MX2008007292A

MX2008007292A - Composiciones inmunoestimuladoras y metodos.

Info

Publication number: MX2008007292A
Application number: MX2008007292A
Authority: MX
Inventors: Haval Shirwan; Kutlu G Elpek; Esma S Yolcu
Original assignee: Univ Louisville Res Found
Priority date: 2005-12-08
Filing date: 2006-12-07
Publication date: 2008-10-17
Also published as: EP1973572A2; US9079976B2; JP5564181B2; US20070172504A1; US20120171240A1; JP2009518426A; CA2632663C; KR20080090411A; US20100158936A1; US8017582B2; EP1976565A2; US20070184473A1; AU2006321888A1; JP2009518427A; KR20080090412A; US7598345B2; WO2007067681A2; US20100240585A1; CA2632663A1; MX2008007286A

Abstract

La presente invención se refiere a conjugados que comprenden un polipéptido co-estimulador inmune y un antígeno o agente infeccioso. Los conjugados son empleados para generar o intensificar una respuesta inmune contra el antígeno o agente infeccioso. La invención también proporciona células inmunes modificadas con un conjugado, que son empleadas para generar o intensificar una respuesta inmune a un antígeno o agente infeccioso. La invención también proporciona porciones inmunoestimuladoras que comprenden un polipéptido co-estimulador inmune, que con empleadas para estimular una respuesta inmune. La invención también proporciona métodos de inmunoterapia y métodos para tratar o prevenir infecciones.

Description

COMPOSICIONES INMÜNOESTIMULADORAS Y MÉTODOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención generalmente se refiere a métodos para generar o mejorar una respuesta inmune, incluyendo una respuesta inmune contra un antigeno, a composiciones para efectuar los métodos, y a células inmunes modificadas útiles en tales métodos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se han descrito procedimientos dirigidos a la amplificación de una respuesta inmune del hospedador para dirigir enfermedades y condiciones caracterizadas por una deficiencia de inmunidad o resolubles por una respuesta inmune más agresiva. Las enfermedades o condiciones ejemplares donde tales procedimientos pueden ser ventajosos incluyen cáncer, influenza y virus de inmunodeficiencia humana (VIH) . Los tratamientos de cáncer que involucran cirugía, quimioterapia y radioterapia son comúnmente usados, pero estos procedimientos carecen de especificidad de tumor, resultando en efectos secundarios adversos y respuestas clínicas menos satisfactorias. Por consiguiente, los métodos para amplificar la respuesta inmune a cáncer dirigiendo específicamente esta respuesta a las células I cancerígenas objetivo sin efectos nocivos significativos i en las células normales podrían ofrecer distintas ventajas i sobre la terapia de cáncer tradicional. ' j Existe un consenso que la vigilancia inmune juega un papel en la prevención y erradicación de tumores, y la ! I inmunidad adaptiva mediada por células T juega un papel en ' este proceso. Véase, por ejemplo, Pardoll, Nat. Rev. i Immunol 2002, 2:227-38; Rosenberg, Nature 2001, 411:380-84; Finn, OJ. Nat. Rev. Immunol. 2003, 3:630-41. La inmunidad ; mediada por célula T también juega un papel en varios 1 i procedimientos inmunoterapéuticos que han mostrado eficiencia en ambientes preclínicos y clínicos limitados. j i Véase, por ejemplo, Pardoll, supra; Finn, supra; Antonia et 1 al., Curr. Opin. Immunol 2004, 16:130-6. Los tumores son ( dirigidos por el sistema inmune * debido a que expresan ¦ antígenos asociados con el tumor (TAAs) , los cuales son ya ; sea auto-proteína mutadas o sobre/aberrantemente expresadas, o proteínas derivadas de virus oncogénicos. ' i Véase, por ejemplo, Finn, supra; Antonia, supra. Bajo, condiciones fisiológicas, los antígenos de tumor son i recolectados por células dendríticas (DC) , transportados a1 órganos linfoides periféricos, y presentados a células Tj naive bajo condiciones inmunogénicas que permiten suj I activación y diferenciación en células efectoras (Tf.,í£) . I I Estas células luego circulan a sitios de tumor y generanj respuestas anti-tumor para erradicación de tumor. Véase, por ejemplo, Spiotto, et al., Immunity. 2002; 17:737-47; Ochsenbein et al., Nature 2001; 411:1058-64; Yu et al., Nat. Immunol. 2004; 5:141-9. Una respuesta de célula T productiva requiere tres señales distintas: Señales 1, 2, t 3. La señal 1 se genera por receptores de célula T (TCR) que interactúan con péptidos nominales presentados por moléculas de complejo de histocompatibilidad principal ( HC) en la superficie de células que presentan antigeno profesional (APCs). La señal 2 es mediada por una serie de moléculas co-estimulantes y es critica a una respuesta inmune sostenida. La señal 3 es transducida vía citocinas elaboradas por linfocitos activados y APCs, tales como macrófagos y DC, y es importante para el mantenimiento de respuestas inmune efectoras. Los tumores han desarrollado varios mecanismos para evadir la vigilancia inmune. Estos mecanismos incluyen: (i) carencia de señal 1, que surge ya sea de la exhibición ineficiente de complejos bimoleculares de MHC/antigeno de tumor en células de tumor, defectos en la transducción de esta señal, o expresión de homólogos de MHC, MIC, que inhiben el asesino natural (células NK) que expresa receptores inhibidores de NKG2 ; (ii) ausencia de señal 2 originada de la carencia de moléculas co- ¡ estimulantes o expresión de moléculas co-inhibidoras en células de tumor; (iii) supresión mediada por tumor de j respuestas inmune a través de la secreción de moléculas i anti-inflamatorias, inducción de anergia en células T reactivas de tumor, eliminación física de células Teff vía : apoptosis, o inducción de células CD4+CD25+FoxP3+T ¡ reguladoras (Treg) que se presentan naturalmente, y (iv) i regulación de inmunidad por estroma de tumor. La evidencia : I acumulada sugiere que muchos de estos mecanismos pueden \ I operar simultáneamente en pacientes con cargas de tumor 1 grandes. Las vacunas contra cáncer las cuales incluyen ¡ antígenos del cáncer objetivo han atraído interés debido a j la promesa de especificidad, seguridad, eficacia y la ¡ memoria de largo plazo del sistema inmune que puede ; 1 prevenir la recurrencia del cáncer. Una vez que se j estableció que el sistema inmune juega un papel importante I I en salvaguardar a los individuos contra el cáncer y se pueden modular para erradicar tumores existentes en modelos ¡ animales, se dedicaron esfuerzos intensos al desarrollo de i j vacunas terapéuticas. Véase, por ejemplo, Berzofsky et al., : J. Clin. Invest 2004,113:1515-25; Platsoucas et al., ' Anticancer Res. 2003; 23,1969-96; Finn, supra. Las ¡ í estrategias de vacuna actuales incluyen lisados de célula I de tumor, células de tumor genéticamente modificadas para i expresar moléculas co-estimulantes , citocinas, y/o quimiocinas , DC impulsadas con antígenos de tumor o transfectadas con ARN o ADN de tumor, e inyección intratumoral de un intervalo de vectores que codifican varias moléculas inmunoestimulantes . La eficacia limitada de estos procedimientos puede detener la capacidad de que los tumores progresen para controlar las respuestas inmunes usando una o varias estrategias de evasión inmune, o debido a los mecanismos inmunosupresores , presentación ineficiencia de TAAs, o carencia de activación potente de DC, células Teff, y células NK.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones inmunoestimulantes y métodos.

De conformidad con una modalidad, la invención proporciona una combinación que comprende (a) un primer conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado que comprende un primer polipéptido inmuno co-estimulante y ¡ i (ii) un miembro de conjugado que comprende un primer1 miembro de un par de enlace; y (b) un segundo conjugado que comprende (i) un miembro, de conjugado que comprende un | primer antigeno y (ii) un miembro de conjugado que ¡ comprende un segundo miembro del par de enlace. En una! I modalidad, el primer miembro del par de enlace puede: comprender avidina o estreptavidina y el segundo miembro del par de enlace puede comprender biotina. En otra modalidad, el primer conjugado puede comprender un polipéptido de fusión que comprende el primer polipéptido inmuno co-estimulante y el primer miembro del par de enlace. En una modalidad específica, el primer polipéptido inmuno co-estimulante se selecciona del grupo que consiste de 4-1BBL, CD86, ICOSL, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, 0X4 OL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, APR.T.L, CD80 y CD40L . En una modalidad específica, el primer antígeno está asociado con un agente infeccioso, tal como virus de inmunodeficiencia humana o influencia humana o aviar. En otra modalidad específica, el primer antígeno es un antígeno asociado con tumor. En una modalidad, la combinación adicionalmente comprende un tercer conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado que comprende un segundo polipéptido inmuno co-estimulante y un primer miembro de un par de enlace y (ii) un miembro de conjugado que comprende un segundo antígeno y un segundo miembro de un par de enlace. En esta modalidad, el segundo polipéptido inmuno co-estimulante es el mismo o diferente del primer polipéptido inmuno coestimulante; el segundo antígeno es el mismo o diferente del primer antígeno; los primer y segundo miembros de par de enlace del tercer conjugado son los mismos o diferentes de los primer y segundo miembros de par de enlace de los primer y segundo conjugados. Adicionalmente , el primer miembro de conjugado se puede unir al segundo miembro conjugado via enlace entre los primer y segundo miembros de par de enlace. En otra modalidad, el segundo conjugado de la combinación comprende (i) un miembro de conjugado que comprende un agente infeccioso y (ii) un miembro de conjugado que comprende un segundo miembro del par de enlace. De conformidad con otro aspecto de la invención, se proporciona un método para generar o mejorar una respuesta inmune contra un tumor el cual expresa un primer antigeno asociado al tumor, que comprende administrar a un paciente con el tumor (a) un primer conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado que comprende un primer polipéptido inmuno co-est intuíante y (ii ) un miembro de conjugado que comprende un primer miembro de un par de enlace, y un segundo conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado que comprende el primer antigeno asociado al tumor y (ii) un miembro de conjugado que comprende un segundo miembro del par de enlace; o (b) células inmune las cuales se han tratado in vitro con los primer y segundo conj ugados . En una modalidad, los primer y segundo conjugados se administran al paciente, separadamente o j simultáneamente, incluidos como parte de una composición única.

En otra modalidad, el paciente es administrado I con células inmunes las cuales se han tratado in vitro con ! i los primer y segundo conjugados. En una modalidad | especifica, las células inmunes comprenden un receptor para j el polipéptido inmu o co-estimulante , y en donde el primer ¡ conjugado es conjugado a las células inmunes vía el enlace ' entre el polipéptido inmuno co-est imulante y los 1 receptores, y el segundo conjugado es conjugado a la célula ' inmune vía el enlace entre los primer y segundo miembros de ¡ par de enlace. i En una modalidad, el método adicionalmente i comprende administrar un tercer conjugado que comprende (i) ; un miembro de conjugado que comprende un segundo polipéptido inmuno co-estimulante y un primer miembro de un j par de enlace y (ii) un miembro de conjugado que comprende1 un segundo antígeno asociado al tumor y un segundo miembro' de un par de enlace. En esta modalidad, el segundo' polipéptido inmuno co-estimulante es el mismo o diferentei del primer polipéptido inmuno co-estimulante; el segundoi antígeno es el mismo o diferente del primer antígeno; los! primer y segundo miembros de par de enlace del tercer; conjugado son los mismos o diferentes de los primer yj i segundo miembros de par de enlace de los primer y segundo conjugados. Adicionalmente, el primer miembro de conjugado i se puede unir al segundo miembro de conjugado vía el enlace 1 entre los primer y segundo miembros de par de enlace. i De conformidad con otro aspecto de la invención, j se proporciona un método para modificar las células inmune para generar o mejorar una respuesta inmune a un tumor que expresa un antígeno asociado al tumor o a un agente ' infeccioso, que comprende poner en contacto las células i inmunes que expresan un receptor para un primer j polipéptido inmuno co-estimulante con (a) un primer ! j conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado que [ comprende el primer polipéptido inmuno co-estimulante y ¡ (ii) un miembro de conjugado que comprende un primer ¡ miembro de un par de enlace; y (b) un segundo conjugado que i comprende (i) un miembro de conjugado que comprende un ' antigeno asociado con el tumor o agente infeccioso o el j agente infeccioso y (ii) un miembro de conjugado que j i comprende un segundo miembro del par de enlace. El primer i I conjugado se puede conjugar a las células inmunes vía el j enlace entre el polipéptido inmuno co-estimulante y el 1 receptor, y el segundo conjugado se puede conjugar a la ¡ célula inmune vía el enlace entre los primer y segundo ¡ miembros de par de enlace. ¡ En una modalidad, la célula inmune es una célula T, tal como una célula CD4+ o células CD8+, o un neutrófilo, células asesina natural, monocito o célula dendritica. En otra modalidad, las células inmunes comprenden un receptor para un segundo polipéptido inmuno coestimulante y el método adicionalmente comprende poner en contacto las células inmunes con un tercer conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado que comprende el segundo polipéptido inmuno co-estimulante y un primer miembro de un par de enlace y (ii) un miembro de conjugado que comprende un segundo antigeno asociado con el tumor o agente infeccioso o el agente infeccioso y un segundo miembro del par de enlace. En esta modalidad, el segundo polipéptido inmuno co-estimulante es el mismo o diferente del primer polipéptido inmuno co-estimulante, el segundo antigeno, si está presente, es el mismo o diferente del primer antigeno, si está . presente; los primer y segundo miembros de par de enlacé del tercer conjugado son los mismos o diferentes de los primer y segundo miembros de par de enlace de los primer y segundo conjugados.

Adicionalmente, el primer miembro de conjugado se puede! i unir al segundo miembro de conjugado vía el enlace entre: los primer y segundo miembros de par de enlace. j De conformidad con otro aspecto de la invención,1 se proporciona una célula inmune modificada que expresa uri receptor para un primer polipéptido inmuno co-estimulante,: i en donde la célula inmune modificada se modifica con (a) un primer conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado que comprende el primer polipéptido inmuno co-estimulante y (ii) un miembro de conjugado que comprende un primer miembro de un par de enlace; y (b) un segundo conjugado que, comprende (i) un miembro de conjugado que comprende un primer antigeno o agente infeccioso y (ii) un miembro de conjugado que comprende un segundo miembro del par de enlace, en donde el primer conjugado es conjugado a la i célula inmune vía el enlace entre el polipéptido inmuno co- ; estimulante y el receptor, y el segundo conjugado es conjugado a la célula inmune vía el enlace entre los primer ; y segundo miembros de par de enlace. En una modalidad, la : célula inmune es una célula T, tal como una célula CD4+ o ¡ célula CD8+, o un neutrófilo, célula asesina natural, monocito o célula dendritica. ' i De conformidad con otro aspecto de la invención, ; se proporciona un método para inducir o mejorar una j respuesta inmune contra un agente infeccioso, que comprende ; administrar a un paciente que sufre o está en riesgo de infección con el agente infeccioso (a) un primer conjugado ' que comprende (i) un miembro de conjugado que comprende un j primer polipéptido inmuno co-estimulante y (ii) un miembro ¡ de conjugado que comprende un primer miembro de un par de enlace; y (b) un segundo conjugado que comprende (i) un : miembro de conjugado que comprender un primer antigeno asociado con el agente infeccioso o que comprende el agente infeccioso y (ii) un miembro de conjugado que comprende un segundo miembro del par de enlace. En una modalidad, al menos uno de los primer y segundo conjugados se administra por inyección directa en un sitio de infección. En una modalidad especifica, la infección es influenza humana o aviar y el primer antigeno se selecciona del grupo que consiste de H, , MI, M2e, NS1, NS2 (NEP) , NP, PA, PB1, y PB2. En otra modalidad especifica, la infección es VIH y el primer antigeno se selecciona del grupo de antigenos de VIH que consisten de proteínas Gag, Pol, Vif, Vpr, Rev, Vpu, epítopes de envoltura, Tat, y Nef. En una modalidad, el método adicionalmente comprende administrar un tercer conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado que comprende un segundo polipéptido inmuno co-est imuíante y un primer miembro de un par de enlace y (ii) un miembro de conjugado que comprende un segundo antigeno asociado con la infección o el agente infeccioso y un segundo miembro del par de enlace, en donde el segundo polipéptido inmuno co-estimularite es el mismo o diferente del primer polipéptido inmuno co-estintuíante; el segundo antigeno, si está presente, es el mismo o diferente del primer antígeno, si está presente; los primer y segundo miembros de par de enlace del te cer conjugado son los mismos o diferentes de los primer y segundo miembros de par de enlace de los primer y segundo conjugados, y el primer miembro de conjugado se une al segundo miembro de conjugado vía el enlace entre los primer y segundo miembros de par de enlace. De conformidad con otro aspecto de la invención, se proporciona un conjugado que comprende un polipéptido inmuno co-estimulante y avidina o estreptavidina . ; De conformidad con otro aspecto de la invención, ¡ se proporciona un método para inducir una respuesta ¡ inmunoestimulante en un animal que comprende administrar al 1 animal un conjugado que comprende un polipéptido inmuno co- 1 estimulante y avidina y estreptavidina. En algunas^ modalidades, el método adicionalmente comprende administrar! un antigeno al animal. ' ¡ BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras 1A y IB describen la secuencia de¡ nucleótido (SEC ID NO:l) y secuencia de aminoácido (SEC ID; NO: 2), respectivamente, de una proteina de fusión que| comprende estreptavidina de núcleo y el dominio! extracelular de la proteina LIGHT murina. La secuencia de' estreptavidina de núcleo es subrayada en la figura IB. '' Las figuras 2A y 2B describen la secuencia de' nucleótido (SEC ID NO: 3) y secuencia de aminoácido (SEC ID N0:4), respectivamente, de una proteína de fusión que comprende el dominio extracelular de CD80 humana y estreptavidina de núcleo. La secuencia de estreptavidina de núcleo es subrayada en la figura 2B. Las figuras 3A y 3B describen la secuencia de nucleótido (SEC ID NO: 5) y secuencia de aminoácido (SEC ID NO: 6), respectivamente, de una proteína de fusión que comprende el dominio extracelular de 4-1BB1 murina y estreptavidina de núcleo. La secuencia de estreptavidina de núcleo es subrayada en la figura 3B. Las figuras 4A y 4B describen la secuencia de nucleótido (SEC ID NO: 7) y secuencia de aminoácido (SEC ID NO:8), respectivamente, de una proteína de fusión que comprende estreptavidina de núcleo y el dominio extracelular de 4-1BBL humana. La secuencia de estreptavidina de núcleo es subrayada en la figura 4B. Las figuras 5A y 5B describen la secuencia de nucleótido (SEC ID NO: 9) y secuencia de aminoácido (SEC ID NO: 10), respectivamente, de una proteína de fusión que comprende estreptavidina de núcleo y el dominio extracelular de CD86 humana. La secuencia de estreptavidina de núcleo es subrayada en la figura 5B. Las figuras 6A, 6B y 6C describen las secuencias de aminoácido de HPV16 E6 (SEC ID NO: 11), una variante de HPV16 E6 (SEC ID NO:12), y HV16 E7 (SEC ID NO:13).

Las figuras 7A y 7B describen las secuencias de | nucleótido y aminoácido de los constructos CD40L CSA- humana (SEC ID NOs 14 y 15) ¡usados en los ejemplos.

La figura 8 muestra los resultados de reacciones ¡ de linfocito mezclado alogénico usando linfocitos BALB/c ¡ I naive como respondedores y esplenocitos irradiados con ; i C57BL/6 alogénico como estimulantes. Los cultivos indicados \ I fueron suplementados con 1 pg/ml de proteína de fusión CSA- j 41BBL. ¡ La figura 9 muestra los resultados de I proliferación de célula T ex vivo donde las células T CD8+ j seleccionadas de ratones C57B/6 fueron estimuladas con , anticuerpo monoclonal anti-CD3 soluble (0.5 g/ml) y ¡ esplenocitos irradiados en la presencia o ausencia de ! proteína de fusión CSA-41BBL (0.5 µg/ml), proteína CSA de j i control (0.19 µ?/ml) , o clon de anticuerpo monoclonal anti- I 4-1BB 3H3 (5 ug/ml) . j La figura 10 muestra la respuesta proliferativa ! de células T CD8+ específicas de antígeno cuando un millón,' de células T OT-I CD8+ fueron etiquetadas con CFSE y; transferidas en ratones B6.SJL que fueron inmunizados con i í OVA biotinilada (10 µg/inyección) y proteína de fusión CSA-1 4-1BBL (1 g/inyección) mezclada con OVA biotinilada' I (41BBL+OVA) o un conjugado que comprende OVA biotinilada y! ! CSA-4-1BBL. El último panel (*) muestra la respuesta para 5' g de CSA-4-1BBL conjugado con 10 pg de OVA conjugada. La estreptavidina de núcleo (SA) se utilizó a nivel equimolar como 4-1BBL.

