MX2008009208A - Tratamiento de trastorno isquemico utilizando trombopoyetina. - Google Patents
Tratamiento de trastorno isquemico utilizando trombopoyetina.Info
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Abstract
Un método para tratamiento terapéutico o profiláctico contra isquemia debido a infarto miocárdico, donde se administra trombopoyetina sola o combinada con otros fármacos, a un paciente que sufre de o está en peligro de lesión cardíaca, como la isquemia miocárdica. La trombopoyetina es administrada a una concentración tal, que el conteo plaquetario del sujeto o la producción de plaquetas no son considerablemente afectados.
Description
TRATAMIENTO DE TRASTORNO ISQUEMICO UTILIZANDO TROMBOPOYETINA
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La enfermedad cardíaca isquémica, la causa subyacente de la mayoría de los infartos de miocardio agudos, insuficiencia cardíaca congestiva, arritmias, y muerte cardíaca súbita, son la causa principal de morbilidad y mortalidad en todas las naciones industrializadas. En los Estados Unidos, la enfermedad cardíaca isquémica causa casi el 20 % de todas las muertes (aproximadamente 600 , 000 muertes cada año). Aproximadamente 1 . 1 millones de estadounidenses tendrán un infarto miocárdico agudo nuevo o recurrente este año, y muchos sobrevivientes experimentarán la morbilidad durable, con la progresión a paro cardíaco y muerte. Cuando la población envejece y los padecimientos, como obesidad y diabetes se hacen más frecuentes, la carga de salud pública enorme causada por la enfermedad cardíaca isquémica probablemente aumentará incluso más (Bolli, et al., Circ. Res. 95 : 125-134 , 2004 ) . La trombopoyetina (Tpo) es una proteína descubierta en el cuerpo que estimula la médula ósea para producir plaquetas y ayuda en su desarrollo. El factor humano de crecimiento megacariocítico pegilado recombinante (PEG-rHuMGDF) es una proteína truncada ( 163 aminoácidos) conteniendo sólo la región de unión al receptor, que ha sido químicamente modificada (alquilación reductiva N-terminal) mediante la adición de PE3 ; Ref. 194637 PEG-rHuMGDF fue desarrollado por Amgen. Pegilación de po aumentos además la vida media plasmática en de 10 veces. Formas ambas de Tpo han experimentado mediante la investigación clínica extensa, y actividades biológicas de proteínas ambas son similares. Ambo han mostrado ser estimuladores potentes de crecimiento megacariocítico y producción plaquetaria y son biológicamente activos para reducir la trombocitopenia de la quimioterapia no mieloablativa. Después de la administración sistémica, el conteo plaquetario comienza a aumentar después de tres a cinco días . Sería deseable proporcionar una terapia y productos terapéuticos para aumentar con eficacia la resistencia del corazón a la lesión causada por la isquemia, incluyendo el establecimiento de cirugía cardíaca y trasplante (isquemia miocárdica global) y ataque cardíaco (isquemia miocárdica localizada) .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una modalidad, la presente invención proporciona métodos para proteger te ido de mamífero y órganos, particularmente el corazón, de los efectos nocivos de la isquemia y proporciona composiciones farmacéuticas que incorporan ligandos de receptor de Tpo para el empleo en tales métodos . Hemos descubierto que la administración de Tpo a un paciente mamífero según los métodos para la invención se proporciona beneficioso inmediato y retardó efectos cardioprotectores en el corazón, particularmente en el aumento de la resistencia del corazón a la isquemia. Según la invención, el ligando de receptor de Tpo, preferentemente de Tpo, es administrado como un agente terapéutico para la cardioprotección y en el tratamiento de la isquemia, incluyendo las lesiones causadas por efectos de reperfusión de la isquemia. En la versión más preferida de la presente invención, el tratamiento no aumenta el conteo plaquetario en más del 10 %, el más preferentemente en más del 1 %. La invención proporciona los métodos para reducir inmediatamente los efectos de la isquemia miocárdica en un humano u otro mamífero para prevenir o disminuir el daño al corazón. El método implica administrar de Tpo en una composición farmacéutica en una cantidad efectiva para reducir los efectos per udiciales de la isquemia miocárdica. En una modalidad, el método comprende el precondicionamiento de un paciente contra la isquemia miocárdica (lesión isquémica) mediante la administración del ligando de receptor de Tpo a un paciente a una concentración y duración efectiva para prevenir o reducir tal lesión sustancialmente inmediatamente después de su acontecimiento. Por ejemplo, el método puede implicar administrar Tpo a un paciente antes de un previsto episodio isquémico, como un procedimiento quirúrgico, para p'recondicionar al paciente. Preferentemente, una composición que contiene una cantidad de ligando de receptor de Tpo efectiva para dar como resultado un nivel de sangre de aproximadamente 0 . 01-10 . 0 ng/ml del ligando de receptor de Tpo dentro de un poco tiempo de la administración de la composición de ligando de receptor de Tpo (preferentemente dentro de 1-20 minutos) es administrada al paciente antes de un episodio isquémico, generalmente 1-60 minutos previos, preferentemente 5-15 minutos antes del episodio. Una cantidad de dosis preferida es de aproximadamente 0 . 01-1 . 0 microgramos/kgs en peso del paciente del ligando de receptor de Tpo. En otra modalidad de la presente invención, el ligando de receptor de Tpo puede ser administrado a un órgano de donante (p.ej, corazón), antes del trasplante vía el sistema vascular a una concentración y duración efectiva para prevenir o reducir la lesión de los efectos de isquemia y reperfusión del procedimiento de trasplante. Preferentemente, una solución que contiene una cantidad efectiva de ligando de receptor de Tpo, preferentemente una concentración de aproximadamente 0 . 01-10 . 0 ng/ml del ligando de receptor de Tpo, es administrada al órgano 1-60 minutos antes del trasplante, preferentemente 5-20 minutos previos, para proporcionar una concentración de aproximadamente 1 . 0 ng/ml del ligando de receptor de Tpo dentro del órgano. Esto podría ser logrado mediante la administración del ligando de receptor de Tpo sistémicamente al cuerpo completo antes de la recolección de órgano o sólo al órgano. En otra modalidad, el Tpo puede ser administrado en comienzo de y/o subsecuente a un episodio isquémico para tratamiento, prevención o disminución de la lesión al corazón. Los ejemplos de tales episodios incluyen un procedimiento quirúrgico durante el cual una lesión por isquemia-reperfusión puede ocurrir al momento de reperfusión de un órgano o tejido, como el corazón u otra cirugía de órgano, un procedimiento de trasplante, y lo similar. Además, un paciente que experimenta los síntomas de un estado de enfermedad, como un infarto miocárdico, por ejemplo, puede ser el ligando de receptor de Tpo administrado para disminuir sustancialmente inmediatamente la lesión isquémica al corazón. El ligando de receptor De Tpo puede ser administrado a un paciente en una composición farmacéutica que contiene una cantidad terapéutica del ligando de receptor de Tpo efectiva a sustancialmente inmediatamente disminución o prevenir el daño al corazón causado por el episodio isquémico. Preferentemente, una composición que contiene una cantidad efectiva de ligando de receptor de Tpo para dar como resultado un nivel de sangre de aproximadamente 0.1-10.0 ng/ml del ligando de receptor de Tpo son administrados al paciente a o sobre el comienzo del episodio isquémico y/o dentro de un poco tiempo subsecuente al episodio isquémico para una duración efectiva, para dar como resultado la cardioprotección sustancialmente inmediata y disminuyeron la lesión isquémica, preferentemente 1-20 minutos después de la administración. Una cantidad de dosis preferida es 0.01-1.0 microgramos/kgs del ligando de receptor de Tpo. Aunque no es para limitar la invención, se cree que un modo que Tpo puede reducir la lesión causada por la isquemia y proporcionar un efecto cardioprotector sustancialmente inmediato mediante la activación de canales de potasio. En consecuencia, la invención también proporciona un método para activar una vía de señalización cardioprotectora, por ejemplo, activar un canal de potasio (p.ej, KATP) para proporcionar un efecto cardioprotector. Preferentemente, una composición que contiene una cantidad efectiva de ligando de receptor de Tpo para obtener un nivel de sangre de aproximadamente 0.05-0.5 ng/ml de ligando de receptor de Tpo sustancialmente inmediatamente después de administración, preferentemente dentro de aproximadamente 1-20 minutos, con una cantidad de dosis preferida de aproximadamente 0.?1-1.0 microgramos/kgs de ligando de receptor de Tpo. La invención además proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden Tpo en un portador fisiológicamente aceptable. Las composiciones son formuladas para proporcionar una cantidad efectiva de Tpo para proporcionar un efecto cardioprotector sustancialmente inmediato, por ejemplo, disminuir los efectos de isquemia en el corazón y/o otro tejido u órgano, preferentemente a una concentración de ligando de receptor de Tpo para dar como resultado un nivel de sangre de aproximadamente 0.1-10.0 ng/ml, preferentemente a o aproximadamente 1.0 ng/ml , preferentemente aproximadamente 1-20 minutos después de la administración. Una composición farmacéutica preferida es formulada para proporcionar una cantidad de dosis de aproximadamente 0.01-1.0 microgramos/kgs del ligando de receptor de po, preferentemente 0.05 microgramos/kgs del ligando de receptor de Tpo y preferentemente en un tratamiento individual. Para un paciente típico, esto sería una composición que comprende 0.8-80 microgramos, preferentemente 2-6 microgramos del ligando de receptor de Tpo. Los métodos para la invención ventajosamente proporcionan un sustancialmente inmediato (y retardado) efecto cardioprotector contra la lesión causada por la isquemia. Cuando se presentan los síntomas del ataque cardíaco, apoplejía u otro estado de enfermedad, o en la conducción de un trasplante de órgano, por ejemplo, cardioprotección inmediata o cerebroprotección contra la lesión isquémica, esto es deseado en vez de un efecto retardado. La invención elimina o sustancialmente reduce el período de espera para que la cardioprotección actúe.