MX2008010999A

MX2008010999A - Tratamientos anti-tumor mejorados.

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Publication number: MX2008010999A
Application number: MX2008010999A
Authority: MX
Inventors: Glynn Thomas Faircloth; Pablo Manuel Aviles Marin; Doreen Lepage; Jesus San Miguel Izquierdo; Atanasio Pandiella
Original assignee: Pharma Mar Sa
Priority date: 2006-02-28
Filing date: 2007-02-28
Publication date: 2008-09-08
Also published as: PT2029155E; DK2029155T3; EP2029155A4; IL193094A; JP2009528379A; KR101512503B1; KR20140101014A; PL2029155T3; CA2643238A1; HK1127294A1; CN101389347A; NO20084047L; EP2029155A2; US8258098B2; JP5393159B2; HUE028055T2; KR20080105123A; ME02450B; CA2643238C; AU2007220050A1

Abstract

La presente invención se refiere a combinaciones de aplidina o análogos de aplidina con otros agentes anti-tumorales, y al uso de estas combinaciones en el tratamiento de cáncer, en particular en el tratamiento de cáncer de pulmón, cáncer de seno, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer renal, melanoma, mieloma múltiple, leucemia y linfoma.

Description

TRATAMIENTOS ANTI-TUMOR MEJORADOS Campo de la Invención La presente invención se refiere a combinaciones de Aplidina o análogos de aplidina con otros agentes anti-tumor, y al uso de estas combinaciones en el tratamiento de cáncer, en particular en el tratamiento de cáncer de pulmón, cáncer de seno, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer renal, melanoma, mieloma múltiple, leucemia y linfoma. Antecedentes de la Invención La Aplidina (Deshidrodidemnina B) es un depsipéptido cíclico que fue aislado de un tunicado marino del Mediterráneo Aplidium albicans, y es el asunto de la Publicación WO 9104985. Se refiere a compuestos conocidos como didemninas, y tiene la siguiente estructura: Se puede encontrar más información con respecto a Aplidina, análogos de aplidina, sus usos, formulaciones y síntesis en las Solicitudes de Patente No. WO 99 42125, WO 01 35974, WO 01 76616, WO 02 30441, WO 02 02596, WO 03 33013 y WO 2004 080477. Hemos incorporado como referencia específica el contenido de cada uno de estos textos PCT. En estudios pre-clínicos tanto animales como estudios clínicos fase I en humanos, la Aplidina ha mostrado tener potencial citotóxico contra un amplio espectro de tipos de tumor incluyendo leucemia y linfoma. Ver por ejemplo las Publicaciones: Faircloth, G. y asociados: "Deshidrodidemnina B (DDB) un agente anti-cáncer nuevo derivado de marinos con actividad contra modelos de tumor experimental", 9o NCI-EORTC Symp. New Drugs Cáncer Ther. (marzo 12-15, Amsterdam) 1996, Abst 111; Faircloth, G. y asociados: "Caracterización preclínica de aplidina, un nuevo depsipéptido anti-cáncer marino", Proc. Amer. Assoc. Cáncer Res. 1997, 38: Abst 692; Depenbrock H, Peter R, Faircloth GT, Manzanares I, Jimeno J, Hanauske AR.: "Actividad ¡n vitro de Aplidina, un Nuevo compuesto anti-cáncer derivado de marinos, en células de tumor humano clonogénico explantado en forma reciente y células precursoras hematopoyéticas" . Br. J. Cáncer, 1998; 78: 739-744; Faircloth G, Grant W, Nam S, Jimeno J, Manzanares I, Rinehart K.: "Dependencia de programa de Aplidina, un depsipéptido marino con actividad antitumor", Proc. Am. Assoc.

Cáncer Res. 1999; 40: 394; Broggini M, Marchini S, D'lncalci M, Taraboletti G, Giavazzi R, Faircloth G, Jimeno J.: "Secreción VEGF de bloques de Aplidina y lazo autocrino VEG F/VEG F-R 1 en una línea celular leucémica humana", Clin. Cáncer Res. 2000; 6 (suppl): 4509; Erba E, Bassano L, Di Liberti G, Muradore I, Chiorino G, Ubezio P, Vignati S, Codegoni A, Desiderio MA, Faircloth G, Jimeno J y D'lncalci M.: "Perturbaciones de fase de ciclo celular y apoptósis en células de tumor inducidas mediante aplidina", Br. J. Cáncer 2002; 86: 1510-1517; Paz-Ares L, Anthony A, Pronk L, Twelves C, Alonso S, Cortes-Funes H, Celli N, Gómez C, Lopez-Lazaro L, Guzman C, Jimeno J, Kaye S.: "Estudio clínico fase I y farmacocinética de aplidina, una nueva didemnina marina, administrada como una infusión de 24-horas semanal" Clin. Cáncer Res. 2000; 6 (suppl): 4509; Raymond E, Ady-Vago N, Baudin E, Ribrag V, Faivre S, Lecot F, Wright T, López Lázaro L, Guzman C, Jimeno J, Ducreux M, Le Chevalier T, Armand JP.: "Estudio farmacocinético y de fase I de aplidina administrado como una infusión continua de 24 horas y cada tercera semana en pacientes con tumor sólido y linfoma" Clin. Cáncer Res. 2000; 6 (suppl): 4510; Maroun J, Belanger K, Seymour L, Soulieres D, Charpentier D, Goel R, Stewart D, Tomiak E, Jimeno J, Matthews S. :"Estudio fase I de aplidina en un bolo de 5 día cada 3 semanas en pacientes con tumores sólidos y linfomas", Clin. Cáncer Res. 2000; 6 (suppl): 4509; Izquierdo MA, Bowman A, Martínez M, Cicchella B, Jimeno J, Guzman C, Germa J, Smyth J.: "Prueba fase I de Aplidina administrada como una infusión semanal intravenosa de 1 hora en pacientes con tumores sólidos avanzados y linfoma", Clin. Cáncer Res. 2000; 6 (suppl): 4509. Los estudios mecánicos indican que la Aplidina puede bloquear la secreción VEGF en células ALL-MOLT4 y la actividad citotóxica in vitro en bajas concentraciones (5n M) ha sido observada en muestras AML y ALL procedentes de pacientes pediátricos con ALL y AML de novo y recurrente. La Aplidina parece inducir la detención tanto de G1 y como de G2 en células de leucemia tratadas con fármacos in vitro. Además de desactivar el receptor VEGF, no se sabe más con respecto al modo(s) de acción de Aplidina. En estudios clínicos fase I con Aplidina, se administró L-carnitina como un tratamiento previo de 24 horas o se administró en conjunto para evitar la mielotoxicidad , ver por ejemplo la Publicación WO 02 30441. La co-administración de L-carnitina probó tener la capacidad de mejorar la recuperación de la toxicidad muscular inducida con fármacos y permitió el escalado de la dosis de Aplidina.

Previamente, se llevaron a cabo ensayos in vitro e in vivo con Aplidina en combinación con otros agentes anti-cáncer, lo cual mostraron que las combinaciones de fármaco ensayadas fueron útiles en terapia de combinación para el tratamiento de leucemia y linfoma. En la Publicación WO 2004 080421, se evalúo específicamente la Aplidina en combinación con metotrexato, arabinósida de citosina, mitoxantrona, vinblastina, metilprednisolone y doxorubicina para el tratamiento de leucemia y linfoma. Ya que el cáncer es una causa principal de muerte en animales y humanos, se han realizado varios esfuerzo y aún están siendo llevados a cabo, con el objeto de obtener una terapia anti-tumor activa y segura para que sea administrada a pacientes que padecen de un cáncer. El problema será resuelto a través de la presente invención, es proporcionar terapias antitumor que sean útiles en el tratamiento de cáncer. Breve Descripción de la Invención Hemos establecido que Aplidina y los análogos de aplidina potencian otros agentes anti-cáncer, y por consiguiente pueden ser utilizados con éxito en terapia de combinación para el tratamiento de cáncer. La presente invención se dirige a composiciones farmacéuticas, formas de dosificación farmacéuticas, equipos, métodos para el tratamiento de cáncer, utilizando estas terapias de combinación y usos de Aplidina y análogos de aplidina en la fabricación de un medicamento para terapia de combinación. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona terapias de combinación efectivas con base en Aplidina y análogos de aplidina, utilizando otros fármacos que son efectivos en el tratamiento de cáncer. Preferentemente, el otro o los otros fármacos son efectivos en el tratamiento de cáncer seleccionado de cáncer de pulmón, cáncer de seno, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer renal, melanoma, mieloma múltiple, leucemia y linfoma. Más preferentemente, el otro o los otros fármacos se seleccionan del grupo que consiste en paclitaxel (TaxoF), doxorubicina, cisplatino, trióxido arsénico, 5-fluorouracil (5-FU), arabinósida de citosina (AraC), carboplatino, 7-etil-10-hidroxicamptotecina (SN38), etopósido (VP16), melfalan, dexametasona, ciclofosfamida , bortezomib, erlotinib, trastuzumab, lenalidomida (Revlimid®), interleucina-2 (IL-2), interferón-a 2 (INF-a), dacarbazina (DTIC), bevacizumab (Avastin®), idarubicina, talidomida, y rituximab. En otra modalidad, la presente invención comprende un método para tratar cáncer, en donde el método comprende administrar a un paciente que necesita de tratamiento una cantidad terapéuticamente efectiva de Aplidina o un análogo de aplidina, o un profármaco, sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo, y una cantidad terapéuticamente efectiva de otro fármaco el cual es efectivo en el tratamiento de cáncer o un profármaco, sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo, administrado antes, durante, o después de la administración de Aplidina o análogo de aplidina. En una modalidad adicional de la presente invención, se administra una cantidad terapéuticamente efectiva de un tercer fármaco, y se administra antes, durante, o después de la administración de Aplidina o análogo de aplidina y el segundo fármaco. Preferentemente, el otro o los otros fármacos son efectivos en el tratamiento de un cáncer seleccionado de cáncer de pulmón, cáncer de seno, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer renal, melanoma, mieloma múltiple, leucemia y linfoma. Más preferentemente el otro o los otros fármacos se seleccionan del grupo que consiste en paclitaxel (Taxol®), doxorubicina, cisplatino, trióxido arsénico, 5-fluorouracil (5-FU), arabinósida de citosina (AraC), carboplatino, 7-eti 1-10-hidroxicamptotecina (SN38), etopósido (VP16), melfalan, dexametasona , ciclofosfamida, bortezomib, erlotinib, trastuzumab, lenalidomida (Revlimid®), interleucina-2 (IL-2), interferón-a 2 (INF-a), dacarbazina (DTIC), bevacizumab (Avastin®), idarubicina, talidomida, y rituximab. El otro o los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición, o proporcionarse como una composición separada para administración al mismo tiempo o en momentos diferentes. En otro aspecto, la presente invención comprende un método para incrementar la eficacia terapéutica de un fármaco efectivo en el tratamiento de cáncer, preferentemente un fármaco efectivo en el tratamiento de un cáncer seleccionado de cáncer de pulmón, cáncer de seno, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer renal, melanoma, mieloma múltiple, leucemia y linfoma, más preferentemente un fármaco seleccionado del grupo que consiste en paclitaxel (Taxol®), doxorubicina, cisplatino, trióxido arsénico, 5-fluorouracil (5-FU), arabinósida de citosina (AraC), carboplatino, 7-eti 1-10-hidroxicamptotecina (SN38), etopósido (VP16), melfalan, dexametasona, ciclofosfamida, bortezomib, erlotinib, trastuzumab, lenalidomida (Revlimid®), interleucina-2 (IL-2), interferón-a 2 (INF-a), dacarbazina (DTIC), bevacizumab (Avastin®), idarubicina, talidomida, y rituximab, o un profármaco, sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el método comprende administrar a un paciente que necesita del mismo una cantidad de Aplidina o un análogo de aplidina, o un profármaco, sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo. La Aplidina o el análogo de aplidina se administra antes, durante, o después de administrar el otro fármaco. En una modalidad adicional, en la presente invención se administra una cantidad terapéuticamente efectiva del tercer fármaco, y se administra antes, durante, o después de la administración de Aplidina o un análogo de aplidina y el segundo fármaco. Preferentemente el tercer fármaco es un fármaco efectivo en el tratamiento de un cáncer seleccionado de cáncer de pulmón, cáncer de seno, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer renal, melanoma, mieloma múltiple, leucemia y linfoma. Más preferentemente el tercer fármaco se selecciona del grupo que consiste en paclitaxel (Taxol®), doxorubicina, cisplatino, trióxido arsénico, 5-fluorouracil (5-FU), arabinosida de citosina (AraC), carboplatino, 7-etil- 10- hidroxicamptotecina (SN38), etopósido (VP16), melfalan, dexametasona, ciclofosfamida , bortezomib, erlotinib, trastuzumab, lenalidomida (Revlimid®), interleucina-2 (IL-2), interferón-a 2 (INF-a), dacarbazina (DTIC), bevacizumab (Avastin®), idarubicina, talidomida, y rituximab, o un profármaco, sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo. En un aspecto adicional la presente invención comprende una composición farmacéutica que comprende Aplidina o un análogo de aplidina, o un profármaco, sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo, y otro fármaco efectivo en el tratamiento de cáncer. En una modalidad adicional de la presente invención, la composición farmacéutica comprende además un tercer fármaco también efectivo en el tratamiento de cáncer. Preferentemente el otro o los otros fármacos son efectivos en el tratamiento de un cáncer seleccionado de cáncer de pulmón, cáncer de seno, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer renal, melanoma, mieloma múltiple, leucemia y linfoma. Más preferentemente el otro o los otros fármacos se seleccionan del grupo que consiste en paclitaxel (Taxol ), doxorubicina, cisplatino, trióxido arsénico, 5-fluorouracil (5-FU), arabinósida de citosina (AraC), carboplatino, 7-etil-10-hidroxicamptotecina (SN38), etopósido (VP16), melfalan, dexametasona, ciclofosfamida, bortezomib, erlotinib, trastuzumab, lenalidomida (Revlimid®), interleucina-2 (IL-2), interferón-a 2 (INF-a), dacarbazina (DTIC), bevacizumab (Avastin®), idarubicina, talidomida, y rituximab. La presente invención también comprende un equipo para utilizarse en el tratamiento o prevención de cáncer, el cual comprende una forma de dosificación de Aplidina o un análogo de aplidina, o un profármaco, sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo, una forma de dosificación de otro fármaco efectivo en el tratamiento de cáncer, o un profármaco, sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo, e instrucciones para el uso de cada uno en combinación para el tratamiento o para prevención de cáncer. En una modalidad adicional de la presente invención, el equipo comprende además una forma de dosificación de un tercer fármaco también efectivo en el tratamiento de cáncer, o un profármaco, sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo. Preferentemente el otro o los otros fármacos son efectivos en el tratamiento de un cáncer seleccionado de cáncer de pulmón, cáncer de seno, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer renal, melanoma, mieloma múltiple, leucemia y linfoma. Más preferentemente el otro o los otros fármacos se seleccionan del grupo que consiste en paclitaxel (Taxol®), doxorubicina, cisplatino, trióxido arsénico, 5-fluorouracil (5-FU), arabinósida de citosina (AraC), carboplatino, 7 - e t i I - 1 O-hidroxicamptotecina (SN38), etopósido (VP16), melfalan, dexametasona, ciclofosfamida , bortezomib, erlotinib, trastuzumab, lenalidomida (Revlimid®), interleucina-2 (IL-2), interferón-a 2 (INF-a), dacarbazina (DTIC), bevacizumab (Avastin®), idarubicina, talidomida, y rituximab. Las terapias de combinación efectivas con base en el uso de los tres fármacos, Aplidina y análogos de aplidina, más dos fármacos adicionales (un segundo fármaco y un tercer fármaco), también están comprendidos en la presente invención. En un aspecto, la presente invención se refiere a combinaciones sinérgicas. Breve Descripción de las Figuras La figura 1 , es un ejemplo de un análisis de regresión lineal el cual es un método para revelar la presencia de sinergia. La figura 2, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con paclitaxel (Taxol®) contra células SKBR3. La figura 3, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con paclitaxel (Taxol®) contra células MOLT3.

