MX2008009792A

MX2008009792A - Construccion de anticuerpo de dominio.

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Publication number: MX2008009792A
Application number: MX2008009792A
Authority: MX
Inventors: Benjamin P Woolven; Ian M Tomlinson; Anthony Gerard Doyle; Jennifer A Lee; Philip Anthony Jennings
Original assignee: Arana Therapeutics Ltd
Priority date: 2006-02-01
Filing date: 2007-02-01
Publication date: 2008-09-01
Also published as: KR20090039666A; EA017417B1; US20110044979A1; EP1987064A1; CA2640661A1; CN101400703B; JP2009525031A; US20070202105A1; AU2007211829B2; CN103232540A; CN101400703A; AU2007211829A1; US7846439B2; AU2007211829C1; WO2007087673A1; JP5259423B2; BRPI0707425A2; EA200870208A1; NZ569988A; EP1987064A4

Abstract

La presente invención proporciona una construcción de anticuerpo de dominio que enlaza a TNF-a humano, la construcción que comprende: (a) un anticuerpo de dominio (dAb) que enlaza a TNF-a humano; (b) una secuencia de región de articulación modificada; (c) una secuencia de región constante de cadena pesada de humano o de primate que tiene un dominio CH1 truncado de no más de 20 residuos, en donde la secuencia de región de articulación modificada contiene ya sea una supresión o una sola sustitución de aminoácido de por lo menos un residuo de cisteína que normalmente facilita la formación de enlace de disulfuro entre las cadenas de anticuerpo pesada y ligera.

Description

CONSTRUCCIÓN DE ANTICUERPO DE DOMINIO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a una construcción de anticuerpo de dominio útil para terapia humana. Más particularmente, la presente invención se relaciona a una construcción de anticuerpo de dominio que enlaza a TNF-a humano y su uso en el tratamiento de desórdenes caracterizados por actividad de TNF-a. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El factor de necrosis de tumor alfa (TNF- ) es una citoquina que se ha implicado en mediar el choque y la patofisiologia de una variedad de enfermedades y desórdenes humanos que incluyen sepsis, infecciones, enfermedades autoinmunes, por ejemplo, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa y otras condiciones del intestino, psoriasis, choque tóxico, rechazo de trasplante y enfermedad de injerto contra el hospedero. TNF-a se produce principalmente por macrófagos activados y linfocitos T, pero también por neutrófilos, células endoteliales, queratinocitos y fibroblastos durante las reacciones inflamatorias agudas. Debido a su función en la inflamación, TNF-a ha emergido como un objetivo importante para la inhibición en esfuerzos para reducir los síntomas de desórdenes inflamatorios. Varios procedimientos para la inhibición de TNF-a para el tratamiento clínico de enfermedad se han propuesto, incluyendo particularmente el uso de receptores de TNF- solubles y anticuerpos específicos para TNF-a. Anticuerpos de dominio Los anticuerpos de dominio (dAb) son las unidades de enlace de funcionamiento más pequeñas de anticuerpos y corresponden a las regiones variables de las cadenas ya sea pesada (VH) o ligera (VL) de anticuerpos. Los anticuerpos de dominio tienen un peso molecular de aproximadamente 13 kDa, o menor que un décimo del tamaño de un anticuerpo completo. En contraste a los anticuerpos convencionales, los anticuerpos de dominio son bien expresados en sistemas bacterianos, de levadura y mamíferos. Su tamaño pequeño permite cantidades molares más altas por gramo de producto, proporcionando de esta manera un incremento significante en la potencia por miligramo de dosis. Además, los dAbs se pueden utilizar como bloques de construcción para crear productos terapéuticos tales como múltiples moléculas que contienen dAb de dirección en las cuales dos o más dAbs enlazan a dos o más objetivos moleculares distintos, o dAbs pueden ser incorporados en estructuras diseñadas para administración pulmonar u oral. Los presentes inventores ahora han ideado una construcción de anticuerpo de dominio novedosa que comprende un dominio variable de inmunoglobulina enlazado a una región constante que incluye un dominio CH1 truncado. Se postula que la inclusión de una región constante ayudará a prolongar la vida media in vivo de dAb que es típicamente de una duración corta. Inmunoglobulina de Primate del Nuevo Mundo Los primates evolucionariamente distantes, tales como primates del Nuevo Mundo son suficientemente similares al humano por tener anticuerpos similares a anticuerpos humanos de modo que el hospedero no genera una respuesta inmune de anti-anticuerpo cuando tales anticuerpos derivados de primates se introducen en un humano. Los primates del Nuevo Mundo ( infraorden-Platyrrhini ) comprenden por lo menos 53 especies comúnmente divididas en dos familias, la .Callithricidae y Cebidae. La Callit ricidae consiste de titís y tamarinos. La Cebidae incluye el mono ardilla, mono tití, mono araña, mono lanudo, capuchino, mono nocturno o trasnochador y el mono aullador. Estudios previos han caracterizado el repertorio de cadena pesada de inmunoglobulina expresado del tití Callithrix jacchus (von Budingen 11-C y colaboradores, Characterizat ion of the expressed immunoglobulin IGHV repertoire in the New World marmoset Callithrix jacchus. Immunogenetics ; 53:557-563 (2001)). Seis subgrupos IGHV se identificaron los cuales mostraron un alto grado, de similitud de secuencia a sus contrapartes de IGHV humanos. Las regiones de estructura fueron más conservadas cuando se comparan con las regiones de determinación de complementariedad (CDRs), con el grado más grande de variabilidad localizado en CDR3. El grado de similitud entre C. jacchus y las secuencias IGHV humanas fue menor que entre los monos del Viejo Mundo y los humanos . BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la presente invención proporciona una construcción de anticuerpo de dominio que enlaza a TNF-a humano, la construcción que comprende: (a) un anticuerpo de dominio (dAb) que enlaza a TNF-a humano (b) una secuencia de región de articulación modificada ; (c) una secuencia de región constante de cadena pesada de humano de primate que tiene un dominio CH1 truncado de no más de 20 residuos, más de preferencia no más de 10 residuos, todavía más de preferencia no más de 5 residuos y aun más de preferencia un solo residuo; en donde la secuencia de región de articulación modificada contiene ya sea una supresión o una sola sustitución de aminoácidos del residuo de cisteína que normalmente facilita la formación de enlace de disulfuro entre las cadenas de anticuerpo pesada y ligera. En un segundo aspecto la presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción de anticuerpo de dominio del primer aspecto de la invención. En un tercer aspecto la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia que codifica una construcción de anticuerpo de dominio que enlaza TNF-a humano, en donde la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico por lo menos 60%, de preferencia por lo menos 80% idéntica, más de preferencia por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 50 o SEQ ID No: 51 y mucho más de preferencia, la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 50 o SEQ ID No: 51. En un cuarto aspecto la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia que codifica una construcción de anticuerpo de dominio que enlaza TNF-a humano, en donde la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que híbrida bajo condiciones de alta severidad a la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID No: 50 o SEQ ID No: 51. En un quinto aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de la construcción de anticuerpo de dominio de acuerdo con el primer aspecto, junto con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona el uso de la construcción de anticuerpo de dominio de acuerdo con el primer aspecto de la invención en una aplicación de diagnóstico para detectar TN F-a humano. En un séptimo aspecto, la invención proporciona un método para tratar un desorden caracterizado por actividad de TN F- OÍ humano en un sujeto humano, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica de acuerdo con el segundo aspecto de la invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID No: 5) y secuencia de nucleótidos (SEQ ID No: 6) del dAb aceptor. La Figura 2 muestra la estructura de la modalidad preferida de la construcción de anticuerpo de dominio de acuerdo con la presente invención como (A) un monómero y (B) un dimero. La Figura 3 muestra las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de segmentos del gen VK de once (11) titís y seis (6) monos trasnochadores. La Figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos y de nucleótidos del dAb aceptor (ambas hebras) . Los sitios de digestión de restricción para Kpn I y San DI que extirpa la región que incluye la C DR2 se indica en la figura. Los residuos C DR2 removidos se indican en subrayado.

La Figura 5 muestra la habilidad del Compuesto 170 (SEQ ID No: 11) para neutralizar la citotoxicidad mediada por TNF-a en un ensayo de viabilidad de células L929 de murino. La Figura 6 muestra que el Compuesto 170 (SEQ ID No: 11) previene la interacción de TNF-a con los receptores de TNF p55 o p75 humanos. La Figura 7 muestra el manchado del Compuesto 170 (SEQ ID No: 11) de células NSO 27D4 que expresan TNF-a de transmembrana (linea negra sólida) que muestra la intensidad de fluorescencia más alta que el control igualado de isotipo de especificidad irrelevante (relleno gris). La Figura 8 muestra el Compuesto 170 (SEQ ID No: 11) producido en un sistema de expresión bacteriano retenido que enlaza a TNF-a en un ELISA. La Figura 9 muestra la eficacia del Compuesto 170 (SEQ ID No: 11) en un modelo de artritis de murino mediado por TNF relativo con IgGi humano de control de especificidad. En intervalos semanales los ratones se registraron (registro artrítico), A, y se pesaron, B. La Figura 10 muestra el efecto sobre la expresión de proteína del Compuesto 112 (SEQ ID No: 59) y el Compuesto 170 (SEQ ID No: 11) . La Figura 11 muestra el análisis de SDS PAGE de no reducción del Compuesto 170 purificado de Proteína A (SEQ ID No: 11) de 4 x 10 L fermentaciones de la línea de células guia; franja 1 = control de inter-ensayo; franja 2 marcadores de peso molecular; franja 3 = blanco; franja 4 = Compuesto 170 purificado de proteina A (SEQ ID No: 11) en 10L de fermentación ID (corrida 1); franja 5 = Compuesto 170 purificado de Proteina A en 10L de fermentación ID (corrida 2); franja 6 = Compuesto 170 purificado de Proteina A en 10L de fermentación ID (corrida 3); franja 7 = Compuesto 170 purificado de Proteina A en 10L de fermentación ID (corrida 4) . La Figura 12 muestra el análisis de SDS PAGE de reducción del Compuesto 170 Purificado de Proteina A (SEQ ID No: 11) de A x 10L fermentaciones de la linea de células guia; franja 1 = control de inter-ensayo; franja 2 marcadores de peso molecular; franja 3 = blanco; franja 4 = Compuesto 170 purificado de Proteina A (SEQ ID No: 11) en 10L de fermentación ID (corrida 1) ; franja 5 = Compuesto 170 purificado de Proteina A en 10L de fermentación ID (corrida 2); franja 6 = Compuesto 170 purificado de Proteina A en 10L de fermentación ID (corrida 3) ; franja 7 = Compuesto 170 purificado de Proteina A en 10L de fermentación ID (corrida 4) . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los presentes inventores han generado una construcción de anticuerpo de dominio que enlaza a TNF-a humano y que se postula para exhibir baja inmunogenicidad cuando se administra a humanos. La construcción de anticuerpo de dominio comprende una porción correspondiente a un dominio variable de una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina (es decir, un anticuerpo de dominio (dAb) ) , una región de articulación y una porción correspondiente a una región constante de una cadena pesada de anticuerpo pero en donde la región constante tiene un dominio CH1 truncado. La inclusión de la porción de región constante se postula para incrementar la vida media in vivo del .dAb asi como proporcionar funciones efectoras que se creen que son un componente del mecanismo anti-inflamatorio de los anticuerpos anti-TNF. En un primer aspecto, la presente invención proporciona una construcción de anticuerpo de dominio que enlaza a TNF- humano, la construcción que comprende: (a) un anticuerpo de dominio (dAb) que enlaza a TNF-a humano (b) una secuencia de región de articulación modificada (c) una secuencia de región constante de cadena pesada de humano de primate que tiene un dominio CH1 truncado de no más de 20 residuos, más de preferencia no más de 10 residuos, todavía más de preferencia no más de 5 residuos y aun más de preferencia un solo residuo; en donde la secuencia de región de articulación modificada contiene ya sea una supresión o una sola sustitución de aminoácido del residuo de cisteina que normalmente facilita la formación de enlace de disulfuro entre las cadenas y anticuerpo pesada y ligera. En una modalidad preferida la secuencia del dominio CH1 y la región de articulación es XEPKSZDKTI ITCPPCPA en donde X es valina, leucina o isoleucina y Z es está ausente o un aminoácido diferente de cisteina. Se prefiere que X sea valina y X sea serina. En una modalidad preferida de la presente invención el dAb comprende un dominio variable de cadena pesada o ligera de inmunoglobulina, en donde el dominio variable comprende por lo menos una región de determinación de complementariedad (CDR) que tiene una secuencia derivada de un primate del Nuevo Mundo en donde la CDR se selecciona del grupo que consiste de YAATKLQS (SEQ ID No: 1), YEASSLQS (SEQ ID No: 2), YEASKLQS (SEQ ID No: 3) y YSASNLET (SEQ ID No: 4). En otra modalidad preferida la CDR es CDR2. En una modalidad preferida el dAb tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: DIQ TQSPSSI^ASVGDRVTITGRASQSmSYLHWYQQKPG AP LLIYSASNLETG WSRFSGSGSGTDÍ LI ISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGT VEIKR ( Compuesto 145; SEQ ID No:7) DIQMTQSPSSUSASVGDRVTH'CRASQAJroSYLHWYQQKPG APKLLIYSASiNLRT GWSRFSGSGSGTDPJ'L'Í^SSLQPEDFATYYCQQVVWRPFIPGQGTKVEI R (Compuesto 123; SEQ 113 No:fi) DIQMTQSFSSLSAS VOD VIT irRASQSroS\OHWYQQ PGKAPKLLIYSASNLETG VPSRFSGSGSGTDFTLT1SSIJ.PK FATYYCQQVVWRPFTFGQGT VÉIKR (Compuesto 100; SEQ 1D No:S)) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAroSYLH QQlO^l^KLLr^SASNLET GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLJPEDFATni^QQVVWRPFTFGQGTKVEIKR (Compuesto 196; SEQ1D No: 10) DIQMTQSPSS1 ^ AS VGDRVTITCRASQSmS Y LHW YQQ PGKPPKLLIYS AS N LETG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGT VEIKR (Compuesto (34; SEQ ID No:52) DIQ^QSPSSLSASVGDRVTITCRASQSTDSYLVlWYQQKPGKlAPKLLrySASNI-ETG VPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFA'n'YCQQVVWRPFTFGQGTKVEÍ R (Compuesto 137; SEQ ID No:53) DIQhíTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSÍDSYLriWYQQ PG APKLLIYSASNLETG VPSRFSGSGSa'rDFTLTlSSLVPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGT VEIKR (Compuesto 121; ; SEQ ID No:54); y una secuencia por lo menos 95%, más de preferencia por lo menos 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una de estas secuencias. En una modalidad preferida adicional la región constante comprende los dominios CH2 y CH3 que con untamente tienen la siguiente secuencia: PEl GGPSVFLFPPKPKDTI-MíSRTPEVTCV DVS IEDPEV P \\? GVEVH I AKT PREEQYNSTY VVSVLTVLHQDWL GKEYKCKVSN ALPAPIE TISKAKG QPREPQVYTLPPSRDELT NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY TTPPV LDS DGSFFL YSKLTVD SRWQQGN V FSCS VMHEALHNHYTQ KSI-SLSPGK; (SEQ ID NO:63) o una secuencia aminoácidos que es por lo menos 60%, de preferencia por menos 80% idéntica, más de preferencia por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la misma. En otra modalidad preferida la construcción de anticuerpo de dominio comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 60%, de preferencia por lo menos 80% idéntica, más de preferencia por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 11, y mucho más de preferencia la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 11. El término "enlaza a" como se utiliza en la presente, se propone para referirse al enlace de un antigeno por una región variable de inmunoglobulina con una constante disociación (Kd) de 1 µ? o inferior como es medido mediante el análisis de resonancia de plasmón de superficie usando, por ejemplo, un sistema de resonancia de plasmón de superficie BIAcore™ y el software de evaluación cinética BIAcore™ (por ejemplo, versión 2.1). La constante de afinidad o disociación (Kd) para una interacción de enlace especifica es de preferencia aproximadamente 500 nM o inferior, más de preferencia aproximadamente 300 nM o inferior y de preferencia por lo menos 300 nM a 50 pM, 200 nM a 50 pM y más de preferencia por lo menos 100 nM a 50 pM, 75 nM a 50 pM, 10 nM a 50 pM. El término "dAb" como se utiliza en la presente se refiere a un polipéptido de dominio variable individual de anticuerpo (VH o VL) que específicamente enlaza antígeno. En una modalidad preferida adicional de la presente invención la construcción de anticuerpo de dominio forma un homo- o heterodimero con otra construcción de un anticuerpo de dominio de acuerdo con la presente invención. La dimerización puede incrementar la intensidad de enlace de antigeno, en donde la intensidad de enlace se relaciona a la suma de las afinidades de enlace de los múltiples sitios de enlace. Para facilitar la formación de dimero, la región de articulación de la construcción de anticuerpo de dominio comprende por lo menos uno y de preferencia dos, residuos de cisteina . En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, la construcción de anticuerpo de dominio forma un homodimero con una construcción de anticuerpo de dominio idéntica. Por consiguiente en otro aspecto de la presente invención proporciona una construcción de anticuerpo de dominio dimérico que enlaza a TNF-a humano en donde el dimero consiste de dos construcciones de anticuerpo de dominio de acuerdo con la presente invención. Se prefiere que la construcción de anticuerpos de dominio dimérico sea un homodimero y es particularmente preferido que las construcciones de anticuerpo de dominio constituyen el homodimero comprenden una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 60%, de preferencia por lo menos 80% idéntica, más de preferencia por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 11, y mucho más de preferencia la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 11. En un segundo aspecto la presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción de anticuerpo de dominio del primer aspecto de la invención. En un tercer aspecto la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia que codifica una construcción de anticuerpo de dominio que enlaza TNF-a humano, en donde la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico por lo menos 60%, de preferencia por lo menos 80% idéntica, más de preferencia por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 50 o SEQ ID No: 51 y mucho más de preferencia, la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 50 o SEQ ID No: 51. En un cuarto aspecto la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia que codifica una construcción de anticuerpo de dominio que enlaza TNF- humano, en donde la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que híbrida bajo condiciones de alta severidad a la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID No: 50 o SEQ ID No: 51.

