MX2008014529A

MX2008014529A - Metodo de deteccion para virus de influenza.

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Publication number: MX2008014529A
Application number: MX2008014529A
Authority: MX
Inventors: Nikolay Vladimirovich Bovin; Irina Alexandrovna Lubavina; Robert-Matthias Leiser
Original assignee: Veterinaermedizinische Uni Wie
Priority date: 2006-05-18
Filing date: 2007-05-18
Publication date: 2009-01-28
Also published as: IL195097A0; EA200870542A1; ATE467836T1; AU2007253354A1; WO2007135099A1; CA2652404A1; KR20090031362A; IL195097A; US20100009339A1; EP2018564A1; EA014533B1; DE602007006471D1; JP2009537128A; EP2018564B1; PL2018564T3

Abstract

La presente invención se refiere a un método para la detección rápida de los virus y/o partículas de virus de la influenza que comprenden una hemaglutinina y un componente de neuraminidasa, el método comprende las etapas de: a) aglutinar los virus y/o las partículas del virus a un soporte que contiene al menos un tipo de receptor del carbohidrato seleccionado del grupo que consiste de un oligosacárido natural o sintético, el cual está conjugado a, o situado en la composición con las glicoproetínas semejantes a glicoforina, a1-glicoproteína ácida, a2-macroglobulina, ovomucoide, y combinaciones de los mismos, tal receptor del carbohidrato se aglutina al componente de hemaglutinina de los virus y/o las partículas del virus; b) hacer reaccionar el componente de neuraminidasa de los virus y/o las partículas del virus aglutinados con su substrato de enzima etiquetado, provocando la generación de una señal detectable; y c) detectar la señal generada en la etapa b).

Description

METODO DE DETECCION PARA VIRUS DE INFLUENZA Campo de la Invención La presente invención se refiere a un método de detección rápida de los virus y/o de las partículas del virus de la influenza que comprende una hemaglutinina y un componente de neuraminidasa, el método comprende la aglutinación de los virus y/o las partículas de los virus a un soporte por una molécula de aglutinación específica, que se aglutina al componente de hemaglutinina del virus y/o las partículas del virus y detectar los virus y/o las partículas del virus aglutinados por la reacción del componente de neuraminidasa con su substrato de la enzima conduciendo a una señal detectable. La misma se refiere además a un sistema de detección para la detección rápida de los virus y/o de las partículas de los virus de la influenza empleando el método de acuerdo con la invención y el uso del sistema de detección de acuerdo con la invención. Antecedentes de la Invención Todos los virus de la influenza aviar (AI) son el virus del tipo A en la familia de virus de Orthomyxoviridae y todas las cepas conocidas del virus A de la influenza infectan a las aves. El virus de la influenza de tipo A está subdividido en subtipos basado en las puntas de las proteínas de hemaglutinina (H) y de neuraminidasa (N) desde el núcleo del virus central. Existen 16 tipos H y hasta 9 subtipos N, Ref .197870 que producen un potencial de 144 combinaciones de H y N. La influenza aviar (también conocida como la gripe de las aves, gripe aviar, la gripe del virus A de la influenza, la gripe del tipo A, o la gripe del género A) es una gripa provocada por un tipo de virus de la influenza que es alojado por las aves, pero que puede infectar a varías especies de mamíferos. Una influenza pandémica es una influenza epidémica a gran escala del virus de la influenza, tal como la gripe española de 1918. La Organización Mundial de la Salud (WHO, por sus siglas en inglés) advierte que existe un riesgo substancial de influenza pandémica dentro de algunos pocos años . Uno de los candidatos más fuertes es el subtipo A (H5N1) de la influenza aviar. El H5N1 es un tipo de virus de influenza aviar (virus de gripe de las aves) que ha mutado a través de la separación antígena en docenas de variantes altamente patógenas, pero todas pertenecen actualmente al genotipo Z del virus H5N1 de la influenza aviar. El genotipo Z surgió por medio de la reclasificación en el año 2002 de los genotipos altamente patógenos iniciales de H5N1 que aparecieron primero en China en 1996 en las aves y en Hong Kong en 1997 en los seres humanos. Los virus de H5N1 de las infecciones humanas y los virus aviarios estrechamente relacionados, aislados en 2004 y 2005 pertenecen a un genotipo único, referido frecuentemente a un genotipo Z. Los subtipos de influenza aviar que han sido confirmados en los seres humanos, ordenados por el número de muertes humanas conocidas son: HlNl que provocó la gripe española, H2N2 que provocó la gripe asiática, H3N2 que provocó la gripe de Hong Kong, H5N1, H7N7 , H9N2, H7N2 , H7N3 , H10N7. Para ser capaz de responder rápidamente en el caso de que surja una nueva cepa de influenza mutada y