MX2008010633A - Composiciones inmunogenicas anti-amiloides, metodos y usos. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona una composición inmunogénica recombinante obtenida mediante la multimerización en tandem de un fragmento que posee el epitopo de célula B de A(42, dentro del sitio de bucle activo de un portador (sitio de visualización), preferentemente la tiorredoxina bacteriana (trx). Los polipéptidos que poseen copias múltiples de los fragmentos de A(42, preferentemente con un ligador de aminoácido interpuesto, fueron construidos e inyectados en ratones en combinación con un adyuvante. Se encontró que los anticuerpos producidos se enlazan selectivamente a A( fibrilar y/o oligomérico dentro de las placas de AD neuríticas.

Description

COMPOSICIONES INMUNOGENICAS ANTI-AMILOIDES , METODOS Y USOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a las construcciones inmunogénicas que comprenden un fragmento de ?ß42 y un portador caracterizado porque el fragmento está colocado dentro del sitio de bucle activo (sitio de visualización) del portador, el método de producción y usos del mismo. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las enfermedades amiloidogénicas tales como la enfermedad de Alzheimer (AD) , han sido reconocidas como la causa principal de demencia en personas ancianas. La declinación de las habilidades cognoscitivas en AD está asociada con los cambios histopatológicos en el cerebro, siendo el más relevante la formación de placas amiloides y marañas neurofibrilares . Mientras que las placas amiloides contienen muchas proteínas, éstas tienen como su constituyente principal el péptido amiloide ß (?ß) . La formación del péptido ?ß, y con esto las placas amiloides ?ß, surge del procesamiento aberrante de la .proteína precursora amiloide (APP, por sus siglas en inglés) . Actualmente, varios procedimientos farmacológicos están siendo desarrollados para retardar o revertir la Ref. 195007 progresión de AD. Mientras que varios procedimientos están dirigidos a inhibir la generación metabólica del péptido ?ß, otros están dirigidos para prevenir la agregación del amiloide ?ß en el cerebro de pacientes afectados con AD. No obstante, los procedimientos más promisorios están dirigidos a incrementar la depuración cerebral de las placas de ?ß a través de la administración ya sea de antigenos capaces de generar una respuesta inmunitaria contra ?ß (inmunización activa) o anticuerpos dirigidos contra ?ß (inmunización pasiva). Los antigenos o inmunógenos son usualmente macromoléculas que contienen sitios antigénicos distintos o "epitopos" que son reconocidos e interactúan con los diversos componentes del sistema inmunitario. Estos usualmente comprenden una molécula pequeña o "hapteno", tal como un péptido corto, acoplado a un portador adecuado. Típicamente, los portadores son proteínas de más alto peso molecular, que son capaces de provocar una respuesta inmunitaria cuando son administradas in vivo. En una respuesta inmunitaria, los anticuerpos son producidos y secretados por los linfocitos B en conjunto con las células T cooperadoras (TH) . En la mayoría de los sistemas de hapteno/portador, las células B producen anticuerpos que son específicos para el hapteno y el portador. En estos casos, los linfocitos T tendrán dominios de enlace específico sobre el portador, pero reconocerán el hapteno solo. En un tipo de sinergismo, las células B y T cooperan para inducir una respuesta de anticuerpo específica de hapteno. Por lo tanto, la construcción de un antígeno efectivo, la selección del portador apropiado y el hapteno apropiado es crucial para garantizar una respuesta inmunogénica robusta y selectiva. La seguridad del antígeno es también de importancia crucial. Por ejemplo, la administración con pacientes a AD de la vacuna AN-1792 promisoria constituida por ?ß42 pre-agregado y el inmunoadyuvante QS-21, condujeron a meningoencefalitis severa en aproximadamente 6% de los sujetos tratados. La activación central de las células T citotóxicas y las reacciones autoinmunitarias fueron propuestas como mecanismos potenciales de toxicidad. Una respuesta inmunitariacon ?ß monomérico endógeno puede ser dañino, ya que la especie ?ß no agregada tiene un papel fisiológico en el papel neuronal. De este modo, es de gran importancia la selección apropiada del hapteno y el portador, para garantizar la selectividad de anticuerpo hacia las especies de ?ß peligrosas, y prevenir la toxicidad autoinmunitaria . El documento WO2005058940 propone conjugar el inmunógeno peptídico que comprende el péptido ?ß o un fragmento del mismo, a un portador proteico/polipeptidico. Las construcciones inmunogénicas son producidas mediante un método químico que comprende la derivat i zación de los grupos funcionales de los residuos de aminoácidos del portador en donde cualesquiera grupos funcionales derivatizados, no conjugados de los residuos de aminoácidos son inactivados vía el encasquetamiento para bloquearlos de la reacción con otras moléculas. Tal método da como resultado los inmunógenos donde el fragmento de ?ß es enlazado a las cadenas laterales de aminoácidos del portador. Mientras que el documento WO2005058940 varios portadores diferentes y haptenos han sido propuestos, su eficacia histopatológica in vivo ha sido mostrada. Kim, H.D. et al., en Biochem. Biophys, Res. Commun . Volumen 336, páginas 84-92 propone una vacuna anti-ADN de ?ß compuesta de 11 repeticiones desplegadas de ?ß1-6. Tal construcción produjo anticuerpos que reconocieron indiscriminadamente las especies de ?ß42 monoméricas, oligoméricas y fibrilares. En general, la dirección selectiva de los inmunógenos contra los diferentes estados de ensamblaje de ?ß42 (monómeros, oligómeros y fibrillas) no ha sido lograda hasta la fecha. En vista de las consideraciones anteriores, existe todavía una necesidad para desarrollar una construcción inmunogénica segura y efectiva que puede ser utilizada en composiciones de vacunación terapéutica para prevenir la agregación del amiloide ?ß en el cerebro de pacientes afectados por AD u otras enfermedades amiloidogénicas tales como el síndrome de Down. La presente invención proporciona una construcción inmunogénica recombinante, caracterizada porque los fragmentos de ?ß son colocados dentro del sitio de bucle activo (sitio de visualización) del portador, en vez de ser enlazados a los extremos del portador. El péptido es obtenido mediante la multimerización en tándem de un epitopo de célula B que posee el fragmento de ?