COMPOSICION Y METODO PARA LA LIBERACION DE PEPTIDOS PROTEGIDOS DE UNA RESINA ANTECEDENTES DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con la síntesis de péptidos y, en particular, con la síntesis de péptidos en fase sólida, ó una combinación de síntesis de péptidos en fase sólida y líquida. Se describen muchos métodos para la síntesis de péptidos en la bibliografía (por ejemplo, vea U.S. Pat. N° 6,015,881; Mergler y otros, (1988) Tetrahedron Letters 29: 4005-4008; Mergler y otros, (1988) Tetrahedron Letters 29: 4009-4012; Kamber y otros, (eds), Peptides, Chemistry and Biology, ESCOM, Leiden (1992) 525-526; Riniker y otros, (1993) Tetrahedron Letters 49: 11065-11133; y Andersson y otros, (2000) Biopolymers 55: 227-250). En la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS, por sus siglas en inglés), un grupo aminoácido ó péptido está unido a una resina de soporte sólido. Sucesivos aminoácidos se adhieren al péptido unido al soporte hasta que se forma el péptido de interés. Después que se forma el péptido deseado, se separa de la resina. Esto requiere separar la unión entre el péptido y la resina y posteriormente recuperar el péptido separado usando una técnica de recuperación adecuada. Los aminoácidos a partir de los cuales se sintetizan los péptidos tienden a tener grupos laterales reactivos al igual que extremos terminales reactivos. Cuando
Ref. 196301 se sintetiza un péptido, es importante que el grupo amino en un péptido reaccione con el grupo carboxilo en otro péptido. Las reacciones indeseables de grupos laterales ó en el extremo terminal equivocado de un reactivo producen subproductos indeseables. Para reducir al mínimo las reacciones laterales, es práctica común bloquear los grupos laterales y los extremos terminales de los reactivos para garantizar que tenga lugar la reacción deseada. Por ejemplo, un esquema de síntesis en fase sólida típico involucra la unión de un primer aminoácido a la resina de soporte a través de la mitad carboxilo del primer aminoácido (aunque algunos esquemas de síntesis unen el primer aminoácido a través del grupo amino) . Esto permite que el grupo amino del aminoácido unido a la resina se acople con otro aminoácido. Por consiguiente, la mitad carboxilo de un aminoácido nuevo reacciona con el grupo amino libre del material unido a la resina. Para evitar reacciones laterales que involucren al grupo amino del aminoácido nuevo, se bloquea dicho grupo amino con un grupo protector durante la reacción de acoplamiento. Dos grupos protectores de amino bien conocidos son el grupo ter-but iloxicarbonilo (BOC) y el grupo 9-fluoroenilmetil carbamato (FMOC) . También se han descrito muchos otros en la bibliografía. Después del acoplamiento, se puede eliminar el grupo protector (generalmente BOC ó FMOC) en el N-terminal del péptido unido a la resina, permitiendo la unión de aminoácidos adicionales a la cadena en crecimiento de manera similar. Los grupos reactivos de las cadenas laterales de los aminoácidos reactivos y el péptido unido a la resina también se pueden bloquear con grupos protectores de cadenas laterales y permanecer bloqueados durante toda la síntesis. Después de la síntesis, se pueden eliminar algunos ó todos los grupos protectores de cadenas laterales del producto de péptido. Cuando se eliminan prácticamente todos los grupos protectores, esto se denomina desprotección global. La desprotección global se puede producir simultáneamente con la separación ó llevarse a cabo más tarde si el péptido se va a procesar adicionalmente , modificar, acoplar a otros péptidos u otro material, etc. Algunos reactivos de separación no sólo separan el péptido de la resina, sino que también causan que la desprotección global tenga lugar al mismo tiempo. Por ejemplo, los reactivos de separación fuertemente ácidos asociados con el tipo de reacción química de BOC tienden a causar la desprotección global en el momento de la separación. Sin embargo, usar la estrategia de FMOC, permite la separación del péptido de la resina permitiendo al mismo tiempo que permanezcan los grupos protectores de cadenas laterales de modo que puedan tener lugar otras reacciones, como la condensación de fragmentos, sin una interferencia importante de los grupos de las cadenas laterales. De este modo, el péptido se separa en estado protegido . Habitualmente , el rendimiento de un péptido sintetizado por síntesis de péptidos en fase sólida disminuye a medida que aumenta la longitud de la cadena peptídica, es decir, cuanto más larga es la cadena del péptido, más probable es que se produzcan productos secundarios indeseables junto con el péptido