En la determinación de si o no dos secuencias de polipéptido caen dentro de los limites de porcentaje de identidad, aquellos expertos en la técnica estarán consientes que es necesario conducir una comparación de lado por lado o múltiple alineación de secuencias. En tales comparaciones o alineaciones, las diferencias surgirán en el posicionamiento de residuos no idénticos, dependiendo del algoritmo utilizado para realizar la alineación. En el presente contexto, la referencia a un "porcentaje de identidad" o "similitud" entre dos o más secuencias de aminoácidos serán tomadas para referirse al número de residuos idénticos o similares respectivamente, entre las secuencias como es determinado utilizando cualquier algoritmo estándar conocido para aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, las identidades o similitudes de secuencia de aminoácidos se pueden calcular utilizando el programa GAP y/o alinear utilizando el programa PILEUP del Computer Genetics Group, Inc., University Research Park, Madison. Wisconsin, United States of America (Devereaux y colaboradores, 1984). El programa GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) para maximizar el número de residuos idénticos/similares y para minimizar el número y longitud de espacios de secuencia en la alineación. Alternativamente o además, en donde más de dos secuencias de aminoácido están siendo comparadas, se utiliza el programa Clustal W de Thompson y colaboradores (1994).

En la determinación de si o no dos secuencias de nucleótido están dentro de estos limites de porcentaje, aquellos expertos en la técnica estarán consientes que es necesario conducir una comparación de lado por lado o múltiple alineación de secuencias. En tales comparaciones o alineaciones, las diferencias pueden surgir en el posicionamiento de residuos no idénticos, dependiendo del algoritmo utilizado para realizar la alineación. En el presente contexto, la referencia a un porcentaje de identidad entre dos o más secuencias de nucleótidos deben ser tomadas para referirse al número de residuos idénticos entre las secuencias domo es determinado utilizando cualquier algoritmo estándar conocido para aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos pueden ser alineadas y su identidad calculada utilizando el programa BESTFIT u otro programa apropiado del Computer Genetics Group, Inc., University Research Park, Madison, Wisconsin, United States of America (Devereaux y colaboradores, Nucí. Acids Res., 12: 387-395, 1984) . Alta severidad de preferencia involucra hibridación bajo condiciones de 65°C y O.lxSSC { lxSSC = NaCl 0.15 M, Citrato de Na3 0.015 M pH 7.0}. En una modalidad, la invención además está basada sobre un método para la amplificación de genes de región variable de inmunoglobulina de primate del Nuevo Mundo, por ejemplo mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR) del ácido nucleico extraído de linfocitos de primate del Nuevo Mundo utilizando cebadores específicos para las familias de genes de región variable de cadena pesada y ligera. Por ejemplo, la información que considera los límites de los dominios variables de los genes de cadena pesada y ligera (VH y VL respectivamente) se puede utilizar para diseñar cebadores de PCR que amplifican el dominio variable de una secuencia de codificación de cadena pesada o ligera que codifica un anticuerpo conocido para enlazar un antígeno dado. La región variable amplificada luego se inserta ya sea sola o como una función con otra secuencia de polipéptido para la secuencia de región constante humana o de primate de la invención en un vector de expresión adecuado para la producción de la construcción de anticuerpo de dominio de la invención. Los vectores de expresión adecuados serán familiares para aquellos expertos en la técnica. El repertorio de dominios de VH, VL y de región constante puede ser un repertorio que ocurre naturalmente de secuencias de inmunoglobulina o un repertorio sintético. Un repertorio que ocurre naturalmente es uno preparado, por ejemplo, de células que expresan inmunoglobulina recolectada de uno o más primates. Tales repertorios pueden ser naive es decir preparados de células que expresan inmunoglobulina recién nacidas, o rearregladas , es decir, preparadas de, por ejemplo, células B de primate adulto. Si es deseado, los clones identificados de un repertorio natural, o cualquier ¦repertorio que enlaza el antigeno objetivo luego se someten a mutagénesis y clasificación adicional con el fin de producir y seleccionar variantes con características de enlace mejoradas. Los repertorios sintéticos de dominios variables de inmunoglobulina individuales se preparan al introducir artificialmente diversidad en un dominio variable clonado. Un repertorio de dominio VH y VL se puede clasificar para la especificidad de enlace deseada y el comportamiento funcional mediante, por ejemplo, la exhibición de fago. Los métodos para la construcción de librerías de exhibición de bacteriófago y librerías de expresión de lambda fago son bien conocidos en la técnica. La técnica de exhibición de fago se ha descrito extensivamente en la técnica y ejemplos de métodos y compuestos para generar y clasificar tales librerías y maduración por afinidad de los productos de estos se pueden encontrar _ en, por ejemplo, Barbas y colaboradores, (1991) PNAS 88:7978-7982; Clarkson y colaboradores (1991) Nature 352:624-628; Dower y colaboradores, PCT . 91/17271, patente norteamericana No. 5,427,908, patente norteamericana No. 5,580,717 y EP 527,839; Fuchs y colaboradores, (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Garrad y colaboradores, (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Garrard y colaboradores, PCT O 92/09690; Gram y colaboradores, (1992) PNAS 89:3576-3580; Griffiths y colaboradores, (1993) EMBO J 12:725-734; Griffiths y colaboradores, patente norteamericana No. 5,885,793 y EP 589,877; Hawkins y colaboradores, (1992) J Mol Biol 226:889-896; Hay y colaboradores, (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Hoogenboom y colaboradores, (1991) Nuc Acid Res 19: 133- 137; Huse y colaboradores, (1989) Science 246:1275-1281 ; Knappik y colaboradores, (2000) J Mol Biol 296:57-86; Knappik y colaboradores, PCT WO 97/08320; Ladner y colaboradores, patente norteamericana No. 5,223,409, No. 5,403,484, No. 5,571,698, No. 5,837,500 y EP 436,597; McCafferty y colaboradores, (1990) Nature 348:552-554; McCafferty y colaboradores, PCT. WO 92/01047, patente norteamericana No. 5,969,108 y EP 589,877; Salfeld y colaboradores, PCT WO 97/29131, solicitud provisional norteamericana No. 60/126,603; y Winter y colaboradores, PCT WO 92/20791 y EP 368,684. Las librerías recombinantes que expresan repertorios de dominios de VH y VL se pueden expresar sobre la superficie de microorganismos, por ejemplo levadura o bacteria (ver las publicaciones de PCT WO 99/36569 y 98/49286) . La construcción de anticuerpo de dominio de la invención se puede producir por medios recombinantes, incluyendo de sistemas de expresión eucarióticos ' que incluyen, por ejemplo, células de levadura, planta superior, insecto y de mamífero, así como sistemas de expresión de hongos y viralmente codificados, como es descrito en la presente como es conocido en la técnica. Las construcciones de anticuerpo de dominio de la presente invención se pueden preparar utilizando un anticuerpo S que codifica ácido nucleico para proporcionar plantas transgénicas y células de plantas cultivadas (por ejemplo, pero no limitadas a tabaco y maíz) que producen tales construcciones en las partes de plantas o en células cultivadas a partir de las mismas. Como un ejemplo no limitativo, las hojas de tabaco transgénicas que expresan proteínas recombinantes se han utilizado exitosamente para proporcionar cantidades grandes de proteínas recombinantes, por ejemplo, utilizando un promotor inducible (ver, por ejemplo, Cramer y colaboradores, Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 1999) y referencias citadas en la misma. También, el maíz transgénico se ha utilizado para expresar proteínas mamíferas como niveles de producción comerciales, con actividades biológicas equivalentes a aquellas producidas en otros sistemas recombinantes o purificadas de fuentes naturales (ver, por ejemplo, Hood y colaboradores, Adv. Exp . Med. Biol. 464:127-147 1999 y referencias citadas en las mismas). Los anticuerpos también se han producido en grandes cantidades de semillas de plantas transgénicas incluyendo fragmentos de anticuerpo, tales como anticuerpos de cadena individual (scFv's), incluyendo semillas de tabaco y tubérculos de papa (ver, por ejemplo, Conrad y colaboradores, Plant Mol. Biol. 38:101-109 1998 y la referencia citada en la misma) . Asi, las construcciones de anticuerpo de dominio de la presente invención también se pueden producir utilizando plantas transgénicas , de acuerdo con métodos conocidos (ver también, por ejemplo, Fischer y colaboradores, Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 Octubre, 1999: Ma & Hein., Trends Biotechnol. 13:522-7 1995; Ma y colaboradores, Plant Physiol. 109:341-6 1995; Whitelam y colaboradores, Biochem. Soc. Trans . 22:940-944 1994; y referencias citadas en las mismas; cada una de las referencias anteriores se incorporan completamente en la presente por referencia) . Las construcciones de anticuerpo de dominio de la presente invención incluyen productos naturalmente purificados, productos de procedimiento sintéticos químicos y productos producidos mediante técnicas recombinantes de un hospedero eucariótico, incluyendo, por ejemplo, levadura, planta superior, células de insecto y mamíferas. Dependiendo del hospedero empleado en un procedimiento de producción recombinante , las construcciones de anticuerpo de la presente invención pueden ser glucosiladas o pueden ser no glucosiladas, con glucosiladas que son preferidas. Tales métodos son descritos en muchos manuales de laboratorio estándares Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989, Sections 17.37-17.42; Ausubel y colaboradores, eds . Current Protocols in Molecular Biology 1987-1993, Chapters 10, 12, 13, 16, 18 y 20, Colligan y colaboradores, Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y. 1997-2001, Protein Science, Chapters 12-14, todos incorporados completamente en la presente por referencia. En un sistema de expresión la librería de péptido/proteína recombinante se exhibe sobre ribosomas (por ejemplos ver Roberts, RW y Szostak, J.W. 1997 Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 94:12297-123202 y publicación de PCT No. WO98/3J700). Así otro ejemplo involucra la generación y transcripción in vitro de una librería de DNA (por ejemplo de anticuerpos o derivados de preferencia preparados de células inmunizadas, pero no así limitados, traducción de la librería tal que la proteína y los mRNAs "inmunizados" permanecen en ribosoma, selección de afinidad (por ejemplo, mediante el enlace a RSP) , aislamiento de mRNA, traducción inversa y amplificación subsecuente (por ejemplo, mediante reacción en cadena de polimerasa o tecnología relacionada) . Rondas adicionales de selección y una amplificación se pueden acoplar como sea necesario para la maduración de afinidad a través de la introducción de mutación somática en este sistema o por otros métodos de maduración de afinidad como es conocido en el estado de la técnica. Otro ejemplo observa la aplicación de la tecnología de compartimentalización de emulsión para la generación de los anticuerpos de dominio de la invención. En la compartimentalización de emulsión, los métodos de clasificación in vitro y ópticos se combinan con la co-compartimentali zación de la proteína traducida y su secuencia de codificación de nucleótidos en fase acuosa con una gotita de aceite en una emulsión (ver las publicaciones de PCT Nos. WO 99/026711 y WO 00/40712). Las secuencias de CDR se pueden obtener de varias fuentes, por ejemplo, bases de datos tales como las bases de datos de proteína y de nucleótidos de The National Centre for Biotechnology Information www . ncbi . nlm. nih . gov, The Kabat Datábase of Sequences of Proteins of Immunological Interest, ww . kabatdatabase . com, o la base de datos IMGT www . imgt . cines . fr . Alternativamente, las regiones CDR se pueden predecir del repertorio de dominio VH y VL (ver por ejemplo, Kabat EA y Wu TT Attempts to lócate complementarity determining residues in the variable positions of light and heavy chains. Ann. NY Acad. Sci. 190:382-393 (1971)). La secuencia CDR puede ser un DNA genómico o un cDNA. Existen un número de maneras en las cuales un CDR de reemplazo puede ser injertado en una secuencia de región variable y tales métodos serán familiares para aquellos expertos en la técnica. El método preferido de la presente invención involucra el ^reemplazo de CDR2 en la región variable (o dAb) por la vía de la mutagénesis dirigida de cebador. Este método consiste de recocer un oligonucleótido sintético que codifica una(s). mutación (es) deseada (s) a una región objetivo donde sirve como un cebador para la iniciación de síntesis de DNA in vitro, extendiendo el oligonucleótido por una DNA polimerasa para generar un DNA de doble hebra que lleva la mutación deseada, y ligar y clonar la secuencia en un rector de expresión apropiado. En una modalidad preferida de la presente invención, la secuencia CDR de primate del Nuevo Mundo se injerta en una secuencia de región variable que es de baja inmunogenicidad en humanos. Por referencia al término "baja inmunogenicidad" se propone que la construcción de anticuerpo de dominio o porción de enlace de antígeno de la misma, no eleva una respuesta de anticuerpo en un humano de magnitud suficiente para reducir la efectividad de . la administración continua de la construcción de anticuerpo de dominio durante un tiempo suficiente para lograr la eficacia terapéutica. De preferencia, la secuencia de región variable en la cual la CDR de primate del Nuevo Mundo se injerta es la "secuencia aceptora de dAb" (designada Compuesto 128), en la Figura 1. La secuencia aceptora de dAb consiste de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No: 5 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC ASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLL1YSASELQSG VPS B FS GS GSGTDFT1.TISSLQPEDFAT Y Y CQQV VWRPFTFGQGTKVEKR (SEQ ID No:5).

