MX2008008948A - Composiciones y metodos de uso para anticuerpos de dickkopf-1 y/o -4 - Google Patents

Abstract

Se proporcionan anticuerpos y fragmentos que se enlazan con el objetivo de proteína Dickkopf (DKK1), asícomo métodos de uso y kits, para el tratamiento de una célula objetivo, en particular un célula asociada con una condición osteolítica.

Description

COM POSICIONES Y MÉTODOS DE USO PARA ANTICU ERPOS DE DICKKOPF-1 Y/O -4 CAMPO DE USO La presente invención se refiere a composiciones y métodos de uso para anticuerpos de Dickkopf-1 ("DKK1 ") , Dickkopf-4 ("DKK4") , o ambos, para el tratamiento de anormalidades relacionadas con DKK de la densidad ósea, del metabolismo, diabetes, cánceres, y similares. 0 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La senda de señalización de Wnt está involucrada en el control del desarrollo embrionario y de los procesos neoplásicos. Las proteínas Wnt extracelulares son responsables del crecimiento y la diferenciación de muchos tipos de células, incluyendo en particular el "5 crecimiento, la diferenciación, y la regulación de los osteoblastos, los osteoclastos, y los adipocitos. Muchos cánceres están asociados con los tejidos óseos, y pueden dar como resultado lesiones osteoblásticas, tales como las que se encuentran en cáncer de próstata, o lesiones osteolíticas, tales como las que se encuentran en cáncer pulmonar, cáncer de mama, y mieloma múltiple (por ejemplo, Tian y colaboradores, 2003 New England J. Med. 349:2483-2494) . Los miembros de la familia del gen Wnt codifican glicoproteínas secretadas que son requeridas para una variedad de procesos del desarrollo (Fedi y colaboradores, 1 999 5 J. Bio. Chem. 274: 1 9465-1 9472) . Una proteína miembro de la familia Wnt inicia una senda de señalización que es importante para el crecimiento y la diferenciación de los osteoblastos, que causan el depósito óseo. En adición a la formación de hueso, la resorción ósea es un proceso normal continuo conducido por las células conocidas como osteoclastos. En contraste, el activador del receptor del ligando del factor nuclear-kappa B (RANKL) es el mediador final de la resorción ósea osteoclástica, en donde tiene un importante papel en la patogénesis de la osteoporosis post-menopáusica, así como en la pérdida ósea asociada con artritis reumatoide, cáncer metastásico, mieloma múltiple, terapia inhibidora de aromatasa, y terapia de privación de andrógeno (véase, por ejemplo, Lewiecki (2006) Expert Opin. Biol. Ther. 6: 1 041 -50). La osteoprotegrina (OPG) , que es expresada por los osteoblastos, inhibe el RAN KL, disminuyendo de esta manera la actividad y formación de osteoclastos. El equilibrio entre la formación ósea anabólica y la resorción ósea analítica regula la densidad ósea normal, mientras que un aumento en una u otra conduce a una mayor densidad ósea o a una mayor pérdida ósea, respectivamente. Wnt se enlaza y actúa a través de otras proteínas de superficie celular, y la señalización de Wnt puede contribuir al proceso neoplásico. Adicionalmente, las alteraciones genéticas pueden afectar a un complejo de proteína celular conocido como poliposis adenomatosa coli , que involucra una proteína de ß-catenina, y estos complejos se han observado en las células de los pacientes con enfermedades tales como cáncer de colon humano, melanomas, y carcinomas hepatocelulares, indicando que las aberraciones de las sendas de señalización de Wnt son relevantes para el desarrollo de estos y posiblemente otros cánceres humanos (Fedi y colaboradores, 1 999 J. Bio. Chem. 274: 1 9465- 1 9472) . Existen cuando menos dos familias de proteínas que inhiben la señalización de Wnt, es decir, la familia relacionada con frizzled secretada, y la familia de Dickkopf (DKK) . La familia DKK actualmente contiene cuatro miembros de la familia, es decir, DKK1 (ADN humano, N úmero de Acceso N M_012242; PRT, N úmero de Acceso 094907) , DKK2 (humano, Número de Acceso NM_01 4421 ; PRT Número de Acceso N P_055236), DKK3 (humano, Número de Acceso NM_015881 ; PRT, Número de Acceso AAQ88744) , y DKK4 (humano, Número de Acceso N M_01 4420; PRT, Número de Acceso N P_055235). Dickkopf-1 (DKK1 ) es un inhibidor secretado de la senda de señalización de Wnt/ß-catenina. Véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 2005-0079173 a Niehrs; la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 2004-023451 5 a McCarthy. DKK1 posee la capacidad para inhibir la duplicación del eje inducida por Wnt, y el análisis genético indica que DKK1 actúa corriente arriba para inhibir la señalización de Wnt. DKK1 también es importante en el desarrollo esquelético, como se demuestra por los efectos sobre la pérdida de las estructuras óseas en embriones de pollos y ratones después de la exposición a niveles elevados de DKK1 (Tian y colaboradores, 2003 New England J. Med. 349:2483-2494) . Los niveles elevados de DKK1 en suero se han asociado con cáncer de próstata, y los niveles elevados de DKK1 y RAN KL en plasma de médula ósea y en sangre periférica de pacientes con mieloma múltiple, están asociados con la presencia de lesiones óseas focales. Véase, por ejemplo, Tian 2003, OMI M, N úmero de Acceso 6051 89. DKK1 también tiene un papel en la adipogénesis, condrogénesis, proliferación epitelial gastrointestinal, pérdida ósea asociada con reumatismos, e inicio de la formación de placas de los folículos pilosos. OMI M , Número de Acceso 6051 89. Dickkopf-4 (DKK4) está menos bien caracterizado, pero de la misma manera es un inhibidor secretado de la senda de Wnt. Se ha demostrado que DKK4 se deposita en placas en los pacientes con enfermedad de Alzheimer, y se expresa en el músculo. Wnt no tiene un papel conocido en el desarrollo muscular, y por consiguiente, se postula en la presente que DKK4 tiene un papel inhibidor sobre el desarrollo muscular. Existe una necesidad de composiciones y métodos para tratar cánceres y anormalidades de la densidad ósea, incluyendo agentes que interfieran con, o que neutralicen , el antagonismo de la señalización de Wnt mediado por DKK1 y/o DKK4. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Una modalidad de la invención en la presente, proporciona un anticuerpo o una porción de enlace de antígeno del mismo que se enlaza selectivamente con, y neutraliza, un polipéptido de DKK1 y/o DKK4, o un fragmento de los mismos. En una modalidad preferida, el anticuerpo es un anticuerpo neutralizante de DKK1/4. En diferentes modalidades, la porción de enlace de antígeno del anticuerpo neutralizante de DKK1/4 no se enlaza con DKK2 o con DKK3. En una modalidad, el anticuerpo o una porción de enlace de antígeno del mismo se configura dentro de un andamiaje de tipo inmunoglobulina, tal como una estructura seleccionada, por ejemplo, a partir de un andamiaje humano, humanizado, humaneered ("humanodiseñado"), de tiburón, o de camélido, y/o puede ser adicionalmente un anticuerpo recombinante, quimérico, o injertado con CDR. Por ejemplo, la tecnología diseñada para minimizar la respuesta del anticuerpo humano anti-murino (la tecnología humanering [humanodiseño] de Kalobios o la tecnología de humanización de PDL), está contemplada dentro de la invención. Además, las porciones de enlace de antígeno específicas para DKK1 ó DKK4 también pueden estar dentro de un andamiaje que no sea de tipo inmunoglobulina, incluyendo, por ejemplo, arregladas dentro de una adnectina, de un fibrinógeno, de repeticiones derivadas de anquirina, etc., en el tipo de estructura. En una modalidad particular, el anticuerpo de Dkk1 se caracteriza por tener una región de enlace de antígeno que es específica para la proteína objetivo DKK1, y el anticuerpo o fragmento funcional se enlaza con DKK1 o un fragmento del mismo. En una modalidad relacionada, el anticuerpo de DKK4 se caracteriza por tener una región de enlace de antígeno que es específica para la proteína objetivo DKK4, y el anticuerpo o fragmento funcional se enlaza con DKK4 o un fragmento del mismo. En una modalidad relacionada, el anticuerpo de Dkk4 se caracteriza por tener una región de enlace de antígeno que es específica para la proteína objetivo DKK4, y el anticuerpo o fragmento funcional se enlaza con DKK4 o un fragmento del mismo. En una modalidad preferida, el anticuerpo o la porción de enlace de antígeno del mismo, se enlaza con un polipéptido de DKK1 y de DKK4, pero no con un polipéptido de DKK2 o de DKK3. En otra modalidad, el anticuerpo o una porción de enlace de antígeno del mismo es monoclonal . En otra modalidad, la porción de enlace de antígeno es policlonal . En diferentes modalidades, el anticuerpo de DKK1 , o una porción de enlace de antígeno del mismo, se enlaza con un péptido que consiste en 30 aminoácidos contiguos de un polipéptido de DKK1 o de DKK4. En una modalidad relacionada, el enlace con DKK1 o con DKK4 se determina cuando menos mediante uno de los siguientes ensayos: inhibición del antagonismo de DKK1 o DKK4 de la transcripción señalizada por Wnt; determinación de afinidad de resonancia de plasmón superficial , enlace en ensayo inmunosorbente enlazado con enzimas; análisis de enlace basado en electroquimiluminiscencia; FMAT, SET, SPR, ALP, TopFlash, concentración de biomarcadores en el suero sanguíneo, tales como osteocalcina (OCN) , propéptido nitrogenoso pro-colágeno tipo 1 (P1 N P) , y osteoprotegrina (OPG) , y el enlace con los receptores de superficie celular tales como Frizzled (Fz), LRP (LRP5/6) o Kremen (Krm). En ciertas modalidades, el anticuerpo de Dkk1 o la porción de enlace de antígeno posee cuando menos una de las siguientes propiedades: selectividad para DKK1 que es cuando menos de 1 03 veces, 1 04 veces, o 1 05 veces mayor que para DKK2 o DKK3 humanos; se enlaza con DKK1 o DKK4 con una Kacti ada de menos de 1 00 n M , 50 n M , 1 0 n M , 1 .0 n M , 500 pM , 1 00 pM , 50 pM o 1 0 pM ; y tiene una velocidad de desactivación para DKK1 de menos de 1 0"2 por segundo, 1 0'3 por segundo, 10"4 por segundo, o 1 0'5 por segundo. En una modalidad relacionada, un anticuerpo de la invención compite con DKK1 y/o DKK4 por el enlace con LPR5/6. En una modalidad relacionada, un anticuerpo de la invención compite con DKK1 y/o DKK4 por el enlace con Krm. En todavía otra modalidad, la invención proporciona una región de enlace de antígeno aislada de cualquiera de los anticuerpos anteriores o fragmentos funcionales de estos anticuerpos, y las secuencias de aminoácidos de los mismos. Por consiguiente, en ciertas modalidades, la invención proporciona secuencias de aminoácidos aisladas seleccionadas a partir del grupo de las SEQ ID NOs:2a 20, y SEQ I D NOs:40 a 72, y las variantes conservadoras o humaneered ("humanodiseñadas") de estas secuencias. Además, en ciertas modalidades adicionales, la invención proporciona las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOs:2-20, 65-72, y las variantes conservadoras o humaneered ("humanodiseñadas") de estas secuencias, que proporcionan regiones de enlace de antígeno aisladas, cada una de las cuales es una H-CDR-3. En una modalidad relacionada, la región de enlace de antígeno aislada es una región H-CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de las SEQ ID NOs: 2-20, 57-64, y las variantes conservadoras humaneered ("humanodiseñadas") de las mismas. En todavía otra modalidad relacionada, la región de enlace de antígeno aislada es una región H-CDR2 en consenso ilustrada en la secuencia seleccionada a partir del grupo de la SEQ ID NO:40 que tiene la secuencia de aminoácidos GISGSGSYTYYADSVKF, SEQ ID NO:41 que tiene la secuencia de aminoácidos GISYYGGNTYYADSVKF, y la SEQ ID NO:42 que tiene la secuencia de aminoácidos GISYYGGSTYYADSVKF, y las variantes conservadoras o humaneered ("humanodiseñadas") de los residuos de aminoácidos de estas secuencias. En ciertas modalidades, la secuencia novedosa proporcionada es una de las SEQ ID NOs:2-5, 8-11, 20, 49-56, y las variantes conservadoras o humaneered ("humanodiseñadas") de las mismas, que proporcionan una región de enlace de antígeno aislada, que es una región H-CDR1. En una modalidad relacionada, la región de enlace de antígeno aislada es una región H-CDR1 en consenso que tiene una secuencia de aminoácidos (utilizando el código de aminoácidos de una letra) seleccionada a partir de las secuencias de aminoácidos GFTFSSYGMT (SEQ ID NO:43), GFTFNSYGMT (SEQ ID NO:44), GFTFSNYGMT (SEQ ID NO:45), GFTFSSYWMT (SEQ ID NO:46), GFTFSSYAMT (SEQ I D NO:47) , GFTFSSYGMS (SEQ ID NO:48) , y las variantes conservadoras o humaneered ("humanodiseñadas") de cualquiera de estas secuencias. En otra modalidad, la invención proporciona secuencias de aminoácidos que son regiones de enlace de antígeno aisladas que tienen una región L-CDR3, tales como secuencias de aminoácidos seleccionadas a partir de las SEQ I D NO:21 -39, 89-96, y las variantes conservadoras o humaneered ("humanodiseñadas") de estas secuencias. En todavía otra modalidad relacionada, la región de enlace de antígeno aislada es una región L-CDR 1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de las SEQ ID NOs:21 -39, 73-80, y las variantes conservadoras o humaneered ("humanodiseñadas") de estas secuencias. En todavía otra modalidad relacionada, la región de enlace de antígeno aislada es una región L-CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de las SEQ I D NOs:21 -39, 81 -88, y las variantes conservadoras o humaneered ("humanodiseñadas") de estas secuencias. En ciertas modalidades, la región de enlace de antígeno aislada es una cadena ligera variable que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de las SEQ ID NOs:21 -39, y las variantes conservadoras o humaneered ("humanodiseñadas") de estas secuencias. En otra modalidad, la invención proporciona una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs:97- 1 03. En una modalidad relacionada, cada una de estas secuencias de nucleótidos codifica una secuencia de aminoácidos, y las variantes conservadoras o humaneered ("humanodiseñadas") de estas secuencias de aminoácidos codificadas, que también están dentro del alcance de la presente invención. En otra modalidad relacionada, la secuencia de nucleótidos de cada una de las SEQ ID NOs:97-100 codifica una cadena ligera de enlace de antígeno. En una modalidad relacionada adicional, la secuencia de nucleótidos de cada una de las SEQ ID NOs: 101 -1 03, codifica una cadena pesada de enlace de antígeno. En todavía otra modalidad relacionada, cada una de estas secuencias de nucleótidos se optimiza adicionalmente para la expresión en una célula. Las células preferidas incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, células de ovario de hámster chino (por ejemplo, CHO) , baculovirus, levadura, bacterias, células de mieloma, y/o H. sapiens. De preferencia, las secuencias se optimizan para la expresión y para la producción y para el uso clínico. Las características para la optimización para uso cl ínico incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, vida media, farmacocinética (PK) , antigenicidad, función efectora, eliminación FcRn, y respuesta del paciente, incluyendo la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) , o las actividades de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . En una modalidad adicional, la invención proporciona una región de enlace de antígeno aislada que tiene una cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs:101-103. En una modalidad relacionada, la invención proporciona una región de enlace de antígeno aislada que tiene una cadena ligera codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs:97-100. En todavía otra modalidad relacionada, la invención proporciona una región de enlace de antígeno aislada que tiene una cadena ligera codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs:97-100, y una cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs:101-103. En ciertas modalidades, la invención proporciona una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs:104-110. En una modalidad relacionada, cada una de estas secuencias de nucleótidos codifica una secuencia de aminoácidos, y las variantes conservadoras o humaneered ("humanodiseñadas") de estas secuencias de aminoácidos, que también están dentro del alcance de la presente invención. En otra modalidad relacionada, la secuencia de nucleótidos de cada una de las SEQ ID NOs:104-107, codifica una cadena ligera de enlace de antígeno. En una modalidad relacionada adicional, la secuencia de nucleótidos de cada una de las SEQ ID NOs:108-110, codifica una cadena pesada de enlace de antígeno. En todavía otra modalidad relacionada, cada una de estas secuencias de nucleótidos se optimiza para la expresión y/o para el uso clínico. En una modalidad adicional, la invención proporciona una región de enlace de antígeno aislada que tiene una cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs:108-110. En otra modalidad relacionada, la invención proporciona una región de enlace de antígeno que tiene una cadena ligera codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs:104-107. En todavía otra modalidad relacionada, la invención proporciona una región de enlace de antígeno aislada que tiene una cadena ligera codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs:104-107, y una cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs:108-110. En otras modalidades, la invención proporciona una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs:111-117, y proporciona variantes conservadoras de estas secuencias. En una modalidad relacionada, cada una de las SEQ ID NOs:111-114 ilustra una cadena ligera de enlace de antígeno. En otra modalidad, cada una de las SEQ ID NOs:115-117 ilustra una cadena pesada de enlace de antígeno. En todavía otra modalidad relacionada, la secuencia de aminoácidos se optimiza para la expresión y/o para el uso clínico. En una modalidad adicional, la invención proporciona una región de enlace de antígeno aislada que tiene una cadena pesada ¡lustrada en una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs:115-117, y proporciona variantes conservadoras de estas secuencias. En una modalidad relacionada, la invención proporciona una región de enlace de antígeno aislada que tiene una cadena ligera ilustrada en una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs: 1 1 1 -1 14, y proporciona variantes conservadoras de estas secuencias. En todavía otra modalidad relacionada, la invención proporciona una región de enlace de antígeno aislada que tiene una cadena pesada ilustrada en una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs: 1 15-1 17, y proporciona variantes conservadoras de estas secuencias, y una cadena ligera ilustrada en una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs: 1 1 1 - 1 14, y proporciona variantes conservadoras de estas secuencias. En otra modalidad, la invención proporciona una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs: 120-1 21 , y/o la región de enlace de antígeno aislada que tiene una región variable de una cadena ligera o de una cadena pesada codificada por las secuencias de nucleótidos respectivas. En una modalidad relacionada, cada una de estas secuencias de nucleótidos codifica una secuencia de aminoácidos, y las variantes conservadoras o humaneered ("humanodiseñadas") de estas secuencias de aminoácidos, que también están dentro del alcance de la invención. En otra modalidad relacionada, la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO: 120 codifica una cadena ligera de enlace de antígeno. En una modalidad relacionada adicional, la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO: 121 codifica una cadena pesada de enlace de antígeno. En todavía otra modalidad relacionada, cada una de estas secuencias de nucleótidos se optimiza adicionalmente para la expresión y/o para el uso clínico. En ciertas modalidades, la invención proporciona una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs: 1 1 8-1 19, y las variantes conservadoras o humaneered ("humanodiseñadas") de estas secuencias. En una modalidad relacionada, la SEQ I D NO: 1 1 8 ilustra una región variable de enlace de antígeno de una cadena ligera. En otra modalidad relacionada, la SEQ I D NO: 1 1 9 ¡lustra una región variable de enlace de antígeno de una cadena pesada. En todavía otra modalidad relacionada, la secuencia de aminoácidos se optimiza para la expresión y/o para el uso clínico. En otras modalidades, la invención proporciona una secuencia de aminoácidos que tiene cuando menos una identidad del 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, ó 99 por ciento con las regiones CD R ilustradas en las SEQ ID NOs:2-39. En una modalidad relacionada, la invención proporciona una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de cuando menos el 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, ó 99 por ciento con una secuencia ilustrada en las SEQ I D NOs: 1 1 1 -120. En todavía otra modalidad relacionada, la invención proporciona una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de cuando menos el 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, ó 99 por ciento con una secuencia ilustrada en las SEQ I D NOs:97-1 10 y 120-1 21 .

En cierta modalidad, cualquiera de los anticuerpos aislados anteriores es una IgG . En una modalidad relacionada, cualquiera de los anticuerpos aislados anteriores es una lgG 1 , una lgG2, una lgG3, o una lgG4. En otra modalidad, el anticuerpo es una IgE, IgM , una IgD, o una IgA. En una modalidad relacionada, la invención se selecciona a partir de una composición de anticuerpo monoclonal o policlonal. En las modalidades adicionales, el anticuerpo es quimérico, humanizado, humaneered ("humanodiseñado") , recombinante, etc. En todavía otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo humano o humanizado aislado o un fragmento funcional del mismo, que tiene una región de enlace de antígeno que es específica para un epítopo de DKK1 , y el anticuerpo o fragmento funcional se enlaza con DKK1 ó DKK4, o de otra manera bloquea el enlace de DKK1 ó DKK4 con un receptor de superficie celular (por ejemplo, receptores tales como LRP5/6, Kremen, Frizzled) . En ciertas modalidades, el anticuerpo o fragmento del mismo previene, trata, o mejora el desarrollo de las lesiones osteol íticas. En otras modalidades, la composición anti-DKK de la invención previene, trata, o mejora un cáncer o una enfermedad asociada con DKK1 ó DKK4. En una modalidad relacionada, la invención proporciona un anticuerpo humano o humanizado aislado o fragmento funcional del mismo, que tiene una región de enlace de antígeno que es específica para un epítopo de DKK1 ó DKK4 objetivo, y el epítopo contiene seis o más residuos de aminoácidos s partir de un fragmento de polipéptido que comprende los dominios CYS 1 -enlazador-CYS2 de DKK1 y/o DKK4. En una modalidad relacionada, el epítopo es un epítopo de conformación. En una modalidad preferida, el epítopo reside dentro del dominio CYS2. En una modalidad particular, el epítopo comprende un residuo de aminoácido modificado. En una modalidad relacionada, el epítopo contiene cuando menos un residuo de aminoácido glicosilado. Los fragmentos funcionales incluyen los fragmentos Fv y Fab (incluyendo las versiones de una sola cadena, tales como scFv) , así como otras regiones de enlace de antígeno de un anticuerpo, incluyendo aquéllas que se enlazan con un andamiaje que no es de inmunoglobulina, y los anticuerpos de cadena pesada, tales como los anticuerpos de camélido y de tiburón, y los nanocuerpos. En una modalidad relacionada, el anticuerpo aislado, como se describe anteriormente, es una IgG . En otra modalidad relacionada, el anticuerpo aislado , como se describe anteriormente, es una lgG 1 , una lgG2, una lgG3, o una lgG4. En una modalidad, el anticuerpo es una IgG, una IgM, o una IgA. En una modalidad relacionada, la invención es una composición de anticuerpo policlonal. En otra modalidad, la invención proporciona una composición farmacéutica que tiene cuando menos uno de los anticuerpos anteriores o fragmentos funcionales o variantes conservadoras, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable para los mismos.

En todavía otra modalidad, la invención proporciona un animal transgénico que lleva un gen que codifica cualquiera de los anticuerpos anteriores o fragmentos funcionales de los mismos. En ciertas modalidades, la invención proporciona un método para el tratamiento de un trastorno o condición asociada con la expresión de DKK1 ó DKK4. Como se utilizan en la presente, "enfermedades asociadas con DKK1 " o "enfermedades asociadas con DKK4", incluyen, pero no se limitan a, lesiones osteolíticas - en especial lesiones osteolíticas asociadas con un mieloma, especialmente un mieloma múltiple, o con cánceres de hueso; mama, colon, melanocitos, hepatocitos, epitelio, esófago, cerebro, pulmón, próstata, o páncreas, o metástasis de los mismos; pérdida ósea asociada con trasplante. Otras enfermedades o trastornos incluyen , pero no se limitan a, por ejemplo, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular (HCC), mieloma, incluyendo mieloma múltiple, diabetes, obesidad, desecho muscular, enfermedad de Alzheimer, osteoporosis, osteopenia, reumatismo, colitis, y/o pérdida de cabello i ndeseada. El método involucra administrar a un sujeto que lo necesite, una cantidad efectiva de cualquiera de las composiciones farmacéuticas anteriores. En una modalidad relacionada, el trastorno o la condición que se va a tratar es una anormalidad de la densidad ósea. En otra modalidad relacionada, la anormalidad de la densidad ósea que se va a tratar es la presencia de una lesión osteolítica en el sujeto. En otra modalidad , el trastorno o la condición que se va a tratar es una condición osteoporótica, tal como una lesión osteolítica asociada con un cáncer. En una modalidad relacionada, el cáncer que se va a tratar es un mieloma, tal como mieloma múltiple, o un cáncer de hueso, mama, colon, melanocitos, hepatocitos, epitelio, esófago, cerebro, pulmón , próstata, o páncreas, o metástasis de los mismos. En otras modalidades, la condición osteoporótica es osteoporosis u osteopenia u osteosarcoma. En ciertas modalidades, cualquiera de los métodos anteriores involucra además administrar un agente quimioterapéutico. En una modalidad relacionada, el agente quimioterapéutico es un agente contra el cáncer. En otra modalidad relacionada, el agente quimioterapéutico es un agente anti-osteoporótico. En todavía otra modalidad, la invención proporciona un método para el tratamiento de una célula objetivo, involucrando el método bloquear la interacción de DKK1 ó DKK4 con la célula, con cualquiera de los anticuerpos anteriores o fragmentos funcionales de los mismos. En general, la célula objetivo lleva un receptor que se enlaza con DKK1 ó DKK4. En una modalidad, la célula objetivo es un osteoblasto, en donde el tratamiento con la composición anti-DKK1 /4 neutralizante de la invención mejorará la proliferación y estimulará la formación ósea. En una modalidad, la célula objetivo es una célula muscular, en donde el tratamiento contrarrestará el desecho muscular. En una modalidad relacionada, el método involucra además el tratamiento de un paciente con la célula objetivo, con un agente quimioterapéutico o radiación. En una modalidad relacionada, en seguida de la administración o del contacto, cualquiera de los métodos anteriores involucra además observar la mejoría o el retardo del desarrollo de una lesión osteolítica. En todavía otra modalidad, la invención proporciona un método para identificar DKK1 ó DKK4 en suero. Este método involucra detectar DKK1 ó DKK4 con cualquiera de los anticuerpos anteriores o fragmentos de anticuerpos, que tengan además una marca detectable. La marca es radioactiva, fluorescente, magnética, paramagnética, o quimiluminiscente. En otra modalidad, cualquiera de los anticuerpos humanos o humanizados, o fragmentos de anticuerpos, son sintéticos. En otra modalidad, la invención proporciona una composición farmacéutica de cualquiera de los anticuerpos anteriores o fragmentos funcionales de estos anticuerpos, y un agente terapéutico adicional. El agente terapéutico adicional se puede seleccionar a partir del grupo que consiste en un agente contra el cáncer; un agente anti-osteoporótico; un antibiótico; un agente anti-metabólico; un agente anti-diabético; un agente anti-inflamatorio; un agente antiangiogénico; un factor de crecimiento; y una citoquina. La invención se refiere además a un método para prevenir o tratar enfermedades proliferativas, o enfermedades tales como cáncer, en un mamífero, en particular en un ser humano, con una combinación de agentes farmacéuticos que comprende: (a) un agente neutralizante de DKK1/4 de la invención; y (b) uno o más agentes farmacéuticamente activos; en donde cuando menos un agente farmacéuticamente activo es un agente terapéutico contra el cáncer. La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden: (a) un agente neutralizante de DKK1 Y4; (b) un agente farmacéuticamente activo; y (c) un vehículo farmacéuticamente aceptable; en donde cuando menos un agente farmacéuticamente activo es un agente terapéutico contra el cáncer. La presente invención se refiere además a un paquete comercial o producto que comprende: (a) una formulación farmacéutica de un anticuerpo neutralizante de DKK1 /4; y (b) una formulación farmacéutica de un agente farmacéuticamente activo para su uso simultáneo, concurrente, separado, o en secuencia; en donde cuando menos un agente farmacéuticamente activo es un agente terapéutico contra el cáncer. En cierta modalidad, la invención proporciona un anticuerpo que tiene una primera secuencia de aminoácidos que es una cadena pesada seleccionada a partir de las SEQ ID NOs:2-20, y una secuencia que tiene una identidad de secuencia de cuando menos el 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, ó 99 por ciento en las regiones CD R, con las regiones CDR que tienen las SEQ ID NOs:2-20; y una segunda secuencia de aminoácidos que es una cadena ligera seleccionada a partir de las SEQ I D NOs:21 -39, y una secuencia que tiene una identidad de secuencia de cuando menos el 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, ó 99 por ciento en las regiones CDR, con las regiones CDR mostradas en las SEQ I D NO:21 -39. En todavía otra modalidad, la invención proporciona un inmunoconjugado hecho de un primer componente que es un anticuerpo o un fragmento como se describe anteriormente, y un segundo componente que tiene una segunda secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, el inmunoconjugado es una citotoxina, o el inmunoconjugado es una proteína de enlace o un anticuerpo que tiene una especificidad de enlace para un objetivo que es diferente de DKK1 ó DKK4. Por ejemplo, el objetivo de la especificidad de enlace diferente de DKK1 ó DKK4 es un antígeno tumoral o una proteína asociada con tumor sobre la superficie de una célula de cáncer. En ciertas modalidades, la invención proporciona cualquiera de los anticuerpos anteriores como un anticuerpo biespecífico. En otra modalidad, la invención proporciona un kit que tiene cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo anteriores. En algunas modal idades, el kit contiene además un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable del mismo. En otras modalidades relacionadas, cualquiera de los anticuerpos anteriores en el kit está presente en una dosis unitaria. En todavía otra modalidad, el kit es un kit de diagnóstico ELISA. En una modalidad relacionada, el kit incluye instrucciones para utilizarse en la administración de cualquiera de los anticuerpos anteriores a un sujeto. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una gráfica que ilustra que no hay pérdida significativa de His-Strep-tagged DKK1 a partir de las perlas recubiertas con Strep-Tactin, cuando las perlas no lavadas se comparan con las perlas lavadas con diferentes astringencias de HuCAL®. La Figura 2 es una gráfica de barras que ilustra los resultados de un ensayo de actividad de Wnt con 1 00 microlitros de reactivo de luciferasa Bright-Glo, como se proporciona en el Ejemplo 3. La Figura 3 es una gráfica de un ensayo inmunosorbente enlazado con enzimas (ELISA) . La fluorescencia se mide en un lector de placas TECAN Spectrafluor, y se m uestran las curvas de enlace.

La Figura 4 es una gráfica que ilustra el ensayo de reportero de luciferasa de TCF/LEF dependiente de Wnt3a estándar, como se proporciona en el Ejemplo 6. La Figura 5 es una gráfica que ilustra una versión mejorada del ensayo de reportero de luciferasa de TCF/LEF, que muestra la sensibilidad altamente mejorada al DKK1 , mediada por la co-expresión de la proteína co-receptora Kremen. La Figura 6A es una ilustración gráfica de la medición de resonancia de plasmón superficial de un anticuerpo anti-DKK1 /4 que se enlaza con DKK1 . La Figura 6B es una tabulación de la afinidad de enlace calculada y los valores cinéticos. La Figura 7A es una representación esquemática de DKK1 de longitud completa y truncado, para utilizarse en el mapeo del epítopo. La Figura 7B ilustra el enlace de un anticuerpo de la invención con las proteínas DKK1, y los fragmentos de la Figura 7A.

La Figura 8 es una ilustración gráfica del enlace del anticuerpo de DKK1/4 en un ensayo ELISA de competencia. La Figura 9 es una ilustración gráfica de la reactivación asociada con el anticuerpo de DKK1/4 de la transcripción genética regulada por Wnt corriente abajo. La Figura 10 es una ilustración gráfica de DKK1 en reversa del anticuerpo de DKK1/4 inhibido de la secreción de ALP. La Figura 11 es una ilustración gráfica de los efectos del anticuerpo de DKK1/4 sobre los xenoinjertos in vivo. La Figura 12 es una ilustración gráfica de la elevación de la densidad ósea asociada con el anticuerpo de DKK1/4 in vivo. La Figura 13 es una ilustración gráfica que compara la eficacia anti-osteolítica de Zometa con un anticuerpo de DKK1/4. La Figura 14 es una ilustración gráfica de la eficacia dependiente de la dosis de un anticuerpo de DKK1/4 sobre el hueso anabólico. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos de DKK1/4 aislados, en particular anticuerpos humanos, que se enlazan específicamente con DKK1 ó DKK4, y que inhiben las propiedades funcionales de DKK1 ó DKK4. En una modalidad preferida, el anticuerpo de DKK1/4 no se enlaza específicamente con DKK2 ó DKK3. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención se derivan a partir de secuencias de cadena pesada y ligera particulares, y/o comprenden características particulares estructurales, tales como regiones CDR que comprenden secuencias de aminoácidos particulares. La invención proporciona anticuerpos aislados, métodos para la elaboración de estos anticuerpos, inmunoconjugados, y moléculas biespecíficas que comprenden estos anticuerpos, y composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos, inmunoconjugados, o moléculas biespecíficas de la invención. La invención también se refiere a métodos para utilizar los anticuerpos con el fin de inhibir un trastorno o condición asociada con DKK1 ó DKK4. Las enfermedades y trastornos contemplados incluyen, pero no se limitan a, lesiones osteol íticas - en especial lesiones osteolíticas asociadas con un mieloma, especialmente un mieloma múltiple, o con cánceres de hueso, mama, colon , melanocitos, hepatocitos, epitelio, esófago, cerebro, pulmón, próstata, o páncreas, o metástasis de los mismos; pérdida ósea asociada con trasplante. Otras enfermedades o trastornos incluyen , pero no se limitan a, por ejemplo, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular (HCC) , mieloma, incluyendo mieloma múltiple, diabetes, obesidad, desecho muscular, enfermedad de Alzheimer, osteoporosis, osteopenia, reumatismo, colitis, y/o pérdida de cabello indeseada. Con el objeto de que la presente invención se pueda entender más fácilmente, primero se definen ciertos términos. Se estipulan definiciones adicionales a través de toda la descripción detallada. El término "respuesta inmune" se refiere a la acción de, por ejemplo, los linfocitos, las células presentadoras de antígeno, las células fagocíticas, los granulocitos, y las macromoléculas solubles producidas por las células anteriores o por el hígado (incluyendo anticuerpos, citoquinas, y complementos), que den como resultado el daño selectivo a, la destrucción de, o la eliminación del cuerpo humano de, patógenos invasores, células o tejidos infectados con patógenos, células cancerosas, o en los casos de la autoinmunidad o inflamación patológica, las células o tejidos humanos normales. Una "senda de transducción de señales" se refiere a la relación bioquímica entre una variedad de moléculas de transducción de señales que tienen un papel en la transmisión de una señal desde una porción de célula hasta otra porción de una célula. Como se utiliza en la presente, la frase "receptor de superficie celular" incluye, por ejemplo, moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal, y capaces de transmitir esta señal a través de la membrana de plasma de una célula. Un ejemplo de un "receptor de superficie celular" de la presente invención es un receptor con el que se enlaza la molécula de proteína de DKK1 ó DKK4. Estos receptores de superficie celular incluyen, pero no se limitan a, Frizzled (Fz), LRP (LRP5 y LRP6), y Kremen (Krm). Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, anticuerpos de una sola cadena, y fragmentos de los mismos, tales como Fab, (ab')2, Fv, y otros fragmentos que retengan la función de enlace de antígeno del anticuerpo progenitor. Como tal, un anticuerpo puede referirse a una inmunoglobulina o glicoproteína, o un fragmento o porción de las mismas, o a una construcción que comprenda una porción de enlace de antígeno comprendida dentro de una estructura de tipo inmunoglobulina modificada, o a una porción de enlace de antígeno comprendida dentro de una construcción que comprenda una estructura o andamiaje que no sea de tipo inmunoglobulina. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a una composición de anticuerpo que tiene una población de anticuerpos homogénea. El término no se limita a considerar la especie o la fuente del anticuerpo, ni pretende limitarse por la manera en la que se elabore. El término abarca las inmunoglobulinas enteras, así como los fragmentos, tales como Fa . (ab )2. Fv, y otros que retengan la función de enlace de antígeno del anticuerpo. En esta invención se pueden utilizar los anticuerpos monoclonales de cualquier especie de mamífero. Sin embargo, en la práctica, los anticuerpos típicamente serán de origen de rata o de murino, debido a la disponibilidad de las líneas celulares de rata o de murino para utilizarse en la elaboración de las líneas celulares híbridas requeridas o de los hibridomas para producir los anticuerpos monoclonales. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo policlonal" se refiere a una composición de anticuerpo que tiene una población de anticuerpos heterogénea. Los anticuerpos policlonales con frecuencia se derivan a parti r del suero reservado de animales inmunizados o de seres humanos seleccionados. Como se utiliza en la presente, la frase "anticuerpos de una sola cadena" se refiere a los anticuerpos preparados mediante la determinación de los dominios de enlace (tanto de la cadena pesada como ligera) de un anticuerpo de enlace; y el suministro de una fracción de enlace que permita la conservación de la función de enlace. Esto forma, en esencia, un anticuerpo radicalmente abreviado, que tiene solamente la parte del dominio variable necesaria para enlazarse con el antígeno. La determinación y construcción de los anticuerpos de una sola cadena se describen en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica N úmero 4,946,778 a Ladner y colaboradores. Un "anticuerpo que se presenta naturalmente" es una glicoproteína que comprende cuando menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada está comprendida de una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como VH) , y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está comprendida de tres dominios, CH 1 , CH2 y CH3. Cada cadena ligera está comprendida de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como V ) , y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está comprendida de un dominio, CL. Las regiones VH y V se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, denominadas como regiones determinantes de complementariedad (CDR) , intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas como regiones de estructura (FR) . Cada VH y V está compuesta de tres regiones determinantes de complementariedad y cuatro regiones de estructura configuradas desde el término amino hasta el término carboxilo en el siguiente orden: FR1 , CDR 1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de enlace que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar el enlace de la inmunoglobulina a los tejidos o factores huésped, incluyendo diferentes cél ulas del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico. El término "porción de enlace de antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de antígeno") , como se utiliza en la presente, se refiere a la secuencia de la proteína que se enlaza con el objetivo, por ejemplo, una o más regiones determinantes de complementariedad. Incluye, por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, uno o más fragmentos de un anticuerpo, y/o regiones determinantes de complementariedad sobre un andamiaje no relacionado con inmunoglobulina que retengan la capacidad para enlazarse específicamente con un antígeno (por ejemplo, DKK1 ) . La función de enlace de antígeno de un anticuerpo se puede llevar a cabo mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa.

Los ejemplos de los fragmentos de enlace abarcados dentro del término "porción de enlace de antígeno" de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios V , VH, C y CH 1 ; un fragmento F(ab)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de articulación; un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH 1 ; un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; un fragmento de dAb (Ward y colaboradores, 1 989 Nature 341 :544-546), que consiste en un dominio VH; y una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Como se utiliza en la presente, un "antígeno" o un "epítopo", se refieren de una manera intercambiable a una secuencia de polipéptido sobre una proteína objetivo reconocida específicamente por una porción de enlace de antígeno de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o sus equivalentes. Un antígeno o epítopo comprende cuando menos seis aminoácidos, los cuales pueden ser contiguos dentro de una secuencia objetivo, o no contiguos. Un epítopo de conformación puede comprender residuos no contiguos, y opcionalmente puede contener residuos de aminoácidos naturalmente o sintéticamente modificados. Las modificaciones a los residuos incluyen , pero no se limitan a: fosforilación, glicosilación, PEGilación, ubiquitinización, furanilización, y similares. Adicionalmente, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, se pueden unir, empleando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que haga posible que se elaboren como una sola cadena de proteína, en donde las regiones V y VH se emparejen para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de una sola cadena (scFv) ; véase, por ejemplo, Bird y colaboradores, 1 988 Science 242:423-426; y H uston y colaboradores, 1 988 Proc. Nati. Acad. Sci. 85:5879-5883) . Estos anticuerpos de una sola cadena también pretenden ser abarcados dentro del término "porción de enlace de antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen empleando técnicas convencionales conocidas por los expertos en este campo , y los fragmentos se rastrean para determinar la utilidad de la misma manera que los anticuerpos i ntactos. Como se describe en la presente, las variantes conservadoras incluyen residuos de aminoácidos en cualquiera de las secuencias de aminoácidos identificadas, en particular cambios conservadores que son bien conocidos por un experto ordinario en el ámbito de la ingeniería de proteínas. Un "anticuerpo aislado", como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tengan diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se enlace específicamente con DKK1 está sustancialmente libre de anticuerpos que se enlacen específicamente con antígenos diferentes de DKK1 ) . Un anticuerpo aislado que se enlaza específicamente con DKK1 , sin embargo, puede tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas de DKK1 de otras especies, u otros miembros de la familia, tales como DKK4 o parálogos relacionados. Más aún, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos. El término "anticuerpo humano", como se utiliza en la presente, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables en donde tanto las regiones de estructura como las regiones determinantes de complementariedad se derivan a partir de secuencias de origen humano. Adicionalmente, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva a partir de estas secuencias humanas, por ejemplo, secuencias de la línea germinal humana, o versiones mutadas de secuencias de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias humanas (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro, o mediante mutación somática in vivo) . Sin embargo, el término "anticuerpo humano" , como se utiliza en la presente, no pretende incluir anticuerpos en donde se han injertado secuencias de regiones determinantes de complementariedad derivadas a partir de la línea germinal de otras especies de mam íferos, tales como un ratón, sobre las secuencias de estructura humanas. El término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a los anticuerpos que exhiben una sola especificidad de enlace que tienen regiones variables, en donde tanto las regiones de estructura como las regiones determinantes de complementariedad se derivan a partir de secuencias humanas. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales humanos son producidos por un hibridoma que incluye una célula-B obtenida a partir de un animal no humano transgénico (por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprenda un transgén de cadena pesada y un transgén de cadena ligera fusionado con una célula inmortalizada. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpos humanizados" significa que cuando menos una porción de las regiones de estructura de una inmunoglobulina se deriva a partir de secuencias de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos "humanizados", tales como los anticuerpos con secuencias de CD R derivadas a partir de la l ínea germinal de otras especies, en especial una especie de mam ífero, por ejemplo un ratón, que se hayan injertado sobre secuencias de estructura humanas. Las tecnologías de ejemplo incluyen la tecnología de humanización de PDL. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpos humaneered ("humanodiseñados")" significa los anticuerpos que se enlazan con el mismo epítopo pero que difieren en la secuencia. Las tecnologías de ejemplo incluyen los anticuerpos humaneered ("humanodiseñados") producidos por la tecnología de humaneering ("humanodiseño") de Kalobios, en donde la secuencia de la región de enlace de antígeno se deriva, por ejemplo, a partir de una mutación, en lugar de ser debido a los reemplazos de aminoácidos conservadores.