deseado. Por consiguiente, para péptidos particularmente largos, el producto de péptido final se produce en fragmentos, los que luego se combinan para formar el producto de péptido deseado. Por ejemplo, un péptido hipotético de 75 aminoácidos se puede sintetizar en tres fragmentos peptídicos, cada fragmento sintetizado por separado mediante síntesis de péptidos en fase sólida. Los fragmentos que constan de 1 a 25 aminoácidos, 26 a 50 aminoácidos y 51 a 75 aminoácidos se pueden sintetizar por separado, y después combinar en el paso de condensación de fragmentos para formar el producto de péptido final completo de 75 aminoácidos. Los métodos de la técnica anterior de separación de un péptido del soporte de resina en un estado protegido originan habitualmente subproductos que tienen ácidos carboxí lieos . Los ácidos carboxílicos interferirán con la reacción posterior de condensación de fragmentos, originando subproductos indeseables. Los métodos de la técnica anteriores resolvieron este problema por la inclusión de un paso adicional a continuación de la separación para eliminar los ácidos carboxilicos indeseables, generalmente por evaporación de la solución de separación. Este paso extra y los disolventes necesarios consumen más tiempo, aumentan el costo y producen desechos que se deben eliminar, originando un gasto adicional. Por consiguiente, existe la necesidad de un método de separación de un péptido de una resina que sea más fácil, barato y eficaz por evasión de la producción de subproductos con ácidos carboxilicos indeseables y, de ese modo, evitando los pasos posteriores que eliminan los ácidos carboxilicos . BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención proporciona una composición y un método para separar un péptido de una resina de soporte sólida. Se usa ácido clorhídrico en un solvente orgánico miscible con agua para separar la unión péptido-resina . Opcionalmente , se puede agregar trifluoroetanol ó hexafluoroisopropanol a la composición de separación para mejorar los resultados. Cuando se usa la composición de separación de la presente, no es necesario un paso de evaporación u otro paso para eliminar los subproductos carboxilicos a continuación de la reacción de separación. Después que la resina se filtra fuera de la mezcla de separación, el péptido se puede precipitar inmediatamente con agua . DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención proporciona una composición y un método para separar un péptido de una resina de soporte sólida que dispensa de la necesidad de un paso subsiguiente para eliminar los ácidos carboxilicos de la mezcla de separación antes de la condensación de fragmentos de péptidos, como se requiere cuando se usan las composiciones y métodos de la técnica anteriores. La presente invención puede proporcionar un menor tiempo de procesamiento, aumentos del rendimiento y la pureza, menores cantidades de reactivos, materiales de partida, solventes, desechos, asi como otras mejoras en relación con la síntesis de péptidos tanto a pequeña como a gran escala. Los péptidos producidos de acuerdo con la presente invención se pueden sintetizar por métodos bien conocidos en la técnica y la presente invención no se limita a ningún método de síntesis en particular. Se puede producir cualquier péptido según la presente invención. Una ventaja de la estrategia de síntesis con FMOC es que el péptido sintetizado se puede separar de la resina de soporte sólida en un estado casi totalmente protegido, es decir, los grupos protectores de cadenas laterales permanecen en el péptido. Esto se debe a la unión sensible a los ácidos del péptido a la resina en comparación con la unión relativamente fuerte de los grupos protectores de cadenas laterales, la cual requiere un ácido más fuerte para eliminarlos del péptido. Por consiguiente, se puede usar una concentración relativamente baja del ácido para separar el péptido de la resina, permitiendo al mismo tiempo que permanezcan los grupos protectores de cadenas laterales, ya que la solución de ácido no es suficientemente fuerte para separar estos grupos. Habitualmente, se utiliza la resina cloruro de 2-clorotrit ilo para facilitar estas ventajas, puesto que la unión entre la resina cloruro de 2-clorotritilo y el péptido es relativamente sensible a los ácidos. No obstante, se pueden usar otras resinas. Aunque la presente invención se describe en conexión con la estrategia de síntesis de péptidos con FMOC, se pueden emplear otras estrategias y sistemas de síntesis de péptidos en fase sólida en combinación con la presente invención. La estrategia con FMOC es simplemente