MX2008010833A

MX2008010833A - Compuestos de hexosa para tratar cancer.

Info

Publication number: MX2008010833A
Application number: MX2008010833A
Authority: MX
Inventors: Waldemar Priebe; Slawomir Szymanski; Izabela Fokt; Charles Conrad; Sigmund Hsu; Theodore J Lampidis
Original assignee: Univ Texas
Priority date: 2006-02-24
Filing date: 2007-02-26
Publication date: 2008-11-12
Also published as: CA2643038A1; EP1986660A4; AU2007220777A1; EP1986660A2; BRPI0708273A2; WO2007101148A3; US20100130434A1; WO2007101148A2; KR20080096807A; JP2009531301A

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para tratar glioblastoma y cáncer pancreático, por la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto hexosa a un sujeto en necesidad de la misma. La invención sujeto incluye métodos para tratar cáncer pancreático y cerebral que comprende, la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto manosa a un sujeto en necesidad de la misma. La invención sujeto además incluye métodos para tratar la proliferación de tumores que comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de 2-FM a un sujeto en necesidad de la misma.

Description

COMPUESTOS DE HEXOSA PARA TRATAR CÁNCER CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a compuestos de hexosa empleados en el tratamiento de cáncer y métodos para tratar enfermedades mediadas por cáncer en un sujeto en necesidad del mismo administrando tal compuesto.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los tratamientos de cáncer son a menudo, asociados con los cambios del desarrollo de resistencia de tumor. La apoptosis, un tipo de muerte celular programada, involucra una serie de eventos químicos que conducen a la morfología y muerte celular. El proceso apoptótico se ejecuta en tal forma para disponer de manera segura de fragmentos celulares. Elucidando las trayectorias de transducción de señal intracelular a través de terapia de cáncer, sin embargo, es posible se afecten las estructuras y procesos cruciales para inducción de muerte celular. Sin embargo, los procesos de apoptosis defectiva han sido implicados en numerosas enfermedades. El exceso de apoptosis causa enfermedades de pérdida celular como daño isquémico. Por otro lado, cantidades insuficientes de apoptosis resultan en proliferación celular no controlada tal como cáncer.

Ocurren cambios cuando el progreso de gliomas malignos puede ser relacionado con la activación de la trayectoria PI-3K/AKT (típicamente por pérdida de PTEN o a través de la actividad del factor de crecimiento tal como EGFR) . Esta trayectoria de supervivencia activa un número de cambios adaptivos que incluyen entre otras cosas, un estímulo por angiogénesis, inhibidores de apoptosis, y cambios metabólicos que promueven la activación de glicólisis, preferencialmente . De manera similar, nuevos objetivos de tratamiento para cáncer pancreático incluyen, objetivos de trayectorias de transducción de señal y moléculas involucradas en la angiogénesis, específicamente, la trayectoria de señalización de oncogene ras e inhibidores de la metaloproteasa de matriz (MMP) . Muchos cánceres tales como gliomas malignos y cáncer pancreático son intrínsecamente resistentes a terapias convencionales y representan cambios terapéuticos significantes. Los gliomas malignos tienen una incidencia anual de 6.4 casos por 100,000 (Central de Registro de Tumores Cerebrales de los Estados Unidos, 2002-2003) y son el subtipo más común de tumores cerebrales primarios y los cánceres humanos más mortales. En su manifestación más agresiva, el glioblastoma multiforme (GBM) , la duración de supervivencia media para pacientes varía desde 9 hasta 12 meses, debido a los esfuerzos máximos de tratamiento. En efecto, aproximadamente un tercio de pacientes con GBM, sus tumores continuarán creciendo debido al tratamiento con radiación y quimioterapia. De manera similar, dependiendo de la magnitud del tumor y el tiempo de diagnóstico, el pronóstico para cáncer pancreático es en general, considerado como pobre, con algunas victimas todavía vivas 5 años después del diagnóstico y remisión completa infrecuente . Además, ulterior al desarrollo de resistencia a tumor a tratamientos, otro problema en el tratamiento de tumores malignos es la toxicidad del tratamiento a tejidos normales no afectados por la enfermedad. A menudo, la quimioterapia es dirigida para eliminar células que se dividen rápidamente con respecto a si estas células son normales o malignas. Sin embargo, la muerte celular distribuida y los efectos secundarios asociados de tratamientos de cáncer, puede no ser necesaria para supresión de tumor, si las trayectorias de control de crecimiento de tumor pueden ser deshabilitadas. Por ejemplo, un procedimiento es el uso de sensibilización de terapia, es decir, usando dosis bajas de un tratamiento estándar en combinación con un fármaco que específicamente dirige procesos cruciales en la célula tumoral, incrementando los efectos del otro fármaco. Además, las terapias de combinación incluyen procedimientos basados en vacuna en combinación con los elementos moduladores inmunes y citoreductivos de quimioterapia con la especificidad citotóxica celular de inmunoterapia . Las terapias de combinación sin embargo, son típicamente más difíciles para tanto el paciente como el especialista, que las terapias que requieren solamente un agente único. Además, ciertos tumores tienen una resistencia intrínseca contra radioterapia y muchas modalidades de quimioterapia pueden ser debido a los patrones de crecimiento diferencial y diferentes tipos de patrones de crecimiento pueden presentar varios grados de regiones hipóxicas dentro de tumores individuales. Por ejemplo, los gliomas pueden crecer en forma predominantemente infiltrativa con poco o ningún mejoramiento de contraste observado en exploraciones de MRI MRI contra lesiones de masa que mejoran el contraste que crecen más rápidamente. De manera similar, las etapas tempranas de cáncer pancreático pueden irse inadvertidamente. También, las áreas hipóxicas relativas pueden ser vistas tanto en el centro de la masa de tumor que crece rápidamente la cual a menudo, tiene regiones de necrosis asociadas con esta, así como también algunas regiones relativamente hipóxicas dentro del componente infiltrativo del tumor también. Por consiguiente, algunas de estas regiones relativamente hipóxicas pueden tener células, las cuales son repetidas a una relación más lenta y pueden por lo tanto, ser resistentes a agentes de quimioterapia . Recientemente, ciertas terapias de cáncer propuestas, dirigen el uso de inhibidores glicólicos. Este tipo de inhibidor es diseñado para beneficiarse de la selectividad que resulta cuando una célula se cambia de metabolismo aeróbico a anaeróbico. Debido al crecimiento del tumor, las células cancerígenas llegan a ser removidas de la sangre (suministro de oxígeno) . Bajo hipoxia, las células tumores regulan ascendentemente la expresión de tanto transportadores de glucosa como enzimas glicolíticas , a su vez, favoreciendo una absorción incrementada de los análogos de glucosa, comparada con células normales en un ambiente aeróbico. Bloqueando la glicólisis en una célula en la sangre, no se eliminará la célula debido a que la célula sobrevive usando oxígeno para quemar grasa y proteína en sus mitocondrias para producir energía (vía moléculas de almacenamiento de energía tales como ATP) . Por el contrario, cuando la glicólisis es bloqueada en células en un ambiente hipóxico, las células mueren, debido a que sin oxígeno, la célula es incapaz de producir energía vía oxidación de mitocondria de grasa y proteína. Por lo tanto, mientras los inhibidores glicolíticos han mostrado prometer tratar ciertos cánceres, no todos los cánceres existen en un ambiente hipóxico. Sin embargo, observaciones clásicas por Otto arburg, han demostrado una preferencia de muchos tumores ara utilizar preferencialmente glicólisis para producción de energía celular, aún en la presencia de cantidades adecuadas de oxígeno (llamada glicólisis oxidativa, o el "efecto Warburg"). Esta respuesta adaptiva del tumor parece mantenerse cierta para gliomas malignos también . Por lo tanto, existe una necesidad para el tratamiento de cánceres que muestran una resistencia a quimioterapia, exhiben patrones de crecimiento diferencial o patrones de crecimiento que tienen varios grados de regiones hipóxicas dentro del tumor y/o tienen trayectorias de supervivencia las cuales son un estímulo para la angiogénesis o inhibir la apoptosis.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se han encontrado compuestos de hexosa y composiciones farmacéuticas de los mismos, que previenen, inhiben y modulan cáncer, junto con el uso de los compuestos para el tratamiento de cáncer, particularmente, glioblastoma y cáncer pancreático. La presente invención describe el uso de compuestos de hexosa empleados en el tratamiento de cáncer y trastornos y condiciones mediadas por cáncer. Los métodos de tratamiento de glioblastoma y cáncer pancreático comprenden, la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto hexosa a un sujeto en necesidad de la misma. De interés particular es el método para tratar la proliferación de tumores que comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de 2-FM a un sujeto en necesidad de la misma. La presente invención incluye métodos para tratar cáncer, administrando un compuesto de mañosa a un sujeto en necesidad del mismo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FIGURAS La Figura 1A representa los resultados de un ensayo inhibidor de crecimiento de tumor en células SKBR3 con 2-DG, 2-FDG, 2-FDM, y oxamato, durante un periodo de 24 horas. Cada valor es el promedio + SD de muestras triplicadas . La Figura IB representa los resultados de un ensayo citotóxico en células SKBR3 con 2-DG, 2-FDG, 2-FDM u oxamato y 24 horas. Cada valor es el promedio + SD de muestras triplicadas. La Figura 2A representa los resultados del crecimiento de células SKBR3 por 24 horas en la ausencia o presencia de ya sea 2 mM de 2-DG o 2-FDG y concentración de lactato en el medio. La Figura 2B representa los resultados del crecimiento de células SKBR3 por 6 horas en la presencia de ya sea 2-DG o 2-FDG a las mismas concentraciones usadas en la Figura 2A, seguidas por cuantificación de ATP en Usados celulares completos. La Figura 3A representa los resultados de ensayos de crecimiento inhibidor en células SKBR3 después del tratamiento con 2-DG en la presencia de varios azúcares.

Cada valor es el promedio + SD de muestras triplicadas. La Figura 3B representa los resultados de ensayos citotóxicos en células SKBR3 después del tratamiento con 2- DG en la presencia de varios azúcares. Cada valor es el promedio + SD de muestras triplicadas. La Figura 3C representa los resultados de ensayos inhibidores de crecimiento en tres diferentes modelos de "hipoxia" después del tratamiento con 2-DG en la presencia o ausencia de 2 mM de mañosa. La Figura 3D representa los resultados de ensayos citotóxicos en tres diferentes modelos de "hipoxia" después del tratamiento con 2-DG en la presencia o ausencia de 2 mM de mañosa. La Figura 4A representa los resultados de células SKBR3 tratadas por 48 horas con varios fármacos como se indica para cada linea y los extractos celulares totales se obtuvieron y mancharon con ConA conjugado HRP. Cantidades iguales de proteina se cargaron en cada linea y se verificaron por ß-actina. Las glicoproteinas (desmarcadas por flechas) , muestran que 8 mM de 2-DG y 2-FDM pero sin 2-FDG, reducen su enlace ConA y que esta reducción puede ser invertida por mañosa. La Figura 4B representa los resultados de células de la Figura 4A, los cuales se mancharon para erB2, una glicoproteina altamente expresada. Un cambio en el peso molecular de esta proteina es causado por las dosis similares de 2-DG y 2-FDM. La Figura 5A muestra los resultados de células SKBR3 tratadas con 8 mM de ya sea 2-DG, 2-FDG o 2-FDM por 24 horas y lisados de células completas se mancharon para dos chaperonas moleculares, Grp78 y Grp94. 1 micro g/ml de tunicamicina (TUN) , se usó como un control positivo. La proteina cargada se verificó por ß-actina. La Figura 5B muestra manchados western de las proteínas ensayadas cuando las células en modelos de "hipoxia" A, B y C, se trataron con dosis similares de análogos de azúcar. La Figura 6 representa los resultados de células SKBR3 tratadas con 8 mM de ya sea 2-DG, 2-FDG o 2-FDM por 24 horas y los lisados celulares completos se sometieron a sondas por CHOP/GADD154. La inducción de CHOP/GADD154 inducida por tanto 2-DG como 2-FM, fue invertida por la adición de mañosa exógena, mientras la glucosa no mostró efecto en la cantidad de esta proteina. Se usó tunicamicina como un control positivo. La carga de proteina se verificó por ß-actina. La Figura 7 muestra las trayectorias de glicosilación N-ligadas y glicolisis, que ilustran que 2-DG, 2-FDM y 3-FDG, pueden inhibir la fosfoglucoisomerasa que resulta en un bloqueo de glicolisis y asegura la muerte celular en células tumorales hipóxicas. Sin embargo, en ciertos tipos de células tumorales bajo condiciones aeróbicas, 2-DG y 2FDM pueden interferir con el ensamble ligado al lipido de oligosacáridos que conducen a la inducción de respuesta de proteina no plegada y toxicidad, debido a sus estructuras semejantes a mañosa asi como también a glucosa, (triángulo = glucosa, hexágono = mañosa y cuadrado = N-acetil-glucosamina ) . La Figura 8A muestra los ensayos MTT que demuestran las sensibilidades de lineas de células de glioma seleccionadas y ciertos compuestos de hexosa de la invención sujeto. La Figura 8B muestra los ensayos MTT que demuestran las sensibilidades de lineas de células de glioma seleccionadas y ciertos compuestos de hexosa de la invención sujeto. La Figura 8C muestra ensayos MTT que demuestran las sensibilidades de lineas de células de glioma seleccionadas y ciertos compuestos de hexosa de la invención sujeto. La Figura 9A representa el crecimiento de células de glioma después del tratamiento con varios compuestos de hexosa . La Figura 9B representa la supresión del crecimiento de células D54 después del tratamiento con 2-DG. La Figura 9C representa la supresión del crecimiento de células D54 después del tratamiento con 2-FG. La Figura 10 demuestra la diferencia en el efecto de hipoxia en células tratadas con 2-DG. La Figura 11 muestra la producción de lactato de una linea de células de glioblastoma humano bajo condiciones hipóxicas y normoxicas. La Figura 12 muestra los resultados de linea de células de glioma que crecen bajo condiciones hipóxicas y normoxicas . La Figura 13 demuestra la absorción de 2-FG en células de glioma. La Figura 14 muestra los resultados de tratamiento de gliomas en ratones con 2-DG. La Figura 15 muestra la actividad 2-FM contra células ce cáncer pancreático Colo357-FG.

