MX2008014910A - Anticuerpos bloqueantes de la funcion de la integrina ?5?1 humanos y humanizados de gran afinidad con inmunogenicidad reducida. - Google Patents

Abstract

Polipéptidos recombinantes humanos o humanizados que se unen a la integrina a5ß1 con gran afinidad y bloquean su función. Además, se describen aplicaciones de diagnóstico y farmacéutico de los polipéptidos.

Description

ANTICUERPOS BLOQUEANTES DE LA FUNCIÓN DE LA INTEGRINA a5B1 HUMANOS Y HUMANIZADOS DE GRAN AFINIDAD CON INMUNOGENICIDAD REDUCIDA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con polipéptidos recombinantes humanos o humanizados que se unen a la integrina a5ß1 con gran afinidad y bloquean su función. Además, se describen aplicaciones de diagnóstico y farmacéuticas de los polipéptidos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La angiogénesis es el proceso por el cual se desarrollan nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes. El crecimiento de nuevos vasos sanguíneos promueve el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas y el ciclo reproductor femenino. También cumple una función importante en el desarrollo patológico de distintos tipos de cáncer sólido y otras enfermedades por ejemplo hemangiomas, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad, psoriasis, artritis reumatoide y posiblemente osteoartritis y enfermedad de intestino inflamatorio (1 ).

Los factores de crecimiento liberados por los tejidos tumorales hipóxicos estimulan el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Aunque los factores de crecimiento y sus receptores cumplen funciones clave en la gemación angiogénica, la adhesión a la matriz extracelular (ECM) también es un regulador primario de la angiogénesis. La adhesión promueve la sobrevida de células endoteliales, así como la proliferación y migración endotelial (2-5). Una proteína ECM particular, la fibronectina, se expresa en matrices provisionales (tumores) y provee señales proliferativas a las células vasculares (2,3). Notablemente, los ratones nulos para fibronectina mueren en una etapa temprana del desarrollo debido a un conjunto de defectos, que incluyen una vasculatura formada inapropiadamente (6,7).

Estudios en modelos de animales experimentales y en ratones mutantes indican que la integrina a5ß1 , que es el receptor más importante para fibronectina, cumple una función clave en la regulación de la angiogénesis. La supresión embrionaria de esta integrina induce anomalías mesenquimáticas tempranas y letales, que incluyen defectos en la organización de la vasculatura emergente (8,9) y defectos en la capacidad de las células endoteliales para formar estructuras tipo vasos in vitro (10,1 1 ).

La expresión de la integrina a5ß1 esta asociada específicamente con la angiogénesis: no es detectable en el endotelio quiescente pero se expresa como respuesta a los factores de crecimiento angiogénicos (3,4) in vitro o dentro de la vasculatura angiogénica de un tumor en crecimiento in vivo (12, 20, 21 ).

Kim et al. (3) pudieron demostrar que el anticuerpo bloqueante de la función de la integrina a5ß1 de ratón, IIA1 , inhibe la angiogénesis inducida por factores de crecimiento y en tumores in vivo. Estudios de las señales transducidas cuando se antagoniza esta integrina indican que el receptor no ligado activa la PKA, que luego activa las caspasas 3 y 8 e induce apoptósis (2,13).

Se ha intentado preparar derivados humanizados del anticuerpo IIA1 de ratón (BD Pharmingen, N° Cat. 555614). Como resultado de ello, se generó un anticuerpo monoclonal lgG4 quimérico 82% humano/18% de ratón denominado M200. Además, se ha generado un fragmento Fab monovalente de M200, denominado F200, y se ha evaluado con éxito en un modelo en macacos de degeneración macular. Además se ha intentado preparar derivados de anticuerpos completamente humanizados de M200 que, no obstante, dieron como resultado una pérdida dramática de la bioactividad (14).

Cualquier aplicación de los anticuerpos conocidos actualmente contra la integrina a5ß1 , tal como M200 o F200, en medicina humana tiene el riesgo de inducir una respuesta inmunogénica de anticuerpos humanos antiquiméricos (HACA) en pacientes humanos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Por consiguiente, un objeto de la presente invención es proveer anticuerpos anti-integrina a5ß1 humanos que tienen una inmunogenicidad reducida en comparación con los anticuerpos quiméricos existentes, en tanto retiene la especificidad del blanco y una gran bioactividad y afinidad. Además, se describen aplicaciones de diagnóstico y farmacéutico de los polipéptidos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La presente invención se explicará con mayor detalle en las siguientes figuras y los ejemplos subsecuentes: Figura 1A: Análisis FACS de células K562 para la expresión de a5: La expresión de la integrina a5ß1 humana sobre la superficie celular de células K562 vivas se demostró con el anticuerpo monoclonal IIA1 bloqueante de la función de la integrina a5ß1 de ratón (14). Para tal fin, se usaron procedimientos FACS estándar según se describe en el Manual de HuCAL® GOLD provisto por MorphoSys.

Figura 1 B: La línea celular de carcinoma de colon humana HT29 no expresa la cadena de integrina a5. El análisis FACS demostró que las células HT29 no expresan la cadena de integrina a5, en tanto la cadena ß1 está presente sobre la superficie celular a una gran densidad. Por este motivo, las células HT29 son sumamente adecuadas para una transfección con la cadena de integrina a5.

Figura 1C: La línea celular de carcinoma de colon humana HT29 expresa la integrina a5ß1 después de una transfección con el ADNc de la integrina a5. Después de una transfección con la cadena de integrina a5, se demostró una expresión homogénea de la integrina a5ß1 sobre la superficie de las células HT29a5 mediante análisis FACS usando el anticuerpo monoclonal IIA1 bloqueante de la función de la integrina a5ß1 humana de ratón como referencia.

Figura 2: Inhibición de la adhesión de células K562 a placas de cultivo recubiertas con fibronectina Se incubaron células K562 precargadas con calceína en presencia de anticuerpos monoclonales bloqueantes (IIA1 ) o no bloqueantes (VC5) de la función de la integrina a5ß1 de ratón. El antecedente de una unión independiente de integrinas de las células K562 a fibronectina se determinó usando EDTA 10 mM. El antecedente general del ensayo se determinó en cavidades bloqueadas con BSA que no permiten la adhesión de las células K562 a la superficie de las placas de cultivo. Las células adheridas (después de un lavado) se lisaron y se determinó la fluorescencia.

Figura 3: Inhibición dependiente de la dosis mediada por Fab de células K562 a fibronectina Se evaluó el anti-a5pi humano específico de Fab por su capacidad para inhibir la unión de células K562 cargadas con colorante fluorescente a fibronectina inmovilizada. Después de la adhesión, las células se lisaron y se determinó la fluorescencia como una medida de las células que se adhirieron. La fibronectina sola indica una adhesión máxima, en tanto el antecedente general del ensayo se determinó sobre células recubiertas con BSA.

Figura 4: Anticuerpos bloqueantes de la función de a5ß1 inducen apoptosis en células endoteliales. La inducción de la activación de caspasa 3/7 por el Fab purificado en el formato monovalente se determinó usando células HUVEC en medio para células endoteliales sin suero. La actividad caspasa se determinó usando un sistema de ensayo quimioluminiscente disponible comercialmente (Caspase Glo, PROMEGA) de acuerdo con las instrucciones del proveedor.

Figura 5: Competencia por FACS de Fab y IIA1 La competencia FACS indica que MOR04624 compite por el epitope del anticuerpo de referencia IIA1 sobre células HT29a5. Se puede concluir que ambos anticuerpos comparten un epitope similar, en tanto los demás Fab reaccionan con sitios de unión no relacionados sobre la integrina a5ß1. (línea negra: unión de Fab, línea verde: unión de Fab cuando se hace competir con el anticuerpo de referencia IIA1 ).

Figura 6: Anticuerpos bloqueantes de la función de a5ß1 madurados por afinidad inducen potentemente la apoptosis en células endoteliales La inducción de la activación de caspasa 3/7 por el Fab purificado en el formato monovalente se determinó usando células HUVEC en medio para células endoteliales sin suero. La actividad caspasa se determinó usando un sistema de ensayo quimioluminiscente disponible comercialmente (Caspase Glo, PROMEGA) de acuerdo con las instrucciones del proveedor.

Figura 7: Anticuerpos Fab que bloquean la función de a5ß1 madurados por afinidad inhiben la proliferación de células endoteliales Se incubaron células HUVEC adherentes en medio para células endoteliales sin suero durante 48 horas en presencia de la cantidad indicada de Fab purificado o anticuerpo de referencia MAL Las células en proliferación se determinaron con un ensayo XTT disponible comercialmente de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se determinaron los valores de IC50 y se resumen en la Tabla 4.

Figura 8: IgG optimizadas en un ensayo de adhesión con HUVEC La inhibición de la adhesión de células HUVEC a fibronectina por anticuerpos IgG bloqueantes de la función de a5ß1. Las IgG MOR04974, MOR04975, MOR04977, MOR04985 bloquean la adhesión con una IC50 similar al IIA1. La conversión de Fab a IgG dio como resultado una mejora de aproximadamente el doble.

Figura 9: Ensayo de viabilidad de HUVEC: análisis de IgG anti-integrina a5ß1 La inhibición de la viabilidad de células HUVEC por anticuerpos IgG bloqueantes de la función de a5ß1. Las células HUVEC se plaquearon sobre placas recubiertas con fibronectina, se incubaron con concentraciones crecientes de anticuerpos IgG y se midió la sobrevida después de 48 hs. Las IgG MOR04974, MOR04975, MOR04977, MOR04985 bloquean la adhesión con una IC50 similar al IIA1. La conversión de Fab en IgG dio como resultado una mejora de aproximadamente el doble.