Esta secuencia es codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID No: 6: GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCÁ TCC TCT CTO TCT GCA TCT GTA GGA GAC CGT GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT GAT AGT TAT TTA CAT TGG TAC CAG CAG ??? CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT AGT GCA TCC GAO TTG CAA AGT CüG GTC CCA TCA CCT TTC AGT GGC ACT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCT ACG TAC TAC TG CAA CÁG GTT CTG TGG CGT CCT TTT ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGG (SEQ ID No:tf) En una modalidad preferida de la presente invención, una secuencia CDR de primate del Nuevo Mundo de titi YSASNLET (SEQ ID No: 4) se injerta en la secuencia aceptora dAb de región variable para reemplazar la secuencia CDR2 (YSASELQS; SEQ ID No: 55) de la secuencia aceptora dAb para producir el siguiente dAb (designado Compuesto 145) : Compuesto 145 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQK GKAP LUYiJASNLETG VPSRFSGSGSGTDI LTíSSLQPEDFATYYCQQVVWRPFrFGQGT VEl R (SEQ ID No:7.) Asi, en una modalidad preferida, el dAb de la construcción de anticuerpo de dominio que enlaza al TNF-a humano, comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No: 7. Está dentro del alcance de la presente invención, que la secuencia de región variable (dAb) de la construcción de anticuerpo del dominio se puede someter además a la modulación de afinidad con el fin de mejorar sus características de enlace de antígeno. Esto puede necesitar la modificación de ciertos residuos de aminoácidos dentro de CDR1, CDR3 o la estructura de la construcción de anticuerpo de dominio. Por ejemplo, la SEQ ID No: 7 se maduró por afinidad como se expone en los Materiales y Métodos y se probó para el enlace de TNF-a. En una modalidad preferida adicional, la región variable (dAb) de la construcción de anticuerpo de dominio que enlaza TNF-a humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 8 o SEQ ID No: 9. Estos han sido designados Compuesto 123 y Compuesto 100 respectivamente, y sus secuencias se muestran enseguida: Compuesto 123 DIQMTQSPSS LS AS VGDR VTITCK ASQA I DS YLH W YQQKPGKAPKLLIYS AS HUET OVPSRFSGSGSGl'DF LTJSSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGT VEI R (SEQ lD No:8) Compuesto 100 D1QMTQSPS SLS AS V GDRVT1TCRASQS 1DS YL> I WYQQ PG APK LLIYS AS NLETG VPSRFSGSGSG I FTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGT VEI R (SEQ lD.No:9) En una modalidad particularmente preferida, la región variable (dAb) de la construcción de anticuerpo de dominio que enlaza a TNF-a humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 10. Este se ha designado Compuesto 196 y la secuencia se proporciona enseguida: Compuesto 196 DTQMTQSPSSI^ASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPG AP LUYSASNLET GYPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGT VEI R (SEQ ID No: 10) Será apreciado por personas expertas en la técnica que la secuencia de región constante de la construcción de anticuerpo de dominio puede ser derivada de secuencias de humano o de primate. La secuencia de primate puede ser un primate del Nuevo Mundo o una secuencia de primate del Viejo Mundo. Los primates del Viejo Mundo adecuados incluyen chimpancés, u otros simios homínidos por ejemplo gorila u orangután, que debido a su estrecha proximidad filogenética a humanos, comparten un alto grado de homología con l secuencia de región constante humana. De preferencia, la región constante se deriva de una secuencia de anticuerpo humana. Ejemplos de tales secuencias se pueden encontrar en las bases de datos de proteína y de nucleótidos en The National Centre for Biotechnology Information www . ncbi . nlm. nih . gov, y The Kabat Datábase of Sequences of Proteins of Immunological Interest www . kabatdatabase . com. o la base de datos IMGT www . imgt . cines . fr . En el diseño de la construcción de anticuerpo de dominio de la presente invención, los inventores han truncado el dominio CH1 de la región constante (Fe) . Un número mínimo de residuos de dominio CH1 se han retenido con el fin de proporcionar flexibilidad en la construcción de anticuerpo de dominio alrededor de la región de articulación. De preferencia, por lo menos 20 residuos de aminoácido C-terminales del dominio CH1 son retenidos, más de preferencia, por lo menos 10 aminoácidos, todavía más de preferencia por lo menos 5 aminoácidos, aun más de preferencia un solo residuo de aminoácido. Así, en una modalidad preferida, la construcción de anticuerpo de dominio tiene un formato que comprende dAb-residuo de dominio CH1 C terminal-región de articulación-dominio CH2-dominio CH3 como es ilustrado esquemáticamente en la Figura 2. En una modalidad particularmente preferida, la construcción de anticuerpo de dominio tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No: 11. Este se ha designado Compuesto 170. Compuesto 170 DIQM QSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDvSYLHWYQQKPGKAPKLLrYSASNLET GYPSRFSGSGSGTDFTLTlSSLLPEDrATVTCQQVVWRPF FGQGTKVEIKRVEP S SD THTCPPCPAPELLGGPS nFLFPPKPKDTLMlSRTPEV;i'CVWDVSi rEDPEV FN \\rm>GVEVHNA TKPREEQYNSTYRVVSVLT^ APl TrS A GQPREPQVYTLPPSRDELTK QVSLTCLYKGFYPSDlAVEWESNG OPENNYKT ITPVLDS DGSFFLYS KLTVDKS R WQQGN VFSCSVMHKALHNH YTQ SLSLSPGK <SEQ lD No:l l) La región de articulación de la inmunoglobulina que ocurre naturalmente contiene una cadena lateral de cisteina (C) que facilitar la formación de un enlace de disulfuro entre el dominio CH1 de la cadena pesada y el dominio constante de la cadena ligera. Debido a que la construcción comprende solamente un solo dominio variable y asi deja un residuo de cisteina no emparejado potencialmente reactivo, el residuo de cisteina se ha sustituido con un residuo de aminoácido que previene la formación de enlace de disulfuro. Las consecuencias potenciales de tener una cisteina no emparejada puede incluir la expresión de proteina reducida debido a la agregación y mal plegamiento de la construcción. Se va a entender que cualquier secuencia de región de articulación derivada de cualquiera de las clases de anticuerpo seria apropiada para el uso en la presente invención. Sin embargo se prefiere que la región de articulación sea derivada del anticuerpo subclase IgGi. De preferencia, la región de articulación está basada sobre la secuencia que ocurre naturalmente en la región de articulación de IgGx y comprende la secuencia EPKSSDKTHTCPPCPA (SEQ ID No: 12) . En esta secuencia, el Cys que normalmente ocurre en la posición 5 se reemplaza por el residuo Ser en negritas subrayado. De preferencia, el residuo de aminoácido C-terminal del dominio CH1 se deriva de IgGl. Más de preferencia, el residuo CH1 es un residuo de valina (V) o una sustitución de aminoácido conservativa tal como leucina (L) o isoleucina (I) . Ese residuo se ubica inmediatamente próximo a la región de articulación y ayuda a incrementar la flexibilidad de la construcción alrededor de la región de articulación. Las secuencias de los dominios CH2 y CH3 de preferencia se derivan de la base de datos Swissprot número de acceso PO 1857: PELLGG PS VFLKPPKP DTLM ÍSRTPEVTC Y VVD VS HEDPE VKFN WYVDG VEY11 N A T KPREEQYNST YRY Y S VLT Y LHQDWLNG KEY LC VSN AUPAP l E T1S AKG QPREPOVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLYKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYICTTPPV U^SDGSFFLYS LTVD SRWQQGNVFSCSV llEALH níYTQKSLSLSPG (SEQ ID No:63).