la manera preferida de sintetizar los péptidos a gran escala. Habitualmente, antes de la presente invención, cuando el péptido deseado se sintetizaba en una resina de soporte sólida, el péptido se separaba de la resina usando una solución de ácido acético (AcOH) ó ácido trifluoroacét ico (TFA) en un solvente como diclorometano (DCM) . Sin embargo, el uso de AcOH ó TFA para separar el péptido produce ácidos carboxílicos como subproductos en la mezcla de separación. Si no se eliminan, estos ácidos carboxílicos interferirán con las reacciones subsiguientes, como las reacciones de condensación de fragmentos, donde se combinan dos ó más fragmentos de péptidos. Por consiguiente, es necesario un paso adicional en el procedimiento de síntesis para eliminar los ácidos carboxílieos . Esto se realiza generalmente mediante la evaporación de la mezcla de separación seguida por la reconstitución. Este paso adicional requiere más tiempo, solventes, desechos, aumenta el gasto y puede disminuir los rendimientos y la pureza. Es más, los ácidos carboxí lieos no se pueden eliminar completamente. Por consiguiente, siempre habrá pequeñas cantidades de residuos presentes, que pueden disminuir la pureza del producto de péptido final. La presente invención prácticamente elimina la producción de los ácidos carboxílicos subproductos y el paso costoso y lento de la eliminación de dichos ácidos carboxílicos que es requerido en los métodos de la técnica anteriores mediante la utilización de un reactivo y método de separación nuevo. En una modalidad, el reactivo de separación es una concentración relativamente baja de ácido clorhídrico (HC1) en un solvente orgánico miscible con agua. Los ejemplos de solventes orgánicos miscibles con agua son dimetilformamida (DMF), N-metilpirrolidona (N P) , dimetilacetamida (DMA) , dimetilsulfóxido (DMSO) , tetrahidrofurano (THF) y dioxano. No obstante, muchos otros solventes orgánicos miscibles con agua son conocidos en el técnica. Un gran rango de concentraciones de HCl separará eficazmente un péptido de la resina y todas están dentro del alcance de la presente invención. Sin embargo, los mejores resultados se lograron con un rango particular, preferentemente entre aproximadamente 0.05 N y aproximadamente 0.5 N de HCl, más preferentemente de aproximadamente 0.1 N de HCl. En otra modalidad de la presente invención, el reactivo de separación de la invención comprende además un alcohol fluorizado incluido pero no exclusivamente el trifluoroetanol (TFE) ó el hexafluoroisopropanol (HFIP) . El alcohol fluorizado está preferentemente en el rango de aproximadamente 1% a aproximadamente 12%, más preferentemente de aproximadamente 5% a aproximadamente 10% y muy preferentemente es de aproximadamente 10% del reactivo de separación. Los inventores encontraron que entre aproximadamente 2 mi y 22 mi de reactivo por gramo de resina, preferentemente entre aproximadamente 4 mi y 10 mi de reactivo por gramo de resina y más preferentemente entre aproximadamente 4 mi y 6 mi de reactivo por gramo de resina son adecuados para separar el péptido de la resina. Sin embargo, otras cantidades del reactivo de separación probablemente separarán eficazmente el péptido de la resina. Según se discutió antes, puesto que prácticamente no se produce ningún ácido carboxilico como subproducto cuando se separa un péptido usando el reactivo y el método de separación de la presente invención, no es necesario un paso de evaporación para eliminar los ácidos carboxilicos subproductos. Por consiguiente, se pueden formar varios fragmentos de péptidos intermedios usando la presente invención y después combinarlos en un paso de condensación de fragmentos. Una modalidad de la presente invención se caracteriza por la ausencia de un paso de evaporación a continuación de la separación. Después de la separación, la mezcla de separación se puede filtrar para eliminar la resina y opcionalmente se puede lavar con solvente. El filtrado obtenido de este modo simplemente se trata con agua para precipitar el fragmento de péptido, el cual después se puede filtrar y opcionalmente lavar con agua. Preferentemente se usa agua fría para precipitar el péptido, preferentemente en el rango de temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 25°C, muy preferentemente a aproximadamente 0°C. Sin embargo, temperaturas mayores del agua también precipitarán eficazmente el péptido del filtrado de separación. Los inventores encontraron que al menos aproximadamente 4 mi de agua por gramo de resina-péptido precipitarán eficazmente el péptido separado, aunque probablemente también lo harán otras cantidades.