El término "anticuerpo humano recombinante", como se utiliza en la presente, incluye todos los anticuerpos humanos que son preparados, expresados, creados, o aislados por medios recombinantes, tales como los anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo, un ratón) que sea transgénico o transcromosómico para los genes de inmunoglobulina humana, o un hibridoma preparado a partir de los mismos, los anticuerpos aislados a partir de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo humano, por ejemplo, a partir de un transfectoma; los anticuerpos aislados a partir de una biblioteca de anticuerpos humanos de combinación recombinantes; y los anticuerpos preparados, expresados, creados, o aislados por cualquier otro medio que involucre el empalme de todo o una porción de un gen de inmunoglobulina humana; las secuencias para otras secuencias de ADN . Estos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en donde las regiones de estructura y las regiones determinantes de complementariedad se derivan a partir de las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En ciertas modalidades, sin embargo, estos anticuerpos humanos recombinantes se pueden someter a mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para las secuencias de Ig humanas, mutagénesis somática in vivo) , y por lo tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y V de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque se derivan a partir de, y están relacionadas con, las secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de la línea germinal del anticuerpo humano in vivo. Como se utiliza en la presente "isotipo" se refiere a una clase de anticuerpo (IgA, IgD, IgM, IgE, IgG, tal como lgG1, lgG2, lgG3 ó lgG4), que es proporcionada por los genes de región constante de cadena pesada. Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno", se utilizan de una manera intercambiable en la presente con el término "un anticuerpo que se enlaza específicamente con un antígeno". Como se utiliza en la presente, un anticuerpo que "se enlaza específicamente con el DKK1 humano" pretende referirse a un anticuerpo que se enlaza con el DKK1 humano con una KD de 5x10"9M o menos, 2x10'9M o menos, ó 1x10'10M o menos. Un anticuerpo que "reacciona cruzadamente con un antígeno diferente del DKK1 humano" pretende referirse a un anticuerpo que se enlaza con el antígeno con una KD de 0.5x10"8M o menos, 5x10'9M o menos, ó 2x10"9M o menos. Un anticuerpo que "no reacciona cruzadamente con un antígeno particular" pretende referirse a un anticuerpo que se enlaza con ese antígeno, con una KD de 1.5x10"8M o más, o una KD de 5-10x10"8M ó 1x10'7M o más. En ciertas modalidades, estos anticuerpos que no reaccionan cruzadamente con el antígeno exhiben un enlace esencialmente indetectable contra estas proteínas en los ensayos de enlace convencionales. Como se utiliza en la presente, un anticuerpo que "inhibe el enlace de DKK1 con un receptor de superficie celular", tal como LRP, Fz, ó Krm , se refiere a un anticuerpo que inhibe el enlace de DKK1 con el receptor con una KD de 1 nM o menos , 0.75 n M o menos , 0.5 n M o menos , o 0.25 n M o menos . Como se utiliza en la presente , "osteólisis" se refiere a una disminución en la densidad ósea, que se puede deber a diferentes mecanismos de acción , incluyendo, por ejemplo, una dismi n ución en la actividad de los osteoblastos, o un incremento en la actividad de los osteoclastos . Por consiguiente, la osteólisis abarca los mecanismos que afectan genéricamente a la densidad mi neral ósea. Como se utiliza en la presente , un anticuerpo que "in hibe la actividad osteol ítica" pretende referi rse a un anticuerpo q ue i nhibe la pérdida de densidad ósea, ya sea mediante el incremento de la formación ósea, o bien mediante el bloqueo de la resorción ósea. El término "Kas0c?ada" o "Ka", como se utiliza en la presente, pretende referirse al índice de asociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno, mientras que el térm ino "Kd,s" o "KD", como se utiliza en la presente, pretende referirse al índice de disociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno . El térm ino "KD", como se utiliza en la presente, pretende referi rse a la constante de disociación , q ue se obtiene a parti r de la proporción de Kd a Ka (es deci r, Kd/Ka) , y se expresa como una concentración molar ( M) . Los valores KD para los anticuerpos se pueden determi nar empleando métodos bien establecidos en este campo. U n método para determinar la KD de un anticuerpo es mediante la utilización de resonancia de plasmón superficial, mediante FMAT, o utilizando un sistema biosensor, tal como un sistema Biacore®. Como se utiliza en la presente, el término "afinidad" se refiere a la fuerza de interacción entre el anticuerpo y el antígeno en sitios antigénicos únicos. Dentro de cada sitio antigénico, la región variable del "brazo" del anticuerpo interactúa a través de fuerzas débiles no covalentes con el antígeno en numerosos sitios; mientras más interacciones haya, más fuerte será la afinidad. Como se utiliza en la presente, el término "avidez" se refiere a una medida de información de la estabilidad global o fuerza del complejo de anticuerpo-antígeno. Se controla mediante tres factores principales: afinidad del epítopo de anticuerpo; la valencia de tanto el antígeno como del anticuerpo; y la configuración estructural de las partes que interactúen. Finalmente, estos factores definen la especificidad del anticuerpo, es decir, la probabilidad de que el anticuerpo particular se esté enlazando con un epítopo de antígeno preciso. Con el objeto de obtener una sonda de más alta avidez, se puede construir un conjugado dimérico (dos moléculas de JWJ-1 acopladas con un marcador FACS) , haciendo de esta manera que las interacciones de baja afinidad (tales como con el anticuerpo de la línea germinal) sean más fácilmente detectadas mediante FACS. En adición, otro medio para aumentar la avidez del enlace de antígeno involucra la generación de dímeros o multímeros de cualquiera de las construcciones de fibronectina descritas en la presente, de los anticuerpos de DKK1 ó DKK4. Estos multímeros se pueden generar a través del enlace covalente entre los módulos individuales, por ejemplo, imitando el enlace natural del término C con N , o imitando los dímeros de anticuerpo que se mantienen juntos a través de sus regiones constantes. Los enlaces diseñados en la interfase de Fc/Fc pueden ser covalentes o no covalentes. En adición, se pueden utilizar componentes de dimerización o multimerización diferentes de Fe en los h íbridos de DKK1 ó DKK4 para crear estas estructuras de orden más alto. Como se utiliza en la presente, el término "reactividad cruzada" se refiere a un anticuerpo o a una población de anticuerpos que se enlazan con epítopos sobre otros antígenos. Esto puede ser causado ya sea por la baja avidez o especificidad del anticuerpo, o bien por múltiples antígenos distintos que tengan epítopos idénticos o muy similares. La reactividad cruzada algunas veces es deseable cuando se desea el enlace general con un grupo relacionado de antígenos , o cuando se trata de marcar especies cruzadas cuando la secuencia del epítopo del antígeno está altamente conservada en la evolución.

Como se utiliza en la presente, el término "alta afinidad" o "alta especificidad" para un anticuerpo de IgG, se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 10"8M o menos, de 10'9M o menos, o de 10' 1 0M o menos para un antígeno objetivo. Sin embargo, el enlace de "alta afinidad" puede variar para otros isotipos de anticuerpos. Por ejemplo, el enlace de "alta afinidad" para un isotipo de Ig M se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 10"7M o menos, o de 1 0'8M o menos. Como se utiliza en la presente, el término "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. El término "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, reses, pollos, anfibios, reptiles, etc. Como se utiliza en la presente, el término "optimizada" significa que una secuencia de nucleótidos se ha alterado para purificar una secuencia de aminoácidos utilizando codones que son preferidos en la célula u organismo de producción, y/o que la secuencia de nucleótidos se ha alterado para remover los sitios donadores de empalme o aceptores de empalme latentes. Las tablas de codones optimizados son bien conocidas en la técnica para una amplia variedad de especies. Las secuencias para los sitios donadores de empalme y aceptores de empalme también se conocen en este campo, y se pueden identificar los sitios de empalme latentes, por ejemplo, mediante el análisis de los datos de transcripción o de expresión. Las células de producción incluyen, pero no se limitan a, una célula procariótica, tal como, por ejemplo, una célula procariótica tal como un baculovirus o una bacteria (E. coli), o una célula eucariótica, por ejemplo, levadura (por ejemplo, Pichia), una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula de mieloma, o una célula humana. La secuencia de nucleótidos optimizada se diseña para retener completamente o tanto como sea posible la secuencia de aminoácidos y el número de residuos originalmente codificados por la secuencia de nucleótidos de partida, que también se conoce como la secuencia "progenitora". Las secuencias optimizadas de la presente se han diseñado para tener codones que son preferidos en las células de producción; sin embargo, también se prevé en la presente la expresión optimizada de estas secuencias en otras células eucarióticas y procarióticas. Las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de nucleótidos optimizadas son referidas opcionalmente como optimizadas. En las modalidades relacionadas, las secuencias de polipéptidos de las composiciones anti-DKK1 /4 neutralizantes de la invención , y los nucleótidos que las codifican, de preferencia se optimizan para la producción y el uso cl ínico. Las características que se pueden optimizar para uso clínico incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, la vida media, la farmacocinética (PK) , la antigenicidad, la función efectora, la eliminación de FcRn, y la respuesta del paciente, i ncluyendo las actividades de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) o de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . Como se utilizan en la presente, "enfermedades asociadas con DKK1 " o "enfermedades asociadas con DKK4" incluyen, pero no se li mitan a, lesiones osteolíticas - en especial lesiones osteol íticas asociadas con un mieloma, en especial un mieloma múltiple, o con cánceres de hueso, mama, colon, melanocitos, hepatocitos, epitelio, esófago, cerebro, pulmón, próstata, o páncreas, o metástasis de los mismos; pérdida ósea asociada con trasplante. Otras enfermedades o trastornos incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular (HCC) , mieloma, incluyendo mieloma múltiple, diabetes, obesidad, desecho muscular, enfermedad de Alzheimer, osteoporosis, osteopenia, reumatismo, colitis, y/o pérdida de cabello indeseada. Como se utiliza en la presente, un "tratamiento" es una intervención realizada con la intención de prevenir el desarrollo o alterar la patología de un trastorno. De conformidad con lo anterior, "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. Aquéllos que necesiten tratamiento incluyen aquéllos que ya tengan el trastorno, así como aquéllos en los que se vaya a prevenir el trastorno. En el tratamiento de tumores (por ejemplo, cáncer), un agente terapéutico puede disminuir directamente la patología de las células tumorales, o hacer que las células tumorales sean más susceptibles al tratamiento mediante otros agentes terapéuticos, por ejemplo radiación y/o quimioterapia. La "patología" del cáncer incluye todos los fenómenos que comprometen el bienestar del paciente. Esto incluye, sin limitación, el crecimiento celular anormal o incontrolable, metástasis, interferencia con el funcionamiento normal de las células vecinas, liberación de citoquinas u otros productos secretores a niveles anormales, supresión o agravamiento de la respuesta inflamatoria o inmunológica, etc. El tratamiento de los pacientes que sufran de síntomas clínicos, bioquímicos, radiológicos, o subjetivos de la enfermedad, tales como osteólisis, pueden incluir aliviar algunos o todos estos síntomas, o reducir la predisposición a la enfermedad. En general, una composición anti-DKK1 /4 neutralizante de la invención previene, trata, o mejora las enfermedades relacionadas con Wnt asociadas con DKK1 ó DKK4, o ambos, pero no las enfermedades asociadas con DKK2 ó DKK3, o con otros moduladores de la senda de Wnt. Diferentes aspectos de la invención se describen con mayor detalle en las siguientes subsecciones. La senda de Wnt es un importante regulador de la diferenciación de las células totipotentes mesenquimales (MSC) hasta los osteoblastos. También es un factor de sobrevivencia importante para los osteoblastos activos. Dickkopf-1 (DKK1 ) es un antagonista de la senda de Wnt expresado predominantemente en el hueso de los adultos, y aumenta en los pacientes de mieloma con lesiones osteolíticas. Un anticuerpo anti-DKK1 /4 neutralizante es un agente verdaderamente anabólico, que actúa a través del aumento de la actividad osteoblástica, mientras que disminuye simultáneamente la actividad osteoclástica. En contraste, los fármacos actuales, tales como PTH , que se comercian como agentes anabólicos, de hecho aumentan los marcadores asociados tanto con los osteoblastos como con los osteoclastos, . En la invención se proporcionan anticuerpos policlonales y monoclonales seleccionados para enlazarse con DKK1 . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-DKK1 reacciona cruzadamente con DKK4 (Kd -300 pM), pero no con DKK2 (análisis de afinidad continuo). Un epítopo preferido para un anticuerpo anti-DKK1 ó anti-DKK4 se mapea en el dominio Cys-2 (aminoácidos 189-263), que se sabe que es responsable del enlace tanto de LRP6 como de Kremen. En una modalidad, el epítopo incluye cuando menos seis, y cuando mucho 30 residuos de aminoácidos a partir del dominio Cys-2 de un polipéptido de DKK1 ó DKK4. En cierta modalidad, el epítopo incluye un estiramiento de cuando menos seis aminoácidos contiguos. En otras modalidades, el sitio de enlace preferido es no lineal, es decir, incluye residuos de aminoácidos no contiguos. En algunas modalidades, el enlace depende de la N-glicosilación. Solamente se predice un sitio de N-glicosilación, en el residuo 256 del dominio Cys-2. En la presente invención, un anticuerpo anti-DKK1 neutralizante bloquea la interacción de DKK1 con LRP6 tanto en el ELISA como en los ensayos de enlace de superficie celular. Como se espera, esto neutraliza efectivamente la actividad supresora de Wnt de DKK1 a EC50s debajo de 1 nM in vitro. En un modelo in vitro de diferenciación de osteoblastos, las células 10T1/2 de ratón se tratan con Wnt3A para estimular la secreción de fosfatasa alcalina (AP), un marcador para la actividad de los osteoblastos. DKK1 bloquea la producción de AP en este modelo, y los anticuerpos de la invención revierten completamente esta inhibición.

En ciertas modalidades, un anticuerpo de la invención exhibe una farmacocinética lineal de la dosis (AUC) en ratones, con una vida media terminal dependiente de la dosis de 35 a 96 horas en los ratones, sobre una dosis de 20 a 200 microgramos/ratón. Utilizando el modelo intratibial de metástasis tumoral de próstata osteolítica, los anticuerpos de la invención inhiben el daño de hueso cortical inducido por tumor. Los efectos sobre el hueso trabecular se confunden en este modelo por la observación de que tanto los implantes tumorales como los implantes falsos provocan daño mecánico al hueso, lo cual da como resultado un aumento inicial en el hueso tejido que posteriormente se remodela, provocando de esta manera una disminución en el volumen óseo aparente. En cierta modalidad, un anticuerpo de la invención aumenta la producción del hueso tejido tanto en las tibias implantadas con tumor como implantadas falsamente, e inhibe la disminución del volumen óseo que acompaña a la remodelación. En las modalidades relacionadas, se utilizan los cambios en los marcadores óseos (osteocalcina, sRANKL, OPG , AP, TRAF) para demostrar los efectos clínicos de los anticuerpos de la invención sobre las enfermedades relacionadas con los huesos, y para predecir los resultados cl ínicos de los tratamientos con niveles farmacéuticamente efectivos de un anticuerpo anti-DKK1 neutralizante, como se dispone en la presente. Krm se enlaza con DKK en aproximadamente la misma región que LRP. Krm se necesita para la inhibición de la señal de Wnt por medio de la interacción de DKK con LRP. Krm-DKK-LRP forman complejo con el objeto de internalizarse para la desactivación de la senda de Wnt. Una composición anti-DKK1 /4 neutralizante de la invención de preferencia se enlaza con DKK1 ó DKK4, bloqueando su interacción con LRP y/o Krm , neutralizando de esta manera el efecto de DKK1 ó DKK4 sobre la senda de señalización de Wnt. La reactivación de la senda de Wnt ocurre solamente cuando DKK1 y/o DKK4 son li mitantes. Los ensayos convencionales para evaluar la capacidad de enlace de los anticuerpos hacia DKK1 de diferentes especies son conocidos en este campo, incluyendo, por ejemplo, ELISAs, Western blot, y RIAs. Los ensayos adecuados se describen con detalle en los Ejemplos. La cinética de enlace (por ejemplo, afinidad de enlace) de los anticuerpos, también se puede evaluar mediante ensayos convencionales conocidos en la materia, tal como mediante el análisis Biacore, el ensayo BioVeris SET, FMAT, quimiluminiscencia, y/o ensayos SPR - ensayos de inhibición o liberación de señales. Los ensayos para evaluar los efectos de los anticuerpos sobre las propiedades funcionales de DKK1 se describen con mayor detalle en los Ejemplos. De conformidad con lo anterior, se entenderá que un anticuerpo que "inhibe" una o más de estas propiedades funcionales de DKK1 (por ejemplo, actividades bioqu ímicas, inmunoquímicas, celulares, fisiológicas, u otras actividades biológicas, o similares), determinadas de acuerdo con las metodologías conocidas en este campo y descritas en la presente, se relaciona con una disminución estadísticamente significativa en la actividad particular en relación con la que se ve en ausencia del anticuerpo (por ejemplo, o cuando está presente un anticuerpo de control de una especificidad irrelevante). Un anticuerpo que inhiba los efectos de la actividad de DKK1 , tales como una disminución estadísticamente significativa, por cuando menos el 10 por ciento del parámetro medido, por cuando menos el 50 por ciento, el 80 por ciento, o el 90 por ciento, y en ciertas modalidades un anticuerpo de la invención, puede inhibir más del 95 por ciento , del 98 por ciento, o del 99 por ciento de la actividad funcional de DKK1 . Miembros de la Famil ia Dickkopf El metabolismo óseo apropiado involucra una compleja red de sendas reguladoras e interconexiones entre osteoblastos, osteoclastos, y el estroma circundante. Los desequilibrios en estos mecanismos reguladores están involucrados en las condiciones osteol íticas, tales como osteoporosis, lesiones osteol íticas inducidas por tumor, lesión ósea inducida por trasplante renal y de hígado, y pérdida ósea inducida por quimioterapia anti-hormona. Estas condiciones pueden tener severos síntomas, incluyendo dolor de huesos, fracturas, compresión vertebral , y movilidad reducida. La mayoría de los tratamientos aprobados o actualmente bajo evaluación clínica, actúan predominantemente inhibiendo la función de los osteoclastos. Por ejemplo, los bisfosfonatos, tales como el ácido zoledrónico (Zometa) , son el estándar actual de cuidado, y actúan inhibiendo la fu nción y sobrevivencia de los osteoclastos . Aunque los bisfosfonatos son en general efectivos, algunos pacientes no responden robustamente, o i nterru mpen el uso debido a toxicidad renal u osteonecrosis [Markowitz 2003] [Ruggiero 2004] . En adición, existen mú ltiples fármacos de investigación que se dirigen al desarrollo de los osteoclastos, tales como RAN KL y los anticuerpos neutralizantes de M-CSF, o la función de los osteoclastos, tales como los inhibidores de Catepsi na K. El estímulo de la actividad de los osteoblastos proporcionaría un mecanismo novedoso mediante el cual tratar la enfermedad osteol ítica. La senda de Wnt tiene un importante papel en la d iferenciación y actividad de los osteoblastos, mientras que la famil ia de antagonistas D ickkopf ( DKK) en particu lar, se han identificado como reguladores clave de este proceso in vitro (véase [Krishnan 2006] para una revisión) . In vitro, Wnt es un factor de sobrevivencia y diferenciación esencial de los osteoblastos. La validación cl ínica para el papel de la senda de Wnt se proporciona m ediante las mutaciones en el co-receptor de Wnt, LRP5. Las mutaciones inactivadoras en LR P5 dan como resultado el sínd rome de pseudo-glioma de osteoporosis (OPPG) [Ai 2005] , m ientras que las mutaciones activadoras dan como resultado una alta masa ósea [Boyden 2002] . Estas mutaciones activadoras se encuentran en el dominio extracelular, y se ha demostrado que deterioran el enlace con la familia de antagonistas de Wnt Dickkopf (DKK) . Se ha reportado que DKK 1 se sobre-expresa en las cél u las de mieloma de los pacientes con lesiones óseas, pero está ausente en las células de plasma normales o en las células de plasma de los pacientes sin lesiones óseas [Tian 2004] [Politou 2006] . Esta sobre-expresión de DKK1 por las células de mieloma, puede alterar el equilibrio normal entre los osteoblastos y los osteoclastos, mediante el bloqueo de la diferenciación de los osteoblastos, y por lo tanto, se promueve la resorción ósea. Más aún, se ha reportado que algunos de los tratamientos anti-tumorales utilizados para mieloma, tales como dexametasona, aumentan DKK1 [Ohnaka 2004] . Por consiguiente, un anticuerpo neutralizante anti-DKK1 debe permitir la reactivación de la senda de Wnt en las lesiones osteolíticas, mientras que no afectaría la señalización de Wnt en otros tejidos en donde los niveles de DKK1 sean relativamente bajos, o en donde predominen otros antagonistas. En los adultos, se ha reportado que DKK1 se expresa altamente sólo en el hueso [Li 2006], sugiriendo un papel continuo para DKK1 en la regulación del metabolismo óseo en los adultos. Los ratones transgénicos que sobre-expresan Wnt1 en el tejido de mama desarrollan carcinomas mamarios[Tsukamoto 1 988], y aproximadamente el 90 por ciento de los cánceres colo-rectales humanos tienen mutaciones en cualquiera de APC ó ß-catenina, dos componentes citoplásmicos de la senda de Wnt [Morin 1997] [Rowan 2000]. Este tipo de evidencia presenta preocupaciones de que la activación de la senda de Wnt podría ser un riesgo para un incremento en el inicio o en el progreso de tumores. En adición, los DKKs disminuyen en los tumores colo-rectales y en los melanomas, sugiriendo un papel supresor de tumor potencial. Un polipéptido de DKK de la invención incluye DKK1 (SEQ ID NO:1) y DKK4 (SEQ ID NO:124), así como DKK2 (SEQ ID NO:122), y DKK3 (SEQ ID NO:123). Los miembros de la familia DKK tienen dos dominios CYS (CYS1 y CYS2), como se muestra en la Tabla A -miembro PileUp de la familia DKK1. Las proteínas DKK contienen un péptido de señal N-terminal ácido, dos dominios CYS que contienen racimos de residuos de cisteína separados por una región enlazadora divergente, y un sitio de N-glicosilación C-terminal potencial. El dominio CYS2 en DKK4 tiene una función de enlace de lípido que puede facilitar las interacciones de Wnt/DKK en la membrana de plasma. OMIM, Número de Acceso 605417. Tabla A: Miembro PileUp de la Familia DKK1 hDKKl hDKK2 hDKK3 MQRLGAT LC L LAAAVPTA PAPAPTATSA PV PGPA SY PQEEATLNEM hDKK —; 51 100 hDKKl M MALGAAGATR VFVAMVAAAL GGHPL GVSA TLNSVLNSNA hDKK2 M AALMRSKDSS CCLLLLAAVL ....MVESSQ IGSSRAK NS hDKK3 FREVEE MED TQHK RSAVE EMEAEEAAAK ASSEVN ANL PPSYHNETNT hDKK 101 150 hDKKl IKN PPP GG AAGHPGSAVS AAPGILYPG. ..GNKYQTID NYQPY|PCAED] hDKK2 IKS...SLGG ET ..PGQAAN RSAG.MYQGL AFGGSKKGKN LGQAY|PCSS51 hDKK3 DTKVGNNTIH VHREIHKITN NQTGQMVFSE TVITSVGDEE GRRSH C??Dl hDKK4 MVAA VLLGLSWLCS PLGALVLDFN NIRSSADLHG ARKGS^CLSD] 151 CYS1 200 hDKKl lEECGTDEYCA SPTRGGDAGV QICLACRKRR KRCMRHAMCC PGNYCKNGiq hDKK2 IKECEVGRYCH SPHQGSSA.. .. CMVCRRKK KRCHRDGMCC PSTRCNMGIC| hDKK3 lEDCGPSMYCQ FASFQ YTCQPCRGQR MLCTRDSECC GDQLCVWGHC| CY§1 hDKK4 frDCNTRKFCL QPRD .... EK PFCATCRGLR RRCQRDAMCC PGTLCVNDVCJ 201 250 hDKKl @SSDQN..HF RGEI...EET ITESFGNDH. STLD.GYSRR TTLSSKMYHT hDKK2 [?P]VTES .. IL TPHIPALDGT RHRDRNHGHY SNHDLG QNL GRPHTKMSHI hDKK3 ffKVlA T hD??4 |TT|MEDATPIL ERQLDEQDGT .HAEGTTGH. .PVQENQPKR KPSIKKSQGR 251 CYS2 300 hDKKl KGQEGSVJCLR SSDCASGLCC A..RHF SKI CKPVLKEGQV CTKHRRK...| hDKK2 KGHEGDP|CLR SSDCIEGFCC A..RHFWTKI CKPVLHQGEV CTKQRKK...| hDKK3 RGSNGTI|CDN QRDCQPGLCC AFQRGLLFPV CTPLPVEGEL CHDPASRLLD| hDKK4 KGQEGES|CLR TFDCGPGLCC A..RHF TKI CKPVLLEGQV CSRRGHK...| CYS2 301 350 hDKKl |...G.SHGLE IFQRCYCGEG LSCRIQKDHH QASNSSRLHT J|QRH hDKK2 |...G.SHGLE IFQRCDCAKG LSCKV KD.A TYSSKARLHV ^C|QKI hDKK3 ILIT ELEPDG ALDRCPCASG LLC QPHSHSLVYV ^KPTFVGSRD hDKK4 |...DTAQAPE IFQRCDCGPG LLCRSQLTSN R .. QHARLRV ÜQKIEKL 351 400 hDKKl hDKK2 hDKK3 QDGEILLPRE VPDEYEVGSF MEEVRQELED LERSLTEEMA LGEPAAAAAA 401 hDKK2 (SEQ ID NO: 122) hDKK3 LLGGEEI (SEQ ID NO:123) hDKK4 (SEQ ID NO:124) Anticuerpos contra D KK1 y DKK4 En una modalidad preferida, el anticuerpo de la invención es específico para una proteína DKK humana. Un anticuerpo neutralizante de DKK1 o de DKK4 es distinto de las modificaciones de la senda de Wnt que se han ligado a la promoción de tumores. La senda de Wnt es regulada por una red compleja de ligandos extracelulares, receptores, y antagonistas, de los cuales DKK1 solamente es uno. Debido a la expresión restringida de DKK1 en los adultos, y a su redundancia funcional con otros antagonistas de Wnt, es poco probable que un anticuerpo de DKK1 neutralizante provoque una activación ampliamente extendida de señalización de Wnt, o por consiguiente, tumorigénesis. Esto es apoyado adicionalmente por dos observaciones: primera, la activación de mutaciones de LRP5 (que inhiben el enlace de DKK) inducen un fenotipo de alta masa ósea, pero no tienen un riesgo de cáncer incrementado aparente [Moon 2004] , mientras que los ratones heterocigóticos nulos de DKK1 o Doubleridge han disminuido los niveles de DKK1 , el fenotipo de alta masa ósea, pero no se reporta ningún índice aumentado de formación de tumor [MacDonald 2004] . Un anticuerpo anti-DKK1 debe impactar positivamente la enfermedad osteol ítica inducida por mieloma, mientras que no aumenta el riesgo de la tumorigénesis de novo. Se espera que este anticuerpo se utilizaría en combinación con quimioterapias antitumorales, y posiblemente con fármacos anti-resorción ósea que inhiban la función de los osteoclastos. Anticuerpos policlonales Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos policlonales, en especial anticuerpos policlonales humanos. Los policlonales se derivan a partir del suero reservado de los animales inmunizados o de los seres humanos seleccionados. Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos de la invención de preferencia son los anticuerpos monoclonales humanos, tales como los aislados y estructuralmente caracterizados, por ejemplo, en los Ejemplos 1 a 8. Se muestran las secuencias de aminoácidos de VH específicas de los anticuerpos, por ejemplo, en las SEQ ID NOs:2-20. Se muestran las secuencias de aminoácidos de VL específicas de los anticuerpos, por ejemplo, en las SEQ ID NOs:21 -39. Una secuencia de aminoácidos de VH del anticuerpo se puede optimizar para la expresión en una célula de mamífero, por ejemplo, tal como la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1 1 9. Una secuencia de aminoácidos de VL de los anticuerpos se puede optimizar para la expresión en una célula de mam ífero, por ejemplo, tal como la secuencia mostrada en la SEQ I D NO: 1 18. De la misma manera, las secuencias se pueden optimizar para la expresión en, por ejemplo, levadura, bacterias, células de hámster y otras células, dependiendo del sistema de expresión preferido para la característica que se esté optimizando . Otros anticuerpos de la invención incluyen los aminoácidos que se han mutado, y que no obstante tienen cuando menos una identidad del 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, ó 99 por ciento en las regiones CD R, con las regiones CDR ilustradas en las secuencias descritas anteriormente. Además, se muestran las secuencias de nucleótidos progenitoras de cadena ligera de longitud completa en las SEQ ID NOs:97-100. Se muestran las secuencias de nucleótidos progenitoras de cadena pesada de longitud completa en las SEQ ID NOs: 101 - 103. Se muestran las secuencias de nucleótidos de cadena ligera de longitud completa optimizadas para la expresión en una célula de mamífero en las SEQ I D NOs: 104-107. Se muestran las secuencias de nucleótidos de cadena pesada de longitud completa para la expresión en una célula de mamífero en las SEQ I D NOs: 108- 1 1 0. Se muestran las secuencias de aminoácidos de cadena ligera de longitud completa codificadas por las secuencias de nucleótidos de cadena ligera optimizadas en las SEQ ID NOs: 1 1 1 -1 1 4. Se muestran las secuencias de aminoácidos de cadena pesada de longitud completa codificadas por las secuencias de nucleótidos de cadena pesada optimizadas en las SEQ I D NOs: 1 1 5-1 1 7. Otros anticuerpos de la invención incluyen aminoácidos o ácidos nucleicos que se han mutado, y que no obstante, tiene una identidad de cuando menos el 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, ó 99 por ciento con las secuencias descritas anteriormente. Debido a que cada uno de estos anticuerpos puede enlazarse con DKK1 , las secuencias VH, VL, de cadena ligera de longitud completa, y de cadena pesada de longitud completa (secuencias de nucleótidos y secuencias de aminoácidos) se pueden "mezclar y emparejar" para crear otras moléculas anti-enlace de DKK1 de la invención. El enlace de DKK1 de estos anticuerpos "mezclados y emparejados" se puede probar utilizando los ensayos de enlace descritos anteriormente, y en los Ejemplos (por ejemplo, ELISAs) . Cuando estas cadenas se mezclan y se emparejan, una secuencia de VH a partir de un par de VH/V particular debe ser reemplazada con una secuencia de VH estructuralmente similar. De la misma manera, una secuencia de cadena pesada de longitud completa a partir de un par particular de cadena pesada de longitud completa/cadena ligera de longitud completa, debe ser reemplazada con una secuencia de cadena pesada de longitud completa estructuralmente similar. De la misma manera, una secuencia de V a partir de un par de VH/VL particular debe ser reemplazada con una secuencia de VL estructuralmente similar. De la misma manera, una secuencia de cadena ligera de longitud completa a partir de un par particular de cadena pesada de longitud completa/cadena ligera de longitud completa debe ser reemplazada con una secuencia de cadena ligera de longitud completa estructuralmente similar. Las secuencias de VH, V , de cadena ligera de longitud completa, y de cadena pesada de longitud completa de los anticuerpos de la presente invención son particularmente susceptibles para la mezcla y el emparejamiento, debido a que estos anticuerpos utilizan las secuencias de VH, VL, de cadena ligera de longitud completa, y de cadena pesada de longitud completa derivadas a partir de las mismas secuencias de la línea germinal, y por lo tanto, exhiben similitud estructural. De conformidad con lo anterior, en un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o una porción de enlace de antígeno del mismo, que tiene: una región VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:2-20 y 1 1 9; y una región V que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:21 -39 y 1 1 8; en donde el anticuerpo se enlaza específicamente con DKK1 . Los ejemplos de las combinaciones de cadena pesada y ligera incluyen: una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, y una región V que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:21; o una región VH que comprende la SEQ ID NO:3, y una región VL que comprende la SEQ ID NO:22; o una región VH que comprende la SEQ ID NO:4 y una región VL que comprende la SEQ ID NO:23; o una región VH que comprende la SEQ ID NO:5 y una región V que comprende la SEQ ID NO:24; o una región VH que comprende la SEQ ID NO:6 y una región VL que comprende la SEQ ID NO:25, o una región VH que comprende la SEQ ID NO:7 y una región VL que comprende la SEQ ID NO:28; o una región VH que comprende la SEQ ID NO:8 y una región V que comprende la SEQ ID NO:29; o una región VH que comprende la SEQ ID NO:9 y una región V que comprende la SEQ ID NO:30; o una región VH que comprende la SEQ ID NO:10 y una región V que comprende la SEQ ID NO:31; o una región VH que comprende la SEQ ID NO:11 y una región V que comprende la SEQ ID NO:32; o una región VH que comprende la SEQ ID NO:12 y una región Vu que comprende la SEQ ID NO:33; o una región VH que comprende la SEQ ID NO:119 y una región VL que comprende la SEQ ID NO:118. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o una porción de enlace de antígeno del mismo que tiene: una cadena pesada de longitud completa que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:115-117; y una cadena ligera de longitud completa que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:111- 114. Por consiguiente, los ejemplos de las combinaciones de cadena pesada de longitud completa y de cadena ligera de longitud completa, respectivamente, incluyen: SEQ ID NO:115 con SEQ ID NO:111; o SEQ ID NO:116 con SEQ ID NO:112; o SEQ ID NO:117 con SEQ ID NO:113; o SEQ ID NO:117 con SEQ ID NO:114. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, que comprende una cadena pesada de longitud completa codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:101-103; y una cadena ligera de longitud completa codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:97-100. Por consiguiente, los ejemplos de los nucleótidos que codifican las cadenas pesada y ligera de longitud completa, respectivamente, que se pueden combinar, incluyen: SEQ ID NO:101 y 97; o SEQ ID NO:102 y 98; o SEQ ID NO:103 y 99; o SEQ ID NO:104 y 100. En todavía otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, que se ha optimizado para la expresión en la célula que tiene: una cadena pesada de longitud completa que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:108-110; y una cadena ligera de longitud completa que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:104-107. En todavía otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos que comprenden las CDR1s, CDR2s, y CDR3s de cadena pesada y de cadena ligera de los anticuerpos, o combinaciones de las mismas. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1s de VH de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs:2-5, 8-11, 20, y 49-56. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2s de VH de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs:2-20 y 57-64. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3s de VH de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs:2-20 y 65-72. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1s de Vu de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs:21-39 y 73-80. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2s de V de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs:21-39 y 81-88. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3s de V de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs:21-39 y 89-96. Las regiones CDR están delineadas utilizando el sistema de Kabat (Kabat, E. A. y colaboradores, 1991 Sequences of Proteins of Imunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, NIH Publicación Número 91-3242). Ciado que cada uno de estos anticuerpos puede enlazarse con DKK1, y que la especificidad de enlace de antígeno es proporcionada primordialmente por las regiones CDRÍ, 2, y 3, las secuencias CDR1, 2, y 3 de VH y las secuencias de CDR1, 2, y 3 de VL se pueden "mezclar y emparejar" (es decir, las CDRs de diferentes anticuerpos se pueden mezclar y emparejar, aunque cada anticuerpo debe contener una CDR1 , 2, y 3 de VH y una CDR 1 , 2 , y 3 de VL para crear otras moléculas de enlace anti-DKK1 de la invención . El enlace de DKK1 con estos anticuerpos "mezclados y emparejados" se puede probar utilizando los ensayos de enlace descritos anteriormente y en los ejemplos (por ejemplo, ELISAs) . Cuando las secuencias de CDR de VH se mezclan y se emparejan , la secuencia de CDR1 , CDR2, y/o CDR3 a partir de una secuencia de VH particular debe ser reemplazada con una secuencia de CDR estructuralmente similar. De la misma manera, cuando las secuencias de CDR de V se mezclan y se emparejan , la secuencia de CDR 1 , CDR2, y/o CDR3 a partir de una secuencia de V particular debe ser reemplazada con una secuencia de CDR estructuralmente similar. Adicionalmente, la secuencia de CDR1 , CDR2 , y/o CDR3 a partir de una secuencia de VH O VL particular se puede mutar de una manera específica o aleatoria para crear anticuerpos, que se pueden probar para determinar sus características de afinidad o de enlace. Será fácilmente evidente para el experto ordinario que las novedosas secuencias de VH y V se pueden crear sustituyendo una o más secuencias de la región CDR de VH y/o V con secuencias estructuralmente similares a partir de las secuencias de CDR mostradas en la presente, para tener los anticuerpos monoclonales de la presente invención. Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, tiene: una región CD R1 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:2-5, 8-11, 20 y 49-56; una región CDR2 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:2-20 y 57-64; una región CDR3 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:2-20 y 65-72; una región CDR1 de V que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:21-39 y 73-80; una región CDR2 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:21-39 y 81-88; y una región CDR3 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:21-39 y 89-96; en donde el anticuerpo se enlaza específicamente con DKK1. En cierta modalidad, el anticuerpo consiste en: una región CDR1 de VH que comprende la SEQ ID NO:2; una región CDR2 de VH que comprende la SEQ ID NO:6; una región CDR3 de VH que comprende la SEQ ID NO:7; una región CDR1 de V que comprende la SEQ ID NO:21; una región CDR2 de VL que comprende la SEQ ID NO:22; y una región CDR3 de VL que comprende la SEQ ID NO:23. En otra modalidad, el anticuerpo consiste en: una región CDR1 de VH que comprende la SEQ ID NO:3; una región CDR2 de VH que comprende la SEQ ID NO:12; una región CDR3 de VH que comprende la SEQ ID NO:13; una región CDR1 de VL que comprende la SEQ ID NO:24; una región CDR2 de VL que comprende la SEQ ID NO:25; y una región CDR3 de VL que comprende la SEQ ID NO:26. En todavía otra modalidad, el anticuerpo consiste en: una región CDR1 de VH que comprende la SEQ ID NO:4; una región CDR2 de VH que comprende la SEQ ID NO:14; una región CDR3 de VH que comprende la SEQ ID NO:15; una región CDR1 de VL que comprende la SEQ ID NO:27; una región CDR2 de V que comprende la SEQ ID NO:28; y una región CDR3 de VL que comprende la SEQ ID NO:29. En otra modalidad, el anticuerpo consiste en: una región CDR1 de VH que comprende la SEQ ID NO:5; una región CDR2 de VH que comprende la SEQ ID NO:16; una región CDR3 de VH que comprende la SEQ ID NO:17; una región CDR1 de V que comprende la SEQ ID NO:30; una región CDR2 de V que comprende la SEQ ID NO:31; y una región CDR3 de VL que comprende la SEQ ID NO:32. En cierta modalidad, el anticuerpo consiste en: una región CDR1 de VH que comprende la SEQ ID NO:8; una región CDR2 de VH que comprende la SEQ ID NO:18; una región CDR3 de VH que comprende la SEQ ID NO:19; una región CDR1 de V que comprende la SEQ ID NO:33; una región CDR2 de VL que comprende la SEQ ID NO:34; y una región CDR3 de VL que comprende la SEQ ID NO:35. En otra modalidad, el anticuerpo consiste en: una región CDR1 de VH que comprende la SEQ ID NO:9; una región CDR2 de VH que comprende la SEQ ID NO:10; una región CDR3 de VH que comprende la SEQ ID NO:11; una región CDR1 de VL que comprende la SEQ ID NO:36; una región CDR2 de VL que comprende la SEQ ID NO:37; y una región CDR3 de VL que comprende la SEQ ID NO:38. Como se utiliza en la presente, un anticuerpo humano comprende las regiones pesadas o VL, o las cadenas pesada y ligera de longitud completa que son "el producto de" o "derivadas de" una secuencia de la línea germinal particular, si las regiones variables o las cadenas de longitud completa del anticuerpo se obtienen a partir de un sistema que utilice los genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Estos sistemas incluyen la inmunización de un ratón transgénico que lleve los genes de inmunoglobulina humana con el antígeno de interés, o el rastreo de una biblioteca de genes de inmunoglobulina humana exhibidos sobre el fago con un antígeno de interés. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "derivado de" una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana, se puede identificar como tal, comparando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano con las secuencias de aminoácidos de las inmunoglobulinas de la línea germinal humana, y seleccionando la secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana que sea más cercana en la secuencia (es decir, que tenga el mayor porcentaje de identidad) con la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "derivado de" una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana particular, puede contener diferencias de aminoácidos, comparándose con la secuencia de la línea germinal, debido, por ejemplo, a las mutaciones somáticas que se presentan naturalmente, o a la introducción intencional de mutación dirigida al sitio. Sin embargo, un anticuerpo humano seleccionado típicamente es cuando menos el 90 por ciento idéntico en la secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de ¡nmunoglobulina de la línea germinal humana, y contiene residuos de aminoácidos que identifican el anticuerpo humano como humano, cuando se compara con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina de la línea germinal de otras especies (por ejemplo, secuencias de la línea germinal de murino). En ciertos casos, un anticuerpo humano puede ser cuando menos el 60 por ciento, el 70 por ciento, el 80 por ciento, el 90 por ciento, o cuando menos el 95 por ciento, o aún cuando menos el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, o el 99 por ciento idéntico en la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal. Típicamente, un anticuerpo humano derivado a partir de una secuencia de la línea germinal humana particular no exhibirá más de 10 diferencias de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En ciertos casos, el anticuerpo humano puede exhibir no más de cinco, o inclusive no más de 4, 3,2, ó 1 diferencias de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal. Anticuerpos homólogos En todavía otra modalidad, un anticuerpo de la invención tiene las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera de longitud completa; las secuencias de nucleótidos de cadena pesada y ligera de longitud completa, las secuencias de nucleótidos de cadena pesada y ligera de regiones variables, o las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera de regiones variables, que son homologas a las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de los anticuerpos descritos en la presente, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de la composición anti-DKK1 /4 neutralizante de la invención. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, que comprende una región VH y una región V , en donde: la región VH comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 80 por ciento homologa a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:2-20 y 1 19; la región V comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 80 por ciento homologa a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:21 -39 y 1 1 8; el anticuerpo se enlaza específicamente con DKK1 y/o DKK4, y el anticuerpo exhibe cuando menos una de las siguientes propiedades funcionales: el anticuerpo neutraliza el enlace de una proteína DKK1 con LPR6, Fz, y/o Krm, o el anticuerpo neutraliza el enlace de una proteína DKK4 con LRP, Pz, y/o Krm. En un ejemplo adicional, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, que comprende una cadena pesada de longitud completa y una cadena ligera de longitud completa, en donde: la cadena pesada de longitud completa comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 80 por ciento homologa a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs: 1 1 5-1 17; la cadena ligera de longitud completa comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 80 por ciento homologa a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs: 1 1 1 -1 14; el anticuerpo se enlaza específicamente con DKK1 , y el anticuerpo exhibe cuando menos una de las siguientes propiedades funcionales: el anticuerpo inhibe el enlace de la proteína DKK1 con el receptor de DKK1 , o el anticuerpo inhibe el enlace del receptor de DKK1 , previniendo o mejorando la osteólísis, o el anticuerpo inhibe el enlace del receptor de DKK1 previniendo o mejorando las lesiones osteolíticas, o el anticuerpo inhibe el enlace del receptor de DKK1 previniendo o mejorando el cáncer. En otro ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, el cual comprende una cadena pesada de longitud completa y una cadena ligera de longitud completa, en donde: la cadena pesada de longitud completa comprende una secuencia de nucleótidos que es cuando menos el 80 por ciento homologa a una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 101 -103; la cadena ligera de longitud completa comprende una secuencia de nucleótidos que es cuando menos el 80 por ciento homologa a una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:97-100; el anticuerpo se enlaza específicamente con DKK1 , y el anticuerpo exhibe cuando menos una de las siguientes propiedades funcionales: el anticuerpo inhibe el enlace de la proteína DKK1 con el receptor de DKK1 , o el anticuerpo inhibe el enlace del receptor de DKK1 previniendo o mejorando la osteólísis, o el anticuerpo inhibe el enlace del receptor de DKK1 previniendo o mejorando las lesiones osteolíticas, o el anticuerpo inhibe el enlace del receptor de DKK1 previniendo o mejorando el cáncer. En otro ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, que se ha optimizado para la expresión en una célula, el cual comprende una cadena pesada de longitud completa y una cadena ligera de longitud completa, en donde: la cadena pesada de longitud completa comprende una secuencia de nucleótidos que es cuando menos el 80 por ciento homologa a una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 108-1 10; la cadena ligera de longitud completa comprende una secuencia de nucleótidos que es cuando menos el 80 por ciento homologa a una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 104-1 07; el anticuerpo se enlaza específicamente con DKK1 , y el anticuerpo exhibe cuando menos una de las siguientes propiedades funcionales: el anticuerpo inhibe el enlace de la proteína DKK1 con el receptor de DKK1 , o el anticuerpo inhibe el enlace del receptor de DKK1 previniendo o mejorando la osteólisis, o el anticuerpo inhibe el enlace del receptor de DKK1 previniendo o mejorando las lesiones osteolíticas, o el anticuerpo inhibe el enlace del receptor de DKK1 previniendo o mejorando el cáncer. En otro ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, que se ha optimizado para la expresión en una célula, el cual comprende una región VH y una región VL, en donde: la cadena pesada de longitud completa comprende una secuencia de nucleótidos que es cuando menos el 80 por ciento homologa a una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en la SEQ ID NO:121; la cadena ligera de longitud completa comprende una secuencia de nucleótidos que es cuando menos el 80 por ciento homologa a una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en la SEQ ID NO:120; el anticuerpo se enlaza específicamente con DKK1, y el anticuerpo exhibe cuando menos una de las siguientes propiedades funcionales: el anticuerpo inhibe el enlace de la proteína DKK1 con el receptor de DKK1, o el anticuerpo inhibe el enlace del receptor de DKK1 previniendo o mejorando la osteólisis, o el anticuerpo inhibe el enlace del receptor de DKK1 previniendo o mejorando las lesiones osteolíticas, o el anticuerpo inhibe el enlace del receptor de DKK1 previniendo o mejorando el cáncer. En diferentes modalidades, el anticuerpo puede exhibir una o más, dos o más, o tres de las propiedades funcionales discutidas anteriormente. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo quimérico. Como se utiliza en la presente, el porcentaje de homología entre dos secuencias de aminoácidos o dos secuencias de nucleótidos, es equivalente al porcentaje de identidad entre las dos secuencias. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de homología = número de posiciones idénticas/número total de posiciones x 100) , tomando en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que se necesitan introducir para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias, se pueden llevar a cabo utilizando un algoritmo matemático, como se describe en los Ejemplos no limitantes que se encuentran más adelante. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Meyers y W. Miller (Comput. Appl . Biosci. , 4: 1 1 -1 7, 1 988) , el cual se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuo de peso PAM 120, una multa por longitud de hueco de 1 2, y una multa de hueco de 4. En adición, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J . Mol. Biol. 48:444-453, 1 970) , el cual se ha incorporado en el programa GAP, en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando ya sea una matriz Blosson 62, o bien una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ó 4, y una peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, ó 6. De una manera adicional o alternativa, las secuencias de proteína de la presente invención se pueden utilizar adicionalmente como una "secuencia pedida", para llevar a cabo una búsqueda contra las bases de datos públicas, por ejemplo, para identificar secuencias relacionadas. Estas búsquedas se pueden llevar a cabo utilizando el programa XBLAST (versión 2.0) de Altschul y colaboradores, 1990 J. Mol. Biol. 215-403-10. Las búsquedas de proteína BLAST se pueden llevar a cabo con el programa XBLAST, puntaje = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a las moléculas de anticuerpos de la invención. Para obtener alineaciones con huecos para propósitos de comparación, se puede utilizar el Gapped BLAST, como se describe en Altschul y colaboradores, 1997 Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Cuando se utiliza los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar los parámetros por omisión de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase http:www.ncbi.nhn.nih.gov. Anticuerpos con modificaciones conservadoras En ciertas modalidades, un anticuerpo de la invención tiene una región VH que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3, y una región V que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3, en donde una o más de estas secuencias de CDR tienen secuencias de aminoácidos especificadas basadas en los anticuerpos descritos en la presente , o modificaciones conservadoras de las mismas , y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de la composición DKK1 /4 neutralizante de la invención. De conformidad con lo anterior, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, que consiste en una región VH que consiste en las secuencias de CDR 1 , CDR2, y CDR3, y una región VL que consiste en las secuencias de CDR 1 , CDR2, y CDR3, en donde: las regiones VH de la CDR 1 son las secuencias que consisten en las secuencias de aminoácidos seleccionadas a partir del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de las SEQ I D NOs:2-5, 8- 1 1 , 20, 49-56, y las modificaciones conservadoras de las mismas; la región VH de las secuencias de CDR2 que consisten en las secuencias de aminoácidos seleccionadas a partir del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs:2-20, 57-64, y las modificaciones conservadoras de las mismas; la región VH de la CDR3 son las secuencias que consisten en las secuencias de aminoácidos seleccionadas a partir del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de las SEQ I D NOs:2-20, 65-72, y las modificaciones conservadoras de las mismas; las regiones V de la CDR1 son las secuencias que consisten en las secuencias de aminoácidos seleccionadas a partir del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs:21 - 39, 73-80, y las modificaciones conservadoras de las mismas; las regiones V de la CDR2 son las secuencias que consisten en las secuencias de aminoácidos seleccionadas a partir del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de las SEQ I D NOs:21 -39, 81 -88, y las modificaciones conservadoras de las mismas; las regiones V de la CDR3 son las secuencias que consiste en las secuencias de aminoácidos seleccionadas a partir del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 21 -39, 89-96, y las modificaciones conservadoras de las mismas; el anticuerpo se enlaza específicamente con DKK1 ; y el anticuerpo exhibe cuando menos una de las siguientes propiedades funcionales: el anticuerpo inhibe el enlace de la proteína DKK1 con el receptor de DKK1 , o el anticuerpo inhibe el enlace del receptor de DKK1 previniendo o mejorando la osteólisis, o el anticuerpo inhibe el enlace del receptor de DKK1 previniendo o mejorando las lesiones osteolíticas, o el anticuerpo inhibe el enlace del receptor de DKK1 previniendo o mejorando el cáncer. En diferentes modalidades, el anticuerpo puede exhibir una o más, dos o más, o tres o más de las propiedades funcionales enlistas discutidas anteriormente. Estos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, o anticuerpos quiméricos. En otras modalidades, un anticuerpo de la invención tiene una secuencia de cadena pesada de longitud completa y una secuencia de cadena ligera de longitud completa, en donde una o más de estas secuencias tienen las secuencias de aminoácidos especificadas, basadas en los anticuerpos descritos en la presente, o las modificaciones conservadoras de las mismas, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de la composición anti-DKK1 /4 neutralizante de la invención. De conformidad con lo anterior, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, que consiste en una cadena pesada de longitud completa y una cadena ligera de longitud completa, en donde: la cadena pesada de longitud completa tiene las secuencias de aminoácidos seleccionadas a partir del grupo de las SEQ I D NOs: 1 1 5-1 1 7, y las modificaciones conservadoras de las mismas; y la cadena ligera de longitud completa tiene las secuencias de aminoácidos seleccionadas a partir del grupo de las SEQ I D NOs: 1 1 1 -1 1 4, y las modificaciones conservadoras de las mismas; el anticuerpo se enlaza específicamente con DKK1 ; y el anticuerpo exhibe cuando menos una de las siguientes propiedades funcionales: el anticuerpo inhibe el enlace de la proteína DKK1 con el receptor de DKK1 , o el anticuerpo inhibe el enlace del receptor de DKK1 previniendo o mejorando la osteólisis, o el anticuerpo inhibe el enlace del receptor de DKK1 previniendo o mejorando las lesiones osteolíticas, o el anticuerpo inhibe el enlace del receptor de DKK1 previniendo o mejorando el cáncer. En diferentes modalidades, el anticuerpo puede exhibir una o más, dos o más, o tres o más de las propiedades funcionales enlistadas discutidas anteriormente. Estos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, o anticuerpos quiméricos. En otras modalidades, un anticuerpo de la invención optimizado para la expresión en una célula tiene una secuencia de la región VH y una secuencia de la región VL, en donde una o más de estas secuencias tienen las secuencias de aminoácidos especificadas, basadas en los anticuerpos descritos en la presente, o modificaciones conservadoras de las mismas, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de la composición anti-DKK1 /4 neutralizante de la invención. De conformidad con lo anterior, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, el cual consiste en una región VH y una región V , en donde: la región VH tiene las secuencias de aminoácidos seleccionadas a partir del grupo de la SEQ I D NO: 1 1 9, y las modificaciones conservadoras de la misma; y la región VL tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de la SEQ ID NO: 1 1 8, y las modificaciones conservadoras de la misma; el anticuerpo se enlaza específicamente con DKK1 , y el anticuerpo exhibe cuando menos una de las siguientes propiedades funcionales: el anticuerpo inhibe el enlace de la proteína DKK1 con el receptor de DKK1 , o el anticuerpo inhibe el enlace del receptor de DKK1 previniendo o mejorando la osteólisis, o el anticuerpo inhibe el enlace del receptor de DKK1 previniendo o mejorando las lesiones osteolíticas, o el anticuerpo inhibe el enlace del receptor de DKK1 previniendo o mejorando el cáncer. En diferentes modalidades, el anticuerpo puede exhibir una o más, dos o más, o tres o más de las propiedades funcionales enlistadas discutidas anteriormente. Estos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, o anticuerpos quiméricos. Como se utiliza en la presente, el término "modificaciones de secuencia conservadoras" pretende referirse a las modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran de una manera significativa las características de enlace del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Estas modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones, y supresiones de aminoácidos. Las modificaciones se pueden introducir en un anticuerpo de la invención mediante técnicas convencionales conocidas en este campo, tales como mutagénesis dirigida al sitio, y mutagénesis mediada por reacción en cadena de la polimerasa. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras son aquéllas en donde el residuo de aminoácido es reemplazado con un residuo de aminoácido que tenga una cadena lateral similar. En la técnica se han definido las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales acidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoieucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoieucina) , y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) . Por consiguiente, uno o más residuos de aminoácidos dentro de las regiones CDR de un anticuerpo de la invención pueden ser reemplazados con otros residuos de aminoácidos de la misma familia de cadena lateral , y el anticuerpo alterado se puede probar para tener una función retenida utilizando los ensayos funcionales descritos en la presente. Anticuerpos que se enlazan con el mismo epítopo que la composición anti-DKK1 /4 neutralizante de la invención En otra modalidad , la invención proporciona anticuerpos que se enlazan con el mismo epítopo que las diferentes composiciones anti-DKK1 /4 neutralizantes de la invención proporcionadas en la presente. Estos anticuerpos adicionales se pueden identificar basándose en su capacidad para competir cruzadamente (por ejemplo, para inhibir competitivamente el enlace de, de una manera estadísticamente significativa) con otros anticuerpos de la invención, en ensayos de enlace de DKK1 convencionales. La capacidad de un anticuerpo de prueba para inhibir el enlace de los anticuerpos de la presente invención con DKK1 humano, demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con ese anticuerpo por el enlace con DKK1 humano; este anticuerpo, de acuerdo con las hipótesis no limitantes, se puede enlazar con el mismo epítopo o uno relacionado (por ejemplo, un epítopo estructuralmente similar o espacialmente proximal) sobre el DKK1 humano que el anticuerpo con el que compite. En cierta modalidad, el anticuerpo que se enlaza con el mismo epítopo sobre el DKK1 humano que los anticuerpos de la presente invención, es un anticuerpo monoclonal humano. Estos anticuerpos monoclonales humanos se pueden preparar y aislar como se describe en los Ejemplos. Anticuerpos de camélido y otros anticuerpos de cadena pesada Se han caracterizado proteínas de anticuerpos obtenidas a partir de miembros de la familia de los camellos y dromedarios ( Camelus bactrianus y Calelus dromaderius) , incluyendo los miembros del N uevo Mundo, tales como las especies de llama (Lama páceos, Lama glama, y Lama vicugna) , con respecto al tamaño, la complejidad estructural , y la antigenicidad para sujetos humanos. Ciertos anticuerpos IgG de esta familia de mam íferos, como se encuentran en la naturaleza, carecen de cadenas ligeras, y por lo tanto, son estructuralmente distintos de la estructura cuaternaria de cuatro cadenas típica que tiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, para los anticuerpos de otros animales. Véase la Publicación del TCP N úmero PCT/EP93/0221 4 (Publicación Internacional Número WO 94/04678 publicada el 3 de marzo de 1 994) . Se puede obtener una región del anticuerpo camélido que sea el dominio variable individual pequeño identificado como VHH. mediante ingeniería genética, para producir una proteína pequeña que tenga una alta afinidad para un objetivo, dando como resultado una proteína derivada de anticuerpo de bajo peso molecular conocida como un "nanocuerpo camélido". Véase la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,759,808, expedida el 2 de junio de 1 998; véase también Stijlemans, B. y colaboradores, 2004 J. Biol. Chem. 279: 1256-1261 ; Dumoulin, M. y colaboradores, 2003 Nature 424:783-788; Pleschberger, M . y colaboradores, 2003 Bioconjugate Chem. 1 4:440-448; Cortez-Retamozo, V. y colaboradores, 2002 Int. J. Cáncer 89:456-62; y Lauwereys, M. y colaboradores, 1 998 EMBO J. 1 7:351 2-3520. Las bibliotecas diseñadas de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de camélidos están comercialmente disponibles en, por ejemplo, Ablynx, Ghent, Bélgica. Como con otros anticuerpos de origen no humano, una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo camélido se puede alterar de una manera recombinante para obtener una secuencia que se parezca más estrechamente a una secuencia humana, es decir, el nanocuerpo se puede "humanizar". Por consiguiente, la baja antigenicidad natural de los anticuerpos camélidos para los seres humanos se puede reducir adicionalmente. El nanocuerpo camélido tiene un peso molecular de aproximadamente una décima parte de aquél de una molécula de IgG humana, y la proteína tiene un diámetro físico de solamente unos cuantos nanómetros. Una consecuencia del pequeño tamaño es la capacidad de los nanocuerpos camélidos para enlazarse con los sitios antigénicos que son funcionalmente invisibles para las proteínas de anticuerpo más grandes, es decir, los nanocuerpos camélidos son útiles como reactivos para detectar los antígenos que son de otra manera crípticos utilizando las técnicas inmunológicas clásicas, y como posibles agentes terapéuticos. Por lo tanto, todavía otra consecuencia del pequeño tamaño, es que un nanocuerpo camélido puede inhibir, como resultado del enlace con un sitio específico en una ranura o hendidura estrecha de una proteína objetivo, y por consiguiente, puede servir en una capacidad que se parezca más estrechamente a la función de un fármaco de bajo peso molecular clásico que aquélla de un anticuerpo clásico. El bajo peso molecular y el tamaño compacto dan como resultado además nanocuerpos camélidos que son extremadamente termoestables, estables a un pH extremo y a la digestión proteolítica, y pobremente antigénicos. Otra consecuencia es que los nanocuerpos camélidos se mueven fácilmente desde el sistema circulatorio hacia los tejidos, e inclusive cruzan la barrera hematoencefálica, y pueden tratar trastornos que afecten al tejido nervioso. Los nanocuerpos pueden facilitar adicionalmente el transporte de fármacos a través de la barrera hematoencefálica. Véase la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica N úmero 200401 61738, publicada el 1 9 de agosto de 2004. Estas características, combinadas con la baja antigenicidad para los seres humanos, indican el gran potencial terapéutico. Además, estas moléculas se pueden expresar completamente en células procarióticas, tales como E. coli, y se expresan como proteínas de fusión con bacteriófagos y son funcionales. De conformidad con lo anterior, una característica de la presente invención es un anticuerpo o nanocuerpo de camélido que tiene una alta afinidad para DKK1. En ciertas modalidades de la presente, el anticuerpo o nanocuerpo camélido se produce naturalmente en el animal camélido, es decir, es producido por el camélido en seguida de la inmunización con DKK1 o con un fragmento peptídico del mismo, empleando las técnicas descritas en la presente para otros anticuerpos. De una manera alternativa, el nanocuerpo de camélido anti-DKK1/4 neutralizante se diseña, es decir, se produce mediante selección, por ejemplo a partir de una biblioteca de fagos que exhiban proteínas de nanocuerpos camélidos apropiadamente mutadas empleando procedimientos de extensión con DKK1 y/o DKK4 como un objetivo, como se describe en los Ejemplos de la presente. Los nanocuerpos diseñados pueden hacerse adicionalmente a la medida mediante ingeniería genética para tener una vida media en un sujeto receptor desde 45 minutos hasta dos semanas. En adición a los anticuerpos de camélido, los anticuerpos de cadena pesada se presentan naturalmente en otros animales, incluyendo, pero no limitándose a, por ejemplo, ciertas especies de tiburón y de pez globo (véase, por ejemplo, la Publicación del TCP Número WO 03/014161). Aunque se pueden utilizar los dominios variables derivados a partir de estos anticuerpos de cadena pesada en la invención, el uso de anticuerpos de cadena pesada derivados de camélido y/o de las secuencias de dominio variable de los mismos, es la optimización preferida, humanización, humaneering ("humanodiseño") , y similares, y/o para uso clínico en seres humanos. Un anticuerpo de la invención se puede preparar adicionalmente utilizando un anticuerpo que tenga una o más de las secuencias de VH y/o V mostradas en la presente como material de partida para diseñar un anticuerpo modificado, cuyo anticuerpo modificado puede tener propiedades alteradas del anticuerpo de partida. Un anticuerpo se puede diseñar mediante la modificación de uno o más residuos dentro de una o ambas regiones variables (es decir, VH y/o VL) , por ejemplo, dentro de una o más regiones CDR, y/o dentro de una o más regiones de estructura. Adicionalmente o de una manera alternativa, un anticuerpo se puede diseñar mediante la modificación de los residuos dentro de las regiones constantes, por ejemplo, para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Un tipo de diseño de región variable que se puede llevar a cabo es el injerto de CDR. Los anticuerpos interactúan con los antígenos objetivos predominantemente a través de los residuos de aminoácidos que se localizan en las seis regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cadena pesada y ligera. Por esta razón , las secuencias de aminoácidos dentro de las CDRs son más diversas entre los anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDRs. Debido a que las secuencias CDR son responsables de la mayoría de las interacciones de anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imiten las propiedades de los anticuerpos específicos que se presentan naturalmente, mediante la construcción de vectores de expresión que incluyan secuencias CDR a partir del anticuerpo específico que se presente naturalmente injertado en las secuencias de estructura de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (véanse, por ejemplo, Riechmann, L. y colaboradores, 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. y colaboradores, 1 986 Nature 321 :522-525; Queen, C. y colaboradores, 1 989 Proc. Nati. Acad. Sci. E. U.A. 86: 1 0029- 10033; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica N úmero 5,225,539 a Winter, y las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica N úmeros 5,530, 101 ; 5,585,089; 5,693,762 y 6, 1 80,370 a Queen y colaboradores) . De conformidad con lo anterior, otra modalidad de la invención pertenece a un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, que comprende una región VH que comprende las secuencias de CDR 1 que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada a parti r del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:2-5, 8-1 1 , 20, 49-56; las secuencias de CDR2 que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:2-20 y 57-64; las secuencias de CDR3 que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:2-20 y 65-72, respectivamente; y una región V que tiene las secuencias de CDR 1 que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:21-39 y 73-80; las secuencias de CDR2 que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:21-39 y 81-88; y las secuencias de CDR3 que consisten en una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:21-39 y 89-96, respectivamente. Por consiguiente, estos anticuerpos contienen las secuencias de CDR VH y V de los anticuerpos monoclonales, y no obstante, pueden contener diferentes secuencias de estructura de estos anticuerpos. Estas secuencias de estructura se pueden obtener a partir de las bases de datos de ADN públicas, o de las referencias publicadas que incluyan secuencias genéticas de anticuerpos de la línea germinal. Por ejemplo, las secuencias de ADN de la línea germinal para los genes de la región de cadena pesada humana y VL se pueden encontrar en la base de datos de secuencias de la línea germinal humana "VBase" (disponible en Internet en www.mrccpe.cam.ac.uk/vbase), así como en Kabat, E. A., y colaboradores, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Publicación de NIH Número 91-3242; Tomlinson, I. M., y colaboradores, 1992 J. Mol. Biol. 227:776-798; y Cox, J. P. L. y colaboradores, 1994 Eur. J. Immunol. 24:827-836; incorporándose el contenido de cada uno de los mismos expresamente a la presente como referencia. Un ejemplo de secuencias de estructura para utilizarse en los anticuerpos de la invención son aquéllas que son estructuralmente similares a las secuencias de estructura utilizadas por los anticuerpos seleccionados de la invención , por ejemplo, las secuencias en consenso y/o las secuencias de estructura utilizadas por los anticuerpos monoclonales de la invención. Las secuencias CDR 1 , 2, y 3 de VH y las secuencias CDR 1 , 2 , y 3 de V se pueden injertar en las regiones de estructura que tengan la secuencia idéntica a la que se encuentra en el gen de inmunoglobulina de la línea germinal a partir del cual se deriva la secuencia de estructura, o las secuencias CDR se pueden injertar en las regiones de estructura que contengan una o más mutaciones, comparándose con las secuencias de la línea germinal. Por ejemplo, se ha encontrado que, en ciertos casos, es benéfico mutar los residuos dentro de las regiones de estructura para mantener o mejorar la capacidad de enlace de antígeno del anticuerpo (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,530, 101 ; 5,585,089; 5,693,762 y 6, 1 80,370 a Queen y colaboradores) . Otro tipo de modificación de la región variable es mutar los residuos de aminoácidos dentro de las regiones CDR 1 , CDR2, y/o CDR3 de VH y/o V , para mejorar de esta manera una o más propiedades de enlace (por ejemplo, afinidad) del anticuerpo de interés, conocida como "maduración por afinidad". Se puede llevar a cabo mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por reacción en cadena de la polimerasa para introducir las mutaciones, y se puede evaluar el efecto sobre el enlace del anticuerpo u otra propiedad funcional de interés en ensayos in vitro o in vivo, como se describe en la presente y como se proporciona en los Ejemplos. Se pueden introducir modificaciones conservadoras (como se discute en lo anterior) . Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones, o supresiones de aminoácidos. Más aún, típicamente se alteran más de 1 , 2, 3, 4, ó 5 residuos dentro de una región CDR . De conformidad con lo anterior, en otra modalidad, la invención proporciona una composición anti-DKK1 /4 neutralizante aislada, o porciones de enlace de antígeno de la misma, la cual consiste en una región VH que tiene: una región de CDR1 VH consistente en una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que tiene las SEQ ID NOs:2-5, 8- 1 1 , 20, 49-56, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro, o cinco sustituciones, supresiones, o adiciones de aminoácidos, comparándose con las SEQ ID NOs:2-5, 8-1 1 , 20, 49-56; una región CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:2-20 y 57-64, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro, o cinco sustituciones, supresiones, o adiciones de aminoácidos, comparándose con las SEQ I D NOs:2-20 y 57-64; una región CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:2-20 y 65-72, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro, o cinco sustituciones, supresiones, o adiciones de aminoácidos, comparándose con las SEQ I D NOs:2-20 y 65-72; una región CDR 1 V que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:21 -39 y 73-80, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro, o cinco sustituciones, supresiones, o adiciones de aminoácidos, comparándose con las SEQ ID NOs:21 -39 y 73-80; una región CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:21 -39 y 81 -88, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro, o cinco sustituciones, supresiones, o adiciones de aminoácidos, comparándose con las SEQ I D NOs:21 -39 y 81 -88; y una región CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:21 -39 y 89-96, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro, o cinco sustituciones, supresiones, o adiciones de aminoácidos, comparándose con las SEQ I D NOs:21 -39 y 89-96. Los anticuerpos diseñados de la invención incluyen aquéllos en donde se han hecho modificaciones a los residuos de estructura dentro de VH y/o VL, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. Típicamente, estas modificaciones de estructura se hacen para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un planteamiento es "retromutar" uno o más residuos de estructura hasta la secuencia de la l ínea germinal correspondiente. De una manera más específica, un anticuerpo que haya sufrido mutación somática puede contener residuos de estructura que difieran de la secuencia de la línea germinal a partir de la cual se deriva el anticuerpo. Estos se pueden identificar mediante la comparación de las secuencias de estructura del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal a partir de las cuales se deriva el anticuerpo. Para regresar a las secuencias de región de estructura hasta su configuración de la línea germinal, las mutaciones somáticas se pueden "retromutar" hasta la secuencia de la línea germinal , por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio o mediante mutagénesis mediada por reacción en cadena de la polimerasa. Estos anticuerpos "retromutados" también están abarcados por la presente invención . Otro tipo de modificación de estructura involucra la mutación de uno o más residuos dentro de la región de estructura, o inclusive dentro de una o más regiones CDR, para remover los epítopos de células T, con el fin de reducir de esta manera la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Este planteamiento también es referido como "desinmunización", y se describe con mayor detalle en la Publicación de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica N úmero 200301 53043, por Carr y colaboradores. En adición o de una manera alternativa a las modificaciones hechas dentro de las regiones de estructura o CDR, los anticuerpos de la invención se pueden diseñar para incluir modificaciones dentro de la región Fe, típicamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como la vida media en suero, la fijación de complemento, el enlace del receptor, y/o la citotoxicidad celular dependiente del antígeno. Adicionalmente, un anticuerpo de la invención se puede modificar químicamente (por ejemplo, una o más fracciones químicas se pueden unir al anticuerpo), o se puede modificar para alterar su glicosilación, nuevamente con el fin de alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas modalidades se describe con mayor detalle más adelante. La numeración de los residuos en la región Fe es aquélla del índice de Estados Unidos de Kabat. En una modalidad, se modifica la región de articulación de CH1, de tal manera que se altere el número de residuos de cisteína en la región de articulación, por ejemplo, que se aumente o se disminuya. Este planteamiento se describe adicionalmente en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,677,425 por Bodmer y colaboradores. El número de residuos de cisteína en la región de articulación de CH1 se altera, por ejemplo, para facilitar el ensamble de las cadenas pesada y ligera, o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo. En otra modalidad, se muta la región de articulación Fe de un anticuerpo para disminuir la vida media biológica del anticuerpo. De una manera más específica, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos en la región de interfase del dominio CH2-CH3 del fragmento de articulación Fe, de tal manera que el anticuerpo tenga deteriorado el enlace de proteína A de Staphylococcyl (SpA) con el enlace SpA del dominio de articulación Fe nativo. Este planteamiento se describe con mayor detalle en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,165,745 por Ward y colaboradores.