ß42, dentro del sitio de bucle activo (sitio de visualización) de un portador, preferentemente la tiorredoxina (Trx) . Se encontró que los inmunógenos de la presente invención promueven anticuerpos que reconocen especies oligoméricas neurotóxicas del amiloide ?ß que recientemente han sido indicados como los agentes causales más parecidos de las enfermedades amiloidogénicas. Esta capacidad ha sido asociada con la construcción del inmunógeno que caracteriza el amiloide ?ß dentro del portador. Tal configuración hacia cierto grado permite el plegamiento correcto de la proteína inmunogénica y lo presenta de manera más efectiva al sistema inmunitario. Cuando el inmunógeno posee más de un fragmento amiloide ?ß, y en particular números específicos de dichos fragmentos, la semejanza del inmunógeno a los oligómeros de amiloide ?ß, se cree que mejora adicionalmente su eficacia así como también incrementa la selectividad. Un ligador entre el portador y los fragmentos ayuda además en la preservación del estado de montaje del epitopo peptídico. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una construcción inmunogénica (también indicada de aquí en adelante como inmunógeno) que comprenden un fragmento que posee el epitopo de célula B inmunodominante de ?ß42 y un portador caracterizado porque dicho fragmento está colocado dentro del sitio de bucle activo (sitio de visualización) del portador. El portador es preferentemente tiorredoxina , mientras que el fragmento de ?ß es ventajosamente un fragmento N-terminal de menos de 30 residuos de aminoácidos, preferentemente de menos de 20 residuos de aminoácidos, más preferentemente es ?ß-15. Aún más preferentemente, la construcción inmunogénica posee más de un fragmento, preferentemente 2 a 16, más preferentemente 4 fragmentos. La presente invención también proporciona un método para construir el inmunógeno, el método comprende una multimerización en tándem asistida por ligador de un epitopo de célula B que posee un fragmento de ?ß42 dentro de la visualización del portador, preferentemente un fragmento N terminal de menos de 30 residuos de aminoácidos. En otro aspecto más, la presente invención proporciona una composición que comprende el inmunogeno para la vacunación activa contra enfermedades amiloidogénicas . En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso del inmunogeno para desarrollar anticuerpos, preferentemente anticuerpos monoclonales , para ser utilizado como vacuna pasiva contra enfermedades amiloidogénicas . BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura la muestra la construcción ???(?ß1-15-Gly-Gly-Pro) de acuerdo a la presente invención. La figura Ib muestra la purificación hasta la homogeneidad mediante cromatografía de afinidad metálica de construcciones que poseen una, cuatro u ocho copias de ?ß?-15 desplegado o visualizado por Trx. La figura le muestra los niveles del anticuerpo anti-?ß promovidos por inmunógenos de acuerdo a las modalidades de la presente invención. La figura Id muestra los inmunógenos de respuesta polarizada por Th2 de acuerdo a las modalidades de la presente invención. Las figuras 2a, 2b, 2c muestran secciones de cerebro humano tratadas con suero provenientes de ratones inmunizados con inmunógeno de acuerdo a las modalidades de la presente invención. La figura 3 muestra las imágenes de AFM que muestran enlaces preferenciales de los inmunógenos de acuerdo a las modalidades de la presente invención. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención proporciona una construcción inmunogénica (o inmunógeno) que comprende un portador que posee al menos un fragmento de ?ß42. Dicho fragmento está colocado dentro de una región expuesta superficialmente (sitio de bucle activo o sitio de visualización o despliegue) del portador, que lo estabiliza conformacionalmente . El tamaño exacto y la homogeneidad química de la construcción son rutinariamente determinados mediante electroforesis en gel y espectrometría de masa. La estructura de la construcción puede ser determinada mediante técnicas analíticas; no obstante, la resonancia magnética nuclear (RMN) es preferentemente empleada. El portador es preferentemente tiorredoxina (Trx) . La Trx es particularmente adecuada por su tamaño pequeño (109 aminoácidos), capacidad de visualización o despliegue de péptido, y la habilidad para actuar como un inmunogenerador no tóxico capaz de estimular la proliferación de células T murinas. No obstante, pueden ser utilizados otros portadores. El fragmento amiloide ?ß es un extremo N-terminal, ventajosamente un fragmento N-terminal que tiene menos de 30 aminoácidos, preferentemente menos de 20 aminoácidos y más preferentemente seleccionados del grupo que consiste de ?ß?-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-13, 1-14, 1-15 reportado en la Tabla 1 siguiente de acuerdo al código de una letra para los aminoácidos. Preferentemente, el fragmento amiloide ?ß es ?ß1-15. Venta osamente, la construcción inmunogénica de la invención posee más de un fragmento, preferentemente de 2 a 16, más preferentemente 4 fragmentos. En una modalidad preferida, los fragmentos son enlazados al portador a todo lo largo de un ligador, para prevenir la formación de epitopos de unión. Dicho ligador es una secuencia corta de aminoácidos, preferentemente un ligador construido de 1 a 5 residuos de aminoácidos, más preferentemente Glicina-Glicina-Prolina (Gly-Gly-Pro) . No obstante, pueden ser utilizados otros ligadores, tales como Glicina-Prolina-Glicina-Prolina-Glicina (Gly-Pro-Gly-Pro-Gly) o Serina-Glicina-Serina-Glicina ( Ser-Gly-Ser-Gly ) . La construcción de inmunógeno preferida consiste de la tiorredoxina enlazada, opcionalmente a través de un ligador adecuado, a cuatro fragmentos de ?ß1-15, indicados de aquí en adelante como Trx (?ß1-15 ) . El método para construir el inmunógeno es un método de clonación que comprende la amplificación del portador en una bacteria adecuada, insertando el portador en un vector adecuado, comprendiendo el vector un promotor T7 para la expresión de la proteína a todo lo largo del sistema de pET; la preparación de un inserto de ADN del fragmento de ?ß que restringe y liga el portador/vector y el inserto de ADN de fragmento ?ß . Preferentemente, el inserto de ADN del fragmento de ?ß comprende un ligador de aminoácido. Siempre que son preparados los multímeros, es empleado un exceso del inserto de ADN del fragmento de ?ß .

