MX2008010980A - Reduccion del crecimiento del pelo. - Google Patents

Abstract

Un método para reducir el crecimiento del pelo que incluye una aplicación tópica de una agonista para una TRPM8 o una TRPA1, solo o en conjunción con calor.

Description

REDUCCION DEL CRECIMIENTO DEL PELO ANTECEDENTES DE LA INVENCION La invención se refiere a la reducción del crecimiento del pelo en mamíferos, en especial para fines cosméticos. Una de las funciones principales del pelo en los mamíferos consiste en protegerlos del medio ambiente. Sin embargo, esa función se ha perdido en gran parte en los seres humanos quienes mantienen o eliminan el pelo de diversas partes del cuerpo, en especial por razones cosméticas. Por ejemplo, habitualmente se prefiere tener pelo en el cuero cabelludo y eliminar el vello del rostro. Para eliminar el pelo no deseado se han empleado diversos procedimientos, entre los que se incluyen afeitado, electrólisis, cremas o lociones depilatorias, depilación con cera, depilación con pinza y antiandrógenos terapéuticos. Estos procedimientos convencionales por lo general tienen ciertas desventajas. Por ejemplo, el afeitado puede producir rasguños y cortes y puede impartir una percepción de aumento en la velocidad de crecimiento del pelo. El afeitado puede dejar también restos de pelo no deseados. Por otra parte, la electrólisis puede mantener un área tratada libre de pelo durante períodos prolongados de tiempo, pero puede ser costosa, dolorosa y a veces dejar cicatrices. Las cremas depilatorias aunque son muy eficaces, normalmente no se recomiendan para usarse frecuentemente debido a su alto potencial de irritación. Las depilaciones con cera y con pinza pueden causar dolor, incomodidad y la eliminación deficiente del pelo corto. Por último, los antiandrógenos, que se han usado para tratar el hirsutismo femenino, pueden tener efectos colaterales no deseados. Previamente se ha expuesto que la velocidad y las características del crecimiento del pelo pueden alterarse por medio de la aplicación de inhibidores de ciertas enzimas en la piel. Estos inhibidores incluyen inhibidores de 5-alfa reductasa, ornitina decarboxilasa, S-adenosilmetionina decarboxilasa, gamaglutamil transpeptidasa y transglutaminasa. Véase, por ejemplo, Breuer y col., patente de los EE.UU. núm. 4,885,289; Shander, patente de los EE.UU. núm. 4,720,489; Ahluwalia, patente los EE.UU. núm. 5,095,007; Ahluwalia y col., patente de los EE.UU. núm. 5,096,911 ; y Shander y col., patente de los EE.UU. núm. 5,132,293. La familia de canales iónicos de potencial receptor transitorio (TRP) comprende más de 30 canales cationes y puede ser dividida en siete subfamilias principales: TRPC, TRPV, TRPM, TRPP, TRPML, TRPA y TRPN. Dos miembros de dos subfamilias distintas de canales TRP fueron identificados como responsables por la sensación de frío: TRPM8 y TRPA1. El Potencial Receptor Transitorio de Melastatina-8 (TRPM8) pertenece a la subfamilia de melastatina de canales iónicos TRP (Tominaga M. y col. (2004) J. Neurobiol. 61 (1 ):3-12). El TRPM8 es un canal catión Ca(2+) -permeable no selectivo que media un influjo directo de iones de Ca(2+) en respuesta a un estímulo específico. Se activa con el frío (temperaturas por debajo de 24 °C) y con compuestos de enfriamiento como mentol e icilina (Tsavaler y col.. (2001 ) Cáncer Res. 61 (9):3760-9; McKemy y col.. (2002) Nature 416:52-8; Peier y col.. (2002) Cell 108(5)705-15). El canal TRPM8 se expresa en un subconjunto de una pequeña raíz dorsal detectora de temperatura y neuronas del ganglio trigémino (McKemy y col.. (2002) supra; Peier y col.. (2002) supra; Babes y col.. (2004) Eur J Neurosci. 20(9):2276-82; Nealen y col.. (2003) J Neurophysiol. 90(1 ):515-20). Las neuronas del ganglio trigémino suministran nervios sensoriales para las áreas faciales por encima de la boca, el área de la mandíbula inferior, así como por encima de la frente y el contorno del ojo. Por ello, el TRPM8 ha sido implicada en la detección de temperaturas frías en las terminales nerviosas termorreceptoras de los mamíferos. Adicional a su presencia en las neuronas sensoriales, el receptor funcional TRPM8 ha sido también identificado en varios tipos de células no neuronales. La expresión de TRPM8 ARNm fue reportada a niveles moderados en tejido normal de próstata y parece ser elevada en el cáncer de próstata, donde involucra un número de procesos Ca(2+)-dependientes, incluyendo proliferación y apoptosis (Thebault y col. 2005) J Biol Chem 280(47):39423-35). También se expresa en varios tumores de origen primario del seno, colon, pulmón y piel (Tsavaler y col.. (2001 ) supra). Otro canal iónico, el canal potencial receptor transitorio repetición de anquirina-1 (TRPA1 ) también referido como proteina tipo receptora anquirina 1 (ANKTM1 ) se activa en temperaturas frías (debajo de 18 °C), cinamaldehído, alicina, eugenol, gingerol y salicilato de metilo y similares al TRPM8, por icilina.