En otra modalidad, el anticuerpo se modifica para aumentar su vida media biológica. Son posibles diferentes planteamientos. Por ejemplo, se pueden introducir una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,277,375 a Ward. De una manera alternativa, con el objeto de aumentar la vida media biológica, el anticuerpo se puede alterar dentro de la región CH1 ó CL, para contener un epítopo de enlace de receptor de salvamento tomado a partir de dos ciclos de un dominio CH2 de una región Fe de una IgG, como se describe en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,869,046 y 6,121,022 por Presta y colaboradores. En todavía otras modalidades, se altera la región Fe reemplazando cuando menos un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido diferente con el fin de alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos pueden ser reemplazados con un residuo de aminoácido diferente, de tal manera que el anticuerpo tenga una afinidad alterada para un ligando efector, pero que retenga la capacidad de enlace de antígeno del anticuerpo progenitor. El ligando efector con el que se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor de Fe, o el componente C1 del complemento. Este planteamiento se describe con mayor detalle en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números ,624,821 y 5,648,260, ambas por Winter y colaboradores. En otra modalidad, uno o más aminoácidos seleccionados a partir de los residuos de aminoácidos pueden ser reemplazados con un residuo de aminoácido diferente, de tal manera que el anticuerpo tenga el enlace de C1 q alterado, y/o las citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida o abolida. Este planteamiento se describe con mayor detalle en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6, 1 94,551 por Idusogie y colaboradores. En otra modalidad, se alteran uno o más residuos de aminoácidos para alterar de esta manera la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento. Este planteamiento es descrito adicionalmente en la Publicación del TCP Número WO 94/29351 por Bodmer y colaboradores. En todavía otra modalidad, se modifica la región Fe para aumentar la capacidad del anticuerpo para medir la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) , y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo para un receptor de Fcy, mediante la modificación de uno o más aminoácidos. Este planteamiento se describe adicionalmente en la Publicación del TCP Número WO 00/42072 por Presta. Más aún, se han mapeado los sitios de enlace sobre la IgG 1 humana para Fc?RI , FcyRI l , Fc?R I I I , y FcRn, y se han descrito variantes con un mejor enlace (véase Shields, R . L. y colaboradores, 2001 , J. Biol. Chem. 276:6591 -6604) . En todavía otra modalidad, se modifica la glicosilación de u n anticuerpo. Por ejemplo, se puede hacer un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación) . La glicosilación se puede alterar, por ejemplo, para aumentar la afinidad del anticuerpo por un "antígeno". Estas modificaciones de carbohidratos se pueden llevar a cabo, por ejemplo, mediante la alteración de uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden hacer una o más sustituciones de aminoácidos que den como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación de estructura de región variable, para eliminar de esta manera la glicosilación en ese sitio. Esta aglicosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Este planteamiento se describe con mayor detalle en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,714,350 y 6,350,861 por Co y colaboradores. De una manera adicional o alternativa, se puede hacer un anticuerpo que tenga un tipo alterado de glicosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tenga cantidades reducidas de fucosilo, o un anticuerpo que tenga más estructuras GIcNac de bisección. Se ha demostrado que estos patrones de glicosilación alterados aumentan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Estas modificaciones de carbohidratos se pueden llevar a cabo, por ejemplo, mediante la expresión del anticuerpo en una célula huésped con una maquinaria de glicosilación alterada. En la técnica se han descrito células con la maquinaria de glicosilación alterada, y se pueden utilizar como células huésped en donde se pueden expresar los anticuerpos recombinantes de la invención , con el objeto de producir de esta manera un anticuerpo con la glicosilación alterada. Por ejemplo, la Patente Europea Número EP 1 , 176, 195 por Hang y colaboradores, describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente alterado, que codifica una fucosil-transferasa, de tal manera que los anticuerpos expresados en esta línea celular exhiben hipofucosilación. La Publicación del TCP Número WO 03/035835 por Presta, describe una línea celular de CHO variante, células Lecl3, con una capacidad reducida para unir la fucosa a los carbohidratos enlazados con Asn(297) , que también dan como resultado la hipofucosilación de los anticuerpos expresados en esa célula huésped (véase también Shields R. L. y colaboradores, 2002 J . Biol. Chem. 277:26733-26740) . La Publicación del TCP Número WO 99/54342 por Umana y colaboradores, describe líneas celulares diseñadas para expresar las glicosil-transferasas modificadoras de glicoproteína (por ejemplo, beta-(1 ,4-N-acetil-glucosaminil-transferasa l l l (Gn TI N)) , de tal manera que los anticuerpos expresados en las líneas celulares diseñadas exhiben más estructuras GIcNac de bisección, lo cual da como resultado una mayor actividad de ADCC de los anticuerpos (véase también Umana y colaboradores, 1 999 Nat. Biotech . 1 7: 176-1 80). Otra modificación de los anticuerpos de la presente que es contemplada por la invención es la pegilación. Un anticuerpo se puede pegilar, por ejemplo, para aumentar la vida media biológica (por ejemplo, en suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o el fragmento del mismo, típicamente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG) , tal como un éster reactivo o un derivado de aldehido de PEG, bajo condiciones en donde uno o más grupos de PEG llegan a unirse con el anticuerpo o con el fragmento de anticuerpo. La pegilación se puede llevar a cabo mediante una reacción de acilación o mediante una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo) . Como se utiliza en la presente, el término "polietilenglicol" pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han utilizado para derivar otras proteínas, tales como mono (C1 -C1 0) alcoxi- o ariloxi-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En ciertas modalidades, el anticuerpo que se va a pegilar es un anticuerpo aglicosilado. Los métodos para la pegilación de proteínas son conocidos en este campo, y se pueden aplicar a los anticuerpos de la invención. Véase, por ejemplo, la Patente Europea Número EP 0, 1 54,31 6 por Nishimura y colaboradores, y la Patente Europea Número EP 0,401 ,384 por Ishikawa y colaboradores. Andamiajes que no son de in munoqlobulina Se puede emplear una amplia variedad de estructuras o andamiajes de anticuerpos/i nmunoglobulina, siempre que el polipéptido resultante incluya cuando menos una región de enlace que sea específica para la proteíria objetivo. Estas estructuras o andamiajes i ncluyen los cinco idiotipos principales de las inmunoglobulinas humanas, o fragmentos de las mismas (tales como se dan a conocer en cualquier otra parte de la presente), e incluyen las inmunoglobulinas de otras especies de animales, de preferencia que tengan aspectos humanizados. Los anticuerpos de una sola cadena pesada, tales como los identificados en los camélidos y/o en el tiburón, son de un interés particular en este aspecto. Los expertos en este campo continúan descubriendo y desarrollando novedosas estructuras, andamiajes, y fragmentos. En un aspecto, la invención pertenece a la generación de anticuerpos no basados en inmunoglobulina, utilizando andamiajes que no son de inmunoglobulina, sobre los cuales se pueden injertar las regiones determinantes de complementariedad de la invención. Las estructuras o andamiajes que no son de inmunoglobulina conocidos o futuros, se pueden emplear, siempre que comprendan una región de enlace específica para la proteína objetivo de la SEQ ID NO:1 o de la SEQ ID NO:122. Estos compuestos son conocidos en la presente como "polipéptidos que comprenden una región de enlace específica del objetivo". Las estructuras o andamiajes que no son de inmunoglobulina conocidos incluyen, pero no se limitan a, adnectinas (fibronectina) (Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA), anquirina (Molecular Partners AG, Zurich, Suiza), anticuerpos de dominio (Domantis, Ltd., Cambridge, MA) y Ablynx nv (Zwijnaarde, Bélgica), lipocalina (Anticalina) (Pieris Proteolab AG, Freising, Alemania), productos inmuno-farmacéuticos modulares pequeños (Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA), maxicuerpos (Avidia, Inc. (Mountain View, CA)), Proteína A (Affibody AG, Suecia), y afilina (gamma-cristalina o ubiquitina) (Scil Proteins GmbH, Halle, Alemania). (i) Adnectinas - Compound Therapeutics Los andamiajes de adnectina se basan en el dominio de fibronectina tipo lll (por ejemplo, el décimo módulo de la fibronectina tipo lll (dominio 10 Fn3). El dominio de fibronectina tipo lll tiene 7 u 8 cadenas beta que se distribuyen entre dos hojas beta, que ellas se empacan unas contra otras para formar el núcleo de la proteína, y que además contienen ciclos (análogos a las regiones determinantes de complementariedad), que conectan las cadenas beta unas con otras, y se exponen al solvente. Hay cuando menos tres de estos ciclos en cada orilla del emparedado de hojas beta, en donde la orilla es el límite de la proteína perpendicular a la dirección de las cadenas beta. (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US 6,818,418). Estos andamiajes basados en fibronectina no son una inmunoglobulina, aunque el pliegue global está estrechamente relacionado con aquél del fragmento de anticuerpo funcional más pequeño, la región variable de la cadena pesada, que comprende la unidad de reconocimiento de antígeno entera en la IgG de camello y de llama. Debido a esta estructura, el anticuerpo que no es de inmunoglobulina imita las propiedades de enlace de antígeno que son similares en su naturaleza y afinidad a las de los anticuerpos. Estos andamiajes se pueden utilizar en una estrategia cíclica de selección aleatoria y mezcla in vitro que es similar al proceso de maduración por afinidad de los anticuerpos in vivo. Estas moléculas basadas en fibronectina se pueden utilizar como andamiajes, en donde las regiones de ciclo de la molécula pueden ser reemplazadas con las regiones determinantes de complementariedad de la invención, empleando técnicas de clonación convencionales. (ii) Anquirina - Molecular Partners La tecnología se basa en la utilización de proteínas con módulos de repetición derivados de anquirina como andamiajes para soportar las regiones variables que se pueden utilizar para enlazarse con diferentes objetivos. El módulo de repetición de anquirina es un polipéptido de 33 aminoácidos que consiste en dos hélices-a antiparalelas y una vuelta-ß. El enlace de las regiones variables se optimiza en su mayor parte utilizando la exhibición del ribosoma. (iii) Maxicuerpos/avímeros - Avidia Los avímeros se derivan a partir de la proteína que contiene el dominio-A natural, tal como LRP-1. Estos dominios son utilizados por la naturaleza para las interacciones de proteína-proteína, y en los seres humanos, más de 250 proteínas están estructuralmente basadas en los dominios-A. Los avímeros consisten en un número de diferentes monómeros de "dominio-A" (2-10) enlazados por medio de enlazadores de aminoácidos. Se pueden crear avímeros que se puedan enlazar con el antígeno objetivo, empleando la metodología descrita, por ejemplo, en las Publicaciones Números 20040175756; 20050053973; 20050048512; y 20060008844. (iv) Proteína A - Affibodv Los ligandos por afinidad Affibody® son pequeñas proteínas simples compuestas de un haz de tres hélices basado en el andamiaje de uno de los dominios de enlace de la Proteína A. La proteína A es una proteína superficial a partir de la bacteria Staphylococcus aureus. Este dominio de andamiaje consiste en 58 aminoácidos, trece de los cuales se seleccionan aleatoriamente para generar las bibliotecas Affibody con un gran número de variantes de ligandos (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US, 5,831,012). Las moléculas Affibody® imitan los anticuerpos, tienen un peso molecular de 6 kDa, comparándose con el peso molecular de los anticuerpos, que es de 150 kDa. A pesar de su pequeño tamaño, el sitio de enlace de las moléculas Affibody® es similar a aquél de un anticuerpo. (v) Anticalinas - Pieris Las Anticalinas® son productos desarrollados por la compañía Pieris ProteoLab AG. Se derivan a partir de las lipocalinas, un grupo ampliamente extendido de proteínas pequeñas y robustas que están usualmente involucradas en el transporte fisiológico o en el almacenamiento de los compuestos químicamente sensibles o insolubles. Varias lipocalinas naturales se presentan en los tejidos humanos o en los líquidos corporales. La arquitectura de la proteína recuerda a la de las inmunoglobulinas, con ciclos hipervariables sobre la parte superior de una estructura rígida. Sin embargo, en contraste con los anticuerpos o sus fragmentos recombinantes, las lipocalinas están compuestas de una sola cadena de polipéptido con 160 a 180 residuos de aminoácidos, que es justamente marginalmente más grande que un solo dominio de inmunoglobulina. El conjunto de cuatro ciclos, que forma el bolsillo de enlace, muestra una plasticidad estructural pronunciada, y tolera una variedad de cadenas laterales. Por lo tanto, el sitio de enlace se puede reconfigurar en un proceso registrado, con el objeto de reconocer las moléculas objetivo prescritas de diferente forma con una alta afinidad y especificidad. Se ha utilizado una proteína de la familia de lipocalina, la proteína de enlace de bilina (BBP) de Pieris Brassicae, para desarrollar las anticalinas, mutando el conjunto de los cuatro ciclos. Un ejemplo de una solicitud de patente que describe las "anticalinas" es la Publicación del TCP Número PCT WO 199916873. (vi) Afilina - Scil Proteins Las moléculas de AfilinaMR son pequeñas proteínas que no son de inmunoglobulina, que están diseñadas para tener afinidades específicas hacia las proteínas y las moléculas pequeñas. Las nuevas moléculas de Afil inaMR se pueden seleccionar muy rápidamente a partir de dos bibliotecas, cada una de las cuales se basa en diferentes proteínas de andamiaje derivadas de seres humanos. Las moléculas de AfilinaMR no muestran ninguna homología estructural con las proteínas de inmunoglobulina. Scil Proteins emplea dos andamiajes de AfilinaMR, uno de los cuales es gamma-cristalino, una proteína del lente del ojo estructural humana, y el otro es de las proteínas de la superfamilia de la "ubiquitina". Ambos andamiajes humanos son muy pequeños, muestran una alta estabilidad a la temperatura, y son casi resistentes a los cambios de pH y a los agentes desnaturalizantes. Esta alta estabilidad se debe principalmente a la estructura de hoja beta expandida de las proteínas. Los ejemplos de las proteínas derivadas del gamma-cristalino se describen en la Publicación Internacional Número WO2001 041 44, y los ejemplos de las proteínas "de tipo ubiquitina" se describen en la Publicación I nternacional Número WO2004106368. Métodos para diseñar anticuerpos Como se describe anteriormente, los anticuerpos anti-DKK1 que tienen las secuencias VH y VL o las secuencias de cadena pesada y ligera de longitud completa mostradas en la presente, se pueden utilizar para crear nuevos anticuerpos anti-DKK1 /4, mediante la modificación de las secuencias de la cadena pesada y/o de la cadena ligera de longitud completa, las secuencias de VH y/o VL, o las regiones constantes unidas a las mismas. Por consiguiente, en otro aspecto de la invención, se utilizan las características estructurales de un anticuerpo anti-DKK1 de la invención para crear anticuerpos anti-DKK1 /4 estructuralmente relacionados que retienen cuando menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, tal como el enlace con DKK1 ó DKK4 humanos, o ambos, y que también inhiben una o más propiedades funcionales de DKK1 ó DKK4, o de ambos. Por ejemplo, una o más regiones determinantes de complementariedad de los anticuerpos de la invención, o mutaciones de los mismos, se pueden combinar de una manera recombinante con las regiones de estructura conocidas y/u otras regiones determinantes de complementariedad para crear anticuerpos anti-DKK1 recombinantemente diseñados adicionales de la invención, como se describe anteriormente. Otros tipos de modificaciones incluyen aquéllas descritas en la sección anterior. El material de partida para el método de diseño es una o más de las secuencias de VH y/o V proporcionadas en la presente, o una o más regiones determinantes de complementariedad de las mismas. Con el fin de crear el anticuerpo diseñado, no es necesario preparar realmente (es decir, expresar como una proteína) un anticuerpo que tenga una o más de las secuencias de VH y/o V proporcionadas en la presente, o una o más de las regiones determinantes de complementariedad de las mismas. Más bien, se utiliza la información contenida en las secuencias como el material de partida para crear secuencias de "segunda generación" derivadas a partir de las secuencias originales, y luego las secuencias "de segunda generación" se preparan y se expresan como una proteína. De conformidad con lo anterior, en otra modalidad, la invención proporciona un método para la preparación de un anticuerpo anti-DKK1 , que consiste en: una secuencia de anticuerpo de la región VH que tiene una secuencia de CDR 1 seleccionada a parti r del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:2-5, 8-1 1 , 20, 49-56; una secuencia de CDR2 seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:2-20 y 57-64; y/o una secuencia de CDR3 seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:2-20 y 65-72; y una secuencia de anticuerpo de la región V que tiene una secuencia de CDR 1 seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:21 -39 y 73-80; una secuencia de CDR2 seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:21 -39 y 81 -88; y/o una secuencia de CDR3 seleccionada a parti r del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:21 -39 y 89-96; alterar cuando menos un residuo de aminoácido dentro de la secuencia del anticuerpo de la región VH y/o dentro de la secuencia del anticuerpo de la región V para crear cuando menos una secuencia de anticuerpo alterada; y expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína. De conformidad con lo anterior, en otra modalidad, la invención proporciona un método para la preparación de un anticuerpo anti-DKK1 , que consiste en: una secuencia de anticuerpo de cadena pesada de longitud completa que tiene una secuencia seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs: 1 1 5-1 17; y una secuencia de anticuerpo de cadena ligera de longitud completa que tiene una secuencia seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs: 1 1 1 -1 14; alterar cuando menos un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de anticuerpo de cadena pesada de longitud completa y/o dentro de la secuencia de anticuerpo de cadena ligera de longitud completa, para crear cuando menos una secuencia de anticuerpo alterada; y expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína. En otra modalidad, la invención proporciona un método para la preparación de una composición anti-DKK1 /4 neutralizante optimizada para la expresión en mamíferos, que consiste en: una secuencia de anticuerpo de la región VL que tiene una secuencia seleccionada a partir del grupo de la SEQ ID NO:119; y una secuencia de anticuerpo de la región V que tiene una secuencia seleccionada a partir del grupo de la SEQ ID NO:118; alterar cuando menos un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de anticuerpo de la región VH y/o dentro de la secuencia de anticuerpo de la región V , para crear cuando menos una secuencia de anticuerpo alterada; y expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína. Se pueden emplear las técnicas de biología molecular convencionales para preparar y expresar la secuencia de anticuerpo alterada. El anticuerpo codificado por las secuencias de anticuerpo alteradas, es uno que retiene una, algunas, o todas las propiedades funcionales de las composiciones anti-DKK1/4 neutralizantes descritas en la presente, cuyas propiedades funcionales incluyen, pero no se limitan a, enlazarse específicamente con el DKK1 humano; y el anticuerpo exhibe cuando menos una de las siguientes propiedades funcionales: el anticuerpo inhibe el enlace de la proteína DKK1 con el receptor de DKK1, o el anticuerpo inhibe el enlace del receptor de DKK1 previniendo o mejorando la osteólisis, o el anticuerpo inhibe el enlace del receptor de DKK1 previniendo o mejorando de esta manera las lesiones osteolíticas, o el anticuerpo inhibe el enlace del receptor de DKK1 previniendo o mejorando el cáncer. El anticuerpo alterado puede exhibir una o más, dos o más, o tres o más de las propiedades funcionales discutidas anteriormente.

Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados se pueden evaluar empleando ensayos convencionales disponibles en la técnica y/o descritos en la presente, tales como aquéllos estipulados en los Ejemplos (por ejemplo, ELISAs) . En ciertas modalidades de los métodos para diseñar los anticuerpos de la invención, se pueden introducir mutaciones de una manera aleatoria o selectiva a lo largo de toda o parte de una secuencia de codificación de anticuerpo anti-DKK1 , y los anticuerpos anti-DKK1 modificados resultantes se pueden rastrear para determinar su actividad de enlace y/u otras propiedades funcionales, como se describen en la presente. Se han descrito métodos de mutación en la técnica. Por ejemplo, la Publicación del TCP Número WO 02/092780 por Short describe métodos para crear y rastrear mutaciones de anticuerpos utilizando mutagénesis de saturación, ensamble de ligamiento sintético, o una combinación de los mismos. De una manera alternativa, la Publicación del TCP Número WO 03/074679 por Lazar y colaboradores, describe métodos para utilizar métodos de rastreo por computación para optimizar las propiedades fisicoquímicas de los anticuerpos. La región constante Fe de un anticuerpo es crítica para determinar la vida media en suero y las funciones efectoras, es decir, la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC), o las actividades de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . Se pueden diseñar mutantes específicos del fragmento Fe para alterar la función efectora y/o la vida media en suero (véase, por ejemplo, Xencor Technology, véase también, por ejemplo, la Publicación I nternacional Número WO2004029207) . Un método para alterar la función efectora y la vida media en suero de un anticuerpo es injertar la región variable de un fragmento de anticuerpo con un fragmento Fe que tenga la función efectora apropiada. Se pueden seleccionar isotipos de lgG 1 ó lgG4 para la actividad de la aniquilación celular, mientras que se puede utilizar el isotipo lgG2 para los anticuerpos silenciosos o neutralizantes (sin actividad de aniquilación celular) . Se pueden obtener anticuerpos silenciosos con una larga vida media en suero, haciendo la fusión quimérica de las regiones variables de un anticuerpo con una proteína de suero, tal como la proteína de enlace de HSA. También se pueden alterar las funciones efectoras mediante la modulación del patrón de glicosilación del anticuerpo. Glycart (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US6,602,684) , Biowa (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US6,946,292) y Genentech (por ejemplo, Publicación Internacional Número WO03/035835), han diseñado líneas celulares de mamífero para producir anticuerpos con una función efectora incrementada o disminuida. En especial , los anticuerpos no fucosilados tendrán mejores actividades de ADCC. Glycofi también ha desarrollado líneas celulares de levadura capaces de producir glicoformas específicas de anticuerpos.