La construcción de anticuerpo de dominio puede ser' derivada o enlazada a otra molécula funcional. Por ejemplo, la construcción de anticuerpo de dominio puede ser funcionalmente enlazada mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera, a una o más de otras entidades moleculares, tal como otro anticuerpo, un agente detectable, un agente citotóxico, un agente farmacéutico y/o una proteina o péptido que puede mediar la asociación del anticuerpo o porción que enlaza anticuerpo con otra molécula (tal como una región de núcleo de estreptavidina o un fragmento de polihistidina ) . Los agentes detectables útiles con los cuales la construcción de anticuerpo de dominio se puede derivar incluyen compuestos fluorescentes. Agentes detectables fluorescentes ejemplares incluyen fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina , rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1-naftalensulfonilo, ficoeritrina y los similares. La construcción de anticuerpo de dominio también se puede derivar con enzimas detectables tales como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa y los similares. Cuando la construcción de anticuerpo de dominio se deriva con una enzima detectable, ésta se detecta al adicionar reactivos adicionales que la enzima utiliza para producir un producto de reacción detectable. La construcción de anticuerpo de dominio también se puede derivar con biotina, y detectar a través de la medición indirecta de avidina o enlace de estreptavidina. La construcción de anticuerpo de dominio de acuerdo con la invención se puede enlazar a una o más moléculas que proporcionan vida media incrementada y resistencia a la degradación sin pérdida en la actividad (por ejemplo, afinidad de enlace) in vivo. Estas moléculas se pueden enlazar a la construcción de anticuerpo de dominio por la vía de un enlazador de modo que no interfieren/impiden estéricamente el sitio de enlace de antigeno. Estas moléculas de aducto incluyen por ejemplo dAbs dirigidos a una molécula endógena - como es descrito en la solicitud de patente norteamericana 20050271663. Típicamente, tales moléculas de aducto son polipéptidos o fragmentos de polipéptidos que ocurren naturalmente in vivo y que resisten a la degradación o remoción mediante mecanismos endógenos. Las moléculas que incrementan la vida media se pueden seleccionar de las siguientes : (a) proteínas de la matriz extracelular , por ejemplo, colágeno, laminina, integrina y fribronectina; (b) proteínas encontradas en la sangre, por ejemplo, fibrina -2 macroglobulina, albúmina de suero, fibrinógeno A, fibrinógeno B, proteína A amiloide de suero, heptaglobina, proteína, ubicuitina, uteroglobulina, ß-2 microglobulina, plasminogeno, lisozima, cistatina C, alfa-1-antitripsina e inhibidor de quipsina pancreático; (c) proteínas se suero inmune, por ejemplo, IgE, IgG, IgM; (d) proteínas de transporte, por ejemplo, proteína que enlaza retino!, a-1 microglobulina; (e) defensinas, por ejemplo, beta-defensina 1, defensinas 1, 2 y 3 de neutrófilo; (f) proteínas encontradas en la barrera hemato encefálica o en tejidos neurales, por ejemplo, receptor de melanocortina , mielina, transportador de ascorbato; (g) proteínas de fusión de agente neurofarmacéutico de ligando específico de receptor de transferrina (ver US5977307); receptor de célula endotelial capilar de cerebro, transferrina, receptor de transferrina, insulina, receptor de factor de crecimiento similar a insulina 1 (IGF1), receptor de factor de crecimiento similar a insulina 2 (IGF2), receptor de insulina; (h) proteínas localizadas al riñon, por ejemplo, policistina, colágeno de tipo IV, transportador de anión orgánico Kl, antígeno de Heymann; (i) proteínas localizadas en el hígado, por ejemplo, alcohol deshidrogenasa, G250; (j) factor de coagulación de sangre X; (k) OÍ-1 antitripsina; (1) HNF la; (m) proteínas localizadas en el pulmón, por ejemplo, componente secretorio (enlace IgA) ; (n) proteínas localizadas en el corazón, por ejemplo, HSP 27; (o) proteínas localizadas a la piel, por ejemplo, queratina; (p) proteínas especificas de hueso, tal como las proteínas morfogénicas de hueso (BMPs) por ejemplo, BMP-2, -4, -5, -6, -7 (también referida como proteína osteogénica (OP-1) y -8 (OP-2) ; (q) proteínas específicas de tumor, por ejemplo, antígeno de trofoblasto humano, receptor de herceptina, receptor de estrógeno, catepsinas por ejemplo catepsina B (encontrada en el hígado y el bazo) ; (r) proteínas específicas de enfermedad, por ejemplo, antígenos expresados solamente en células T activadas: incluyendo LAG-3 (gen de activación de linfocito) ; ligando de osteoprotegerina (OPGL) ver Kong YY y colaboradores, Nature (1999) 402, 304-309; OX40 (un miembro de la familia de receptor TNF, expresado sobre células T activadas y la molécula de célula T solamente coestimuladora conocida que es específicamente regulada hacia arriba en las células que producen virus de leucemia de célula T humana tipo 1 (HTLV-I) - ver Pankow R y colaboradores, J. Immunol. (2000) Julio 1; 165 (1) : 263-70; metaloproteasas (asociadas con artritis/cánceres) , incluyendo CG6512 de Drosofila, paraplegina humana, FtsH humana, AFG3L2 humana, ftsH de murino; factores de crecimiento angiogénicos , incluyendo- el factor de crecimiento de fibroblasto acídico (FGF-1), factor de crecimiento de fibroblasto básico (FGF-2), factor de crecimiento endotelial Vascular/factor de permeabilidad vascular (VEGF/VPF) , factor de crecimiento de transformación-a (TGF-a) , factor de necrosis de tumor-alfa (TNF-a) , angiogenina, interleucina-3 (IL-3), lnterleucina-8 (IL-8), factor de crecimiento endotelial derivado de plaqueta ( PD-ECGF) , factor de crecimiento placental (PIGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas de midquina-BB (PDGF), fractalquina ; (s) proteínas de estrés (proteínas de coque térmico) ; y (t) proteínas involucradas en el transporte de Fe. La presente invención también se extiende a una construcción de anticuerpo de dominio PEGilado que proporciona vida media incrementada de resistencia a la degradación sin pérdida en la actividad (por ejemplo, afinidad de enlacé) con relación a los polipéptidos de anticuerpo no PEGilados. La construcción de anticuerpo de dominio se puede acoplar, utilizando métodos conocidos en la técnica, a moléculas de polímero (de preferencia PEG) útiles para lograr la vida media incrementada y las propiedades de resistencia de degradación. Las porciones de polímero que se pueden utilizar en la invención pueden ser sintéticas o que ocurren naturalmente e incluyen pero no limitadas a polímeros de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena recta o ramificada, o un polisacárido ramificado o no ramificado tal como un homo- o heteropolisacárido . Ejemplos preferidos de polímeros sintéticos que se pueden utilizar en la invención incluyen poli ( etilenglicol ) (PEG), poli (propilenglicol ) o poli (alcohol vinílico) de cadena recta o ramificado y derivados y formas sustituidas de los mismos. Los polímeros sustituidos particularmente preferidos para el enlace a la construcción de anticuerpo de dominio incluyen PEG sustituido, incluyendo metoxi (prolietilenglicol ) . Las porciones de polímero que ocurren naturalmente que se pueden utilizar además de o en lugar de PEG incluyen lactosa, amilosa, dextrano o glucógeno, así como derivados de los mismos que serán reconocidos por personas expertas en la técnica . Las moléculas de polímero (PEG) útiles en la invención se pueden unir a la construcción de anticuerpo de dominio utilizando métodos que son bien conocidos en la técnica. La primera etapa en la unión de PEG u otras porciones de polímero a la construcción de anticuerpo de dominio de la invención es la sustitución de los grupos de extremo de hidroxilo del polímero PEG mediante grupos funcionales que contienen electrófilo. Particularmente, los polímeros PEG se unen a residuos ya sea de cisteína o lisina presentes en los monómeros o multímeros de construcción de anticuerpo de dominio. Los residuos de cisteína y lisina pueden estar ocurriendo naturalmente, o se pueden diseñar en la molécula de construcción de anticuerpo de dominio. La PEGilación de las construcciones de anticuerpo de dominio de la invención se pueden realizar mediante cualquiera de un número de medios (ver, por ejemplo, Kozlowski-A & Harris JM (2001) Journal of Controlled Reléase 72:217) . PEG se puede unir a la construcción de anticuerpos de dominio ya sea directamente o mediante un enlazador de intervención. Los sistemas sin enlazador para unir polietilenglicol a proteínas es descrito en Delgado y colaboradores, (1992), Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304; Francis y colaboradores, "(1998), Intern. J. Hematol. 68:1-18; US 4,002,531; US 5,349,052; WO 95/06058; y WO 98/32466, las descripciones de cada una de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Un sistema para unir polietilenglicol directamente a residuos de aminoácido de proteínas sin un enlazador de intervención emplea MPEG tresilado, que se produce mediante la modificación de monometoxi polietilenglicol (MPEG) utilizando cloruro de tresilo. Después de la reacción de los residuos de aminoácido con MPEG tresilado, el polietilenglicol se une directamente a los grupos amina. Así, la invención incluye conjugados de proteína-polietilenglicol producidos al hacer reaccionar proteínas de la invención con una molécula de polietilenglicol que tiene un grupo 2,2,2- trifluoreotano sulfonilo. El polietilenglicol también se puede unir a proteínas utilizando un número de diferentes enlazadores de intervención. Por ejemplo, la patente norteamericana US 5,612,460 divulga enlazadores de uretano para conectar polietilenglicol a proteínas. Los conjugados de proteína-polietilenglicol en donde el donde el polietilenglicol se une a la proteína mediante un enlazador también se pueden producir mediante la reacción de proteínas con compuestos tales como MPEG-succinimidilsuccinato, MPEG activado con 1, 1' -carbonildiimidazol, MPEG-2, 4, 5-tricoloropenilcarbonato, MPEG-p-nitrofenolcarbonato y varios derivados de MPEG-succinato. Un número de derivados de polietilenglicol adicionales y químicas de reacción para unir polietilenglicol a proteínas se describe en WO 98/32466, la descripción completa de la cual es incorporada en la presente por referencia . En una modalidad particularmente preferida de la presente invención la construcción de anticuerpo de dominio se acopla directamente a polietilenglicol por la vía de un residuo de lisina. En todavía otra modalidad preferida de la presente invención, la construcción de anticuerpo de dominio se acopla directamente a PEG por la vía de un residuo de cisteína. El residuo de cisteína no emparejado podría preexistir en la secuencia, podría ser adicionado al incorporar un residuo de cisteina en, por ejemplo, el C-terminal de la construcción de anticuerpo de dominio. Alternativamente, la unión del PEG a la construcción de anticuerpo de domino podría ser facilitada por la vía de una cisteina enlazada a disulfuro tal como aquella descrita en la patente norteamericana US20060210526. Otras formas derivadas de moléculas de polímero incluyen, por ejemplo, derivados que tienen porciones adicionales o grupos reactivos presentes en los mismos para permitir la interacción con residuos de aminoácido de las construcciones de anticuerpo de dominio descritos en la presente. Tales derivados incluyen éteres activos de N-hidroxilsuccinimida (NHS) , polímeros de propionato de succinimidilo, y agentes reactivos selectivos de sufhidrilo tal como maleimida, vinil sulfona y tiol. Los polímeros de PEG pueden ser moléculas lineales o pueden ser ramificadas en donde múltiples porciones de PEG están presentes en un solo polímero. El grupo reactivo (por ejemplo, MAL, NHS , SPA, VS o Tiol) se pueden unir directamente al polímero de PEG o se pueden unir a PEG por la vía de una molécula · enlazadora . El tamaño de los polímeros útiles en la invención puede estar en el intervalo de 500 Da a 60 kDa, por ejemplo, entre 1000 Da y 60 kDa, 10 kDa y 60 KDa, 20 kDa y 60 kDa, 30 kDa y 60 kDa, .40 kDa y 60 kDa, y hasta entre 50 kDa y 60 kDa.

