polinucleótido o secuencia de polipéptido generalmente proviene de un mamífero que incluye, sin limitaciones, primates, por ejemplo humano; roedor, por ejemplo rata, ratón, hámster; vaca, cerdo, caballo, oveja o cualquier mamífero. Los ácidos nucleicos y las proteínas de la invención incluyen moléculas naturales o recombinantes . Generalmente, estos genes codifican proteínas que tienen actividad de canal iónico, es decir son permeables al sodio o al litio. Por "determinar el efecto funcional" o "determinar el efecto sobre la célula" se entiende analizar el efecto de un compuesto que incrementa o reduce un parámetro que está bajo la influencia, directa o indirecta de un gen del gusto, de preferencia un gen del gusto salado identificado en la presente por ejemplo, efectos funcionales, físicos, fenotípicos y químicos. Los efectos funcionales incluyen sin limitaciones cambios del flujo iónico, del potencial de membrana, la amplitud de la corriente y la regulación por voltaje, así como otros efectos biológicos tales como cambios de la expresión génica de cualquier gen marcador, y similares. El flujo iónico puede incluir cualquier ión que atraviesa el canal, por ejemplo sodio o litio, y sus análogos tales como radioisótopos . Los efectos funcionales se pueden medir por cualquier medio conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo, estrechamiento de parche, mediante el uso de colorantes sensibles a voltaje, o por medición de cambios de los parámetros tales como las características espectroscopicas (por ejemplo fluorescencia, absorbancia, índice de refracción) , hidrodinámicas (por ejemplo, forma) , cromatográficas , o propiedades de solubilidad. "Inhibidores", "activadores" y "moduladores" de las secuencias expresadas en las células del gusto objetivos de polinucleótidos y polipéptidos se usan para referirse a moléculas activadoras, inhibidoras o moduladoras identificadas al usar análisis in vitro e in vivo de estas secuencias de polinucleótidos y polipéptidos . Los inhibidores son compuestos que, por ejemplo, se fijan, bloquean en forma total o parcial la actividad, reducen, previenen, retrasan la activación, inactivan, desensibilizan o regulan hacia abajo la actividad o expresión de estas proteínas específicas del gusto, por ejemplo, los antagonistas. Los "activadores" son compuestos que incrementan, abren, activan, facilitan, mejoran la activación, sensibilizan, agonizan o regulan hacia arriba la actividad de la proteína. Los inhibidores, activadores o moduladores también incluyen generalmente versiones modificadas de las proteínas específicas de las células del gusto objetivo, por ejemplo, versiones con actividad alterada, así como ligandos naturales y sintéticos, antagonistas, agonistas, péptidos, péptidos cíclicos, ácidos nucleicos, anticuerpos, moléculas antisentido, siAKN, ribosomas, moléculas orgánicas pequeñas y similares. Los análisis para inhibidores y activadores incluyen, por ejemplo, la expresión de la proteína específica de las células del gusto objetivo in vitro, en las células, en extractos celulares, o membranas celulares, la aplicación presuntos compuestos moduladores, y luego determinar los efectos funcionales sobre la actividad, tal como se describió con anterioridad.

Las muestras o análisis que comprenden las proteínas codificadas por los genes identificados en la presente que son tratadas con un activador, inhibidor o modulador potencial se comparan con muestras control sin el inhibidor, activador o modulador a fin de examinar el grado modulación de la activación o migración. A las muestras de control (no tratadas con inhibidores) se les asigna un valor de actividad de proteína relativo del 100%. La inhibición de un canal iónico se logra cuando el valor de actividad relativa respecto del control es de aproximadamente 80%, de preferencia 50%, con mayor preferencia 25-0%. La activación de un canal iónico se logra cuando el valor de actividad relativo respecto del control (no tratado con activadores) es del 110%, con mayor preferencia 150%, con mayor preferencia 200-500% (es decir, dos a cinco veces mayor respecto del control) , con mayor preferencia 1000-3000% o mayor. El término "compuesto de prueba" o "fármaco candidato" o "modulador" o sus equivalentes gramaticales tal como se usan en la presente describe cualquier molécula, compuesto natural o sintético, de preferencia una molécula pequeña, o una proteína, oligopéptido (por ejemplo, desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 25 aminoácidos de longitud, de preferencia desde aproximadamente 10 a 20 ó 12 a 18 aminoácidos de longitud, de preferencia 12, 15 ó 18 aminoácidos de longitud) , molécula orgánica pequeña, polisacárido, lípido, ácido graso, polinucleótido, siARN, oligonucleótido, ribozima, etc., que se analiza en su capacidad para modular la sensación de frío. El compuesto de prueba puede estar en la forma de una biblioteca de compuestos de prueba, tales como una biblioteca combinatoria o aleatoria que provee suficiente rango de diversidad. Los compuestos de prueba se ligan opcionalmente a una contrapartida de fusión, por ejemplo, compuestos objetivos, compuestos de rescate, compuestos de dimerización, compuestos estabilizantes, compuestos dirigidos y otros radicales funcionales. Convencionalmente, se generan nuevas entidades químicas con propiedades de utilidad al identificar un compuesto de prueba (denominado "compuesto guía") con alguna propiedad o actividad de interés, por ejemplo, actividad inhibitoria, la creación de variantes del compuesto guía y la evaluación de la propiedad y actividad de los compuestos variantes. A menudo se usan métodos de análisis de alto rendimiento (HTS) para los análisis . Una "molécula orgánica pequeña" se refiere a una molécula orgánica, natural o sintética, que tiene un peso molecular mayor de aproximadamente 50 Dalton y menor de aproximadamente 2500 Dalton, de preferencia menor de aproximadamente 2000 Dalton, de preferencia entre aproximadamente 100 y aproximadamente 1000 Dalton, con mayor preferencia entre aproximadamente 200 y aproximadamente 500 Dalton.