virulenta capaz de la transmisión de ser humano a ser humano, requiere un método de prueba rápido y confiable para determinar si un animal o persona está infectado con el virus. Los métodos de laboratorio actuales para la detección de los virus a partir de las muestras del medio ambiente, de los animales y de los pacientes, son laboriosos y llevan mucho tiempo. US-B-6 , 503 , 745 describe el ciclopentano y compuestos del ciclopentano provistos en compañía del uso de un método para detectar el virus de la influenza. El virus es capturado utilizando una superficie recubierta con fetuina y la detección es efectuada con un compuesto etiquetado que se aglutina a la neuraminidasa . D.E. Noyola et al, reporta en Journal of Clinical Microbiology, 2000, p. 1161-1165, acerca de las perlas recubiertas con fetuina. La fetuina también actúa como un substrato para la neuraminidasa, y la detección es llevada a cabo utilizando la aglutinación. US-A-2003/0129618 describe métodos y composiciones para la detección de los analitos utilizando una fluorescencia que está presente en el material polimérico en respuesta a la aglutinación selectiva de los analitos a los materiales poliméricos. En particular, la presente invención permite la detección fluorescente de las reacciones modificadoras de la membrana y los analitos que tienen una respuesta a tales modificaciones y para la selección de los inhibidores de la acción. Todos los métodos sobre el sitio, rápidos, accesibles y conocidos, están basados en el uso de anticuerpos para los epítopos virales o sobre las pruebas de neuraminidasa simple (NA) . La desventaja principal de los métodos de los anticuerpos basados en la técnica de flujo lateral u otros tipos de ensayo, es la inestabilidad de los reactivos de anticuerpos. Además, la mayoría de los ensayos inmunológicos valiosos hasta ahora muestran una especificidad hacia la influenza A, pero no hacia H5N1. Adicionalmente, el uso de anticuerpos conduce inevitablemente a un incremento de los costos del ensayo. La desventaja principal de las pruebas de NA específicas para los virus de la influenza es el reactivo del substrato costoso necesario utilizado en el estado del arte, que debe ser parcialmente metilado . Breve Descripción de la Invención La presente invención resuelve estos problemas proporcionando un método para la detección rápida de los virus y/o de las partículas del virus de la influenza, un sistema de detección que emplea el método así como el uso de tal sistema de detección como se define en las reivindicaciones . Las siguientes abreviaturas serán utilizadas en la especificación: 3 ' SLN = Neu5Aca2-3Gaipi-4GlcNac HA hemaglutinina; HAR = reacción de hemoaglutinación; LOD = límite de detección; NA = neuraminidasa; TCID = dosis infecciosa de cultivo del tejido; amortiguador de TN = tris-HC1 0.02 M (pH 7.2) con 0.1 M de NaCl . Breve Descripción de las Figuras La figura 1 es un diagrama esquemático de una tira de prueba para una prueba lateral de flujo. La Figura 2 describe un esquema del método de detección de acuerdo con la invención. Descripción Detallada de la Invención De acuerdo con la invención, se emplea un método para la detección rápida del virus y/o de las partículas del virus de la influenza, el método comprende las etapas de: a) aglutinar los virus y/o las partículas del virus a un soporte que contiene la menos un tipo de receptor del carbohidrato seleccionado del grupo que consiste de un oligosacárido natural o sintético, el cual está conjugado a, o situado en la composición con las glicoproteínas semejantes a glicoforina, al-glicoproteina ácida, a2-macroglobulina, ovomucoide, y combinaciones de los mismos a los cuales se aglutina el receptor del carbohidrato con respecto al componente de hemaglutinina de los virus y/o las partículas del virus; b) hacer reaccionar el componente de neuraminidasa de los virus y/o las partículas del virus aglutinados con su substrato de enzima etiquetado, provocando la generación de una señal detectable; y c) detectar la señal generada en la etapa b) . En particular, los virus y las partículas del virus de la influenza que comprenden todos los subtipos de la influenza aviar (AI) conocidos, son detectados. En otra modalidad de la invención, los virus y las partículas del virus de la influenza comprenden un cierto sub-tipo o grupo de subtipos. El método es adecuado para detectar los virus y/o las partículas del virus de la influenza que comprenden una variante altamente patogénica. La invención puede ser efectuada en particular con un soporte que es un papel o membrana cromatográfica . Tales materiales son bien conocidos para la persona experta. De acuerdo con la invención, es posible fijar covalentemente o absorber físicamente el receptor del carbohidrato, como se refirió aquí anteriormente, al soporte.