Los polímeros utilizados en la invención, particularmente PEG, pueden ser polímeros de cadena recta o pueden presentar una conformación ramificada. En una . modalidad adicional, la construcción de i anticuerpo de dominio de acuerdo con el primer aspecto puede ser multimerizada, como por ejemplo, hetero- u homodímerqs, i hetero- u homotrímeros , hetero- u homotetrámeros , o hetero-! u homomultímeros de orden más alto. La multimerización puede incrementar la resistencia del enlace de antígeno, en donde la resistencia del enlace está relacionada con la suma de lias afinidades de enlace de los múltiples sitios de enlace. \ En un quinto aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de la construcción de anticuerpo de dominio de acuerdo con ¡el primer aspecto, junto con un portador o diluyerite farmacéuticamente aceptable. ! i Un ."portador farmacéuticamente aceptable" inclu|ye ? cualquiera y todos los solventes, medios, de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungalejs , agentes isotónicos y que retardan la absorción y l.ps similares que son fisiológicamente compatibles. Ejemplos jde portadores farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más be agua, solución salina, solución salina regulada de fosfato, i dextrosa, glicerol, etanol y los similares así como combinaciones de los mismos . En muchos casos será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes al como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. Las sustancias farmacéuticamente aceptables tales como cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, conservadores' o soluciones reguladoras. La composición puede estar en una variedad ; de formas, incluyendo formas de dosificación liquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones liquidas (por ejemplo, inhalables, inyectables y soluciones infusionables ) , dispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. De preferencia, la composición está .i en la forma de una solución inyectable para inmunización. ;|La administración puede ser intravenosa, intra-arterial , subcutánea, intraperitoneal o intramuscular. j Las composiciones terapéuticas típicamente deben 1 ser estériles y estables bajo las condiciones de manufactura y almacenamiento. Las composiciones pueden ser formuladas como una solución, microemulsión , dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para alta concentración de fármaco. La fluidez apropiada de una solución se puede mantener mediante, por ejemplo, el uso de un recubrimierijto tal como lecitina y/o surfactantes . Las soluciones í inyectables estériles se pueden preparar al incorporar jel compuesto activo (es decir, construcción de anticuerpo !de dominio) en la cantidad requerida en un solventes apropiado con uno o una combinación de ingredientes listados en |lo anterior, seguido por la esterilización filtrada. La composición también se puede formular como ¡un I polvo estéril para la preparación de soluciones inyectables i estériles. j vinilo, polianhídridos , ácido poliglicólico, colágeno, poliortoesteres y ácido poliláctico. La composición también se puede formular pa'ra administ ación oral. En esta modalidad, la construcción Ide anticuerpo de dominio se puede encerrar como una cápsula 'de gelatina de cubierta dura o blanda, comprimir en tabletasj o incorporar directamente en la dieta del sujeto. Las formulaciones que permiten la administración pulmonar, rectal, transdérmica , intratecal e intraocular serán familiares para personas expertas en la técnica. Los compuestos suplementarios activos también pueden ser incorporados en la composición. La construcción de anticuerpo de dominio puede ser co-formulada con y/o j co-administrada con uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, receptor de TNF- solubles o agente químico que inhibe la producción de TNF-a humano | o anticuerpos que enlazan otros objetivos tales como citoquirlas o moléculas de superficie celular. Alternativamente, esta ¡se puede co-administrar con un reactivo inmunoquímico soluble tal como la proteína A, C, G o L. Una cantidad efectiva puede incluir una cantidad .1 terapéuticamente efectiva o cantidad profilácticamente i efectiva' de la construcción de anticuerpo de dominio de ¡la invención. Una cantidad terapéuticamente efectiva se refiere a una cantidad efectiva en dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad profilácticamente efectiva se refiere! a una cantidad efectiva en dosificaciones durante períodos |de tiempo necesarios para lograr el resultado profiláctico deseado. Debido que una dosis profiláctica se administra a ¡un sujeto antes de o en una etapa temprana de la enfermedad, ¡la cantidad -profilácticamente efectiva puede ser menor que ¡la cantidad terapéuticamente efectiva. '< ¡ En un sexto aspecto, la presente invencijón proporciona el uso de la construcción de anticuerpo 'de dominio de acuerdo con el primer aspecto de la invención ¡en una aplicación de diagnóstico para detectar TNF-a humano. j Por ejemplo, la construcción de anticuerpo ¡de dominio anti-TN F-a humano de acuerdo con la invención ¡se puede formular para detectar TNF-a humano por ejemplo en ina muestra biológica, tal como suero o plasma utilizando jun I inmunoensayo convencional, tal como un ensayo inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA) , un radioinmunoensayo (RIA) j o inmunohistoquimica de tejido. La construcción de anticuerpo de dominio anti-TN F-a humano de acuerdo con la invención ¡se 1 puede analizar en fluidos biológicos mediante un inmunoensayo , de competición utilizando estándares de TNF-a humano recombinantes marcados con una sustancia detectable y un anticuerpo TNF-a humano no marcado. ¡ La construcción de anticuerpo de dominio anti-TNFpa humano de acuerdo con la invención también se puede utilizar para detectar TN F-a de especies diferentes de humanos talles ? como primates no humanos que incluyen cinomolgus, chimpancés, i titis, rhesus y otras especies tales como perro, rata, ratóln,. ) conejo, gato, cerdo, bovino. ¡ i La construcción de anticuerpo de dominio anti- TN F¡-a i humano de acuerdo con la invención también se puede utilizjar en aplicaciones de cultivo de células donde es deseabjle inhibir la actividad de TN F- . j En un séptimo aspecto, la invención proporciona ¡un I método para tratar un desorden caracterizado por actividad 'de TN F-OÍ humano en un sujeto humano, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica de acuerdo con el segundo aspecto de la invención. Un desorden caracterizado por la actividad de TNF-a humano se propone para incluir enfermedades y otros desórdenes en los cuales la presencia de TNF-a en un sujeto que sufre del desorden se ha mostrado que es o se sospecha ;de ser ya sea responsable para la patofisiologia del desorden o un factor que contribuye a un empeoramiento del desorden. ,De preferencia, el desorden caracterizado por la actividad ¡de TNF-a humano se selecciona del grupo que consiste ¡de inflamación, enfermedades inflamatorias, sepsis, que incluyen i choque séptico, choque endotóxico, sepsis gran negativa, y síndrome de choque tóxico; enfermedad autoinmune, que incluye artritis reumatoide, artritis juvenil, espondilitis reumatoide, espondilitis anquilosante, síndrome de Sjógren, osteoartritis y artritis gotosa, alergia, esclerosis múltiple, diabetes autoinmune, uveítis autoinmune, psoriasis, síndrome penfigoide y nefrótico; condiciones inflamatori'as del ojo, que incluye degeneración macular, uveítis, enfermedad de Behcet; enfermedad infecciosa, que incluye fiebre y mialgias debido a la infección y caquexia secundaria a la infección; enfermedad de injerto contra hospedero; crecimiento de tumor o metástasis, malignidades hematológicas ; desórdenes pulmonares que incluyen asma, síndrome de aflicción respiratoria de adulto, pulmón de choque, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, sarcoidosís pulmonar, fibrosis y silicosis pulmonar; desórdenes del intestino inflamatorio que incluye la enfermedad de Crohri y la colitis ulcerativa; desórdenes cardiacos, falla del corazón congestivo; desórdenes vasculares que incluyen ; la 1 enfermedad de Wegener, arteritis de célula giganta-desórdenes de hueso inflamatorio, desórdenes del sistema i nervioso central tal como la enfermedad de Alzheimér; desórdenes del sistema nervioso periférico tal como ciática, hepatitis, disturbios de coagulación, quemaduras, lesión por reperfusión, endometriosis , formación queloide y formación I de tejido de cicatrización. | En una modalidad particularmente preferida, ¡el desorden caracterizado por la actividad de TNF-a humano es La degeneración macular relacionada con la edad. TNF- está implicado en estimular la producción de VEGF y promover Jla neovascularización en el ojo (Oh-H y colaboradores, 1999 Investigative Ophthalmology & Visual Science 40 : 1891-98 ) , ¡¡ y por lo tanto los inhibidores de la actividad de TNF-a, talles como las construcciones de anticuerpo del dominio descritos en la presente, serian útiles para la terapia de desórdenes oculares relacionados con angiogénesis que incluye !la degeneración macular relacionada con la edad. Por toda esta especificación la palabra "comprende" o variaciones tales como "se comprende" o "que comprende" será entendido .que implica la inclusión de un elemento, de iun número entero o etapa establecida, un grupo de elementos de números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas. Todas las publicaciones mencionadas en esta especificación son incorporadas en la presente por referencia. Cualquier discusión de documentos, actas, materiales, dispositivos, artículos o los similares que ¡se han incluido en la presente especificación es solamente para el propósito de proporcionar un contexto para la presente invención. No se va a tomar como una admisión de que cualquiera de todas estas materias, forman parte de la base de la técnica previa o fueron del conocimiento general común en el campo relevante a la presente invención como existió en Australia o en otra parte antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de esta solicitud. Con el fin de que la naturaleza de la presente invención pueda ser más claramente entendida, formas preferidas de la misma ahora serán descritas con referencia¡ a los siguientes ejemplos no limitativos. EJEMPLO 1 I Materiales y Métodos \ Aislamiento de genes VL de primate del Nuevo Mundo DNA genómico de tití (género Callithrix, especies desconocidas) y mono trasnochador {Aotus trivirgatus) se obtuvieron de la European Collection of Cell Cultures (ECACC) , números de catálogo 85011419 y 90110510 respectivamente. El DNA de titi se derivó de la linea ;de células B95-8 mientras que el DNA del mono trasnochador provino de la linea de células O K 637-69. ! Los cebadores degenerados basados en secuencias i guia VK humanas y las secuencias de señal de recombinación (RSS) se derivaron de Walter and Tomlinson, Antibody Engineering: A Practical Approach (1996). Los cebadores utilizados para la amplificación del DNA de VK de linea germinal fueron como sigue: Cebador VK1BL AATCKCAGGTKCCAGATG ( SEQ ID No: 13) Cebador VKlBL35a GTTYRGGTKKGTAACACT (SEQ ID No: 14) Cebador VKlBL35b ATGMCTTGTWACACTGTG (SEQ ID No: 15) La PCR (30 ciclos) se realizó utilizando Taq polimerasa con ya sea el par de cebadores VKlBLxVKlBL35a o VKlBLxVKIBL35b . Hubo sobr.eposición entre las secuenci'as clonadas y los dos conjuntos de cebadores utilizados. Los productos de PCR genómicos se clonaron en el kit de clonación TOPO TA de Invitrogen (Cat No K4500-01) y se secuenciaron con los cebadores M13 Delantero y pUC Trasero. La secuencia se confirmó en las direcciones delantera y I trasera. Con el fin de confirmar adicionalmente las i secuencias claves no se sometieron a errores de PCR,' la PCR y I el proceso de clonación se repitieron dos veces para secuencias de titi. Los nucleótidos (SEQ ID Nos: 16-26 y SEQ ID Nos: 38-43) y los aminoácidos (SEQ ID Nos: 27-37 y SEQ 'ID Nos: 44-49) se dan en la Figura 3. Las secuencias de titi .1, 2 y 3 se confirmaron. Las secuencias 4, 5, 6, 7 y 8 se observaron solamente en la PCR inicial. Las secuencias 9, !10 ! i y 11 se observaron solamente en la PCR de repetición (es decir, segunda) y la clonación. Oligo Síntesis y Clonación en la Secuencia Aceptora Cuatro secuencias de CDR, específicamente YAATKL:QS (SEQ ID No: 1). de la secuencia de mono Trasnochador 1 (SEQ ID No: 44), YEASSLQS (SEQ ID No: 2) de la secuencia de mono Trasnochador 2 (SEQ ID No:45), YEASKLQS (SEQ ID NO: 3) de la secuencia de Titi 1 (SEQ ID No: 27) y YSASNLET (SEQ ID No: 4) y de la secuencia de Titi 2 (SEQ ID No: 28), se seleccionaron de las secuencias de aminoácidos mostradas en la Figura 3. La secuencia de mono Trasnochador 5, YYASSLQS (SEQ ID No: 56) se encontró que es idéntica a GI6176295 una secuencia de cDNA de Aotus nancymaac (mono nocturno de MA) , todas las otras secuencias fueron únicas. La secuencia de región variable .aceptora (anticuerpo de dominio anti-TNF) en el vector de expresión (vector patentado de Domantis) se digirió (25 yg) i j secuencialmente con Kpnl y SanDI que extirpan la mayoría ¡de FR2 así como CDR2 como es indicado sobre el mapa de digestión de restricción, Figura 4. El vector luego se purificó en gel para remover la secuencia FR2 de tipo silvestre extirpadaj y CDR2. · ' I El oligo recocido se realizó al incubar oligo pares (500 pmol, basado en secuencias mostradas en la Figura 3)! a 95°C durante 5 minutos, seguido por 65°C durante 5 minutosj y luego se dejó alcanzar la temperatura ambiente lentamerite sobre un bloque caliente. Las sobreposiciones luego ¡se rellenaron durante una reacción de Klenow en la presencia de dNTPs . La clonación molecular del DNA de doble hebra sintético (derivado mediante oligo recocido y rellenado ¡de extremo) en la secuencia de región variable aceptora se logró utilizando métodos estándares. Maduración de Afinidad El compuesto 145 ( SEQ ID No: 7) de dAb injertajdo con CDR de tití se maduró por afinidad al construir 14 La selección se basó en los residuos en CDR1 y CDR3 que se conocen que son diversificados en el repertorio , Ig humano maduro, y los residuos de estructura que se han observado que producen proteínas funcionales después de la mutagénesis en dAbs relacionados. Para cada uno de los residuos seleccionados, los pares de cebadores de PCR i delantero y trasero complementarios se diseñaron con degeneración de NKK y dos reacciones de PCR iniciales se realizaron con cada cebador mutagénico individual y el cebador flanqueante. Después de la limpieza, los dos productos de PCR se recocieron y luego se amplificaron utilizando cebadores flanqueantes solamente (empalme mediante extensión de sobreposición de PCR; Lowman H.L. & Clackson ;T. (eds) , Phage Display: A practical approach, Oxford University Press, Oxford, UK) . Los clones se clasificaron inicialmerite mediante ELISA utilizando TNF en fase sólida, y los clones positives se secuenciaron . La proteína dAb se purificó de ios i mejores clones y se evaluó para la potencia en los ensayos ¡de enlace de receptor y los ensayos de citotoxicidad de L92|9.

Los Compuestos 100 (SEQ ID No: 9) y 123 (SEQ ID No: 8) se encontraron que tienen neutralización de TNF mejorada con relación al dAb de origen, Compuesto 145 (SEQ ID No: 7) . La combinación de las sustituciones aumentadoras de afinidad de los Compuestos 100 y 123, produjo un dAb anti-TNF con potencia mejorada adicional en el ensayo citotoxicidad i L929 (Compuesto 196; SEQ ID No: 10) .