Una "muestra biológica" incluye cortes de tejido tales como muestras de biopsias y autopsias, y cortes congelados obtenidos con fines histológicos . Las muestras incluyen sangre, esputo, tejido, células cultivadas, por ejemplo, cultivos primarios, explantados y células transformadas, heces, orina, etc. Una muestra biológica generalmente se obtiene de un organismo eucarionte, con mayor preferencia un mamífero tal como un primate, por ejemplo chimpancé o humano; vaca; pero; gato; un roedor, por ejemplo, cobayo, rata, ratón; conejo o un ave; reptil o pez. Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad" en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos nucleótidos que son iguales (es decir, aproximadamente 60% de identidad, con preferencia 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad para una región específica (por ejemplo, un gen o secuencia contenida en las Tablas de la presente) , cuando se compara y alinea para un máximo de correspondencia sobre una ventana de comparación o región designada) medido por un algoritmo de comparación de secuencias BLAST o BLAST 2.0 con los parámetros predeterminados descritos más adelante, o mediante alineamiento manual e inspección visual (ver, por ejemplo, el sitio de red NCBI o similares). Luego se dice que las secuencias son "sustancialmente idénticas". Esta definición también se refiere, o se puede aplicar al complemento de una secuencia de prueba. La definición también incluye secuencias que tienen eliminaciones y/o adiciones, asi como las que tienen sustituciones. Tal como se describe más adelante, los algoritmos preferidos pueden considerar brechas y similares. De preferencia, existe identidad en una región que tiene al menos aproximadamente 25 aminoácidos o nucleotidos de longitud o con mayor preferencia sobre una región que tiene 50-100 aminoácidos o nucleotidos de longitud. Por comparación de secuencias, generalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia, a la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa in algoritmo de comparación de secuencias, se ingresan las secuencias de prueba y de referencia en una computadora, se diseñan coordenadas de subsecuencia, de ser necesario, y se diseñan parámetros del programa de algoritmo de secuencias. De preferencia, se pueden usar parámetros predeterminados del programa o se pueden diseñar parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencias luego calcula el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias de prueba respecto de la secuencia de referencia, sobre la base de los parámetros del programa. Una "ventana de comparación" , tal como se usa en la presente, incluye la referencia a un segmento de una cualquiera de la cantidad de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste de 20 a 600, usualmente desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 200, más usualmente desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 150, en donde una secuencia se puede comparar con una secuencia de referencia de la misma cantidad de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alinean óptimamente. Los métodos de alineamiento de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl . Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante la selección del método de similitudes de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci . USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o por alineamiento manual e inspección visual (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds . 1995 suplemento)). Un ejemplo preferido de algoritmo adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, los cuales se describen en Altschul et al., Nucí. Acids Res 25:3389-3402 (1977) y Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), respectivamente. BLAST y BLAST 2.0 se usan con los parámetros descritos en la presente, a fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia para los ácidos nucleicos y las proteínas de la invención. El software para realizar los análisis BLAST está disponible al público a través del Nacional Center For Biotechnology Information. Este algoritmo implica primero identificar los pares de secuencia de alta calificación (HSP) mediante la identificación de palabras de * longitud cortas W en la secuencia incógnita, los cuales coinciden o satisface cierta calificación con umbral de valor positivo T cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se refiere al umbral de calificación de la palabra vecina (Altschul et al., supra) . Estas coincidencias de la palabra inicial vecina actúan como semillas para iniciar las selecciones para hallar HSP más largas que las contienen. Las coincidencias de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia por todo lo que se puede incrementar la calificación de alineamiento acumulativo . Las calificaciones acumulativas se calculan usando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (calificación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre > 0) y N (calificación de penalidad para residuos no coincidentes; siempre < 0) . Para las secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de calificación para calcular la calificación acumulada. Las extensiones de las coincidencias de palabras en cada dirección se detienen cuando: la calificación de alineamiento acumulado excede en un valor X de su máximo valor obtenido; la calificación acumulada llega a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de calificación negativa; o se llega al final de cualquiera de las secuencias . Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como predeterminados una longitud de palabra (W) de 11 , una expectativa (E) de 10 , M = 5 , N = 4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como predeterminados una longitud de palabra de 3, y una expectativa (E) de 10 , y la matriz de calificación BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci . , USA 89 : 10915 ( 1989 ) ) con alineamientos (B) de 50 , expectativa (E) de 10 , M = 5 , N = 4 y una comparación de ambas cadenas. "Ácido nucleico" se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y sus polímeros en forma monocatenaria o bicatenaria, y sus complementos. El término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o residuos de esqueletos modificados o enlaces que son sintéticos, naturales y no naturales, que tienen propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia y que son metabolizados de manera similar a los nucleótidos de referencia. Los ejemplos . de los análogos incluyen sin limitación, fosforotioatos , fosforamidatos , metilfosfonatos, quiralmetilfosfonatos , 2-0-metilribonucleótidos , ácidos peptidonucleicos (PNA) . A menos que se indique otra cosa, una secuencia particular' de ácidos nucleicos abarca implícitamente sus variantes modificadas conservadoramente (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente se pueden lograr sustituciones de codones degenerados a través de la generación de secuencias en las cuales la tercera posición de uno o más (o todos) los codones seleccionados está sustituida por residuos de base mixta y/o desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19 : 5081 ( 1991 ) ; Ohtsuka et al., J. Biol . Chem. 260 : 2605-2608 ( 1985 ) ; Rossolini et al., Mol. Cell Probes 8 : 91-98 ( 1994 ) ) . El término ácido nucleico se usa indistintamente con gene, ADNc, ARm, oligonucleótido y polinucleótido . Una secuencia particular de ácido nucleico también abarca implícitamente las "variantes de empalme" . De modo similar, una proteína particular codificada por un ácido nucleico abarca implícitamente cualquier proteína codificada por un variante de empalme del ácido nucleico. Las "variantes de empalme", tal como su nombre sugiere, son productos del empalme alternativo de un gen. Después de la transcripción, una transcripción inicial del ácido nucleico se puede empalmar de manera tal que diferentes (productos alternativos) de empalme de ácidos nucleicos codifican diferentes polipéptidos . Los mecanismos para la producción de variantes de empalme varían, pero incluyen el empalme alternativo de exones . Los polipéptidos alternativos derivados del mismo ácido nucleico por la transcripción de lectura completa también están abarcados por la presente definición. Cualquier producto de una reacción de empalme que incluya formas recombinantes de los productos de empalme están incluidos en la presente definición. Un ejemplo de variantes de empalme de canales de potasio se analiza en Leicher, et al., J. Biol. Chem. 273 ( 52 ) : 35095-35101 ( 1998 ) . Los términos "polipéptido, péptido y proteína" se usan indistintamente en la presente en referencia a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más residuos de aminoácidos es un mimético químico artificial de un correspondiente aminoácido natural, además de los polímeros de aminoácidos naturales y los polímeros de aminoácidos no naturales . El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos naturales y sintéticos, así como análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que actúan de manera similar a los aminoácidos naturales . Los aminoácidos naturales son los codificados por el código genético, así como los aminoácidos que son modificados más tarde, por ejemplo, hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato y 0-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido natural, es decir, un carbono ligado a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metilsulfonio de metionina. Los análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o esqueletos de péptidos modificados, pero retienen la misma estructura química básica que el aminoácido natural. Los miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de manera similar a un aminoácido natural . Los aminoácidos se pueden referir en la presente mediante sus símbolos comúnmente conocidos de tres letras o mediante los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de IUPAC-IUB. De modo similar, los nucleótidos se pueden referir por sus códigos de letra única comúnmente aceptados . Las "variantes modificadas conservadoramente" se aplican a las secuencias de aminoácidos y a ácidos nucleicos. Con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes modificadas conservadoramente se refieren a los ácidos nucleicos que codifican secuencias idénticas o esencialmente idénticas de aminoácidos, o en donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos esencialmente idéntica. Debido a la degeneración del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todo el aminoácido alanina. En consecuencia, en cualquier posición en la cual alanina esté especificado por un codón, se puede alterar el codón por cualquiera de los correspondientes codones descritos sin alterar el polipéptido codificado. Las variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son una especie de las variaciones modificadas conservadoramente. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente que codifica un polipéptido también describe cualquier posible variación silenciosa del ácido nucleico . Un experto en la técnica reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que por lo general es el único codón para metionina, y TGG, que por lo general es el único codón para triptofano) se puede modificar para dar una molécula funcionalmente idéntica. En consecuencia, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita con respecto del producto de expresión, pero no con respecto a las secuencias de sonda reales . Respecto de las secuencias de aminoácidos, un experto en la técnica reconocerá que las sustituciones individuales, eliminaciones o adiciones a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína que altera o elimina un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada conservadoramenté" cuando la alteración resulta en la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservadora que proveen aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Las variantes modificadas conservadoramente se agregan y no excluyen las variantes polimórficas, los homólogos interespecies y los alelos de la invención. Los siguientes ocho grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí: 1) alanina (A), glicina (G) ; 2) ácido aspártico (D) , ácido glutámico (E) ; 3) asparagina (N) , glutamina (Q) ; 4) arginina (R) , lisina ( ) ; 5) isoleucina Q) leucina (L) , metionina (M) , valina (V); 6) fenilalanina (F) , tirosina (Y) , triptófano (W) ; 7) serina (S) , treonina (T) ; y 8) cisteína (C) , metionina (M) (ver, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984) ) . Las estructuras macromoleculares tales como las estructuras de polipéptidos se pueden describir en términos de diversos niveles de organización. Para un análisis general de esta organización, ver, por ejemplo, Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (3S ed. , 1994) y Cantor y Schimmel, Biophysical C emistry Part 1: The Conformation of Biological Macromolecules (1980) . La "estructura primaria" se refiere a la secuencia de aminoácidos de un péptido particular. La "estructura secundaria" se refiere a estructuras tridimensionales ordenadas localmente dentro de un polipéptido. Estas estructuras se denominan comúnmente dominios, por ejemplo, dominios transmembrana, dominios de poro y dominios citoplasmáticos . Los dominios son porciones de un polipéptido que forman una unidad compacta del polipéptido y generalmente tienen 15 a 350 aminoácidos de longitud. Los ejemplos de dominios incluyen dominios extracelulares, dominios transmembrana y dominios citoplasmáticos . Los dominios típicos se componen de secciones de menor organización tales como extensiones de láminas beta y hélices alfa. La "estructura terciaria" se refiere a la estructura tridimensional completa de un monómero de un polipéptido. La "estructura cuaternaria" se refiere a la estructura tridimensional formada por la asociación no covalente de unidades terciarias independientes . Los términos anisotrópicos también se denominan términos de energía. Una "marca" o "porción detectable" es una composición detectable mediante medios espectroscópicos , fotoquímicos , bioquímicos, inmunoquímicos u otros medios físicos. Por ejemplo, las marcas de utilidad incluyen P, colorantes fluorescentes, reactivos electrodensos, enzimas (por ejemplo los comúnmente usados en ELISA) , biotina, digoxigenina o haptenos y proteínas que se pueden hacer detectables, por ejemplo, al incorporar una marca radiactiva en el péptido o usarlo para detectar anticuerpos específicamente reactivos con el péptido . El término "recombinante" cuando se usa con referencia, por ejemplo, a una célula o ácido nucleico, proteína o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector ha sido modificado por la introducción de un ácido nucleico o proteína heteróloga o la alteración de un ácido nucleico o proteína nativa, o que la célula deriva de una célula así modificada. En consecuencia, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que se encuentran dentro de una forma nativa (no recombinante) de la célula o expresa genes nativos de otra manera anormalmente expresada, expresada en defecto o no expresada en absoluto . El término "heterólogo" usado con referencia a porciones de un ácido nucleico indica que el ácido nucleico comprende dos o más sub-secuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico generalmente se produce en forma recombinante con dos o más secuencias provenientes de genes no relacionados dispuestos para formar un nuevo ácido nucleico funcional, por ejemplo, un promotor de una fuente y una región codificadora de otra fuente. De modo similar, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más sub-secuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión) . La frase "condiciones de hibridación rigurosas" se refieren a condiciones en las cuales una sonda se híbrida a su sub-secuencia objetivo, generalmente una mezcla compleja de ácido nucleicos, pero no con otras secuencias. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en distintas circunstancias. Las secuencias más largas se hibridan específicamente a mayores temperaturas . Una extensa guía a la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hibridization with Nucleic Probes, "Overview of principies of hibridation and the strategy of nucleic acid assays ( 1993 ) . Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan en aproximadamente 5 -10 °C inferiores al punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica para un pH de fuerza iónica definida. La Tm es la temperatura (con fuerza iónica definida, pH y concentración nucleica) en la cual el 50% de las sondas complementarias al objetivo se hibridan con la secuencia objetivo en el equilibrio (dado que las secuencias objetivo están presentes en exceso, a Tm el 50% de las sondas están ocupadas en el equilibrio) . Las condiciones rigurosas se pueden obtener con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Para la hibridación selectiva o específica, una señal positiva es al menos dos veces el contexto, de preferencia 10 veces la hibridación del contexto. Los ejemplos de condiciones de hibridación rigurosas pueden ser como sigue 50% de formamida, 5X SSC y 1% de SDS, incubar a 42°C, o 5X SSC, l%de SDS, incubar a 65 °C, con lavado en 0.2X de SSC y 0.1% de SDS a 65 °C. Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí en condiciones rigurosas aún son sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto ocurre, por e emplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico mediante el uso del máximo de degeneración de codón permitido por el código genético. En tales casos, los ácidos nucleicos generalmente se hibridan en condiciones de hibridación moderadamente rigurosas. Los ejemplos de "condiciones de hibridación moderadamente rigurosas" incluyen una hibridación con un tampón de 40% de formamida, 1 M de NaQ, 1% de SDS a 37 °C y un lavado en IX SSC a 45 °C. Una hibridación positiva es al menos dos veces el contexto. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente que se pueden utilizar condiciones alternativas de hibridación y lavado para proveer condiciones de similar rigurosidad. Otras pautas para determinar los parámetros de hibridación se proveen en numerosas referencias, por ejemplo, y Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al. Para PCR, una temperatura de aproximadamente 36 °C es típica para la amplificación de baja rigurosidad, aunque las temperaturas de sellado pueden variar entre aproximadamente 32 y 48 °C, según la longitud del cebador. Para la amplificación por PCR de alta rigurosidad es típica una temperatura de aproximadamente 62 °C, aunque las temperaturas de sellado elevadas pueden variar desde aproximadamente 50 °C hasta aproximadamente 65 °C, según la longitud del cebador y su especificidad. Las condiciones típicas de ciclado para las amplificaciones de alta y baja rigurosidad incluyen una fase de desnaturalización de 90 °C-95 °C durante 30 s-2 min, y una fase de sellado que dura 30 s-2 min. , y una fase de extensión de aproximadamente 72 aC durante 1-2 min. Los protocolos y las pautas para las reacciones de amplificación de alta y baja rigurosidad se proveen, por ejemplo, en Innis et al. ( 1990 ) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. Y) . "Anticuerpo" se refiere a un polipéptido que comprende una región marco proveniente de un gen de inmunoglobulina o sus fragmentos que se fija específicamente y reconoce un antígeno . Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de las regiones constantes kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como una miríada de genes de región variable de la inmunoglobulina. Las cadenas livianas se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, las cuales a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Generalmente, la región fijadora de antígeno de un anticuerpo es la más crítica en especificidad y afinidad de unión. El término anticuerpo, tal como se usa en la presente también incluye fragmentos de anticuerpo producidos por la modificación de anticuerpos enteros o los sintetizados de novo mediante el uso de metodologías de ADN recombinante (por ejemplo, Fv monocatenario) , quimérico, humanizado o. los identificados mediante el uso de bibliotecas de presentación de fago (ver, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)). Para la preparación de anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos recombinantes , monoclonales o policlonales , se pueden usar muchas técnicas conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Kohler & Milstein, - ature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., lmmunology Today 4:72 (1983); Colé et al., p. 77-96 en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy. Alan R. Liss, Inc. (1985) ; Coligan, Current Protocole in lmmunology (1991) ; Harlow & Lañe, Antibodies, A Laboratory Manual (1988) y Harlow & Lañe, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1999); y Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (2a ed 1986) ) . La frase "fijarse específicamente (o selectivamente) " a un anticuerpo o es "específicamente (o selectivamente) inmunorreactivo con" en referencia a una proteína o péptido, se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína, a menudo en una heterogénea población de proteínas y otras sustancias biológicas. En consecuencia, en condiciones designadas de inmunoanálisis, los anticuerpos específicos se fijan a una proteína particular al menos dos veces el contexto y más generalmente más de 10 a 100 veces el contexto. La fijación específica a un anticuerpo en tales condiciones requiere un anticuerpo que sea seleccionado por su especificidad por una proteína particular. Por ejemplo, se pueden seleccionar los anticuerpos policlonales generados para proteínas, variantes polimórficas , alelos, ortólogos y las variantes modificadas conservadoramente o las variantes de empalme o porciones de los para obtener sólo los anticuerpos policlonales que son específicamente inmunorreactivos con los productos génicos que codifican proteínas identificadas en la presente solicitud y no con otras proteínas . Esta selección se puede lograr al sustraer los anticuerpos que forman enlaces cruzados con otras moléculas . Se puede usar una variedad de formatos de inmunoanálisis para seleccionar los anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, los inmunoanálisis de fase sólida de ELISA se usan de rutina para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína (ver, por ejemplo, Harlow & Lañe, Antibodies, A Laboratory Manual ( 1988 ) para una descripción de formatos y condiciones de inmunoanálisis que se pueden usar a fin de determinar la inmunorreacti idad específica) . Por "dosis terapéuticamente efectiva" se entiende en la presente una dosis que produce el efecto para el cual se administra. La dosis exacta dependerá del objeto del tratamiento, y puede ser determinada por un experto en la técnica mediante técnicas conocidas (ver, por ejemplo. Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vol . 1-3 , 1992 ) ; Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding ( 1999 ) ; y Pickar, Dosage Calculations ( 1999 ) ) .

