MX2008011350A - Dominios kunitz quimericos y su uso. - Google Patents
Dominios kunitz quimericos y su uso.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a quimeras del dominio 1 del inhibidor del factor tisular humano con dominios de Kunitz naturales y no naturales, y su preparación y uso.
Description
DOMINIOS KUNITZ QUIMERICOS Y SU USO
Campo de la invención La presente invención se refiere a quimeras del dominio 1 del inhibidor del factor tisular humano con dominios Kunitz naturales y no naturales, y su preparación y uso. Antecedentes de la invención Los dominios Kunitz son polipéptidos que inhiben una gran cantidad de serina proteasas de potencia variable. Comprenden tres puentes disulfuro que estabilizan la proteína y determinan su estructura tridimensional. La interacción con la serina proteasa respectiva tiene lugar principalmente mediante un bucle que es de aproximadamente 9 aminoácidos de longitud y está en la región N-terminal del dominio Kunitz. Este bucle se une al centro catalítico de la proteasa y previene de este modo la escisión de los sustratos de proteasa apropiados (Laskowski y Kato [1980] ; Bode y Huber [1992] ) . La aprotinina (BPTI; Fig. 1; Sec N° 6) se contempla como un prototipo de dominios Kunitz (Fritz y Wunderer [1983] ) . Esto es una proteína básica con una longitud de 58 aminoácidos que puede aislarse a partir de diversos órganos bovinos (entre otros páncreas, pulmones, hígado y corazón) . La aprotinina se estabiliza mediante tres puentes disulfuro (Cys 5 - Cys 55; Cys 14 - Cys 38; Cys 30 - Cys 51) y es entre
REF. : 195788 otros un potente inhibidor de tripsina, plasraina y calicreína del plasma. Ha sido posible mostrar mediante análisis estructural de rayos X del complejo entre la aprotinina y la tripsina bovina, que la región de contacto de aprotinina con el centro catalítico de la proteasa está formada esencialmente por un bucle constituido por aminoácidos 11 a 19 (véase Bode y Huber [1992] y las referencias que se muestran en ese documento) . El aminoácido Lys 15 es de capital importancia para el efecto inhibidor de aprotinina y está en un contacto particularmente íntimo con el resto serina catalíticamente activo de la proteasa. El aminoácido Lys 15 se denomina por lo tanto por definición como el resto Pl (Schechter y Berger [1967] . Los restos P2 , P3 , etc. se sitúan en el extremo N-terminal con respecto a Lys-15, mientras que los aminoácidos situados en el extremo C-terminal con respecto a Lys-15 se denominan Pl ' , P2 ' , etc. Puesto que Lys-15 se sitúa directamente en posición C-terminal al lado del segundo resto de cisteína de la aprotinina, del mismo modo el aminoácido correspondiente en esta posición en otros dominios Kunitz se denomina resto Pl . Se ha demostrado ya que el efecto inhibidor de aprotinina puede modificarse dirigiendo un intercambio de aminoácidos en la región del resto 11 al resto 19 (Otlewski y col [2001] , Apeler y col. [2004], Krowarsch y col. [2005]). Los aminoácidos 36-39 también son importantes para la actividad de la aprotinina (Fritz y Wunder [1983], Krowarsch y col. [2005] ) . Actualmente la aprotinina se emplea principalmente con el nombre propietario Trasylol en la cirugía cardiaca puesto que los estudios clínicos han demostrado que el tratamiento con aprotinina reduce de forma significativa la necesidad de transfusión en dichas operaciones y conduce a una reducción de las hemorragias secundarias (Royston [1992] ) . Su efecto clínico se atribuye a la inhibición de la coagulación intrínseca de la sangre (activación por contacto) , la inhibición de la fibrinolisis y la reducción de la formación de trombina (Blauhut y col. [1991], Dietrich y col. [1995]). Por tanto, la inhibición de plasmina y de calicreína del plasma es importante para el efecto hemostático de la aprotinina. La aprotinina como proteína bovina conduce a la formación de anticuerpo en seres humanos. La administración repetida de Trasylol puede conducir a reacciones alérgicas graves (shock anafiláctico) . El riesgo de esto es del 2,8%, y por tanto la posibilidad de uso múltiple de aprotinina se restringe en gran medida (Dietrich y col. [2001] , Beierlein y col. [2005]) . Hay por tanto una gran demanda médica de ingredientes activos que tengan un efecto clínico similar o mejor que la aprotinina y que provoquen una reacción alérgica significativamente menor.
La activación de la coagulación de la sangre mediante la vía extrínseca (por ejemplo, en lesiones tisulares) se inicia mediante la liberación de factor tisular de las células endoteliales (Lindahl [1997] , Lwaleed y Bass [2005] ) . Cuando el factor tisular entra en la sangre se une al factor Vlla. El complejo formado de este modo activa tanto el factor X (coagulación extrínseca de la sangre) y el factor IX (coagulación intrínseca de la sangre) . En condiciones fisiológicas, el factor tisular se inhibe mediante el inhibidor de factor tisular (TFPI) . El inhibidor del factor tisular humano (hTFPI) es una proteína con una longitud de 276 aminoácidos y una masa molecular de aproximadamente 42 kDa . Inhibe en primer lugar al factor Xa y después se une al complejo del factor Vlla/factor tisular. El TFPI está constituido por tres dominios Kunitz y, en el plasma, se une principalmente a lipoproteínas . Se denomina también por lo tanto como "el inhibidor de coagulación asociado a lipoproteínas" (LACI) . El TFPI se purificó la primera vez a partir de sobrenadantes de células HepG2 humanas (Broze y col. [1987]) y un poco más tarde a partir de plasma humano (Novotny y col. [1989]). El ADNc de hTFPI se clonó en 1988 (Wun y col. [1988]) . Sprecher y col. describen la clonación y la caracterización de una isoforma adicional del inhibidor del factor tisular (hTFPI2; Sprecher y col. [1994]). Fue posible demostrar mediante intercambio dirigido de los aminoácidos en la posición Pl de los dominios Kunitz respectivos de hTFPI que el dominio Kunitz 2 (D2) es responsable de la inhibición del factor Xa, mientras que los dominios Kunitz 1 (DI) y 2 son necesarios para unirse al complejo del factor VIIa/factor tisular (Girard y col. [1989] ) . Las investigaciones con dominios Kunitz de hTFPI expresados por separado han demostrado que el factor Xa puede inhibirse solamente mediante el dominio Kunitz 2, mientras que el dominio Kunitz 1 inhibe también la plasmina (Petersen y col. [1996]). Markland y col. describen