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es Western blot (transferencia Western) que demuestra la presencia del receptor de Tpo en el corazón. La Figura 2 es una descripción de un protocolo experimental usado para los estudios de respuesta a concentración de po. La Figura 3 es una descripción gráfica de los resultados del estudio de respuesta a concentración de Tpo en vi tro que ilustra la reducción del tamaño de infarto (% en el ventrículo izquierdo (LV) ) en el corazón después de 15 minutos del tratamiento con Tpo a 0.01, 0.1, 1.0 y 10.0 ng/ml antes de isquemia generalizada de 25 minutos y reperfusión de 180 minutos. Los datos son el promedio. +-.SD, n=8 corazones /grupo . * =P <0.05, Tpo contra control sin fármaco. La Figura 4 es una descripción gráfica de los resultados del estudio de respuesta a concentración Tpo en vitro ilustración del por ciento (%) de la recuperación de la presión desarrollada en el ventrículo izquierdo (cuadro relleno) . en el corazón después de 15 minutos de tratamiento con Tpo a 0.01, 0.1, 1.0 y 10.0 ng/ml antes de isquemia generalizada de 25 minutos y reperfusión de 180 minutos. Los datos son el promedio ± SD, n=8 corazones /grupo . * =P <0.05, Tpo contra control sin fármaco . La Figura 5 es una representación gráfica del grado con el cual Tpo limita la apoptosis después de un tratamiento de 15 minutos con Tpo (1.0 ng/ml) antes de isquemia generalizada de 25 minutos y reperfusión de 180 minutos. * =P <0.05, contra perfusión, #=P<0.05, contra isquemia/reperfusión. Las Figuras 6A-6B son una representación gráfica de los resultados de los efectos -cardioprotectores mediados de Akt por Tpo. Recuperación de Presión desarrollada en el ventrículo Izquierdo (LVDP) (Figura 6B) y el grado de tamaño de infarto (Figura 6A) después de un tratamiento de 15 minutos con Tpo (1.0 ng/ml) y un inhibidor de Akt antes de isquemia generalizada de 25 minutos en vitro y reperfusión de 180 minutos. El inhibidor de Akt usado era la wortmanina ("Wort") a 100 nM. Los datos son el promedio ± SD (n=8 corazones/grupo) . * =P <0.05, Tpo contra fármaco control libre. + =P <0.05, Tpo + fármaco contra. Tpo. Las Figuras 7A-7B son una descripción gráfica de los resultados de los efectos cardioprotectores mediados del canal de potasio por Tpo. Recuperación de Presión desarrollada en el ventrículo Izquierdo (LVDP) (Figura 7B) y el grado de tamaño de infarto (Figura 7A) después de un tratamiento de 15 minutos con Tpo (1.0 ng/ml) y un bloqueador de canal de potasio antes de isquemia generalizada de 25 minutos en vitro y reperfusión de 180 minutos. El bloqueador de canal de potasio usado era la gibenclamida ("Glib") a 3µ?. Los datos son el promedio ± SD (n=8 corazones/grupo) . * =P <0.05, Tpo contra fármaco control libre, + =P <0.05, Tpo+drug contra. Tpo. La Figura 8 es una descripción gráfica del efecto del Tpo (0.05 microgr mos/kgs ) en el tamaño de infarto miocárdico in vivo (como el porcentaje del área en peligro) cuando es administrado intravenosamente 15 minutos antes de una isquemia miocárdica localizada de 30 minutos in vivo inducido por el ligamiento por sutura de la arteria coronaria principal izquierda y reperfusión de 3 horas. * =P <0.05, con Tpo contra sin Tpo (control) antes de una isquemia miocárdica localizada de 30 minutos in vivo inducido por ligamiento por sutura de la arteria coronaria principal izquierda y reperfusión de 3 horas. * =P <0.05, con Tpo contra sin Tpo (control) . La Figura 9 es una descripción gráfica del efecto de Tpo (0.05pg/kg) en el tamaño de infarto miocárdico in vivo (como el % de porcentaje del área en peligro) cuando administrado intravenosamente 15 minutos después del inicio de 30 minutos isquemia miocárdica localizada in vivo inducido por el ligamiento por sutura de la arteria coronaria principal izquierda y reperfusión de 3 horas. * =P <0.05, con Tpo contra sin Tpo (control) . La Figura 10 es una descripción gráfica del efecto de Tpo (0.05pg/kg) en el tamaño de infarto miocárdico in vivo (como el % de porcentaje del área en peligro) cuando administrado intravenosamente 10 segundos después del inicio de reperfusión de 3 horas después de 30 minutos isquemia miocárdica localizada in vivo inducido por el ligamiento por sutura de la arteria coronaria principal izquierda. * =P <0.05, con Tpo contra sin Tpo (control) . La Figura 11 es una descripción gráfica de la disminución en el tamaño de infarto miocárdico in vivo cuando el Tpo (0.05 microgramos/kgs) fue administrado intravenosamente 24 horas antes de 30 minutos isquemia miocárdica in vivo localizada induqida por el ligamiento por sutura de la arteria coronaria principal izquierda y reperfusión de 3 horas. * =P <0.05, sin Tpo (control) contra con Tpo. Las Figuras 12A y 12B es una descripción gráfica del conteo plaquetario (Figura 12A) / hematocrito (Figura 12B) después del tratamiento individual con el Tpo (0.05 microgramos/kgs) con respecto a un periodo de seguimiento de 14 días . Las Figuras 13A-13B son una descripción gráfica del conteo plaquetario (Figura 13A) / hematocrito (Figura 13B) después del tratamiento individual con el Tpo (1.0 microgramos/kgs) con respecto a un periodo de seguimiento de 28 días.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En Términos generales La trombopoyetina (también conocido como Tpo, ligando de c-mpl, factor de diferenciación y crecimiento megacariocítico, factor estimulante de trombocitopoyesis ) es una hormona de aproximadamente peso molecular de 70 000 daltons. El Tpo, el ligando de c-mpl, es el regulador fisiológico primario -del desarrollo megacariocítico y plaquetario. Es producido principalmente en el hígado. Varios Tpos recombinantes han sido desarrollados para la evaluación clínica, incluyendo rhTpo y PEG-rHu MEDF. La secuencia de aminoácido de rhTpo «Senentech, San Francisco del Sur, California) es un polipéptido de cadena completa idéntico a aquel de Tpo endógenos. El rhTpo es producido en células de mamífero y está glucosilado. PEG-rHu MGDF es producido en Escherichia coli. No se sabe si el receptor para Tpo está presente en el corazón o si ese Tpo desempeña un papel fisiológico en el corazón o puede proteger órganos/tej idos de la lesión que proviene de la isquemia/reperfusión. La isquemia es una afección que resulta de la disminución o la falta del flujo de sangre y oxígeno a una parte del cuerpo, como el corazón o cerebro (isquemia cardíaca; la cardiomiopatía isquémica) , que causa daño al te ido que es distal a un bloqueo. Durante ciertos procedimientos quirúrgicos, como cirugía cardíaca y trasplante de órgano, el flujo de sangre es detenido temporalmente y luego reanudado (reperfusión) , dando como resultado lesión por isquemia-reperfusión. Durante un ataque cardíaco, la sangre que suministra el corazón es detenida, también dando como resultado isquemia que puede evolucionar en el infarto. El tratamiento actual para aliviar ataques cardíacos requiere reperfusión del área isquémica del corazón usando fármacos trombolíticos y angioplastia coronaria percutánea transluminal . Tpo es el ligando para el receptor de citocina Mpl y es el regulador primario de la maduración megacariocítica . Tpo es producido en el hígado, ríñones, y médula ósea y pone en circulación en el plasma sanguíneo a un intervalo de concentración normal de 50-250 pg/ml. El receptor Mpl es expresado en plaquetas, megacariocitos , y todas las etapas de progenitores megacariocíticos que incluyen CD34 + nueva población de células madres . El enlace entre niveles de sangre Tpo reducidos y enfermedad cardíaca no es concluyente. En una modalidad, la invención es dirigida a métodos para usar Tpo para proteger inmediatamente el corazón o el cerebro de un paciente contra la lesión causada por la isquemia miocárdica. Por "inmediatamente", se da a entender que el efecto cardioprotector contra la isquemia ocurre al instante o dentro de un período de poco tiempo después de la administración de una composición que comprende Tpo o ligando de receptor Tpo, preferentemente dentro de al menos 35 minutos después de la administración, más preferentemente dentro de 1-20 minutos, más preferentemente dentro de 1-15 minutos, más preferentemente dentro de 1-10 minutos, y el más preferentemente dentro de 1-5 minutos. En otra modalidad, Tpo también confiere la cardioprotección retardada que es relevante para el tratamiento de la angina de pecho inestable. Por "retardado", se da a entender que el efecto cardioprotector contra la isquemia está presente después de un período de tiempo después de la administración de una composición que contiene Tpo o ligando de receptor Tpo, preferentemente la cardioprotección todavía está presente después de 24 , preferentemente 96 horas. Preparación de Tpo Adecuada Las preparaciones Tpo adecuadas para el empleo en los métodos para la invención ("ligandos de receptor Tpo", "o ligandos de receptor de trombopoyetina" ) incluyen Tpo de origen natural (p.ej, Tpo extraído de la orina humana y purificado) o Tpo humano recombinante (rhTpo) , y modificaciones de lo mismo, teniendo propiedades fisiológicas y biológicas sustancialmente comparables (el más preferentemente, la capacidad de aumentar el conteo plaquetario / cantidad) a Tpo mamífero, sobre todo el Tpo y rhTpo humano. El mayor conteo plaquetario / cantidad es ejemplificado en el Somlo, et al., Blood 93 : 2798-7806 , 1999 y Vadhan-Ra ú et al., Ann. Intern. Med. 126 : 673 - 681 , 1997 . Una preparación