La figura 4, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con paclitaxel (Taxol®) contra células PC3. La figura 5, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con paclitaxel (Taxol®) contra células HL60. La figura 6, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con paclitaxel (Taxol®) contra células MX1. La figura 7, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con paclitaxel (Taxol®) contra células A549. La figura 8, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con doxorubicina (DOX) contra células A549. La figura 9, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con doxorubicina (DOX) contra células HT29. La figura 10, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con doxorubicina (DOX) contra células PC3. La figura 11, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con doxorubicina (DOX) contra células MOLT3. La figura 12, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin ) en combinación con doxorubicina (DOX) contra células MX1. La figura 13, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con doxorubicina (DOX) contra células SKBR3. La figura 14, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (AP, Aplidin®) en combinación con cisplatino (DDP) contra células MX1. La figura 15, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con cisplatino (cis-DDP) contra células HT29. La figura 16, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (APL, Aplidin®) en combinación con cisplatino (cis-DDP, DDP) contra células SKBR3. La figura 17, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con cisplatino (cis-DDP, DDP) contra células MOLT3. La figura 18, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con cisplatino (cis-DDP, DDP) contra células A549. La figura 19, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con trióxido arsénico (TRI) contra células A549. La figura 20, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con trióxido arsénico (TRI) contra células HT29. La figura 21, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con trióxido arsénico (TRI) contra células PC3. La figura 22, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con trióxido arsénico (TRI) contra células MOLT3. La figura 23, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con 5-fluorouracil (5FU) contra células HL60. La figura 24, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con 5-fluorouracil (5FU) contra células SKBR3. La figura 25, son datos de la activida.d in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con 5-fluorouracil (5FU) contra células A549. La figura 26, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con 5-fluorouracil (5FU) contra células PC3. La figura 27, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con 5-fluorouracil (5FU) contra células HT29. La figura 28, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con arabinósida de citosina (AraC) contra células SKBR3.

La figura 29, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con arabinósida de citosina (AraC) contra células A549. La figura 30, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con arabinósida de citosina (AraC) contra células PC3. La figura 31, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con arabinósida de citosina (AraC) contra células HL60. La figura 32, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con arabinósida de citosina (AraC) contra células HT29. La figura 33, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con carboplatino contra células PC3. La figura 34, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con carboplatino contra células HT29.

La figura 35, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con carboplatino contra células A549.

La figura 36, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con carboplatino contra células MOLT3. La figura 37, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con carboplatino contra células MX1. La figura 38, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con SN-38 contra células A549.

La figura 39, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con SN-38 contra células SKBR3. La figura 40, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con SN-38 contra células HL60. La figura 41, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con SN-38 contra células PC3. Las figuras 42A y 42B, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (A, Aplidin®) en combinación con VP16 (B) contra células HL-60. Las figuras 43A y 43B, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (A, Aplidin®) en combinación con VP16 (B) contra células K562. Las figuras 44A y 44B, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (A, Aplidin®) en combinación con VP16 (B) contra células OLT-3. Las figuras 45A y 45B, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (A, Aplidin®) en combinación con VP16 (B) contra células MC116. Las figuras 46A y 46B, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (A, Aplidin®) en combinación con VP16 (B) contra células RAMOS. Las figuras 47A y 47B, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (A, Aplidin®) en combinación con VP16 (B) contra células U937. Las figuras 48A y 48B, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (A, Aplidin®) en combinación con VP16 (B) contra células NCI-H929. Las figuras 49A y 49B, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (A, Aplidin®) en combinación con VP16 (B) contra células HUNS-1. Las figuras 50A y 50B, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (A, Aplidin®) en combinación con VP16 (B) contra células U266 B1. Las figuras 51A y 51B, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (A, Aplidin®) en combinación con VP16 (B) contra células RPMI 8226. La figura 52, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con carboplatino contra células LOX-l-MVI. La figura 53, son datos de la actividad in vitro de Aplidina (Aplidin®) en combinación con carboplatino contra células UACC-257. La figura 54, la respuesta de dosis a Aplidina después de (tratamiento 48 horas) en líneas celulares de MMIS, MMIR, U266 y U266-LR7. La figura 55, es una comparación de la eficacia de dosis de Aplidina (Aplidin®) y otros fármacos en la línea celular MMIS (48 horas de tratamiento). La figura 56, es una combinación de Aplidina (Aplidin®) y Dexametasona en 3 días.

A) Curva de efecto de dosis. B) Trazo Fa-CI. La figuras 57, es una combinación de Aplidina (Aplidin®) y Dexametasona en 6 días. A) Curva de efecto de dosis. B) Trazo Fa-CI. La figura 58, es una combinación de Aplidina (Aplidin®) y Melfalan en 3 días. A) Curva de efecto de dosis. B) Trazo Fa-CI.

La figura 59, es una combinación de Aplidina (Aplidin®) y Melfalan en 6 días. A) Curva de efecto de dosis. B) Trazo Fa-CI. La figura 60, es una combinación de Aplidina (Aplidin®) y Doxorubicina en 3 días. A) Curva de efecto de dosis. B) Trazo Fa-CI. La figura 61, es una combinación de Aplidina (Aplidin®) y Doxorubicina en 6 días. A) Curva de efecto de dosis. B) Trazo Fa-CI. La figura 62, es una combinación de Aplidina (Aplidin®) y Lenalidomida ( evlimid®) en 3 días. A) Curva de efecto de dosis. B) Trazo Fa-CI. La figura 63, es una combinación de Aplidina (Aplidin®) y Lenalidomida (Revlimid®) en 6 días. A) Curva de efecto de dosis. B) Trazo Fa-CI. La figura 64, es una combinación de Aplidina (Aplidin®) y Bortezomib en 3 días. A) Curva de efecto de dosis. B) Trazo Fa-CI. La figura 65, es una combinación de Aplidina (Aplidin®) y Bortezomib en 6 días. A) Curva de efecto de dosis. B) Trazo Fa- Cl. La figura 66, son las cinéticas del volumen de tumor neto después del inicio de tratamiento con Aplidina (Aplidin®) como un agente simple o en combinación con Dacarbazina en xenoinjertos de tumor de melanoma MRI-H-187. La figura 67, son las cinéticas del volumen de tumor neto después del inicio de tratamiento con Aplidina (Aplidin®) como un agente simple o en combinación con Carboplatino en xenoinjertos de tumor en melanoma MRI-H-187. La figura 68, son las cinéticas del volumen de tumor neto después del inicio de tratamiento con Aplidina (Aplidin®) como un agente simple o en combinación con lnterleucina-2 (IL- 2) en xenoinjertos de tumor de melanoma MRI-H-187. La figura 69, son las cinéticas del volumen de tumor neto después del inicio de tratamiento con Aplidina (Aplidin®) como un agente simple o en combinación con I nterferón-a 2a (INF-a) en xenoinjertos de tumor de melanoma MRI-H-187. Las figuras 70, son las cinéticas del volumen de tumor neto después del inicio de tratamiento con Aplidina (APL) como un agente simple o en combinación con Dacarbazina (DTIC) en xenoinjertos de tumor de melanoma LOX-IMVI. La figura 71, son las cinéticas del volumen de tumor neto después del inicio de tratamiento con Aplidina (APL) como un agente simple o en combinación con Carboplatino en xenoinjertos de tumor de melanoma LOX-IMVI.

La figura 72, son las cinéticas del volumen de tumor neto después del inicio de tratamiento con Aplidina (APL, Api i d i n®) como un agente simple o en combinación con I nterleuci na-2 (IL-2) en xenoinjertos de tumor de melanoma LOX-IMVI. La figura 73, son las cinéticas del volumen de tumor neto después del inicio de tratamiento con Aplidina (APL, Aplidin®) como un agente simple o en combinación con I nterferón-a 2a (INF-a) en xenoinjertos de tumor de melanoma LOX-IMVI. La figura 74, son las cinéticas del volumen de tumor neto después del inicio de tratamiento con Aplidina (APL) como un agente simple o en combinación con Bevacizumab (Avastin®) en xenoinjertos de tumor renal CaKi-1. La figura 75, son las cinéticas del volumen de tumor neto después del inicio de tratamiento con Aplidina (APL) como un agente simple o en combinación con lnterleucina-2 (IL-2) en xenoinjertos de tumor renal CaKi-1. La figura 76, son las cinéticas del volumen de tumor neto después del inicio de tratamiento con Aplidina (APL) como un agente simple o en combinación con I nterferón-a 2a (INF-a 2a) en xenoinjertos de tumor renal CaKi-1. La figura 77, son las cinéticas del volumen de tumor neto después del inicio de tratamiento con Aplidina (APL) como un agente simple o en combinación con Bevacizumab (Avastin®) en xenoinjertos de tumor renal MRI-H121. La figura 78, son las cinéticas del volumen de tumor neto después del inicio de tratamiento con Aplidina (APL) como un agente simple o en combinación con lnterleucina-2 (IL-2) en xenoinjertos de tumor renal MRI-H121. La figura 79, son las cinéticas del volumen de tumor neto después del inicio de tratamiento con Aplidina (APL) como un agente simple o en combinación con lnterferón-a 2a (INF-a) en xenoinjertos de tumor renal MRI-H121. La figura 80, es una combinación de Aplidina (A) + Lenalidomida (Revlimid®; R) + Dexametasona (D) en MMIS después de 72 horas de tratamiento. Las dosis de Aplidina se expresan en unidad de nM, las dosis de Lenalidomida se expresan en unidades µ M y Dexametasona se expresan en unidades nM. La figura 81, es una combinación de Aplidina (A) + Bortezomib (B) + Dexametasona (D) en MMIS después de 72 horas de tratamiento. Las dosis de Aplidina se expresan en unidades, las dosis de Bortezomib se expresan en unidades y las dosis de Dexametasona se expresan en unidades nM. La figura 82, es una combinación de Aplidina (A) + Bortezomib (B) + Lenalidomida (Revlimid®; R) en MMIS después de 72 horas de tratamiento. Las dosis de Aplidina se expresan en unidades nM, las dosis de Bortezomib se expresan en unidades y Lenalidomida se expresan en unidades µ?. La figura 83, es una combinación de Aplidina (A) + Talidomida (T) + Dexametasona (D) en MMIS después de 72 horas de tratamiento. Las dosis de Aplidina se expresan en unidades, la dosis de Talidomida se expresan en unidades µ? y las dosis de Dexametasona se expresan en unidades nM. La figura 84, es una combinación de Aplidina (A) + Melfalan (M) + Dexametasona (D) en MMIS después de 72 horas de tratamiento. Las dosis de Aplidina se expresan en unidades, las dosis de Melfalan se expresan en unidades µ? y las dosis de Dexametasona se expresan en unidades nM. La figura 85, es una combinación de Aplidina (A) + Melfalan (M) + Bortezomib (B) en MMIS después de 72 horas de tratamiento. Las dosis de Aplidina se expresan en unidades nM, las dosis de Melfalan se expresan en unidades µ? y las dosis de Bortezomib se expresan en unidades nM. Breve Descripción de la Invención Por el término "cáncer" se entiende que incluye tumores, neoplasias y cualquier orden o tejido o células malignas. La presente invención se dirige al uso de Aplidina o un análogo de aplidina en combinación par los tratamientos de cáncer en general, aún más preferentemente para el tratamiento de cáncer de pulmón, cáncer de seno, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer renal, melanoma, mieloma múltiple, leucemia y linfoma. Con el objeto de estudiar la potenciación posible de otros agentes anti-cáncer con Aplidina iniciamos un estudio sistemático de combinaciones de fármaco para el posible uso en los tipos de cáncer antes mencionados. Los estudios de combinación de fármaco se llevaron a cabo en diferentes tipos de líneas celulares. Los estudios in vitro se llevaron a cabo utilizando líneas de células de tumor tales como NSCL A549, carcinoma de seno MX1, leucemia promielocítica HL60, adenocarcinoma de colon HT29, adenocarcinoma de próstata PC3, adenocarcinoma de seno SKB R3 y leucemia linfoblástica aguda (MOLT3), los cuales tiene diferente sensibilidad a Aplidina (de baja a alta). Se llevaron estudios adicionales con líneas celulares de leucemias, linfomas, mieloma múltiple y melanoma. Además, los estudios in vivo utilizando melanoma, xenoinjertos renales, de mieloma, y linfomas se utilizaron para establecer el efecto de Aplidina en combinación con otros agentes estándar. Finalmente, los estudios in vitro se llevaron a cabo en líneas celulares de mieloma múltiple utilizando combinaciones triples, esto es combinando Aplidina con dos agentes estándares adicionales (un segundo y un tercer fármaco). Como conclusión general, descubrimos que la citotoxicidad de Aplidina en células de tumor, se mejora en gran parte en combinación con muchos de los agentes estándar utilizados para esta evaluación. Se observó un efecto sinérgico importante con la combinación de Aplidina con paclitaxel (Taxol®), doxorubicina, cisplatino, trióxido arsénico, 5-fluorouracil (5-FU), arabinósida de citosina (AraC), carboplatino, 7-eti 1-10- hidroxicamptotecina (SN38), etopósido (VP16), melfalan, dexametasona, ciclofosfamida, bortezomib, erlotinib, trastuzumab, lenalidomida (Revlimid®), interleucina-2 (IL-2), interferón-a2 (INF-a), dacarbazina (DTIC), bevacizumab (Avastin®), idarubicina, talidomida, y rituximab. Además, se descubrió que también se obtuvo una mejoría en la citotoxicidad con combinaciones triples de Aplidina con los agentes antes mencionados. Particularmente preferida es la combinación de Aplidina con paclitaxel en el tratamiento de cáncer, y más particularmente en el tratamiento de un cáncer seleccionado de cáncer de seno, leucemia, y cáncer de próstata. Particularmente preferida es la combinación de Aplidina con doxorubicina en el tratamiento de cáncer, y más particularmente en el tratamiento de un cáncer seleccionado de cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de próstata, y mieloma múltiple. Particularmente preferida es la combinación de Aplidina con cisplatino en el tratamiento de cáncer, y más particularmente en el tratamiento de un cáncer seleccionado de cáncer de seno, y cáncer de colon. Particularmente preferida es la combinación de Aplidina con trióxido arsénico en el tratamiento de cáncer, y más particularmente en el tratamiento de un cáncer seleccionado de cáncer de pulmón, cáncer de colon, y cáncer de próstata.