Ejemplo : El ejemplo siguiente describe brevemente la síntesis de un péptido utilizando la presente invención. Aunque el ejemplo describe la síntesis de enfuvirtida, los principios descritos se pueden aplicar a cualquier péptido, preferentemente cualquier péptido protegido que se sintetice en un soporte lábil frente ácido como la resina cloruro de clorotritilo (CTC, por sus siglas en inglés), una resina Sieber ó una resina Rink. Los ejemplos no limitantes de dichos péptidos incluyen pramlintida, exenatida, enfuvirtida, calcitonina y PYY-3-36. El ejemplo siguiente es simplemente un método preferido de preparación de enfuvirtida y no pretende limitar de ninguna manera la presente invención. Carga de FMOC-aminoácido en la resina CTC: 1. Método general Se agregó una solución de FMOC-aminoácido (0.8 a 1.5 mols eq.) en DCM ó DMF + DCM (4:1) que contenía DIEA (1 a 1.7 mols eq. ) a la resina CTC hinchada previamente (1 mol eq.) y se agitó durante 2 horas bajo corriente de nitrógeno. Se drenó y se agitó con mezcla de MeOH + DIEA (9:1) durante 20 a 30 minutos para destruir el exceso de cloruro activo de la resina. La resina se filtró, se lavó con DMF (1 x 3 min) , DCM (1 x 3 min), IPA (2 x 3 min) y se secó hasta un peso constante. La densidad de sustitución del aminoácido cargado se determinó por el método del aumento de peso y el método de análisis de DBU . 2. Síntesis del fragmento 1: AC-AA (1-16) -CTR La síntesis se realizó manualmente en un reactor de 250 mi comenzando con 17.5 g de FMOC-Gln-CTR (sust. = 0.60 mm/g) y usando la SPPS basada en FMOC . El grupo FMOC se eliminó con piperidina en NMP al 20% (2 x 20 min.) y el acoplamiento de todos los FMOC-aminoácidos se realizó por el método de HBTU/HOBT en presencia de DIEA (1.5 eq. cada uno) en NMP + DCM (3:1) salvo para FMOC-Gln (Trt) en la posición 15, que se llevó a cabo utilizando 2.5 mols equivalentes de los reactivos. Todos los aminoácidos se incorporaron mediante un único acoplamiento salvo Asn (trt) 14, Gln (trt) 13 y Ser (tBu) 12 donde fue requerido un doble acoplamiento. Después de la eliminación del grupo FMOC del último aminoácido, la resina se trató con 5 mols equivalentes de anhídrido acético y piridina en NMP durante una hora para incorporar el grupo acetilo en el N-terminal. El rendimiento de resina-péptido totalmente protegido fue de 34.9 g (72.8%) en comparación con un rendimiento teórico de 48 g. Según la HPLC, la pureza del péptido fue > 89.1% (a 262 nm) . 3. Síntesis del fragmento 2: FMOC-AA ( 17-26) -CTR La síntesis se comenzó con 25 g de FMOC-Leu-CTR
(sust. = 0.8 mm/g) usando el método de acoplamiento de HBTU/HOBT (1.5 mols eq.) . Todos los aminoácidos (1.5 mols eq.) se incorporaron mediante un único acoplamiento usando NMP + DCM (3:1) como solvente de acoplamiento y DIEA (1.5 mols eq.) como base. La finalización del acoplamiento se monitoreó mediante la prueba de Kaiser. La eliminación del grupo FMOC se llevó a cabo con piperidina en DMC al 20% (2 x 20 min) . El rendimiento de resina-pépt ido protegido fue de 58.7g (93.4%) en comparación con un rendimiento teórico de 62.9 g. Según la HPLC, la pureza del péptido fue > 97.1% (a 262 nm) . 4. Síntesis del fragmento 3: FMOC-AA (27-35) -CTR La síntesis se comenzó con 37.5 g de FMOC-Trp