Tabla 1. Descripción ?ß1-3 DAE ?ß1-4 DAEF ?ß1-5 DAEFR ?ß1-6 DAEFRH ?ß1-7 DAEFRHD ?ß1-8 DAEFRHDS ?ß1-9 DAEFRHDSG ?ß?-10 DAEFRHDSGY ?ß?-11 DAEFRHDSGYE ?ß1-12 DAEFRHDSGYEV ?ß?-13 DAEFRHDSGYEVH ?ß?-14 DAEFRHDSGYEVHH ?ß1-15 DAEFRHDSGYEVHHQ La construcción inmunogénica preferida de la presente invención, después de la inyección una vez al mes por 4 meses en ratones transgénicos en los cuales ha sido inducida una patología ß-amiloide cerebral, parece reducir el número y el tamaño de las placas de ?ß en el hipocampo y en la corteza cerebral. Además, la construcción inmunogénica preferida de la invención se encontró que promueve anticuerpos que reconocen especies determinadas de ?ß42. Los anticuerpos, después de la inyección intra-hipocámpica son capaces de despejar las placas positivas ?ß42 en el hipocampo y la corteza de ratones transgénicos, siendo dicho efecto de depuración o despejo particularmente evidente para especies de ?ß oligoméricas . Se encontró que los anticuerpos mejoran fuertemente la astrogliosis asociadas a ?ß (Ejemplo 2) . En consecuencia, la construcción inmunogénica de la presente invención, puede formar composiciones para el uso como vacuna activa y pasiva contra enfermedades amiloidogénicas .

Para la vacunación activa, una composición farmacéutica que comprende la composición inmunogénica de la invención es ventajosamente administrada en combinación con un adyuvante. La selección de un adyuvante y/o portador depende de la estabilidad de la vacuna que contiene el adyuvante, la ruta de administración, el esquema de dosificación, la eficacia del adyuvante para la especie que es vacunada, y en humanos, un adyuvante farmacéuticamente aceptable que ha sido aprobado o es aprobable para la administración a humanos por los cuerpos regulatorios pertinentes. Por ejemplo, el adyuvante completo de Freund no es adecuado para la administración a un humano. Los adyuvantes adecuados incluyen el monofosforil-lipido A 3-Des-O-acilado (MPL, por sus siglas en inglés), el muramil-di-péptido y las saponinas tales como QS21 y Quil A. Una clase preferida de adyuvantes son las sales de aluminio (alumbre) , tales como el hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio. Adyuvantes adicionales incluyen citocinas, tales como interleucinas (IL-1, IL-2 y IL-12), factor estimulador de colonias de macrófago (M-CSF) , factor de necrosis neoplásica (TNF) . Un adyuvante puede ser administrado con el inmunógeno como una composición simple, o puede ser administrado antes, concurrente o después de la administración del inmunógeno. Opcionalmente, puede ser utilizado simultáneamente dos o más adyuvantes diferentes. El inmunógeno y el adyuvante pueden ser empaquetados y suministrados ya sea en el mismo frasco o en frascos separados y mezclados antes del uso. Las composiciones farmacéuticas que comprenden la construcción inmunogénica de la invención pueden también incluir una variedad de otros componentes farmacéuticos. Ver Remington' s Pharmaceut ical Science (15a Ed. , Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1980) . La forma farmacéutica preferida depende del modo pretendido de administración y la aplicación terapéutica. Las composiciones pueden también incluir, dependiendo de la formulación deseada, portadores y diluyentes no tóxicos, farmacéuticamente aceptables, los cuales son definidos como vehículos comúnmente utilizados para formular composiciones farmacéuticas para administración a animales o humanos. El diluyente se selecciona para no afectar la actividad biológica de la combinación. Los ejemplos de tales diluyentes son agua destilada, solución salina fisiológica amortiguada con fosfato, soluciones de Ringer, solución de dextrosa, y solución de Hank. Para la administración parenteral, la construcción inmunogénica de la invención puede ser administrada como dosis inyectable de una solución o suspensión de la sustancia en un diluyente fisiológicamente aceptable, con un portador farmacéutico que puede ser un liquido estéril tales como agua, aceites, solución salina, glicerol, o etanol . Además, en las composiciones pueden estar presentes sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes , surfactantes , sustancias amortiguadoras del pH y similares. Las composiciones de la invención pueden ser preparadas como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones liquidas; formas sólidas adecuadas para la solución en, o la suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección, pueden ser también preparados. La construcción inmunogénica de la invención puede ser administrada en la forma de una inyección de depósito o preparación de implante que puede ser formulada de una manera tal como para permitir una liberación sostenida del ingrediente activo. Las formulaciones adicionales adecuadas por otros modos de administración incluyen las formulaciones orales, intranasales y pulmonares, supositorios y formulaciones transdérmicas . Para la vacunación pasiva, la composición es inyectada dentro de un mamífero, tal como un cobayo u otra especie animal, y los anticuerpos resultantes son purificados y subsecuentemente inyectados en humanos.