la preparación de bibliotecas de proteínas mediante la variación de hTFPI DI por medio de una exposición de fagos. También fueron capaces de modificar, a través de mutaciones en la región de los aminoácidos 10 a 21 y 31 a 39, las propiedades de hTFPI DI de tal manera que los dominios Kunitz resultantes de las mismas son inhibidores de plasmina altamente potentes y selectivos (Markland y col. [1996a]) o inhibidores altamente potentes y selectivos de la calicreína del plasma (Markland y col. [1996b]). Baja y col., describen la significación de los aminoácidos 8 a 20 y 31 a 39 para la actividad inhibidora de hTFPI DI (Bajaj y col. [2001]). Las variantes de los dominios Kunitz que inhiben la plasmina con alta potencia y específicamente se describen en los documentos US 6.010.880; EP 0 737 207; US 6.071.723 y US 6.953.674. Los documentos US 5.795.865; EP 0 739 355 y US2004/0038893 describen variantes de dominios Kunitz que inhiben la calicreína del plasma con alta potencia y específicamente. El documento US 6.783.960 describe proteínas quiméricas constituidas por diversos dominios Kunitz de hTFPIl y/o hTFPI2. Los inhibidores de calicreína en el plasma de tipo Kunitz se describen en los documentos US 5.786.328; US 5.780.265 y EP 0 832 232. Sumario de la invención El objetivo de la presente invención es preparar variantes del dominio 1 del inhibidor 1 del factor tisular humano (hTFPI DI) con una actividad que es comparable a o mejor que la de aprotinina aunque teniendo significativamente menos inmunogenicidad. Las propiedades deseadas se consiguen intercambiando aminoácidos en el centro activo de hTFPI DI por aminoácidos correspondientes del centro activo de otros dominios Kunitz naturales o no naturales . Las quimeras generadas de este modo inhiben la plasmina y la calicreína en el plasma con alta potencia. Descripción detallada de la invención Los dominios Kunitz en el contexto de esta invención son homólogos de aprotinina que tienen de 55 a 62 aminoácidos que comprenden seis restos de cisteína y tres puentes disulfuro. Los aminoácidos, como se muestra en la Tabla 1, se numeran de acuerdo con los 58 aminoácidos de aprotinina. De este modo, Cys 1 es el aminoácido 5, Cys 6 es el aminoácido 55. En la Tabla 1 "x" significa cualquier aminoácido y "X" significa uno de los aminoácidos en cada caso especificado en detalle. Los puentes disulfuro se forman en cada caso entre las posiciones Cys 5 - Cys 55; Cys 14 - Cys 38 - Cys 30 - Cys 51.
Hasta la fecha, se han descubierto inhibidores de Kunitz entre otros en diversos vertebrados (por ejemplo seres humanos, ganado) y en algunos invertebrados (babosas, anémonas marinas) (Laskowski y Kato [1980] y referencias citadas en ese documento) . Dichos dominios Kunitz de origen natural se denominan "dominios Kunitz naturales" en esta solicitud. Los ejemplos de dominios Kunitz naturales son entre otros aprotinina, dominio 1 de la bikunina placentaria humana, dominio 2 de la bikunina placentaria humana, el dominio Kunitz del precursor de la proteína A4 beta amiloide humana y el dominio Kunitz del precursor de la Epina humana. Las secuencias de algunos dominios naturales Kunitz se detallan en la Tabla 2. Es posible por medio de procedimientos de ingeniería genética preparar variantes recombinantes de dominios Kunitz que difieran de dominios Kunitz naturales en uno o más aminoácidos. Dichos dominios Kunitz resultantes del intercambio de aminoácidos se denominan "dominios Kunitz no naturales" en esa solicitud. Se han descrito diversos dominios Kunitz no naturales en la bibliografía (Dennis y col. [1995], Markland y col. [1996a], Markland y col.
[1996b], Apeler y col. [2004], EP 0307592). Las secuencias de varios dominios Kunitz no naturales se muestran en la Tabla 3. El objetivo de esta invención es preparar un dominio Kunitz que tenga un efecto clínico que sea comparable a o mejor que el de aprotinina pero que provoque una reacción alérgica significativamente menor en seres humanos que la aprotinina. El hTFPI DI es un dominio Kunitz humano que tiene la secuencia MHSFCAFKADDGPCKAIMKRFFFNIFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRD (Sec n° 2) Por causa del origen humano, no se espera reacción alérgica comparable a la de la aprotinina en el uso de hTFPI DI en seres humanos . La aprotinina es un potente inhibidor de la plasmina y de la calicreína del plasma (Tabla 4) cuyo efecto clínico se atribuye a la coagulación intrínseca de la sangre (activación por contacto) , la inhibición de la fibrinolisis y la reducción de la formación de trombina (Blauhut y col. [1991], Dietrich y col. [1995]). Por el contrario a esto, hTFPI DI es un inhibidor considerablemente más débil de la plasmina y además no muestra efecto inhibitorio sobre la calicreína del plasma (Tabla 4) . El objetivo de esta invención es por lo tanto preparar variantes de hTFPI DI con potencial inmunogénico mínimo y que inhiban adicionalmente tanto la plasmina como la calicreína del plasma con alta potencia. Las variantes preferidas de acuerdo con la invención y miden la plasmina con una CI50 de < 100 nM, pero mejor con una CI50 de
< 10 nM. La calicreína del plasma se inhibe mediante variantes preferidas de acuerdo con la invención con una CI50
< 100 nM, pero mejor con una CI50 de < 10 nM. Las variantes de acuerdo con la invención de hTFPI DI se producen formando quimeras entre hTFPI DI y otros dominios Kunitz naturales o no naturales. La formación de las quimeras tiene lugar intercambiando uno o más aminoácidos en el centro activo de hTFPI DI por aminoácidos correspondientes del centro activo de otros dominios Kunitz naturales o no naturales. El centro activo incluye los aminoácidos 10 a 21 y 31 a 39 del dominio Kunitz correspondiente. Se ha descubierto sorprendentemente que las variantes de hTFPI DI producidas de este modo muestran propiedades que no solamente son comparables con las de aprotinina sino que en algunos casos son claramente mejores. De este modo, se ha descubierto por ejemplo que las variantes de TFPI de acuerdo con la invención tienen un efecto inhibidor sustancialmente más fuerte sobre la calicreína del plasma que la aprotinina (Tabla 4) . Además, se ha descubierto que las variantes de TFPI de acuerdo con la invención tienen un efecto anticoagulante similar o claramente mejorado en comparación con aprotinina (Fig. 3, Fig. 8) . La fibrinolisis en el plasma