Tpo adecuada para el empleo en la presente invención aumentará el conteo plaquetario / cantidad, como es ejemplificado en las siguientes referencias, en al menos el 20 % de ser cuantificado en la manera de las referencias citadas con anterioridad. Tpo puede ser obtenido comercialmente o, por ejemplo, como se describe en la Patente Estadounidense Número 5 830 647 (Eaton, et al.) y Patente Estadounidense Número 5 879 673 (Thomas, et al.). El Tpo humano recombinante (rhTpo) está comercialmente disponible de Genentech (San Francisco del Sur, California) y Pfizer (Nueva York, Nueva York) . Forma truncada de la molécula ha sido desarrollada por Amgen Inc. (Thousand Oaks, CA) . Los ligandos de receptor Tpo adecuados abarcados por la presente invención también incluyen moléculas Tpo-derivadas con actividades dirigidas hacia el mejoramiento de actividad trombopoyética en la molécula, incluyendo, entre otros, por ejemplo, aquellos con aminoácidos en término de carboxi ; isoformas de Tpo con diversas cantidades de residuos ácidos siálicos por molécula; los péptidos que unen al receptor Tpo como se describe en Patentes de EE.UU Número 5 869 451, 5 932 546, 6 083 913, 6 121 238, 5 869 451, 6,251,8646,506,362 y 6 465 430 Número de Publicación de EE.UU. US 2003/0158116 y ejemplificado por el compuesto 497115 de Glaxo Smith Kline, miméticos de pequeña molécula como se describe en Número de Publicación de EE.UU. US 2003/0195231, US 2003/0162724, US 2004/0063764, US 2004/0082626; Tpo modificado por polietilenglicol , Tpo modificado por glucosilación como se describe por Elliot, et al. (Nature Biotechnology 21:414-421, 2003), AMG531 (Amgen, Thousand Oaks, CA) y anticuerpo de agonista Tpo descrito por Alexion Pharmaceuticals (Cheshire, Connecticut) y Xoma (Berkeley, California) y descrito en Bar estadounidense. No. 2004/0136980 estadounidense. Las modificaciones adicionales pueden incluir Tpos pero no se limitan a, carboamilado, Tpos succinilado, Tpos acetilado, Tpos biotinilado, Tpos yodado, y carboximetilisilo Tpos, y lo similar. Otros ligandos de receptor Tpo adecuados son descritos y afirmados en las Patentes de EE.UU Número 6 887 890; 5 989 538; 5 756 083; 5 498 599; y 6 866 998. Otros novedosos compuestos que unen al receptor Tpo y son "ligandos de receptor Tpo" son descritos aquí (todos incorporados por referencia) : 1. Wang. B. y Al-.. Clin. Pharmacol . Ther. 73:628-638. 2004. 2. Orita, T.f y Al-, Blood 105:562-566, 2005. 3. Inagaki, K., et al., Blood 104:58-64, 2004. 4. de Serres, M. , et al . , Stem Cells 17:203-209, 1999. 5. de Serres, M. , et al., Stem Cells 17:316-326, 1999. 6. Cwirla, S.E., et al., Science 276:1696-1699, 1997. 7. Caso, a. de J.C., et al., Stem Cells 18:360-365, 2000.
8. Erickson-Miller , C.L., et al., Exp. Hematol . 33:85-93, 2005.
Composiciones Farmacéuticas En la presente invención, el ligando de receptor Tpo es formulado en una composición farmacéutica mediante la combinación del ligando de receptor Tpo con un portador farmacéuticamente aceptable en una cantidad terapéutica efectiva para reducir la isquemia miocárdica en un paciente para disminuir el daño al corazón. La composición farmacéutica puede ser administrada oralmente, intravenosamente, subcutáneamente, intramuscularmente, intraperitonealmente, transdérmicamente, nasalmente, o por el supositorio, en general, la administración sistémica es preferible. El ligando de receptor Tpo, como el ingrediente activo para la reducción de la isquemia miocárdica, puede ser formulado con portadores parenterales convencionales farmacéuticamente aceptables para la administración por inyección, que son compatibles con Tpo, esencialmente es no tóxico y no terapéutico, como agua destilada estéril, solución salina, solución de Ringer, solución dextrosa, solución de Hank, o lo similar, y fisiológicamente aceptable para el paciente. Para la administración parenteral, el Tpo puede ser incorporado en una solución o suspensión, preferentemente una solución o suspensión amortiguada. Una formulación intranasal puede estar preparada como una preparación parenteral como una solución o suspensión para la administración en forma de gotas o utilización de aerosol, por ejemplo, un nebulizador o atomizador para la inhalación por el paciente. Una preparación parenteral o intranasal puede ser asépticamente encerrada en ampollas, frascos, jeringas desechables y otros recipientes adecuados. En un sistema de administración transdérmico, el ligando de receptor Tpo puede estar preparado como una composición tópica en forma líquida o semilíquida, como una loción, crema, ungüento, gel, pasta, solución o suspensión. La administración transdérmica de Tpo por la penetración de piel puede ser potenciada por el empleo de métodos oclusivos (p.ej, abrigo o película plástica impermeable) que hidrato la piel y temperatura de piel de aumento, o por el empleo de un agente de penetración adecuado (p.ej, agua, polioles, como glicerina y propilenglicol ) . Una forma de dosificación de supositorio puede estar preparada mediante la combinación del ligando de receptor Tpo con un portador que comprende una base de mantequilla de cacao, o una base hidrosoluble o dispersable, como polietilenglicoles y glicéridos, que es sólido a temperatura ambiente (aproximadamente 20 ° C) y derrite a la temperatura de cuerpo. Los supositorios son comúnmente individualmente la hoja ' de metal se abrigó, o herméticamente selló en un recipiente plástico moldeado. El tratamiento del paciente usando el método para la presente invención implica administrar cantidades terapéuticas del ligando de receptor Tpo composición farmacéutica, que contiene el ligando de receptor Tpo en una cantidad efectiva para proporcionar una dosis adecuada con su objetivo intencionado . Las composiciones preferidas y las preparaciones están preparadas de modo que forma de unidad de dosis contenga una cantidad de ligando de receptor Tpo efectivo para proporcionar una concentración sanguínea de 0.01-10.0 ng/ml del ligando de receptor Tpo, preferentemente 0.05-0.5 ng/ml del ligando de receptor Tpo, preferentemente 0.5-5.0 ng/ml del ligando de receptor Tpo, y preferentemente aproximadamente 1.0 ng/ml del ligando de receptor Tpo, inmediatamente después de la administración. Preferentemente, la composición contiene el ligando de receptor Tpo en un efecto de cantidad de proporcionar una concentración sanguínea deseada del ligando de receptor Tpo dentro de al menos 35 minutos después de la administración, preferentemente dentro de 1-20 minutos, preferentemente dentro de 1-15 minutos, preferentemente dentro de 1-10 minutos, y preferentemente dentro de 1-5 minutos. La cantidad de dosis efectiva del ligando de receptor Tpo que es administrado puede variar según la ruta de administración, y la edad, peso y/o la salud del paciente, y otros factores, como afección que es sometida a tratamiento. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir pequeñas cantidades de adyuvantes, como amortiguadores y conservadores para mantener la isotonicidad, fisiológica y estabilidad de pH, que no afectan negativamente la eficacia de la composición de ligando de receptor Tpo. En una modalidad preferida, a un paciente se le administra un tratamiento individual (tratamientos en vez de múltiples o repetidos diariamente, por ejemplo) de aproximadamente 0.01-1.0 microgramos/kgs del ligando de receptor Tpo para conferir un efecto cardioprotector sustancialmente inmediato, preferentemente 0.05 microgramos/kgs del ligando de receptor Tpo . Una dosis preferida del ligando de receptor Tpo de la presente invención está entre 0.6 y 60 microgramos para un paciente típico. Con mayor preferencia, la dosis está entre 2 y 6 microgramos.
Métodos Los métodos para la invención utilizan Tpo para proteger un tejido afectado, preferentemente el corazón o el cerebro de un paciente contra la lesión causada por la isquemia. Los métodos implican administrar una composición farmacéutica que comprende el ligando de receptor Tpo a un humano u otro mamífero en una cantidad efectiva para lograr el efecto deseado para tratar la lesión miocárdica y/o cerebral causada por incidencias isquémicas . La duración de administración de la composición de ligando de receptor Tpo generalmente depende de- la formulación de la composición de ligando de receptor Tpo y la cantidad de dosis deseada para ser administrada. Otros factores que pueden variar el período de tiempo de administración incluyen, por ejemplo, el tipo de tratamiento que es proporcionado o procedimiento que es conducido, por ejemplo, la preparación de un órgano para ser trasplantado, el precondicionamiento de un trasplante (donante) órgano, tratamiento de un ataque cardíaco o apoplejía al paciente, el tratamiento antes de, durante y después de una cirugía de corazón, la prevención de una lesión por isquemia- reperfusión, etc.; y la duración deseada o requerida del tratamiento o procedimiento que es conducido; entre otros factores . Para las ventajas de la cardioproteccion sustancialmente inmediata contra la lesión isquémica por los métodos para la invención, es preferido que la composición de ligando de receptor Tpo sea administrada durante un período de 1-60 minutos, preferentemente hasta 30 minutos, preferentemente hasta 20 minutos, preferentemente 5-15 minutos. La duración de la administración puede ser extendida tan necesaria, por ejemplo hasta 24 horas o más larga, como necesario conferir la cardioproteccion y/o proporcionar efectos terapéuticos adicionales sin aumentar el conteo plaquetario normal del paciente en más del 10 %, o el más preferentemente el 1 % (es decir, ningunos aumentos observados) . Para las ventajas de la cardioproteccion retardada contra la lesión isquémica <p.ej contra la angina de pecho) la composición de ligando de receptor Tpo es administrada durante un período de 1-60 minutos, preferentemente hasta 30 minutos, preferentemente hasta 20 minutos, preferentemente 5-15 minutos.