Expresión Recombinante del Gen de Gusto (Salado) Identificado en la Presente Para obtener un alto nivel de expresión de un gen clonado, tal como los ADNc que codifican los genes objetivo, generalmente se subclona el gen en un vector de expresión que contiene un promotor fuerte para dirigir la transcripción, un terminador de la transcripción/traducción, y si es un ácido nucleico que codifica una proteína, un, sitio de fijación del ribosoma para iniciar la traducción. Los promotores eucariontes y procariontes adecuados son bien conocidos en la técnica y se describen por ejemplo, en Sambrook et al., y Ausubel et al. supra. Por ejemplo, los sistemas de expresión bacteriana para expresar la proteína del gusto específica están disponibles por. ejemplo, en E. coli, Bacillus sp. y Salmonella (Palva et al., Gene 22:229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302:543-545 (1983). Los kits para los sistemas de expresión están disponibles en el comercio. Los sistemas de expresión eucariontes para células de mamíferos, levaduras y células de insectos son bien conocidos en la técnica y están disponibles en el comercio. Por ejemplo, los sistemas de expresión retroviral se pueden usar en la presente invención. Tal como se describe más adelante, los genes que afectan el presunto gusto salado objeto con preferencia se expresan en células humanas tales como células HEK-293 que se usan ampliamente para análisis de alto rendimiento. La selección del promotor usado para dirigir la expresión de un ácido nucleico heterólogo depende de la aplicación particular. El promotor de preferencia se coloca aproximadamente a la misma distancia del sitio de inicio de la transcripción heteróloga que del sitio de inicio de la transcripción en su ubicación natural. Sin embargo, tal como se conoce en la técnica, cierta variación de esta distancia se puede ajustar sin pérdida de la función del promotor. Además del promotor, el vector de expresión generalmente contiene una unidad de transcripción o cásete de -expresión que contiene todos los elementos adicionales requeridos para la expresión del ácido nucleico en la célula hospedará. En consecuencia, un cásete de expresión típico contiene un promotor ligado operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica el gen identificado y las señales requeridas para la eficiente poliadenilación de la transcripción, los sitios de unión al ribosoma y la terminación de la traducción. Otros elementos del cásete pueden incluir mej oradores, y si se usa un ADN genómico como gen estructural, los intrones con los sitios funcionales de donante y aceptor de empalme. Además de la secuencia promotor, el cásete de expresión también debería contener una región de terminación de la transcripción cadena abajo respecto del gen estructural para proveer la terminación eficiente. La región de terminación se puede obtener del mismo gen que la secuencia promotor o se puede obtener de diferentes genes. El vector de expresión particular usado para transportar la información genética al interior de la célula no es particularmente crítico. Se puede usar cualquiera de los vectores convencionales usados para la expresión en células eucariontes o procariontes . Los vectores de expresión bacterianos estándar incluyen plásmidos tales como plásmidos basados en pBR322, pS F, pET23D, y sistemas de expresión de fusión tales como MBP, GST y LacZ . También se pueden agregar marcas de epitopo a las proteínas recombinantes para proveer métodos convenientes de aislamiento, por ejemplo, c-myc. Se pueden incluir marcas de secuencia en un cásete de expresión para el rescate del ácido nucleico . Se pueden incluir marcadores tales como proteínas fluorescentes, proteína fluorescente verde o roja, ß-gal, CAT y similares en los vectores como marcadores para la transduccion del vector. Los vectores de expresión que contienen elementos reguladores provenientes de virus eucariontes se usan generalmente en vectores de expresión eucariontes, por ejemplo, vectores SV40, vectores de papiloma virus, vectores retrovirales y vectores derivados de virus de Epstein-Barr . Otros ejemplos de vectores eucariontes incluyen pMSG, pAV009/A+, ????10/?+, pMAMneo-5, pDSVE de baculovirus y cualquier otro vector que permita la expresión de proteínas bajo la dirección del promotor CMV, promotor temprano SV40, promotor tardío SV40, promotor metalotioneína, promotor de virus de tumor mamario murino, promotor de virus de sarcoma de Rous, promotor poli edrina u otros promotores que demuestren ser efectivos para la expresión en células eucariontes. La expresión de proteínas a partir de vectores eucariontes también se puede regular mediante el uso de promotores inducibles. Con los promotores inducibles, los niveles de expresión están ligados a la concentración de agentes inductores tales como tetraciclina o ecdisona, mediante la incorporación de elementos de respuesta para estos agentes en el promotor. Generalmente, sólo se obtiene alto nivel de expresión de los promotores inducibles en presencia del agente inductor; los niveles de expresión basal son mínimos . Los vectores usados en la invención pueden incluir un promotor regulable, por ejemplo, sistemas tet-regulados y el sistema RU- 86 (ver, por ejemplo, Gossen & Bujard, Proc. Nat'l Acad. Sci USA 89 : 5547 ( 1992 ) ; Oligino et al., Gene Ther. 5 : 491-496 ( 1998 ) ; Wang et al., Gene Ther. 4 : 432441 ( 1997 ) ; Neering et al., Blood 88 : 1147-1155 ( 1996 ) ; y Rendahl et al., Nat. Biotechnol. 16 : 757-761 ( 1998 ) ) . Estos imparten control de moléculas pequeñas sobre la expresión de los ácidos nucleicos blanco candidatos . Esta propiedad beneficiosa puede ser usada para al determinar si un fenotipo deseado es causado por un ADNc transfectado en lugar de una mutación somática. Algunos sistemas de expresión tienen marcadores que proveen amplificación génica, tales como timidinaquinas y dihidrofolatorreductasa . Alternativamente, también son adecuados los sistemas de expresión de alto rendimiento que no incluyen amplificación génica, tales como el uso de un vector baculovirus en células de insecto, con una secuencia codificadora bajo la dirección del promotor polihedrina u otros promotores de baculovirus fuertes . Los elementos que generalmente se incluyen en los vectores de expresión también incluyen un replicón que actúa en la célula del huésped particular. En el caso de E. coli, el vector puede contener un gen que codifica la resistencia a antibióticos que permite seleccionar las bacterias que alojan plásmidos recombinantes y los sitios de restricción singulares en regiones no esenciales del plásmido para permitir la inserción de secuencias eucariontes . El gen de resistencia a antibióticos particular elegido no es esencial, cualquiera de los muchos genes de resistencia conocidos en la técnica es adecuado. Las secuencias procariontes con preferencia se eligen de manera tal que no interfieran con la replicacion del ADN en células eucariontes, de ser necesario. Se pueden usar métodos estándar de transfección para producir lineas celulares bacterianas, de mamíferos, de levaduras o de insectos que expresen grandes cantidades de la proteína específica del gusto deseada, que luego son purificadas mediante técnicas estándar (ver, por ejemplo, Colley et al., J. Biol . Chem. 264 : 17619-17622 ( 1989 ) ; Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol . 182 (Deutscher, ed. 1990 ) ) . La transformación de células eucariontes y procariontes se realiza de conformidad con técnicas estándar (ver, por ejemplo, Morrison, J. Bact. 132 : 349-351 ( 1977 ) ; Clark-Curtj ss & Curtiss, Methods in Enzymology 101 : 347-362 (Wu et al., eds, 1983 ) . Se puede usar cualquiera de los procedimientos bien conocidos para introducir secuencias de nucleótidos extrañas en las células hospedoras . Estos incluyen el uso de transfección con fosfato de calcio, polibreno, fusión de protoplasto, electroporación, biolistica, liposomas, microinyección, vectores plasmáticos, vectores virales y cualquiera de los demás métodos bien conocidos para introducir ADN genómico clonado, ADNc, ADN sintético u otro material genético extraño en una célula huésped (ver, por ejemplo, Sambrook et al., supra) . Sólo es necesario que el procedimiento de ingeniería genética particular usado sea capaz de introducir con éxito al menos un gen en la célula del huésped capaz de expresar el gen. Después de introducir el vector de expresión en las células, las células transfectadas se cultivan en condiciones que favorecen la expresión del gen. En algunos casos, los polipéptidos se pueden recuperar del cultivo mediante las técnicas estándar identificadas más adelante. Análisis para moduladores de presuntos productos génicos específicos de las células del gusto identificadas en la presente La modulación de una presunta proteína específica de las células del gusto ser puede evaluar mediante el uso de un variedad de análisis in vitro e in vivo, incluso modelos celulares tal como se describió con anterioridad. Los análisis se pueden usar para el análisis de inhibidores y activadores de la proteína o sus fragmentos, y en consecuencia, sus inhibidores y activadores. Los moduladores son potencialmente de utilidad en medicaciones o como saborizantes para modular el gusto salado u otras modalidades del gusto o del gusto en general o para el uso como potenciales terapéuticas para modular una función relacionada con las células del gusto o el fenotipo que incluye uno o varios de los genes específico de las células del gusto identificadas e informadas en la presente . Los análisis que utilizan células que expresan las proteínas específicas del gusto objetivo, sean recombinantes naturales, se pueden llevar a cabo mediante el uso de diversos análisis in vitro, in vivo o ex vivo, tal como se describe en la presente. Para identificar las moléculas capaces de modular su actividad, se realizan análisis a fin de detectar el efecto de diversos candidatos de moduladores sobre la actividad expresada de preferencia en una célula. La actividad de canal de las proteínas de canales iónicos se pueden ensayar en particular mediante el uso de un variedad de análisis, a fin de medir cambios de los flujos iónicos, que incluyen técnicas de estrechamiento de parche, la medición de corrientes de células enteras, análisis de flujo iónico con marca radiactiva o un prueba de flujo acoplado a espectroscopia de absorción atómica y análisis de fluorescencia que utilizan colorantes sensibles a voltaje o colorantes sensibles a litio o sodio (ver, por ejemplo, Vestergarrd-Sogind et al., J. Membrana Biol . 88:67-75 (1988); Daniel et al., J. Pharmacol . Meth. 25:193 (1991); Hoevinsky et al., J. Membrane Biol . 137:59-70 (1994)) . Por ejemplo, se puede inyectar un ácido nucleico que codifica una proteína de canal iónico o su homólogo en ovocitos de Xenopus o transfectarlo en células de mamíferos, de preferencia células humanas tales como HEK-293. La actividad de canal se puede evaluar entonces mediante la medición de los cambios de la polarización de membrana, es decir cambios en el potencial de membrana . Un medio preferido para obtener mediciones electrofisiológicas consiste en medir las corrientes usando la técnica de estrechamiento de parche, por ejemplo el modo "adosado a célula", el modo "de adentro hacia afuera" y el modo "de célula entera" (ver, por ejemplo, Ackerman et al., New Engl. J. Med. 336:15754595, 1997) . Las corrientes de célula entera se pueden determinar mediante el uso de metodologías estándar tales como las descritas por Hamil et al., Pflugers. Archiv. 391185 (1981) . La actividad de canal también se puede evaluar convenientemente mediante la medición de cambios de los niveles iónicos intracelulares , es decir, sodio o litio. Los métodos se ejemplifican en la presente. Por ejemplo, se puede medir el flujo de sodio mediante la evaluación de la captación del sodio con marca radiactiva o mediante el uso de colorantes fluorescentes adecuados . En un típico en prueba de microfluorimetría, se carga un colorante que sufre un cambio de fluorescencia tras la unión a un único ión de sodio en el citosol de las células que expresan el canal iónico específico de las células del gusto. Tras la exposición a un agonista, un incremento del sodio del citosol se refleja mediante un cambio de la fluorescencia que tiene lugar cuando se fija el sodio. Además de estos métodos preferidos, la actividad de los polipéptidos específicos de las células del gusto objetivo se puede evaluar mediante el uso de diversos otros análisis in vitro e in vivo para determinar los efectos funcionales, químicos y físicos, por ejemplo, al medir su fijación a las demás moléculas, incluso, péptidos, moléculas orgánicas pequeñas y lípidos; al medir los niveles de proteína y/o ARM o medir otros aspectos de los polipéptidos objetivo, por ejemplo, los niveles de transcripción o los cambios fisiológicos que afectan la actividad de las proteínas específicas de las células del gusto. Cuando se determinan las consecuencias funcionales mediante el uso de células o animales intactos, también se pueden medir diversos efectos tales como los cambios de crecimiento celular o los cambios de pH o los cambios de los segundos mensajeros intracelulares tales como IP3 , cGMP o cAMP, o los componentes o reguladores de la vía de señales de la fosfolipasa C. Los análisis se pueden usar para analizar los activadores e inhibidores de las proteínas KC B. Los moduladores así identificados son de utilidad, por ejemplo para muchas aplicaciones de diagnóstico y terapéutica. Análisis in vitro Los análisis para identificar compuestos con actividad moduladora en los genes objeto se realizan de preferencia in vitro. Los análisis de la presente de preferencia usan prote na de longitud total de conformidad con la invención o una de sus variantes . Esta proteína opcionalmente se puede fusionar a una proteína heterologa para formar una quimera. En los análisis ejemplificados en la presente, de preferencia se usan células que expresan el polipéptido de longitud total en análisis de alto rendimiento para identificar compuestos que modulan la función génica. Alternativamente, se pueden usar proteínas purificada recombinante o natural en los métodos in vitro de la invención. Además de la proteína purificada o sus fragmentos, la proteína recombinante o natural de las células del gusto pueden ser una parte de un lisado celular o una membrana celular. Tal como se describe más adelante, la prueba de fijación puede ser de estado sólido o soluble. De preferencia, la proteína, su fragmento o la membrana se fija a un soporte sólido, en forma covalente o no covalente. A menudo, los análisis in vitro de la invención son análisis de fijación de ligando o de afinidad de ligando, no competitivos o competitivos (con ligandos extracelulares conocidos tales como mentol) . Estos análisis in vitro incluyen la medición de cambios de las propiedades espectroscópicas (por ejemplo, fluorescencia, absorbancia, índice de refracción) , hidrodinámicos (por ejemplo forma) , cromatográficos o de solubilidad para la proteína. De preferencia, se realiza una prueba de fijación de alto rendimiento en el cual la proteína se pone en contacto con un potencial modulador y se incuba durante un periodo adecuado . Se puede usar una amplia variedad de moduladores, tal como se describe más adelante, incluso moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, anticuerpos y análogos de ligando. Se puede usar una amplia variedad de análisis para identificar la fijación del modulador, incluso análisis de fijación de proteína a proteína marcada, cambios de movilidad electroforática, inmunoanálisis, análisis enzimáticos tales como análisis de fosforilación y similares. En algunos casos, la fijación del candidato a modulador se determina a través del uso de análisis de fijación competitivos, en donde la interferencia con la fijación de un ligando conocido se mide en presencia de un potencial modulador. En tales análisis, el ligando " conocido se fija primero, y luego se añade el compuesto deseado, es decir, el presunto mejorador. Después de lavar la proteína particular, se determina la interferencia con la unión,, sea del potencial modulador o del ligando conocido. A menudo se rotula el potencial modulador o el ligando conocido . Además, los análisis genómicos funcionales de alto rendimiento también se pueden usar para identificar moduladores de sensación de frío para identificar compuestos que alteran las interacciones proteicas entre el polipéptido específico del gusto y otras proteínas a las cuales se fija. Los análisis, por ejemplo, pueden monitorear cambios en la expresión de marcadores de superficie celular, cambios en el calcio intracelular o cambios en las corrientes de membrana mediante el uso de líneas celulares o células primarias . Generalmente, las células se ponen en contacto con un ADNc o una biblioteca de péptidos aleatoria (codificada por ácidos nucleicos) . La biblioteca de ADNc puede comprender ADNc con sentido, antisentido, de longitud total y truncada. La biblioteca de péptidos es codificada por ácido nucleicos . El efecto de la biblioteca de ADNc o péptidos sobre el fenotipo de las células luego se monitorea mediante el uso de una prueba tal como se describió con anterioridad. El efecto del ADNc o péptido se puede convalidar y distinguir de las mutaciones somáticas por el uso, por ejemplo, de la expresión regulable del ácido nucleico tales como la expresión a partir de un promotor de tetraciclina .. Los ADNc y los ácidos nucleicos que codifican péptidos pueden ser rescatados mediante el uso de técnicas conocidas por los expertos en la técnica, por ejemplo mediante el uso de una marca de secuencia. Las proteínas que interactúan con la proteína codificada por un ADNc de conformidad con la invención se .pueden aislar usando un sistema de dos híbridos de levaduras, un sistema de dos híbridos de mamífero o análisis de presentación de fago, etc. Los objetivos así identificados también se pueden usar como cebo en estos análisis, a fin de identificar otros componentes que pueden interactuar con el canal iónico particular, el receptor o la proteína transportadora cuyos miembros también son objetivos del desarrollo de fármacos (ver, por ejemplo, Fields et al., Nature 340:245 (1989); Vasavada et al., Proc. Nat'l Acad. Sci, USA 88:10686 (1991); Fearon et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:7958 (1992); Dang et al., Mol. Cell. Biol . 11:954 (1991); Chien et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 9378 (1991); y las patente de los Estados Unidos Nos. 5,283,173, 5,667,973, 5,468,614, 5,525,490 y 5,637,463). Análisis celulares in vivo En formas de realización preferidas, las proteínas específicas de las células del gusto de tipo silvestre y mutantes se expresan en una célula, y se realizan análisis funcionales, por ejemplo, de cambios físicos y químicos o fenotípicos, para identificar moduladores que modulan la función o que restablecen la función de los genes mutantes, por ejemplo, los que tienen función reguladora de portal deteriorada. Las células que expresan proteínas también se pueden usar en análisis de fijación. Se puede medir cualquier efecto funcional adecuado, tal como se describe en la presente. Por ejemplo, los cambios de potencial de membrana, los cambios de los niveles intracelulares de litio o sodio, y la fijación de ligandos son análisis adecuados para identificar potenciales moduladores usando un sistema de base celular. Las células adecuadas para los análisis de base celular incluyen células primarias y líneas celulares recombinantes sometidas a ingeniería para expresar una proteína. Las proteínas específicas de las células del gusto objetivo en consecuencia pueden ser naturales o recombinantes. Además, tal como se describió con anterioridad, se pueden usar fragmentos de las proteínas o quimeras con actividad de canal iónico en análisis de base celular. Por ejemplo, un dominio transmembrana de un gen de canal iónico o GFCR o transportador de conformidad con la invención se puede fusionar con un dominio citoplasmático de una proteína heteróloga, de preferencia una proteína heteróloga de canal iónico . La proteína quimérica tendría actividad de canal iónico y podría usarse en análisis de base celular de la invención. En otra modalidad, se usa un dominio de la proteína específica de las células del gusto, tal como el dominio extracelular o citoplasmático, para los análisis de base celular de la invención . En otra modalidad, se pueden determinar los niveles de polipéptido celular del polipéptido del gusto objetivo particular a través de la medición del nivel de proteína o ARNm. El nivel de proteína o de proteínas relacionadas con la activación de canal iónico se mide mediante inmunoanálisis tales como técnica de inmunotransferencia ligada a enzimas, ELISA y similares con un anticuerpo que se fija selectivamente a un polipéptido o uno de sus fragmentos . Para la medición de ARNm se prefiere la amplificación, por ejemplo, mediante el uso de PCR, LCR o análisis de hibridación, por ejemplo, hibridación Northern, protección de ARNsa, transferencia de puntos. El nivel de proteína ARNm se detecta mediante el uso de agentes de detección marcados en forma directa o indirecta, por ejemplo, ácido nucleicos con marca fluorescente o marca radiactiva, anticuerpos con marca radioactiva o enzimática, y similares, tal como se describe en la presente. Alternativamente, se puede medir la expresión proteica mediante el uso de un sistema de gen informador. El sistema se puede diseñar mediante el uso de un promotor del gen blanco ligado operativamente a un gen informador tal como cloramfenicolacetiltransferasa, luciferasa de luciérnaga, luciferasa bacteriana, ß-galactosidasa y fosfatasa alcalina. Además, se puede usar la proteína de interés como informador indirecto a través de la adhesión a un segundo informador tal como proteína fluorescente roja o verde (ver, por ejemplo, Mistili & Spector, Nature Biotechnology 15 (1997) ) . La construcción informadora generalmente se transfecta en una célula. Después del tratamiento con un potencial modulador se mide la cantidad de la transcripción, traducción o actividad del gen informador de conformidad con técnicas estándar conocidas por los expertos en la técnica. En otra modalidad, se puede medir un efecto relacionado con la transducción de señales . Un canal iónico activado o inhibido o GPCR o transportador alterará potencialmente las propiedades de las enzimas objetivo, segundos mensajeros, canales y otras proteínas efectoras . Los ejemplos incluyen la activación de fosfolipasa C y otros sistemas de señales. También se pueden examinar consecuencias cadena abajo tales como la generación de diacilglicerol e IP3 por fosfolipasa C.