Figura 10: Ensayo con caspasa en HUVEC de IgG anti-integrina a5ß1 La inducción de la activación de caspasa 3/7 por los anticuerpos IgG bloqueantes de la función a5ß1 se determinó usando células HUVEC en medio para células endoteliales sin suero. La actividad de caspasa se determinó usando un sistema de ensayo quimioluminiscente disponible comercialmente (Caspase glo, PROMEGA) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Las MOR04974, MOR04975, MOR04977 y MOR04985 tienen una actividad similar al anticuerpo de referencia IIA1.

Figura 11 : Fab madurado por afinidad precipita específicamente la integrina a5ß1 de lisados de superficies celulares biotiniladas Se incubaron lisados de superficies biotiniladas NP40 de HT29a5 y HT29wt con Fab acoplado a esferas magnéticas Dyna. Los inmunoprecipitados fueron transferidos a membranas de PVDF y se analizaron con estreptavidina-fosfatasa alcalina (AP). Todos los Fab precipitaron específicamente a la proteína del tamaño esperado comparable al anticuerpo de referencia IIA1 fuera del lisado HT29a5, en tanto ninguna proteína era detectable en el lisado de HT29wt. El Fab MOR03207 irrelevante no precipitó específicamente ninguna proteína.

Figura 12: Especificidad de unión de la IgG anti-integrina a5ß1 (ejemplo MOR04974) con HT29-wt y HT29a5 (medición FACS) Se incubaron anticuerpos IgG madurados por afinidad 10 pg/ml con 5 x 105 células HT29wt y HT29a5. Los anticuerpos unidos específicamente fueron detectados con un anticuerpo secundario marcado con Cy3. Panel superior: IIA1 incubado con HT29wt (izquierda) o células HT29a5 (derecha), panel inferior: lgG1 MOR04974. El cambio de fluorescencia indica unión específica con la integrina a5 y se observó para MOR04975, MOR04977, MOR04985 y MOR04624. Los controles de isotipo del anticuerpo son negativos (líneas negras). Los anticuerpos anti-integrina de la invención se unen a las células transfectadas con la cadena a5 con la misma especificidad que el anticuerpo de referencia IIA1.

Figura 13: Unión competitiva de las IgG anti-integrina a5ß1 (ejemplo MOR04974) sobre células HT29a5 con IIA1 (medición con FACS). La IgG anti-integrina a5ß1 compite con IIA1 por un epitope superpuesto. Se incubaron anticuerpos anti-integrina a5ß1 de producción propia a 1 pg/ml con 5 x 105 células HT29a5 que se habían preincubado, o no, con IIA1 20 pg/ml. La presencia de la unión de IIA1 queda demostrada por la detección con FITC anti-ratón de cabra (panel de la izquierda). La unión y competencia del anticuerpo humano (MOR04974) se muestra por la detección con el anticuerpo secundario FITC anti-humano de cabra (panel de la derecha). Este ejemplo muestra la competencia para MOR04974. Se obtuvo el mismo resultado para MOR04975, MOR04977, MOR04985, MOR04624.

Figura 14: Análisis de los anticuerpos lgG1 anti-integrina a5ß1 en el ensayo de formación de tubos (Ejemplo MOR04974). Los anticuerpos lgG1 anti-integrina a5ß1 optimizados por afinidad bloquean la formación de tubos tan eficazmente como IIA1. Se cosecharon células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC N° 2519) de pasaje temprano hasta 60-80% de confluencia y se inocularon 2 x 104 células sobre cavidades Matrigel (Becton Dickinson N° 354234) en medio EBM-2 (Clonetics N° CC3156). Los anticuerpos se agregaron 15 min después y se dejó que avanzara la formación de tubos durante 18-24 hs a 37°C. A continuación, las células se fijaron (formalina 4%), se permeabilizaron, bloquearon y tiñeron con anti-CD31. Los anticuerpos se aplicaron a concentraciones de 6 nM, 3 nM, 600 pM, 300 pM y 60 pM. Se muestran las imágenes representativas para el efecto a 300 pM A: muestra no tratada, B: lgG1 anti-lisozima MOR03207 humana, C: lgG1 MOR04624, D: lgG1 MOR04974, E: IIA1 , F: lgG1 murina. También se encontró el mismo resultado para MOR04975 y MOR04977 Figura 15: Actividad de los anticuerpos IgG anti-integrina a5ß1 optimizados por afinidad en el ensayo de migración Transwell. El ensayo de migración se efectúa en una microplaca para migración Transwell de 96 cavidades (poros de 8 µ?t?, N° 351 163 Falcon/BD), con fibronectina como único estímulo. El lado inferior de la membrana Fluoroblok se recubrió con fibronectina 2 pg/ml por 1 h a 37°C y se bloqueó con BSA 2% por 30 min a 37°C. Se usó medio endotelial sin suero humano (Invitrogen) que contenía BSA 0,1 % como solución amortiguadora de migración en la cámara superior e inferior. Se agregaron anticuerpos anti-integrina a5ß1 (0,6-10 pg/ml) a la cámara superior de cada cavidad, se agregaron HUVEC de pasaje temprano (2 x 104) y se dejó que avanzara la migración de células por 4 hs a 37°C. Las células migradas sobre el lado inferior de las membranas se tiñeron luego con calceína y se determinó la fluorescencia resultante con un contador Perkin Elmer1220 Víctor a 485 nm de excitación y 535 nm de emisión. A: Las imágenes que se muestran se obtuvieron a una concentración de anticuerpo 10 Mg/ml. MOR04974, MOR04975, MOR04977 inhibieron la migración de HUVEC de manera tan eficaz como IIA1. B: Dosis-respuesta de la actividad anti-migratoria de MOR04974, 75, 77 (isotipo del anticuerpo lgG4-Pro). IC50 (MOR04974: 1 pg/ml, MOR04975: 1 ,5 g/ml, MOR04977: 1 pg/ml, IIA1 : 2 pg/ml) Figura 16: Patrón de tinción IHC de anticuerpos lgG1 anti-integrina a5ß1 optimizadas por afinidad en tejido de carcinoma de colon. Aumento 10x, se titularon anticuerpos biotinilados sobre secciones de tejido en serie de carcinoma de colon. La detección se efectuó con estreptavidina-fosfatasa alcalina. A modo de ejemplo se muestran las secciones inmunohistoquímicas obtenidas con una concentración de 2,5 pg/ml. Para IIA1 y MOR04974, se observó coloración de vasos de tamaño pequeño a intermedio y del compartimiento estromático. Las flechas negras muestran los mismos vasos teñidos con ambos anticuerpos. Se encontró un patrón de coloración similar para MOR04975 y MOR04977. Las flechas azules indican los vasos teñidos. Se puede concluir que los anticuerpos anti-integrina a5ß1 optimizados muestran patrones de coloración comparables a IIA1.

Figura 17: Direccionamiento a tumores de los anticuerpos anti-adß? integrina optimizados por afinidad (lgG4-Pro). Los anticuerpos anti-integrina a5ß1 fueron marcados radioactivamente con yodo-125 (1 min, método lodogen). Se determinó que la inmunorreactividad remanente era del 75-80% y se inyectaron 3 pg de anticuerpo marcado en ratones desnudos con xenoinjertos de HT29a5. A: Captación por el tumor de lgG1 MOR04974, MOR04975 y controles (anticuerpo de referencia IIA1 y anti-lisozima MOR03207), B: Captación por el tumor de lgG1 MOR04977 y controles. La captación de anticuerpos de los anticuerpos anti-integrina a5ß1 era similar a IIA1 y significativamente mayor en comparación con el lgG1 MOR03207 irrelevante. Los autores concluyen a partir de este resultado que los anticuerpos anti-integrina a5ß1 están dirigidos específicamente a los xenoinjertos de HT29a5 positivos para la integrina a5ß1.

Figura 18: Análisis de los anticuerpos IgG optimizados anti-integrina a5ß1 en el modelo de angiogénesis esferoide sustituto 3D in vivo. Se implantaron cartuchos de Matrigel que contenían esferoides de un número definido de células endoteliales junto con VEGF y FGF2 por vía subcutánea en ratones SCID. Se analizó la gemación de EC y la formación vasos de una compleja red de la vasculatura de ratón después del tratamiento con los anticuerpos anti-integrina a5ß1 humanos optimizados y anticuerpos control. Los anticuerpos IgG MOR04974 y MOR04975 humanos fueron tan eficaces como IIA1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De acuerdo con la presente invención, anticuerpos completamente humanos en el formato Fab fueron aislados de una biblioteca de anticuerpos HuCAL®-Gold mediante expresión en fagos usando células transfectadas con integrina a5ß1. Estos anticuerpos muestran una gran actividad in vitro en tanto se puede esperar una baja inmunogenicidad en pacientes humanos debido al origen completamente humano. Por consiguiente, un primer aspecto de la presente invención es un anticuerpo humano o humanizado, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que (i) se une a la integrina a5ß1 con una afinidad de 100 nM y preferentemente < 10 nM y (ii) inhibe la adhesión de las células que expresan integrina a5ß1 a su receptor in vitro e in vivo.