La invención emplea en particular un receptor del carbohidrato que contiene la porción 2-3Gal. De acuerdo con una modalidad de la invención (método de transferencia de puntos) la aglutinación de los virus y/o las partículas del virus es efectuada por la carga de un virus y/o las partículas del virus que contienen la muestra a un soporte como una mancha. De acuerdo con la invención, la aglutinación de los virus y/o las partículas del virus es efectuada por la infiltración de la muestra que contiene el virus y/o las partículas del virus a lo largo del soporte en la forma de un así llamado método de flujo lateral. En otra modalidad de la invención, un substrato de la enzima etiquetada del componente de neuraminidasa es precipitado sobre el lugar del virus y/o las partículas del virus aglutinadas. En todavía otra modalidad de la presente invención, el substrato de la enzima es etiquetado con un grupo cromogénico y la reacción con una neuraminidasa induce un cambio de color del substrato de la enzima. Como los substratos de enzima pueden ser empleados entre otros, los siguientes derivados cromogénicos del ácido N-acetil neuramínico, en particular el ácido 5-bromo-4-cloro-3 -indolil-a-N-actil neuramínico. Alternativamente, la reacción con la neuraminidasa induce una señal de fluorescencia específica cuando se emplean las moléculas fluorescentes adecuadas como una etiqueta.

El método de la invención puede ser efectuado ventajosamente con un sistema de detección para la detección rápida de los virus y/o las partículas del virus de la influenza de acuerdo con la invención. El sistema comprende un sistema de detección para la detección rápida de los virus de la influenza y/o de las partículas del virus utilizando el método de la invención, el sistema comprende: a) un soporte que contiene al menos un tipo de un receptor del carbohidrato seleccionado del grupo que consiste del oligosacárido natural o sintético, que está conjugado a, o situado en la composición con las glicoproteínas semejantes a la glicoforina, al-glicoproteína ácida, a2-macroglobulina, ovomucoide, y combinaciones de los mismos, tal receptor de carbohidrato se aglutina al componente de hemaglutinina de los virus y/o las partículas del virus; b) un substrato de enzima etiquetada que reacciona con el componente de neuraminidasa, por lo cual se genera una señal detectable . En particular, el soporte está encerrado en un contenedor de plástico con una ventana para leer el resultado de prueba con una muestra y un control positivo. El soporte comprende en particular al menos dos diferentes cantidades de los aglutinantes específicos para la estimación semi-cuantitativa del contenido del virus en la muestra. En otra modalidad, el soporte comprende al menos dos receptores específicos de diferente especificidad del subtipo para la detección simultánea de los virus que pertenecen a diferentes subtipos. El sistema de detección de la invención sirve como un contenedor para la muestra y una unidad de transporte para las pruebas confirmatorias semejantes a la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa después de revelar la presencia del virus y/o las partículas del virus de la especificidad deseada. De acuerdo con la invención, también el uso de un sistema de detección es reivindicado para la detección de los virus de la influenza y/o de las partículas del virus en las muestras de animales y/o seres humanos semejantes a los hisopos, las heces y la sangre en las muestras ambientales y/o como un sistema de advertencia temprana del surgimiento de subtipos del virus altamente patogénicos. La hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA) están presentes sobre la superficie de un virus de la influenza. HA induce la aglutinación del virus a los receptores de las células que contienen sialilo, mientras que NA promueve el acceso del virus a las células objetivo y facilita la liberación del virus de las células infectadas y de los inhibidores naturales [Matrosovich, M.N. , Matrosovich, T. Y., Gray, . , Roberts, N.A. , Klenk, H.D. 2004 : J. Virol . 