Particularmente preferida es la combinación de Aplidina con 5-f luorouracil en el tratamiento de cáncer, y más particularmente en el tratamiento de un cáncer seleccionado de leucemia, cáncer de pulmón, cáncer de seno, y cáncer de próstata. Particularmente preferida es la combinación de Aplidina con arabinósida de citosina en el tratamiento de cáncer, y más particularmente en el tratamiento de un cáncer seleccionado de cáncer de pulmón, cáncer de seno, y cáncer de próstata. Particularmente preferida es la combinación de Aplidina con carboplatino en el tratamiento de cáncer, y más particularmente en el tratamiento de un cáncer seleccionado de cáncer de colon, cáncer de próstata, y melanoma. Particularmente preferida es la combinación de Aplidina con SN38 en el tratamiento de cáncer, y más particularmente en el tratamiento de cáncer de pulmón. Particularmente preferida es la combinación de Aplidina con etopósida en el tratamiento de cáncer, y más particularmente en el tratamiento de un cáncer seleccionado de linfoma, y mieloma múltiple. Particularmente preferida es la combinación de Aplidina con dexametasona en el tratamiento de cáncer, y más particularmente en el tratamiento de mieloma múltiple. Particularmente preferida es la combinación de Aplidina con lenalidomida en el tratamiento de cáncer, y más particularmente en el tratamiento de mieloma múltiple. Particularmente preferida es la combinación de Aplidina con bortezomib en el tratamiento de cáncer, y más particularmente en el tratamiento de mieloma múltiple. Particularmente preferida es la combinación de Aplidina con dacarbazina en el tratamiento de cáncer, y más particularmente en el tratamiento de melanoma. Particularmente preferida es la combinación de Aplidina con bevacizumab en el tratamiento de cáncer, y más particularmente en el tratamiento de cáncer renal. Particularmente preferida es la combinación de Aplidina con interleucina-2 en el tratamiento de cáncer, y más particularmente en el tratamiento de cáncer renal. Particularmente preferida es la combinación de Aplidina con melfalan en el tratamiento de cáncer, y más particularmente en el tratamiento de mieloma múltiple. Particularmente preferida es la combinación de Aplidina con idarubicina en el tratamiento de cáncer, y más particularmente en el tratamiento de leucemia. Particularmente preferida es la combinación de Aplidina con rituximab en el tratamiento de cáncer, y más particularmente en el tratamiento de linfoma. Particularmente preferida es la combinación de Aplidina con talidomida en el tratamiento de cáncer, y más particularmente en el tratamiento de mieloma múltiple.

Particularmente preferida es la triple combinación de Aplidina con lenalidomida y dexametasona en el tratamiento de cáncer, y más particularmente en el tratamiento de mieloma múltiple. Particularmente preferida es la triple combinación de Aplidina con bortezomib y dexametasona en el tratamiento de cáncer, y más particularmente en el tratamiento de mieloma múltiple. Particularmente preferida es la triple combinación de Aplidina con bortezomib y lenalidomida en el tratamiento de cáncer, y más particularmente en el tratamiento de mieloma múltiple. Particularmente preferida es la triple combinación de Aplidina con bortezomib y talidomida en el tratamiento de cáncer, y más particularmente en el tratamiento de mieloma múltiple. Particularmente preferida es la triple combinación de Aplidina con dexametasona y talidomida en el tratamiento de cáncer, y más particularmente en el tratamiento de mieloma múltiple. Particularmente preferida es la triple combinación de Aplidina con dexametasona y melfalan en el tratamiento de cáncer, y más particularmente en el tratamiento de mieloma múltiple. Particularmente preferida es la triple combinación de Aplidina con melfalan y bortezomib en el tratamiento de cáncer, y más particularmente en el tratamiento de mieloma múltiple. Las composiciones de la presente invención pueden comprender todos los componentes (fármacos) en una formulación farmacéuticamente aceptable simple. Como alternativa, los componentes pueden ser formulados por separado y administrados en combinación en combinación con otros. Varias formulaciones farmacéuticamente aceptables son conocidas para los expertos en la técnica y se pueden utilizar en la presente invención. La selección de una formulación adecuada para utilizarse en la presente invención se puede llevar a cabo en forma rutinaria a través de los expertos en la técnica, con base en el modo de administración y las características de solubilidad de los componentes de la composición. Los ejemplos de composiciones farmacéuticas que contienen Aplidina o un análogo de aplidina incluyen composiciones líquidas (soluciones, suspensiones, o emulsiones) adecuadas para administración intravenosa y pueden contener el compuesto puro o en combinación con cualquier transportador u otros compuestos farmacológicamente activos. La Aplidina solubilizada muestra degradación sustancial bajo condiciones de prueba de tensión por calor y luz, y se desarrolló una forma de dosificación liofilizada, ver la Publicación WO 99 42125 incorporada a la presente invención como referencia. La administración de Aplidina o composiciones de la presente invención se basa en un Protocolo de Dosificación Preferentemente mediante Infusión intravenosa. Preferimos utilizar tiempos de infusión de hasta 72 horas, más preferentemente 1 a 24 horas, con aproximadamente 1, aproximadamente 3 o aproximadamente 24 horas como los más preferidos. Los tiempos de infusión cortos que permiten que el tratamiento se lleve a cabo sin una estancia de una noche en el hospital, son especialmente deseables. Sin embargo, la infusión puede ser de alrededor de 24 horas o incluso más si se requiere. La infusión puede llevarse a cabo en intervalos adecuados con patrones diversos, en forma ilustrativa una vez a la semana, dos veces a la semana o más frecuentemente por semana, repetida cada semana opcionalmente con espacios normalmente de una o varias semanas. La dosis correcta de los compuestos de la combinación variará de acuerdo con la formulación particular, el modo de aplicación y el sitio particular, huésped y tumor que esté siendo tratado. También se deben tomar encuentra otros factores tipo la edad, peso corporal, sexo, dieta, tiempo de administración, rango de excreción, condición del huésped, combinaciones de fármaco, sensibilidades de reacción y severidad en la enfermedad. La administración se puede llevar a cabo en forma continua o periódica dentro de la dosis máxima tolerada. Una guía adicional para la administración de Aplidina se proporciona en la Publicación WO 01 35974, la cual está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia. En un aspecto, la presente invención se refiere a combinaciones sinérgicas que emplean Aplidina o un análogo de aplidina. Se puede obtener fácilmente una indicación de sinergia, probando combinaciones y analizando los resultados, por ejemplo, mediante análisis de regresión lineal. Se hace referencia a la figura 1 para ilustrar este punto. Están disponibles métodos alternativos, tal como análisis de isobolograma, para revelar la sinergia y se pueden emplear para los propósitos de la presente invención. Los análogos de aplidina adecuados incluyen los compuestos definidos en la reivindicación 1 de la Publicación WO 02 02596, especialmente los compuestos definidos a través de cualesquiera de las reivindicaciones que dependen de la reivindicación 1. Hemos incorporado como referencia específica, la descripción que se encuentra en la Publicación WO 02 02596 con respecto a los compuestos que son análogos de aplidina, incluyendo las reivindicaciones. EJEMPLOS EJEMPLO 1. Estudios in vitro para determinar el efecto de Aplidina en combinación con otro agente estándar en líneas de célula de tumor. Aplidina, en la forma de un agente simple o en combinación con agentes quimioterapéuticos estándar seleccionados, se evaluó contra varias líneas de células de tumor para medir las diferencias en citotoxicidad . Se seleccionaron los siguientes agentes estándar como agentes simples y para la combinación con Aplidina: paclitaxel (Taxol®), doxorubicina, cisplatino, trióxido arsénico (Trisonex®), 5-fluorouracil (5-FU), arabinósida de citosina (AraC), carboplatino y 7-eti I - 1 O-hidroxicamptotecina (SN38). Una Aplidina de agente simple es citotóxico para varios tipos de cáncer con una potencia diversa. Por esa razón, las lineas de célula de tumor representativas se seleccionaron para que tengan una sensibilidad baja, media o alta a Aplidina. Las líneas de célula de tumor que se utilizaron se describen en la tabla 1. Tabla 1 La clasificación se llevó a cabo en dos partes: a. En el primer grupo de ensayos, se determinaron los valores IC50 de cada compuesto después de 72 horas de exposición del fármaco en cada una de las líneas de célula de tumor. Todas las líneas celulares se mantuvieron en un medio de crecimiento respectivo a una temperatura de 37°C, 5% C02 y 98% de humedad. No todas las formulaciones del medio contuvieron antibióticos. El día antes del revestimiento de las células, todos los cultivos se alimentaron con un medio de crecimiento completo, fresco. El día de la cosecha (revestimiento) las células se contaron mediante un método de tinción por exclusión con Trypan Blue (cultivo celular básico). Las células se cosecharon y sembraron en placas de microtitulación de 96 depósitos en 10,000 células por depósito en 190 µ? de medio, y se incubaron durante 24 horas para permitir que las células se adhieran antes de la adición del fármaco. Se trataron células con los fármacos y se midió el efecto citotóxico a través del ensayo MTS (Tetrazolio), el cual es un método colorimétrico para determinar el número de células viables. Después de 72 horas de incubación con el fármaco, se agregó 25 µ? de una solución MTS + PMS a cada depósito de microtitulación y se incubó durante 4 horas a una temperatura de 37°C. Las placas se eliminaron posteriormente del incubador y se colocaron en un agitador de placa durante 5 minutos (cubierto con lámina de aluminio para la protección contra la luz). Se leyeron las densidades ópticas 490 nm en un lector de placa de espectrofotómetro . Los datos se analizaron utilizando el programa SoftMax v 3.12. Se calculó el IC50, el cual es el equivalente aproximado de IG50 (concentración en donde se mide una inhibición de crecimiento al 50%). Se generó una curva de regresión utilizando el programa SoftMax, y posteriormente se interpoló manualmente en una concentración de inhibición al 50% y se convirtió dicha concentración a molar (M) dividiendo entre el peso molecular del compuesto. Los valores IC50 individuales (72 horas de exposición de fármaco) se muestran en la tabla 2. Los valores IC50 representan el 100% de la concentración del fármaco .