Preferentemente, los anticuerpos son monoclonales y son producidos mediante la inmunización de un mamífero con la construcción inmunogénica Trx (?ß1-15 ) 4. Los anticuerpos son utilizados para la prevención y tratamiento de las enfermedades amiloidogénicas, en particular la enfermedad de Alzheimer . EJEMPLO 1 Preparación de diferentes construcciones inmunogénicas de ?t??ß y la evaluación ex vivo de los efectos de diferentes anticuerpos anti-TrxAp Una estrategia de clonación que confían en el uso de un exceso del inserto de ADN de ?ß1-15 con respecto a un vector recipiente modificado que posee la secuencia de codificación de Trx bajo el control de un promotor fago T7, fue utilizada para la construcción de ?t?(?ß1-15)? (Figura la) . Las construcciones que poseen una, cuatro u ocho copias de ?ß1-15 mostrado por Trx, fueron aisladas y utilizadas para expresar los polipéptidos correspondientes, los cuales fueron luego purificados hasta la homogeneidad mediante cromatografía de afinidad de metal (Figura Ib) . Una cuestión fundamental para la producción de los multímeros de ?ß1-15 adecuadamente ensamblados, fueron la direccionalidad y la capacidad de infusión infraestructura! del sitio Cpol único presente durante la secuencia de Trx (posiciones de nucleótidos 99-105, correspondientes a los residuos de aminoácidos 34-45, identificados como: 5' ...CG/GT (A) CCG...3' ) asi como la incorporación dentro del ADN de ?ß1-15 de una secuencia terminal que codifica para un ligador de intervención Gly-Gly-Pro, poniendo también de este modo la formación de epitopos de unión. Una cuarta construcción que posee una copia simple del péptido ?ß42 de longitud completa fue preparada de una manera similar. Mientras que todos los polipéptidos Trx(Api-15)n fueron solubles no obstante de la multiplicidad de ?ß1-15, la mayor parte de la proteina TrxAp42 terminó en cuerpos de inclusión en una forma insoluble (no mostrada) . De este modo, ?ß42 parece ser pobremente soluble, incluso cuando está fusionada a Trx en el contexto heterologo de las células bacterianas. Cinco grupos de 10 ratones BALB/c fueron tratados con 10 nmol de los polipéptidos Trx(Api5)n anteriormente mencionados, y con cantidades equivalentes de ?ß42 sintético o pre-agregados , todos suplementados con alumbre, un adyuvante aprobado para el uso en humanos (Figura le) . Dos grupos adicionales inyectados con amortiguador solo (PBS) o con ?ß42 libre de alumbre sirvieron como controles negativos. Los sueros fueron recolectados dos semanas después de la cuarta inyección, aleatoriamente combinados en pares, y analizados con el Ensayo Inmunosorbente Ligado a Enzimas (ELISA) utilizando ?ß42 agregado como el antígeno objetivo. Como se muestra en la Figura le, los niveles de anticuerpo anti-?ß medios promovidos por Trx (?ß1-15) 4 y Trx (?ß1-15 ) 8 , pero no por TrxApi-15, fueron significativamente superiores (P < 0.05;) que aquellos de los controles pseudotratados , y similares a aquellos de los grupos tratados con ?ß42, donde funcionó asi como ?ß42 libre. P es el valor de p asociado con la prueba t sobre control transformado logarítmicamente, y los datos experimentales utilizando las direcciones estándares Bayesianas o regularizadas; P indica la probabilidad de que el resultado obtenido en una prueba estadística sea debido a la probabilidad en vez a una relación verdadera de las mediciones . Una respuesta polarizada por Th2 fuertemente antiinflamatoria, típica del adyuvante alumbre, fue revelada mediante perfilamiento de isotipo (Figura Id). Aunque una prevalencia de la inmunoglobulina de la clase G y la subclase 1 (IgGl) fue observada con todos los antígenos, una proporción de IgGl/IgG2 (inmunoglobulina de la clase G y de la subclase 2) fue reproduciblemente más alta (P < 0.05) multimérico y los inmunoconj ugados de 2 no conjugado. La habilidad de los antisueros generados en respuesta a para enlazarse a las placas amiloides, fue en seguida investigada. Esta propiedad, actualmente considerada como la mejor indicación de pronóstico de la eficacia del anticuerpo anti-?ß ín vivo, no es compartida por todos los antisueros anti-?ß previamente descritos (por ejemplo, m266 y otros anticuerpos que se dirigen a la porción C terminal de ?ß42) . Como se muestra en las Figuras 2a-2b, los sueros provenientes de ratones inmunizados con la forma tetramérica u octamérica de Trx (?ß1-15 ) n, se enlazaron en las placas amiloides hasta una dilución de 1/1000. Las placas neuríticas grandes, así como las placas maduras e inmaduras, fueron marcadas por anticuerpos antimultiméricos Trx (api-15) n. Una inmunotinción más amplia, especialmente dentro de los núcleos de placa senil, fue observada con el antisuero ant?-ß-amiloide Pan, control positivo, generado en conejos utilizando ?ß40 como el antígeno (no mostrado) . Por comparación, no fueron detectadas placas ya sea con el suero de los animales pseudotratados (no mostrados) , o bien con los sueros provenientes de ratones inmunizados con ?t??ß 1-15 (Figura 2c) . Finalmente, fueron utilizadas inmunotransferencias para evaluar las capacidad de los diversos anticuerpos anti-Trx(Api-15)n hacia diferentes estados de ensamblaje de ?ß42 (monómeros, oligómeros y fibrillas) generados in vitro bajo las condiciones previamente determinadas y verificadas mediante microscopía de fuerza atómica (AFM) . Los resultados de este análisis son dados en la Figura 3, que muestra que los anticuerpos anti-Trx (?ß1-15 ) 8 se enlazan a las tres especies de ?ß42, mientras que los anticuerpos anti-Trx (?ß1-15 ) 4 se enlazan preferentemente a los oligómeros solubles y a las fibrillas pero no a los monómeros de ?ß42. En agudo contraste, los anticuerpos producidos contra el antígeno ?t??ß1-15 monomérico no muestra enlace, así como falta de reconocimiento de las fibrillas de ?ß42. La última observación está en concordancia con la incapacidad de estos anticuerpos para reconocer agregados de ?ß42 de más alto orden en ELISA, así como fibrillas de ?ß en placas de AD (ver Figura le y 2c) . De manera interesante, no obstante, los anticuerpos anti-?t??