En una modalidad del método, una composición farmacéutica que contiene el ligando de receptor Tpo en una cantidad efectiva para reducir un episodio isquémico es administrada a un paciente antes del episodio isquémico, por ejemplo, antes de un procedimiento quirúrgico previsto, para precondicionar al paciente contra la lesión isquémica. Por ejemplo, los procedimientos quirúrgicos que pueden llevar a la lesión isquémica incluyen la cirugía de corazón, un procedimiento de trasplante de corazón, la angioplastía, la cirugía laparoscópica, y lo similar. Como ejemplo adicional, el ligando de receptor Tpo también puede ser beneficiosamente administrado a un paciente donador para la conservación de un órgano de donante para el trasplante (p.ej, un trasplante de corazón) y la prevención de la lesión de reperfusión isquémica al órgano. Preferentemente, la composición de ligando de receptor Tpo es administrada a un paciente antes de un episodio isquémico para proporcionar una concentración sanguínea del ligando de receptor Tpo para la cardioprotección sustancialmente inmediata, preferentemente proporcionar un nivel de sangre de aproximadamente 0.1-10.0 ligando de receptor Tpo ng/ml dentro de período de 1-35 minuto. La composición de ligando de receptor Tpo es preferentemente administrada al menos 1-60 minutos antes del episodio, preferentemente 1-30 minutos, preferentemente aproximadamente 1-20 minutos, preferentemente durante un período de 5-15 minutos. Como un ejemplo adicional, para reducir los efectos de la isquemia miocárdica en un receptor del órgano de trasplante, un órgano para ser trasplantado, como un corazón, por ejemplo, puede ser expuesto a una cantidad efectiva de Tpo en una formulación farmacéuticamente aceptable para reducir los efectos de isquemia y reperfusión en el órgano al momento de trasplante. El órgano de trasplante puede ser expuesto al Tpo, por ejemplo, mediante una infusión vía la vasculatura, una. solución que contiene una cantidad efectiva de Tpo al órgano para ser trasplantado. Preferentemente, la infusión de ligando de receptor Tpo al órgano proporciona una concentración sanguínea de ligando de receptor Tpo de aproximadamente 0.5-5.0 ng/ml del ligando de receptor Tpo dentro de un período de un 1-35 minuto. La exposición del órgano de trasplante a Tpo puede ser continua para el período que precede al trasplante, y es preferentemente durante 1-60 minutos antes del trasplante, preferentemente 1-30 minutos antes del trasplante, preferentemente durante un período de 5-15 minutos antes del trasplante . Otro método para la invención implica administrar el ligando de receptor Tpo en una cantidad terapéutica efectiva a sustancialmente inmediatamente tratar, prevenir o disminuir la lesión isquémica al corazón a o después del inicio de un episodio isquémico, por ejemplo, durante un procedimiento quirúrgico o al momento de experimentación de síntomas de un estado de enfermedad para reducir la severidad de un incidente isquémico miocárdico y prevenir el daño posterior. Los ejemplos de procedimientos quirúrgicos que pueden llevar a la lesión isquémica, la lesión particularmente isquémica-reperfusión, incluyen la cirugía de corazón, un procedimiento de trasplante de corazón, la angioplastia, la cirugía laparoscópica, y lo similar. Por ejemplo, el ligando de receptor Tpo puede ser administrado a un paciente durante una cirugía de corazón para disminuir el daño causado por la isquemia y reperfusión durante el procedimiento. Como ejemplo adicional, el ligando de receptor Tpo puede ser administrado en el comienzo de reperfusión, durante reperfusión, o ambo. Los ejemplos de estados de enfermedad a los cuales el método puede ser aplicado para proporcionar una cardioprotección sustancialmente inmediata contra la lesión isquémica al corazón al momento de la presentación de síntomas incluyen, por ejemplo, infartos de miocardio, infartos pulmonares, enfermedad oclusiva vascular periférica, apoplejía, infarto cerebral, oclusión vascular, privación de oxígeno prenatal o postnatal, trauma, incluyendo cirugía y radioterapia, enfermedad crónica pulmonar obstructiva, enfisema, síndrome de angustia respiratoria de adulto, choque séptico, crisis de célula falciforme, disritmias, narcosis de nitrógeno y déficits neurológicos causados por procedimientos de derivación cardiopulmonar, y lo similar. Preferentemente, la composición de ligando de receptor Tpo es administrada al paciente en el comienzo del episodio isquémico y/o dentro de un período de poco tiempo subsecuente al comienzo del episodio isquémico para proporcionar una concentración de ligando de receptor Tpo de sangre de aproximadamente 0.1-10.0 ng/ml del ligando de receptor Tpo dentro de período de 1-35 minuto. El momento de administración de ligando de receptor Tpo al paciente puede ser durante un período de tiempo efectivo, preferentemente durante aproximadamente 1-60 minutos subsecuentes al episodio, preferentemente durante 1-30 minutos, preferentemente durante un período de aproximadamente 5-15 minutos. Aún otro método para la invención implica administrar el ligando de receptor Tpo en una cantidad efectiva para activar una vía de señalización cardioprotectora . En una modalidad, el método comprende la administración del Tpo en una composición farmacéutica en una cantidad y duración efectiva para activar Tpo-R para proporcionar un efecto cardioprotector sustancialmente inmediato contra la lesión isquémica, preferentemente una composición para lograr un nivel de sangre de aproximadamente 0.1-10.0 ng/ml del ligando de receptor Tpo cuando es administrado a un paciente (humano u otro mamífero) con respecto a un período de un 1-35 minuto. El momento de administración de ligando de receptor Tpo al paciente puede ser a un período de tiempo efectivo, preferentemente durante 1-60 minutos antes de o subsecuente al episodio, preferentemente durante 1-30 minutos, preferentemente durante un período de 5- 15 minutos. En otra modalidad, Tpo es administrado en una composición farmacéutica en una cantidad efectiva y duración para activar un canal de potasio, como el KA P para lograr sustancialmente cardioprotección inmediata contra la lesión isquémica, preferentemente para lograr un nivel de sangre de aproximadamente 0.1-10.0 ng/ml del ligando de receptor Tpo cuando es administrado a un paciente durante un período de un 1-35 minuto. La composición de ligando de receptor Tpo es administrada al paciente durante un período de tiempo efectivo, preferentemente durante 1-60 minutos antes de o subsecuente al episodio, preferentemente durante 1-30 minutos, preferentemente durante un período de 5-15 minutos para proporcionar un efecto cardioprotector sustancialmente inmediato contra la lesión isquémica . Las lesiones isquémicas miocárdicas que pueden ser prevenidas o reducidas según la invención incluyen enfermedad de arteria coronaria, infarto miocárdico, cardiopatía isquémica, angina de pecho de Prinzmetal, ruptura cardíaca e insuficiencia cardíaca congestiva, por ejemplo. La eficacia de la composición y su administración puede ser supervisada por la ausencia o una disminución en la severidad de una Lesión isquémica miocárdica mediante el uso de la metodología convencional, como pérdida de enzima cardíaca, pérdida de proteína contráctil cardíaca, presiones de cavidad ventricular cardíacas derechas e izquierdas, arritmias y elevación de segmento de S-T. El efecto de la composición de ligando de receptor Tpo puede ser evaluado aproximadamente 1-48 horas después de la administración de la composición farmacéutica. La invención será descrita además en cuanto a los ejemplos detallados, donde las metodologías son descritas a continuación. Estos ejemplos no pretenden limitar el alcance de la invención que ha sido expuesta en la descripción anterior. Hay que entender que las variaciones y las modificaciones dentro de los conceptos de la invención pueden elaborarse, mientras que estos permanecen dentro del espíritu y el alcance de la invención. La descripción de referencias citadas, patentes, y usos evidentes en todas partes del uso es incorporada por referencia aquí .
EJEMPLO 1 Efectos Cardioprotectores Inmediatos de Trombopoyetina contra Isquemia generalizada en vitro y Mediación por Activación de Canales de Potasio La enfermedad cardíaca isquémica es la causa subyacente de la mayoría de los infartos de miocardio agudos, insuficiencia cardíaca congestiva, arritmias y muerte cardíaca súbita, y es una causa principal de morbilidad y mortalidad en todas las naciones industrializadas {BoIH et al . , Circ . Res . 95 : 125-134 , 2004 ) . La protección del corazón contra la isquemia permanece un desafío para el cardiólogo y el cirujano cardíaco. Sin embargo no hay ninguna terapia actual que se haya probado que proteja directamente el corazón contra los efectos nocivos de la isquemia en humanos . Los estudios recientes han mostrado que la eritropoyetina, una citocina usada para estimular la producción celular roja, también protege el corazón contra la lesión isquémica por un mecanismo que implicó la activación de canales de potasio dependientes del potasio (KATP) (Shi, et al . , Basic Res. Cardiol. 99: 173-182, 2004). Tpo, otra citocina que comparte la homología limitada con la eritropoyetina, está en el empleo clínico para acelerar la producción plaquetaria después del trasplante celular. Sin embargo es actualmente desconocido si Tpo tiene una función fisiológica en el miocardio. Supusimos que Tpo sería capaz de proteger el corazón contra la lesión causada por la isquemia/reperfusión y daría como resultado una disminución en tamaño de infarto y apoptosis y potenciaría la recuperación de la función ventricular después de la isquemia. Para determinar una función posible para Tpo en la cardioprotección y los mecanismos subyacentes, los corazones de rata adultos eran sometidos a tratamiento con Tpo recombinante humano antes de la isquemia. Los objetivos del estudio eran determinar si la exposición aguda (contra la exposición crónica) del corazón a Tpo aumentaría la resistencia a la isquemia subsecuente, la concentración Tpo que confiere la protección óptima del corazón y la función de canales de potasio en mediar la cardioproteccion. El estudio fue dirigido a la determinación si Tpo (0.01- 10.0 ng/ml) confiere la cardioproteccion inmediata en corazones de rata y la contribución de canales de potasio al mecanismo subyacente. Los corazones de ratas Sprague Dawley de edad de 8 semanas normóxicas (n=8/grupo) fueron aislados y perfundidos en el modo Langendorff. La función hemodinámica fue registrada en condiciones estables antes de 25 minutos de isquemia generalizada sin flujo y 180 minutos de reperfusión.