La TRPA1 se expresa en un subconjunto de neuronas sensoriales que expresan marcadores de las nociceptivas, como TRPV1 , péptido calcitoníno relacionado con el gen (CGRP) y la substancia P (Story y col.. (2003) Célula 1 12:819-829). También se ha reportado que se expresa en fibroblastos cultivados, donde se lo regula por decremento después de la transformación oncogénica fibroblasta (Jaquemar y col.. (1999) J. Biol. Chem. 274:7325-7333).

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En un aspecto, la invención proporciona un método (generalmente un método cosmético) para reducir el crecimiento de pelo indeseado en mamíferos (preferentemente en seres humanos). El método incluye la aplicación de una composición que incluye uno o más agonistas receptores de frío, p. ej.: un agonista de un Potencial Receptor Transitorio Melastatin-8 (TRPM8) y/o un agonista de un canal potencial receptor transitorio repetición de anquirina-1 (TRPA1 ) a un área de la piel. El crecimiento de pelo no deseado puede ser, por ejemplo, desde un punto de vista estético. Los agonistas TRPM8 o TRPA1 incluyen compuestos que activan por lo menos una actividad de uno o más folículos pilosos TRPM8(s) o TRPA1 (s) (p. ej. , una o más TRPM8(s) o TRPA1 (s)) al interactuar firmemente con lo(s)TRPM8(s) o TRPA1 (s); compuestos que incrementan los niveles o expresión de uno a más TRPM8(s) o TRPA1 (s) en folículos pilosos o compuestos que incrementan la expresión de uno o más ARNm de TRPM8 o TRPA1 en folículos pilosos. El término "Interactua firmemente" significa un compuesto que liga o que preferentemente liga al TRPM8(s) o TRPA1 (s). El compuesto puede seleccionarse, por ejemplo, de uno de los tipos de compuestos presentados a continuación. Los agonistas ilustrativosTRPM8 incluyen terpenos, por ejemplo, terpenos cíclicos (p. ej., mentol o lactato de mentilo), WS-3, agente enfriante 10, Frescolat MGA, y Frescolat ML. El agonista de TRPM8 puede también ser un agonista de TRPA1 , por ejemplo, la icilina y el eugenol. Otros agonistas ilustrativos para TRPA1 incluyen gingerol, salicilato de metilo, alícina y cinamaldehído. Ejemplos adicionales de agonistas de TRPM8 o TRPA1 están descritos en la presente. En una modalidad, la composición consiste prácticamente de un agonista de TRPM8 o de TRPA1 por ejemplo, una composición que tenga un agonista de TRPM8 o TRPA1 como el único inhibidor activo del crecimiento del pelo. En otras modalidades, la composición no incluye una o más de: alfa-difluorometilornitina (DFMO), una proteína inhibidora de choque térmico, un compuesto que estimula la apóptosis, o una combinación de éstas. En aún otra modalidad, la composición no incluye un terpeno, por ejemplo, mentol. En otras modalidades, la composición incluye 25 % o más en peso del agonista deTRPM8 o TRPA1 . En otras modalidades, el método incluye una composición que incluye uno o más agonistas deTRPM8 o un TRPA1 . En una modalidad, el agonista activa unTRPM8 y unTRPAI ; por ejemplo, el agonista icilina, que se liga y activa ambos canales. En otras modalidades, se utiliza una combinación de uno o más agonistas selectivos para TRPM8 o TRPA1 . Por lo general, en la práctica de los métodos descritos en la presente, la composición incluirá además un vehículo dermatológica o cosméticamente aceptable. En otra modalidad, el método además incluye el tratamiento del área de la piel con calor, un depilador químico (incluyendo, por ejemplo, uno o más agentes reductores de crecimiento del pelo como está descrito en la presente) u otros métodos para la remoción de pelo (incluyendo una o más de por ejemplo, la afeitada, encerada, depilación mecánica o electrólisis). En una modalidad, el tratamiento depilatorio térmico incluye calentar el área de la piel, por ejemplo con láser o equipo de luz. Por lo general, se aplica el calentamiento dentro de los diez, siete, cinco días y más generalmente dentro de los tres, dos días o un día o simultáneamente junto con la aplicación de la composición. El periodo de tiempo apropiado depende del agonista especifico y puede ser tan corto como un día. El tratamiento puede incluso ser simultáneo. Por lo general, se aplica varias veces la composición y el calentamiento se lleva a cabo dentro de los siete días y con mayor preferencia dentro de tres, dos días o un día o simultáneamente con una de las aplicaciones. En otras modalidades el o los agonista(s) de TRPM8 o TRPA1 mejora(n) la eficacia del inhibidor de pelo térmico mediado o reduce la fluidez de dispositivos fototérmicos. Por ejemplo, la energía de salida de la luz o dispositivo fototérmico, puede ser reducido a aproximadamente 10 a 30 J/cm2, por lo general aproximadamente de 1 a 3 J/cm2. En otras modalidades, la composición que incluye al o los agonista(s) deTRPM8 o TRPA1 , es aplicada a la piel antes, durante