humano se inhibió mediante variantes de TFPI de acuerdo con la invención con una potencia comparable a la de la aprotinina (Fig. 2, Fig. 7) . El efecto hemostático de las variantes de TFPI de acuerdo con la invención se ensayó en diversos modelos animales. En un modelo de hemorragia de ratas, las variantes de TFPI de acuerdo con la invención mostraron un efecto comparable al de la aprotinina (Fig. 4, Fig. 9) . El periodo de hemorragia mesentérica de la rata se redujo mediante la aprotinina y las variantes de TFPI de acuerdo con la invención con potencia comparable (Fig. 11, Fig. 12) . El efecto antitrombótico de las variantes de TFPI de acuerdo con la invención se investigó en un modelo de vía arteriovenosa de ratas. En este caso, las variantes de TFPI de acuerdo con la invención mostraron un efecto antitrombótico comparable al de la aprotinina (Fig. 10) . Los posibles efectos no deseados de las variantes de TFPI de acuerdo con la invención sobre el sistema cardiovascular se examinaron en ratas anestesiadas. Las variantes de TFPI de acuerdo con la invención no mostraron efecto sobre la presión sanguínea y sobre el ECG en administración intravenosa de una dosis de hasta 50 mg/kg (Tabla 8) . El trauma, la reperfusión y la circulación extracorporea son causas de procesos inflamatorios complejos, con activación de sistemas de cascada celular y humoral. Esto conduce a la activación de, entre otros, leucocitos y plaquetas que causan los efectos secundarios observables clínicamente tales como formación de edema y daño a los órganos (Hess PJ Jr. [2005] ) . Diversos estudios muestran posibles efectos de aprotinina sobre el estatus inflamatorio de pacientes con bypass (Asimakopoulos G. y col. [2000] ) . La posible influencia de las variantes de TFPI de acuerdo con la invención sobre los procesos inflamatorios se ensayó en diversos sistemas de ensayo celular. Por tanto, las variantes de TFPI de acuerdo con la invención inhibieron la quimiotaxis de neutrófilos inducida por IL-8 y C5a con una potencia que es comparable o ligeramente mejor que la de la aprotinina (Fig. 13, Tabla 6) . Del mismo modo se inhibió el aumento de la permeabilidad inducido por CAP-37 mediante las variantes de TFPI de acuerdo con la invención con una potencia comparable a o ligeramente mejor que la de la aprotinina (Fig. 1 , Tabla 7) . Las variantes de acuerdo con la invención de hTFPI DI tienen la fórmula general MHSFCAFKAX10X11GPCX15Xi6Xi7Xi8Xi9X2oX2 iX22 FNI FTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESL
EECKKMCTRD o EAMHSFCAFKAX10X11GPCX15Xi6Xi7Xi8Xi9X2oX2 iX22 FNI FTRQCEEFIYGGCEGNQNRFE SLEECKKMCTRD En esta, "X" es un aminoácido de un dominio Kunitz de acuerdo con la numeración mostrada en la Tabla 1. Este aminoácido puede obtenerse de hTFPI DI o de otros dominios Kunitz naturales o no naturales que se muestran en las Tablas 2 y 3. Las variantes de acuerdo con la invención se producen mediante el intercambio de al menos un aminoácido de hTFPI DI por otro aminoácido del dominio Kunitz natural o no natural correspondiente. Los aminoácidos de los dominios Kunitz naturales y no naturales que pueden intercambiarse preferiblemente por los aminoácidos correspondientes de hTFPI DI se resumen a modo de ejemplo en la Tabla 5. Se prefieren particularmente las siguientes variantes de hTFPI DI : MHSFCAFKAETGPCRAA.HPRWFFNIFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRD (Sec N° 4) MHSFCAFKAETGPCRAAHPRWWFNIFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRD (Sec N° 5) . EAMHSFCAFKAETGPCRAAHPRWFFNIFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRD (Sec N° 19) EAMHSFCAFKAETGPCRAAHPRWWFNIFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRD (Sec N° 20) . Los valores de CI50 de algunas variantes de hTFPI DI de acuerdo con la invención para la inhibición de tripsina, plasmina y calicreína del plasma se resumen en la Tabla 4. En la Fig. 1 se muestran variantes adicionales de acuerdo con la invención de hTFPI DI. Esta invención se refiere también a medicamentos que comprenden una o más de las variantes de acuerdo con la invención de hTFPI DI. Los nuevos dominios Kunitz descritos son adecuados para el tratamiento de los siguientes estados patológicos: pérdida de sangre asociada con operaciones con un riesgo aumentado de hemorragia; terapia de afecciones tromboembólicas (por ejemplo, después de operaciones, accidentes), choque, politrauma, sepsis, coagulación intravascular diseminada (DIC) , fallo multiorgánico, angina inestable, infarto de miocardio, apoplejía, embolia, trombos de las venas profundas, trastornos inflamatorios (por ejemplo, reumatismo, asma) , crecimiento tumoral invasivo y metástasis, terapia del dolor y edema (edema cerebral, edema de la médula espinal), prevención de la activación de la hemostasis en tratamiento de diálisis, tratamientos de síntomas del envejecimiento de la piel (elastosis, atrofia, arrugas, alteraciones vasculares, alteraciones pigmentarias, queratosis actínica, espinillas, quistes), cáncer de piel, tratamientos de síntomas de cáncer de piel (queratosis actínica, carcinoma de las células básales, carcinoma de las células escamosas, melanoma maligno), esclerosis múltiple, fibrosis, hemorragia cerebral, inflamaciones del cerebro y de la médula espinal, infecciones del cerebro.
Modalidades ejemplares Ejemplo 1 Clonación del dominio 1 del inhibidor del factor tisular humano (hTFPI , inhibidor de la vía del factor tisular) y generación de variantes de TFPI . El vector trasbordador de E. coli/S. cerevisiae disponible en el mercado pYES2 (Invitrogen) se modificó (véase Apeler [2005] ) y sirvió como material de partida para la construcción de los vectores de secreción de levadura pIUlO.lOW y pIU3.12.M. pIUlO .10.w Promotor MFal - MFal-Metl-Arg2 ... presecuencia ... Alal7-Leul8-Alal9| peptidasa señal pIU3.12.M Promotor MFal - MFal-Metí-Arg2 ... preprosecuencia ... Asp83-Lys84-Arg85 Iproteasa KexII El dominio 1 de origen natural de TFPI humano (hTFPI DI, acc . P10646, aminoácido Met49 - Aspl07, en este documento Metí - Asp58) se fusionó como un gen sintético (optimizado para el uso de codón de S. cerevisiae) o a Alal9 en el vector de secreción de levadura pIUlO.lO.W (mediante los sitios de escisión de restricción BsaBI y Xhol) o a Arg85 en el vector de secreción de levadura pIU3.12.M (por medio de PCR y los sitios de escisión de restricción HindIII y BamHI) .