La Figura 16 muestra la actividad 2-halo-D-manosa contra células de glioma U251. La Figura 17 muestra la supresión de células U87 que crecen por 2-FM. La Figura 18 proporciona un diagrama que representa el porcentaje de inducción de autofagia en células de glioma U87 después del tratamiento con 2-fluoro-manosa .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las opciones terapéuticas para gliomas malignos permanecen casi limitadas. Esto es debido en parte, a la resistencia intrínseca de las células a muchas opciones de quimioterapia que están disponibles. También puede ser debido en parte, a los patrones de crecimiento diferencial los cuales exhiben gliomas malignos. Es decir, gliomas pueden crecer en predominantemente una forma infiltrativa con poco o ningún mejoramiento de contraste visto en exploraciones de MRI contra lesiones de masa que mejoran el contraste que crecen más rápidamente. Muchos estudios han indicado que estos tipos diferentes de patrones de crecimiento también representan varios grados de regiones hipóxicas dentro de tumores individuales. Las áreas hipóxicas relativas pueden ser vistas ambas en el centro de la masa de tumor que crece rápidamente, la cual a menudo, tiene regiones de necrosis asociadas con estas, asi como también algunas regiones relativamente hipóxicas dentro del componente infiltrativo del tumor también. Por consiguiente, algunas de estas regiones relativamente hipóxicas pueden tener células, las cuales están repetidas a una relación más lenta y pueden por lo tanto, ser más resistentes a muchos agentes de quimioterapia. Adicionalmente , las observaciones por Warburg quien describe una preferencia de muchos tumores para someterlos a glicólisis aún en la presencia de cantidades adecuadas de oxigeno (llamada glicólisis oxidativa, o el "efecto Warburg"), parecen mantenerse ciertas para gliomas malignos también. Se postula que debido a estas características, los gliomas y otros tumores altamente glicolíticamente sostenidos, tales como cáncer pancreático, pueden ser sensibles a inhibidores de glicólisis y pueden tener un impacto significante en el crecimiento de tumores. Por lo tanto, características adicionales únicas al cerebro en general, y gliomas específicamente, son la expresión incrementada de transportadores de glucosa, los cuales producen absorción ávida de azúcar en el SNC. Se postula que debido a estas características, los gliomas representan un estado de enfermedad único que debe ser particularmente sensible a inhibidores de glicólisis. Para probar esta hipótesis, se usan inhibidores conocidos de glicólisis contra un número de paneles de línea de células glioma in vitro, bajo tanto condiciones hipóxicas como normóxicas. El efecto de los agentes también se examinó en animales que portan xenoinjertos de glioma ortotópicos usando un número de diferentes esquemas de dosificación. Un cambio en metabolismo por gliomas de alto grado para utilizar preferencialmente glicólisis como la fuente primaria para producción de energía aún en la presencia de oxígeno. El "Efecto Wargurg", el cual está en parte, accionado por HIF-la y activación de la trayectoria de cinasa PI-3. Un inhibidor efectivo de glicólisis, 2-desoxiglucosa, bloquea la conversión de 2-desoxiglucosa-6-fosfato por reacción de enolasa y produce una acumulación de estas especies en la célula debido al grupo fosfato cargado. Cambios metabólicos conocidos ocurren en neoplasmas de alto grado que incluyen, gliomas que preferencialmente usan glicólisis para los requerimientos de energía de la célula. Estos cambios son accionados por trayectorias de supervivencia que incluyen, activación de cinasa HIF-la y PI-3 que induce producción de enzimas críticas requeridas para glicólisis, así como también transportadores de glucosa regulados ascendentemente. El fenotipo glicolítico es una característica dominante, la cual prevalece aún bajo condiciones normóxicas. Este fenotipo ha sido reconocido y previamente descrito como el "Efecto Warburg". Debido a este cambio fenotipico, estos tumores deben ser más sensibles a inhibidores de glicólisis que células normales. Un grupo de inhibidores glicoliticos a base de azúcar y otros compuestos de mañosa, pueden servir como agentes terapéuticos Una 2-desoxiglucosa inhibidora a base de azúcar prototipica, ha sido mostrada por tener efectos anti-glioma potentes y tolerables en este estudio. Los compuestos de hexosa ya sea solos o en combinación con quimioterapia citotóxica, son efectivos en el tratamiento de cáncer, particularmente, gliomas y cáncer pancreático. Adicionalmente , puesto que este fenotipo glicólico es inicialmente accionado por condiciones hipóxicas dentro del ambiente tumoral, este tipo de terapia debe ser considerada con terapia anti-angiogénica . En efecto, tumores que son capaces de "escapar" de terapia anti-angiogénica , pueden ser preferencialmente más sensibles a inhibidores de glicólisis y/o compuestos de hexosa en general. Se ha mostrado que compuestos de hexosa a base de azúcar, son eficaces en el tratamiento de tumores de glioma de alto grado y cáncer pancreático. Adicionalmente, otros tipos de inhibidores de compuestos, están siendo diseñados por tener absorción favorable en el SNC y mantener la biodisponibilidad oral favorable que el 2-DG actualmente disfruta. Estudios en curso con compuestos de hexosa tanto en combinación con agentes citotóxicos como agentes anti-angiogénicos , de manera óptima proporcionarán conductores inteligentes para ensayos combinatoriales clínicos futuros. Un compuesto de hexosa significa e incluye cualquier monosacárido que contiene seis átomos de carbono. Una clase de hexosas es la familia aldohexosa, la cual incluye glucosa, galactosa y mañosa, por ejemplo. Las aldohexosas pueden también comprender varios desoxiazúcares tales como 2-desoxiglucosa, fucosa, cimarosa y ramnosa. Otra clase de hexosas es la familia cetohexosa ejemplificada por fructuosa y sorbosa. Aunque las hexosas de la presente invención son normalmente de la configuración D que se origina naturalmente, las hexosas pueden también ser enantiómeros L. Las hexosas de la presente invención pueden incluir anómeros alfa, anómeros beta y mezclas de los mismos. Cualquiera de las hexosas de la presente invención puede ser opcionalmente sustituida. Tales sustituciones involucran reemplazo de un grupo hidroxilo con un halógeno tal como flúor, cloro o bromo. En la presente invención, la sustitución es típicamente en el carbono C-2 de la hexosa y puede ocupar ya sea la posición ecuatorial o axial de una hexosa en su conformación de cadena de anillo de 6 miembros. La sustitución en C-2 que es axial, designa el azúcar como un derivado de mañosa o un azúcar de configuración mano. La sustitución en C-2 que es ecuatorial, designa el azúcar como un derivado de glucosa o un azúcar de configuración gluco. Los compuestos de hexosa empleados en la práctica de la invención sujeto, incluyen compuestos descritos en la Patente Estadounidense No. 6,670,330 y Solicitudes de Patentes Estadounidenses 20030181393, 20050043250 y 20060025351, aquí incorporada por referencia. En ciertas modalidades de la presente invención, los compuestos preferidos son inhibidores a base de azúcar de proliferación tumoral tales como, 2-desoxi-glucosa (2-DG) , 2-desoxi-manosa (2-DM), 2-fluoro-glucosa (2-FG), y 2-fluoro-manosa (2-FM) y similares. "Tumor del sistema nervioso central", significa cualquier crecimiento anormal de tejido dentro del cerebro, médula espinal u otro tejido del sistema nervioso central, ya sea benigno o maligno. Particularmente incluye gliomas tales como astrocitoma pilocitico, astrocitoma de bajo grado, astrocitoma anaplástico y glioblastoma multiforma (GBM o glioblastoma) . "Tumor del sistema nervioso central", también incluye otros tipos de gliomas benignos o malignos, tales como glioma troncal cerebral, ependimoma, ganglioneuroma , glioma policitico juvenil, glioma mezclado, oligodendroglioma y glioma del nervio óptico. "Tumor del sistema nervioso central", también incluye no gliomas tales como cordoma, craniofaringioma, meduloblastoma , meningioma, tumores pineales, adenoma de pituitaria, tumores neuroectodérmicos primitivos, schwannoma, tumores vasculares y neurofibromas . Finalmente, el tumor del sistema nervioso central también incluye tumores metastásicos en donde las células malignas se han esparcido al sistema nervioso central de otras partes del cuerpo. De conformidad con la presente invención "tratar", "tratamiento" o "alivio", se refiere a tanto tratamiento terapéutico como mediciones profilácticas o preventivas, en donde el objeto es prevenir o reducir el crecimiento de un tumor del sistema nervioso central, reducir el tamaño del tumor o eliminarlo completamente. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen, sujetos que tienen un tumor identificado del sistema nervioso central, sujetos sospechosos de tener un tumor del sistema nervioso central y sujetos identificados por estar en riesgo de desarrollar un tumor del sistema nervioso central. Un sujeto es exitosamente "tratado" por un tumor del sistema nervioso central, si después de recibir una cantidad terapéutica de un compuesto de hexosa de conformidad con los métodos de la presente invención, se observan una o más de las siguientes condiciones: reducción en el tamaño del tumor o ausencia del tumor; inhibición o cesación de crecimiento del tumor; inhibición o cesación de metástasis de tumor; y/o alivio de alguna extensión de uno o más de los síntomas asociados con el tumor, tales como morbidez reducida y mortalidad o calidad de vida mejorada. En la magnitud que el compuesto de hexosa previene el crecimiento y/o eliminación de células de tumor cerebral existentes, este puede ser considerado citostático y/o citotóxico. Los términos "coadministrar" o "coadministración", están propuestos para abarcar administración simultánea o secuencial de terapias. Por ejemplo, co-administración puede incluir administrar tanto un inhibidor glicolítico como un agente quimioterapéutico en una composición única. También puede incluir administración simultánea de una pluralidad de tales composiciones. Alternativamente, la coadministración puede incluir administración de una pluralidad de tales composiciones a tiempos diferentes durante el mismo periodo . Un compuesto de hexosa de conformidad con la presente invención incluye, pero no se limita a, un inhibidor glicolítico el cual es un compuesto capaz de inhibir la glicólisis oxidativa en un glioma u otro tumor cerebral y puede incluir compuestos de hexosa tales como 2-desoxiglucosa, 2-fluoro-glucosa, 2-fluoro-manosa y similares.