o después de la aplicación a la piel de un químico depilador u otros métodos de remoción, p. ej.: encerarse. Por ejemplo, la composición puede ser aplicada una o varias veces y el encerado se lleva a cabo dentro de los siete días y con mayor preferencia dentro de los tres o dos días o un día, o simultáneamente con una de las aplicaciones. La composición también puede ser aplicada después de la remoción de pelo, por ejemplo, encerado, proporcionando de esta manera una ventaja adicional para disminuir el dolor asociado con la remoción de pelo. En algunas realizaciones el o los agonista(s) deTRPM8 o TRPA1 reduce(n) uno o más de los efectos indeseables inducidos por el calor, químico u otros métodos de depilación, esto incluye la transmisión de dolor, irritación o inflamación. La presente invención también se refiere a composiciones tópicas (p. ej., cosméticas) que comprenden un vehículo dermatológica o cosméticamente aceptable y un agonista receptor de frío, por ejemplo, un agonista de TRPM8 o TRPA1 como está descrito en la presente o una composición de ella. Adicíonalmente, la presente invención se refiere al uso de un agonista receptor de frío, por ejemplo, un agonista de TRPM8 o TRPA1 como está descrito en la presente, para la fabricación de una composición tópica (p. ej., una composición como se describe en la presente). Las modalidades de estos aspectos de la invención pueden incluir una o más de las características planteadas anteriormente. Los compuestos mencionados en la presente incluyen el compuesto en sí mismo y sales farmacológicamente aceptables de éste. Otras características y ventajas de la invención serán aparentes de la descripción detallada y de las reivindicaciones.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Un ejemplo de una composición incluye un agonista receptor de frío, por ejemplo, un agonista de TRPM8 o TRPA1 , en un vehículo cosmética o dermatológicamente aceptable. La composición puede ser sólida, semisólída o líquida. La composición puede ser, por ejemplo, un producto cosmético y dermatológico en forma de pomada, loción, espuma, crema, gel o solución. La composición puede estar también en la forma de una preparación para afeitar o para después de afeitar. El vehículo en sí mismo puede ser inerte o puede poseer beneficios cosméticos, fisiológicos o farmacéuticos propios. Ejemplos de agonistas de TRPM8 incluyen terpenos, por ejemplo, terpénos cíclicos, como mentol y lactato de metilo(Frescolat ML). Los terpenos son una clase de compuestos orgánicos que se encuentran en aceites esenciales y han sido empleados como fragancias, saborizantes y medicinas. Un terpeno se refiere a un compuesto que está basado en una unidad isoprena (C5H8) y puede ser clasificado en base al número de unidades isoprenoides que contiene. Por ejemplo, un monoterpeno consiste de dos unidades isoprénicas (C10), sesquiterpénicos tiene tres (C15) y los diterpénicos tienen cuatro (C20). Un terpeno comúnmente utilizado es mentol, el que ha sido incorporado en preparaciones inhalantes y emolientes. Otros ejemplos de terpenos incluye eucalipto (1 ,8-cineol), geraniol, nerolidol, mentona, cineol, terpineol, D-limoneno, linalol, pulegol (p. ej., isopulegol) y carvacrol. Otros ejemplos de agonistas terpénicos y no-terpénicos TRPM8 incluyen Trans-p-mentano-3,8-diol, cis-p-mentano-3,8-diol, L-carvona (Aceite de menta), N,2,3-trimetil-2-isopropilbutanamida (WS-23), N-etil paramentano-3-carboxaminde (WS-3), mentona glice na acetal (Frescolat MGA), mentoxipropanediol (agente de enfriamiento 10), Coolact P, PMD-38, monomentilo succinato (Physcool), monomentilo glutarato e hidroxicitronelal. (Para ejemplo, ver WO 2005/089206; Behrendt, H-J. y col. (2004) British Journal oí Pharmacology 141 :737-745; Calixto, J.B. y col.. (2005) Pharmacology & Therapeutics 106: 179-208 Erman, M. B. y col. (2005) Cosmetics & Toiletries 120(5): 105-1 18, el contenido de todos ellos están incorporados en la presente como referencia). Ejemplos de agonistas que se ligan y activan a TRPM8 y TRPA1 incluyen eugenol, icilina y análogos del los mismos, por ejemplo, compuestos análogos a la icilina. Icilina, 1 -(2-hidroxifenilo)-4-(3-nitrofenil)-1 ,2,3,6-tetrahidropirimidina-2-ona (CAS No. 36945-98-9) tiene una estructura química como la descrita a continuación: Compuestos análogos a la ¡cilina, por lo general, tienen una estructura química general de 1-[R1-fenil] 4-[R2-fenil]-1 ,2,3,6-tetrahidropirimidina- 2-ona como se muestra a continuación, en donde, por lo general, se escoge a R1 de uno o más hidroxilo, cloro, fluoro, alquilo (con aproximadamente 2 a aproximadamente 4 átomos de carbono), acetoxi, o trifluorometil y, por lo general, se escoge a R2 de uno o más nitro, cloro, fluoro, alquilo (con aproximadamente 2 a 4 átomos de carbono) o trifluorometilo.