La figura 11A es un histograma que muestra células PE+ de DC no tratada (área llenada con gris) , DC tratada con PE biotinilado (linea de puntos) y DC tratada i con conjugado de PE biotinilado/CSA-4-lBBL (linea continua) . La figura 11B muestra la intensidad de , fluorescencia promedio (MFI) de PE para DC que recibe cada 1 tratamiento. : La figura 12A muestra los resultados de la 1 citometría de flujo realizada para analizar niveles de CD86 : y MHC clase II de DC no tratada (gris oscuro) o tratada con > CSA-41BBL (línea continua) o LPS (línea de puntos) en la í presencia de GM-CSF. La figura 12B muestra la intensidad de ; fluorescencia promedio de CD86 y MHC clase II. j La figura 13 muestra la intensidad de | fluorescencia promedio de expresión de CD40, CD86 y MHC j clase II en células DC de naíve, tratadas con OVA; biotinilada/CSA y animales tratados con OVA1 biotinilada/CSA-4-lBBL. ; I La figura 14A muestra los resultados de los: experimentos de co-cultivo donde las células T CD4+ CD25"' i (positivo único, SP) y CD4+ CD25+ (positivo doble, DP): fueron seleccionadas de los nodos linfáticos de bazo periféricos de ratones BALB/c naive y cultivadas solas o en relación 1:1 por 3 días, en cultivos suplementados con esplenocitos irradiados, un anticuerpo anti-CD3 (0.5 yg/ml) , y concentraciones indicadas {]iq/ml) de 4-1BBL o cantidad equimolar de proteina CSA de control. La figura 14B muestra los resultados de un ensayo CFSE donde las células T SP etiquetadas con CFSE fueron usadas en un ensayo de supresión bajo condiciones descritas para la figura 14A, excepto que se utilizó 4-1BBL a 0.5 µg/ml. El porcentaje de células divididas se muestra de cada histograma . La figura 15 muestra los resultados de proliferación de célula T ex vivo donde las células T CD4+ CD25" (positivo único, SP) y CD4+ CD25+ (positivo doble, DP) fueron seleccionadas de los nodos linfáticos de bazo y periféricos de ratones BALB/c naive y cultivadas solas o en una relación 1:1 en la presencia de 0.5 yg/ml de anticuerpo anti-CD3 y esplenocitos irradiados con o sin 1 g/ml de 4-1BBL. La figura 16 muestra la construcción de constructos CSA-hCD40L y CSA-mCD40L. Las flechas indican cebadores (a, b, c, d) y sus orientaciones usadas para propósitos de clonación. La figura 17 muestra el análisis de citometria de flujo que demuestra el enlace de CSAmCD40L y CSA-hCD40L a j receptores CD40, donde las líneas celulares de THP-1 humana ' y A20 de ratón fueron incubadas con CSA-mCD40L o CSA- ' hCD40L, manchadas con anticuerpo anti-estreptavidina ' etiquetado con FITC, y analizadas en citometría de flujo. j Los paneles (a) y (b) muestran el enlace de CSA-mCD40L a j líneas celulares humana y de ratón, respectivamente, y los i paneles (c) y (d) muestran el enlace de CSA-hCD40L a líneas ¡ celulares humana y de ratón, respectivamente. ¡ La figura 18 muestra el análisis de citometría de ¡ flujo que demuestra la sobre-regulación de HLA clase II y j moléculas co-est imulantes en macrófagos estimulados con , CSA-hCD40L, donde una línea celular THP-1 humana fue j estimulada con 100 ng/ml de CSA-hCD40L por 48 horas (líneas j continuas delgadas) y analizada usando anticuerpos a 1 moléculas HLA clase II (figura 18A) y CD80 (figura 18B) en l citometría de flujo. Las células incubadas con proteína CSA i (histogramas continuos) y1 transíectores de célula CHO que i expresan CD40L de ratón unido a membrana (línea continua! gruesa) sirvieron como controles negativo y positivo, ] respectivamente. ¡ La figura 19 muestra el análisis de citometría de | flujo que demuestra la maduración fenotípica de DCs murinas [ estimuladas con CSA-mCD40L, donde las DCs inmaduras! derivadas de médula ósea fueron estimuladas con; i concentraciones variadas de CSA-mCD40L (histogramas ' I I abiertos) por varios periodos de tiempo, y analizadas ¡ usando anticuerpos específicos para la expresión de CD80 j (figura 19A) y CD86 (figura 19B) . Las células dejadas no , estimuladas (líneas continuas delgadas) o estimuladas con j proteína CSA (histogramas continuos) sirvieron como i controles. Los datos se muestran para 200 ng de proteína por 106 células estimuladas por 48 horas.

La figura 20 muestra la secreción de citocinas ¦ por monicitos humanos estimulados con CSA-CD40L, donde los l monocitos humanos elutriados primarios fueron estimulados ¡ con 1 g/ml de cada rhsCD40L + mejorados (figura 20A) y 100 ng/ml de CSA-hCD40L (figura 20B) o 250 ng/ml de CSA-mCD40L ' i (figura 20C) o CSA por 18 horas, y los sobrenadantes fueron \ i analizados para contenido de IL-?ß e IL-6 por ELSA. La ¡ i figura 20D muestra los resultados cuando una línea celular i de macrófago murino genéticamente modificada para expresar j CD40 humana (CD40KO) se estimuló con CSA o CSA-hCD40L (lj pg/ml) por 3 horas y el ARN se extrajo y analizó por ensayo, de protección de ARNsa usando el sistema de protección de , i ¡ ARNsa de multisondas RiboQuant con el molde mck-3b. se mostraron las sondas protegidas para IL-6, L32, y GAPDH. El i histograma representa la densidad de banda de IL-6 después1 de la normalización con el. gen de servicio L32. ¡ La figura 21 muestra la estimulación de expresión¡ de iNOS en macrófagos estimulados con CSA-hCD40L, donde lal linea de macrófago CD40KO murino transfectada para expresar ¡ la CD40 humana fue cebada con IFN-? por 24 horas y las células luego fueron estimuladas con 1 pg/ml de rhsCD40L ' comercial con el mejorador o 300 ng/ml CSA-hCD40L o 1 proteínas CSA por 24 horas, y los lisados de célula fueron I analizados por Análisis Western blot usando anticuerpo 1 i anti-iNOS. El histograma representa la densidad de las [ bandas iNOS.

La figura 22 muestra el fuerte efecto de adyuvante in vivo de CSA-4-1BBL cuando se compara con LPS a dosis de 12.5 y 25 iq, con 50 g de OVA como el antígeno. ¡ Los resultados se reportaron en términos de porcentaje de aniquilación in vivo. ! i La figura 23 muestra los efectos en tumores i cérvicos existentes de vacunación con (i) PBS (?, n=20); ' i (ii) 50 g de P1+ 12.5 pg, de CSA (", n=6) (iii) 25 ug de , CSA-4-1BBL n=10); (iv) 50 µ? de P1+ 25 pg de CSA-4-1BBL J (?, n=13), o (v) 50 g de P1+ 10 g de CpG (?, n=7). La ; vacunación con la combinación de Pl y CSA-4-1BBL resultó en | velocidades de supervivencia significativamente mejoradas, mientras la vacunación ya sea con Pl o CSA-4-1BBL ' proporcionó alguna inmunoterapia exitosa.

La figura 24 muestra los resultados de la : vacunación con un conjugado de OVA biotinilada/CSA-4-lBBL ] en la prevención de crecimiento de tumor. La supervivencia' libre de tumor de ratones vacunados con OVA (?) , un conjugado de OVA biotinilada/CSA-4-llBBL ( A ) y ratones de control (·) se muestran, con ratones vacunados con el conjugado de OVA biotinilada/CSA-4-lBBL que muestra 100% de supervivencia. La figura 25 muestra la citometria de flujo de células manchadas con CFSE, que demuestra que 4-1BBL podrá mejorar la respuesta CTL especifica de antigeno in vivo a niveles mayores comparado con el antigeno solo, o antigeno y LPS. LOs resultados se expresan en la esquina de cada panel como porcentaje de lisis del pico CFSEhi impulsado por péptido cuando se compara con el pico CFSElow de referencia normalizado al animal naive. La figura 26 muestra los datos de citometria de flujo que demuestran que la estimulación de 4-1BBL incrementó la presentación de antigeno in vivo. La figura 27 muestra los datos de citometria de flujo que la co-estimulación de 4-1BBL incrementa la absorción de antigeno por células dendriticas in vivo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos y composiciones para generar o mejorar una respuesta inmune, incluyendo una respuesta inmune contra un antigeno, tal como un TAA o antigeno asociado con un agente infeccioso tal como influenza humana y aviar o VIH. La invención también proporciona células inmunes modificadas que son útiles para generar o mejorar una respuesta inmune a un antigeno. La invención también proporciona métodos de inmunoterapia, incluyendo métodos de inmunoterapia de cáncer, tales como métodos para reducir el tamaño de tumor y métodos para inhibir el crecimiento de células de tumor, y métodos para tratar o prevenir infecciones. Una respuesta inmune adaptiva productiva requiere interacciones coordinadas y a tiempo entre las células efectoras T ("Teff") naive y APCs dentro de las estructuras organizadas de órganos linfoides secundarios. Esta interacción promueve la activación reciproca de células Teff y APCs, conduciendo a la expresión de varios receptores y ligandos de superficie celular asi como proteínas solubles que son importantes para la iniciación, mantenimiento, y memoria de largo plazo de la respuesta. Como se discutió anteriormente, al menos tres señales (Señal 1, 2, y 3) , están involucradas en la activación inicial de células T naive. Se han implicado diversas moléculas co-estimulantes inmunes que estimulan una o más de estas señales. La presente invención se refiere al uso de uno o más polipéptidos co-estimulantes inmunes y uno o más antígenos asociados con un tumor o agente infeccioso en métodos que presentan el antigeno a células inmunes de modo que se induce una respuesta inmune efectiva contra el tumor o agente infeccioso. Alternativamente, se puede usar un agente infeccioso en lugar de un antigeno asociado con este. Mientras que no se busca que se una por cualquier teoría, se cree que la presente invención logra resultados ventajosos facilitando la presentación de antígeno y activando la respuesta inmune. En otra modalidad alternativa, la invención proporciona porciones inmunoestimulantes que comprenden un polipéptido inmuno coestimulante, que son útiles para estimular una respuesta inmune . Para los propósitos de la presente solicitud, los siguientes términos tienen estas definiciones: Como se usa en la presente "un" o "uno" significa uno o más, a menos que se indique específicamente para significar solo uno. "Administración" como se usa en la presente abarca todos los medios adecuados para proporcionar una sustancia a un paciente. Las rutas comunes incluyen ora, sublingual, transmucosal, transdérmica, rectal, vaginal, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intra-arterial , intratecal, vía catéter, vía implante, etc. En algunas modalidades, una composición se administra cerca o directamente al tumor, tal como por inyección directa en el tumor o inyección en la sangre tal como cuando el tumor es , un tumor de la sangre. i "Antigeno" se usa en la presente sin limitación.

Los antigenos incluyen proteínas, lípidos, azúcares, ácidos nucleicos, porciones químicas, y otras porciones que ¡ i inducen una respuesta inmune. Los antígenos incluyen ; proteínas, las cuales pueden o no pueden ser modificadas, tal como por glicosilacion o metilación, que son ciclizadas o unidas a lípidos, por ejemplo. Los antígenos asociados con un agente infeccioso o enfermedad incluyen antígenos que son parte del agente infeccioso, tales como proteínas j i naive, proteínas de capsida, proteínas de superficie, ! toxinas, paredes celulares, lípidos antigénicos, y > similares. Otros antígenos se pueden expresar solamente en la presencia del hospedador. Otros antígenos adecuados, en ! i algunas modalidades, pueden incluir antígenos del j hospedador, incluyendo aquellos que son inducidos, i modificados o de otra forma sobre-expresados como un ; marcador de infección o enfermedad. Tales antígenos que se , I derivan de, o asocian con, un agente infeccioso, una ' infección, una condición o enfermedad, son adecuados para ; i el uso en la presente invención. También adecuados para el ! uso como un "antígeno" de conformidad con la presente ' i invención son los péptidos que comprenden porciones ¦ antigénicas de proteínas de longitud completa, tales como I I péptidos que comprenden una porción de una proteina que induce una respuesta inmune, tal como un epitope inmunogénico . Por ejemplo, los antigenos adecuados pueden incluir péptidos sintéticos que inducen una respuesta inmune . "Par de enlace" se refiere a dos moléculas las cuales interactúan entre si a través de cualquiera de una variedad de fuerzas moleculares incluyendo, por ejemplo, enlace iónico, covalente, hidrofóbico, van der Waals, e hidrógeno, de modo que los pares tienen la propiedad de enlazarse específicamente entre si. El enlace específico significa que los miembros de par de enlace exhiben enlace entre si bajo condiciones donde no se enlazan a otra molécula. Los ejemplos de pares de enlace son biotina-avidina, hormona-receptor, receptor-ligando, enzima-sustancia, IgG-proteína A, antígeno-anticuerpo, y similares . "polipéptido inmuno co-estimulante" significa un polipéptido que incrementa una respuesta inmune del individuo contra un patógeno (incluyendo un agente infeccioso) o tumor. "Célula inmune como se usa en la presente incluye cualquier célula que se involucra en la generación, regulación o efecto del sistema inmune adquirido o innato. Las células inmunes incluyen células T tales como células CD4+, células CD8+ y varios subconjuntos de células T, células B, células exterminadoras naturales, macrófagos, monocitos y células dendriticas, y neutrófilos. "Paciente" como se usa en la presente incluye cualquier animal vertebrado, incluyendo equino, ovino, caprino, bovino, porcino, aviar, canino, felino y especies de primates. En una modalidad, el paciente es humano. Una persona de experiencia ordinaria en la técnica reconocerá que moléculas co-estimulantes inmunes particulares, moléculas de señalización, marcadores de células, tipos de células, agentes infecciosos, etc., descritos con referencia a una especie, pueden tener análogos correspondientes en diferentes especies, y que tales análogos, y su uso en especies correspondientes y relacionadas, se incluyen por la presente invención. "Tumor" como se usa en la presente incluye tumores sólidos y no sólidos (tales como leucemia) ; y etapas diferentes de desarrollo de tumor a partir de lesiones pre-cancerosas y tumores benignos, a tumores cancerosos, malignos y metastáticos . En términos generales, la invención proporciona métodos por los cuales una respuesta inmune contra un primer antigeno es generada o mejorada usando (a) un primer conjugado que comprende (1) un miembro de conjugado que comprende un primer polipéptido inmuno co-estimulante y (ii) un número de conjugado que comprende un primer l elemento de un par de enlace, y (b) un segundo conjugado ! que comprende (i) un miembro de conjugado que comprende el ! primer antigeno y (ii) un miembro de conjugado que ! comprende un segundo miembro del par de enlace. ! El antigeno puede ser un TAA o un antigeno i asociado con un agente infeccioso, o el agente infeccioso j por él mismo. Los conjugados se pueden administrar I i directamente a un paciente que comprende el antigeno o j agente infeccioso, o puede ser usado para tratar células inmunes las cuales entonces se administran a un paciente.

La invención también proporciona composiciones que comprenden los conjugados, células inmunes tratadas con los conjugados, y métodos para hacer células inmunes tratadas. | La invención también proporciona porciones inmunoestimulantes que comprenden un polipéptido inmuno co- ¡ estimulante, tal como un conjugado o proteina de fusión que ¡ comprende un polipéptido inmuno co-estimulante y avidina o j , i estreptavidina . La invención también proporciona un método j para inducir una respuesta . inmunoestimulante en un animal j que comprende administrar una porción inmunoestimulante al ! animal. En algunas modalidades, un antigeno también se j I administra al animal. También se proveen las composiciones ¡ j que comprenden la porción. i De acuerdo con un aspecto de la invención, el I i I I I antigeno o agente infeccioso está presente en células inmunes como parte de un conjugado que comprende un polipéptido inmuno co-estimulante que selectivamente se dirige a uno o más tipos de células inmunes, tales como cualquiera de los polipéptidos co-estimulantes inmunes descritos posteriormente. Por consiguiente, de acuerdo con una modalidad, la invención proporciona un conjugado que comprende un polipéptido inmuno co-estimulante y un antigeno asociado con un tumor o agente infeccioso o el agente infeccioso. El antigeno o agente infeccioso se puede conjugar al polipéptido inmuno co-estimulante por cualquier medio, incluyendo enlace covalente, directamente o a través de un enlazante, o a través. de miembros de par de enlace. En una modalidad, ; en antigeno o agente infeccioso está conjugado al polipéptido inmuno co-estimulante a través de las interacciones de enlace de un par de enlace. De acuerdo con esta modalidad, cada uno del antigeno (o agente infeccioso) y el polipéptido inmuno co-estimulante se conjuga a un elemento de un par de enlace, y la interacción de enlace de los miembros de par de enlace se enlazan al antigeno (o agente infeccioso) y polipéptido inmuno co-estimulante conjuntamente en un conjugado, tal como un primer miembro de par de enlace-polipéptido inmuno co-estimulante: segundo miembro de par de enlace conjugado de antigeno (o agente infeccioso) .

De acuerdo con esta modalidad, la invención proporciona una combinación que comprende (a) un primer conjugado que comprende, (i) un miembro de conjugado que comprende un primer polipéptido inmuno co-estimulante y (ii) un miembro de conjugado que comprende un primer miembro de un par de enlace, y (b) un segundo conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado que comprende un primer antigeno asociado con un tumor o agente infeccioso (o el agente infeccioso por él mismo) y (ii) un miembro de conjugado que comprende un segundo miembro del par de enlace . En otra modalidad, la combinación comprende un tercer conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado que comprende un segundo polipéptido inmuno co-estimulante y (ii) un miembro de conjugado que comprende un segundo antigeno asociado con el tumor o agente infeccioso (o el agente infeccioso por él mismo) , en donde el polipéptido inmuno co-estimulante del tercer conjugado es el mismo como o diferente del polipéptido inmuno co-estimulante del primer conjugado y el segundo antigeno es el mismo como o diferente del primer antigeno. En un aspecto especifico de esta modalidad, el polipéptido inmuno co-estimulante y segundo antigeno del tercer conjugado se enlazan conjuntamente vía enlace entre miembros de par de enlace asociados con cada uno del polipéptido inmuno co- estimulante y segundo antigeno. De acuerdo con esta modalidad, los elementos de par de enlace del tercer conjugado pueden ser los mismos o diferentes del primer y segundo miembros de par de enlace de los primer o segundo con ugados .

El primer, segundo y opcionalmente tercer conjugados se pueden proporcionar en composiciones separadas. Alternativamente, los primer y segundo conjugados se pueden proporcionar en una composición única, y el tercer conjugado se puede proporcionar en una j composición separada. En todavía otra alternativa, el 1 primer, segundo y tercer conjugados se proporcionan en una composición única. En otra alternativa, el primer conjugado j I j se proporciona en una composición y el segundo y tercer i í conjugados se proporcionan en otra composición.

Cada composición opcionalmente puede comprender , un portador farmacéuticamente aceptable. Un portador í farmacéuticamente aceptable es un material que se puede ¡ usar como vehículo para la composición porque el material ¡ es inerte o de otra forma aceptable en medicina, ; así como también compatible con el agente (s) activo (s), en ! I el contexto de administración. Un portador ¡ farmacéuticamente aceptable puede contener aditivos ; farmacéuticos convencionales así como también conocidos en la técnica. ! Polipéptidos Co-Estimulantes Inmunes ¡ Las moléculas co-estimulantes inmunes están j involucradas en la interacción natural entre las células T ; naive y antigeno que presenta células, lo cual resulta en su activación reciproca y propone la expresión de varios ¡ receptores y ligandos de superficie celular, y proteínas de ! solubles que contribuyen a la iniciación, mantenimiento, y ¦ memoria de largo plazo de la respuesta inmune. Como se : discutió anteriormente, al menos tres señales son ¡ i requeridas para la activación inicial de células T naive. ¡ La señal es generada por interacciones entre un receptor de célula T (TCR) y un péptido nominal presentado por moléculas de complejo de histocompatibilidad principal (MHC) en la superficie de APC profesional, tales como 1 células dendríticas (DC) . La señal 2 se puede mediar por varias moléculas diferentes y es importante para una respuesta inmune sostenida. La señal 3 es transducida vía i citocinas elaboradas por células T activas y APC y es ¡ importante para el mantenimiento de respuestas inmunes : efectoras. Un número de moléculas co-estimulantes inmunes se : ha identificado. Las moléculas co-estimulantes inmunes i ejemplares (polipéptidos) útiles de conformidad con la , invención incluyen, sin limitación, LICHT, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), ICOS, ICOSL (incluyendo B7h, B7-H2, B7RP-1, ¡ GL-50 y LICOS) , CD94 (KP43), CD40L (CD 154), ICAM-I (CD54), ! ICAM-2, ICAM-3, SLAM (CD 150), HAS (CD24), 4-1BB (CDwl37), ( 4-1BBL (CDwl37L), OX40L, CD28, CD40 (BP50), CD25 (IL-2R a), : I Linfotoxina (LT o LTp) , TNF, Fas-1, GI R (TNRF inducible ¡ j por activación) , Ligando GITR, CDlla (aL integrina) , CDllb ; (aM integrina) , L-selectina (CD62L) , CD69 (antigeno de ¡ activación muy temprana), CD70 (CD27L) , PD-L1, PD-L2, B7- H3, B7-H4, 0X40L, 4-1BBL, CD27L, CD30.L, LIGHT, BAFF, y I APRIL. Véase, por ejemplo, Watts & DeBenedette, 1999, Curr. j Opin. Immunol. 11:286-93. : A menos que se especifique en la presente como i "longitud completa", la referencia en la presente a un polipéptido inmuno co-estimulante abarca el polipéptido de longitud completa asi como fragmentos o porciones del mismos que exhiben función inmuno co-estimulante, 1 incluyendo, pero no limitado a aquellos fragmentos y ! porciones específicamente identificados posteriormente. Por , consiguiente, por ejemplo, la referencia a un polipéptido ¡ 4-1BBL connota un polipéptido que comprende un fragmento o porción de 4-1BBL de longitud completa que exhibe función , I inmuno co-estimulante, tal como el dominio extracelular de | i 4-1BB.L, la. proteína 4-1BBL de longitud, completa. En una i i modalidad, el polipéptido inmuno co-estimulante no ; comprende el dominio de transmembrana de una molécula : inmuno co-estimulante. En una modalidad, el polipéptido ¦ inmuno co-estimulante comprende el dominio extracelular de una molécula inmuno co-estimulante, o un fragmento de enlace de receptor de la misma. Los ejemplos de secuencias de aminoácido representativas y los polipéptidos co-estimulantes inmunes codificados incluyen aquellos mostrados en los Accesos de Banco de Genes Nos. AB029155 (LIGHT murina) ; NM_172014 (variante 2 de transcripto de ARNm TNFSF14 humano) ; NM_003807 (variante 1 de transcripto de ARNm TNFSF14 humano) ; NM_005191 (ARNm CD80 de ratón) ; NM_009855 (ARNm CD80 de ratón); NM_214087 (ARNm CD80 de Sus scrofa) ; NM_009404 (ARNm Tnfsf9 murino) ; NM_003811 (ARNm TNFSF9 humano); NM _181384 (ARNm Tnfsf9 de Rattus norvegicus); BAA88559 (proteina LIGHT murina) ; Q9QYH9 (proteina soluble y proteina de enlace de membrana TNFSF14 murina); AAH18058 (proteina TNFSF14 humana) ; NP_005182 (proteina CD80 humana) ; NP_033985 (proteina CD80 murina) ; NP_037058 (proteina CD80 de Rattus norvegicus) ; NP_003802 (proteina TNFSF9 humana); NP_033430 (proteina TNFSF9 de ratón); NP_852049 (proteina TNFSF9 de Rattus norvegicus); N _012967 (ARNm ICAM-1 de Rattus norvegicus); X69711 (ARNm ICAM-1 humano) ; X52264 (ARNm ICAM-1 murino) ; X69819 (ARNm ICAM-3 humano); AF296283 (ARNm ICAM-4 murino); NM_021181 (ARNm SLAMF7 humano); NM_033438 (ARNm SLAMF9 humano); NM_029612 (ARNm SLAMF9 murino); NM 144539 (ARNm SLAMF7 murino); L13944 (gen CD18 murino) ; X53586 (ARNm de integrina aß ! humana); X68742 (ARNm de integrina a humana); J04145 (ARNm 1 de sub-unidad alfa-M de receptor de adherencia de i neutrófilo huamno) ; AJ246000 (ARNm de L-selectina de ¡ receptor de adhesión de leucocito humano) ; AY367061 (ARNm j de L-selectina humano, cds parciales) ; Y13636 (ARNm CD70 ! murino); NM_001252 (ARN TNFSF7 humano); BC000725 (ARNm ! I TNFSF7 humano (clon ADNc MGC:1597 I AGE : 3506629 ) , cds ¡ completas); X69397 (gen CD24 humano y CDS completa); j NM_013230 (ARNm CD24 humano) ; NM_012752 (ARNm CD24 de j Rattus norvegicus); Y00137 (gen de factor de necrosis de ¡ tumor-beta (linfotoxina) murino) ; X02911 (gen de factor de ¡ necrosis de tumor-beta (linfotoxina) humano) ; D00102 (ARNm , de linfotoxina humano, CDS completas) ; X01393 (ARNm. de linfotoxina humano) ; y A06316 (ARNm de linfotoxina humano) . 1 Otras secuencias de ácido nucleico que codifican los mismos u otros polipéptidos co-estimulantes inmunes y/o secuencias · ! de aminoácido de polpéptidos co-estimulantes se pueden encontrar, por ejemplo, buscando la base de datos de Banco de Genes públicamente disponible (disponible, por ejemplo, en ncbi.nlm.nih.gov en la Web Mundial). 1 Las interacciones entre CD28 y CD80/CD86 parecen | jugar un papel significativo en la transducción de la señal j 2. Véase, por ejemplo, Harding & Allison, J. Exp. Med. ' 1993, 177: 1791-96; Ramarathinam et al., J. Exp. Med. 1994, I 179: 1205-14; Townsend & Allison, Science 1993, 259: 368-70; Gause et al., J. Immunol. 1997, 159: 1055-58. CD80 usualmente no se expresa en las células B en reposo y se expresa a bajos niveles en los monocitos de sangre periférica y DC; sin embargo, ambas células asi como macrófagos y otras APCs sobre-regulan su expresión de CD80 después de la activación. Véase, por ejemplo, Lenschow et al., Ann. Rev. Immunol. 1996, 14: 233-58; Freeman et al., J. Immunol 1989, 143:2714-22. En contraste, CD86 es constitutivamente expresada en monocidos de sangre periférica y DC y más rápidamente se sobre-regulan en células B. Véase, por ejemplo, Lenschow et al., supra, Inaba et al., J. Exp. Med. 1994, 180: 1849-60. La interacción del TCR con complejo de MHC/péptido en APCs permite el acoplamiento simultáneo de moléculas CD80/86 con CD28 y conduce a la fosforilación de tirosina del lipido cinasa fosfatidilinositol 3-cinasa, el cual a su vez inicia una serie de eventos intracelulares complejos que resultan en la inducción de la expresión del gen IL-2, proliferación celular, y diferenciación en la función efectora. Véase, por ejemplo, Slavik et al., Immunol. Res. 1999, 19: 1-24; Azuma et al., Nature 1993/ 366: 76-79; Allison & Krummel, Science 1995, 270: 932-33. La señal 2 puede aumentar adicionalmente una respuesta inmune productiva previniendo la muerte celular a través de la regulación de los genes anti-apoptóticos, tal como Bcl-xL. Véase, por .ejemplo, Radvanyi et al., J. Immunol. 1996, 156: 1788-98; Boise et: al., Immunity 1995, 3: 87- 98; Boise & Thompson, Science 1996, 274: 67-68. Después de las etapas iniciales de activación inmune, un número de pares de receptor-ligando adicionales son sobre-regulados en la superficie de las células T y APCs. Estos pares de receptor/ligando "secundarios", tal como 4-1BBL/4-1BB, juegan papeles importantes en el mantenimiento de eventos de activación post-inicial , homeostasis inmune, y generación de memoria inmunológica . Véase, por ejemplo, Yu et al., Nat. Immunol . 2004, 5: 141-49; Armitage et al., Nature 1992, 357: 80-82; Zhai et al., J. Clin. Invest. 1998, 102: 1142-51; Bourgeois et al. Science 2002, 297: 2060-63; Kikuchi et al., Nat. Med. 2000, 6: 1154-59.