Los análisis para la actividad de canal incluyen células cargadas con colorantes sensibles a iones o voltaje para informar la actividad, por ejemplo, mediante la observación del influjo de sodio o la liberación intracelular de sodio. Los análisis para determinar la actividad de los receptores también pueden usar agonistas y antagonistas conocidos para estos receptores como controles negativos o positivos, a fin de evaluar la actividad de los compuestos estudiados . En análisis para la identificación de compuestos moduladores (por ejemplo, agonistas, antagonistas), se monitorean los cambios del nivel de iones en el citoplasma o el voltaje de membrana mediante el uso de un indicador sensible a iones o fluorescente de voltaje de membrana, respectivamente. Entre los indicadores sensibles a iones y las sondas de voltaje que se pueden emplear están los descritos en el Catálogo de Sondas Moleculares 1997. También se pueden usar análisis de flujo iónico con marca radiactiva o una prueba de flujo acoplado a espectroscopia de absorción atómica.

Modelos animales Los modelos animales también se pueden utilizar poteneraímente en el análisis de moduladores de la actividad génica. De modo similar, la tecnología de animales transgénicos que incluyen tecnología de siARN y de nuligénico, por ejemplo como consecuencia de la recombinación homologa con un vector dirigido a un gen adecuado o la sobreexpresion de un gen dan por resultado la ausencia o el aumento de la expresión de la proteína objetivo. La misma tecnología también se puede aplicar para obtener células nuligénicas. Cuando se desee, puede ser necesaria la expresión específica de tejido o el nuligénico objetivo. Los animales transgénicos generados por los métodos se pueden usar como modelo animal de respuesta relacionada con el gen objetivo. Por ejemplo, los animales que expresan un gen o genes de conformidad con la invención se pueden usar para derivar fenotipos de gusto superlativo por ejemplo para el uso en el análisis de toxinas químicas y biológicas, alimentos rancios/deteriorados/contaminados y bebidas, o para analizar compuestos terapéuticos que modulan la diferenciación de las células madre del gusto. Las células agónicas y los ratones transgénicos se pueden obtener por inserción de un gen marcador u otro gen heterólogo en un sitio génico endógeno en el genoma murino por recombinación homologa. Los ratones también se pueden obtener por sustitución de un gen endógeno por una versión mutada del gen objetivo, o por mutación de un gene endógeno, por ejemplo, por exposición a mutágenos conocidos . Una construcción de ADN se introduce en el núcleo de células madre embrionarias . Las células que contienen la lesión genética recién obtenida por ingeniería se inyectan en un embrión murino huésped, el cual es reimplantado en una hembra receptora. Algunos de estos embriones desarrollan ratones quiméricos que poseen células madre derivadas parcialmente de la línea celular mutante. En consecuencia, al criar los ratones quiméricos es posible obtener una nueva línea de ratones que contienen la lesión genética introducida (ver, por ejemplo, Capecchi et al., Science 244 : 1288 ( 1989 ) ) . Los ratones objetivo quiméricos se pueden derivar de conformidad con Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual ( 1988 ) y Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells : A Practical Approach (Robertson, ed. , 1987 ) . Moduladores candidatos Los compuestos estudiados como moduladores de las presuntas proteínas relacionadas con el gusto u otras funciones no relacionadas con el gusto y fenotipos que incluyen las células del gusto pueden ser cualquier molécula orgánica pequeña o una entidad biológica, tal como una proteína, por ejemplo, un anticuerpo o péptido, un azúcar, un ácido nucleico, por ejemplo un oligonucleótido antisentido o una ribosoma, o un lípido. Alternativamente, los moduladores pueden ser versiones genéticamente alteradas de una proteína. Generalmente, los compuestos de prueba son moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, lípidos y análogos de lípidos . En una modalidad, el compuesto es un análogo de mentol natural o sintético . Esencialmente, se puede usar cualquier compuesto químico como posible modulador o ligando en los análisis de la invención, aunque la mayoría de las veces los compuestos se pueden disolver y usar en soluciones acuosas u orgánicas (especialmente en base de DMSO) . Los análisis están diseñados para analizar grandes bibliotecas químicas por automatización de las etapas de prueba y proveer compuestos provenientes de cualquier fuente a los análisis, que generalmente se corren en paralelo (por ejemplo, en formatos de microtitulación en análisis robóticos) . Se apreciará que hay muchos proveedores de compuestos químicos, incluso Sigma (St. Louis, Mo.), Aldrich (St. Louis, Mo.), Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo) , Flukas Chemika-Biochemica Analitika (Buchs Suiza) , y similares . En una modalidad preferida, los métodos de análisis de alto rendimiento incluyen proporcionar una molécula orgánica pequeña combinatoria o biblioteca de péptido que contiene una gran cantidad de potenciales compuestos terapéuticos (potenciales moduladores de compuestos ligandos) . Luego se analizan las "bibliotecas químicas combinatorias" o "bibliotecas de ligandos" en uno o más análisis, tal como se describe en la presente, para identificar los miembros de la biblioteca (especies o subclases químicas particulares) que presentan una actividad característica deseada. Los compuestos así identificados pueden servir como "compuestos guía" convencionales o pueden ser usados ellos mismos como terapéuticos potenciales o reales. Una biblioteca química combinatoria es una colección de diversos compuestos químicos generados por síntesis química o por síntesis biológicas, por combinación de una cantidad de "bloques de construcción" químicos tales como los reactivos. Por ejemplo, una biblioteca química combinatoria lineal tal como una biblioteca de polipéptido se forma al combinar un conjunto de bloques de construcción químicos (aminoácidos) en todas las formas posibles para determinada longitud de compuesto (es decir, la cantidad de aminoácidos en un compuesto polipéptido) . Los millones de compuestos químicos se pueden sintetizar a través de estas ¦ mezclas combinatorias de bloques de construcción químicos . La preparación y el análisis de las bibliotecas químicas combinatorias es bien conocida por los expertos en la técnica. Las bibliotecas químicas combinatorias incluyen, sin limitaciones, bibliotecas de péptidos (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos de América No. 5,010,175, Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991) y Houghton et al, Nature 354:84-88 (1991)). También se pueden usar otros químicos para generar bibliotecas de diversidad química. Los compuestos químicos incluyen, sin limitaciones : peptoides (por ejemplo, la publicación de PCT No. WO 91/19735), péptidos codificados (por ejemplo, la publicación de PCT No. WO 93/20242) , biooligómeros aleatorios (por ejemplo, la publicación de PCT No. WO 92/00091), benzodiazepinas (por ejemplo la patente de los Estados Unidos de América No. 5,288,514), diversómeros tales como hidantoínas, benzodiazepinas y dipéptidos (Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993)), polipéptidos vinílogos (Hagihara et al., J. Amer. C em. Soc. 114:6568 (1992)), peptidomiméticos no peptídicos con armazones de glucosa (Hjrschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9213 (1992)), síntesis orgánicas de análogos de bibliotecas de compuestos pequeños (Chen et al., J. AMER. Chem. Soc. 116:2661 (1994)), oligocarbamatos (Cho et al., Science 261:1303 (1993)), y/o peptidilfosfonatos (Campbell et al., J. Org. Chem. 59; 658 (1994)), bibliotecas de ácidos nucleicos (ver Ausubel, Berger y Sambrook, todos supra) , bibliotecas de ácidos nucleicos de péptidos (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos de América No. 5.539.083), bibliotecas de anticuerpos (ver, por ejemplo, Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14(3) :309-314 (1996) y el documento PCT/US96/10287 ) , bibliotecas de hidratos de carbono (ver, por ejemplo, Liang et al., Science, 274:1520-1522(1996) y la patente de los Estados Unidos de América No. 5,593,853), bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas (ver, por ejemplo, benzodiazepinas, Baum C&EN, enero 18, página 33 (1993); isoprenoides , patente de los Estados Unidos de América No. 5,569,583; tiazolidinonas y metatiazanonas , patente de los Estados Unidos de América No. 5,549,974; pirrolidinas, patentes de los Estados Unidos Nos. 5,525,735 y 5,519,134, compuestos morfolino, patente de los Estados Unidos de América No. 5,506,337; benzodiazepinas, patente de los Estados Unidos de América No. 5,288,514, y similares) . Los dispositivos para la preparación de bibliotecas combinatorias están disponibles en el comercio (ver, por ejemplo, 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville Ky.

Symphony, Rainin, Woburn, Mass., 433A Applied Biosystems, Foster City, Calif., 9050 Plus, Millipore, Bedford, Mass.).

Además, numerosas bibliotecas combinatorias están por sí mismas disponibles en el comercio (ver, por ejemplo, ComGenex, Princeton, N.J., Saines, Moscú, Ru, Tripos, Inc., St. Louis Mo., ChemStar, Ltd Moscú, RU, 3D P armaceuticals , Exton, PA, Maxtek Biosciences, Columbia, Md. ) . Análisis de alto rendimiento solubles Además, se pueden efectuar análisis solubles mediante el uso de una proteina específica del gusto objetivo, o una célula o tejido que exprese una proteína del gusto objetivo descrita en la presente, en forma natural o recombinante . También alternativamente, se pueden efectuar análisis in vitro basados en fase sólida en un formato de alto rendimiento, en donde la proteína o su fragmento, tal como el dominio citoplasmático, se adosa al sustrato de fase sólida. Cualquiera de los análisis descritos en la presente se puede adaptar al análisis de alto rendimiento, por ejemplo, fijación de ligando, flujo de calcio, cambio de potencial de membrana, etc . En los análisis de alto rendimiento de la invención, en estado soluble o sólido, es posible analizar varios miles de diferentes moduladores o ligandos en un mismo día. Esta metodología se puede usar para analizar proteínas in vitro, o para análisis basados en células o basados en membrana que comprenden una proteína proveniente de un gen identificado en la presente aplicación. En particular, se puede usar cada cavidad de una placa de microtitulación para correr una prueba diferente contra un modulador potencial seleccionado, o si se deben observar los efectos de la concentración o el tiempo de la incubación, cada 5-10 cavidades pueden estudiar un único modulador. En consecuencia, una única placa de microtitulación estándar puede analizar aproximadamente 100 (por ejemplo, 96) moduladores. Si se usan placas de 1536 cavidades, entonces una única placa puede analizar desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 1500 compuestos diferentes. Es posible analizar muchas placas por día; se pueden realizar análisis de prueba de hasta aproximadamente 6,000, 20,000, 50,000, o más de 100,000 diferentes compuestos mediante los sistemas integrados de la invención. Para una reacción de estado sólido, la proteína de interés o uno de sus fragmentos, por ejemplo un dominio extracelular, o una célula o membrana que comprende la proteína de interés o uno de sus fragmentos como parte de una proteína de fusión se puede ligar al componente de estado sólido en forma directa o indirecta, por enlace covalente o no covalente por ejemplo, mediante una marca. La marcación puede ser cualquiera de diversos componentes. En general, una molécula que se fija a la marca (un ligador de marcación) se adosa a un soporte sólido y la molécula de interés con marca se adosa al soporte sólido por interacción entre la marca y el ligador de marcación. Se pueden usar numerosas marcas y ligadores de marcación, sobre la base de interacciones moleculares conocidas bien descritas en la bibliografía. Por ejemplo, cuando una marca tiene un ligador natural, por ejemplo, biotina, proteína A o proteína G, se puede usar en conjunción con ligadores de marcación adecuados (avidina, estreptavidina, neutravidina, la región Fe de una inmunoglobulina, etc.). Los anticuerpos para moléculas con ligadores naturales tales como biotina también están ampliamente disponibles y son ligadores de marcación adecuados; ver, catálogo SIGMA de Inmunoquímicos 1998, SIGMA, St . Louis Mo . ) . De modo similar, se puede usar cualquier compuesto hapteno o antígeno en combinación con un anticuerpo apropiado para formar un par marcador/ligador de marcación. Miles de anticuerpos específicos están disponibles en el comercio y muchos anticuerpos adicionales se describen en la bibliografía. Por ejemplo, en una configuración común, la marcación es un primer anticuerpo y el ligador de marcación es un segundo anticuerpo que reconoce el primer anticuerpo. Además de las interacciones anticuerpo-antígeno, las interacciones receptor-ligando también son apropiadas como pares de marcación y ligador de marcación. Por ejemplo, los agonistas y antagonistas de los receptores de la membrana celular (por ejemplo, las interacciones de receptor celular-ligando tales como transferrina, c-kit, ligandos de receptor vital, receptores de citoquinas, receptores de quimioquina, receptores de interleuquina, receptores de inmunoglobulina y anticuerpos, la familia de cadherina, la familia de integrinas, la familia de selectinas, y similares; ver, por ejemplo Pigott & Power, The Adhesión Molecule Facts Book I ( 1993 ) . De modo similar, las toxinas y los venenos, los epitopos vitales, hormones (por ejemplo, opioides, esteroides, etc.)/ los receptores intracelulares (por ejemplo los que median los efectos de diversos ligandos pequeños, incluso esteroides, hormona tiroidea, retinoides y vitamina D; péptidos) , fármacos, lectinas, azúcares, ácido nucleicos (tanto las b configuraciones de polímeros lineales como cíclicos), oligosacáridos, proteínas, fosfolípidos y anticuerpos pueden interactuar con diversos receptores celulares . Los polímeros sintéticos tales como poliuretanos , poliésteres, policarbonatos , poliureas, poliamidas, polietileniminas , sulfuros de poliarileno, polisiloxanos , poliimidas y poliacetatos también pueden formar una marca o ligador de marcación adecuado . Muchos otros pares de marcas/ligadores de marcación también son útiles en los sistemas de prueba descritos en la presente, tal como será aparente para los expertos al revisar la presente descripción.