Clonación de hTFPI DI en el vector de secreción de levadura pIUlO.lO.W El gen preparado de forma sintética para hTFPI DI (Sec N° 2) se subclonó por medio de la enzima de restricción BsaBI (5') y Xhol (3') en el vector de secreción de levadura pIUlO.lO.W (Fig. 5) y se comprobó la secuencia de nucleótidos mediante análisis de secuencia de ADN. La preparación de variantes de hTFPI DI en levadura mediante la transformación de pIUlO.lO.W conduce la expresión de variantes de hTFPI DI que tienen la secuencia de aminoácidos N- terminal MHSF. Clonación de hTFPI DI en el vector de secreción de levadura pIU3.12.M El hTFPI DI (Sec N° 2) se subclonó por medio de la reacción en cadena de la polimeraza (PCR) y cebadores de PCR apropiados con sitios de escisión de restricción apropiados (cebador de PCR 1 /HindIII, 5' y cebador de PCR 2/BamHI, 3') en el vector de secreción de levadura pIU3.12.M (Fig. 6) y se comprobó la secuencia de nucleótidos mediante análisis de secuencia de ADN. Los siguientes cebadores de PCR 1 y 2 se usaron para la subclonacion de hTFPI DI en el vector de secreción de levadura pIU3.12.M. Las secuencias de reconocimiento para las enzimas de restricción (HindIII, BamHI) usadas para la subclonacion están subrayadas.
HindIII, Cebador de PCR 1: 5 ' -GGTAAGCTTGGATAAAAGAGAAGCTATGCATTTTTTTTGTGCTTTTAA- BamHI Cebador de PCR 2: 5 ' -TAGTGGATCCCGAGCTTGCTTATTAATCTCTAGTACACATT- 3 '
La preparación de variantes de hTFPI DI en levadura mediante la transformación de pIU3.12.M conduce la expresión de variantes de hTFPI DI que tienen la secuencia de aminoácidos N-terminal EA HSF. Generación de variantes de hTFPI DI Variante 1: TFPI mutl (Sec. N° 1) TFPI mutl tiene en comparación con hTFPI DI intercambios de los siguientes aminoácidos: K15R, I17A, M18H, K19P, F21W.
TFPI mutl se generó mediante PCR y modificó apropiadamente cebadores de PCR (cebadores de PCT 3 y 4) Cebador de PCR 3: Nsil CATGTAGAGC
Xhol Cebador de PCR 4: 5' -TCCCT CGAGTTATTAATC'TCTAGTACACAT- 3' Los intercambios de nucleótidos que conducen a los intercambios de aminoácidos correspondientes se muestran en negrita con un fondo gris en el cebador de PCR 3. El fragmento de ADN amplificado con los cebadores de PCR 3 y 4 se clonó mediante los sitios de escisión de restricción Nsil (5') y Xhol (3') en el vector de secreción de levadura pIUlO.lO.W. Los cebadores de PCR descritos en la sección 2 (cebador de PCR 1 y cebador de PCR 2) se usaron para subclonar TFPI mutl en el vector de secreción de levadura pIU3.12. M . Las secuencias de nucleótidos se comprobaron en cada caso mediante análisis de la secuencia de ADN. Variante 2: TFPI mut3 (Sec N° 4) TFPI mut3 tiene en comparación con hTFPI DI y TFPI mutl intercambios de aminoácidos adicionales: D10E, D11T, K15R, I17A, M18H, K19P, F21 (Sec N° 4) TFPI mut3 se generó mediante mutagénesis in vitro (usando el kit de mutagénesis sitio-dirigida Quick-change II XL, de Stratagene) , comenzando a partir de TFPI mutl usando los cebadores de mutagénesis 1 y 2. La secuencia inicial en TFPI mutl (secuencia parcial) a mutar es 5'... -mGTGCTmAAAGCTGj ATGGTCCATGTAOAGCTGCTC- .... 3' C A F K A D G P C R A A
Cebador de mutagénesis 1: 5' -TTTGTGCTTTTAAAGCTGAAACTGGTCCATGTAGAGCTGCTC-3 ' El cebador de mutagénesis 1 comprende en lugar de los tripletes GAT/D10 y GAT/D11 los tripletes modificados GAA y AC.T y por tanto conduce a los intercambios de aminoácidos D10E y D11T. Cebador de mutagénesis 2: ( 5 ' -GAGCAGCTCTACATGGACCAGTTTCAGCTTTAAAAGCACAAA-
Xhol Cebador de PCR 4: 5' -TCCCT CGAGTTATTAA TCT CTAGTACACAT- 3'
Los intercambios de nucleótidos que conducen a los intercambios de aminoácidos correspondientes se muestran en negrita con un fondo gris en el cebador de PCR 3. El fragmento de ADN amplificado con los cebadores de PCR 3 y 4 se clonó mediante los sitios de escisión de restricción Nsil (5') y Xhol (3') en el vector de secreción de levadura pIUlO.lO.W. Los cebadores de PCR descritos en la sección 2 (cebador de PCR 1 y cebador de PCR 2) se usaron para subclonar TFPI mutl en el vector de secreción de levadura pIU3.12.M. Las secuencias de nucleótidos se comprobaron en cada caso mediante análisis de la secuencia de ADN. Variante 2: TFPI mut3 (Sec N° 4) TFPI mut3 tiene en comparación con hTFPI DI y TFPI mutl intercambios de aminoácidos adicionales: D10E, D11T, K15R, I17A, M18H, K19P, F21W (Sec N° 4) TFPI mut3 se generó mediante mutagénesis in vitro (usando el kit de mutagénesis sitio-dirigida Quick-change II XL, de Stratagene) , comenzando a partir de TFPI mutl usando los cebadores de mutagénesis 1 y 2. La secuencia inicial en TFPI mutl (secuencia parcial) a mutar es 5'... -TTTGTGCTTTTAAAQCTGAJOATGGTCCATGTAGAGCTGCTC- ... 3' C A F K A D D G P C R A A
Cebador de mutagénesis 1: 5 ' -TTTGTGCTTTTAAAGCTGAAACTGGTCCATGTAGAGCTGCTC- 3 ' El cebador de mutagénesis 1 comprende en lugar de los tripletes GAT/D10 y GAT/D11 los tripletes modificados GAA y AGT y por tanto conduce a los intercambios de aminoácidos D10E y D11T. Cebador de mutagénesis 2: ( 5 ' -GAGCAGCTCTACATGGACCAGTTTCAGCTTTAAAAGCACAAA- 3 ' ) es complementario al cebador de mutagénesis 1. La mutagénesis se realizó de acuerdo con la información proporcionada por el fabricante, y la secuencia de nucleótidos se comprobó después mediante análisis de la secuencia de ADN . Ejemplo 2 Transformación de Saccharomyces cerevisiae Se cultivaron células de levadura por ejemplo de la cepa JC34.4D ( ATC3, ura3-52, suc2) en 10 mi de YEPD (glucosa al 2%; peptona al 2%; extracto de levadura Difco al 1%) y se recogieron a una DO600 nm de 0,6 a 0,8. Las células se lavaron con 5 mi de solución A (sorbitol 1 M; bicina 10 mM pH 8,35; etilenglicol al 3%), se resuspendieron en 0,2 mi de solución A y se almacenaron a -70 °C. El ADN del plásmido que comprende el gen que codifica
TFPI mut3EA (5 µg) y el ADN vehículo (50 µg) de ADN de esperma de arenque) se añadieron a las células congeladas. Las células se descongelaron después mediante agitación a 37°C durante 5 min. Después de la adición de 1,5 mi de solución B (PEG 1000 al 40%; bicina 200 mM pH 8,35), las células se incubaron a 30°C durante 60 minutos, y después de la sedimentación, se lavaron con 1,5 mi de solución C (NaCl 0,15 M; bicina 10 mM pH 8,35) y se resuspendieron en 100 µ? de solución C. La colocación en placas tuvo lugar en un medio de selección con agar al 2%. Los transformantes se obtuvieron después de la incubación a 30 °C durante 3 días. Ejemplo 3 Preparación de TFPI mut3EA mediante fermentación de las células de levadura
