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MX2008008138A - Prueba de activacion de monocito mejorada para tener mejor capacidad para detectar contaminantes pirogenicos sin endotoxina en productos medicos. - Google Patents

Prueba de activacion de monocito mejorada para tener mejor capacidad para detectar contaminantes pirogenicos sin endotoxina en productos medicos.

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MX2008008138A
MX2008008138A MX2008008138A MX2008008138A MX2008008138A MX 2008008138 A MX2008008138 A MX 2008008138A MX 2008008138 A MX2008008138 A MX 2008008138A MX 2008008138 A MX2008008138 A MX 2008008138A MX 2008008138 A MX2008008138 A MX 2008008138A
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MX
Mexico
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monocyte
test
reservoir
antibody
microtiter
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MX2008008138A
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Mehul Patel
Stephen Poole
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Baxter Int
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Abstract

Se describe una prueba de activación de monocitos mejorada, la cual tiene mejor capacidad de detectar pirógenos sin endotoxina en productos médicos, en donde la muestra se incuba con un reactivo que contiene monocitos en un sistema de ensayo que comprende al menos una superficie que comprende polipropileno. La presente invención también se refiere a sistemas de ensayo para utilizarse en estas pruebas que incluyen al menos un depósito de microtitulación que tiene al menos una superficie interior que comprende polipropileno y que tiene una forma tal que el reactivo que contiene monocitos se concentra en el depósito para proporcionar un mayor contacto célula con célula. La presente invención también se refiere a un equipo de diagnóstico que puede ser utilizado para probar la presencia de pirógenos sin endotoxina en una muestra.

Description

PRUEBA DE ACTIVACIÓN DE MONOCITO MEJORADA PARA TENER MEJOR CAPACIDAD PARA DETECTAR CONTAMINANTES PIROGÉNICOS SIN ENDOTOXINA EN PRODUCTOS MÉDICOS Campo de la Invención La presente invención se refiere de manera general a una prueba de activación de monocitos mejorada que tiene una mejor capacidad para detectar pirógenos sin endotoxina en productos médicos, en donde una muestra se incuba con un reactivo que contiene monocitos en un sistema de ensayo que comprende al menos una superficie que comprende polipropileno. La presente invención también se refiere a sistemas de ensayo para utilizarse en estas pruebas, los cuales incluyen al menos un depósito de microtitulación que tiene al menos una superficie interior que comprende polipropileno y que tiene una forma tal que el reactivo que contiene monocitos se concentra en el depósito para proporcionar un mayor contacto célula con célula. La presente invención también se refiere a un equipo de diagnóstico que se puede utilizar para probar la presencia de pirógenos sin endotoxina en una muestra. Antecedentes de la Invención Cuando ciertos compuestos químicos o biológicos se ponen en contacto con el sistema circulatorio de humanos u otros mamíferos, originan una respuesta sistémica conocida como respuesta inflamatoria o inflamación. La respuesta inflamatoria es un mecanismo de defensa para proteger al cuerpo de infección y/o lesión; la inflamación incrementa el flujo sanguíneo al sitio de inyección o lesión, llevando fluidos, proteínas y glóbulos blancos (leucocitos) necesarios para ayudar en el proceso de curación. Por ejemplo, un síntoma asociado con la respuesta inflamatoria es una elevación en la temperatura corporal o fiebre, que funciona como un mecanismo de defensa a patógenos que originan un sobre-calentamiento. La respuesta inflamatoria puede estar asociada con una variedad de síntomas "tipo flu" que incluyen fiebre, escalofríos, fatiga, dolor de cabeza, pérdida de apetito y rigidez muscular. Un compuesto químico o biológico que dispara la fiebre ha sido referido históricamente como un pirógeno o un compuesto "pirogénico", que se refiere a la respuesta con fiebre que dichos compuestos pueden originar. Sin embargo, dichos compuestos químicos o biológicos, generalmente son pro-inflamatorios y pueden o no originar fiebre como parte de la respuesta inflamatoria que pueden originar. En algunos casos, dependiendo de la sensibilidad del individuo y el tipo de concentración de pirógenos al que está expuesto el individuo, un individuo puede desarrollar síntomas tipo shock que ponen en riesgo la vida después de un pirógeno. Los productos médicos que pueden ser inhalados, inyectados, o infusionados y los aparatos médicos tales como membranas o materiales implantados, ponen un riesgo particular de pirogenicidad. Incluso los nutrientes pueden representar un riesgo de pirogenicidad. Los pirógenos contenidos en productos médicos y nutrientes son referidos como pirógenos exógenos; en contraste, los pirógenos endógenos son compuestos mensajeros del sistema inmune que transmiten una respuesta inflamatoria individual a los pirógenos exógenos. Además de la naturaleza pirogénica de un producto por si mismo o sub-productos de sub-producción, la contaminación del producto con frecuencia puede originar pirogenicidad. La pirogenicidad debido a contaminación de un producto puede ser originada por cualquiera de un grupo diverso de pirógenos derivados de bacterias, viruses, hongos o incluso del huésped. Este problema puede persistir incluso si el producto es "esterilizado" mediante calor o métodos químicos; un compuesto pirogénico comúnmente encontrado, endotoxina bacteriana (que consiste en gran parte de lipopolisacárido (LPS) de la pared celular de bacteria Gram-negativa) que puede permanecer después de que exterminan las bacterias. Por lo tanto, las pruebas de pirógeno derivados farmacéuticos, nutrientes y productos médicos para aplicación parenteral es necesario con el objeto de asegurar la seguridad de dichos productos. Normalmente los productos que actúan como un pirógeno, realizan esto estimulando la producción de pirógenos endógenos, tales como prostaglandinas y citocinas, pro-inflamatorias, en monocitos después del contacto con tejido, células o fluidos corporales. Son estos pirógenos producidos en forma endógena los que transmiten la respuesta inflamatoria en el organismo afectado. Lo más importante y bien conocido de estos pirógenos endógenos, son las citocinas, interleucina-1 (IL-1), interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 ( I L - 8 ) y factor de necrosis de tumor (TNF) y la prostaglandina transmisora de lípidos de bajo peso molecular E2 (PGE2). Estos compuestos son ensayados en forma rutinaria mediante ensayos ELISA, o ensayos inmunoabsorbentes enlazados por enzimas (para IL-1, IL-6, o TNF), y EIA, o inmunoensayo de enzima (para PGE2). Con el objeto de evitar una reacción pirogénica y confirmar la seguridad de cualquier fármaco o producto farmacéutico administrado en forma parenteral, la contaminación pirogénica debe ser monitoreada para identificar lotes individuales que están contaminados con contaminantes bacterianos. Dos métodos de la Farmacopea a base de animales, la prueba de Usado de amebocito Limulus (LAL), también referido como prueba de endotoxinas bacterianas (BET), y la prueba de pirógeno de conejo, son utilizadas de manera rutinaria normalmente para monitorear contaminación de pirógenos en productos farmacéuticos producidos en masa. La prueba de conejo es una prueba in vivo que consiste en inyectar un número estadísticamente significativo de conejo con el compuesto de muestra y observar el surgimiento promedio en la temperatura corporal provocada en los animales de prueba. Aunque la prueba de conejo responde a un amplio espectro de agentes pirogénicos, incluyendo pirógenos sin endotoxinaa, la prueba de conejo tiene una sensibilidad relativamente baja (ng endotoxina/ml) en comparación con otras pruebas de pirógenos (pg endotoxina/ml para la prueba LAL). Además, la correlación de respuestas pirogénicas a compuestos entre especies, es cuando mucho, un aproximado. Se ha documentado, por ejemplo, que la dosis de la endotoxina bacteriana que provoca una respuesta pirogénica varía tanto como 10,000 veces entre las especies. La insensibilidad relativa, resultados cuantitativos deficientes, variabilidad entre especies de conejos y aspectos éticos implicados en las pruebas con animales, han desfavorecido la prueba con conejos en los últimos años. En contraste con la prueba de conejos, que detecta un amplio rango de pirógenos, la prueba LAL únicamente detecta pirógenos de endotoxina. La endotoxina bacteriana, por ejemplo, es lipopolisacárido (LPS), que viene de la pared celular de bacterias Gram-negativa , es uno de los compuestos pirogénicos mejor descritos (Moltz y asociados, N eu rosci . Biobehav. Rev.. 1993, 17, 237-269; Tilders y asociados, Psvchoneuroendocrinoloqy, 1994, 19, 209-232; Rothwell, Crit. Rev. Neurobiol., 1994, 8, 1-10; Zeisberger y Roth, Neuropsvchobioloqy, 1993, 28, 106-109). Por consiguiente se consideró que era generalmente útil reemplazar experimentos con conejos costosos y tardados con una prueba LAL directa para endotoxina bacteriana. Este método tiene limitaciones obvias. La prueba LAL es una prueba in vitro muy sensible; sin embargo, únicamente detecta endotoxinas de bacteria Gram-negativa y proporciona resultados negativos falsos con ciertos productos que aún pueden estimular monocitos para elaborar citocinas pirogénicas. La prueba LAL también es susceptible a interferencia, por ejemplo, a través de altos niveles de proteína de sustancias de prueba o mediante glucanos (Roslansky y Novitsky, J. Clin. Microbiol. , 1991, 29, 2477; Fennrich y asociados, Dev. Biol. Stand., 1999, 101, 131 ). Por otra parte, la prueba Limulus es tan sensible que puede estar fácilmente propensa a resultados positivos falsos debido a impurezas que no son relevantes para la calidad del producto (Fujiwara y asociados, Yakuqaku Zasshi, 1990, 1 10, 332-340). Por lo tanto, existe la necesidad de un sistema de pruebas a base de no animales que esté caracterizado por alta sensibilidad, alta especificada y la capacidad de detectar un amplio rango de pirógenos. Con este proyecto y esta comprensión mejorada de la respuesta inflamatoria humana, los sistemas de prueba con base en la activación in vitro de monocitos humanos han sido desarrollados. Hace casi 20 años, los investigadores utilizaban células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para detectar endotoxina monitoreando la liberación de citocinas pirogénicas. (Dinarello y asociados, J__. Clin. Microbiol. , 1984, 20, 323; Duff y Atkins, J. Immunol. Methods, 1982, 52, 323). Desde entonces, se han desarrollado varios diferentes sistemas de prueba que utilizan diferentes fuentes de monocitos humanos, incluyendo sangre completa periférica humana (WB), PBMCs, o líneas celulares monolíticas tales como MONOMAC-6 (MM6) (Ziegler-Heitbrock y asociados, Int. J. Cáncer, 1988, 41, 456) o THP-1 (Tsuchiya y asociados, Int. J. Cáncer, 1980, 26, 171 ), y varias lecturas, incluyendo factor alfa de necrosis de tumor de citocinas pirogénicas, TNF-a, IL-6, IL-1/3, y la neopterina de metabolito no pirogénica (Hartung y asociados, The Report y Recommendations of ECVAM Workshop 43, 2001, 29, 99; Poole y Gaines Das. Eur J Parenteral Sciences, 2001, 6, 63; Poole y asociados, Immunol. Methods, 2003, 274, 209; Gaines Das y asociados, J Immunol Methods, 2004, 288, 165). Recientemente, en un estudio Europeo de colaboración, se evaluaron seis de las pruebas de activación de monocitos más prominentes, utilizando cada una diferente combinación de las fuentes celulares y lecturas antes mencionadas, con respecto a la capacidad de detectar endotoxina en productos médicos ajustados con varias concentraciones de endotoxina pura. En cinco de las seis pruebas, las células fueron cultivadas en placas de poliestireno de 96 depósitos con depósitos de fondo plano (Hoffmann y asociados, J. Immunol. Methods, 2005, 298, 161). En la sexta prueba, con base en las publicaciones de (based on Fennrich y asociados, Dev. Biol. Stand., 1999; Fennrich y asociados, ALTEX , 1999; Hartung y asociados, 2001 ), se utilizaron tubos centrífugos de Eppendorf (1.2 mi) elaborados de poliestireno, con fondos cónicos para la mayor parte de la evaluación, y en otra parte del estudio, se sustituyeron los tubos de polipropileno (1.5 mi), con fondos redondos, por los tubos de polietileno de Charles River Laboratories, el fabricante del equipo de prueba Endósate® In vitro Pyrogen Test (IPT) utilizado en el estudio. Esta sustitución no reportó tener efecto significativo en la prueba, y los propios tubos de polipropileno fueron reemplazados posteriormente con placas de 96 depósitos de poliestireno de fondo plano, cuando los laboratorios Charles River Laboratories modificaron el Endosafe® IPT para volúmenes reducidos. La fuente de monocitos en esta prueba fue sangre completa y las lecturas fueron IL-?