El polipéptido de la presente invención es un anticuerpo humano o humanizado, o un fragmento de unión al antígeno del mismo. El término "anticuerpo humano" de acuerdo con la presente invención se relaciona con moléculas de anticuerpo que tienen dominios variables sustancialmente humanos o completamente humanos y, si están presentes, dominios constantes humanos. El término "humano", según se usa en la presente solicitud, se relaciona con secuencias que se pueden formar en seres humanos individuales o mediante el uso de las secuencias consenso que resultan de las mismas, por ejemplo como se describe en el correspondiente compendio de Kabat et al. (1991 ), Sequences of Proteins of immunological Interest, 5a Edición, publicación del NIH N° 91 -3242, US Department of Health and Human Services, Washington, DC, que se incorpora en la presente a modo de referencia. El término "sustancialmente humano" se refiere a secuencias que pueden diferir de las secuencias "completamente humanas", descritas por Kabat et al., en hasta 1 , 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos. Más particularmente, los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo, de acuerdo con la presente invención comprenden regiones de marco de trabajo variables sustancialmente o completamente humanas en las cadenas de inmunoglobulina pesada (H) y liviana (L). El término "anticuerpo humanizado" en el sentido de la presente invención se relaciona con moléculas de anticuerpo que contienen dominios variables sustancialmente murinos o completamente murinos y dominios constantes humanos o sustancialmente humanos, y que son > 82%, preferentemente al menos 90% y con especial preferencia al menos 98% humanos. El término "murino" según se usa en la presente solicitud se relaciona con secuencias que se pueden formar en roedores individuales o mediante el uso de secuencias consenso resultantes de las mismas. El término "sustancialmente murino" se refiere a secuencias que pueden diferir de las secuencias "completamente murinas" en hasta 1 , 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos. Preferentemente, el anticuerpo, o fragmento de anticuerpo del mismo, es un anticuerpo IgG, por ejemplo un anticuerpo lgG1 , lgG2, lgG3 o lgG4 humano o humanizado, o un fragmento del mismo, por ejemplo un fragmento Fab, Fab' o (Fab)2. Sin embargo, la presente invención también se relaciona con anticuerpos recombinantes que contienen secuencias humanas, por ejemplo anticuerpos de cadena simple (se), o un fragmento de los mismos, p.ej. fragmentos scFv.

Los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo, de la presente invención contienen uno o más sitios de unión al antígeno que interactúan específicamente con la integrina a5ß1. Preferentemente, estas propiedades de unión al antígeno se obtienen combinando una región de la cadena pesada variable (VH) con la de una cadena liviana variable (VL). Una región VH o VL incluye regiones de marco de trabajo (FR1 , FR2, FR3 y FR4) y regiones CDR que intervienen en la unión al antígeno (H-CDR1 , H-CDR2, H-CDR3 para la región VH y L-CDR1 , L-CDR2, L-CDR3 para la región VL).

El anticuerpo humano o humanizado, o fragmento de anticuerpo, de la invención tiene preferentemente una afinidad por la integrina a5ß1 correspondiente a un valor de KD = 100 nM, preferentemente < 10nM y con mayor preferencia = 1 nM, en donde la afinidad se determina por titulación FACS en células HUVEC humanas a5ß1 -positivas según se describe en los ejemplos o por medición de competencia BIAcore o de competencia ELISA.

Además, los polipéptidos de la invención inhiben la adhesión de una célula tumoral humana que expresa la integrina a5ß1 como se describe en los ejemplos, p.ej. las células K562 (ATCC, N° Acceso: CCL-243) estudiadas por Lozzio et al. (1979), Leukemia Research, 3: 363-370, in vitro. Preferentemente, el anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, muestra una inhibición del 50% de la adhesión celular a una concentración (IC50) = 10 nM y preferentemente = 5 nM.

Además, los polipéptidos de la invención tienen preferentemente la capacidad para inducir actividad caspasa en células HUVEC. El valor IC50, con respecto a la viabilidad de HUVEC, es preferentemente = 10 nM, más preferentemente = 5 nM, en donde el valor IC50 (50% de viabilidad) se determina como se describe en los ejemplos.

Además, los polipéptidos, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la invención se pueden usar preferentemente para el diagnóstico y la prevención y el tratamiento de tumores y cáncer, en especial carcinoma de colon.

Dichos polipéptidos, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo se pueden conjugar con grupos de marcación detectables, tal como grupos de marcación radioactivos, NMR, colorantes, enzimas y fluorescentes. Los grupos radioactivos pueden ser, por ejemplo, I125, 1131 o Y90.

Preferentemente, el anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, de la invención comprende: (a) una región VH seleccionada entre (i) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 1 (MOR04624), la SEQ ID N°: 3 (MOR04055) o al menos una región H-CDR1 , H-CDR2 y/o H-CDR3 de una de dichas regiones de VH o (ii) una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de (i) por alteración de al menos una región H-CDR y/o (b) una región VL seleccionada entre (i) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 2 (MOR04624), la SEQ ID N°: 4 (MOR04055) o al menos una región L-CDR1 , L-CDR2 y/o L-CDR3 de una de dichas regiones VL o (ii) una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de (i) por alteración de al menos una región L-CDR.

Es especialmente preferido un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, que comprende una región VH derivada de una región VH de (a) (i) descrita precedentemente por randomización de la región H-CDR2.

En otra modalidad especialmente preferida, el anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, comprende una región VL derivada de una región VL de (b) (i) descrita precedentemente por randomización de la región L-CDR3.

En aún otra modalidad especialmente preferida, el anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, comprende una región VH y/o VL derivada de una región VH de (a) (i) y/o una región VL de (b) (i) por entremezclado de las cadenas de anticuerpo.

Se generan sub-bibliotecas de H-CDR2 y L-CDR3 por intercambio de H-CDR2 y L-CDR3, respectivamente, con repertorios de CDR humanas usando métodos de ingeniería de proteínas (17).

Por ejemplo, el anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, comprende una región VH y/o VL derivada de la región VL y/o VH descrita en la SEQ ID N°: 1 o la SEQ ID N°: 2 (MOR04624). Es especialmente preferido un polipéptido que comprende: (a) una región VH seleccionada entre secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 5 (MOR04971 ), SEQ ID N°: 7 (MOR04974), SEQ ID N°: 9 (MOR04975), SEQ ID N°: 1 1 (MOR04977), y SEQ ID NO. 11 (MOR04985) o al menos una región H-CDR1 , H-CDR2 y/o H-CDR3 de dichas regiones VH, y/o (b) una región VL seleccionada entre las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID N°: 6 ( OR04971 ), SEQ ID N°: 8 (MOR04974), SEQ ID N°: 10 (MOR04975), SEQ ID N°: 12 (MOR04977) y SEQ ID N°: 14 (MOR04985), o al menos una región L-CDR1 , L-CDR2 y/o L-CDR3 de dicha región VL.

Los ejemplos específicos de polipéptidos de la presente invención son: Un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, que comprende la región VH de la SEQ ID N°: 1 y la región VL de la SEQ ID N°: 2 (MOR04624) o al menos una región H-CDR1 , H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1 , L-CDR2 o L-CDR3 de las mismas. Un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, que comprende la región VH de la SEQ ID N°: 3 y la región VL de la SEQ ID N°: 4 (MOR04055) o al menos una región H-CDR1 , H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1 , L-CDR2 o L-CDR3 de las mismas.

Un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, que comprende la región VH de la SEQ ID N°: 5 y la región VL de. la SEQ ID N°: 6 (MOR04971 ) o al menos una región H-CDR1 , H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1 , L-CDR2 o L-CDR3 de las mismas.

Un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, que comprende la región VH de la SEQ ID N°: 7 y la región VL de la SEQ ID N°: 8 (MOR04974) o al menos una región H-CDR1 , H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1 , L-CDR2 o L-CDR3 de las mismas.

Un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, que comprende la región VH de la SEQ ID N°: 9 y la región VL de la SEQ ID N°: 10 (MOR04975) o al menos una región H-CDR1 , H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1 , L-CDR2 o L-CDR3 de las mismas.

Un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, que comprende la región VH de la SEQ ID N°: 1 1 y la región VL de la SEQ ID N°: 12 (MOR04977) o al menos una región H-CDR1 , H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1 , L-CDR2 o L-CDR3 de las mismas.

Un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, que comprende la región VH de la SEQ ID N°: 13 y la región VL de la SEQ ID N°: 14 (MOR04985) o al menos una región H-CDR1 , H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1 , L-CDR2 o L-CDR3 de las mismas.

La invención también se refiere a anticuerpos o fragmentos de anticuerpo dirigidos contra el mismo epítope sobre el antígeno que los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo, preferidos y/o ejemplificados mencionados previamente.

Las cadenas VH y VL del polipéptido comprenden las siguientes regiones: la cadena VH de MOR04624, MOR04055 y derivados (esquema de numeración de acuerdo con (17)): - La región del marco de trabajo 1 que se extiende entre los aminoácidos 1 y 30 - La región CDR1 que se extiende entre los aminoácidos 31 y 35 - La región del marco de trabajo 2 que se extiende entre los aminoácidos 36 y 49 - La región CDR2 que se extiende entre los aminoácidos 50 y 65 - La región del marco de trabajo 3 que se extiende entre los aminoácidos 66 y 94 - La región CDR3 que se extiende entre los aminoácidos 95 y 102 - La región del marco de trabajo 4 que se extiende entre los aminoácidos 103 y 1 13 la cadena VLK1 de MOR04624 y derivados de la misma(esquema de numeración de acuerdo con (17)): la región del marco de trabajo 1 que se extiende entre los aminoácidos 1 y 23 la región CDR1 que se extiende entre los aminoácidos 24 y 35 la región del marco de trabajo 2 que se extiende entre los aminoácidos 36 y 50 la región CDR2 que se extiende entre los aminoácidos 51 y 57 la región del marco de trabajo 3 que se extiende entre los aminoácidos 59 y 89 la región CDR3 que se extiende entre los aminoácidos 90 y 98 la región del marco de trabajo 4 región que se extiende entre los aminoácidos 99 y 109 La cadena VL 1 de MOR04055 y derivados (esquema de numeración de acuerdo con (17)): la región del marco de trabajo 1 que se extiende entre los aminoácidos 1 y 23 la región CDR1 que se extiende entre los aminoácidos 24 y 35 la región del marco de trabajo 2 que se extiende entre los aminoácidos 36 y 50 la región CDR2 que se extiende entre los aminoácidos 51 y 57 la región del marco de trabajo 3 que se extiende entre los aminoácidos 58 y 89 la región CDR3 que se extiende entre los aminoácidos 90 y 98 la región del marco de trabajo 4 que se extiende entre los aminoácidos 99 y 109 Las regiones de marco de trabajo de la cadena VH y/o VL se pueden alterar por intercambio de uno o más aminoácidos, p.ej. 1 , 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos. Por ejemplo, se puede alterar la región del marco de trabajo 3 de la cadena VLK1 en los miembros de la familia MOR04624. Preferentemente, el aminoácido de la posición 85 de la secuencia del Fab es intercambiable, siendo especialmente preferido un intercambio de valina (MOR04624, MOR04985) por treonina (MOR04974, -75, -77). Además, se puede alterar la región del marco de trabajo 1 de la cadena VH. En una modalidad preferida, se puede intercambiar el aminoácido de la posición 3 de cada secuencia de VH-Fab. Se prefiere especialmente un intercambio de glutamina (q) por ácido glutámico (e) que puede tener lugar, p.ej., durante la clonación.