El tratamiento anti-proliferativo definido en la presente anteriormente, puede ser aplicado como una terapia única o puede involucrar, además de al menos un compuesto de la invención, una o más de otras sustancias y/o tratamientos. Tal tratamiento puede lograrse por medio de la administración simultánea, secuencial o separada, de componentes individuales del tratamiento. Los compuestos de esta invención pueden también ser empleados en combinación con agentes citotóxicos y anti-cancerigenos conocidos y tratamientos tales como terapia de radiación. Si se formula como una dosis fija, tales productos de combinación emplean los compuestos de esta invención con el rango de dosificación descrito aquí y el otro agente farmacéuticamente activo dentro de su intervalo de dosificación aprobado. Los inhibidores glicólicos pueden ser usados secuencialmente como parte de un régimen quimioterapéutico también involucrando otros agentes citotóxicos o anticancerigenos y/o en conjunto con tratamientos no quimioterapéuticos tales como cirugía o terapia por radiación. Los agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a, tres categorías principales de agentes terapéutico: (i) agentes antiangiogénicos tales como, linomido, inhibidores de la función integrina -alfa-beta 3, angiostatina, razocano) ; (ii) agentes citostáticos tales como antiestrógenos (por ejemplo, tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno, yodoxifeno) , progestógenos (por ejemplo, acetato de megestrol), inhibidores de aromatasa (por ejemplo, anastrozol, letrozol, borazol, exemestano) , antihormonas, antiprogestógenos , antiandrógenos (por ejemplo, flutamida, nilutamida, bicalutamida , acetato de citoperona) , agonistas de LHRH y antagonistas (por ejemplo, acetato de goserelina, leuprólido) , inhibidores de 5-alfa-dihidroreductasa de testosterona (por ejemplo, finasterido) , inhibidores de farnesiltransferasa, agentes anti-invasión (por ejemplo, inhibidores de metaloproteinasa como marimastat e inhibidores de la función del receptor activador del plasminógeno urocinasa) e inhibidores de la función del factor de crecimiento, (tales factores de crecimiento incluyen por ejemplo, EGF, FGE, factor de crecimiento derivado de plaquetas y factor de crecimiento de hepatocito, tales inhibidores incluyen anticuerpos del factor de crecimiento, anticuerpos del receptor del factor de crecimiento tales como Avastina (bevacizumab) y Erbitux (cetuximab) ; inhibidores de tirosina cinasa e inhibidores de serina/treonina cinasa); y (iii) fármacos antiproliferativos/antineoplásicos y combinaciones de los mismos, como se usa en oncología médica, tales como antimetabolitos (por ejemplo, antifolatos como metotrexato, fluoropirimidinas como 4-fluorouracilo, purina y análogos de adenosina, citocina arabinósido) ; antibióticos antitumorales interalantes (por ejemplo, antraciclinas como doxorubicina , daunomicina, epirubicina e idarubicina, mitomicina-C, dactinomicina, mitramicina) ; derivados de platino (por ejemplo, cisplatino, carboplatino ) ; agentes alquilantes (por ejemplo, mostaza de nitrógeno, melfalano, clorambucilo, busulfan, ciclofosfamida , nitrosoureas de ifosfamida, tiotepa; agentes antimicóticos (por ejemplo, vinca alcaloides como vincristina y taxoides como Taxol (paclitaxel ) , Taxótero (docetaxel) y agentes de microtúbulo más recientes tales como, análogos de epotilona, análogos de discodermólido , y análogos de eleuterobina ) ; inhibidores de topoisomerasa (por ejemplo, epidofilotoxinas como etopósido y tenipósido, amsacarina, topotecano) ; inhibidores del ciclo celular; modificadores de la respuesta biológica e inhibidores de proteasoma tales como Velcade (bortezomib) . Uno de habilidad ordinaria en la técnica, reconocerá que los métodos de tratamiento descritos en la presente invención, pueden ser realizados a través de rutas múltiples de administración y con varias cantidades /concentraciones de compuestos hexosa . La ruta preferida de administración puede variar, dependiendo de los compuestos de hexosa siendo usados y tales rutas incluyen, pero no se limitan a, oral, bucal, intramuscular (i.m), intravenosa (i.v.), intraparental (i.p.), tópica o cualquier otra ruta de administración reconocida por la FDA. Las concentraciones terapéuticas o administradas variarán, dependiendo del sujeto a ser tratado y los compuestos de hexosa a ser administrados. En ciertas modalidades, la concentración de compuestos de hexosa varia desde 1 mg hasta 50 mg por kilogramo de peso corporal. Inicialmente, una serie de análogos de glucosa 2-fluoro, 2-bromo y 2-cloro sustituidos, se preparó y analizó como sustratos competitivos posibles a glucosa en la trayectoria de glicólisis, y que tales análogos podrían operar como inhibidores glicolíticos en una manera similar a 2-desoxi-glucos (2-DG) . Se ha descubierto que 2-fluoro-D-manosa es un agente antitumoral efectivo debido a que sus propiedades podrían ser derivadas del hecho que 2-fluoro-D-manosa (aquí también referido como "2-FM"), es ya sea, similar a 2-desoxi-D-glucos (mismo como 2-desoxi-D-manosa) , considerando la similitud en el tamaño del átomo de flúor e hidrógeno, o podría ser similar a D-manosa, asemejándose al grupo hidroxilo de mañosa mejor que el hidrógeno en términos de efectos inductivos y la posibilidad de formación de enlace de hidrógeno. En una última situación, 2-fluoro-D-manosa podría afectar las funciones biológicas, metabolismo y procesos biológicos relacionados con D-mañosa. También, la combinación de efectos que podrían efectuar tanto los procesos celulares relacionados con D-glucosa como D-manosa. En efecto, los datos proporcionados en las Figuras 15 hasta 18, muestran que 2-fluoro-D-manosa es más potente que 2-DG y también tiene mejor o similar actividad que aquella de 2-fluoro-D-glucosa en células pancreáticas Colo357-FG. Además, 2-fluoro-D-manosa (2-FM) , se comparó con otros análogos de 2-desoxi-D-manosa es decir, con 2-cloro-D-manosa (2-CM) y 2-bromo-D-manosa (2-BM) . De manera sorprendente y sin predecir, 2-fluoro-manosa es más potente que los otros en esta serie. Específicamente, los datos muestran que 2-fluoro-D-manosa (2-FM) , es claramente superior a tanto análogos de bromo (2-BM) como cloro (2-CM) en la inhibición de crecimiento de células tumorales de cerebro de glioblastoma U251. El 2-FM también exhibe actividad sorprendentemente mejor bajo normoxia que bajo hipoxia contra células de glioblastoma U87 (Figura 17). Adicionalmente , al menos un modo de acción de 2-FM que fue imposible predecir que es 2-FM exhibe capacidad para inducir potencialmente autofagia en células de cerebro tumorales y por lo tanto, proporcionan al menos, una explicación del mecanismo de acción contra las líneas de células de tumor. Como se muestra inmediatamente abajo, 2-desoxi glucosa (2-DG) , tiene dos hidrogenasas en la posición C-2 del azúcar. En la conformación de cadena de anillo de 6 miembros del azúcar, estos dos hidrógenos ocupan posiciones axiales y equitoriales . 2-DG 2-FM mañosa En esencia, 2-fluoromanosa (2-FM), reemplaza el hidrógeno axial en 2-desoxiglucosa (lo cual es la misma cosa como 2-desoximanosa ) con flúor. El flúor es generalmente considerado isostérico con hidrógeno. De este modo, en algunos aspectos, la química de 2-FM podría ser similar a 2-DG. Sin embargo, 2-FM podría exhibir actividad inhibidora glicolítica basada en este argumento isostérico. Sin embargo, el flúor es sustancialmente más electronegativo que el hidrógeno y es capaz de acoplarse en porciones que se enlazan a hidrógeno como un resultado. En este aspecto, 2-FM podría comportarse más cercanamente a mañosa, y de este modo, el 2-FM podría romper las trayectorias de proteina/glicolipido ligado en la síntesis de oligosacáridos de alta mañosa. En breve, 2-FM exhibe sorprendentemente, buenos efectos de proliferación contra células tumorales y parece más potente que 2-desoxi-D-glucosa (también referida aquí como "2-DG") y 2-desoxi-2-fluoro-D-glucosa (también referida aquí como "2-FG"). Como se discute anteriormente, el compuesto 2-FM fue específicamente probado en cáncer de mama 231-GFP, tumor cerebral multiforme de glioblastoma U251 (figura 16) y líneas de cáncer humano pancreático Colo357-FG (figura 15) . En células U251 y Colo357-FG, 2-FM fue directamente comparado con 2-DG, 2-FG, 2-desoxi-2-cloro-D-manosa (aquí referido algunas veces como "2-CM") , 2-desoxi-2-bromo-manosa (también referido aquí como "2-BM") , 2-desoxi-cloro-D-glucosa (también referido aquí como "2-CG") y 2-desoxi-2-bromo-D-glucos (también referido aquí como "2-BG") . En tanto glioblastoma (Figuras 16, 17 y 18) como cáncer pancreático (figura 15), 2-FM fue el agente más potente de aquellos comparados y las diferencias observadas fueron específicamente grandes entre 2-FM y sus derivados cloro y bromo. Las diferencias también fueron significantes cuando se comparan con 2-DG. Los datos por lo tanto, indican que el 2-FM puede ser un tratamiento terapéutico antitumoral muy efectivo para cáncer, particularmente tumores pancreáticos y cerebrales. Más particularmente, la Figura 5 demuestra las curvas de respuesta de dosis de viabilidad celular a través de ensayos MTT de líneas de células Colo357 en respuesta a cualquier tratamiento con 2-desoxi-glucosa (2-DG) , 2-fluoro-glucosa (2-FG) o 2-fluoro-manosa (2-FM) . Como se puede ver, el cambio de las curvas de respuesta de dosis a la izquierda, indica que el 2-FM es más potente que ya sea 2-DG o 2-FG. La Figura 16 demuestra que la naturaleza de halógeno en la posición 2 de mañosa es un factor importante que afecta la actividad. La linea de células de glioma U251 MG, se trató con ya sea 2-cloro-manosa (2-CM) , 2-bromo-manosa (2-BM) , o 2-fluoro-manosa (2-FM). Nuevamente, la viabilidad celular se midió por ensayos MTT y el resultado muestra claramente actividad superior de 2-FM cuando se compara con otros análogos a base de halógeno. La Figura 17 demuestra ensayos de MTT de linea de células U87 que son tratados con 2-fluoro-manosa (2-FM) en la presencia de hipoxia (<1% de oxigeno) o normoxia (20% de oxigeno) . Como se puede ver, los datos representan una situación inusual con este agente en la linea de células U87, que no es más sensible en la presencia de hipoxia. Esto indica potencialmente, que un mecanismo alterno de acción para 2-FM, puede ser responsable del efecto de eliminación celular . La Figura 18 demuestra mecanismos previamente identificados y únicos de 2-fluoro-manosa (2-FM) . En lineas de células de glioma U87 MG, 2-FM induce la muerte celular a través de autofagia. Gráficamente representados, están los resultados de análisis citométrico de flujo de Organelos Vesiculares Acidicos (AVO) por teñido con anaranjado acridina (véase procedimientos), el cual es específico y característica del proceso autofágico. Los resultados indican un incremento del porcentaje de células que se someten a autofagia con incremento de exposición de dosis de 2-FM. Este grado de inducción de autofagia es impresionante, puesto que el tiempo de exposición de solamente 40 horas es completamente corto para ver este efecto . El 2-DG está actualmente siendo administrado en un ensayo clínico para evaluar la magnitud a la cual la adición de un inhibidor glicolítico, el cual elimina las células tumorales hipóxicas de lento crecimiento, a más población celular resistente encontrada en tumores sólidos, puede incrementarse la eficacia de tratamiento de células normóxicas de rápida división objetivo de quimioterapia estándar. La presente invención se origina en parte, a partir del descubrimiento que, aún en la presencia de oxígeno, ciertas líneas de células tumorales son eliminadas con 2-DG o 2-FM pero no cuando se administra 2-desoxi-2-fluoro-D-glucosa (2-FG) . Debido a que 2-FG y 2-DG ambos inhiben la glicólisis, un mecanismo distinto del bloqueo de glicólisis se presume, es responsable de este efecto. Estudios conducidos en 1970, conduce a reportes que 2-DG y 2-FM interfieren con la glicosilación N-ligada de glicoproteínas de recubrimiento viral, en las cuales, la interferencia puede ser invertida por la adición de mañosa. Debido a la diferencia que cae entre mañosa y glucosa en la orientación del hidrógeno en la posición del carbono 2, y debido a que el 2-DG tiene dos hidrógenos en la posición 2 (en lugar de un hidrógeno y un grupo hidroxi, como es el caso para tanto mañosa como glucosa, 2-DG puede ser revisado ya sea como una mañosa o un análogo de glucosa. Por consiguiente, 2-DG puede actuar en tanto glicólisis como glicosilación . La presente invención proporciona métodos para inhibir la proliferación de células tumorales con respecto de si las células están en un ambiente hipóxico o normóxico, usando derivados de hexosa solos, o en combinación con otros tratamientos anti-tumorales , que incluyen pero no se limitan a, agentes citotóxicos que dirigen las células normóxicas, agentes anti-angiogénicos , terapia de radiación y cirugía. La presente invención también proporciona una base para el uso clínico de análogos tales como 2-DG, '2-CM y 2-FM, como agentes citotóxicos que pueden dirigir poblaciones de células de cáncer tanto normóxicas (vía interferencia con glicosilación) como todas las hipóxicas (vía bloqueo de glicólisis), en ciertos tipos de tumores. Los ejemplos abajo, proporcionan datos que verifican la efectividad de la invención, y confirman que 2-DG, 2-CM y 2-FM, pero no 2-FG, son tóxicos a tipos de células tumorales seleccionadas que crecen bajo normoxia. Algunos de los experimentos descritos en los ejemplos se diseñaron para determinar si la interferencia con glicosilación contraria a la inhibición de glicólisis, es el mecanismo responsable del efecto normóxico. Mientras no se desee ligar por teoría, los resultados obtenidos soportan que estos compuestos pueden inhibir la glicosilación y con ello, eliminar ciertos tipos de células de cáncer independientemente de si estas células están en un ambiente hipóxico. Los resultados también son alentadores de la conclusión que 2-FM, 2-DG y 2-CM, pero no 2-FG, rompen el ensamble de cadenas de oligosacáridos ligados al lípido e inducen una respuesta de proteína no plegada (UPR) , la cual puede ser un indicador de interferencia con la síntesis de glicoproteína . A su vez, la UPR conduce a activación de señales apoptóticas específicas de UPR en células sensibles pero no resistentes. Los tipos de células tumorales que son sensibles a 2-DG, 2-FM y 2-CM bajo condiciones normóxicas, han sido identificados. Las células se aislaron de un tumor y se probaron ex vivo, para determinar si las células son sensibles a 2-DG, 2-CM o 2-FM bajo condiciones normóxicas. Los ejemplos abajo, ilustran métodos para determinar si una célula es sensible. En otras modalidades, las firmas moleculares de 2-DG sensible y pares de células resistentes estrechamente relacionadas, son comparadas a una linea de células de prueba. Las diferencias en el nivel y/o actividad de fosfomanosa isomerasa y otras enzimas involucradas en glicosilación y enzimas involucradas en acumulación de 2-DG, se describen. En la presencia de oxigeno (condiciones normóxicas), 2-DG es tóxico a una subserie de lineas de células tumorales. Este resultado es sorprendente, debido a que previa investigación demuestra que células tumorales y normales se hacen crecer inhibidas, pero no eliminadas cuando se tratan con 2-DG bajo normoxia. Esta observación previa de inhibición de crecimiento se cree, es debida a la acumulación de 2-DG a niveles suficientemente altos para bloquear la glicólisis en células bajo normoxia, de manera que el crecimiento se reduce debido a la reducción en los niveles de intermediarios de la trayectoria glicolitica, los cuales son usados para varios procesos anabólicos involucrados con la proliferación celular. Las células no mueren, sin embargo, debido a que su función mitocondrial es normal, entonces las células aeróbicamente tratadas, pueden sobrevivir el bloqueo de glicólisis por 2-DG. Una explicación posible para cuanto una célula podría ser sensible a 2-DG bajo condiciones normóxicas es, por lo tanto, que la célula tiene mitocondrias defectivas. En este sentido, se sabe que células tumorales utilizan glucosa a través de la glicólisis anaeróbica para la producción de energía (ATP) en lugar de fosforilación oxidativa debido a la respiración mitocondrial defectiva. Sin embargo, experimentos adicionales han demostrado que otros inhibidores de glicólisis, tales como oxamato y 2-FG, no son tóxicos a estas células, ya que un defecto en la respiración mitocondrial es indistintamente considerado por su sensibilidad a 2-DG. Es hipotético por lo tanto, que un mecanismo distinto que el bloqueo de glicólisis, es responsable de la toxicidad de 2-DG en estas líneas de células seleccionadas bajo condiciones normóxicas. Por consiguiente, otras hipótesis pueden explicar el mecanismo de esta citotoxicidad normóxica. Un mecanismo potencial es interferencia con glicosilación . El soporte para este mecanismo potencial podría ser identificado en una serie de documentos desde finales de 1790 en los cuales se reportó que, en ciertos virus, la síntesis de glicoproteína N-ligada se inhibe por un número de análogos de azúcar, que incluyen 2-DG. La glucosa es metabolizada a través de tres trayectorias principales: glicólisis, derivación de pentosa fosfato y glicosilación. La Figura 7 es un diagrama esquemático de las trayectorias metabólicas de glicosilación y glicólisis. Después que la glucosa entra al citoplasma, la hexocinasa fosforila el carbono 6 de glucosa, resultando en la síntesis de glucosa- 6-fosfato (G6P) . Si G6P es convertido a fructosa-6-fosfato por fosfoglucosa isomerasa (PGI), puede continuar en la trayectoria de glicólisis y producir ATP y piruvato. Alternativamente, el G6P puede ser usado para la síntesis de varias porciones de azúcar, que incluyen mañosa, la cual se requiere para ensamble de oligosacáridos ligados al lípido, la síntesis la cual se realiza en el ER. El 2DG ha sido mostrado por interferir con dos de las tres trayectorias metabólicas: puede bloquear la glicólisis inhibiendo PGI o puede romper el ensamble del precursor oligosacárido N-ligado interfiriendo con la transferencia de mañosas ligadas a fosfato dolicol de guanosina difosfato (GDP) , sobre los residuos de N-acetilglucosamina y pueden agotar el dolicol-P, el cual se requiere para transferir la mañosa del citoplasma al lúmen del ER. Como se notó anteriormente, debido a que el 2-DG tiene hidrógenos en ambas posiciones del carbono 2 y es similar a un análogo de mañosa. Por el contrario, la presencia de un fluoruro en esta posición en análogos de fluoro, crea un nuevo centro enantiomérico , y así el derivado fluoro puede solamente ser considerado análogos de ya sea glucosa o mañosa; en la representación de estos análogos, la porción de fluoruro es extraída "ascendentemente" o arriba del plano del anillo carbohidrato por análogos de mañosa, y hacia abajo para los análogos de glucosa. Para la mañosa a ser agregada a una cadena de oligosacárido ligado al lípido, debe primero ser activada siendo transferida a difosfato guanosina (GDP) o dolicol fosfato. 2-DG se somete a conversión a 2-DG-GPD, el cual compite con manosa-GPD por la adición de mañosa sobre residuos de N-acetilglucosamina durante el ensamble de oligosacáridos ligados al lípido. De este modo, los oligo-sacáridos aberrantes producidos como un resultado de tratamiento de 2-DG, resultan en síntesis reducida de las glicoproteínas virales en los experimentos reportados en la literatura científica. En estos experimentos, el efecto inhibidor de 2-DG fue invertido con la adición de mañosa exógena, pero no cuando se agregó glucosa, además, confirmando que 2-DG actúa algo similar a análogo de mañosa. Estos investigadores también mostraron que otro análogo de mañosa, 2-fluoro-manosa (2-FM) , tiene efectos similares como 2-DG, que fueron también invertidos por mañosa, indicando que la configuración de mañosa de estos análogos puede ser importante para su interferencia con glicosilación . Además, los estudios genéticos han mostrado que el rompimiento de glicosilación puede tener efectos biológicos profundos. La enzima fosfomanosa isomerasa (PMI) está ausente en pacientes que sufren de Síndrome de Glicoproteína Deficiente de Carbohidrato Tipo Ib. La ausencia de esta enzima resulta en hipoglicosilación de glicoproteínas del suero, que conducen a trombosis y trastornos gastrointestinales caracterizados por la enteropatía de pérdida de proteína. Cuando la mañosa exógena se agrega a las dietas de estos pacientes, sus síntomas desaparecen, sus glicoproteínas de suero regresan a lo normal, y con ello, se recuperan de la enfermedad. Esta observación es consistente con un mecanismo de acción para los compuestos empleados en la presente invención, ya que datos experimentales muestran que la mañosa exógena puede rescatar las células tumorales seleccionadas que son eliminadas cuando se tratan con 2-DG en la presencia de niveles de oxígeno normales. Es posible que estas células tumorales particulares sean ya sea PMI reguladas descendentemente o tengan un defecto en esta enzima. Por otro lado, las enzimas que producen intermediarios de mañosa necesarios para glicosilación N-ligada, pueden ser reguladas ascendentemente en estas células, resultando en una relación de 2-DG-GDP a GPD-manosa superior y con ello, causando esta sensibilidad inusual a 2-DG bajo condiciones de oxígeno normales.

Con respecto a los mecanismos, la presente invención proporciona métodos para tratar cáncer administrando 2-DG y otros análogos de glucosa y mañosa como agentes únicos para tratar tumores aún bajo condiciones normóxicas. Los compuestos han sido demostrados por ser efectivos contra un número de lineas de células tumorales, que incluyen lineas de células de cáncer de mama humano (SKBR2), de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) , gliomas, pancreático y osteosarcoma, todas las cuales se someten a muerte celular cuando se tratan con dosis relativamente bajas de 2-DG. La Figura 3B es un diagrama que muestra la respuesta de células SKBR3 tratadas por 72 horas con 2-DG, 2-FM y otros agentes bajo condiciones de oxigeno normal a las dosis indicadas. La citotoxicidad se mide por exclusión de azul tripano. Los resultados muestran que el 2-DG y el análogo de mañosa 2-FM son tóxicos, mientras 2-FG, un análogo de glucosa no lo es. Sin embargo, el oxamato, un análogo de piruvato que bloquea la glicólisis en el nivel de deshidrogenasa láctica, también no es tóxico a estas células que crecen bajo condiciones normóxicas. Por el contrario, el análogo de mañosa, 2-FM también probó ser tóxico en estas células, nuevamente indicando que una estructura de mañosa es importante para compuestos que tienen esta actividad.