Soluciones nutrientes Se usaron las siguientes soluciones nutrientes para la fermentación de células de levaduras para expresar TFPI mut3EA:
Solución 4 de elementos traza (solución SL4) :
Titriplex III (Merck 8418) 5 g FeS04 · 7H20 (Merck 3965) 2 g ZnS04 ¦ 7H20 (Merck 8883) 0, 1 g
MnCl2 · 4H20 (Merck 5927) 30 mg H3BO3 (Merck 165) 0,3 g
CoCl2 · 6H20 (Merck 2533) 0,2 g
CuCl2 · 2H20 (Merck 2733) 10 mg NiCl2 · 6H20 (Merck 6717) 20 mg Na2Mo04 · 2H20 (Merck 6521) 30 mg
Los ingredientes de la solución SL4 se disolvieron en agua desmineralizada y se ajustó el pH a un pH de 3-4 con NaOH. La solución de nutrientes se ajustó a 1000 mi con agua desmineralizada y se almacenó en alícuotas a -20 °C. Los ingredientes de las soluciones nutrientes SD2 y SC5 se ajustaron en agua desmineralizada y el pH se ajustó a pH 5,5. La esterilización tuvo lugar a 121°C durante 20 minutos. La glucosa se disolvió en 1/5 del volumen requerido en agua desmineralizada, se esterilizó por separado, y después de enfriarla, se añadió a la solución nutriente restante. Soluciones madre de cepas Las soluciones madre de cepas de todos los transformantes de levadura se prepararon mezclando alícuotas de 1 mi de un precultivo con 1 mi de solución de glicerol al 80% y almacenando a -140°C. Precultivos Las fermentaciones del precultivo se realizaron en matraces de agitación de 50 mi (para los cultivos primarios de pequeño volumen) o de 1 litro (para los cultivos primarios de volumen intermedio) , cargados respectivamente con 10 ó 100 mi de solución nutriente SD2. La inoculación tuvo lugar con una solución madre de la cepa o con una única colonia a partir de una placa de agar de SD2. Los cultivos se incubaron con agitación continua (240 rpm) a 28-30°C durante 2-3 días. Fermentaciones de los cultivos primarios Las fermentaciones de los cultivos primarios a pequeña escala tuvieron lugar con el uso de un matraz de agitación de 1 1 cargado con 100 mi de solución nutriente SC5. La inoculación tuvo lugar normalmente con 3 mi del precultivo descrito anteriormente. Los cultivos se incubaron después con agitación continua (240 rpm) a 28-30°C durante 4 días. En el caso de las fermentaciones del cultivo primario a escala intermedia, se empleó el sistema biorreactor de Wave Biotech (Tagelswangen, CH) . Específicamente, se inocularon 1000 mi de medio SC5 con 30 mi de precultivo y se incubaron en una Wavebag con una velocidad de agitación de 32/minuto durante 4 días (ángulo: 10°; suministro de aire: 0,25 litros/minuto) . El pH de los cultivos se controló el día 1 y el día 3 y se ajustó a pH 5-6 si era necesario con NaOH 5 M. En el día 1 a 3, se añadieron 1 mi de solución extracto de levadura de potencia del 50% y 4 mi de solución de glucosa 4 M a cada uno de los cultivos de 100 mi. En el caso de los cultivos de 1000 mi, se añadieron de forma apropiada -10 ó 40 mi de las soluciones nutriente de forma continua a lo largo del día. Para controlar el crecimiento, se determinó la D06oo nm de los cultivos en diversos momentos.
Después de 4 días, los sobrenadantes sin células se recogieron mediante centrifugado (15 minutos a 6000 rpm en un rotor JA 14) . Ejemplo 4 Purificación de TFPI mut3EA a partir de los sobrenadantes de células de levadura fermentadas . Se añadió NaOH 1 M a los sobrenadantes sin células que contenían TFPI mut3EA preparados en la fermentación de cultivo primario hasta que el pH era de 7,8. Las partículas suspendidas presentes en el sobrenadante se sedimentaron mediante centrifugado a 2000 rpm a 4°C (15 minutos; Beckman-Allegra 6KR) . El sobrenadante se introdujo a 1 ml/minuto en una columna de tripsina-agarosa de 10 mi (Sigma-T1763 ) . La columna se lavó después con 70 mi de Tris 50 mM pH 7,8, NaCl 250 mM y con 50 mi de Tris 50 mM pH 7,8, NaCl 600 mM . Después se eluyó el TFPI mut3EA con 180 mi de KCl 50 mM/HCl 10 mM pH 2,0. Las fracciones de 2 mi se recogieron en tubos que contenían cada uno 500 µ? de Tris 200 mM pH 7,6, NaCl 2 M para la neutralización. Las fracciones que contenían TFPI mut3EA se identificaron mediante la inhibición de tripsina en el ensayo descrito a continuación. Las fracciones inhibidoras de tripsina se reunieron y se dializaron en un tubo de diálisis con un límite de 1000 dalton (Spectra/POR6) dos veces contra 2 litros de Tris 50 mM pH 7,5 cada vez. El producto dializado se concentró a través de una membrana de ultrafiltración con un límite de 1000 dalton en una célula agitada Amicon 8200. La concentración de proteína se determinó usando un ensayo de Coomassie plus (Pierce, 23236) según lo indicado por el fabricante. La concentración de proteína medida estaba típicamente entre 0,1 y 6 mg/ml. Como alternativa, las fracciones inhibidoras de tripsina se reunieron después de la purificación en agarosa- tripsina y se mezclaron con el mismo volumen de TFA al 0,1%, y se introdujeron en una columna Source 15 RPC. La columna se lavó con 6 mi de TFA al 0,1% (tampón HPLC-A) y después se eluyó el TFPI mut3EA con un gradiente de 25 mi de tampón HPLC-B al 50% (TFA al 0,1%, acetonitrilo al 60%) y con un gradiente adicional de 5 mi al 100% de tampón HPLC-B. Los eluatos que contenían TFPI mut3EA se liofilizaron y el liofilizado se recogió en 250 µ? de Tris 50 mM pH 7,5 por fracción. Ejemplo 5 Determinación de la potencia inhibidora de TFPI mut3EA para tripsina, plasmina, y calicreina del plasma La potencia inhibidora del TFPI mut3 sobre las actividades enzimáticas de tripsina, plasmina, y calicreina del plasma se determinó con la ayuda de sustratos fluorogénicos en ensayos bioquímicos en placas de microtitulación blancas de 384 pocilios. El tampón de ensayo estaba constituido por Tris 50 mM/Cl, pH 7,4, NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM, y BSA al 0,08% (p/v) . Las condiciones del ensayo eran específicamente como siguen:
Se introdujeron 10 µ? de una dilución seriada de TFPI mut3EA en cada pocilio y se preincubaron con 20 µ? de enzima a temperatura ambiente durante 5 minutos. La reacción se inició después añadiendo 20 µ? de sustrato a cada uno. La medición tuvo lugar después de 60-90 minutos en un lector Tecan con una longitud de onda de excitación de 360 nm y una longitud de onda de emisión de 465 nm. Los gráficos dosis- actividad y las constantes de inhibición de la mitad del máximo (valores CI50) se determinaron usando un software GraphPad Prism (versión 4.02).