El polipéptido de la invención es adecuado para aplicaciones terapéuticas o de diagnóstico, por ejemplo para aplicaciones de diagnóstico in vitro o in vivo.

Para las aplicaciones terapéuticas, el anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, se puede usar como tal. Como alternativa, el polipéptido se puede encontrar en la forma de un conjugado con un agente terapéutico seleccionado, por ejemplo, entre agentes radioterapéuticos o agentes quimioterapéuticos, por ejemplo agentes de bajo peso molecular o citostáticos biológicos o citotóxicos. El agente terapéutico se puede conjugar al anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, de acuerdo con métodos conocidos, preferentemente a través de un enlace covalente a grupos reactivos de amino, carboxi, hidroxi y/o sulfhidrilo del polipéptido, opcionalmente usando ligadores homo- o hetero-bifuncionales.

En una modalidad adicional, el polipéptido se puede encontrar en la forma de una proteína de fusión que comprende un dominio de un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, y un dominio de fusión heterólogo, por ejemplo una citoquina, tal como IL-2, IL-12 o TNF-a. Otros miembros de fusión terapéuticamente relevantes de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la invención comprenden las partes Fe IgG manipuladas para una mayor o menor reclutamiento de células inmunoefectoras, toxinas proteicas tal como RNAsas o ETA, pequeñas moléculas de droga, tal como derivados de maytansina o auristatina, enzimas para la activación de prodrogas, proteínas de fusión con otros antagonistas bloqueantes de la función de integrinas o proteínas de fusión con enzimas que tienen actividad antiangiogénica, tal como MMP-2 o MMP-9 (15). Además, la proteína de fusión se puede encontrar en la forma de un anticuerpo biespecífico que comprende al menos un dominio de unión de la integrina a5ß1 descrita precedentemente y un dominio de unión específico de otro antígeno. Por ejemplo, el segundo dominio de unión al antígeno puede estar dirigido contra agentes quelantes para radionucleótidos de diagnóstico y/o terapéuticos, por ejemplo radionúclidos emisores de radiación alfa, beta o gamma tal como 90Y, colorantes de diagnóstico del NIR (infrarrojo cercano), colorantes terapéuticamente activos, moléculas de superficie sobre células efectoras inmunológicas, por ejemplo células NK, células T citotóxicas o células T NK, dominios de unión anti-VEGF bloqueantes funcionales y dominios de unión bloqueantes de la función contra el receptor de VEGF 1 , 2 y 3 y citoquinas tales como interleuquinas.

Para las aplicaciones de diagnóstico, el polipéptido se puede encontrar en la forma de un conjugado con un grupo de marcación detectable, p.ej. un grupo de marcación para una aplicación de diagnóstico in vitro o in vivo. Por ejemplo, el grupo de marcación detectable se puede seleccionar entre grupos de marcación radioactivos, NMR, colorantes, enzimas y fluorescentes (p.ej., fluorescentes del NIR).

Para las aplicaciones terapéuticas, el polipéptido se formula preferentemente en una composición farmacéutica que además puede comprender otros ingredientes activos y/o vehículos, diluyentes y/o adyuvantes aceptables para uso farmacéutico. La composición farmacéutica comprende al agente activo en una dosis terapéuticamente activa, que el especialista puede determinar de acuerdo con métodos estándar, por ejemplo mediante experimentos in vitro o en modelos de animales. La composición es administrada preferentemente por infusión, inyección o inhalación. La dosis de ingrediente activo se determina de acuerdo con el tipo y la severidad del trastorno y la constitución del paciente a tratar. Preferentemente, la composición terapéutica es administrada en varias dosis sobre un tiempo de al menos 2-4 semanas. En este contexto, se hace referencia a protocolos conocidos para la administración de anticuerpos o anticuerpos conjugados, por ejemplo según se describe en Ferrara et al. Nature Reviews Drug Discovery, Vol. 3, mayo de 2004, 391 -400 y Salgaller, Current Opinión in Molecular Therapeutics, 2003, 5(6), 657-667 o a protocolos de administración de anticuerpos farmacéuticos tipo Rituximab, Campath, Remicade, etc.

Además, la invención se relaciona con una composición de diagnóstico que comprende un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, descrita precedentemente como un reactivo de diagnóstico. La composición de diagnóstico además puede comprender reactivos, vehículos, diluyentes y/o adyuvantes aceptables para uso diagnóstico. La composición de diagnóstico comprende al polipéptido en una cantidad suficiente para permitir la detección de diagnóstico en el formato de ensayo respectivo, por ejemplo en un formato de ensayo de diagnóstico in vivo o in vitro.

La composición se puede usar para aplicaciones terapéuticas o de diagnóstico en los trastornos asociados con la integrina a5ß1. Por ejemplo, estos trastornos pueden ser trastornos hiperproliferativos, por ejemplo trastornos asociados con angiogénesis y/o metástasis, en particular cáncer. Los distintos tipos de cáncer que pueden ser tratados con la composición de acuerdo con la invención comprenden particularmente todos los tipos de tumores sólidos, por ejemplo cáncer de colon, riñon, pulmón, próstata, mama, cerebro, estómago, hígado o piel. Como alternativa, las composiciones se pueden emplear en el tratamiento de los tipos de cáncer hematológicos asociados con una angiogénesis. Otros trastornos asociados con una neovascularización comprenden, pero en un sentido no taxativo, endometriosis, hemangioma, artritis reumatoide, osteoartritis, placas arterioscleróticas, enfermedad de intestino inflamatorio, enfermedad inflamatoria del CNS, psoriasis, trastornos oftalmológicos tales como retinopatía diabética o enfermedad macular relacionada con la edad y cicatrices hipertróficas. En una modalidad preferida, la actividad antiangiogénica de la composición es independiente de los factores de crecimiento.

La composición puede comprender uno o varios anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, por ejemplo una combinación de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que se unen a diferentes dominios de la integrina a5ß1. La composición también puede contener drogas de moléculas pequeñas para una terapia combinada. La composición es adecuada para aplicaciones en medicina humana y veterinaria. Se prefiere especialmente una aplicación en medicina humana.

Además, la presente invención se relaciona con un ácido nucleico que codifica un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, o un polipéptido de fusión descrito precedentemente. El ácido nucleico puede ser, por ejemplo, ADN o ARN de cadena simple o de cadena doble. Preferentemente, el ácido nucleico está ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión, que permite la expresión en una célula huésped u organismo huésped adecuado. El ácido nucleico puede encontrarse en un vector o un sistema de vectores, (es decir, una pluralidad de vectores) que puede introducirse en una célula huésped u organismo huésped. El vector puede ser un vector procariota adecuado para células procariotas, por ejemplo un plásmido o bacteriófago. Además, el vector puede ser un vector eucariota para células huésped u organismos huésped eucariotas, por ejemplo un plásmido, un cromosoma artificial o un vector viral. Los vectores adecuados se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory Press y Ausubel et al. (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley y Sons.

La presente invención también se refiere a una célula, por ejemplo una célula procariota o una célula eucariota, tal como una célula humana, que es transformada con un ácido nucleico o un vector descrito precedentemente. Aún más, la invención se relaciona con un organismo no humano, p.ej. un animal transgénico, tal como un mamífero no humano transgénico que es transformado con un ácido nucleico o vector descrito precedentemente. El término "transformación" incluye todos los métodos para introducir ácidos nucleicos extraños en una célula o un organismo incluyendo transfección o infección.

El polipéptido se puede preparar cultivando una célula o un organismo no humano descrito precedentemente bajo condiciones que permitan expresar el polipéptido y luego se recupera el polipéptido expresado, por ejemplo a partir de una célula, medio de cultivo, organismo o productos de excreción del organismo.