78 ( 22 ) 12 665 - 7 ] , es decir HA es aglutinante al receptor mientras que NA es destructor del receptor. Una condición importante para una replicación eficiente del virus es la acción concertada de HA y NA, y para las diferentes especies la relación de estas dos actividades es diferente. Los virus de la influenza aislados de las aves exhiben algunas características distintivas. Todos los virus de la influenza aviar poseen HA, que tiene la afinidad más elevada hacia las cadenas de carbohidratos terminadas en Neu5Aca2-3Gal . Además, su actividad de NA es más elevada comparado con los virus de otros orígenes . En el método de detección y el sistema de detección de conformidad con la presente invención, son utilizadas estas propiedades de ambos componentes de los viriones HA y NA, de los virus aviarios. Un virus de la influenza será aglutinado a una molécula de aglutinación específica, preferentemente a una substancia que contenga carbohidratos sialilatados y es unido a una membrana, seguido por la reacción con, preferentemente, la digestión de un substrato de neuraminidasa que provoca el teñido de la zona que contiene el virus sobre la membrana. El método y sistema de detección del virus de la gripe de acuerdo con la presente invención, exhibe una variedad de ventajas comparado con los sistemas de prueba del estado del arte: utilizando dos componentes, HA y NA, se incrementa la especificidad del ensayo y permite la construcción de sistemas de detección con las especificidades elegidas. Al mismo tiempo y en contraste con los sistemas de detección basados en los métodos inmunológicos , no existe la necesidad de una enzima marcadora adicional para revelar la detección positiva, a causa de que la propia neuraminidasa viral es utilizada para este propósito. Las diferentes variantes de los tipos elegidos de principio a fin de las moléculas receptoras de carbohidratos colectarán todos los virus de la influenza independientemente del tipo y subtipo, y son capaces de la detección especifica simultánea de las variantes altamente patogénicas semejantes a H5N1. El resultado del método de detección de acuerdo con la invención puede ser obtenido sin el uso de algún dispositivo sofisticado. El método de acuerdo con la invención permite la detección de los virus de la influenza dentro del transcurso de 0.1 hasta 2 horas. La invención será explicada además por medio de los siguientes ejemplos no limitativos. E emplos Ejemplo 1: Síntesis de un conjugado de poliacrilamida del trisácarido ' SLN para la preparación de la molécula receptora carbohidrato específico Una solución de 1.7 mg (10 µp???) del ácido poliacrílico completamente activado con la N-hidroxisuccinimida, PM -1000 kDa, en 200 µ? de DMSO, y 4 µ? de diisopropiletilamina fueron agregados a una solución de 1 . 46 mg ( 2 µp???) de 3 ' SLN-0 (CH2 ) 3NH2 en 200 µ? de DMSO, la mezcla se mantiene a 37 aC durante 48 h, se agregan 40 µ? de una solución de amoniaco acuoso al 25 % o 40 µ? de etanolamina y la solución se mantiene durante 18 h a temperatura ambiente seguido por la cromatografía de permeacion en un gel sobre sefarosa LH, rendimiento ~ 90 % . Ejemplo 2 : Detección de los virus de la influenza en el fluido alantoico por el uso del método y sistema de prueba de acuerdo con la invención Ejemplo-Kit : 1 . Tira de prueba 2 . Amortiguador de la sonda Amortiguador # 1 3 . Amortiguador contrastante Amortiguador # 2 4 . Amortiguador de lavado A Amortiguador # 3 5 . Amortiguador de lavado B Amortiguador # 4 6. Amortiguador de teñido Amortiguador # 5 7 . Tira doble ( 2 hileras con 8 cavidades) o placa de 96 cavidades 8 . Tijeras o escalpelos 9. Pinzas 10 . Placa para el lavado de la tira 11. Viales de desarrollo 12. Termostato (o su substituto) 13. Cámara para el procedimiento de cromatografía (o una tapa, que es utilizada para cubrir la placa de 96 cavidades con tiras) . Materiales Tiras: almohadilla de muestreo, absorbente, con nitrocelulosa, obtenida de Whatman, EUA. 1. El reactivo específico (fetuina, Sigma) se aisló de huevos frescos de pollo. 