ß. La sangre completa fue incubada con varios fármacos ajustados con diferentes concentraciones de endotoxina. Carlin y Viitanen describen una prueba de activación de monocitos, con base en sangre completa o células MONOMAC-6 como la fuente de monocitos y IL-6 como la lectura, para evaluar la pirogenicidad inherente de la vacuna Infanrix, la cual contiene antígenos Gram-positivo y Gram-negativo, incluyendo varios pirógenos sin endotoxina, por ejemplo toxoide Diphtheria , toxoide Pertussis, y toxoide Tetanus (Pharmeuropa, 2003, 15, 3, 418-423). Las células fueron cultivadas a una baja densidad celular en tubos de grado Bio-Pure de Eppendorf libres de endotoxina de composición no descrita. La pirogenicidad de la vacuna no fue el resultado de la contaminación de la vacuna durante su fabricación o almacenamiento. Hartung y Wendel describen una activación de monocitos con base en sangre completa como la fuente de monocitos y I L - 1 ß como la lectura preferida, para detectar pirógenos de endotoxina y sin endotoxina en sus formas puras, es decir, LPS preferente de Salmonella abortus equi, streptolysin O (SLO) procedente de Streptococcus pyrogens, y dipéptido de muramilo (MDP) (Hartung y Wendel, In Vitro Toxicolog y. 1996, 9, 4, 353-359; Patente Norteamericana No. 5,891,728). Las células fueron cultivadas en tubos de polipropileno. Yamamoto y asociados describe una prueba de activación de monocitos con base en sangre completa o células de diferentes líneas celulares humanas, siendo preferidas la línea celular 28SC, como la fuente de monocitos/células monolíticas y IL-6 como la lectura preferida, para detectar pirógenos de endotoxina (Jpn. J. Infect. Dis., 2003, 56, 93-100). La prueba de endotoxina se sabe que anticipa la posibilidad de una sinergia in vivo entre la endotoxina un fármaco parenteral, particularmente interferón, de modo que el fármaco aumenta los efectos pirogénicos de la endotoxina. Las células fueron cultivadas con cualquier endotoxina en su forma pura o una mezcla de endotoxina en su forma pura e interferón humano. Las células de la línea celular fueron cultivadas en placas de 96 depósitos de poliestireno con depósitos de fondo redondo. Las células de sangre fueron cultivadas en tubos de material no específico. Nakagawa y asociados describe una prueba de activación de monocitos, con base en sangre completa de células MM6-CA8 (un subclon de MONOMAC-6) como la fuente de monocitos y IL-6 como la lectura preferida, para detectar pirógenos de endotoxina y sin endotoxina en sus formas puras, es decir LPS de E. coli 055:B5 y péptidoglican ¡nsoluble (PG) derivado de S. aureus (Clinical y Diagnostic Laboratory Immunol., 2002, 9, 3, 588-597). Las células MM6-CA8 fueron cultivadas en placas de 96 depósitos de poliestireno. Las células de sangre fueron cultivadas en tubos de polipropileno; los volúmenes utilizados (225 µ? se sangre, 25 µ? de solución de prueba, 750 µ? de solución salina) excluyeron los utilizados de las placas de 96 depósitos estándar (250 µ?/depósito). Recientemente, varias fuentes indican que el polipropileno será evitados en pruebas de pirógenos. Por ejemplo, los laboratorios Charles River Laboratories recomiendan evitar el polipropileno debido a la naturaleza hidrofóbica de una superficie de polipropileno que puede dar como resultado la absorción de endotoxinas en dicha superficie debido a los dominios hidrofóbicos asociados con el componente de líquido A de LPS (Charles River Laboratories, Endosa fe Times, Sept. 2004). Harían Sera-Lab, un fabricante de pruebas de bioseguridad, manifiesta que los tubos de polipropileno pueden interferir con un ensayo LAL (Harían Sera-Lab, 2004 Catalogue). Y, la Asociación European Dialysis and Transplant Nurses Association así como la Asociación European Renal Care Association recomendó evitar el polipropileno y utilizar poliestireno en pruebas de endotoxina, debido a que el poliestireno no absorbe normalmente la endotoxina (lineamientos EDTNA/ERCA). Por lo tanto, existe la necesidad de una prueba de pirógenos a base de no animales, caracterizado por alta sensibilidad, alta especificidad y la capacidad de detectar un amplio rango de contaminantes pirogénicos en productos médicos. Breve Descripción de la Invención Los solicitantes han desarrollado una prueba de pirógenos i n vitro que es sensible y detecta contaminantes pirogénicos presentes en productos médicos. Generalmente, la presente invención se dirige a un método para detectar pirógenos sin endotoxina en una muestra, combinando monocitos, es decir, en la forma de un reactivo que contiene monocitos, y la muestra que será probada en un primer sistema de ensayo que comprende al menos una superficie que comprende polipropileno, de modo que los monocitos estén en contacto con la superficie. Los monocitos y la muestra se incuban de modo que los monocitos produzcan una citocina o un transmisor endógeno de respuesta inflamatoria durante la incubación. Los contenidos del primer sistema de ensayo se transfieren a un segundo sistema de ensayo que comprende al menos una superficie tratada con un anticuerpo para una citocina o un transmisor endógeno o marcador de la respuesta inflamatoria. El segundo sistema de ensayo se ensaya para la presencia de citocina o transmisor endógeno enlazado al anticuerpo en la superficie. Cuando los monocitos utilizados en este método son PBMCs o células de línea celular monolítica, los monocitos están presentes en los sistemas de ensayo en una alta densidad celular. La presente invención también se dirige de manera general a un método para detectar pirógenos sin endotoxina en un producto médico administrado en forma parenteral, combinando sangre completa, como el reactivo que contiene monicitos, y el producto médico que será probado en un primer sistema de ensayo que comprende al menos una superficie que comprende polipropileno, de modo que la sangre esté en contacto con la superficie. La sangre y el producto médico se incuban de modo que la sangre produzca la citocina IL-6 durante la incubación. Los contenidos del primer sistema de ensayo son transferidos a un segundo sistema de ensayo que comprende al menos una superficie tratada con un anticuerpo para IL-6. El segundo sistema se ensayo se ensaya para la presencia de IL-6 enlazado al anticuerpo en la superficie. La presente invención se refiere además a un método para cultivar monocitos, es decir, en la forma de un reactivo que contiene monicitos, para utilizarse en una prueba de pirógenos sin endotoxina que combina los monocitos en una muestra que será probada en un sistema de ensayo que comprende al menos una superficie que comprende polipropileno, de modo que los monocitos estén en contacto con la superficie. La presente invención también se dirige a un método para cultivar monocitos como parte de una prueba de pirógenos sin endotoxina, combinando los monocitos y una muestra en un sistema de ensayo que comprende al menos un depósito de microtitulador formado de manera que el reactivo que contiene monocitos esté concentrado en comparación con un depósito de microtitulador de fondo plano, una superficie del depósito que comprende polipropileno, de modo que los monocitos estén en contacto con la superficie. Cuando los monocitos utilizados en estos métodos de cultivos son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o células de línea celular monocítica, los monocitos se encuentran en los sistemas de ensayo en una alta densidad celular. La presente invención también se dirige a un método para detectar pirógenos sin endotoxina en un producto médico administrado en forma parenteral, combinando sangre completa, como el reactivo que contiene monocitos y el producto médico que será probado en un sistema de ensayo que comprende al menos una superficie que comprende polipropileno y al menos una superficie tratada con un anticuerpo para IL-6, de modo que la sangre está en contacto con la superficie que contiene polipropileno, y ensayar el sistema de ensayo para la presencia de IL-6 enlazada al anticuerpo en la superficie. La presente invención proporciona además un equipo de diagnóstico que contiene una placa de microtitulación que comprende una pluralidad de depósitos de microtitulación formados de tal manera que el medio de cultivo contenido en cada depósito esté concentrado en comparación con un depósito de microtitulación de fondo plano, una superficie de cada depósito comprendiendo polipropileno, y monocitos críoconservados, es decir, en la forma de un reactivo que contiene monocito críoconservado, contenido en los depósitos en una placa de microtitulación, de modo que los monocitos estén en contacto con las superficies de los depósitos. Cuando los monocitos en el equipo son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o células de línea celular monolítica, los monocitos se encuentran en los depósitos a una alta densidad . La presente invención también proporciona un equipo de diagnóstico que contiene un sistema de ensayo para detectar pirógenos sin endotoxina en un producto médico administrado en forma parenteral, comprendiendo un sistema de ensayo una placa de microtitulación que comprende una pluralidad de depósitos de microtitulación formados de modo que el medio de cultivo contenido en cada depósito sea concentrado en comparación con un depósito de microtitulación de fondo plano, una superficie de cada depósito comprendiendo polipropileno, sangre completa críoconservada, en la forma del reactivo que contiene monocito críoconservado, contenido en los depósitos de la placa de microtitulación, de modo que la sangre esté en contacto con las superficies de los depósitos, y un anticuerpo para I L-6. Otros objetos y características de la presente invención, podrán ser apreciados y señalados más adelante. Breve Descripción de los Dibujos La figura 1, es una gráfica que ilustra respuestas IL-6 para muestras de prueba que tienen cuatro diferentes densidades celulares (1 millón, 0.5 millones, 0.25 millones y 0.13 millones PBMC por 250 pl depósito) en una prueba de activación de monocitos llevada a cabo con células mononucleares de sangre periférica o placas de polipropileno con depósitos de fondo redondo, con IL-6 como la lectura. Las respuestas IL-6 are son para el estándar de endotoxina (1 unidad de endotoxina por mi) y control positivo Extraneal® (es decir, un lote de este producto contaminado con pirógeno sin endotoxina). La figura 2, es una gráfica que ilustra las respuestas IL-6 para muestras de prueba que tiene una baja densidad celular en una prueba de activación de monocitos llevada a cabo con sangre completa en placas de poliestireno con depósitos de fondo plano. Las respuestas IL-6 serán LPS, control negativo Extraneal® (es decir, un lote limpio de este producto), control positivo Extraneal®, control negativo de Hemoglobina (Hb) (es decir, un lote limpio de este producto), y control positivo de Hemoglobina (Hb) (es decir, un lote de este producto contaminado con pirógeno sin endotoxina). La figura 3, es una gráfica que ilustra respuestas IL-6 para muestras de prueba que tiene una baja densidad celular en una prueba de activación de monocitos llevada a cabo con células mononucleares de sangre periférica sobre placas de poliestireno en depósitos de fondo redondo. Las respuestas IL-6 son para LPS, controles positivos y negativos Extraneal® y controles positivos y negativos Hb. La figura 4, es una gráfica que ilustra las respuestas IL-6 de muestras de prueba que tiene baja densidad celular en una prueba de activación de monocito llevada a cabo con células MONOMAC6 en placas de poliestireno con depósitos de fondo redondo. Las respuestas IL-6 son para LPS, controles positivos y negativos Extraneal® y controles positivos y negativos Hb. La figura 5, es una gráfica que ilustra las respuestas IL-6 para muestras de prueba que tiene una baja densidad celular en una prueba de activación de monocitos llevada a cabo con células THP-1 en placas de poliestireno con depósitos de fondo redondo. Las respuestas IL-6 son para LPS, controles positivos y negativos Extraneal® y controles positivos y negativos Hb. La figura 6, es una gráfica que ilustra respuestas TNF-s de muestras de prueba que tiene una baja densidad celular en una prueba de activación de monocitos llevada a cabo con células THP-12A9 sobre placas de poliestireno con depósitos de fondo redondo. Las respuestas TNF-a son para LPS, controles positivos y negativos Extraneal® y controles positivos y negativos Hb. La figura 7, es una gráfica que ilustra las respuestas IL-6 para muestras de prueba que tiene baja densidad celular en una prueba de activación de monocitos ¡levada a cabo con células de clon MONOMAC6-CA8 sobre placas de poliestireno con depósitos de fondo redondo. Las respuestas IL-6 serán para LPS, y controles positivos y negativos Extraneal®. La figura 8, es una gráfica que ¡lustra respuestas IL-6 para muestras de prueba que tiene baja densidad celular en una prueba de activación de monocitos llevada a cabo con células 28SC en placas de poliestireno con depósitos de fondo redondo. Las respuestas IL-6 son para LPS y controles positivos y negativos de dextrano. La figura 9, es una gráfica que ilustra respuestas IL-6 de muestras de prueba que tienen alta densidad celular en una prueba de activación de monocitos llevada a cabo con células mononucleares de sangre periférica sobre placas de polipropileno con depósitos de fondo redondo. Las respuestas IL-6 serán para LPS, controles positivos y negativos Extraneal® y controles positivos y negativos de dextrano. La figura 10, es una gráfica que ilustra respuestas IL-6 de muestras de prueba que tiene una baja densidad celular en una prueba de activación de monocitos llevada a cabo con sangre completa en placas de polipropileno con depósitos de fondo redondo. Las respuestas IL-6 son para LPS, y controles positivos y negativos Extraneal®. La figura 11A, es una gráfica que ¡lustra respuestas IL-6 de placas de polipropileno (columnas negras) y placas de poliestireno (columnas color gris) en una prueba de activación de monocitos llevada a cabo con células mononucleares de sangre periférica (1 millón de células por depósito). Las respuestas IL-6 son para LPS, controles positivos y negativos Extraneal® y controles positivos y negativos Hb. La figura 11B, es una gráfica que ilustra respuestas I L - ß de placas de polipropileno (columnas negras) y placas de poliestireno (columnas color gris) en una prueba de activación de monocitos llevada a cabo con células mononucleares de sangre periférica (1 millón de células por depósito). Las respuestas IL-?ß son para LPS, controles positivos y negativos Extraneal® y controles positivos y negativos Hb. La figura 12A, es una gráfica que ¡lustra respuestas IL-6 de muestras de prueba que tienen alta densidad celular en una prueba de activación de monocitos llevada a cabo con células mononucleares de sangre periférica sobre placas de polipropileno con depósitos de fondo redondo. Las respuestas IL-6 son para LPS y controles positivos y negativos Extraneal®.