Métodos Animales . Las ratas usadas en el estudio recibieron el cuidado humano conforme "la Guía para el Cuidado y el Empleo de Animales de Laboratorio" formulada por el Consejo de Investigación Nacional, 1996. Las ratas Sprague Dawley de ocho semanas de edad fueron mantenidas en un ambiente normóxico (Sa02> el 95 %) . Reactivo . El Tpo humano recombinante fue obtenido del Cell Science, Inc (Norwood, Mass.). La gibenclamida fue obtenida de Calbiochem (San Diego, California.). 5-HD fue comprado de Sigma-Aldrich (San Louis, Mo.). Los anticuerpos al receptor Tpo fueron obtenidos de Santa Cruz Biotechnology . El anticuerpo secundario era la peroxidasa de rábano obtenida de Zymed (San Francisco del Sur, California.).
Perfusión de corazón aislado. Los corazones de rata aislados fueron perfundidos con amortiguador de bicarbonato presión a constante en una manera retrógrada e instrumentada como se describe en Baker, et al., Am. J. Physiol. Heart Circulat. Physiol. 278 : 1395-1400 , 2000 bloqueadores de canal de potasio fueron añadidos a este perfusato como necesario. Una derivación de 3 vías, ubicada inmediatamente por arriba del sitio de canulación, permitió que el perfusato completo fuera divertido lejos del corazón para producir la isquemia global, sin flujo. Reperfusión fue lograda por la reubicación de la derivación para permitir que perfusato sea administrado al corazón. La función ventricular izquierda fue supervisada continuamente en todas partes de cada experimento como se describe en Baker, et al . , supra, 2000 . La persión diastólica terminal fue al principio determinada a 3 mraHg durante 2 minutos . El globo fue cada vez más inflado luego con una microjeringuilla para determinar presiones diastólicas terminales a 8 mmHg para el ventrículo izquierdo, con presión desarrollada y ritmo cardíaco registrado durante condiciones estables. La velocidad de flujo coronaria fue cuantificada en todas partes del experimento por colecciones calculadas de las aguas residuales coronarias de la derecha del corazón en un cilindro graduado. La velocidad de flujo coronaria fue expresada como mililitros por minuto por gramo peso húmedo. Resistencia a isquemia miocárdica. Los corazones de ratas adultas fueron perfundidos con amortiguador de bicarbonato, y la función biventricular fue supervisada continuamente en todas partes de cada experimento como se describe en Baker, et al . , supra, 2000 . Para estudios de respuesta a concentración, los corazones fueron perfundidos luego con Tpo ( 0 . 01-10 . 0 ng/ml) durante 15 minutos antes de 25 minutos de la isquemia y 180 minutos de reperfusión. El protocolo experimental usado es mostrado en la Figura 2. Para estudios de mecanismo con bloqueadores de canal de potasio, los corazones fueron perfundidos con fármacos durante 15 minutos solos seguido de 15 minutos combinados con Tpo antes de la isquemia. Los corazones perfundidos con bloqueadores de canal de potasio solos en ausencia de Tpo durante 30 minutos antes de la isquemia se usaron como controles no sometidos a tratamiento para estos estudios. La recuperación de la presión desarrollada en el ventrículo izquierdo postisquémica fue expresada como un porcentaje de su prefármaco, valor preisquémico . Evaluación de función ventricular. La función ventricular izquierda fue supervisada continuamente en todas partes de cada experimento como se describe en Baker, et al . , supra, 2000 . La recuperación de la presión ventricular izquierda después de la isquemia era usada para evaluar la resistencia a la isquemia. Las medidas del tamaño/área de infarto' en peligro 3 horas después de reperfusión, eran usados para evaluar la resistencia a la isquemia miocárdica. Para la caracterización del tamaño de infarto, los corazones fueron perfundidos con 10ml de amortiguador de bicarbonato que contiene cloruro de trifeniltetrazolio (SIGMA) a 37° C. El corazón fue seccionado en segmentos de 2 mm del ápice al surco atrioventricular de una forma transversal. Cada segmento fue registrado y colocado en la formalina. Después de veinticuatro (24) horas, el espécimen fue digitalmente fotografiado en un soporte de cámara para normalizar la distancia de espécimen a la lente. Cada fotografía fue añadida luego al Adobe Photoshop (Adobe™) para cuantificar la densidad de pixel de infartado contra áreas no infartadas. El porcentaje del infarto de cada diapositiva fue expresado como un porcentaje del área completa del corazón. La suma de todos los porcentajes de espécimen dio como resultado un porcentaje total del infarto en cada animal.
Cuantificación de apoptosis Los corazones de ratas Sprague Dawley perfundidos continuamente con amortiguador de bicarbonato durante 245 minutos funcionaron como controles no isquémicos (Figura 5) . Los corazones aeróbicamente perfundidos durante 35 minutos y objetivo a 25 minutos de isquemia generalizada seguido de reperfusión de 3 horas funcionaron como el grupo control de reperfusión de la isquemia. Los corazones aeróbicamente perfundidos con amortiguador durante 20 minutos y luego perfundido con Tpo (1 ng/ml) durante 1S minutos antes de la isquemia y reperfusión funcionaron como un grupo Tpo- sometido-a-tratamiento. Cada corazón al final de perfusión era el chasquido congelado en el nitrógeno líquido. Cuatro secciones congeladas (10 micrón espeso) de cada corazón (72 total de secciones) fueron procesadas para el ensayo de TUNEL según el protocolo de fabricantes (Roche) . Las diapositivas fueron examinadas bajo el microscopio fluorescente (400x aumento, excitación 490 nm, y emisión 515 nm) . Veintidós campos de gran potencia aleatorios de cada muestra de corazón fueron elegidos y ciegamente cuantificados . Los resultados de TUNEL son presentados como el % (núcleos positivos por núcleos de campaña/totales por campo xlOO %) . Análisis estadístico. Los datos hicieron un informe son el promedio ± SD. El análisis estadístico fue llevado a cabo por el empleo de medidas repetidas ANOVA con el ajuste de Greenhouse-Geisser usado para corregir el riesgo inflado del error Tipo 1 (Baker, et al., Circulation 99: 1249-1254, 1999). De ser significativo, la prueba de Mann-Whitney se usó como una segunda etapa para identificarse qué grupos eran considerablemente diferentes. Después de ANOVA los datos fueron analizados para diferencias relacionadas con comparaciones múltiples (Baker, et al., supra, 1999). La significancia fue determinada a P <0.05.
Estudios y Resultados Presencia del receptor de trombopoyetina (c-mpl) en el corazón. (FIGURA 1) Cebadores (cebador directo = 5 ' -CTA GCT CCC GAG GCT TCT TC-3 ' ; cebador inverso = 5 ' -GGC TCC AGC ACC TTC CAG TCC-31 ) , para el receptor Tpo, fueron diseñados según Rouleau, et al . y la secuencia de ARNm de receptor Tpo para la rata es depositada en GenBank (número GI : 34871077). Los cardiomiocitos ventriculares de rata adultos fueron aislados de ratas Sprague Dawley macho como es descrito antes (Konorev, et al., Aren. Biochem. Biophys. 368:421-428, 1999). Usando cebadores basados en la secuencia para el receptor Tpo en la rata, subclonamos el mensaje para el receptor Tpo en homogenatos de corazón y cardiomiocitos de la rata usando el RT-PCR. La secuencia para el receptor Tpo de rata fue depositada en GenBank (Números de acceso DQ013345 para Dahl S rata, DQ013344 para la rata café de Noruega, DQ013343 para la rata Sprague Dawley) . La secuencia para el receptor Tpo de conejo fue depositada en GenBank (Número de acceso DQOl 3342) . La presencia de la proteína de receptor Tpo en homogenatos de corazón y cardiomiocitos obtenidos de ratas Sprague Dawley fue detectada luego por el Western blot. Las células de leucemia crónica mielógena humana se usaron como un control positivo (Figura 1) . A. Estudios de respuesta a concentración de trombopoyetina . La eritropoyetina protege el corazón contra el daño isquémico por un mecanismo que implica la activación de canal de potasio, Shi, Y., et al . , Basic Res. Cardiol. 99: 173- 182, 2004. Tpo comparte la homología aproximadamente del 25 % en la secuencia de aminoácido con la eritropoyetina en el dominio de N-termino. Tabla 1. Valores hemodinámicos para estudios de respuesta a concentración Tpo en corazones de rata vitro
PREFÁR ACO POSFARMACO REPERFUSION
., . . . . Presión Presión w Presión Vj_elocidad desarrollada d deessaarrrrooliliaadaaa Ve cid —ad d deessaarrrroollllaeda, ae riijo en ventrículo de flujo en ventrículo de fkijo en ventrículo coronana i IzZqquUiieerrdOXo Ritmo cardiaco coronaria izquierdo Ritmo cardiaco coronaria ¡zqu¡erdo (latidos/minuto (ml/min/g) (mmHg) 1. Drug-frcc 246±20 6±l 117±!0 — — ~ 232125 4±l 3917 control 2. Tpo 225131 6±1 130113 202±16 5±I I56±13 I84±31 3±l 5219 (O.Olng/ml) 3. Tpo 228±17 5±l I20±I5 233112 5±l 158+13 I97±36 3±1 6 ±ll (O.Ing/ml) 4. Tpo 240134 6±1 119±I5 228±I7 Sil 151±19 20±1 4±1 62±8
(l.Ong/ml) 5. Tpo 226129 6±l I34±I3 220110 6±l 172.26 183±I6 4±t 64110
(lO.Ong/ml)
Tpo = trombopoyetina Datos son el promedio ± desviación estándar Los corazones de ratas Sprague Dawley macho a 8 semanas de edad fueron aislados y perfundidos con Tpo a 0.01, 0.1, 1.0, y 10 ng/ml durante 15 minutos antes de 25 minutos de isquemia generalizada y reperfusión de 180 minutos (Figura 2). Tpo (1.0 ng/ml) redujo la velocidad de flujo coronaria antes de la isquemia de 6 ± 1 ml/min/g a 5±1 ml/min/g, presión desarrollada en el ventrículo permiso aumentada de 119 ±15 mmHg a 151 ± 19 mmHg y disminuyó el ritmo cardíaco de 240 ± 34 latidos/minuto a 228 ± 17 latidos/minuto . Tabla 1 (por arriba de) muestra valores hemodinámicos para estudios de respuesta a concentración Tpo en corazones normóxicos (ver Figuras 3 y 4) .