I. 4-1BBL En una modalidad particular de la invención, el polipéptido inmuno co-estimulante es un polipéptido de 4-1BBL. 4-1BBL (también conocida como 4-BB-L, ligando 4-BB, TNFSF9, ligando ILA) es una proteina tipo II expresada en células B activadas, macrófagos, y DC dos a tres dias después de la activación. Véase, por ejemplo, Alderson et al. Eur. J. Immunol. 1994, 24: 2219-27; Goodwin et al., Eur. J. Immunol. 1993, 23: 2631-41; Pollok et al., Eur. J.

Immunol. 1994, 24: 367-74; DeBenedette et al., J. Immunol. 1997, 158: 551-59. Su receptor, 4-1BB (CD137), es expresado en la superficie de células T CD4+ y CD8+ activadas, en células asesinas naturales, monocitos, y DC en reposo. Véase, por ejemplo, Pollock, supra; Wilcox et al., J. Immunol. 2002, 169: 4230-36; Futagawa et al., Int. Immunol . 2002, 14: 275-86; Pollok et al., J. Immunol. 1993, 150: 771-81. Las interacciones de 4-1BB/4-1BBL también transducen la señal 2 a células T CD8+ de una manera independiente de CD28 y las estimulan para producir citocinas, expandir, y adquirir funciones efectoras. Véase, por ejemplo, Cannons et al., J. Immunol. 2001, 167: 1313-24; Hurtado et al., J. Immunol. 1995, 155: 3360-67. Kim & Broxmeyer, J. Hematother. Stem Cell Res. 2001, 10: 441-49; Saoulli et al., J. Exp. Med. 1998, 187: 1849-62; Shuford et al., J. Exp. Med. 1997, 186:47-55; Tan et al., J. Immunol. 1999, 163: 4859-68; Vinay & Kwon, Semin. Immunol. 1998, 10: 481-89. La interacción de 4-1BB/4-1BBL también es importante para la activación de monocitos y DC, sus síntesis de citocinas, y comunicación con células NK. Véase, por ejemplo, Futagawa et al., supra; Wilcox et al., J Clin. Invest 2002, 109: 651-9. De manera similar, además de su papel en la promoción de la expansión de células T específicas de antígeno a través de la sobre-regulación de ciclinas D2 y E, y la bajo-regulación del inhibidor de I cinasa dependiente de ciclina p27kipl, la señalización de j 4-lBB juega un papel en la supervivencia de la célula T, ya ' que previene la muerte celular inducida por activación vía ! i la sobre-regulación de Bcl-xL y Bcl-2 anti-apoptótica y el ¡ establecimiento de memoria inmunológica de largo plazo. ¡ Véase, por ejemplo, Takahashi et al., J. Immunol. 1999, 162: 5037-40; Hurtado et al., J. Immunol. 1997, 158: 2600- ! 09; Kim et al., Eur. J. Immunol. 1998, 28: 881-90. La | interacción de 4-1BB/4-1BBL también se ha mostrado que promueve selectivamente las citocinas tipo 1, tales como; IL-2, IFN-?, y TNF-a, sugiriendo que la 4-lBB puede ser una ; molécula co-estimulante especifica para células T efectoras ' tipo 1, las cuales juegan un papel en la erradicación de, tumor. ! i Recientemente se ha mostrado que las células Treg constitutivamente expresan el receptor de 4-lBB y que la¡ transducción de señal a través del receptor de 4-lBB inhibe1 la función supresora de estas células. Véase, por ejemplo,; Choi et al., supra; Morris et: al., supra, y los ejemplos, posteriores. Esto es importante debido a que las células1 Treg juegan un papel significativo en la evasión de tumor del sistema inmune. Diversos estudios clínicos demuestran; que existe una correlación directa entre el número dé células Treg Y la progresión del tumor. Curiel et al., Nat.' ! Med. 2004, 10: 942-49. En efecto, la erradicación de las ! células Tr g en modelos animales ha resultado en la : erradicación de tumores grandes, proporcionando evidencia : I directa de su papel dominante en la progresión del tumor. Yu et al, J. Exp. Med. 2005, 201: 779-91. De manera similar, los agentes infecciosos, tal como VIH, pueden usar ¡ células T para la evasión inmune. Aunque no se desee que se una por teoría, se cree que el uso de 4-1BBL como un polipéptido inmuno co- j estimulante de conformidad con la invención puede activar ' el receptor consanguíneo en células T, resultando en 1 diversos efectos inmuno-estimulantes importantes. Un efecto ¡ puede ser la transducción de la señal 2 a células T CD8 de una manera independiente de CD28, la cual estimula las , células T para producir citocinas, expandir, y adquirir ! funciones efectoras. Otro efecto de la interacción de 4- : 1BB/4-11BBL puede ser la activación de monocitos y DC la cual resulta en la síntesis y liberación de citocinas. ¡ Todavía otro efecto de la señalización de 4-1BB puede ser ¡ la promoción de supervivencia de célula T y establecimiento de memoria inmunológica de largo plazo previniendo la ' muerte celular inducida por activación (AICD) . Aún otro efecto de la interacción de 4-1BB/4-1BBL puede ser la producción selectiva de citocinas tipo 1, tales como IL-2, | IL- 12, IFN-?, y TNF-a de células T, DC y macrofagos, las cuales actúan en las células T efectoras tipo 1 importantes para la erradicación del tumor. Además, como se explicó anteriormente, la interacción de 4-1BB/4-1BBL puede inhibir la función supresora de células Treg. Por consiguiente, por ejemplo, un conjugado de 4-lBBL-antigeno puede enlazar específicamente a DC que expresa el receptor 4-1BB, facilitar la presentación de antígeno, activar la DC para la generación de una respuesta de célula T primaria, directamente actuar en células T activadas (incluyendo células Teff) y células NK para amplificar su respuesta contra el antígeno, e inhibir la función supresora de células Treg. 4-lBBL contiene 254 aminoácidos (26624 Da) . Ver Alderson et al. Eur J Immunol. 1994 Sept; 24 ( 9 ): 2219-27. La secuencia de aminoácidos completa de 4-lBBL humano se puede encontrar bajo el acceso no. P41273 en la base de datos Swiss-Prot. 4-lBBL es una glicoproteína de tipo II con 1-28 residuos que forman un dominio citoplásmico potencial, 29-49 residuos que forman un dominio de transmembrana precitado único, 50-254 residuos que forman un dominio extracelular potencial, y 35-41 residuos que representan un estiramiento de poli-Leu. La secuencia de nucleótido en humanos que codifican el 4-lBBL se puede encontrar en acceso de Banco de Genes no. NM_003811. Como se describió anteriormente, 4-lBBL se expresa por células que presentan antígeno activado incluyendo células B activadas, macrófagos, y DC, los días 2-3 siguiendo la activación. 4-1BB, el cual es el receptor para 4-lBBL, se expresa en la superficie de las células CD4+ y CDS+ activadas, en células asesinas naturales, monocitos, y DC resultante. Los 50-254 residuos de 4-lBBL o fragmentos de los mismos que pueden unirse a su receptor 4-1BB consanguíneo, se pueden enlazar o expresar como una fusión con un miembro de par de enlace para uso de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, las Figuras 3A y B muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de una proteína de fusión de 4-lBBL CSA-murina (SEC ID NOs 5 y 6) . Las Figuras 4A y B muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de una proteína de fusión que comprende el dominio extracelular de 4-lBBL humano y estreptavidina de núcleo (SEC ID NOs 7 y 8). 2. CD80 y CD86 CD80 (también conocido como B7.1, CD28LG, LAB7 ) y CD86 (también conocido como B7.2, CD28LG2, LAB72) son polipéptidos co-estimulantes ejemplares, ambos de los cuales se unen al co-receptor CD28/CTLA4 expresado por células T. CD80 contiene 288 aminoácido (33048 Da) . Véase Freeman et al. J. Immunol. 143 (8), 2714-2722 (1989). La secuencia de aminoácidos completa de CD80 humano se puede encontrar bajo el acceso no. P33681 en la base de datos Swiss-Prot. CD80 es una glicoproteína de tipo I con 1-34 residuos que forman una señal de secreción, 35-242 residuos que forman un dominio extracelular potencial, 243-263 residuos que forman un dominio de transmembrana potencial, y 264-288 residuos que forman un dominio citoplásmico potencial. Por consiguiente, la molécula CD80 madura sin su secuencia de señal de secreción representa 35-288 aminoácidos. La secuencia de nucleótidos en humanos que codifican CD80 se puede encontrar en acceso de Banco de Genes no. NM_005191. Los 35-242 residuos de CD80 o fragmentos de éstos que se pueden unir a su receptor CD28 consanguíneo se pueden enlazar o expresar como una proteína de fusión con un miembro de par de enlace para uso de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, las Figuras 2A y 2B describen los nucleótidos (SEC ID NO: 3) y secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 4) de una proteína de fusión que comprende el dominio extracelular de humano CD80 (B7.1) y estreptavidina del núcleo. CD86 (B7.2) contiene 329 aminoácidos (37696 Da). Véase Freeman et al. Science 262 (5135), 909-911 (1993). La secuencia de aminoácidos completa de CD86 humano se puede encontrar bajo el acceso no. P42081 en la base de datos Swiss-Prot. CD86 es una glicoproteína de tipo I con i residuos 1-23 que forman una señal de secreción, 24-247 residuos que forman un dominio extracelular potencial, 248-268 residuos que forman un dominio de · transmembrana potencial, y 269-329 residuos que forman un 1 dominio citoplásmico potencial. Por consiguiente, la molécula de CD86 madura sin su secuencia de señal ¡ i de secreción representa 24-329 aminoácidos. La ! i secuencia de nucleótidos en humanos que codifican CD86 se , , I pueden encontrar en el acceso del Banco de Genes no. ! NM_175862. ' Los 24-247 residuos de CD86 o fragmentos de éstos se pueden unir a su receptor CD28 consanguíneo, se pueden i enlazar o expresar como una fusión con un elemento de par ' de enlace para uso de acuerdo con la presente invención. ' i ! Por ejemplo, las Figuras 5A y 5B describen el nucleótido ¡ (SEC ID NO: 9) y secuencias de aminoácidos (SEC ID NO: 10) de' una proteína de fusión que comprende el dominio ; extracelular de CD86 humano (b7.2) y estreptavidina de j núcleo. ] CD86 usualmente no se expresa en células B' restantes y se expresa a bajos niveles en monocitos de la I sangre periféricos (PBC) y DC . Su expresión, sin embargo, ! se sobrerregula en células B y otro APC tal como macrofagos1 y DC seguido de activación. En contraste, CD86 se expresa constitutivamente sobre PBC y DC y más rápidamente sobre-; regulado en células B. La interacción del receptor de célula T (TCR) con el complejo MHC/péptido en APC permite el acoplamiento simultáneo de CD80/86 con CD28 en la célula T, lo cual conduce a fosforilación de tirosina del lipido cinasa fosfotidilinositol 3-cinasa, la cual a su vez inicia una serie de eventos ext'racelulares que resulta en la inducción de expresión del gen IL-2, proliferación celular, y diferenciación en función de efector. La señal 2 puede aumentar además una respuesta inmune productiva previniendo muerte celular a través de la regulación de genes antiapoptótico, tales como Bcl-xL. 3. LIGHT Seguido de las etapas iniciales de activación inmune, pares de receptor/ligando "secundarios" tales como 4-1BBL/4-1BB (descritos anteriormente) y LIGHT/HVEM llega a ser superregulado en la superficie de células T y APC. Estos pares de receptor/ligando se involucran en el mantenimiento de eventos de activación post inicial, homeostasis inmune, y generación de memoria inmunológica . El polipéptido LIGHT (también conocido como TNFS14, HVEM-L, LTg, TR2) es un miembro de superfamilia TNF el cual es homólogo a linfotoxina. Véase Mauri et al. Immunity 8 (1), 21-30 (1998). La secuencia de aminoácidos completa de LIGHT humana se puede encontrar bajo el acceso no. 043557 en la base de datos Swiss-Prot. LIGHT contiene 240 aminoácidos (26351 Da) y es una glicoproteina de tipo II con 1-37 residuos que forman un dominio citoplásmico potencial, 38-58 residuos que forman un dominio de transmembrana predicho único, y 59-240 residuos que forman un dominio extracelular potencial. Un sitio de escisión involucra 82-83 residuos. La secuencia de nucleótidos en humanos que codifican LIGHT se puede encontrar en el acceso del Banco de Genes no. NM_172014. Los 59-240 residuos de LIGHT o fragmentos de los mismos que pueden unirse a su receptor consanguíneo HVEM, LTßR o TR6, se puede enlazar o expresar como una fusión con un miembro de par de enlace para uso de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, las Figuras 1A y IB describen el nucleótido (SEC ID NO:l) y secuencias de aminoácidos (SEC ID NO:2) de una fusión que comprende estreptavidina de núcleo y el dominio extracelular de LIGHT murina. LIGHT se expresa principalmente en células T activadas, células NK, y células dendríticas inmaduras, y sirve para regular varios aspectos de respuestas inmunes. LIGHT es sintetizada como una proteína unida a membrana, pero su expresión de superficie celular es regulada por varios mecanismos postraduccionales . LIGHT es escindida de la superficie celular por metaloproteinasas de matriz dentro de minutos de su expresión y se acumula como una molécula soluble (isoforma 1; representa aproximadamente 83-240 residuos; (Swiss-Prot 043557-1) . El segmento citoplásmico de superficie celular representa la isoforma 2 (Swiss-Prot 043557-2). Adicionalmente , varios tipos celulares almacenan LIGHT en vesículas y las excretan en la activación por varios estímulos fisiológicos. Aunque el papel de la forma soluble de LIGHT no está bien caracterizado, puede servir como un circuito de retroalimentación negativo para inhibir la función de la forma unida a la membrana compitiendo para HVEM y LTßR. LIGHT interactúa con tres diferentes receptores: - (1) mediador de entrada de virus herpes (HVEM) en células T, (2) LTpR el cual es expresado principalmente en células epiteliales y estromales, y (3) el receptor 3 señuelo soluble en varias células. Estas interacciones dotan a LIGHT con diferentes funciones. La interacción con LTpR en células estromales está asociada con la producción de varias citocinas/quimiocinas, organogénesis del nodulo linfático (LN) , y restauración de estructuras linfoides secundarias. Por otra parte, la interacción de LIGHT con el receptor de HVEM en linfocitos resulta en la activación y producción de citocinas, dominada por IFN-? y GM-CSF. En este contexto, el eje LIGHT/HVEM parece suministrar señales co-estimulantes asociadas con la activación de respuestas tipo thl las cuales juegan papeles críticos en la erradicación de tumor. LIGHT juega un papel en la organogénesis linfoide y en la generación de respuestas tipo Thl. Véase, por ejemplo, Yang et al., 2002, J. Biol. Regul. Homeost. Agents, 16:206-10; Schneider et al., 2004, Immunol. Rev. , 202:49-66. El efecto de LIGHT se ha mostrado en diferentes modelos de tumor tanto in vitro como in vivo. Las células leucémicas linfocíticas crónicas transducidas por amplicon de virus de herpes simple que expresa LIGHT se ha reportado que mejoran la proliferación de célula T en reacciones linfocíticas mezcladas. La sobre-expresión de LIGHT en células de cáncer de mama humanas MDA-MB-231 se ha mostrado que suprime el crecimiento de tumor. La transfección de LIGHT en diferentes líneas celulares de cáncer estimula la expresión en estas células. La presencia de ICAM-1 se cree que es benéfica ya que habilita la señalización efectiva para producir la actividad anti-tumor en células de tumor. Otra función importante de LIGHT, además de la activación de célula T, es su capacidad de transducir las señales a través de LTßR, el cual juega un 4 papel importante en el desarrollo de estructuras linfoides secundarias mediadas a través de la inducción de expresión de quimiocina asi como moléculas de adhesión en células estromales. La interacción de LIGHT con LT R en células estromales regula la expresión de CCL21, que controla el albergue de células T naive a tejidos linfoides . Una ventaja de las modalidades de la invención donde el polipéptido inmuno co-estimulante es LIGHT es la capacidad de LIGHT para estimular la organogénesis linfoide y soportar la generación de respuesta tipo Thl. Otra ventaja es la capacidad de LIGHT para estimular las respuestas inmunes contra tumores y activar el estroma de tumor para aumentar adicionalmente estas respuestas. El estroma sirve como una barrera física para prevenir la infiltración de linfocitos en el sitio de tumor. El estroma también inhibe la activación de linfocitos dentro del microambiente del tumor. Esto puede ser debido a la carencia de señales co-estimulantes necesarias para la activación de célula T y/o la presencia de varios mediadores solubles inmunoinhibidores , tal como TGF-ß e IL-10, que son sintetizados y secretados tanto por células de tumor como fibroblastos estromales. El estroma promueve la ignorancia inmunológica confinando células de tumor al sitio de tumor, previniéndolas de negociar con los nodos linfáticos regionales. Las células estromales de tumor también expresan | varios receptores inmunológicos , tal como LT R, que se i pueden aprovechar para el mejoramiento de inmunidad anti- ; tumor de conformidad con la presente invención. j 4. OX40L OX40L se expresa por células dendriticas y otra I APC y enlaza a OX40 al cual está presente en células T : activadas. OX40L contiene 183 aminoácidos (21950 Da). Véase, Miura et al. Mol. Cell. Biol. 11:1313-1325 (1991). | La secuencia de aminoácido completa de 0X40L se puede ' encontrar bajo acceso no. P23510 en la base de datos de ¡ i Í Swiss-Prot. OX40L es una glicoproteina tipo II con un ; dominio citoplásmico en los residuos 1-23, un dominio de i transmembrana en los residuos 24-50 y un dominio extracelular en los residuos 51-183. La secuencia de j nucleótido de 0X40L es 3510 bp, con la secuencia de j codificación siendo 157-708 (véase acceso de Banco de ; Genes no. NM_003326.2) . Los residuos 51-183, o j fragmentos de los mismos de OX40L que pueden enlazar a su ' receptor consanguíneo 0X40, se pueden enlazar o expresar como una fusión C-terminal a un miembro de par ¡ de enlace para uso de conformidad con la presente invención .