Ejemplo 6 Inhibición de la fibrinolisis mediante variantes de hTFPI DI El efecto de las variantes de hTFPI DI se ensayó en un modelo de fibrinolisis in vitro y se comparó con el efecto de Trasylol (aprotinina) . Se mezcló plasma citrado humano con el factor tisular (TF) 0,13 pM y 164 U/ml de activador del plasminógeno tisular (tPA) y con variantes de hTFPI DI o aprotinina en diversas concentraciones (0,06 µ? a 15 µ?) y se incubaron a 37 °C durante 40 minutos. Se usó solución salina fisiológica como control. La formación de coágulos mediante TF y la posterior lisis de los coágulos mediante tPA se determinó mediante las mediciones de la densidad óptica (DO405 nm) con un Tecan Safire. El área bajo la curva resultante de las mismas (AUC) se calculó y se representó contra las concentraciones de las sustancias. Una reducción en la AUC indica inhibición de la fibrinolisis. En experimentos posteriores, la fibrinolisis se definió como una disminución relativa de la DO después de la formación del coágulo. La inhibición de la disminución relativa de la DO es la medida de la actividad antifibrinolítica . La actividad antifibrinolítica de TFPI mut3EA y TFPI mut4EA era comparable a la de Trasylol.
Ejemplo 7 Inhibición de la coagulación mediante variantes de hTFPI Di El efecto de las variantes de hTFPI DI se ensayó en un modelo de coagulación in vitro y se comparó con el efecto de Trasylol (aprotinina) . Se mezcló plasma citrado humano con CaCl2 12 mM para inducir la coagulación y con las variantes de hTFPI DI o aprotinina en diversas concentraciones (0,1 µ? a 25 µ?) . Se usó solución salina fisiológica como control. La DO a 405 nm se determinó como una medida de la coagulación durante la incubación a 37 °C durante 90 minutos. El tiempo de coagulación a la mitad del máximo se calculó a partir de la misma. Una prolongación del tiempo de coagulación a la mitad del máximo significa inhibición de la coagulación. Mediante la comparación con Trasylol, la actividad anticoagulante de TFPI mut3EA aumentó y la de TFPI mut4EA aumentó ligeramente. Ejemplo 8 Efecto hemostático de las variantes de hTFPI DI en un modelo de hemorragia de rata . Se canularon con un catéter de polietileno ambas venas yugulares de ratas anestesiadas. Para prolongar el periodo de hemorragia normal, se infundió a las ratas tPA (activador de la plasmina tisular) (8 mg/kg/h) durante todo el experimento. 10 minutos después del comienzo de la infusión de tPA, los animales se trataron con variantes de hTFPI DI o Trasylol (aprotinina) mediante infusión o mediante administración en embolada combinada y la posterior infusión de mantenimiento. En el primer experimento, se administraron TFPI mut3EA o Trasylol en una dosis de 6 mg/kg/h mediante infusión continua. En el segundo experimento, los animales se trataron con TFPI mut4EA o Trasylol en dosis de 1,5 mg/kg (en embolada) y 3 mg/kg/h (en infusión) hasta 5 mg/kg y 10 mg/kg/h. Se usó solución salina fisiológica como control en los dos experimentos. 15 minutos después del comienzo de la infusión, se realizó un corte transversal de la cola (2 rom) . La punta de la cola se sumergió en solución salina fisiológica a 37°C, y se determinó el periodo de hemorragia. El periodo de hemorragia se definió como el intervalo de tiempo entre el corte transversal y el final visible de la hemorragia. El acortamiento del periodo de hemorragia era la medida del efecto hemostático. El efecto hemostático de TFPI mut3EA y TFPI mut4EA era comparable al de Trasylol. Ejemplo 9 Efecto antitrombótico de TFPI mut4EA en un modelo de vía arteriovenosa (AV) en ratas El efecto antitrombótico de TFPI mut4EA se investigó en un modelo de vía arteriovenosa de rata. La arteria carótida y la vena yugular de ratas anestesiadas se canularon con un catéter de polietileno, y los catéteres se conectaron conjuntamente mediante una pieza de tubo (vía) . Se introdujo un bucle de nylon endurecido en el tubo y sirvió como superficie trombogénica . La formación del trombo seguía después a la circulación extracorporea de la sangre a través de la vía durante 15 minutos. El trombo resultante se retiró después del tubo, y se determinó el peso del trombo. Las ratas se trataron con TFPI mut4EA o Trasylol (aprotinina) mediante administración en embolada y la posterior infusión de mantenimiento. Las dosis empleadas fueron 0,15 mg/kg (en embolada) y 0,3 mg/kg/h (en infusión) hasta 5 mg/kg y 10 mg/kg/h. Se usó solución salina fisiológica como control. La reducción del peso del trombo era la medida del efecto antitrombótico. TFPI mut4EA mostró un efecto antitrombótico comparable al de Trasylol . Ejemplo 10 Influencia de Trasylol y TFPI mut4EA sobre el periodo de hemorragia mesen érica relativa en ratas Se anestesiaron por vía intraperitoneal (tiopental sódico, 100 mg/kg) ratas Wistar (250-300 g) y provistas con un catéter en la vena. Después de abrir el abdomen, se transfirió al exterior un bucle de intestino delgado. Mientras se irrigaba con solución salina caliente, se cortó una pequeña arteria mesentérica con la ayuda de unas microtijeras en un estéreo-microscopio. Se midió el periodo de hemorragia de tres cortes de control antes de la administración de la sustancia y de un corte después de la administración de la sustancia de ensayo. El periodo de hemorragia después del tratamiento con la sustancia se relacionó con el periodo de hemorragia de control antes de la administración de la sustancia de forma individual en cada animal . El Trasylol redujo el periodo de hemorragia mesentérica de forma dependiente de la dosis (Fig. 11) . La administración de 1,5 mg/kg de Trasylol en embolada con una posterior infusión (3 mg/kg/h) no tuvo efectos significativos sobre el periodo de, hemorragia. Una dosis más alta de 5 mg/kg en embolada con 10 ó 30 mg/kg/h como infusión redujo el periodo de hemorragia de forma correspondiente en 28,5 ± 7,4% y 42,7 ± 4,2%. El TFPI mut4EA (Fig. 12) redujo el periodo de hemorragia mesentérica de manera similar al Trasylol. La administración de 5 mg/kg de TFPI mut4EA en embolada y 10 mg/kg/h en forma de infusión acortaron el periodo de hemorragia en un 23,6%. Los mayores efectos de TFPI mut4EA se observaron después de la administración de 5 mg/kg en embolada y 30 mg/kg/h en infusión. A esta dosis, TFPI mut4EA redujo el periodo de hemorragia en un 31,7%. Ejemplo 11 Investigaciones sobre el efecto de las variantes de hTFPI DI sobre el sistema cardiovascular en ratas anestesiadas Las ratas se anestesiaron con pentobarbital sódico. Durante el experimento, las ratas respiraban de forma