La invención se ilustra además con los ejemplos. Sin embargo, los siguientes ejemplos no deben considerarse como limitaciones. Ejemplos 1. Generación de anticuerpos bloqueantes de la función de la integrina a5ß1 1.1 Estrategias de estudio El anticuerpo monoclonal IIA1 de ratón se une a un epítope de conformación de la integrina a5ß1 que solamente está presente sobre células vivas activadas (endoteliales). Para abarcar tanto la selectividad como la actividad funcional, se estableció una vía de estudio compuesta por paneos alternados de antígenos aislados y células que expresan antígenos en combinación con ensayos de selección y examen basados en células funcionales para la identificación de los principales candidatos de anticuerpo derivados de HuCAL® GOLD en el formato Fab: 1. Selección de fragmentos de anticuerpo Fab de unión a anti-integrina a5ß1 por expresión en fagos usando la biblioteca HuCAL®-Gold (MorphoSys). Los experimentos de paneo se efectuaron con antígenos aislados y células que expresan antígenos. Sobre la base de las secuencias de aminoácidos de los mejores clones de anticuerpo, se generaron sub-bibliotecas por randomización de VL-CDR3 o VH-CDR2 usando secuencias de CDR humanas y a partir de las cuales se seleccionaron en experimentos de paneo adicionales ligadores aún más avanzados. Se obtuvieron clones adicionales por clonación de combinaciones de cadenas livianas y pesadas que contienen las VL-CDR3 y VH-CDR2 de interés en una molécula de anticuerpo ("clonación-X"). 2. Selección y examen de los anticuerpos Fab enriquecidos se efectuó de la siguiente manera. Los ligadores de todos los paneos fueron evaluados por su unión en ELISA sobre células positivas para la integrina a5ß1 y negativas para la integrina a3ß1. Los clones positivos según el ELISA fueron analizados además por la unión a células en experimentos FACS en células que sobreexpresan a5 y células negativas para a5. A continuación, se analizaron los clones adecuados en ensayos funcionales para i) adhesión celular a fibronectina ii) inducción de apoptosis de HUVEC (células endoteliales de vena umbilical humana) y/o HDMVEC (células vasculares endoteliales dérmicas humanas) iii) medición de afinidad y ensayo de competencia por FACS con el anticuerpo de referencia IIA1 y iv) reactividad cruzada entre especies. 1.2 Generación de las herramientas y desarrollo del ensayo ADNc de la cadena de integrina a5 El ADNc de la cadena a5 humana se obtuvo de RZPD (IMAGE-ID 6821577) y se clonó en el vector de expresión pADNc3 (INVITROGEN) de acuerdo con métodos estándar.

Receptores de integrina purificados Los receptores de integrina a5ß1 (Chemicon CC1052) y a3ß1 (Chemicon CC1092) humanos solubilizados en detergente se obtuvieron de CHEMICON INTERNATIONAL (Temecula, CA, EE.UU.). Para los ensayos de expresión en fagos en fase sólida, ELISA y BiaCore, se seleccionaron lotes de integrina con una pureza de al menos 90% por SDS-PAGE no desnaturalizante.

Líneas celulares La adhesión de la línea celular K562 de leucemia mielogénica crónica humana (ATCC, N° Acceso: CCL-243) a fibronectina está mediada solamente por la integrina a5ß1 (16). Esta línea celular se usó en el ensayo de adhesión mediado por fibronectina para un examen funcional inicial. Se demostró la presencia de la integrina a5ß1 mediante análisis FACS usando el anticuerpo IIA1 para la detección (Figura 1A).

Un prerrequisito para de las estrategias de paneo diferencial de células es un sistema de modelos donde el blanco de interés es sobreexpresado sobre una línea celular que es negativa para el blanco. Para tal fin, los autores eligieron la línea celular de carcinoma de colon humana HT29 (ATCC, N° Acceso: HTB-38) que expresa la cadena de integrina ß1 , pero no la cadena a5 (Figura 1 B). El ADNc de la cadena a5 se transfectó en las células progenitores HT29 usando lipofectamina de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se seleccionó un clon estable que sobreexpresaba a5 mediante examen por FACS usando el anticuerpo monoclonal IIA1 de ratón para marcar específicamente la integrina a5ß1 expresada en superficie (Figura 1 C).

Ensayo de adhesión Se estableció un ensayo de adhesión sensible para un examen funcional usando la línea celular K562 que sólo expresa la integrina a5ß1 humana. Para tal fin, se recubrieron placas de 96 cavidades con fibronectina humana o BSA 1 µg/ml como sustrato no adhesivo para determinar el antecedente general del ensayo. Dado que la adhesión de integrinas a las moléculas ECM es dependiente de la presencia de Ca2+/Mg2+, se usó EDTA 10 mM para determinar la unión basal a fibronectina independiente de integrina. Se usó el anticuerpo IIA1 bloqueante de la función como referencia y un anticuerpo monoclonal anti-integrina a5ß1 de ratón no bloqueante (VC5) sirvió como control de anticuerpo negativo. Según lo esperado, los recubrimientos con EDTA, IIA1 (5 pg/ml) y BSA inhibieron la unión de la adhesión mediada por K562, en tanto VC5 (5 pg/ml) no interfirió en la adhesión celular (Figura 2). 1.3 Expresión del anticuerpo en fagos y estrategias de paneo La expresión de anticuerpos en fagos para la identificación de los anticuerpos anti-integrina a5ß1 completamente humanos se efectuó con una biblioteca HuCAL®-GOLD de acuerdo con los protocolos descritos en la literatura (17-20). Se aplicaron las siguientes estrategias de paneo y se corrieron en paralelo (Tabla 1 ): Subcódigo de 1a ronda 2a ronda 3a ronda paneo 1298.1 -3 integrina a5ß1 integrina a5ß1 integrina a5ß1 en fase sólida en fase sólida en fase sólida 1298.4-6 integrina a5ß1 Células K562 integrina a5ß1 en fase sólida en fase sólida 1299.1 -3 Células K562 integrina a5ß1 Células K562 en fase sólida 1321.1-3 integrina a5ß1 Células HT29a5 integrina a5ß1 en fase sólida en fase sólida 1322.1 -3 Células HT29a5 integrina a5ß1 Células p.a. HT29wt en fase sólida HT29a5 1322.4-6 Células HT29a5 Células HT29a5 Células p.a. HT29wt p.a. HT29wt HT29a5 1324.1 -3 HDMVEC integrina a5ß1 HDMVEC en fase sólida 1369.1-2 integrina a5ß1 Células HT29a5 integrina a5ß1 en fase sólida p.a. HT29wt en fase sólida 1371.1-2 Células HT29a5 integrina a5ß1 Células p.a. HT29wt en fase sólida HT29a5 p.a. HT29wt Tabla 1 : Revisión de enfoques de paneo p.a: post-adsorción con HT29wt (para reducir la unión no específica a la superficie celular) Resultados: Durante los paneos 1298-1324, se examinaron varios miles de clones. A pesar del hecho aplicaron diversas estrategias de expresión, se aisló repetidamente un clon (MOR04055) que era selectivo en ELISA y FACS. Además de MOR04055, que aparentemente se une a un epitope inmunodominante, se identificaron 4 clones adicionales (MOR04139, 04141 , 04160, 04568). Para incrementar aún más la probabilidad de seleccionar ligadores de integrina más diversos y específicos, se llevaron a cabo 2 paneos adicionales (1369.1-2 y 1371.1-2). En este caso, se agregó MOR04055-Fab 10 pg/ml durante la expresión en fagos con el fin de suprimir el enriquecimiento del clon dominante, MOR04055. A pesar de la competencia del Fab, todos los ligadores específicos hallados en todos los paneos 1369 eran nuevamente MOR04055. En los paneos 1371 , se identificó un ligador individual adicional (MOR04624). 1.4 Pruebas funcionales con anticuerpos-Fab Ensayo de adhesión Los anticuerpos obtenidos con el enfoque del primer paneo fueron clasificados de acuerdo con su potencia bloqueante de la función en un experimento de selección y examen previos de la siguiente manera: MOR04624 > MOR04055 > MOR04141 = MOR04568 = MOR04160. MOR04139 era ligeramente inhibidor pero no alcanzó un 50% de inhibición. Los estudios dependientes de la dosis de los anticuerpos a diferentes concentraciones en el ensayo de adhesión K562 confirmó el resultado del experimento de la selección y examen previos de los solicitantes con una excepción: MOR04139 no mostró ninguna inhibición dependiente de la dosis. Este anticuerpo no se investigó más (figura 3).

Inducción de apoptósis Los anticuerpos obtenidos con el enfoque del primer paneo fueron evaluados además por las propiedades de inducción de apoptósis. Por ello, se recubrieron placas de 96 cavidades con fibronectina 0,2 y 0,4 pg/ml por 1 hora a 37°C y se bloquearon con BSA 2%. Se incubaron 1 x 104 células HUVEC junto con el respectivo anticuerpo en medio de cultivo para células endoteliales sin suero (Gibco). Después de 18 horas, se usó un conjunto de elementos de ensayo de caspasa 3/7 para lisis celular y cuantificación de la actividad caspasa de acuerdo con el procedimiento descrito por el proveedor (Caspase Glo 3/7; Promega). A una concentración de 100 g/ml de Fab MOR04055 y 04624 monovalente indujo actividad caspasa 3/7 en células HUVEC tan fuertemente como el anticuerpo de referencia bivalente IgG IIA1 a 10 pg/ml (Figura 4). Los demás Fab fueron negativos en este ensayo.

Mediciones de la afinidad por titulación FACS Para analizar la potencia de unión con la integrina a5ß1 nativa, se evaluaron todos los anticuerpos con células HUVEC positivas para a5ß1 por titulación FACS (Tabla 2). MOR04055 mostró la afinidad de unión más alta (0,9 nM) y mostró un incremento en el formato de IgG dimérica. Para MOR04624 se encontró una KD en el rango nanomolar bajo para el Fab monovalente y un incremento en la KD para la IgG dimérica.