Los ligadores comunes tales como péptidos, poliéteres y similares también pueden servir como marcas e incluyen secuencias de polipéptidos tales como secuencias de entre aproximadamente 5 y 200 aminoácidos. Los ligadores flexibles son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los ligadores de poli (etilenglicol) están disponibles de Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Ala. Estos ligadores opcionalmente tienen enlaces amida, enlaces sulfhidrilo o enlaces heterofuncionales . Los ligadores de marcación se fijan a sustratos sólidos ¦ que usan una variedad de métodos disponibles en la actualidad. Los sustratos sólidos generalmente se derivan o muestran funciones al exponer la totalidad o una porción del sustrato a un reactivo químico que fija un grupo químico a la superficie que reacciona con una porción del ligador de marcación. Por ejemplo, los grupos adecuados para la fijación a una porción de cadena más larga incluyen los grupos amina, idroxilo, tiol y carboxilo. Se pueden usar aminoalquilsilanos e hidroxialquilsilanos para agregar funciones a diversas superficies, tales como las superficies de vidrio. La construcción de las disposiciones de biopolímeros de fase sólida está bien descrita en la bibliografía. Ver, por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963) (describe la síntesis de fase sólida, por ejemplo de péptidos); Geysen et al., J. lmmunol . Meth. 102:259-274 (1987) (describe la síntesis de componentes de fase sólida en varillas); Frank & Doring, Tetrahedron 44:6031-6040 (1988) (describe la síntesis de diversas secuencias de péptido sobre discos de celulosa); Fodor et al. Science, 251:767-777 (1991); Sheldon et al., Clinical Chemistry 39 (4) : 718-719 (1993); y Kozal et al., Nature Medicine 2(7):753-759 (1996) (todos describen disposiciones de biopolímeros fijados a sustratos sólidos) . Los métodos no químicos para fijar ligadores de marcas a sustratos incluyen otros métodos comunes tales como calor, formación de enlaces cruzados por radiación UV y similares . Una vez descrita la invención con anterioridad, los ejemplos provistos en adelante ilustran mejor algunas formas de realización preferidas de la invención. Estos ejemplos se proveen sólo con fines ilustrativos y no se deben interpretar como limitantes de la invención objeto. Aplicaciones Prácticas de la Invención Los compuestos que modulan, de preferencia mejoran la actividad de los genes identificados en la presente en las Tablas 1-3 tienen importantes implicaciones en la modulación del sabor salado humano y poténcialmente otras modalidades del gusto o el gusto en general. Además, estos compuestos son poténcialmente útiles en aplicaciones terapéuticas que incluyen otras funciones relacionadas con las células del gusto y fenotipos tales como el ciclo de las células del gusto, enfermedades digestivas, la función digestiva, la regulación del metabolismo, la regulación de la inmunidad en la cavidad oral y/o el aparato digestivo y similares. Los compuestos que activan los canales iónicos del gusto en las papilas gustativas de la lengua se pueden usar para mejorar la sensación salada al promover el transporte de Na+ al interior de las células de la papila gustativa. Esto tiene obvias aplicaciones de consumo al mejorar el gusto y la palatabilidad de alimentos y bebidas con bajo contenido de sal . Además, los genes y productos génicos de la presente se pueden usar como marcadores para la identificación, el aislamiento o el enriquecimiento de tipos o linajes específicos de las células del gusto que incluyen el sabor dulce, amargo, sabroso, ácido, salado, graso, metálico, etc. Además, los genes y productos génicos específico de las células del gusto identificados en la presente se pueden usar para identificar compuestos que modulan la apoptosis de las células del gusto, modulan factores de transcripción que controlan la expresión del receptor del gusto, modulan la expresión del receptor del gusto amargo por ejemplo, a fin de aliviar el sabor desagradable de algunos vegetales, medicinas, café y similares; modular la modulación autocrina/paracrina del desarrollo de las células del gusto, prolongar la vida media de la papila gustativa, obtener fenotipos de animales con gusto superlativo para el uso en selecciones tales como bioterrorismo o animales de uso en el análisis de compuestos que inducen la activación y la diferenciación de células madre en las células del gusto in vivo.

Además, los genes objeto y los productos génicos y las células que los expresan se pueden usar para identificar los receptores del gusto derivados o los receptores primarios del gusto tales como las células del gusto graso o metálico. Además, los genes objeto, los productos génicos y las células que los expresan se pueden usar en el análisis para identificar compuestos que afectan la función digestiva, tales como la motilidad gástrica, la detección de alimentos, la absorción de alimentos o la producción de líquidos digestivos, péptidos, hormonas o enzimas tales como GLP-1 (péptido símil glucagón 1) , GIP (polipéptido insulinotrófico dependiente de glucosa) pepsina, secretina, amilasa, saliva, etc. Además, los genes objeto, los productos génicos y las células que los expresan se pueden usar en el análisis para identificar compuestos que afectan el tránsito de receptores del gusto desde y hacia la membrana apical/región del poro gustativo a fin de mejorar o reprimir sabores generales o específicos, regular la frecuencia de desencadenamiento del potencial de acción de las células del gusto/potencial de membrana a fin de controlar la intensidad de sabores generales o específicos, regular la liberación de neurotransmisores al nervio aferente para controlar la intensidad del sabor general o específico, y para la modulación autocrina/paracrina de la función del receptor del gusto. Además, los genes objeto, los productos génicos y las células que los expresan se pueden usar para identificar compuestos que regeneran las células del gusto tales como individuos geriátricos o pacientes con cáncer, quimioterapia, radiación, lesiones o cirugía que afecta el gusto, disgeusia inducida por fármacos, ageusia y para aliviar la pérdida de la papila gustativa. Además, los genes objeto y los productos génicos y las células que los expresan se pueden usar para analizar compuestos que afectan la higiene oral, halitosis, destoxificación de sustancias nocivas en la cavidad oral, y neutralización/eliminación de bacterias, virus y otros inmunogenos en la saliva/boca o el tracto digestivo. Además, los genes objetivo y los productos génicos y las células que los expresan se pueden usar para analizar compuestos que afectan la producción de la saliva y la composición de un tratamiento de la boca seca en condiciones tales como xerostomía (tal como por ejemplo en síndrome de Sjógren) y enfermedades gastrointestinales inmunitarios o inflamatorias tales como IBD, colitis ulcerada y diverticulitis , y cánceres que afectan la cavidad oral y el tracto digestivo. Los siguientes ejemplos fueron realizados usando los materiales y métodos descritos con anterioridad. Estos ejemplos se presentan a fin de proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y una descripción completa a sobre cómo realizar y usar la invención objeto, y no pretenden limitar el alcance de los que se considera la invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Este experimento, cuyos resultados están contenidos en la Figura 1, es un ejemplo de LCM en tejido humano del gusto. A-C: recolección de papilas gustativas en empalizada (CV) . D-E recolección de epitelio lingual. La columna de la izquierda muestra los cortes antes de LCM. La columna del medio muestra cortes después de LCM. La columna de la derecha muestra papilas gustativas CV recolectadas y aisladas (5-10 células por papila gustativa circular) y tejido epitelial lingual. Las regiones de , la papila gustativa previamente recolectadas por LCM también son visibles en D y E.

EJEMPLO 2 Este ejemplo, cuyos resultados están contenidos en la Figura 2, es un ejemplo de control de calidad de PCR de células humanas del gusto y linguales. Las células del gusto, pero no las células linguales, expresan específicamente los marcadores específicos del gusto gustducina, TRPM5 y PLCP2. En cambio, las células del gusto y linguales expresan los genes organizadores domésticos ubicuos GAPDH y ß-actina, lo cual indica que el AR de las células del gusto y linguales está intacto y es de alta calidad.

EJEMPLO 3 Este experimento, cuyos resultados están en la Figura 3, es un ejemplo de PCR de alto rendimiento para identificar canales iónicos específicos del gusto. Se muestran ocho canales iónicos diferentes. Para cada canal hay 6 carriles. Para cada canal, los dos carriles de la izquierda muestran PCR de las papilas gustativas CV humanas ( TB ) (+ indica con transcriptasa inversa y - indica un control negativo sin transcriptasa inversa) , los dos carriles centrales muestran PCR de epitelio lingual humano (LE) , y los dos carriles de la derecha muestran PCR con un control positivo (denotado colección) a fin de demostrar que los cebadores PCR generan un producto en las condiciones de ciclación de PCR. Nótese que todos los 8 canales iónicos forman un producto de PCR de tamaño apropiado en el control positivo (colección) pero sólo TRPP3 (también denominado P D2L1) genera un producto de tamaño apropiado en las papilas gustativas y no en el epitelio lingual (flecha amarilla) . En consecuencia, TRPP3 /PKD2L1 es un gen específico del gusto.

EJEMPLO 4 Este experimento, cuyos resultados están contenidos Figura 4 , es un ejemplo de hibridación in situ y métodos histológicos de inmunohistoquimica para visualizar la expresión del gen del gusto conocido gustducina en cortes de tejido del gusto murinos o humanos. Las imágenes de la izquierda muestran papilas gustativas CV murinas marcadas con el ARN antisentido murino de la proteína G específica del gusto gustducina (verde) pero no el control negativo de ARN con sentido murino. Las imágenes del centro muestran papilas gustativas CV murinas marcadas gustducina usando un anticuerpo comercial (rojo) pero no con el control negativo (anticuerpo preincubado con péptido antigénico) . Las imágenes de la derecha muestran papilas gustativas CV humanas marcadas con el ARN antisentido humano de la proteína G específica del gusto (azul oscuro) pero no el ARN con sentido humano control negativo.

EJEMPLO 5 Este experimento, cuyos resultados están contenidos en la Figura 5, es un ejemplo de hibridación in situ y métodos histológicos de inmunohistoquimica para visualizar la expresión del gen del gusto TRPM5 en cortes tisulares del gusto murinos o humanos. Las imágenes de la izquierda muestran papilas gustativas CV murinas marcadas con el ARN antisentido murino del canal iónico específico del gusto TRPM5 (verde) pero no el ARN con sentido murino de control negativo. Las imágenes del centro muestran papilas gustativas CV murinas marcadas con TRPM5 al usar un anticuerpo desarrollado por Senomyx (rojo) pero no con el anticuerpo secundario de control negativo solo. Las imágenes de la derecha muestran papilas gustativas CV humanas marcadas con TRPMS al usar un anticuerpo desarrollado por Senomyx (rojo) pero no con el anticuerpo secundario de control negativo solo.

EJEMPLO 6 Este experimento, cuyos resultados están contenidos en la Figura 6, es un ejemplo de inmunohistoguímica para visualizar la expresión del gen del gusto TRPM5 en tejido del gusto murino. La imagen muestra papilas gustativas en empalizada (CV) murinas marcadas con TRPM5 mediante un anticuerpo desarrollado por Senomyx. TRPM5 está polarizado hacia la región del poro del gusto apical orientado hacia la saliva.

EJEMPLO 7 Este experimento, cuyos resultados están contenidos en la Figura 7, es un ejemplo de métodos histológicos de inmunohistoquímica para visualizar la expresión del gen de canal de sodio SCN3A/Navl.3 en tejido del gusto murino. La imagen de la izquierda muestra papilas gustativas CV murinas marcadas con un anticuerpo comercial contra SCN3A/Navl .3 pero no con el control negativo (anticuerpo pre-incubado con péptido antigénico; imagen de la derecha; Ab + péptido) . Este resultado confirma que SCN3A/Navl .3 es un gen específico del gusto. Se identificó SCN3A/ Navl.3 como gen específico del gusto a través de métodos de chip génico y de PCR.

EJEMPLO 8 Este experimento, cuyos resultados están contenidos en la Figura 8, es un ejemplo de inmunohistoquímica de doble marcado que ilustra la co-expresión de SCN3A y TRPM5 en las mismas células del gusto. SCN3A (izquierda; verde) es detectable en células que expresan TRPM5 (centro; rojo) . La superposición de las señales de SCN3A y TRPM5 se muestra en amarillo (derecha) . Dado que TRPM5 se expresa en las células responsables del sabor dulce, amargo y sabroso, estos datos sugieren que SCN3A funciona como modulador de la función de las células de gusto dulce, amargo y/o sabroso. SCN3A se expresa en células TRPM5 responsables de las sensaciones de sabor dulce, amargo y sabroso. En consecuencia, se podrían usar los compuestos que modulan la función de SCN3A para mejorar o bloquear el sabor dulce, amargo y/o sabroso.

EJEMPLO 9 Este experimento, cuyos resultados están contenidos en la Figura 9 , es un ejemplo de inmunohistoquímica para visualizar la expresión del gen del gusto PKD2L1 en tejido del gusto murino. La imagen de la izquierda muestra papilas gustativas CV murinas marcadas con un anticuerpo comercial contra PKD2L1. La imagen central muestra falta de marcado en una sección adyacente incubada sin anticuerpo primario PKD2L1 (control negativo de anticuerpo secundario solo; 22 Ac solo) . La imagen de la derecha muestra un acercamiento de una única papila gustativa CV murina que ilustra la polarización de P D2L1 hacia la región del poro de gusto apical gusto frente a la saliva.