Cultivo de Células \ Las células CH0K1SV (Lonza Biologics, UK) , una variante de suspensión de CH0K1, se mantuvieron en fase j de crecimiento logarítmica en el medio de CD' CHO suplementario i con L-glutamina 6 mM (Invitrogen Cat Nos. 10743-029 y 25030-081). Los cultivos se incubaron a 36.5°C, C02 al 10% j- y agitación a 140 rpm. 24 horas antes de la transfección ¡el número de células y la viabilidad se estimó mediante ¡la exclusión de azul de tripano (Sigma Cat No. T8154) sobre un hematocímetro . 8 x 106 células viable se formaron en pelotillas en 200 x g durante 5 minutos y se resuspendie on en 8 mi del medio CM25 (Lonza Biologics, UK) suplementado ion suero de ternero fetal dializado inactivado con calor al 10% I (Invitrogen Cat No. 26400-044) y L-glutamina .6 mM. lias células se colocaron en 500 µ? por cavidad en una placa de |24 cavidades y se incubaron a 36.5°C, C02 al 10%. ;¡ 3 horas antes de la transfección el medio se renojvó con una alícuota fresca de 500 µ? del medio CM25 suplementajdo i con suero de ternero fetal dializado inactivado con calor ¡al 10% y L-Glutamina 6 mM. j Vectores de expresión Las secuencias de gen para el Compuesto 112 (SEQ ¡ID No: 50) y Compuesto 170 (SEQ ID No: 51) se optimizaron para la expresión de células mamíferas y se sintetizaron. Compuesto 112 GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCTCTGTGGGCGATAGAGTGACG ATCAECTGCAGAGCCAGCCAGGCCATCGACAGCTACCTGCAC GG ATCAGCAGAAGCC GGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACAGCGCCAGCAATCTGGAGACCGGCG GCCTAGG AGAOTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCAC'CCTÓACCATCAGCAGCCTGCTGCCT GAGGAT TCGCCACCTACTACTGCCAGCAGGTGGTG GGAGACC TCACC TCGGCCAG GGCACCAAGG GGAGATCAAGCGGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGC CCCCCCLXK:CCTCCCCCCGAGCTGCRGGGCGGACCCAGCGTG CCTGTTCCCCCCCAAG CCTAAGGA ACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACC GCGTGGTGGTGGATGTG AGCCACGAGGACCCTGAGG GAAG CAACTGGTACGTGGACGGCG GGAGGTCCACAA'IL GCCAAGLACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACA CAGCLACC^ACCGGGTGGTG CCGTGC G ACCG GCTGCACCAGGA GGCTGAACGGCAAGGAGTACAAG GCAAGGTG CCAACAAG GCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCC TAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACC TGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAG GGGAGAGCAACGGCCAG CCCGAGAACAACTACAAGACCACCGCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTG TAC GCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGC I GTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCI AAG (SEQIDNo:50) Compuesto 170 GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCC C GTGGGCGATAGAGTGACC ¡ ATCACCTGCAGAGCCAGCCAGGCCATCGACAGCTACCTGCACTGG ATCAGCAGAAGCCT J GGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGA CTACAGCGCCAGCAATCTGGAGACCGGCGTGCCTAGC I AGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCC GCTGCCT ! GAGGA TCGCCACCTACTACTGCCAGCAGGTGGTCTGGAGACCTT CACCTTCGGCCAG · GGCACCAAGG GGAGATCAAGCGGGTGGAGCCCAAGAGCAGCGATAAGACCCACACCTGC Í CCCCCC GCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGACCCAGCGTGT CCTGTTCCCCCCCAAG ; CC AAGGACACCCTGA GATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGA GTG ! AGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGT CAACTGGTACGTGGACGGCG GGAGGTGCACAAT i GCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGC G i ACCG GCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAG GCAAGG GTCCAACÍ AG 1 GCCCTGCCrGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGQCCAGCCCAGAGAGCCC CAGGTG ACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTG CCCTGACC TGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAG CCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTCGACAGCGATGGCAGC CTTCCTG TACAGCAAOCTGACCGTQGACAAOAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGC GTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGC AAG (SEQIDNo:51) Cada secuencia se flanqueó en el extremo 5' con un sitio HindIII, una secuencia Kozak (GCCACC; SEQ ID No: 57), y una secuencia guia de IgG kappa humana (secuencia de aminoácidos MSVPTQVLGLLLLWLTDARC; SEQ ID NO:58). En el extremo 3' dos codones de detención y un sitio EcoRI ! se adicionaron a cada secuencia. Después los genes de síntesis se proporcionaron clonados en un vector pCRScript (Stratagene) y se liberaron mediante ,1a digestión ¡de HindIII/EcoRI en la solución reguladora de enzima de restricción apropiada (Roche Diagnostics Cat Nos. 10656313001, 10703737001 y 11417967001 respectivamente). El vector de expresión GS pEE12.4 (Lonza Biologies, UK) se digirió de manera similar y se desfosforiló utilizando fosfatasa alcalina intestinal de ternero (Roche Diagnostics Cat No. 10713023001) . Cada en se ligó en la cadena principal pEE12.4 preparada utilizando el sistema de Ligación de QNA Rápido LigaFast de Promega (Cat No. M8221). Las ligaciones luego se transformaron en células químicamente competentes One Shot Top 10 (Invitrogen Cat No. C4040-03) y las colonias positivas se identificaron mediante técnicas estándareis. '? Cantidades grandes de los vectores resultantes (pEE12.|4-PN0621 y pEE12.4-PN0521-S114C) se prepararon mediante i midiprep de cultivos durante la noche utilizando columnas midiprep QIAfilter (QIAgen Cat No. 12243) . Los vectores j se prepararon para la transfeccion al precipitar 20 yg en etanol ¦i I al 100% con 1/10 volumen de acetato de sodio 3 M (pH 5L 2 ) (Sigma Cat Nos. B7023 y S2889 respectivamente). Después de¡un lavado en etanol al 70%, los vectores se resuspendieron en¡40 i µ? de T.E. pH 8.0 (Sigma Cat No. T9285) a una concentración de trabajo de 0.5 pg/ l. ¡ Transfeccion \ I i Para cada transfeccion 2 µ? de Lipofectamina 2000 se adicionó a 50 µ? del medio Optimen I (Invitrogen Cat Nos. 11668-027 y 31985-062) en una cavidad de una placa de i 96 cavidades. En una segunda cavidad 1.6 µ? del vector ¡de expresión (0.8 µg) se adicionó a 50 µ? del medio Optimen Jl. Después de una incubación a temperatura ambiente de 5 minutos los contenidos de las dos cavidades se mezclaron conjuntamente, y se dejaron durante una incubación de ¡20 minutos adicional. Después de esta segunda incubación ¡la mezcla de transfeccion completa se adicionó a una cavidad !en la placa de 24 cavidades que contienen las células CH0K1SV.. Las células se incubaron por al menos 72 horas y ¡se recolectaron los sobrenadantes. Los sobrenadantes ¡se centrifugaron a 4,000 x g durante 5 minutos para formar en pelotilla los restos celulares y se almacenaron a -20°C hasjta ? . que la expresión del compuesto 112 (SEQ ID No: 59) y ¡el Compuesto 170 (SEQ ID No: 11) se analizó mediante ELISA de TNF. Compuesto 112 DIQMTQSPSS L«S AS VGDRVTCrCRASQAIDS Y UHWYQQKPQ K AP LLIYSASN LET GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSU,PEDFATYYCQQVVWRPTOGQG rKVEIKRVEPKS CDKTHTCPPCPAPEI GGPSVFIJFPPKPm^ ! WYVDGVEVH AKTKPREEQY STYRWS VLTVLHQDWLNG EYKCKVS KALP APEKTISKA GQPREPQVYTLPPSRDKLTKNQVSLTCLV GFYPSDIAVRWESNG QPEN YKT7*PPVI_DSDGSF>1<Y5KI-TVDKSRWQQG-^^ i SLSLSPGK.(SEQ ID No:59) | ¦ i ELISA de TNF i Placas de microtitulo (por ejemplo, Sarstedt i 82.9923-148) se recubrieron con 1 pg/mL de solución de ???-a recombinante humano (Peprotech Cat # 300-01A) en solución reguladora de recubrimiento de carbonato/bicarbonato pH 9.6, 100 µL/cavidad. Después de la incubación durante la noche a 4°C las placas se lavaron con PBS (0.01 M, pH 7.2) con Twéen 20 al 0.05%, y 3 veces con PBS. 200 pL de solución reguladora bloqueante (PBS con BSA al 1% {albúmina de suero bovino, Sigma Cat # A-9647}) se adicionó por cavidades y se incubó¡ a 25°C durante 1 hora. Las placas se lavaron, como en 'lo anterior, y volúmenes de 100 pL de muestra o estándares del Compuesto 170 diluidos en diluyente de anticuerpos (PBS con BSA al 1% y Tween 10 al 0.5%) se adicionaron por cavidad. Después de la incubación de 1 hora a 25°C, las placas !se lavaron, como en lo anterior, y volúmenes de 100 pL de anticuerpo secundario ( inmunoglobulinas anti-humanas de cabjra conjugadas con peroxidasa, Zymed, Cat # 81-7120) en dilucijón de 1:1000 en diluyente de anticuerpos se adicionaron pjor 1 cavidad. Las places se lavaron y volúmenes de 100 ]i del sustrato de ABTS sal de diamonio de ( 2 , 2 ' -Azino-bis (j3-Etilbenz-Tiazolin-6-Sulfónico) Sigma Cat # A-1888, 0.5 mg/mL en solución reguladora de citrato pH 4.4, con H2O2 al 0.03%) se adicionó por cavidad. El sustrato se desarrolló durante Í30 minutos a temperatura ambiente y la absorbencia se leyó a 405 nm (referencia 620 nm) . Las concentraciones de muestra se determinaron con relación a la curva estándar y se expresaron j con relación a la concentración media del Compuesto Ijl2 expresado. j Resultados I Inclusión de CH1 truncado ? La inclusión del CH1 truncado en la construcción Jde anticuerpo de dominio da por resultado una unión entre ¡el dominio variable y la articulación con la homología más alJta a una unión de CHl-articulación de IgGi convencional (91.7|%) í que una unión que carece de CH1 truncado (83.3%; calculado \ utilizando Aling X sobre el Vector NT1 (Invitrogen) con una sanción de abertura de espacio de 1) . La homología aumentada es probablemente que se traduzca a reensamble incrementadoj a las secuencias de péptido de inmunoglobulina convencionales a las cuales los pacientes humanos deben ser inmunológicamente i tolerantes, para de esta manera reducir el potencijal 1 . . i inmunogenico . ; i Secuencia s : ¡ Región variable del Compuesto 170-CH1 truncado-unión de articulación: TKVRIKPJ¾EPKS IgGi CHl-unión de articulación (NCBI acceso AAG00909) : 1??¾_????d . , Región variable de Compuesto 170-unión de articulación (CH1 truncado ausente) : TKVEIKREPKS ! La secuencia CH1 está sombreada como es indicado. ¡ El dominio CH1 (SEQ ID No: 60) obtenida de la base de datos jde proteina NCBI (http: //www . ncbi . nlm. nih . aov) AAG00909: I 1 STKGPSVFPI, A-PBSKSTCCG 't'MLU LV D YFFEPVTVSW NSGALTSCrVH ' PAVLQBBC I 61 LYer.sswTV PSSSLCTQTY ICNVNHXPSN TKVDKRVEPK SCPKT11TCPP CPAPELLGCP I 12 X SVFLFPFKPK DTLMISRTPE VTCVWDVÍIH EDPtvVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNÍJ 1 181 TYRWSVLTV LHQDWLNG B YKCKVBWKñL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTIJPFSREEÍ-. 2<U TKNQVtfJ/rCL VKCTYPSDIA VEWESNGCJPE NNYKTTPPVI, fíVGÜFFliYS KLTVDKSRWQ i v i 301 ÜONVFSCSVM HEALHNHYTO XSLSLBPGK La CHI-unión de articulación se indica en subrayado. ¡ i Neutralización de la Citotoxicidad Inducida por TNF- j La habilidad de la construcción de anticuerpo 'de dominio Compuesto 170 (SEQ ID No: 11) para neutralizar |la citotoxicidad mediada por TNF-a se estimó utilizando jun ensayo de viabilidad de células L929 de murino. Las diluciones en serie del Compuesto 170 del medio RPMI con suero bovino fetal al 10% (RP I-FBS) se preparó en volúmenes i de 50 pL en placas de 96 cavidades de fondo plano. A cada Una de estas cavidades de adicionó 50 i~L de TNF-a humajno recombinante (Strathmann Biotec, Hamburgo, Germany) a una concentración de 360 pg/mL, seguido por 2.5xl04 células L9¡29 en 50 y 25 L de Actinomicina D en 40 g/mL, todas I preparadas en RPMI-FBS. Los controles incluyeron cavidades sin TNF (para determinación de la viabilidad de 100%), sin células (viabilidad al 0%) y una curva estándar de TNF-a que varia de 2 pg/mL a 4200 pg/mL. Las placas de cultivo ¡se incubaron en una atmósfera de C02 al 5% a 37 °C durante -20 horas, luego 3 horas adicionales después de la adición de 25 pL de 3- ( 4 , 5-dimetiltiazol-2-il ) -5- ( 3-carboximetoxifenil ) -2- ( 4-sulfofenil ) -2H-tetrazolio (MTS) /etosulfato de fenazina (PES) (Promega CellTiter 96 AQCUenus One, Madison USA) . ;La absorbencia en 492 nm se determinó contra una longitud |de i onda de referencia de 630 nm y las curvas ¡de viabilidad se graficaron utilizando valores promedio calculados de cavidades de prueba por triplicado. ¡La habilidad neutralizante de TNF- del Compuesto 170 les indicado al incrementar la viabilidad celular con ] concentraciones incrementadas del Compuesto 170 (Figura 6) . j Neutralización del enlace de TNF-cc a receptores de TNF p55| y i p75 humanos La habilidad de la construcción de anticuerpo de dominio Compuesto 170 (SEQ ID No: 11) para inhibir el enlace de TNF-a a los receptores de TNF p55 y p75 humanos se evaljuó mediante ensayos de enlace de receptor. p55 humano (sistemas RnD, Cat No: 372-RI) o p75 (sistemas RnD, Cat No: 762-R2) |se ¦I recubrió sobre placas Maxisorb (Nunc) en 0.1 µ?/p?]_, jen solución reguladora de recubrimiento de carbonato pH íj.2 mediante la incubación durante la noche a 4°C. Diluciories ! i semi-log en serie del Compuesto 170 que varían de 100 µg/jmL debajo de 3.15 ng/mL (y un control de ^blancos' ) que no es leí Compuesto 170 se prepararon en diluyente de anticuerpo (EjBS pH 7.2, Tween-20 al 0.05%, BSA al 1%) y se mezclaron con |un volumen igual de 60 ng/mL de TNF-a humano en diluyente jde I anticuerpo. Un blanco que no contiene PN0621 y nada de TNF,-a i también se preparó para medir el enlace de fondo. Todas las l mezclas se dejaron incubar por exactamente 1 hora a temperatura ambiente con agitación moderada. Durante está incubación las placas recubiertas se lavaron 3 veces con PBS, Tween-20 al 0.05% y luego 3 veces con PBS. Las placas :se bloquearon con 200 µ?/cavidad de PBS, BSA al 1% durante j 45 í minutos a temperatura ambiente. Después del lavado de ¡la placa, 100 µ? de las mezclas de Compuesto 170/TNF- jse I adicionaron a cavidades por triplicado para cada concentración del Compuesto 170 probado junto con la adición de todos los controles. La placa luego se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después del lavado de la placa, un anticuerpo anti-TNF-a humano biotinilado (RnD Systems, Cat No: BAF210) se adicionó en 0.6 yg/mL :en diluyente de anticuerpo a cada cavidad y se incubó durante' 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado un conjugado i de Est.reptavidina-HRP (Zymed, Cat No: 43-4323) se adicionó jen 1:2000 en diluyente de anticuerpo y se incubó a temperatura i I ambiente durante 45 mins. La visualización se realizó utilizando el sustrato TMB (Invitrogen, Cat No: 00-202¡3) detenido con HC1 1 M después de 4 minutos. Las lecturas ;de absorbencia luego se midieron en 450 nm utilizando una referencia de 620 nm. El análisis se realizó al calcular la absorbencia promedio de los triplicados. El promedio del enlace no específico (sin TNF-a) se sustrajo de cada valor :de absorbencia. 1 Los resultados se indican en la Figura 7 y muestran que el Compuesto 170 previene la interacción de TNF-a con los receptores de p55 o p75 humanos. ¡ Enlace de TNF-ct enlazado a célula El análisis del enlace del TNF-OÍ enlazado a célul Ias I (transmembrana) se realizó utilizando una línea de células NS0, 27D4, establemente transfectada con una proteína de TNF- i , a humana que codifica el gen que carece de un sitio !de segmentación TACE, tal que el TNF-a permanece asociado a lia membrana celular debido a que no puede ser segmentado. Urna linea de célula similar basada sobre otro mieloma de murino (SP2/0) se ha descrito (Scallon y colaboradores, (1995) Cytokine 7 251-259) . ' El análisis de citometria de flujo se realizó sobre 5 x 105 células 27D4 viables por muestra con todas las etapas realizadas a 4°C o sobre hielo. Las pelotillas de células .se resuspendieron con la prueba (Compuesto 170; SEQ ID No:ll): o el control igualado de isotipo de especificidad irrelevarJte (Sigma, Cat No: 15154) a 100 g/ml en FBS que contiene FBS al 2%, y se incubó sobre hielo durante 1 hora. Dos ciclos 'de lavado de células se realizaron, cada uno que comprende, centrifugación durante 10 minutos a 1000 x g y resuspensijón de la. pelotilla de células en PBS/FES al 2%. Después de otra etapa de centrifugación la pelotilla de célula se resuspendió en 100 L de conjugado de anticuerpo secundario (conjugado FITC anti-Fc humano, Sigma, Cat. No:F9512) y se incubó durante 30 mins. Las muestras luego se lavaron dos veces como es descrito en lo anterior y las pelotillas de células se resuspendieron en 500 µ? de PBS/FBS al 2% con 5 g/mL ele yoduro de propidio (Sigma, Cat No:P4864). El manchajdo fluorescente de las células se analizó en un citómero jde flujo Beckman Coulter Cell Lab Quanta y los datos se procesaron utilizando WinMDI .