ß1-15 monomérico se enlazan a los monómeros de ?ß42 y a los oligómeros (figura 3) . Trx ( ?ß1-15 ) 4 es de este modo, un derivado de amiloide ß que carece del epitopo de célula T, soluble, con buena actividad inmunogénica, incluso cuando es formulado con un adyuvante de fuerza moderada tal como alumbre, Al (OH) 3 . También significativa la habilidad de ?t?(?ß1-15)4 para generar anticuerpos que se enlazan a los oligómeros y a las fibrillas de ?ß42 sinaptotóxicos , pero no a la especie de ?ß monomérica, presumiblemente fisiológica. Las ventajas principales de Trx-dPI en comparación a otras estrategias de inmunización con péptidos son su tiempo y efectividad adecuados, la falta de toxicidad celular y el rendimiento de los inmunoconj ugados químicamente homogéneos, la consistencia lote a lote de los cuales puede ser verificada fácilmente. Además, una vez que un "antígeno guía" ha sido identificado, éste es fácilmente disponible para la modificación posterior, incluyendo la incorporación de epitopos peptídicos adicionales y reemplazo de vectores para fines de vacunación con ADN . Construcciones de ?t??ß. La secuencia que codifica para la tiorredoxina de E. coli, ha sido amplificada mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) empleando los cebadores 1 y 2 (Tabla 2), diseñados para conferir el sitio de restricción Ndel y BamHI . El fragmento amplificado ha sido doblemente digerido con las enzimas de restricción Ndel y bamHI, y ligado a pET28b® (Novagen) digerido con las mismas dos enzimas; el vector resultante, designado como pT7Kan-Trx, alberga la secuencia de una versión marcada con His6 N- y C-terminalmente de la tiorredoxina bacteriana, junto con un marcador de resistencia a la kanamicina. El sitio Cpol único presente dentro de la secuencia de codificación de Trx (posiciones de nucleótidos 99-105, correspondientes a los residuos de aminoácidos 34-35, identificados como: 5'... CG/GT (A) CCG ... 3') se utilizó como el sitio de clonación. Sustancial para la producción de los multimeros son las capacidades de direccionalidad y fusión intra-estructural del sitio Cpol único. pT7Kan-TrxApi-15. La secuencia que codifica para el péptido de ?ß1-15, el fragmento N-terminal del péptido beta amiloide ?ß42, ha sido obtenida mediante el recocido de los oligonucleótidos fosforilados : 5 ' -GTCCGATGGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTT CATCATCAAGGCG- 3 ' (delantero) 3' - GCTACCTACGTCTTAAGGCTGTACTGAGTCCTATACTTCAAGTAG TAGTTCCGCCAG-5 ' (inverso) . Que posee una secuencia de reconocimiento de Cpol terminal. El inserto de ADN de 57 pares de bases (Cpol que sobresale en el extremo 5') ha sido ligado a pT7Kan-Trx digerido con Cpol, a una proporción molar 1/10 del vector/inserto. N-n4-6xHis-n 10-TRX(I- 33) GPMDAEFRHDSGYEVHHOGGPTR (36-109Vn15-6xHis-C La secuencia completa es: mgsshhhhhhssglvprgshMGDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDF WAEWCGPMDAEFRHDSGYEVHHQGGPCKMIA ILDEIADEYQGKL TVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFK GEVAATKVGALSKGQL KEFLDA LRdpnsssvdklaaalehhhhhh Las características principales de la construcción de TrxApi-15 conciernen a la presencia del residuo Met en el extremo (M) N del péptido ?ß?-15, un ligador de Gly-Gly-Pro en el extremo C del péptido ?ß1-15 y las secuencias que codifican para una versión marcada con His6 N- y C-terminalmente de la tiorredoxina bacteriana. pT7Kan-Trx(Api-15)4 y pT7Kan-Tr (?ß1-15) 8. Las construcciones que poseen más copias del péptido ?ß1-15 han sido obtenidas de una manera similar, pero a una proporción molar del vector/inserto de 1/100. Los clones recombinantes fueron seleccionados mediante digestión de restricción/electroforesis en gel y dos de ellos que poseen cuatro u ocho copias de la secuencia de ?ß1-15 fueron utilizados para expresar y purificar las proteínas recombinantes correspondientes Tr (?ß1-15) 4 y Trx (?ß1-15) 8. La presencia de dos marcadores de His6 ayuda al paso de purificación y podría incrementar la inmunogenicidad, como el caso de las repeticiones en tándem de los residuos de lisina.

Tabla 2 Expresión y purificación de los polipéptidos de Trx ?ß . La expresión fue inducida mediante la adición de isopropil-p-D-tiogalactopiranósido 1 mM (IPTG) a células E. coli BL21Star (DE3) (Invitrogen) transformadas con cada una de las construcciones anteriores y se dejó proceder por 2 horas a 37°. Una cepa de E. coli diferente (Origami-DE3; Novagen) y las construcciones de expresión modificadas (vector pT7-Amp-Trx; 5 horas a 30°C) se utilizaron para Trx ?ß42, que fue de otro modo completamente insoluble. Después de la lisis celular, los polipéptidos de TrxA marcados con His6 fueron marcados a una resina de afinidad metálica (Talón; Clontech) , purificada siguiendo las instrucciones del fabricante e intensivamente dializada contra solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . La concentración de proteina fue determinada con el método de coloración de Coomassie (Bio-Rad) y mediante absorbancia de UV. La composición y la pureza de los polipéptidos individuales fue evaluada mediante electroforesis en gel sobre geles de poliacrilamida-SDS al 11% y análisis ALDI-TOF (MassLynx 4.0, aters) . Protocolos de inmunización. Los polipéptidos de Trx ?ß recombinantes (2 mg/ml en PBS) fueron esterilizados por filtración y una alícuota de cada uno (10 nmol) se mezcló con 1 mg de alumbre (Sigma-Aldrich) , en un volumen final de 400 µ?, inmediatamente antes del uso. ?ß 42 (Sigma-Aldrich) se disolvió en PBS (2 mg/ml) y se agregó toda la noche a 37°C antes de la inmunización. Cinco grupos aleatoriamente clasificados de ratones macho BALB/c de un mes de edad (Charles River Laboratories; 10 animales cada uno) fueron inyectados subcutáneamente con los antígenos anteriores en el día 1, 15, 30 y 60, como se especifica en la Figura le. Se aplicó el mismo tratamiento a dos grupos control negativo que fueron inyectados con PBS y con ?ß 42 agregado, ambos con alumbre. Los sueros fueron recolectados dos semanas después del último reto y aleatoriamente combinados en pares.