EJEMPLO 10 Este experimento, cuyos resultados están contenidos en la Figura 10 es un ejemplo de inmunohistoquímica de doble marcado que ilustra la expresión de PKD2L1 y TRPM5 de diferentes células del gusto. La imagen de la izquierda muestra papilas gustativas CV murinas marcadas con un anticuerpo comercial contra PKD2L1 (verde) ; la imagen central muestra el marcado con TRPM5 usando un anticuerpo desarrollado por Senomyx (rojo) ; la imagen de la derecha muestra la fusión de las marcas PKD2L1 y TRPM5. Las imágenes de la parte inferior muestran papilas gustativas individuales con gran aumento; nótese que PKD2L1 no se colocaliza con TRPM5 (las marcas se expresan en distintos tipos celulares) , lo cual indica que P D2L1 no se expresa en células del gusto dulce, amargo y/o sabroso (marcadas con TRPM5) .

Este resultado confirma que PKD2L1 es un gen específico del gusto. PKD2L1 se identificó como gen específico del gusto por métodos de chip génico y PCR. PKD2L1 no se expresa en células TRPM5 responsables de la sensación del gusto dulce, amargo y sabroso. Informes recientes indican que P D2L1/PKD1L3 funciona como receptor ácido y que PKD2L1/PKD1L3 es un marcador de células de gusto ácido (Ishimara et al PNAS 103 (33) : 12569-12574, 2006; Huang et al., Nature 434: 225-229, 2006) . En consecuencia, los compuestos que modulan la función de PKD2L1/PKD1L3 podrían usarse para mejorar o bloquear el sabor ácido.

EJEMPLO 11 Se condu eron experimentos histológicos adicionales para determinar si la hiperpolarización y en canal iónico catiónico de nucleótido cíclico HCN4, identificado como gen específico del gusto en papilla CV murina mediante análisis por PCR se co-localiza con TRPM5 (un marcador de las células del gusto dulce, amargo y sabroso), PKD2L1 (un marcador de células del gusto ácido) o un tipo celular exclusivo (una presunta célula del gusto salado) . Mediante el uso de anticuerpos específicos para HCN4, se determinó que HCN4 no se expresa en células TRPM5 (ver Figura 12) pero se expresa en células PKD2L1 (ver Figura 12) . Tal como se muestra en la Figura 11, se usó inmunoquímica de doble marcado para visualizar HCN4 y TRPM5 en distintas células CV murinas . TRPM5 (izquierda, verde) está presentes en las células que no expresan HCN4 (centro, rojo) . La fusión de las marcas TRPM5 y HCN4 se muestra a la derecha. Dado que TRPM5 se expresa en las células responsables de los sabores dulce, amargo y sabroso, los datos de esta figura indican que HCN4 no modula el sabor dulce, amargo o sabroso. La cantidad y el porcentaje de células que expresan HCN4 solo, TRFM5 solo o HCN4 y TRPM5 se muestran en la lista de la tabla de la Figura 11. La Figura 12 contiene los resultados de otro experimento de inmunoquímica de doble marcado usado para visualizar HCN4 y PKD2L1 en las mismas células CV murinas. PKD2L1 (izquierda, verde) está presente en las células que expresan HCN4 (centro, rojo) . La fusión de las marcas PKD2L1 y HCN4 se muestra a la derecha; el color amarillo indica células P D2L1 que también expresan HCN4. Dado que P D2L1 está expresado en las células responsables del sabor ácido, los datos indican que HCN4 funciona como modulador del gusto ácido y se puede usar en análisis para identificar compuestos moduladores del gusto ácido. La cantidad y el porcentaje de células que expresan HCN4 solo, PKD2L1 solo, o HCN4 y PKD2L1 se muestran en la lista de la Figure 12. Las células HCN4 (rojas) que no se co-localizan con las células PKD2L1 (verde) en la imagen fusionada representan células que se descamaron en las hendiduras CV y no son células contenidas en las papilas gustativas; en consecuencia, no se contaron estas células. Tal como se muestra mediante los resultados experimentales contenidos en la Figura 13, HCN4 no estaba presente en las microvellosidades que se proyectan hacia el interior del poro del gusto. Específicamente, el experimento de inmunoquímica de doble marcado contenido en la Figura 13 demuestra la exclusión de HCN4 del poro gustativo en células CV del gusto murino. [En esta PKD2L1 (izquierda, verde) , HCN4 (centro, rojo) , y la fusión de PKD2L1 y HCN4 (derecha, amarillo)]. La misma figura también muestra que PKD2L1 se extiende hasta las puntas de las células receptoras del PKD2L1 (imágenes superiores) , mientras que HCN4 está excluido de la región del poro gustativo. PKD2L1 y HCNA se co-localizan en el cuerpo celular, pero sólo PKD2L1 se expresa en la membrana apical. La imagen inferior muestra el acercamiento de la zona encerada en el recuadro de puntos de la imagen fusionada.

RESULTADOS Tabla 1 : Síntesis de la expresión de genes del gusto murinos por microdisposiciones Affymetrix 430 2.0/chip génicos. Se condujeron experimentos de chip génico en 5 muestras apareadas de CV del gusto y linguales murinos y se analizaron mediante software GeneSpring CX v7.3 (Agilent Technologies). Se aislaron entre 1300 y 2000 células CV del gusto y linguales por LCM y se aisló y purificó la totalidad del AR . El AR se amplificó y se híbrido a los chip génicos. Se realizaron análisis mediante dos algoritmos distintos: Affymetrix Suite 5 (MAS5) que tiene en cuenta las sondas de coincidencia perfecta y de falta de coincidencia en los c ip génicos, y el algoritmo multichip fuerte (RMA) , que sólo tiene en cuenta las sondas de coincidencia perfecta en los chip génicos . La tabla muestra una lista de genes identificados por los siguientes análisis. Primero, los genes se identificaron y clasificaron como genes específicos del gusto que cumplen los siguientes criterios: 1) anotado como codificador de proteínas transmembrana, 2) expresión mayor o igual a 1,4 veces mayor en las células del gusto, comparado con las células linguales por cualquier algoritmo, y 3) exhiben valores de expresión crudos mayores o iguales a 5. Estos criterios inclusivos, tal como se esperaba, permitieron la identificación de genes del gusto conocidos, incluso los genes para los receptores de gusto dulce, amargo, sabroso y ácido y otros genes . Se enumeran las veces de cambio (índices de expresión génica en las células del gusto comparado con células linguales) , los recuentos crudos de expresión génica en las células del gusto, y los números de acceso para los genes específicos del gusto que codifican las proteínas membrana. Segundo, se identificaron los genes como genes específicos del gusto mediante el uso de los siguientes criterios específicos de inclusión. Criterios de inclusión a) Usando datos normalizados de Affymetrix MAS5 ¦ valor medio de expresión de papila gustativa CV >50 proporción de expresión de CV versus LE > 4 veces mayor valor p de proporción de expresión de CV versus < 0.05 Se identificaron 433 genes b) Usando datos normalizados de Affymetrix GC-RMA valor medio de expresión de papila gustativa CV >50 proporción de expresión de CV versus LE = 5 veces mayor valor p de proporción de expresión de CV versus < 0.2 Se identificaron 137 genes c) MAS 419 genes identificados de ambos conjuntos de datos (MAS5 y RMA) d) Usando datos normalizados de Affymetrix MAS5 Gene Springs valor medio de expresión de papila gustativa CV > 100 proporción de expresión de CV versus LE > 2 veces mayor proporción de expresión de CV versus LE de prueba t + corrección de análisis múltiples de Benjamín-Hochberg < 0.05 Se identificaron 77 genes Cantidad TOTAL de genes específicos de papilas gustativas murinas = 1066 Los genes de este segundo análisis que codifican proteínas con múltiples dominios transmembrana con escasa o nada caracterización funcional se enumeran a continuación TABLA 1: proteínas de membranas específicas del gusto, identificadas en células en empalizada murinas Tabla 2: Síntesis de canales iónicos específicos del gusto proveniente de análisis por PCR. Se enumeran los genes que generan productos por PCR específicamente en las células del gusto humanas y/o murinas o los genes que generan productos por PCR que eran más abundantes en las células del gusto que las células linguales . La determinación de la secuencia de ADN confirmó la identidad de todos los genes específicos del gusto. Se presentan los números de acceso para los genes específicos del gusto.