La figura 12B, es una gráfica que ilustra respuestas IL-6 de muestras de prueba que tienen baja densidad celular en una prueba de activación de monocitos llevada a cabo con células mononucleares de sangre periférica sobre placas de poliestireno con depósitos de fondo redondo. Las respuestas IL-6 son para LPS y controles positivos y negativos Extraneal®. La figura 13A, es una gráfica que ilustra respuestas IL-6 para las muestras de prueba que tienen alta densidad celular en una prueba de activación de monocitos llevada a cabo con células mononucleares de sangre periférica sobre placas de polipropileno con depósitos de fondo redondo. Las respuestas IL-6 son para LPS y controles positivos y negativos Extraneal®. La figura 13B, es una gráfica que ilustra las respuestas IL- 6 de muestras de prueba que tienen alta densidad celular en una prueba de activación de monocitos llevada a cabo con células mononucleares de sangre periférica sobre placas de poliestireno con depósitos de fondo redondo. Las respuestas IL-6 son para LPS y controles positivos y negativos Extraneal®.
La figura 14A, es una gráfica que ilustra respuestas IL-6 para muestras de prueba que tienen alta densidad celular en una prueba de activación de monocitos llevada a cabo con células mononucleares de sangre periférica en placas de polipropileno con depósitos de fondo redondo. Las respuestas IL-6 son para LPS y controles positivos y negativos Extraneal®.
La figura 14B, es una gráfica que ilustra respuestas IL-6 de muestras de prueba que tienen alta densidad celular en una prueba de activación de monocitos llevada a cabo con células mononucleares de sangre periférica en placas de poliestireno con depósitos de fondo redondo. Las respuestas IL-6 son para LPS y controles positivos y negativos Extraneal®. La figura 15, es una gráfica que ilustra respuesta I L - 1 ß de muestras de prueba que tienen alta densidad celular en una prueba IPT comercialmente disponible llevada a cabo con sangre completa en placas de poliestireno con depósitos de fondo redondo. Las respuestas I L - 1 ß son para LPS, controles positivos y negativos Extraneal®, controles positivos y negativos de hemoglobina, control salino y control Gram positivo. Descripción Detallada de la Invención Los pirógenos estimulan monocitos de sangre (asi como otros leucocitos) y macrófagos que producen y liberan numerosos transmisores pirogénicos endógenos de la respuesta inflamatoria, incluyendo citocinas (por ejemplo, TNF-s, IL-1/3, y IL-6).. la liberación de estos transmisores pirogénicos en la circulación ha sido una cascada de eventos que conducen a una respuesta inflamatoria en el individuo afectado. La prueba de activación de monocitos de la presente invención, depende de la medida de estos pirógenos endógenos como un marcador de una respuesta inflamatoria. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, se incuba una muestra con un reactivo que contiene monocitos en un primer sistema de ensayo que comprende una superficie comprendida de polipropileno, el reactivo que contiene monocitos estando presente en el sistema de ensayo en una alta densidad. Los contenidos del primer sistema de ensayo posteriormente son transferidos a un segundo sistema de ensayo que comprende una superficie recubierta con anticuerpos anti-citocina, y el segundo sistema de ensayo es ensayado para la presencia de citocinas enlazadas a la superficie a través de los anticuerpos.
Las pruebas de pirógenos de la presente invención se utilizan para detectar pirógenos sin endotoxina es decir bacteria G ra m-positi va (por ejemplo, Staphylococcus aureus) o sus componentes (por ejemplo, muropéptido, ácido lipoteicoico, enterotoxinas, estreptolisina), estimuladores inmune tales como fitohemaglutimina o forbolesteras, así como endotoxina. Debido a que la prueba utiliza la respuesta de citocina de monocitos para diversos pirógenos en lugar de una respuesta especifica a endotoxina de bacteria Gram negativa, se puede detectar un amplio espectro de agentes pirogénicos con la prueba de la presente invención. Las pruebas de pirógeno de la presente invención han mostrado ser más efectivas para detectar pirógenos sin endotoxina en lotes contaminados de un producto médico con comparación con pruebas convencionales. Los ejemplos de la presente invención muestran que estas pruebas convencionales no tiene la capacidad de distinguir muestras de control positivo de una solución de diálisis peritoneal Extraneal®, hemoglobina, o dextrano de muestras de control negativo de los mismos parenterales. La muestra de control positivo Extraneal® se obtuvo de un lote de producto contaminado con pirógenos sin endotoxina; el otro contaminado originó reacciones adversas en humanos, aunque probó ser negativo para la presencia de pirógeno de acuerdo con una prueba LAL, la cual únicamente prueba los pirógenos de endotoxina (Martis, y asociados, Lancet, 365(9459), 588). La muestra de control positivo de hemoglobina obtenida de un lote de producto contaminado con pirógeno sin endotoxina; el otro contaminado originó respuestas de fiebre en conejos, aunque probó ser negativo para la presencia de pirógeno de acuerdo con una prueba LAL. El control positivo de dextrano fue una preparación de dextrano que se ha descubierto que origina fiebre en humanos aunque probó ser negativo para la presencia de pirógeno de acuerdo con una prueba LAL. La capacidad de la prueba de detectar contaminantes sin endotoxina en productos médicos es de gran valor ya que permite la identificación de lotes de producto médico contaminado antes de que el lote sea liberado para utilizarse en pacientes. Las pruebas conocidas funcionan bien dentro del contexto de detectar pirógenos sin endotoxina y con endotoxina puro, es decir peptidoglican (PG) de S. aureus y LPS de E. col i tal como se describe en la Publicación de Nakagawa y asociados, tal como se describió anteriormente, o el ajuste de endotoxina de productos, es decir, se ajustaron varios fármacos con diferentes concentraciones de endotoxina en las seis pruebas del Estudio Humano(e) tal como se describió anteriormente. La función de las pruebas LAL proporcionó de manera efectiva un producto médico contaminado con endotoxina (Mascoli, CC, Weary, M. E., J Parenter Druq Assoc. 2003, 33, 81 ; Mascoli, CC, Weary, M.E., Proq Clin Biol Res. 2003, 29, 387). Sin embargo, cuando un producto médico está contaminado con pirógenos sin endotoxina, dichas pruebas fallan en detectar el pirógeno. Sin limitarse a una teoría en particular, se considera que el pirógeno sin endotoxina intercepta con el producto médico dando como resultado un "ocultamiento" del pirógeno y la incapacidad de detectar contaminantes sin endotoxina. Las pruebas de pirógeno de la presente invención, superan este efecto de ocultamiento y tienen la capacidad de detectar contaminantes sin endotoxina en productos médicos: por ejemplo, en una modalidad preferida, en la cual PBMCs se cultivaron a una alta densidad celular en depósitos de polipropileno de fondo redondo, la prueba de pirógeno de la presente invención tuvo la capacidad de distinguir entre muestras de control positivo y negativo de solución Extraneal® y dextrano (ver figura 9). Ninguno de los equipos disponibles que fueron probados tuvieron la capacidad de distinguir entre controles positivos y negativos Extraneal® o de hemoglobina (ver figuras 1 a 8). Nuevamente, sin pretender atarse a la teoría, se considera que las altas densidades celulares proporcionan más células para un mayor contacto célula con célula. El contacto incrementado célula con célula, facilita mayor comunicación entre células, y por consiguiente, da como resultado una respuesta inflamatoria mejorada a un contaminante pirogénico. Las células se comunican entre sí a través de transmisores solubles, tal como citocinas, y a través del contacto célula con célula, en donde las citocinas también pueden tomar parte. Un depósito de fondo redondo, o un depósito con forma general de modo que las células estén concentradas, proporciona un mayor contacto célula con célula en comparación con un depósito de fondo redondo. Y se considera que el polipropileno incrementa la biodisponibilidad de pirógenos sin endotoxina. Nuevamente, sin estar atados a una teoría en particular, se considera que el tratamiento de la superficie de las placas de poliestireno tal como se utiliza convencionalmente en cultivo celular, hace a su superficie menos hidrofóbica y con mejor capacidad de enlazar a células, pero también origina que su superficie enlace y neutralice los pirógenos sin endotoxina. La placa de polipropileno no está tratada en la superficie, de modo que permanece más hidrofóbica que la placa de poliestireno y probablemente neutraliza en menor cantidad los pirógenos sin endotoxina. 1. Componentes de Prueba de Pirógenos Una prueba de pirógeno que está caracterizada por cierta combinación de los tres elementos antes descritos, alta densidad celular, fondo redondo (o una forma adecuada diferente), y polipropileno, es decir, PBMCs presentes en una alta densidad celular en un depósito de poliestireno en fondo redondo, permite una detección mejorada de contaminación sin endotoxina en productos médicos. Las pruebas de pirógenos de la presente invención pueden utilizarse para probar una variedad de productos médicos para la presencia de contaminación sin endotoxina, incluyendo productos de sangre, productos médicos para administración parenteral, dializados, vacunas, soluciones intravenosas y cualquier fluido que contacte el cuerpo o fluidos corporales. A. Transmisores Citocina o Endógeno de la Respuesta Inflamatoria Cualquier transmisión endógena de la respuesta inflamatoria secretado por el reactivo que contiene monocitos que es detectable, puede ser utilizado como la base de la prueba de pirógeno de la presente invención. Sin embargo, preferentemente, se emplea un marcador de citocina o endotelina debido a que es más fácil ser detectado a través de un método de la presente invención. Se ha descubierto que los monocitos en sangre completa incubados con pirógeno con endotoxina o sin endotoxina produce varias clases de citocinas, incluyendo pero sin limitarse a citocinas pre-inflamatorias. (TNF-a, IL-1 , IL-6), citocinas antiinflamatorias (IL-4, IL-10, IL-13, I L-1 ra, TGF), Th1 (IL-2, IFN, IL-12), Th2 (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13), I L- 1 ß , I L- 1 ra , l L-8 y PGE2. Los marcadores de citocina preferidos para utilizarse en la presente invención incluyen TNF-a, I L- 1 ß , IL-1 ra, IL-6, I L-8 y PGE2. IL-6 es un marcador de citocina particularmente preferido para ensayarse en la presente invención. IL-6 se produce en cantidades detectables dentro de un periodo de incubación relativamente corto. IL-6 inmunorreactivo, a diferencia de I L - ß inmunorreactivo y TNF-a, se secreta completamente en el medio/sangre acondicionado con la célula, en grandes cantidades, lo que permite su estimado total. En contraste, TNF-a y I L - 1 ß inmunorreactivos permanecen en gran parte intracelulares, elevando la posibilidad de que las preparaciones de prueba que afectan la permeabilidad celular puedan interferir más fácilmente