. CD40L CD40L es expresada por células T activadas y también existe como una forma soluble extracelular la cual se deriva de la forma de membrana por procesamiento proteolitico. CD40L (a.k.a. TNFSF5) contiene 261 aminoácidos (29350 Da). Véase, Villinger et al. Immunogenetics 53:315-328 (2001). La secuencia de aminoácido completa de CD40L se puede encontrar bajo el acceso no. Q9BDN3. CD40L es una glicoproteina tipo II con un dominio citoplásmico en los residuos 1-22, un dominio de transmembrana en los residuos 23-43 y un dominio extracelular en los residuos 44-261. La secuencia de nucleótido de CD40L es 1834 bp, con la secuencia de codificación siendo 73-858 (véase acceso de Banco de Genes no. NM_000074). Los residuos 44-261, o fragmentos de los mismos de CD40L que pueden enlazar a su receptor consanguíneo CD40, se pueden enlazar o expresar como una fusión N-terminal a un miembro del par de enlace para uso de conformidad con la presente invención. 6. PD-L1 PD-L1 se expresa en células B y T activadas, células dendríticas, querátinocitos y monocitos. PD-L1 (a.k.a. B7-H; B7H1; PDL1; PDCD1L1) contiene 290 aminoácidos (33275 Da). Véase Dong et al. Nat . Med. 5: 1365-1369 (1999). La secuencia de aminoácido completa de PD-L1 se puede encontrar bajo el acceso no. Q9NZQ7 en la base de datos de Swiss-Prot. PD-L1 contiene 290 aminoácidos de los cuales 18 aminoácidos en el N término representan la secuencia de señal. El dominio extracelular se ubica en los aminoácidos 19-238, un domino de transmembrana se ubica en los residuos 239-259 y un dominio citoplásmico se ubica en los residuos 260-290. La secuencia de nucleótido de PD-Ll (1553 bp) está disponible en las bases de datos públicas (véase acceso de Banco de Genes no. NM_014143) (la secuencia de codificación es 53-925) . Las isoformas de PD-Ll existen por vía de empalme alternativo. El dominio extracelular o fragmentos del mismo de PD-Ll que pueden enlazar a su receptor consanguíneo PDCD1, se puede enlazar o expresar como una fusión N-terminal a un miembro de par de enlace para el uso de conformidad con la presente invención. 7. GL50 La isoforma 1 GL50 es ampliamente expresada (cerebro, corazón, riñon, pulmón, páncreas, placenta, músculo esquelético, médula ósea, colon, ovarios, próstatas, testículos, nodulos linfáticos, leucocitos, bazo, glándula timo y amígdalas); la isoforma 2 GL50 (swissprot 075144) se expresa en nodulos linfáticos, leucocitos y bazo y en monocitos activados y células dendriticas. GL50 (a.k.a. B7-H2; B7H2; B7RP-1; B7RP1; ICOS-L; ICOSLG; KIAA0653; y LICOS) contiene 290 aminoácidos (33275 Da). Véase Wang et al. Blood 96:2803-2813 (2000). La secuencia de aminoácido de GL50 se puede encontrar bajo acceso no. 075144 en la base de datos Swiss-Prot. GL50 contiene 302 aminoácidos de los cuales 18 aminoácidos en el N término representan la secuencia de señal. El dominio extracelular se ubica en los aminoácidos 19-256, un dominio de transmembrana se ubica en los residuos 257-277 y un dominio citoplásraico se ubica en los residuos 278-392. La secuencia de nucleótido de GL50 (3239 bp) está disponible en las bases de datos públicas (véase acceso de Banco de Genes no. NM_015259) (región de codificación que representa 135-1043). Las isoformas de GL50 existen por via de empalme: alternativo. El dominio extracelular o fragmentos del mismo; de GL50 que pueden enlazar a su receptor consanguíneo ICOS, j I se puede enlazar o expresar como una fusión. N-terminal a un miembro de par de enlace para el uso de conformidad con la presente invención. i La tabla 1 resume varias moléculas co-. I estimulantes ejemplares y sus receptores e incluye, modalidades de conjugados de par de ligando de co-¡ receptor.

Tabla 1 Nombre de Receptor Expresión de receptor constructo y orientación CD80-CSA CD28 Constitutiva en casi todas las células T CD4 y aproximadamente 50% de células T CD8 GL50-CSA ICOS Detectable en células T en reposo Sobre-regulada en células T CD4+ y T CD8+ y células NK PD-L1-CSA PD-1 Inducible en células T CD4+ y CD8+, células B, y monocitos Bajos niveles en células T NK CSA-CD40L CD40 Constitutiva en células B, monocitos, DC, células endoteliales y epiteliales CSA-4 -1BBL CD137 Inducible en células T activadas (pico 48b, decline 96h) asi como células NK tratadas con citocina Constitutiva en subconjuntos de DC (bajo) monocitos humanos, DC folicular, células T reguladoras CD4+ CD25+ CSA-OX40L 0X40 Inducible en células T CD4 (preferiblemente) y CD8 (respuesta de antigeno fuerte) activadas (pico 48h, decline 96h) CSA-LIGHT HVEM Constitutiva en células T en reposo, monocitos, y DC inmadura Bajo-regulada en activación de célula T y maduración de DC Otros polipéptidos co-estimulantes inmunes se pueden usar de conformidad con la invención. Por ejemplo US 2003/0219419 (los contenidos completos de la cual se incorporan en la presente para referencia en su totalidad) describe las proteínas de fusión IL-2-CSA, y proteínas de fusión CSA-CD40L que son útiles en la presente invención. En resumen, los polipéptidos co-estimulantes ejemplares útiles de conformidad con la presente invención incluyen los siguientes.

Tabla 2: MIEMBROS DE FAMILIA DE B7 y CD28 * es un miembro de TNF i i Tabla 3: MIEMBROS DE FAMILIA DE TNF ** estos están relacionados con la célula B Tabla 4A: Referencias para secuencias de nucleótido y/o aminoácido de Miembros de Familia de B7 LIGANDO REFERENCIA (Humano) PD-L2 Tseng et al., J. Exp. Med. 193: 839-846 (2001) . Latchman et al., Nat. Imunol. 2: 261-268 (2001) . B7-H3 Steinberger et al., Submitted (SEP-2003) to EMBL/GenBank/DDBJ databases. Mingyi et al., J. Immunol 168: 6294-6297 (2002) . B7-H4 Zang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A.

(B7x; B7S1) 100: 10388-92 (2003) . Sica et al., Submitted (APR-2003) to EMBL/GenBank/DDBJ databases.

Tabla 4B: Referencias para secuencias de nucleótido y/o aminoácido de Miembros de Familia de TNF LIGANDO REFERENCIA (Humano) 0X40L Baum et al., Circ. Shock 44: 30-34 (1994). Miura et al., Mol. Cell. Biol. 11: 1313-1325 (1991) . Godfrey et al., J. Exp. Med. 180: 757-762 (1994) . 4-1BBL Alderson et al., Eur . J. Immunol. 24: 2219- 2227 (1994).

LIGANDO REFERENCIA (Humano) CD40L Graf et al., Eur. J. Immunol 22: 3191-3194 (1992) . Hollenbaugh et al., EMBO J. 11: 4313-4321 (1992) . CD27L Goodwin et al., Cell 73: 447-456 (1993). (CD70) CD30L Smith et al., Cell 73: 1349-1360 (1993). LIGHT Mauri et al., Immunity 8: 21-30 (1998). GITRL Gurney et al., Curr. Biol. 9: 215-218 (1999).

BLyS Moore et al., Science 285: 260-263 (1999). APRIL Hahne et al., J. Exp. Med. 188: 1185-1190 (1998) .

Agentes Antigenos e Infecciosos j Los métodos y composiciones de la invención son ' útiles para generar o mejorar una respuesta inmune contra cualquier antigeno o agente infeccioso, incluyendo TAAs, ¡ antigenos asociados con un agente infeccioso, y un agente; infeccioso mismo. De conformidad con la invención, un' antígeno asociado con el tumor o agente infeccioso de,' objetivo (o el agente infeccioso mismo) se presenta a: células inmunes, generando o mejorando una respuesta inmune . : I . TAAs En una modalidad, el antígeno es TAA, y la; invención proporciona métodos de inmunoterapia de cáncer ¡ efectivos para generar o mejorar una respuesta inmune del paciente contra un tumor. De conformidad con esta j modalidad, la invención proporciona métodos para reducir el I tamaño de tumor y métodos para inhibir el crecimiento de células de tumor. Las células de tumor representativas contra las ! I cuales esta invención es útil incluyen, sin limitación, carcinomas, las cuales se pueden derivar de cualquiera de los diversos órganos del cuerpo incluyendo pulmón, hígado, ' mama, vejiga, estómago, colon, páncreas, piel y similares. ¡ Los carcinomas pueden incluir adenocarcinoma , los cuales se \ desarrollan en un órgano o glándula, y carcinoma de célula escamosa, los cuales se originan en el epitelio escamoso. ! Otros cánceres que se pueden tratar incluyen sarcomas, tal 1 como osteosarcoma o sarcoma osteogénico (huesos) , condrosarcoma (cartílago) , leyomiosarcoma (músculo liso) , ¡ rabdomiosarcoma (músculo esquelético) , sarcoma mesotelial o ! mesotelioma (revestimiento membranoso de cavidades del cuerpo), fibrosarcoma (tejido fibroso), angiosarcoma o ' i hemangioendotelioma (vasos sanguíneos), liposarcoma (tejido adiposo), glioma o astrocitoma (tejido conectivo ' neurogénico encontrado en el cerebro), mixosarcoma (tejido ! j cognitivo embriónico primitivo) , un tumor esenquimoso o i mesodérmico mezclado (tipos de tejido conectivo mezclado). ; Además los mielomas, leucemias, y linfomas también son susceptibles al tratamiento. Un número de TAAs asociados con los tipos de tumos específicos se han identificado. Estos incluyen transcriptasa inversa de tolomerasa humana (hTERT) , survivina, MAGE-1, MAGE-3, gonadotropina coriónica humana, antigeno carcinoembriónico, alfa fetoproteina, antígeno oncofetal pancreático, MUC-1, CA 125, CA 15-3, CA 19-9, CA 549, CA 195, antigenos específicos de próstata; antígeno de membrana específica de próstata, Her2/neu, gp-100, proteínas K-ras mutantes, p53 mutante, receptor de factor de crecimiento epidérmico truncado, proteína quimérica p210BCR-ABL; proteína E7 de virus de papiloma humano, y proteína EBNA3 de virus 'de Epstein-Barr . Cualquiera de estos antígenos, fragmentos antigénicos de los mismos, y mezclas de antígenos y/o fragmentos se pueden usar de conformidad con la invención para generar o mejorar una respuesta inmune anti-tumor. La tabla 5 lista TAAs ejemplares y enfermedades asociadas con tales TAAs.

Tabla 5 i i Antigeno En ermedades Antígenos de membrana Linfoma de leucemia de celular asociados con célula T en adulto (ATL) leucemia de célula T humana (HTLV-MA) Antigeno de superficie de Mayoría de leucemias agudas timocito JLl Antigeno asociado con Leucemia de célula T en retrovirus humano, asociado adulto con leucemia de célula T en adulto (ATLA) Antigenos de virus de Linfoma de Burkitt, Epstein-Barr (EPV) enfermedad de Hodgkin Cinasa de linfoma Linfoma de célula grande anaplásico (ALK) anaplásico CD30+ Proteínas de fusión (ALCL) (NPM/ALK y variantes) Antigeno de leucemia Leucemias linfoblásticas más linfoblástica aguda común agudas (CALLA) Inmunoglobulina Id; Enfermedades glicoproteinas Tipo II (por linfoproliferativas ejemplo, HM1.24; KW-2, KW- 4, KW-5, KW-12); Proteina de receptor laminima inmadura de antigeno oncofetal (OFA-iLRP) ; proteínas EBV (por ejemplo, LMP2A) Los TAAs humanos adicionales reconocidos por las células T se pueden encontrar en, por ejemplo, Novellino et i al. "A listing of human tumor antigens recognized by T ; cells: March 2004 update" Cáncer Immunology and : Immunotherapy, 54: 187-207 (2005) la cual se incorpora para ; referencia en la presente. Muchos TAAs de animal ' corresponden a correlaciones animales de estas ¡ enfermedades, y otras enfermedades de animales, son conocidos en la técnica y también se incluyen dentro del 1 alcance de la invención.

En una modalidad de la invención, el TAA se ¡ selecciona del grupo que consiste de transcriptasa inversa ; i de telomerasa humana (hTERT) y survivina como TAAs. hTERT ; se expresa en >85% de cánceres humanos, mientras que su ' expresión se restringe en tejidos normales. Véase, por' ejemplo, Vonderheide et al., Immunity 1999, 10: 673-79. De ¡ manera similar, la survivina, la cual se ha identificado I como un inhibidor de apoptosis, está ausente de tejidos' normales pero se expresa en la mayoría de tipos de tumor ; incluyendo pulmón, colon, páncreas, próstata y cáncer de; mama. Véase, por ejemplo, Ambrosini et al., Nat . Med. 1997, ; 3: 917-21. Debido a que estos TAAs se expresan en la1 mayoría de los tipos de cáncer y son raros o ausentes de : los tejidos normales, son antígenos atractivos para el. usoi en métodos de inmunoterapia de cáncer de acuerdo con laj presente invención. I En otra modalidad de la invención, el TAA se asocia con cáncer cervical. Aproximadamente 500, 000 mujeres en el mundo desarrollan cáncer cervical anualmente y es la segunda causa principal de muerte de cáncer en mujeres. El ! cáncer cervical se ha enlazado directamente a la infección viral genital por virus de papiloma humano (HPV) y es un problema de salud mundial. El HPV tipo 16 en particular se : encuentra en aproximadamente la mitad de cánceres > cervicales. Los HPV genitales tipos 16 y 18, y menos frecuentemente, tipos 31, 33, 35, 45, 51 y 56, también se j han implicado en la etiología de cánceres cervicales y otros anogenital.es. Los tipos de HPV encontrados en células ( de cáncer tienen actividad transformadora en estudios in 1 vivo y las proteínas transformadoras virales, E6 y E7 ¡ ! (también conocidas como proteínas "tempranas"), son consistentemente expresadas en líneas celulares de cáncer ¡ cervical y en cánceres asociados con HPV. Las E6 y E7 son conocidas por enlazar los supresores de tumor, p53 y retinoblastoma (Rb) , respectivamente. En la transformación maligna asociada con HPV, los genes tardíos (Ll y L2) y j i algunos genes tempranos (El y E2) son usualmente perdidos, dejando los E6 y E7 como las únicas estructuras de lectura j abierta frecuentemente encontradas en carcinomas. La ; expresión de E6 y E7 es probablemente superar la regulación ' i de proliferación celular normalmente mediada por proteínas ! como p53 y Rb, permitiendo el crecimiento no controlado y i i proporcionando el potencial de transformación maligna. Por consiguiente, de conformidad con una modalidad específica de la invención, el TAA es uno o más de E6 y E7. El uso de E6 y E7 de conformidad con la invención puede ofrecer diversas ventajas. Primero, E6 y E7 son consistentemente expresados en la mayoría de cánceres cérvicos. Segundo, mientras la mayoría de antígenos de tumor son derivados de las proteínas normales o auto-proteína matada, los E6 y E7 son proteínas virales completamente extrañas, y pueden albergar péptridos o epitopes más antigénicos que una proteína mutante. Tercero, E6 y E7 juegan un papel importante en la inducción y mantenimiento del fenotipo maligno, y sin E6 y E7 funcionales, estas células podrían cesar de ser tumorigénicos . Las secuencias de nucleótido y aminoácido de las proteínas E6 y E7 de diferentes especies (por ejemplo, humano, bovino) y para diferentes tipos de virus de papiloma (por ejemplo, HPV 16 y 18) son conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, la base de datos de secuencia de HPV en http : //www . stdgen . lanl . gov/stdgen/vims/hpv/index . html . Las secuencias de aminoácido de HPV16 E6, una variante de HPV16 E6, y E7 se describen en las figuras 6A (SEC ID NO: 11), 6B (SEC ID NO: 12) y 6C (SEC ID NO: 13), respectivamente. 2. Agentes Infecciosos Los agentes infecciosos representativos contra los cuales la invención es útil incluyen, sin limitación, cualquier virus, bacterias, hongos o protozoarios . La tabla 6 lista los ejemplos de agentes infecciosos.

TABLA 6 AGENTE GENERO ENFERMEDAD ETIOLOGICO ASOCIADA BACTERIANO Mycobacterium Tuberculosis tuberculosis Bacillus Antrax anthracis Staphylococcus Sepsis aureus VIRAL Adenoviridae Mastadenovirus hepatitis canina infecciosa arenaviridae Arenavirus Coriomeningitis linfocítica Caliciviridae Norovirus Infección por virus Norwalk Coronaviridae Coronavirus Síndrome Respiratorio Agudo Severo Torovirus Filoviridae Marburgvirus Fiebres hemorrágicas virales Ebolavirus Fiebres hemorrágicas virales Flaviviridae Flavivirus Encefalitis del Nilo Occidental Hepacivurs Infección por virus de Hepatitis C Pestivirus Diarrea por Virus Bovino, Peste porcina clásica Hepadnaviridae Orthohepadnavirus Hepatitis AGENTE GENERO ENFERMEDAD ETIOLOGICO ASOCIADA VIRAL Herpesviridae Simplexvirus Herpes labial, herpes genital, mamilitis bovina Varicellovirus varicela, zona, aborto en caballos , encefalitis en ganado vacuno Cytomegalovirus mononucleosis infecciosa Mardivirus enfermedad de Marek Orthomyxoviridae Influenzavirus A Influenza Influenzavirus B Influenza Papillomaviridae Papillomavirus Papiloma cutáneo, cáncer de piel, cáncer cervical Picornaviridae Enterovirus Polio Rhinovirus Resfriado común Aphthovirus Fiebre aftosa Hepa tovirus Hepatitis Poxviridae Orthopoxvirus Viruela bovina, virus Vaccinia, Viruela Reoviridae Rotaviruses Diarrea Orbivirus Enfermedad de lengua azul Retroviridae Gammaretrovirus Leucemia felina Del taretrovirus Leucemia bovina Lentivirus Inmunodeficieñe ia humana, FIV, y SIV Rhabdoviridae Lyssavirus Rabia Ephemerovirus Fiebre efímera bovina Togaviridae Alphavirus Encefalitis equina Oriental y Occidental PARASITICO Plasmodium Malaria Leíshmania Leishmaniasis FUNGICO Aspergillis Candida Coccidia Cryptococci Geotricha Histoplasma Microsporidia Pneumocystis La influenza humana y aviar, VIH, hepatitis C, , tuberculosis, virus del nilo occidental, herpes por criptococosis (meningitis), clamidia, y ántrax son' representativos de agentes infecciosos. Cualquier antigeno ¡ asociado con el agente infeccioso se puede usar de ! conformidad con la invención. De conformidad con una modalidad, el agente infeccioso por mismo se usa en un conjugado de acuerdo con ; la invención. De conformidad con esta modalidad, se usa un , i conjugado que comprende el agente infeccioso, tal como un ; i virus, y un miembro de par de enlace. Cualquier agente i infeccioso se puede usar, tal como un virus, incluyendo un ' i virus de influenza humana o aviar o VIH, o cualquier otro virus. El agente infeccioso puede ser modificado o atenuado para reducir o eliminar su inefectividad. ¡ Para el propósito de ilustración solamente, este aspecto de la invención se describe con más detalle con ¡ referencia a influenza. La influenza es una enfermedad i contagiosa causada por el virus de influenza, y afecta el 1 tracto respiratorio, frecuentemente resultando en síntomas en la nariz, garganta y pulmones, así como fiebre, dolor de 1 cabeza, fatiga y cólico abdominal. También puede conducir a ¦ complicaciones tales como neumonía, bronquitis, o sinusitis i i e infecciones del oído o condiciones crónicas exacerbadas. ¡ I Los virus de influenza se clasifican como tipo A, B o C.

Las cepas que pertenecen a los tipos A y B circulan en la población y están asociadas con la mayoría de los casos de influenza humana. La influenza tipo A causa la mayoría de problemas de salud pública aplastantes en humanos. Los virus de influenza tipo A son clasificados en sub-tipos dependiendo de la composición de dos de sus proteínas; hemaglutinina (H) , una proteína que facilita el enlace y entrada del virus en la célula objetivo, y neuraminidasa (N) , una proteína involucrada en la liberación de partículas de virus recientemente formadas de células infectadas y expandiéndolas a través del cuerpo. Quince subtipos de hemaglutinina (H1-H15) y 9 subtipos de neuraminidasa (N1-N9) se han identificado. El gran brote de influenza en humanos se ha causado por tres sub-tipos de hemaglutinina (Hl, H2 y H3) y dos sub-tipos de neuraminidasa (NI y N2). Por ejemplo, la hemaglutinina del virus de influenza de 1918 fue Hl, su neuraminidasa fue NI, de este modo se designó como un sub-tipo HlNl. Otros brotes han incluido el subtipo H2N2 en 1957, H3N2 en 1968, y H5N1 en brotes recientes en pájaros y humanos en Asia Sudoriental, China y ahora Europa y el Este Medio. Los virus de influenza A constantemente evolucionan por mecanismos los cuales involucran mutaciones o cambios en los sitios reactivos o antigénicos de hemaglutinina y neuraminidasa, o por el reemplazo súbito de un subtipo de hemaglutinina o neuraminidasa por otro subtipo. Estos mecanismos resultan en nuevos subtipos de virus y permiten que el virus de influenza evada las defensas del sistema inmune y se expanda. Las variantes antigénicas de virus de influenza A emergen cada año y demandan una formulación de vacuna actualizada basada en la vigilancia internacional progresiva de virus de influenza por la Organización Mundial de Salud. Debido al fenómeno en el cual los nuevos subtipos de virus de influenza constantemente emergen, tal como H5N1 en años recientes, brotes mayores de influenza se espera que ocurran. En ciertos escenarios de bioterrorismo plausibles, los virus derivados de laboratorio podrían de manera similar ser diseñados para efectuar cambios antigénicos y por lo tanto causar brotes que podrían evadir las defensas del hospedador establecido. Los conjugados de la presente invención se pueden usar en vacunas contra influenza que son fáciles de producir y manufacturar rápidamente, cuyo componente antigénico se puede cambiar y actualizar basado en las necesidades de salud actuales sin dificultas, que selectivamente se dirige a células infectadas y maquinaría viral, y que se puede administrar post-infección para un efecto terapéutico así como pre-infección para prevención. Por consiguiente, de acuerdo con una modalidad, un antigeno de influenza (o fragmento antigénico del mismo) se usa como el componente de antigeno de un conjugado de la presente invención. Por ejemplo, el antigeno puede comprender uno o más de Hl y NI (ambos altamente inmunogénicos ) y/o uno o más de nucleoproteina (NP) y proteina de matriz 1 (MP1) y/o proteina de matriz 2 (MP2) (todas proteínas estructurales, altamente conservadas) . Las proteínas de cepas pandémicas tales como H5, también se pueden usar como antígenos de acuerdo con la invención. Aunque no quiere estar limitado por cualquier teoría, las proteínas intracelulares tales como NP y MP2 pueden proporcionar una vacuna más universal porque la misma exhibe poco o nada de variación y por consiguiente pueden prevenir infecciones virales heterólogas sin la necesidad de ajuste anual. Por ejemplo, NP exhibe >90% de homología de secuencia de proteína entre aislados de influenza A y contiene epítopes objetivo de células T citotóxicas dominantes. Otros antígenos de influenza útiles en la presente invención incluyen PA, PBl y PB2 (subunidades de polimerasa de ARN) y NS1 y NS2 (inhibidor de respuesta de interferón y exportación nuclear de RNP) . Véase también, Brown, 2000, Biomed. Pharmacother . 54: 196-209; Steinhauer et al., 2002, 36: 305-32; De Jong et al., 2000, 40: 218-28; Alexander, Vet . icrobiol. 74: 3-13. Por consiguiente, de acuerdo con una modalidad, una proteina de hemaglutinina de influenza Tipo A (o fragmento antigénico de la misma) se usa como el componente de antigeno de un conjugado de la presente invención. Actualmente, la prevención de influenza se logra por inyección subcutánea de una vacuna de influenza con H como el principal componente. Por ejemplo, Hl del virus de influenza A/Puerto Rico/8/34 (PR8) (H1N1) es la proteina H circulante, predominante y se ha caracterizado bien, y se puede usar de acuerdo con la invención. En otra modalidad, una proteina de neuraminidasa de influenza Tipo A (o fragmento antigénico de la misma) se usa como el componente de antigeno del conjugado. Una composición que comprende ya sea un conjugado que contiene la proteina H o un conjugado que contiene la proteina N es útil como una vacuna contra influenza. (Por ejemplo, vacunas de influenza actuales comprenden una proteina H como el principal componente, y se ha demostrado que inducen a inmunidad suficiente para prevenir una epidemia de virus homólogo.) Alternativamente, puede ser ventajoso administrar tanto un conjugado que comprende una proteina H y un conjugado que comprende una proteina N, o cualquier combinación de antigenos, tales como una combinación de antigenos variables y conservados. Esto se podría efectuar administrando dos o más composiciones, cada una comprende un conjugado que contiene antígeno único, o proporcionar dos o más conjugados (y, por I consiguiente, dos o más antigenos) en un composición única. 1 En una modalidad, los componentes de antigeno del . conjugado (s) se eligen basados en las necesidades de salud ; pública actuales.