? Tabla 3 : Síntesis de la colocalización de los genes específicos del gusto en células TRPM5 (dulce, amargo, sabroso) y PKD2L1/PKD1L3 (ácido) en experimentos de histología mediante hibridación in situ y/o inmunohistoquímica Tal como se mencionó con anterioridad, los genes específicos de las células del gusto identificados en la presente y los correspondientes productos génicos, y las células que los expresan, por ejemplo las células endógenas del gusto o las células quimiosensoriales y las células recombinantes que incluyen los genes específicos del gusto citados en las Tablas 1, 2 y 3 y sus ortólogos, variantes alélicas, variantes que poseen al menos 90% de identidad de secuencia con ellos y/o genes que se hibridan específicamente a ellos en condiciones de hibridación explicadas con anterioridad se pueden usar en análisis para identificar compuestos moduladores del gusto, así como en análisis de selección terapéutica. Por ejemplo, estos genes específicos del gusto, los polipéptidos y las células que los expresan se pueden usar para analizar compuestos para el tratamiento de trastornos del aparato digestivo. Estos trastornos incluyen a modo de ejemplo condiciones que afectan la digestión tales como dispepsia, enfermedades inmunitarios e inflamatorias que afectan el aparato digestivo tales como colitis ulcerada, síndrome de intestino inflamatorio, síndrome de Cro n, enfermedad celíaca y pre-cánceres y cánceres que afectan el aparato digestivo tales como cánceres que afectan las glándulas salivales, las papilas gustativas, el estómago, el páncreas, la vesícula biliar, el esófago, el ano o el colon Además, estos genes específicos del gusto se pueden usar en análisis de selección para detectar compuestos que afectan el ciclo de las células del gusto. Es sabido que las células del gusto tienen un ciclo rápido (aproximadamente cada dos semanas). Además, muchas condiciones, incluso quimioterapia y tratamiento con radiación, así como la edad avanzada, pueden afectar negativamente la capacidad de desarrollo de las células del gusto. El resultado es una sensación disminuida del gusto, el cual puede dar por resultado una disminución de la calidad de vida en pacientes con cáncer o ancianos. Esto es particularmente pronunciado en pacientes con cáncer de cabeza y cuello, y cánceres de esófago, estómago, pulmón o páncreas. Además, esto puede evolucionar junto con otra condición, caquexia o síndrome de desgaste, que se combinan para reducir el deseo de comer. La falta de nutrición adecuada es una causa seria de morbilidad y mortalidad en pacientes de cáncer. Los genes específicos del gusto objetivo contienen genes expresados en las células madre que sugieren que son marcadores de células madre precursoras, las cuales evolucionan a las células del gusto. Estos genes o las células que los expresan se pueden usar para identificar las señales que aceleran el desarrollo de" las células del gusto. Estas señales probablemente comprenden receptores símil citoquina presentes en las células del gusto que posiblemente median el desarrollo de las células del gusto y se pueden usar en selecciones para identificar compuestos que inducen la diferenciación o proliferación de las células del gusto. Los ligandos en consecuencia potencialmente se pueden aislar de la saliva y pueden ser responsables de la capacidad de la saliva para influir sobre la función del gusto. Por ejemplo, los pacientes con síndrome de Sjógren (una enfermedad autoinmunitaria que atacan las glándulas salivales) exhiben alteraciones de las funciones del gusto. Los genes objeto y el estudio de la expresión génica en las glándulas salivales mediante el uso de disposiciones génicas facilita el conocimientos de estos mecanismos de diferenciación. Los genes específicos de las células del gusto objeto y los correspondientes productos génicos y las células que expresan estos genes también se pueden usar para identificar potenciales terapéuticas para modular el sistema inmunitario de la cavidad oral. La cavidad oral está poblada de una flora normal, al igual que el tracto digestivo. Las alteraciones de la flora normal dan origen a padecimientos tales como gingivitis, alitosis, problemas gástricos y otras infecciones que pueden causar deterioro de los dientes o pérdida -dentaria. Se incluyen en los genes específicos de las células del gusto identificados en la presente una cantidad de genes del sistema inmunitario. Estos genes y los correspondientes polipéptidos o células que los expresan se pueden usar para identificar terapéuticas para mantener la homeostasis inmunitaria en la cavidad oral, prevenir el crecimiento excesivo de microbios patógenos y para la identificación de los tipos celulares en la cavidad oral que son los jugadores clave del mantenimiento, de la adecuada inmunidad de la cavidad oral . Además, los genes específicos de las células del gusto objeto y los correspondientes productos génicos o las células que los expresan con de utilidad en análisis de selección para . la identificación de compuestos para el tratamiento de diabetes, trastornos de la alimentación tales como obesidad, anorexia, bulimia y otros trastornos metabólicos. La expresión de los receptores del gusto en el aparato digestivo probablemente representa un sistema amplio que detecta alimentos y diferentes tipos en diferentes sitios durante la digestión. En consecuencia, "sentir" la presencia de alimentos o tipos específicos tales como hidratos de carbono, grasas, alimentos sabrosos, sales, deberla desencadenar diversas señales que regulan la producción de moléculas que participan en la regulación de la digestión tales como GIP (polipéptido insulinotrófico dependiente de glucosa) y GLP-1 (péptido símil glucagón 1) producidas por las células enteroendocrinas del intestino. Probablemente los receptores del gusto en estas células regule la producción de otras señales moleculares en otras células del aparato digestivo cuando se disparan. Estos fenómenos se pueden mediante la determinación de las células que expresan diferentes receptores y luego el uso de disposiciones génicas para estudiar las moléculas que estas células producen cuando se activan. Referencias Todas las referencias citadas en la presente solicitud se incorporan por referencia en su totalidad en la presente. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES
Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones. 1. Método para identificar un gen que codifica un polipéptido que interviene en la percepción del gusto salado en un mamífero, caracterizado porque comprende: (i) identificar un conjunto de genes que incluye genes que se expresan en las células del gusto pero que no se expresan en células linguales y/o genes que se expresan en las células del gusto en niveles sustancialmente mayores que en las células linguales; (ii) de los genes identificados en (i) identificar un conjunto de genes que no está expresado en las células del gusto que expresan receptores o marcadores de sabor sabroso, dulce, amargo o gusto ácido de estas células (TlR o T2R TRPM5, y PKD2L1/PKD1L3 ) ; y (iii) expresar funcionalmente uno o más genes identificados de conformidad con (ii) y determinar cuáles de los genes actúan como canal iónico que responde a sodio o receptor o transportador que responde a sodio y así identificar este gen o genes como presunto gen que modula el sabor salado . 2. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa (comprende el uso de microdisección de captura láser (LCD) para disecar y purificar tejidos del gusto respecto de los tejidos distintos de los del gusto. 3. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porgue la etapa (1) comprende amplificación de
ARN de genes provenientes de las células del gusto y células linguales y los genes amplificados se analizan respecto de un chip génico que contiene una muestra de genes específicos para el mamífero particular del cual se obtienen los tejidos del gusto y lingual.
4. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los tejidos del gusto derivan de una fuente humana o de roedores .
5. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los chip génicos incluyen un conjunto de genes de mamíferos anotados.
6. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque 1.a etapa (i) comprende PCR de alto rendimiento mediante el uso de cebadores para cada canal iónico en el genoma humano o de mamífero.
7. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque etapa (ii) se efectúa mediante hibridación in si tu usando sondas de ARN antisentido específicas para los genes identificados en la etapa (i) para determinar el nivel de expresión en las células del gusto versus las células linguales .
8. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa (ii) se efectúa mediante el uso de detección inmunoquímica usando un anticuerpo específico marcado para la proteína codificada por el gen o los genes identificados en la etapa (i) .
9. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el /los gen (es) identificados son característicos de las células que no expresan TRPM5 o PKD2L1/PKD1L3.
10. Método para seleccionar células que no expresan TRPM5 o PKD2L1/PKD1L3 , que comprende determinar si una célula expresa un gen identificado acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es menos probable que las células que expresan el gen expresen TRPM5 o PKD2L1/P D1L3.
11. Método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el gen es seleccionado de los genes contenidos en cualquiera de las tablas 1-3.
12. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los genes actúan como canales iónicos que responden al sodio, y además en donde una fracción de la población del canal está abierta y pasa sodio en reposo.
13. Método para identificar un gen que codifica un polipéptido que interviene en la percepción del gusto salado en un mamífero caracterizado porque comprende: (i) identificar un conjunto de genes que incluyen genes que se expresan en las células del gusto pero que no se expresan en las células linguales y/o genes que se expresan en las células del gusto en niveles sustancialmente más elevados que en las células linguales; (ii) de los genes identificados en (i) identificar un conjunto de genes que no se expresan en las células del gusto, las cuales expresan receptores del gusto sabroso, dulce, amargo o ácido, o marcadores de estas células (TlR o T2R o TRPM5 o PKD2L1/PKD1L3) ; y (iii) determinar en una neurona primaria que expresa uno o más genes identificados de conformidad con (II) , cuáles de los genes actúan como canal iónico que responde al sodio o receptor o transportador que responde al sodio y así identificar este gen o genes como presunto gen que modula el sabor salado .
14. Método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque los genes incluyen los citados en una de las Tablas 1, 2 ó 3, o un ortólogo o variante alélica, o una variante que codifica una proteína que es al menos 90% idéntica a la proteína codificada por el gen o su ortólogo.
15. Análisis para la identificación de un compuesto que tiene potencial aplicación in vivo para modular el gusto salado humano, caracterizado porque comprende lo siguiente: (i) poner en contacto una célula que expresa un gen que codifica un canal iónico, receptor o transportador identificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14 o un gen que codifica un polipéptido que posee al menos 90% de identidad de secuencia con el polipéptido así codificado con al menos un presunto compuesto mej orador; (ii) analizar la conductancia del sodio, la actividad de receptor o el transporte de sodio en presencia y ausencia del presunto mej orador; e (iii) identificar el compuesto como potencial mej orador del gusto salado sobre la base de si incrementa la conductancia del sodio, la actividad del receptor o el transporte de sodio.
16. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el gen codifica un canal iónico.
17. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el gen codifica un GFCR.
18. Método de conformidad con la reivindicación 16 ó 17, caracterizado porque el gen es un gen humano o de mamífero.
19. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque también incluye analizar el efecto del compuesto o su derivado en una prueba del gusto humana.
20. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el presunto gen que afecta el gusto salado se expresa en un ovocito de anfibio.
21. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el presunto gen que afecta el gusto salado se expresa en una célula de mamífero.
22. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el análisis es un análisis electrofisiológico que usa un colorante sensible a sodio.
23. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la prueba es una prueba de estrechamiento de voltaje de dos electrodos.
24. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la célula de prueba es un ovocito de Xenopus o una célula de mamífero.
25. Método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la célula de mamífero se selecciona del grupo que consiste de una célula HEK293, HEK293T, Swiss3T3, CHO, BHK, NIH3T3 y COS.
26. Método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la célula es un ovocito de Xenopus.
27. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el análisis es un análisis de estrechamiento de parche.
28. Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el colorante de potencial de membrana se selecciona del grupo que consiste de un Molecular Devices Membrana Potential it (Cat#R8034), Di-4-ANEPPS sal interna de (4- (2- ( 6- (dibutilamino) -2-naftalen-il) etenil) -1- (3-sulfopropil)hidróxido de piridinio, DÍSBACC4 (2 ) (bis- (ácido 1, 2-dibarbitúrico) -trietinoxanol) , Cc-2-DMPE (Pacific Blue sal de trietilamonio de 1 , 2-dietradecanoíl-sn-glicerol-3-fosfoetanolamina) y SBFI-AM (ácido 1 , 3-bencenodicarboxílico, bis-tetrakis ( (acetiloxi)metil}éster de 4 , 4- [1 , 4 , 10-trioxa-7 , 13-diazacilopentadecan-7 , 13-diil-bis (5-metoxi-6 ,1,2-benzofurandiilo) } (Molecular Probes) .
29. Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el colorante sensible a sodio es tetraacetato de sodio verde (Molecular Probes) o Kit colorante sensible a Na (Molecular Devices) .
30. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la prueba mide la actividad mediante un análisis de flujo iónico.
31. Método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque utiliza espectroscopia de absorción atómica para detectar el flujo iónico.
32. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el" presunto gen que afecta el gusto salado se expresa bajo el control de un promotor regulable.
33. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque utiliza un lector de fluorescencia de placa (FLIPR) .
34. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque utiliza un lector de placa de imagen por voltaje (VIPR) que se usa para incrementar la absorción de sodio o fluido.
35. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el compuesto seleccionado promueve el transporte de ión sodio al interior de las células de la papila gustativa.
36. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque utiliza un colorante de potencial de membrana seleccionado del grupo que consiste de Molecular Devices Membrane Potential Kit (cat#8034) , Di-4-ANEPPS sal interna de (4- ( 2- (6- (dibutilamino) -2-naftalen-il) etenil) -1- (3-sulfopropil) hidróxido de piridinio) ; DÍSBACC4 ( 2 ) (bis- (ácido 1 , 2-dibarbitúrico) -trietinoxanol) , Cc-2-DMPE (Pacific Blue sal de trietilamonio de 1 , 2-dietradecanoíl-sn-glicerol-3-fosfoetanolamina) y SBFI-AM (ácido 1,3-bencenodicarboxílico, bis-tetrakis ( (acetiloxi)metil}éster de 4, 4- [1, 4, 10-trioxa-7 , 13-diazacilopentadecan-7 , 13-diil-bis (5-metoxi-6 , 1 , 2-benzofurandiilo) } (Molecular Probes) .
37. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la célula expresa en forma estable el presunto gen que afecta el gusto salado.
38. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la célula expresa transitoriamente el presunto gen' que afecta el gusto salado.
39. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la actividad es monitoreada mediante el uso de un colorante sensible a sodio. ! 5
40. Método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el colorante es tetraacetato verde de sodio (Molecular Probes) o Kit de colorante sensible a Na (Molecular Devices) .
41. Método de conformidad con la reivindicación 15, 10 caracterizado porque la actividad se analiza en un ovocito de rana electrofisiológicamente mediante estrechamiento de parche o estrechamiento de voltaje de dos electrodos.
42. Método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque utiliza un instrumento automático para 15 la obtención de imágenes.
43. Método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el instrumento es un lector de placa fluorescente (FLIPR) .
44. Método de conformidad con la reivindicación 42, 20 caracterizado porque el instrumento es un lector de placa de imagen por voltaje (VIPR) .
45. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la célula que expresa la secuencia génica es seleccionada del grupo que consiste de HEK-293, 25 BHK, CHO, COS, célula L de mono, célula de riñon de mono verde africano, célula Ltk y un ovocito.
46. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-45, caracterizado porque los genes analizados incluyen los contenidos en cualquiera de las Tablas 1-3.
47. Método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la célula es una célula HEK-293.
48. Análisis para identificar un compuesto con potencial aplicación in vivo para modular el gusto dulce, amargo o sabroso humano, caracterizado porque comprende lo siguiente: (i) poner en contacto una célula que expresa un gen incluido en las Tablas 1-3 presente en las células del gusto TRPM5 con al menos un presunto compuesto mej orador; (ii) analizar la conductancia de sodio, la actividad de receptor o de transporte de sodio en presencia y ausencia del presunto mej orador; e (iii) identificar el compuesto como potencial mej orador de gusto dulce, amargo o sabroso basado en si aumenta la conductancia de sodio, la actividad del receptor o el transporte de sodio
49. Análisis de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la célula es una célula de mamífero o un ovocito de rana.
50. Análisis de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la célula de mamífero es una célula CHO, Cos, BHK o HEK- 293.
51. Análisis de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la célula es una célula HEK-293.
52. Análisis de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el efecto del compuesto sobre el gusto dulce se confirma en las pruebas del gusto.
53. Análisis de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el efecto del compuesto sobre el gusto sabroso se confirma en las pruebas del gusto.
54. Análisis de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el efecto del compuesto sobre el gusto amargo se confirma en las pruebas del gusto.
55. Análisis de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52-54, caracterizado porque las pruebas del gusto se efectúan con voluntarios humanos.
56. Análisis para la identificación de un presunto modulador del gusto ácido, caracterizado porque comprende: (i) poner en contacto una célula que expresa un gen incluido en las Tablas 1-3 presente en las células del gusto PKD2L1/PKD1L3 y opcionalmente otro gen que interviene en la percepción de gusto ácido con un compuesto; (ii) analizar el efecto del compuesto sobre el transporte iónico, la conductancia iónica o una actividad desencadenada por el canal iónico; e (iii) identificar el compuesto como modulador de gusto ácido si tiene efecto sobre el transporte iónico, la conductancia iónica o una actividad desencadenada por el canal iónico.
57. Análisis de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porgue el ión es sodio.
58. Análisis de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque el efecto del compuesto sobre el gusto ácido se confirma mediante la pruebas del gusto.