Tabla 2: Resultado de la determinación de la afinidad de Fab e IgG monovalentes por titulación FACS Competencia FACS de Fab y IIA1 Para investigar si los anticuerpos Fab comparten, o no, el mismo epitope con IIA1 , se incubaron células HT29a5 ya sea con Fab 0,5 pg/ml solo o junto con IIA1 10 µg/ml. La unión de los Fab humanos con las células se detectó con anti-PE específico de Fab humano de cabra conjugado para los análisis FACS. En la Figura 7 se muestra una superposición de la tinción de Fab solamente (líneas negras) y Fab + IIA1 (lineas verdes). Como resultado de ello, la adición de IIA1 conduce a una clara disminución en la intensidad de la coloración por MOR04624. Todos los demás Fab no eran afectados por IIA1. Este resultado indica que IIA1 y MOR04624 compiten entre si por la unión a un epitope idéntico o superpuestos, en tanto los otros 4 Fab se unen a epitopes no relacionados. 1.5 Maduración por afinidad: Análisis de anticuerpos Fab e IgG Los Fabs MOR04055 y 04624 fueron sometidos a una ronda de maduración por afinidad. Por eso se construyeron sub-bibliotecas a partir del Fab progenitor ya sea por randomización de VL-CDR3 o VH-CDR2 (17) y luego fueron sometidas a selección por expresión en fagos con a5ß1 purificada y células HT29a5. Los ligadores positivos de este examen fueron analizados adicionalmente en un ensayo de adhesión con células HT29a5 y clasificados de acuerdo con su actividad inhibidora. Se encontró que el mejor potencial inhibidor era para los derivados de MOR04624. Los derivados de MOR04055, MOR04568, MOR04141 mostraron una mejora tan solo moderada o no significativa en la inhibición. Sobre la base de las cadenas liviana y pesada de estos clones se clonaron 12 nuevas combinaciones de VL-CDR3 y VH-CDR2 para su optimización adicional (la denominada "clonación X"). Se expresaron y se purificaron los mejores clones inhibidores y los clones de la clonación-X y se compararon in vitro de modo que eventualmente se identificaron 7 ligadores únicos consolidados con actividades mejoradas como bloqueantes de la función para un análisis más profundo adicional (MOR04971 , 72, 74, 75, 77, 85, 87).

Inducción de apoptósis La inducción con células HUVEC in vitro se midió por la actividad caspasa y la sobrevida celular (Figura 6 y Figura 7). En ambos ensayos, la eficacia de los Fab monovalentes MOR04974, 04975 y 04977 era comparable a la del anticuerpo de referencia monoclonal bivalente de ratón, Tabla 3: Valores IC50 de los anticuerpos Fab en el ensayo de proliferación XTT En comparación con el Fab progenitor, los anticuerpos madurados por afinidad eran significativamente mejores (hasta un factor de 190). La inhibición de la proliferación del Fab monovalente era 4 veces menos eficaz que la del anticuerpo de referencia bivalente, IIA1.

Inmunoprecipitación Para demostrar la especificidad de los anticuerpos Fab, se incubaron lisados de superficie biotinilados NP-40 de células HT29a5 y HT29wt con Fab acoplados a esferas magnéticas Dyna. Se usó IIA1 como anticuerpo de referencia. Después de lavados exhaustivos, los precipitados se llevaron a ebullición en solución amortiguadora para muestras de SDS-PAGE bajo condiciones reductoras, se transfirieron a membranas de PVDF y fueron sometidos a pruebas con sonda usando estreptavidina-AP. Todos los anticuerpos anti-integrina a5ß1 precipitaron específicamente una proteína banda doble de -135 kDa que corresponde al peso molecular esperado de las cadenas a5 y ß1 de la integrina (Figura 11) y no se encontró en el lisado de células HT29wt. Se encontró la misma banda doble con IIA1. El Fab MOR03207 irrelevante se usó como control negativo y no precipitó esta banda doble. Este resultado demuestra la gran especificidad de los anticuerpos Fab.

IgG optimizadas en el ensayo de adhesión con HUVEC Para investigar si la potencia ¡n vitro de los anticuerpos Fab descritos previamente mejora con el formato dimérico, los anticuerpos fueron convertidos en moléculas lgG1 completas de acuerdo con tecnologías estándar usando el conjunto de elementos para el Vector IgG MorphoSys HuCAL (MorphoSys AG, Munich; Alemania) y se analizaron en el ensayo de adhesión con HUVEC (Figura 8), en el ensayo de viabilidad con HUVEC (Figura 9) y en el ensayo de apoptosis con HUVEC (Figura 10) en comparación con el anticuerpo de referencia IIA1.

Más importante aún, se incluyó IIA1 en cada experimento como punto de referencia. En este sentido, la conversión de IgG de MOR04974, 75 y 77 dio como resultado IgG HuCAL con una IC50 muy similar a la de IIA1 , lo que indica que la conversión conducía verdaderamente a una mejora del doble en comparación con el formato con Fab monovalente. IgG optimizadas en el ensayo de viabilidad con HUVEC Se observó que después de la conversión de IgG, cinco ligadores mostraban una mejora del doble de los valores de IC50 en comparación con el formato Fab. MOR04974, 75 y 77 mostraron una eficacia muy similar en la reducción de la viabilidad en HUVEC a la referencia IIA1 IgG.

IgG optimizadas en ensayo de apoptosis con HUVEC A partir del análisis de las principales IgG en el ensayo con Caspasa 3.7 se pudo concluir que MOR04974, 75 y 77 indujeron una apoptosis tan bien como el anticuerpo de referencia IIA1. 1.6 Análisis profundo de anticuerpos IgG anti-integrina optimizados por afinidad Especificidad de los anticuerpos anti-integrina optimizados por afinidad Los anticuerpos madurados por afinidad del formato lgG1 fueron evaluados por su especificidad de unión mediante análisis FACS en células HT29wt vs. HT29a5. Las células HT29wt son a5-negativas pero contienen la cadena ß? -integrina. Las células HT29a5 pero no HT29wt son reconocidas específicamente por los anticuerpos lgG1 anti-integrina y el anticuerpo de referencia II A1 según lo indica el cambio de fluorescencia. (Figura 12). Un anticuerpo control del isotipo no específico no se une a las células y no se observaron cambios en la fluorescencia medida. Estos experimentos muestran que los principales anticuerpos candidato reconocen específicamente a la integrina a5 y se unen con la misma especificidad que el anticuerpo de referencia IIA1.

La especificidad del epitope de anticuerpos anti-integrina a5ß1 es retenida después de la maduración por afinidad y reclonación en el formato IgG Los autores han mostrado en experimentos FACS que el anticuerpo Fab MOR04624 y sus derivados compiten con el anticuerpo de referencia IIA1 para la unión a un epitope superpuesto. Después de la conversión al formato lgG1 , los anticuerpos anti-integrina a5ß1 fueron evaluados nuevamente por su unión competitiva con el IIA1. La unión de los anticuerpos lgG1 anti-integrina a5ß1 MOR04974, 75, 77, 85 y MOR04624 a células ??29a5 dio como resultado un cambio de fluorescencia que fue completamente inhibido cuando las células eran preincubadas con IIA1. Este resultado confirmó la competencia del epitope de IIA1 y los anticuerpos lgG1 anti-integrina a5ß1 (Figura 13).

Análisis cualitativo de los anticuerpos lgG1 anti-integrina a5ß1 en el ensayo de angiogénesis con formación de tubos. El bloqueo de los vasos recientemente formados a partir de células endoteliales activadas es considerado una de las actividades inhibidoras clave de los anticuerpos anti-integrina a5ß1. Para una caracterización completa, los autores analizaron los anticuerpos lgG1 anti-integrina a5ß1 optimizadas por afinidad en comparación con el anticuerpo de referencia IIA1 en un ensayo de formación de tubos con HUVEC.

En este ensayo, se sembraron 2 x 104 células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC, N° 2519, Promocell) sobre Matrigel rico en factores de crecimiento (Becton Dickinson, N° 354234) en medio EBM-2 (Clonetics, N° CC3156). Los anticuerpos (6 nM, 3 nM, 600 pM, 300 pM, 60 pM) se agregaron 15 min después y se permitió la formación de tubos por 18-24 hs a 37°C. A continuación, las células se fijaron y se tiñeron con anti-CD31 para la documentación fotográfica de la formación de tubos.

El análisis visual de las complejas redes formadas en las cavidades reveló una actividad bloqueante de la formación de tubos para todos los anticuerpos anti-adß? integrina derivados de MOR04624 con una potencia similar a la del anticuerpo de referencia (Figura 14). A concentraciones más altas, el bloqueo por anticuerpos de la formación de tubos también se observó para los controles de isotipo lgG1 humanos y murinos. Sin embargo, a concentraciones inferiores de anticuerpo (tan bajas como 300 pM) se observó una ventana de actividad donde la formación de tubos solamente era bloqueada en las cavidades tratadas con anticuerpo específico pero no en las cavidades no tratadas o en las cavidades tratadas con el control de isotipo del anticuerpo o con el anticuerpo de débil función bloqueante, MOR04624.

Análisis de los anticuerpos IgG anti-integrina a5ß1 en el ensayo de migración Durante el proceso angiogénico, las células endoteliales activadas migran hacia un estímulo angiogénico sobre una matriz provisional específica de la angiogénesis que consiste principalmente de fibronectina (FN). Los autores analizaron los anticuerpos IgG anti-integrina a5ß1 optimizados en el ensayo de migración Transwell y observaron una actividad bloqueante de la migración de HUVEC dependiente de a5ß1 -fibronectina para todos los anticuerpos anti-a5pi con una eficacia en el mismo orden de magnitud (1-10 pg/ml) que el IIA1 (Figura 15).