El efecto inhibidor de 2-DG fue invertido con la adición de mañosa exógena pero no cuando se agregó glucosa, además confirmando que 2-DG está actuando como un análogo de mañosa. Otras pruebas mostraron que 2-DG es también tóxico a un NSCLC que crece bajo condiciones normóxicas y que la adición de 1 mM de mañosa invierte esta toxicidad. Estos datos además soportan que 2-DG y 2-FM son tóxicos a células de tumores seleccionadas que crecen bajo condiciones normóxicas debido a la interferencia con glicosilación . Evidencia adicional de que estos análogos de mañosa están trabajando a través de este mecanismo y no a través del bloqueo de glicólisis, es que las proteínas de respuesta de proteína no plegada, GRP 78 y 94, es indicativo de proteínas mal plegadas y/o mal glicosiladas , son reguladas ascendentemente por 2-DG y 2-FM en una manera dependiente de la dosis, pero no por 2-FG; este efecto es del mismo modo, invertido por la adición de mañosa. De este modo, los análogos de mañosa 2-DG y 2-FM, pero no el análogo de glucosa 2-FG, son tóxicos a tipos de células tumorales seleccionadas que crecen bajo normoxia, y la adición de mañosa invierte esta toxicidad. Debido a que 2-FG inhibe la glicosilación mejor que 2-DG, la interferencia con glicosilación y no inhibición de glicólisis es el mecanismo que se cree es responsable de este efecto. Como se mencionó anteriormente, se ha reportado que 2-DG interfiere con glicosilación N-ligada de proteínas revestidas virales y que la mañosa exógenamente agregada, invierte el efecto. Los efectos tóxicos de 2-DG en SKBR3, NSCLC y dos de otras líneas de células de tumor humano bajo normoxia son por lo tanto, probablemente por ser debido a la interferencia de glicosilación. Si esta teoría mecanística es correcta, entonces la adición de mañosa debe invertir la toxicidad de 2DG en estas líneas de células. Sin embargo, 1 m de mañosa invierte los efectos tóxicos de 6 mM de 2DG en una de las líneas de células probadas (NSCLC) . Debido a que los niveles de sangre de mañosa se conocen por variar entre 50 y 60 micro g/ml, experimentos de respuesta de dosis para determinar la dosis de mañosa mínima necesaria para invertir la toxicidad 2-DG, pueden ser realizados. Por ejemplo, esto se puede lograr por experimentos en los cuales el medio de crecimiento es suplementado con suero bovino fetal dializado (FBS), debido a que el FBS normalmente contiene cantidades residuales de mañosa. Sin embargo, para confirmar que la adición de mañosa y no otros azúcares es requerida para invertir la toxicidad de 2-DG, los azúcares conocidos por participar en la síntesis de glicoproteína , es decir, glucosa, fucosa, galactosa, y similares, pueden ser probados por la capacidad para invertir la toxicidad de 2-DG. Si cualquiera de estos azúcares es capaz de invertir la toxicidad similarmente , entonces su actividad puede ser comparada con aquella de mañosa en los experimentos descritos abajo para invertir los efectos de 2-DG en la inducción de UPR y sus consecuencias, interferencia con elongación de cadena de oligosacárido, y enlace de concavalina A. En total, estos experimentos permiten a uno valorar la dosis in vitro de 2-DG o 2-FM que puede ser usada in vivo para proporcionar la actividad anti-tumoral en la presencia de concentraciones fisiológicas de mañosa. La dosis terapéuticamente efectiva de 2-DG, 2-FM y 2-CM oralmente administrado para uso en los métodos de la invención, sin embargo, típicamente estará en el intervalo de 5-500 mg/kg de peso de paciente, tal como 50-250 mg/kg. En una modalidad, la dosis es aproximadamente 100 mg/kg de peso de paciente. La presente invención también proporciona un número de métodos de diagnóstico que un especialista puede usar para determinar si un tumor u otras células que contienen cáncer, son susceptibles al método actual de tratamiento. En una modalidad, células de un tumor son probadas bajo condiciones normóxicas para determinar si son eliminadas por 2-DG, 2-FM o 2-CM. En otra modalidad, esta prueba se conduce: entonces, la mañosa se agrega para determinar si invierte los efectos citotóxicos. En otra modalidad, la prueba para determinar susceptibilidad se realiza usando glicosilación N-ligada como un indicador. Como se mencionó anteriormente, 2-DG y2 -FM pero no 2-FG, rompen el ensamble de cadenas de oligosacárido ligadas al lipido, (2) induce una respuesta de proteina no plegada (UPR) , la cual es un indicador de interferencia con síntesis de glicoproteína normal, y (3) activa las señales apoptóticas específicas de UPR en células 2-DG sensibles pero no resistentes. Adicionalmente, la mañosa invierte estos efectos. Por consiguiente, estas mismas pruebas pueden ser realizadas en una célula de cáncer o tumor de interés, para determinar si tal célula es susceptible a tratamiento con el método presente. Como se notó anteriormente, la incorporación de mañosa en una cadena de oligosacárido ligado al lipido ocurre sobre la superficie citoplásmica del ER en las células infectadas con virus, y esta incorporación puede ser inhibida por derivados de GDP de 2-DG o 2-FM, es decir, GDP-2DG y GDP-2FM. Normalmente, después que la quinta mañosa ha sido agregada, la cadena de oligosacárido ligada al lipido se voltea para encarar el lúmen del ER. Para continuar agregando mañosa a la cadena en crecimiento, se usa dolicol-fosfato (Dol-P) como un portador para transportar mañosa del citoplasma a la matriz de ER. El 2-DG-GDP compite con manosa-GDP para enlace a dolicol y con ello, además interfiere con glicosilación N-ligada. Sin embargo, 2-DG ligado a dolicol también compite con la transferencia de mañosa sobre la cadena de oligosacárido en el ER. Por consiguiente, pueden ser realizados experimentos para demostrar los efectos de 2-DG y 2-FM en la formación de precursores oligosacáridos ligados al lipido y los derivados de mañosa, es decir, manosa-6-fosfato, manosa-1-fosfato, GDP-manosa y Dol-P-manosa , en ambas lineas de células 2DG sensibles y resistentes. Esto a su vez, demuestra la etapa o etapas en ensamble de oligosacárido que son inhibidas por 2-DG y 2-FM. Esto en cambio, permite a uno caracterizar otros tipos de células como sensibles o resistentes basadas en los oligosacáridos producidos (y no producidos), después de la exposición a 2-DG, 2-FM y/o 2-CM. Métodos cromatográficos previamente establecidos, pueden ser usados para colectar y medir la cantidad de derivados de mañosa y precursores de oligosacáridos ligados al lipido en células SKBR3 y NSCLC. Brevemente, las células pueden ser etiquetadas con mañosa [2-H3] y Usados celulares extraídos con cloroformo/metanol (3:2) y cloroformo/metanol/agua (10:10:3) para colectar Dol-P-Man y oligosacáridos ligados al lipido, respectivamente. Alícuotas que contienen Dol-P-Man, pueden ser sometidas a cromatografía de capa delgada mientras los oligosacáridos ligados al lipido, pueden ser separadas por CLAR. Las fracciones de eluado pueden ser analizadas por conteo de escint ilación liquida. Los fosfatos de mañosa y GDP-manosa, pueden ser separados por cromatografía de papel descendente y mañosa [2-H3] liberada de cada fracción por hidrólisis de ácido medio y medidas. Los valores derivados de células tratadas con 2-DG o 2-FM pueden ser comparados a controles no tratados para demostrar los efectos de estos fármacos en precursores de oligosacáridos N-ligados y derivados de mañosa. Debido a que la mañosa exógena invierte la toxicidad 2-DG, se puede probar también si la mañosa invierte también las perturbaciones de glicosilación 2-DG observadas. Además de 2-DG y 2-FM, dos de otros inhibidores de glicosilación tunicamicina y desoximanoj irinomicina (DMJ), los cuales pueden inhibir etapas específicas de glicosilación N-ligada, pueden ser usados como controles positivos. La tunicamicina interfiere con la adición del primer residuo de N-acetilglucosamina sobre pirofosfato de dolicol, y DMJ es un inhibidor específico de manosidasa I, la cual recorta 3 residuos de mañosa al final de la cadena de oligo-sacárido N-ligada. De este modo, la mañosa exógena debe no ser capaz de invertir ya sea la toxicidad o los efectos en la glicosilación de cualquiera de estos agentes. Sin embargo, debido a que el análogo de glucosa 2-FG no elimina las células SKBR3 y NSCLC bajo normoxia, sino es más potente que 2-DG en el bloqueo la glicólisis y eliminación de células hipóxicas, puede interferir con la glicólisis sin afectar la glicosilación y así, ser usada como una herramienta en tales pruebas también. La interferencia con el proceso de glicosilación N-ligado en el retículo endoplasmático (ER) , causa pliegue inapropiado de glicoproteínas , lo cual provoca una respuesta a estrés ER llamada la respuesta de proteína no plegada (UPR) . Reminiscente de la respuesta P53 a daño de ADN, el ER responde al estrés en mucho del mismo modo por (1) incrementando la capacidad de plegado a través de la inducción de chaperones residentes (GRP 78 y GRP 94), (2) reduciendo su propia carga biosintética por síntesis de proteína de lanzadera-descendente, y (3) incrementando la degradación de proteínas no plegadas. Si el estrés no puede ser aliviado, las trayectorias apoptóticas son iniciadas y la célula subsecuentemente muere. De este modo, una medida de interferencia con glicosilación es regulación ascendente de UPR. Cuando las células SKBR3 son tratadas con 2-DG, ambas de estas proteínas de respuesta al estrés ER, GRP 78 y 94, incrementan como una función del incremento de dosis; la mañosa invierte esta inducción. El 2-FG no induce estas proteínas. Por consiguiente, en otra modalidad de esta invención, esta respuesta es usada para determinar si un tumor o célula de cáncer es susceptible a tratamiento, de conformidad con el presente método. Las lineas celulares que no son sensibles a 2-DG bajo condiciones normóxicas, pueden ser similarmente usadas como controles negativos en los cuales la ausencia de regulación ascendente de estas proteínas se correlaciona con su resistencia a 2-DG. Cuando el estrés ER no puede ser superado, las señales apoptóticas son iniciadas. El estrés ER induce una trayectoria apoptótica dependiente mitocondrial vía CHOP/GADD153 , un factor de transcripción nuclear que regula descendentemente BLC-2, y una trayectoria independiente mitocondrial por caspasas 4 y 5 en humano y caspasa 12 en líneas de células de ratón. De este modo, pueden ser realizados experimentos para determinar si las señales apoptóticas particulares al estrés de ER son activadas en células 2-DG sensibles pero no resistentes. La regulación ascendente de CHOP/GADD153 y activación de caspasas 4 y 5, pueden ser ensayadas por manchado western. Como con las pruebas previas, si esta regulación ascendente es específica a líneas 2-DG-sensibles , entonces la regulación ascendente observada en una célula de cáncer de prueba sirve como un indicador que el cáncer a partir del cual la célula se deriva, es susceptible a tratamiento de conformidad con la presente invención. Debido a que el SKBR3 expresa abundantemente la glicoproteina Erb2, se espera que 2-DG pueda afectar la glicosilación N-ligada de esta proteína, conduciendo a mal plegado y degradación. Los manchados Western de ErB2 de células SKBR3 tratadas con 2-DG, pueden ser comparados con aquellos de células no tratadas para determinar el nivel total de esta proteína. Además, el contenido de mañosa de ErB2 después del tratamiento de 2-DG, puede ser analizado por inmuno-precipitación de esta proteína y manchado con Conconavalina A, una lectina que reconoce oligosacáridos N-ligados de tipo alta mañosa. Debido a que es probable que los análogos de mañosa puedan inhibir el contenido de mañosa de no solamente ErbB2, sino todas las glicoproteínas N-ligadas, lisados de célula completa obtenidos de estas células, pueden también ser probados con esta lectina. El teñido Ponceau, el cual se enlaza a todas las proteínas, puede ser usado como un control negativo para verificar que el 2DG y 2FM específicamente afecta las glicoproteínas, y nuevamente, esta o similar metodología, puede ser usada para determinar si una célula de tumor o cáncer es susceptible a tratamiento de conformidad con la presente invención . Aún si el estrés ER es indicativo de interferencia con glicosilación N-ligada es efectivamente confirmado por ocurrir por 2-DG y 2-FM, puede también ser evaluada la interferencia con O-glicosilación, la cual toma lugar en el citoplasma opuesto a ER. La literatura científica reporta que 2-DG puede inhibir el recorte de residuos de N-acetilglucosamina a partir de un factor de transcripción O-glicosilado, Spl, que resulta en la inhibición de enlace a sus respectivos promotores. Spl es un factor de transcripción importante para activación de numerosos oncógenos, los cuales si se afectan por 2-DG pueden, al menos en parte, explicar porqué las células SKBR3 crecen bajo normoxia son sensibles a 2-DG. De esta forma, el patrón de glicosilación de Spl después del tratamiento con 2-DG y 2-FM puede ser investigado por inmunoprecipitado y sondeo con WGA, una lectina que específicamente enlace las proteínas O-glicosiladas . Para la magnitud que 2-DG afecta Spl y glicosilación O-enlazado, esta alteración de glicosilación puede ser medida y usada como un indicador que el tumor u otra línea de célula cancerígena es susceptible a eliminación celular medida por 2-DG. La muerte celular provocada por la respuesta de proteína no plegada, la cual ocurre en retículo endoplásmico de cada célula en respuesta a proteínas mal plegadas, puede ser mejorada por la administración de un agente adicional, versipeloestatina . De esta forma, en una modalidad 2-DG, 2-FM y/o 2-CM se administran a un paciente en necesidad del tratamiento para cáncer, y la versipeloestatina es co-administrada al paciente. Similarmente, la muerte celular que ocurre en respuesta al mal plegamiento de proteínas puede ser mejorada bloqueando la proteólisis de las glicoproteínas mal plegadas con un inhibidor de proteosoma. De esta forma, en otra modalidad, la invención proporciona un método para tratar cáncer administrando un inhibidor de proteosoma en combinación con 2-DG, 2-FM y/o 2-CM. En una modalidad, el inhibidor de proteosoma es Velcade. Ciertos tipos de cáncer pueden ser más susceptibles para tratamiento con el presente método que otros. Para identificar tales tipos, se puede examinar una variedad de tipos celulares de conformidad con los métodos de la invención. Por ejemplo, se puede obtener una variedad de líneas de células cancerígenas a partir del ATCC y seleccionarlas como se describe anteriormente para identificar otros tipos de células exquisitamente sensibles a análogos de mañosa, tal como 2DG y 2FM, en la presencia de oxígeno. Las células que son eliminadas en concentraciones de 5 mM de 2-DG o 2-FM o menos se identifican como susceptibles. Estas líneas de células de tumor susceptibles pueden también ser probadas por su sensibilidad a 2-FG y oxamato a dosis hasta de 20 mM y 30 mM, respectivamente. Sí la interferencia con la glicosilación es la forma de toxicidad de 2-DG y 2-FM, entonces estas líneas celulares deben ser resistentes a los otros inhibidores glicolíticos , 2-FG y oxamato, a menos que tengan una deficiencia en fosforilación oxidativa de mitocondria. Para confirmar la funcionalidad de mitocondria de estas células, la respiración se puede medir usando, por ejemplo, un aparato de electrodo Clark. Para confirmar que la toxicidad de 2-DG y 2-FM es debido a la interferencia con glicosilación en estas líneas celulares, se puede someter a ensayo la recuperación de la muerte celular por mañosa como se describe anteriormente. Las bases moleculares de una célula que es resistente al método actual y otro no puede ser debido a diferencia en la expresión del gen involucrado en la síntesis de mañosa GDP a partir de glucosa, es decir fosfoglucosa isomerasa (PMI), la cual convierte glucosa-e-fosfato a manosa-6-fosfato (véase, Figura 7). Una supresión en PMI, como se menciona anteriormente, se muestra por provocar síndrome de glicosilación Ib, el cual resulta en hipoglicosilación de glicoproteínas de suero que conduce a trombosis y trastornos gastrointestinales en un paciente identificado con este defecto. La adición de mañosa a la dieta, se muestra para aliviar los síntomas del paciente, así como glicoproteínas his normalizadas. De esta forma, una deficiencia o regulación descendente de esta enzima puede explicar la toxicidad de 2DG y 2FM, e invertido por mañosa exógena en las lineas celulares sensibles hasta ahora probadas. La razón porqué la regulación descendente o supresión de PMI puede conducir a toxicidad de 2-DG en las lineas celulares sensibles es que, en la ausencia de esta enzima, las células son dependientes en mañosa exógena (presente en suero) para sintetizar precursores de oligosacárido N-enlazado. Las concentraciones de mañosa en el suero de mamíferos (50-60 microg/ml), o en el medio usado para estudios in vitro, se conocen por ser significantemente menor que la concentración de glucosa. De esta forma, en células con PMI suprimido o regulado en forma descendente, dosis bajas de 2-DG y 2-FM pueden favorablemente competir con las cantidades bajas de mañosa presente en suero, resultando en bloqueo completo de la adición de esta azúcar en las cadenas de oligosacárido. Por otra parte, las células con PMI normal puede producir mañosa GDP a partir de glucosa; de esta forma, dosis mucho mayores de 2-DG o 2-FM son necesarias para provocar rompimiento completo de ensamble de oligosacárido. De esta forma se puede explicar porqué muchas células probadas son resistentes a 2DG bajo condiciones normóxicas. Se pueden usar mediciones directas de la actividad de esta enzima de conformidad con la invención para determinar sí niveles de PMI bajos o defectuosos son responsables para la sensibilidad a 2-DG y 2-F en células seleccionadas que crecen bajo normoxia, y si es asi, entonces pueden ser usados para identificar tumores y células cancerígenas susceptibles al tratamiento de conformidad con el presente método. Otro, pero menos probable, posiblemente para explicar esta sensibilidad inusual, es que el PMI en estas células seleccionadas es inhibida más por 2-DG y 2-FM que en la mayoría de las líneas celulares normales o de tumor que son afectadas por estos agentes cuando crecen bajo tensión de oxígeno normal. Para probar esto directamente, se pueden aislar extractos celulares a partir de pares de células sensibles y resistentes SKBR, y la capacidad para convertir glucosa-6-? a manosa-6-? puede ser determinada en la presencia o ausencia de 2-DG y 2-FM. Si la actividad de PMI disminuida no es responsable por toxicidad de 2-DG en células sensibles SKBR3, entonces un mecanismo alternativo para explicar esta regulación ascendente de genes que codifican enzimas involucradas en la producción de derivados de mañosa se usa para ensamble de oligosacáridos , es decir fosfomanomutasa (PMM) y sintasa DGP-Man (Figura 7). Existe la posibilidad que las células sensibles a 2-DG sean sometidas a glicosilación incrementada y por lo tanto regulación ascendente ya sea en una o ambas de estas enzimas. Tal célula podrá acumular más 2-DG-GDP, por lo tanto conduce a mayor interferencia con glicosilación y consecuentemente muerte celular que una célula resistente en la cual la glicosilación ocurre a una velocidad o capacidad menor. A pesar de que si la regulación ascendente de glicosilación cambia para ser un mecanismo por el cual las células llegan a ser sensibles a 2-DG, la cantidad total de 2-DG que es acumulada o incorporada en una célula también contribuye a su sensibilidad incrementada. De esta forma, se pueden realizar estudios de absorción y acumulación usando 2-DG etiquetado con [3H] para determinar si niveles superiores celulares de transportador de glucosa, lo consideran más susceptible al tratamiento de conformidad con el presente método. Se pueden obtener mutantes resistentes a 2-DG a partir de células sensibles tratando las últimas con dosis incrementadas de 2-DG y seleccionando para supervivencia. Los mutantes resistentes y sus contrapartes sensibles parentales pueden ser usadas en los métodos descritos. Tales estudios pueden también proporcionar un medio de entendimiento de mecanismos por los cuales las células llegan a ser resistentes a 2-DG y por lo tanto, pueden ser aplicables al mejor uso de este fármaco clínicamente. La discusión mencionada anteriormente, refleja que una firma molecular puede ser usada para predecir cuales tipos de células tumorales serán sensibles a 2-DG y 2-FM en la presencia de oxígeno. La ejecución de muerte celular muestra una plasticidad remarcable que recorre el intervalo entre apoptosis y necrosis. Usando métodos establecidos para comparar el modo de muerte celular investigando el tipo de desdoblamiento de ADN, cambios en la composición de membrana, integridad y tono, pueden determinar los mecanismos de muerte celular inducidos por interferencia con glicosilación y por inhibición de glicólisis. La inhibición de tanto glicólisis como fosforilación oxidativa, resulta en depleción de ATP severa, con ello, causando un cambio de apoptosis a necrosis. Debido a que el ATP es requerido para activar caspasas, cuando es severamente suprimido, se bloquea la apoptosis, y eventualmente , sin energía, la célula sucumbe vía necrosis. Una célula aeróbica tratadas con un inhibidor glicolítico es capaz de producir ATP vía fosforilación oxidativa abastecida por ya sea aminoácidos y/o grasas como fuentes de energía. De este modo, cuando 2-DG induce una respuesta UPR que conduce a muerte celular bajo normoxia, se cree que las células se someterán a apoptosis. Contrariamente, en modelos de células hipóxicas, se espera que cuando la dosis de 2-DG sea suficientemente alta para bloquear la glicólisis, estas células deben someterse a depleción de ATP y muerte a través de necrosis.