Moléculas de ácidos n ucleicos que codifican los anticuerpos de la invención Otro aspecto de la invención pertenece a moléculas de ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la invención. Los ejemplos de las secuencias de nucleótidos progenitoras de cadena ligera de longitud completa se muestran en las SEQ I D NOs:97-100. Los ejemplos de las secuencias de nucleótidos progenitoras de cadena pesada de longitud completa se muestran en las SEQ I D NOs: 1 01 -1 03. Los ejemplos de las secuencias de nucleótidos de cadena ligera de longitud completa optimizadas para la expresión en una célula se muestran en las SEQ ID NOs: 104-1 07. Los ejemplos de las secuencias de nucleótidos de cadena pesada de longitud completa optimizadas para la expresión en una célula se muestran en las SEQ ID NOs: 108-1 10. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en las células enteras, en un lisado celular, o pueden ser ácidos nucleicos en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico se "aisla" o "se hace sustancialmente puro", cuando se purifica de otros componentes celulares o de otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas convencionales, incluyendo tratamiento alcalino/SDS, banda de CsCI, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa, y otros bien conocidos en este campo. Véase F. Ausubel y colaboradores, Editores, 1 987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nueva York. Un ácido nucleico de la invención , por ejemplo, puede ser A DN ó ARN , y puede contener o no secuencias intrónicas. En una modal idad, el ácido nucleico es una molécula de ADNc. El ácido nucleico puede estar presente en un vector, tal como en un vector de exhibición de fagos , o en un vector de plásmido recombinante . Los ácidos nucleicos de la invención se pueden obtener empleando técnicas de biolog ía molecular convencionales. Para los anticuerpos expresados por hibridomas (por ejemplo, los hibridomas preparados a parti r de ratones transgénicos que ll even genes de i n munoglobulina h umana, como se describe adicional mente más adelante) , los ADNcs que codifiquen las cadenas l igera y pesada del anticuerpo hecho por el hib ridoma se pueden obtene r mediante ampl ificación con reacción en cadena de la polimerasa convencional , o mediante técnicas de clonación de ADNc. Para los anticuerpos obtenidos a parti r de u na biblioteca de genes de i nmu noglobulina (po r ejemplo, uti lizando técnicas de exh ibición de fagos) , el ácido n ucleico que codifica el anticuerpo se puede recuperar a parti r de diferentes clones de fagos que sean miembros de la biblioteca. Una vez que se obtengan los fragmentos de ADN que codifiquen los segmentos VH y VL, estos fragmentos de ADN se pueden manipular adicionalmente mediante técnicas de ADN recombinantes convencionales, por ejemplo, para converti r los genes de región variable hasta los genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, hasta los genes de f ragmentos Fab, o hasta u n gen scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifique V ó VH se enlaza operativamente con otra molécula de ADN , o con un fragmento que codifique otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo, o un enlazador flexible. El término "operativamente enlazado", como se utiliza en este contexto, pretende significar que los dos fragmentos de ADN se unen de una manera funcional, por ejemplo, de tal manera que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen dentro del marco, o de tal manera que la proteína se expresa bao el control de un promotor deseado. El ADN aislado que codifica la región VH se puede convertir hasta un gen de cadena pesada de longitud completa mediante el enlace operativo del ADN que codifique VH con otra molécula de ADN que codifique regiones constantes de cadena pesada (CH 1 , CH2, y CH3) . Las secuencias de los genes de región constante de cadena pesada humanos son conocidas en este campo (véase, por ejemplo, Kabat, E. A. y colaboradores, 1 991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Publicación de NIH Número 91 -3242) , y los fragmentos de ADN que abarquen estas regiones se pueden obtener mediante amplificación en cadena de la polimerasa convencional . La región constante de cadena pesada puede ser una región constante de lgG 1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM ó IgD. Para un gen de cadena pesada de un fragmento Fab, el ADN que codifique VH se puede enlazar operativamente con otra molécula de ADN que codifique solamente la región constante CH 1 de cadena pesada. El ADN aislado que codifica la región V se puede convertir hasta el gen de cadena ligera de longitud completa (así como hasta un gen de cadena ligera de Fab), mediante el enlace operativo del ADN que codifique VL con otra molécula de ADN que codifique la región constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de los genes de región constante de cadena ligera humanos se conocen en la materia (véase, por ejemplo, Kabat, E. A. y colaboradores, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Publicación de NIH Número 91-3242), y los fragmentos de ADN que abarquen estas regiones se pueden obtener mediante amplificación con reacción en cadena de la polimerasa convencional. La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda. Con el fin de crear un gen scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y V se enlazan operativamente con otro fragmento que codifique un enlazador flexible, por ejemplo, que codifique la secuencia de aminoácidos (Gly4 -Ser)3, de tal manera que se puedan expresar las secuencias VH y V como una proteína de una sola cadena contigua, con las regiones V y VH unidas por el enlazador flexible (véase, por ejemplo, Bird y colaboradores, 1988 Science 242: 423-426; Huston y colaboradores, 1988 Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85: 5879-5883; McCafferty y colaboradores, 1990 Nature 348: 552-554).

Producción de los anticuerpos monoclonales de la invención Los anticuerpos monoclonales (mAbs) se pueden producir mediante una variedad de técnicas, incluyendo la metodología de anticuerpos monoclonales convencional , por ejemplo, la técnica de hibridación de células somáticas convencional de Kohler y Milstein, 1 975 Nature, 256:495. Se pueden emplear muchas técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo la transformación viral u oncogénica de los linfocitos B. Un sistema animal para preparar hibridomas es el sistema de murino. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento bien establecido. Los protocolos de inmunización y las técnicas para el aislamiento de los esplenocitos inmunizados para la fusión son conocidos en este campo. También se conocen los componentes de fusión (por ejemplo, células de mieloma de murino) y los procedimientos de fusión. Los anticuerpos quiméricos o humanizados de la presente invención se pueden preparar basándose en la secuencia de un anticuerpo monoclonal de murino preparado como se describe anteriormente. El ADN que codifique las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera se puede obtener a partir del hibridoma de interés, y se puede diseñar para contener secuencias de inmunoglobulina que no sean de murino (por ejemplo, humanas), empleando técnicas de biología molecular convencionales. Por ejemplo, con el objeto de crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables de murino se pueden enlazar con las regiones constantes humanas, empleando métodos conocidos en la materia (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,816,567 a Cabilly y colaboradores) . Con el fin de crear un anticuerpo humanizado, las regiones CDR de murino se pueden insertar en una estructura humana, empleando métodos conocidos en este campo. Véanse, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,225,539 a Winter, y las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,530, 101 ; 5,585,089; 5,693,762 y 6, 1 80,370 a Queen y colaboradores. En cierta modalidad, los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales humanos. Estos anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra DKK1 , se pueden generar utilizando ratones transgénicos o transcromosómicos que lleven partes del sistema inmune humano, en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen los ratones referidos en la presente como ratones HuMAb y ratones KM , respectivamente, y son referidos colectivamente en la presente como "ratón de Ig humana". El ratón HuMAb® (Medarex, Inc.) contiene mini-/oc del gen de inmunoglobulina humana que codifican secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada (µ y y) y K humanas no reconfiguradas, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci de cadena µ y K endógenos (véase, por ejemplo, Lonberg y colaboradores, 1994 Nature 368(6474): 856-859) . De conformidad con lo anterior, los ratones exhiben una expresión reducida de IgM ó K de ratón, y en respuesta a la inmunización, los transgenes de cadena pesada y ligera humanos introducidos sufren una conmutación de clase y una mutación somática para generar la IgG K humana de alta afinidad monoclonal (Lonberg, N. y colaboradores, 1994 supra; revisado en Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101; Lonberg, N. y Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, y Harding, F. y Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). La preparación y uso de los ratones HuMAb, y las modificaciones genómicas llevadas por estos ratones, se describen adicionalmente en Taylor, L. y colaboradores, 1992 Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen, J. y colaboradores, 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon y colaboradores, 1993 Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 94: 3720-3724; Choi y colaboradores, 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. y colaboradores, 1993 EMBO J. 12:821-830; Tuaillon y colaboradores, 1994 J. Immunol. 152: 2912-2920; Taylor, L. y colaboradores, 1994 International Immunology 579-591; y Fishwild, D. y colaboradores, 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851, el contenido de todos los cuales se incorpora específicamente a la presente como referencia en su totalidad. Véanse además, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; y 5,770,429; todas a Lonberg y Kay; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,545,807 a Surani y colaboradores; Las Publicaciones del TCP Números WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 971 1 3852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas a Lonberg y Kay; y la Publicación del TCP Número WO 01 /1 4424 a Korman y colaboradores. En otra modalidad, los anticuerpos humanos de la invención se pueden reproducir utilizando un ratón que lleve secuencias de inmunoglobulina humana sobre los transgenes y los transcromosomas, tal como un ratón que lleve un transgén de cadena pesada humano y un transcromosoma de cadena ligera humano. Estos ratones, referidos en la presente como "ratones KM", se describen con detalle en la Publicación del TCP Número WO 02/43478 a Ishida y colaboradores. Todavía además, hay sistemas de animales transgénicos alternativos que expresan los genes de ¡nmunoglobulina humana disponibles en la técnica, y se pueden utilizar para reproducir los anticuerpos anti-DKK1 de la invención. Por ejemplo, se puede utilizar un sistema transgénico alternativo referido como el Xenomouse® (Abgenix, Inc.) . Estos ratones se describen , por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,939,598; 6,075, 181 ; 6, 1 14,598; 6, 150,584, y 6, 162,963 a Kucherlapati y colaboradores. Más aún, hay sistemas de animales transcromosómicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana disponibles en la técnica, y se pueden utilizar para reproducir los anticuerpos anti-DKK1 de la invención . Por ejemplo, se pueden utilizar ratones que lleven tanto un transcromosoma de cadena pesada humano como un transcromosoma de cadena ligera humano, referidos como "ratones TC"; estos ratones se describen en Tomizuka y colaboradores, 2000 Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 97: 722-727. Adicionalmente, se han descrito en la técnica vacas que llevan transcromosomas de cadena pesada y ligera humanos (Kuroiwa y colaboradores, 2002 Nature Biotechnology 20: 889-894) , y se pueden utilizar para reproducir los anticuerpos anti-DKK1 de la invención. Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también se pueden preparar empleando métodos de exhibición de fagos para rastrear bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana. Estos métodos de exhibición de fagos para aislar anticuerpos humanos están establecidos en la técnica. Véanse por ejemplo: Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica N úmeros 5,223,409; 5,403,484; y 5,571 ,698 a Ladner y colaboradores; Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,427,908 y 5,580,717 a Dower y colaboradores; Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,969, 1 08 y 6, 1 72, 1 97 a McCafferty y colaboradores; y Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,885,793; 6,521 ,404; 6,544,731 ; 6,555,31 3; 6,582,91 5 y 6,593,081 a Griffiths y colaboradores. Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también se pueden preparar utilizando ratones SCI D, en los cuales se han reconstituido las células inmunes humanas, de tal manera que se puede generar una respuesta a anticuerpo humano después de la inmunización. Estos ratones se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números . 5,476,996 y 5,698,767 a Wilson y colaboradores. Se pueden emplear rastreos de bibliotecas de anticuerpos humanos para identificar un anticuerpo de la invención. La elección de las tecnologías de rastreo incluyen , pero no se limitan a, exhibición de fagos (Morphosys) , el tipo de bibliotecas (por ejemplo, la biblioteca HuCal de Morphosys) , la tecnología de maduración por afinidad, y otras secuencias de optimización de codones. Generación de anticuerpos monoclonales humanos contra DKK1 El DKK1 humano recombinante purificado derivado a partir de E. coli, baculovirus, o células HEK-EBNA, o el DKK1 humano recombinante purificado conjugado con hemocianina de limpete de orificio (KLH) , se utiliza como el antígeno. Los anticuerpos monoclonales completamente humanos para DKK1 se preparan utilizando las razas HCo7, HCo12, y HCo17 de ratones transgénicos HuMAb, y la raza KM de ratones transcromosómicos transgénicos, cada una de las cuales expresa los genes de anticuerpo humanos. En cada una de estas razas de ratón, el gen de cadena ligera kappa de ratón endógeno se puede alterar homocigóticamente, como se describe en Chen y colaboradores, 1 993 EMBO J . 12:81 1 -820, y el gen de cadena pesada de ratón endógeno se puede alterar homocigóticamente como se describe en el Ejemplo 1 de la Publicación del TCP Número WO01 1 091 87. Cada una de estas razas de ratón lleva un transgén de cadena ligera kappa humano, KCo5, como se describe en Fishwild y colaboradores, 13 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851. La raza HCo7 lleva el transgén de cadena pesada humano HCo7, como se describe en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,545,806; 5,625,825; y 5,545,807. La raza HCo12 lleva el transgén de cadena pesada humano HCo12, como se describe en el Ejemplo 2 de la Publicación del TCP Número WO 01/09187. La raza HC017 lleva el transgén de cadena pesada humano HCo17. La raza KNM contiene el transcromosoma SC20, como se describe en la Publicación del TCP Número WO 02/43478. Para generar los anticuerpos monoclonales completamente humanos para DKK1, los ratones HuMAb y los ratones KM se inmunizan con el DKK1 recombinante purificado derivado a partir de E. coli, o el conjugado de DKK1-KLH como el antígeno. Los esquemas de inmunización generales para los ratones HuMAb se describen en Lonberg, N. y colaboradores, 1994, Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. y colaboradores, 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851, y en la Publicación del TCP Número WO 98/24884. Los ratones son de 6 a 16 semanas de edad después de la primera infusión de antígeno. Se utiliza una preparación recombinante purificada (de 5 a 50 microgramos) del antígeno de DKK1 (por ejemplo, purificado a partir de células de E. coli transfectadas que expresen DKK1), para inmunizar a los ratones HuMAb y a los ratones KM intraperitonealmente, subcutáneamente (Se), o mediante inyección en la planta de la pata. Los ratones transgénicos se inmunizan dos veces con el antígeno en adyuvante completo de Freund o en adyuvante de Ribi, ya sea intraperitonealmente (IP), subcutáneamente (Se), o mediante inyección en la pata (FP), seguido por 3 a 21 días de inmunización intraperitoneal, subcutánea, o mediante inyección en la pata (hasta un total de 1 1 inmunizaciones) con el antígeno en adyuvante incompleto de Freund o Ribi . La respuesta inmune se monitorea mediante sangrados retro-orbitales. El plasma se rastrea mediante ELISA, y se utilizan los ratones con suficientes titulaciones de inmunoglobulina humana anti-DKK1 . Los ratones se refuerzan intravenosamente con el antígeno 3 y 2 días antes del sacrificio y de la remoción del bazo. Típicamente, se llevan a cabo de 1 0 a 35 fusiones por cada antígeno. Se inmunizan varias docenas de ratones por cada antígeno. Se inmunizan un total de 82 ratones de las razas de ratones HCo7, HCo1 2, HCo1 7, y KM con DKK1 . Con el fin de seleccionar los ratones HuMAb ó KM que produzcan anticuerpos que se enlacen con DKK1 , se pueden probar los sueros de los ratones inmunizados mediante ELISA, como es descrito por Fishwild, D. y colaboradores, 1 996. Dicho de una manera breve, las placas de microtitulación se recubren con DKK1 de E. coli recombinante purificado a 1 -2 microgramos/mililitro en suero regulado con fosfato, a 50 microgramos/pozo, incubados a 4°C durante la noche, y luego se bloquean con 200 microlitros/pozo de suero de pollo al 5 por ciento en suero regulado con fosfato/Tween (al 0.05 por ciento) . Se agregan diluciones de plasma a partir de los ratones inmunizados con DKK1 a cada pozo, y se incuban durante 1 a 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavan con suero regulado con fosfato/Tween, y luego se incuban con anticuerpo policlonal Fe de IgG de cabra anti-humano conjugado con peroxidasa de radícula roja (HRP) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, las placas se desarrollan con sustrato ABTS (Sigma, A-1 888, 0.22 miligramos/mililitro) , y se analizan mediante el espectrofotómetro a una OD de 41 5-495. Los ratones que desarrollaron las titulaciones más altas de los anticuerpos anti-DKK1 son los que se utilizan para las fusiones. Se llevan a cabo las fusiones, y se prueban los sobrenadantes de hibridoma para determinar la actividad anti-DKK1 mediante ELISA. Los esplenocitos de ratón , aislados a partir de los ratones HuMAb y de los ratones KM, se fusionan con PEG a una línea celular de mieloma de ratón, basándose en los protocolos convencionales. Entonces se rastrean los hibridomas resultantes para determinar la producción de anticuerpos específicos del antígeno. Las suspensiones celulares individuales de los linfocitos esplénicos de los ratones inmunizados se fusionan a una cuarta parte del número de células de mieloma de ratón no secretoras de SP2/0 (ATCC, CRL 1 581 ) con PEG al 50 por ciento (Sigma) . Las células se aplican a aproximadamente 1 x105/pozo en placas de microtitulación de fondo plano, seguido por aproximadamente dos semanas de incubación en un medio selectivo conteniendo suero bovino fetal al 1 0 por ciento, medio acondicionado P388D 1 al 1 0 por ciento (ATCC, CRL TIB-63) , Origen® al 3-5 pro ciento (IGEN) en DMEM (Mediatech , CRL 1 001 3, 16 con alta glucosa, L-glutamina, y piruvato de sodio) , más HEPES 5 mM, 2-mercaptoetanol 0.055 mM, 50 miligramos/mililitro de gentamicina, y 1 x HAT (Sigma, CRL P-71 85). Después de una a dos semanas, las células se cultivan en el medio en donde se reemplaza el HAT con HT. Luego se rastrean los pozos individuales mediante ELISA para determinar los anticuerpos IgG monoclonales anti-DKK1 humanos. Una vez que se presenta un crecimiento de hibridoma extenso, se monitorea el medio usualmente después de 10 a 14 días. Los hibridomas secretores de anticuerpo se vuelven a aplicar en la placa, se rastrean nuevamente, y si todavía son positivos para la IgG humana, se subclonan los anticuerpos monoclonales anti-DKK1 cuando menos dos veces mediante dilución limitante. Entonces se cultivan los subclones estables in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en un medio de cultivo de tej ido para la caracterización adicional . Inm unización de ratones con Iq humana Cuando se utilizan ratones con Ig humana para reproducir los anticuerpos humanos de la invención, estos ratones se pueden inmunizar con una preparación purificada o enriquecida del antígeno de DKK1 y/o del DKK1 recombinante, o una proteína de fusión de DKK1 , como es descrito por Lonberg, N . y colaboradores, 1 994 Nature 368(6474):856-859; Fishwald, D. y colaboradores, 1 996 Nature Biotechnology 14:845-851 ; y en las Publicaciones del TCP N úmeros WO 98124884 y WO 01 /1 4424. Los ratones pueden ser de 6 a 1 6 semanas de edad después de la primera infusión . Por ejemplo, se puede utilizar una preparación purificada o recombinante (de 5 a 50 microgramos) de antígeno de DKK1 para inmunizar los ratones de Ig humana intraperitonealmente. Anteriormente se describen los procedimientos detallados para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos para DKK1 . La experiencia acumulativa con diferentes antígenos ha demostrado que los ratones transgénicos responden cuando inicialmente se inmunizan intraperitonealmente (I P) con el antígeno en adyuvante de Freund completo, seguido por inmunizaciones intraperitoneales cada tercer semana (hasta un total de 6) con el antígeno en adyuvante incompleto de Freund. Sin embargo, también se encontró que son efectivos otros adyuvantes diferentes de los de Freund. En adición, se encuentra que las células enteras en ausencia de adyuvante son altamente inmunogénicas. La respuesta inmune se puede monitorear durante el transcurso del protocolo de inmunización con muestras de plasma obtenidas mediante sangrados retro-orbitales. El plasma se puede rastrear mediante ELISA, y se pueden utilizar los ratones con suficientes titulaciones de inmunoglobulina humana anti-DKK1 para las infusiones. Los ratones se pueden reforzar intravenosamente con antígeno tres días antes del sacrificio, y se remueve el bazo. Se espera que se puede necesitar llevar a cabo dos a tres fusiones por cada inmunización. Típicamente se inmunizan entre 6 y 24 ratones por cada antígeno. Usualmente, se utilizan ambas cepas HCo-7 y HCo-12. En adición, ambos transgenes de HCo-7 y HCo-12 se pueden reproducir juntos en un solo ratón que tenga dos diferentes transgenes de cadena pesada humanos (HCo7/HCo12). Generación de anticuerpos monoclonales humanos productores de hibridomas Con el objeto de hibridomas que produzcan anticuerpos monoclonales humanos de la invención, se pueden aislar los esplenocitos y/o las células de nodos linfáticos de los ratones inmunizados, y se pueden fusionar con una línea celular inmortalizada apropiada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes se pueden rastrear para determinar la producción de anticuerpos específicos del antígeno. Por ejemplo, se pueden fusionar suspensiones de células individuales de linfocitos esplénicos de los ratones inmunizados con una sexta parte del número de células de mieloma de ratón no secretoras P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) con PEG al 50 por ciento. Las células se aplican a aproximadamente 2 x 145 en placas de microtitulación de fondo plano, seguido por una incubación de dos semanas en un medio selectivo conteniendo suero de clon fetal al 20 por ciento, medio acondicionado "653" al 1 8 por ciento, Origen® al 5 por ciento (IGEN) , L-glutamina 4 mM, piruvato de sodio 1 mM , HEPES 5 mM, 2-mercapto-etanol 0.055 m M, 50 unidades/mililitro de penicilina, 50 miligramos/mililitro de estreptomicina, 50 miligramos/mililitro de gentamicina, y 1 X HAT (Sigma; el HAT se agrega 24 horas después de la fusión). Después de aproximadamente dos semanas, las células se pueden cultivar en el medio en donde el HAT es 19 reemplazado con HT. Luego los pozos individuales se pueden rastrear mediante ELISA para determinar los anticuerpos IgM e IgG monoclonales humanos. Una vez que se presenta un crecimiento de hibridoma extenso, se puede observar el medio usualmente después de 10 a 14 días. Los hibridomas secretores de anticuerpos se pueden volver a aplicar en placas, se rastrean nuevamente, y si todavía son positivos para la IgG humana, los anticuerpos monoclonales se pueden subclonar cuando menos dos veces mediante dilución limitante. Luego los subclones estables se pueden cultivar in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en un medio de cultivo de tejido para la caracterización. Con el fin de purificar los anticuerpos monoclonales humanos, los hibridomas seleccionados se pueden cultivar en matraces centrífugos de dos litros para la purificación del anticuerpo monoclonal. Los sobrenadantes se pueden filtrar y concentrar antes de la cromatografía por afinidad con la proteína A-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, N . J .) . La IgG eluida se puede verificar mediante electroforesis en gel y mediante cromatografía de l íquidos de alto rendimiento, para asegurar la pureza. La solución reguladora se puede intercambiar en suero regulado con fosfato, y se puede determinar la concentración mediante la OD2ßo. utilizando un coeficiente de extinción de 1 .43. Los anticuerpos monoclonales se pueden poner en alícuotas y se almacenan a -80°C.

Generación de anticuerpos monoclonales prod uctores de transfectomas Los anticuerpos de la invención también se pueden producir en un transfectoma de célula huésped utilizando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección genética, como es bien conocido en este campo (por ejemplo, Morrison, S . ( 1 985) Science 229: 1202) . Por ejemplo, para expresar los anticuerpos, o los fragmentos de anticuerpos de los mismos, se pueden obtener ADNs que codifiquen las cadenas ligera y pesada parciales o de longitud completa mediante técnicas de biología molecular convencionales (por ejemplo, amplificación con reacción en cadena de la polimerasa o clonación de ADNc utilizando un hibridoma que exprese el anticuerpo de interés) , y los ADNs se pueden insertar en vectores de expresión , de tal manera que los genes se enlacen operativamente con las secuencias de control de transcripción y de traducción. En este contexto, el término "operativamente enlazado" pretende significar que se liga un gen de anticuerpo en un vector, de tal manera que las secuencias de control de transcripción y de traducción dentro del vector sirven para su función pretendida de regular la transcripción y la traducción del gen de anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de expresión se seleccionan para que sean compatibles con la célula huésped de expresión utilizada. El gen de cadena ligera del anticuerpo y el gen de cadena pesada del anticuerpo se pueden insertar en un vector separado, o más típicamente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión . Los genes de anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante los métodos convencionales (por ejemplo, ligamiento de los sitios de restricción complementarios sobre el fragmento del gen de anticuerpo y el vector, o ligamiento de extremos romos si no hay sitios de restricción presentes). Las regiones ligera y VH de los anticuerpos descritos en la presente se pueden utilizar para crear genes de anticuerpo de longitud completa de cualquier isotipo de anticuerpo, mediante su inserción en vectores de expresión que ya codifiquen las regiones constante de cadena pesada y constante de cadena ligera del isotipo deseado, de tal manera que el segmento VH se enlace operativamente con los segmentos CH dentro del vector, y el segmento V se enlace operativamente con el segmento CL dentro del vector. Adicionalmente o de una manera alternativa, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido de señal que facilite la secreción de la cadena de anticuerpo desde una célula huésped. El gen de la cadena de anticuerpo se puede clonar en el vector, de tal manera que el péptido de señal se enlace dentro del marco con el término amino del gen de la cadena de anticuerpo. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de inmunoglobulina o un péptido de señal heterólogo (es decir, un péptido de señal a partir de una proteína que no sea inmunoglobulina) . En adición a los genes de cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinante de la invención llevan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadena de anticuerpo en una célula huésped. El término "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores, y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o la traducción de los genes de cadena de anticuerpo. Estas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 1 85, Academic Press, San Diego, CA 1 990) . Los expertos en la materia apreciarán que el diseño del vector de expresión , incluyendo la selección de las secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que se vaya a transformar, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Las secuencias reguladoras para la expresión de células huésped de mam ífero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteína en células de mamífero, tales como promotores y/o potenciadores derivados a partir de citomegalovirus (CMV) , virus de simio 40 (SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardío mayor de adenovirus (AdMLP)) , y polioma. De una manera alternativa, se pueden utilizar secuencias reguladoras no virales, tales como el promotor de ubiquitina o el promotor de p-globina. Todavía adicionalmente, los elementos reguladores compuestos de secuencias a partir de diferentes fuentes, tales como el sistema promotor S Ra, que contiene secuencias a partir del promotor temprano de SV40, y la repetición terminal larga del virus de leucemia de células-T humano tipo 1 (Takebe, Y. y colaboradores, 1 988 Mol. Cell. Biol. 8:466-472). En adición a los genes de cadena de anticuerpo y a las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinante de la invención pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulen la réplica del vector en las células huésped (por ejemplo, orígenes de réplica) , y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de las células huésped en donde se haya introducido el vector (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,399,216; 4,634,665; y 5, 179,01 7, todas de Axel y colaboradores). Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G41 8, higromicina, o metotrexato, en una célula huésped en la que se haya introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables incluyen el gen de reductasa de dihidrofolato (DHFR) (para utilizarse en células huésped-dhfr con selección/amplificación de metotrexato) , y el gen neo (para la selección de G41 8) . Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, los vectores de expresión que codifiquen las cadenas pesada y ligera se transfectan a una célula huésped mediante técnicas convencionales. Las diferentes formas del término "transfección" pretenden abarcar una amplia variedad de técnicas comúnmente utilizadas para la introducción de ADN exógeno en una célula huésped procariótica o eucariótica, por ejemplo electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección de DEAE-dextrano, y similares. Teóricamente, es posible expresar los anticuerpos de la invención en células huésped procarióticas o eucarióticas. La expresión de anticuerpos en células eucarióticas, en particular en células huésped de mam ífero, se discute debido a que estas células eucarióticas, y en particular las células de mam ífero, tienen más probabilidades que las células procarióticas de ensamblarse y secretar un anticuerpo apropiadamente plegado y de enlace de antígeno. La expresión procariótica de los genes de anticuerpo se ha reportado como inefectiva para la producción de altos rendimientos de anticuerpos activos (Boss, M. A. y Wood, C. R. , 1 985 Immunology Today 6: 12-1 3) . Las células huésped de mam ífero para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen las células de ovario de hámster chino (células CHO) (incluyendo las células CHO-DHFR, descritas en U rlaub y Chasin, 1 980 Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 77: 4216-4220, utilizadas con un marcador seleccionable de DHFR, por ejemplo como se describe en . R. J. Kaufman y P. A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 1 59: 601 -621 , células de mieloma NSO, células COS , y células SP2. En particular, para utilizarse con células de mieloma NSO, otro sistema de expresión es el sistema de expresión del gen GS mostrado en las Patentes Números WO 87/04462, WO 89/01036, y EP 338,841 . Cuando se introducen vectores de expresión recombinante que codifican genes de anticuerpo en células huésped de mamífero, los anticuerpos se producen mediante el cultivo de las células huésped durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped, o la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en donde se cultiven las células huésped. Los anticuerpos se pueden recuperar a partir del medio de cultivo empleando métodos de purificación de proteína convencionales. Composiciones farmacéuticas En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contiene una o una combinación de una composición anti-DKK1/4 neutralizante, o porciones de enlace de antígeno de la misma, de la presente invención, formulada junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones pueden incluir una o una combinación de (por ejemplo, dos o más diferentes) anticuerpos, o inmunoconjugados, o moléculas biespecíficas de la invención. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la invención puede comprender una combinación de anticuerpos (o inmunoconjugados o biespecíficos) que se enlacen con epítopos diferentes sobre el antígeno objetivo, o que tengan actividades complementarias. Las composiciones farmacéuticas de la invención también se pueden administrar en una terapia de combinación, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir un anticuerpo anti-DKK1 de la presente invención, combinado con cuando menos otro agente anti-inflamatorio o anti-osteoporótico. Los ejemplos de los agentes terapéuticos que se pueden utilizar en la terapia de combinación se describen con mayor detalle más adelante en la sección sobre usos de los agentes de la invención . Como se utiliza en la presente, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de absorción, y similares, que sean fisiológicamente compatibles. El vehículo debe ser adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal, o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, el anticuerpo, inmunoconjugado, o molécula biespecífica, se puede recubrir en un material para proteger al compuesto de la acción de los ácidos y otras condiciones naturales que puedan inactivar el compuesto. Los compuestos farmacéuticos de la invención pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto progenitor, y no imparte ningún efecto toxicológico indeseado (véase, por ejemplo, Berge, S. M. y colaboradores, 1 977 J. Pharm. Sci. 66: 1 -1 9) . Los ejemplos de estas sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de base. Las sales de adición de ácido incluyen aquéllas derivadas a partir de los ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como ácido clorh ídrico, n ítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso, y similares, así como a partir de los ácidos orgánicos no tóxicos, tales como los ácidos mono- y di-carboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos sustituidos por fenilo, hidroxi-ácidos alcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos, y similares. Las sales de adición de base incluyen aquéllas derivadas a partir de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio, y similares, así como a partir de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N , N'-dibencil-etilen-diamina, N-metil-glucamina, cloro-procaína, colina, dietanolamina, etilen-diamina, procaína, y similares. Una composición farmacéutica de la invención también puede incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de los antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio, y similares; antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxi-anisol butilado (BHA) , hidroxitolueno butilado (BHT) , lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol , y similares; y agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilen-diamina-tetra-acético (EDTA) , sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares. Los ejemplos de los vehículos acuosos y no acuosos adecuados que se pueden emplear en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol , polioles (tales como glicerol , propilenglicol, polietilenglicol, y similares) , y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y esteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones, y mediante el uso de tensoactivos. Estas composiciones también pueden contener adyuvantes, tales como conservadores, agentes humectantes, agentes emulsionantes, y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos se puede asegurar tanto mediante procedimientos de esterilización, supra, como mediante la inclusión de diferentes agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, cloro-butanol, ácido sórbico de fenol, y similares. También puede ser recomendable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio, y similares, en las composiciones. En adición, se puede provocar una absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable mediante la inclusión de agentes que retarden la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de este medio y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la materia. Excepto hasta donde sea cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas de la invención. También se pueden incorporar compuestos activos suplementarios en las composiciones. Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un solvente o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol , poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol , y polietilenglicol líquido, y similares) , y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión , o mediante el uso de tensoactivos. En muchos casos, se pueden inclui r agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol , o cloruro de sodio en la composición. Se puede provocar una absorción prolongada de las composiciones inyectables mediante la inclusión en la composición de un agente que retarde la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar mediante la incorporación del compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado, con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, como se requiera, seguida por esterilización por microfiltración. En términos generales, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contenga un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos a partir de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son secado al vacío y secado por congelación (liofilización) , lo cual proporciona un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente filtrada estéril del mismo. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material de vehículo para producir una sola forma de dosificación variará dependiendo del sujeto que se esté tratando, y del modo de administración particular. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material de veh ículo para producir una sola forma de dosificación en general será la cantidad de la composición que produzca un efecto terapéutico. En general , del cien por ciento, esta cantidad estará en el intervalo de aproximadamente el 0.01 por ciento a aproximadamente el 99 por ciento de ingrediente activo, de aproximadamente el 0.1 por ciento a aproximadamente el 70 por ciento, o de aproximadamente el 1 por ciento a aproximadamente el 30 por ciento de ingrediente activo, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica).

Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a través del tiempo, o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente, como sea indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente conveniente formular las composiciones parenterales en una forma unitaria de dosificación para mayor facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma unitaria de dosificación, como se utiliza en la presente, se refiere a unidades físicamente separadas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos que se vayan a tratar; cada unidad contiene una cantidad previamente determinada del compuesto activo, calculada para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención es dictada por, y depende directamente de, las características únicas del compuesto activo, y del efecto terapéutico particular que se vaya a lograr, y de las limitaciones inherentes en la técnica de la composición de este compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en los individuos. Para la administración del anticuerpo, la dosificación está en el intervalo de aproximadamente 0.0001 a 200 miligramos/kilogramo, y más usualmente de 0.01 a 50 miligramos/kilogramo del peso corporal del huésped. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 0.3 miligramos/kilogramo de peso corporal, 1 miligramo/kilogramo de peso corporal, 3 miligramos/kilogramo de peso corporal, 5 miligramos/kilogramo de peso corporal , o 10 miligramos/kilogramo de peso corporal , o dentro del intervalo de 1 a 20 miligramos/kilogramo. Un régimen de tratamiento de ejemplo implica la administración una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses, o una vez cada 3 a 6 meses. Los regímenes de dosificación para un anticuerpo anti-DKK1 de la invención incluyen 1 miligramo/kilogramo de peso corporal o 3 miligramos/kilogramo de peso corporal mediante administración intravenosa, dándose el anticuerpo empleando uno de los siguientes programas de dosificación: cada cuatro semanas para seis dosificaciones, luego cada tres meses; cada tres semanas; 3 miligramos/kilogramo de peso corporal una vez, seguidos por 1 miligramo/kilogramo de peso corporal cada tres semanas. En algunos métodos, se administran simultáneamente dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de enlace, en cuyo caso, la dosificación de cada anticuerpo administrado cae dentro de los intervalos indicados. El anticuerpo normalmente se administra en múltiples ocasiones. Los intervalos entre las dosificaciones individuales pueden ser, por ejemplo, semanalmente, mensualmente, cada tres meses, o anualmente. Los intervalos también pueden ser irregulares, como se indique midiendo los niveles de anticuerpo en la sangre del paciente para el antígeno objetivo o de algún biomarcador, tal como OCN , OPG , ó P1 NP. En algunos métodos, la dosificación se ajusta para alcanzar una concentración del anticuerpo en plasma de aproximadamente 1 a 1 ,000 microgramos/mililitro, y en algunos métodos de aproximadamente 25 a 300 microgramos/mililitro. De una manera alternativa, el anticuerpo se puede administrar como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso, se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia varían dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la vida media más larga, seguidos por los anticuerpos humanizados, los anticuerpos quiméricos, y los anticuerpos no humanos. La dosificación y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En las aplicaciones profilácticas, se administra una dosificación relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un largo período de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo el tratamiento durante el resto de sus vidas. En las aplicaciones terapéuticas, algunas veces se requiere una dosificación relativamente alta a intervalos relativamente cortos, hasta que se reduzca o se termine el progreso de la enfermedad, o hasta que el paciente muestra una disminución parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Posteriormente, se puede administrar al paciente un régimen profiláctico. Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición, y modo de administración particular, sin que sea tóxica para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos, incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o el éster, la sal, o amida de las mismas, la vía de administración, el tiempo de administración, el índice de excreción del compuesto particular empleado, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, la condición, la salud general, y la historia médica previa del paciente que se esté tratando, y factores similares bien conocidos en la técnica médica. Una "dosificación terapéuticamente efectiva" de un anticuerpo anti-DKK1 de la invención puede dar como resultado una disminución en la severidad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duración de los períodos sin síntomas de la enfermedad, o una prevención del deterioro o discapacidad debido a la aflicción de la enfermedad. Una composición de la presente invención se puede administrar por una o más vías de administración, empleando uno o más de una variedad de métodos conocidos en este campo. Como será apreciado por el experto, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Las vías de administración para los anticuerpos de la invención incluyen administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal, u otras vías de administración parenterales, por ejemplo mediante inyección o infusión. La frase "administración parenteral", como se utiliza en la presente, significa los modos de administración diferentes de la administración enteral y tópica, usualmente mediante inyección , e incluye, sin limitación, la inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intra-arterial , intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal , subcutánea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal , epidural , e intraesternal. De una manera alternativa, un anticuerpo de la invención se puede administrar por una vía no parenteral , tal como una vía de administración tópica, epidérmica, o mucosa, por ejemplo intranasalmente, oralmente, vaginalmente, rectalmente, sublingualmente, o tópicamente. Los compuestos activos se pueden preparar con vehículos que protegerán al compuesto contra la liberación rápida, tales como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos, y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biocompatibles y biodegradables, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poli-glicólico, colágeno, poli-orto-ésteres, y ácido poli-láctico. Muchos métodos para la preparación de estas formulaciones están patentados o son generalmente conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed. , Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1 978. Las composiciones terapéuticas se pueden administrar con los dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una modalidad, una composición terapéutica de la invención se puede administrar con un dispositivo de inyección hipodérmico sin aguja, tal como los dispositivos mostrados en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,399, 1 63; 5,383,851 ; 5,31 2,335; 5,064,41 3; 4,941 ,880; 4,790,824 o 4,596,556. Los ejemplos de los implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente invención incluyen: Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,487,603, la cual muestra una bomba de micro-infusión ¡mplantable para dosificar medicamento a una velocidad controlada; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,486, 1 94, la cual muestra un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel ; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica N úmero 4,447,233, la cual muestra una bomba para infusión de medicamento para suministrar medicamento a una velocidad de infusión precisa; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica N úmero 4,447,224, la cual muestra un aparato para infusión implantable de flujo variable para suministro continuo del fármaco; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,439, 1 96, la cual muestra un sistema de suministro de fármaco osmótico que tiene compartimientos de múltiples cámaras; y Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,475, 196, la cual muestra un sistema de suministro de fármaco osmótico. Estas patentes se incorporan a la presente como referencia. Muchos otros de estos implantes, sistemas de suministro, y módulos, son conocidos por los expertos en la materia. En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales humanos de la invención se pueden formular para asegurar una distribución apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera hemato-encefálica (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrof ílicos. Con el objeto de asegurar que los compuestos terapéuticos de la invención crucen la barrera hemato-encefálica (si se desea) , se pueden formular, por ejemplo, en liposomas. Para los métodos de fabricación de liposomas , véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,522,81 1 ; 5,374,548; y 5,399,331 . Los liposomas pueden comprender una o más fracciones, las cuales se transportan selectivamente hacia las células u órganos específicos , y de esta manera mejoran el suministro del fármaco dirigido (véase, por ejemplo, V. V. Ranade, 1 989 J . Cline Pharmacol. 29:685) . Las fracciones de dirección de ejemplo incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados U nidos de Norteamérica Número 5,41 6,01 6 a Low y colaboradores) ; manosidas (Umezawa y colaboradores, 1 988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 1 53: 1038); anticuerpos (P. G . Bloeman y colaboradores, 1 995 FEBS Lett. 357: 1 40; M. Owais y colaboradores, 1 995 Antimicrob. Agents Chemother. 39: 1 80) ; receptor de proteína A de tensoactivo (Briscoe y colaboradores, 1 995 Am . J. Physiol. 1 233: 134) ; página 120 (Schreier y colaboradores, 1 994 J. Biol. Chem. 269: 9090) ; véase también K.