Tabla 2 b. En un segundo grupo de ensayos, cada línea se incubó con Aplidina en combinación con cada uno de los agentes estándares mencionados anteriormente en las siguientes combinaciones de concentraciones IC50 únicas: IC50 de Aplidina IC50 de Agente Estándar 100% 0% 75% 25% 60% 40% 50% 50% 40% 60% 30% 70% 25% 75% 0% 100% 0% 0% Las placas se microtitulación se incubaron durante 72 horas, en 5% C02, y a una temperatura de 37°C. Se midió el efecto citotoxico mediante ensayo MTS. Las densidades ópticas se leyeron en 490 nm. Se trazaron datos normalizados y se interpretaron tal como se describió. Los datos se analizaron como: 1. Programa de software Prism (Graphpad) fue utilizado para normalizar los datos para valores de control (100% = crecimiento celular en la ausencia de un agente (fármaco); 0% = control en blanco). 2. Los datos normalizados se trazaron en la forma de trazos de dispersión. Se dibujó una línea que conecta los valores de IC50 100% de cada agente (fármaco). Los valores significativamente arriba de la línea indicaron antagonismo, debajo de la línea indicaron sinergia, y en la línea indicaron capacidad aditiva. El tratamiento estadístico de los datos es de acuerdo con las Publicaciones de Laska E. y asociados, Biometrics (1994) 50:834-841 y Greco y asociados, Pharmacol Rev. (1995) 47: 331-385. Las combinaciones en las proporciones de las dosis probadas se juzgaron como sinérgicas cuando la inhibición de la proliferación celular excedió valores de inhibición máxima para cada fármaco por separado (en un IC50 100%). De manera inversa, el antagonismo se concluyó cuando la inhibición fue menor a ambas máximas. La capacidad aditiva se concluyó cuando los efectos de combinaciones no fueron significativamente diferentes a la máxima de ambos fármacos. La importancia estadística fue evaluada llevando a cabo una prueba-t del estudiante en cuanto a la inhibición en cada proporción de dosis versus de inhibición en el máximo de cada fármaco. La significancia general de las combinaciones de fármaco para cada línea celular, fue dependiente de lo que muestra la significancia estadística para valores mayores al 50% de las proporciones de dosis. Como un auxiliar visual, se trazaron valores de respuesta en un trazo de dispersión con proporciones de dosis proporcionadas en el eje x y el porcentaje de los valores de respuesta en el eje y. se dibujó una línea horizontal entre los dos valores de respuesta de punto de extremo (por ejemplo entre los valores de respuesta Aplidina IC50 al 100% y el agente quimioterapéutico estándar IC50 al 100%). En casos en donde los valores de respuesta en los dos puntos de extremo fueron aproximadamente equivalentes, los puntos que están arriba o debajo de esta línea de capacidad aditiva anticipada pueden ser interpretados como que representan una interacción de fármaco antagónica o sinérgica, respectivamente. Las combinaciones in vitro de cada fármaco con Aplidina tienen el potencial de ser sinérgicas, aditivas o antagónicas. Las citotoxicidad sinérgica para las células de tumor, es un efecto óptimo e implica ante la combinación de Aplidina con otro fármaco es más efectiva que cualquier fármaco sólo. De acuerdo con este ensayo, se descubrió que: a. La combinación de Aplidina con paclitaxel mostró sinergia en células de adenocarcinoma de seno SKBR3 (figura 2), células de leucemia linfoblástica aguda MOLT3 (figura 3) y células de adenocarcinoma de próstata PC3 (figura 4). Se observó una tendencia a la capacidad aditiva en células de leucemia promielocítica HL60 (figura 5), célula de carcinoma de seno MX1 (figura 6) y células NSCL A549 (figura 7). b. La combinación de Aplidina con doxorubicina mostró sinergia en células NSCL A549 (figura 8), células de adenocarcinoma de colon HT29 (figura 9) y células de adenocarcinoma de próstata PC3 (figura 10). La capacidad aditiva se observó en células de leucemia linfoblástica aguda MOLT3 (figura 11), células de carcinoma de seno MX1 (figura 12) y células de adenocarcinoma de seno SKBR3 (figura 13). c. La combinación de Aplidina con cisplatina mostró sinergia en células de carcinoma de seno MX1 (figura 14) y células de adenocarcinoma de colon HT29 (figura 15). La capacidad aditiva se observó en células de adenocarcinoma de seno SKB R3 (figura 16) y células de leucemia linfoblástica aguda MOLT3 (figura 17), y en células NSCL A549 (figura 18) se descubrió la tendencia a la sinergia. d. La combinación de Aplidina con trióxido arsénico mostró sinergia en células NSCL A549 (figura 19), células de adenocarcinoma de colon HT29 (figura 20) y células de adenocarcinoma de próstata PC3 (figura 21). Se observó capacidad aditiva en células de leucemia linfoblástica aguda MOLT3 (figura 22). e. La combinación de Aplidina con 5-fluorouracil mostró sinergia en células de leucemia promielocítica HL60 (figura 23), células de adenocarcinoma de seno SKBR3 (figura 24), células NSCL A549 (figura 25) y células de adenocarcinoma de próstata PC3 (figura 26). Se observó capacidad aditiva en células de adenocarcinoma de colon HT29 (figura 27). f. La combinación de Aplidina con arabinósida de citosina mostró sinergia en células de adenocarcinoma de seno SKBR3 (figura 28), células de seno NSCL A549 (figura 29) y células de adenocarcinoma de próstata PC3 (figura 30). La capacidad aditiva se encontró en células de leucemia promielocítica HL60 (figura 31) y células de adenocarcinoma de colon HT29 (figura 32). g. La combinación de Aplidina con carboplatino mostró sinergia en células de adenocarcinoma de próstata PC3 (figura 33) y células de adenocarcinoma de colon HT29 (figura 34). Se observó capacidad aditiva en células NSCL A549 (figura 35), células de leucemia linfoblástica aguda MOLT3 (figura 36) y células de carcinoma de seno MX1 (figura 37). h. La combinación de Aplidina con SN38 mostró sinergia en células NSCL A549 (figura 38). Se observó capacidad aditiva en células de adenocarcinoma de seno SKBR3 (figura 39), células de leucemia promielocítica HL60 (figura 40) y células de adenocarcinoma de próstata PC3 (figura 41). Ejemplo 2. Estudios in vitro para determinar el efecto de Aplidina en combinación con otro agente estándar en líneas de células de leucemia, linfoma, mieloma múltiple y melanoma. Siguiendo el mismo procedimiento descrito en el ejemplo 1 , se evaluó Aplidina en la forma de un agente simple o en combinación con un agente quimioterapéutico estándar seleccionados, contra diversas líneas de células de tumor para medir diferencias en citotoxicidad. Se seleccionaron los siguientes agentes estándar como agentes simples y para combinación con Aplidina: etopósido (VP16) y carboplatino. Las líneas de célula de tumor seleccionadas para este ensayo se muestran en la tabla 3. Tabla 3 Método de cultivo celular Todas las líneas celulares se mantuvieron en los medios de crecimiento respectivos a una temperatura de 37°C, 5% C02 y 98% humedad. No todas las formulaciones del medio contuvieron antibióticos. El día antes del revestimiento de las células, todos los cultivos se alimentaron con un medio de crecimiento completo, freso. El día de la cosecha (revestimiento) las células se contaron mediante método de tinción por exclusión Trypan Blue. Revestimiento celular Se cosecharon y sembraron células en placas de microtitulación de 96 depósitos en 15,000 células por depósito en 190 µ? de un medio y se incubaron durante 24 horas hasta dejar que las células se adhirieran antes de la adición del fármaco . Tratamiento de fármaco Se prepare una solución de reserve de Aplidina en 100% DMSO en 5 mg/ml. Las soluciones de reserva de agentes quimioterapéuticos VP16 y carboplatino, se prepararon en DMSO al 100% en una concentración de 2 mg/ml para ambos fármacos. Se trataron células con Aplidina y los otros agentes estándar en el rango que se describe más adelante, y la concentración de fármacos individual se elaboraron por triplicado por placa. La concentración de los agentes de prueba utilizados se expresa como un porcentaje del IC50, del agente individual, los cuales se determinaron con en el Ejemplo 1.

Los valores IC50 de cada agente de cada línea celular se muestran en la tabla 4. Tabla 4 Se midió el efecto citotóxico mediante el ensayo MTS (Tetrazolio), el cual es un método colorimétrico para determinar el número de células viables. Después de 72 horas de incubación con los agentes probados, se agregaron 25 µ? de solución MTS + PMS a cada depósito de microtitulación y se incubaron durante 4 horas a una temperatura de 37°C. Posteriormente las placas se eliminaron del incubador y se colocaron en un agitador de placa durante 5 minutos (cubierto con una lámina de aluminio para protegerlo de la luz). Las densidades ópticas se leyeron en 490 nm en un lector de placa de espectrofotómetro. Los datos se analizaron como: 1. Se utilizó el programa de software Prism (Graphpad) para normalizar los datos a los valores de control (100% = crecimiento celular en la ausencia de un agente (fármaco); 0% = control en blanco). 2. Los datos normalizados se trazaron en trazos de dispersión. Se dibujó una línea que conecta los valores de IC50 100% de cada agente (fármaco). Los valores significativamente arriba de la línea indicaron antagonismo, debajo de la línea indicaron sinergia, y en la línea indicaron capacidad aditiva. El tratamiento estadístico de los datos es de acuerdo con las Publicaciones de Laska E. y asociados, Biometrics (1994) 50:834-841 y Greco y asociados, Pharmacol Rev. (1995) 47: 331-385. Las combinaciones en las proporciones de las dosis probadas se juzgaron como sinérgicas cuando la inhibición de la proliferación celular excedió valores de inhibición máxima para cada fármaco por separado (en un IC50 100%). De manera inversa, el antagonismo se concluyó cuando la inhibición fue menor a ambas máximas. La capacidad aditiva se concluyó cuando los efectos de combinaciones no fueron significativamente diferentes a la máxima de ambos fármacos. La importancia estadística fue evaluada llevando a cabo una prueba-t del estudiante en cuanto a la inhibición en cada proporción de dosis versus de inhibición en el máximo de cada fármaco. La significancia general de las combinaciones de fármaco para cada línea celular, fue dependiente de lo que muestra la significancia estadística para valores mayores al 50% de las proporciones de dosis. Como un auxiliar visual, se trazaron valores de respuesta en un trazo de dispersión con proporciones de dosis proporcionadas en el eje x y el porcentaje de los valores de respuesta en el eje y. se dibujó una línea horizontal entre los dos valores de respuesta de punto de extremo (por ejemplo entre los valores de respuesta Aplidina IC50 al 100% y el agente quimioterapéutico estándar IC50 al 100%). En casos en donde los valores de respuesta en los dos puntos de extremo fueron aproximadamente equivalentes, los puntos que están arriba o debajo de esta línea de capacidad aditiva anticipada pueden ser interpretados como que representan una interacción de fármaco antagónica o sinérgica, respectivamente. En las figuras 42A y 42B se muestra los datos de actividad in vitro de Aplidina en combinación con VP16 contra células HL-60. De acuerdo con estos datos se obtuvo el efecto aditivo. En las figuras 43A y 43B se muestra los datos de actividad in vitro de Aplidina en combinación con VP16 contra células K562. De acuerdo con estos datos se obtuvo la capacidad aditiva. En las figuras 44A y 44B se muestra los datos de actividad in vitro de Aplidina en combinación con VP16 contra células MOLT-3. De acuerdo con estos datos se obtuvo la capacidad aditiva. En las figuras 45A y 45B se muestra los datos de la actividad in vitro observada con Aplidina en combinación con VP16 contra células MCI 16. De acuerdo con estos datos, se obtuvo la capacidad aditiva en esta línea de célula de tumor. En las figuras 46A y 46B se muestra los datos de actividad in vitro observada con Aplidina en combinación con VP16 contra células RAMOS. De acuerdo con estos datos, se obtuvo la capacidad de sinergia en esta línea de célula de tumor. En las figuras 47A y 47B se muestra los datos de actividad in vitro observada con Aplidina en combinación con VP16 contra células U937. De acuerdo con estos datos se obtuvo la capacidad aditiva. En las figuras 48A y 48B se muestra los datos de actividad in vitro observada con Aplidina en combinación con VP16 contra células NCI-H929. De acuerdo con estos datos se obtuvo la sinergia . En las figuras 49A y 49B se muestra los datos de actividad in vitro observada con Aplidina en combinación con VP16 contra células HUNS-1. De acuerdo con estos datos se obtuvo la capacidad aditiva en esta línea de célula de tumor. En las figuras 50A y 50B se muestra los datos de actividad in vitro observada con Aplidina en combinación con VP16 contra células U266B-1. De acuerdo con estos datos se obtuvo la capacidad aditiva en esta línea de célula de tumor. En las figuras 51A y 51B se muestra los datos de actividad in vitro observada con Aplidina en combinación con VP16 contra células RPMI 8226. De acuerdo con estos datos se obtuvo la capacidad aditiva en esta línea de célula de tumor. En las figuras 52 se muestra los datos de actividad in vitro observada con Aplidina en combinación con carboplatino contra células LOX-I-M VI . De acuerdo con estos datos se obtuvo la capacidad aditiva en esta línea de célula de tumor. En la figura 53 se muestra los datos de actividad in vitro observada con Aplidina en combinación con carboplatino contra células UACC-257. De acuerdo con estos datos, se obtuvo la capacidad de sinergia en esta línea de célula de tumor. Ejemplo 3: Estudios in vitro para determinar el efecto de Aplidina en combinación con otros agentes estándar en líneas de célula de tumor de mieloma múltiple. El mieloma múltiple (MM) es una enfermedad maligna de células de plasma, originada generalmente a partir de un clon de células de plasma que prolifera y se acumula en la médula ósea. Las características clinopatológicas de los pacientes con mieloma, incluyen acumulación de proteína monoclonal en la sangre u orina, lesiones líticas de huesos, anemia y disfunción renal (Sirohi B. y asociados, Lancet (2004) 363: 875-87). El tratamiento real para el mieloma depende de una terapia de dosis alta soportada mediante el trasplante de células madre. A pesar de los avances en la última década, actualmente MM permanece como una enfermedad incurable con un promedio general de supervivencia para pacientes de 2 a 5 años (Sirohi B. y asociados, Lancet (2004) 363: 875-87). Se necesitan nuevos métodos de tratamiento para mejorar los resultados de los pacientes siguiendo tres líneas de investigación principal: a) mejorar la eficacia de la quimioterapia a través del uso de una dosis alta; b) aumentar la respuesta inmune del huésped contra células de mieloma; y c) desarrollar fármacos novedosos con objetivos más específicos que puedan interferir, no únicamente con células de mieloma, sino también con el microambiente de la médula ósea (San Miguel JF y asociados, Curr. Treat. Options Oncol. (2003) 4: 247-58). Se espera que la combinación de dos o más de estos agentes terapéuticos conduzca a una eficacia anti-MM mejorada y a rangos de supervivencias más prolongados. En la presente invención se reportan varios estudios con respecto al efecto de Aplidina en la forma de un fármaco nuevo en el tratamiento de mieloma múltiple. Estos estudios incluyen: 1) eficacia citotóxica de Aplidina (sola o en combinación) en varias líneas de célula MM utilizando ensayos de viabilidad celular (ensayo MTT) y de apoptósis (tinción con anexina V). 2) eficacia citotóxica de combinaciones de Aplidina y otros fármacos desarrollados en forma reciente y clásicos en el tratamiento de esta enfermedad.