(BOC)-CTR (sust. = 0.7 mm/g) usando el método de acoplamiento de HBTU/HOBT en NMP + DCM (3:1) como solvente. Todos los aminoácidos se acoplaron mediante un único acoplamiento excepto el último aminoácido FMOC-Asp (otBu) que se acopló dos veces (2 x 2 horas) seguido por acetilación. Se usó un exceso de 1.5 veces de aminoácidos y reactivos para el acoplamiento y la finalización del acoplamiento se monitoreó por el método de Kaiser. El rendimiento de resina-pépt ido fue de 73 g (89.3%) en comparación con un rendimiento teórico de 81.8 g. Según la HPLC, la pureza del péptido fue > 80.65% (a 220 nm) . 5. Separación de los fragmentos protegidos del soporte a. Separación del fragmento 1: Ac-AA ( 1-16 ) -OH Se agitaron 10.0 g (2 mm) de Ac-AA ( 1-16 ) -CTR con 100 mi de HC1 0.1 N en DMF durante 4.5 horas a temperatura ambiente, se filtró y a continuación se lavó con DMF. Se agregó el filtrado combinado a agua en agitación a 0°C y el sólido precipitado se filtró, a continuación se lavó y se secó para producir 5.62 g (78.5%) del péptido protegido, en comparación con un rendimiento teórico de 7.2 g. Según la HPLC, la pureza fue > 85.64% (sistema de IPA) . Cuando la unión resina-pépt ido se cortó con HC1 0.1 N en DMF que contenia TFE al 10%, el rendimiento del péptido protegido fue de 92% con una pureza por HPLC > 96.86% (sistema de IPA) . b. Separación del fragmento 2: FMOC-AA (17-26) -OH Se agitó una muestra de resina-péptido protegido (5 g, 1.7 mm) con 50 mi de HC1 0.1 N en DMF durante 4.5 horas, se filtró y a continuación se lavó con DMF. El filtrado se agregó a agua en agitación a 0°C y el sólido precipitado se filtró, se lavó con agua y se secó para producir 2.9 g (74.2%) del péptido protegido. Según la HPLC, la pureza del péptido fue > 90.1% (sistema de ACN) y > 81% (sistema de IPA) . Cuando la separación de la unión resina-péptido se realizó con HC1 0.1 N en DMF que contenia TFE al 10%, el rendimiento del péptido fue de 91.6% y la pureza por HPLC fue > 96.66% (sistema de IPA) . c. Separación del fragmento 3: FMOC-AA ( 27-35 ) -OH Se agitó una muestra de 2.5 g (0.8 mm) de resina-péptido con 25 mi de HC1 0.1 N en DMF que incluía TFE al 10% a temperatura ambiente durante 4.5 horas y se filtró. El filtrado se agregó a agua en agitación a 0°C y el sólido obtenido se recogió por filtración seguida de lavado con agua. Después de secar durante toda la noche rindió 72.4% (1.28 g) del péptido deseado con una pureza por HPLC de 84%. Cuando la separación de la unión resina-péptido se hizo con HC1 0.1 N en D F que contenia TFE al 5%, el rendimiento del péptido protegido fue de 67.9 g (1.2 g) y la pureza fue de 88.2%. 6. Síntesis de enfuvirtida protegida mediante condensación de fragmentos en solución a. Acoplamiento del fragmento 3 con Phe-NH2 dentro de FMOC-AA (27-36) -NH2 Se agitó una mezcla de fragmento 3 (2.62 g, 1 eq.), Phe-NH2 (0.24 g, 1.2 eq. ) y HOAT (0.2 g, 1.2 eq.) con 30 mi de DMF en presencia de DIEA (0.43 mi; 2.1 eq. ) y la solución de trató con HBTU (0.55 g, 1.2 eq.) a 0°C durante 15 a 20 minutos y después a temperatura ambiente durante 70 a 80 minutos. El progreso de la reacción se monitoreó por TLC (CM-10) y HPLC. La mezcla de reacción se enfrió a 0°C y se trató con 20 a 30 mi de agua, el sólido incoloro separado se filtró, a continuación se lavó con agua y se secó para