En una modalidad, el conjugado comprende 4-1BBL I como el polipéptido inmuno co-estimulante . Aunque no se ' quiere estar limitado por cualquier teoría, se cree que : este conjugado, cuando se administra a un paciente in vivo, ¡ se unirá a CDs a través de la interacción entre 4-1BBL y el I receptor de 4-1BB en DCs, resultando en internalización de 1 la vacuna y presentación del antígeno de influenza sobre la , superficie del DC, así como también activación y maduración ; de CDs. La activación del DC puede conducir a su vez a ! interacción con y activación de células CD8 y CD4. Las ¦ células T CD4 activadas pueden interactuar entonces con , células y causar su activación y diferenciación en células i secretadoras de anticuerpo, que conducen a una respuesta ¦ humoral. La activación de células T CD8 también puede conducirse a diferenciación y proliferación de más células ', T CD8 las cuales funcionan para exterminar células infectadas con virus. El conjugado también puede unirse i directamente a células T CD4 y CD8 activadas que expresan 1 el receptor 4-1BB, además amplificando la señal. Además, el conjugado (vía 4-1BBL) puede unirse directamente a células 1 asesinas (NK) naturales activadas, las cuales también funcionan para asesinar células infectadas con virus, todas i de las cuales resultan en una respuesta inmune más robusta.

Por consiguiente, el conjugado generará tanto respuestas celulares como humorales que soportan su eficacia en ' vacunas terapéuticas y profilácticas.

Los componentes de antigeno de conjugados útiles ! como vacunas contra otros agentes infecciosos se pueden i seleccionar de una manera análoga por aquellos expertos en : la técnica, basados en los antigenos asociados con aquellos ' I agentes infecciosos. Por ejemplo, los antigenos asociados ¡ con VIH incluyen epitopes gpl20 de envoltura de VIH (por ' I ejemplo, circuitos variables tales como V3) , u otras i proteínas de VIH tales como proteínas Gag ( Pr55ga9, matriz j pl7, capsida p24, nucleocapsida p7), p5; Pol (polimerasa) , i Vif (factor de capacidad de infección viral p23) ; Vpr (proteína viral R pl5) ; Rev (regulador de expresión del gen ! viral pl9) ; Vpu (proteína viral U) ; Env (gp 160, gpl20, j gp41) ; Tat (activador transcripcional pl4); y Nef (efector ¡ negativo p24). Ver, por ejemplo, Peters, 201. Vaccine 2: : i 688-705; Michael, 2003, Clin. Med. 3: 269-72; Gandhi & i Walker, 2002, Ann. Rev. Med. 53: 149-72; Haseltine, 1991, : i FASEB 5: 2349-60. Otros antígenos útiles en vacunas j incluyen polisacáridos capsulares de Haemophilius influenzae tipo b, polisacáridos capsulares de Neisseria i meningitidis , polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae, antigenos de superficie de Hepatitis B, y j exotoxinas inactivadas de toxinas de tétanos y difteria. ! I Estos antigenos se pueden usar de acuerdo con la presente invención como se describió anteriormente con referencia a los antigenos de influenza. ' i Pares de Enlace Un par de enlace ejemplar es biotina y ' estreptavidina (SA) o avidina . Los fragmentos de SA o j avidina los cuales retienen actividad de enlace sustancial ; para biotina, tal como al menos 50% o más de la afinidad de · enlace de SA nativa o avidina, respectivamente, también puede ser usada. Tales fragmentos incluyen "estreptavidina i de núcleo" ("CSA") una versión truncada del polipéptido de : estreptavidina de longitud completa el cual puede incluir 1 13-138, 14-138, 13-139 y 14-139 residuos de estreptavidina.

Véase por ejemplo, Pahler et al., J. Biol. Chem. 1987. ! 262:13933-37. Otras formas truncadas de estreptavidina y i avidina que retienen fuente enlace a biotina también se ' i pueden usar. Véase, por ejemplo, Sano et al., J Biol Chem. 1995 Nov 24, 270(47): 28204-09 (que describen variantes de ! estreptavidina de núcleo 16-133 y 14-138) (Patente ¡ Norteamericana no. 6,022,951). También se pueden usar : mutantes de estreptavidina y formas de núcleo de ; estreptavidina las cuales retienen substancialmente ' actividad de enlace de biotina o actividad de enlace de biotina incrementada. Véase Chilcoti et al., Proc Nati Acad Sci U S A. 1995 Feb 28;92(5): 1754-8; Reznik et al., Nat Biotechnol. 1996 Agosto; 14(8): 1007-11. Por ejemplo, se pueden usar mutantes con inmunogenicidad reducida, tales como mutantes mutados por mutagénesis dirigida al sitio para remover epitopes de célula T potenciales o epitopes de linfocito. Véase Meyer et al., Protein Sci. 2001 10: 491-503. De igual forma, también se pueden usar mutantes de avidina y formas de núcleo de avidina las cuales retienen actividad de enlace de biotina substancial o actividad de enlace de biotina incrementada. Véase Hiller et al., J. Biochem. (1991) 278: 573-85; Livnah et al. Proc Nati Acad Sci USA (0: 5076-80 (1993). Por conveniencia, en la presente descripción, los términos "avidina" y "estreptavidina" como se usan en la presente se pretende que incluyan fragmentos de enlace de biotina, mutantes y formas de núcleo de estos miembros de par de enlace. La avidina y estreptavidina están disponibles de proveedores comerciales. Además, las secuencias de ácido nucleico que codifican estreptavidina y avidina y las secuencias de aminoácidos de estreptavidina y avidina se pueden encontrar, por ejemplo, en Accesos del Banco de Genes Nos. X65082; X03591; NM_205320; X05343; Z21611; and Z21554. Como se usa en la presente "biotina" incluye porciones que contienen biotina que son capaces de unirse a las superficies, tales como superficies celulares (incluyendo superficies celulares de tumor) , tales como NHS-biotina y EZ-lLink™ Sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierce) . Tales formas de proteina reactiva de biotina están disponibles comercialmente . La interacción entre biotina y su socio de enlace, avidina o estreptavidina, ofrecen varias ventajas en el contexto de la presente invención. Por ejemplo, la biotina tiene una afinidad extremadamente alta para tanto estreptavidina (1013 NT1 ) y avidina (1015 M"1) . Adicionalmente , tanto estreptavidina y avidina son polipéptidos tetraméricos que cada una enlaza cuatro moléculas de biotina. Las porciones co-estimulantes inmunes que comprenden estreptavidina o avidina por consiguiente tienen una tendencia para formar tetrámeros y estructuras superiores. Como un resultado, los mismos pueden reticular sus receptores de células inmunes correspondientes para transducción de señal más potente, tal como a través de agregación de receptores. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que otros mecanismos (por ejemplo, otros métodos de . conj ugación usando, por ejemplo, otras porciones de enlace o reticulaciones genéticas o .químicas) se pueden usar para proporcionar estructuras de orden superior de moléculas co- estimulantes inmunes, tales como conjugados que comprenden dimeros, trímeros, tetrámeros y multímeros de orden superior de moléculas co-estimulantes inmunes, los cuales también exhibirán propiedades ventajosas. Tales conjugados se incluyen dentro del alcance de esta invención.

Conjugados Un conjugado que comprende un polipéptido inmuno co-estimulante , antígeno, o agente infeccioso y un elemento de un par de enlace se puede hacer por métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido/antígeno/agente infeccioso y miembro de par de enlace se puede unir covalentemente entre sí o se conjuga entre sí directamente o a través de un enlazante. De acuerdo con una modalidad, el polipéptido/antígeno/agente infeccioso y miembro de par de enlace son componentes de una proteína de fusión. Las proteínas de fusión se pueden hacer por cualquiera de un número de métodos diferentes conocidos en la técnica. Por ejemplo, uno o más de los polipéptidos de componente de las proteínas de fusión se pueden sintetizar químicamente o se pueden generar usando tecnología de ácido nucleico recombinante bien conocida. (Como se usa en la presente, "ácido nucleico" se refiere a ARN o ADN.) Las secuencias de ácido nucleico útiles en la presente invención se pueden obtener usando, por ejemplo, la reacción de cadena de (polimerasa (PCR) . Se describen varios métodos de PCR, por ejemplo, en PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach 7 Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. De acuerdo con una modalidad, un polipéptido inmuno co-estimulante se enlaza via su C-término al N-término del miembro de par de enlace. Por ejemplo, un polipéptido inmuno co-estimulante se puede unir via su C-término al N-término de estreptavidina de núcleo (CSA) . Por consiguiente, la invención incluye proteínas de fusión CD80-CSA, donde la porción CD80 se une vía su C-terminal a la N-terminal de CSA. De acuerdo con otra modalidad, el polipéptido inmuno co-estimulante se une vía su N-término al C-término del miembro de par de enlace. Por ejemplo, un polipéptido inmuno co-estimulante se puede unir vía su N-término al C-término de CSA. Por ejemplo, la invención incluye proteínas de fusión CSA-4-1BBL, CSA-LIGHT, CSA-CD40L, y CSA-OX40L donde la porción CSA se une vía su C-terminal a la N-terminal del polipéptido inmuno coestimulante. El polipéptido inmuno co-estimulante se puede unir directamente al miembro de par de enlace o se pueden unir vía una o más porciones de enlace, tales como uno o más polipéptidos de enlace. De acuerdo con una modalidad, el polipéptido inmuno co-estimulante, antígeno o agente infeccioso es biotinilado. Los conjugados biotinilados se pueden hacer por métodos conocidos en la técnica, y se ejemplifican posteriormente en los ejemplos. Por ejemplo, tecnología Biotin AviTag de Avidity, Inc. (Denver, CO) se puede usar para generar proteínas biotiniladas o agentes infecciosos. La Biotin AviTag está comprendida de un único péptido de 15 aminoácidos que es reconocido por ligasa de biotina, BirA, que une biotina a un residuo de lisina en la secuencia de péptido. Schatz, 1993, Biotechnology . 11: 1138-43. La Biotin AviTag se puede fusionar genéticamente a cualquier proteína de interés, que permita a la proteína ser marcados con una molécula de biotina . Una desventaja potencial para la tecnología de Biotin AviTag es la posibilidad de un bajo grado de biotinilación, porque el sistema biotinila la proteína en un residuo de lisina único, solo en la región de marca. Para superar cualquier problema, las proteínas marcadas purificadas se pueden modificar in vitro usando ligasa de biotina purificada. Porque la biotinilación se realiza enzimáticamente, las condiciones de reacción son más gentiles, el etiquetado es altamente específico, y la reacción es más eficiente que la modificación química de la proteína usando derivados de biotina. Alternativamente, los métodos descritos en Jordán, et al, 2003, Clin. Diag. Lab.

Immunol. 10: 339-44, se pueden usar para producir una i proteina biotinilada modificada genéticamente. ; Los fragmentos de un polipéptido inmuno co¬ estimulante, antigeno de miembro de par de enlace, o agente infeccioso son útiles en la presente invención, mientras 1 que el fragmento retiene la actividad de la porción de ¡ longitud completa referente. Asi, por ejemplo, un fragmento '; inmuno co-estintuíante deberá retener su actividad inmuno ; co-estimulante (por ejemplo, retener su capacidad para unir ; su receptor o ligando) , un fragmento de miembro de enlace deberá retener su capacidad para unirse con su socio de i enlace, y un antigeno o fragmento de agente infeccioso deberá retener su capacidad para inducir una respuesta i inmune contra el antigeno de longitud completa referente o agente infeccioso. Los fragmentos se pueden seleccionar > para retener actividad por métodos que son rutina en la técnica. Los fragmentos ejemplares de polipéptidos co- ; estimulantes inmunes se describieron anteriormente.

Los conjugados pueden incluir un enlazante tal ! como un enlazante de péptido entre el miembro de par de ¡ enlace y el polipéptido inmuno co-estimulante, antigeno o agente infeccioso. La composición y longitud de enlazante se puede elegir para mejorar la actividad de cualquiera o ambos extremos funcionales del conjugado (por ejemplo, polipéptido co-estimulante/antigeno/agente infeccioso o miembro de par de enlace) . El enlazante generalmente es \ desde aproximadamente 3 a aproximadamente 15 aminoácidos de largo, en forma más preferible de aproximadamente 5 a ¡ aproximadamente 10 aminoácidos de largo, sin embargo, se pueden usar enlazantes más largos o más cortos o el ; enlazante puede ser administrado completamente. Los ! enlazantes flexibles (por ejemplo, (Gly4Ser)3) tales como se ' han usado para conectar cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo de cadena única se pueden usar en esta , consideración. Véase Huston et al. (1988) Proc. Nat . Acad.

Sci. USA, 85:5879-5883; Patentes de Estados Unidos Nos. , i ,091,513, 5,132,405, 4,956,778; 5,258,498, y 5,482,858. ' Otros enlazantes son FENDAQAPKS o LQNDAQAPKS. Uno o más 1 dominios y regiones Fe de inmunoglobulina (por ejemplo, CH1, CH2 y/o CH3) también se pueden usar como un enlazante. I También se pueden usar enlazantes químicos. 1 Los ácidos nucleicos y polipéptidos que son modificados, variados, o mutados también son útiles en la ; presente invención, siempre y cuando retengan la actividad del ácido nucleico o polipéptido referente. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico y polipéptido adecuadas para el uso en la presente invención pueden tener al menos ' aproximadamente 80% de identidad de secuencia (incluyendo al menos 80% de identidad de secuencia) a un ácido nucleico i o polipéptido referente, es decir, a un ácido nucleico que codifica un polipéptido inmuno co-estimulante o miembro de par de enlace conocido. En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico o polipéptido que tiene al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia al ácido nucleico o polipéptido referente . La invención incluye ácidos nucleicos con cambios base que están "callados" porque codifican el mismo aminoácido (es decir, degeneran las secuencias de ácido nucleico) . La invención también incluye ácidos nucleicos que codifican polipéptidos con sustituciones de aminoácido conservadoras, y tales polipéptidos. Las sustituciones de aminoácido conservadoras (por ejemplo, sustituir un residuo hidrofóbico con un diferente residuo hidrofóbico) son bien conocidas en la técnica y se pueden efectuar, por ejemplo, por mutaciones de punto y similares. La adaptabilidad de una secuencia, variantes o mutante modificado dado se puede confirmar usando enlace de receptor y/o métodos de selección biológica que son conocidos en la técnica, tales como aquellos discutidos anteriormente con referencia a los fragmentos . Como usa en la presente, el "% de identidad de secuencia" se calcula determinando el número de posiciones igualadas en secuencias de polipéptido y ácido nucleico alineadas, dividiendo el número de posiciones igualadas por ¡ el número total de aminoácidos o nucleótidos alineados, respectivamente, y multiplicando por 100. Una posición igualada se refiere a una posición en la cual los nucleótidos o aminoácidos idénticos se presentan en la I misma posición en las secuencias alineadas. El número total i de nucleótidos o aminoácidos alineados se refiere al número mínimo de nucleótidos o aminoácidos que son necesarios para l alinear la segunda secuencia, y no incluyen alineación (por ( ejemplo, alineación forzada) con secuencias no homologas, ¡ tales como aquellas que se pueden fusionar al N-terminal o C-terminal de la secuencia de interés (es decir, la , secuencia que codifica el miembro de par de enlace o ¡ i polipéptido inmuno co-estimulante) . El número total de i nucleótidos o aminoácidos alineados puede corresponder a la secuencia de codificación total o puede corresponder a i fragmentos de la secuencia de longitud completa como se ; define en la presente. Las secuencias se pueden alinear usando el algoritmo descrito por Altschul et al. (1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402) como se incorpora en los programas BLAST (herramienta de búsqueda de alineación local básica) , ' disponibles en ncbi.nlm.nih.gov en la Web Mundial. Las · búsquedas o alineaciones de BLAST se pueden realizar para | determinar el porcentaje de identidad de secuencia entre i una molécula de ácido nucleico (la "secuencia pregunta") y ' cualquier otra secuencia o porción de la misma usando ; I algoritmo de Altschul. BLASTN se puede usar para alinear y , comparar la identidad entre las secuencias de ácido < nucleico, mientras que BLASTP se puede usar para alinear y comparar la identidad entre secuencias de aminoácido.