Materiales y métodos Líneas celulares y reactivos de cultivo celular Se utilizaron cuatro líneas celulares derivadas de MM en este estudio: las variantes sensibles a dexametasona (MM.1S) y resistentes a dexametasona (MM.1R) de la línea de célula de mieloma múltiple humano MM.1 (Greenstein S. y asociados, Exp. Hematol (2003) 31:.271-82), las cuales fueron amablemente proporcionadas por el Dr. S Rudikoff, Bethesda MD; y U266 y sus líneas de célula U266 LR7 de contraparte resistentes a melfalan fueron obtenidas a través del Dr. W. Dalton, Tampa, FL. Todas las líneas de célula MM fueron crecidas en un medio RPMI 1640 suplementado con suero de bovino fetal inactivado con calor al 10%, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina y 2 mM de L-glutamina. Todos los medios de cultivo celular y los reactivos fueron comprados en Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA). Ensayos de viabilidad celular El análisis de la proliferación de célula MM se evaluó utilizando el ensayo colorí métrico de metiltiotetrazole (MTT; Sigma, St. Louis MO). Se sembraron líneas de célula MM en una densidad de 50000 células/200 µ? medio por depósitos en placas de 48 depósitos y se trataron con una dosis de fármaco y tiempo determinado. Las dos horas antes del final del tratamiento, se agregó una solución MTT (5 mg/ml en PBS; normalmente un 10% del volumen en cada depósito) y la sal de tetrazolio se redujo mediante células metabólicamente activas para cristales de formazan con color. Después de la solubilización de estos cristales mediante incubación durante la noche con una solución 10% SDS-HCI, se midió la absorbancia en 570 nm con corrección en 630 nm. Se analizaron cuatro depósitos por cada condición, y los resultados se presentan como el promedio ± SD de los cuadruplicados de un experimento representativo que fue repetido al menos dos veces. Manchado Western Se recolectaron células y se lavaron con PBS, y se obtuvieron lisados celulares totales después de la incubación en amortiguador de lisis enfriado con hielo (140 mM NaCI, 10 mM de EDTA, 10% de glicerol, 1% de Nonidet P-40, 20 mM Tris (pH 7.0), 1 µ? de pepstatin, 1 pg/ml de aprotinin, 1 pg/ml de leupeptin, 1 mM ortovanadato de sodio). Posteriormente las muestras fueron centrifugadas en 10,000g a una temperatura de 4°C durante 10 minutos y se resolvieron cantidades iguales de proteína en los sobrenadantes mediante 6% - 12.5% SDS-PAGE. Posteriormente las proteínas fueron transferidas en nitrocelulosa o membranas PVDF, se bloquearon mediante incubación en leche descremada sin grasa al 5% en un amortiguador PBST (0.05% -Tween 20 en PBS) y subsecuentemente se incubaron con los anticuerpos específicos primarios de Santa Cruz Technologies, [los anticuerpos anti-p- c-jun, anti-p-Erk112 y anti-Erk5 se compraron en Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA), mientras que el anti-p-p38 se obtuvo de Cell Signaling (Danvers, MA) y el anticuerpo anti-PARP se obtuvo de Becton Dickinson Biosciences (Bedford, MA)]. Después de una segunda incubación con el anticuerpo secundarios correspondiente, se desarrollaron los inmunomanchados mediante quimioluminiscencia mejorada (ECL; Amersham, Arlington Heights, IL). La identificación de JNK y Erk5 activados requirió de inmuno-precipitación previa de Usados de proteína con los anticuerpos específicos correspondientes y la sefarosa de proteína A. Análisis de isobolograma La interacción entre Aplidina y otros agentes anti-MM fue analizado utilizando el programa de software Calcusyn (Biosoft, Ferguson, MO). Los datos del ensayo de viabilidad celular (MTT) se expresaron como la fracción de células afectadas por la dosis (Fa) en células tratadas con fármaco, en comparación con células no tratadas (control). Este programa está basado en el método de Chou-Talalay (Chou TC y asociados, Adv. Enzyme Regul. (1984) 22: 27-55) de acuerdo con la siguiente ecuación Cl = (D) 1/(Dx) 1 + (D) 1 (D) 2 /(Dx) 1 (Dx) 2, en donde (D)1 y (D) 2 son las dosis de fármaco 1 y 2 que tiene el mismo efecto x, cuando se utilizan solas. Los valores Cl menores a 1.0 indican sinergia, los valores Cl = 1.0 indican un efecto aditivo, mientras que los valores mayores a 1 corresponden a un efecto antagónico. Resultados Respuesta de dosis a Aplidina en líneas de célula derivadas-MM Se determine primero si Aplidina afecta la viabilidad celular utilizando el ensayo MTT en líneas celulares derivadas de MM tanto sensibles como resistentes a fármacos de terapia convencional. Tal como se aprecia en la figura 54, el tratamiento de Aplidina durante 48 horas induce a una disminución similar en viabilidad celular en una forma dependiente a la dosis en todas las líneas de células probadas. El cincuenta por ciento de disminución en células viables (IC50) después de un tratamiento de 48 horas, estuvo dentro de un rango de 1-10 nM para las cuatro líneas celulares probadas. La eficacia de Aplidina también se comparó con otros fármacos clásicos (Melfalan, Dexametasona) y fármacos nuevos (Bortezomib) en el tratamiento de MM. La figura 55 muestra la potencia superior de Aplidina en comparación con otros fármacos cuando se prueban en dosis 0.1-1 nM durante 48 horas en la línea de célula MM.1S; su efecto fue similar al de Bortexomib en dosis máximas de (10-100 nM). Evaluación de sinergia en combinaciones dobles de Aplidina Ya que la exposición continua a quimioterapia a MM en muchos casos está asociada con toxicidad incrementada y desarrollo de la resistencia al fármaco de novo, probamos si la combinación de concentraciones mínimamente tóxicas de Aplidina y otros fármacos puede afectar la viabilidad de células MM. Específicamente, se combinó Aplidina con fármacos clásicos en el tratamiento de MM (tal como Dexametasona o Melfalan), también con agentes anti-mieloma recientemente desarrollados (Bortezomib), y con fármacos que pueden dirigirse específicamente al microambiente de la médula ósea (lenalidomida (Revlimid®)). También se llevaron cabo experimentos en el transcurso de los días 1, 2, 3 y 6 con respecto a los agentes terapéuticos mencionados, para determinar las dosis sub-óptimas adecuadas (inhibición de crecimiento del 10% al 30%) para los experimentos de combinación, así como para explorar la duración de los tratamientos. Los experimentos de combinación de Aplidina y el resto de los fármacos se llevaron a cabo después de la incubación durante 3 ó 6 días. Se midió el rendimiento celular de la línea de célula MM.1S mediante ensayo MTT tal como se describió anteriormente, y se analizaron los porcentajes de inhibición mediante el programa CalcuSyn. Se utilizó el índice de combinación calculado en computadora (Cl) para juzgar los resultados de una combinación: Cl > 1 , Cl = 1 , y Cl < 1 indicando efectos antagónicos, aditivos y sinérgicos, respectivamente. La conformidad de datos con el principio de efecto promedio, puede ser manifestada fácilmente a través del coeficiente de correlación lineal (r) del trazo de efecto promedio: log (fa/fu) = m log (D)- m log (Dm), en donde D es la dosis, Dm es la dosis requerida para un efecto del 50%, fa es la fracción afectada por la dosis, fu es la fracción no afectada, y m es un coeficiente de la sigmoidicidad de la curva de efecto de dosis. Para cada combinación doble, se utilizó una combinación de proporción no constante. Cada experimento se repitió tres veces, y se llevó a cabo un mínimo de tres puntos de datos por cada fármaco simple y tres combinaciones. Combinación de Aplidina con Dexametasona En el día 3, se observó sinergia para la combinaciones de 0.5 nM Aplidina 1 nM y 10 nM Dexametasona (figura 56). Tal como se ilustra en la figura 57, la combinación fue más sinérgica a los 6 días. Combinación de Aplidina con Melfalan Las siguientes combinaciones mostraron efectos casi aditivos a los 3 y 6 días (figuras 58 y 59, respectivamente). Combinación de Aplidina con Doxorubicina A los 3 días, únicamente una combinación fue moderadamente sinérgica (figura 60, combinación 1) y dos combinaciones fueron aditivas (figura 60, combinaciones 3 y 4).

A los 6 días, únicamente dos combinaciones fueron aditivas (figura 61, combinación 7 y 8). Combinación de Aplidina con lenalidomida (Reylimid®) En este estudio, la combinación de Aplidina y lenalidomida (Revlimid®) mostró mayores grados de sinergia que todas las otras combinaciones revisadas (figura 62). En forma remarcada, la sinergia fue más importante a los 6 días (figura 63). Combinación de Aplidina con Bortezomib Esta combinación mostró antagonismo a los 3 días (figura 64); a los 6 días se descubrió sinergia para dos combinaciones (figura 65, combinación 4 y 6). Ejemplo 4: Estudios in vivo para determinar el efecto de Aplidina en combinación con otros agentes estándar en melanoma y xenoinjertos renales. El propósito de este estudio fue evaluar la actividad antitumor de Aplidina cuando se administra con un agente estándar anti-tumor, administrados ambos utilizando un programa de dosificación múltiple en varios tipos de xenoinjertos de tumor en ratones atímicos hembra. Se recibieron ratones hembra desprotegidos atímicos de Harían Sprague Dawley, Madison, Wisconsin con 4 a 5 semanas de edad. Los ratones fueron aclimatados a laboratorio durante al menos una semana antes del implante del tumor. Los animales fueron alojados en jaulas estáticas con agua y alimento permitidos ad libitum. Los animales experimentales fueron implantados ya sea con fragmentos de tumor derivados de tumores humanos establecidos mediante trasplante o con células obtenidas directamente de un cultivo in vitro. Los tumores fueron implantados en forma subcutánea en el flanco derecho en día 0. Se registraron las medidas del tamaño del tumor dos veces a la semana comenzando el día 4 ó 5 utilizando calibradores Vernier. Se utilizó la fórmula para calcular el volumen para un elipsoide de prolato, para estimar el volumen de tumor de medidas de tumor bi-di mensional : volumen de tumor (mm3) = (longitud x ancho2) ÷ 2. Asumiendo la densidad de unidad, el volumen se convirtió en peso (por ejemplo, 1 mm3 = 1 mg). Cuando los tumores alcanzaron un rango de volumen aproximada de 100 ± 15 mg, los ratones fueron aleatorizados en grupos de tratamiento y de control. Los tratamientos se iniciaron y administraron en una base de pero corporal individual. Se llevó a cabo un estudio de descubrimiento de rango de dosis en cada modelo de tumor, para determinar el nivel de dosis adecuado de cada compuesto utilizado en los estudios de combinación. Se combinaron los siguientes estándares de agentes de cuidado para los diversos tipos de cáncer (indicaciones) con Aplidina (APL) para determinar si la terapia de combinación proporcionará una mayor actividad anti-tumor cuando se compara con la actividad combinada de los dos agentes suministrados en la forma de monoterapias.

Las tablas 5 a 10 muestras las cinéticas del volumen de tumor neto (promedio ± S. E. M., mg) después del inicio del tratamiento con Aplidina, ya sea sola o en combinación con un estándar de agentes de cuidados en melanoma y xenoinjertos de cáncer renal . Las tablas 5 y las figuras 66 y 67 muestran cinéticas del volumen de tumor neto después del inicio del tratamiento con Aplidina (Aplidin®) como un solo agente o en combinación con DTIC y carboplatino en xenoinjertos de tumor de melanoma MRI-H 187. Se administró Aplidina cada día durante 9 días consecutivos mediante inyección intraperitoneal (i.p.). control salino (solución salina estéril), cada día durante 9 días consecutivos mediante inyección, DTIC cada día durante 5 consecutivos mediante inyección i.p. y Carboplatino una dosis cada 4 días durante un total de 4 tratamientos mediante inyección i.p. Tabla 5 S.E.M. = Error estándar del promedio Tabla 5 (cont. ) Tabla 5 (cont. ) A partir de este estudio de xenoinjerto, se concluyó que en células de melanoma MRI-H187, la combinación de Aplidina con DTIC y Aplidina con carboplatino muestra una potenciación clara estadísticamente significativa de actividad anti-tumor, siendo más remarcable en el caso de la combinación con carboplatino. La tabla 6 y las figuras 68 y 69 muestran la cinética del volumen de tumor neto después de del inicio del tratamiento con aplidina (Api id i n®) en la forma de un agente simple o en combinación con lnterleucina-2 (IL-2) e lnterferón-a 2a (INF-a) en xenoinjertos de tumor de melanoma MRI-H-187. Se administró Aplidina cada día durante 9 días consecutivos mediante inyección i.p., control salino (solución salina estéril) cada día durante 9 días consecutivos mediante inyección i.p., IL-2 cada día durante 5 días a la semana (Lunes-Viernes) durante 3 semanas mediante inyección i.p. y INF-a cada día durante 5 días a la semana (Lunes-Viernes) durante 3 semanas mediante inyección subcutánea (s.c). Tabla 6 S.E.M. = Error estándar del promedio Tabla 6 (cont.) A partir de este estudio de xenoinjerto, se concluyó que en células de melanoma MRI-H187, la combinación de Aplidina con IL-2 y Aplidina con INF-a mostró capacidad aditiva. La tabla 7 y las figuras 70 y 71 muestran cinética del volumen de tumor neto después del inicio del tratamiento con Aplidina (APL) en la forma de un agente solo o en combinación con DTIC y carboplatino en xenoinjertos de tumor de melanoma LOX-I VI. Se administró Aplidina cada día durante 9 días consecutivos mediante inyección i.p., control salino (solución salina estéril) cada día durante 9 días consecutivos mediante inyección i.p., DTIC cada día durante 5 días consecutivos mediante inyección i.p. y Carboplatino una dosis cada 4 días para un total de 4 tratamientos mediante inyección i.p. Tabla 7 S.E.M. = Error estándar del promedio A partir de este estudio xenoinjerto se puede concluir que en células de melanoma LOX-IMVI, la combinación de Aplidina con DTIC muestra un patrón aditivo y la combinación de Aplidina con carboplatino muestra una tendencia a la sinergia. La tabla 8 y las figuras 72 y 73 muestran cinéticas del volumen de tumor neto después del inicio del tratamiento con Aplidina (APL) como un agente simple o en combinación con lnterleucina-2 (IL-2) e lnterferon-a 2a (INF-a) en xenoinjertos de tumor de melanoma LOX-IMVI. La Aplidina se administró cada día durante 9 días consecutivos mediante inyección i.p., control salino (solución salina estéril) cada día durante 9 días consecutivos mediante inyección i.p., IL-2 cada día durante 5 días a la semana (Lunes-Viernes) durante 3 semanas mediante inyección i.p. y INF-a cada día durante 5 días a la semana (Lunes-Viernes) durante 3 semanas mediante inyección s.c. Tabla 8 S.E.M. = Error estándar del promedio A partir de este estudio de xenoinjerto se concluyó que en células LOX-IMVI de melanoma, La combinación de Aplidina con IL-2 y Aplidina con INF-a mostró capacidad aditiva. La tabla 9 y las figuras 74, 75 y 76 muestran cinéticas del volumen de tumor neto después de tratamiento con aplidina (APL) como un agente simple o en combinación con Bevacizumab (Avastin®), lnterleucina-2 (IL-2) e lnterferon- 2a (INF-a) en xenoinjertos de tumor renal CaK¡-1. La Aplidina se administró cada día durante 9 días consecutivos mediante inyección i.p., el control salino (solución salina estéril) cada día durante 9 días consecutivos mediante inyección i.p., Bevacizumab (Avastin®) cada 3 días durante un total de 4 tratamientos mediante inyección i.p., IL-2 cada día durante 5 días a la semana (Lunes-Viernes) durante 3 semanas mediante inyección i.p., y INF-a cada día durante 5 días a la semana (Lunes-Viernes) durante 3 semanas mediante inyección s.c. Tabla 9 S.E.M. = Error estándar del promedio Tabla 9 (continuación).