Los métodos adecuados para la preparación de icilina y compuestos análogos a la icilina, están descritos en la patente de los EE.UU. núm. 3,821 ,221 y patente de los EE.UU. núm. 6,919,348, el contenido de ambas está incorporado en la presente como referencia. Ejemplos de agonistas de TRPA- incluyen gingerol; metil salicilato (aceite de menta verde); compuestos de isotiocianato (p. ej., alicina o isotiocianato de alilo (aceite de mostaza), así como bencilo, feniletilo, isopropilo y metil isotiocianato); cinamaldehído (aceite de canela), y ?9-tetrahidrocanabinol. Los métodos para la sintetización y examinación de los agonistas TRPA1 divulgados en la presente, asi como análogos del mismo, son conocidos en la industria y descritos, por ejemplo, en la patente WO 2005/089206 y Calixto, J.B. y col.. (2005) supra, el contenido de los mismos está por este medio incorporado en la presente como referencia. La composición puede incluir uno o más agonistas deTRPM8 o TRPA1 . La composición también puede incluir uno o más de otros tipos de agentes reductores de crecimiento de pelo, como los descritos en la patente de los EE.UU. núm. 4,720,489; patente de los EE.UU. núm. 4,885,289; patente de los EE.UU. núm. 5,095,007; patente de los EE.UU. núm. ,096,91 1 ; patente de los EE.UU. núm. 5,132,293; patente de los EE.UU. núm. 5,143,925; patente de los EE.UU. núm. 5,328,686; patente de los EE.UU. núm. 5,364,885; patente de los EE.UU. núm. 5,41 1 ,991 ; patente de los EE.UU. núm. 5,440,090; patente de los EE.UU. núm. 5,468,476; patente de los EE.UU. núm. 5,475,763; patente de los EE.UU. núm. 5,554,608; patente de los EE.UU. núm. 5,648,394; patente de los EE.UU. núm. ,652,273; patente de los EE.UU. núm. 5,674,477; patente de los EE.UU. núm. 5,728,736; patente de los EE.UU. núm. 5,776,442; patente de los EE.UU. núm. 5,824,665; patente de los EE.UU. núm. 5,840,752; patente de los EE.UU. núm. 5,908,867; patente de los EE.UU. núm. 5,939,458; patente de los EE.UU. núm. 5,958,946; patente de los EE.UU. núm. 5,962,466; patente de los EE.UU. núm. 6,020,006; patente de los EE.UU. núm. 6,037,326; patente de los EE.UU. núm. 6,060,471 ; patente de los EE.UU. núm. 6,093,748; patente de los EE.UU. núm. 6,121 ,269; patente de los EE.UU. núm. 6,218,435; patente de los EE.UU. núm. 6,235,737; patente de los EE.UU. núm. 6,239,170; patente de los EE.UU. núm. 6,248,751 ; patente de los EE.UU. núm. 6,299,865; patente de los EE.UU. núm. 6,414,017; patente de los EE.UU. núm. 6,743,419; y patente de los EE.UU. núm. 6,743,822, todas ellas incorporadas en la presente como referencia. La concentración del agonista deTRPM8 o TRPA1 en la composición puede variar por todo un amplio intervalo hasta una solución saturada, preferentemente de 0.1 % a 30 % en peso o aun más; la reducción del crecimiento del pelo aumenta a medida que aumenta la cantidad de compuesto aplicada por área unitaria de la piel. La cantidad máxima aplicada eficazmente está limitada solamente por la velocidad de penetración de la piel. Las cantidades eficaces pueden variar, por ejemplo, de 10 a 3000 microgramos o más, por centímetro cuadrado de piel. El vehículo puede ser inerte o puede tener beneficios cosméticos, fisiológicos o farmacéuticos propios. Los vehículos pueden formularse con emolientes líquidos o sólidos, solventes, espesantes, humectantes o polvos. Los emolientes incluyen alcohol estearílico, aceite de visón, alcohol cetílico, alcohol oleílico, laurato de isopropilo, polietilenglicol, vaselina, ácido palmítico, ácido oleico y miristato de miristilo. Los solventes incluyen alcohol etílico, isopropanol, acetona, dietilenglicol, etilenglicol, sulfóxido de dimetilo y dimetilformamida. La composición opcionalmente puede incluir componentes que mejoran la penetración del agonista de TRPM8 o TRPA1 a la piel o al lugar de acción. Los ejemplos de potenciadores de penetración incluyen urea, éteres polioxietileno (p. ej., Brij-30 y laureth- 4),3-hidroxilo-3,7,1 1-tr¡met¡lo-1 ,6,10-dodecatrieno, ácidos grasos cis (p. ej., ácido oleico, ácido palmitoleico), acetona, laurocaprama, sulfóxido de dimetilo, 2-pirrolidona, alcohol oleílo, glicerilo-3-estearato, propan-2-ol, isopropilo éster del ácido mirístico, colesterol y propilenglicol. Puede añadirse un potenciador de penetración, por ejemplo, con concentraciones de 0.1 % a 20 % o de 0.5 % a 5 % en peso. También se puede formular la composición para proveer un reservorio dentro o en la superficie de la piel que provee una liberación continua y lenta del agonista de TRPM8 o TRPA1 . La composición puede formularse para que se evapore lentamente de la piel, dando al agonista tiempo adicional para penetrar en la piel. Se prepara una composición tópica a base de crema que contiene un agonista deTRPM8 o de TRPA1 mezclando agua y todos los componentes solubles en agua en un recipiente de mezclado- A. El pH se ajusta dentro de un intervalo deseado que varía de aproximadamente 3.5 a 8.0. Para que los ingredientes se disuelvan completamente, la temperatura del recipiente debe elevarse hasta 45 °C. La selección del pH y de la temperatura dependerá en la estabilidad del agonista deTRPM8 o TRPA1. Los componentes de aceite soluble, excepto los componentes conservadores y de fragancia se mezclan en otro recipiente (B) y se calientan hasta 70 °C para que los componentes se fundan y mezclen. El contenido caliente del recipiente B se vierte en la fase acuosa (recipiente A) y se agita en forma rápida y enérgica. Se continúa mezclando por aproximadamente 20 minutos. Los componentes conservadores se añaden a una temperatura de aproximadamente 40 °C. Se continúa la agitación hasta que la temperatura alcanza aproximadamente 25 °C para producir una crema blanda con una viscosidad de 8 Pa.s (8000 cps) - 12 Pa.s (12,000 cps), o una viscosidad deseada. Los componentes de fragancia se añaden a aproximadamente 25 °C - 30 °C mientras el contenido todavía se está mezclando y la viscosidad no ha alcanzado el intervalo deseado. Para aumentar la viscosidad de la emulsión resultante se puede aplicar esfuerzo cortante con un homogeneizador convencional, por ejemplo, un homogeneizador Silverson L4R con una criba de alto esfuerzo cortante con orificios cuadrados. Para elaborar la composición tópica puede incluirse el agente activo en la fase acuosa durante la preparación de la formulación descrita anteriormente o puede añadirse una vez que se termina de preparar la formulación (vehículo). El agente activo puede añadirse también en cualquiera de los pasos de preparación del vehículo. Los componentes de las formulaciones en crema se describen en los siguientes ejemplos.