rendir 2.76 g (98.6%) de FMOC-AA (27-36) -NH2. Según la HPLC, la pureza del péptido fue > 88.15%. El experimento se repitió varias veces y los rendimientos obtenidos variaron entre 97% y 100% con una pureza entre 82.6% y 88.2%. b. Desprotección de FMOC-AA (27-36) -NH2 dentro de H-AA(27-36) -NH2 fragmento 4 Se agitó una solución de FMOC-AA (27-36) -NH2 (1.16 g, 0.5 mm) en 5 mi de piperidina en DMA al 5% durante 2 horas a temperatura ambiente y después se diluyó con agitación con 15 mi de agua a 0°C. El sólido incoloro separado se filtró, a continuación se lavó con agua y se secó. Se lavó con éter y hexano (una vez cada uno) para rendir 0.91 g (86.7%) del producto con una pureza por HPLC de 85.85% (sistema de ACN) . c. Acoplamiento de los fragmentos 2 y 4 dentro de F-AA(17-36) -NH2 [A] Método de HBTU/HOAT Se agitó una solución de fragmento 2 (1.80 g, 0.8 mm, 1 eq.), fragmento 4 (1.68 g = 0.8 mm) , HBTU (0.3 g, 0.8 mm) y HOAT (0.16 g, 1.2 mm, 1.5 eq. ) en 23 mi de DMF que contenia DIEA (0.2 mi, 1.2 mm) a 0 - 5o durante 15 a 20 minutos y a temperatura ambiente durante 2 horas, y el progreso de la reacción se monitoreó por TLC en CMA (90:8:2) y HPLC. Se trató con 23 mi de agua fría a 0 - 5°C y después de agitar durante 30 minutos se filtró, a continuación se lavó con agua y se secó para rendir 3.53 g (101.2%) del producto con una pureza de 79.4%. Después de la cristalización con IPA/H20 al 95%, el rendimiento fue de 74.5% y la pureza fue de 89.96%. Se contaminó con pequeñas cantidades del fragmento 2 (0.24%) y el fragmento 4 (0.15%) (sistema de IPA) . [B] Método de TBTU/HOAT La reacción de acoplamiento se realizó en el solvente DMA usando TBTU en la misma proporción de mols mencionada antes y el rendimiento fue de 3.56 g (101.95%) con una pureza de 70.2%. Después de la cristalización con IPA/H20 al 95%, el rendimiento fue de 74.5% (2.6 g) con una pureza por HPLC de 88.4% (sistema de IPA). Se desbloqueó con piperidina (10 eq.) en DMA y se aisló con agua para un rendimiento de 93.3% del producto con una pureza por HPLC de 85.3% (sistema de IPA) . d. Acoplamiento del fragmento 1 con H-AA(17-36)-NH2 dentro de enfuvirtida protegida. Se agitaron fragmento 1 (0.4 g, 1 eq.), HOAT (0.03 g, 1.5 eq.) y DIEA (0.03 mi, 1.5 eq.) en 8 mi de DMA para conseguir una solución transparente y después se agitó a 0.5°C. Se agregó TBTU (0.04 g, 1 eq. ) y se agitó la solución a 0°C durante 15 a 20 minutos y después se agregó una solución de H-AA (17-36) -NH2 (0.5 g, 1 eq.) en DMA y se continuó agitando a 0°C durante 30 minutos y después a temperatura ambiente durante 2 horas. Se agregó agua fría (~15 mi) a 0°C y se filtró el sólido separado, a continuación se lavó con agua y se secó para producir enfuvirtida protegida en un 97.3% (0.9 g) de rendimiento con una pureza por HPLC > 66.93% (sistema de IPA) . Después de la cristalización con ACN/H20 al 95%, el rendimiento fue de 55.3% y la pureza del péptido fue >72.8%. (Esquema de reacción 1) 7. Acoplamiento in situ de los fragmentos a. Liberación de F-AA (27-35 ) -OH de su resina CTC Se agitaron 5.0 g (1.62 mm) de FMOC-AA (27-35 ) -CTR con 25 mi de HC1 0.1 N en DMF durante 4 horas, se filtró y a continuación se lavó una vez con 10 mi de DMF. Volumen total de FMOC-AA (26-35) -OH en DMF = 35 mi (1.62 