espontánea, y la temperatura corporal se mantuvo constante mediante una manta eléctrica. La presión sanguínea arterial se midió mediante un catéter en la arteria carótida usando un transductor de presión y un puente de medición de presión. Se registró el ECG con 3 cables de punta convencional por medio de un amplificador de ECG. Las señales medidas se adquirieron, se evaluaron y se almacenaron mediante un software. La presión sanguínea sistólica, diastólica y media, y el ritmo cardíaco, se calcularon a partir de la señal de presión sanguínea. Se evaluó adicionalmente el ECG y se evaluó manualmente después del experimento. Hubo adicionalmente un registro análogo de la presión sanguínea y de las señales de ECG. Después de la instalación de los catéteres y una fase de curso (presión sanguínea y ritmo cardíaco constantes), se administró TFPI mut3EA o TFPI mut4EA i.v. en forma de una inyección en embolada o infusión continua. Después de un período de observación fijado, se finalizó el experimento sacrificando a los animales mediante una sobredosis de anestésico. Ejemplo 12 Inhibición de la quimiotaxis de neutrófilos inducida por IL-8 y C5a mediante variantes de hTFPI DI . Se aislaron neutrófilos de la sangre mediante procedimientos convencionales. La quimiotaxis de los neutrófilos se realizó en un sistema de dos cámaras. Se cultivó una monocapa de HUVEC sobre la membrana usada (tamaño de poro 3 µt , policarbonatos , de Falcon) durante 24 horas. Se colocaron lxlO5 neutrófilos en medio RPMI 1640, que se había cargado previamente con un tinte fluorescente, en la cámara superior. La cámara inferior contenía concentraciones variables de estímulos o una concentración de estímulo constante (IL-8: 5 nM o C5a: 10 nM) y concentraciones variables de las sustancias de ensayo Trasylol (aprotinina) , TFPI mut3EA o TFPI mut4EA. Las sustancias a investigar estaban presentes en las dos cámaras. La mezcla de ensayo se incubó a 37 °C y C02 al 5% durante 45 minutos. Después de la incubación, las células que habían migrado a la cámara inferior se determinaron (medición de la fluorescencia, recuento) . Ejemplo 13 Inhibición del aumento de la permeabilidad inducida por CAP-37 mediante variantes de hTFPI Di Se cultivó una monocapa confluyente de HUVEC sobre la membrana del inserto en un sistema de dos cámaras (Falcon) . Para este fin, se sembraron 2 x 105 células por inserto y se incubaron (37°C/C02 al 5%) durante 18-20 h. La continuidad de la monocapa se comprobó por medio de una solución de albúmina conjugada con azul de tripano antes de comenzar el experimento. Después se colocó CAP37 (5 µ?) en la cámara superior. El cambio de la permeabilidad se determinó en presencia de concentraciones variables (10 µ?-0,01 µ?) de la sustancia de ensayo Trasylol (aprotinina) , TFPI mut3EA o TFPI mut4EA durante 3h. La descarga de la solución de albúmina conjugada con azul de tripano servía en este caso como indicador del cambio de la permeabilidad. La DO se mide a 590 nm . Referencias
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Abreviaturas AUC área bajo la curva BPTI inhibidor de la tripsina pancreática bovina DIC coagulación intravascular diseminada ADN ácido desoxirribonucleico ECG electrocardiograma HepG2 línea celular de hepatoma humano HPLC cromatografía de líquidos de alta resolución hTFPI inhibidor 1 de la vía del factor tisular humano hTFPI DI dominio Kunitz 1 del inhibidor 1 de la vía del factor tisular humano HUVEC células endoteliales de la vena umbilical humana CI50 concentración inhibidora al 50% de la inhibición de la actividad enzimática IL-8 interleuquina 8 i.v. intravenosa kDa Kilodalton LACI inhibidor de la coagulación asociado a lipoproteínas M molar (mol por litro) Min Minuto MOF fallo multiorgánico DO Absorción PEG polietilen glicol PCR reacción en cadena de la polimerasa Rpm revoluciones por minuto TF factor tisular TFA ácido trifluoroacético TPA activador del plasminógeno tisular U unidad (unidad de actividad enzimática) Breve descripción de las figuras La Fig.l muestra la secuencia de aminoácidos de algunas variantes preferidas de acuerdo con la invención de hTFPI DI, además las secuencias de aprotinina (BPTI) y hTFPI DI. La Fig. 2 muestra el efecto de Trasylol (aprotinina) y de la variante de acuerdo con la invención TFPI mut3EA (Sec N° 19) sobre la fibrinolisis en plasma humano (in vitro) . La Fig. 3 muestra el efecto de Trasylol (aprotinina) y de la variante de acuerdo con la invención TFPI mut3EA (Sec N° 19) sobre la coagulación en plasma humano (in vitro) . La Fig. 4 muestra el efecto de Trasylol (aprotinina) y de la variante de acuerdo con la invención TFPI mut3EA (Sec N° 19) sobre el periodo de hemorragia en la rata en presencia de TPA (in vivo) . La Fig. 5 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos obtenida del dominio de hTFPI DI sintético (hTFPI DI, en negrita), clonada en el vector pIUlO.lO. . Las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción (BsaBI, Xhol) usadas para la subclonacion están subrayadas . La Fig. 6 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos obtenida del dominio de hTFPI DI sintético (hTFPI DI, en negrita), clonado en el vector pIU3.12.M. Las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción (HindIII, BamHI) usadas para la subclonación están subrayadas, y los cebadores de PCR empleados tienen un fondo gris. La Fig. 7 muestra el efecto de Trasylol (aprotinina) y de la variante de TFPI mut4EA de acuerdo con la invención (Sec N° 20) sobre la fibrinolisis en plasma humano (in vitro) . La Fig. 8 muestra el efecto de Trasylol (aprotinina) y de la variante de TFPI mut4EA de acuerdo con la invención (Sec N° 20) sobre la coagulación en plasma humano (in vitro) . La Fig. 9 muestra el efecto de Trasylol (aprotinina) y de la variante de TFPI mut4EA de acuerdo con la invención (Sec N° 20) sobre el periodo de hemorragia en la rata en presencia de TPA (in vivo) . La Fig. 10 muestra el efecto antitrombótico de Trasylol (aprotinina) y de la variante de TFPI mut4EA de acuerdo con la invención en un modelo de vía arteriovenosa (AV) de ratas. La Fig. 11 muestra el efecto de Trasylol sobre el periodo de hemorragia mesentérica relativa en ratas. El periodo de hemorragia después de la administración de la sustancia de ensayo se relacionó con el periodo de hemorragia de control medio antes de la administración de la sustancia. Los valores se han mostrado como la media ± DTM, n = 8. * significativamente diferente del vehículo, p < 0,05; *** significativamente diferente del vehículo, p < 0,001.