A partir de este estudio de xenoinjerto se concluyó que en células CaKi-1 renales, la combinación de Aplidina con Avastin® y Aplidina con IL-2 muestran sinergia, siendo más remarcable en el caso de la combinación con IL-2. Por otra parte, la combinación de Aplidina con INF-a muestra un patrón aditivo. La tabla 10 y las figuras 77, 78 y 79 muestran cinéticas de volumen de tumor neto después del inicio del tratamiento con aplidina (APL) como un agente simple o en combinación con Bevacizumab (Avastin®), I nterleuci na-2 (IL-2) e lnterferon-a 2a (INF-a) en xenoinjertos de tumor renal MRI-H121. Se administró la Aplidina cada día durante 9 días consecutivos mediante inyección i.p., control salino (solución salina estéril) cada día durante 9 días consecutivos mediante inyección i.p., Bevacizumab (Avastin®) cada 3 días durante un total de 4 tratamientos mediante inyección i.p., IL-2 cada día durante 5 días a la semana (Lunes-Viernes) durante 3 semanas mediante inyección i.p., y INF-a cada día durante 5 días a la semana (Lunes-Viernes) durante 3 semanas mediante inyección s.c. Tabla 10 S.E.M. = Error estándar del promedio Tabla 10 (continuación).

A partir de este estudio de xenoinjerto se concluyó que en células MRI-H121 renales, las tres combinaciones muestran un patrón aditivo. Ejemplo 5. Los ensayos in vitro adicionales en múltiples líneas celulares de mieloma múltiple (RPMI-8226 y U266B1) se llevaron a cabo para determinar el efecto de Aplidina en combinación con dos agentes quimioterapéuticos de cuidado estándar (Bortezomib y Melfalan). Aplidina en forma de un agente simple o en combinación ya sea con Bortezomib o Melfalan se evaluaron contra líneas de célula de mieloma múltiple, específicamente líneas de célula RPMI-8226 y U266B1. Estas líneas celulares fueron cultivadas en un medio RPMI1640 con FBS al 10% y L-Glutamina al 1%. La línea celular se revistió en placas de 96 depósitos en 20,000 células por depósito. Primero, se probaron Aplidina, Bortezomib y Melfalan solos para determinar el valor IC50 de cada uno de ellos en forma individual. Para determinar el valor IC50, cada fármaco se revisó en un rango diferente de concentración de fármaco, siguiendo el procedimiento que se describe en el Ejemplo 1. La Tabla 11 muestra el IC50 individual obtenido con cada uno de los tres fármacos contra las dos líneas celulares de mieloma múltiple. Tabla 11 En el siguiente paso, se combinaron ya sea Bortezomib o Melfalan con Aplidina. En estos experimentos, se utilizaron las concentraciones de Aplidina con una dilución en serie 1:10. Cada dilución en serie se emparejó con cuatro diferentes concentraciones de Bortezomib o Melfalan. Las placas se incubaron durante 3 días a una temperatura de 37°C y 5% C02. Las placas se leyeron utilizando el sistema de ensayo Promega MTS con MTS siendo metabolizado mediante células vivas cambiadas en formazan el cual es fluorescente en una longitud de onda de 490 nm. Esta es una medida indirecta de la viabilidad celular. Estos se analizaron utilizando el programa Softmax Pro que determina el porcentaje de los depósitos de control con base en la viabilidad celular. Estos datos IC50 posteriormente se transfirieron en el programa CalcuSyn para el análisis de índice de combinación, CalcuSyn compara IC50, los valores de los fármacos solos junto con el de los fármacos en combinación utilizando un algoritmo para determinar un índice de combinación. Es importante observar que el índice de combinación (Cl) es una reflexión del efecto de combinación de los dos fármacos: Cl = 1 indica un efecto aditivo; Cl < 1 indica un efecto sinérgico; y Cl > 1 indica un efecto antagónico. La Tabla 12 resume las dosis en donde se observó el efecto sinérgico en la combinación de Aplidina con Bortezomib contra la línea de célula RMPI8226: Tabla 12 La Tabla 13 resume las dosis, en donde el efecto sinérgico fue observado en la combinación de Aplidina con Melfalan contra la línea de célula RMPI8226: Tabla 13 La Tabla 14 resume las dosis, en donde el efecto sinérgico fue observado en la combinación de Aplidina con Bortezomib contra la línea de célula U266B1: Tabla 14 La Tabla 15 resume las dosis, en donde el efecto sinérgico fue observado en la combinación de Aplidina con Melfalan contra la línea de célula U266B1 : Tabla 15 Ejemplo 6. Se llevaron a cabo ensayos in vitro adicionales en líneas celulares de leucemia (MOLT4 y K-562), para determinar el efecto de Aplidina en combinación con un estándar de agente quimioterapéutico de cuidados, tal como Idarubicin. La Aplidina, en la forma de un agente simple o en combinación con Idarubicin, se evaluó contra líneas celulares de leucemia, específicamente líneas celulares MOLT4 y K562.

Estas líneas celulares se cultivaron en un medio RP I1640 con FBS al 10% y 2 mM de L-Glutamina. Cada línea celular se revistió en placas de 96 depósitos en 20,000 células por depósito. Primero, se probaron Aplidina e Idarubicin solos para determinar el valor IC50 de cada uno de ellos en forma individual. Para determinar el valor IC50, cada fármaco se revisó en un diferente rango de concentración de fármaco, siguiendo el procedimiento que se describe en el Ejemplo 1. La Tabla 16 muestra el IC50 individual obtenido con cada uno de los fármacos contra las dos líneas celulares de leucemia. Tabla 16 En el siguiente paso, se combinó Idarubicin con Aplidina. En el experimento relacionado con la línea de célula MOLT4, las concentraciones de Aplidina se utilizaron con una dilución en serie 1:10. Cada dilución en serie se emparejó con 4 diferentes concentraciones de Idarubicin. En el experimento relacionado con la línea de célula K562, se utilizaron concentraciones de Aplidina con una dilución en serie de 1:5, y se agregó una concentración de Idarubicin a cada grupo de combinación con base en una proporción. Por lo tanto, la combinación A fue 1:1, la combinación B fue 0.008:1, la combinación C fue 6.4E-05:1 y la combinación D fue 5.12E-07:1. Las placas se incubaron durante 3 días a una temperatura de 37°C y 5% C02. Las placas se leyeron utilizando el sistema de ensayo Promega MTS con MTS siendo metabolizado a través de células vivas que se convierten en formazan, el cual es fluorescente en una longitud de onda de 490 nm. Esta es una medida indirecta de la viabilidad celular. Esto se analizó utilizando el programa Softmax Pro, el cual determina la viabilidad celular con base en el porcentaje de los depósitos de control. Posteriormente estos datos IC50 se transfirieron en el programa CalcuSyn para el análisis de índice de combinación. CalcuSyn compara los valores IC50 de los fármacos solos con el de los fármacos en combinación utilizando un algoritmo para determinar un índice de combinación. Es importante observar que el índice de combinación (Cl) sea una reflexión del efecto de combinación de los dos fármacos: Cl = 1 indica un efecto aditivo; Cl < 1 indica un efecto sinérgico; y Cl > 1 indica un efecto antagónico. La Tabla 17, resume las dosis en donde se observó un efecto sinérgico en la combinación de Aplidina con Idarubicin contra la línea celular MOLT4: Tabla 17 La Tabla 18 resume las dosis en donde se observó un efecto sinérgico en la combinación de Aplidina con Idarubicin contra la línea de célula K562: Tabla 18 Ejemplo Estudios in vivo para determinar el efecto de Aplidina combinación con otro agente estándar en xenoinjertos de melanoma. El propósito de este estudio fue evaluar la eficacia antitumor de Aplidina, cuando se administra en combinación con Carboplatino contra células de melanoma humano UACC-257 implantado en forma subcutánea en ratones UCr-nu/nu atímicos, hembra . Los animales se alojaron en jaulas micro aislantes, hasta cinco por jaula en un ciclo de 12 horas luz/obscuridad. Se aclimataron ratones NCr-nu/nu atímicos, hembra de seis semanas de edad en los laboratorios durante una semana antes del experimento. Cada ratón fue inoculado en forma subcutánea cerca del flanco derecho con células de melanoma humano UACC-257 procedente de un cultivo celular in vitro utilizando una aguja calibre 23. Cada ratón recibió 2 x 107 células resuspendidas en 0.2 ml_ de Matrigel®. Se descongeló un frasco con células congeladas de melanoma humano UACC-257, y se cultivó en un medio RPMI 1640 que contiene bajo contenido de glucosa (2,000 mg/L), bicarbonato de sodio (1,500 mg/mL), 2 mM de L-glutamina y 10% de suero de bovino fetal (medio completo) y se creció en un incubador +37°C en una atmósfera humidificada con 5% C02 hasta que se obtuvo el número necesario de células por inoculación de ratón. Las células fueron cosechadas después de cuatro pasajes en el cultivo. Las células se eliminaron de los frascos, se colocaron en tubos de centrifugación 50-mL y se centrifugaron en 1,000 rpm durante 10 minutos en un centrifugador refrigerado. Los pelets celulares se resuspendieron en un medio completo fresco. Se determinó el conteo y viabilidad celular con un contador celular y analizador de viabilidad Beckman Coulter VI CELL XR. La suspensión celular fue centrifugada, y el pelet celular se resuspendio en Matrigel® en una densidad celular de 1.0 x 108 células/mL y se colocó en hielo húmedo. La concentración final de Matrigel® en la suspensión celular fue de 56.9%. El día de la cosecha de las células, la viabilidad celular fue de 98.9%. El día de la inoculación del tumor, se designó como el Día 0. Los tumores individuales crecieron en 150 a 245 mg en peso (150-245 mm3 en tamaño) el día del inicio del tratamiento, el Día 13 después de la inoculación de la célula de tumor. Se asignaron cuarenta animales con tumores dentro del rango de adecuado a cuatro grupos de tratamiento, de modo que los pesos de tumor promedio del primer día de tratamiento, estuvieron cercanos entre si lo más posible. El experimento consistió en un grupo de control tratado con vehículos de 10 ratones y tres grupos tratados con fármacos de 10 ratones por grupo para un total de 40 ratones el primer día de tratamiento, el Día 13 después de la inoculación de la célula de tumor. Los animales del Grupo 1 se trataron i.p. cada día durante 9 días consecutivos (Días 13-21) con un vehículo de Aplidina diluido con solución salina. La Aplidina se administró i.p. cada día durante 9 días (Días 13-21) en una dosis de 60 µ?/??^?e?e sola (Grupo 2) o en combinación con Carboplatino (Grupo 4). Se administró Carboplatino i.v. cada 4 días durante un total de tres tratamientos (Días 13, 17 y 21) en una dosis de 50 mg/kg/dosis sola (Grupo 3) o en combinación con Aplidina (Grupo 4). Los días cuando se administraron ambos compuestos en el Grupo 4, se inyectó la Aplidina primero a los diez animales del grupo, seguido inmediatamente de la administración de Carboplatino (Grupo 4). El Grupo 1 se trató i.p. con 0.18% de cremofor EL/0.18% de etanol/0.84% WFI/98.8% solución salina (volumen de inyección: 0.1 mL/10 g peso corporal). La Aplidina se reconstituyó con un vehículo que contiene 15% de cremofor EL/15% de etano/70% WFI y se diluyó con solución salina (volumen de inyección: 0.1 mL/10 g peso corporal). Se preparó Carboplatino en WFI (volumen de inyección: 0.1 mL/10 g peso corporal ). Los animales se observaron diariamente y se observaron los signos clínicos. Se midieron los tumores s.c. y los animales fueron pesados dos veces a la semana comenzando el primer día de tratamiento, Día 13. El volumen del tumor se determinó mediante medidas de calibre (mm) y utilizando la fórmula de una esfera elipsoide: L x W2 /2 = mm3, en donde L y W se refieren a las dimensiones perpendiculares más grandes y más pequeñas recolectadas en cada medida. Esta fórmula también se utilizó para calcular el peso del tumor, asumiendo una densidad de unidad (1 mm3= 1 mg). La comparación del peso del tumor promedio en los grupos de tratamiento (T) con el peso de tumor promedio en el grupo de control (T/C x 100%) en el Día 23 (dos días al término del tratamiento) y el Día 70 (el día de la terminación del estudio) se utilizaron para la evaluación de la eficacia antitumor. %T/C para cada tratamiento se reporta en la Tabla 19. Tabla 19 El tratamiento de combinación de Aplidina más Carboplatino se toleró sin muertes. El tratamiento de combinación dio como resultado valores T/C de 95% y 53% en los días 23 y 70, respectivamente. Ejemplo 8: Estudios in vivo para determinar el efecto de Aplidina en combinación con otro agente estándar en xenoinjertos de mieloma. El propósito de este estudio fue evaluar la eficacia antitumor de Aplidina, cuando se administra en combinación con bortezomib contra células de mieloma humano RPMI 8226 implantado en forma subcutánea en ratones SCID, macho. Los animales fueron alojados en jaulas microaislantes, hasta cinco por jaula en un ciclo de 12 horas de luz/obscuridad. Se aclimataron ratones SCID, macho de seis semanas de edad en los laboratorios durante una semana antes del experimento.