EJEMPLO 1 Crema a El ingrediente activo es un agonista deTRPM8 o TRPA. b Polyquartinium-51 (Collaborative Labs, NY). c Glicerina, agua, sodio PCA, urea, trehalosa, polyquaternium-51 y hialuronato de sodio (Collaborative Labs, NY).

Crema El ingrediente activo es un agonista deTRPM8 o TRPA1 .

EJEMPLO 3 Crema a El ingrediente activo es un agonista deTRPM8 o TRPA1 .

EJEMPLO 4 Crema Se adhiere un agonista de TRPM8 o TRPAI a la formulación ejemplo 4 y se mezcla hasta solubilizada.

EJEMPLO 5 Crema Se adhiere un agonista deTRPM8 o TRPAI a la formulación del ejemplo 5 y se mezcla hasta solubilizada.

EJEMPLO 6 Crema Se adhiere un agonista deTRPM8 o TRPAI a la formulación del ejemplo 6 y se mezcla hasta solubilizada.

EJEMPLO 7 Crema Se adhiere un agonista deTRPM8 o TRPA1 a la formulación del ejemplo 7 y se mezcla hasta solubilizada.

Crema Se adhiere un agonista deTRPM8 o TRPA1 a la formulación del ejemplo 8 y se mezcla hasta solubilizada. Se prepara una formulación hidroalcohólica conteniendo un agonista deTRPM8 o TRPA1 mezclando los componentes de la formulación en un recipiente de mezclado. El pH de la formulación se ajusta hasta un valor deseado dentro del intervalo comprendido en el rango de 3.5 - - 8.0. El pH puede ajustarse también para disolver completamente los ingredientes de la formulación. Además, se puede aplicar calor de tal manera que la temperatura sea de hasta 45 °C o incluso de hasta 70 °C en función de la estabilidad del activo para que los ingredientes de la formulación se disuelvan. A continuación se incluyen varias formulaciones hidroalcohólicas.

EJEMPLO 9 Hidroalcohólico El ingrediente activo es un agonista deTRPM8 o TRPA. Triglicérido caprilico/cáprico (Abitec Corp., OH).

EJEMPLO 10 Hidroalcohólico 3 El ingrediente activo es un agonista deTRPM8 o TRPA1 .

EJEMPLO 11 Hidroalcohólico Se adhiere un agonista deTRPM8 o TRPA1 a la formulación y se mezcla hasta solubilizada. El calentamiento puede realizarse, por ejemplo, utilizando un láser, equipo de luz o un dispositivo de Luz Intensa Pulsada (IPL). Por ejemplo, el dispositivo puede ser un láser Diodo en el intervalo de longitud de onda de 700 - 1300 nm (por ejemplo, 810 nm), un láser Ruby a 654 nm, un láser Alexandrite a 755 nm, un láser de Nd:YAG a 1064 nm, un láser de Nd:YAG en un intervalo de 600 - 850 nm, una Luz Pulsada, Luz Pulsada Intensa o un equipo de luz en el intervalo de longitud de onda de 400 -1200 nm, una Luz Fluorescente Pulsada a 550, 580 o 615 - 1200 nm, un Diodo Electroluminiscente (LED) en el intervalo de longitud de onda de 400 -700 nm, y una energía óptica (580 - 980 nm) o Diodo (800 ± 25 nm) combinado con energía eléctrica con Radio-Frecuencia. La energía de salida (J/cm2) de la luz y artefactos fototérmicos pueden ser, por ejemplo, de 0.5 -50 J/cm2, 2 - 20 J/cm2, o 1 - 10 J/cm2. Otros láseres y parámetros de fuente liviana cuyos efectos de calentamiento incluyen la duración del pulso, tamaño del punto y la velocidad de repetición. Los intervalos de estos parámetros dependen del dispositivo de calentamiento utilizado. La duración del pulso puede variar, por ejemplo, de 0.1 ms hasta 500 ms o puede ser una onda continua (CW) como descrito en la patente de los EE.UU. 6,273,884. Durante el calentamiento, la temperatura de la piel se calienta generalmente hasta al menos 40 °C, por ejemplo, entre 40 °C y 55 °C. Sin embargo, la piel puede calentarse, tanto como, por ejemplo, 70 °C utilizando pulsos cortos de milisegundos y evitando quemarla. Para el nivel de temperatura baja entre 40 - 60 °C, se debe mantener el tiempo de exposición entre 0.5 min a varios minutos. Para temperaturas por encima de los 60 °C, se debe permanecer dentro del tiempo de exposición de 1 -500 msec. La temperatura de la piel obtenida por calentamiento de un mecanismo en particular, generalmente puede ser determinado como sigue. Se coloca un sujeto con una temperatura corporal normal en una habitación con una temperatura de 25 °C. Un termopar de 0.23 mm (0.009-pulgada) de diámetro se coloca en un área de la piel. La salida del par termoeléctrico se conecta a un acondicionador de señal de par termoeléctrico National Instruments SCXI-1 1 12. Un tablero de captación de datos National Instruments 6052E, con una velocidad de captación de 333 kilo-muestras por segundo controló la captación de datos y el aumento de señal. La combinación de SCXI- 1 2 y NI 6052E DAQ pueden detectar simultáneamente hasta ocho salidas de par termoeléctrico a una velocidad de 42 kilo-muestras por segundo. La velocidad de muestreo puede realizarse, por ejemplo, a 1000 muestras/seg.