Se pude usar por lo tanto, métodos establecidos para ensayar apoptosis y necrosis y determinar si 2-DG está eliminando células via apoptosis, necrosis y/o una mezcla de ambos. Varios parámetros apoptóticos pueden ser ensayados para distinguir la necrosis de apoptosis usando análisis de citometria de flujo. Después del tratamiento de 2-DG, las células pueden ser teñidas duales con Anexina-V y yoduro de propidio para detectar la exposición de fosfatidil serina sobre la superficie celular y pérdida de la integridad de la membrana celular, respectivamente. El teñido con ya sea anexina-V sola o tanto con anexina-V como yoduro de propidio, indica apoptosis, mientras el teñido con yoduro de propidio solo indica necrosis. Además, dos de los resultados finales de apoptosis, fraccionamiento de ADN nuclear y formación de ADN de hebra única, también pueden ser medidos. Estos dos últimos parámetros han sido reportados por ser únicos a muerte células apoptótica y han sido usados por varios investigadores para diferenciar apoptosis de necrosis. Los niveles de ATP pueden también ser ensayados para determinar si se correlacionan con los modos de muerte detectada. Sin embargo, si 2-DG induce tanto apoptosis como necrosis en células apoptóticas, entonces se puede determinar si el modo de muerte celular se induce por 2-FG bajo condiciones hipóxicas. Como se mencionó anteriormente, 2-FG no interfiere con la glicosilación y es un inhibidor glicolitico más potente que 2-DG. De este modo, se espera que la muerte celular inducida por 2-FG ocurra solamente vía necrosis. Las lineas de células probadas por ser sensibles a 2DG y/o 2FM y/o 2-CM in vitro bajo normoxia que crece fácilmente en ratones sin pelo, pueden ser usadas para demostrar que 2DG (y 2-FM y 2-CM) , es efectivo como un agente único contra ellos cuando se dan in vivo. Después que los tumores alcanzan un cierto tamaño, el tratamiento con 2DG será aplicado vía inyección intraperitoneal . La dosis y régimen de tratamiento de 2DG de conformidad con la dosis letal mínima establecida previamente en estos animales, puede ser usada para demostrar la regresión del tumor y citotoxicidad .

Ejemplo 1: Materiales y Métodos Aislamiento de mutantes resistentes. Células SKBR3 y NSCLC sensibles a 2-DG, son expuestas a dosis incrementadas de 2-DG y colonias resistentes son aisladas y clonadas en las dosis apropiadas de 2-DG. Las células resistentes a 2-DG clonadas, son entonces analizadas y comparadas con la contraparte sensible de tipo nativa para expresión de genes específicos que pueden ser sensibles para esta sensibilidad única.

Fármacos y Anticuerpos. Rho 123, oligomicina, estaurosporina, y 2-DG, 2-FG, 2-FM, tunicamicina , desoximanoj irinomicina, se obtienen de Sigma Chemical Co. Pueden ser usados los siguientes Abs primarios: monoclonales a HIF-la y LDH-a. (BD Biosciences ) ; erbB2 (Calbiochem, USA); Grps 78 y 94, (StressGen, USA); caspasas 4 y 5 (StressGen, USA); y actina (Sigma Chemical Co.); abs policlonales a GLUT-1 (USA Biological) y GADD153/CHOP (Santa Cruz, USA). Los anticuerpos secundarios son peroxidasa de rábano picante conjugada con anti-ratón de conejo y anti-conejo de cabra (Promega, Co.). Ensayo de citotoxicidad y Análisis de Contenido de ADN Rápido. Las células se incubaron por 24 horas a 37°C en 5% de CO2, en tal tiempo, los tratamientos de fármaco comenzaron y continuaron por 72 horas. En este tiempo, las células unidas se tripsinizaron y combinaron con sus respectivos medios de cultivo seguidos por centrifugación a 400g por 5 minutos. Las pelotillas que contienen las células son ya sea resuspendidas en 1.5 mi de una mezcla de azul triptano/medio por ensayos de citotoxicidad o solución de teñido de citrato hipotónico/yoduro de propidio para determinar el contenido de ADN nuclear y el ciclo celular por un citómetro de flujo Coulter XL. Un mínimo de 10,000 células se analizaron para generar un histograma de distribución de ADN.

Ensayo de ácido láctico. El ácido láctico es medido agregando 0.025 mi de medio desproteinado, de cultivos tratados o no tratados, a una mezcla de reacción que contiene 0.1 mi de deshidrogenasa de ácido láctico (1000 unidades/ml) , 2 mi de amortiguador de glicina (glicina, 0.6 mol/1, e hidrazina, pH 9.2), y 1.66 mg/ml de NAD. La desproteinización ocurre tratando 0.5 mi de medio de los cultivos de prueba con 1 mi de ácido perclórico a 8% en v/p, sometiendo a vórtices por 30 segundos, después incubando esta mezcla a 4°C por 5 minutos, y centrifugando a 1500 g por 10 minutos. El sobrenadante es centrifugado tres veces más, y 0.025 mi de un sobrenadante claro fino se usan para determinaciones de ácido láctico. La formación de NADH es medida con un espectrofotómetro vi/UV DU r 520 a 340 nm, el cual directamente corresponde a niveles de ácido láctico como se determina por una curva estándar de lactado . Absorción de 2-DG. Las células son sembradas en cajas de Petri, e incubadas por 24 horas a 37°C y 5% de C02. El medio es entonces removido y las placas son lavadas con medio libre de suero y glucosa. 2 mi de medio libre de suero que contiene 2-DG etiquetado 3H, son agregados a la caja (1 YCi/placa) , y las placas son incubadas por la cantidad apropiada de tiempo. El medio es entonces removido, las placas son lavadas tres veces a 4°C, y se agrega el medio libre de suero que contiene 100 micro M de 2-DG no etiquetado y 0.5 mi de 1N NaOH. Después de la incubación a 37°C por 3 horas (o durante la noche), las células son raspadas y homogenizadas por ultrasonicación (10 segundos) . La solución es colectada en tubos para cuantificación de 3H (guardando una porción de ensayo de proteina) . 100 micro 1 de ácido fórmico, 250 micro 1 de muestra, y 7 mi de cóctel de escintilación , se combinaron en un vial de conteo de 3H, y se leyó con un contador de escintilación . La velocidad de transporte (nmol/ng de proteina/tiempo) , es calculada por CPM total/radioactividad especifica/proteina total. Ensayo de cuantificación de ATP. El kit ligero de ATP (Perkin Elmer) , puede ser usado para cuantificar niveles de ATP. Aproximadamente 50 micro 1 de solución de lisis celular se agregan a 100 micro 1 de suspensión celular en una placa de 96 cavidades de fondo blanco. La placa es incubada a temperatura ambiente en un sacudidor (700 rpm) por cinco minutos. 50 micro 1 de solución de sustrato entonces se agregan a las cavidades y se sacuden (700 rpm) por cinco minutos. La placa es entonces adaptada a oscuridad por diez minutos y medida por luminiscencia. Etiquetado metabólico y extracción de Dol-P Man y oligosacáridos ligados al lipido (LLO) . De conformidad con el procedimiento descrito por Lehle, las células son etiquetadas con [ 2-3H] mañosa por 30 minutos, raspadas en 2 mi de metanol enfriado en hielo y lisado por sonicación. Después de agregar 4 mi de cloroformo, el material es sonificado, seguido por centrifugación por 10 minutos a 5000 rpm a 4°C. Los sobrenadantes son colectados y las pelotillas son extraídas dos veces con cloroformo/metanol (3:2) (C/M) . Los sobrenadantes combinados que contienen Dol-P Man y oligosacáridos ligados al lípido de tamaño pequeño, son secados bajo N2, disueltos en 3 mi de C/M, lavados y analizados por cromatografía de capa delgada sobre 60 láminas de aluminio de gel de sílice en un amortiguador de corrida que contiene C/M/H20 (65:25:4). La pelotilla restante que contiene los LLO de gran tamaño se lava y extrae con C/M/H20 (10:10:3). Alícuotas correspondientes de los extractos de C/M y C/M/H20, son combinados y secados bajo N2 y resuspendidos en 1-propanol 35 Yl . Para liberar los oligosacáridos por hidrólisis de ácido molido, 500 Yl de 0.02N de HC1, son agregados seguidos por una incubación por 30 minutos a 100°C. El material hidrolizado se seca bajo N2 y después se resuspende por sonicación en 200 Yl de agua y se separa por centrifugación. El sobrenadante que contiene los oligosacáridos liberados se usa para análisis de CLAR. Fraccionamiento de tamaño de oligosacáridos por CLAR. La separación de LLOs puede ser realizada en una columna LC-NH2 de Supelcosil (25 cm x 4.6 mm; 5 Ym; Sulpeco) que incluye una precolumna LC-NH2 (2 cm x 4.6 mm) . Un gradiente lineal de acetonitrilo de 70% hasta 50% en agua, se aplica a una velocidad de flujo de 1 ml/min. Las fracciones eluadas son analizadas por conteo de escintilacion liquida. La preparación de 6-fosfato de mañosa, 1-fosfato de mañosa, GDP-manosa. Después de etiquetar con [2-3H] de mañosa, las células son cosechadas y la mañosa libre se separa de derivados de mañosa fosforilados y ligados al nucleotido por cromatografía de papel, como se describe por Korner et al. Las fracciones eluadas son analizadas por conteo de escintilacion líquida. Análisis de Manchado Western. Las células son plaqueadas a 104 célula por cm2 y se hacen crecer bajo tratamiento de fármaco por los tiempos indicados. Al final del periodo de tratamiento, las células son colectadas y lisadas con amortiguador RIPA (150 mM de NaCl, 1% de Np-40, 0.5% DOC, 0.1% de SDS, 50 mM de Tris-HCl, pH 8.0), suplementado con un cóctel inhibidor de proteinasa. El ADN es fragmentado pasando la solución a través de una aguja 21G 10 veces. Las concentraciones de proteína son medidas por un Kit de Ensayo de Proteína Súper (Cytoskeleton, USA) . Las muestras son mezcladas con amortiguador de muestra Laemmli 2x (Bio-Rad, USA) y corridas en un gel de poliacrilamida SDS. Los geles son transferidos a membranas de nitrocelulosa (Amersham, USA) y probados con anticuerpos específicos. Después de la sonda, las membranas son lavadas e incubadas con un anticuerpo secundario conjugado a HRP. La quimioluminiscencia se detecta por exposición a película . En donde se indica, las membranas son retiradas con Amortiguador de Separación (Pierce, USA) y sometidas a sonda nuevamente con anticuerpo primario anti-actina. Inmunoprecipitación de ErbB2. Después del tratamiento de células por 24 horas, son sometidas a lisis por RIPA (15 mM de NaCl, 1% de Np-40, 0.1% de SDS) y sonicadas. Los lisados celulares son incubados con perlillas de Sepharosa activadas por CnBr (Amersham, USA) , ligadas a anticuerpo monoclonal ErB2 (Calbiochem, USA) y centrifugadas a 400 g por 5 minutos. El ErbB2 inmunoprecipitado es cargado sobre geles de SDS-PAGE y manchado con Conconavalina A, la cual se enlaza específicamente a residuos de mañosa de glicoproteínas . Ensayos de apoptosis. Se usa el ensayo de ELISA de apoptosis como se describe, y se basa en la desnaturalización selectiva de ADN en cromatina condensada de las células apoptóticas por formamida y reactividad de ADN de hebra única (ssADN) en células apoptóticas con anticuerpos monoclonales altamente específicos a ssADN. Estos anticuerpos detectan específicamente, células apoptóticas y no reaccionan con las células necróticas. Investigación de mecanismo de muerte celular por citometría de flujo. La apoptosis es distinguida de necrosis por Kit de Teñido Anexina-V-Fluos (Roche, USA) . Siguiendo los tratamientos indicados, células 106 se resuspendieron en amortiguador de incubación que contiene Anexina-V conjugada con FITC y yoduro de propidio, para detectar fosfotidilserina e integridad de membrana plasmática, respectivamente. Después de la incubación, las células son analizadas por un citómetro de flujo usando excitación a 488 nm y un filtro de paso de banda de 515 nm para detección de fluoresceína y un filtro de >600 nm para detección de PI . Perfil de expresión de Gen. Un kit de arreglo de gen puede ser adquirido de Super Array Inc. El ARN total de las líneas de células seleccionadas, es sometido a sonda con dCTP [a-32P] ( 3000Ci/mmol ) , a través de una reacción de transcripción inversa. El ADNc etiquetado sometido a sonda, es entonces agregado a la membrana de arreglo pre-hibridizado e incubado en un horno de hibridización durante la noche. Después de lavados múltiples para remover la sonda libre, la membrana es expuesta a película de rayos X para grabar la imagen.

Experimentos de tumor in vivo. El protocolo descrito para 2-DG + Dox reportado en Cáncer Res. 2004 (por Lampidis et al.), puede ser replicado sustituyendo 2-FG por 2-DG. Ratones sin pelo, cepa DC1, de 5 a 6 semanas de edad, que pesan 30 g, son implantados (S.C.) con 100 Yl de linea de células de osteosarcoma humano 143b a 107 células/ml. Cuando los tumores son de 50 mm3 en tamaño (9-10 días después), los animales son apareados en pares en cuatro grupos (8 ratones/grupo) como sigue: control tratado con salina; 2-FG solo; Dox solo; y Dox + 2-FG. Al dia 0, los grupos de 2-FG solo y Dox + 2-FG, reciben 0.2 mi de 2-FG i.p. a 75 mg/ml (500 mg/kg) , lo cual se repite 3 x semana por la duración del experimento. Al dia 1, los grupos Dox y Dox + 2-DG reciben 0.3 mi de Dox i.v. a 0.6 mg/ml (6 mg/kg) , lo cual se repite una vez por semana por un total de tres tratamientos (18 mg/kg) . Los ratones son pesados, y las mediciones de tumor se toman por calibrados tres veces por semana. Las células SKBR3 son implantadas y probadas en el modelo anterior con 2-DG o 2-FM sin doxorubicina (Dox) .

Ejemplo 2 Sensibilidad Normóxica de ciertas células de tumor a derivados de mañosa Las células que crecen bajo hipoxia son solamente dependientes del metabolismo de glucosa vía glicólisis para producción de energía. Consecuentemente, cuando esta trayectoria es bloqueada, con 2-desoxi-D-glucosa (2-DG) , las células hipóxicas mueren. Por el contrario, cuando la glicólisis es bloqueada bajo normoxia, la mayoría de las células sobrevive, debido a que las proteínas y grasas pueden sustituirse como fuentes de energía por combustible de fosforilación oxidativa mitocondrial . La presente invención se basa en parte, en el descubrimiento que, bajo tensión de oxígeno normal, un número seleccionado de líneas de células de tumor son eliminadas a una dosis relativamente baja de 2-DG (4 mM) . Se ha mostrado previamente que, 2-DG interfiere con el proceso de glicosilación N-ligada en síntesis de glicoproteína de recubrimiento viral, la cual puede ser invertida por adición de mañosa exógena. Debido a que la toxicidad de 2-DG bajo normoxia descrita en la presente, puede ser completamente invertida por mañosa de dosis baja (2 mM) , la glicosilación y no glicólisis, se cree es el mecanismo responsable de estos resultados. Adicionalmente , 2-fluoro-desoxi-D-fucosa (2-FDG), la cual es más potente que 2-DG en el bloqueo de glicólisis y eliminación de células hipóxicas, no muestra toxicidad a cualquiera de los tipos celulares que son sensibles a 2-DG bajo condiciones normóxicas.

Para investigar el efecto de 2-DG en la síntesis de proteína, concanavalina A (la cual se enlaza específicamente a porciones de mañosa en glicoproteínas ) , se usó en estudios que muestran que 2-DG pero no 2-FDG reducen el enlace, el cual es irreversible por adición de mañosa exógena. De manera similar, las proteínas de respuesta de proteína no plegada (UPR) , grp 98 y 78, las cuales se conocen por ser inducidas cuando la glicosilación n-ligada es alterada, se encuentran por ser sobre reguladas por 2-DG pero no por 2-FDG, y nuevamente, este efecto podría ser invertido por mañosa. Sin embargo, 2-DG induce la muerte celular vía regulación ascendente de un factor de transcripción específico de UPR (GADD15 /CHOP) , el cual media la apoptosis. De este modo, en ciertos tipos de tumores celulares, 2-DG puede ser usado clínicamente como un agente único para eliminar selectivamente tanto las células aeróbicas (vía interferencia con glicosilación) , así como también las hipóxicas (vía inhibición de glicólisis) de un tumor sólido. Debido a al angiogénesis , las demandas metabólicas de rápido crecimiento de tumor a menudo, superan el suministro de oxígeno, el cual contribuye a la formación de regiones hipóxicas dentro de la mayoría de tumores sólidos. La reducción en niveles de oxígeno que ocurre conforme el tumor crece, conduce a reducción de la velocidad de replicación de células en las porciones hipóxicas, que resultan en la resistencia a la mayoría de agentes quimioterapéuticos los cuales normalmente dirigen las células que proliferan rápidamente. Brown, J.M, et al., Exploiting Tumor Hypoxia In Cáncer Treatment , Nat Rev Cáncer 2004; 4:437-47. Las células hipóxicas también son resistentes a tratamiento de radiación debido al crecimiento lento y a la ausencia de oxígeno necesaria para producir especies de oxígeno reactivas. Semenza, G.L., Intratumoral Hypoxia, Radiation Resistance , And HIF-1, Cáncer Cell 2004;5:405-406. Además de estas desventajas para tratamiento de cáncer, la hipoxia proporciona una célula de tumor dependiente de la glicólisis para producción de energía y supervivencia. Bajo hipoxia, la fosforilación oxidativa, los medios más eficientes de producción de ATP, son inhibidos conduciendo a la glicólisis como el único medio para producir ATP. De este modo, bloqueando la glicólisis en células de tumor hipóxico se debe conducir a muerte celular. Sin embargo, bajo 3 condiciones diferentes de hipoxia estimulada in vitro, se ha mostrado que las células tumorales pueden ser eliminadas por inhibidores de glicólisis. Maher, J. C, et al., Greater Cell Cycle Inhibition And Cytotoxicity Induced By 2-Deoxy-D-Glucose In Tumor Cells Treated Under Hypoxic vs Aerobio Conditions, Cáncer Chemother Pharmacol 2004; 53: 116-122.