Detección de anticuerpo anti-?ß 42. Los anticuerpos anti-?ß 42 totales fueron detectados mediante ELISA a una dilución fija de 1/200, utilizando ?ß42 agregado (0.5 pg/pozo) como el antígeno objetivo 23. Después de la incubación, lavado y la adición de inmunoglobulinas anti-ratón conjugadas a la peroxidasa de rábano (HRP) (1/5000; Sigma-Aldrich) y el sustrato cromogénico o-fenilendiamina ( Sigma-Aldrich) , las placas fueron leídas espectrofotométricamente a 450 nm. La determinación del isotipo de inmunoglobulina fue conducida a una dilución fija de 1/200, utilizando los anticuerpos secundarios conjugados a HRP específicos de subclase anti-Ig de ratón (TechniPharm) . Los ELISA fueron conducidos por triplicado sobre sueros penta-apareados de cada grupo; únicamente un subgrupo de sueros proveniente de los tres respondedores superiores a los grupos 1, 3, 4, 6 y 7 (Figura le) fue utilizado para la determinación del isotipo. Las comparaciones entre grupos fueron conducidas mediante análisis de varianza (ANOVA. por sus siglas en inglés) de una vía utilizando el software Analyze-it.

Inmunohistoquimica . Los sueros provenientes de ratones inmunizados con cada uno de los tres TrxApi-15 fueron seleccionados por su habilidad de enlazarse a las placas de ?ß en secciones cerebrales humanas provenientes de un paciente de 68 años de edad con síntomas neuropatológicos y clínicos típicos de enfermedad de Alzheimer severa. Las diversas diluciones (1/100-1/1000) de los sueros combinados de los tres respondedores superiores en los grupos 5, 6 y 7 fueron analizadas, los mejores resultados fueron obtenidos con una dilución de 1/500. Los sueros fueron agregados a secciones cerebrales seriales de 8 µ?? de tejido cortical temporal fijado con formalina, pre-tratado con ácido fórmico (80%, 15 minutos). Los sueros provenientes de animales pseudo-tratados (PBS) y una preparación de anticuerpo policlonal anti-Ap40 comercial (Anti-Pan ß-Amyloid, Biosource) fueron utilizados como control negativo y positivo, respectivamente La inmunomarcación fue revelada con el sistema de En Vision Plus/peroxidasa de rábano (Dako), utilizando 3-3'-diaminobencidina como el sustrato cromogénico de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las imágenes fueron capturadas con una cámara digital a amplificaciones en el intervalo de 50 a 400X.

Ensayos de transferencia por puntos y formación de imagen AFM . Las especies de ?ß42 para el análisis de transferencia por puntos fueron preparadas de acuerdo a los protocolos previamente conocidos en la técnica (ver por ejemplo, Stine, W.B. et al en J. Biol . Chem. Volumen 278, página 11612-11622) . En resumen, ?ß42 disuelto en DMSO 2 M (concentración final de 1 mM) fue utilizada como la fuente de la forma monomérica; la dilución de la solución de reserva de DMSO en el medio F12K de Ham frío (libre de rojo de fenol; Biosource) a una concentración final de 100 µ?, seguido por la incubación por 24 horas a 4°C se utilizó para preparar oligómeros solubles; la misma solución de reserva diluida en HC1 10 m a una concentración final de 100 µ? e incubada por 24 horas a 37°C se utilizó para generar fibrillas de ?ß . La identidad de las diversas especies de ?ß, asi como la ausencia de fibrillas provenientes de las soluciones de oligómero soluble, fue verificada mediante AFM. Para este fin, las soluciones de ?ß42 anteriormente descritas fueron diluidas 10 veces en 20 µ? de amortiguador de deposición (HEPES 4 mM, pH 7.4, NaCl 10 mM, MgCl2 7 mM) a una concentración final de 10 µ? e inmediatamente depositadas sobre mica rubí recién escindida a temperatura ambiente. Después de cinco minutos, los discos de mica fueron enjugados con agua grado mili-Q y suavemente secados bajo una corriente de nitrógeno. Las imágenes fueron recolectadas con un microscopio Nanoscope III (Digital Instruments) operado en el modo de golpeteo, utilizando apoyos en voladizo de silicio de tablero de inmersión comercial (MikroMasch) . Un volumen fijo de cada especie de ?ß correspondiente ya sea a 0.1 pmol ó 1 pmol del péptido ?ß42 fue transferido por puntos sobre membranas de ni t rocelulosa (GE Healthcare Life Sciences) pre-humedecidas con Tris-HCl 20 mM, pH 7.5, NaCl 0.8%, (TBS) utilizando un aparato de transferencia por puntos operado a vacio (96 pozos; Bio-Rad) . Las transferencias por puntos fueron preparadas en lotes de ocho membranas cada uno, que fueron luego secados y almacenados a 4SC por no más de dos semanas antes del uso. Los antisueros para el análisis de transferencia por puntos fueron purificados por afinidad sobre minicolumnas de proteína (Diatheva) siguiendo las estructuras del fabricante. Después de la determinación de la concentración de la inmunoglobul ina con el método de colorante de Coomassie, las inmunoglobul inas purificadas fueron utilizadas para los ensayos de transferencia por puntos, a una concentración final de 0 . 7 5 µg/ l . Después del bloqueo a temperatura ambiente con leche en polvo descremada al 5 % en TBS suplementada con 0 . 0 5 % de Tween 2 0 ( TBS ) , las transferencias fueron incubadas por 1 . 5 horas con cada uno de los tres anticuerpos primarios para Trx ?ß 1 - 1 5 en leche deshidratada-TBS , lavados 3 veces por 1 0 minutos con TBST, seguido por la detección de inmunoglobul ina de ratón con el equipo SuperSignal West Femto kit (Pierce) como es especificado por el fabricante. Tres replicas técnicas independientes fueron llevadas con los antisueros desde el combinado respondedor superior en cada grupo.