Cada ratón fue inoculado s.c. cerca del flanco derecho con células de mieloma humano RPMI 8226 procedentes de un cultivo celular in vitro utilizando una aguja calibre 23. Cada ratón recibió 2 x 107 células resuspendidas en 0.2 ml_ de Matrigel®. Las células de mieloma humano RPMI 8226 fueron compradas originalmente en ATCC (número ATCC: CCL-155). Se descongeló un frasco con células congeladas y se cultivó en un medio que contiene alto contenido de glucosa (4,500 mg/L), bicarbonato de sodio (1,500 mg/mL), 2 mM de L-glutamina, 10 mM Hepes, 1 mM de piruvato de sodio y 10% de suero de bovino fetal (medio completo) y se crecieron en un incubador + 37°C en una atmósfera humidificada con 5% C02 hasta que se obtuvo el número necesario de células para la inoculación de los ratones. Las células fueron cosechadas después de cuatro pasajes en el cultivo. Las células fueron eliminadas de los frascos, colocadas en los tubos de centrifugación 50-mL y centrifugadas en 1,000 rpm durante 10 minutos en un centrifugador refrigerado. Los pelets celulares se resuspendieron en un medio completo, fresco. Se determinó el conteo y viabilidad celular con un contador celular y analizador de viabilidad Beckman Coulter VI CELL XR. La suspensión celular se volvió a centrifugar, y el pelet celular se resuspendió en Matrigel® en una densidad celular de 1.0 x 108 células/mL y se colocó en hielo húmedo. La concentración final de Matrigel® en la suspensión celular fue de 78.3%. El día de la recolección celular, la viabilidad celular fue de 89.3%. El día de la inoculación de la célula de tumor fue designado como el Día 0. Los tumores individuales crecieron a 75-188 mg en peso (75-188 mm3 en tamaño) el día del inicio del tratamiento, el Día 18 después de la inoculación de la célula de tumor. Los animales seleccionados con tumores dentro del rango de tamaño adecuado fueron asignados a cuatro grupos de tratamiento, de modo que los pesos de tumor promedio en el primer día de tratamiento también estuvieron cercanos entre si lo más posible. El experimento consistió en un grupo de control tratado con vehículos de 10 ratones y tres grupos tratados con fármacos de 10 ratones por grupo para un total de 40 ratones el primer día de tratamiento, el Día 18 después de la inoculación de la célula de tumor. Los animales en el Grupo 1 fueron tratados i.p. durante dos vueltas cada día durante 9 días consecutivos (Días 18-26 y Días 38-46) con un vehículo de Aplidina diluido con solución salina. Se administró la Aplidina i.p. durante dos vueltas cada día durante 9 días consecutivos (Días 18-26 y Días 38-46) en una dosis de 60 sola (Grupo 2) o en combinación con bortezomib (Grupo 4). Bortezomib se administró i.v. en una dosis de 0.35 mg/kg/dosis durante cuatro semanas cada 3 días durante un total de 2 tratamientos, comenzando el Día 18 seguido de una inyección i.v. más, administrada el Día 46 sola (Grupo 3) o en combinación con Aplidina (Grupo 4). Los días cuando ambos compuestos fueron administrados en el Grupo 4, se inyectó la Aplidina primero a los diez animales en el grupo, seguido inmediatamente de la administración de bortezomib (Grupo 4). El Grupo 1 fue tratado i.p. con 0.18% de cremofor EL/0.18% de etanol/0.84% WFI/98.8% salina (volumen de inyección: 0.1 mL/10 g peso corporal). La Aplidina fue reconstituida con un vehículo que contiene 15% de cremofor EL/15% de etano/70% WFI y se diluyó con solución salina (volumen de inyección: 0.1 mL/10 g peso corporal). Se preparó Velcade® (Bortezomib) en solución salina (volumen de inyección: 0.1 mL/10 g peso corporal). Los animales fueron observados diariamente y se observaron los signos clínicos. Se midieron los tumores s.c. y los animales fueron pesados dos veces a la semana comenzando el primer día de tratamiento, Día 18 después de la inoculación de célula de tumor. Se determinó el volumen de tumor mediante medidas de calibre (mm) y utilizando la fórmula de una esfera elipsoide tal como se describe en el Ejemplo 7. Se utilizó una comparación del peso de tumor promedio en los grupos de tratamiento (T) con el peso de tumor promedio del grupo de control (T/C x 100%) el Día 27 (un día después del término de la primera vuelta del tratamiento de Aplidina) y el Día 48 (dos días después del término del tratamiento con Aplidina y Bortezomib) para la evaluación de la eficacia antitumor. %T7C de cada tratamiento se reporta en la Tabla 20. Tabla 20 Vehículo de programa: qld x 9 día 18, 38 Aplidina de programa: qld x 9 día 18, 38 Bortezomib de programa: q3d x 2 día 18, 25, 32, 39; qld x 1 día 46 Aplidina/Bortezomib de programa: qld x 9 día 18, 38/ q3d x 2 día 18, 25, 32, 39; qld x 1 día 46 El tratamiento de combinación de Aplidina más Bortezomib, se toleró sin muertes. El tratamiento de combinación fue efectivo en la inhibición del crecimiento de células de mieloma RPMI 8226, dando como resultado valores T/C de 49% y 31% los Días 27 y 48, respectivamente. La actividad antitumor del tratamiento de combinación fue mayor al aditivo comparado con la actividad antitumor producida mediante la administración de cada compuesto solo. Ejemplo 9: Estudios in vivo para determinar el efecto de Aplidina en combinación con otro agente estándar en xenoinjertos de linfoma. El propósito de este estudio fue evaluar la eficacia antitumor de Aplidina, cuando se administró en combinación con rituximab contra células de linfoma humano RL implantadas en forma subcutánea en ratones SCID, hembra. Los animales fueron alojados en jaulas microaislantes, hasta cinco por jaula en un ciclo de 12 horas de luz/obscuridad. Se aclimataron ratones SCID macho, de seis semanas de edad en los laboratorios durante una semana antes del experimento.

Cada ratón fue inoculado s.c. cerca del flanco derecho con células de linfoma humano RL procedentes de un cultivo celular in vitro utilizando una aguja calibre 23. Cada ratón recibió 1.0 x 107 células resuspendidas en 0.2 mL de Matrigel®. Se descongeló un frasco con células congeladas y se cultivaron en un medio RPMI 1640 que contiene alto contenido de glucosa (4,500 mg/L), bicarbonato de sodio (1,500 mg/mL), 2 mM de L-glutamina, 10 mM Hepes, 1 mM de piruvato de sodio y 10% de suero de bovino fetal (medio completo), y se crecieron en un incubador +37°C en una atmósfera humidificada con 5% C02 hasta que se obtuvo el número necesario de células para la inoculación de los ratones. Las células fueron cosechadas después de seis pasajes en el cultivo. Las células fueron eliminadas de los frascos, colocadas en los tubos de centrifugación 50-mL y centrifugadas en 1,000 rpm durante 10 minutos en un centrifugador refrigerado. Los pelets celulares se fueron resuspendidos en un medio completo, fresco. El conteo celular se determinó con un contador celular Coutler Model Z1 y se midió la viabilidad después de la tinción con yoduro de propidio y se analizó utilizando un citómetro de flujo Beckman Coulter EPICS CL. La suspensión celular se re-centrifugó, y el pelet celular se resuspendió en Matrigel® a una densidad celular de 5.0 x 107 células/mL y se colocó en hielo húmedo. La concentración final de Matrigel® en la suspensión celular fue de 73.0%. El día de la recolección celular, la viabilidad celular fue de 98.9%. El día de la inoculación de la célula de tumor fue designado como el Día 0. Los tumores individuales crecieron a 100-196 mg en peso (100-196 mm3 en tamaño) el día del inicio del tratamiento, el Día 15 después de la inoculación de la célula de tumor. Se asignaron cuarenta animales con tumores dentro del rango de tamaño adecuado a cuatro grupos de tratamiento, de modo que los pesos de tumor promedio en todos los grupos el primer día de tratamiento, estuvieron tan cercanos entre si como fue posible. El experimento consistió en un grupo de control tratado con vehículos de 10 ratones y tres grupos tratados con fármacos de 10 ratones por grupo para un total de 40 ratones el primer día de tratamiento, el Día 15 después de la inoculación de la célula de tumor. Los animales del Grupo 1 se trataron i.p. durante dos vueltas cada día durante 9 días consecutivos (Días 15-23 y Días 28-36) con un vehículo de Aplidina diluido con solución salina. La Aplidina fue administrada i.p. durante dos vueltas cada día durante 9 días consecutivos (Días 15-23 y Días 28-36) en una dosis de 60 µ?/??^?e?e sola (Grupo 2) o en combinación con Rituximab (Grupo 4). El Rituximab se administró i.p. en una dosis de 20 mg/kg/dosis durante cuatro vueltas de tratamiento semanales cada 3 días durante un total de 2 tratamientos (programa q3d x 2), comenzando el Día 15 solo (Grupo 3) o en combinación con Aplidina (Grupo 4). Los días cuando ambos compuestos fueron administrados en el Grupo 4, la Aplidina fue inyectada primero a los diez animales del grupo, seguido inmediatamente de la administración de Rituximab (Grupo 4). El Grupo 1 fue tratado i.p. con 0.18% de cremofor EL/0.18% de etanol/0.84% WFI/98.8% salina (volumen de inyección: 0.1 mL/10 g peso corporal). La Aplidina fue reconstituida con un vehículo que contiene 15% de cremofor EL/15% de etano/70% WFI y se diluyó con solución salina (volumen de inyección: 0.1 mL/10 g peso corporal). Se preparó Rituxan® (Rituximab) en solución salina (volumen de inyección: 0.1 mL/10 g peso corporal). Los animales se observaron diariamente y se observaron los signos clínicos. Se midieron los tumores s.c. y los animales fueron pesados dos veces a la semana comenzando el primer día de tratamiento, el Día 15. El volumen de tumor fue determinado mediante medidas de calibre (mm) y utilizando la fórmula de una esfera elipsoide tal como se describe en el Ejemplo 7. La comparación del peso de tumor promedio en los grupos de tratamiento (T) con el peso de tumor promedio en el grupo de control (T/C x 100%) el Día 24 (un día después del final de la primera vuelta de 9 días de tratamiento de Aplidina) y el Día 38 (dos días después del final de la segunda vuelta de 9 días de tratamiento de Aplidina) se utilizó para evaluar la eficacia antitumor. %T/C de cada tratamiento se reporta en la Tabla 21. Tabla 21 Aplidina de programa: qld x 9 día 15, 28 Rituximab de programa: q3d x 2 día 15, 22, 29, 36 AplldinaRítuximab de programa: qld x 9 día 15, 28/ q3d x 2 día 15, 22, 29, 36 El tratamiento de combinación de Aplidina más Rituximab, fue tolerado sin muertes. El tratamiento de combinación fue efectivo en la inhibición del crecimiento de células de linfoma RL, dando como resultado valores T/C de 69% y 74% los Días 24 y 38, respectivamente. Posteriormente, cuando se combinó Aplidina con Rituximab, se observó una potenciación de la actividad antitumor.