Reactividad de los anticuerpos anti-integrina a5ß1 Reactividad en líneas tumorales y de células endoteliales Se evaluó la reactividad de los anticuerpos anti-integrina a5ß1 en diversas líneas de células endoteliales y tumorales mediante experimentos de unión FACS (tabla 4). Se observó unión a todas las líneas de células endoteliales y tumorales evaluadas, excepto las células HT29wt que son conocidas por ser negativas para la cadena a5. En comparación con el anticuerpo de referencia IIA1 , los principales anticuerpos candidato se unieron igualmente bien a todas las líneas celulares evaluadas y el cambio resultante en la fluorescencia era similar para todos los anticuerpos. Los anticuerpos de control del isotipo no se unieron. En resumen, los anticuerpos anti-integrina a5ß1 muestran una reactividad equivalente a IIA1 en los experimentos de unión de células FACS.

PC-3 Adenocarcinoma de próstata humano + + ++ ++ U251 Glioblastoma humano + + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ HT29 Adenocarcinoma humano +/- + - - ??29a5 HT29 transfectadas con la cadena a5 +++ +++ +++ +++ +++ +++ 5 Tabla 4: Reactividad según FACS de los anticuerpos anti-integrina a5ß1 con diversas líneas celulares. + = cambio débil, ++ = cambio fuerte (fluorescencia 1 log), +++ = cambio muy fuerte (fluorescencia 2 log); controles de anticuerpo *mlgG1 y hulgGI , se usaron como controles estándar y la unión era negativa; material de anticuerpo: anti-CD51/61 human Chemicon N° CBL 544, anti-a?ßd Chemicon N° Mab 20192, 10 anticuerpo VC5 no bloqueante de la función de la integrina a5ß1 Pharmingen N° 555650, anticuerpo IIA1 anti-integrina a5ß1 Pharmingen N° 55561 Reactividad de anticuerpos anti-a5 1 en secciones de tejido normal y tumoral: inmunohistoquímica Los anticuerpos anti-integrina a5ß1 optimizados por afinidad fueron analizados en experimentos de inmunohistoquímica con diferentes secciones de tejido y el perfil de reactividad específico de los anticuerpos anti-integrina en los respectivos tejidos era muy parecido a la tinción de IIA1. En resumen, los autores concluyen que los anticuerpos anti-integrina a5ß1 de la invención muestran patrones de coloración comparables a IIA1 (figura 16).

Caracterización in vivo de los anticuerpos IgG anti-integrina a5ß1 optimizados por afinidad Demostración del reconocimiento dirigido in vivo en ratones desnudos con xenoinjertos Se compararon las propiedades de reconocimiento dirigido in vivo de los anticuerpos anti-integrina a5ß1 optimizados en comparación con IIA1 en ratones desnudos que portaban xenoinjertos de células HT29a5.

La marcación radioactiva de los anticuerpos anti-integrina a5ß1 optimizados (lgG4-Pro) se efectuó con iodo-125 de acuerdo con el método lodogen por 1 min de acuerdo con procedimientos estándar. La ¡nmunorreactividad se midió en un ensayo de unión celular ("ensayo Lindmo"). Se incubaron 50 ng de anticuerpo marcado radioactivamente con números crecientes (0,25 a 10 mili.) de células positivas para la integrina a5ß1 durante 2 hs a 4°C. A continuación, se lavaron las células y se determinó la radioactividad unida con un contador de centelleo. Se gráfico el cociente de cuentas totales/cuentas unidas contra 1 /número de células y los datos se ajustaron usando un modelo de regresión no lineal. A partir de la intersección con el eje y se calculó la ¡nmunorreactividad restante para una densidad de antígeno infinito, y se encontró que era del 75-80% para todos los anticuerpos anti-integrina a5ß1.

Los anticuerpos anti-integrina a5ß1 humanos se acumularon dentro de las 24 horas en los xenoinjertos ??29a5, con > 10% de ID/g que duraba 96 horas para todos los anticuerpos analizados, excepto MOR04975 que disminuyó rápidamente después de 48 horas a menos que un 5% ID/g después de 72 hs. MOR04974 alcanzó su valor pico después de 48 horas, con un 18% de ID/g, y MOR04977 después de 72 hs con un 18% de ID/g. En comparación, el anticuerpo IIA1 murino se acumuló dentro de las 24 hs en los xenoinjertos de HT29c¡5 con > 10% de ID/g que duraba hasta 96 hs. Para el anticuerpo anti-lisozima no específico MOR03207 se observó menos que un 3% de ID/g en cualquier tiempo. A partir de estos resultados, se puede concluir un reconocimiento dirigido específico de los xenoinjertos de HT29a5 positivos para a5ß1. El reconocimiento dirigido in vivo de los anticuerpos anti-integrina a5ß1 MOR04974 y MOR04977 es similar a IIA1 y en tiempos puntuales es aún superior.

Eficacia in vivo de los anticuerpos anti-integrina a5ß1 en modelos de animales de angiogénesis sustitutos Al igual que el anticuerpo de referencia IIA1 , los anticuerpos anti-integrina a5ß1 no presentan reactividad cruzada con la integrina a5ß1 de ratón y rata. Por ello es difícil el análisis de la eficacia terapéutica in vivo y la demostración del efecto antiangiogénico específico in vivo en modelos de animales y debe efectuarse en modelos de angiogénesis sustitutos.

La comparación in vivo de los anticuerpos IgG anti-integrina a5ß1 con IIA1 se efectuó en el modelo de angiogénesis esferoide sustituto 3D in vivo (figura 18).

Para este modelo, se mezclaron esferoides de un número definido de células endoteliales con colágeno que se dejó polimerizar en una placa de 24 cavidades. Los esferoides de EC en cartuchos de Matrigel que contienen VEGF y FGF2 fueron implantados luego por vía subcutánea en ratones SCID, donde las EC estimuladas formaron una compleja red tridimensional de capilares humanos que se anastomosaron con la vasculatura del ratón. Los anticuerpos anti-integrina a5ß1 (200 ig) fueron administrados dos veces por semana durante tres semanas. El estudio terminó el día 21 , se retiraron los cartuchos de Matrigel y se examinó en ellos la densidad de vasos sanguíneos. El tratamiento del anticuerpo de referencia IIA1 con los anticuerpos IgG anti-integrina a5ß1 optimizados MOR04974 y MOR04975 redujo la densidad microvascular en los cartuchos de Matrigel en un factor de dos hasta 20 microvasos aproximadamente por mm2, en tanto el tratamiento con el anticuerpo anti-lisozima humano irrelevante MOR03277 dio como resultado 40 microvasos aproximadamente por mm2. Sobre la base de este resultado se puede concluir que los anticuerpos anti-integrina a5ß1 humanos optimizados MOR04974 y MOR04975 tienen una eficacia anti-angiogénica in vivo comparable a IIA1 en el modelo de angiogénesis esferoide sustituto 3D in vivo.

Conclusión: En los experimentos in vitro las mejores propiedades inhibidoras en los formatos Fab así como lgG1 se observaron consistentemente para MOR4974, 75, 77. Las tres IgG son comparables al mAb de referencia IIA1. Estos ligadores son derivados de MOR04624.

En los experimentos in vivo, se demostró que las IgG completamente humanas y optimizadas MOR04974, 75, 77 son dirigidas eficazmente a los xenoinjertos tumorales en ratones desnudos y en el modelo de angiogénesis con esferoides 3D, MOR04974 y MOR04975 fueron tan eficaces como el anticuerpo de referencia IIA1.

Las secuencias de aminoácidos de las cadenas V de los anticuerpos anteriores se muestran en la Tabla 4: MOR04624 progenitor hlgG1 kappa final Vector-VH-h- Vector-VL-h-kappa lgG1 MOR04974 MOR04985 MOR04990 MOR04975 MOR04985 MOR04991 MOR04977 MOR04987 MOR04989 MOR04985 MOR04985 MOR04624 MOR04624 V (SEQ ID NO; 1 ) diqmtqspsslsasvgdn titcrasqgissnlnwyqqkpgkapklliyaasnlqsgpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfavyycqqysdqs ytfgqgtkveikrt VH (SEQ ID N°: 2) qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssygmswvrqapgkglewvssisysdsntyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtav yycarglgdyghhhglsgifdywgqgtlvtvss MOR04055 VLA3 (SEQ I D N°: 3) dieltqppsvsvapgqtariscsgdsigeqyahwyqqkpgqapvlviyddnkrpsgiperfsgsnsgntatltisgtqaedeadyycgsytlt ntasvfgggtkltvlg VH3 (SEQ ID N°: 4) qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsnyamnwvrqapgkglewvsrisysgsdtyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtav yycaregefgfmystlvfdswgqgtlvtvss MOR04971 VLA3 (SEQ I D N°: 5) dieltqppsvsvapgqtariscsgdsigeqyahwyqqkpgqapvlviyddnkrpsgiperfsgsnsgntatltisgtqaedeadyycssyty ssdasvfgggtkltvlg VH3 (SEQ ID N°: 6) qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsnyamnwvrqapgkglewvsaihdnghtyypdsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtav yycaregefgfmystlvfdswgqgtlvtvss MOR04974 VLK (SEQ I D N0: 7) diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgissnlnwyqqkpgkapklliyaasnlqsgpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqyasprq tfgqgtkveikrt VH (SEQ I D °: 8) qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssygmswvrqapgkglewvsgirakqsgyatdyaapvkgrftisrdnskntlylqmnslraedt avyycarglgdyghhhglsgifdywgqgtlvtvss MOR04975 VLK (SEQ ID N°: 9) diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgissnlnwyqqkpgkapklliyaasnlqsgpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqyefgiqtf gqgtkveikrt VH (SEQ ID N°: 10) qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssygmsvwrqapgkglewvsgirakqsgyatdyaapvkgrftisrdnskntlylqmnslraedt avyycarglgdyghhhglsgifdywgqgtlvtvss MOR04977 VLK (SEQ ID N°: 1 1 ) diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgissnlnwyqqkpgkapklliyaasnlqsgpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqyssnpq tfgqgtkveikrt VH (SEQ ID N°: 12) qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssygmswrqapgkglewvsfiepkwrggathyaasvkgrftisrdnskntlylqmnslraedt avyycarglgdyghhhglsgifdywgqgtlvtvss MOR04985 VLK (SEQ ID N0: 13) diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgissnlnwyqqkpgkapklliyaasnlqsgpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfavyycqqysdqs ytfgqgtkveikrt VH (SEQ ID °: 14) qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssygmswvrqapgkglewvsgirakqsgyatdyaapvkgrftisrdnskntlylqmnslraedt avyycarglgdyghhhglsgifdywgqgtlvtvss 2. Conclusión: Los anticuerpos bloqueantes de la función de la integrina a5ß1 solamente han estado disponibles en un formato de anticuerpos quiméricos. Los enfoques de una humanización completa han fracasado. La aplicación de tales anticuerpos en el ensayo clínico puede inducir una respuesta inmune en pacientes humanos. Especialmente para un compuesto anti-angiogénico aplicado crónicamente esto puede conducir a una mayor dosificación o aún a efectos secundarios severos que pueden llevar a una terminación temprana del tratamiento.