2. Amortiguador # 1: Tris-HCl 0.02 M (pH 7.2) con 3 M de NaCl y 0.5 % de Tween-20 3. Amortiguador # 2: Tris-HCl 0.02 M (pH 7.2) con 0.3 M de NaCl y 0.5 % de Tween-20 4. Amortiguador # 3: Tris-HCl 0.02 M (pH 7.2) con 0.1 M de NaCl y 0.05 % de Tween-20 5. Amortiguador # 4: Tris-HCl 0.02 M (pH 7.2) con 0.1 M de NaCl (amortiguador de TN) 6. Amortiguador # 5 : Solución 4 mM de Neu-X en el amortiguador de TN con CaCl2 0.01 M El amortiguador de TN puede ser substituido con otro amortiguador de ajuste, por ejemplo una solución salina o una solución salina amortiguada con fosfato. La tira (figura 1) está dividida en tres zonas: las zonas de infiltración, detección y absorción. Una línea de la molécula receptora de carbohidrato (línea de prueba) así como una línea de control, están localizadas en la zona de detección. Las tiras son ensambladas a partir de la membrana, y las almohadillas absorbentes y de muestreo. La molécula receptora del carbohidrato ( 1 microlitro de 1 mg/ml de la solución) se carga sobre la zona de detección, después que la tira es secada y lavada. Luego la tira es almacenada en un recipiente cerrado herméticamente a 18 -25 aC . Detección 1 . Preparación de la muestra. 1 /10 parte (v/v) del amortiguador # 1 es agregada a la sonda directamente antes del análisis y se agita bien. Ésta es la sonda número 1 (P #1 ) . 2. El procedimiento de detección involucra varias etapas (Figura 2 ) En la primera etapa, la almohadilla de muestreo de la tira es colocada en 80- 100 µ? de P #1 . Durante la acción de las fuerzas de capilaridad el líquido de la muestra es infiltrado y se introduce a la sonda de absorción a través de la zona de detección en donde las partículas del virus se aglutinan a la molécula receptora del carbohidrato. La duración de este procedimiento depende de la viscosidad de la muestra, pero no debe exceder 15 minutos. El amortiguador #2 es agregado a la misma cavidad de la placa (alternativamente es posible transferir la tira a otra cavidad rellena con el amortiguador #2 ) . Después de 10 minutos, la tira es retirada de la cavidad. En la segunda etapa, la parte de infiltración de la tira es cortada (con tijeras) . Después de la remoción cuidadosa (por ejemplo con la ayuda de pinzas) de la zona absorbente de la parte de la tira, la zona de prueba es lavada con el amortiguador #3 y luego con el amortiguador #4 . Subsiguientemente la zona absorbente también es cortada. En la tercera etapa, el resto de la zona de prueba es colocada en el recipiente con el amortiguador #5. El recipiente es cerrado herméticamente, y se deja que repose en la oscuridad a 37 -40 SC. La presencia de un virus de influenza en la muestra es detectada como un tinte azul oscuro de la zona de la molécula receptora del carbohidrato. La duración de esta etapa depende de la concentración del virus de la muestra y puede tomar desde 20 minutos hasta 60 minutos antes que un virus pueda ser detectado por la reacción de hemoaglutinación (titulación con HAR de aproximadamente 2 ) . Como una regla, estas muestras tienen un valor de TCID/ml de aproximadamente 105 . Para las sondas con 10 y 100 veces menos contenido del virus ( 10 -103 TCID/ml), el tinte puede aparecer después de varias horas. Después de este procedimiento la tira es retirada de la solución seguido por la evaluación visual del resultado de la reacción . La linea de control de la neuraminidasa en la zona de detección es utilizada para la evaluación de la funcionalidad del ensayo. El teñido azul oscuro de la zona de control debe llevarse a cabo. Los resultados son interpretados de la siguiente manera: 1) Si una línea teñida uniformemente es observada, la misma se considera positiva, es decir sonda contiene el virus; la intensidad del color debe ser comparable con la intensidad de la línea de control. 2) Si una línea teñida débilmente es observada, la muestra contiene el virus en una concentración que es insuficiente para la detección no ambigua, y la exposición de la tira en el amortiguador #5 debe ser prolongada toda la noche o la prueba puede ser repetida una vez más . 3) La ausencia de la línea coloreada significa que no existen virus en la muestra o su concentración es menor que el nivel de detección mínimo. 4) La ausencia de la línea coloreada en la línea de control positivo ya sea significa que el experimento fue efectuado incorrectamente o que la NA en la línea de control ha sido destruida; en este caso se recomienda volver a probar el espécimen utilizando un nuevo kit de prueba.