Keinanen; M. L. Laukkanen, 1994 FEBS Lett. 346: 123; J. J. Killion; I . J . Fidler, 1 994 Immunomethods 4:273. Las combinaciones La invención se refiere además a un método para prevenir o tratar enfermedades o trastornos proliferativos, tales como cáncer, en un mamífero, en particular en un ser humano, con una combinación de agentes farmacéuticos que comprende: (a) una composición anti-DKK1 /4 neutralizante; y (b) uno o más agentes farmacéuticamente activos. La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden: (a) una composición anti-DKK1 /4 neutralizante; (b) un agente farmacéuticamente activo ; y (c) un vehículo farmacéuticamente aceptable. La presente invención se refiere además a un paquete comercial o a un producto que comprende: (a) una formulación farmacéutica de una composición anti-DKK1 /4 neutralizante; y (b) una formulación farmacéutica de un agente farmacéuticamente activo para su uso simultáneo, concurrente, separado, o en secuencia. Los agentes farmacéuticamente activos El término "agentes farmacéuticamente activos" es amplio y cubre muchos agentes farmacéuticamente activos que tienen diferentes mecanismos de acción. Las combinaciones de algunos de éstos con los anticuerpos/composiciones neutralizantes de DKK1/4 pueden dar como resultado mejoras en la terapia de cáncer. En términos generales, los agentes farmacéuticamente activos se clasifican de acuerdo con el mecanismo de acción. Muchos de los agentes disponibles son anti-metabolitos de las sendas de desarrollo de diferentes tumores, o reaccionan con el ADN de las células tumorales. También hay agentes que inhiben las enzimas, tales como topoisomerasa I y topoisomerasa II, o que son agentes anti-mitóticos. El término "agente farmacéuticamente activo" significa en especial cualquier agente farmacéuticamente activo diferente de una composición anti-DKK1/4 neutralizante, o un derivado del mismo. Incluye, pero no se limita a: i. un inhibidor de aromatasa; ii. un anti-estrógeno, un anti-andrógeno, o un agonista de gonadorelina; iii. un inhibidor de topoisomerasa I o un inhibidor de topoisomerasa II; iv. un agente activo en microtúbulos, un agente alquilante, un anti-metabolito anti-neoplástico, o un compuesto de platina; v. un compuesto que dirige/reduce la actividad de una cinasa de proteína o de lípido, o la actividad de una fosfatasa de proteína o de lípido, un compuesto anti-angiogénico adicional, o un compuesto que induce los procesos de diferenciación celular; vi. anticuerpos monoclonales; vii. un inhibidor de ciclo-oxigenasa, un bisfosfonato, un inhibidor de heparanasa, un modificador de la respuesta biológica; viii. un inhibidor de las isoformas oncogénicas ras; y ix. un inhibidor de telomerasa; x. un inhibidor de proteasa, un inhibidor de metaloproteinasa de matriz, un inhibidor de aminopeptidasa de metionina, o un inhibidor de proteasoma; xi. agentes utilizados en el tratamiento de malignidades hematológicas, o compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de Flt-3; xii. un inhibidor de HSP90; xiii. anticuerpos anti-proliferativos; xiv. un inhibidor de desacetilasa de histona (HDAC); xv. un compuesto que dirige, reduce, o inhibe la actividad/función de la cinasa mTOR de serina/treonina; xvi. un antagonista del receptor de somatostatina; xvii. un compuesto anti-leucémico; xviii. planteamientos que dañan las células tumorales; xix. un enlazador de EDG; xx. un inhibidor de reductasa de ribonucleótido; xxi. un inhibidor de descarboxilasa de S-adenosil-metionina; xxii. un anticuerpo monoclonal de VEGF ó VEGFR; xxiii. terapia fotodinámica; xxiv. un esteroide angiostático; xxv. un implante que contiene corticosteroides; xxvi. un antagonista del receptor AT1; y xxvii. un inhibidor de ACE. El término "inhibidor de aromatasa", como se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto que inhibe la producción de estrógeno, es decir, la conversión de los sustratos androstenodiona y testosterona hasta estrona y estradiol, respectivamente. El término incluye, pero no se limita a, esteroides, en especial atamestano, exemestano, y formestano; y en particular, no esteroides, en especial aminoglutetimida, rogletimida, piridoglutetimida, trilostano, testolactona, quetoconazol, vorozol, fadrozol, anastrozol, y letrozol. El exemestano se comercia como AROMASIN; el formestano como LENTARON; el fadrozol como AFEMA; el anastrozol como ARIMIDEX; el letrozol como FEMARA o FEMAR; y la aminoglutetimida como ORIMETEN. Una combinación de la invención que comprenda un agente farmacéuticamente activo que sea un inhibidor de aromatasa, es particularmente útil para el tratamiento de los tumores positivos para el receptor de hormonas, por ejemplo los tumores de mama. El término "anti-estrógeno", como se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto que antagoniza el efecto de los estrógenos al nivel del receptor de estrógeno. El término incluye, pero no se limita a, tamoxifeno, fulvestrant, raloxifeno, y clorhidrato de raloxifeno. El tamoxifeno se puede administrar en la forma como se comercia, por ejemplo NOLVADEX; y el clorhidrato de raloxifeno se comercia como EVISTA. El fulvestrant se puede formular como se da a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,659,516, y se comercia como FASLODEX. Una combinación de la invención que comprenda un agente farmacéuticamente activo que sea un anti-estrógeno, es particularmente útil para el tratamiento de los tumores positivos para el receptor de estrógeno, por ejemplo tumores de mama. El término "anti-andrógeno", como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier sustancia que sea capaz de inhibir los efectos biológicos de las hormonas androgénicas, e incluye, pero no se limita a, bicalutamida (CASODEX), que se puede formular, por ejemplo, como se da a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,636,505. El término "agonista de gonadorelina" como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, abarelix, goserel?na, y acetato de goserelina. La goserelina se da a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,100,274, y se comercia como ZOLADEX. El abarelix se puede formular, por ejemplo, como se da a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,843,901. El término "inhibidor de topoisomerasa I", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, topotecano, gimatecano, irinotecano, camptotecina y sus análogos, 9-nitro-camptotecina, y el conjugado de camptotecina macromolecular PNU-166148 (compuesto A1 de la Publicación Internacional Número WO 99/17804). El irinotecano se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo bajo la marca comercial registrada CAMPTOSAR. El topotecano se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo bajo la marca comercial registrada HYCAMTIN . El término "inhibidor de topoisomerasa M" como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, las antraciclinas, tales como doxorrubicina, incluyendo la formulación liposomal, por ejemplo CAELYX, daunorrubicina, incluyendo la formulación liposomal, por ejemplo DAUNOSOME, epirrubicina, idarrubicina, y nemorrubicina; las antraquinonas mitoxantrona y losoxantrona; y las podofilotoxinas etoposida y teniposida. La etoposida se comercia como ETOPOPHOS; la teniposida como VM 26-BRISTOL; la doxorrubicina como ADRIBLASTIN o ADRIAMYCI N ; la epirrubicina como FARMORUBICIN; la idarrubicina como ZAVEDOS; y la mitoxantrona como NOVANTRON. El término "agente activo en microtúbulos", como se utiliza en la presente , se refiere a los agentes estabilizantes de microtúbulos, desestabilizantes de microtúbulos, y a los inhibidores de la polimerización de microtubulina, incluyendo, pero no limitándose a, taxanos, por ejemplo paclitaxel y docetaxel; alcaloides vinca, por ejemplo vinblastina, en especial sulfato de vinblastina, vincristina, en especial sulfato de vincristina, y vinorelbina; discodermolidas; colquicina y epotilona y derivados de las mismas, por ejemplo epotilona B o un derivado de la misma. El paclitaxel se comercia como TAXOL; el docetaxel como TAXOTERE; el sulfato de vinblastina como VI N BLASTI N RP; y el sulfato de vincristina como FARMISTI N . También se incluyen las formas genéricas de paclitaxel , así como diferentes formas de dosificación de paclitaxel . Las formas genéricas de paclitaxel incluyen, pero no se limitan a, clorhidrato de betaxolol. Diferentes formas de dosificación de paclitaxel incluyen, pero no se limitan a, paclitaxel en nanopartículas de albúmina comerciado como ABRAXANE; ONXOL, CYTOTAX. La discodermolida se puede obtener, por ejemplo, como se da a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,01 0,099. También se incluyen los derivados de epotilona, los cuales se dan a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6, 1 94, 1 81 , y en las Publicaciones Internacionales N úmeros WO 98/101 21 , WO 98/25929, WO 98/08849, WO 99/43653, WO 98/22461 y WO 00/31 247. Se prefieren en especial epotilona A y/o B. El término "agente alquilante", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalano, o nitrosourea (BCN U ó Gliadel), o temozolamida (TEMODAR) . La ciclofosfamida se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo bajo la marca comercial registrada CYCLOSTIN ; y la ifosfamida como HOLOXAN . El término "anti-metabolito anti-neoplásico" incluye, pero no se limita a, 5-fluoro-uracilo (5-FU); capecitabina; gemcitabina; agentes desmetilantes de ADN , tales como 5-azacitidina y decitabina; metotrexato; edatrexato; y antagonistas de ácido fólico, tales como, pero no limitándose a, pemetrexed. La capecitabina se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo bajo la marca comercial registrada XELODA; y la gemcitabina como GEMZAR. El término "compuesto de platina", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, carboplatina, cisplatina, cisplatino, oxaliplatina, Satraplatina, y agentes de platino, tales como ZD0473. La carboplatina se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo CARBOPLAT; y la oxaliplatina como ELOXATIN. El término "compuestos que dirigen/reducen la actividad de cinasa de proteína o de lípido; o una actividad de fosfatasa de proteína o de lípido; u otros compuestos anti-angiogénicos", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, inhibidores de cinasa de proteína tirosina y/o de cinasa de serina y/o treonina, o inhibidores de cinasa de lípido, por ejemplo: i) compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de los receptores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), tales como los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de VEGF, en especial los compuestos que inhiben al receptor de VEGF, tales como, pero no limitándose a, derivados de 7H-pirrolo-[2,3-d]-pirimidina (AEE788); BAY 43-9006; compuestos de isolcolina dados a conocer en la Publicación Internacional Número WO 00/09495, tales como (4-terbutil-fenil)-94-il-metil-isoquinolin-1-il)-amina (AAL881); y ii) compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de los receptores del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), tales como los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad del PDGFR, en especial los compuestos que inhiben al receptor de PDGF, por ejemplo un derivado de N-fenil-2-pirimidin-amina, por ejemplo imatinib, SU101, SU6668, y GFB-111; iii) compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR); iv) compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad del receptor del factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF-1R), tales como los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de IGF-1R, en especial los compuestos que inhiben al receptor de IGF-1 R. Los compuestos incluyen, pero no se limitan a, los compuestos que se dan a conocer en la Publicación Internacional Número WO 02/092599, y los derivados de los mismos de 4-amino-5-fenil-7-ciclobutil-pirrolo-[2,3-d]-pirimidina (AEW541); v) compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de la familia de cinasa de tirosina receptora Trk; vi) compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de la familia de cinasa de tirosina receptora Axl; vii) compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad del receptor c-Met; viii) compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de la cinasa de tirosina receptora Ret; ix) compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de la cinasa de tirosina receptora Kit/SCFR; x) compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de las cinasas de tirosina receptoras C-kit (parte de la familia PDGFR), tales como los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de la familia de cinasa de tirosina receptora C-kit, en especial los compuestos que inhiben al receptor C-kit, por ejemplo imatinib; xi) compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de los miembros de la familia c-Abl, y sus productos de fusión genética, por ejemplo la cinasa BCR-Abl, tales como los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de los miembros de la familia c-Abl y sus productos de fusión genética, por ejemplo, un derivado de N-fenil-2-pirimidin-amina, por ejemplo imatinib, PD180970, AG957, NSC 680410 ó PD173955 de ParkeDavis; BMS354825; xii) compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de los miembros de la cinasa C de proteína (PKC) y de la familia Raf de cinasas de serina/treonina, los miembros de la familia MEK, SRC, JAK, FAK, PDK y Ras/MAPK, ola familia de cinasa Pl(3), o de la familia de cinasa relacionada con cinasa Pl(3), y/o los miembros de la familia de cinasa dependiente de ciclina (CDK), y son en especial los derivados de estaurosporina que se dan a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,093,330, por ejemplo midostaurina; los ejemplos de otros compuestos incluyen, por ejemplo, UCN-01; safingol; BAY 43-9006; Briostatina 1; Perifosina; llmofosina; RO 318220 y RO 320432; GO 6976; Isis 3521; LY333531 /LY3791 96; compuestos de isoquinolina, tales como los que se dan a conocer en la Publicación Internacional Número WO 00/09495; FTIs; PD 1 84352 o QAN697, a un inhibidor de P 1 3K; xiii) compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de la cinasa de proteína tirosina, tales como mesilato de imatinib (GLEEVEC) ; ti rfostina, o piridil-amino-benzamida y sus derivados (AMN 107) . Una tirfostina es de preferencia un compuesto de bajo peso molecular (Mr < 1 500), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en especial un compuesto seleccionado a partir de la clase de benciliden-malonitrilo, o de la clase de compuestos de S-aril-bencen-malonitrilo o bisustrato quinolina, más especialmente cualquier compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste en Tirfostina A23/RG-50810, AG 99, Tirfostina AG 213, Tirfostina AG 1 748, Tirfostina AG 490, Tirfostina B44, enantiómero (+) de Tirfostina B44, Tirfostina AG 555, AG 494, Tirfostina AG 556; AG957 y adafostina (adamantil-éster del ácido 4-{[(2,5-dihidroxi-fenil)-metil]-aminoj-benzoico, NSC 680410, adafostina); xiv) compuestos que dirigen , reducen, o inhiben la actividad de la familia de cinasas de tirosina receptoras del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4 como homo- o hetero-dímeros) , tales como los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico, que son en especial los compuestos, proteínas, o anticuerpos que inhiben a los miembros de la familia de cinasa de tirosina receptora de EGF, por ejemplo el receptor de EGF, ErbB2, ErbB3, y ErbB4, o que se enlazan con EGF o con ligandos relacionados con EGF, y son en particular los compuestos, proteínas, o anticuerpos monoclonales genérica y específicamente dados a conocer en la Publicación I nternacional Número WO 97/02266, por ejemplo el compuesto del Ejemplo 39, o en las Patentes Números EP 0 564 409, WO 99/03854, EP 0520722, EP 0 566 226, EP 0 787 722, EP 0 837 063, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,747,498, WO 98/1 0767, WO 97/30034, WO 97/49688, WO 97/38983, y en especial en la Publicación Internacional N úmero WO 96/30347, por ejemplo el compuesto conocido como CP 358774, en la Publicación Internacional Número WO 96/33980, por ejemplo el compuesto ZD 1 839; y en la Publicación Internacional N úmero WO 95/03283, por ejemplo el compuesto ZM 1051 80, por ejemplo trastuzumab (H ERCEPTI N®) , cetuximab, I ressa, OS I-774, Cl 1 033, EKB-569, GW-201 6, E1 .1 , E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.1 1 , E6.3, ó E7.6.3, y los derivados de 7H-pirrolo-[2,3-d]-pirimidina, los cuales se dan a conocer en la Publicación Internacional Número WO 03/01 3541 , erlotinib y gefitinib. El erlotinib se puede administrar en la forma como se comercia, por ejemplo TARCEVA, y el gefitinib como I RESSA, y los anticuerpos monoclonales humanos contra el receptor de factor de crecimiento epidérmico, incluyendo ABX-EGFR; y xv) compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad/función de la cinasa mTOR de serina/treonina, que son en especial los compuestos, proteínas, o anticuerpos que dirigen/inhiben a los miembros de la familia de cinasa mTOR, por ejemplo RAD, RAD001 , CC I-779, ABT578, SAR543, rapamicina y sus derivados/análogos , AP23573 y AP23841 de Ariad, everolimus (CERTICAN) y sirolimus. CERTICAN (everolimus, RAD) , un inhibidor de la señal de proliferación novedoso de investigación, que previene la proliferación de las células-T y de las células del músculo liso vascular. Cuando se hace referencia a un anticuerpo, se debe incluir a los anticuerpos monoclonales intactos, nanocuerpos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos formados a partir de cuando menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada. La frase "compuesto que dirige, reduce, o inhibe la actividad de una fosfatasa de proteína o de lípido", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, los inhibidores de fosfatasa 1 , fosfatasa 2A, PTEN ó CDC25, por ejemplo ácido ocadaico o un derivado del mismo. El término "anticuerpos monoclonales" , como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, bevacizumab, cetuximab, trastuzumab, Ibritumomab-tiuxetano, denosumab, anti-CD40, anti-GM-CSF, y tositumomab, y yodo I 131 . El bevacizumab se puede administrar en la forma como se comercia, por ejemplo AVASTI N ; el cetuximab como ERBITUX; el trastuzumab como HERCEPTI N ; el Rituximab como MABTHERA; el Ibritumomab-tiuxetano como ZEVULI N ; anti-RANKL como denosumab (AMG 1 62) , anti-CD40 como HCD122 (Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 2002-0106371), y tositumomab y yodo I 131 como BEXXAR. La frase "compuestos anti-angiogénicos adicionales" incluye, pero no se limita a, compuestos que tengan otro mecanismo para su actividad, por ejemplo, no relacionado con la inhibición de la cinasa de proteína o de lípido, por ejemplo talidomida (THALOMID), y TNP- 470. La frase "compuestos que inducen los procesos de diferenciación celular", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, ácido retinoico, a-, y-, ó d-tocoferol, ó a-, y-, ó d-tocotrienol. El término "inhibidor de ciclo-oxigenasa", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, por ejemplo, inhibidores de COX-2, ácido 2-aril-amino-fenil-acético sustituido por 5-alquilo y sus derivados, tales como celecoxib (CELEBREX), rofecoxib (VIOXX), etoricoxib, valdecoxib, o un ácido 5-alquil-2-aril-amino-fenil-acético, por ejemplo ácido 5-metil-2-(2'-cloro-6'-fluoro-anilino)-fenil-acético, lumiracoxib. El término "bisfosfonatos", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, ácido etridónico, clodrónico, tiludrónico, pamidrónico, alendrónico, ibandrónico, risedrónico, y zoledrónico. El "ácido etridónico" se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo DIDRONEL; el "ácido clodrónico" como BONEFOS; el "ácido tiludrónico" como SKELID; el "ácido pamidrónico" como AREDIA; el "ácido alendrónico" como FOSAMAX; el "ácido ibandrónico" como BONDRANAT; el "ácido risedrónico" como ACTONEL; y el "ácido zoledrónico" como ZOMETA. El término "inhibidor de heparanasa", como se utiliza en la presente, se refiere a los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la degradación del sulfato de heparina. El término incluye, pero no se limita a, PI88. El término "modificador de la respuesta biológica", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, linfosina o interferones, por ejemplo interferón y. El término "inhibidor de las isoformas oncogénicas Ras", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, H-Ras, K-Ras, ó N-Ras, como se utilizan en la presente, y se refiere a los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad oncogénica de Ras, por ejemplo un inhibidor de farnesil-transferasa (FTI), por ejemplo L-744832, DK8G557 ó R115777 (ZARNESTRA). El término "inhibidor de telomerasa", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de la telomerasa. Los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de la telomerasa son en especial los compuestos que inhiben al receptor de telomerasa, por ejemplo telomestatina. El término "inhibidor de la metaloproteinasa de matriz" o (inhibidor de MMP), como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, inhibidores peptidomiméticos y no peptidomiméticos de colágeno; derivados de tetraciclina, por ejemplo el inhibidor peptidomimético de hidroxamato, batimastato; y su análogo oralmente biodisponible, marimastato (BB-2516), prinomastato (AG3340), metastato (NSC 683551) BMS 279251, BAY 12-9566, TAA211, MMI270B ó AAJ996. El término "inhibidor de amino-peptidasa de metionina", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de la amino-peptidasa de metionína. Los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de la amino-peptidasa de metionina son, por ejemplo, bengamida o un derivado de la misma. El término "inhibidores de proteasoma", como se utiliza en la presente, incluye los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad del proteasoma. Los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad del proteasoma incluyen, pero no se limitan a, PS-341; MLN 341. bortezomib o Velcade. La frase "agente utilizado en el tratamiento de malignidades hematológicas", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, inhibidores de cinasa de tirosina tipo FMS, por ejemplo los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de los receptores de cinasa de tirosina tipo FMS (Flt-3R); interferón, 1-b-D-arabino-furanosil-citosina (ara-c), y bisulfano; e inhibidores de ALK, por ejemplo los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la cinasa de linfoma anaplásico. La frase "compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de Flt-3", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, los compuestos, proteínas, o anticuerpos que inhiben Flt-3, por ejemplo N-benzoil-estaurosporina, midostaurina, un derivado de estaurosporina, SU11248 y MLN518. El término "inhibidores de HSP90", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad intrínseca de la ATPasa de HSP90; que degradan, dirigen, reducen, o inhiben las proteínas clientes de HSP90 por medio de la senda de proteasoma de ubiquitina. Los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad intrínseca de ATPasa de HSP90 son en especial los compuestos, proteínas, o anticuerpos que inhiben la actividad de ATPasa de HSP90, por ejemplo, 17-alil-amino-17-desmetoxi-geldanamicina (17AAG), un derivado de geldanamicina; otros compuestos relacionados con geldanamicina; radicicol, e inhibidores de HDAC. El término "un anticuerpo anti-proliferativo", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, trastuzumab (HERCEPTIN), trastuzumab-DM1, erlotinib (TARCEVA), bevacizumab (AVASTIN), rituximab (RITUXAN), PR064553 (anti-CD40), y anticuerpo 2C4. Anticuerpos significa, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos formados a partir de cuando menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada. El término "inhibidor de HDAC", como se utiliza en la presente, se refiere a los compuestos que inhiben la desacetilasa de histona, y que poseen una actividad anti-proliferativa. Esto incluye, pero no se limita a, los compuestos que se dan a conocer en la Publicación Internacional Número WO 02/22577, en especial N-hidroxi-3-[4-[[(2-hidroxi-etil)-[2-(1H-indol-3-il)-etil]-amino]-metil]-fenil]-2E-2-propenamida, y N-hidroxi-3-[4-[[[2-(2-metil-1 H-indol-3-il)-etil]-amino]-metil]-fenil]-2E-2-propenamida, y las sales farmacéuticamente aceptables de las mismas (LBH589). Además incluye en especial el ácido hidroxámico de suberoil-anilida (SAHA); el piridin-3-il-metil-éster del ácido [4-(2-amino-fenil-carbamoil)-bencil]-carbámico y sus derivados; ácido butírico; piroxamida, tricostatina A, Oxamflatína, apicidina, depsipéptido; depudecina, y trapoxina. La frase "compuesto que dirige, reduce, o inhibe la actividad/función de la cinasa mTOR de serina/treonina", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, los compuestos, proteínas, o anticuerpos que dirigen/inhiben a los miembros de la familia de cinasa mTOR, por ejemplo RAD, RAD001, CCI-779, ABT578, SAR543, rapamicina y sus derivados/análogos, AP23573 y AP23841 de Ariad, everolimus (CERTICAN), y sirolimus (RAPAMUNE), CCI-779 y ABT578. CERTICAN (everolimus, RAD), un inhibidor de la señal de proliferación novedoso de investigación que previene la proliferación de las células-T y de las células de músculo liso vascular. El término "antagonista del receptor de somatostatina", como se utiliza en la presente, incluye, pero no sé limita a, los agentes que dirigen, tratan, o inhiben al receptor de somatostatina, tales como octreorida y SOM230. El término "compuesto anti-leucémico", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, Ara-C, un análogo de pirimidina, que es el derivado de 2'-a-hidroxi-ribosa (arabinosida) de la desoxicitidina. También se incluye el análogo de purina de la hipoxantina, 6-mercapto-purina (6-MP) , y fosfato de fludarabina. La frase "planteamientos que dañan las células tumorales", se refiere a los planteamientos, tales como radiación ionizante. El término "radiación ionizante", referido anteriormente y más adelante en la presente, significa la radiación ionizante que se presenta ya sea como rayos electromagnéticos, tales como rayos-X y rayos gamma; o partículas, tales como partículas alfa, beta, y gamma. La radiación ionizante se proporciona en , pero no se limita a, terapia de radiación, y se conoce en este campo. Véase Hellman , Cáncer, 4a Edición, Volumen 1 , Devita y colaboradores, Editores, páginas 248-275 ( 1 993). El término "enlazador de EDG", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, una clase de inmunosupresores que modula la recirculación de linfocitos, tales como FTY720. El término "inhibidor de reductasa de ribonucleótido", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, análogos de nucleósidos de pirimidina o purina, incluyendo, pero no limitándose a, fludaravina y/o ara-C; 6-tioguanina; 5-FU ; cladribina; 6-mercapto-purina, en especial en combinación con ara-C contra la leucemia linfocítica aguda; y/o pentostatina. Los inhibidores de reductasa de ribonucleótido son en especial hidroxi-urea o derivados de 2-hidroxi-1H-isoindol-1,3-diona, tales como PL-1, PL-2, PL-3, PL-4, PL-5, PL-6, PL-7, ó PL 8. Véase Nandy y colaboradores, Acta Oncológica, Volumen 33, Número 8, páginas 953-961 (1994). El término "descarboxilasa de S-adenosil-metionina", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, los compuestos que se dan a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,461,076. La frase "anticuerpos monoclonales de VEGF ó VEGFR", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, los compuestos que se dan a conocer en la Publicación Internacional Número WO 98/35958, por ejemplo, 1 -(4-cloro-anilino)-4-(4-piridil-metil)-ftalazina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, por ejemplo el succinato, o en las Patentes Números WO 00/09495, WO 00/27820, WO 00/59509, WO 98/11223, WO 00/27819 y EP 0769947; aquéllos descritos por Prewett y colaboradores, Cáncer Res, Volumen 59, páginas 5209-5218 (1999); Yuan y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, Volumen 93, páginas 14765-14770 (1996); Zhu y colaboradores, Cáncer Res, Volumen 58, páginas 3209-3214 (1998); y Mordenti y colaboradores, Toxicol Pathol, Volumen 27, Número 1, páginas 14-21 (1999), en las Publicaciones Internacionales Números 00/37502 y WO 94/10202; ANGIOSTATINA, descrita por O'Reilly y colaboradores, Cell, Volumen 79, páginas 315-328 (1994); ENDOSTATINA, descrita por O'Reilly y colaboradores, Cell, Volumen 88, páginas 277-285 ( 1 997) ; amidas del ácido antran ílico; ZD41 90; ZD6474; SU5416; SU6668; bevacizumab; o anticuerpos anti-VEGF o anticuerpos anti-receptor de VEGF, por ejemplo rhuMAb y RH UFab; aptámero de VEGF, por ejemplo Macugon; inhibidores de FLT-4; inhibidores de FLT-3; anticuerpo de lgG 1 de VEGFR-2; Angiozima ( RPI 4610); y Avastan. El término "terapia fotodinámica", como se utiliza en la presente, se refiere a la terapia que utiliza ciertos productos químicos conocidos como agentes fotosensibilizantes, para tratar o prevenir cánceres. Los ejemplos de la terapia fotodinámica incluyen, pero no se limitan a, el tratamiento con agentes, tales como VISUDYNE, y porfímero-sodio. El término "esteroide angiostático", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, agentes que bloquean o inhiben la angiogénesis, tales como, por ejemplo, anecortave, triamcinolona, hidrocortisona, 1 1 -a-epihidrocortisol , cortexolona, 1 7a- hidroxi- progesterona, corticosterona, desoxi-corticosterona, testosterona, estrona, y dexametasona. La frase "implante que contiene corticosteroides", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a los agentes tales como, por ejemplo, fluocinolona y dexametasona. El término "antagonista del receptor AT1 ", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, agentes tales como DIOVAN . El término "inhibidor de ACE", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, CIBACEN , benazepril , enazepril (LOTENSI N), captopril, enalapril , fosinopril, lisinopril, moexipril, quinapril, ramipril, perindopril , y trandolapril . Otros agentes farmacéuticamente activos incluyen, pero no se limitan a, alcaloides de plantas, agentes y antagonistas hormonales, modificaciones de la respuesta biológica, de preferencia linfocinas o interferones, oligonucleótidos anti-sentido o derivados de oligonucleótidos; o agentes varios, o agentes con otros mecanismos de acción desconocidos. En cada caso en donde se den citas de solicitudes de patente o de publicaciones científicas, en particular con respecto a las reivindicaciones del compuesto respectivo y a los productos finales de los ejemplos de procesamiento de las mismas, el asunto objeto de los productos finales, las preparaciones farmacéuticas, y las reivindicaciones, se incorporan a la presente solicitud como referencia a estas publicaciones. De la misma manera están comprendidos los estereoisómeros correspondientes, así como las modificaciones de cristal correspondientes, por ejemplo solvatos y polimorfos, que se dan a conocer en las mismas. Los compuestos utilizados como ingredientes activos en las combinaciones que se dan a conocer en la presente, se pueden preparar y administrar como se describe en los documentos citados, respectivamente. La estructura de los agentes activos identificados por números de código, nombres genéricos o comerciales, se puede tomar de la edición actual del compendio estándar "The Merck Index", o de las bases de datos, por ejemplo Patents International, por ejemplo IMS World Publications, o de las publicaciones mencionadas anteriormente y más adelante. El contenido correspondiente de las mismas se incorpora a la presente como referencia. Se entenderá que las referencias a los componentes (a) y (b) pretenden incluir también las sales farmacéuticamente aceptables de cualquiera de las sustancias activas. Si las sustancias activas comprendidas por los componentes (a) y/o (b) tienen, por ejemplo, cuando menos un centro básico, pueden formar sales de adición de ácido. También se pueden formar las sales de adición de ácido correspondientes que tengan, si se desea, un centro básico adicionalmente presente. Las sustancias activas que tengan un grupo ácido, por ejemplo COOH, pueden formar sales con bases. Las sustancias activas comprendidas en los componentes (a) y/o (b), o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, también se pueden utilizar en la forma de un hidrato, o pueden incluir a otros solventes utilizados para la cristalización. Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para la prevención o el tratamiento de enfermedades proliferativas, o enfermedades que sean desencadenadas por una angiogénesis persistente en un mamífero, de preferencia en un paciente humano, el cual comprende tratar al paciente de una manera concurrente o en secuencia con cantidades farmacéuticamente efectivas de una combinación de: (a) una composición anti-DKK1/4 neutralizante; y (b) un agente farmacéuticamente activo.

En una modalidad preferida, la presente invención proporciona una preparación farmacéutica que comprende: (a) una composición anti-DKK1 /4 neutralizante; y (b) uno o más agentes farmacéuticamente activos seleccionados a partir del grupo que consiste en un inhibidor de aromatasa; un anti-estrógeno; un anti-andrógeno; un agonista de gonadorelina; un inhibidor de topoisomerasa I ; un inhibidor de topoisomerasa I I ; un agente activo en microtúbulos; un agente alquilante; un anti-metabolito anti-neoplásico; un compuesto de platina; un compuesto que dirige/reduce una actividad de cinasa de proteína o de l ípido, o una actividad de fosfatasa de proteína o de lípido; un compuesto anti-angiogénico; un compuesto que induce los procesos de diferenciación celular; anticuerpos monoclonales; un inhibidor de ciclo-oxigenasa; un bisfosfonato; un inhibidor de heparanasa; un modificador de la respuesta biológica; un inhibidor de las isoformas oncogénicas Ras; un inhibidor de telomerasa; un inhibidor de proteasa; un inhibidor de metaloproteinasa de matriz; un inhibidor de amino-peptidasa de metionina; un inhibidor de proteasoma; agentes que dirigen , reducen, o inhiben la actividad de Flt-3; un inhibidor de HSP90; anticuerpos anti-proliferativos; un inhibidor de HDAC; un compuesto que dirige, reduce, o inhibe la actividad/función de la cinasa mTOR de serina/treonina; un antagonista del receptor de somatostatina; un compuesto antileucémico; planteamientos que dañan las células tumorales; un enlazador de EDG: un inhibidor de reductasa de ribonucleótido; un inhibidor de descarboxilasa de S-adenosil-metionina; un anticuerpo monoclonal de VEGF ó VEGFR; terapia fotodinámica; un esteroide angiostático; un implante que contiene corticosteroides; un antagonista del receptor AT1 ; y un inhibidor de ACE . Cualquiera de la combinación de los componentes (a) y (b) , el método para el tratamiento de un animal de sangre caliente que comprende administrar estos dos componentes, una composición farmacéutica que comprende estos dos componentes para su uso simultáneo, separado, o en secuencia, el uso de la combinación para la demora del progreso o el tratamiento de una enfermedad proliferativa o para la fabricación de una preparación farmacéutica para estos propósitos, o un producto comercial que comprende esta combinación de los componentes (a) y (b), todos como se mencionan o se definen anteriormente, serán referidos subsiguientemente también como la combinación de la invención. De tal manera que este término se refiere a cada una de estas modalidades (que por lo tanto, pueden reemplazar a este término donde sea apropiado) . Por ejemplo, la administración simultánea puede tener lugar en la forma de una combinación fija con dos o más ingredientes activos, o mediante la administración simultánea de dos o más ingredientes activos que se formulen de una manera independiente. El uso en secuencia (administración) de preferencia significa la administración de uno (o más) componentes de una combinación en un punto del tiempo, otros componentes en un punto del tiempo diferente, es decir de una manera crónicamente escalonada, de preferencia de tal manera que la combinación muestre más eficiencia que los compuestos individuales administrados de una manera independiente (en especial, que muestre sinergismo) . El uso (administración) separado de preferencia significa la administración de los componentes de la combinación independientemente unos de otros en diferentes puntos del tiempo, significando de preferencia que los componentes (a) y (b) se administran de tal manera que no hay ningún traslape presente de niveles en sangre mensurables de ambos compuestos de una manera traslapada (al mismo tiempo) . También son posibles las combinaciones de dos o más administraciones en secuencia, separadas, y simultáneas, de preferencia de tal manera que los fármacos componentes de la combinación muestren un efecto terapéutico conjunto que exceda al efecto que se encuentra cuando los fármacos componentes de la combinación se utilicen independientemente a intervalos de tiempo tan grandes que no se pueda encontrar un efecto mutuo sobre su eficiencia terapéutica, prefiriéndose en especial un efecto sinérgico.

El término "demora de progreso", como se utiliza en la presente, significa la administración de la combinación a los pacientes que están en una etapa previa o en una primera fase, de la primera manifestación o una recurrencia de la enfermedad que se vaya a tratar, en cuyos pacientes, por ejemplo, se diagnostique una pre-forma de la enfermedad correspondiente, o cuyos pacientes estén en una condición, por ejemplo, durante un tratamiento médico, o una condición resultante de un accidente, bajo la cual sea probable que se desarrolle una enfermedad correspondiente. "Conjuntamente activos terapéuticamente" o "efecto terapéutico conjunto", significa que los compuestos se pueden dar por separado (de una manera crónicamente escalonada, en especial de una manera específica en secuencia) , a intervalos de tiempo tales que de preferencia, en el animal de sangre caliente, en especial en el ser humano, que se vaya a tratar, todavía muestren una interacción (de preferencia sinérgica) (efecto terapéutico conjunto). El que éste sea el caso se puede determinar, entre otras cosas, siguiendo los niveles en sangre, mostrando que ambos compuestos están presentes en la sangre del ser humano que se vaya a tratar cuando menos durante ciertos intervalos de tiempo. "Farmacéuticamente efectiva" de preferencia se refiere a una cantidad que es terapéuticamente, o en un sentido más amplio, también profilácticamente efectiva contra el progreso de una enfermedad proliferativa. El término "un paquete comercial" o "un producto", como se utiliza en la presente, define en especial un "kit de partes", en el sentido de que los componentes (a) y (b), como se definen anteriormente, se pueden dosificar de una manera independiente, o mediante el uso de diferentes combinaciones fijas con cantidades distinguidas de los componentes (a) y (b) , es decir, de una manera simultánea o en diferentes puntos del tiempo. Más aún, estos términos comprenden un paquete comercial que comprende (en especial que combina), como ingredientes activos, los componentes (a) y (b) , junto con instrucciones para el uso simultáneo, en secuencia (crónicamente escalonados, en una secuencia específica en el tiempo, preferencialmente), o (menos preferiblemente) separado de los mismos, en la demora del progreso o el tratamiento de una enfermedad proliferativa. Las partes del kit de partes, por ejemplo, se pueden administrar entonces de una manera simultánea o cronológicamente escalonada, es decir, en diferentes puntos del tiempo y con intervalos de tiempo iguales o diferentes para cualquier parte del kit de partes. De una manera muy preferible, los intervalos de tiempo se seleccionan de tal manera que el efecto sobre la enfermedad tratada en el uso combinado de las partes, sea mayor que el efecto que se obtendría mediante el uso de solamente cualquiera de los componentes de combinación (a) y (b) (como pueda ser determinado de acuerdo con los métodos convencionales) . La proporción de las cantidades totales del componente de combinación (a) al componente de combinación (b) que se vayan a administrar en la preparación combinada, se puede variar, por ejemplo, con el objeto de tratar con las necesidades de una sub-población de pacientes que se vaya a tratar, o con las necesidades del paciente individual, cuyas diferentes necesidades se pueden deber a la enfermedad particular, la edad, el sexo, el peso corporal , etc. , de los pacientes. De una manera preferible, hay cuando menos un efecto benéfico, por ejemplo una mejora mutua del efecto de los componentes de combinación (a) y (b) , en particular un efecto más que aditivo, que, por consiguiente, se podría lograr con dosis más bajas de cada uno de los fármacos combinados, respectivamente, de lo que sea tolerable en el caso del tratamiento con los fármacos individuales solamente sin combinación , produciendo efectos convenientes adicionales, por ejemplo menos efectos secundarios, o un efecto terapéutico combinado en una dosificación no efectiva de uno o ambos de los componentes de combinación (componentes (a) y (b)) , y muy preferiblemente, un fuerte sinergismo de los componentes de combinación (a) y (b) . Tanto en el caso del uso de la combinación de los componentes (a) y (b), como del paquete comercial, también es posible cualquier combinación de uso simultáneo, en secuencia, y separado, significando que los componentes (a) y (b) se pueden administrar en un punto del tiempo de una manera simultánea, seguidos por la administración de solamente un componente con una toxicidad más baja para el huésped, ya sea crónicamente, por ejemplo más de 3 a 4 semanas de dosificación diaria, en un punto del tiempo posterior, y subsiguientemente el otro componente o la combinación de ambos componentes en un punto del tiempo todavía posterior (en los siguientes cursos de tratamiento de la combinación de fármacos para un efecto anti-tumoral óptimo) , o similares. La COMBI NACIÓN DE LA INVENCIÓN también se puede aplicar en combinación con otros tratamientos, por ejemplo intervención quirúrgica, hipertermia, y/o terapia de i rradiación. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por medios convencionales, y son aquéllas adecuadas para administración enteral, tal como oral o rectal , y parenteral a mamíferos, incluyendo el hombre, comprendiendo una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de VEGF, y cuando menos un agente farmacéuticamente activo solo o en combinación con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, en especial aquéllos adecuados para aplicación enteral o parenteral. Las composiciones farmacéuticas comprenden de aproximadamente el 0.00002 a aproximadamente el 100 por ciento, en especial, por ejemplo, en el caso de las diluciones para infusión que están listas para usarse, del 0.0001 al 0.02 por ciento, o, por ejemplo, en el caso de concentrados para inyección o infusión, o especialmente en formulaciones parenterales, de aproximadamente el 0.1 por ciento a aproximadamente el 95 por ciento, de preferencia de aproximadamente el 1 por ciento a aproximadamente el 90 por ciento, más preferiblemente de aproximadamente el 20 por ciento a aproximadamente el 60 por ciento de ingrediente activo (peso por peso, en cada caso). Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención, por ejemplo, pueden estar en una forma de dosis unitaria, tal como en la forma de ampolletas, frascos, grageas, tabletas, bolsas para infusión , o cápsulas. La dosificación efectiva de cada uno de los componentes de combinación empleados en una formulación de la presente invención, puede variar dependiendo del compuesto o composición farmacéutica particular empleada, del modo de administración, de la condición que se esté tratando, y de la severidad de la condición que se esté tratando. Un médico, clínico, o veterinario de una experiencia ordinaria, puede determinar fácilmente la cantidad efectiva de cada uno de los ingredientes activos, necesaria para prevenir, tratar, o inhibir el progreso de la condición . Las tirfostinas, en especial la Adafostina, de preferencia se administran a un animal de sangre caliente, en especial a un ser humano, en una dosificación en el intervalo de aproximadamente 1 a 6,000 miligramos/día, más preferiblemente de 25 a 5,000 miligramos/día, y de una manera muy preferible de 50 a 4,000 miligramos/día. A menos que se informe de otra manera en la presente, el compuesto de preferencia se administra de 1 a 5, especial de 1 a 4 veces al día. Las preparaciones farmacéuticas para la terapia de combinación para administración enteral o parenteral, por ejemplo, son aquéllas que están en formas de dosificación unitaria, tales como tabletas recubiertas con azúcar, cápsulas, o supositorios, y además ampolletas. Si no se indica de otra manera, estas formulaciones se preparan por medios convencionales, por ejemplo por medio de los procesos convencionales de mezcla, granulación, recubrimiento con azúcar, disolución, o liofilización. Se apreciará que el contenido unitario de un componente de combinación contenido en una dosis individual de cada forma de dosificación no necesita constituir por sí mismo una cantidad efectiva, debido a que se puede alcanzar la cantidad efectiva necesaria mediante la administración de una pluralidad de unidades de dosificación. Un experto en la materia tiene la capacidad para determinar las cantidades farmacéuticamente efectivas apropiadas de los componentes de la combinación . De preferencia, los compuestos o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos se administran como una formulación farmacéutica oral en la forma de una tableta, cápsula, o jarabe; o como inyecciones parenterales, si es apropiado. En la preparación de las composiciones para administración oral, se puede emplear cualquier medio farmacéuticamente aceptable, tal como agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes saborizantes, conservadores, agentes colorantes. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen almidones, azúcares, celulosas microcristalinas, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglutinantes , agentes desintegrantes. Las soluciones del ingrediente activo, y también las suspensiones, y en especial las soluciones o suspensiones acuosas isotónicas, son útiles para la administración parenteral del ingrediente activo, siendo posible, por ejemplo, en el caso de las composiciones liofilizadas, que comprendan al ingrediente activo solo o junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo manitol, para que se produzcan estas soluciones o suspensiones antes de usarse. Las composiciones farmacéuticas se pueden esterilizar y/o pueden comprender excipientes, por ejemplo conservadores, estabilizantes, agentes humectantes y/o emulsionantes, solubilizantes, sales para regular la presión osmótica y/o reguladores del pH, y se preparan de una manera conocida por sí misma, por ejemplo por medio de los procesos convencionales de disolución o liofilización. Las soluciones o suspensiones pueden comprender sustancias incrementadoras de la viscosidad, tales como carboxi-metil-celulosa de sodio, carboxi-metil-celulosa, dextrano, polivinil-pirrolidona, o gelatina. Las suspensiones en aceite comprenden, como el componente de aceite, los aceites vegetales, sintéticos, o semi-sintéticos acostumbrados para propósitos de inyección. El agente isotónico se puede seleccionar a partir de cualquiera de aquéllos conocidos en la técnica, por ejemplo manitol, dextrosa, glucosa, y cloruro de sodio. La formulación para infusión se puede diluir con el medio acuoso. La cantidad del medio acuoso empleado como diluyente, se selecciona de acuerdo con la concentración deseada del ingrediente activo en la solución para infusión. Las soluciones para infusión pueden contener otros excipientes comúnmente empleados en las formulaciones para administrarse intravenosamente, tales como antioxidantes. La presente invención se refiere además a "una preparación combinada", la cual, como se utiliza en la presente, define especialmente un "kit de partes", en el sentido de que los componentes de combinación (a) y (b), como se definen anteriormente, se pueden dosificar de una manera independiente, o mediante el uso de diferentes combinaciones fijas con cantidades distinguidas de los componentes de combinación (a) y (b) , es decir, de una manera simultánea o en diferentes puntos del tiempo. Las partes del kit de partes se pueden administrar entonces , por ejemplo, de una manera simultánea o cronológicamente escalonada, es decir, en diferentes puntos del tiempo y con intervalos de tiempo iguales o diferentes para cualquier parte del kit de partes. La proporción de las cantidades totales del componente de combinación (a) al componente de combinación (b) que se van a administrar en la preparación combinada, se puede variar, por ejemplo, con el objeto de tratar con las necesidades de una sub-población de pacientes que se vaya a tratar, o con las necesidades del paciente individual, basándose en la severidad de cualquiera de los efectos secundarios que experimente el paciente. Usos y métodos de la invención Los anticuerpos (e inmunoconjugados y moléculas biespecíficas) de la presente invención tienen utilidades de diagnóstico y terapéuticas in vitro e in vivo. Por ejemplo, estas moléculas se pueden administrar a las células en cultivo, por ejemplo in vitro o in vivo, o a un sujeto, por ejemplo, in vivo, para tratar, prevenir, o diagnosticar una variedad de trastornos. El término "sujeto", como se utiliza en la presente, pretende incluir a animales humanos y no humanos. Los animales no humanos incluyen todos los vertebrados, por ejemplo mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, reses, caballos, pollos, anfibios, y reptiles. Los métodos son particularmente adecuados para el tratamiento de pacientes humanos que tengan un trastorno asociado con la expresión de DKK1 . Cuando se administran los anticuerpos para DKK1 junto con otro agente, los dos se pueden administrar en cualquier orden o de una manera simultánea. En una modalidad, los anticuerpos (e inmunoconjugados y moléculas biespecíficas) de la invención, se pueden utilizar para detectar los niveles de DKK1 , o los niveles de células que contengan DKK1 . Esto se puede lograr, por ejemplo, poniendo en contacto una muestra (tal como una muestra in vitro) , y una muestra de control, con el anticuerpo anti-DKK1 , bajo condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo y DKK1 . Cualesquiera complejos formados entre el anticuerpo y DKK1 , se detectan y se comparan en la muestra y en el control. Como un ejemplo no limitante, se pueden llevar a cabo los métodos de detección convencionales que son bien conocidos en este campo, tales como, por ejemplo, ELISA, MALDI , y ensayos de citometría de flujo, utilizando las composiciones de la invención. De conformidad con lo anterior, en un aspecto, la invención proporciona además métodos para detectar la presencia de DKK1 (por ejemplo, antígeno de DKK1 humano) en una muestra, o para medir la cantidad de DKK1 , los cuales comprenden poner en contacto la muestra, y una muestra de control , con un anticuerpo de la invención, o una porción de enlace de antígeno del mismo, que se enlace específicamente con DKK1 , bajo condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo o una porción del mismo y DKK1 . Entonces se detecta la formación de un complejo, en donde una diferencia en la formación de un complejo entre la muestra comparada con la muestra de control indica la presencia de DKK1 en la muestra. También, dentro del alcance de la invención, están los kits que consisten en las composiciones (por ejemplo, anticuerpos, anticuerpos humanos, inmunoconjugados, y moléculas biespecíficas) de la invención, e instrucciones para su uso. El kit puede contener además cuando menos un reactivo adicional , o uno o más anticuerpos adicionales de la invención (por ejemplo, un anticuerpo que tenga una actividad complementaria que se enlace con un epítopo sobre el antígeno objetivo distinto del primer anticuerpo) . Los kits típicamente incluyen una marca que indique el uso pretendido del contenido del kit. El término "marca" incluye cualquier escrito, o material registrado suministrado sobre o con el kit, o que de otra manera acompañe al kit. Habiéndose descrito completamente la invención, se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos y reivindicaciones, que son ilustrativos y no pretenden ser adicionalmente limitantes. Los expertos en la materia reconocerán o podrán aseverar, empleando no más que la experimentación de rutina, numerosos equivalentes a los procedimientos específicos descritos en la presente. Estos equivalentes están dentro del alcance de la presente invención y de las reivindicaciones. El contenido de todas las referencias, incluyendo las patentes expedidas y las solicitudes de patente publicadas, citadas a través de toda esta solicitud, se incorpora a la presente como referencia. EJEMPLOS Ejemplo 1: Generación de anticuerpos específicos de DKK1 humana a partir de la biblioteca HuCAL GOLD®. Se generan anticuerpos terapéuticos contra la proteína DKK1 humana mediante la selección de clones que tengan altas afinidades de enlace, utilizando la fuente de las proteínas variantes de anticuerpos de una biblioteca de exhibición de fagos comercialmente disponible, la biblioteca MorphoSys HuCAL GOLD®. HuCAL GOLD® es una biblioteca de Fab (Knappik y colaboradores, 2000, J. Mol. Biol. 296:57-86; Krebs y colaboradores, 2001 J. Immunol. Methods 254:67-84; Rauchenberger y colaboradores, 2003 J. Biol. Mol. Chem. 278(40):38194-38205), en donde las seis regiones determinantes de complementariedad están diversificadas mediante la mutación apropiada, y que emplea la tecnología CysDisplay® para enlazar los fragmentos Fab con la superficie del fago (Publicación Internacional Número WO 01/05950, Lóhning 2001). Procedimientos Generales: Rescate de faqémidos. amplificación de fagos, y purificación La biblioteca HuCAL GOLD® se amplifica en un medio bacteriano rico estándar (2xYT) que contiene 34 microgramos/mililitro de cloranfenicol, y glucosa al 1 por ciento (2xYT-CG). Después de la infección de las células a una OD60onm de 0.5 con fagos auxiliares VSCM13 (incubando la mezcla de fagos y células durante 30 minutos a 37°C sin agitación, seguidos por 30 minutos a 37°C agitando a 250 revoluciones por minuto) , las células se centrifugan (4, 1 20 g; 5 minutos ; 4°C), se vuelven a suspender en 2xYT/34 microgramos/mililitro de cloranfenicol/50 microgramos/ mililitro de canamicina/I PTG 0.25 mM, y se cultivan durante la noche a 22°C. Al final de este período, las células se remueven mediante centrifugación, y los fagos se precipitan en PEG dos veces a partir del sobrenadante, se vuelven a suspender en suero regulado con fosfato/glicerol al 20 por ciento, y se almacenan a -80°C. La amplificación de fagos entre dos rondas de paneo se conduce como sigue: las células de la cepa TG1 de E. coli en la fase media-log se infectan con fagos y se eluyen en seguida de la selección con la proteína DKK1 , y se aplican sobre LB-ágar complementado con el 1 por ciento de glucosa y 34 microgramos/mililitro de cloranfenicol (placas de LB-CG) . Después de la incubación durante la noche de las placas a 30°C, se raspan las colonias bacterianas de la superficie de ágar, y se utilizan para inocular el caldo 2xYT-CG para obtener una OD6oonm de 0.5, y luego se agregan los fagos auxiliares VSCM1 3 para obtener una infección productiva como se describe anteriormente. Experi mentos previos para el paneo en solución utilizando perlas magnéticas Strep-Tacti n Se ha reportado que la Strep-tag I I tiene una baja afinidad para la matriz Strep-Tactin (KD de aproximadamente 1 µM de acuerdo con Voss y Skerra, 1 997, Protein Eng. 10:975-982) , y por consiguiente, se lleva a cabo un experimento previo para evaluar la idoneidad de utilizar perlas MagStrep recubiertas con Strep-Tactin para la captura del antígeno durante las selecciones de anticuerpos, y para evitar la pérdida del antígeno durante los paneos. Para este propósito, se incuban 8 miligramos de perlas MagStrep con 46 microgramos de DKK1 marcada con His-Strep durante 1 hora a temperatura ambiente, y la muestra se divide en cuatro tubos Eppendorf previamente bloqueados. Un tubo sirvió como el control positivo (sin lavarse) , y las otras tres muestras se lavan con diferentes astringencias de acuerdo con la sección de paneo del manual de HuCAL GOLD®. La detección del enlace de DKK1 marcada con His-Strep a las perlas MagStrep (perlas magnéticas recubiertas con Strep-Tactin obtenidas de IBA, Góttingen, Alemania) , se lleva a cabo en BioVeris, utilizando un anticuerpo de cabra anti-DKK1 , y un anticuerpo de detección anti-cabra marcado con rubidio. Como se muestra en la Figura 1 de la presente, no se puede detectar ninguna pérdida significativa de la DKK1 marcada con His-Strep a partir de las perlas recubiertas con Strep-Tactin cuando se comparan las perlas no lavadas con las perlas lavadas con diferentes astringencias de H uCAL®. Por consiguiente, parece que la DKK1 marcada con His-Strep es adecuada para utilizarse en los paneos en solución con las perlas magnéticas recubiertas con Strep-Tactin (perlas MagStrep).