Los resultados se indican en la Figura 8, , y muestran que el manchado del Compuesto 170 de las células NSO 27 D4 que expresan TNF-a de transmembrana (linea negra sólida) muestra intensidad de fluorescencia más alta que el control igualado de isotipo de especificidad irrelevante (relleno gris) Creación de líneas de células que expresan alto contenido del Compuesto 170 Lineas de células estables de CHO 1SV que expresjan el Compuesto 170 (SEQ ID No: 11) se crearon utilizando ¡el vector de expresión descrito en los Materiales y Métodojs. Brevemente 1 x 107 células en fase de crecimiento logarítmica se electroporaron en medio libre de proteína CDCHO libre de glutamina en la presencia de 40 \iq de DNA de plásmrdo linealizado. 14 horas de post-transfección una presión selectiva de sulfometionina sulfoximina 50 µ? (Sigma) se aplicó y células resistentes se permitieron formar colonias en placas de 96 cavidades. Cuando se aproximan a la confluencia, las colonias individuales se transfirieron a places de 24 cavidades, T25 y luego matraces T75. Una vjez sobre la confluencia en matraces T75 las líneas de células se progresaron a cultivo en matraces Edenmeyer E125 y se adaptaron al crecimiento de suspensión sobre 6 subcultivos. Una vez adaptadas al crecimiento ¡en suspensión las líneas de células se criopreservaron en una mezcla de congelación de 92.5% de medio CDCHO:7.;5% DMSO. Mientras que las lineas de células estuvieron siendo expandidas a través de diferentes tamaños de cavidad y de matraz, un número de estimaciones de productividad ;se realizaron en paralelo al progreso de las lineas de células' a la siguiente etapa. Asi, en la placa de 24 cavidades y |el matraz Erlenmeyer E125 se realizaron las estimaciones Le etapas de productividad. En cada caso las células se dejaron crecer durante 14 días y los sobrenadantes se evaluaron mediante el método de ELISA de TNF descrito en el Ejemplo 1 para niveles del Compuesto 170. Las lineas de células clasificaron sobre la productividad y el 10 más alto jse seleccionó para la evaluación en una estimación de productividad de lote de alimentación patentado en Lon'za Biologics. Las productividades obtenidas estuvieron entre 700 i mg/L y 3371 mg/L. Una linea de células guia con Una productividad de 2724 mg/L se seleccionaron para ¡la evaluación en los fermentadores escala de laboratorio de 10L. Cuatro fermentadores a escala de laboratorio de 10L separados se hicieron funcionar durante 15 días con la linea i de células de guia y un proceso de lote de alimentación genérico patentado basado en el medio CDCHO libre jde proteina. La productividad media resultante de ljas fermentaciones fue 4851 mg/L con la productividad más al;ta diseñaron para imitar las condiciones de fermentación encontradas en los termentadores de escala más grande jde hasta 2000L, por consiguiente la línea de células de guía ¡se espera que sea adecuada para la manufactura a escala comercial. En realidad los niveles de expresión similares se observaron en un termentador de 200L. El producto recolectado de las fermentaciones de 4 x 10L de la línea de células de guía que expresa el Compuesto 170 (SEQ ID No: 70) se purificó mediante la cromatografía !de afinidad de Proteína A y se analizó mediante SDS PAGE bajo condiciones tanto de reducción como de no reducción. Comoise muestra en la Figura 11, el Compuesto 170 se expresa como un monómero de aproximadamente 90 kDa . Este monómero está compuesto de 2 subunidades de aproximadamente 40 kDa que son evidentes en la Figura 12 cuando el SDS PAGE se corre bajo condiciones de reducción. Puesto que el SDS PAGE no jes adecuado para el dimensionamiento exacto de proteínas, iel análisis adicional del monómero del Compuesto 170 se jha realizado. ESI-MS (Espectrometría de masas de ionización jde electrorocío) ha dimensionado el monómero de Compuesto 170 en 78.739 kDa. Esto está en acuerdo con el peso molecular predicho de 2 subunidades (2 x 38.058 = 76.116 kDa) cada uno de los cuales también lleva una estructura de azúcar |de glicado glucosilado de núcleo bi-antenario . Larga vida media de suero en primates no humanos ' El Compuesto 170 (SEQ ID No: 11) se administró i subcutáneamente a monos cinomolgus en dosis de 0.5, 5 y |50 mg/kg, y muestras de sangre se tomaron en 0.5, 1, 2, 6 y 124 horas luego en el día 1,· 2, 4, 7, 10 y 14 días. En análisjis i de estas muestras para cuantificación de los niveles del I Compuesto 170 se realizó utilizando el método de ELISA antk-TNF descrito en el Ejemplo 1. La vida media de eliminación se determine mediante el análisis de los niveles del Compuesto I 170 en estas muestras. En 0.5 mg/Kg una vida media ¡de eliminación de 110.5 + 13.9 horas se calculó. El 5 mg/Kg y j50 i mg/Kg las vidas medias de eliminación de 110.9 ± 10.4 y 103-5 I ± 11.5 horas se calcularon. J Cuando el Compuesto 170 se administró mediante lia ruta intravenosa en 50 mg/Kg muestras de sangre se tomaron jen 10, 30 y 60 minutos, 4 y 24 horas, 2, 4, 7, 10 y 14 días. El análisis de estas muestras para la cuantificación de los niveles del Compuesto 170 se realizó utilizando el método jde ELISA anti-TNF descrito en el Ejemplo 1. La vida media !de ¡ i eliminación se determinó mediante el análisis de los niveles Compuesto 170 en estas muestras. Después la administración intravenosa de 50 mg/Kg se calculó una vida media de eliminación de 109.6 ± 10.7 horas. ¦ Perfil de Seguridad Favorable El Compuesto 170 (SEQ ID No: 11) manufacturado con estándares de GMP se evaluó en estudios de seguridad' y toxicologia en animales. Seguridad de Dosis Unica . Diferentes monos administrados con dosis únicas del Compuesto 170 a 0.5, 5 y 50 mg/kg mediante la ruta !de administración subcutánea intravenosa no mostraron efectos relacionados con su tratamiento con el Compuesto 170. En estos estudios el examen microscópico de una gama de órganos fue llevado a cabo y no se observaron efectos. ! Dosis de escalación y seguridad de dosis de repetición ¡ Iniciando una dosis de 0.5 mg/kg dada ya , sea subcutáneamente o intravenosamente dosis de escalación Ide I I hasta 50 mg/kg se administraron a monos cinomolgus cada¡ 7 1 días. Los animales se estimaron para una amplia gama !de parámetros fisiológicos y de comportamiento incluyendo i hematología, química clínica, peso del cuerpo y órgano' e inspección macroscópica de los órganos después de ila 1 necropsia. Por todos estos estudios no se reportaron i reacciones adversas al tratamiento con el Compuesto 17j0.

Después de la conclusión de la fase de escalación de dosis jde i los estudios esos animales que recibieron la dosis -ide escalación subcutáneamente se administraron con 4 dosis adicionales de 50 mg/kg durante un periodo de 4 semanas adicional. Nuevamente no se observaron efectos, a través de la amplia gama de parámetros, relacionados con el tratamiento con el Compuesto 170. Seguridad Cardiovascular La seguridad cardiovascular del Compuesto 170 en 50 mg/kg se evaluó en monos cinomolgus adaptados con monitores de radio-telemetria . Estos monitores reportan una gama de jde i parámetros respiratorios y cardiovasculares directamente |de i los monos conscientes. Después de la dosificación con leí Compuesto 170 no se reportaron observaciones clínicas adversas relacionadas con el tratamiento. Expresión bacteriana El Compuesto 170 (SEQ ID No: 11) en los ejemplos precedentes se produjo en sistemas de expresión mamíferos. El Compuesto 170 funcional se produjo utilizando el sistema !de expresión bacteriano. Las secuencias de aminoácidos para el Compuesto 170 menos la secuencia de señal se tradujo nuevamente y 'se optimizó mediante GeneQptimizer™ para la expresión de E. co'li y se sintetizó de novo en GeneArt GmbH. El gen sintetizado ;se i subclonó en el vector de expresión pBAD gil I /His-TAGGF (Invitrogen) por la vía de los sitios de restricción Ncl\ y HindIII (Roche) generando un vector listo para la expresión bacteriana. Las células TOP10 (Invitrogen) se transformaron I con el vector mediante el método de choque térmico | y extractos de glicerol de colonias individuales se generaron.

Las condiciones de inducción fueron arabinosa al 0.00 I2% (Sigma; concentración final) y periodos de inducción de; 4 hrs . Las muestras de proteina del Compuesto 170 se generaron utilizando el método de choque osmótico como es detallado ien el manual del sistema de expresión bacteriano pBAD ( Invitrogen) . El ensayo BCA (Pierce) se utilizó pa!ra determinar la concentración de proteina total de las muestras. El Compuesto 170 materialmente expresado se analizó para enlazar a TNF-a en una ELISA como es descrito en el Ejemplo 1. La Figura 9 muestra que el Compuesto 170 produjo :un sistema bacteriano retenido que enlaza a TNF-a en un ensa'yo de ELISA. La secuencia de DNA para la expresión bacteriana del Compuesto 170 es como sigue: ATGGCGAGCACCGATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGT GATCGTGTGACCATTACCTGCCGTGCGAGCCAGGCGATTGATAGCTATCTGCATTGGTAT CAGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGA TTATAGCGCGAGCAACCTGGAAAGC GGCGTGCCGAGCCGTTTTAGCGGCAGCGGTAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGC AGCCTGCTGCCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCCAGCAGGTGGTGTOGCGTCCGTIJT ACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGCQTGGAACCGAAAAGCAGCGATAAÍA ACCCACACGTGCCCGCCGTGTCCGGCGCCGGAACTGCTGGGTGGCCCGAGCGTGTTTCT,G TTTCCGCCGAAACCGAAAGATACCCTGATGATTAGCCGTACCCCGGAAGTGAGCTCCGTp GTGGTGGATGTGAGCCATGAAGATCCGGAAGTGAAATTCAACTGGTATGTGGATGGCGT'G La secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID No: 61 es como sigue: (SEQ ID NO:62) ' Eficacia in vivo del Compuesto 170 en un modelo de artriéis de murino mediado por TNF humano. La linea de ratón transgénico de TNF humano, Tgl9j7, muestra expresión de TNF desregulada y desarroljla poliartritis inflamatoria crónica (Keffer, J. I y colaboradores, (1991) Transgenic mice expressing human tumor necrosis factor: a predictive genetic model of artritis.' EM¾0 Journal 10:4025-31). La administración del Compuesto 170 (SEQ ID No: 11) previno el desarrollo de artritis y la pérdida de peso asociada en estos ratones (Figura 10A & B) . Los grupos de 8 Tgl97 heterocigotos (cada uno que contiene 4 machos y 4 hembras) se trataron con inyecciones intraperitoneales dos veces a la semana del Compuesto 170 y el IgGi humano ;de control de especificidad irrelevante (palivizumab {Synagis®}, Medlmmune /Abbott ) en PBS, ambos en 10 mg/kg. El tratamierito comenzó cuando los ratones tuvieron 3 semanas de edad. ¡En intervalos semanales, los ratones se pesaron y se registraron (registro artrítico) basado en la morfología del tobillo macroscópico (hinchamiento, distorsión y grado de ¦I movimiento) . i I La sustitución de Cys en la posición 114 en el Compuesto 112 da por resultado expresión de proteína incrementada El Compuesto 112 (SEQ ID No: 59) es una modificación del Compuesto 170 (SEQ ID No: 11) que contiene un residuo de cisteína en la posición 114 en lugar de un residuo de serina que está presente en esta posición en el Compuesto 170. El efecto de sustituir la cisteína 114 por serina en ¡la expresión de proteína se evaluó mediante la comparación con el Compuesto 170. Múltiples cultivos de células hospederas transíectadas con construcciones de gen para el Compuesto 1¡12 y 170 se analizaron para la expresión de proteína mediante i ELISA con TNF en fase sólida como se expone en los Materiales y Métodos. Los resultados se exponen en la Figura 11. i Será apreciado por las personas expertas en ia I técnica que numerosas variaciones y/o modificaciones ¡se pueden hacer a la invención como es mostrado en la modalidad especifica sin apartarse del espíritu o alcance la invención como es descrito ampliamente. Las presentes modalidades, por ? I lo tanto, se van a considerar en todos los aspectos como ilustrativas y no restrictivas. !