Se utiliza un método similar para determinar el intervalo de temperatura en la región hipodérmica. En este caso, se inserta un par termoeléctrico a una profundidad de aproximadamente 5 mm en la piel humana ex-vivo y el tratamiento se aplica en la superficie de la piel. La composición debe ser aplicada en forma tópica a un área seleccionada de la piel en la que se desee reducir el crecimiento de pelo. El periodo de tiempo para la aplicación de la composición tópica, antes o después, del tratamiento de calentamiento puede variar desde un día o incluso una aplicación simultánea, dependiendo de la naturaleza del químico activo en la composición tópica. Preferentemente la composición se aplica (varias veces, por ejemplo, dos, tres o cuatro veces) dentro de los siete días del calentamiento y con mayor preferencia, al menos una vez dentro de uno o dos días de calentamiento. Las composiciones pueden aplicarse una vez al día durante al menos dos o tres días antes del calentamiento. Por ejemplo, la composición puede aplicarse en el rostro, especialmente en el área de la barba, es decir, la mejilla, el cuello, el labio superior y el mentón. La composición puede también ser aplicada a las piernas, brazos, torso, axilas, cejas o área de bikini. La composición es especialmente adecuada para reducir el crecimiento de pelo no deseado en mujeres que sufren de hirsutismo u otras afecciones. Se puede utilizar la combinación composición/calentamiento adicionalmente a otros métodos de remoción de pelo, incluyendo afeitado, encerado, depilación mecánica, depilación química y electrólisis. Por ejemplo, se pueden utilizar agonista(s) de TRPM8 o TRPA1 , en combinación con cualquiera de los métodos de remoción de pelo anteriormente mencionados, por ejemplo, encerado. Dicha combinación de tratamiento puede además incluir un tratamiento depilatorio por calentamiento (p. ej., láser). Cualquier combinación o secuencia de los tratamientos antes mencionados con un agonista de TRPM8 o TRPA1 está dentro de la visión de la invención. La reducción del crecimiento capilar puede demostrarse cuantitativamente por medio de la reducción de la longitud del pelo, el diámetro del pelo, la pigmentación del pelo, o la densidad del pelo en el área tratada. La reducción del crecimiento capilar puede demostrarse cosméticamente por menos pelo visible, trazos de barba, pelo más fino/delgado, o afeitadas más duraderas en el área tratada. Más adelante se exponen los protocolos utilizados en los Ejemplos anexados.

Ensayo del crecimiento del folículo piloso en el ser humano: En la fase de crecimiento los folículos pilosos en el ser humano (anágeno) fueron aislados del tejido de cirugía plástica facial (obtenida de cirujanos plásticos). La piel se cortó en tiras finas dejando expuestas 2 - 3 hileras de folículos que podrían disecarse fácilmente. Los folículos se colocaron en un medio William's E (Life Technologies, Gaithersburg, Maryland.) suplementados con 2 mM L-glutamina, 10 pg/mL insulina, 10 ng/mL hidrocortisona, y una mezcla de un antibiótico/antimicótico como está descrito en Philpott y col.. (1990) J. Cell Sci. 97 (Pt3):463-71 . Los folículos fueron incubados por diferentes periodos de tiempo en placas de 24 pocilios (1 folículo/pocilio) a 37 °C en una atmósfera de 5 % CO2 y 100 % de humedad. (Philpott y col.. (1990) supra). La longitud del folículo piloso fue evaluada utilizando un sistema de software para el análisis de imágenes. Para determinar el efecto de moléculas modulando la actividad de TRPM8 /TRPA1 en el crecimiento del pelo, se incubaron los folículos pilosos con icilina (Tocris Bioscience) y L-Mentol, L-lactato de mentilo (Sigma). Se tomaron imágenes del folículo piloso en las placas de 24 pocilios en condiciones de disección con una potencia de 20x. El largo del folículo piloso fue medido en día 0 (folículos día fueron puestos en cultivo) y nuevamente en el día 6. El crecimiento de la fibra de pelo fue calculado por la resta del largo del folículo en día 0 del determinado en el día 6.