Selección mediante paneo de anticuerpos específicos de DKK1 a partir de la biblioteca Para la selección de los anticuerpos que reconozcan la DKK1 humana, se aplican dos estrategias de paneo. En resumen, los fagos-anticuerpos HuCAL GOLD® se dividen en cuatro grupos que comprenden diferentes combinaciones de genes maestros VH (el grupo 1 contiene VH1/5 A K; el grupo 2 contiene VH3 ??¡ el grupo 3 contiene VH2/4/6 AK; y el grupo 4 contiene VH1 -6 A K) . Estos grupos se someten individualmente a dos rondas de paneo en solución de DKK1 marcada con His-Strep capturada sobre perlas magnéticas Strep-Tactin (perlas Mega Strep; IBA) , y para la tercera ronda de selección solamente, ya sea sobre DKK1 marcada con His-Strep capturada sobre perlas magnéticas Strep-Tactin, o bien sobre la proteína DKK1 humana marcada con APP capturada por perlas de estreptavidina (Dynabeads® M-280, Estreptavidina; Dynal) , con un anticuerpo anti-APP biotinilado. Con detalle, para el paneo en solución utilizando DKK1 marcada con His-Strep acoplada con perlas magnéticas Strep-Tactin, se aplica el siguiente protocolo: se preparan tubos previamente bloqueados (tubos Eppendorf de 1 .5 mililitros) mediante el tratamiento con 1 .5 mililitros de ChemiBLOCKER 2x diluido a 1 : 1 con suero regulado con fosfato durante la noche a 4°C. Se preparan perlas previamente bloqueadas mediante el tratamiento como sigue: 580 microlitros (28 miligramos de perlas) de perlas magnéticas Strep-Tactin se lavan una vez con 580 microlitros de suero regulado con fosfato, y se vuelven a suspender en 580 microlitros de ChemiBLOCKER (diluido en un volumen de suero regulado con fosfato 1 x) . El bloqueo de las perlas se lleva a cabo en los tubos previamente bloqueados durante la noche a 4°C. Las partículas de fagos diluidas en suero regulado con fosfato hasta un volumen final de 500 microlitros para cada condición de paneo se mezclan con 500 microlitros de ChemiBLOCKER/Tween al 0.1 por ciento, y se mantienen durante 1 hora a temperatura ambiente sobre una rueda giratoria. La adsorción previa de las partículas de fago para remover el Strep-Tactin o los fagos enlazados con las perlas, se lleva a cabo dos veces: se agregan 160 microlitros de perlas magnéticas Strep-Tactin bloqueadas (4 miligramos) a las partículas de fagos bloqueadas, y se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente sobre una rueda giratoria. Después de la separación de las perlas mediante un dispositivo magnético (Dynal MPC-E) , el sobrenadante de fagos (aproximadamente 1 .1 mililitros) se transfiere a un tubo de reacción bloqueado fresco, y se repite la pre-absorción utilizando 1 60 microlitros de perlas bloqueadas durante 30 minutos. Entonces, se agrega DKK1 marcada con His-Strep, ya sea en 400 m M ó en 1 00 mM, a las partículas de fago bloqueadas, en un tubo de reacción de 1 .5 mililitros bloqueado fresco, y la mezcla se incuba durante 60 minutos a temperatura ambiente sobre una rueda giratoria. Los complejos de fago-antígeno se capturan utilizando 320 microlitros o bien 1 60 microlitros de perlas magnéticas Strep-Tactin bloqueadas agregadas a los grupos de paneo de fagos en 400 nM ó en 1 00 nM, respectivamente, que entonces se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente sobre una rueda giratoria. Las partículas de fago enlazadas a las perlas magnéticas Strep-Tactin se recolectan nuevamente con el separador de partículas magnéticas. Luego las perlas se lavan siete veces con suero regulado con fosfato/Tween al 0.05 por ciento (PBST), seguido por lavado otras tres veces con suero regulado con fosfato solamente. La elución de las partículas de fago a partir de las perlas magnéticas Strep-Tactin se lleva a cabo mediante la adición de 200 microlitros de DTT 20 mM en Tris-HCl 1 0 m M , pH de 8.0 a cada tubo durante 10 minutos. El eluato se recolecta, y las perlas se lavan una vez con 200 microlitros de suero regulado con fosfato, y se agrega el eluato de suero regulado con fosfato al eluato de DTT. Esta muestra eluida se utiliza para infectar 14 mililitros de un cultivo de TG-1 de E. coli, que se había cultivado hasta una OD60onm de 0.6 a 0.8. Después de la infección y de la siguiente centrifugación durante 1 0 minutos a 5,000 revoluciones por minuto, cada granulo bacteriano se vuelve a suspender en 500 microlitros del medio 2xYT, se aplica sobre placas de ágar 2xYT-CG , y se incuba durante la noche a 30°C. A la mañana siguiente, se raspan las colonias resultantes de las placas, y se prepara el fago mediante rescate y amplificación como se describe anteriormente. La segunda ronda de paneos en solución sobre DKK1 marcada con His-Strep se l leva a cabo de acuerdo con el protocolo de la primera ronda, excepto que se utilizan cantidades decrecientes de antígeno (50 nM , y 10 nM), y se altera apropiadamente la astringencia del procedimiento de lavado. Se aplican dos estrategias de paneo diferentes para la tercera ronda de selección: la producción de fagos amplificada de la segunda ronda de paneo se divide y se somete a dos condiciones de paneo diferentes. La primera mitad de producción de fagos se utiliza para la estrategia de paneo estándar sobre DKK1 marcada con His-Strep humana capturada sobre perlas Strep-Tactin, como se describe anteriormente (las cantidades de antígeno son de 10 nM o de 1 nM, respectivamente). La segunda variación de paneo para la tercera ronda de selección se lleva a cabo sobre DKK1 marcada con APP humana. La proteína DKK1 marcada con APP en una concentración final de 50 nM o de 1 0 nM, se mezcla con 1 mililitro de partículas de fago de la segunda ronda previamente aclaradas, y la mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora sobre una rueda giratoria. En paralelo, se incuban 8 miligramos de Dynabeads M-280 Estreptavidina previamente bloqueadas (Dynal) con 40 microgramos de anticuerpo anti-APP de ratón biotinilado durante 30 minutos a temperatura ambiente sobre una rueda giratoria, seguido por dos pasos de lavado con PBST. Los complejos previamente formados consistentes en fagos-anticuerpos enlazados a la DKK1 marcada con APP, se capturan mediante las perlas magnéticas de estreptavidina M-280 recubiertas con anti-APP durante 30 minutos a temperatura ambiente. La elución y amplificación de fagos se llevan a cabo como se describe en lo anterior. Subclonación y expresión de fragmentos Fab sol ubles Los insertos que codifican Fab de los fagémidos HuCAL GOLD® seleccionados se subclonan en el vector de expresión pMORPH®X9_Fab_FH, con el objeto de facilitar la expresión rápida y eficiente de los Fabs solubles. Para este propósito, el ADN del plásmido de los clones seleccionados se digiere con las endonucleasas de enzimas de restricción Xba\ y EcoRI , separando de esta manera el inserto que codifica Fab (ompA-VLCL y phoA-Fd) . Este inserto se clona entonces en el vector de expresión pMORPH®X9_Fab_FH digerido por Xoal y EcoRI . Las proteínas de Fab se expresan a partir de este vector, y como resultado , llevan dos marcas C-terminales (FLAGMR y 6xHis, respectivamente), tanto para la detección como para la purificación. M icroexpresión de anticuerpos Fab HuCAL GOLD® en E. coli Para obtener suficientes cantidades de proteína codificada por cada uno de los clones obtenidos anteriormente, se seleccionan colonias bacterianas individuales resistentes al cloranfenicol, después de la subclonación de los Fabs seleccionados , en el vector de expresión pMORPH®X9_Fab_FH . Cada una de estas colonias se utiliza entonces para inocular los pozos de una placa de microtitulación estéril de 96 pozos, conteniendo cada pozo 100 microlitros del medio 2xYT-CG por pozo, y se cultivan las bacterias durante la noche a 37°C . Una muestra (5 microlitros) de cada cultivo de TG-1 de E. coli se transfiere a una placa de microtitulación estéril fresca de 96 pozos previamente llenada con 100 microlitros del medio 2xYT complementado con 34 microgramos/mililitro de cloranfenicol, y glucosa al 0.1 por ciento por pozo. Las placas de microtitulación se incuban a 30°C con agitación a 400 revoluciones por minuto sobre un agitador de microplacas, hasta que los cultivos quedan ligeramente turbios (de aproximadamente 2 a 4 horas), con una OD6oonm de aproximadamente 0.5. Para la expresión en el formato de estas placas, se agregan 20 microlitros del medio 2xYT complementado con 34 microgramos/mililitro de cloranfenicol IPTG 3 mM (isopropil-ß-D-tiogalactopiranosida) por pozo (concentración final de IPTG 0.5 mM), las placas de microtitulación se sellan con una cinta permeable al gas, y se incuban durante la noche a 30°C, agitando a 400 revoluciones por minuto. Generación de lisados celulares enteros (extractos BEL) A cada pozo de las placas de expresión, se le agregan 40 microlitros de regulador BEL (2xBBS/EDTA: 24.7 gramos/litro de ácido bórico, 18.7 gramos de NaCI/litro, 1.49 gramos de EDTA/litro, pH de 8.0), conteniendo 2.5 miligramos/mililitro de lisozima, y las placas se incuban durante 1 hora a 22°C sobre un agitador de placas de microtitulación (400 revoluciones por minuto). Los extractos BEL se utilizan para el análisis de enlace mediante FMAT (véase el Ejemplo 2).

Expresión de las cantidades en microgramos de los anticuerpos Fab HuCAL GOLD® en E. coli y purificación La expresión de los fragmentos Fab purificados con pMORPH®X9_Fab_FH en las células TG1 F de E. coli, se lleva a cabo en tubos de plástico de 50 mililitros. Para este propósito, los pre-cultivos inoculados con clones individuales se cultivan en un medio 2xYT-CG durante la noche a 30°C. A la mañana siguiente, se utilizan 50 microlitros de cada pre-cultivo para inocular 25 mililitros del medio 2xYT complementado con 34 microgramos/mililitro de cloranfenicol, IPTG 1 mM, y glucosa al 0.1 por ciento, en tubos de plástico estériles de 50 mililitros, y se incuban durante la noche a 30°C. Las células de E. coli se cosechan, los granulos celulares se congelan, y finalmente se alteran con el Bug Buster (Novagen). Los fragmentos Fab se aislan utilizando Agarosa de Ni-NTA (Qiagen, Hilden, Alemania). Expresión de las cantidades en miligramos de los anticuerpos Fab HuCAL GOLD® en E. coli y purificación La expresión de los fragmentos Fab purificados por pMORPH®X9_Fab_FH en las células TG1 F se lleva a cabo en cultivos de matraz agitador utilizando 750 mililitros del medio 2xYT complementado con 34 microgramos/mililitro de cloranfenicol. Los cultivos se agitan a 30°C hasta que la OD6oonm alcanza 0.5. La expresión se induce mediante la adición de IPTG 0.75 mM, seguida por la incubación durante 20 horas a 30°C. Las células se alteran utilizando lisozima, y los fragmentos Fab se aislan mediante cromatografía con Ni-NTA (Qiagen, Hilden, Alemania). Las concentraciones de proteína se determinan mediante espectro-fotometría ultravioleta (Krebs y colaboradores, 2001 ) . Ejemplo 2: identificación de anticuerpos H uCAL® específicos para DKK1 . Los extractos BEL de los clones individuales de E. coli seleccionados mediante las estrategias de paneo anteriormente mencionadas, se analizan mediante la Tecnología de Ensayo de Microvolumen fluorométrico (FMATM R, analizador 8200 Cellular Detection System, Applied Biosystems, Foster City, Calif.) , para identificar los clones que codifican los Fabs específicos de DKK1 . El sistema FMATM R 8100 HTS es un instrumento de rastreo de alta producción, macro-confocal, de fluorescencia, que automatiza la detección de ensayos no radioactivos de mezcla y lectura con células vivas o perlas (Miraglia, J . Biomol . Screening ( 1 999) , 4(4) 1 93-204). Análisis de enlace basado en la tecnología de ensayo de microvolumen fluorométrico (FMAT), para la detección de los Fabs gue se enlazan con DKK1 . a partir de lisados bacterianos Para la detección de los anticuerpos Fab que se enlazan con DKK1 a partir de los lisados de E. coli (extractos BEL) , se analiza el enlace con el sistema de detección celular FMAT 8200 (Applied Biosystems) . Para acoplar la DKK1 marcada con His-Strep sobre las perlas M-450 Epoxy (Dynal) , se transfiere una muestra de 300 microlitros de perlas M-450 Epoxy (1 .2x1 08 perlas) a un tubo de reacción, y se captura con un separador de partículas magnéticas. El sobrenadante se remueve, y las perlas se lavan cuatro veces en 1 mililitro de regulador de fosfato de sodio 1 00 mM, pH de 7.4. Para el recubrimiento del antígeno, se agregan 60 microgramos de DKK1 marcada con His-Strep a la suspensión de perlas en 1 50 microlitros de regulador de fosfato de sodio 1 00 mM, pH de 7.4. La suspensión de antígeno-perlas se incuba durante 1 6 horas a temperatura ambiente sobre una rueda giratoria. Luego las perlas recubiertas se lavan tres veces con suero regulado con fosfato, y se vuelven a suspender en un volumen final de 250 microlitros de suero regulado con fosfato. Para cada placa de 384 pozos, se prepara una mezcla de 20 mililitros de suero regulado con fosfato conteniendo albúmina de suero bovino al 3 por ciento, Tween 20 al 0.005 por ciento, 4 microlitros de perlas recubiertas con DKK1 ( 1 .9x106 perlas) , y 4 microlitros de anticuerpo de detección Cy5M R. Se dosifica una muestra de 45 microlitros de esta solución por pozo en una placa de fondo negro/transparente FMAT de 384 pozos (Applied Biosystems) . El extracto BEL que contiene el Fab (5 microlitros) se agrega a cada pozo. Las placas FMAT se incuban a temperatura ambiente durante la noche. A la mañana siguiente, las placas se analizan en el sistema de detección celular 8200 (Applied Biosystems) . Se obtienen los clones positivos, y se analizan las secuencias de cadena pesada y ligera de los clones que produzcan señales específicas positivas en el FMAT. Se observa que se identifican 57 clones anti-DKK1 únicos (no redundantes), que muestran un enlace suficientemente fuerte con la DKK1 humana. Estos clones se expresan, se purifican, y se prueban para determinar su afinidad, y en los ensayos funcionales. Determinación de afinidades nanomolares utilizando resonancia de plasmón superficial Utilizando estos clones, se lleva a cabo el análisis cinético de SPR sobre un chip CM5 (Biacore, Suecia), que se había recubierto con una densidad de aproximadamente 400 RU ya sea de la DKK1 humana recombinante, DKK1 de ratón (R&D System), o DKK1 de mono cinomolgo, en acetato de sodio 10 mM, pH de 4.5, utilizando la química de acoplamiento de amina estándar de EDC-NHS. Una cantidad comparable de albúmina de suero humano (HSA) se inmoviliza sobre la celda de flujo de referencia. Se utiliza suero regulado con fosfato (NaCI 136 mM, KCl 2.7 mM, Na2HP04 10 mM, KH2P04 1.76 mM, pH de 7.4) como el regulador de ejecución. Las preparaciones de Fab se aplican en series de concentraciones de 16 a 500 nM, a una velocidad de flujo de 20 microlitros/minuto. La fase de asociación se establece en 60 segundos, y la fase de disociación en 120 segundos. En la Tabla 1 de la presente se muestra un resumen de las afinidades en nM para cada una de las DKK1 humana, de ratón, y de mono cinomolgo, determinadas mediante ese método.

Tabla 1 Afinidades de los Fabs seleccionados para cada una de DKK1 humana, de ratón, y de mono cinomolgo *Una sola medición. N.d. = No determinado. Ejemplo 3: Identificación de los Fabs candidatos anti-DKK1 humana que inhiben la actividad antagonista de Wnt de la DKK1.

Los 57 diferentes anticuerpos específicos de DKK1 resultantes seleccionados a partir de la biblioteca HuCAL GOLD®, se utilizan para obtener el anticuerpo purificado, el cual entonces se prueba para determinar su potencia para inhibir la actividad antagonista de Wnt de la DKK1 humana. De éstos, 17 anticuerpos candidatos son funcionalmente activos, como se muestra en las Figuras 2 y 4.

La actividad funcional de cada uno de los Fabs HuCAL® se verifica utilizando un ensayo de gen reportero de luciferasa. Se clonan doce sitios de enlace de TCF/Lef corriente arriba del gen reportero de luciferasa, haciendo que el gen de luciferasa responda a TCF/Lef. Las proteínas Wnt canónicas conducen a una estabilización de beta-catenina, activando de esta manera la transcripción de TCF/Lef, y produciendo la proteína de luciferasa. La adición de la proteína DKK1 bloquea la actividad de Wnt, y por consiguiente, también la transcripción del gen de luciferasa. En consecuencia, se expresan los niveles de luciferasa producidos por las células respectivas para correlacionarse con la potencia de los Fabs seleccionados para bloquear la acción de DKK1. Línea celular reportera HEK293T/17-12xSTF gue responde a TCF/Lef estable Se llevan a cabo bioensayos utilizando la línea celular reportera de células de riñon embrionario humana estable HEK293T/17-12xSTF. Las células se cultivan en un medio DMEM alto en glucosa (Invitrogen), conteniendo suero fetal de becerro al 10 por ciento (PAN o BioWhittaker), y 1 microgramo/mililitro de puromicina (BD Biosciences), hasta que se alcanza una confluencia del 90 por ciento. Luego las células se tripsinizan, se cuentan, y se diluyen en el medio de cultivo sin puromicina, hasta una concentración de 4x105 células por mililitro. Subsiguientemente, las células se siembran en una placa blanca de fondo plano de 96 pozos (Corning; 100 microlitros de suspensión celular por pozo), y se incuban a 37°C y con C02 al 5 por ciento durante la noche. Al día siguiente, se prepara el medio de ensayo: se agregan 500 nanogramos/mililitro de DKK1/APP al medio acondicionado con Wnt3a (CM). Los Fabs HuCAL® anti-DKK1 (concentración final de 20 microgramos/mililitro), y el anticuerpo de cabra anti-DKK1 humana (R&D Systems) utilizado como control positivo (concentración final de 1.5 microgramos/mililitro), se diluyen en el medio acondicionado con Wnt3a. Se remueve un volumen de 60 microlitros del medio de cada pozo de la placa de ensayo sin alterar las células adherentes, y se sustituye por 60 microlitros del anticuerpo de prueba o del control, diluido en el medio acondicionado en Wnt3a. Las células se incuban durante otras 24 horas, y se agregan 100 microlitros de reactivo de luciferasa Bright-Glo a cada pozo. Después de un tiempo de incubación de 5 minutos, se lee la luminiscencia en un luminómetro (GenioPro, Tecan). Los resultados obtenidos con 20 de los 57 Fabs se muestran en la Figura 2 en la presente. La extensión de luciferasa expresada es una medida de la extensión de anticuerpo presente. Ejemplo 4: Análisis cuantitativo de las afinidades de enlace: Determinación de los Fabs candidatos anti-DKK1 humana que inhiben la actividad antagonista de Wnt de la DKK1. Determinación de afinidad Con el objeto de caracterizar adicionalmente los anticuerpos anti-DKK1, se determina la afinidad con la DKK1 humana, de mono cinomolgo, y de ratón. La proteína DKK1 recombinante se inmoviliza sobre un chip CM5 Biacore, y los Fabs se aplican en la fase móvil en diferentes concentraciones. Para una determinación confiable de las afinidades monovalentes, solamente se utilizan los lotes de Fab para las mediciones Biacore que muestren una fracción monomérica >.90 por ciento en una cromatografía por exclusión de tamaños. Los datos de afinidad resumidos sobre la DKK1 humana, de ratón, y de mono cinomolgo, se muestran en la Tabla 2. Se encuentra que los 17 Fabs probados tienen afinidad con la DKK1 humana debajo de 100 nM. Además, nueve de los clones produjeron anticuerpos con afinidades menores de 10 nM. En todos los casos probados, las afinidades para DKK1 de mono cinomolgo y de ratón son casi idénticas a aquéllas para la DKK1 humana. Tabla 2 Datos de afinidad de los Fabs seleccionados sobre la DKK1 humana, de ratón, y de mono cinomolgo N . d. = No determinado. Determi nación de la ECsn Los datos que muestran la concentración efectiva para la inhibición del 50 por ciento para los clones de los anticuerpos que tienen la mayor afinidad para DKK1, se muestran en la Tabla 3 de la presente. Los datos muestran que la EC50 de las concentraciones efectivas está en el intervalo de 39 a 95 nM, con un valor medio entre 58 y 83 nM. Tabla 3 Concentración efectiva para la inhibición del 50 por ciento de los Fabs seleccionados Ejemplo 5: Maduración por afinidad de los Fabs anti-DKK1 seleccionados mediante intercambio paralelo de los casetes LCDR3 y HCDR2. Para optimizar las afinidades de los anticuerpos descritos en la presente para DKK1 para un grupo de fragmentos Fab progenitores, se remueve la LCDR3, la estructura 4, y la región constante de las cadenas ligeras (405 pares de bases) de cada Fab progenitor, utilizando Bp/I y Sph\ , y son reemplazados por un repertorio de LCDR3s diversificadas, junto con la estructura 4 y el dominio constante. Una muestra de 0.5 microgramos del vector del grupo enlazador se liga con un exceso molar de tres veces del fragmento de inserto que lleva las LCDR3s diversificadas. En un planteamiento similar, la HCDR2 se diversifica utilizando los sitios X GÍOI y BssH I l , y las regiones de estructura de conexión se mantienen constantes. Con el objeto de aumentar la eficiencia de la clonación , la HCDR2 progenitora es reemplazada por una secuencia embutida de 590 pares de bases antes de la inserción del cásete de HCD R2 diversificado. Las mezclas de ligamiento de 1 1 bibliotecas diferentes se electroporan en 4 mililitros de células TOP10 F' de E. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) , produciendo de 2x107 a 2x1 08 colonias independientes. La amplificación de las bibliotecas se lleva a cabo como se describe anteriormente (Rauchenberger y colaboradores, 2003 J. Biol. Chem. 278(40) :381 94-38205) . Para el control de calidad , se recogen aleatoriamente varios clones por biblioteca, y se secuencian (SequiServe, Vaterstetten, Alemania) , utilizando los cebadores CFR84 (VL) y OCAL_Seq_Hp (VH) . Selección de candidatos para la maduración por afinidad Se seleccionan seis candidatos de maduración seleccionados ("Fabs progenitores"), habiéndose caracterizado por tener las siguientes propiedades: afinidades con la DKK1 humana menores de nM, con una reactividad cruzada significativa con la DKK1 de mono cinomolgo y de ratón, una EC50 menor de 100 nM, y niveles de expresión de Fab de buenos a moderados en E. coli, y carecen de acumulación después de la purificación del Fab. Durante el transcurso de las mediciones por afinidad, llegó a ser evidente que MOR04480 es altamente inestable en altas diluciones. Por esta razón, se omite MOR04480 de la lista de candidatos de maduración, a pesar de tener la más alta afinidad (1 nM) y la mejor EC50 (7 nM) de todos los Fabs probados. MOR04483 tuvo una alta afinidad de 5.5 nM para la DKK1 humana, pero se muestra que reacciona cruzadamente con la DKK1 de ratón, y MOR04453 contuvo una alta proporción de agregados de Fab después de la purificación. Por consiguiente, también se excluyen estos dos anticuerpos de la maduración. Después de una cuidadosa evaluación de todos los datos disponibles, se seleccionan seis candidatos de maduración (MOR04454, MOR04455, MOR04456, MOR04461, MOR04470, y MOR04516). Las propiedades de estos candidatos se enlistan en la Tabla 4 de la presente.

Tabla 4 Propiedades de los Fabs seleccionados *Una sola medición. N. d. = No determinado. # Porción monomérica >90 por ciento. Generación de bibliotecas de Fab seleccionadas para la maduración por afinidad Con el objeto de obtener clones que tengan una mayor afinidad y actividad inhibidora de los anticuerpos anti-DKK1, los clones de Fab seleccionados MOR04454, MOR04455, MOR04456, MOR04461, MOR04470, y MOR4516 mostrados en el ejemplo anterior, se someten a rondas adicionales de diversificación y selección, un proceso conocido como madu ración por afinidad. Para este propósito, las regiones determinantes de complementariedad se diversifican utilizando los casetes de maduración LCDR3 y HCDR2 correspondientes previamente construidos mediante mutagénesis de trinucleótidos (Virnekás y colaboradores, 1 994 Nucleic Acids Res. 22:5600-5607; Nagy y colaboradores, 2002 Nature Medicine 8:801 -807) . La Tabla 5 de la presente muestra las secuencias de LCDR3 para los clones progenitores MOR04454, MOR04455, MOR04456, MOR061 , MOR04470 y MOR451 6. Tabla 5 Secuencias de LCDR3 para los Fabs seleccionados La Tabla 6 de la presente muestra las secuencias de HCDR2 para los clones progenitores MOR04454, MOR04455, MOR04456, MOR061 , MOR04470 y MOR4516. Tabla 6 Secuencias de HCDR2 para los Fabs seleccionados Los fragmentos Fab del vector de expresión pMORPH®X9_Fab_FH se subclonan en el vector de fagémido pMORPH®25 (véase la Patente de los Estados U nidos de Norteamérica N úmero 6,753, 136) . Este vector proporciona la proteína de fago plll fusionada N-terminalmente con un residuo de cisteína, así como una cisteína C-terminal para la cadena de anticuerpo Fd, y por lo tanto, permite la exhibición enlazada por disulfuro de los fragmentos Fab respectivos sobre la superficie del fago. Se aplican dos estrategias diferentes en paralelo para optimizar tanto la afinidad como la eficacia de los Fabs progenitores.

Se generan cinco bibliotecas de anticuerpos de Fab de fagos, en donde la LCDR3 de cinco de los seis clones progenitores es reemplazada por un repertorio de secuencias de CDR3 de cadena ligera individuales. No se lleva a cabo la maduración con LCDR3 de MOR04454, debido a que este clon tiene un sitio de restricción Bp/'l adicional en una de las regiones determinantes de complementariedad, y se utiliza la enzima de restricción Bp/'l para el procedimiento de clonación de la biblioteca. En paralelo, la región HCDR2 de cada clon progenitor es reemplazada por un repertorio de secuencias de CDR2 de cadena pesada individuales. Cada Fab progenitor es separado y reemplazado por un embutido de 590 pares de bases. Este embutido de ADN facilita la separación de las bandas de vector individualmente digeridas de las doblemente digeridas, y reduce el fondo de los Fabs progenitores de alta afinidad durante los paneos de maduración. En un paso subsiguiente, el embutido se separa de los plásmidos que codifican el Fab de cada clon progenitor, y es reemplazado por el cásete de maduración de HCDR2 altamente diversificado. Se generan bibliotecas grandes de maduración de gran afinidad de más de 2x107 miembros mediante procedimientos de clonación convencionales, y los clones diversificados se transforman en células TOP10F' de E. coli electro-competentes (Invitrogen). Se preparan fagos presentadores de Fab como se describe en el Ejemplo 1 anterior.

Se construyen cuatro grupos de maduración con el objeto de facilitar el siguiente proceso de selección: el grupo 1 a consistió en las bibliotecas de LCDR3 MOR04470 y MOR04516; el grupo 1 b consistió en las bibliotecas de HCDR2 MOR04470 y MOR0451 6; el grupo 2a consistió en las bibliotecas de LCDR3 MOR04454, MOR04455, MOR04456, y MOR04461 ; y el grupo 2b consistió en las bibliotecas de HCDR2 MOR04454, MOR04455, MOR04456, y MOR04461 . Para cada grupo, el paneo se lleva a cabo en solución, utilizando cantidades decrecientes de DKK1 marcada con His-Strep y fago-antígeno capturado por perlas Strep-Tactin. En paralelo, cada grupo se aplica en los paneos utilizando cantidades decrecientes de DKK1 biotinilada, que se captura sobre placas recubiertas con neutravidina. Con el objeto de aumentar la astringencia del paneo , y de seleccionar mejores índices de desactivación , se lleva a cabo la competencia con los Fabs progenitores purificados, así como con el antígeno no marcado, durante los períodos de incubación prolongados. Inmediatamente después de los paneos, los grupos de fagémidos enriquecidos se subclonan en el vector de expresión pMORPH®X9_FH . Se recogen aproximadamente 2,300 clones individuales, y se inducen los Fabs con I PTG. Estrategias de paneo de maduración Los procedimientos de paneo utilizando los cuatro grupos de anticuerpos se llevan a cabo con la DKK1 marcada con His-Strep, y con la DKK1 marcada con His-Strep biotinilada en solución por dos o tres rondas, respectivamente. Para cada una de olas estrategias de paneo, se utiliza competencia con las proteínas de Fab progenitoras purificadas o con la DKK1 marcada con APP no etiquetada, así como bajas concentraciones de antígeno y un extenso lavado, para aumentar la astringencia. El paneo en solución sobre la DKK1 marcada con His-Strep no etiquetada se lleva a cabo en dos rondas de selección, principalmente de acuerdo con el protocolo convencional descrito en el Ejemplo 1 . Las excepciones a estos procedimientos son la aplicación de cantidades reducidas de antígeno (disminuyendo desde 5 nM bajando hasta 1 nM) , la alta astringencia del procedimiento de lavado, ya sea con competidor o sin él , y períodos de incubación prolongados de anticuerpos-fagos junto con el antígeno. Para la primera ronda de selección utilizando la DKK1 biotinilada, los pozos de una placa de Neutravidina se lavan dos veces con 300 microlitros de suero regulado con fosfato. Los pozos se bloquean con ChemiBLOCKER (Chemicon, Temecula, CA) diluido a 1 : 1 en suero regulado con fosfato ( Regulador de Bloqueo) . Antes de las selecciones, también se bloquean los fagos HuCAL GOLD® con un volumen de Regulador de Bloqueo conteniendo Tween 20 al 0.1 por ciento durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las preparaciones de fagos bloqueadas se transfieren en al ícuotas de 1 00 microlitros a los pozos de una placa recubierta con Neutravidina durante 30 minutos a temperatura ambiente. Este paso de pre- absorción se repite una vez. Las preparaciones de fagos bloqueadas y previamente aclaradas se incuban con la DKK1 biotinilada 5 nM durante 2 horas a 22°C sobre una rueda giratoria. Se agrega el Fab progenitor, APP-DKK1 , o ningún competidor, y las muestras se incuban durante la noche a 4°C sobre una rueda giratoria. Los complejos de antígeno-fago se capturan en los pozos de una placa de neutravidina durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de extensos pasos de lavado, las partículas de fago enlazadas se eluyen mediante la adición de 200 microlitros de DTT 20 m M en Tris 10 mM, pH de 8.0, por pozo, durante 1 0 minutos a temperatura ambiente. El eluato se remueve y se agrega a 1 4 mililitros de células TG 1 de E. coli cultivadas hasta una OD60on de 0.6 a 0.8. Los pozos se enjuagan una vez con 200 microlitros de suero regulado con fosfato, y esta solución también se agrega a las células TG 1 de E. coli. Se permite la infección con fago de E. coli durante 45 minutos a 37°C sin agitación. Después de la centrifugación durante 1 0 minutos a 5,000 revoluciones por minuto, los granulos bacterianos se vuelven a suspender cada uno en 500 microlitros del medio 2xYT, se aplican a las placas de ágar con 2xYT-CG , y se incuban durante la noche a 30°C. Las colonias se cosechan raspando de la superficie de las placas, y se rescatan las partículas de fagos y se amplifican como se describe anteriormente.

Las segunda y tercera rondas de la selección se llevan a cabo como se describe en lo anterior para la primera ronda de selección, excepto que las condiciones de lavado son más astringentes, y las concentraciones de antígeno son de 1 y 0.1 nM, respectivamente. Análisis de enlace basado en electroauimiluminiscencia (BioVeris) de los Fabs gue se enlazan con DKK1 Para la detección de los fragmentos de anticuerpo específicos de DKK1 mejorados por afinidad en los lisados de E. coli (extractos BEL), se utiliza una estación de trabajo BioVeris M-384 SERIES® (BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, Reino Unido). El ensayo se lleva a cabo en placas de microtitulación de polipropileno de 96 pozos, y suero regulado con fosfato complementado con albúmina de suero bovino al 0.5 por ciento y Tween 20 al 0.02 por ciento, como el regulador de ensayo. La DKK1 humana biotinilada se inmoviliza sobre perlas paramagnéticas de estreptavidina M-280 (Dynal) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se agrega una dilución de 1:25 de la solución de suministro de perlas por pozo. Las muestras de 100 microlitros de extracto de BEL diluido y perlas se incuban durante la noche a temperatura ambiente sobre un agitador. Para la detección, se utiliza el (Fab)'2 anti-humano (Dianova) marcado con BV-tagMR de acuerdo con las instrucciones del proveedor (BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, Reino Unido). Se analiza un conjunto de aproximadamente 2,300 clones aleatoriamente recogidos mediante el método descrito anteriormente. Se selecciona un subconjunto de 160 clones que dan los valores más altos para el análisis adicional en la titulación en equilibrio en solución.

Determinación de las afinidades picomolares utilizando la Titulación en Equilibrio en Solución (SET) Para la determinación de la KD, se utilizan fracciones de monómeros (cuando menos un contenido del 90 por ciento de monómero, analizado mediante SEC analítica; Superdex75, Amersham Pharmacia) del Fab. La determinación de la afinidad basada en electroquimiluminiscencia (ECL) en solución, y la evaluación de los datos, se llevan a cabo básicamente como es descrito por Haenel y colaboradores, 2005. Se equilibra una cantidad constante de Fab con diferentes concentraciones (3n diluciones en serie) de la DKK1 humana (concentración inicial de 4 nM) en solución. Se agrega la DKK1 humana biotinilada acoplada con las perlas paramagnéticas (M-280 Estreptavidina, Dynal), y el (Fab)'2 anti-humano marcado con BV-tagMR (BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, Reino Unido) (Dianova), y la mezcla se incuba durante 30 minutos. Subsiguientemente, se cuantifica la concentración de Fab no enlazado mediante detección con ECL utilizando el analizador M-SERIES® 384 (BioVeris Europe). Para este propósito, se seleccionan 160 clones individuales, y se purifican mediante Ni-NTA Agarosa en la escala de microgramos. Se determinan las afinidades preliminares mediante titulación en equilibrio en solución de cuatro puntos (SET) en BioVeris. A partir de estos datos, se seleccionan 20 clones que muestran afinidades. Estos Fabs se purifican en la escala de miligramos. Se excluye el MOR04950 de la determinación de afinidad, y su evaluación adicional, debido a la acumulación parcial del Fab que se detecta en la cromatografía por exclusión de tamaños. Las afinidades finales se determinan a partir de dos lotes independientes de cada clon de Fab utilizando una medición de SET de 8 puntos, y la DKK1 humana, de ratón, y de mono cinomolgo. La determinación de afinidad para la DKK1 de ratón y de mono cinomolgo se hace esencialmente como se describe anteriormente, utilizando la DKK1 de ratón (R&D Systems) y la DKK1 de mono cinomolgo como el analito en solución, en lugar de la DKK1 humana. Para la detección del Fab libre, se utiliza la DKK1 humana biotinilada acoplada con perlas paramagnéticas. Las afinidades se calculan de acuerdo con Haenel y colaboradores, 2005 Anal. Biochem. 339.1:182-184. Utilizando las condiciones de ensayo descritas anteriormente, se determinan en solución las afinidades para los Fabs anti-DKK1 optimizados por afinidad. Las afinidades se determinan para MOR04910 y MOR04946, con las KDs debajo de 30 pM para la DKK1 humana, y entre 36 y 42 pM para la DKK1 de ratón y de mono cinomolgo. Otros siete anticuerpos mostraron afinidades debajo de 100 pM para los tres antígenos. El clon MOR04950 no mostró enlace con la DKK1 biotinilada. Las afinidades se resumen en la Tabla 7 de la presente.

Tabla 7 Afinidades de Fabs *: Se llevan a cabo cuando menos dos mediciones independientes a partir de dos lotes diferentes de Fab. #: Una sola medición. Ejemplo 6: Caracterización de los Fabs anti-DKK1 humana opti mizados por afinidad. Técnicas de ensayo inm unosorbente enlazado con enzimas (ELISA) Se determina la especificidad de enlace de los Fabs madurados en la presencia de suero humano (HS) al 50 por ciento. Las diluciones en serie de la DKK1 biotinilada humana recombinante en TBS se recubren sobre las placas de microtitulación de neutravidina durante 2 horas a temperatura ambiente, desde 8 nanogramos de DKK1 por pozo hasta una concentración de 125 nanogramos de DKK1 por pozo. Después del recubrimiento del antígeno, los pozos se bloquean con PBS/Tween al 0.05 por ciento (TBS-T) complementado con albúmina de suero bovino al 1 por ciento durante 1 hora a temperatura ambiente. Los Fabs purificados descritos anteriormente se diluyen ya sea en TBS/albúmina de suero bovino al 4 por ciento, o bien en TBS/suero humano al 50 por ciento, en una concentración final de 1 microgramo/mililitro, se agregan a los pozos recubiertos y bloqueados, y las placas se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. Para la detección, se utilizan un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (AP) anti-FLAG (dilución de 1:5000 en TBST), y el sustrato fluorogénico AttoPhos (Roche). Después de cada incubación, los pozos de las placas de microtitulación se lavan con TBST cinco veces, excepto después del paso de incubación final con el anticuerpo secundario marcado, cuando los pozos se lavan tres veces. La fluorescencia se mide en un lector de placas TECAN Spectrafluor. Las curvas de enlace de ejemplo se muestran en la Figura 3 de la presente. La Tabla 8 resume la actividad de enlace de los Fabs anti-DKK1 optimizados en la presencia de suero humano al 50 por ciento, comparándose con la actividad de enlace en albúmina de suero bovino al 4 por ciento, que está en el intervalo del 83 por ciento al 1 00 por ciento. Se encuentra que el valor medio es del 93 por ciento , y por lo tanto, se encuentra que los Fabs anti- DKK1 se enlazan completamente con el objetivo en la presencia de suero h umano. Tabla 8 Actividad de enlace de los Fabs *Una sola medición. Ensayo de células reporteras de luciferasa en la presencia de suero humano, utilizando la línea celular U2QS Para una determinación adicional de la especificidad de enlace de los Fabs anti-DKK1 optimizados, se repite el ensayo de células reporteras de luciferasa en la presencia de suero humano al 15 por ciento, utilizando la línea celular de osteosarcoma U20S. Las células U20S (ATCC No. HTB-96) se cultivan de acuerdo con el protocolo del proveedor (ATCC, Manassas, VA, EUA). Las células se tripsinizan, se cuentan, y se diluyen en el medio de cultivo (McCoy's 5a/FCS al 10 por ciento), hasta una concentración de 2x105 células/mililitro. Por cada 2x104 células, se prepara una solución que es una mezcla de 0.075 microgramos de pTA-LUC-12xSuperTopFlash, y 0.004 microgramos de phRL-SV40. Éstos se mezclan en un volumen final de 9.8 microlitros de OPTI-MEM. Entonces se agregan 0.2 microlitros de Reactivo de Transfección FuGENE 6 (Roche, Mannheim, Alemania). Esta mezcla de transfección se incuba brevemente, y luego se mezcla con las células previamente preparadas. Subsiguientemente, las células se siembran en 100 microlitros por pozo de una placa de cultivo celular blanca de fondo plano de 96 pozos, y se incuban a 37°C y con C02 al 5 por ciento durante la noche. Al día siguiente, se remueven 75 microlitros del medio de cada pozo de la placa de ensayo, y se sustituyen por 10 microlitros de diluciones de anticuerpos Fab HuCAL® a partir de (10 a 0.01 microgramos/mililitro diluidos en el medio de cultivo sin suero), y se agregan a cada pozo 15 microlitros de cualquiera de FCS al 70 por ciento o suero humano, y 50 microlitros del medio acondicionado de Wnt3a, conteniendo 600 nanogramos/mililitro de DKK1-ATP. Para el control negativo, se agrega el medio sin suero en lugar de las diluciones de anticuerpo. Con el objeto de obtener una máxima señal de luciferasa, se agregan los controles que contienen 10 microlitros del medio sin suero en lugar de las diluciones de anticuerpos, y 50 microlitros del medio acondicionado de Wnt3a sin DKK1-APP. Después de una incubación de 24 horas a 37°C, con C02 al5 por ciento, se mide la luminiscencia con el Sistema de Ensayo de Luciferasa Dual-Glo (Promega, Madison, Wl, EUA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La Tabla 9 muestra la actividad inhibidora de los Fabs anti-DKK1 optimizados en la presencia de suero humano al 15 por ciento (comparándose con la actividad inhibidora en FCS al 15 por ciento). Los datos muestran que la actividad obtenida en la presencia de suero está en el intervalo del 26 por ciento al 90 por ciento, con un 21 valor medio del 70 al 74 por ciento. Estos datos muestran que se obtienen clones de los Fabs anti-DKK1 que fu ncionan en la presencia de suero humano . Tabla 9 Actividad inhi bidora de los Fabs Determinación de la EC^n de los Fabs anti-DKK1 optimizados por afinidad mediante el ensayo de células reporteras de luciferasa La prueba de los Fabs mejorados por afinidad en el ensayo de TCF dependiente de Wnt3a estándar/reportero de luciferasa LEF, utilizó DKK1 10 nM para obtener la inhibición de la expresión de luciferasa. Se ve que los valores EC50 no se pudieron generar mediante este método, debido a que la sensibilidad del ensayo es demasiado baja. Esto se indica por las curvas de inhibición muy pronunciadas y los valores EC50 similares para todos los Fabs probados, como se ve en la Figura 4 de la presente. Se desarrolla una versión mejorada del ensayo de TCF/reportero de luciferasa LEF. La DKK1 se enlaza con las proteínas transmembranas Kremen-1 y -2, y esta interacción conduce a una fuerte inhibición sinérgica de la señalización de Wnt (Mao y colaboradores, 2002 Nature 417:664-67). Por consiguiente, el ADNc de Kremen se co-transfecta con el ensayo de TCF/reportero de luciferasa LEF. El ensayo de reportero dependiente de Wnt3a resultante mostró una sensibilidad altamente mejorada a la DKK1, mediada por la co-expresión de la proteína co-receptora Kremen. En este ensayo, la DKK1 0.33 nM es suficiente para inducir una inhibición completa de la señalización de Wnt. Las titulaciones de Fabs (en 10 concentraciones) se repiten utilizando DKK1 0.33 nM, y producen curvas de inhibición sigmoidales (Figura 5 de la presente), a partir de las cuales se pueden calcular los valores EC50. De esta manera se analizan los Fabs anti-DKK1 optimizados por afinidad con respecto a la EC50, como se describe anteriormente. Como se muestra en la Tabla 10 de la presente, los valores EC50 obtenidos mediante este método estuvieron en el intervalo de 0.2 nM a 5.6 nM. Tabla 10 EC50 de los Fabs Análisis de secuencias de los Fabs optimizados por afinidad Se determinan las secuencias de nucleótidos de las regiones pesada y V (VH y VL) de los veinte Fabs. En la Tabla 11 A y en la Tabla 11B de la presente se enlistan las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs).