en la prueba con (inmunorreactivo) TNF-a o IL-1ß en la forma de la lectura, en lugar de IL-6 (ver figuras 2 y 3). Sin embargo, TNF-a o I L - 1 ß también pueden utilizarse como un marcador de citocina en la presente invención. TNF-a se produce en forma más temprana que IL-6 en la respuesta de pirógeno de monocito. Por lo tanto, una modalidad de la presente invención que ensaya TNF-a puede utilizar un tiempo de incubación más corto (~1 a 2 horas) que modalidades que ensayan IL-6. Los diferentes contaminantes pirogénicos pueden provocar diferentes respuestas de citocina en el cultivo celular. Por consiguiente, la presente invención puede ser diseñada para detectar la formación de citocinas particulares cuando la contaminación con un pirógeno particular que origina una secreción de dichas citocinas, es probable para un producto farmacéutico. B. Anticuerpo para el Transmisor de Citocina o Endógeno Una vez que la citocina que será ensayada ha sido determinada, se debe elaborar un anticuerpo para dicha citocina para utilizarse en la presente invención. Los anticuerpos policlonales purificados bajo condiciones estrictas, tal como se describe en el ejemplo 1 de la patente norteamericana No. 6,696,261, la cual está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia, trabajan bien en la prueba de pirógeno. Debido a que la sangre animal de la cual los anticuerpos policlonales se aislan es naturalmente libre de pirógenos (si se toma de animales saludables) se debe prevenir simplemente la contaminación de materiales sin procesar con pirógenos durante purificación para obtener un producto libre de pirógeno. Se utilizan amortiguadores libres de pirógeno y fases sólidas en columnas de cromatografía de afinidad para obtener anticuerpos policlonales libres de pirógenos tal como se describe en el ejemplol de la Patente Norteamericana No. 6,696,261. Como alternativa, se pueden utilizar anticuerpos monoclonales de cultivos de hibridoma. Sin embargo, cuando se utilizan anticuerpos monoclonales, se debe tener cuidado de aislar los anticuerpos de cualquier pirógeno contaminante que pueda encontrarse en el cultivo de célula de hibridoma. Para utilizarse en la presente invención, el anticuerpo para las citocinas se aplica a una superficie en un sistema de ensayo. Los métodos, tales como recubrimiento, para anticuerpos de enlace sobre la superficie en un sistema de ensayo, tal como depósito de microtitulación, son bien conocidos en las técnicas bioquímicas. Muchos sistemas de ensayo están comercialmente disponibles y el fabricante normalmente proporciona materiales e instrucciones para recubrir anticuerpos sobre una superficie del sistema. Debido a su facilidad de lectura y el pequeño volumen de muestra requerido, los depósitos de microtitulación en los cuales la parte de la superficie interior del depósito se recubre a través del anticuerpo, se utilizan en una modalidad preferida de la presente invención. Con el objeto de explotar completamente las ventajas de la presente invención, se prefiere que el microtitulador sea parte de una placa de microtitulación, la cual es una formación plana de depósitos similares, situados de modo que la formación de depósitos pueda ser leída con un equipo de lectura de placa de inmunoensayo automático (ver por ejemplo Patente Norteamericana No. 5,281,540, incorporada a la presente invención como referencia). El equipo automático tal como los lectores de placa ELISA (por ejemplo Ultramark Microplate Reader, disponible en Bio-Rad Laboratories, Inc.) automatiza el proceso de evaluación del ensayo y disminuye en gran medida el costo por prueba. Si se desea, las placas de depósitos de microtitulación se pueden hacer libres de pirógenos (si no están suministrados ya como tal) mediante un lavado extenso con amortiguador libre de pirógeno. En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, se recubren anticuerpos policlonales anti-IL-6 sobre los depósitos de una placa ELISA. Sin embargo, otros formatos de prueba de inmunodiagnóstico (por ejemplo, en donde el anticuerpo se recubre sobre una varilla indicadora o gránulo) son aceptables para utilizarse en la presente invención. Además del anticuerpo de "captura", otros anticuerpos y reactivos para utilizarse en el ensayo de las citocinas, pueden aplicarse cuando se elaboran sistemas de placa de microtitulación para utilizarse en la presente invención. Por ejemplo, después de que se aplica el anticuerpo de captura a la placa de microtitulación, los sitios de enlace restantes de la placa pueden ser "bloqueados con otra proteína. Después del bloqueo, el anticuerpo de detección etiquetado (tal como un anticuerpo biotinilado o etiquetado con enzimas) puede aplicarse a la placa de microtitulación, junto con un compuesto de glaseado protector. Por lo tanto, cuando se incuba una muestra en el depósito de microtitulación tal como se describirá más adelante, se captura una citocina liberada a través del anticuerpo de captura enlazado al depósito, y se etiqueta a través del anticuerpo de detección en forma simultánea durante el período de incubación de la muestra. C. Reactivo que Contiene Monocitos Como el primer paso en las pruebas de pirógeno de la presente invención, se cultivan células contenidas en el reactivo que contiene monocitos, combinando el reactivo que contiene monocitos y la muestra que será aprobada en un sistema de ensayo. El reactivo que contiene monocitos de la presente invención se selecciona del grupo que consiste en PBMCs, células de línea celular monocítica, sangre completa o cualquier línea celular que exprese o pueda ser elaborada para expresar los receptores tipo Toll (TLRs) que están implicados en las respuestas de transmisión a los activos proinflamatorios y pirogénicos, incluyen células en las cuales estos receptores han sido inducidos o clonados. Preferentemente, la línea celular monocítica es seleccionada del grupo que consiste en MONOMAC-6 (MM6), THP-1 y 28SC. Los monocitos en el reactivo que contiene monocitos, son preferentemente monocitos de las mismas especies para las cuales el producto probado será administrado (es decir, humano para productos farmacéuticos; gato, perro, caballo, etc., para productos veterinarios). Sin embargo, los monocitos de otras especies con la reactividad de pirógeno deseada también pueden ser utilizados. En ciertas modalidades preferidas, el reactivo que contiene monocitos comprende PBMCs. En una modalidad de la presente invención, el reactivo que contiene monocitos es sangre completa y el sistema de ensayo incluye al menos una superficie que comprende polipropileno, de modo que el reactivo que contiene monocitos está en contacto con la superficie. En otra modalidad, el reactivo que contiene monocitos es PBMCs presentes en alta densidad celular, y el sistema de ensayo incluye al menos una superficie que comprende polipropileno, polietileno, poliestireno, u otro material similar en contacto con las PBMCs. Cuando el reactivo que contiene monocitos es PBMCs o células de la linea celular, el reactivo se encuentra en el sistema de ensayo en una alta densidad celular, para facilitar un mayor contacto célula con célula, tal como se explica con detalle anteriormente, en ciertas modalidades, el reactivo que contiene monocitos se encuentra en un sistema de ensayo a una densidad celular por depósito de al menos aproximadamente 125,000 células, al menos aproximadamente 250,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1,000,000, 1,100,000, 1,200,000, 1,300,000, 1,400,000, 1,500,000, 1,600,000, 1,700,000, 1,800,000, 1,900,000 ó 2,000,000 células por depósito. Uno experto en la técnica podrá reconocer que la densidad celular máxima se excede cuando existen nutrientes celulares insuficientes en el volumen de reactivo dentro del depósito para mantener adecuadamente las células dentro del depósito, Cuando el reactivo que contiene monocitos es sangre completa, el reactivo se encuentra en el sistema de ensayo en una densidad celular inferior que PBMCs o células de línea celular. En ciertas modalidades en donde el reactivo que contiene monocitos es sangre, el reactivo se encuentra en el sistema de ensayo en una densidad celular de al menos aproximadamente 100,000 células mononucleares de sangre periférica por depósito, al menos aproximadamente 200,000, 210,000, 220,000, 230,000, 240,000, 250,000, 260,000, 270,000, 280,000, 290,000, 300,000, 310,000, 320,000, 330,000, 340,000, 350,000, 360,000, 370,000, 380,000, 390,000 ó 400,000 PBMC por depósito. Sin pretender atarse a teoría en particular, se considera que la sangre completa puede utilizar en una densidad celular menor en comparación con PBMCs o células de línea celular debido a que los monocitos están en su ambiente natural, y todos los componentes del suero que pueden influenciar su respuesta a pirógenos están presente en la solución. Además, cuando el reactivo que contiene monocitos comprende sangre completa, la lectura de la prueba de pirógeno es IL-6. Preferentemente, cuando se utiliza sangre como el reactivo que contiene monocitos, la sangre es fresca, o con menos de 24 horas de existencia, y más preferentemente menos de 4 horas de existencia. Asimismo, cuando se utiliza sangre completa, se puede incluir anticoagulantes para retardar o evitar la coagulación de la sangre; los ant i coagulantes adecuados incluyen citrato (por ejemplo, a una concentración final de 0.38%) heparina (heparinato de sodio) o fragmin (heparina de bajo peso molecular). Se pueden utilizar aditivos anticoagulantes sin afectar la respuesta de los monocitos a pirógenos en la muestra de prueba. También se puede eluir la sangre completa con un amortiguador adecuado u otro diluyente, tal como medio de cultivo celular RPMI o solución salina fisiológica. La sangre completa se diluye preferentemente al menos al 50%, más preferentemente de aproximadamente 5% a aproximadamente 25%, y más preferentemente aproximadamente 20% del volumen total para incubación (ver figura 1 Patente Norteamericana No. 6,696,261 ). Al diluir la sangre completa, la curva de respuesta IL-6 de la mayoría de los donantes puede llevarse dentro de un rango compacto que puede ser utilizado para cuantificar un mayor rango de concentraciones de contaminación con pirógenos (ver figura 3 de la Patente Norteamericana No. 6,696,261 ). 