Sin embargo, la inhibición de glicólisis en células normalmente oxigenadas, no afecta significantemente su producción de energía, debido a las fuentes de carbono alternativas, es decir, aminoácidos y grasas, pueden ser utilizadas para accionar la fosforilación oxidativa mitocondrial . Por lo tanto, los inhibidores glicolíticos pueden ser usados para dirigir células tumorales hipóxicas selectivamente, sin mostrar mucha toxicidad a células normales o tumorales que crecen aeróbicamente . Boros, L. G., et al., Inhibition Of Oxidative And Nonoxidative Pentose Phosphate Pathways By Somatostatin : A Possible Mechanism Of Antitumor Action, Med Hypotheses 1998; 50:501; LaManna, J. C, Nutrient Consumption And Metabolic Perturbation, Neurosurg Clin N Am 1997;8: 145-163. En efecto, experimentos in vivo, han mostrado que 2-DG (células tumorales hipóxicas que crecen lentamente de objetivo), incrementa la eficacia de agentes quimioterapéuticos estándares (dirigidos contra células aeróbicas que rápidamente proliferan) , en diferentes xenógrafos tumorales humanos. Maschek, G., et al., 2 -Deoxy-D-Glucose Increases The Efficacy Of Adriamycin And Paclitaxel In Human Osteosarcoma And Non-Small Cell Lung Cancers In Vivo, Cáncer Res 2004;64:31-4. Los resultados de estos estudios, así como también los datos de modelos in vitro de hipoxia, han conducido a probar esta estrategia para el mejoramiento de protocolos de quimioterapia en humanos en la forma de un ensayo clínico Fase I titulado "Ensayo de escalación de dosis Fase I de 2-desoxi-D-gluoca sola y en combinación con docetaxel en sujetos, con malignidades sólidas avanzadas, "el cual está actualmente en curso. Maher, J.C., et al., Greater Cell Cycle Inhibition And Cytotoxicity Induced By 2-Deoxy-D-Glucose In Tumor Cells Treated Under Hypoxic vs Aerobio Conditions, Cáncer Chemother Pharmacol 2004; 53: 116-122. Los datos de estudios animales, así como también los resultados preliminares del ensayo clínico Fase I, indican que el 2-DG es bien tolerado y relativamente no tóxico a células normales . Aunque teóricamente las células tumorales con mitocondrias capaz de someterse a fosforilación oxidativa no deben ser eliminadas por el inhibidor glicolítico 2-DG, un número seleccionado de líneas de células de cáncer muere en la presencia de oxígeno con bajas dosis de sus análogos de azúcar. El mecanismo de toxicidad no es vía bloqueo de glicólisis, debido a que estas líneas celulares se someten a respiración mitocondrial normal y son resistentes a otros inhibidores glicolíticos . Un mecanismo similar ha sido mostrado en la síntesis de glicoproteína viral, en la cual, 2-DG bloquea la glicosilación N-ligada interfiriendo con el ensamble de oligosacárido ligado al lípido. Datema, R. , et al al., Interference With Glycosylation Of Glycoproteins, Biochem J 1979; 184: 113-123; Datema, R., et al., Formation Of 2-Deoxyglucose-Containing Lipid-Linked Oligosaccharides, Eur J Biochem 1978; 90: 505-516. La toxicidad con 2-DG en las lineas de células tumorales seleccionadas que crecen bajo normoxia, parece ser debido a un mecanismo similar. De conformidad con la presente invención, 2-DG puede ser usado como un agente único en ciertos pacientes con tumores sólidos que contienen células sensibles a 2-DG bajo normoxia. De este modo, en estos pacientes, 2-DG debe tener un efecto dual por (1) dirigiendo la población de células tumorales aeróbicas vía interferencia con glicosilación; y (2) inhibiendo la glicólisis en la porción hipóxica del tumor; ambos mecanismos conducen a muerte celular .

Materiales y Métodos Tipos de Células Las células p° son aisladas tratando lineas de células de osteosarcoma 143B (peso) con bromuro de etidio por periodos prolongados, como se describe previamente. King, M. P., et al., Human Cells Lacking Mtdna : Repopulation With Exogenous Mitochondria By Complementation, Science 1989; 246: 500-503. Debido a que las células p° son autótrofos de uridina y piruvato, se hacen crecer en DMEM (GIBCO, USA) , suplementado con 10% de suero de bovino fetal, 50 micro g/ml de uridina y 100 mM de piruvato de sodio. La linea de células SKBR3 se obtiene del laboratorio del Dr. Joseph Rosenblatt en la Universidad de Miami. Las lineas de células de cáncer pancreático 1420 y 1469, la linea de células de cáncer de ovario SKOV3, la linea de células de cáncer cervical HELA, y la linea de células de osteosarcoma 143B, son adquiridas del ATCC. Las lineas de células de cáncer de pulmón de células pequeñas y cáncer de pulmón de células no pequeñas, se derivan de pacientes por el Dr. Niramol Savaraj en la Universidad de Miamia. Las células SKBR3 y SKOV3, se hacen crecer en medio McCoy 5A; 1420, 1469 y 143B se hacen crecer en DEM (GIBCO, USA) ; y HELA se hace crecer en MEM (GIBCO, USA) . El medio se suplementa con suero bovino fetal al 10%. Todas las células se hacen crecer bajo 5% de C02 y a 37°C.

Fármacos y químicos 2-DG, oligomicina y tunicamicina , son adquiridos de Sigma. 2-FDG y 2-FDM, son un tipo de donación del Dr. Priebe (MD Anderson Cáncer Center, TX) .

Hipoxia Para estudios en condiciones hipóxicas (Modelo C) , las células son sembradas e incubadas por 24 horas a 37°C y 5% de C02 como se describe abajo para ensayos de citotoxicidad directa. Después de la incubación de 24 horas, las células reciben tratamiento de fármaco y son colocadas en una cámara in vitro Pro-OX, unida a un controlador de oxigeno modelo 110 (Reming Bioinstruments Co. Redfield, NY) , en el cual, una mezcla de 95% de nitrógeno y 5% de C02 se usa para perfundir la cámara para lograr los niveles de 02 deseados (0.1%).

Ensayos de Citotoxicidad Las células son incubadas por 24 h a 37°C en 5% de C02 , en tal tiempo, los tratamientos de fármaco comienzan y se continúan por 72 horas. En este tiempo, las células unidas son tripsinizadas y combinadas con su respectivo medio de cultivo, seguido por centrifugación a 400 g por 5 minutos. Las pelotillas son resuspendidas en 1 mi de solución Hanks y analizadas por analizador de viabilidad celular Vi-Cell (Beckman Coulter, USA) .

Ensayo de ácido láctico El ácido láctico es medido agregando 0.025 mi de medio desproteinado, de cultivos tratados o no tratados, a una mezcla de reacción que contiene 0.1 mi de deshidrogenasa láctica (1000 unidades/ml ) , 2 mi de amortiguador de glicina (glicina, 0.6 mol/1, e hidrazina, pH 9.2), y 1.66 mg/ml de NAD. La desproteinización ocurre tratando 0.5 mi de medio a partir de cultivos de prueba con 1 mi de ácido perclórico a 8% p/v, sometiendo a vórtices por 30 segundos, después exponiendo esta mezcla a 4°C por 5 minutos, y centrifugación a 1500 g por 10 minutos. El sobrenadante es centrifugado tres veces más, y 0.025 mi de un sobrenadante transparente final, se usan para determinaciones de ácido láctico como anteriormente. La formación de NADH es medida con un espectrofotómetro Beckman DU r 520 UV/vis a 340 nm, el cual corresponde directamente a los niveles de ácido láctico, como se determina por una curva estándar de lactato.

Ensayo de cuantificación de ATP El kit ligero de ATP (Perkin Elmer) , puede ser usado para cuantificar niveles de ATP. Aproximadamente 50 mi de solución de lisis celular se agregan a 100 mi de suspensión celular en una placa de 96 cavidades de fondo blanco. La placa es incubada a temperatura ambiente en un sacudidor (700 rpm) por cinco minutos. Aproximadamente 50 mi de solución de sustrato son entonces agregadas a las cavidades y sacudidas (700 rpm) por otros cinco minutos a temperatura ambiente. La placa es entonces adaptada a la oscuridad por diez minutos y medida por luminiscencia.

Análisis de Manchado Western Las células son plaqueadas a 104 célula por cm~2 y crece bajo tratamiento de fármaco por los tiempos indicados. Al final del periodo de tratamiento, las células son colectadas y sometidas a lisis con 1% de SDS en 80 mM de Tris-HCl (pH 7.4) de amortiguador suplementado con un cóctel inhibidor de proteinasa. El ADN es fragmentado por sonicación y las concentraciones de proteina son mediadas por un kit de ensayo de proteina microBCA (Pierce, USA) . Las muestras son mezcladas con amortiguador de muestra Laemmli 2x (Bio-Rad, USA) y corridas en un gel de SDS-poliacrilamida . Los geles son transferidos a membranas de nitrocelulosa (Amersham, USA) y sometido a sonda con anti-KDEL (Stressgen, Canadá) (para Grp78 y Grp94); anti-CHOP/GADD154 policlonal (Santa Cruz, USA), anti-erB2 policlonal (DAKO, USA). Después de la sonda, las membranas son lavadas e incubadas con un anticuerpo secundario conjugado a HRP. La quimioluminiscencia se detecta por exposición a película. En donde se indica, las membranas son retiradas con Amortiguador de Separación (Pierce, USA) y sometidas a sonda nuevamente con anticuerpo primario anti-actina (Sigma, USA). Para analizar el enlace de conconavalina A (ConA) , las membranas son incubadas con 0.2 micro g/ml de ConA conjugada a HRP, y la quimioluminiscencia se detecta como se describe.

Resultados 2-DC y 2-fluoro-D-manosa, pero no 2-FDG, elimina a células SKBR3 que crecen bajo condiciones normóxicas. En la supervivencia de un número de lineas de células tumorales por su sensibilidad diferencial a inhibidores glicoliticos bajo condiciones normóxicas contra hipóxicas, se descubrió que la linea de células de cáncer humano SKBR3, es sensible a 2-DG cuando se hace crecer bajo condiciones normóxica. Figura 1A y B demuestran que cuando SKBR3 es tratado con 3 m de 2-DG por 72 horas, 50% de su crecimiento se inhibe (ID50), mientras a 12 mM, 60% de las células son eliminadas. Estudios previos muestran que cuando la respiración mitocondrial es deficiente o químicamente bloquead, las células tumorales mueren cuando son tratadas con dosis similares de 2-DG. Por lo tanto, para determinar si estas células son deficientes en la respiración mitocondrial, se mide su consumo de oxígeno. Como se demuestra en la Tabla 1 abajo, no existe diferencia significante entre el consumo de oxígeno promedio de células SKBR3 y dos de otras líneas celulares que son resistentes al tratamiento de 2-DG cuando se hacen crecer bajo condiciones normóxicas. Por otro lado, una línea celular deficiente mitocondria, p°, mostró consumo de oxígeno drásticamente reducido, confirmando que SKBR3 está respirando normalmente. Además, las otras dos líneas celulares, 1420 y HELA, las cuales son sensibles a 2-DG bajo normoxia, respiran tan bien o mejor que las lineas de células resistentes (Véase Tabla 1) . De este modo, la toxicidad de 2-DG en estas células bajo condiciones normóxicas es debido a un mecanismo distinto que el bloqueo de glicólisis. Para confirmar esto, las células SKBR3 se trataron con dos de otros inhibidores glicoliticos , es decir, 2-desoxi-2-fluoro-glucosa (2-FDG) y oxamato. En la Figura IB y B, se puede ver que ninguno de estos agentes causa toxicidad a las células SKBR3 cuando se hacen crecer bajo normoxia.

Tabla 1. Comparación de consumo de oxigeno en lineas de células 2-DG sensibles contra resistentes Sin embargo, 2-fluoro-D-manosa (2-FDM) fue similar a 2-DG, a pesar de ser menos eficiente, en causar citotoxicidad en células SKBR3 (véase Figura 1). Tanto 2-DG como 2-FMD pero no 2-FDG, se asemejan a la estructura de mañosa y con ello, pueden interferir con el metabolismo de mañosa. Estos datos indican que la interferencia por 2-DG y 2-FDM con el metabolismo de mañosa, la cual está involucrada principalmente en la glicosilación N-ligada de numerosas proteínas, resulta en muerte celular así como también en la inhibición de crecimiento en células SKBR3.

El 2-FDG es un mejor inhibidor de glicólisis que 2-DG que conduce a mejor supresión de ATP en células SKBR3 En un reporte previo, se sugiere que la toxicidad de 2-DG en células SKBR3 que crecen bajo normoxia es mediada vía inhibición de glicólisis y producción de ATP. Aft. R.L., et al., Evaluation Of 2- Deoxy-D-Glucose As A Chemotherapeutic Agent: Mechanísm Of Cell Death, Br J Cáncer 2002;87:805-812. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, otro inhibidor glicolítico, 2-FDG, no es tóxico en estas células. Sin embargo, el análogo 2-FDG es mejor que 2-DG en la inhibición de la glicólisis y eliminación de células hipóxicas. Lampidis, TJ. , et al., Efficacy of 2-Halogen Substituted D-Glucose Analogs in Blocking Glycolysis and Killing "Hypoxic Tumor Cells, " Cáncer Chemother Pharmacol (en prensa). Sin embargo, cuando las células SKBR3 son tratadas con 2-FDG contra 2-DG, el anterior inhibe los niveles de lactato (una medida de glicólisis), mejor que los últimos (véase Figura 2A) . Además, la depleción de ATP fue más prominente con tratamiento de 2-FDG, confirmando además que este análogo de azúcar es un mejor inhibidor de glicólisis y producción de ATP en estas células (véase Figura 2B) . Sin embargo, se descubrió que, cuando las células SKBR3 se hacen crecer bajo condiciones hipóxicas, el 2-FDG es más tóxico que el 2-DG, confirmando además que es un mejor inhibidor de la glicólisis en células SKBR3 (datos no mostrados) . De este modo, contrario a reportes previos, la toxicidad inducida por 2-DG bajo condiciones normóxicas, parece ser dependiente de su capacidad para inhibir la glicólisis y reducir las combinaciones de ATP.

La toxicidad 2-DG en células SKBR3 bajo normoxia puede ser invertida por mañosa exógena En proteínas virales, el 2-DG ha sido mostrado por inhibir el ensamble de oligosacáridos N-ligados, y esta inhibición puede ser invertida por mañosa exógena. Datema, R. , et al., Interference With Glycosylation Of Glycoproteins, Biochem J 1979; 184:113-123. La Figura 3A y 3B ilustran que con la adición de mañosa, pero no otros azúcares, es decir, glucosa, fructuosa y fucosa, la muerte celular de exposición de 2-DG bajo normoxia, puede ser invertida, sugiriendo que la muerte celular es mediada por interferencia con glicosilación vía un mecanismo similar. Datema, R., et al., Interference With Glycosylation Of Glycoproteins, Biochem J 1979; 184:113- 123. Como un control negativo, se encontró que la mañosa no invierte la toxicidad inducida por tunicamicina en células SKBR3 bajo las mismas condiciones. Esto puede ser explicado por el hecho de que la tunicamicina interfiere con la glicosilación en una etapa que precede la adición de mañosa a la cadena de oligosacárido, con ello, considerándolo independiente del metabolismo de mañosa (datos no mostrados ) .

La toxicidad de 2-DG en tres modelos de "hipoxia", no puede ser invertida por mañosa exógena Como se mencionó anteriormente, las células que crecen bajo condiciones hipóxicas dependen solamente de la glicólisis para producir energía. De este modo, la inhibición de esta trayectoria metabólica por inhibidores glicolíticos , debe conducir a muerte celular, como se ha demostrado previamente. Maher, J. C, et al., Greater Cell Cycle Inhíbition And Cytotoxicity Induced By 2-Deoxy-D-Glucose In Tumor Celis Treated Under Hypoxic vs Aerobio Conditions, Cáncer Chemother Pharmacol 2004; 53: 116-122. Para distinguir el mecanismo por el cual 2-DG es tóxico a células SKBR3 que crecen bajo normoxia, se agregó mañosa a células que crecen bajo tres condiciones diferentes de "hipoxia". Como se muestra en las Figuras 3C y D, no se encontró diferencia significante en la inhibición de crecimiento y muerte celular en ya sea medio de crecimiento normal o en el mismo medio suplementado con 2 mM de mañosa. Estos resultados proporcionan evidencia de que la inversión de toxicidad de 2-DG en células SKBR3 que crecen bajo normoxia por mañosa exógena no está relacionada con la glicólisis, implicando además, interferencia con glicosilación como el modo de muerte celular en estas células que crecen bajo normoxia. 2-DG y 2-FDM son tóxicos a solamente un número seleccionado de lineas de células de tumor que crecen bajo condiciones normóxicas Para investigar si la toxicidad de 2-DG bajo condiciones normóxicas se confina a un cierto tipo de tejido de cáncer, se probó un número de lineas celulares. Los resultados de estas pruebas, mostrados en la Tabla 2, muestran que solamente un número seleccionado de lineas de células de tumor (6 de 15) que crecen bajo tensión de oxigeno normal, se someten a muerte celular significante cuando se tratan con ya sea 2-DG o 2-FDM, pero no con 2-FDG a 6 mM. Las lineas de células que se encontraron por ser sensibles a 2-DG, fueron SKBR3, una linea de células de cáncer de mama; 1420, una linea de células de cáncer pancreático; 2 lineas de células de cáncer de pulmón de células no pequeñas derivadas directamente de pacientes; RT 8226, una linea de células de mieloma múltiple; HELA, un carcinoma cervical y TG98, una linea de células de glibolastoma . Sin embargo, las lineas de células de cáncer derivadas de tejidos similares, se encontraron por ser resistentes a tanto 2-DG como 2-FDM bajo tensión de oxigeno normal, indicando que la toxicidad de estos análogos de azúcar no es necesariamente especifica del tipo de tejido.