Tpo aumentó la recuperación de la presión desarrollada en el ventrículo izquierdo después de la isquemia y reperfusión en una manera dependiente de la concentración en forma de campana de Gauss . La concentración óptima que proporcionó la recuperación máxima de la presión desarrollada en el ventrículo derecha e izquierda postisquémica fue manifestada a 1.0 ng/ml (Figura 3 ) . Tpo redujo el tamaño de infarto después de la isquemia y reperfusión en una manera dependiente de la concentración en forma de U. La concentración óptima de Tpo que proporcionó la reducción máxima del tamaño de infarto fue manifestada a 1.0 ng/ml. Tpo redujo la apoptosis después de la isquemia y reperfusión cuando fue administrado a una concentración de 1.0 ng/ml antes de la isquemia (Figura 4) . Tpo (1.0 ng/ml) redujo la apoptosis después de la isquemia y reperfusión (Figura 5) . Ya que Tpo redujo el tamaño de infarto y aumentó la recuperación de LVDP, también examinamos si Tpo protege el miocardio isquémico contra la apoptosis. Por la marcación de TUNEL de secciones de ventrículo izquierdo después de 25 minutos de isquemia generalizada y 3 horas de reperfusión, el TUNEL - las células positivas fueron observadas (3.56 el 0.75 % ±) dos veces como esto en corazones no isquémicos (el 1.91±0.54 %) . En el grupo sometido a tratamiento con Tpo, considerablemente menos tinción fue observada (el 1.94±0.55 %, P <0.05). TUNEL representativo - las secciones manchadas son mostradas en la Figura 5, demostrando menos células positivas apoptóticas en el corazón sometido a tratamiento con Tpo. B: la recuperación de ritmo cardíaco fue disminuida del 94±6 % en corazones no sometidos a tratamiento al 85±7 % de valores preisquémi-cos en corazones sometidos a tratamiento con 1.0 ng/ml de Tpo . La recuperación de la velocidad de flujo coronaria es inafectada por 1.0 ng/ml de Tpo. Estos datos indicaron que Tpo inmediatamente protege el corazón contra la lesión isquémica en una manera dependiente de la concentración.
C : Función de Akt en cardioprotección inducida por la trombopoyetina . Akt es un mediador importante de la cardioprotección. Para investigar una función para Akt en mediar la cardioprotección inducida con Tpo, el estudio de seguimiento fue llevado a cabo en ratas normóxicas. Los corazones fueron perfundidos con un inhibidor de Akt solo durante 15 minutos y luego combinados con Tpo (1.0 ng/ml) para otro período de 15 minutos antes de la isquemia. La wortmanina (100 nM) , un inhibidor de Akt específico, completamente suprimió el efecto cardioprotector de Tpo (1.0 ng/ml) (Figura 6A/6B) . La wortmanina sola no tenía ningún efecto en la cardioprotección (Figura 6A/6B) . Así, se mostró que los efectos cardioprotectores por Tpo eran mediados por Akt . D. Función de canales KATP en cardioprotección inducida por la trombopoyetina . Canales K+ (KATP) ATP-sensibles , muy expresados en sarcolema miocárdico y que pensamos fueron expresados en la mitocondria miocárdica, han sido descubiertos servir como mediadores de la cardioprotección. Para investigar una función para canales KATP en mediar la cardioprotección inducida con Tpo, el estudio de seguimiento fue llevado a cabo en ratas normóxicas. Los corazones fueron perfundidos con un bloqueador de canal KATP solo durante 15 minutos y luego combinados con Tpo (1.0 ng/ml) para otro período de 15 minutos antes de la isquemia . Gibenclamida (3. mu. M) , un no bloqueador de canal KATP específico, completamente suprimió el efecto cardioprotector de Tpo (1.0 ng/ml) (Figura 7 A/7B) . La gibenclamida sola no tenía ningún efecto en la cardioprotección (Figura 7A/7B) . Así, se mostró que los efectos cardioprotectores por Tpo eran mediados por canales KATP.
Discusión La administración de Tpo durante 15 minutos inmediatamente antes de la isquemia dio como resultado una reducción de necrosis y apoptosis y un aumento de la recuperación de la función ventricular en corazones después de la isquemia miocárdica. La concentración óptima de Tpo que proporcionó la recuperación máxima de la presión desarrollada fue manifestada a 1.0 ng/ml. El estudio mostró que Tpo inmediatamente ejerce un dependiente de concentración efecto cardioprotector con la mayor resistencia a la isquemia miocárdica mediada por canales de potasio. La mayor resistencia a la isquemia miocárdica fue observada inmediatamente después del tratamiento con Tpo, indicando que la inducción de nuevos genes no es necesaria para su efecto cardioprotector para ser manifestado. El estudio demuestra que los efectos biológicos de Tpo son mediados por una vía de señal que da como resultado la activación inmediata de un canal de potasio, el canal KATP. Los resultados también muestran que Tpo confiere la cardioprotección inmediata mediante la activación de canales de potasio (KATP) - Vario tipo distinto del canal de potasio está presente en el corazón, de cual el canal de KATP sirve para proteger el corazón contra condiciones de la privación de oxígeno, como hipoxia e isquemia. Los resultados mostraron que la protección inducida con Tpo contra la isquemia es completamente prevenida por la gibenclamida, un bloqueador de canal ??t? no específico. La gibenclamida sola no tenía ningún efecto en la cardioprotección, que indicó que los canales KATP no son activados en corazones no expuestos a Tpo. El canal KATP parece desempeñar un papel fundamental en mediar la cardioprotección inducida con Tpo. Se piensa que este canal de potasio es ubicado a dos sitios dentro de la célula, sarcolema y la mitocondria. Una vez activado, el canal KATP sarcol-emo promueve el eflujo de potasio del citosol al exterior la célula, mientras que la activación del canal KATP mitocondrial da como resultado un influjo de potasio del citosol en la mitocondria. La activación del canal KATP sarcolemo puede actuar para reducir el influjo de calcio en la célula durante la isquemia. Además, el canal KATP sarcolemo también puede ser responsable de abrir el canal KATP mitocondrial. En contraste, la activación del canal KATP mitocondrial puede mediar la' cardioprotección por energías mejoradas (Eells, et al., Cjrc, Res, 87 : 915-921 , 2000 ) . La vía de señalización por la cual Tpo protege contra la lesión al corazón causado por la isquemia es mediada en parte por Akt y canales KATP. Se sabe que la activación de Akt reduce la lesión de isquemia/reperfusión en el corazón y favorece la expresión de la familia bel de genes antiapoptoticos. En apoyo de esto, los resultados muestran que Tpo redujo el grado de apoptosis inducida por la isquemia y reperfusión en el corazón. La activación de canales KATP también tiene que ver con la mayor resistencia a la isquemia miocárdica conferida por el precondicionamiento isquémico y farmacológico.
Tpo confiere la protección contra la lesión cuando es administrado después del inicio de isquemia es decir después del inicio de los síntomas. En pacientes que experimentan síntomas de un infarto miocárdi-co, o aquellos que están a punto de experimentar a la cirugía cardíaca, Tpo pueden ser administrados intensamente para disminuir la lesión isquémica al corazón. Así, Tpo representa a un agente importante y potente para aumentar inmediatamente la cardioprotección. El nivel de cardioprotección lograda con Tpo es comparable al que es conferido por el precondicionamiento isquémico. Baker, et al . , Circulation 99:1249-1254, 1999. El precondicionamiento isquémico es un fenómeno endógeno potente donde los breves episodios de un daño isquémico subtóxico inducen la protección sólida contra la isquemia más prolongada, letal . Los mecanismos moleculares que son la base del precondicionamiento isquémico todavía están siendo elucidados, y el uso clínico del precondicionamiento isquémico permanece evasivo y todavía no ha ganado la aceptación generalizada como una estrategia de tratamiento. El precondicionamiento farmacológico contra la isquemia ofrece un modo más práctico de controlar los mecanismos moleculares responsables de la mayor cardioprotección. Los estudios mostraron que precondicionamiento farmacológico a través de Tpo es efectivo y representa una novedosa estrategia cardioprotectora en el establecimiento de la isquemia miocárdica optativa como fue descubierto durante cirugía cardíaca y angioplastia . Ventajosamente, Tpo es aprobado actualmente y disponible para el empleo clínico humano. Este compuesto bien tolerado no requiere de un sistema de administración de fármaco complicado como es necesario para muchas terapias basadas en el gen. Los resultados demuestran que Tpo es un agente exógeno adecuado para precondicionar farmacológicamente el corazón contra la isquemia. Los resultados además muestran que para conferir la cardioprotección, Tpo es ventajosamente administrado antes del daño isquémico, incluyendo, por ejemplo, episodios isquémicos, como cirugía cardíaca, angioplastia o conservación de corazones de donante para el trasplante.