Tabla 1 1 A Secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada Tabla 11B Secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera El análisis de secuencia mostró que cinco de los seis Fabs progenitores (P) produjeron sucesores mejorados en afinidad. MOR04461 y MOR04470 se pudieron optimizar en HCDR2, así como en LCDR3. No se obtienen sucesores optimizados de MOR04454. En adición, aparece una alta homología entre anticuerpos progenitores distintos, como se muestra en las secuencias en consenso 1 y en consenso 2 para las diferentes regiones determinantes de complementariedad en la Tabla 1 1 B. Se pueden proporcionar secuencias en consenso similares para las secuencias progenitoras mostradas en la Tabla 10A empleando métodos bien conocidos por un experto en este campo. En adición , se determina que MOR04920 tiene una mutación en la región HCDR2 (un residuo Ser hasta un Gly en la posición 73 de acuerdo con el esquema de numeración publicado por Honegger y Pluckthum , 2001 J . Mol. Biol. 309.3:657-670) desviándose de esta manera del diseño de HuCAL®. Se muestra que MOR04913 tiene una mutación puntual en la estructura 4 de la cadena ligera kappa (intercambio de Lys hasta Asn en la posición 148) . Debido a que no se espera que esta posición tenga un efecto sobre las propiedades de enlace del anticuerpo, se revierte la mutación de regreso hasta la composición de la línea germinal/HuCAL® durante la conversión de la IgG , produciendo el anticuerpo MOR051 45. MOR04947 tiene un sitio de glicosilación potencial en la LCDR2. Este sitio no se remueve, debido a que MOR04947 se selecciona solamente como uno de los candidatos de respaldo. Ejemplo 7: Producción de inmunoglobulinas HuCAL®. Conversión hasta el formato de IqG Con el objeto de expresar la inmunoglobulina de longitud completa (Ig), se subclonan fragmentos de dominio variable de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL) a partir de los vectores de expresión de Fab pMORPH®X9_FH, ya sea en la serie de vectores pMORPH®_h_lg ó pMORPH®2_h_lg para la lgG1 humana y la lgG4 humana. Se pueden utilizar vectores alternativos para la lgG2 humana. Se utilizan las enzimas de restricción EcoRI, M/el, y B/pl para la subclonación del fragmento de dominio VH en pMORPH®_h_lgG1 y pMORPH®_h_lgG4. Se utilizan las enzimas de restricción Mfe\ y B/pl para la subclonación del fragmento de dominio de VH en pMORPH®2_h_lgG1f y pMORPH®2_h_lgG4. Se lleva a cabo la subclonación del fragmento de dominio de V en pMORPH®_h_lg? y pMORPH®2_h_lg?, utilizando los sitios EcoRV y BsWI, mientras que se hace la subclonación en pMORPH®_h_lg? y pMORPH®2_h_lg?2 utilizando EcoRV y Hpal. Expresión transitoria y purificación de la IqG humana Las células HEK293 se transfectan con una cantidad equimolar de los vectores de expresión de cadena pesada y ligera de IgG. En los días 4 ó 5 después de la transfección, se cosecha el sobrenadante del cultivo celular. Después de ajustar el pH del sobrenadante a 8.0, y de la filtración estéril, la solución se somete a cromatografía en columna de proteína A estándar (Poros 20A, Biosystems). Conversión de los Fabs progenitores hasta los formatos de IqG En paralelo al inicio de la maduración por afinidad, se clonan MOR04454, MOR04456, y MOR04470 en los vectores de expresión pMORPH®_h_lgG 1 y pMORPH®_h_lgG4. Se pueden utilizar construcciones alternativas para la creación de los vectores de expresión de lgG2. La expresión a escala pequeña se lleva a cabo mediante la transfección transitoria de las células HEK293, y se purifican las i nmunoglobulinas de longitud completa a partir del sobrenadante del cultivo celular. Los datos muestran, mediante la cromatografía por exclusión de tamaños, que los anticuerpos están en una forma monomérica. La prueba del ensayo de reportero dependiente de Wnt3a probó que las proteínas son funcionales. Ejemplo 8: Secuencias de aminoácidos y secuencias de nucleótidos de los genes optimizados para la expresión. Con el objeto de aumentar la expresión en mamífero, se introducen cambios en las cadenas pesada y ligera de los Fabs de la presente, para la optimización del uso de codones para su expresión en una célula. Se sabe que varios motivos de acción negativamente cis disminuyen la expresión en mamíferos. El proceso de optimización de la presente remueve los sitios de acción-c/'s negativa (tales como los sitios de empalme o las señales de poli(A) , que tienen una influencia negativa sobre la expresión. El proceso de optimización de la presente enriquece adicionalmente el contenido de GC, para prolongar la vida media del ARNm. Las regiones de cadena ligera y pesada variables se optimizan utilizando un clon de un Fab, MOR04945 (la secuencia de nucleótidos progenitora de cadena ligera de longitud completa es la SEQ I D NO:98, y la secuencia de nucleótidos progenitora de cadena pesada de longitud completa es la SEQ ID NO: 102) , aislado en la presente mediante la selección con exhibición de fagos. Entonces, se optimizan cada una de las secuencias de nucleótidos que codifican cada una de las cadenas ligera y pesada enteras de este y otros clones empleando estos procedimientos. Proceso de optimización para las cadenas VH v Vi de MOR04945 Para optimizar la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de cada una de las cadenas VL y VH para su expresión en células de mamífero, se adapta el uso de codones a la inclinación de los codones de los genes de mamífero. En adición, donde sea posible, se reducen o se eliminan las regiones de muy alto (>80 por ciento) o muy bajo (<30 por ciento) contenido de GC. De una manera alternativa, la optimización para la expresión en bacterias, levadura, o baculovirus, implicaría adaptar el uso de codones inclinado para sus genes respectivos. Durante el proceso de optimización para la expresión en mam ífero, se eliminan los siguientes motivos de secuencia de acción-cis: los cuadros TATA internos, los sitios-chi, y los sitios de entrada ribosomal , los estiramientos de secuencias ricos en AT o ricos en GC, los elementos de secuencia del motivo de inestabilidad de ARN (ARE) , los elementos de secuencia de ARN inhibidor (INS) , los elementos de secuencia que responden a cAMP (CRS) , las secuencias de repetición y las estructuras secundarias de ARN , los sitios donadores y aceptores de empalmes, incluyendo los sitios crípticos, y los puntos de ramificación . Excepto como se indica, se evita la introducción de los sitios Mlu l y Hindl l l en el proceso de optimizar la secuencia de nucleótidos de la cadena VL. Excepto como se indica, se evita la introducción de los sitios Mlyl y BstEI I en el proceso de optimizar la secuencia de nucleótidos de la cadena VH. Secuencias de aminoácidos de las cadenas VH V V de MOR04945 opti mizadas para la expresión Se adapta el uso de codones a aquél de mamíferos para hacer posible índices de expresión más altos y más estables en una célula de mam ífero, para las secuencias de aminoácidos optimizadas resultantes para las cadenas VH y V del clon MOR04945 descritas anteriormente. Véase el Ejemplo 5. La Tabla 12A siguiente muestra las secuencias de nucleótidos en sentido y anti-sentido (AS) de la cadena ligera variable (SEQ ID NO: 120) , y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable resultante (designados como AA) (SEQ ID NO: 1 18), como se optimiza para la expresión.

Tabla 12A Secuencias de nucleótidos en sentido y anti-sentido, y secuencias de aminoácidos de la cadena VH optimizada para la expresión 5 Mlul EcoRV BstNI ACGCGTTGCGATATCGCCCTGACCCAGCCCGCCAGCGTGTCCGGCAGCCCTGGCCAGAGC (en sentido) TGCGCAACGCTATAGCGGGACTGGGTCGGGCGGTCGCACAGGCCGTCGGGACCGGTCTCG (AS) -| o T_R_C_D_L_A_L_T_Q_P_A_S_V_S_G_S_P_G_Q_S_ (AA) Pvull BstNI BstNI ATCACCATCAGCTGTACCGGCACCAGCAGCGACCTGGGCGGCTACAACTACGTGTCCTGG (en sentido) TAGTGGTAGTCGACATGGCCGTGGTCGTCGCTGGACCCGCCGATGTTGATGCACAGGACC (AS) l_T_l_S_C__T_G_T _S_S_D_L_G_G_Y_N_Y_V_S_W_ (AA) 15 TATCAGCAGCACCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGATGATCTACGACGTGAACAACAGACCT (en sentido) 121 + + + + + + ATAGTCGTCGTGGGGCCGTTCCGGGGGTTCGACTACTAGATGCTGCACTTGTTGTCTGGA (AS) Y_Q_a_H_P_G_K_A_P_K_L_M_l_Y_D_V_N_N_R_P_ (AA) Hmfl AGCGGCGTGTCCAACAGATTCAGCGGCAGCAAGAGCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATC (en sentido) 181 + + + + + + TCGCCGCACAGGTTGTCTAAGTCGCCGTCGTTCTCGCCGTTGTGGCGGTCGGACTGGTAG (AS) S_G_V_S_N_R_F_S_G_S_K_S_G_N_T_A_S_L__T_I_ (AA) 25 Pstl TCTGGCCTGCAGGCTGAGGACGAGGCCGACTACTACTGCCAGACCTACGACCAGATCAAG (en sentido) 241 + + + + + + AGACCGGACGTCCGACTCCTGCTCCGGCTGATGATGACGGTCTGGATGCTGGTCTAGTTC (AS) S_G_L_Q_A_E_D_E_A_D_Y_Y_C_a_T_Y_D_Q_l_K_(AA) Hindlll CTGTCCGCCGTGTTTGGCGGCGGAACAAAGCTT (en sentido) (SEQ ID NO:120) 301 + + + - - - GACAGGCGGCACAAACCGCCGCCTTGTTTCGAA (AS) L_S_A_V_F_G_G_G_T_K_L_ (AA) (SEQ ID N0:118) La Tabla 12B muestra las secuencias de nucleótidos de cadena pesada variables en sentido y anti-sentido (SEQ ID NO:121), y la secuencia de aminoácidos (designados como AA) de cadena pesada variable resultante (SEQ ID NO:119), como se optimiza para la expresión. Tabla 12B Secuencias de nucleótidos en sentido y anti-sentido, y secuencias de aminoácidos de la cadena VH optimizada para la expresión Mlyl Hinfl BstNI Pvull GAGTCCATTGGGAGTGCAGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGAGGACTGGTGCA (en sentido) CTCAGGTAACCCTCACGTCCGGGTCCACGTCGACCACCTCTCGCCGCCTCCTGACCACGT(AS) G_V_Q_A_Q_V_Q_L_V_E_S_G_G_G_L_V_Q_ (AA) BstNI GCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACTG (en sentido) + + + + + + CGGACCGCCGTCGGACTCTGACTCGACACGGCGGTCGCCGAAGTGGAAGTCGTCGATGAC (AS) _P_G_G_S_L_R_L_S_C_A_A_S_G_F_T_F_S_S_Y_W_ (AA) BstNI BstNI Bell GATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCGTGATCAGCAG (en sentido) + + + + + + CTACTCGACCCACTCCGTCCGGGGACCGTTCCCGGACCTCACCCACAGGCACTAGTCGTC (AS) _M_S_W_V_R_Q_A_P_G_K_G_L_E_W_V_S_V_I_S_S_ (AA) CGATAGCAGCAGCACCTACTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGA (en sentido) GCTATCGTCGTCGTGGATGATGCGGCTATCGCACTTCCCGGCCAAGTGGTAGTCGGCCCT (AS) _D_S_S_S_T_Y_Y_A_D_S_V_K_G_R_F__T__I_S_R_D_ (AA) Pstl BspMI CAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGT (en sentido) + + + + + + GTTGTCGTTCTTGTGGGACATGGACGTCTACTTGTCGGACTCTCGGCTCCTGTGGCGGCA (AS) _N_S_K_N_T__L_Y__L_Q_M_N_S_L_R_A_E_D_T_A_V_ (AA) BstNI BstNI BstNI BstEII GTACTACTGTGCCAGGCACGGCATCGACTTCGACCACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCAC (en sentido) + + + + + + CATGATGACACGGTCCGTGCCGTAGCTGAAGCTGGTGACCCCGGTCCCGTGGGACCAGTG (AS) _Y_Y__C_A_R_H_G_I_D_F_D_H_W_G_Q_G_T_L_V_T_ C (en sentido) (SEQ ID NO:121) 361 G (AS) _ (AA) (SEQ ID NO:119) Los diagramas de pre- y post-optimización pueden proporcionar los porcentajes de codones de secuencias para cada una de las secuencias progenitoras y genes optimizados, respectivamente, y analizan la clase de calidad de las secuencias de nucleótidos respectivas que codifican las cadenas VH y VL. El valor de calidad, como se utiliza en la presente, significa que el uso de codones más frecuente para un aminoácido dado en el sistema de expresión deseado se establece como 100, y los codones restantes se escalan de acuerdo con la frecuencia de uso. (Sharp, P. M. , Li , W. H . , Nucleic Acids Res. 1 5 (3) , 1987). Además, el índice de adaptación de codones (CAÍ) es un número que describe qué tan bien se emparejan los codones de la secuencia de nucleótidos con la preferencia del uso de codones del organismo objetivo. El máximo valor de CAÍ se establece en 1 .0, y por lo tanto, se considera que un CAÍ de >0.9 hace posible una alta expresión . El CAÍ para la cadena VL antes de la optimización se encuentra que es de 0.73, y después de la optimización, se determina que el CAÍ es de 0.95. De una manera similar, el CAÍ para la cadena VH antes de la optimización se encuentra que es de 0.74, y después de la optimización, se determina que es de 0.98 en las construcciones optimizadas, y se aumenta el contenido de GC en la cadena VL desde el 51 por ciento para la secuencia progenitora de MOR04945 hasta el 62 por ciento para la secuencia optimizada derivada a partir del MOR04945. Como se muestra en las Figuras 9A y 9B, se aumenta el contenido de GC en la cadena VH desde el 54 por ciento para la secuencia progenitora de MOR04945 hasta el 64 por ciento para el derivado optimizado de MOR04945. Optimización para la expresión de las cadenas ligeras v las cadenas pesadas de longitud completa de MOR04910. MOR04945, MOR04946. V MOR05145 Se aplica el proceso de optimización a cada una de las secuencias de nucleótidos de longitud completa progenitoras de las cadenas ligeras de MOR04910 (SEQ ID NO:97), MOR04945 (SEQ ID NO:98), MOR04946 (SEQ ID NO:99), y MOR05145 (SEQ ID NO:100), y las secuencias de nucleótidos de longitud completa progenitoras de las cadenas pesadas de MOR04910 (SEQ ID NO:101), MOR04945 (SEQ ID NO:102), MOR04946 (SEQ ID NO:103), y MOR05145 (SEQ ID NO:103). El proceso de optimización se utiliza para construir cada una de las siguientes secuencias de nucleótidos de cadena ligera asociadas con los números de clones progenitores: para el clon MOR04910, la secuencia de nucleótidos optimizada es la SEQ ID NO:104; para el clon MOR04945, la secuencia de nucleótidos optimizada es la SEQ ID NO:105; para el clon MOR04946, la secuencia de nucleótidos optimizada es la SEQ ID NO:106; y para el clon MOR05145, la secuencia de nucleótidos optimizada es la SEQ ID NO:107. Además, se utiliza el proceso de optimización para construir cada una de las siguientes secuencias de nucleótidos de cadena pesada asociadas con los números de clones progenitores: para el clon MOR04910, la secuencia de nucleótidos optimizada es la SEQ ID NO:108; para el clon MOR04945, la secuencia de nucleótidos optimizada es la SEQ ID NO:109; para el clon MOR04946, la secuencia de nucleótidos optimizada es la SEQ ID NO:110; y para el clon MOR05145, la secuencia de nucleótidos optimizada es la SEQ ID NO:110. Las secuencias de nucleótidos de cadena ligera optimizadas están asociadas con las siguientes secuencias de aminoácidos de cadena ligera optimizadas: para el clon MOR04910, la secuencia de aminoácidos optimizada es la SEQ ID NO:111; para el clon MOR04945, la secuencia de aminoácidos optimizada es la SEQ ID NO:112; para el clon MOR04946, la secuencia de aminoácidos optimizada es la SEQ ID NO:113; y para el clon MOR05145, la secuencia de aminoácidos optimizada es la SEQ ID NO:114. Las secuencias de nucleótidos de cadena pesada optimizadas están asociadas con las siguientes secuencias de aminoácidos de cadena pesada optimizadas: para el clon MOR04910, la secuencia de aminoácidos optimizada es la SEQ ID NO:115; para el clon MOR04945, la secuencia de aminoácidos optimizada es la SEQ ID NO:116; para el clon MOR04946, la secuencia de aminoácidos optimizada es la SEQ ID NO:117; y para el clon MOR05145, la secuencia de aminoácidos optimizada es la SEQ I D NO: 1 1 7. En la Tabla 1 3A y en la Tabla 1 3B se proporciona un l isado de las secuencias de nucleótidos y pol ipéptidos de las secuencias de cadena l igera y pesada de longitud completa contempladas . La Tabla 1 3A proporciona las secuencias de nucleótidos optimizadas y los polipéptidos codificados por las m ismas. Estas secuencias de n ucleótidos se opti mizan para remover los sitios de empalme latentes que son reconocidos en los sistemas de expresión de mamífero. La Tabla 1 3B proporciona las secuencias de n ucleótidos progenitoras para los clones enlistados en la Tabla 1 3A.

Tabl a 1 3A Secuenci as de cadena ligera (LC) y de cadena pesada (HC) Opti m izadas LC (opt) 4910 nucleótidos SEQ ID NO:97 GATATCGCACTGACCCAGCCAGCTTCAGTGAGCGGCTCACCAGGTCAGAGC ATTACCATCTCGTGTACGGGTACTAGCAGCGATGTTGGTGGTTTTAATTATGT GTCTTGGTACCAGCAGCATCCCGGGAAGGCGCCGAAACTTATGATTCATGAT GGTTCTAATCGTCCCTCAGGCGTGAGCAACCGTTTTAGCGGATCCAAAAGCG GCAACACCGCGAGCCTGACCATTAGCGGCCTGCAAGCGGAAGACGAAGCGG ATTATTATTGCCAGTCTTGGGATGTTTCTCCTATTACTGCTGTGTTTGGCGGC GGCACGAAGCTTACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACT CTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGT GTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAG ATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACAACCACACCCTCCAAACAAA GCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGT GGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCG TGGAAAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAG LC4910 (BHQ880) polipéptido SEQ ID NO:111 DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGFNYVSWYQQHPGKAPKLMIHDGS NRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQSWDVSPITAVFGGGTKL TVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAG VETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS LC (opt) 4945 nucleótidos SEQ ID NO:98 GATATCGCACTGACCCAGCCAGCTTCAGTGAGCGGCTCACCAGGTCAGAGC ATTACCATCTCGTGTACGGGTACTAGCAGCGATCTTGGTGGTTATAATTATGT GTCTTGGTACCAGCAGCATCCCGGGAAGGCGCCGAAACTTATGATTTATGAT GTTAATAATCGTCCCTCAGGCGTGAGCAACCGTTTTAGCGGATCCAAAAGCG GCAACACCGCGAGCCTGACCATTAGCGGCCTGCAAGCGGAAGACGAAGCGG ATTATTATTGCCAGACTTATGATCAGATTAAGTTGTCTGCTGTGTTTGGCGGC GGCACGAAGCTTACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACT CTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGT GTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAG ATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACAACCACACCCTCCAAACAAA GCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGT GGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCG TGGAAAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAG LC4945 (BHQ892) polipéptido SEQ ID N0:112 DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNN RPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQTYDQIKLSAVFGGGTKLTV LGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVE TTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS LC (opt) 4946 nucleótidos SEQ ID NO:99 GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAA CGTGCGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGAATCTTTTTTCTCCTTATCTGG CTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTATTAATTTATGGTGCT TCTAATCGTGCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGC ACGGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGGTGT ATTATTGCCAGCAGTATCTTACTCTTCCTCTTACCTTTGGCCAGGGTACGAAA GTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCAT CTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAAC TTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAAT CGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCT ACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAA AGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAA GAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG LC4946 (BHQ898) polipéptido SEQ ID NO:113 DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNLFSPYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASNR ATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYLTLPLTFGQGTKVEIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC LC (opt) 5145 nucleótidos SEQ ID NO:100 GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAA CGTGCGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGAATCTTTTTTCTCCTTATCTGG CTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTATTAATTTATGGTGCT TCTAATCGTGCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGC ACGGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGGTGT ATTATTGCCAGCAGTATATGACTCTTCCTCTTACCTTTGGCCAGGGTACGAAA GTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCAT CTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAAC TTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAAT CGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCT ACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAA AGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAA GAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG LC5145 (BHQ901) polipéptido SEQ ID NO:114 DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNLFSPYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASNR ATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYMTLPLTFGQGTKVEIKRT VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC HC (opt) 4910 nucleótidos SEQ ID NO:101 CAGGCACAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGG CGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTTCTTCTTAT TGGATGTCTTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGC GGTATCTCTTATTCTGGTAGCAATACCCATTATGCGGATAGCGTGAAAGGCC GTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACA GCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTATGGGTATTGA TCTTGATTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACC AAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGG GGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTG ACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCG GCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTCGTGACCGTGC CCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCC CAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT CACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTC TTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTG AGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGT TCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGC GGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCC TGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAA AGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCC CCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAA GAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATC GCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCG TGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGC ATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGG GTAAATGA HC4910 (BHQ880) polipéptido SEQ ID O-.115 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSGIS YSGSNTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMGIDLDYW GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK HC (opt) 4945 nucleótidos SEQ ID NO:102 CAGGCACAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGG CGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTTCTTCTTAT TGGATGTCTTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGC GTTATCTCTTCTGATTCTAGCTCTACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCG TTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAG CCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTCATGGTATTGAT TTTGATCATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCA AGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGG GCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGA CGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGG CTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTCGTGACCGTGCC CTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCC AGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTC ACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCT TCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGA GGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTT CAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG GGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCT GCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAA GCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCC CGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAG AACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCG CCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGC CTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGT GGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCA TGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGT AAATGA HC4945 (BHQ892) polipéptido SEQ ID NO:116 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSVIS SDSSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGIDFDHW GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK HC (opt) 4946=5145 nucleótidos SEQ ID NO:103 CAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAG CCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAACAACTACGGCATG ACCTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCGGCAT CAGCGGCAGCGGCAGCTACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTT CACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGC CTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCCGGACCATCTACATG GACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAG GGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGC ACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACG GTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCT GTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTCGTGACCGTGCCCT CCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAG CAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCAC ACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTC CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGG TCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCA ACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGG AGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGC ACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGC CCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCG AGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAA CCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCC GTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCT CCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGG ACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATG AGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAA ATGA HC4946=5145 (BHQ898/901) polipéptido SEQ ID NO:117 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYGMTWVRQAPGKGLEWVSGIS GSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTIYMDYWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK Tabla 1 3B Secuencias de cadena ligera (LC) y de cadena pesada (HC) Progen itoras LC (progenitora) 4910 nucleótidos SEQ ID NO:104 GATATCGCCCTGACCCAGCCCGCCAGCGTGTCCGGCAGCCCTGGCCAGAG CATCACCATCAGCTGTACCGGCACCAGCAGCGATGTGGGCGGCTTCAACT ACGTGTCCTGGTATCAGCAGCACCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGATGATC CACGACGGCAGCAATAGACCCAGCGGCGTGTCCAATAGATTCAGCGGCAG CAAGAGCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATCAGCGGCCTGCAGGCTGAG GACGAGGCCGACTACTACTGCCAGAGCTGGGATGTGAGCCCCATCACCGC CGTGTTTGGCGGCGGAACAAAGCTTACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTG CCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACA AGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAG TGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACAAC CACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAG CCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCA CGCATGAAGGGAGCACCGTGGAAAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA TAG LC (progenitora) 4945 SEQ ID NO:105 GATATCGCCCTGACCCAGCCCGCCAGCGTGTCCGGCAGCCCTGGCCAGAG CATCACCATCAGCTGTACCGGCACCAGCAGCGACCTGGGCGGCTACAACT ACGTGTCCTGGTATCAGCAGCACCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGATGATC TACGACGTGAACAACAGACCTAGCGGCGTGTCCAACAGATTCAGCGGCAG CAAGAGCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATCTCTGGCCTGCAGGCTGAGG ACGAGGCCGACTACTACTGCCAGACCTACGACCAGATCAAGCTGTCCGCC GTGTTTGGCGGCGGAACAAAGCTTACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGC CCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAA GGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGT GGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACAACC ACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGC CTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCAC GCATGAAGGGAGCACCGTGGAAAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCAT AG LC (progenitora) 4946 nucleótidos SEQ ID NO:106 GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCTGGCGA GAGAGCCACCCTGTCTTGTAGGGCCAGCCAGAACCTGTTCAGCCCTTACCT GGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGACTGCTGATCTACG GCGCCAGCAACAGAGCCACCGGCGTGCCCGCCAGATTCAGCGGCAGCGG CTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCTGAGGATTT CGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACCTGACCCTGCCCCTGACCTTCGGCC AGGGCACCAAGGTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCA TCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGT GCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGG ATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGAC AGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGC AGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCT GAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG LC (progenitora) 5145 nucleótidos SEQ ID NO:107 GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCTGGCGA GAGAGCCACCCTGTCTTGTAGGGCCAGCCAGAACCTGTTCAGCCCTTACCT GGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGACTGCTGATCTACG GCGCCAGCAACAGAGCCACCGGCGTGCCCGCCAGATTCAGCGGCAGCGG CTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCTGAGGATTT CGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACATGACCCTGCCTCTGACCTTCGGCCA GGGCACCAAGGTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCAT CTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTG CCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGA TAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACA GCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCA GACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCT GAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG HC (progenitora) 4910 nucleótidos SEQ ID NO:108 CAGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTG GCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGC TACTGGATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGG TGTCCGGCATCAGCTACAGCGGCAGCAATACCCACTACGCCGACAGCGTG AAGGGCAGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCT GCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCC GGATGGGCATCGACCTGGATTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTC TCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCC AAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTA CTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCG GCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCA GCAGCGTCGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATC TGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGA GCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGA ACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACAC CCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGA GCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTA CCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCA AGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAG AAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACAC CCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTC CGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTG GCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAA CCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA HC (progenitora) 4945 nucleótidos SEQ ID NO:109 CAGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTG GCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGC TACTGGATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGG TGTCCGTGATCAGCAGCGATAGCAGCAGCACCTACTACGCCGATAGCGTG AAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCT GCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCA GGCACGGCATCGACTTCGACCACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTC TCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCC AAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTA CTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCG GCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCA GCAGCGTCGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATC TGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGA GCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGA ACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACAC CCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGA GCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTA CCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCA AGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAG AAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACAC CCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTC CGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTG GCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAA CCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA HC (progenitora) 4946=5145 nucleótidos SEQ ID NO:110 CAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCA GCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAATAATTATGGTA TGACTTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGGT ATCTCTGGTTCTGGTAGCTATACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTT TTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAG CCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTACTATTTATAT GGATTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAA GGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGG GCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTG ACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCC GGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTCGTGACCGT GCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAA GCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAA AACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGT CAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGA CCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAG GTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGAC AAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCC TCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAG GTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCC AAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGA GGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTA TCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAAC AACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTC TATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTT CTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAG CCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA Ejemplo 9: Ensayos de bioactividad. Se mide la actividad biológica de un anticuerpo anti-DKK1 /4 neutralizante en un ensayo de gen reportero, utilizando la línea celular genéticamente modificada HEK293 T/1 7 STF_70IRES_Krm_(17) , denominada como SuperTopflash Krm17. Esta línea celular se deriva a partir de la l ínea celular de riñon embrionario humano HEK293, y se transfecta establemente con: i) una construcción reportera en donde el promotor TCF se fusiona corriente arriba del gen de luciferasa de luciérnaga, y ii) una construcción que conduce a la sobre-expresión de Krm sobre la superficie de esta célula. En esta l ínea celular, la exposición a la proteína Wnt estimula la expresión de luciferasa de una manera dependiente de la dosis. La adición de cantidades graduadas de anticuerpo anti-DKK1 /4 a una dosis sub-máxima fija de DKK1 en la presencia de Wnt, provoca un incremento en la expresión de luciferasa durante un período de incubación de 1 6 horas. Al final de este período, se cuantifica la cantidad de luciferasa basándose en su actividad enzimática en el lisado celular. La luciferasa cataliza la conversión del sustrato de luciferina hasta oxi-luciferina, un producto quimiluminiscente. Entonces se determina la quimiluminiscencia de tipo brillo resultante con un luminómetro apropiado. Se determina la potencia biológica de una muestra de prueba de anticuerpo anti-DKK1 /4 neutralizante comparando su capacidad para aumentar la expresión de luciferasa, con aquélla de un estándar de referencia. Las muestras y el estándar se normalizan con base en el contenido de proteína. Luego se calcula la potencia relativa utilizando un ensayo de líneas paralelas de acuerdo con Farmacopea Europea. El resultado final se expresa como la potencia relativa (en porcentaje) de una muestra comparada con el estándar de referencia. Ejemplo 10: Actividad in vitro sobre objetivos biológicos relevantes. Se seleccionan los Fabs líderes que tengan afinidades en el intervalo nanomolar bajo, y una potente actividad en el ensayo celular. Los componentes de enlace fisiológico para DKK1 son LRP5/6 (KD de aproximadamente 340pM) , y Kremen 1 y 2 (KD de aproximadamente 280 pM) [Mao 2001 ] [Mao 2002]. Dadas estas interacciones de alta afinidad, es deseable mejorar adicionalmente la afinidad, con el objeto de competir mejor con las interacciones fisiológicas de DKK1 . Con el fin de aumentar la afinidad y la actividad biológica de los Fabs seleccionados, se optimizan las regiones CDR-L3 y CDR-H2 en paralelo mediante mutagénesis de cásete, utilizando la mutagénesis dirigida a trinucleótidos [Virnekas 1 994] [Knappik 2000] [Nagy 2002]. En seguida de la maduración por afinidad, se selecciona un Fab que tenga una baja afinidad picomolar, que reactive la señalización de Wnt inhibida por DKK1 con una EC50 debajo de 1 nM, y que reaccione cruzadamente con la DKK1 de mono cinomolgo, de ratón, y de rata. Entonces se diseñan las regiones variables de FAb en dos estructuras de lgG1 humanas diferentes. El anticuerpo anti-DKK1 /4 tiene una alta afinidad para la DKK1 humana (2 pM), con una cinética de enlace típica para un anticuerpo de esta afinidad . Véase la Figura 6. Figura 6. MÉTODOS: Se miden la afinidad de enlace y la cinética de los candidatos l íderes y de rhDKKI (DKK1 humana recombinante) (Lote BTP7757), utilizando resonancia de plasmón superficial , con un instrumento Biacore T100 (Biacore, Uppsala, Suecia) , que contiene un chip sensor CM5 (S) (Cat. #BR-1006-68). El Fe anti-lgG 1 humana (Jackson I mmuno Research, Cat. #1 09-006-098) se inmovilizada sobre cada celda de flujo, seguido por la captura de un candidato líder a una captura esperada de aproximadamente 1 00 RU. Finalmente, se ejecutan seis concentraciones de DKK1 (intervalo de 0.1 95a 6.25 nM) , con una concentración de repetición sobre el chip. Las celdas de flujo se activan para el enlace de DKK1 durante 240 segundos, y sigue la disociación durante 30 minutos. Los datos normalizados (se sustrae el fondo) se ajustan a un enlace de 1 : 1 con el modelo de transporte de masa, utilizando el análisis de cinética en el software BIA evaluation 1 .0. Este experimento se lleva a cabo por triplicado, y los datos se presentan como el promedio de estos tres experimentos con la desviación estándar. Ejem plo 1 1 : Mapeo de epítopos. La DKK1 madura es una proteína de 266 aminoácidos con dos regiones ricas en cisteína (Cys-1 y Cys-2) . El dominio Cys-2 es responsable del enlace tanto de LRPs como de las proteínas Kremen, y es necesario y suficiente para la inhibición de la señalización de Wnt[Li 2002] [Brott 2002]: Los experimentos de inmunoprecipitación (Figuras 7A y 7B) demuestran que el anticuerpo anti-DKKl /4 se enlaza específicamente con el dominio Cys-2, pero no con el dominio Cys-1 . El anticuerpo anti-DKK1 /4 sólo es débilmente activo en el Western blot con la DKK1 desnaturalizada, y en un experimento de mapeo de péptidos no se encuentra que se enlace específicamente con cualquiera de los péptidos de 1 5 aminoácidos traslapados que cubren la longitud de la proteína (JTP) , sugiriendo que el anticuerpo anti-DKK1 /4 probablemente reconoce un epítopo no lineal dentro de Cys-2.

La Figura 7(A) muestra una representación esquemática de la DKK1 de longitud completa y truncada. La longitud completa (FL, que contiene los residuos 1 -266), la truncada carboxi-terminal (?C, que contiene los residuos 1 -1 85) , y la truncada amino-terminal (?N , que contiene los residuos 1 -60 más los residuos 157-266), se fusionan con un epítopo HA en sus términos C, y se clonan en un vector de expresión de mam ífero bajo el control del promotor de citomegalovirus (CMV) . La Figura 7(B) ilustra el enlace de un anticuerpo anti-DKK1/4 neutralizante y las proteínas DKK1 . El medio acondicionado a partir de las células HEK293 transitoriamente transfectadas que expresan las proteínas DKK1 de longitud completa, amino-truncada y truncadas carboxi-terminales, se incuba con el control de IgG anti-lisozima o con los anticuerpos anti-DKK1 /4 durante 2 horas a temperatura ambiente, y se recolectan los inmunocomplejos sobre perlas de proteína G, se resuelven mediante SDS-PAGE, se transfieren, y se manchan con un anticuerpo anti-HA. Se carga 1 /1 0 de la entrada total como control . Ejem plo 11 : Mapeo de epítopos - N-glicosilación. Un número de proteínas dentro de la senda de señalización de Wnt se modifican covalentemente mediante enzimas posteriores a la traducción, que regulan su actividad celular. Los miembros de la familia DKK, incluyendo DKK1 , se modifican mediante N-glicosilación [Krupnik 1 999]. DKK1 tiene un sitio de glicosilación N-enlazado teórico en el aminoácido 256 dentro del dominio Cys-2. Dada la naturaleza altamente conservada del dominio Cys-2, y el sitio de enlace potencial de tanto DKK1 para LRP6 como del anticuerpo anti-DKK1/4 para DKK1, buscamos determinar si el anticuerpo anti-DKK1/4 reconocía la forma N-glicosilada de DKK1. Un ELISA demuestra que el anticuerpo anti-DKK1/4 reconoce la forma N-glicosilada de rhDKKI mucho mejor que la forma específicamente desglicosilada N-enlazada de rhDKKL Tabla 14A. Aunque las mismas proteínas son reconocidas igualmente bien con un segundo anticuerpo (anti-HIS), dirigido hacia la región de marca del epítopo fusionado de la proteína recombinante. Esta diferencia en la afinidad se cuantifica utilizando resonancia de plasmón superficial, y se encuentra que el anticuerpo anti-DKK1/4 tiene una KD 100 veces más alta para la rhDKKI glicosilada que para la proteína desglicosilada; véase la Tabla 14B.

Tabla 14A Porcentaje de enlace - Dependencia en la glicosilación del enlace del anticuerpo anti-DKK1/4 con DKK1 e Tabla 14B Resonancia de plasmen superficial El enlace del anticuerpo anti-DKK1 /4 con la rhDKKI de tipo silvestre (WT) (Lote #BTP7757 marcado con el epítopo HEK HIS) , y la rhDKKI desglicosilada N-enlazada (N-DESG LI) , desglicosilada N-enlazada con la enzima PNGasa F (Sigma, Cat. #E-DEGLY)) , se mide mediante ELISA. Dicho de una manera breve, una placa de ELISA de alto enlace (Nunc. #442404) se recubre con 1 microgramo/mililitro de DKK1 de tipo silvestre o N-desglicosilada. Se muestra la proporción del enlace de tanto el anticuerpo anti-DKK1 /4 como el anticuerpo anti-HIS con la DKK1 de tipo silvestre, comparándose co su enlace respectivo de la N-desglicosilada. Este experimento se lleva a cabo con tres concentraciones diferentes (se muestran datos para una concentración representativa) , y todas las concentraciones tuvieron resultados similares. B. Se mide la afinidad de enlace y la cinética del anticuerpo anti-DKK1 /4 para la DKK1 tanto de tipo silvestre como N-desglicosilada (HEK293, Lote #BTP7757), utilizando un Biacore T1 00. El anticuerpo anti-DKK1 /4 tuvo consistentemente una afinidad 1 00 veces más baja para la DKK1 N-desglicosilada que para la DKK1 de tipo silvestre.

Ejemplo 12: Porcentaje de identidad de los miembros de la familia DKK. La familia Dickkopf humana consiste en cuatro parálogos (véase la Tabla 15), tres de los cuales (DKK1, 2, y 4) se enlazan con las proteínas LRP6 y Kremen, inducen la internalización de LRP5/6, e inhiben la señalización de Wnt canónica [Mao 2001] [Mao 2003]. DKK2 también tiene sinergismo con la sobre-expresión de LRP6 para mejorar la señalización de Wnt, pero la co-expresión de LRP6 y Kremen 2 restablece la inhibición de la senda por DKK2 [Mao 2003]. Por consiguiente, DKK2 puede actuar como un agonista así como un antagonista, dependiendo del contexto celular. DKK3 es el menos conservado de los miembros de la familia, incluyendo dentro del dominio Cys-2 responsable de las interacciones de LRP5/6 y Kremen, y es distinto de los otros miembros de la familia DKK, debido a que no se enlaza con los LRPs o Kremens, y no bloquea la señalización de Wnt [Mao 2001] [Mao 2003].

Tabla 15 Porcentaje de identidad de los miembros de la familia DKK a través de la proteína entera y dentro de los dominios Cys-2 La homología entre los miembros de la familia DKK se evalúa (Vector NTI Advanced 9.1 .0) utilizando el algoritmo AlignX para las alineaciones de secuencias por pares , comparando las proporciones de identidades de aminoácidos. Se aplican las multas de abertura de hueco y extensión de hueco de 1 0 y 0.1 , respectivamente. Esta evaluación incluye comparaciones de proteínas enteras, así como comparaciones de los dominios Cys-2 solamente. Como se indica en la tabla anterior, las DKKs 1 , 2, y 4 comparten una homología de secuencias de aminoácidos del 30 al 40 por ciento a través de la proteína entera. La comparación de los dominios Cys-2 solamente muestra que las DKKs 1 y 2 comparten una homología del 69 por ciento dentro de esta región, mientras que DKK4 comparte aproximadamente el 57 por ciento con el mismo dominio de las DKKs 1 y 2. DKK3 muestra el nivel más bajo de homología con los otros miembros de la familia. Entre todos los miembros, es mayor la homología dentro del dominio Cys-2.