Cuando se utilizan programas BLAST para calcular el porcentaje de identidad entre una secuencia de ácido \ nucleico que codifica un polipéptido terapéutico y otra I secuencia, los parámetros de omisión de los programas respectivos se pueden usar incluyendo la omisión por penalidad de abertura. ! Los ácidos nucleicos de la presente invención se pueden detectar por métodos tales como análisis de Southern o Northen blot (es decir, hibridación) , PCR, o análisis de ; hibridación in situ. Los polipéptidos típicamente se j detectar por inmunocitoquímica en líneas celulares ¡ transfectadas o por electroforesis de dodecil sulfato de ; sodio (SDS)-gel de poliacrilamida seguida por análisis de manchado Azul de Coomassie o Western blot usando anticuerpos (monoclonales o policlonales ) que tienen afinidad de enlace específica para el polipéptido particular. Muchos de estos métodos se discuten con detalle en Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory i I Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold 1 Spring Harbor, NY) . ; Las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido inmuno co-estimulante y el miembro de par de enlace se pueden enlazar operativamente a otra en un ¡ constructo usando las técnicas de biología molecular convencional. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A ¡ Laboratory Manual (Sambrook et al., 2001, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press) o Short Protocols in i Molecular Biology (Ausubel et al., 2002, 5th Ed., Current : Protocols) . Los constructos adecuados para el uso en estos métodos están comercialmente disponibles y son usados rutinariamente en la técnica. Los constructos pueden ' incluir elementos necesarios para la expresión tales como \ secuencias promotoras, elementos reguladores tales como secuencias mej oradoras, y, elementos de respuesta y/o < elementos inducibles que modulan la expresión de una secuencia de ácido nucleico. Como se usa en la presente, ¡ "operativamente enlazado" se refiere a (i) posicionamiento ¦ de un elemento promotor y/u otro regulador con relación a ¡ una secuencia de ácido nucleico de tal forma para dirigir o ¡ regular la expresión del ácido nucleico; y/o (ii) ! posicionamiento del ácido nucleico que codifica el ; polipéptido inmuno co-estimulante y el ácido nucleico que codifica el miembro de par de enlace, de modo que las ! secuencias de codificación están "en. estructura", es decir, : de modo que el constructo codifica una proteína de fusión que comprende el polipéptido inmuno co-estimulante y el miembro de par de enlace. Un constructo se puede propagar o expresar para generar un polipéptido en una célula hospedadora por métodos conocidos en la. técnica. Como se usa en la presente, el término "hospedador" o "célula hospedadora" se entiende que incluye no solamente procariotas, tales como E. coli, sino también eucariotas, tal como células de levadura, insecto, planta y animal. Las células de animal incluyen, por ejemplo, células COS y células HeLa . Una célula hospedadora se puede transformar o transfectar con una molécula de ADN (por ejemplo, un constructo) usando cualquiera de las técnicas comúnmente conocidas por aquellos de experiencia ordinaria en esta técnica, tal como precipitación de acetato de litio o fosfato de calcio, electroporación, lipofección y bombardeo de partículas. Las células hospedadoras que contienen un vector de la presente invención se pueden. usar para propósitos tal como propagación del vector, producción de un ácido nucleico (por ejemplo, ADN o AR ) , expresión de un polipéptido inmuno co-estimulante o fragmentos del mismo, o expresión de una proteína de fusión, como se describió anteriormente. Las figuras IA y IB, 2A y 2B, 3A y 3B, 4A y 4B, 5A y 5B, y 7A y 7B muestran secuencias de ácido nucleico representativas (SEC ID NOs . 1, 3, 5, 7, 9 y 14) que incluyen secuencias de codificación para porciones inmuno co-estimulantes que comprenden estreptavidina de núcleo y i un polipéptido inmuno co-estimulante, y las secuencias de aminoácido codificadas correspondientes (SEC ID NOs. 2, 4, 6, 8, 10 y 15) . i Inmunoterapia Una modalidad de la presente invención proporciona un método para generar o mejorar una respuesta inmune contra un primer antigeno o agente infeccioso ; administrando a un paciente en necesidad del mismo (a) un ¡ primer conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado 1 que comprende un primer polipéptido inmuno co-estimulante y (ii) un miembro de conjugado que comprende un primer miembro de un par de enlace; y (b) un segundo conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado que comprende el primer antigeno o el agente infeccioso y (ii) un miembro de conjugado que comprende un segundo miembro del par de enlace. En una modalidad alternativa, las células inmunes son tratadas con los primer y segundo conjugados y luego administradas al paciente. Como se discutió anteriormente, cualquier polipéptido inmuno co-estimulante y cualquier antigeno asociado con un tumor o agente infeccioso (o el agente infeccioso mismo) se puede usar, como cualquier par de enlace. La presente invención incluye el uso de moléculas co-estimulantes quiméricas con y sin conjugación al antigeno de interés. En modalidades donde los conjugados se administran directamente al paciente, el primer conjugado y el segundo conjugado se pueden administrar sustancialmente al mismo tiempo o en diferentes tiempos. En una modalidad, los conjugados son unidos conjuntamente via la actividad de enlace de los miembros de par de enlace antes de la administración al paciente. Por ejemplo, los primer y segundo conjugados se pueden combinar in vitro y administrar en una composición única. En otra modalidad, el primer conjugado se administra primero, seguido por administración del segundo conjugado después de un tiempo suficiente para que el polipéptido inmuno co-estimulante se enlace a células inmunes. Este periodo de tiempo, por ejemplo, puede variar desde una a unas cuantas horas, desde un día a unos cuantos dias, desde una semana o más tiempo. Los primer y segundo conjugados se pueden administrar al paciente sistémicamente o localmente, tal como por inyección intravenosa, intranasal, peritoneal, o subcutánea. En una modalidad, una o más de las composiciones son administradas localmente via inyección directa en un sitio de tumor, tal como por inyección intratumoral , o en un sitio de infección local. En otra modalidad una o más de las composiciones son administradas por diferentes rutas. Por ejemplo, una o más composiciones se pueden administrar localmente y una o más se pueden administrar sistémicamente . En modalidades donde los conjugados se usan para tratar células inmunes las cuales luego se administran directamente al paciente, las células inmunes se pueden ; tratar con los primer y segundo conjugados sustancialmente ' al mismo tiempo o a diferentes tiempos. En una modalidad, 1 los primer y segundo conjugados se unen conjuntamente via ¡ la actividad de enlace de los miembros de par de enlace ' antes de ser usados para tratar células inmunes. Por ; ejemplo, los primer y segundo conjugados se pueden combinar 1 en una composición única y se usan para tratar células inmunes in vitro, tal como poniendo en contacto las células inmunes con la composición. En otra modalidad, las células' inmunes se tratan con el primer conjugado, seguido después ¡ de un periodo de tiempo por tratamiento con el segundo ' conjugado. Este periodo de tiempo, por ejemplo, puede variar desde una a unas cuantas horas, desde un día a unos < cuantos días, desde una semana o más tiempo. Las células; inmunes tratadas se administran al paciente por cualquier; medio descrito anteriormente, incluyendo administración! sistémica o local, tal como inyección intratumoral o; inyección en un sitio de infección local. De conformidad con una modalidad, el método adicionalmente comprende administrar un tercer conjugado o tratar células inmunes con un tercer conjugado. En una modalidad, el tercer conjugado comprende (i) un miembro de conjugado que comprende un polipéptido inmuno coestimulante y (ii) un miembro de conjugado que comprende un segundo antigeno asociado con el tumor o agente infeccioso o el agente infeccioso mismo. El polipéptido inmuno coestimulante del tercer conjugado puede ser el mismo o diferente del polipéptido inmuno co-estimulante del primer conjugado, y el segundo antigeno puede ser el mismo o diferente del primer antigeno. En un aspecto especifico de esta modalidad, el polipéptido inmuno co-estimulante y el segundo antigeno se unen conjuntamente vía interacciones de miembros de par de enlace asociados con cada uno del polipéptido inmuno co-estimulante y segundo antigeno. De conformidad con esta modalidad, el primer y segundo miembros de par de enlace del tercer conjugado puede ser el mismo o diferente de los primer y segundo miembros de par de enlace de los primer y segundo conjugados. En una modalidad, el primer conjugado comprende un polipéptido inmuno co-estimulante que enlaza un receptor constitutivo, tal como CD80, LIGHT, y CD40L, y el tercer conjugado comprende un polipéptido inmuno co-estimulante que enlaza un receptor inducible, tal como 4-1BBL y OX40L La tabla 7 posterior proporciona un listado moléculas co-estimulantes que son constitutivas inducibles .

TABLA 7 La eficacia de inmunoterapia de cáncer se puede valorar determinando la disminución de proliferación de célula de tumor y/o tamaño de tumor. El número de células de tumor es no estático y refleja tanto el número de células que sufren división celular como el número de células teñidas (por ejemplo, apoptosis) . El incremento de una respuesta inmune del individuo contra las células de tumor puede inhibir la proliferación de las células. La proliferación de células de tumor como se usa en la presente se refiere a un incremento en el número de células de tumor (in vitro o in vivo) durante un periodo de tiempo dado (por ejemplo, horas, días, semanas, o meses) . La inhibición de la proliferación de células de tumor se puede medir por una disminución en la velocidad de incremento en; número de célula de tumor, una pérdida completa de células, de tumor, o cualquier disminución de proliferación entre estas. Una disminución en el tamaño de un tumor sólido es una indicación de una inhibición de proliferación de: células de tumor. ' La presente invención ofrece una ventaja sobre las vacunas contra cáncer de la técnica previa_ proporcionando la capacidad de dirigir TAAs específicamente; a DCs a través de la interacción del polipéptido inmuno coestimulante (tal como 4-1BBL) son su receptor. Además, la-invención proporciona una vacuna que se puede administrar a> un paciente por inyección y absorbida por la DC in vivo,: conduciendo a una presentación y activación de antígeno sin, requerir el aislamiento y manipulación ex vivo de DCs o el uso de terapia de gen. ; La eficacia de inmunoterapia contra infección se; puede valorar determinando la carga de infección del' paciente, y valorando los puntos finales clínicos, tal como fiebre o hinchamiento . El uso de pares de enlace de avidina/biotina de; conformidad con la invención (u otros mecanismos para; proporcionar estructuras de orden mayor de moléculas inmuno; co-estimulantes ) ofrece la ventaja adicional de: proporcionar una estructura tetramérica (u otra estructural multimérica ) que permite la reticulación del receptor! inmuno co-estimulante para una respuesta más fuerte y que, permite el suministro de múltiples moléculas de antigeno a I DCs . En una modalidad, el primer miembro de par de enlace, es decir, el miembro de par de enlace del primer conjugado1 (que comprende el primer polipéptido inmuno co-estimulante ) ! es avidina, estreptavidina o estreptavidina de núcleo, y el. segundo miembro de par de enlace, es decir el miembro de par de enlace del segundo conjugado (que' comprende el primer antigeno o el agente infeccioso) es; biotina. En otra modalidad, el primer miembro de; par de enlace es biotina y el segundo miembro de par de! enlace es avidina, estreptavidina, o estreptavidina de núcleo. El uso de 4-1BBL como el polipéptido inmuno coestimulante puede ofrecer1 ventajas adicionales, debido a! que la estimulación de DCs con 4-1BBL ha mostrado nulificar, i la función supresora de células Treg que juegan un papel, dominante en evasión de tumor del sistema inmune. Por1 consiguiente, los conjugados de la presente invención que comprenden 4-1BBL y un TAA suministrarán el TAA a las DCs' para presentación efectiva, activarán las DCs para; elaboración de varias citocinas, y nulificarán la función! de las células Treg mientras amplifica la función de células; Teff y NK para erradicación de tumor.

Células Inmunes Modificadas La invención también proporciona células inmunes modificadas, y métodos para hacerlas, que son útiles en¡ métodos de inmunoterapia como se describió anteriormente.

De conformidad con este aspecto de la invención, se: proporciona un método para modificar células inmunes para generar o mejorar una respuesta inmune a un tumor que¡ expresa un primer antigeno asociado al tumor o a un agente infeccioso . El método comprende poner en contacto las¡ células inmunes que expresan un receptor para un primer polipéptido inmuno co-estimulante con (a) un primer conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado que comprende el primer polipéptido inmuno co-estimulante y: (ii) un miembro de conjugado que comprende un primer miembro de un par de enlace; y (b) un segundo conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado que comprende un antigeno asociado con el tumor o agente infeccioso o el i agente infeccioso y (ii) un miembro de conjugado que comprende un segundo miembro del par de enlace. De conformidad con este método, el primer conjugado es conjugado con las células inmunes vía el enlace entre el polipéptido inmuno co-estimulante y el receptor, y el segundo conjugado se conjuga con la célula inmune vía el enlace entre los primer y segundo miembros de par de enlace .

Las células inmunes se pueden poner en contacto; con los primer y segundo conjugados por cualquier medio, y1 esto se puede efectuar in vivo o in vitro. Por ejemplo, un: método in vivo pede comprender administrar los primer y segundo conjugados a un paciente que comprende las células inmunes y que comprende o está en riesgo de comprender el tumor o agente infeccioso. De conformidad con este método, los primer y segundo conjugados se pueden administrar sustancialmente simultáneamente (en las mismas o separadas composiciones) o consecutivamente (en composiciones separadas) . En una modalidad donde el paciente comprende un tumor, al menos uno de los primer y segundo conjugados es administrado por inyección intratumoral . Un método in vitro ejemplar puede comprender poner en contacto las células inmunes con los primer y segundo conjugados in vitro, tal como puesta en contacto con una composición única que comprende los primer y segundo conjugados, o puesta en contacto con las primera y segunda composiciones que comprenden los primer y segundo conjugados, respectivamente. Cuando los conjugados se proporcionan en una composición única, se pueden unir conjuntamente via enlace entre los primer y segundo miembros de par de enlace, como se proporciona en la composición . Cualquier polipéptido inmuno co-estimulante , antígeno o agente infeccioso, y miembros de par de enlace se puede usar en este aspecto de la invención, incluyendo cada uno descrito anteriormente. Cualquier célula inmune que expresa un receptor para el primer polipéptido inmuno co-estimulante se puede1 modificar de conformidad con este método. En una modalidad, , las células inmunes son células T o neutrófilos. Las células T ejemplares incluyen células CD4+, células CD8+, células asesinas naturales, monocitos y células' dendriticas. ' En una modalidad adicional de este aspecto de la , invención, las células inmunes comprenden un receptor para . un segundo polipéptido inmuno co-estimulante, y el método ' adicionalmente comprende poner en contacto las células 1 inmunes con un tercer conjugado que comprende (i) un primer ! miembro de conjugado que comprende el segundo polipéptido ; inmuno co-estimulante y (ii) un segundo miembro de i conjugado que comprende un antigeno asociado con el tumor o ; i agente infeccioso (o el agente infeccioso mismos) . En esta modalidad, el segundo polipéptido inmuno co-estimulante puede ser el mismo o diferente del primer polipéptido . inmuno co-estimulante y el segundo antigeno, si está ¦ presente, puede ser el mismo o diferente del primer antigeno, si está presente. En otra modalidad especifica, los primer y segundo miembros de conjugado adicionalmente comprenden los primer y segundo miembros de un par de< enlace, respectivamente. De conformidad con esta modalidad, los primer y segundo miembros de par de enlace del tercer' conjugado son los mismos o diferentes de los primer y i segundo miembros de par de enlace de los primer y segundo ! conjugados. Adicionalmente,; el primer miembro de conjugado! I se puede unir al segundo miembro de conjugado via el enlace entre los primer y segundo miembros de par de enlace. ¦ Como con los primer y segundo conjugados ! discutidos anteriormente, el tercer conjugado puede comprender cualquier polipéptido inmuno co-estimulante , antigeno o agente infeccioso y miembros de par de enlace, incluyendo cualquiera descrito en la presente. En un aspecto relacionado, la invención proporciona una población de células inmunes hechas por este método. Tales células inmunes generan o mejoran una respuesta inmune al tumor cuando hacen contacto con otras células inmunes. La invención también proporciona una célula inmune modificada que expresa un receptor para un primer polipéptido inmuno co-estimulante, en donde la célula inmune modificada es modificada con (a) un primer conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado que comprende el primer polipéptido inmuno co-estimulante y (ii) un miembro de conjugado que comprende un primer miembro de un par de enlace; y (b) un segundo conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado que comprende un primer antigeno o agente infeccioso y (ii) un miembro de conjugado que! comprende un segundo miembro del par de enlace. De i conformidad con esta modalidad, el primer conjugado es | conjugado con la célula inmune vía el enlace entre el polipéptido inmuno co-estimulante y el receptor, y el segundo conjugado es conjugado con la célula inmune vía el enlace entre los primer y segundo miembros de par de enlace . Como con los métodos descritos anteriormente, cualquier polipéptido inmuno co-estimulante, antigeno agente infeccioso, y miembros de par de enlace se pueden usar en este aspecto de la invención, incluyendo cada uno descrito anteriormente. Adicionalmente, cualquier célula inmune que expresa un receptor para el primer polipéptido inmuno coestimulante se puede modificar de conformidad con este método. En una modalidad, la célula inmune es una célula T o neutrófilo. Las células T ejemplares incluyen células CD4+, células CD8+, células asesinas naturales, monocitos y células dendriticas.

Porciones Inmunoestimulantes La invención también proporciona porciones inmunoestimulantes que tienen actividad inmunoestimulante . , Las porciones inmunoestimulantes son útiles cuando se administran solas, o cuando se usan como un adyuvante en1 conjunto con la administración de un antigeno u otro agente1 inmunoestimulante. Por ejemplo, las porciones' inmunoestimulantes son útiles en el contexto de vacunas, , inmunoterapia de cáncer, y el tratamiento de trastornos . basados en inmunidad. Las porciones inmunoestimulantes se ' pueden formular en composiciones adecuada para la administración a un animal, y se pueden administrar a un 1 animal en necesidad de inmunoestimulación, tal como un animal que recibe una vacuna, inmunoterapia de cáncer, o se somete a tratamiento para un trastorno basado en inmunidad. . De conformidad con una modalidad, la porción inmunoestimulante comprende cualquiera de los polipéptidos co-estimulantes inmunes descritos anteriormente, tales como ; 4-1BBL, CD86, ICOSL, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, ' CD27L, CD30L, LIGHT , BAFF, APRIL, CD80 y CD40L. En otra ¡ modalidad, el polipéptido inmuno co-estimulante se selecciona del grupo que consiste de 4-1BBL, ICOSL, PD-L1, PD-L2, OX40L, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, y APRIL. En ; todavía otra modalidad, el polipéptido inmuno coestimulante es 4-1BBL. De conformidad con un aspecto especifico de esta modalidad, la porción inmunoestimulante adicionalmente comprende estreptavidina o estreptavidina de núcleo. Por ejemplo, la porción inmunoestimulante puede ser un conjugado o proteína de fusión que comprende un polipéptido inmunoestimulante y estreptavidina de núcleo. En otra modalidad, la porción inmunoestimulante consiste esencialmente del polipéptido inmuno coestimulante y estreptavidina o estreptavidina de núcleo. De conformidad con esta modalidad, la porción co-estimulante no comprende y no se conjuga o de otra forma se une a cualquiera otro agente inmunoestimulante, tal como otro , polipéptido inmuno co-estimulante o antigeno. La invención también incluye un método inmunoestimulante que comprende administrar una porción inmunoestimulante a un paciente en necesidad de estimulación inmune. En una modalidad de este método, la ! porción inmunoestimulante comprende un polipéptido inmuno co-estimulante y estreptavidina o estreptavidina de núcleo. En otra modalidad, la porción inmunoestimulante consiste esencialmente del polipéptido inmuno co-estimulante y estreptavidina o estreptavidina de núcleo. En una modalidad adicional, el método adicionalmente comprende administrar un antígeno al paciente, simultáneamente o consecutivamente (ya sea antes o después) de la administración de la porción inmunoestimulante. En algunas modalidades de administración simultánea, la porción inmunoestimulante y antígeno son administrados en una composición única, tal como una mezcla que comprende la porción inmunoestimulante y antigeno. En otras modalidades de administración simultánea, la porción.' inmunoestimulante y antigeno se administran en composiciones separadas. En algunas modalidades, el antigeno se administra como un conjugado que contiene' antigeno como se describió anteriormente, tal como un! conjugado que comprende un antigeno y un miembro de un par' de enlace. En otras modalidades, el antigeno no es 1 administrado como un conjugado que comprende un miembro de' un par de enlace. Otra modalidad del método inmunoestimulante . consiste esencialmente de administrar una porción; inmunoestimulante que consiste esencialmente de polipéptido inmuno co-estimulante y estreptavidina o estreptavidina de , núcleo. De conformidad con esta modalidad, ningún otro I agente inmunoestimulante, tal como otro polipéptido inmuno : co-estimulante o antigeno, es administrado que podría j llegar a ser conjugado o de otra forma unido a la porción inmunoestimulante. Por consiguiente, por ejemplo, ninguna molécula biotinilada, tales como células biotiniladas o ; conjugado de proteína que comprende biotina, se administra. ! Aunque no se desea que se una por cualquier teoría, se cree que las porciones inmunoestimulantes de la 1 invención estimulan interacciones entre receptores inmunes '. de superficie celular y sus ligandos, por esto se promueven respuestas humorales y celulares. Las porciones' inmunoestimulantes que comprenden estreptavidina (o. estreptavidina de núcleo) forman tetrámeros y oligómeros1 estables que acoplan de manera efectiva los receptores, y estimulan las células B, monocitos, y células dendriticas I para la producción de citocinas, quimiocinas, y sobre-regulan las moléculas inmunoestimulantes . Los siguientes ejemplos ilustran la invención con' más detalle, y no se pretende que limiten el alcance de laj invención en cualquier aspecto.

EJEMPLOS Métodos Experimentales Animales. Ratones adultos innatos BALB/c (H-2d) y C57BL/6 se compraron de Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine) . Animales TCR transgénicos OT-I, DO11.10, C57BL/6.SJL se compraron de Taconics (Germantown, NY) y se mantuvieron bajo las Directrices NIH. Establecimiento de células A20 que expresan OVA. Un constructo IVA se obtuvo de Dr. Tom Mitchell de la Universidad de Louisville y se clonó direccionalmente en el vector pcADN3 (Invitrogen, San Diego, CA) restringido con BglII y EcoRI . Después de la transformación bacteriana y selección sobre medio de ampicilina, varios clones se sometieron a preparación de miniplásmido y se digirieron; con Bgll/EcoRI para indentificar clones positivos. Un clon que contiene el inserto se utilizó entonces para la< preparación de plásmido grande y la transfeccion en células A20 usando kit Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen) de acuerdo1 con las instrucciones del fabricante. Las células se seleccionaron en medio que ¦ contiene G418 (Geneticin) y la' expresión de OVA se determinó usando Western blots y anticuerpos contra OVA o ensayos de proliferación de; células T. Establecimiento de modelo de cáncer cervical transplantable TC-1. Un modelo de tumor TC-1 se estableció en ratones C57BL/6. La linea celular TC-1 tumorigena se! derivó por cotransformación de células epiteliales de pulmón de ratón C57BL/6 primarias con HPV-16 E6 y E7 y un; i oncógeno ras activado, y se ha caracterizado como un modelo para carcinoma cervical humano. Las células TC-1 formani tumores en ratones C57BL/6 singeneicos. Para establecer el' modelo, 1 x 105 células de tumor se transplantaron en el; i lado derecho de ratones C57BL/6 y se monitorearon animales para el crecimiento de tumor. j Expresión y purificación del 4-1BBL recombinante usando sistema de expresión DES de insecto. Los: transíectados estables que expresan 4-1BBL que usan el Sistema de Expresión Drosophila DES (Invitrogen; Carlsbad, ? CA) se establece como se describe en Singh et al., 2003, Cáncer Res. 63: 4067-73. Los transfectados se inducen para la expresión de proteina recombinante en medio libre de: suero de Drosophila (Gibco; Carlsbad, CA) complementado con 1 mM de sulfato de cobre por 72 horas en un sacudidor de incubador ajustado a 25°C y 105 rpm. El sobrenadante de cultivo es recolectado por centrifugación y sometido a purificación a gran escala usando resina de afinidad metálica inmovilizada con agarosa reticulada con cobalto; ( II ) -carboximetilaspartato (BD-Talon, BD Biosciences) o' resina de afinidad de metal Ni-NTA (Qiagen) , tomando! ventaja de la 6x-His-tag modificada por ingeniería en las1 proteínas. En resumen, el medio de cultivo que contiene 4-1BBL se precipitó por adición por goteo de 95% de etanoi; para producir una concentración final de 10% de etanoi. Después de una incubación durante la noche a 4°C el 4-lBBL; precipitado se volvió a disolver en 1/10 de su volumen del partida con amortiguador de enlace (50 mM de fosfato de sodio pH 7.0; 500 mM de cloruro de sodio; 0.5% de Tween-20; 1% de glicerol; 5 mM de 2-mercaptoetanol ) . La resina de; afinidad de metal se equilibró usando volumen de lecho de' gel 5X de amortiguador de enlace, se adicionó a la solución de proteína redisuelta que contiene 4-1BBL, y se incubó1 con rotación vertical por 45 minutos a temperatura ambiente. La resina de afinidad de metal unida a 4-1BBL se lavó 2X con 50-100 mi de amortiguador de lavado (50 mM de; fosfato de sodio pH 7.0; 500 mM de cloruro de sodio). El 4-1BBL unido se eluyó de la resina de afinidad de metal con 1 volumen de lecho de gel 2X de amortiguador de elución (50 mM de fosfato de sodio pH 7.0; 500 mM de cloruro de sodio, 150 mM de imidazol) . Los eluidos de 4-1BBL purificados se agruparon y cargaron en dispositivos de filtro centrifugo Amicon Ultra™ (Millipore; Bedford, Mass.) con corte de membrana de 30 kD de peso molecular. Los dispositivos de filtro centrifugo se someten a centrifugación a 3000 rpm (2000 x g) a 4°C por 15 minutos. Se adicionó PBS estéril al retenido y los filtros se centrifugaron de nuevo a 3000 rpm (2000 x g) . El ' retenido que contiene el 4-1BBL concentrado/desalado se aspiró de los dispositivos de filtro centrifugo, se colocó i en crioviales estériles, y se almacenó en nitrógeno 1 liquido. La pureza de las proteínas aisladas se valora por electroforesis de gel de SDS-poliacrilamida . La 1 concentración de proteína se determinó usando el ensayo de proteína BCA (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Expresión y purificación de OVA biotinilada. El constructo de OVA descrito anteriormente se subclonó en los vectores de pAN y pAC de Avidity, Inc. (Denver, CO) para I expresar la N-terminal asi como también fusiones de; proteina- AviTag de C-terminal, respectivamente. Después de; la transformación bacteriana y selección en medio de ampicilina, varios clones se ajustaron a preparación de miniplásmido y se digirieron con las enzimas de restricción ¦¦ apropiadas para identificar clones positivos. Un clon con el inserto se utilizó para la preparación de plásmido grande. Los plásmidos se utilizaron para transformar AVB100 j i E. coli, una cepa con el gen de ligasa birA establemente integrado en el cromosoma. La expresión de proteina se i indujo con L-arabinosa para alto nivel de expresión de OVA con la etiqueta de biotina. Las proteínas expresadas se purificaron usando una agarosa de anticuerpo AviTag. El OVA I purificada se valoró para concentración, nivel de endotoxina, y biotinilación usando Western blot y estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina para sondeo. Si fuera necesario, se remueve la endotoxina usando kit de Remoción de Endotoxina de Detoxi-Gel (Pierce) . El OVA biotinilada se conjugó con proteína de fusión de CSA-4- 1BBL y se probó en ensayos de proliferación in vivo usando células transgénicas de TCR OT-I, como se describe posteriormente. La proteína es alícuota y se congeló a - 70°C hasta su uso. Ensayos de proliferación. Para ensayos de proliferación in vivo, se cultivaron células de nodo linfático y bazo de animales transgénicos de TCR OT-I: (OVA257-264/ b) . Las células se etiquetaron con 5 µ? de CFSE ( succinimidiléster de diacetato de carboxifluoresceina) y un millón de células etiquetadas con CFSE son transferidas a ratones B6-SJL congeneicos CD45.1+ por inyección en la, vena de la cola. Después de 24 horas, los animales se inmunizaron con 10 µ? de OVA solo, OVA se mezcló con o conjugó en CSA o CSA-4-1BL. Las células de nodos linfáticos , y bazo se inmunizaron después de 3 días y la proliferación ' se determinó por análisis de dilución de CFSE en poblaciones de célula CD8+ CD45.1" (OT-1) en la compuerta linfoide. Las células se inmunizaron a partir de algunos ; animales que no reciben proteina OVA son usadas para determinar la población precursora para análisis Los ensayos de proliferación in vitro se realizan , como sigue: las células transgénicas de TCR DOl 1.10 , (OVA323-339/I-Ad) etiquetadas con CFSE de ratones BALB/c se i usan como respondedores contra transfectores A20 irradiados que expresan OVA a varias relaciones por 3 dias. Los cultivos se recolectaron y analizaron en citometria de flujo por proliferación. Citometria de flujo. Se realizaron los análisis citométricos de flujo primero titulando los anticuerpos primarios y secundarios de interés y luego usando las concentraciones óptimas en citometria de flujo usando procedimientos estándares. Véase, por ejemplo, Mhoyan et al., 1997, Transplantation 64: 1665-70. Los anticuerpos unidos a isotipo sirven como controles negativos. Las muestras se realizan en un FACS Calibur o Vantage (Becton Dickinson; ountain View, CA) y se realiza análisis usando software FlowJo software (TreeSoft) . Inmunoterapia . Las vacunas se realizaron como sigue: Brevemente, las proteínas de CSA-4-1BBL se mezclaron con OVA biotinilada en PBS a varias relaciones molares y luego se inyectaron intraperitonealmente en ratones BALB/c por pre-vacunación, o por inmunoterapia en animales que se han inoculado subcutáneamente en el flanco con una dosis letal de células A20 (lx 106) viables. Los controles incluyen animales sin vacunación o estos vacunados con proteínas de control. Una vez detectados, los tumores se midieron cada día usando calibradores y el tamaño de tumor se reportó como el promedio del diámetro más largo y el diámetro perpendicular + error estándar. Los animales se eutanizaron cuando el tamaño del tumo alcanzó aproximadamente 20 mm de diámetro para evitar el malestar. Estadísticas. El efecto de tratamientos en supervivencia de tumor se estimó usando curvas de Kaplan-Meier. Las diferencias en supervivencia entre diferentes grupos se valoraron usando la prueba de rango logarítmico (generalizado por Savage/Mantel Cox) . Los procedimientos que involucran la comparación de datos a partir de los grupos de animales individuales primero tendrá la igualdad de variación examinada usando la prueba F (dos grupos) o prueba de Levene (grupos múltiples) . Cuando las variaciones no son iguales, se realizan transformaciones logarítmicas. Cuando los medios de muestra normalmente distribuidos son comparados, se usa la prueba de Estudiante (dos grupos) o la prueba de Newman-Keuls (grupos múltiples) . Cuando los datos no están distribuidos normalmente, se usa la prueba de Mann-Whitney U (dos grupos) o la prueba de Kruskal- allis (grupos múltiples) . El significado estadístico se define como P<0.05.