EJEMPLO 2 Estudios In Vivo de Efecto Cardioprotector Inmediato de Trombopoyetina Contra Isquemia Miocárdica Localizada Cuando Es Administrado Antes del Inicio de Isquemia Un modelo de ligamiento de arteria coronaria era usado para demostrar el efecto protector inmediato de Tpo. Los animales usados en este estudio eran ratas Sprague Dawley macho adultas ( 200-350 g, generalmente 300 g) . Los animales fueron alojados en condiciones convencionales y permitidas alimentarse a discreción. El Comité de Empleo y Cuidado Animal del Colegio Médico de Wisconsin aprobó todos los procedimientos llevados a cabo de acuerdo con las regulaciones adoptadas por los Institutos Nacionales de la Salud. Las ratas fueron anestesiadas con pentobarbital sódico (50 mg./kgs i.p.). La heparina fue administrada (150 U/kg i.p.) para prevenir la formación de un trombo en la vasculatura coronaria. Un infarto miocárdico fue producido vía el ligamiento de la arteria principal izquierda usando 6-0 sutura prolene (Ver, p.ej, Clements-Jewerv, et al . , Br . J . Pharmacol . 135:807-815, 2002; Farkas, et al., J. Cardiovasc . Pharmacol. 39:412-424, 2002). La arteria coronaria principal izquierda fue identificada y ligada con una 5-0 Sutura prolene roscada a través de un tubo de polietileno para actuar como un oclusor. El grupo control incluyó los corazones con cirugía simulada en los cuales sólo la sutura fue pasada alrededor de la arteria coronaria principal izquierda. Los animales eran sometidos a tratamiento con el Tpo (0.005-0.5 microgramos/kgs) administrados intravenosamente durante 15 minutos antes del inicio de la isquemia. La isquemia localizada y reperfusión fueron inducidas apretando el oclusor y liberándolo. Los corazones fueron objetivos luego a 30 minutos de la isquemia localizada seguida de 3 horas de reperfusión. La recuperación de presión desarrollada en el ventrículo izquierdo y tamaño/área de infarto en peligro a 3 horas de reperfusión era usada para evaluar la resistencia a la isquemia miocárdica. Para la caracterización del tamaño de infarto, los corazones fueron perfundidos con 10ml amortiguador de bicarbonato que contiene cloruro de trifeniltetrazolio (SIGMA) a 37 0 C. El corazón fue seccionado en segmentos de 2 mm del ápice al surco atrioventricular de una forma transversal . Cada segmento fue registrado y colocado en la formalina. Después de veinticuatro (24) horas, el espécimen fue digitalmente fotografiado en un soporte de cámara para normalizar la distancia de espécimen a la lente. Cada fotografía fue añadida luego al Adobe Photoshop (Adobe™) para cuantificar la densidad de pixel de áreas infartadas contra áreas no infartadas . El porcentaje del infarto de cada diapositiva fue expresado como un porcentaje del área completa del corazón. La suma de todos los porcentajes de espécimen dio como resultado un porcentaje total del infarto en cada animal . No había ninguna diferencia significativa en peso corporal, peso de corazón o tamaño de zona de riesgo entre grupos. El ritmo cardíaco, es decir que la presión arterial y el producto frecuencia-tensión (doble producto) fueron cuantificados durante el valor de referencia, .15 minutos en la isquemia y a 2 horas de reperfusión y ratas de intervención simulada en comparación con las no sometidas a tratamiento para cada grupo (Tabla 2) . Las diferencias significativas fueron descubiertas para presión arterial promedio y presión de velocidad para algunos grupos cuando en comparación con intervención simulada. Para cada grupo, calculamos el área en peligro en comparación con peso de ventrículo izquierdo total. No había ningunas diferencias significativas observadas entre los grupos (no se muestran datos) .
Tabla 2. Valores hemodinámicos para estudios de respuesta de la dosis agudos Tpo in vivo. Tpo = trombopoyetina. Los datos son el promedio ± desviación estándar, n=6/grupo, * =p <0.05, Tpo más la isquemia contra la isquemia sola.
BASAL 15 mln de ISQUEMIA 3 hrs de REPERFUSlON Producto Producto Producto Presión velocidad Presión velocidad Presión velocidad Ritmo cardiaco arterial de presión Ritmo cardiaco arterial de resión Ritmo cardiaco arterial de presión (latidos/ promedio (mmHp (latidos promedio (mmHg/ (latidos/ promedio (mmHg/
N minuto) (mmHg) seg.) minuto) (mmHg) seg.) minuto) (mmHg) seg.)
Solo isquemia 6 352±13 13618 4812 361116 I02±6 36±5 3)7111 8915 3016
Tpo 6 386117 133U3 50±6 374112 104111 3819 359113 (0.005pe¾B) 9217 3215
Tpo 6 342H6 I38±6 50±3 352111 124111 4715 332111 10511 !? 3814
(0.05 g/kg) Tpo 6 3711U 14416 49±3 382113 121113 4416 364113 108116* 3715
(0.5Mg kg)
Tpo = trombopoyetina Datos son el promedio ± desviación estándar La Figura 8 muestra una disminución en el tamaño de infarto miocárdico cuando Tpo fue administrado 15 minutos antes de la isquemia miocárdica localizada in vivo inducido por el ligamiento por sutura de la arteria coronaria principal izquierda. Tpo disminuyó el tamaño de infarto postisquemico en una manera dependiente de la concentración en forma de U. La concentración óptima de Tpo que proporcionó la reducción máxima del tamaño de infarto fue manifestada a 0 . 05 yg/kg (Figura 8 ) . EJEMPLO 3 Estudios In Vivo de Efecto Cardioprotector Inmediato de
Trombopoyetina Contra Isquemia Miocárdica Localizada Cuando es Administrado Después del Inicio de Isquemia Un modelo de ligamiento de arteria coronaria era usado para demostrar el efecto protector inmediato de Tpo. Los animales usados en este estudio eran ratas Sprague Dawley macho adultas ( 200-350 g, generalmente 300 g) . Los animales fueron alojados en condiciones convencionales y permitidos alimentarse a discreción. El Comité de Empleo y Cuidado Animal del Colegio Médico de Wisconsin aprobó todos los procedimientos llevados a cabo de acuerdo con las regulaciones adoptadas por los Institutos Nacionales de la Salud. Un infarto miocárdico fue producido vía el ligamiento de la arteria principal izquierda usando 6-0 sutura prolene (Ver, p.ej, Clements-Jewery, et al., supra, 2002 ; Farkas, et al., supra, 2002 ) . Las ratas fueron anestesiadas con pentobarbital sódico ( 50 mg./kgs i.p.). La arteria coronaria principal izquierda fue identificada y ligada con una 5-0 Sutura prolene roscada a través de un tubo de polietileno para actuar como un oclusor. Un grupo control incluyó corazones con cirujía simulada en los cuales sólo una sutura fue pasada alrededor de la arteria coronaria principal izquierda fue llevado a cabo. La isquemia localizada y reperfusión fueron inducidas a un apretamiento del oclusor y mediante la liberación de esto. Los corazones fueron objetivos luego a 30 minutos isquemia localizada seguido de reperfusión de 3 horas. La recuperación de presión desarrollada en el ventrículo izquierdo y tamaño/área de infarto en peligro a reperfusión de 3 horas era usada para evaluar la resistencia a la isquemia miocárdica. Para la caracterización del tamaño de infarto, los corazones fueron perfundidos con 10ml amortiguador de bicarbonato que contiene cloruro de trifeniltetrazolio (SIGMA) a 37 ° C. El corazón fue seccionado en segmentos de 2 mm del ápice al surco atrioventricular de una forma transversal . Cada segmentó fue registrado y colocado en la formalina. Después de veinticuatro (24) horas, el espécimen fue digitalmente fotografiado en un soporte de cámara para normalizar la distancia de espécimen a la lente. Cada fotografía fue añadida luego al Adobe Photoshop (Adobe™) para cuantificar la densidad de pixel de infartado contra áreas no infartadas. El porcentaje del infarto de cada diapositiva fue expresado como un porcentaje del área completa del corazón. La suma de todos los porcentajes de espécimen dio como resultado un porcentaje total del infarto en cada animal . La Figura 9 demuestra una disminución en el tamaño de infarto miocárdico cuando Tpo (0.05 g/kg) fue administrado 15 minutos antes de reperfusión después de 30 minutos isquemia miocárdica localizada in vivo inducido por el ligamiento por sutura de la arteria coronaria principal izquierda. EJEMPLO 4 Estudios In Vivo de Efecto Cardioprotector Inmediato de
Trombopoyetina Contra Isquemia Miocárdica Localizada Cuando es Administrado Después del Inicio de Reperfusión Un modelo de ligamiento de arteria coronaria era usado para demostrar el efecto protector inmediato de Tpo. Los animales usados en este estudio eran ratas Sprague Dawley macho adultas ( 200-350 g, generalmente 300 g) . Los animales fueron alojados en condiciones convencionales y permitidos alimentarse a discreción. El Comité de Empleo y Cuidado Animal del Colegio Médico de Wisconsin aprobó todos los procedimientos llevados a cabo de acuerdo con las regulaciones adoptadas por los Institutos Nacionales de la Salud. Un infarto miocárdico fue producido vía el ligamiento de la arteria principal izquierda usando 6 - 0 sutura prolene (Ver, p.ej, Clements-Jewery, et al., supra, 2002 ; Farkas, et al., supra, 2002 ) . Las ratas fueron anestesiadas con pentobarbital sódico ( 50 mg./kgs i.p.). La arteria coronaria principal izquierda fue identificada y ligada con una 5- 0 Sutura prolene roscada a través de un tubo de polietileno para actuar como un oclusor. Se llevo a cabo un grupo control que incluyó corazones con cirujía simulada en los cuales sólo una sutura fue pasada alrededor de la arteria coronaria principal izquierda. ,La isquemia localizada y reperfusión fueron inducidas a un apretamiento del oclusor y mediante la liberación de esto. Los corazones fueron objetivos luego a 30 minutos isquemia localizada seguido de reperfusión de 3 horas. La recuperación de presión desarrollada en el ventrículo izquierdo y tamaño/área de infarto en peligro a reperfusión de 3 horas era usada para evaluar la resistencia a la isquemia miocárdica. Para la caracterización del tamaño de infarto, los corazones fueron perfundidos con 10ml amortiguador de bicarbonato que contiene cloruro de trifeniltetrazolio (SIGMA) a 37 ° C. El corazón fue seccionado en segmentos de 2 mm del ápice al surco atrioventricular de una forma transversal . Cada segmento fue registrado y colocado en la formalina. Después de veinticuatro (24) horas, el espécimen fue digitalmente fotografiado en un soporte de cámara para normalizar la distancia de espécimen a la lente. Cada fotografía fue añadida luego al Adobe Photoshop (Adobe™) para cuantificar la densidad de pixel de infartado contra áreas no infartadas. El porcentaje del infarto de cada diapositiva fue expresado como un porcentaje del área completa del corazón. La suma de todos los porcentajes de espécimen dio como resultado un porcentaje total del infarto en cada animal . La Figura 10 demuestra una disminución en el tamaño de infarto miocárdico cuando Tpo fue administrado 10 segundos después de reperfusión después de 30 minutos isquemia miocárdica localizada in vivo inducido por el ligamiento por sutura de la arteria coronaria principal izquierda. EJEMPLO 5 Estudios In Vivo de Efecto Cardioprotector Retardado de