2. Sistema de Dos Ensayos En ciertas modalidades de la presente invención, la prueba de pirogenicidad se lleva a cabo en un sistema de contenedor de dos ensayos, de modo que los pasos de la incubación de prueba con el reactivo que contienen monocitos y la captura de citocina(s) producida por el reactivo que contiene monocitos, ocurre en sistemas de dos contenedores de ensayo diferentes. El paso de incubación después del paso de cultivo descrito anteriormente; la incubación de la muestra de prueba con el reactivo que contiene monocitos (tal como PBMCs) se lleva a cabo en el mismo sistema de ensayo que el paso de cultivo. El tiempo de incubación óptimo para utilizarse en la prueba de pirógenos de la presente invención, variará dependiendo de las condiciones de ensayo, es decir la citocina que es ensayada. Por ejemplo, cuando se incuba sangre completa con endotoxina y la lectura es IL-6, se produce una citocina adicional mínima a través del reactivo que contiene monocitos después de la incubación durante 6 horas; después de 4 horas de incubación, se ha secretado una cantidad suficiente de IL-6 por parte del reactivo para permitir la cuantificación del contaminante de pirógeno. Cuando la sangre completa se incuba con pirógeno sin endotoxina y se utiliza cualquier lectura, una cantidad suficiente de IL-6 ha sido secretada por el reactivo para permitir la cuantificación del contaminante de pirógeno después de aproximadamente 16 a 24 horas de incubación. Para una modalidad de la presente invención que ensaya la producción IL-6, se prefiere un tiempo de incubación de aproximadamente 6 hasta aproximadamente 24 horas, preferentemente de aproximadamente 12 hasta aproximadamente 24 horas, y más preferentemente de aproximadamente 16 hasta aproximadamente 24. Si se ensaya otra citocina, el periodo de incubación debe ser optimizado para la producción de dicha citocina particular. Dicha optimización está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica. Si la citocina que será ensayada no es liberada a través de los monocitos, las células pueden ser lisadas mediante descongelación o agregando un detergente al final del periodo de incubación en una concentración que no interrumpa el enlace de los ligandos a los anticuerpos. Una vez que se contempla el paso de incubación, los contenidos del sistema de ensayo (el primer sistema de ensayo), es decir el reactivo que contiene monocitos y la muestra de prueba, se transfieren a un segundo sistema de ensayo que comprende al menos una superficie tratada con un anticuerpo para una citocina o un transmisor endógeno de la respuesta inflamatoria, por ejemplo, endotelina. El segundo sistema de ensayo, se ensaya para la presencia de transmisor de citocinas o endógeno en la superficie recubierta con el anticuerpo transmisor anti-citocina o anti-endógeno. Preferentemente, se mantienen condiciones estériles, rigurosas en todos los puntos en el procedimiento antes de que la superficie recubierta con anticuerpo sea ensayada con respecto a citocina enlazada. Si se utiliza una placa lisa recubierta con un anticuerpo de captura como la modalidad de la presente invención, la placa se lava, y el segundo anticuerpo anti-citocina conjugado con una enzima, se agrega a la placa ELISA (a menos que el segundo anticuerpo etiquetado, "de detección" se agregado inicialmente a la placa antes del glaseado o junto con los contenidos de primer sistema de ensayo). La placa ELISA se lava nuevamente, y la adición de un substrato a la placa ELISA produce un color. Después de un tiempo de incubación corto, la reacción se termina, y la densidad óptica de la solución se mide en un lector de placa ELISA. Este proceso se refiere en forma adicional en el ejemplo 2 de la Patente Norteamericana No. 6,696,261. Como alternativa, se pueden utilizar técnicas de inmunoensayo no enzimáticas. Por ejemplo, el segundo anticuerpo del "emparedado" de inmunoensayo puede ser etiquetado con una porción fluorescente o un isótopo radioactivo. Después de lavarse, la cantidad de citocina capturada en el depósito puede ser cuantificada detectando la cantidad de fluorescencia o radiación presente en el depósito. Están disponibles comercialmente varios sistemas de ensayo con base enzimática o no enzimática y pueden ser modificados fácilmente para utilizarse en la presente invención, a través de un experto en la técnica. 3. Sistema de un Ensayo En ciertas modalidades de la presente invención, se lleva a cabo la prueba de pirogenicidad en un sistema de un contenedor de ensayo, de modo que los pasos de la incubación de muestra con el reactivo que contiene monocitos y la captura de citocina(s) producida por el reactivo que contiene monocitos, ocurre en el mismo sistema de contenedor de ensayo. El sistema de ensayo comprende al menos una superficie que comprende polipropileno y al menos una superficie tratada con un anticuerpo para una citocina o un transmisor endógeno de la respuesta inflamatoria. El paso de incubación sigue el paso de cultivo descrito anteriormente y se lleva a cabo en el mismo sistema de ensayo que el paso de cultivo. Tal como se describió anteriormente dentro del contexto del sistema de dos contenedores de ensayo, el tiempo de incubación óptimo para utilizarse en la prueba de pirógenos de la presente invención, variará dependiendo de las condiciones de ensayo, es decir la citocina que será ensayada. Generalmente, las técnicas con respecto al paso de incubación descritas con respecto al sistema de dos contenedores de ensayo aplica también al sistema de un contenedor de ensayo. El periodo de incubación debe ser optimizado para la producción de una citocina particular, y dicha optimización está dentro de las capacidades de un experto en la técnica. Si la citocina que será ensayada no es liberada por los monocitos, las células pueden ser Usadas mediante descongelación, o agregando un detergente al final del periodo de incubación en una concentración que no interrumpa el enlace de los ligandos a los anticuerpos. Una vez que se completa el paso de incubación, el sistema de ensayo, el cual comprende al menos una superficie tratada con un anticuerpo para una citocina o transmisor endógeno de la respuesta inflamatoria, por ejemplo, endotelina, se ensaya para la presencia de transmisor de citocina o endógeno en la superficie recubierta con el anticuerpo transmisor de anti-citocina o anti-endógeno. Preferentemente, se mantiene en condiciones estériles, rigurosas en todos los puntos en el procedimiento antes de la superficie recubierta con anticuerpo sea ensayada para la citocina enlazada. Generalmente, la descripción con respecto al paso de ensayo del sistema de dos contenedores de ensayo, es decir, la descripción de las técnicas de inmunoensayo de placa ELISA y no enzimáticos, aplican también a un sistema de un contenedor de ensayo. En general, el sistema de un contenedor de ensayo y el sistema de dos contenedores de ensayo son intercambiables. 4. Contenedores de Ensayo Los sistemas de ensayo de la presente invención comprenden al menos una superficie en contacto con el reactivo que contiene monocitos. En ciertas modalidades de la presente invención, el sistema de ensayo(s) incluye al menos un depósito de microtitulación , y la superficie es al menos una parte del interior del depósito de microtitulación. En modalidades particulares, la superficie del depósito de microtitulación comprende un recubrimiento de polipropileno o un depósito de microtitulación completo está compuesto de polipropileno. En ciertas modalidades, en donde el sistema de ensayo comprende al menos una superficie tratada con un anticuerpo para una citocina o para un transmisor endógeno de la respuesta inflamatoria, la superficie en la cual se aplica el anticuerpo, es al menos una parte del interior del depósito de microtitulación. Preferentemente, el depósito de microtitulación se forma de modo que el reactivo que contiene monocito esté concentrado en comparación con un depósito de microtitulación de fondo plano. En ciertas modalidades, el depósito(s) de microtitulación comprende una parte superior abierta, una región superior que se extiende hacia abajo desde la parte superior abierta, y una pared del fondo que se ahusa en diámetro desde una ubicación arriba del punto más bajo hacia el punto más bajo. En ciertas modalidades, el depósito(s) de microtitulación comprende una región superior abierta, una región superior que se extiende hacia abajo desde la parte superior abierta que tiene un extremo superior y un extremo del fondo, y una región inferior que tiene un extremo superior y un punto más bajo, extendiéndose la región del fondo desde el extremo del fondo de la región superior y ahusándose en diámetro más rápidamente que la región superior desde el extremo superior de la región del fondo hacia el punto más bajo. En ciertas modalidades, la pared del fondo del depósito de microtitulación es no plana, preferentemente curva, algunas veces parabólica. En ciertas modalidades particulares, la pared del fondo se extiende hacia abajo, o los lados del depósito de microtitulación se hacen en pendiente hacia abajo. 5. Equipo de Diagnóstico Cualesquiera de las modalidades descritas anteriormente pueden ser incorporadas en un equipo de diagnóstico para llevar a cabo pruebas pirogénicas. El equipo se utiliza para detectar una variedad de pirógeno sin endotoxina, incluyendo bacteria Gram positiva (por ejemplo Estafilococcus aureus) o sus componentes (por ejemplo, muropéptido, ácido lipotecoico, enterotoxinas, estreptolisina), asi como pirógenos de endotoxina en una variedad de productos médicos, incluyendo productos de sangre u otros parenterales, tales como dializados, vacunas y soluciones intravenosas. Generalmente, dicho equipo incluye una placa de microtitulación que comprende una pluralidad de depósitos de microtitulación formados de modo que el medio de cultivo contenido en cada depósito sea concentrado en comparación con un depósito de microtitulación de fondo plano, comprendiendo los depósitos al menos una superficie que comprende polipropileno. Los depósitos de la placa de microtitulación contienen un reactivo que contiene monocitos crioconservados que comprenden sangre completa crioconservada, células mononucleares de sangre periférica crioconservados o líneas celulares de célula monocítica crioconservada, las cuales están en contacto con las superficies de los depósitos. En ciertas modalidades, los depósitos de la placa de microtitulación comprenden polipropileno. Cuando el reactivo que contiene monocito crioconservado comprende células mononucleares de sangre periférica crioconservadas o células de linea celular monocítica crioconservada, el reactivo se encuentra en los depósitos en una alta densidad. Los equipos que contienen sangre completa crioconservada como el reactivo que contiene monocitos también contienen anticuerpos para IL-6, ya que IL-6 es la lectura preferida. En modalidades particulares, los depósitos incluyen una barrera que es impermeable a los monocitos. La barrera comprende al menos una superficie comprendida de un material libre de pirógenos, y normalmente es una membrana, una rejilla, un cernidor o un cribador. La barrera es preferentemente estéril. Los materiales de barrera adecuados para utilizarse en placas de microtitulación son conocidos en la técnica. La barrera, la cual es permeable a fluidos, permite que las células crioconservadas sean lavadas sin eliminarlas de los depósitos; se puede eliminar el sulfóxido de dimetilo (DMSO), lo cual baña las células crioconservadas y actúa como un conservador, de modo que no interfiera con la prueba. Las muestras de prueba se agregan arriba de la barrera, penetra en la barrera, contactan células debajo de la barrera, y estimulan potencialmente estas células para producir citocinas. Las citocinas liberadas mediante células, se difunden en el medio arriba de la barrera. Normalmente, las soluciones arriba y debajo de la barrera se mezclan profundamente, aspirando las soluciones. En forma subsecuente, una alícuota de medio bien mezclado de la parte superior de la barrera, se ensaya con respecto a la presencia de citocina o un transmisor endógeno de la respuesta inflamatoria. 