Los autores han identificado anticuerpos bloqueantes de la función de la integrina a5ß1 completamente humanos con un excelente perfil biológico. Es ventajoso para los anticuerpos murinos y quiméricos existentes debido a su naturaleza completamente humana que garantizará la ausencia de efectos secundarios en los ensayos clínicos en tanto sea posible. Se espera que la probabilidad de inducir una respuesta inmune contra esta molécula con efectos secundarios severos y de mayores dosis sea mucho menor. Por ello es que estas moléculas son mucho más adecuadas para su aplicación en la medicina humana, por ejemplo para el tratamiento de tumores sólidos.

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Claims (44)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo humano o humanizado, o un fragmento de unión al antigeno del mismo, que se une a la integrina a5ß1 con una afinidad = 100 nM y que inhibe la adhesión de las células que expresan integrina a5ß1 a su receptor in vitro e in vivo.

2. El anticuerpo, o fragmento de la reivindicación 1 , que se une a la integrina a5ß1 afinidad = 10 nM.

3. El anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, de la reivindicación 1 ó 2, que inhibe la adhesión de la línea celular K562 in vitro.

4. El anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende: (a) una región VH seleccionada entre (i) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 1 (MOR04624), SEQ ID N°: 3 (MOR04055) o al menos una región H-CDR1 , H-CDR2 y/o H-CDR3 de una de dichas regiones VH, o (ii) una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de (i) por alteración de al menos una región H-CDR y/o (b) una región VL seleccionada entre (i) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 2 (MOR04624), SEQ ID N°: 4 (MOR04055) o al menos una región L-CDR1 , L-CDR2 y/o L-CDR3 de una de dichas regiones VL o (ii) una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de (i) por alteración de al menos una región L-CDR.

5. El anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, de la reivindicación 4, que comprende una región VH derivada de una región VH de (a) (i) por randomización de la región H-CDR2.

6. El anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, de la reivindicación 4 ó 5, que comprende una región VL derivada de una región VL de (b) (i) por randomización de la región L-CDR3.

7. El anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, que comprende una región VH- y/o VL derivada de una región VH de (a) (i) y/o de una región VL de (b) (i) por entremezclado de las cadenas de anticuerpo.

8. El anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, que comprende (a) una región VH seleccionada entre las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID N°: 5 (MOR04971 ), SEQ ID N°: 7 (MOR04974), SEQ ID N°: 9 (MOR04975), SEQ ID N°: 11 (MOR04977) y SEQ ID NO. 1 1 (MOR04985), o al menos una región H-CDR1 , H-CDR2 y/o H-CDR3 de dichas regiones VH, y/o (b) una región VL seleccionada entre las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID N°: 6 (MOR04971 ), SEQ ID N°: 8 (MOR04974), SEQ ID N°: 10 (MOR04975), SEQ ID N°: 12 (MOR04977) y SEQ ID N°: 14 (MOR04985), o al menos una región L-CDR1 , L-CDR2 y/o L- CDR3 de dichas regiones VL.

9. Un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, que comprende la región VH de la SEQ ID N°: 1 y la región VL de la SEQ ID N°: 2 (MOR04624) o al menos una región H-CDR1 , H-CDR-2, H-CDR3, L-CDR1 , L-CDR2 o L-CDR3 de la misma.

10. Un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, que comprende la región VH de la SEQ ID N°: 3 y la región VL de la SEQ ID N°: 4 (MOR04055) o al menos una región H-CDR1 , H-CDR-2, H-CDR3, L-CDR1 , L-CDR2 o L-CDR3 de la misma.

1 1. Un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, que comprende la región VH de la SEQ ID N°: 5 y la región VL de la SEQ ID N°: 6 (MOR04971 ) o al menos una región H-CDR1 , H-CDR-2, H-CDR3, L-CDR1 , L-CDR2 o L-CDR3 de la misma. 12. Un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, que comprende la región VH de la

SEQ ID N°: 7 y la región VL de la SEQ ID N°: 8 (MOR04974) o al menos una región H-CDR1 , H-CDR-2, H-CDR3, L-CDR1 , L-CDR2 o L-CDR3 de la misma.

13. Un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, que comprende la región VH de la SEQ ID N°: 9 y la región VL de la SEQ ID N°: 10 (MOR04975) o al menos una región H-CDR1 , H- CDR-2, H-CDR3, L-CDR1 , L-CDR2 o L-CDR3 de la misma.

14. Un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, que comprende la región VH de la SEQ ID N°: 1 1 y la región VL de la SEQ ID N°: 12 (MOR04977) o al menos una región H-CDR1 , H-CDR-2, H-CDR3, L-CDR1 , L-CDR2 o L-CDR3 de la misma.

15. Un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, que comprende la región VH de la SEQ ID N°: 13 y la región VL de la SEQ ID N°: 14 (MOR04985) o al menos una región H-CDR1 , H-CDR-2, H-CDR3, L-CDR1 , L-CDR2 o L-CDR3 de la misma.

16. El anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que es un anticuerpo IgG, por ejemplo un anticuerpo lgG1 , lgG2, lgG3 o lgG4 humano o humanizado, o un fragmento del mismo, por ejemplo un fragmento Fab, Fab' o F(ab)2.

17. El anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que es un anticuerpo recombinante, por ejemplo una anticuerpo de cadena simple (se), o un fragmento del mismo, por ejemplo un fragmento se Fv.

18. El anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, de cualquiera de las reivindicaciones 1-17 en la forma de un conjugado con un agente terapéutico.

19. El anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, de la reivindicación 18, en donde el agente terapéutico se selecciona entre agentes radioterapéuticos y agentes quimioterapéuticos.

20. El anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, de la reivindicación 19, en donde el agente radioterapéutico es I125, G31 o Y90.

21. El anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 -17 en la forma de un polipéptido de fusión.

22. El anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, de la reivindicación 21 como un polipéptido de fusión con una citoquina o como un anticuerpo biespecífico.

23. El anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 -17 en la forma de un conjugado con un grupo de marcación detectable.

24. El anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, de la reivindicación 23, en donde el grupo de marcación detectable se selecciona entre grupos de marcación radioactivos, NMR, colorantes, enzimas y fluorescentes.

25. El anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, de la reivindicación 24, en donde el grupo de marcación radioactivo detectable se selecciona entre I125, 1131 o Y90.

26. Una composición farmacéutica que comprende como agente activo un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25.

27. La composición de la reivindicación 26, para la prevención o el tratamiento de trastornos iperproliferativos.

28. La composición de la reivindicación 26 ó 27, para la prevención o el tratamiento de cáncer.

29. La composición de la reivindicación 26 ó 27, para la prevención o el tratamiento de carcinoma de colon.

30. La composición de la reivindicación 26 ó 27, para la prevención o el tratamiento de tumores.

31. Una composición de diagnóstico que comprende como reactivo de diagnóstico un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 -17 o 23-24.

32. La composición de la reivindicación 32, para el diagnóstico de trastornos hiperproliferativos o de una predisposición a los mismos.

33. La composición de la reivindicación 32, para el diagnóstico de cáncer o una predisposición al mismo.

34. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 26 a 33, para su uso en medicina humana.

35. Un ácido nucleico que codifica un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 ó 21 a 22.

36. El ácido nucleico de la reivindicación 35, que está ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión.

37. Un vector, o sistema de vectores, que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 35 ó 37.

38. Una célula que es transformada con el ácido nucleico de la reivindicación 35 ó 36 o con un vector de la reivindicación 37.

39. Un organismo no humano que es transformado con el ácido nucleico de la reivindicación 35 ó 36 o con un vector de la reivindicación 37.

40. Un método para preparar el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 -17 ó 21-22, en donde la célula de la reivindicación 38 o el organismo no humano de la reivindicación 39 se cultiva bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido y se recupera el polipéptido expresado.

41. Uso de un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de trastornos asociados con la integrina a5ß1 , o una predisposición a los mismos.

42. El uso de la reivindicación 41 para elaborar un medicamento para la prevención o el tratamiento de cáncer.

43. Uso de un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 para elaborar un reactivo para el diagnóstico de los trastornos asociados con la integrina a5ß1 o una predisposición a los mismos.

44. El uso de la reivindicación 43 para elaborar un reactivo para el diagnóstico de cáncer.