mm, supuesto) . b. Preparación de FMOC-AA (27-36) -NH2 ?H. A (27-36-NH2 Se agitó la solución anterior (del paso N° 1) a 0°C y se neutralizó con DIEA hasta pH ~ 7. Se agregaron un exceso de 1.2 veces de Phe-NH2 (0.32 g, 1.94 mm) , HOAT (0.26 g) , HBTU (0.74 g) y un exceso de 2.1 veces de DIEA (0.6 mi, 3.4 mm) y la mezcla se agitó a 0°C durante 0.5 horas y a temperatura ambiente durante 2 horas. La finalización de la reacción se monitoreó por TLC (CM-10) . En ese momento, se agregó DBU (10 eq. ) y se continuó agitando durante otras 2 horas y el progreso del desbloqueo se monitoreó por TLC (CM-10) y HPLC. c. Liberación de FMOC-AA ( 17-26) del soporte y su acoplamiento con H-AA (27-36) -NH2 dentro de FMOC-AA ( 17-36) -NH2 ?H.AA(17-36) -NH2 Se agitaron 4.7 g (1.62 mm) de FMOC-AA ( 17-26) -CTR con 25 mi de HC1 0.1 N en DMF durante 4 horas, se filtró y a continuación se lavó con 10 mi de DMF (volumen total = 35) y la solución se agitó a 0°C. Se trató con una solución de H-AA(27-36) -NH2 (paso N° 2) y el pH de la mezcla se ajustó a 7. Se agregaron HOAT, HBTU (1 mol eq. cada uno) y DIEA (1.8 mols eq.) y la mezcla se agitó a 0°C durante 0.5 horas y a temperatura ambiente entre 2 horas y toda la noche. El progreso de la reacción se monitoreó por TLC (C -10) y HPLC. La mezcla se trató entonces con DBU (10 eq. ) durante 2 horas para eliminar el grupo FMOC N-terminal (volumen de mezcla = 70 mi) . Se neutralizó a un pH ~7 a 0°C para usar en la reacción siguiente. d. Liberación de Ac-AA ( 1-16 ) -OH del soporte y su acoplamiento con H-AA ( 17-36) -NH2 dentro de AC-AA ( 1-36 ) -NH2 Se separaron 8.3 g (1.62 mm) de AC-AA ( 1-16 ) -CTR con
40 mi de HC1 0.1 N en DMF durante 4 horas según se describe antes y se ajustó a 7 el pH de la solución filtrada a 0°C. Después se trató con HOAT (1.5 eq.), DIEA (1.5 eq. ) y HBTU (1 eq. ) en orden y después de agitar a 0°C durante 15 a 20 minutos, se agregó la solución desbloqueada (paso N° 3) y se continuó agitando durante 0.5 horas a 0°C y entre 2 horas y toda la noche a temperatura ambiente. En ese momento se agregó a agua en agitación (-300 mi) mientras precipitaba hacia afuera un sólido. Después de agitar durante una hora, el sólido se filtró, a continuación se lavó con agua y se secó. El sólido seco se lavó con hexano para rendir 10.9 g (91.2%) del producto. Según la HPLC, la pureza del producto fue sólo de 32.71% y contenia aproximadamente 26% del fragmento 1 sin reaccionar. Por consiguiente, se hizo reaccionar nuevamente usando 50% de la cantidad de H-AA ( 17-36 ) -NH2 , HOAT, DIEA y
HBTU y se procesó de la manera usual para producir 13.2 g (110%) del producto. Según la HPLC, la pureza del péptido fue de 45.7%. Cuando la solución en agitación a 0°C del fragmento
1 aislado (0.98 g, 0.3 mm) en DMF se condensó con DBU al que se había eliminado el FMOC y una solución neutralizada de FMOC-AA (17-36) -NH2 aislada (1.31 g, 0.3 mm) en DMF en presencia de 1.5 mols equivalentes de HOAT, DIEA y 1 mol equivalente de HBTU, el rendimiento aislado del producto fue de 91.9% (2 g) con una pureza por HPLC > 62.1%. De manera similar, cuando el H- ( 17-36) -NH2 aislado se acopló al fragmento 1 sin aislar, el rendimiento y la pureza del péptido fueron de 95.7% y de 33.6%, respectivamente. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.