6. Interpretación de Datos de Producción de Citocina A. Método de Curva Estándar Con el objeto de interpretar en forma adecuada los datos de producción de citocina generados en la prueba de pirógeno de la presente invención, se genera una curva estándar de endotoxina incubando el reactivo que contiene monocitos con endotoxina estándar USP. El propósito de esto es cuantificar la respuesta de producción de citocina medida para una muestra de prueba en términos de respuesta observada para un pirógeno conocido. Se puede generar una curva estándar de cualquier número de puntos de datos estadísticamente significativos generados con concentraciones significativamente variadas de endotoxina estándar utilizando un software de análisis de datos de mejor ajuste estándar. Los métodos para generar dichas curvas estándar generalmente son conocidos en la técnica. Los solicitantes han descubierto que los puntos de datos de 10, 4, 1, 0.25, 0.06, 0.06 y 0 EU/ml de endotoxina, son adecuados para generar una curva estándar, aunque puede ser adecuado cualquier número de concentraciones estadísticamente significativo a través de un rango similar. Una vez que se genera una curva estándar, la concentración sin endotoxina equivalente (cuantificada en unidad-equivalentes de endotoxina), se pueden interpolar de la respuesta de citocina utilizando la curva estándar. Ya que la respuesta de los reactivos que contienen monocitos a base de sangre completa pueden variar significativamente de donante a donante, es importante generar una curva estándar para cada grupo de ensayos llevados a cabo con un lote particular de reactivos que contienen monocitos. Sin embargo, debido a que la modalidad de placa ELISA preferida de la presente invención utiliza cantidades muy pequeñas de sangre humana (aproximadamente 40 pL/depósito) se puede utilizar una unidad simple de sangre donada para varios cientos de depósitos. La curva estándar generada utilizando la endotoxina USP, ayuda a la normalización de los datos en términos de relacionar las unidades de endotoxina (EU, tal como se define a través de USP/FDA, las cuales son idénticas a IU, unidades internacionales tal como se define mediante WHO), la cual es el estándar en la industria para expresar la contaminación de endotoxina/pirógeno. B. Método de Lote de Referencia Como alternativa, los datos de producción de citocinas generados en la prueba de pirógenos de la presente invención, pueden interpretarse comparando respuestas de citocinas provocadas por lotes de prueba de un producto para los provocados mediante lotes de referencia de un producto, un lote de referencia contaminado y un lote de referencia no contaminado. Primero, los dos lotes de referencia de un producto químico son identificados: los lotes de referencia son pirógenos probados y las respuestas de citocinas provocadas por estos lotes, son medidas. Posteriormente, los lotes de prueba son pirógeno probado y las respuestas provocadas por estos lotes se comparan con las de los lotes de referencia. Generalmente, una prueba se considerará no contaminada si provoca una menor respuesta al lote de referencia contaminado y una respuesta similar a la del lote de referencia no contaminado. Cada lote de prueba puede ser probado una vez o varias veces. Por ejemplo, de acuerdo con un método de lote de referencia, el producto se consideró no contaminado si provocó la liberación de no más de dos veces tanto de IL-6 como el lote de referencia no contaminado en cuatro de los cuatro donantes o siete de los ocho donantes; la prueba se llevó a cabo por duplicado utilizando la sangre de cuatro diferentes donantes. Un método de lote de referencia preferido se describe en la publicación de Gaines-Das y asociados, 2004, en donde se requiere que el método de prueba estimule la liberación de menos IL-6 que la referencia. En dicho artículo, se requiere que la preparación de prueba pase la prueba dentro del PBMNC procedente de cuatro diferentes donantes. Si la preparación de prueba pasa la prueba con PBMNC de tres de los cuatro donantes, la prueba continúa con PBMNC de cuatro donantes adicionales, ninguno de ellos proporcionó PBMNC para la primera prueba, y se requiere que la preparación de prueba pase la prueba con el PBMNC de siete de los ocho diferentes donantes. En forma conveniente, las pruebas de activación de monocitos de la presente invención tienen una mejor capacidad de detectar la presencia de una amplia variedad de pirógenos, incluyendo pirógenos sin endotoxina, en productos médicos tales productos de sangre, soluciones intravenosas y vacunas. Definiciones Tal como se utiliza en la presente invención, el término pirógeno de endotoxina o sin endotoxina "puro" o pirógeno en su "forma pura" se refiere a una endotoxina que ha sido desprendida de su proteína asociada. La endotoxina pura también es conocida como lipopolisacárido (LPS). El término "reactivo que contiene monocitos", significa cualquier solución de células de leucocito monocíticas del sistema inmune. Preferentemente, estas células se derivan del organismo al cual el producto que está siendo probado será administrado (por ejemplo, humano para productos farmacéuticos, gato, perro, caballo, etc. para productos vertebrados). Un ejemplo de reactivo que contiene monocitos es la sangre completa humana. El término "sistema de ensayo" significa cualquier contenedor y superficie que puede ser utilizada en una prueba de activación de monocitos, incluyendo un contenedor en el cual las células son cultivadas e incubadas con una muestra de prueba así como un contenedor y superficie con anticuerpo enlazado que puede ser utilizado en un inmunoensayo. Preferentemente, con respecto a llevar a cabo un inmunoensayo, dichos contenedores son placas de depósitos de microtitulación con anticuerpo enlazado a la superficie en el depósito, en donde se puede llevar a cabo un gran número de ¡nmunoensayos enlazados por enzimas colorimétricos en paralelo y los cuales pueden ser evaluados automáticamente a través de una máquina de lectura de placa ELISA. Sin embargo, se consideran otros sistemas de inmunoensayo, especialmente aquellos en donde la superficie recubierta no es necesariamente parte de la pared del contenedor. Por ejemplo, un tubo de prueba más grande que contiene una cuenta de poliestireno o una varilla indicadora recubierta por el anticuerpo, se puede utilizar en la presente invención. El término "línea celular monocítica" incluye cualquier línea celular que tenga receptores tipo CD14 y/o Toll endógenos (TLRs) o que haya sido transfectada con CD14 y/o TLRs y/o genes reporteros para transmisores inflamatorios/pirogénicos. La línea celular no tiene que ser monocítica siempre que haya sido transfectada con los componentes de los "receptores pirogénicos" presentes en los monocitos: estos componentes incluyen TLRs y CD14. Por ejemplo, las células de Riñon Embriónico Humano (HEK) ya han tenido la mayor parte de los TLRs y pueden ser transfectadas en forma estable con los TLRs que no tienen - TLR2 y TLR4 - y también CD14 para hacerlos en forma suficiente tipo un monocito para funcionar en los métodos de la presente invención. Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de PBMC. Se aislaron PBMCs de sangre periférica heparinizada humana que no tenía más de cuatro horas de existencia, mediante centrifugación de densidad-gradiente utilizando Ficoll Paque (Pharmacia #17-1440-02). Las células se lavaron dos veces con solución salina amortiguada por fosfato de Dulbecco's sin calcio y magnesio (Gibco #14190), se resuspendieron en un medio Mínimum Essential Media (MEM) (Gibco #11090), amortiguador HEPES (Gibco #15630) y 5pL del plasma desactivado por calor del propio donante (es decir 2% de la concentración final). Las PBMCs se dividieron a las densidades celulares requeridas (8 millón, 4 millón, 2 millón y 1 millón PBMCs por mL). Cultivo celular. Se llevaron a cabo cultivos celulares por cuadruplicado en las siguientes placas de microtitulación: Corning Costar #3790, #3359. 125 µ?_ de la suspensión celular que contiene 1 millón, 0.5 millón, 0.25 millón o 0.13 millón de células se agregó a cada depósito, seguido de 125 pl_ de la muestra de prueba o endotoxina estándar (0.0064-20 EU/mL). La mezcla 250 pL se mezcló suavemente y se incubó a una temperatura de 37±1°C en 5% C02 y en un aire humidificado. La duración del cultivo fue de 16 a 24 horas, tiempo después del cual se obtuvieron las alícuotas del fluido de cultivo, se diluyeron en 1 en 2 y 1 en 50, y se ensayaron para IL-6. ELISA para IL-6. Las placas de 96 depósitos (Immulon 4, Dynex #011-010-3855) fueron recubiertas con 150 pL de 3 pg/mL de IgG monoclonal de ratón (R&D Systems #MAB206 disuelto en amortiguador de bicarbonato, pH 9.5) mediante incubación en la noche a una temperatura de 2-8°C. Las placas se lavaron tres veces con 300 pL de amortiguador de lavado (20 mM HEPES, 150 mM NaCI, pH 7.4). Se bloquearon sitios de enlace no específicos sobre las placas agregando 200 pL de solución de bloqueo (0.02 g/L Bovine Serum Albumin, Fracción V, libre de proteasa). Las placas nuevamente se lavaron tres veces con 300 pL del mismo amortiguador de lavado, y 100 pL de muestras (divididas previamente 1 en 2 y 1 en 50 en el diluyente de muestra) o estándares (7.8-1000 pg/mL del estándar internacional WHO para IL-6, #89/548) fueron agregadas a cada depósito. 100 µ?_ del diluyente de muestra se agregó a cada depósito no utilizado. La placa se cubrió con un sellador (Falcon #3073) y se incubó con agitación (aproximadamente 300 rpm) durante 1 hora ± 5 minutos. Posteriormente la placa fue aspirada y lavada cinco veces con 300 pL de amortiguador de lavado. Posteriormente, se agregaron 100 µ?_ de 0.2 pg/mL de anticuerpo IL-6 anti-humano de cabra biotinilado (R&D Systems, #BAF206) a cada depósito y la placa nuevamente se cubrió con sellador y se incubó con agitación (de aproximadamente 300 rpm) durante aproximadamente 1 hora ± 5 minutos. Posteriormente la placa fue aspirada y lavada cinco veces con 300 pL de amortiguador de lavado. Posteriormente se agregaron 100 pL de 0.02 pg/mL de fosfatasa alcalina (Rockland #S000-05) a cada depósito y la placa se cubrió nuevamente con un sellador y se incubó con agitación (aproximadamente 300 rpm) durante 1 hora ± 5 minutos. La placa se aspiró y se lavó cinco veces con 300 pL de amortiguador de lavado. Posteriormente, se agregaron a cada depósito 200 pL de 1 mg/mL pNNP en amortiguador de dietanolamina con 0.5 mM MgCI2. La placa se cubrió nuevamente con sellador y se incubó con agitación (aproximadamente 300 rpm) a temperatura ambiente hasta que la concentración más alta de la curva estándar IL-6 (1000 pg/mL) tuvo una densidad óptica entre aproximadamente 2.5 y 3.0 a 405 nm, punto en el cual la reacción se detuvo agregando 50 µ?_ de 2M NaOH a cada depósito. La densidad óptica de cada depósito fue determinada a los 30 minutos de que se detuvo la reacción utilizando un lector de microplaca ajustado a 405 nm.