Ejemplo 13: Afinidad del anticuerpo anti-DKK1/4 para los miembros de la familia DKK humanos. En adición al enlace de DKK1, el anticuerpo anti-DKK1/4 también se enlaza con DKK4; véase la Tabla 16. Aunque la afinidad para DKK4 es aproximadamente 100 veces menor que para DKK1, todavía es subnanomolar, y por consiguiente, es probablemente biológicamente y químicamente relevante. Se debe observar que ni DKK2 ni DKK4 conservan el residuo de asparagina que se predice que es dirigido para la glicosilación en el dominio Cys-2 de DKK1. Los experimentos de inmunoprecipitación preliminares sugieren que el anticuerpo anti-DKK1/4 no se enlace específicamente con DKK2. La afinidad de enlace del anticuerpo anti-DKK1/4 para enlazarse con DKK2, será determinada en seguida de la purificación con éxito de DKK2. De una manera consistente con las distintas propiedades de función y enlace de DKK3, el anticuerpo anti-DKK1/4 no se enlaza con DKK3. Tabla 16 Afinidad del anticuerpo anti-DKK1/4 para los miembros de la familia DKK humanos La afinidad de enlace y la cinética del anticuerpo anti-DKK1/4 para otros miembros de la familia de proteínas DKK humanas, se miden utilizando un Biacore T100. Como antes, los experimentos se llevan a cabo por triplicado para las proteínas con un enlace significativo con el anticuerpo anti-DKK1/4, y se reportan como el promedio de tres experimentos con la desviación estándar. DKK3, que es el miembro de la familia menos homólogo, no tuvo enlace que fuera detectable arriba de los niveles del fondo, y de esta manera, se considera NSB (enlace no significativo). De la misma manera, los datos recientes sugieren que un anticuerpo anti-DKK1/4 de la invención tampoco tiene un enlace significativo con DKK2. Ejemplo 14: El anticuerpo anti-DKK1/4 bloquea el enlace de DKK1 con el LRP6. DKK1 media su actividad antagonista de Wnt a través de las interacciones con LRP5/6 y Kremen, induciendo la internalización, y bloqueando la interacción inducida por Wnt de LRP5/6 con los receptores Frizzled. El anticuerpo anti-DKK1/4 inhibe competitivamente el enlace de DKK1 con LRP6 en un ensayo ELISA de competencia en la Figura 8. Las células HEK293T no expresan niveles suficientes de LRP5 ó 6 endógenos para permitir la visualización del enlace de DKK1. Sin embargo, después de la co-transfección de LRP6 con una proteína chaperona de tráfico superficial, MESD, se puede detectar la DKK1 marcada con GFP sobre la superficie celular, ilustrando la naturaleza específica de la interacción de DKK1 /LRP6. MOR0491 0, que comparte las mismas regiones variables que el anticuerpo anti-DKK1 /4, bloquea específicamente esta interacción. Se mide la capacidad del anticuerpo anti-DKK1 /4 para inhibir el enlace de DKK1 directamente con LRP6 mediante un ELISA. Brevemente, las placas no tratadas (Fisher, Cat. #1 2565501 ) se recubren con 1 microgramo/mililitro de LRP6 recombinante (R&D Systems, Cat. #1 505-LR) , luego con 500 nanogramos/mililitro de rhDKKI , y se pre-incuba sobre hielo una curva de concentración ya sea del anticuerpo anti-DKK1 /4 o de h lgG 1 (MOR3207 anti-lisozima, ACE 1091 5) durante 30 minutos, después de lo cual se colocan sobre placas recubiertas con LRP6 durante 2 horas. Las placas se lavan, y se detecta el nivel de enlace de DKK1 con el anticuerpo anti-DKK1 (R&D Systems AFI096) . Se muestran los valores OD brutos (sustrayendo el fondo) . Las concentraciones crecientes del anticuerpo anti-DKK1 /4 inhiben el enlace de DKK1 directamente con LRP6 de una manera dependiente de la dosis, mientras que las concentraciones crecientes de hlgG 1 no bloquean el enlace de DKK1 con LRP6. Se mide la capacidad del MOR04910 para inhibir el enlace de DKK1 /LRP6 sobre la superficie celular, mediante el microscopio de fluorescencia. Las células HEK293T se transfectan simuladamente, y se transfectan transitoriamente, con plásmidos que codifican LRP6 y MESD. Las células se incuban con un medio acondicionado con DKK1 -GFP junto con el Fab anti-lisozima o el Fab MOR04910 anti-DKK1 durante 1 hora a 37°C, y se examinan mediante el microscopio de fluorescencia. La fluorescencia de GFP refleja el enlace de DKK1 /-GFP con el LRP6 sobre-expresado sobre la membrana de plasma. El anticuerpo anti-DKK1 /4 bloquea las interacciones de DKK1 con LRP6 sobre las superficies celulares. Ejemplo 14: Ensayos de reporteros - Reactivación de la transcripción del gen TCF/LEF inhibida por DKK1 . La señalización de Wnt canónica culmi na en la translocalización de beta-catenina hasta el núcleo, en donde se asocia con los factores de transcripción de la familia TCF/LEF, dando como resultado un mejor transcripción de los genes que responden a Wnt. Se establece un ensayo de reportero utilizando un promotor que responde a TCF/LEF que impulsa la transcripción del gen de luciferasa, facilitando la detección de la modulación de la senda de Wnt. DKK1 efectivamente bloquea la actividad de luciferasa inducida por el medio acondicionado con Wnt3a (CM) en este ensayo. El anticuerpo anti-DKK1 /4 reactiva la señalización de Wnt suprimida por DKK1 con una EC5o aparente de 0.16 nM en la Figura 9. Debido a que el ensayo requiere aproximadamente 1 nM de DKK1 para una supresión completa, y la afinidad del anticuerpo es de 2 pM, es probable que esta EC50 refleje la sensibilidad del ensayo y las cantidades relativas de cada proteína, en lugar de un límite absoluto de competencia del anticuerpo anti-DKK1 /4. Las células 293T transfectadas establemente con el reportero SuperTopflash y Kremen, se tratan con 1 0 nanogramos/mililitro de rhDKKI , medio acondicionado de Wnt3a al 50 por ciento, y diferentes cantidades del anticuerpo anti-DKK1 /4. Dieciocho horas después, se mide la actividad de luciferasa mediante el kit de ensayo de luciferasa Bright-Glo (Promega) . Ejem plo 15: Ensayos de reporteros - Reversión de la secreción de fosfatasa alcalina inhibida por DKK1 en las células de tipo pre-osteoblastos. Con el objeto de determinar si el anticuerpo anti-DKK1 /4 bloquea las funciones de DKK1 en un establecimiento más fisiológicamente relevante, se establece un ensayo in vitro para medi r la diferenciación de osteoblastos mediada por Wnt de la línea celular de ratón pl uripotente C3H 10T1 /2 ( 1 0T1 /2) ; véase la Figura 1 0. Después de la diferenciación de los osteoblastos, las células 1 0T1 /2 secretan fosfatasa alcalina (AP) , un fenómeno que puede ser inhibido por DKK1 . El anticuerpo DKK1 /4, pero no el control de IgG, bloquea la supresión por DKK1 de la diferenciación de 10T1 /2 en la presencia del medio acondicionado de Wnt3a. Se ha reportado que Wnt induce la proliferación e inhibe la apoptosis en un número de contextos celulares, y la activación de la senda de Wnt, como se indica mediante la estabilización de beta-catenina o la estabilización nuclear, con frecuencia está asociada con el progreso del tumor. Adicionalmente, la disminución de DKK1 en algunos cánceres (por ejemplo, carcinoma de colon y melanoma) [González-Sancho 2005] [Kuphal 2006], ha conducido a algunos investigadores ha sugerir que DKK1 puede ser un supresor de tumor para algunos cánceres. Con el fin de probar si DKK1 tiene efecto sobre la proliferación o sobrevivencia del tumor, las líneas celulares tumorales se tratan con el anticuerpo anti-DKK1/4, y se analizan para determinar los cambios en el crecimiento. No se encuentra que ninguna línea celular tumoral probada sea significativamente afectada por la adición del anticuerpo anti-DKK1/4. El efecto del anticuerpo anti-DKK1/4 sobre la sobrevivencia y proliferación de varias líneas celulares de cáncer se evalúa in vitro. En este ensayo, el anticuerpo anti-DKK1/4 (100 microgramos/mililitro) se incuba con una línea celular tumoral; después de 3 días, se evalúa el número de células mediante cuantificación de ATP (Promega, Cell Titer Glo Assay®), como una medida de las células metabólicamente activas, con una relación lineal con el número de células. Este ensayo se lleva a cabo en tres concentraciones en suero diferentes (sin suero, crecimiento mínimo, y crecimiento completo). No se encuentran cambios significativos, comparándose con las células no tratadas y tratadas con hlgG1. Los sobrenadantes de la línea celular se analizan para determinar la expresión de DKK1 mediante ELISA. Ejemplo 16: Reactividad cruzada entre especies y neutralización de DKK1. Se selecciona un anticuerpo anti-DKK1/4 neutralizante, no por su alta afinidad contra la DKK1 humana y capacidad neutralizante, sino también basándose en su reactividad cruzada con otras especies que se podrían utilizar para los estudios de eficacia y seguridad. El anticuerpo anti-DKK1/4 reacciona cruzadamente con la DKK1 de ratón, de rata, y de mono cinomolgo (cinomolgo, Macaca fascicularis), con una afinidad similar a la de la DKK1 humana; véase la Tabla 17. Más aún, el anticuerpo anti-DKK1/4 neutraliza la actividad supresora de Wnt mediada por DKK1 de las cuatro especies (Tabla 17), sugiriendo que estas especies deben ser relevantes para los modelos tanto de seguridad como de eficacia. Tabla 17 Reactividad cruzada entre especies y neutralización de DKK1 Se ensaya la determinación de afinidad para DKK1 humana, de mono cinomolgo, de ratón, y de rata, mediante titulación en equilibrio en solución (SET), utilizando el analizador M-384 SERIES® (BioVeris, Europe). Para la determinación de la KD mediante la titulación en equilibrio en solución (SET), se utilizan fracciones de monómeros (cuando menos el 90 por ciento de contenido de monómeros, analizados mediante SEC analítica; Superdex75, Amersham Pharmacia) de las proteínas IgG. La determinación de la afinidad basada en la electroquimiluminiscencia (ECL) en solución, y la evaluación de los datos se llevan a cabo básicamente como es descrito por [Haenel y colaboradores, 2005], se aplica el modelo de ajuste de enlace modificado de acuerdo con [Piehler y colaboradores, 1997]. Una cantidad constante de IgG de MOR04910 se equilibra con diferentes concentraciones (3n diluciones en serie) de DKK1 humana (concentración inicial de 4 nM) en solución. Se agrega DKK1 humana biotinilada acoplada con perlas paramagnéticas (M-280 Estreptavidina, Dynal), y anticuerpo policlonal (Fab)'2 de cabra anti-humano marcado BV-tagMR (BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, Reino Unido), y se incuban durante 30 minutos. Posteriormente, se cuantifica la concentración de la IgG no enlazada por medio de la detección ECL, utilizando el analizador M-384 SERIES® (BioVeris, Europe). La determinación de afinidad para la DKK1 de rata, de ratón, y de mono cinomolgo se lleva a cabo esencialmente como se describe en lo anterior, utilizando DKK1 de ratón, de rata, y de mono cinomolgo como analito en solución, en lugar de la DKK1 humana. Para la detección de las moléculas de IgG libres, se utiliza la DKK1 humana biotinilada acoplada con perlas paramagnéticas. MOR04910 y el anticuerpo anti-DKK1/4 neutralizan la DKK1 humana (Novartis) con una EC50 equivalente; el anticuerpo anti-DKK1 /4 también neutraliza la DKK1 de mono (Novartis) , de ratón (R&D Systems 1765-DK-01 0) y de rata (Novartis) . El ensayo del reportero TOPFLASH para DKK1 humana, de rata, de ratón, y de mono cinomolgo, se lleva a cabo esencialmente como se describe en lo anterior (Figura 9) , utilizando la DKK1 recombinante de cada especie como el inhibidor del medio acondicionado de Wnt, en lugar de la DKK1 humana. La DKK1 recombinante de rata requirió de concentraciones más altas de proteína para alcanzar una inhibición significativa del ensayo TOPFLASH . Ejemplo 17: Efecto del anticuerpo anti-DKK1 /4 sobre el crecimiento intratibial de xenoinjertos de PC3M2AC6. Las metástasis tu morales de próstata son únicas entre las metástasis óseas, porque son abrumadoramente osteoblásticas, en lugar de ser osteolíticas [Keller 2001 ] . Sin embargo, inclusive las metástasis óseas predominantemente osteoblásticas tienen regiones subyacentes de osteólisis, y con frecuencia tienen bajas densidades de masa ósea (BMD) , en especial cuando los pacientes están con terapia de ablación de andrógeno [Saad 2006] . Recientemente, se demostró que la DKK1 puede actuar como un conmutador, mediante el cual la expresión de DKK1 mejora las propiedades osteolíticas de una línea celular de tumor de próstata osteoblástico/osteolítico mixto (C4-2B) . En adición, la supresión de DKK1 por el shARN inhibió la actividad osteolítica de una línea celular de tumor de próstata predominantemente osteolítico (PC3) [Hall 2005] [Hall2006]. La eliminación genética de DKK1 también inhibió el crecimiento intratibial del xenoinjerto tumoral, conduciendo a los autores a especular que la actividad osteol ítica puede ser importante para el establecimiento de un nicho metastásico, pero después de la pérdida de DKK1 en las metástasis prostéticas, convierte el tumor hasta un fenotipo osteoblástico. Un modelo de tumor de próstata osteolítico se adapta a partir de un método de [Kim 2003]. Se inyecta una variante de la línea celular de tumor de próstata osteol ítico (PC3M) que expresa establemente la luciferasa (PCM2AC6) en la tibia de los ratones. El crecimiento del tumor se monitorea mediante luciferasa, mientras que los cambios en el hueso se monitorean mediante tomografía micro-computarizada (micro-CT) e histología. En lugar de mejorar el crecimiento tumoral, el anticuerpo anti-DKK1 /4 tendió hacia la inhibición del crecimiento tumoral. Aunque la inhibición no es significativa en cualquier estudio, ha ocurrido consistentemente en 5/5 estudios conducidos hasta la fecha, mostrando un estudio representativo los efectos de tres dosis del anticuerpo anti-DKK1 /4 sobre el crecimiento tumoral , como se muestra en la Figura 1 1 . Se presentó una tendencia no significativa similar hacia la inhibición con los ratones tratados con el anticuerpo anti-DKK1 /4, con xenoinjertos de PC3M2AC6 subcutáneos. Los tratamiento se inician en el d ía 5 después del implante (0.2 millones de células/animal) . El anticuerpo anti-DKK1 /4 se administra intravenosamente, en dosis de 20, 60, y 200 microgramos/ratón/día, cada día, tres veces por semana durante dos semanas. Se administra la IgG de control intravenosamente a 200 microgramos/ratón/día, cada día, tres veces por semana durante dos semanas. Se administra el control de vehículo (suero regulado con fosfato) intravenosamente cada día, tres veces por semana durante tres semanas. Después del tratamiento, se calculan los datos de eficacia finales y el cambio de peso corporal. Utilizando este modelo, encontramos que un anticuerpo anti-DKK1 /4 inhibe el daño óseo cortical inducido por tumor. Los efectos sobre el hueso trabecular se confunden en este modelo por la observación de que tanto los implantes tumorales como los implantes falsos provocan daño mecánico al hueso, que da como resultado un aumento inicial en el hueso tejido, que posteriormente se remodela, provocando una disminución en el volumen óseo aparente. Los efectos relativos del hueso tejido recién formado y las trabéculas sobre las proporciones globales de volumen óseo/volumen trabecular (BV/TV) , por consiguiente, quedan oscurecidos. Sin embargo, está claro que el anticuerpo anti-DKK1 /4 aumenta la producción de hueso en las tibias tanto implantadas con tumor como falsamente implantadas, e inhibe o demora la disminución en el volumen óseo que acompaña a la remodelación. Utilizando el mismo modelo osteol ítico inducido por tumor, el anticuerpo anti-DKK1 /4 demuestra una actividad anti-osteol ítica equivalente que el Zometa; véase la Figura 1 2. Los efectos metabólicos óseos del anticuerpo anti-DKK1 /4 responden a la dosis en el intervalo de 20 a 200 microgramos/ratón, con una dosis m ínimamente eficaz de entre 20 y 60 microgramos/ratón; véase la Figura 1 3. Juntos, estos datos sugieren que el anticuerpo anti-DKK1 /4 debe tener un impacto en la enfermedad osteol ítica inducida por tumor, pero también puede ser efectivo en las enfermedades óseas no tumorales, tales como osteoporosis, o para mejorar la reparación de las fracturas de huesos. Ejemplo 18: El anticuerpo anti-DKK1 /4 mantiene una densidad ósea elevada en las tibias implantadas tanto con tumor como falsamente. En un esfuerzo por evaluar los marcadores farmacodinámicos de la eficacia en los ratones, se analizan tres marcadores de suero del metabolismo óseo: osteocalcina (OC), osteoprotegerina (OPG) , y activador de receptor secretado del ligando del factor nuclear KB (sRANKL) . Estos marcadores de osteoblastos se utilizan en lugar de los marcadores de osteoclastos más típicos, debido al mecanismo de acción esperado del anticuerpo. Sin embargo, no se detectan cambios consistentes en los animales con tumor contra los animales limpios. No se observa consistentemente ninguna correlación de pérdida ósea, medida mediante la micro-CT ó IHC, con cualquiera de estos marcadores. En la Figura 12A se muestran ejemplos representativos de las reconstrucciones micro-CT de las tibias de los ratones tratados. El daño cortical se califica desde 0 = ningún daño hasta 3 = daño severo. Figura 1 2B. El daño cortical en las tibias implantadas con tumor se califica manualmente mediante el análisis micro-CT que están ciegas con respecto a los grupos en estudio. No se observa ningún daño cortical en cualquiera de las piernas falsamente implantadas. Métodos: Los ratones hembras sin pelo de 12 semanas de edad se implantan intratibialmente con 2x105 células PC-3M2AC6 en la tibia izquierda, y se inyectan falsamente en la tibia derecha. Los tratamiento se inician en el día 5 después del implante. El NVP-anticuerpo anti-DKK1/4-NX (anticuerpo anti-DKK1/4) y el control de IgG se administran intravenosamente en dosis de 200 microgramos/ratón/día cada día, tres veces por semana durante dos semanas. También se administra el control de vehículo (suero regulado con fosfato) intravenosamente cada día, tres veces por semana durante dos semanas. Los animales se exploran en los días 7,14, y 18 después del implante del tumor utilizando el explorador µ-CT VivaCT40 (SCANCO, Suiza). La densidad ósea trabecular (BV/TV) se analiza como se describe en los métodos. Un asterisco (+) indica la diferencia significativa estadística de los controles de vehículo e IgG (n=12) en el mismo punto del tiempo a una p<0.05. En la Figura 13, para determinar la masa ósea, se toman imágenes de la espongiosa secundaria de la tibia con el Zeiss Imager Z.1 y el software Axiovision basado en Giemsa. La lectura se basa en el porcentaje de hueso calcificado en todo el campo. Cada columna representa la desviación media y estándar del número de animales mencionado. En los grupos tratados con PBS, IgG, y anticuerpo anti-DKK1 /4, solamente se analizan los animales con tumor. Las piernas derechas no tuvieron inyecciones falsas, y las piernas izquierdas tuvieron tumor. Estadística: Prueba de múltiples comparaciones de Dunnett, ANOVA de una vía. Las piernas izquierdas o las piernas derechas se compararon con la pierna respectiva en el grupo de PBS p<0.05*, p<0.01 *J p>0.05 n .s. La Figura 1 4 muestra la eficacia ósea anabólica de un anticuerpo anti-DKK1 /4 que depende de la dosis con una dosis de eficacia m ínima de entre 20 y 60 microgramos/ratón tres veces por semana. Los ratones hembras sin pelo de 12 semanas de edad se implantan intratibialmente con 2x105 células PC-3M2AC6 en la tibia izquierda, y se les pone una inyección falsa en la tibia derecha. Los tratamientos se inician en el día 6 después del implante. Se administra intravenosamente NVP-anticuerpo anti-DKK1 /4-NX (anticuerpo anti-DKK1 /4) , en dosis de 20, 60 , y 200 microgramos/ratón/día, cada día, tres veces por semana durante dos semanas. Se administra la IgG de control intravenosamente en 200 microgramos/ratón/día cada día, tres veces por semana durante dos semanas. Se administra el control de vehículo (PBS) intravenosamente cada día, tres veces por semana durante dos semanas. Los animales se exploran en los días 7 y 20 después del implante del tumor, utilizando el explorador µ-CT VivaCT40 (SCANCO, Suiza) . La densidad ósea trabecular (BV/TV) se analiza como se describe en los métodos. El asterisco (*) indica la diferencia significativa estadística de todos los controles, incluyendo vehículo, IgG, perforación solamente, y animales limpios en el mismo punto del tiempo a una p < 0.05. Ejemplo 18A: Estado del biomarcador. Biomarcadores de DKK1 Se ha descrito el patrón de expresión de ARN de la DKK1. Krupnik (1999) mostró la expresión en placenta mediante análisis Northern blot, sin expresión detectada en corazón, cerebro, pulmón, hígado, músculo esquelético, o páncreas. Wirths (2003) mostró una falta de expresión de ARN en hígado, riñon, y mama, aunque la expresión del ARN se ve en un subconjunto de hepatoblastomas y tumores de Wilms. Los trabajadores que examinaron la expresión en el tracto gastrointestinal de DKK1 mediante hibridación del ARN in situ, no mostraron expresión en el estómago y en el colon, ya sea normal o maligna (Byun 2006). El análisis de expresión de ARN en los ratones reveló altos niveles de expresión de DKK1 en hueso, una expresión media en feto y placenta, y una expresión débil en el tejido adiposo color café, en el timo, y en el duodeno [Li 2006]. Se evalúa la expresión de la proteína DKK1 en muestras de mieloma utilizando el mismo anticuerpo de cabra empleado en el estudio actual (Tian, 2003). En este documento, se ve la expresión en células de mieloma de los pacientes con una morfología de grado bajo; no se detecta la expresión de la proteína DKK1 en las muestras de biopsia de médula ósea de cinco sujetos de control.

Se estudia la distribución en el tejido y la reactividad cruzada entre especies del anticuerpo terapéutico anti-DKK1 /4 mediante su rastreo contra una serie de tejidos normales humanos y de mono. Se evalúan tanto las secciones de tejido enteras como microarreglos de tejido. Los controles positivos incluyeron un anticuerpo comercial para DKK1 que se evalúa en el mismo tejido. DDK1 _1 5 (anticuerpo anti-DKK1 /4 conjugado con FITC) y DKK1 _8 (anti-DKK1 de cabra conjugado con FITC, R&D Systems, # AF1096, lotes GBL013101 y GBL141 1 1 ). Otros biomarcadores Debido a que se conoce poco acerca del papel patofisiológico de la DKK1 , se ha enfocado una cantidad significativa de esfuerzo sobre la acumulación de la base de conocimiento acerca de los efectos in vivo del anticuerpo anti-DKK1 /4 mediante estudios de biomarcadores, y de la manera en que esto se podría explotar para un desarrollo adicional. Las áreas clave de enfoque han incluido: 1 ) El entendimiento del efecto del anticuerpo anti-DKK1 /4 en el metabolismo óseo normal y metastásico mediante la medición de los marcadores circulantes de la actividad osteoclástica y osteoblástica. 2) Los niveles de expresión comparativos de DKK1 en mieloma múltiple y otros tumores para confirmar y expandir las indicaciones objetivo. 3) Los efectos al nivel de expresión genética en los tejidos clave como el colon, médula ósea, pulmón, piel , y mama, para evaluar la activación de beta-catenina. Los estudios epidemiológicos moleculares preliminares han confi rmado los mayores niveles en sue ro de DKK1 en los pacientes con m ieloma m últiple, y apoyan una POC en esta indicación . Basándose en el conoci miento existente , la Tabla 1 8 proporciona los biomarcadores potenciales propuestos para u n anticuerpo anti-DKK1 /4. Tabla 1 8 Biomarcadores para los objetivos de DK K1 y DKK4 Tejido Categorías Tumor Sangre subrogado Farmacodinámica (PD) N/A Niveles de DKK1 - Objetivo libre y enlazada con anticuerpo libre y anti-DKK1/4 Corriente abajo Activación de beta- Adiposo/piel catenina Mecanismo de NTx, CTx, PINP, acción Osteocalcina, RANKL, OPG, PTH, Vitamina D3, Tejido Categorías Tumor Sangre subrogado calcitonina Eficacia Proteína M en NTx, CTx, PINP, suero, proteína M Osteocalcina, total en orina, RANKL, OPG, microglobina b2, PTH, calcitonina LDH ósea - ALP, CICP, CTx, NTx, etc.

Marcadores DKK-1 , CTx, PINP, predicti os Osteocalcina, Estratificación RANKL, OPG, PTH, Vitamina D3, calcitonina Pre-selección Niveles de DKK1 Expresión de DKK1 en suero Seguridad Inmunogenicidad Farmacocinética Anticuerpo anti- DKK1/4 Ejemplo 19: Secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos anti-DKK1. Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadenas ligera y pesada de los anticuerpos anti-DKK1, cuyas regiones determinantes de complementariedad se muestran en las Tablas 5a, 6, 11A, y 11B, se proporcionan por completo en la Tabla 19.

Tabla 19 Secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos anti-DKK1 (SEQ ID NOs:2-39) MOR04454 VH: (SEQ ID NO:2) QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGLHWVRQAPGKGLEWVSSIS YYGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSHMD KPPGYVFAFWGQGTLVTVSS MOR04454 VL: (SEQ ID NO:21 ) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIKNYLNWYQQKPGKAPKLLIGAASSL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYYGMPPTFGQGTKVEIK RT MOR04455 VH: (SEQ ID NO:3) QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLEWVSGI SGSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHYMDH WGQGTLVTVSS MOR04455 VL: (SEQ ID NO:22) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLHWYQQKPGKAPKLLIYGASNL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYDSIPMTFGQGTKVEIK RT MOR04456 VH: (SEQ ID NO:4) QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYGMTWVRQAPGKGLEWVSGI SGSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTIYMDY WGQGTLVTVSS MOR04456 VL: (SEQ ID NO:23) DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNLFSPYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASN RATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQQYGDEPITFGQGTKVEIK RT MOR04461 VH: (SEQ ID NO:5) QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSGI SYSGSNTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMGIDLD YWGQGTLVTVSS MOR04461 VL: (SEQ ID NO:24) DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGFNYVSWYQQHPGKAPKLMIHDG SNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSTWDMTVDFVFGGGT KLTVLGQ MOR04470 VH: (SEQ ID NO:6) QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSVI SSDSSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGIDFD HWGQGTLVTVSS MOR04470 VL: (SEQ ID NO:25) DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDV NNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQSYASGNTKVVFGGG TKLTVLGQ MOR04516 VH: (SEQ ID NO:7) QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTNYYIGWVRQMPGKGLEWMGIIYP TDSYTNYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGIPFRMRG FDYWGQGTLVTVSS MOR04516 VL: (SEQ ID NO:26) DIVLTQPPSVSGAPGQRVTISCSGSSSNIGSSFVNWYQQLPGTAPKLLIGNNSN RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQSEDEADYYCASFDMGSPNVVFGGGTK LTVLGQ MOR04907 VH: (SEQ ID NO:8) QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYGMTWVRQAPGKGLEWVSGI SGSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTIYMDY WGQGTLVTVSS MOR04907 VL: (SEQ ID NO:27) DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNLFSPYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASN RATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYLSLPTTFGQGTKVEIK RT MOR04913 VH: (SEQ ID NO:9) QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYGMTWVRQAPGKGLEWVSGI SGSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTIYMDY WGQGTLVTVSS MOR04913 VL: (SEQ ID NO:28) DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNLFSPYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASN RATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYMTLPLTFGQGTKVEIN RT MOR04946 VH: (SEQ ID NO: 10) QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYGMTWVRQAPGKGLEWVSGI SGSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTIYMDY WGQGTLVTVSS MOR04946 VL: (SEQ ID NO:29) DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNLFSPYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASN RATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYLTLPLTFGQGTKVEIK RT MOR04910 VH: (SEQ ID NO:11 ) QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSGI SYSGSNTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMGIDLD YWGQGTLVTVSS MOR04910 VL: (SEQ ID NO:30) DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGFNYVSWYQQHPGKAPKLMIHDG SNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQSWDVSPITAVFGGGT KLTVLGQ MOR04921 VH: (SEQ ID NO: 12) QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSGI SYSGSNTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMGIDLD YWGQGTLVTVSS MOR04921 VL: (SEQ ID NO:31) DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGFNYVSWYQQHPGKAPKLMIHDG SNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQTWATSPLSSVFGGG TKLTVLGQ MOR04948 VH: (SEQ ID NO:13) QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSGI SYSGSNTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMGIDLD YWGQGTLVTVSS MOR04948 VL: (SEQ ID NO:32) DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGFNYVSWYQQHPGKAPKLMIHDG SNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQTWDSLSFFVFGGGT KLTVLGQ MOR04914 VH: (SEQ ID NO:14) QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSVI SSDSSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGIDFD HWGQGTLVTVSS MOR04914 VL: (SEQ ID NO:33) DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDV NNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQSYTYTPISPVFGGGT KLTVLGQ MOR04920 VH: (SEQ ID NO:15) QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSSI EHKDAGYTTWYAAGVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGID FDHWGQGTLVTVSS MOR04920 VL: (SEQ ID NO:34) DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDV NNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQSYASGNTKVVFGGG TKLTVLGQ MOR04945 VH: (SEQ ID NO:16) QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSVI SSDSSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGIDFD HWGQGTLVTVSS MOR04945 VL: (SEQ ID NO:35) DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDV NNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQTYDQIKLSAVFGGGT KLTVLGQ MOR04952 VH: (SEQ ID NO:17) QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSVI SSDSSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGIDFD HWGQGTLVTVSS MOR04952 VL: (SEQ ID NO:36) DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDV NNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQSYDSPTDSVVFGGG TKLTVLGQ MOR04954 VH: (SEQ ID NO:18) QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSVI EHKDKGGTTYYAASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGID FDHWGQGTLVTVSS MOR04954 VL: (SEQ ID NO:37) DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDV NNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQSYASGNTKVVFGGG TKLTVLGQ MOR04947 VH: (SEQ ID NO:19) QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTNYYIGWVRQMPGKGLEWMGIIVP GTSYTIYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGIPFRMRGF DYWGQGTLVTVSS MOR04947 VL: (SEQ ID NO:38) DIVLTQPPSVSGAPGQRVTISCSGSSSNIGSSFVNWYQQLPGTAPKLLIGNNSN RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQSEDEADYYCASFDMGSPNVVFGGGTK LTVLGQ MOR05145 VH: (SEQ ID NO:20) QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYGMTWVRQAPGKGLEWVSGI SGSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTIYMDY WGQGTLVTVSS MOR05145 VL: (SEQ ID NO:39) DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNLFSPYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASN RATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYMTLPLTFGQGTKVEIK RT Las secciones CDR y FR de las regiones variables de la Tabla 19, están alineadas en la Tabla 20A para las cadenas pesadas (SEQ ID NOS:2-20; VH3 es la SEQ ID NO:125, VH5 es la SEQ ID NO:126), en la Tabla 20B para las cadenas ligeras kappa (SEQ ID NOS:21, 22, 23, 27, 28 y 29; VK1 es la SEQ ID NO:127 y VK3 es la SEQ ID NO:128), y en la Tabla 20C para las cadenas ligeras lambda (SEQ ID NOS:24, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 y 37; VL2 es la SEQ ID NO:129 y VL1 es la SEQ ID NO:130).

Tabla 20A Alineación de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada de los anticuerpos anti-DKK1 (SEQ ID NOs:2-20, 125-126) VH Tabla 20B Alineación de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena ligera kappa de los anticuerpos anti-DKK1 (SEQ ID N Os: 24-25, 30-37, 129-130) Enlazadores de DKKl VL de las secuencias kappa VL 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 5 6 7 8 9 oo Tabla 20C Alineación de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena ligera lambda de los anticuerpos anti-DKK1 (SEQ ID NOs:) Enlazadores de DKK 1 VL de las secuencias lambda VL C0R1 C0R2 Estructura 3 CDR3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 p 12345678901234567890 1234567890 a b c d e 1123456789012345678 901234567890123456789012345678901234567890123458t678901234567 8 9 OO Las secuencias de CDR en consenso se proporcionan cuando menos en las SEQ ID NOs:40-48 y en la Tabla 1 1 B. Un experto en la materia puede determinar secuencias de CDR en consenso adicionales a partir de las alineaciones de las Tablas 20A-20C, empleando métodos convencionales, y los métodos proporcionados en la presente. EQUIVALENTES A partir de la descripción detallada anterior de las modalidades específicas de la invención, debe ser evidente que se han descrito los anticuerpos novedosos y fragmentos inmunológicos de los mismos. Aunque se han dado a conocer en la presente con detalle las modalidades particulares, esto se ha hecho a manera de ejemplo para propósitos de ilustración solamente. En particular, el inventor contempla que se pueden hacer diferentes sustituciones, alteraciones, y modificaciones a la invención sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

Claims (53)

REIVINDICACIONES

1 . Una composición que comprende una región de enlace de antígeno que se enlaza específicamente con un epítopo en un polipéptido de DKK1 (SEQ I D NO: 1 ) y/o en un polipéptido de DKK4 (SEQ ID NO: 122) , en donde el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo se enlaza con cuando menos un epítopo en DKK1 ó DKK4, o ambas.

2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el enlace con DKK1 ó DKK4 se determina en cuando menos un ensayo seleccionado a partir de: antagonismo de la transcripción señalizada por Wnt; análisis de enlace basado en electroquimiluminiscencia; enlace de ensayo inmunosorbente enlazado con enzimas; FMAC ; SET; SPR; concentración de osteocalcina (OCN) en suero; concentración de osteoprotegrina (OPG) en suero; concentración de propéptido nitrogenoso procolágeno tipo 1 (P 1 N P) en suero; producción de ALP; TopFlash, o mejoría de osteólisis.

3. Una secuencia de aminoácidos aislada seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs:2-20 y de las SEQ I D NOs:40-72, y las variantes conservadoras o humaneered (humanodiseñadas) de las mismas.

4. Las secuencias de aminoácidos aisladas de acuerdo con la reivindicación 3, en donde las secuencias de aminoácidos se seleccionan a partir de: a) el grupo de las SEQ ID NOs:2-20, 65-72, cada una comprendiendo una región de enlace de antígeno que comprende una región H-CDR3; b) el grupo de las SEQ ID NOs:2-20, 57-64, cada una comprendiendo una región H-CDR2; c) el grupo de la SEQ ID NO:40 que comprende la secuencia GISGSGSYTYYADSVKF, el grupo de la SEQ ID NO:41 que comprende la secuencia GISYYGGNTYYADSVKF, y SEQ ID NO:42 que comprende la secuencia GISYYGGSTYYADSVKF, cada una comprendiendo la región H-CDR2 en consenso; d) el grupo de las SEQ ID NOs:2-5, 8-11, 20, 49-56, cada una comprendiendo una región H-CDR1; y e) el grupo de la SEQ ID NO:43 que tiene la secuencia de aminoácidos GFTFSSYGMT, SEQ ID NO:44 que tiene la secuencia de aminoácidos GFTFNSYGMT, SEQ ID NO:45 que tiene la secuencia de aminoácidos GFTFSNYGMT, SEQ ID NO:46 que tiene la secuencia de aminoácidos GFTFSSYWMT, SEQ ID NO:47 que tiene la secuencia de aminoácidos GFTFSSYAMTF, y SEQ ID NO:48 que tiene la secuencia de aminoácidos GFTFSSYGMS, cada una comprendiendo una región H-CDR1 en consenso; o f) las SEQ ID NOs:21-39 y 73-88; y las variantes conservadoras o humaneered (humano-diseñadas) de las mismas.

5. La región de enlace de antígeno aislada de acuerdo con la reivindicación 4, en donde las secuencias de aminoácidos seleccionadas a partir del grupo de las SEQ ID NOs:21-39 cada una comprende una región L-CDR3, las secuencias de aminoácidos seleccionadas a partir del grupo de las SEQ ID NOs:21-39, 73-80 cada una comprende una región L-CDR1, las secuencias de aminoácidos seleccionadas a partir del grupo de las SEQ ID NOs:21-39, 81-88 cada una comprende una región L-CDR2, las secuencias de aminoácidos seleccionadas a partir del grupo de las SEQ ID NOs:21-39 cada una comprende una región variable de una cadena ligera.

6. Una secuencia de nucleótidos aislada seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs:97-103.

7. Una secuencia de aminoácidos aislada codificada por una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 6, y las variantes conservadoras o humaneered (humanodiseñadas) de la secuencia de aminoácidos, en donde: a) cada una de las SEQ ID NOs:97-100 codifica una cadena ligera de enlace de antígeno; y b) cada una de las SEQ ID NOs:101-103 codifica una cadena pesada de enlace de antígeno.

8. Una secuencia de nucleótidos aislada de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la secuencia de nucleótidos se optimiza adicionalmente para su expresión y/o para su uso clínico.

9. Una secuencia de nucleótidos aislada seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs:104-110.

10. Una secuencia de aminoácidos aislada codificada por una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 9, y las variantes conservadoras o humaneered (humanodiseñadas) de la secuencia de aminoácidos, en donde: a) cada una de las SEQ ID NOs:104-107 codifica una cadena ligera de enlace de antígeno; y b) cada una de las SEQ ID NOs:108-110 codifica una cadena pesada de enlace de antígeno.

11. Una secuencia de nucleótidos aislada de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la secuencia de nucleótidos se optimiza para su expresión y/o para su uso clínico.

12. Una secuencia de aminoácidos aislada seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs:111-117, y las variantes conservadoras o humaneered (humanodiseñadas) de las mismas, en donde: a) cada una de las SEQ ID NOs:111-114 codifica una cadena ligera de enlace de antígeno; y b) cada una de las SEQ ID NOs:115-117 codifica una cadena pesada de enlace de antígeno.

13. La secuencia de aminoácidos aislada de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la secuencia de aminoácidos se optimiza para su expresión y/o para su uso clínico.

14. Una secuencia de nucleótidos aislada seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs:120-121.

15. Una secuencia de aminoácidos aislada codificada por una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 14, y las variantes conservadoras o humaneered (humanodiseñadas) de la secuencia de aminoácidos, en donde: a) la SEQ ID NO:120 codifica una región variable de enlace de antígeno de una cadena ligera, y b) la SEQ ID NO:121 codifica una región variable de enlace de antígeno de una cadena pesada.

16. Una secuencia de nucleótidos aislada de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la secuencia de nucleótidos se optimiza para su expresión y/o para su uso clínico.

17. Una región de enlace de antígeno aislada que comprende una región variable de una cadena ligera codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de la SEQ ID NO:120, y una región variable de una cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de la SEQ ID NO:121.

18. Una secuencia de aminoácidos aislada seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs:118-119, y la variantes conservadoras o humaneered (humanodiseñadas) de las mismas.

19. La secuencia de aminoácidos aislada de acuerdo con la reivindicación 18, en donde la SEQ ID NO:118 ilustra una región variable de enlace de antígeno de una cadena ligera.

20. La secuencia de aminoácidos aislada de acuerdo con la reivindicación 18, en donde la SEQ ID NO:119 ilustra una región variable de enlace de antígeno de una cadena pesada.

21. La secuencia de aminoácidos aislada de acuerdo con la reivindicación 1 8, en donde la secuencia de aminoácidos se optimiza para su expresión y/o para su uso cl ínico.

22. Una secuencia de aminoácidos aislada que tiene una identidad de cuando menos el 95 por ciento con cuando menos una región determinante de complementariedad seleccionada a partir de las regiones ilustradas en las SEQ I D NOs:2-121 .

23. Una secuencia de aminoácidos aislada que tiene una secuencia en consenso de las regiones determinantes de complementariedad , como se muestran en las Tablas 1 1 A y 1 1 B.

24. El anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 1 , el cual comprende un andamiaje seleccionado a partir de una IgM y una IgG, en donde la IgG se selecciona a parti r de una lgG 1 , una lgG2, una lgG3, o una lgG4.

25. El anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 24, en donde la IgM o la IgG se selecciona a partir de policlonal o monoclonal .

26. U n anticuerpo aislado o un fragmento funcional del mismo, el cual comprende una región de enlace de antígeno que es específica para un epítopo de DKK1 , en donde el anticuerpo o fragmento funcional se enlaza con DKK1 ó DKK4, y previene o mejora el desarrollo de una enfermedad asociada con DKK1 o de una enfermedad asociada con DKK4.

27. Una región de enlace de antígeno aislada de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo de acuerdo con la reivindicación 26.

28. Un anticuerpo aislado o un fragmento funcional del mismo, el cual comprende una región de enlace de antígeno que es específica para un epítopo de la DKK1 ó DKK4 objetivo, o ambas, en donde el epítopo comprende cuando menos seis o más residuos de aminoácidos de un dominio Cys-2 de la DKK1 ó DKK4 objetivo.

29. El anticuerpo aislado o fragmento funcional de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 anteriores, el cual se selecciona a partir de una inmunoglobulina entera o un fragmento Fab o un fragmento de anticuerpo scFv de la misma, un anticuerpo de cadena pesada, y una región de enlace de antígeno de la misma, sobre un andamiaje que no es de inmunoglobulina.

30. El anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo de acuerdo con la reivindicación 29, en donde el epítopo es un epítopo de conformación.

31 . Una composición farmacéutica, la cual comprende cuando menos un anticuerpo o fragmento funcional de acuerdo con la reivindicación 29, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable para el mismo.

32. Un animal transgénico que lleva un gen que codifica un anticuerpo o fragmento funcional del mismo, de acuerdo con la reivindicación 29.

33. Un método para el tratamiento de un trastorno o condición asociada con la presencia de DKK1 ó DKK4, el cual comprende administrar a un sujeto que lo necesite, una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 31 .

34. El método de acuerdo con la reivindicación 33, en donde el trastorno o la condición se selecciona a partir de lesiones osteolíticas - en especial lesiones osteolíticas asociadas con un mieloma, especialmente un mieloma múltiple, o con cánceres de hueso, mama, colon, melanocitos, hepatocitos, epitelio, esófago, cerebro, pulmón , próstata, o páncreas, o metástasis de los mismos; pérdida ósea asociada con trasplante; o es un osteosarcoma, cáncer de próstata, carci noma hepatocelular (HCC), mieloma, incluyendo mieloma múltiple, diabetes, obesidad, desecho muscular, enfermedad de Alzheimer, osteoporosis, osteopenia, reumatismo, colitis, y/o pérdida de cabello indeseada.

35. El método de acuerdo con la reivindicación 33, en donde el método comprende además administrar un segundo agente terapéutico.

36. El método de acuerdo con la reivindicación 35, en donde el agente quimioterapéutico es Zometa.

37. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 35, en donde el agente terapéutico adicional se selecciona a partir del grupo que consiste en un agente contra el cáncer; un agente anti-metabólico; un agente anti-diabético; un agente anti-osteoporótico; un antibiótico; un agente anti-inflamatorio; un factor de crecimiento; y una citoquina.

38. Un anticuerpo aislado, el cual comprende una primera secuencia de aminoácidos que es una cadena pesada seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:2-20, y una secuencia que tiene una identidad de secuencia de cuando menos el 95 por ciento en las regiones determinantes de com plementariedad con las regiones determ inantes de complementariedad ilustradas en las SEQ I D NOs:2-20; y una segunda secuencia de aminoácidos que es una cadena ligera seleccionada a parti r del grupo que consiste e n las SEQ I D NOs:21 -39, y una secuencia que tiene una identidad de secuencia de cuando menos el 95 por ciento en las regiones determ i nantes de complementariedad con las regiones determinantes de complementariedad i lustradas en las SEQ I D NOs:21 -

39. 39. Un inmunoconjugado, el cual comprende un primer componente que es un anticuerpo o fragmento del m ismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

40. U n kit que comprende un anticuerpo o fragmento del m ismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores .

41 . El kit de acuerdo con la reivindicación 40, el cual comprende además un veh ículo o excipiente farmacéuticamente aceptable para el m ismo.

42. El kit de acuerdo con la reivindicación 40 , en donde el anticuerpo está presente en una dosis unitaria.

43. El kit de acuerdo con la reivindicación 40, el cual comprende además instrucciones para utilizarse en la adm inistración a un sujeto.

44. U na composición, la cual com prende un anticuerpo anti- DKK1 /4 neutralizante.

45. El anticuerpo de la reivindicación 40, en donde el anticuerpo se enlaza con DKK1 con una Kact?vada de menos de 100 nM, 50 nM, 10nM, 1.0 nM, 500 pM ó 100 pM; y tiene un índice de desactivación para la DKK1 de menos de 10"2 por segundo, 10"3 por segundo, 10"4 por segundo, o 10'5 por segundo.

46. El anticuerpo de la reivindicación 40, en donde el anticuerpo tiene una afinidad de 102 a 106 más alta para DKK1 ó DKK4, comparándose con DKK2 ó DKK3.

47. El anticuerpo de la reivindicación 40, en donde el anticuerpo compite contra un anticuerpo anti-DKK1/4 neutralizante por el enlace con DKK1 ó DKK4.

48. Un método para el tratamiento de enfermedades con una composición que comprende cuando menos una secuencia de polipéptido de la SEQ ID NO:118, y una secuencia de polipéptido de la SEQ ID NO:119, o los cambios conservadores o humaneered (humanodiseñados) de las mismas, en donde la composición es un anticuerpo anti-DKK1/DKK4 neutralizante.

49. Un método para prevenir o tratar enfermedades proliferativas, o enfermedades tales como un cáncer, en un mamífero, en particular en un ser humano, con una combinación de agentes farmacéuticos que comprende: (a) una composición anti-DKK1/4 neutralizante; y (b) uno o más agentes farmacéuticamente activos. La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden: (a) una composición anti-DKK1/4 neutralizante; (b) un agente farmacéuticamente activo; y (c) un vehículo farmacéuticamente aceptable. La presente invención se refiere además a un paquete comercial o a un producto que comprende: (a) una formulación farmacéutica de una composición anti-DKK1/4 neutralizante; y (b) una formulación farmacéutica de un agente farmacéuticamente activo para su uso simultáneo, concurrente, separado, o en secuencia.

50. El método de la reivindicación 49, en donde el agente farmacéuticamente activo es en especial cualquier agente farmacéuticamente activo diferente de una composición anti-DKK1/4 neutralizante, o un derivado del mismo, cuyo agente se selecciona a partir de: i. un inhibidor de aromatasa; ii. un anti-estrógeno, un anti-andrógeno, o un agonista de gonadorelina; iii. un inhibidor de topoisomerasa I o un inhibidor de topoisomerasa II; iv. un agente activo en microtúbulos, un agente alquilante, un anti-metabolito anti-neoplástico, o un compuesto de platina; v. un compuesto que dirige/reduce la actividad de una cinasa de proteína o de lípido, o la actividad de una fosfatasa de proteína o de lípido, un compuesto anti-angiogénico adicional, o un compuesto que induce los procesos de diferenciación celular; vi. anticuerpos monoclonales; vii. un inhibidor de ciclo-oxigenasa, un bisfosfonato, un inhibidor de heparanasa, un modificador de la respuesta biológica; viii. un inhibidor de las isoformas oncogénicas ras; y ix. un inhibidor de telomerasa; x. un inhibidor de proteasa, un inhibidor de metaloproteinasa de matriz, un inhibidor de aminopeptidasa de metionina, o un inhibidor de proteasoma; xi. agentes utilizados en el tratamiento de malignidades hematológicas, o compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de Flt-3; xii. un inhibidor de HSP90; xiii. anticuerpos anti-proliferativos; xiv. un inhibidor de desacetilasa de histona (HDAC); xv. un compuesto que dirige, reduce, o inhibe la actividad/función de la cinasa mTOR de serina/treonina; xvi. un antagonista del receptor de somatostatina; xvii. un compuesto anti-leucémico; xviii. planteamientos que dañan las células tumorales; xix. un enlazador de EDG; xx. un inhibidor de reductasa de ribonucleótido; xxi. un inhibidor de descarboxilasa de S-adenosil-metionina; xxii. un anticuerpo monoclonal de VEGF ó VEGFR; xxiii . terapia fotodinámica; xxiv. un esteroide angiostático; xxv. un implante que contiene corticosteroides; xxvi. un antagonista del receptor AT1 ; y xxvii. un inhibidor de ACE.

51 . Un anticuerpo que se enlaza con DKK1 con una afinidad (KD) de 10"8 o menos, y compite con cualquiera de los anticuerpos de la reivindicación 1 .

52. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 51 , el cual no se enlaza detectablemente con DKK2 ó DKK3.

53. El anticuerpo de la reivindicación 52, en donde el anticuerpo se enlaza con DKK1 ó DKK4 con una (KD) de 10"3 o más alta.