Ejemplo 1: CSA-4-1BBL Aumenta Las Respuestas Impulsadas por Aloantígeno Como se describió anteriormente, el 4-1BBL juega un papel importante en la regulación de respuestas inmunes innatas y adaptivas. El 4-1BBL sirve como una molécula coestimulante para la activación de células CD4+ y CD8+, células NK, y DCs e inhibe la función supresora de células Treg. Por lo tanto, esta molécula puede servir como un adyuvante específico para la generación de una respuesta de tumor efectiva para terapia de cáncer. La proteína de fusión de CSA-4-1BBL forma estructura tetramérica/oligomérica debido a la presencia de la porción de estreptavidina de núcleo, y es una molécula soluble. La actividad inmunoestimulante de CSA-4-1BBL en respuestas de células T se demostró usando reacciones de; linfocitos mezclados alogeneicos (MLR) como sigue. Las células de nodulos linfáticos de ratones C57BL/6 se usaron como respondedores contra esplenocitos irradiados con BALB/c en la presencia o ausencia de CSA-4-; 1BBL. Los cultivos se etiquetaron con [JH]timidina por al; menos 18 horas del periodo de cultivo y se valoró la proliferación. Los cultivos suplementarios con CSA-4-1BBL1 mostraron actividad proliferativa potente cuando se compararon con controles (Figura 8).

Ejemplo 2: CSA-4-1BBL Mejora la Proliferación de células T Para valorar la actividad relativa de la proteina de fusión 4-1-BBL a un anticuerpo monoclonal contra 4-1BB, ; las células CD4+ y CD8+ clasificadas por citometria de flujo^ se estimularon policlonalmente con una concentración sub- ' óptima de anticuerpo anti-CD3 en la presencia de varias cantidades de proteina de fusión de 4-1BBL y anticuerpo en ensayos de proliferación. La proteina de fusión tuvo 70 veces más actividad en la proliferación de células T que el anticuerpo (Figura 9) . Debido a que este anticuerpo Ab se ha mostrado que tiene actividad potente en modelos animales de inmunoterapia de cáncer, véase, por ejemplo, Melero et al-, 1998, Cell Immunol. 190: 167-72; Melero et al., 1997 Nat . Med. 3: 682-85, estos datos indican que la proteina de fusión CSA-4-1BBL será un componente útil de vacunas contra cáncer, tanto como un adyuvante como un vehículo para suministrar TAAs a DCs .

Ejemplo 3: Efecto de Un Conjugado de OVA biotinilada/CSA-4-1-BBL En Células T CD8+ El péptido ovalbúmina (OVA) se biotiniló usando un kit comercialmente disponible (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) . El OVA biotinilada se premezcló in vitro con proteína de fusión CSA-4-1BBL para conjugación a varias relaciones y se inyectó intraperitonealmente en animales C57BL/6.SJL naive adoptivamente transferidos con un millón de células T OT-1. Específicamente, un millón de células T OT-1 CD8+ fueron etiquetadas con CFSE y transferidas en ratones B6.SJL que fueron inmunizados con ovalbúmina biotinilada (10 yg/inyección) ("OVA") y CSA-4-1BBL (1 g/inyeción) mezclada con OVA biotinilada ( " 41BBL+0VA" ) o conjugados con OVA-biotina/CSA-4-lBBL ( " 1BBL-OVA) . (Figura 10) Este último panel de la figura 10 ( " 41BBL-0VA* " ) muestra la respuesta para 5 µg de CSA-4-1BBL conjugada con 10 yg de OVA biotinilada. Para controles, estreptavidina de núcleo ("SA") se utilizó a nivel equimolar como CSA-4-1BBL.

Como se muestra en la figura 10, los conjugados de 4-1BBL/OVA generaron una respuesta proliferativa potente (73.5%) en células OT-1 cuando se compara con conjugados de "SA/OVA" de control (33.6%) o proteínas únicas no conjugadas, " 1BBL+OVA" (35.5%). La respuesta proliferativa fue dependiente de la dosis puesto que una dosis de 5 µg de CSA-4-1BBL generó una respuesta mucho mejor (94.5%) que una dosis de 1 yg (73.5%). Este ejemplo muestra que la proteína de fusión CSA-4-1BBL incrementó la respuesta proliferativa de células T CD8+ específicas de antígeno, indicando que el const.ru.cto de 4-lBBL-CSA/antígeno biotinilado puede suministrar exitosamente antígeno APCs profesionales y activar estas células para la. generación de una respuesta inmune efectiva.

Ejemplo 4: CSA-4-1BBL Suministra Antígenos a DCs Este ejemplo demuestra que CSA-41BBL efectivamente suministra antígeno a DC . El PE biotinilado se utilizó como un antígeno fluorescente. El PE biotinilado (250 ng) se conjugó con 250 ng CSA-41BBL en hielo por 30 minutos. Células dendríticas Jaws II ( 5xl05/cavidad) se cultivaron por 16 horas con PE biotinilado (250 ng/ml) o conjugado de PE biotinilado/CSA-41BBL . El nivel de PE se detectó usando citometría de flujo. La figura 11A es un histograma que muestra las células PE+ . El área rellenada con gris representa las células no tratadas, la linea de puntos negros representa las células tratadas con PE biotinilado, y la linea negra representa las células tratadas con conjugaod de PE biotinilado/CSA-41BBL . La figura 11B muestra la intensidad de fluorescencia promedio (MFI) de PE para cada tratamiento, y demuestra que las células tratadas con conjugado exhibieron una respuesta significativamente mayor.

Ejemplo 5: CSA-4-1BBL Activa DCs Este ejemplo demuestra que 4-1BBL activa las células dendriticas. Células dendriticas Jaws II ( 5xl05/cavidad) fueron no tratadas y tratadas con 5 g/ml de conjugado de CSA-41BBL o 5 g/ml de lipopolisacárido (LPS) en la presencia de 5 ng/ml de GM-CSF por 48 horas en placas de 24 cavidades. Los niveles de CD86 y MHC clase II se analizaron usando citometría de flujo, como se muestra en la. figura 12A. El área rellenada con gris claro representa las células tratadas con isotipo, el área rellenada con gris oscuro representa las células no tratadas, la linea negra representa células tratadas con CSA-4-1BBL, y la linea de puntos representa células tratadas con LPS. La figura 12B muestra la intensidad de fluorescencia promedio (MFI) de CD86 y MHC clase II, y demuestra que las células tratadas con CSA-4-1BBL exhibieron una respuesta significativamente mayor .

Ejemplo 6: CSA-4-1BBL Suministra Antigenos a DCs y Activa DCs in vivo Este ejemplo demuestra que CSA-4-1BBL suministra antigenos biotinilados a células dendriticas e impulsa estas células a activación in vivo. El OVA biotinilada se puso en contacto con CSA-41BBL para producir un conjugado de OVA biotinilada/CSA-4-lBBL. Este conjugado o un conjugado de OVA biotinilada/CSA se inyectó intravenosamente en ratones C57BL/6 naive. 24 horas después, los animales fueron eutanizados y se recolectaron las células del bazo. La activación de célula dendritica se analizó usando citometria de flujo en poblaciones de célula CDllct. La intensidad de fluorescencia promedio ( FI) de la expresión de CD40, CD86 y HC clase II en células dendriticas de animales naive, tratados con OVA biotinilada-SA, y tratados con OVA biotinilada/CSA-41-BBL fue determinada, como se muestra en la figura 13. Esta figura demuestra que los animales tratados con OVA biotinilada/CSA-41-BBL exhibieron una respuesta significativamente mayor.

Ejemplo 7: CSA-4-1BBL Neutraliza La Función Supresora de, Células Treg Como se discutió anteriormente, las células Treg ' CD4+CD25+FoxP3+ Treg que se presentan naturalmente constitutivamente expresan el receptor 4-1BB y, como tal, 1 responden a estimulación de 4-1BBL. El siguiente ejemplo ¡ demuestra la actividad estimulante de la proteina de fusión i 4-1BBL en células Treg. Las células Teff CD4+CD25+ y células Treg CD4+CD25+ fueron aisladas usando distribución de flujo, se ' cultivaron en una relación 1:1 en la presencia de células singeneicas irradiadas y anticuerpo anti-CD3. Para diferencias entre la proliferación de células T CD4+CD25+ (DP) contra CD4+CD25" (SIP) en experimentos de co- cultivo, las células T CD4+CD25" fueron manchadas con succinimidiléster de diacetato de carboxifluoresceina (CFSE, Molecular Probes, OR) y se usaron en ensayos de supresión. Brevemente, las células se lavaron con PBS, se incubaron en 4 mi de 2.5 µ? CFSE/lxlO6 células (la relación se mantuvo cuando cantidades menores de células fueron etiquetadas) por 7 min a temperatura ambiente. Las células luego fueron incubadas en dos volúmenes de suero bovino fetal por 1 min, y se lavaron 2 veces con PBS para asegurar la remoción de todo el CFSE en exceso. La proliferación fue valorada usando citometria de flujo. Las células Treg no respondieron a estimulación anti-CD3 ya que son anérgicas, pero mostraron proliferación moderada en respuesta a 4-lBBL (Figura 15) . Notablemente, las células Treg inhibieron la respuesta proliferativa de células Teff, un efecto que podrá ser invertido por la adición de 4-lBBL. Esto es consistente con los datos usando células Treg naive, donde el efecto supresor de las células expandidas se neutralizó por la presencia de CSA-4-1BBL (véase posteriormente) . Estos datos confirman los efectos inmunomoduladores de 4-lBBL, y su utilidad para inmunoterapia de cáncer. Por ejemplo, la proteina de fusión 4-lBBL amplifica las funciones de Teff mientras bajo-regula la función inhibidora de células Treg para una respuesta inmune anti-tumor más robusta.

Ejemplo 8: Papel Dual de 4-lBBL El papel de la señalización mediada por 4-1BB/4-1 BBL en la regulación de la función de Treg ha sido el objeto de dos estudios recientes con descubrimientos opuestos. Mientras que un estudio demostró que la señalización de 4-1BB neutraliza la función supresora de células Treg, Choi et al., 2004, J. Leukoc. Biol. 75: 785-91, el otro reportó que la señalización de 4-1BB media la proliferación de Treg sin un efecto principal en su función supresora, Zheng et al., 2004, J. Immonul. 173: 2428-34.

Para aclarar esta discrepancia, el papel de la señalización de 4-1BB en la función de Treg se investigó usando una proteina de fusión CSA-4-1BBL.

Las células T CD4+CD25~ (positivo único; SP) y! CD4+CD25+ (positivo doble; DP) fueron seleccionadas del bazo y nodulos linfáticos de ratones BALB/c naive y se ¦ cultivaron solas o en relación 1:1 por 3 días. Los cultivos ¦ se suplementaron con esplenocitos irradiados, un anticuerpo! anti-CD3 (0.5 g/ml), y las concentraciones de 4- 1BBL o cantidades equimolares de proteina CSA de control se I indican en la figura 14A. Las células T CD4+CD25+ positivo doble (DP) purificadas de ratones BALB/c naive usando distribución de flujo marcadamente inhibieron la respuesta proliferativa de células Teff CD4+CD25" positivo único (SP) inducidas por un anticuerpo contra CD3 en experimentos de' co-cultivo. Este efecto supresor se invirtió efectivamente y específicamente suplementando los cultivos con 1 g/ml de! CSA-4-1BBL, pero no se utilizó CSA de control a un nivel equimolar.

Para probar si la inversión observada de: supresión por la proteína de fusión CSA-4-1BBL es debido a; la restauración de la respuesta proliferativa de células! SP, las células SP fueron etiquetadas con CFSE y se usaron! en experimentos de co-cultivo en la presencia de CSA-4-1BBL (0.5 g/ml) o CSA como una proteina de control. El CSA-4-1BBL incrementó la proliferación de células SP de 44% para control y 46% para proteina CSA a 60%. Las células DP significativamente redujeron la proliferación de células T SP (16%), las cuales se restauraron significativamente (34%) por 4-1BBL, pero no proteina de control CSA (17%) . (Figura 14B) Estos datos demuestran que la proteina de fusión 4-1BBL bajo-regula la función supresora de células Treg. Por consiguiente, el trabajo muestra que la proteina de fusión CSA-4-1BBL manifestó dos actividades opuestas en las células Treg. Por una parte, se sinergizó con anticuerpos anti-CD3 y una IL-2 para promover la expansión de célula Treg. Por otra parte, bloqueó la función supresora tanto de células na ve como Treg activadas, pero solamente cuando las células Treg estuvieron en contacto con la proteina de fusión 4-1BBL, puesto que su remoción del medio de cultivo resultó en recuperación de la función supresora. Este último efecto de 4-1BBL puede tener alguna importancia en el contexto de tumores e infecciones que usan células Treg como mecanismos de evasión inmune.

Ejemplo 9: Uso de Conjugado Antigeno- -1-BBL Como Vacuna Contra Cáncer (a) Producción de transfectores A20 que expresan OVA como una proteina soluble . El constructo OVA descrito anteriormente se transfectó en células A20 usando kit Lipofectamine™ 2000 de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen) . Los transfectores estables se seleccionaron en medio de selección G418, se clonaron e nivel celular único, y se probaron para la expresión de OVA usando Western blots. Los clones con nivel significativo de expresión de OVA son como estimuladores para células T DO11.10 CD4+ especificas para péptido de OVA en ensayos de proliferación de CFSE como se describió con referencia a la figura 10 anterior. Una vez confirmada positiva la expresión de OVA, un millón de células A20 vivas se inyectaron subcutáneamente en el flanco derecho de ratones BALB/c. Los animales se monitorearon para desarrollo de tumor y supervivencia un día su y otro no, y fueron eutanizados cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 20 mm de diámetro. Los animales inoculados con las células A20 parentales servirán como control para crecimiento de tumor. Los transfectores de célula A20 que expresan OVA formarán tumores cuando se inyectan en ratones BALB/c singeneicos. (b) Producción de proteina de fusión CSA-4-1BBL usando sistema DES de insecto. Una proteina CSA-4-1BBL se hizo usando el sistema de expresión DES (Invitrogen) y nuestros protocolos establecidos. Véase, por ejemplo, Singh et al., 2003, Cáncer Res. 63: 4067-73; Yolcu et al., 2002, Immunity 17: 795-808. La proteina de fusión se purificó usando cromatografía de afinidad basado en metal inmovilizado tomando ventaja de la marca 6XHis modificada en la proteína de fusión CSA-4-1BBL. La proteína se desaló, se concentró por ultrafiltración, y se analizó por SDS-PAGE para pureza. Las preparaciones de proteína se valoraron para concentración usando el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce) y se probaron para la presencia de endotoxina usando ensayo de punto final Cromogénico LAL QCL-1000® de Cambrex . (c) Biotinilacion de OVA OVA de pollo, libre de endotoxina, activado por maleimida (Pierce) es biotinilado usando el Kit de Etiquetado con Biotina DSB-X de acuerdo con el protocolo del fabricante (Molecular Probes, San Diego, CA) . Después de diálisis extensa en PBS, la OVA biotinilada se valoró para concentración, nivel de endotoxina, y biotinilacion usando Western blot y estreptavidina conjugada con fosfatase alacalina para sondeo. Si es necesario, la endotoxina será removida usando kit de Remoción de Endotoxina Detoxi-Gel (Pierce) . La OVA biotinilada se; conjugó con la proteina de fusión CSA-4-1BBL. El conjugado de proteina se tomó en alícuotas y congeló a -80°C hasta uso . (d) Uso de Conjugado de OVA biotinilada/CSA-4-l-BBL Como Vacuna contra el Cáncer CSA-4-1BBL y OVA biotinilada se premezclaron en ' PBS a varias relaciones molares, tales como 1:1, 1:5, 1:10, ' 5:1, y 10:1 4-lBBI:OVA, y se inyectaron, intraperitonealmente en un grupo de ratones BALB/c a varias dosis (tal como 10, 50, y 100 ug de OVA) a intervalos de tres semanas. Los animales inyectados con estreptavidina | conjugada con OVA biotinilada, OVA biotinilada sola, u OVA no biotinilado mezclada con CSA-4-1BBL servirán como, controles. Los animales se inmunizaron subcutáneamente con 1 millón de células de tumor A20 vivas en el flanco derecho, se monitorearon para desarrollo de tumor y supervivencia un : día si y otro no, y se eutanízaron cuanto los tumores : alcanzaron un tamaño de 20 mm de diámetro. ; La vacunación con conjugado de OVA : biotinilada/CSA-4-l-BBL generará una respuesta inmune anti- tumor potente, conduciendo a la prevención de crecimiento de tumor. La vacunación con 4-1BBL no conjugado y OVA también puede generar una respuesta, pero cualquier respuesta será menor que aquella generada por el conjugado de antigeno/4-l-BBL . La vacunación con OVA sola o CSA-OVA también puede producir respuestas mínimas, y como tal deberán ser inefectivas en la prevención de crecimiento de tumor .