Ejemplo 10: Estudios in vivo para determinar el efecto de Aplidina en combinación con otros agentes estándar (combinaciones triples) en las líneas de célula de tumor de mieloma múltiple. En este estudio se analizaron combinaciones triples de agentes antitumor. Todas las combinaciones fueron probadas utilizando un ensayo de viabilidad celular (MMT) en la línea celular MM.1S, una línea celular MM muy sensible. Los resultados se analizaron utilizando el software Calcusyn. Líneas celulares y reactivos de cultivo celular La línea celular MM sensible a dexametasona , MM.1S, fue proporcionada amablemente por el Dr. S Rudikoff, Bethesda MD. La línea celular fue crecida en un medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero de bovino fetal desactivado con calor, 100 U/ml de penicilina, 100 ug/ml de estreptomicina y 2 mM de L-glutamina. Todos los medios de cultivo celular y los reactivos fueron comprados en Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA). Ensayos de viabilidad celular Se evaluó el análisis de la proliferación de células MM utilizando el ensayo colorimétrico de metiltiotetrazole (MTT; Sigma, St. Louis MO). Se sembraron líneas de células MM en una densidad de 50000 células/200 µ? medio por depósito en placas de 48 depósitos, y se trataron con una dosis de fármaco y tiempo determinado. Dos horas antes del final del tratamiento, se agregó una solución MTT (5 mg/ml en PBS; normalmente un 10% de volumen de cada depósito) y la sal de tetrazolio se redujo mediante células metabólicamente activas a cristales de formazan con color. Después de la solubilización de estos cristales mediante incubación durante la noche con una solución 10% SDS-HCI, se midió la absorbancia en 570 nm con corrección en 630 nm. Se analizaron cuatro depósitos para cada condición, y los resultados se presentaron como el promedio ± SD de cuadruplicados de un experimento representativo que se repitió al menos tres veces. Análisis Isobologram La interacción entre Aplidina y otros agentes anti-MM se analizó utilizando el programa de software Calcusyn (Biosoft, Ferguson, MO). Los datos de ensayo de viabilidad celular (MTT) fueron expresados como la fracción de células afectadas por la dosis (Fa) en células tratadas con fármaco, en comparación con células no tratadas (control). Este programa se basó en el método Chou-Talalay de acuerdo con la siguiente ecuación Cl = (D)1/(Dx)1 + (D)1(D)2/(Dx)1(Dx)2, en donde (D)1 y (D)2 son las dosis del fármaco 1 y 2 que tienen el mismo efecto x que cuando se utilizan solos. Se utilizó el índice de combinación calculado con computadora (Cl) para juzgar los resultados de una combinación: C I > 1 , C I = 1 y C I < 1 indicando efectos antagónicos, aditivos y sinérgicos, respectivamente. La conformidad de los datos con el principio de efecto promedio puede ser fácilmente manifestada a través del coeficiente de correlación lineal (r) del trazo de efecto-promedio: log (fa/fu) = m log (D)- m log (Dm), en donde D es la dosis, Dm es la dosis requerida para un efecto del 50%, fa es la fracción afectada por la dosis, fu es la fracción afectada, y m es un coeficiente de sigmoidicidad de la curva de efecto-dosis. Para cada combinación, se utilizó una combinación de proporción no constante. Resultados Combinación de Aplidina + Lenalidomida (Reylimid®) + Dexametasona La adición de Dexametasona a la combinación de Aplidina + Lenalidomida mostró una sinergia importante en todas las combinaciones probadas en la línea celular sensible (MM1S) (Figura 80). En la figura 80, las dosis de Aplidina se expresaron en unidades nM, las dosis de Lenalidomida se expresaron en unidades µ?, y las dosis de Dexametasona se expresaron en unidades nM. Combinación de Aplidina + Bortezomib + Dexametasona La adición de Dexametasona a la combinación de Aplidina con Bortezomib, dio como resultado varias dosis con una clara tendencia a la sinergia (Figura 81). En la figura 81, las dosis de Aplidina se expresaron en unidades nM, las dosis de Bortezomib se expresaron en unidades nM, y las dosis de Dexametasona se expresaron en unidades nM.

Combinación de Aplidina + Bortezomib + Lenalidomida (Reylimid®) La adición de Bortezomib a la combinación de Aplidina con un agente inmuno-modulador, tal como Lenalidomida incrementó claramente su efecto antitumor con Cl en el rango sinérgico MM1S (Figura 82). En la figura 82, las dosis de Aplidina se expresaron en unidades nM, las dosis de Bortezomib se expresaron en unidades nM, y las dosis de Lenalidomida se expresaron en unidades µ?. Combinación de Aplidina + Talidomida + Dexametasona Esta combinación mostró una clara sinergia en las combinaciones triples, tal como se puede apreciar en la figura 83. En la figura 83, las dosis de Aplidina se expresaron en unidades nM, las dosis de Talidomida se expresaron en unidades µ?, y las dosis de Dexametasona se expresaron en unidades nM. Combinación de Aplidina + Melfalan + Dexametasona Esta combinación mostró también un claro rango sinérgico, principalmente con altas dosis de fármacos (figura 84). En la figura 84, las dosis de Aplidina se expresaron en unidades nM, las dosis de Melfalan se expresaron en unidades µ?, y las dosis de Dexametasona se expresaron en unidades nM. Combinación de Aplidina + Melfalan + Bortezomib Esta combinación dio como resultado Cl dentro del rango sinérgico cuando se utilizan dosis altas (figura 85). En la figura 85, las dosis de Aplidina se expresan en unidades nM, las dosis de Melfalan se expresan en unidades µ?, y las dosis de Bortezomib se expresan en unidades nM. Estos descubrimientos con respecto a Aplidina, pueden extenderse a análogos de aplidina, derivados y compuestos relacionados. Por ejemplo, la presente invención proporciona una combinación de un compuesto tal como el de la publicación WO 02 02596, con un fármaco anti-cáncer, preferentemente paclitaxel (Taxol®), doxorubicin, cisplatin, trióxido arsénico, 5-fluorouracil (5-FU), arabinosida de citosina (AraC), carboplatino, 7-etil-10-hidroxicamptotecin (SN38), etoposida (VP16), melfalan, dexametasona, ciclofosfamida, bortezomib, erlotinib, trastuzumab, lenalidomida (Revlimid®), interleucina-2 (IL-2), interferon-a 2 (INF-a), dacarbazina (DTIC), bevacizumab (Avastin®), idarubicin, talidomida y rituximab. Los ejemplos de análogos de aplidina que se pueden utilizar en lugar del propio Aplidina, incluyen los compuestos preferidos que se proporcionan en la publicación WO 02 02596, y en particular, los especificados en esta especificación de patente, la descripción de los compuestos preferidos y aspectos relacionados proporcionados en la publicación WO 02 02596. Más preferentemente, los análogos son estructuralmente cercanos a Aplidina, y normalmente difieren de Aplidina con respecto a un aminoácido o la cadena lateral terminal. El aminoácido diferente puede estar en la parte cíclica de la molécula o en la cadena lateral. Muchos ejemplos de dichos compuestos se proporcionan en la publicación WO 02 02596, y son candidatos para utilizarse en la presente invención.

Claims

REIVINDICACIONES 1. El uso de Aplidina o un análogo de aplidina en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, mediante terapia de combinación empleando Aplidina o un análogo de aplidina con otro fármaco.
2. El uso de Aplidina o un análogo de aplidina tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el otro fármaco es efectivo en el tratamiento de un cáncer seleccionado de cáncer de pulmón, cáncer de seno, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer renal, melanoma, mieloma múltiple, leucemia y linfoma.
3. El uso de Aplidina o un análogo de aplidina tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la Aplidina o el análogo de aplidina o el otro fármaco, forman parte de la misma composición.
4. El uso de Aplidina o un análogo de aplidina tal como se describe en la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la Aplidina o el análogo de aplidina y el otro fármaco se proporcionan como composiciones separadas para la administración al mismo tiempo o en tiempos diferentes.
5. El uso de Aplidina o un análogo de aplidina tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el otro fármaco es seleccionado del grupo que consiste en paclitaxel, doxorubicin, cisplatin, trióxido arsénico, 5-fluorouracil, arabinosida de citosina, carboplatino, 7 - e t i I - 1 O-hidroxicamptotecin, . etoposida, melfalan, dexametasona , ciclofosfamida, bortezomib, erlotinib, trastuzumab, lenalidomida, interleucina-2, interferon-a 2, dacarbazina, bevacizumab, idarubicin, talidomida y rituximab.
6. El uso de Aplidina o un análogo de aplidina tal como se describe en cualesquiera de las rei indicaciones anteriores, caracterizado porque la Aplidina o el análogo de aplidina es Aplidina.
7. El uso de Aplidina o un análogo de aplidina tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se administra un tercer fármaco.
8. El uso de Aplidina o un análogo de aplidina tal como se describe en la reivindicación 7, caracterizado porque el segundo y tercer fármaco se seleccionan del grupo que consiste en paclitaxel, doxorubicin, cisplatin, trióxido arsénico, 5-fluorouracil , arabinosida de citosina, carboplatino, 7-etil-10-hidroxicamptotecin , etoposida, melfalan, dexametasona, ciclofosfamida, bortezomib, erlotinib, trastuzumab, lenalidomida, interleucina-2, interferon-a 2, dacarbazina, bevacizumab, idarubicin, talidomida y rituximab.
9. Un método para tratar cáncer, caracterizado porque comprende administrar a un paciente que necesita de dicho tratamiento, una cantidad terapéuticamente efectiva de Aplidina o un análogo de aplidina y una cantidad terapéuticamente efectiva de otro fármaco el cual es efectivo en el tratamiento de cáncer.
10. El método para tratar cáncer tal como se describe en la reivindicación 9, caracterizado porque el cáncer que será tratado es seleccionado de cáncer de pulmón, cáncer de seno, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer renal, melanoma, mieloma múltiple, leucemia y linfoma.
11. El método para tratar cáncer tal como se describe en la reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque el otro fármaco se selecciona del grupo que consiste en paclitaxel, doxorubicin, cisplatin, trióxido arsénico, 5-fluorouracil , arabinosida de citosina, carboplatino, 7-etil-10-hidroxicamptotecin, etoposida, melfalan, dexametasona, ciclofosfamida , bortezomib, erlotinib, trastuzumab, lenalidomida, interleucina-2, interferon-a 2, dacarbazina, bevacizumab, idarubicin, talidomida y rituximab.
12. Un método para incrementar la eficacia terapéutica de un fármaco efectivo en el tratamiento de cáncer, caracterizado porque comprende administrar a un paciente que necesita del mismo, una cantidad de Aplidina o un análogo de aplidina.
13. El método para incrementar la eficacia terapéutica de un fármaco efectivo en el tratamiento de cáncer, tal como se describe en la reivindicación 12, caracterizado porque el cáncer que será tratado es seleccionado de cáncer de pulmón, cáncer de seno, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer renal, melanoma, mieloma múltiple, leucemia y linfoma.
14. El método para incrementar la eficacia de un fármaco efectivo en el tratamiento de cáncer, tal como se describe en la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque el fármaco es seleccionado del grupo que consiste en paclitaxel, doxorubicin, cisplatin, trióxido arsénico, 5-fluorouracil , arabinosida de citosina, carboplatino, 7-etil-10-hidroxicamptotecin, etoposida, melfalan, dexametasona, ciclofosfamida, bortezomib, erlotinib, trastuzumab, lenalidomida, interleucina-2, interferon-a 2, dacarbazina, bevacizumab, idarubicin, talidomida y rituximab.
15. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 9 a 14, caracterizado porque la Aplidina o análogo de aplidina y el otro fármaco forman parte de la misma composición.
16. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 9 a 14, caracterizado porque la Aplidina o análogo de aplidina y el otro fármaco se proporcionan como composiciones separadas para administración al mismo tiempo o en tiempos diferentes.
17. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 9 a 16, caracterizado porque Aplidina o el análogo de aplidina es Aplidina.
18. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 9 ó 17, caracterizado porque se administra una cantidad terapéuticamente efectiva de un tercer fármaco.
19. El método tal como se describe en la reivindicación 18, caracterizado porque el segundo y tercer fármaco se seleccionan del grupo que consiste en pacíitaxel, doxorubicin, cisplatin, trióxido arsénico, 5-fluorouracil , arabinosida de citosina, carboplatino, 7-etil-10-hidroxicamptotecin , etoposida, melfalan, dexametasona, ciclofosfamida, bortezomib, erlotinib, trastuzumab, lenalidomida, interleucina-2, interferon-a 2, dacarbazina, bevacizumab, idarubicin, talidomida y rituximab.
20. Un equipo para utilizarse en el tratamiento o prevención de cáncer, el cual comprende una forma de dosificación de Aplidina o un análogo de aplidina, una forma de dosificación de otro fármaco efectivo en el tratamiento de cáncer e instrucciones para el uso de cada componente en combinación para el tratamiento o prevención de cáncer.
21. El equipo tal como se describe en la reivindicación 20, caracterizado porque el equipo es para utilizarse en el tratamiento o prevención de un cáncer seleccionado de cáncer de pulmón, cáncer de seno, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer renal, melanoma, mieloma múltiple, leucemia y linfoma.
22. El equipo tal como se describe en la reivindicación 20 ó 21, caracterizado porque el otro fármaco se selecciona del grupo que consiste en pacíitaxel, doxorubicin, cisplatin, trióxido arsénico, 5-fluorouracil, arabinosida de citosina, carboplatino, 7-ett I- 10-hidroxicamptotecin, etoposida, melfalan, dexametasona, ciclofosfamida, bortezomib, erlotinib, trastuzumab, lenalidomida, interleucina-2, interferon-a 2, dacarbazina, bevacizumab, idarubicin, talidomida y rituximab.
23. El equipo tal como se describe en la reivindicación 20 ó 21, el cual comprende además una forma de dosificación de un tercer fármaco efectivo en el tratamiento de cáncer.
24. El equipo tal como se describe en la reivindicación 23, caracterizado porque el segundo y tercer fármaco se seleccionan del grupo que consiste en paclitaxel, doxorubicin, cisplatin, trióxido arsénico, 5-fluorouracil , arabinosida de citosina, carboplatino, 7-etil-10-hidroxicamptotecin , etoposida, melfalan, dexametasona, ciclofosfamida, bortezomib, erlotinib, trastuzumab, lenalidomida, interleucina-2, interferon-a 2, dacarbazina, bevacizumab, idarubicin, talidomida y rituximab.
25. Una composición farmacéutica que comprende Aplidina o un análogo de aplidina, y otro fármaco efectivo en el tratamiento de cáncer.
26. La composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 25, caracterizada porque el otro fármaco es efectivo en el tratamiento de un cáncer seleccionado de cáncer de pulmón, cáncer de seno, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer renal, melanoma, mieloma múltiple, leucemia y linfoma.
27. La composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 25 ó 26, caracterizada porque el otro fármaco es seleccionado del grupo que consiste en paclitaxel, doxorubicin, cisplatin, trióxido arsénico, 5-fluorouracil , arabinosida de citosina, carboplatino, 7-etil-10-hidroxicamptotecin , etoposida, melfalan, dexametasona, ciclofosfamida, bortezomib, erlotinib, trastuzumab, lenalidomida, interleucina-2, interferon-a 2, dacarbazina, bevacizumab, idarubicin, talidomida y rituximab.