Claims

REIVI DICACIONES j í 1. Una construcción de anticuerpo de dominio que enlaza a TNF-OÍ humano, la construcción caracterizada porque comprende: (a) un anticuerpo de dominio (dAb) que enlaza a TNF-a humano; · (b) una secuencia de región de articulación modificada; (c) una secuencia de región constante de cadena pesada ,de humano o de primate que tiene un dominio CH1 truncado ¡ de no más de 20 residuos, I I i en donde la secuencia de región de articulación modificada contiene ya sea. una supresión o una sola sustitución ¡de aminoácido de por lo menos un residuo de cisteina que normalmente facilita la formación de enlace de disulfuro I entre las cadenas de anticuerpo pesada y ligera. ! 2. La construcción de anticuerpo de dominio de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque !la secuencia de región constante de cadena pesada de humano o ;de primate que tiene un dominio CH1 truncado comprende no más jde 10 residuos. 3. La construcción de anticuerpo de dominio, de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque ¡la secuencia de región constante de cadena pesada de humano o jde primate que tiene un dominio CH1 truncado comprende no más de 5 residuos. I 4. La construcción de anticuerpo de dominio de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la secuencia de región constante de cadena pesada de humano o de primate que tiene un dominio CH1 truncado comprende no más de un solo residuo. 5. La construcción de anticuerpo de dominio 'de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la secuencia del dominio CH1 y la región de articulación es XEPKSZDKTHTCPPCPA ( SEQ ID No: 64) en donde es X es valina, leucina o isoleucina y Z está ausente o jun aminoácido diferente de cisteina. 6. La construcción de anticuerpo de dominio , de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porquej X es valina y Z es serina. 1 7. La construcción de anticuerpo de dominio jde conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a .¡6, caracterizada porque el dAb comprende un dominio variable ¡de secuencia derivada de un primate del Nuevo Mundo en donde j'la CDR se selecciona del grupo que consiste de YAATKLQS (SEQ |ID I No:l), YEASSLQS (SEQ ID No : 2 ) , YEASKLQS (SEQ ID No:3) ¡ y YSASNLET (SEQ ID No : 4 ) . j 8. La construcción de anticuerpo de dominio ¡de j conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque lia CDR es CDR2. j 9. La construcción de anticuerpo de dominio !de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque el anticuerpo de dominio tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVV RPFTFGQGTKVEIKR , (SEQ ID No:7); DÍQMTQSPSSLSASVGDRVTrrCRASQAIDSYLHWYQQ PGKAPKLLlYSASNLET ¡ GVPSRFSGSGSOrDFTLTISSLQPEDFAlYYCQQVV PFTFCQG VEI R ¡ (SEQ ID No:8); j DIQMTQ5PSSLSASVGDR VT1TCR ASQSIDS YLHWYQQ KPGKAP LLIYSASNLETG 1 VPSRFSGSGSGTDFTLTISS!-LPEDFATYYCQQVVWRP TFGQGT ^IKR (SEQ ID No:9); DlQMTQSPSSI^ASVGDR\ rrCRASQAlDSYLfWYQQKPGKAPKLIJY6'ASNLET 1 GVPSRFSGSGSGTDPIXTISSLI^EDFATYYCQQVVWRPFTFGQGT VEÍ R ¦! (SEQ ID No: 10); DIQMTQSPSSJ -S AS VGDRVTITCR ASQS ÍDSYLHWYQQKP í PP LLIYSASNLETG VPSRFSGSGSOTDFrLTISSLQPEDFATr'CQQVYWRPFTFGQGT VEIKR (SEQ ID No:52); DIQMTQSPvSvSLSASVGDRVTlTCUASQSIDSYLmVYQQ PG AP LLrYSASNLET » ! VPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFrFGQGTKVEIKR | (SEQ ID No:53); DIQMTQSPSSLSAS VQD VTrrCRASQS IDSYLHWYQQ PG APKLLlYSAS LETG VPSRI¾GSGSOTDFlLTIS5LVPfcOFATYYCQQ WRPHTOQGTKVEIKR una secuencia por lo menos 95% idéntica a una de estas secuencias. j 10. La construcción de anticuerpo de dominio -de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque el residuo de cisteina dentro de la i región de articulación que normalmente facilita la formación de enlace de disulfuro entre las cadenas de anticuerpo pesada y ligera es sustituido con un residuo de serina. 11. La construcción de anticuerpo de dominio ¡de i conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque la región de articulación comprende | la secuencia EPKSSDKTHTCPPCPA (SEQ ID No : 12 ) . 12. La construcción de anticuerpo de dominio ide conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque la región constante comprende los dominios CH2 y CH3 por lo menos 60% idénticos a la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 63. ¡ 13. La construcción de anticuerpo de dominio 'de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque 1 los dominios CH2 y CH3 son por lo menos 80% idénticos a ¡la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 63. 14. La construcción de anticuerpo de dominio ;de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque i los dominios CH2 y CH3 son por lo menos 90% idénticos a |la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 63. 15. La construcción de anticuerpo de dominio !de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque los dominios CH2 y CH3 son por lo menos 95% idénticos a la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 63. 16. La construcción de anticuerpo de dominio de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque j i los dominios CH2 y CH3 son por lo menos 96% idénticos a la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 63. ¡ 17. La construcción de anticuerpo de dominio jde conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque ¡ los dominios CH2 y CH3 son por lo menos 97% idénticos a lia i secuencia expuesta en la SEQ ID No: 63. j construcción de anticuerpo de dominio de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque los dominios CH2 y CH3 son por lo menos 98% idénticos a !la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 63. 19. La construcción de anticuerpo de dominio ¡de I conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque los dominios CH2 y CH3 son por lo menos 99% idénticos a ¡la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 63. ¡ I 20. La construcción de anticuerpo de dominio ;de I conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a l|9, caracterizada porque CDR1, CDR3 o por lo menos una región jde estructura se modifica para mejorar el enlace de antigeno, j 21. El anticuerpo de dominio de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizacio porque la secuencia de aminoácidos es por lo menos 60% i idéntica a la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 11. ; 22. El anticuerpo de dominio de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es por lo menos 80% idéntica a la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 11. 23. El anticuerpo de dominio de conformidad con :la reivindicación 22, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es por lo menos 90% idéntica a la secuencia i expuesta en la SEQ ID No: 11. 24. El anticuerpo de dominio de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la secuencia !de aminoácidos es por lo menos 95% idéntica a la secuencjia expuesta en la SEQ ID No: 11. j ' 25. El anticuerpo de dominio de conformidad con jla reivindicación 24, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es por lo menos 96% idéntica a la secuencia expuesta en. la SEQ ID No: 11. ; 26. El anticuerpo de dominio de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la secuencia de i aminoácidos es por lo menos 97% idéntica a la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 11. 27. El anticuerpo de dominio de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es por lo menos 98% idéntica a la secuencia ¡ expuesta en la SEQ ID No: 11. ! ¦ 28 . El anticuerpo de dominio de conformidad con jla reivindicación ' 27 , caracterizado porque la secuencia j de aminoácidos es por lo menos 99% idéntica a la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 11 . 29 . El anticuerpo de dominio de conformidad con i la reivindicación 28 , caracterizado porque la secuencia |de aminoácidos es idéntica a la secuencia expuesta en la SEQ jlD No:ll. < i 30 . La construcción de anticuerpo de dominio de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29 , caracterizada porque el anticuerpo de dominio tiene baja inmunogenicidad en humanos. \ 31 . Una construcción de anticuerpo de dominio dimérica que enlaza a TNF-a humano, caracterizada porque ¡el dimero consiste de dos construcciones de anticuerpo ¡de dominio de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones i 1 a 30 . j 32 . La construcción de anticuerpo de dominÜo dimérica de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada porque la construcción de anticuerpo de dominio dimérica es un homodimero. I 33 . La construcción de anticuerpo de dominjio í dimérica de conformidad con la reivindicación 32 , caracterizada porque las construcciones de anticuerpo de dominio que constituyen el homodimero comprenden una j secuencia de aminoácidos que es por lo menos 50% idéntica a i la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 11. j i 3 . La construcción de anticuerpo de dominio dimérica de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque las construcciones de anticuerpo de dominio que constituyen el homodimero comprenden una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80%· idéntica; a la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 11. 35. La construcción de anticuerpo de dominio í dimérica de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque las construcciones de anticuerpo |de dominio que constituyen el homodimero comprenden üna secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a I la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 11. ; 36. La construcción de anticuerpo de dominio dimérica de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque las construcciones de anticuerpo de dominio que constituyen el homodimero comprenden una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 11. i ! 37. La construcción de anticuerpo de dominio dimérica de conformidad con la reivindicación 3!ß, caracterizada porque las construcciones de anticuerpo 'de dominio que constituyen el homodimero comprenden una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 96% idéntica' a la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 11. j 38. La construcción de anticuerpo de dominio dimérica de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque las construcciones de anticuerpo de dominio que constituyen el homodimero comprenden una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 97% idéntica a la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 11. 39. La construcción de anticuerpo de dominio dimérica de conformidad con la reivindicación 38, i caracterizada porque las construcciones de anticuerpo j de dominio que constituyen el homodimero comprenden lina secuencia de aminoácidos que es por lo menos 98% idéntica a la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 11. ' 40. La construcción de anticuerpo de dominio i dimérica de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque las construcciones de anticuerpo de dominio que constituyen el homodimero comprenden na secuencia de aminoácidos que es por lo menos 99% idéntica! a i la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 11. j 41. La construcción de anticuerpo de dominio 1 dimérica de conformidad con la reivindicación 40, ? caracterizada porque las construcciones de anticuerpo 'de dominio que constituyen el homodimero comprenden la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No: 11. j 42. Una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque codifica una construcción de anticuerpo J de dominio de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30. 43. Una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque comprende una secuencia de ácido j nucleico que codifica una construcción de anticuerpo i de dominio que enlaza TNF-a humano, en donde la secuencia de ácido nucleico es por lo menos 60% idéntica a la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 50 o SEQ ID No: 51. ' I 44. La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque. la secuencia de ácido nucleico es por lo menos 80% idéntica a ¡la I secuencia expuesta en la SEQ ID No: 50 o SEQ ID No.51. 45. La molécula de ácido nucleico aislada !de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada porque la • i secuencia de ácido nucleico es por lo menos 90% idéntica a jla secuencia expuesta en la SEQ ID No: 50 o SEQ ID No.51. j i 46. La molécula de ácido nucleico aislada jde conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque jla secuencia de ácido nucleico es por lo menos 95% idéntica a ¡la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 50 o SEQ ID No.51. :. 47. La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque la secuencia de ácido nucleico es por lo menos 96% idéntica a la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 50 o SEQ ID No.51. j 48. La molécula de ácido nucleico aislada ¡de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque j la secuencia de ácido nucleico es por lo menos 97% idéntica a ' la j secuencia expuesta en la SEQ ID No: 50 o SEQ ID No.5-1. 49. La molécula de ácido nucleico aislada I de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque ; la i secuencia de ácido nucleico es por lo menos 98% idéntica a ; la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 50 o SEQ ID No.51. I 50. La molécula de ácido nucleico aislada 'de i conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porquería secuencia de ácido nucleico es por lo menos 99% idéntica a 'la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 50 o SEQ ID No.51. 51. La molécula de ácido nucleico aislada ,de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque la secuencia de ácido nucleico es idéntica a la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 50 o SEQ ID No.51. 52. Una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una construcción de anticuerpo ;de dominio que enlaza TNF-a humano, en donde la secuencia de ácido nucleico híbrida bajo condiciones de alta severidad a la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID No: 50 o SEQ ID No: 51. 53. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una cantidad efectiva de una construcción :de anticuerpo de dominio de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, junto con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. j 54. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una cantidad efectiva de una construcción de anticuerpo de dominio dimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, junto con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. ¡ 55. Un método para detectar TNF-a humano en una muestra, caracterizado porque comprende poner en contacto jla muestra con una cantidad efectiva de una construcción jde i anticuerpo de dominio de conformidad con cualquiera de ljas reivindicaciones 1 a 41 y detectar la cantidad jde construcción de anticuerpo de dominio enlazada. 56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la muestra es una muestra biológica. 1 57. Un método para tratar un desorden representado por actividad de TNF-a humano en un sujeto humano, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una j cantidad efectiva de una composición farmacéutica de ¡la reivindicación 55 o reivindicación 56. '< 58. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el desorden representado por actividad de TNF-a humano se selecciona del grupo que consiste de inflamación, enfermedades inflamatorias, sepsis, que incluye choque séptico, choque endotóxico, sepsis grám negativa y síndrome de choque tóxico; enfermedad autoinmune, que incluye artritis reumatoide, artritis juvenil, espondilitis reumatoide, espondilitis anquilosante, síndrome de Sjógren, osteoartritis y artritis gotosa, alergia, esclerosis múltiple, diabetes autoinmune, uveítis autoinmune, psoriasis, síndrome penfigoide y nefrótico; condiciones inflamatorias del ojo, que incluye degeneración macular, uveítis, enfermedad de Behcet; enfermedad infecciosa, que incluye fiebre y mialgias debido a la infección y caquex'ia secundaria a la infección; enfermedad de injerto contra hospedero; crecimiento de tumor o metástasis, malignidades hematológicas ; desórdenes pulmonares que incluyen asma, síndrome de aflicción respiratoria de adulto, pulmón de choque, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, sarcoidosis pulmonar, fibrosis y silicosis pulmonar; desórdenes del intestino inflamatorio que incluye la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerativa; desórdenes cardíacos, falla del corazón congestivo; desórdenes vasculares que incluyen la enfermedad de egener, arteritis de célula gigante; desórdenes de hueso inflamatorio, desórdenes del sistema nervioso central tal como la enfermedad de Alzheimér; desórdenes del sistema nervioso periférico tal como ciática, hepatitis, disturbios de coagulación, quemaduras, lesión por reperfusión, endometriosis, formación queloide y formación de tejido de cicatrización. 59. El método de conformidad con la reivindicación 57 o reivindicación 58, caracterizado porque el desorden representado por actividad de TNF- humano es un desorden ocular relacionado con angiogénesis . '! 60. El método de conformidad con la reivindicaci|ón 59, caracterizado porque el desorden ocular relacionado cjon i angiogénesis es la degeneración macular relacionada con ila edad .