Tabla 2. Lineas de células resistentes contra sensibles (2-DG bajo normoxia) Líneas de Células Sensibles 2-DG Lineas de Células Resistentes 2-DG SKBR3, cáncer de mama S OV3, cáncer de ovario 1 20, ciincer pancreático 1469, áncei pancreático HELA, cáncer ccn ical 143B, osteosarcoma S-l y S-2 cáncer de pulmón de Ra- 1 ,2 and 3, cáncer pulmonar de células pequeñas TG98, cáncer cerebral fglioblustoma) MCF-7, cáncer de mama RT 8228, mieloma múltiple U266, mieloma múltiple HEPA- 1 , bepaloma de rala MDA-MB-23 1 , cáncer de mama MDA-MB-468, cáncer de manía 2-DG y 2-FDM reducen el enlace de Conconavalina A (ConA) y el peso molecular de una glicoproteina en células SKBR3 ConA es una lectina que se enlaza específicamente a mañosa en glicoproteínas y ha sido usada para detectar glicoproteínas de tipo mañosa alta. Protein Purification Methods : A Practícal Approach, In: Harris ELV, Angal S, editors. New York: IRLPress at Oxford University Press; 1994. p.270. Esta técnica se usó para mostrar que tanto 2-DG como 2-FDM, así como también tunicamicina, reducen el enlace de ConA en un número de glicoproteínas (véase figura 4A) . Sin embargo, la mañosa exógena restaura los niveles de enlace de ConA de control en 2-DG y 2-FDM pero sin células tratadas con tunicamicina, mientras células tratadas con 2-FDG no muestran reducción en el enlace de ConA. Además, un cambio en el tamaño de una glicoproteina conocida, erbB2, el cual es un receptor de tirosina cinasa expresado en células SKBR3 siguiendo el tratamiento de 2-DG, se analizó por manchado western. La Figura 4B ilustra que tanto 2-DG como 2-FDM, reducen el peso molecular de erbB2, mientras 2-FDG no tiene efecto. En correlación con los datos de ConA, la mañosa exógena restaura el tamaño de la proteína a su peso original. Estos datos soportan además, la conclusión que 2-DG y 2-FDM pero no 2-FDG, son tóxicos para seleccionar las células tumorales vía interferencia con glicosilación N-ligada, y que esta interferencia puede ser invertida por mañosa.

El tratamiento por ya sea 2-DG o 2-FDM, conduce a respuesta de proteina no plegada en células SKBR3 bajo normoxia Cuando el proceso normal de glicosilación de proteina se afecta, las proteínas mal plegadas se acumulan en el retículo endoplasmático (ER) , conduciendo a una cascada de señalización conocida como respuesta de proteína no plegada (UPR) . Los fármacos que interfieren con la glicosilación, han sido mostrados por inducir UPR, conduciendo a un incremento en la capacidad de plegado de la proteína de ER vía regulación ascendente de las chaperonas, es decir, Grp78/Bip o Grp9 . Como se muestra en la Figura 5, cuando las células SKBR3 son tratadas con 2-DG, 2-FDM, o tunicamicina , un inhibidor bien conocido de glicosilación, bajo normoxia, tanto Grp78 como Grp94, son regulados ascendentemente . Sin embargo, la adición de 2 mM de mañosa invierte la regulación ascendente de 2-DG y 2-FDM de chaperonas pero no de aquellas de tunicamicina. La inversión de mañosa de 2-DG que induce UPR, se correlaciona con los datos en la Figura 3D, que demuestran que la toxicidad de 2-DG es invertida por la adición de mañosa exógena; resultados similares se encontraron en células tratadas con 2-FDM (datos no mostrados) . Como se esperaba, 2-FDG no incrementa los niveles de estas chaperonas tanto como 2-DG o 2-FDM, que se correlacionan con los datos de toxicidad (Figura IB), que no ilustran muerte celular en células SKBR3 cuando se tratan bajo condiciones normoxicas. Por el contrario, cuando 2-DG o 2-FDM se aplican a células que crecen bajo tres diferentes condiciones experimentales de hipoxia, no se observa regulación ascendente significante de la UPR en modelos A y B, como se compara con el modelo C, en donde ambas chaperonas son reguladas ascendentemente. Sin embargo, la tunicamicina , como un control positivo, se muestra por inducir la síntesis de estas chaperonas en los tres modelos (Figura 5B) . Estos resultados indican que, cuando las células son tratadas con 2-DG o 2-FDM, el mecanismo de muerte celular difiere bajo condiciones "hipóxicas" (bloqueo de glicólisis) contra normoxicas (interferencia con glicosilación ) .

La toxicidad de 2-DG y 2-FDM se correlacionan con la inducción de la trayectoria apoptotica específica de UPR en células SKBR3 Se ha reportado que cuando las células no pueden superar el estrés de ER, la UPR induce trayectorias apoptóticas específicas vía inducción de GADD154/CHOP. Xu, C, et al., Endoplasmic Retículum Stress: Cell Life And Death Decisions, J Clin Invest 2005; 115: 2656-2664; Obeng, E. A. , et al . , Caspase-12 And Caspase-4 Are Not Required For Caspase-Dependent Endoplasmic Reticulum Stress-Induced Apoptosis, J Biol Chem 2005; 280: 29578-29587. De este modo, para determinar si 2-DG y 2-FDM eliminan células SKBR3 debido al estrés de ER bajo normoxia, esta proteina apoptótica especifica de UPR es ensayada usando análisis de manchado western. Como se pude ver en la Figura 6, después de 2-DG, 2-FDM y tunicamicina, pero sin tratamiento de 2-FDG, se induce GADD154 /CHOP . Cuando esta trayectoria apoptótica es inducida por ya sea 2-DG o 2-FDM, se puede invertir por el co-tratamiento con mañosa; sin embargo, GADD154/CHOP inducido por tunicamicina, no puede ser invertido por adición de esta azúcar. Estos datos se correlacionan con la inversión de citotoxicidad por mañosa, como se muestra en la Figura 2B.

Discusión de Ejemplos 1 y 2 Los tumores sólidos contienen células hipóxicas asi como también áreas normóxicas debido a la angiogénesis insuficiente, crecimiento rápido de tumor y capacidad de portar oxigeno reducido de vesículas tumorales. Gillies, RJ. , et al., MRI Of The Tumor Microenviroment , J Magn Reson Imaging 2002; 16:430-450; Maxwell, P. H., et al., Hypoxia-Inducible Facoro-1 Modulates Gene Expression In Solid Tumors And Influences Both Angiogenesis And Tumor Growth, PNAS 1997; 94:8104-8109; Semenza, G.L., Targeting HIF-I For Cáncer Therapy, Nature Rev 2003;3:721-732. Debido a que la única trayectoria de producción de energía en células hipóxicas es glicólisis, se ha mostrado que el inhibidor glicolítico 2-DG es selectivamente tóxico a estas células, per no es tóxico y solamente inhibe el crecimiento de células aeróbicas. aher, J. C, et al., Greater Cell Cycle Inhibitíon And Cytotoxicity Induced By 2-Deoxy-D-Glucose In Tumor Cells Treated Under Hypoxic vs Aerobio Conditions, Cáncer Chemother Pharmacol 2004; 53: 116-122; aschek, G., et al., 2-Deoxy-D-Glucose Increases The Efficacy Of Adriamycin And Paclitaxel In Human Osteosarcoma And Non-Small Cell Lung Cancers In Vivo, Cáncer Res 2004;64:31-4; Liu, H., et al., Hypersensitization Of Tumor Cells To Glycolytic Inhibitors, Biochemistry 2001; 40:5542-5547; Liu, H., et al., Hypoxia Increases Tumor Cell Sensitivity To Glycolytic Inhibitors : A Strategy For Solid Tumor Therapy (Model C, . Biochem Pharmacol 2002; 64: 1745-1751. Sin embargo, un número seleccionado de líneas de células tumorales es eliminado por 2-DG en la presencia de oxígeno. Entre estos tipos de células sensibles está la línea de cáncer de mama humano SKBR3. Una deficiencia en la respiración mitocondrial podría explicar la sensibilidad de estas células a 2-DG, debido a que el bloqueo de glicólisis en células con mitocondrias comprometidas podría reducir los niveles de ATP, conduciendo a muerte celular necrótica. Gramaglia, D., et al., Apoptosis To Necrosis Switching Downstream Of Apoptosome Formation Requires Inhibition Of Both Glycolysis And Oxidative Phosphorylation In A BCL-X! And PKB/AKT-Independent Fashion, Cell Death Differentiation 2004; 11: 342-353. Sin embargo, esta posibilidad se reglamenta por los experimentos de consumo de oxígeno, los cuales muestran que células SKBR3 respiran de manera similar a otras dos líneas celulares encontradas por ser resistentes a 2-DG bajo normoxia (Tabla 1) . Además, la velocidad de respiración de la línea celular 1420, la cual es también sensible a 2-DG bajo normoxia, se encontró por ser superior que en las líneas de células resistentes a 2-DG. De este modo, la toxicidad de 2-DG en SKBR3 bajo normoxia, no puede ser explicada por una deficiencia en la función mitocondrial, indicando que el mecanismo de muerte celular no está relacionado con el efecto de este azúcar en el bloqueo de glicólisis. Previamente, se reportó que las células SKBR3 fueron sensibles a 2-SG bajo normoxia debido a la inhibición de glicólisis, conduciendo a depleción de combinaciones de ATP, las cuales resultan en expresión incrementada de transportador I de glucosa y mayor absorción de 2-DG. Aft, R.L., et al., Evaluation Of 2- Deoxy-D-Glucose As A Chemotherapeutic Agent : Mechanism Of Cell Death, Br J Cáncer 2002; 87:805-812. Sin embargo, 2-FDG es un inhibidor más potente de glicólisis que 2-DG (11, figura 2), pero no es tóxico a células SKBR3 que crecen bajo normoxia, soportando además, la conclusión que 2-DG elimina estas células vía un mecanismo distinto que el bloqueo de glicólisis e inhibición de producción de ATP. Los datos muestran que células SKBR3 son también sensibles al análogo de mañosa 2-FDM, indican que la configuración mano de análogos de azúcar es importante por su actividad tóxica en las células de tumor seleccionadas que crecen bajo normoxia. La carencia de un átomo de oxigeno en el segundo carbono de 2-DG, considera este compuesto tanto un análogo de glucosa como mañosa, mientras el grupo fluoro en 2-FDG lo considera un análogo de glucosa solamente. La conclusión que la configuración mano es relevante a la toxicidad de estos análogos de azúcar, es soportada por el trabajo publicado a finales de los 70' s por un grupo encabezado por Schwartz. El grupo mostró que 2-DG, 2-FDG y 2-FDM podrían interferir con la glicosilación N-ligada en fibroblastos de embriones de pollo, los cuales se infectaron con virus de plaga aviar, resultando en síntesis reducida de glicoproteína y reproducción viral. Datema, R., et al., Interference With Glycosylation Of Glycoproteins, Biochem J 1979;184: 113-123; Datema, R . , et al., Formation Of 2-Deoxy glucose-Containing Lipid-Linked Oligosaccharides, Eur J Biochem 1978/ 90: 505-516; Datema, R. , et al., Fluoro-Glucose Inhibition Of Protein Glycosylation In Vivo, Eur J Biochem 1980; 109:331-341; Schmidt, M.F.G., et al . , Núcleoside-diphosphate Derivatives Of 2-Deoxy-D-Glucose In Animal Cells, Eur J Biochem 1974; 49: 237-247; Schmidt, M.F.G., et al., Metabolism Of2-Deoxy-2-Fluoro-D-[3H] Glucose And 2-Deoxy-2-Fluoro-D-f H] Mannose In Yeast And Chick-Embryo Cells, Eur J Biochem 1978; 87: 55-68; McDowell, ., et al., Mechanism Of Inhibition Of Protein Glycosylation By The Antiviral Sugar Analogue 2-Deoxy-2-Fluoro-D-Mannose : Inhibition Of Synthesis Of Man (Gicnac) 2 , PP-Dol By The Guanosine Diphosphate Ester, Biochemistry 1985; 24:8145-8152. Sus reportes concluyen que 2-DG puede inhibir el ensamble de oligosacáridos ligados al lipido, los cuales son transferidos sobre las proteínas dentro del retículo endoplasmático de la célula. Se demostró que un metabolito de 2-DG, GDP-2DG, podría causar terminación prematura del ensamble de oligosacárido conduciendo a oligosacáridos ligados al lipido acortados, no adecuados para su transferencia sobre proteínas. Datema, R. , et al., Formation Of 2-Deoxy glucose-Containing Lipid-Linked Oligosaccharides, Eur J Biochem 1978; 90:505-516. En total, estos resultados muestran que la potencia de estos análogos para inhibir la síntesis de glicoproteína viral es en el orden de 2-DG>2-FDM>2-FDG, el cual es similar a la toxicidad de estos análogos en células SKBR3 que crecen bajo normoxia. Datema, R. , et al., Fluoro-Glucose Inhibition Of Protein Glycosylation In Vivo, Eur J Biochem 1980; 109:331-341. Este grupo también reportó que los efectos inhibidores de estos análogos podrían ser invertidos por la adición de mañosa exógena de dosis baja. Datema, R. , et al., Interference With Glycosylation Of Glycoproteins, Biochem J 1979; 184: 113-123. De manera similar, 2 mM de mañosa invierten completamente la toxicidad 2-DG y 2-FDM en células SKBR3, indicando que ambos análogos de mañosa eliminan estas células vía interferencia con glicosilación N-ligada. Datema, R. , et al., Interference With Glycosylation Of Glycoproteins, Biochem J 1979; 184: 113-123.; Datema, R. , et al., Formation Of 2-Deoxy glucose-Containing Lipid-Linked Oligosaccharides, Eur J Biochem 1978; 90:505-516; Datema, R. , et al., Fluoro-Glucose Inhibition Of Protein Glycosylation In Vivo, Eur J Biochem 1980; 109:331-341; Schmidt, M.F.G., et al., Núcleoside-diphosphate Derivatives Of 2-Deoxy-D-Glucose In Animal Cells, Eur J Biochem 1974; 49: 237-247; Schmidt, M.F.G., et al., Metabolism Of 2-Deoxy-2-Fluoro-D- [3H] Glucose And 2-Deoxy-2-Fluoro-D- [3H] Mannose In Yeast And Chick-Embryo Cells, Eur J Biochem 1978; 87: 55-68; McDowell, W., et al.r Mechanism Of Inhibition Of Protein Glycosylation By The Antiviral Sugar Analogue 2-Deoxy-2-Fluoro-D-Mannose : Inhibition Of Synthesis Of Man (Gicnac) 2 PP-Dol By The Guanosine Diphosphate Ester, Biochemistry 1985; 24:8145-8152. Aunque la mañosa es un azúcar de núcleo en proteínas glicosiladas N-ligadas, también participa en la trayectoria glicolítica, debido a que puede ser convertida a fructuosa-6-fos fato por fosfomanoisomerasa . De este modo, permanece posible que la mañosa pueda invertir la toxicidad de 2-DG en células SKBR3 evitando la etapa glicolítica en la cual, se inhibe 2-DG (Figura 7) . Sin embargo, esta posibilidad parece ser menos probable, debido a que 2 mM de mañosa no invierten (véase Figura 3C y 3D) la inhibición de crecimiento y muerte celular inducida por 2-DG en modelos "hipóxicos" A y B, mientras en el modelo C, en el cual las células están creciendo actualmente bajo hipoxia, hubo un ligero efecto de recuperación. Esta ligera recuperación puede ser explicada por (1) 2-DG y 2-FDM que interfieren con glicosilación aún bajo condiciones hipóxicas, y/o (2) mañosa que invierte la inhibición de glicólisis en el modelo C, debido a que estas células bajo 0.5% de hipoxia, están todavía sometidas a fosforilación oxidativa, ya sea reducida. En total, la inversión de toxicidad de 2-DG y 2-FDM por mañosa en células sensibles a estos análogos de azúcar bajo normoxia pero no en células cuyas mitocondrias es cerrada (modelos A y B) , soportando que la interferencia con glicosilación, y sin inhibición de glicólisis, es responsable de la hipoxia normóxica. Cuando se inhibe la glicosilación N-ligada, las proteínas no pueden ser plegadas apropiadamente y son retenidas en el ER. Ellgaard, L., et al., Quality Control In The Endoplasmic Reticulum, Nat Rev Mol Cell Biol 2003; 4: 181-191; Parodi, AJ. , Protein Glycosylation And Its Role In Protein Folding, Annu Rev Biochem 2000; 69:69-93. La acumulación de proteínas no plegadas resulta en la distensión del organelo, así como también de traducción de proteína alterada. En tal caso, las células inician un complejo, pero aún conservado, de cascada de señalización, conocida como respuesta de proteína no plegada (UPR) para reestablecer la homeostasis en ER. Tres proteínas de transmembrana ER transducen la señal de proteína no plegada al núcleo: enzima 1 que requiere inositol (IRE1) ; proteína cinasa activada por ARN de doble hebra (PERK) y activación del factor de transcripción 6 (ATF6) . Schroder, M . , et al, ER Stress And Unfolded Protein Response, Mutat Res 2005; 569:29-63. Cuando las proteínas no plegadas se acumulan en el ER, una chaperona molecular, proteína 78 regulada por glucosa (Grp78/Bip) , se disocia de estas tres proteínas de la transmembrana ER, con ello, activándolas. Pahl, H.L., Signal Transduction From The Endoplasmic Reticulum To The Cell Nucleus, Physiol Rev 1999; 79: 683-701. Esto resulta en un número de alteraciones raetabólicas y moleculares, que incluyen, regulación ascendente de transportadores de azúcar, incremento en la síntesis de fosfolípido, transporte de aminoácido, y expresión de chaperonas moleculares Grp78/Bip y Grp94. Ma, Y., et al, The Unfolding Tale Of The Unfolded Protein Response, Cell 2001; 107: 827-830; Doerrler. W.T., et al., Regulation Of Dolichol Pathway In Human Fibroblasts By The Endoplasmic Reticulum Unfolded Protein Response, PNAS 1999; 96: 13050-13055; Breckenridge , D. G., et al., Regulation Of Apoptosis By Endoplasmic Reticulum Pathways, Oncogene 2003;22: 8608-8618. 2-DG y 2-FDM regulan ascendentemente la expresión de tanto Grp78 como Grp94 en células SKBR3 que crecen bajo condiciones normóxicas, las cuales pueden ser invertidas por la adición de mañosa exógena, soportando fuertemente que estos análogos de azúcar están interfiriendo con glicosilación N-ligada, conduciendo a proteínas no plegadas y con ello, iniciando la UPR. Además, 2-FDG, el cual es un mejor inhibidor de glicólisis que ya sea 2-DG o 2-FDM, no es efectivo en la inducción de una respuesta de UPR. La magnitud de la respuesta de UPR a estos análogos parece reflejar el grado de interferencia con glicosilación, el cual está de acuerdo con los reportes que demuestran tal 2- DG>2-FDM>2-FDG en el bloqueo de ensamble de oligosacárido ligado al lipido en proteínas de cubierta viral. Datema, R., et al., Fluoro-Glucose Inhibition Of Protein Glycosylation In Vivo, Eur J Biochem 1980; 109:331-341; Schmidt, .F.G., et al., Nucleoside-diphosphate Derivatives Of 2-Deoxy-D-Glucose In Animal Cells, Eur J Biochem 1974; 49: 237-247; Schmidt, M.F.G., et al., Metabolism Of 2-Deoxy-2-Fluoro-D- [3H] Glucose And 2-Deoxy-2~ Fluoro-D- [3H] Mannose In Yeast And Chick-Embryo Cells, Eur J Biochem 1978; 87: 55-68; McDowell, W. , et al., Mechanism Of Inhibition Of Protein Glycosylation By The Antiviral Sugar Analogue 2-Deoxy-2-Fluoro-D-Mannose : Inhibition Of Synthesis Of Man (Gicnac) 2 PP-Dol By The Guanosine Diphosphate Ester, Biochemistry 1985; 24:8145-8152. Sin embargo, estos datos de UPR se correlacionan con los resultados de citotoxicidad, los cuales muestran similarmente tal 2-DG>2-FDM >»2-FDG en inhibición de crecimiento y eliminación de células SKBR3 bajo normoxia. Por otro lado, en los modelos "hipóxicos" A y B, Grp78 y Grp94, no son regulados ascendentemente por 2-DG, indicando que estas células mueren vía inhibición de glicólisis y no a través de interferencia con glicosilación . Un mecanismo posible para explicar porque la UPR no es inducida en estos modelos se refiere a los niveles de ATP conocidos por ser necesarios para proteínas no plegadas que se enlazan a Grp78/Bip y con ello, activan la UPR. Contrario al modelo A y B, la UPR es inducida en el modelo C (Figura 5B) , en donde los niveles de ATP son reducidos por menos de 2-DG. Sin embargo, la tunicamicina , la cual se conoce por no afectar los niveles de ATP significantemente, regula ascendentemente las chaperonas en los modelos "hipóxicos", demostrando una trayectoria UPR funcional en estas células. La UPR es muy similar a p53, en donde detienen el ciclo celular las señales de daño de ADN, activación de enzimas de reparación de ADN, y dependiendo del resultado de estos procesos, apoptosis. De este modo, si la UPR falla por establecer homeostasis dentro del retículo endoplásmico, las trayectorias apoptóticas específicas del estrés-ER del retículo endoplasmático, son activadas. Breckenridge, D. G., et al., Regulation Of Apoptosis By Endoplasmic Reticulum Pathways, Oncogene 2003; 22:8608-8618. Entre los mediadores de las trayectorias apoptóticas las cuales incluyen caspasa 4, caspasa 12 y CHOP/GADD154 , la activación incrementada del último has sido mostrada por ser un mejor indicador de la trayectoria apoptótica de mamífero inducida por ER entre los otros. Obeng, E. A., et al., Caspase-12 And Caspase-4 Are Not Required For Caspase-Dependent Endoplasmic Reticulum Stress-Induced Apoptosis, J Biol Chem 2005; 280: 29578-29587. De este modo, la figura 6, en donde se muestra que la expresión de CHOP/GADD154 se correlaciona con citotoxicidad 2-DG y 2-FDM en células SKBR3 que crecen bajo normoxia, soporta que estos análogos de azúcar son tóxicos vía interferencia con glicosilación que conduce a estrés por ER. Sin embargo, la inversión de inducción de CHOP/GADD154 por adición de mañosa pero no por glucosa, soporta además que 2-DG y 2-FDM son tóxicos via este mecanismo. Una cuestión fundamental es como ciertos tipos de células tumorales mueren cuando se tratan con 2-DG en la presencia de 02, mientras la mayoría del tumor así como también células normales no. Una respuesta a esta pregunta viene de estudios genéticos en los cuales, la enzima fosfomanoseisomerasa se muestra por ser suprimida en pacientes que sufren de lo que es descrito como Síndrome de Glicoproteína Deficiente en Carbohidratos Tipo Ib. J Clin Invest 1998; 101: 1414- 1420; Freeze, H.H., Human Disorders in N-glycosylation and Animal Models, Biochim Biophys Acta 2002; 1573:388-93. La supresión de esta enzima resulta en hipoglicosilación de glicoproteínas del suero, conduciendo a trombosis y trastornos gastrointestinales caracterizados por enteropatía de pérdida de proteína. Cuando se agrega mañosa exógena a las dietas de estos pacientes, sus glicoproteínas del suero regresan a lo normal, su síntomas desaparecen. Freeze, H. H., Sweet Solution: Sugars to the Rescue, J Cell Biol 2002; 158:615-616; Paneerselvam, K. , et al., Mannose Corrects Altered N-glycosylation in Carbohydrate-Deficient Glycoprotein Syndrome Fibroblasts, J Clin Invest 1996; 97:1478-1487. Esto se correlaciona con los presentes datos que muestran que la mañosa exógena rescata las células tumorales seleccionadas que son eliminadas cuando se tratan con 2-DG en normoxia. Es posible que estos tipos de células tumorales sean ya sea regulantes descendentemente o defectivos en la fosfomanoseisomerasa, o que el 2-DG efectúe esta enzima más en estas células tumorales que en muchas otras, las cuales han sido mostradas por ser resistentes a tratamiento de 2-DG en normoxia. Sin embargo, como se indica en la Figura 7, existen numerosas otras etapas en donde 2-DG y 2-FDM pueden estar inhibiendo el metabolismo de mañosa involucrado con la glicosilación N. ligada. 2-DG, 2-CM y 2-FDM (2-FM) , eliminan ciertos tipos de tumor vía interferencia con glicosilación que conduce a estrés de ER y apoptosis. El hallazgo de que 2-FDG no elimina estas células, elimina la posibilidad de que la toxicidad de 2-DG y 2-FDM es debido a la inhibición de glicólisis y supresión de ATP. Estos agentes pueden ser usados como agentes de terapias únicos en el tratamiento de tumores sólidos seleccionados (véase Figura 7).