La figura 1, muestra el efecto de la densidad celular en las respuestas IL-6 para el estándar de endotoxina (1 EU/ml) y control positivo Extraneal®. El control positivo Extraneal® fue contaminado con pirógeno sin endotoxina y originó una reacción de fármaco adversa en receptores humanos de este lote de este fármaco, pero proporcionó una respuesta negativa en la prueba LAL (Martis y asociados 2005). Los valores son error promedio ± estándar de los promedios de cuatro depósitos replicados. Las densidades celulares de 0.25 a 1 millón PBMC por depósito, respondieron en forma similar al estándar de endotoxina 1 EU/ml. La muestra control positiva se detectó de mejor manera utilizando 1 millón > 0.5 millón > 0.25 millón >> 0.13 millón de células por depósito. Ejemplo 2 - Pruebas de Pirógeno Comparativas Los métodos descritos en la presente invención como el estado corriente de la técnica fueron replicados. Ninguno de estos métodos diferencian controles de producto positivos de solución de diálisis Extraneal®, hemoglobina y/o dextrán de los controles de producto negativo. Los ensayos de Hoffman y asociados, 2005 fueron replicados tal como se describe en la presente invención utilizando placas de microtitulación de poliestireno con depósitos de fondo redondo y lectura IL-6. El reactivo que contiene monocito se utilizó en una baja densidad celular y fue sangre completa (75,000 células por depósito), PBMCs (100,000 células por depósito), MONOMAC6 (250,000 células por depósito), o THP-1 (250,000 células por depósito) en las figuras 2 a 5, respectivamente. Se debe observar que en la figura 5, la lectura IL-6 fue sustituida por neopterina debido a que IL-6 es un pirógeno endógeno (en contraste con neopterina) y una lectura más robusta en los métodos de la presente invención. En la figura 6, las células THP-12A9 en baja densidad celular (250,000 células por depósito) fueron utilizadas como el reactivo que contiene monocitos y TNF fue la lectura. Se replicó el ensayo de Nakagawa y asociados tal como se describe en dicho documento utilizando 1,000,000 células de clon MONOMAC-CA8 por mi como el reactivo que contiene monocitos, lectura IL-6, y placas de microtitulación de poliestireno con depósitos de fondo redondo. Ver figura 7. El ensayo de Yamamoto y asociados fue replicado tal como se describe en el documento utilizando 1,000,000 células 28C por mi como el reactivo que contiene monocitos, lectura IL-6, y placas de microtitulación de poliestireno con depósitos de fondo redondo. Ver figura 8. Sin embargo, las células 28C fueron primadas con calcitrol (100 ng/ml) en lugar de inferieron gamma debido a que este último falló en producir una curva de respuesta-dosis a endotoxina estándar. Ejemplo 3 - Prueba de Pirógenos de la Presente Invención Los cultivos (200 µ?) de 20% de sangre completa humana (40 µ? = aproximadamente 60,000 PBMC/depósito = aproximadamente 300,000 PBMC/ml) fueron llevados a cabo por cuadruplicado en placas de polipropileno de fondo redondo de 96 depósitos (Costar#3790, Corning I ncorporated , USA). Las adiciones por depósito fueron: MEM-HEPES (60 pl), sangre de un donante simple (40 µ?), endotoxina estándar o muestras Extraneal® diluidas 1:1 con MEM-HEPES (100 µ?, es decir la solución Extraneal® estuvo en una dilución final de 1 en 4 mi en el depósito). Los contenidos de los depósitos fueron mezclados arremolinándolos suavemente (sin depósitos de contaminación cruzada) e incubados sin vibración (para permitir que la células se asentaran) a una temperatura de 37°C durante 16 a 24 horas en una atmósfera de 5% C02 en el aire. Al final de la incubación de cultivo de tejido, se tomaron 100 µ? de alícuotas de sobrenadante claro de cada depósito para el ensayo de IL-6 mediante ELISA. La metodología utilizada para las muestras de dextrano fue similar a la que se describió anteriormente en el ejemplo 1. El aislamiento celular y cultivo fueron similares, excepto que la densidad celular fue de 400,000 células por depósito y la dilución de muestras utilizada en ELISA fue de 1 en 10. El IL-6 ELISA fue diferente al que utilizó placas recubiertas con el anticuerpo monoclonal de clon 16 (para captura de IL-6) y anticuerpo policlonal de oveja conjugado para peroxidasa de rábano como el anticuerpo de detección. El ELISA se utiliza en la prueba de sangre completa/l L-6 (NIBSC) y la prueba PBMC/IL-6 (Novartis) tal como se describe en la publicación de Hoffmann y asociados documento 2005. La figura 9 ilustra resultados comparativos de la muestra de control negativo Extraneal® y muestra de control positivo Extraneal®, y para muestra de control negativo de dextrano y muestra de control positivo de dextrano. Se puede apreciar que la prueba de pirógeno de la presente invención puede diferenciar fácilmente entre estos controles positivos y negativos. La prueba se puede llevar a cabo, por cuadruplicado, de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente, con sangre de un solo donante. Los valores son error promedio ± estándar de los promedios de los cuatro depósitos de réplica. La figura 10 ilustra resultados comparativos de la muestra de control negativo Extraneal® y la muestra de control positivo Extraneal®. Se puede apreciar que la prueba de pirógenos de la presente invención puede diferenciar fácilmente entre estos controles positivos y negativos. La prueba se llevó a cabo, por cuadruplicado, de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente, con sangre procedente de un solo donante. Los valores son error promedio + estándar de los promedios de los cuatro depósitos de réplica. Se debe observar que la baja densidad celular fue suficiente para diferenciar controles Extraneal positivos de los negativos cuando la sangre completa fue el reactivo que contiene monocitos y se utilizaron depósitos de polipropileno de fondo redondo. Ejemplo 4. Prueba de Pirógeno de la Presente Invención: Resultados Comparativos para Placas de Polipropileno versus Placas de Poliestireno y IL-6 versus I L - 1 ß para un Donante Simple Las muestras de prueba se prepararon de acuerdo con el método del ejemplo 1, excepto que se utilizaron densidades celulares de 1 millón de células por depósito, algunas muestras fueron sometidas a lectura I L - 1 ß , y algunas muestras fueron colocadas en placas de microtitulación de poliestireno con depósitos de fondo redondo. La figura 11A muestra que las respuesta IL-6 para controles positivos fueron claramente diferenciadas de los controles negativos para pruebas conducidas en placas de polipropileno, aunque no diferencias para las que están en placas de poliestireno. Los valores son errores promedio ± estándar de los promedios de los cuatro depósitos de réplica. La figura 11B muestra que I L - 1 ß responde a controles positivos cuando se distinguió claramente de controles negativos para pruebas llevados a cabo en placas de polipropileno, aunque no se distinguieron de las de que están en placas de poliestireno. Sin embargo, la magnitud de la respuesta en la figura 11B fue mucho menor que la de la figura 11A, lo que indica que ??_-1ß es una lectura deficiente en comparación con IL-6. Los valores son error promedio ± estándar de los promedios de los cuatro depósitos de réplica. Ejemplo 5 - Prueba de Pirógeno de la Presente Invención: Resultados Comparativos para Placas de Polipropileno versus Placas de Poliestireno para Donantes Múltiples Las muestras de prueba se prepararon de acuerdo con el método del ejemplo 1, excepto que se utilizaron densidades celulares de 0.88 y 1 millón por depósito, se utilizaron tres donantes, algunas muestras se colocaron en placas de microtitulación con depósitos de fondo redondo, y el I L- 6 ELISA utilizó placas recubiertas con el anticuerpo monoclonal de clon 16 y un anticuerpo policlonal de oveja conjugado para peroxidasa de rábano como el anticuerpo de detección tal como se describe en la publicación de Hoffmann y asociados documento 2005. Las figuras 12A y 12B ilustran la respuesta a IL-6 de las placas de microtitulación de polipropileno con depósitos de fondo redondo y placas de microtitulación de poliestireno con depósitos de fondo plano para densidad de células PBMC de 0.88 millón de células por depósito para el donante A, respectivamente. Para el donante A, la prueba de pirógeno no diferenció entre controles positivos y negativos cuando se utilizaron placas de poliestireno, aunque distinguió entre estos controles cuando se utilizaron placas de polipropileno. Las figuras 13A y 13B ilustran la respuesta a IL-6 para placas de microtitulación de polipropileno con depósitos de fondo redondo y placas de microtitulación de poliestireno con depósitos de fondo plano para una densidad celular de PBMC de 1 millón de células por depósito para el donante B, respectivamente. Aunque ambas pruebas de pirógeno diferenciaron entre controles positivos y negativos para el donante B, la respuesta IL-6 del control positivo fue aproximadamente 6 veces la del control negativo utilizando las placas de polipropileno, pero únicamente aproximadamente 2 veces el del control negativo utilizando placas de poliestireno. Las figuras 14A y 14B ilustran la respuesta a IL-6 para placas de microtitulación de polipropileno con depósitos de fondo redondo y placas de microtitulación de poliestireno con depósitos de fondo plano para densidad celular de PBMC de 0.88 millón de células por depósito para el donante C, respectivamente. Aunque ambas pruebas de pirógeno diferenciaron entre controles positivos y negativos para el donante B, la respuesta a IL-6 del control positivo fue aproximadamente dos veces tan grande utilizando las placas de polipropileno versus las placas de poliestireno. Se debe observar que en polipropileno la respuesta al control positivo Extraneal® excede a la respuesta de la dosis más grande del estándar LPS, es decir 0.4 EU/ml, en tanto que en poliestireno la respuesta al control positivo Extraneal® es menor que la respuesta para la dosis menor del estándar LPS, es decir 0.1 EU/ml. Ejemplo 6 - Prueba de Pirógeno Comparativa: IPT (Laboratorios Charles River) La metodología utilizada para llevar a cabo esta prueba se describe en la hoja de instrucción de Endosafe® - IPT InVitro Pyrogen Test (comercialmente disponible en Charles River Laboratories (PIIPT10002)) utilizando el procedimiento para estimulación de sangre completa utilizando I L - 1 ß y placas de microtitulación de poliestireno. La figura 15 ilustra que la prueba IPT falló en diferenciar entre controles positivos y negativos Extraneal® y Hemoglobina, aunque el equipo respondió al estándar LPS y a un control positivo de equipo de ácido lipotecoico de una bacteria Gram-positiva. Ejemplo 7 - Prueba de Pirógeno de la Presente Invención Utilizando Células Crio-conservadas La suspensión celular (por ejemplo 1 millón PBMC o células) en plasma y sulfóxido de dimetilo (o en sangre completa y sulfóxido de dimetilo) se agrega a cada depósito de una placa de polipropileno de 96 depósitos con depósitos de 250 pL de fondo redondo, los cuales posteriormente se sellan y crio-conservan . El día de la prueba, la placa se descongeló, se llevó a temperatura ambiente, el sello se eliminó y el inserto de 96 depósitos se empujó firmemente en la posición. El inserto tuvo paredes de polipropileno y un fondo plano que es una barrera para el paso de células, pero no de líquidos. El DMSO se lavó de las células llenando el inserto con medio fresco y aspirando el medio hacia arriba y hacia abajo para mezclar las soluciones arriba y debajo de la barrera celular antes de aspirar y desechar la solución que se encuentra arriba de la barrera celular. Al repetir este paso de lavado 5 veces, las células son lavadas esencialmente libres de DMSO y se retienen en un volumen conocido de medio fresco. La muestra de prueba o estándar y el medio más fresco fueron agregados al inserto, y aspirando esta solución hacia arriba y hacia abajo para mezclar las soluciones arriba y debajo de la barrera celular, el pirógeno en la muestra o estándar (pirógeno) se dejó tener acceso a las células. Esta placa se incuba a una temperatura de 37±1°C en gas de dióxido de carbono al 5% en aire humidificado durante 16-24 horas. Durante la incubación, el asentamiento celular permitió que las células se contactaran entre sí, lo cual facilita la liberación IL-6 estimulada por pirógeno. Al final del periodo de incubación, las soluciones arriba y abajo de la barrera celular se mezclaron profundamente aspirando la solución arriba de la barrera celular hacia arriba y hacia abajo, antes de que se tomara una alícuota de un medio acondicionado por células para el ensayo de IL-6. Las PBMCs crioconservadas son convenientes debido a que pueden ser transportadas fácilmente sobre hielo seco en todo el mundo. A diferencia de poliestireno, el polipropileno soporta nitrógeno líquido sin desquebrajarse. A la llegada, las PBMCs únicamente necesitan ser descongeladas y lavadas para quedar libres de DMSO para estar listas para utilizarse en una prueba, junto con el inserto de placa proporcionado. Al transportar las células en un número óptimo por depósito, y utilizando las células junto con el inserto de la placa, se proporciona al usuario final un equipo de prueba mejorado. Con un equipo convencional. Las células son enviadas en un tubo, y una vez descongeladas, tienen que ser lavadas mediante centrifugación, lo cual peletiza las células, permitiendo que se dispersen en un medio limpio. Normalmente las células son lavadas dos a tres veces en esta forma. Posteriormente las células tiene que ser contadas y resuspendidas en la densidad celular requerida antes de que puedan suministrarse dentro de los depósitos. La prueba de pirógeno de la presente invención es de labor menos intensa, menos tardada y menos traumática para las células en comparación con pruebas convencionales las cuales pueden dar como resultado pérdida, activación y muerte celular. Cuando se introducen elementos de la presente invención o la modalidad(s) preferida de los mismos, el artículo "un", "una", "el" y "las, los" pretenden significar que existen uno o más de los elementos. Los términos "que comprenden", "que incluyen" y "que tiene" pretenden ser inclusivos y significa que pueden ser elementos adicionales además de los elementos descritos. Ya que se pueden realizar varios cambios a los métodos y composiciones anteriores sin apartarse del alcance de la presente invención, se pretende que todo el contenido en la descripción anterior, deba ser interpretado como ilustrativo y no en un sentido limitante.