La Fig. 12 muestra el efecto de la variante TFPI mut4EA de acuerdo con la invención sobre el periodo de hemorragia mesentérica relativa en ratas. El periodo de hemorragia después de la administración de la sustancia de ensayo se relacionó con el periodo de hemorragia de control medio antes de la administración de la sustancia.
Los valores se han mostrado como la media ± DTM, n = 8.
** significativamente diferente del vehículo, p < 0,01;
*** diferente significativamente del vehículo, p < 0,001. La Fig. 13 muestra la inhibición de la quimiotaxis de neutrófilos inducida por IL-8 mediante la variante de
TFPI mut4EA de acuerdo con la invención. La Fig. 14 muestra la inhibición del aumento de la permeabilidad inducido por CAP37 mediante la variante de TFPI mut4EA de acuerdo con la invención.
Tabla 1 Definición de un dominio Kunitz
1 2 3 4 5 1234567890123456789012345678901234567890123456789012345678 xxxxCxxxxxxGxCxxxxxxXXXxxxxxxCxxFxXXGCxXxxXxXxxxxxCxxxCxxx
X21 = Phe, Tyr, Trp X22 = Tyr, Phe, Trp, Ala, His X23 = Tyr o Phe X35 = Tyr, Phe, Ser X36 = Gly, Ser, Arg, Thr X40 = Gly, Ala, Arg X43 = Asn o Gly X45 = Phe o Tyr Aminoácido 1, 2, 3, 4 puede estar ausente Aminoácido 56, 57, 58 puede estar ausente
Tabla 2 : Secuencias de algunos dominios Kunitz naturales
Tabla 3 : Secuencias de algunos dominios Kunitz no naturales
10 15
Tabla 4: Valores de CI50 de algunos dominios Kunitz para la inhibición de tripsina, plasmina y calicreina del plasma humanas 5
Tabla 5: Aminoácidos de la región con actividad inhibidora de dominios Kunitz naturales o no naturales que pueden sustituirse por los aminoácidos correspondientes de hTFPI DI
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (9)
- REIVINDICACIONES
- Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Variantes de hTFPI DI de la fórmula general MHSFCAFKAX10Xi1GPCX15X16X17X18X19X2oX2iX22FNIFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESL EECKKMCTRD caracterizadas porque tiene al menos una mutación en las posiciones ?0 , Xn, X15 , X16, X17, X18, x19, x20, X2i y X22 en comparación con la secuencia natural, donde X10 es los aminoácidos D, E, Y, V 0 Xll es los aminoácidos D O T, Xis es los aminoácidos K O R, X16 es los aminoácidos A, Xl7 es los aminoácidos I, R, S O A, Xl8 es los aminoácidos M, I, F 0 H, Xl9 es los aminoácidos K, I O ' P, X20 es los aminoácidos R, X21 es los aminoácidos F O , y X22 es los aminoácidos F 0 , excluyendo el péptido de la secuencia SEC ID N° 1 (TFPI mutl) . 2. Péptidos de conformidad con la reivindicación 1, caracterizados porque comprenden adicionalmente los aminoácidos E y A en el extremo N.
- 3. Péptidos de conformidad con la reivindicación 1, caracterizados porque son seleccionados entre el grupo que comprende : Sec ID N° 3 (TFPI mutl3), Sec ID N° 4 (TFPI mut3), Sec ID N° 5 (TFPI mut4), Sec ID N° 7 (TFPI mut2), Sec ID N° 8 (TFPI mut5) , Sec ID N° 9 (TFPI mut6) , Sec ID N° 10 (TFPI aleatorio) , Sec ID N° 11 (TFPI mut7) , Sec ID N° 12 (TFPI mut8) , Sec ID N° 13 (TFPI mut9) , Sec ID N° 14 (TFPI mutlO) , Sec ID N° 15 (TFPI mutll), y Sec ID N° 16 (TFPI mutl2).
- 4. Péptidos de conformidad con la reivindicación 2, caracterizados porque son seleccionados entre el grupo que comprende : Sec N° 17 (TFPI mutl5) , Sec N° 18 (TFPI mutl3EA) , Sec N° 19 (TFPI mut3EA) , Sec N° 20 (TFPI mut4EA) , Sec N° 21 (TFPI mut2EA) , Sec N° 22 (TFPI mut5EA) , Sec N° 23 (TFPI mut6EA) , Sec N° 24 (TFPI aleatorioEA) , Sec N° 25 (TFPI mut7EA) , Sec N° 26 (TFPI mut8EA) , Sec N° 27 (TFPI mut9EA) , Sec N° 28 (TFPI mutlOEA) , Sec N° 29 (TFPI mutllEA) , Sec N° 30 (TFPI mutl2EA) , y Sec N° 31 (TFPI mutl5EA) .
- 5. ADN caracterizado porque codifica uno de los péptidos de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4.
- 6. Vector caracterizado porque comprende el ADN de conformidad con la reivindicación 5.
- 7. Microorganismo caracterizado porque comprende el ADN de conformidad con la reivindicación 5.
- 8. Procedimiento para preparar los péptidos de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque es mediante expresión del microorganismo de conformidad con la reivindicación 5.
- 9. Medicamento caracterizado porque comprende uno o más de los péptidos de conformidad con las reivindicaciones 1 a
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