Inmunohistoquimica Para determinar la expresión de TRPM8 en el folículo piloso se empleó el protocolo de inmunofluorescencia indirecta. Secciones Criostatas (8 pm) de folículos pilosos fueron frescamente preparados y fijados en acetona y preincubados con 10 % de suero normal de cabra, seguido por una incubación con el anticuerpo primario contra TRPM8 (1 :50; Novus-Biologicals) durante la noche a temperatura ambiente. Entonces, se incubaron secciones con TRITC-etiquetada cabra contra ratón IgG (Jackson Immuno Research; 45 min, 37 °C). Para la detección de la proliferación de células, el protocolo indirecto de inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo monoclonal de conejo contra Ki-67. Se prepararon ocho secciones pm de folículos pilosos en formalina y postfixed en etanol/ácido acético. Después, se incubaron las secciones con el anticuerpo contra Ki-67 (1 : 50; Dako; M 7187) durante la noche a temperatura ambiente, seguido por incubación con TRITC-etiquetada cabra contra ratón IgG (Jackson ImmunoResearch; 45 min, 37 °C). El contramarcado se realizó utilizando el tinte HOECHST 33342 (10 mg/mL en PBS; 10 minutos). Cada fase se intercaló con un paso de lavado (tres veces) en PBS. Finalmente, las secciones se montaron utilizando el medio VectaShield de Vector Laboratories). Para la inmunodetección de proteínas melanogénicas, se incubaron secciones ya sea con un anticuerpo ratón monoclonal contra tirosinasa humana o un anticuerpo monoclonal gallina contra humano p-mel 1 7 (Neomarker y Zymed, respectivamente; 1 :100, durante la noche), seguido por incubación con TRITC-etiquetada cabra anti-conejo IgG (Jackson ImmunoResearch; 45 min, 37 °C) y FITC-etiquetada cabra anti-gallina IgG, respectivamente. Después, las secciones fueron contra-tincionadas con Hoechst 33342 (1 : 300, 15 min) para la identificación del núcleo celular y montadas utilizando VectaShield (Vector Laboratories). Todas las secciones se examinaron bajo un microscopio fluorescente Olympus BX 60 y se fotodocumentaron con la ayuda de un sistema de análisis digital (cámara CCD enfriada CoolSnap™ , Alpha Innotech).

Análisis Western Blot (Transferencia de Western) En un regulador de lisis se cosecharon proteínas celulares totales de melanocitos humanos (Estuche de extracción de proteína total; CHEMICON International, Inc). Se cargaron veinte pg de proteína por línea, separados por 10 % de electroforesis en gel de poliacrilamida sulfato de dodecilo sódico, y fueron transferidos a una membrana nitrocelulosa a 100 V por 1 h. Seguido de un bloqueo durante la noche con 5 % de albúmina sérica de leche descremada en polvo/bovina (BSA) en regulador tri-fosfato salino (a) (PBS) (0.5 % Tween-20 en PBS) a 4 °C, la membrana fue incubada durante la noche con un anticuerpo monoclonal contra ya sea tirosinasa o proteína-1 relacionada con la tirosinasa o actina en una dilución de 1 :1000. Después de la incubación, la membrana fue brevemente lavada en PBS, después tres veces con Tris-PBS, e incubada con el correspondiente anticuerpo secundario a una dilución de 1 :1000 (Pierce, Rockford, IL) en 1 % leche/0.2 % BSA por 1 hora. Después de un lavado intenso, la membrana fue incubada por 1 min con quimicoluminisencia enlazada a una enzima Western Blotting Detection Reagent (Reactivo de Detección de transferencia de Western) (Amersham, Buckinghamshire, U.K.) y se detectaron bandas en película Kodak X-Omat pre-flasheada y desarrollada después de varios segundos de exposición.

La transcripción del gen RT-PCR TRPA1 en piel humana de grosor completo y en células aisladas de la papila dérmica del folículo piloso, está caracterizada por el análisis RT-PCR. El ARN total fue aislado de muestras de grosor completo de cuero cabelludo y células folículas pilosas aisladas de papila dérmica, utilizando reactivo TRIzol (Invitrogen, San Diego, Calif.). Se sintetizó un ADNc por transcripción reversa de 2.5 pg de total ARN, utilizando un SuperScript™ Sistema de Síntesis de Primera-Hebra (First-Strand Synthesis System) para RT-PCR (Invitrogen, San Diego, Calif.). Los siguientes sets de cebador oligonucleótido fueron utilizados para amplificar un ADNc especifico: TRPA1 humano: Cebador #1 : 5'-TCATGGTCCAACAGAACACATGGC-3' y 5'-GCATGACAGGCATGGTACAGTGTT-3' (Tamaño Producto Cebador: 228 bp), Cebador #2: 5'- TCCTCTCCATCTGGCAGCAAAGAA -3' y 5'-ATTGTGGCTCAGAAGAAGCGCAAC -3' (Tamaño Producto Cebador: 262 bp). La amplificación se realizó utilizando PCR SuperMix (Invitrogen) por encima de los 38 ciclos, utilizando un ciclador térmico automatizado. Cada ciclo consistió de los siguientes pasos: desnaturando a 94 °C (1 min), recocimiento a 58 °C (45 s), y extensión a 72 °C (45 s). Los productos PCR fueron analizados por electroforesis en gel (2 % agarosa) y digestión enzimática utilizando métodos estándares.

EJEMPLO 1 Localización de inmunohistoquímica de TRPM8 en Folículos Pilosos Aná enos Para localizar un TRPM8 en el folículo piloso humano anágeno, se aplicó inmunohistoquímica usando un anticuerpo conejo policlonal contra un TRPM8 humano. Se encontró la expresión de TRPM8 en la papila dérmica del folículo piloso, así como en las células de la matriz del pelo que circunda la papila dérmica. Un doble inmunomanchado para la detección simultánea de un TRPM8 y un marcador de melanocito pMel-17 (gp 100) revelado colocalización de estas dos proteínas en el folículo piloso. Esto sugiere que la expresión de células TRPM8 que se ven en la matriz del pelo son melanocitos. De esa manera, se detectó la expresión TRPM8 en la papila dérmica del folículo piloso y en los melanocitos foliculares y epidérmicos.