Claims (37)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un método para detectar pirógenos sin endotoxina en una muestra, en donde el método comprende los pasos de: combinar un reactivo que contiene monocitos y la muestra que será probada en un primer sistema de ensayo que comprende al menos una superficie que comprende polipropileno, en donde el reactivo que contiene monocito comprende células mononucleares de sangre periférica o células de línea celular monocíticas, está en contacto con la superficie celular, y está presente en el sistema de ensayo en una alta densidad celular. incubar el reactivo que contiene monocito y la muestra, en donde el reactivo que contiene monocito produce una citocina y un transmisor endógeno de la respuesta inflamatoria; transferir los contenidos de primer sistema de ensayo a un segundo sistema de ensayo que comprende al menos una superficie tratada con un anticuerpo para una citocina o un transmisor endógeno de la respuesta inflamatoria; y ensayar el segundo sistema de ensayo con respecto a la presencia de citocina o un transmisor endógeno enlazado al anticuerpo en la superficie; mediante lo cual el nivel elevado de citocina o transmisor endógeno enlazado a la superficie indica la presencia de pirógenos en la muestra probada.
  2. 2. Un método para detectar pirógenos sin endotoxina en un producto médico administrado en forma parenteral que comprende los pasos de: combinar un reactivo que contiene monocito y el producto médico que será probado en un primer sistema de ensayos que comprende al menos una superficie que comprende polipropileno, en donde el reactivo que contiene monocito comprende sangre completa y está en contacto con la superficie; incubar el reactivo que contiene monocito y el segundo producto, en donde el reactivo que contiene monocito produce IL-6; transferir los contenidos del primer sistema de ensayo a un segundo sistema de ensayo que comprende al menos una superficie tratada con un anticuerpo para IL-6; y ensayar el segundo sistema de ensayo para la presencia de IL-6 enlazado al anticuerpo en la superficie; mediante lo cual un nivel elevado de IL-6 enlazado a la superficie, indica la presencia de pirógenos en el producto médico probado.
  3. 3. Un método para detectar pirógenos sin endotoxina en un producto médico administrado en forma parenteral que comprende los pasos de: combinar un reactivo que contiene monocito y el producto médico que será probado en un sistema de ensayo que comprende al menos una superficie que comprende polipropileno y al menos una superficie tratada con un anticuerpo para IL-6, en donde el reactivo que contiene monocito comprende sangre completa y está en contacto con la superficie que comprende polipropileno; y ensayar el sistema de ensayo para la presencia de IL-6 enlazado al anticuerpo en la superficie; mediante lo cual un nivel elevado de IL-6 enlazado a la superficie, indica la presencia de pirógenos en el producto médico tratado.
  4. 4. Un método para cultivar células contenidas dentro de un reactivo que contiene monocito para utilizarse en un ensayo de pirógenos sin endotoxina que comprende los pasos de: combinar el reactivo que contiene monocito y una muestra que será probada en un sistema de ensayos que comprende al menos una superficie que comprende polipropileno, en donde el reactivo que contiene monocito comprende células mononucleares de sangre periférica o células de línea celular monocítica, está en contacto con la superficie, y se encuentra en el sistema de ensayo en una alta densidad celular.
  5. 5. El método tal como se describe en la reivindicación 4, caracterizado porque el sistema de ensayo comprende al menos un depósito de microtituiación formado de manera que el reactivo que contiene monocitos se concentre en comparación con un depósito de microtituiación de fondo plano, al menos una superficie del depósito comprende polipropileno, y el reactivo que contiene monocito se encuentra en dicho depósito en una alta densidad celular.
  6. 6. El método tal como se describe en la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque al menos uno del primero y segundo sistemas de ensayo incluyen al menos un depósito de m icrotitu lación , y la superficie(s) es al menos una parte del interior de la pared de microtitulación.
  7. 7. El método tal como se describe en la reivindicación 3 ó 4, caracterizado porque el sistema de ensayo incluye al menos un depósito de microtitulación, y la superficie(s) es al menos una parte del interior del depósito de microtitulación.
  8. 8. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 5 a la 7, caracterizado porque el depósito se forma de manera que el reactivo que contiene monocito esté concentrado para proporcionar mayor contacto célula con célula en comparación con un depósito de microtitulación de fondo plano.
  9. 9. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 5 a la 7, caracterizado porque el depósito de microtitulación comprende una región superior abierta, una región superior que se extiende hacia abajo desde la parte superior abierta, y una pared del fondo que se ahusa en diámetro desde la parte de arriba del punto más bajo hasta el punto más bajo.
  10. 10. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 5 a la 7, caracterizado porque el depósito de microtitulación comprende una región superior abierta, una región que se extiende hacia abajo desde la región superior que tiene un extremo superior y un extremo de fondo, y una región inferior que tiene un extremo superior y un punto más bajo, extendiéndose la región inferior desde el extremo inferior de la región superior y ahusándose en diámetro más rápidamente que la región superior del extremo superior de la región inferior hacia el punto más bajo.
  11. 11. El método tal como se describe en la reivindicación 9, caracterizado porque la pared superior del depósito de microtitulación es no plana, curva, parabólica o se extiende hacia abajo.
  12. 12. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 5 a la 7, caracterizado porque los lados del depósito de microtitulación están con pendiente hacia adentro.
  13. 13. El método tal como se describe en la reivindicación 5, caracterizado porque el sistema de ensayo comprende al menos una superficie tratada con un anticuerpo para una citocina, y la superficie en la cual el anticuerpo se aplica es al menos una parte del interior del depósito de microtitulación.
  14. 14. El método tal como se describe en la reivindicación 13, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo para un transmisor endógeno de la respuesta inflamatoria.
  15. 15. El método tal como se describe en la reivindicación 14, caracterizado porque el transmisor endógeno es endotelina.
  16. 16. El método tal como se describe en la reivindicación 5, caracterizado porque comprende además el paso de ensayar el sistema de ensayo para la presencia de un transmisor de citocina o endógeno enlazado al anticuerpo en la superficie; mediante lo cual un nivel elevado de citocina o transmisor endógeno enlazado a la superficie, indica la presencia de pirógenos en la muestra probada.
  17. 17. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 1, 13 ó 16, caracterizado porque la citocina es seleccionada del grupo que consiste en interleucina-1 (IL-1), interleucina- ra (IL-1 ra ) , interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (IL-8), y factor-a de necrosis de tumor (TNF-a).
  18. 18. El método tal como se describe en la reivindicación 17, caracterizado porque la citocina es IL-6.
  19. 19. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 18, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo.
  20. 20. El método tal como se describe en cualesquiera de las rei indicaciones de la 1 a la 18, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
  21. 21. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 20, caracterizado porque el sistema(s) de ensayo es un ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzimas (ELISA) colorimétrico, un inmunoensayo radioetiquetado o un inmunoensayo etiquetado con fluorescencia.
  22. 22. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 1 o de la 4 a la 21, caracterizado porque la línea celular monocítica comprende una línea celular monocítica humana.
  23. 23. El método tal como se describe en la reivindicación 22, caracterizado porque la línea celular monocítica humana es MONOMAC-6, THP-1 o 28SC.
  24. 24. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 1 y de la 4 a la 21, caracterizado porque la línea celular monocítica comprende una línea celular que tiene receptores tipo CD14 y Toll endógenos o que han sido transfectados con receptores tipo CD14 y/o Toll y/o genes reporteros para transmisores inflamatorios o pirogénicos.
  25. 25. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 1 y de la 4 a la 24, caracterizado porque la muestra es un producto médico administrado en forma parenteral .
  26. 26. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 2, 3 y 25, caracterizado porque el producto médico administrado en forma parenteral se selecciona del grupo que consiste en un producto de sangre, solución de diálisis, vacuna y expansor de plasma.
  27. 27. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 1 y de la 4 a la 26, caracterizado porque el reactivo que contiene monocitos se encuentra en el sistema de ensayo en una densidad celular de al menos aproximadamente 250,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1,000,000, 1,100,000, 1,200,000, 1,300,000, 1,400,000, 1,500,000, 1,600,000, 1,700,000, 1,800,000, 1,900,000 ó 2,000,000 células por depósito.
  28. 28. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 1 y de la 4 a la 27, caracterizado porque las células mononucleares de sangre periférica comprenden células mononucleares de sangre periférica humana.
  29. 29. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 2, 3, 6 a 12, 19 a 21 y 26, caracterizado porque el reactivo que contiene monocitos comprende además un diluyente.
  30. 30. El método tal como se describe en la reivindicación 29, caracterizado porque el diluyente es un medio RPMI.
  31. 31. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 2, 3, 6 a 12, 19 a 21, 26, 29 y 30, caracterizado porque el reactivo que comprende monocito comprende además un anticoagulante.
  32. 32. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 2, 3, 6-12, 19-21, 26 y 29-31, caracterizado porque la sangre completa comprende sangre completa humana.
  33. 33. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 2, 3, 6 a 12, 19 a 21, 26 y 29 a 31, caracterizado porque el reactivo que contiene monocito se encuentra en el sistema de ensayos en una densidad celular mayor a aproximadamente 100,000, 200,000, 210,000, 220,000, 230,000, 240,000, 250,000, 260,000, 270,000, 280,000, 290,000, 300,000, 310,000, 320,000, 330,000, 340,000, 350,000, 360,000, 370,000, 380,000, 390,000 ó 400,000 de células mononucleares de sangre periférica por depósito.
  34. 34. Un equipo de diagnóstico que comprende: una placa de microtitulación que comprende una pluralidad de depósitos de microtitulación formados de modo que las células contenidas en cada depósito sean concentradas en comparación a un depósito de microtitulación de fondo plano, una superficie del depósito que comprende polipropileno; y un reactivo que contiene monocitos crioconservado el cual está contenido en los depósitos de la placa, en donde el reactivo que contiene monocitos comprende células mononucleares de sangre periférica crioconservadas o células de línea celular monocítica crioconservada, está en contacto con las superficies de los depósitos y se encuentra en el depósito a una alta concentración celular.
  35. 35. Un equipo de diagnóstico que comprende: un sistema de ensayo para detectar pirógenos sin endotoxina en un producto médico administrado en forma parenteral, en donde el sistema de ensayo comprende una placa de microtitulación que comprende una pluralidad de depósitos de microtitulación formados de modo que las células contenidas en cada depósito sean concentradas en comparación con un depósito de microtitulación de fondo redondo, comprendiendo una superficie del depósito polipropileno; un reactivo que contiene monocitos crioconservado que está contenido en los depósitos de la placa, en donde el reactivo que contiene monocitos comprende sangre completa crioconservada y está en contacto con la superficie de los depósitos; y un anticuerpo para IL-6.
  36. 36. Un equipo tal como se describe en la reivindicación 34 ó 35, caracterizado porque el depósito comprende además una barrera que es impermeable a monocitos.
  37. 37. Un equipo tal como se describe en la reivindicación 36, caracterizado porque la barrera comprende una membrana, una rejilla, un cernidor o un cribador.
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