Trom opoyetina Contra Isquemia Miocárdica Localizada Un modelo de ligamiento de arteria coronaria fue usado para demostrar el efecto protector retardado de Tpo. Los animales usados en este estudio eran ratas Sprague Dawley macho adultas ( 200-350 g, generalmente 300 g) . Los animales fueron alojados en condiciones convencionales y permitidos alimentarse a discreción, las Ratas fueron anestesiadas con pentobarbital sódico ( 50 mg./kgs i.p.). La heparina fue administrada ( 150 U/kg i.p.) para prevenir la formación de un trombo en la vasculatura coronaria. Un infarto miocárdico fue producido vía el ligamiento de la arteria principal izquierda usando 6-0 sutura prolene (Ver, p.ej, Clements-Jewery, y un]., supra .2002 Farkas et al., supra, 2002 ) . La arteria coronaria principal izquierda fue identificada y ligada con una 5-0 Sutura prolene roscada a través de un tubo de polietileno para actuar como un oclusor. U grupo control incluyó corazones con cirugía simulada en los cuales sólo una sutura fue pasada alrededor de la arteria coronaria principal izquierda fue llevado a cabo. Los animales eran sometidos a tratamiento con el Tpo ( 0 . 05 microgramos/kgs ) administrados intraperitonealmente y se les permitió recuperarse durante 24 horas antes del inicio de la isquemia. La isquemia localizada y reperfusión fueron inducidas a un apretamiento del oclusor y mediante la liberación de esto. Los corazones fueron sometidos luego a 30 minutos de isquemia localizada seguido de reperfusión de 3 horas. La recuperación de presión desarrollada en el ventrículo izquierdo y tamaño/área de infarto en peligro a reperfusión de 3 horas era usada para evaluar la resistencia a la isquemia miocárdica. Para la caracterización del tamaño de infarto, los corazones fueron perfundidos con 10ml amortiguador de bicarbonato que contiene cloruro de trifeniltetrazolio (SIGMA) a 37 ° C. El corazón fue seccionado en segmentos de 2 mm del ápice al surco atrioventricular de una forma transversal . Cada segmento fue registrado y colocado en la formalina. Después de veinticuatro (24) horas, el espécimen fue digitalmente fotografiado en un soporte de cámara para normalizar la distancia de espécimen a la lente. Cada fotografía fue añadida luego al Adobe Photoshop (Adobe™) para cuantificar la densidad de pixel de infartado contra áreas no infartadas. El porcentaje del infarto de cada diapositiva fue expresado como un porcentaje del área completa del corazón. La suma de todos los porcentajes de espécimen dio como resultado un porcentaje total del infarto en cada animal . La Figura 11 demuestra una disminución en el tamaño de infarto miocardico cuando Tpo fue administrado 24 horas antes de 30 minutos de la isquemia miocárdica localizada in vivo inducido por el ligamiento por sutura de la arteria coronaria principal izquierda . EJEMPLO 6 El tratamiento de trombopoyetina no da como resultado el mayor conteo plaquetario y el hematocrito Para determinar si una dosis individual de Tpo que confiere la cardioprotección inmediata y retardada in vivo dio como resultado un mayor conteo plaquetario, las ratas eran sometidas a tratamiento con Tpo (0.05yg/kg i.v.). Antes del tratamiento, los conteos plaquetarios en ratas no sometidas a tratamiento eran 850±96 103/ul, y el hematocrito en ratas no sometidas a tratamiento era el 43.8±1.8 %. La Figura 12A/B demuestra que después del tratamiento de Tpo, los valores para conteo plaquetario y hematocrito permanecieron sin alterar con respecto a los de 14 días cumplen el período. La dosis de Tpo usado para nuestros estudios in vivo de 0.05pg/kg para conferir la cardioprotección inmediata y retardada -es aproximadamente diez veces más abajo que esto usado en humanos para estimular la producción plaquetaria en pacientes con cáncer (Vadhan- aj, et al., Ann. Intem. Med. 126:673-^81, 1997) y movilizar células de progenitor de sangre periféricas (Gajewski, et al., Biol. Blood Marrow Transplant. 8:550-556, 2002; Linker, et al., Biol. Blood Marrow Transplant. 9:405-413, 2003). En procesos humanos iniciales de dosis de Tpo de l-5pg/kg mayor producción plaquetaria 5-1? veces en pacientes sanos y en aquellos que iban a recibir quimioterapia contra un tumor maligno. De manera similar en ratas, la dosis de Tpo pegilado solía reducir la trcmbocitopenia (100 g/kg) (Harada, et al., J. Pharm. Pharmacol . 52:321-325, 2000) y mejorar trombocitopenia en ratas sometidas a tratamiento por el carboplatino (l-30 g/kg) Ide, et al., Int. J. Heatol . 70:91-96, 1999 también es bastante más elevado que la dosis usada en nuestro estudio. La dosis individual de Tpo <0.05yg/kg) que usamos no dio como resultado un mayor conteo plaquetario o hematocrito con respecto al periodo de seguimiento de 14 días. Las Figuras 13A/13B son un gráfico de datos adicionales {significan la desviación estándar ±, n + 6 por grupo) que evaluó una dosis individual de Tpo (l^g/kg i.v.) en conteo plaquetario y hematocrito. No había ningún efecto. Conforme al estatuto, la invención ha sido descrita en la lengua en cuanto a rasgos estructurales y metódicos. Hay que entender, sin embargo, que la invención no es limitada con los rasgos específicos mostrados y descritos, ya que los promedios aquí descritos comprenden formas preferidas de poner la invención en práctica. La invención es, por lo tanto, afirmada en cualquiera de sus formas o modificaciones dentro del alcance apropiado de las reivindicaciones anexadas apropiadamente interpretadas de acuerdo con la doctrina de equivalentes. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (18)
- REIVINDICACIONES
- Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Uso de un ligando de receptor de trombopoyetina para elaborar un medicamento para proteger el tejido u órganos de mamífero de los efectos deletéreos de isquemia, en donde el conteo plaquetario del paciente aumenta menos que el 10 %. 2. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el aumento es menos que el 1 % .
- 3. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el ligando es la trombopoyetina humana.
- 4. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde es administrada una dosis farmacéutica que comprende 0.8-80 microgramos del ligando de receptor Tpo.
- 5. Uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde la cantidad efectiva del ligando da como resultado en un nivel de sangre de 0.1-10.0 ng/ml del ligando de receptor Tpo.
- 6. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el ligando es seleccionado del grupo que consiste de trombopoyetina de origen natural, trombopoyetina recombinante, y modificaciones de la trombopoyetina que tiene propiedades fisiológicas y biológicas sustancialmente comparables a aquella de la trombopoyetina de mamífero.
- 7. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde se administra una dosis farmacéutica que comprende 2-6 microgramos del ligando de receptor Tpo.
- 8. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el ligando además comprende un portador farmacéuticamente aceptable.
- 9. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el ligando es suministrado a un órgano de donante.
- 10. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el ligando es administrado al comienzo de o subsecuente a un episodio isquémico.
- 11. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el ligando es administrado antes de un episodio isquémico.
- 12. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el ligando es administrado en una manera seleccionada del grupo que consiste oralmente, intravenosamente, subcutáneamente, intramuscularmente, interperitonealmente , transdérmicamente, nasalmente, o por supositorio.
- 13. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde además, comprende la etapa de (b) evaluación del conteo plaquetario del paciente.
- 14. uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde además, comprende la etapa de (b) evaluación de la reducción de efectos deletéreos de isquemia.
- 15. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad de ligando de receptor Tpo efector para proteger órganos tisulares de mamífero de los efectos deletéreos de la isquemia, caracterizada porque la preparación farmacéutica comprende 0.6-60 microgramos del ligando de receptor Tpo.
- 16. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la composición comprende 3-5 microgramos del ligando de receptor Tpo.
- 17. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el ligando de receptor Tpo es seleccionada del grupo que consiste de trombopoyetina de origen natural y trombopoyetina recombinante .
- 18. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el ligando de receptor Tpo es seleccionada del grupo que consiste de la trombopoyetina humana .
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|---|---|---|---|
| FA | Abandonment or withdrawal |