EJEMPLO 2 Evaluación de los efectos ant i -Trx ( ?ß?—15 ) 4 ?? vivo sobre la patología ß-amllolde cerebral en ratones transgénicos Tg2576 adultos Métodos Ratones transgénicos hembras AD (Tg2576) que expresan la mutación Sueca (Swedish) de APP (1) humano fueron obtenidos de la colonia de ratones del Centro de la enfermedad de Alzheimer de la Universidad de Boston. Los fundadores para esta colonia fueron proporcionados por el Dr. aren Hsiao-Ashe (Departamento de Neurología, Escuela de Medicina de la Universidad de Minnesota) . Los ratones APP Tg2576 desarrollan anormalidades conductuales y muestran evidencia histológica de depósitos de ?ß cerebrales como placas, junto con la astrogliosis asociada, desde tan tempranamente como los 8 meses. Los ratones fueron genotipificados utilizando un ensayo de PCR estandarizado sobre ADN de cola y fueron alojados cuatro en cada jaula bajo condiciones estándares con acceso ad libitum al alimento y agua. Seis ratones APP de 14 meses de edad (32-34 g cada uno) , colocados en un esquema de 12 horas de luz, fueron utilizados para las cirugías. Los ratones fueron anestesiados con clorhidrato de cetamina/xilazina como una inyección intraperi toneal (100 mg/kg de cetamina y 10 mg/kg de xilazina; 100 µ1/10 g de peso corporal) y fueron colocados en un aparato es tereotáxico (Koph) con un adaptador de cabeza de ratón. La termorregulación fue mantenida a 37SC utilizando una almohadilla de calentamiento con monitoreo respiratorio a todo lo largo del procedimiento. El cuero cabelludo fue extirpado en la línea intermedia para exponer la sutura sagital y las coordenadas es tereotáxicas en ambos hemisferios fueron determinadas (2) . El bregma fue utilizado como punto de referencia (2.0 mm) y fueron perforados orificios en la calva en la unión de las coordenadas lateral izquierda y derecha (1.75 mm) . Los anticuerpos anti-Trx ( ?ß1-15 ) 4 purificados por afinidad junto con las pseudo- inmunoglobul inas provenientes de ratones tratados con PBS (2 µ? cada uno) fueron estereotáxicamente inyectadas en el hipocampo izquierdo y derecho (2.0 mm ventral), respectivamente, utilizando una jeringa de 10 µ? con punta roma (Hamilton) . Después de la colocación de la jeringa existió un tiempo de residencia de 2 minutos, seguido por un tiempo de inyección de 4 minutos y un tiempo de residencia adicional de 2 minutos antes del retiro de la jeringa. Se aplicó un antiséptico tópico conforme era cerrada la incisión, utilizando una autopinza de 9 mm . Los ratones fueron mantenidos sobre una almohadilla caliente hasta la recuperación completa. Todos los experimentos en animales fueron realizados de acuerdo con los Institutos Nacionales de Guía para la Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y la Administración de Veteranos y Comités de Cuidado de Animales de la Universidad de Boston. Siete días después de la inyección, los ratones fueron profundamente anestesiados y transcardiacamente prefundidos con paraf ormaldehí do amortiguado al 2% (100 mi) . Los cerebros fueron post-fijados por 2 horas, crioprotegidos en una serie graduada de glicerol y subsecuentemente seccionados congelados (50 µp?) . Secciones tisulares de ratón cortadas en serie fueron teñidas para la sustancia de Nissl, inmunoteñidas con anticuerpos 3 ? ? ?-?ß42 (cat. No. 344; Biosource Internacional) , anti-oligómero ?ß (All; Biosource International) y para la proteína del antígeno fibrilar glial (GFAP; Dako) , y teñidos con plata utilizando el método de Campbell-Swi tzer para la identificación de las placas ?ß maduras. Secciones tisulares coronales inmunoteñidas de ?ß42 cortadas en serie, dentro del hipocampo comenzando desde Interaural : 1.68 mm/Bregma : -2.12 mm hasta Interaural : 2.16 mm/Bregma: -1.64 mm fueron cuantitativamente analizados. Las placas positivas a ?ß42 fueron cuant i f i cadas a partir de imágenes de alta resolución de las mismas áreas cerebrales dentro del hemisferio tratado con anti-Trx ( ?ß1-15 ) 4 y el hemisferio tratado con PBS , contralateral utilizando los programas de software BioVision (3) y Neurolucida ( icroBrightField, Williston, VT) . BioVision se diferencia y cuenta las placas del neuropilo de fondo o antecedente, mientras que Neurolucida extrae los datos de las imágenes de BioVision, exportándolas a Excel (Microsoft, Redmond, WA) para el análisis estadístico . Resultados El potencial inmunoterápico de anti-Trx (?ß?-15)4 fue evaluado enseguida al inyectar es terotáxicamente este anticuerpo en el hipocampo de ratones transgénicos AD de 14 meses de edad APP (Tg2576) . Las inmunogl obul inas pseudo provenientes de ratones tratados con PBS únicamente, inyectados dentro del hemisferio contralateral, sirvieron como un control interno para este experimento. Siete días después de la inyección, el examen hi s t opa t ológi co reveló una reducción marcada de la inmunotinción de ?ß en el hipocampo, y pasando por encima de la neocorteza de ratones que reciben el anticuerpo anti-Trx ( ?ß 1 - 15 ) 4 , en contraste al hemisferio pseudo-inyectado. Las placas positivas a ?ß estuvieron no solamente presentes en el sitio de la inyección, sino que disminuyeron significativamente dentro de la penumbra de la inyección (2 mm ant er i or /pos t er i or al sitio de la inyección) . Esto sugiere que no solamente las fibrillas y los oligómeros pequeños, sino también los oligómeros de más alto orden son dirigidos in vivo por el anticuerpo anti-Trx (?ß1-15 ) 4. Con el fin de verificar que estos hallazgos no fueran el resultado de una competencia entre el anticuerpo anti-Trx (?ß?-15)4 y el anticuerpo primario anti-?ß, se realizaron análisis histopatologicos alternativos utilizando la inmunot inción de la proteína del antígeno fibrilar glial (GFAP) y tinción de plata Campbell-Switzer para detectar la astrogliosis y las placas de ?ß . Las placas de astrogliosis asociadas a la glia fueron marcadamente reducidas dentro de la penumbra de inyección del anticuerpo anti-Trx (?ß1-15 ) 4 en comparación al hemisferio pseudo- inyectado , contralateral . Además, como fue revelado por la tinción con plata Campbell-Switzer, existieron mucho

Claims (36)

1. menos placas en el hemisferio inyectado con anti-Trx(A i-15)4 en comparación al hemisferio pseudo-inyectado. Ambas observaciones son consistentes con los datos de inmunot inción obtenidos con la detección del anticuerpo anti-?ß. Desde un punto de vista cuantitativo, en comparación al hemisferio tratado con PBS, existió una reducción significativa en el número de placas positivas a ?ß42 en el hemisferio tratado con anti-Tr ( ?ß1-15 ) 4 (hemisferio tratado con PBS: 3.34 x 103 ± 0.58; hemisferio tratado con anti-Trx (?ß? -15 ) 4 : 0.97 x 103 ± 0.27, P<0.01) . Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invenc i ón.
2. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Una construcción inmunogénica , caracterizada porque comprende un portador, el portador posee al menos un fragmento de ?ß42 dentro de su sitio de bucle activo. 2. La construcción inmunogéni ca de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el portador es t iorredoxina .
3. 3. La construcción inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el fragmento de ?ß42 es enlazado al portador por medio de un ligador de aminoácido.
4. 4. La construcción inmunogénica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque al menos un fragmento ?ß42 es un fragmento N-terminal de menos de 30 residuos de aminoácidos, preferentemente seleccionado del grupo que consiste de ?ß?-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-13, 1-14, 1-15.
5. 5. La construcción inmunogénica de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque al menos un fragmento ?ß42 es ?ß1-15.
6. 6. La construcción inmunogénica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el fragmento de ?ß1-15 es enlazado a la tiorredoxina por medio de un ligador de aminoácido.
7. 7. La construcción inmunogénica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el ligador de aminoácido es Gly-Gly-Pro.
8. 8. La construcción inmunogénica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la tiorredoxina posee más de un fragmento ?ß?-15.
9. 9. La construcción inmunogénica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la tiorredoxina posee 4 a 16 fragmentos ?ß?-15.
10. 10. La construcción inmunogénica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la tiorredoxina posee cuatro fragmentos ?ß1-15 (Trx (?ß1-15) 4) ·
11. 11. La construcción inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizada porque cada fragmento de ?ß1-15 es enlazado a la tiorredoxina por medio de un ligador de aminoác ido .
12. 12. La construcción inmunogénica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el ligador de aminoácido es Gly-Gly-Pro.
13. 13. Una composición farmacéutica para el uso como una vacuna terapéutica contra enfermedades amiloidogénicas , caracterizada porque comprende una construcción inmunogénica que incluye un portador, el portador posee al menos un fragmento de ?ß42 dentro de su sitio de bucle activo.
14. 14. La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el portador es t iorredoxina .
15. 15. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el fragmento de ?ß42 es enlazado al portador por medio de un ligador de aminoácido.
16. 16. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque al menos un fragmento de ?ß42 es un fragmento N-terminal de menos de 30 residuos de aminoácidos, preferentemente seleccionado del grupo que consiste de ?ß1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-13, 1-14, 1-15.
17. 17. La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque al menos un fragmento de ?ß42 es ?ß1-15.
18. 18. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el fragmento de ?ß1-15 es enlazado a la tiorredoxina por medio de un ligador de aminoácido.
19. 19. La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el ligador de aminoácido es Gly-Gly-Pro.
20. 20. La composición de conformidad con la reivindicación 17, carac erizada porque la tiorredoxina posee más de un fragmento de ?ß1-15.
21. 21. La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque la tiorredoxina posee 4 a 16 fragmentos ?ß1-15.
22. 22. La composición de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la tiorredoxina posee 4 fragmentos ?ß1-15.
23. 23. La composición de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque cada fragmento ?ß1-15 es enlazado a la tiorredoxina por medio de un ligador de aminoácido.
24. 24. La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el ligador de aminoácido es Gly-Gly-Pro.
25. 25. La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque comprende además un adyuvante.
26. 26. La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque el adyuvante se selecciona del grupo que consiste de monofos fori 1 -lípido A 3 -des-O-acilado (MPL), la saponina QS21, el muramil-di-péptido o una sal de aluminio.
27. 27. La composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la sal de aluminio se selecciona del grupo que consiste de hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y sulfato de aluminio .
28. 28. Un anticuerpo monoclonal, caracterizado porque reconoce la construcción inmunogénica de conformidad con las reivindicaciones 1 a 12.
29. 29. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la construcción inmunogénica es Trx ( ?ß 1 - 15 ) .
30. 30. Un agente terapéutico para prevenir o tratar una enfermedad ami loidogéni ca , caracterizado porque comprende el anticuerpo monoclonal de conformidad con las reivindicaciones 28 ó 29, como un ingrediente activo.
31. 31. El agente terapéutico de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la enfermedad amiloidogénica es la enfermedad de Al zheimer .
32. 32. Un método para preparar una construcción inmunogénica que incluye un portador, el portador posee al menos un fragmento de ?ß42 dentro de su sitio de bucle activo, caracterizado porque comprende : i) amplificar el portador en una bacteria adecuada, ii) insertar el portador en un vector adecuado, el vector comprende un promotor de T7 para la expresión de la prote na a todo lo largo del sistema de pET; iii) preparar un inserto de ADN del fragmento de ?ß; iv) restringir y ligar el portador-vector y el inserto de ADN del fragmento de ?ß .
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el portador es t iorredoxina .
34. 34. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la bacteria es E . col i .
35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 32 , caracterizado porque el vector es pT7Kan-Trx.
36. 36. La construcción inmunogénica , caracterizada porque es obtenida mediante el método de conformidad con la reivindicación 32.