59. Análisis de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque las pruebas del gusto se efectúan en voluntarios humanos .
60. Análisis de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque incluye la adición de un compuesto conocido por desencadenar un gusto ácido y el análisis analiza el efecto del compuesto sobre el transporte iónico, la conductancia iónica o una actividad desencadenada por el canal iónico.
61. Análisis de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque la célula también expresa PKD2L1/P D1L3.
62. Método para usar un polipéptido del gusto específico codificado por un gen seleccionado de los genes incluidos en la Tabla 1 o la Tabla 2 o la Tabla 3 o uno de sus ortólogos o variantes, caracterizado porque poseen al menos 90% de identidad de secuencia con el mismo, en un método de análisis de fijación o funcional que selecciona compuestos que se fijan y/o modulan específicamente la actividad del polipéptido del gusto específico, y se basa en análisis de selección para identificar compuestos que presuntamente modulan al menos uno del desarrollo, la senescencia, la apoptosis de las células del gusto, o la regeneración de la papilas gustativas.
63 . Método de conformidad con la reivindicación 62 , caracterizado porque el análisis de selección se efectúa en un animal transgénico que expresa el gen o en un animal genéticamente modificado que exhibe expresión reducida o eliminada del gen mediante métodos de siARN o agénico.
64 . Método para usar un polipéptido específico del gusto codificado por un gen seleccionado de los genes citados en la Tabla 1 o la Tabla 2 o la Tabla 3 o uno de sus ortólogos o variantes, caracterizado porque posee al menos 90% de identidad de secuencia con él o un método de prueba de fijación o funcional que busca compuestos que se fijan específicamente y/o modulan la actividad del polipéptido específico de gusto y sobre la base del prueba de selección identificar compuestos que presuntamente modulan la función gastrointestinal .
65 . Método de conformidad con la reivindicación 64 , caracterizado porque las células son células del gusto o gastrointestinales y el análisis analiza compuestos que afectan la motilidad gástrica, la sensibilidad a los alimentos, la absorción de alimentos o la secreción del péptido .
66 . Método de conformidad con la reivindicación 65 , caracterizado porgue los compuestos analizados afectan la secreción al menos de uno de amilasa, GLP-1 (péptido símil glucagón 1) , secretina, pepsina y GIP (polipéptido insulinotrofico dependiente de glucosa) .
67 . Método de conformidad con la reivindicación 64 , caracterizado porque los compuestos identificados se evalúan in vivo respecto de su efecto sobre el gusto o la función gastrointestinal .
68 . Método de conformidad con la reivindicación 64 , caracterizado porque la función gastrointestinal incluye la absorción de nutrientes, la sensibilidad por nutrientes, el transporte iónico, la secreción de péptidos u hormonas o enzimas, y/o el apetito.
69 . Método para usar un polipéptido específico del gusto codificado por un gen seleccionado de los genes citados en la Tabla 1 o la Tabla 2 o la Tabla 3 o uno de sus ortólogos o variantes que poseen al menos 90% de identidad de secuencia con el mismo en un método de análisis de fijación o funcional, caracterizado porque que analiza compuestos que se fijan específicamente y/o modulan la actividad del polipéptido específico del gusto y sobre la base del análisis de selección identifica compuestos que tienen potencial eficacia terapéutica en el tratamiento o la prevención de una condición patológica que afecta el aparato digestivo o un órgano digestivo.
70. Método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque la condición es dispepsia funcional y otra dispepsia que está o no relacionada con úlcera.
71. Método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el compuesto terapéutico incluye sobre una hormona que interviene en el hambre o la digestión.
72. Método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque la proteína se selecciona de gastrina, secretina, amilasa, colecistoquinina, polipéptido insulinotrófico dependiente de glucosa, glucagón símil péptido 1 grelina, o leptina.
73. Método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el compuesto terapéutico es de utilidad para tratar una enfermedad gastrointestinal inflamatoria o autoinmunitaria .
74. Método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque la enfermedad es seleccionada de enfermedad celíaca, síndrome inflamatorio intestinal, enfermedad de Crohn, síndrome de Sjógren, gastritis, diverticulitis o colitis ulcerada.
75. Método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el compuesto terapéutico se usa para tratar o prevenir el cáncer asociado con el aparato digestivo o de un órgano digestivo.
76 . Método de conformidad con la reivindicación 75 , caracterizado porque el cáncer afecta un órgano seleccionado de colon, intestino delgado o grueso, ano, hígado, páncreas, vesícula biliar, esófago, lengua, glándulas salivales, papila gustativa, o cáncer de estómago o una caquexia asociada con cáncer.
77 . Método de conformidad con la reivindicación 69 , caracterizado, porque el compuesto terapéutico se usa para tratar o prevenir una enfermedad o disfunción relacionada con el apetito.
78 . Método de conformidad con la reivindicación 77 , caracterizado porque la enfermedad o condición relacionada con el apetito es bulimia o anorexia, o una caquexia asociada con las mismas .
79 . Método de conformidad con la reivindicación 69 , caracterizado porque el compuesto terapéutico se usa para tratar o prevenir un trastorno o enfermedad asociados con reflujo gástrico.
80 . Método de conformidad con la reivindicación 79 , -caracterizado porque el trastorno o enfermedad se selecciona de enfermedad por reflujo gastroesofágico, esófago de Barrett o cardialgía.
81 . Método para usar un polipéptido específico del gusto codificado por un gen seleccionado de los genes citados en la Tabla 1 o la Tabla 2 o la Tabla 3 o uno de sus ortólogos o variantes que poseen al menos 90% de identidad de secuencia con el mismo en un método de prueba de fijación o funcional, caracterizado porque que analiza compuestos que fijan específicamente y/o modulan la actividad del polipéptido específico del gusto y sobre la base del prueba de selección identificar compuestos de utilidad para modular el sistema inmunitario en la cavidad oral o el tracto gastrointestinal.
82. Método de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque se usa para buscar compuestos de utilidad para tratar gingivitis, halitosis o neutralizar o inhibir una sustancia nociva o los microbios que contiene.
83. Método para usar un polipéptido específico del gusto codificado por un gen seleccionado de los genes citados en la Tabla 1 o la Tabla 2 o la Tabla 3 o uno de sus ortólogos o variantes que poseen al menos 90% de identidad de secuencia con el mismo en un método de prueba de fijación o funcional, caracterizado porque analiza compuestos que fijan específicamente y/o modulan la. actividad del polipéptido específico del gusto y sobre la base del prueba de selección identificar un compuesto de utilidad para tratar uno de xerostomía (por ejemplo como en síndrome de Sjógren) , disgeusia o ageusia.
84 . Método para usar un polipéptido específico del gusto codificado por un gen seleccionado de los genes citados en la Tabla 1 o la Tabla 2 o la Tabla 3 o uno de sus ortólogos o variantes que poseen al menos 90% de identidad de secuencia con el mismo en un método de prueba de fijación o funcional, caracterizado porque analiza compuestos que fijan específicamente y/o modulan la actividad del polipéptido específico del gusto y sobre la base del prueba de selección identificar un compuesto de utilidad para tratar un trastorno metabólico que incluye la función de las células del gusto o digestivas.
85 . Método de conformidad con la reivindicación 84 , caracterizado porque el trastorno metabólico es diabetes u obesidad.
86 . Método para usar un polipéptido específico del gusto codificado por un gen seleccionado de los genes citados en la Tabla 1 o la Tabla 2 o la Tabla 3 o uno de sus ortólogos o variantes que poseen al menos 90% de identidad de secuencia con el mismo en un método de análisis de fijación o funcional, caracterizado porque analiza compuestos que fijan específicamente y/o modulan la actividad del polipéptido específico del gusto y sobre la base del análisis de selección identifican compuestos que afectan al menos uno del tránsito de receptores de las células del gusto, liberación de neurotransmisores de. las células del gusto, modulación autocrina/paracrina de la función del receptor del gusto y la frecuencia de desencadenamiento del potencial de acción de las células del gusto/potencial de membrana .
87. Método para usar un polipéptido específico del gusto codificado por un gen seleccionado de los genes citados en la Tabla 1 o la Tabla 2 o la Tabla 3 o uno de sus ortólogos o variantes que poseen al menos 90% de identidad de secuencia con el mismo en un método de prueba de fijación o funcional, caracterizado porque analiza compuestos que fijan específicamente y/o modulan la actividad del polipéptido específico del gusto y sobre la base del análisis de selección identificar compuestos potencialmente de utilidad para tratar la pérdida de las células del gusto después de lesión, cáncer, quimioterapia, radiación, daño o cirugía, o el resultado de la pérdida de las papilas gustativas relacionada con la edad.
88. Célula del gusto o gastrointestinal aislada o purificada, caracterizada porque expresa al menos el gen citado en la Tabla 1, 2 ó 3.
89. Célula del gusto aislada de conformidad con la reivindicación 88, caracterizada porque también expresa alfa ENaC, citoqueratina 19 y/o C6orf15.
90. Célula del gusto aislada de conformidad con la reivindicación 88, caracterizada porque no expresa TlR.
91. Célula del gusto aislada de conformidad con la reivindicación 88, caracterizada porque no expresa T2R.
92. Célula del gusto aislada de conformidad con la reivindicación 88, caracterizada porque no expresa PKD2L1 / PKD1L3 y/o TRPM5.
93. Célula del gusto aislada de conformidad con la reivindicación 88, caracterizada porque es humana.
94. Célula del gusto aislada de conformidad con la reivindicación 88, caracterizada porque no expresa TlR, T2R o PKD2L1/PKD1L3.
95. Célula del gusto aislada de conformidad con la reivindicación 88, caracterizada porque expresa un gen relacionado con células madre.
96. Célula del gusto aislada de conformidad con la reivindicación 88, caracterizada porque expresa un gen de citoquina seleccionado de TNF, MIF, interferón y una interleucina .
97. Célula del gusto aislada de conformidad con la reivindicación 88, caracterizada porque expresa un factor de crecimiento.
98. Célula del gusto aislada de conformidad con la reivindicación 88, caracterizada porque expresa gustducina o transducina .
99. Célula del gusto aislada de conformidad con la reivindicación 88, caracterizada porque no expresa gustducina o transducina.
100. Método para usar al menos un gen contenido en la Tabla 1 , 2 ó 3 o uno de sus ortólogos o variantes que codifica una proteína con al menos 90% de identidad con el mismo en una técnica de aislamiento, purificación, enriquecimiento, o marcación de células que aisla, purifica, enriquece y/o marca al menos un subtipo o linaje deseado de las células del gusto contenido en una población mixta de células o una suspensión celular, caracterizado porque comprende un subtipo o linaje deseado de las células del gusto sobre la base de la expresión o ausencia de expresión de al menos un gen contenido en la Tabla 1 , 2 ó 3 , uno de sus ortólogos, o un gen que codifica una proteína que tiene al menos 90% de identidad con el gen o uno de sus ortólogos.
101. Método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque el subtipo o linaje deseado de las células del gusto se aisla, purifica, enriquece o marca mediante un método que incluye el uso de un clasificador celular activado por fluorescencia (FACS) .
102. Método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque el subtipo o linaje deseado de las células del gusto se aisla, purifica, enriquece o marca mediante un método que incluye el uso de perlas magnéticas marcadas ,
103. Método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque la población celular mixta o suspensión celular se obtiene por digestión enzimática y/o desagregación tisular de los tejidos que contienen las células del gusto.
104. Método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque las células se derivan de al menos uno de la lengua, la cavidad oral, el tracto gastrointestinal o los órganos asociados, o el tracto urinario.
105. Método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque el subtipo o linaje deseado de las células del gusto se aisla, purifica, enriquece o marca mediante un método que incluye una técnica de selección celular negativa que elimina al menos un subtipo o linaje no deseado de las células del gusto sobre la base de la expresión o ausencia de expresión de al menos un gen contenido en la Tabla 1, 2 ó 3.
106. Método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque utiliza anticuerpos citotóxicos para matar específicamente al menos un tipo o linaje de células no deseadas .
107. Método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque el subtipo o linaje de las células del gusto enriquecidas, aisladas, purificadas o marcadas comprende células del gusto dulce.
108. Método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque el subtipo o linaje de las células del gusto enriquecidas, aisladas, purificadas o marcadas comprende células de gusto sabroso.
109. Método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque el subtipo o linaje de las células del gusto enriquecidas, aisladas, purificadas o marcadas comprende células de gusto amargo.
110. Método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque el subtipo o linaje de las células del gusto enriquecidas, aisladas, purificadas o marcadas comprende células de gusto ácido.
111. Método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque el subtipo o linaje de las células del gusto enriquecidas, aisladas, purificadas o marcadas comprende células de gusto salado.
112. Método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque el subtipo o linaje de las células del gusto enriquecidas, aisladas, purificadas o marcadas comprende células del gusto graso.
113. Método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque el subtipo o linaje de las células del gusto enriquecidas, aisladas, purificadas o marcadas comprende células madre de gusto.
114. Método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque el subtipo o linaje de las células del gusto enriquecidas, aisladas, purificadas o marcadas comprende células de neuronas del gusto.
115. Método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque el subtipo o linaje de las células del gusto enriquecidas, aisladas, purificadas o marcadas comprende células inmunitarias de gusto.
116. Método para usar una célula aislada, purificada, enriquecida o marcada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 100-112, caracterizado porque analiza compuestos moduladores del gusto.
117. Método para usar una célula madre del gusto aislada, purificada, enriquecida o marcada de conformidad con la reivindicación 113, caracterizado porque analiza compuestos para inducir la diferenciación de las células madres del gusto aisladas, purificadas, enriquecidas o marcadas en uno o más linajes o subtipos de las células del gusto o de la papilas gustativas.
118. Método de conformidad con la reivindicación 117, caracterizado porque los linajes o subtipos de las células del gusto se identifican sobre la base de la expresión o ausencia de expresión de al menos un gen específico del gusto contenido en la Tabla 1, 2 ó 3.
119. Linaje o subtipo de las células del gusto aisladas, purificadas, enriquecidas o marcadas, caracterizado porque se obtiene de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 100-118.
120. Linaje o subtipo de las células del gusto aisladas, purificadas, enriquecidas o marcadas de conformidad con la reivindicación 119, caracterizado porque comprende las células del gusto dulce, sabroso, amargo, ácido, salado, graso o metálico o neuronas de las células del gusto, células inmunitarias o células madre.
121. Linaje o subtipo de las células del gusto aisladas, purificadas, enriquecidas o marcadas de conformidad con la reivindicación 119, caracterizado porque que es humano.
122. Linaje o subtipo de las células del gusto aisladas, purificadas, enriquecidas o marcadas de conformidad con la reivindicación 119, caracterizado porque se deriva de la lengua humana, la cavidad oral, el tracto gastrointestinal o los órganos asociados, o el tracto urinario o los órganos urinarios .
123. Uso de células específicas del gusto células de conformidad con la reivindicación 119 en un prueba que analiza los compuestos que modulan al menos uno los sabores dulce, sabroso, amargo, ácido, graso, salado o metálico.
124. Uso de células de conformidad con la reivindicación 119 en un método que analiza los compuestos que modulan la diferenciación o el ciclo de las células del gusto.
125. Uso de las células del gusto de conformidad con la reivindicación 119 en un análisis que analiza compuestos que modulan o tratan al menos uno de una función digestiva, ciclo de las células del gusto, sensibilidad a los alimentos, inmunidad oral, apetito, un trastorno metabólico gastrointestinal, absorción de nutrientes, excreción de nutrientes, fluido digestivo, secreción de péptidos, enzimas u hormonas, tránsito de receptor del gusto, o una enfermedad o trastorno gastrointestinal autoinmunitario, neoplásico o inflamatorio . RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a nuevos fundamentos y métodos para identificar genes específicos del gusto, incluso de genes que intervienen en la percepción del sabor salado, especialmente en la percepción humana del sabor salado, pero también de genes que intervienen en la percepción de sabor dulce, amargo, sabroso y ácido, y de genes que intervienen en otras actividades de las células del gusto o de receptores de sabores, tales como la función digestiva y enfermedades relacionadas con la digestión, el ciclo de las células del gusto, la inmunorregulacion del tracto oral y digestivo y la regulación metabólica, por ejemplo en la diabetes y la obesidad, los genes detectados mediante el uso de estos métodos, y análisis para identificar moduladores del gusto (me oradores o blogueadoras) y posibles agentes terapéuticos que utilizan estos genes. Estos compuestos tienen potencial aplicación en la modulación (mejoramiento o bloqueo) de la percepción del gusto, especialmente la percepción del sabor salado y como posibles agentes terapéuticos. Además, la presente invención se refiere a nuevos métodos para identificar genes específicos del gusto que se pueden usar como marcadores pará diferentes tipos de células del gusto, incluso las células del gusto dulce, amargo, sabroso, ácido, salados y de otro tipo en mamíferos, así como análisis para medir la actividad de los receptores de sabor dulce, amargo, sabroso o ácido en presencia de estos genes, a fin de identificar moduladores de sabor dulce, amargo, sabroso y ácido, e identificar agentes terapéuticos especialmente para el tratamiento de trastornos digestivos o metabolicos, pérdida del gusto e infecciones orales. Además, la invención provee métodos específicos para purificar, enriquecer, aislar o marcar subtipos o linajes deseados de las células del gusto, por ejemplo células para el sabor dulce, sabroso, amargo, salado, ácido, graso, o células madre, por ejemplo mediante el uso de FACS, perlas magnéticas u otros métodos de selección que las purifiquen, enriquezcan, marquen o eliminen, por ejemplo mediante el uso de citotoxinas marcadas, o células que expresen o no expresen uno o más genes específicos para el gusto .