EJEMPLO 2 La expresión TRPA1 ARNm en la piel humana y folículos pilosos En una transcripción del gen TRPA1 en piel humana de grueso total y en células de papila dérmica aislada del folículo piloso fue caracterizada por una análisis RT-PCR. Se extrajo el ARN total de la piel de cuero cabelludo humano y de la papila dérmica del folículo piloso y fueron transcritas en reverso.

Como resultado, se encontraron los niveles de un estado constante detectable de niveles de TRPA1 -RNAm en la piel así como en las células de papila dérmica.

EJEMPLO 3 Efecto de los Agonistas de TRPM8 y TRPA1 en el Crecimiento de Pelo Para identificar si la modulación de la actividad de TRPM8 y TRPA1 pudiera afectar el crecimiento de pelo, se probaron sus agonistas en un modelo de cultivo folículo piloso. El tratamiento de folículos pilosos con 10 µ? de mentol, icilina, y lactato de mentilo, estadísticamente causó una significante inhibición del crecimiento del pelo en 40 %, 45 % y 60 % respectivamente, en comparación con el control. El tratamiento de folículos pilosos con icilina (un agonista de TRPM8 y TRPA1 ), resultó en la inhibición de la proliferación celular de una manera dependiente de la concentración, que fue detectada por una notable disminución en la inmunorreactividad de Ki-67 en la matriz capilar y en la envoltura externa de la raíz. De esa manera, la activación de cualquiera de TRPM8 o TRPA1 por un agente enfriante, lleva a una reducción significante en la velocidad de crecimiento de pelo in vitro.

EJEMPLO 4 Efecto de los agonistas de TRPM8 y TRPA1 en Melanocitos Para determinar ya sea que un agonista de TRPM8 y TRPA1 pueda afectar al pigmento, produciendo actividad en los melanocitos, la expresión de tirosinasa fue analizada en los folículos pilosos tratados con 10 u de icilina por inmunohistoquímica. En comparación al control, la expresión de tirosinasa fue disminuida en los folículos pilosos tratados. Adicionalmente, se comprobaron los efectos de la expresión de la proteína melanogénica en la cultura epidérmica de melanocitos. Después del tratamiento de 48 horas de icilina de 10 uM, se observó un disminución en los niveles de la expresión de la proteína tirosinasa y tirosinasa-relacionada (TRP)-1 comparado con el control, como está determinado por el análisis Western Blot. Por ello, la icilina ejerce un efecto inhibidor en el crecimiento del pelo in vitro, acompañado por una disminución en la actividad de producción de pigmento de los melanocitos. Estos resultados sugieren que los receptores agonistas de TRPM8 y TRPA1 puedan proteger los melanocitos de sobre pigmentación. Otras modalidades se incluyen en las reivindicaciones. Por ejemplo, las clases de compuestos y los compuestos específicos descritos en la lista de las patentes anteriores e incorporadas como referencia, pueden utilizarse en los métodos descritos en la sección de resumen. Todos los documentos citados en la Descripción Detallada son, en sus partes relevantes, incorporados en la presente como referencia; la cita de cualquier documento no deberá interpretarse como una admisión de que constituye una industria anterior con respecto a la presente invención. En la medida que cualquier significado o definición de un término en este documento escrito contradiga cualquier significado o definición del mismo término en un documento incorporado como referencia, el significado o definición asignado a ese término en este documento deberá regir. Si bien se han ilustrado y descrito modalidades particulares de la presente invención, será evidente para aquellos con experiencia en la industria que pueden hacerse varios cambios y modificaciones sin desviarse del espíritu y alcance de la invención. Se ha pretendido, por consiguiente, cubrir en las reivindicaciones anexas todos los cambios y modificaciones que están dentro del alcance de la invención.

Claims (10)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION
2. REIVINDICACIONES
3. Lo que se reivindica es: 1 . - Un método para reducir el crecimiento del pelo en un mamífero, que comprende: (a) seleccionar un área de la piel en el mamífero, en la que se desea reducir el crecimiento del pelo; y (b) aplicación al área de la piel de una composición dermatológicamente aceptable que comprende un agonista receptor de frío escogido de un agonista de un Potencial Receptor Transitorio Melastatina-8 (TRPM8), un canal agonista potencial receptor transitorio de repetición de anquirina-1 (TRPA1 ) o una combinación de éstos. 2. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la composición no incluye alfa-difluorometilomitina. 3.- El método de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado además porque los agonistas de TRPM8 son agonistas no terpénicos TRPM8.
4. 4.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la composición comprende además un terpeno.
5. 5.- El método de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado además porque el agonista de TRPM8 es un terpeno.
6. 6.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el terpénico es mentol o lactato de mentilo.
7. 7. - El método de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado además porque el agonista de TRPM8 o TRPA1 es icilina.
8. 8. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque la composición no incluye un inhibidor de proteína de choque térmico o un compuesto que promueva la apoptosis.
9. 9. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque comprende adicionalmente el paso de (c) contactar el área de la piel con un depilador térmico.
10. 10. -El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque se utiliza un láser para el paso (c). 1 1 . -El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el área de la piel es tratada con un láser dentro de las 48 horas de la aplicación de la composición. 12. -El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque se utiliza un equipo de luz para el paso (c). 13. -El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque la composición incluye entre 0.1 % y 30 % del agonista en peso. 14. -El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el área seleccionada de piel de un humano consiste del grupo de la cara, axilas, piernas, cejas y área de bikini.