Los datos sobre la sensibilidad de prueba se proporcionan en la Figura 1 . Ej emplo 3 : Detección de los virus de inf luenza en las heces de pollo utili zando el sistema de detección de acuerdo con la invención En este ej emplo se uti li zaron los mismos métodos y materiales que en el ej emplo 2 . 1 . Las diluciones en serie de las sondas que contienen el virus en suspensión de las heces de pollo sanas ( 2 g de la substancia seca por 10 mi del amortiguador ) fueron efectuadas . Se ha demostrado que las heces no afectan la sensibilidad y especi ficidad de la detección del virus de la inf luenza con la prueba . 2. A las heces de pollo frescas se agrega 1/10 partes (v/v) del virus A/duck/Alberta/76 (titulación por HAR 1 : 10) y la mezcla se homogeneiza . Después de la adición del amortiguador #2 al homogenc.to (1 : 1 v/v) , se toma una alícuota de la suspensión resultante para su so en el ensayo . El teñido azul oscuro en la zona de prueba apareció después de 2 h. Ninguna influencia notable sobre los resultados de prueba fue observada cuando las heces de pollo se agregaron a las muestras de la tabla 1 antes del inicio del procedimiento de prueba. Ej emplo 4 : Detección de los virus de inf luenza en el tej ido del pulmón de los pollos muertos utili zando el sistema de detección de acuerdo con la invención En este ejemplo se utilizaron los mismos métodos y materiales que en el ejemplo 2. El tejido del pulmón de los pollos que murieron de la infección con el virus H5N1 de la influenza ha sido extraído con el amortiguador silin analizado (colectado: Crimea/enero 2006) . Se podría mostrar que el virus de la influenza puede ser detectado confiablemente en el pulmón del cuerpo del pollo analizado. Tabla 1: Límite de detección (LOD) de los virus de influenza aviar en las muestras que contienen el virus cuando son sondeadas con el sistema de prueba de acuerdo con la invención.

LOD durante 2h No. Virus TCID/ml Titulación de HAR-muestri 1 A/duck/Alberta/35/76 (H1N1) 105 4 2 A/duck/France/146/82 (H1N1) 2 x 10" 10" 3 A/pintail/Primorie/695/76 (H2N3) 2 x 10' 10 4 A/gull/Astrakhan/165/86 (H6N5) 10J lO" 5 A/FPV/Rostock/34 (H7N1) 104 1 6 A/mallard/NT/12/02 (H7N3) 5 10" 5 10"' 7 A/mallard/Primorie/3/82 (H9N2) 10" 10"' 8 A/Hongkong/1073/99 (H9N2) 10* 1 9 A/mallard/Guriev/244/82 (H14N6) 5 x 10° 10" 10 A/mallard/PA/10218 (H5N2) No determinada 10" 1 1 A/duck/Postdam/1402/6/86 (H5N2) 5 x 10' 5 x 10"' 12 A/NIBRG-14 (H5Nl)a 5 x 10J 5 13 A/chiken/Kurgan/5/2005 (H5N1) 104 < 1 2 pasadas en MDCK 14 A/duck/Kurgan/8/2005 (H5N1) 10° lO"' 2 pasadas en MDCK a - Esta es la cepa de la vacuna, que tiene los genes de HA y NA a partir del virus patógeno de A/Vietnam/1194/04 y todos los genes de la proteína interna de A/Puerto Rico/2/34. Los virus fueron obtenidos del Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitis (En la región de Moscú) y el Institute of Influenza (En San Petesburgo) . Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método de detección rápida de los virus y /o partículas del virus de la influenza que comprende una hemaglutinina y un componente de neuraminidasa, caracterizado porque comprende las etapas de: a) aglutinar los virus y/o las partículas del virus a un soporte que contiene al menos un tipo de receptor del carbohidrato seleccionado del grupo que consiste de un oligosacárido natural o sintético, el cual está conjugado a, o situado en la composición con las glicoproteínas semejantes a glicoforina, al-glicoproteína ácida, a2-macroglobulina, ovomucoide, y combinaciones de los mismos, tal receptor del carbohidrato se aglutina al componente de hemaglutinina de los virus y/o las partículas del virus; b) hacer reaccionar el componente de neuraminidasa de los virus aglutinados y/o las partículas del virus con su substrato de enzima etiquetado, provocando la generación de una señal detectable; y c) detectar la señal generada en la etapa b) .