Ejemplo 3 Como se muestra en las Figuras 8 y 9, ensayos MTT múltiples demuestran las sensibilidades de lineas de células glioma de alto grado seleccionadas y varios inhibidores glicoliticos a base de azúcar y gráficamente exhibidos. Varias condiciones son usadas que incluyen, la exposición a ya sea normoxia o hipoxia y su influencia en la sensibilidad a estos compuestos. Los resultados indican una sensibilidad relativamente uniforme de los varios inhibidores glicoliticos a base de azúcar (con algunas diferencias subtituladas) . Existe una clara diferencia con algunas lineas celulares con respecto a la influencia de la sensibilidad en condiciones hipóxicas. En general, la mayoría de las líneas son más sensibles a inhibidores glicoliticos cuando crecen en condiciones hipóxicas, lo cual podría ser pronosticado. Sin embargo, algunas líneas celulares tales como U87 MG, son completamente cometidas a un fenotipo glicolítico aeróbico ("efecto arburg" completo) , que el nivel de ácido láctico (un marcador subrogado de glicólisis) es máximo en condiciones normóxicas y no incrementa en condiciones hipóxicas (véase datos de lactado abajo) . En estas circunstancias, la diferencia en sensibilidad es explicada por la observación empírica que las células que crecen en condiciones hipóxicas son de crecimiento más lento y por lo tanto, probablemente tienen menos demandas de energía en las células . La Figura 8A muestra ensayos MTT de la línea de células de tumor cerebral humano U87, siendo tratada con 2-FG en la presencia de hipoxia (<1% de oxígeno) o normoxia (20% de oxígeno) . Ambas figuras 8B y 8C, representan experimentos similares, sin embargo, el inhibidor glicolítico a base de azúcar es diferente. En el caso del panel B, 2-DG se usa y en el panel C, se emplea 2-FM. Como se puede ver, U87 representa un fenotipo inusual que está persistentemente utilizando glicolisis por sus necesidades metabólicas y, por lo tanto, esta línea de células no muestra sensibilidad incrementada a estos agentes en hipoxia . La Figura 9 muestra las curvas de crecimiento durante 6 días en la presencia de ya sea 2-FG o 2-FM. Este panel demuestra la inhibición de crecimiento significante de la línea de células U87 en donde 2-FG parece ser ligeramente más efectivo que 2-FM. El Panel B y Panel C demuestran inhibición similar de las curvas de crecimiento para una línea de células D-54 que crece tanto en condiciones de hipoxia como normoxia. En este caso, existe claramente un efecto aumentado cuando las células se hacen crecer en condiciones hipóxicas y esto se refiere a la capacidad para estimular el metabolismo glicolítico adicional para esta linea de célula particular en hipoxia.

Ejemplo 4 Las Figuras 10 y 11 muestran la diferencia en sensibilidad en linea de células de glioblastoma-astrocitoma U87 MG humano (U87), contra la linea de células de glioma humano D-54 en condiciones de normoxia e hipóxicas con exposición a 2-DG. Las células U87 MG exhiben altas relaciones de glicólisis ya sea en condiciones hipóxicas o en condiciones aeróbicas (glicólisis oxidativa del "Efecto Warburg"), por lo tanto, la sensibilidad de células U87 MG a 2-DG, no cambia cuando se hacen crecer bajo condiciones hipóxicas. Por otro lado, células D54 son parcialmente cambiadas a metabolismo glicolitico bajo condiciones de crecimiento aeróbico, por lo tanto, la sensibilidad a 2-DG es mayor cuando esta linea celular se hace crecer en condiciones hipóxicas. La Figura 10 muestra la diferencia significante entre estas dos lineas de células y la insensibilidad relativa de U87, la cual es más prominente. La Figura 11 muestra lo racional además de esta diferencia fenotipica entre U87 y D54. Este panel demuestra la inducción de glicólisis mayor por D54, mientras U87 está ya sea produciendo máximamente niveles de lactato. Los resultados mostrados en las Figuras 10 y 11 demuestran un efecto diferencial de hipoxia cuando las lineas de células son tratadas con inhibidores glicoliticos . Las lineas de células que son dependientes altamente glicolíticamente (tales como U87 MG) , son ya máximamente sensibilizadas a inhibidores glicoliticos y no requieren estar en un ambiente anóxico para mostrar sensibilidad. Esto demuestra que el nivel alto y sin cambio de producción de lactato por lineas de células tales como U87 MG mientras D54 incrementa tanto la sensibilidad como niveles de lactato en respuesta a hipoxia. Sorprendentemente, las lineas de células de glioma son casi resistentes a condiciones hipóxicas. Como se observa en la Figura 12, las lineas de células que crecen en ya sea condiciones normóxicas o condiciones hipóxicas completas (<1%), pueden continuar creciendo razonablemente dependiendo también de la glicólisis para proporcionar las demandas de energía de la célula.

Ejemplo 5 Demostración de absorción de tumor del análogo 2-DG 2-fluoro18-glucosa (2-FL8G) . La Figura 13 demuestra la absorción exagerada de 2-F18G dentro de un glioma durante los estudios de exploración de PET de rutina. Una exploración PET de un paciente con glioblastoma multiforme demuestra la absorción significante de 2-FG dentro de este tumor. Los paneles muestran un CT sin contraste (A), CT con contraste (B) y exploración PET registrada por CT después de proporcionar al paciente mCi 2-F18G. Este fenómeno farmacodinámico proporciona una demostración dramática de que estos tumores son únicamente estudiados para inhibidores de glicólisis a base de azúcar.

Ejemplo 6 Tratamiento de gliomas humanos en ratón. Xenógrafos ortópicos de ratón de células de glioma humano, son tratadas con ya sea 2-DG solo o con Temozolomida (Temodar) . Estos animales representan un modelo de xenógrafo ortópico de glioma de alto grado. Estos experimentos fueron repetidos tres veces con resultados similares como se muestra en la Figura 14. Los animales fueron implantados intracranealmente con células U87 MG y fueron entonces tratados después de 5 días con ya sea control negativo (PBS), control positivo (Temodar), agente único experimental (2-DG) o combinación experimental (2-DG + Temodar) . Los resultados mostrados en la Figura 12, demuestran por primera vez, la eficacia de agente único de 2-DG contra un modelo de tumor ortópico. Estos resultados se repitieron y son consistentes con tres experimentos animales consecutivos con un total de 18 animales en cada grupo (datos no mostrados). Este modelo animal particular es muy riguroso y solamente ganancias modestas en supervivencia son reveladas con nuevos fármacos de investigación. Como se puede ver, 2-DG es igualmente efectuado como el mejor fármaco actualmente disponible para tumores cerebrales. Temozolomida (véase como control positivo) . De manera sorprendente, 2-DG fue igualmente efectivo como Temodar y la combinación fue aún superior al la terapia de agente único. El 2-DG fue dado oralmente y fue bien tolerado. La equivalencia funcional de 2-DG y Temodar fue notable debido a que el Temodar es el "estándar de oro" actual para el tratamiento de tumores cerebrales. Finalmente, la eficacia de agente único también ha demostrado esta clase de agentes, los cuales son únicos para esta enfermedad. Estos resultados demuestran que una inhibición de la glicólisis incrementa la supervivencia animal de manera similar a aquella del control positivo usado, temozolomida. Esta terapia fue bien tolerada por los animales y no mostró evidencia de toxicidad. Finalmente, ahora se están seleccionado compuestos a partir de un grupo de inhibidores glicoliticos a base de azúcar relacionados, para conducir selecciones candidatas, las cuales se basarán en una eficacia in vitro e in vivo, propiedades farmacocinéticas , estabilidad química y el costo de la síntesis química. Después de la selección de conducción, se iniciarán estudios más avanzados, así como también pruebas de toxicología animal formal. Mientras las modalidades específicas de la invención han sido mostradas y descritas en detalle para ilustrar la aplicación de los principios de la invención, se entenderá que la invención puede ser incluida de otro modo, sin apartarse de tales principios.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN
Habiéndose descrito la presente se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:
REIVINDICACIONES 1. Un método para tratar glioblastoma , caracterizado porque comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de 2-FM, 2-CM o 2-BM a un sujeto en necesidad de la misma. 2. Un método para tratar cáncer pancreático, caracterizado porque comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de 2-FM, 2-CM o 2-BM a un sujeto en necesidad de la misma. 3. Un método para tratar la proliferación de tumores, caracterizado porque comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de 2-FM, 2-CM o 2-BM a un sujeto en necesidad de la misma.
4. Un método para el tratamiento de cáncer, caracterizado porque comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de 2-FM, 2-CM o 2-BM a un sujeto en necesidad de la misma, en donde la muerte de célula de cáncer es por autofagia.
5. Un método para lograr un efecto en un paciente, caracterizado porque comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de 2-FM, 2-CM o -2BM, en donde el efecto se selecciona del que consiste de cáncer pancreático y glioblastoma.
6. Un método para tratar gliomas altamente glicólicos, de alto grado, caracterizado porque comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de 2-DG a los gliomas, en donde ocurre la muerte celular de los gliomas.