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los virus y/o las partículas de los virus de la influenza comprenden todos los subtipos de la influenza aviar (AI) conocidos.
3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque los virus y/o las partículas de los virus de la influenza comprenden un cierto subtipo o un grupo de subtipos .
4. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque los virus y/o las partículas de los virus de la influenza comprenden una variante altamente patogéna .
5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el soporte es una membrana o papel cromatográfico .
6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el receptor del carbohidrato está fijado covalentemente o adsorbido físicamente con respecto al soporte.
7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el receptor del carbohidrato contiene la porción de alfa2-3Gal.
8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la aglutinación de los virus y/o las partículas de los virus es efectuada por la carga de una muestra que contienen el virus y/o las partículas del virus al soporte como una mancha (método de transferencia de puntos) .
9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la aglutinación de los virus y/o las partículas de los virus es efectuada por la infiltración de una muestra que contiene el virus y/o las partículas del virus a lo largo del soporte (método de flujo lateral) .
10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el substrato de enzima etiquetada del componente de neuraminidasa es precipitado sobre el lugar de los virus y/o las partículas de los virus aglutinados.
11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el substrato de enzima es etiquetado con un grupo cromogénico y la reacción con la neuraminidasa induce un cambio de color del substrajo de enzima.
12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el substrato de enzima es un derivado cromogénico del ácido N-acetilneuramínico, en particular el ácido 5-bromo-4-cloro- -indol-a-N-acetilneuramínico .
13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la reacción con la neuraminidasa induce una señal de fluorescencia específica.
14. Un sistema de detección para la detección rápida de los virus y/o partículas de los virus de la influenza utilizando un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque comprende: a) un soporte que contiene al menos un tipo de un receptor de carbohidrato seleccionado del grupo que consiste del oligosacárido natural o sintético, que está conjugado a, o situado en la composición con las glicoproteínas semejantes a la glicoforina, al-glicoproteína ácida, a2-macroglobulina, ovomucoide, y combinaciones de las mismas, tal receptor de carbohidrato se aglutina al componente de hemaglutinina de los virus y/o las partículas del virus; b) un substrato de enzima etiquetado que reacciona con el componente de neuraminidasa, por lo cual se genera una señal detectable.
15. El sistema de detección de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el soporte está encerrado en un sujetador de plástico con una ventana para la lectura de los resultados de prueba con una muestra y un control positivo.
16. El sistema de detección de conformidad con las reivindicaciones 14 y/o 15, caracterizado porque el soporte comprende al menos dos diferentes cantidades de los aglutinantes específicos para una estimación semi-cuantitativa del contenido del virus en la muestra.
17. El sistema de detección de conformidad con las reivindicaciones 14 y/o 16, caracterizado porque el soporte comprende al menos dos receptores específicos de diferente especificidad del subtipo para una detección simultánea de los virus que pertenecen a diferentes subtipos.
18. El sistema de detección de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16-17, caracterizado porque después que revela la presencia del virus y/o las partículas del virus de la especificidad deseada, sirve como el recipiente de la muestra y la unidad de transporte para las pruebas confirmatorias semejantes a la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa.
19. El uso de un sistema de detección de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18 para la detección de los virus y/o partículas de los virus de la influenza en las muestras de animales y/o seres humanos semejantes a los hisopos, heces y sangre, en las muestras ambientales y/o como un sistema de calentamiento inicial de los subtipos del virus altamente patógenos.