Ejemplo 10: Vacunación Temprana/Tardía Con Conjugado Antígeno-4-l-BBL Como se discutió anteriormente, los tumores evaden el sistema inmune por varios mecanismos desarrollados durante el transcurso del crecimiento del tumor. La eficacia temprana de los conjugados de la presente invención en la progresión de tumor se demostró por vacunación de animales concurrentemente con inmunización de tumor, cuando los mecanismos de evasión de inmune no se han establecido. La eficacia de los conjugados de la presente invención contra tumores establecidos se demostró por vacunación de animales una vez que los tumores se han establecido, y han desarrollado completamente mecanismos de evasión inmune . (a) Eficacia Temprana en Progresión de Tumor Ratones BALB/c son inmunizados con un millón de células A20 vivas en el flanco derecho y simultáneamente se vacunaron intraperitonealmente con conjugado de OVA biotinilada/CSA-4-lBBL . La vacunación con el conjugado de antigeno/4-lBBL se repitió una vez a la semana por cuatro semanas, por este tiempo el tumor en animales de control alcanzará un tamaño de 10-15 mm de diámetro. Animales no manipulados y animales vacunados con conjugados de CSA-OVA servirán como controles. (b) Eficacia Contra Tumores Estabilizados Ratones BALB/c se inocularon en el flanco derecho con 1 millón de células de tumor A20 vivas. Los animales se monitorearon para desarrollo de tumor y se vacunaron con conjugado de OVA biotinilada/CSA-4-l-BBL cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 4-6 mm de diámetro. El protocolo de vacunación inicialmente involucrará inyecciones intraperitoneales semanales hasta que el tumor ya sea desaparezca o alcance un tamaño de 20 mm de diámetro. Los animales que efectivamente erradican sus tumores serán inmunizados con 2 millones de células A20 vivas 60 días después de la desaparición de tumor para probar la respuesta de memoria. Mientras que no se desea que se una por cualquier teoría, el conjugado antígeno/4-lBBL de la invención puede tener mayor eficacia en la prevención del crecimiento de tumor cuando se administra temprano en la progresión de tumor, cuando se compara con la administración una vez que los tumores se establecen, debido a la carencia de varios mecanismos supresores tempranos en el transcurso de progresión de tumor. No obstante, el conjugado antígeno/4-1BBL mostrará eficacia en la erradicación de tumores establecidos debido al objetivo específico de antígeno a DCs para presentación de antígeno eficiente, activación de DCs para la generación de una señal peligrosa (efecto adyuvante), y bajo-regulación de las funciones supresoras de las células Treg. Además del efecto indirecto en DCs, la inyección repetida con la vacuna puede adicionalmente amplificar el sistema inmune acoplando el receptor 4-lBB en células NK y T activadas, conduciendo a su proliferación vigorosa, supervivencia, y ;memoria de la función de célula T.

Ejemplo 11: Eficacia de Conjugado Antígeno- -1-BBL por Efecto Bystander El siguiente ejemplo demostrará que el conjugado OVA biotinilada/CSA-4-lBBL genera unas respuestas inmunes contra los antígeno de tumor A20 no definidos (diferentes de OVA) , ya sea por efecto bystander o expansión de epítope . Los animales BALB/c se inocularon con A20 que expresa OVA en el flanco derecho y células A20 no modificadas parentales en el flanco izquierdo. Una vez que los tumores son palpables, los animales son vacunados con el conjugado OVA biotinilada/CSA-4-lBBL . Se siguió el programa de vacunación resumido anteriormente, pero se puede modificar como sea necesario para eficacia mejorada. Los animales son monitoreados para el crecimiento de ambos tipos de tumor. Alternativamente, los animales que tienen exitosamente erradicado su tumor después de la vacunación con conjugado OVA biotinilada/CSA-4-lBBL (tal como en el ejemplo anterior) son inmunizados subcutáneamente con 2 millones de células A20 parentales en el flanco opuesto 60 días después de la erradicación de tumores A20 que expresan OVA. La vacuna de conjugado OVA biotinilada/CSA-4-lBBL mostrará eficacia contra tumores A20 parentales que carecen de OVA como un TAA. Por ejemplo, una respuesta inmune efectiva contra OVA conducirá a la aniquilación del tumor, difusión de antigenos de tumor, y captura y presentación por APCs para la generación de respuestas de célula T contra un nuevo conjunto de TAAs . La erradicación de tumores parentales puede adicionalmente ser facilitada por efectos bystander generados contra tumores A20-OVA.

Ejemplo 12: Producción De Antigeno Biotinilado Usando Sistema de Expresión Bacteriano En algunas circunstancias, puede ser ventajoso producir antigenos genéticamente biotinilados para ser usados como el componente antigénico de la vacuna de la presente invención. La tecnología Biotin AviTag de Avidity, Inc. (Denver, CO) se puede usar a este respecto. La Biotin AviTag está comprendida de un péptido único de 15 aminoácidos que es reconocido por la biotina ligasa, BirA, que une la biotina al residuo lisina en la secuencia peptídica. La Biotin AviTag se puede fusionar genéticamente a cualquier proteína de interés, permitiendo que la proteína sea marcada con una molécula de biotina. El ADNc que codifica OVA es subclonado en el vector pAN y pAC para expresar fusiones de Avi-Tag-proteína N-terminales así como C-terminales, respectivamente. La cepa AVB100 E. coli B con un gen birA establemente integrada en el cromosona se transformó e indujo con L-arabinosa para alto nivel de expresión de OVA que porta una marca de biotina. Las proteínas expresadas son purificadas usando un anticuerpo agarosa AviTag. La OVA purificada se valoró para concentración, nivel de endotoxina, y biotinilación usando kit BCA, kit QCL-1000® Chromogenics LALm y Western blot sondeados con estreptavidina conjugada: con fosfatasa alcalina. Si es necesario, la endoxotina es 1 removida usando kit de Remoción de Endotoxina Detoxi-Gel ¡ ( Pierce ) . El OVA biotinilada se conjugó con CSA-4-1BBL como; se describió anteriormente. El conjugado de proteina se ¡ tomo en alícuotas y se congeló a -80°C hasta el uso.

Ejemplo 13: Uso , de Conjugados Antígeno/4-lBBL Que ; Comprenden TERT o Survivina | El conjugado antígeno biotinilado/CSA-4-lBBL ¡ ejemplificado anteriormente con OVA biotinilada/CSA-4-lBBL , se puede usar en cualquier vacuna equipada con cualquier ! antígeno. En el contexto de vacunas contra cáncer, dos TAAs ' humanos universales, transcriptasa inversa de tolomerasa y ¡ survivina, pueden ser componentes antigénicos ventajosos de \ un conjugado antígeno biotinilado/CSA-4-lBBL de la presente ! invención.

Ejemplo 14: Conjugados E7/4-1BBL i Como se discutió anteriormente, un conjugado de : la presente invención que comprende el antígeno E7 de virus : de papiloma humano como el componente antígeno es útil | i contra cáncer cervical. Este ejemplo se relaciona con esta i modalidad específica de la invención. \ (a) Producción de E7 de HPV-16 biotinilada Se utilizó E7 biotinilada como el componente antigénico de un conjugado de acuerdo con la presente invención útil como una vacuna contra HPV. En una modalidad, la proteína E7 de longitud completa es para proporcionar un número máximo de epítopes. Un ADNc que codifica E7 de HPV-16 de longitud completa se clonó por RT-PCR usando ARN total de células TC-1. Después de la verificación de secuencia, el ADNc se subclónó en el vector pMIB/V5-His (Invitrogen) en estructura con la marca 6X-His para expresión constitutiva y secreción en el sistema DES. La proteína secretada se purificó usando una resina de afinidad de metal como se describió anteriormente, la E7 purificada es biotinilada in vitro usando Sulfo-NHS-LC- ; Biotina de Enlace a EZ siguiendo el protocolo del fabricante (Pierce). Brevemente, la E7 concentrada purificada se intercambio de amortiguador en solución ! amortiguada con fosfato (PBS) y se incubó con Sulfo-NHS-LC-Biotina de Enlace a EZ a temperatura ambiente por 1 hora. La biotina no conjugada de removió usando filtración de ' flujo tangencial (Spectrum Labs, NJ) . (b) Producción de Conjugados E7/4-1BBL Un conjugado que comprende E7 y 4-1BBL se produjo . usando E7 biotinilada y una proteína de fusión CSA-4-1BBL, después de los procedimientos generales descritos j anteriormente. Para comparación, una proteina de fusión E7/4-1BBL se produjo como sigue. ADNc que codifica E7 y 4- 1BBL se subclonó en el vector pMIB/V5-His (Invitrogen) en ,: armazón con la marca 6X-His para expresión constitutiva y ! secreción en el sistema DES, y la proteina se expresó y ¦ purificó como se describió anteriormente.

I (c) Actividad de Enlace de Conjugado E7/4-1BBL i El enlace de biotina y la actividad de enlace de receptor 4-1BB del conjugado E7/4-1BL se valoraron como sigue.

Para enlace de biotina, células TC-1 se ' biotinilaron e incubaron con CSA-4-1BBL (100 ng/106 células) en PBS en hielo. Las células se lavaron extensamente con PBS, se mancharon con un anticuerpo etiquetado con fluorocromo contra 4-1BBL, y se analizaron ¡ usando citometria de flujo. Las células biotiniladas conjugadas con CSA sirven como controles.

Para probar el enlace del conjugado o proteina de ; fusión al receptor 4-1BB en células T activadas, los esplenocitos de ratones C75BL/B6 se activaron con 5 yg/ml 1 de concanavalina A (Con A) por 36 horas, se lavaron con PBS ; y se incubaron con varias concentraciones del conjugado o proteina de fusión en hielo. Las células se lavaron extensamente y se mancharon con los anticuerpos etiquetados con fluorocromo apropiados a 4-1BBL, estreptavidina de núcleo, o E7, y se analizaron en citometria de flujo. El enlace del conjugado CSA-4-1BBL a E7 biotinilada se determinó formando primero conjugados usando las proteínas en una relación 1:4 (CSA-4-1BBL : e7 ) , siguiendo la estequiometría del enlace de CSA-biotina, y luego probando los conjugados en un ELISA de intercalación. Brevemente, las proteínas conjugadas se unen a placas de 96 cavidades revestidas con anticuerpo anti-E7, se lavaron, y luego se incubaron con un anticuerpo anti-estreptavidina reactivo para medir la cantidad de complejo E7/4-1BBL presente. Después de confirmar la formación de conjugados, se valoraron para la capacidad de enlazar al receptor 4-lBB en células T activadas como se describió anteriormente.

Ejemplo 13: Respuestas Inmunes Inducidas por Conjugado E7/4-1BBL (a) Optimización de Dosis La optimización de dosis de una vacuna que comprende un conjugado E7/4-1-BBL se puede valorar como sigue. Un conjugado que comprende E7 biotinilada y CSA-4-1BBL se formó mezclando E7 biotinilado y CSA-4-1BBL a dos relaciones (tal como CSA-4-1BBL : E7 de 1:4 y 1:8) usando 1, 10 ó 50 µg de E7 biotinilado. Las cantidades comparables de E7 no biotinilado de control también se usaron. (Estas dosis de E7 se basan en estudios que demuestran que la vacunación con 50 yg de E7 es efectiva para generar una respuesta inmune protectora contra las células TC-1) . Las relaciones óptimas de 4-lBB:E7 y cantidades óptimas de antigeno se pueden determinar y ajustar experimentalmente, valorando las respuestas inmunes a la vacuna bajo varios protocolos, tales como aquellos descritos posteriormente. (b) Análisis de Tetrámero El manchado con tetrámero permite la valoración de la. eficacia de la vacuna con respecto a la expansión de células T CD8+. Ratones hembra C57BL/6 se inyectaron intraperitonealmente con las preparaciones de vacuna descritas anteriormente en PBS. Los ratones inyectados con PBS, CSA-4-1BBL, CSA-4-1BBL + E7 no biotinilada, o proteina de fusión E7-4-1BBL sirven como controles. Una segunda dosis equivalente se dio intraperitonealmente 10 días después, y tres días después de la última vacunación, los esplenocitos se recolectaron y el número de células T CD8+ especificas de E7 se cuantificó usando tecnología de tetrámero y citometría de flujo. Brevemente, los esplenocitos de los animales inmunizados se etiquetaron con anticuerpo FITC-anti-CD8 y PE-tetrámeros de moléculas H2-D de MHC clase I cargadas con el epítope inmunodominante de E7, péptido 49-57 (RAHYNIVTF) . (El tetrámero se puede obtener de los National Institutes of Health Tetramer Facility (Atlanta, GA) ) . Las moléculas H-2Db clase I cargadas con 324-332 péptidos de nucleoproteína de virus Sendai (FAPGNYPAL) sirve como un control negativo. Después del manchado, las células son analizadas por citometria de flujo para cuantificar el porcentaje de células T CD8+' positivas para el tetrámero. (c) Análisis de IFN-? Intrácelular i La caracterización de células T CD8+ inducidas por vacuna para la expresión de IFN-?, una citocina de' identificación para las células T CD8+ efectoras, permite: la valoración de la función de las células T. Ratones C57BL/6 hembra se inyectaron intraperitonealmente con una dosis óptima de vacuna de conjugado E7 biotinilada/CSA-4- 1BBL (determinada como se describió anteriormente) , y 10 días después de que los esplenocitos de animales : inmunizados se recolectaron y co-cultivaron con células TC- , 1 irradiadas que expresan E7 por 5 días, y luego se suplementaron con el inhibidor de transporte Golgi brefeldina A durante la noche. Las células vivas se i recolectaron usando gradientes Ficoll y se incubaron con anticuerpo de receptor Fcy anti-ratón (2.4G2 de Colección: de Cultivo Tipo Americano) por 1 hora seguido por manchado , con anticuerpo anti-CD28 etiquetado con FITC. Las células, luego se fijaron, permeabilizaron, mancharon para anticuerpo anti-IFN-? etiquetado con PE (Pharmingen) y se analizaron por citometria de flujo. Las células manchadas con anticuerpos de isotipo sirven como controles. Los esplenocitos de animales inmunizados con PBS, proteina de fusión E7-4-1BBL, o CSa-4-lBBl + E7 no biotinilada sirven: como controles. (d) Respuesta a Aniquilación 1 La capacidad de las células T CD8+ inducidas por I vacuna para lisar las células TC-1 que expresan molécula E7 se valoró como sigue. Los esplenocitos recolectados de, animales vacunados como se describió anteriormente son co- cultivados en la presencia de 100 ug/ml de proteina E7 por' dias. Los cultivos son suplementados con 50 U/ml de IL-2 exógena para soportar el crecimiento de células T CD8+. Los' i esplenocitos viables son recuperados usando gradientes; Ficoll y se usaron como células efectoras contra células, objetivo TC-1 a varias relaciones de efectora : obj etivo (tal como 1:1, 10:1, 20:1, 40:1, y 80:1) en el ensayo JAM.

Véase, por ejemplo, Singh et al., 2003, Cáncer Res. 63: 4067-73. Debido a que la aniquilación directa de células de: tumor por células T CD8+ es importante para inmunoterapiai de cáncer, la demostración de eficacia en este ensayo adicionalmente soportará la eficacia de la vacuna contra cáncer cervical. (e) Respuesta de proliferación de célula T CD4+ La eficacia de E7 biotinilada/CSA-4-lBBL en la; inducción de una respuesta de célula T CD4+ se valoró como' sigue. Los esplenocitos de los animales inmunizados son etiquetados con CFSE y se co-cultivaron con proteina E7 recombinante bajo las mismas condiciones de cultivo como se describió anteriormente, excepto que la IL-2 no se agregó a! los cultivos. Las células se recolectaron en varios días durante el cultivo, se mancharon con un anticuerpo APC-CD4, y se analizaron para proliferación usando citometria de¡ flujo. Los cultivos sin proteina E7 o con proteína OVA sirven como controles. Debido a que existe un consenso general que una respuesta de célula T CD4+ es importante; para las respuestas de células B y célula T CD8+ , la1 demostración de la eficacia en este ensayo adicionalmente; soportará la eficacia de la vacuna contra cáncer cervical. , (f) Respuesta Humoral La capacidad del tratamiento in vivo con una vacuna de E7 biotinilada/CSA-4-lBBL para generar una respuesta humoral se valoró como sigue. La sangre del ratones vacunados se colectó, y el suero se aisló y utilizó para tamizar placas de ELISA Maxisorb (Nalgene Nunc International) revestidas con proteína El. la IgG anti-E7 e, IgM se detectaron con anticuerpos IgM anti-ratón de cabra e Ig anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano. · Los controles incluyen suero recolectado de animales inmunizados con PBS y proteínas de control tales corno, aquellas descritas anteriormente. La vacuna de conjugado E7 biotinilada/CSA-4-lBBL ' generará respuestas potentes en estos ensayos. La vacunación con proteína de fusión E7-4-1BBL también puede generar una respuesta, pero cualquier respuesta se espera1 que sea de menor magnitud. La vacunación con CSA-4-1BBL más: E7 no biotinilada puede producir una respuesta, pero tal respuesta no será tan fuerte que de la vacuna de conjugado debido a que la absorción del antígeno E7 por APCs será un evento aleatorio, y no tan eficiente como el suministro de objetivo de E7 a APCs logrado por el conjugado.

Ejemplo 16: Eficacia Terapéutica de Conjugado E7/4-1BBL : La eficacia de una vacuna que comprende un' conjugado E7/4-1BBL de la presente invención en la prevención y erradicación de formación de tumor en modelos; de tumor transplantable TC-1 se valoró en dos diferentes ambientes. El primer ambiente involucra la vacunación previo a inyecciones de tumor, cuando los mecanismos de evasión inmune todavía no se han desarrollado. El segundo* ambiente involucra la vacunación contra los tumores establecidos con los mecanismos de evasión inmunes , desarrollados. Los ratones C57BL/6 son inyectados con, células TC-1 para inducir formación de tumor, e ' inyección pre- y post-TC-1 vacunada con conjugado E7 biotinilada/CSA-4-lBBL. Las respuestas inmunes son' valoradas como se describió anteriormente. Los ratones también se monitorearon para desarrollo de tumor y ¡ supervivencia un día si y otro no, y se eutanizaron 1 cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 20 mm de diámetro. (a) Eficacia de Conjugado E7/4-1BBL Contra Inmunización de Tumor Subsiguiente El siguiente ejemplo demostrará que la inmunización con un conjugado E7/4-1BBL de la presente invención genera inmunidad protectora contra una inmunización de tumor subsiguiente. Ratones C57BL/6 hembra se inyectaron intraperitonealmente con PBS solo, CSA-4-1BBL solo, CSA-4-1BBL mezclado con E7 no biotinilada, un conjugado E7 biotinilada/CSA-4-lBBL de la invención, y una proteína de fusión E-7-4-1BBL. Se utilizaron las dosis optimizadas como se describieron anteriormente. Una segunda dosis equivalente se dio subcutáneamente 14 dias después de la primera dosis. Las células TC-1 se recolectaron, resuspendieron en PBS estéril, y se usaron para inyección catorce dias después de la última inmunización. Los ratones se inmunizaron subcutáneamente en el flanco derecho con 1 x 105 células TC-1 (día 0) y se observaron por 60 dias. Como un control para verificar la especificidad del conjugado para tumores E7+, un conjunto de ratones inmunizados se inmunizaron con células de cáncer A20. Los ratones son monitoreados para desarrollo de tumor y supervivencia un ; día si y otro no, y se eutanizaron cuando los tumores . alcanzaron un tamaño de 20 mm de diámetro. Los animales que no desarrollaron tumores son re-inmunizados con 1 x 106 células TC-1 60 dias después de la primera inmunización de tumor para probar la respuesta de memoria. A intervalos de catorce dias, los ratones de cada grupo son sacrificados y sus esplenocitos son recolectados. Los esplenocitos son: usados para determinar las respuestas de célula T CD8+ : usando manchado de tetrámero y manchado de citocinas como<' se describió anteriormente. : (b) Eficacia de Conjugado E7/4-1BBL Contra Tumores Existentes Los efectos terapéuticos de un conjugado E7/4- ¦ IBBL de la presente invención contra tumores pre-existentes se demostraron como sigue. Ratones C57BL/6 hembra se inyectaron subcutáneamente en el blanco derecho con células TC-1 y se vacunaron cuando 100% de los ratones tuvieron tumores palpables. Las vacunas son dosis administradas optimizadas como se describió anteriormente intraperitonealmente cada semana hasta que el tamaño de tumor alcanza 20 mm de diámetro, en este tiempo los ratones son eutanizados. La velocidad de crecimiento de los tumores y morbidez se valoró por 60 días. Además, la supervivencia a largo plazo se valoró y siguió durante 90 días. La vacunación' con un conjugado E7 biotinilada/CSA-4-lBBL de la invención generará una respuesta inmune anti-tumor potente en ambos ambientes, conduciendo a la prevención de crecimiento de tumor y la erradiación de tumores existentes. La vacunación con CSA-4-1BBL no conjugado y E7 con la proteina de fusión E7-4-1BBL también puede generar una respuesta anti-tumor, pero cualquier respuesta será mínima y probablemente inefectiva en la prevención de crecimiento de tumor o erradicación de tumores existentes.

Ejemplo 17: Conjugados Que Comprenden Antígenos de Influenza A ADNc de proteínas de influenza de interés (por ejemplo, Hl, NI, NP y/o MP2) se generaron por: la reacción en cadena de transcriptasa inversa-polimerada , de ARN de influenza A. Los ADNc son subclonados en el vector pCSA, y se transfectaron en células de insecto Drosophila para el establecimiento de transfectores estables . Tomando ventaja de una marca 6X-His fabricada en las proteínas, las proteína Hl, NI, NP y MP2 secretadas se purificaron de medios de cultivo Drosophila usando una resina de afinidad de metal y filtración de flujo; tangencial (métodos y técnicas ya empleados por Apolmmune) . Las proteínas purificadas se analizaron por electroforesis de gel, técnicas de inmunomanchado, espectrometría de masa de desorción/ionización láser; asistida por matriz (MALDI/MS ) , y ultracentrifugación analítica. CSA-4-1BBL (hecho como se describió; anteriormente) se mezcló a una relación molar de 1:4 con: Hl, NI, NP o MP2 biotinilada para formar un conjugado. Antígeno de Influenza A/4-1BBL. Brevemente, la Hl, Ni, NP o MP2 biotinilada se incubó con CSA-4-1BBL por una hora a 4°C. Hl, NI, NP o MP2 no biotinilada se incubaron con CSA-i 4-1BBL para servir como controles no conjugados. Los conjugados se pueden formular en composiciones útiles como vacunas.

Ejemplo 18: Vacunación Contra Influenza A (a) Optimización de Dosificación Ratones C57BL/6 se vacunaron con dosis variadas de los conjugados antigeno de Influenza A/4-1BBL descritos anteriormente. Las respuestas inmunes en los ratones se determinaron usando técnicas inmunológicas estándar incluyendo tecnología de tetrámero, manchado de citocina, ensayos de citotoxicidad, y la medición de respuestas humorales, como se describió anteriormente. Los resultados iniciales se usaron para determinar un régimen de dosificación óptimo para las vacunas. (b) Vacunación Con Inmunización de Infección La eficacia protectora y terapéutica de las vacunas de conjugado antígeno de Influenza A/4-1BBL se demostró en ratones inmunizados con influenza A como sigue. Animales infectados con virus de influenza humana se trataron con vacunas de conjugado antígeno de Influenza A/4-1BBL pre- y post-infección y se midieron los títulos virales para determinar la eficacia de tratamiento. Los pulmones de animales vacunados e infectados con control se recolectaron los días 1, 3, 5, 7, y 9 post-infección . La pérdida de peso se determinó diariamente como una medición indirecta de morbidez.

En otra serie de experimentos, la patología pulmonar se evaluó y los títulos virales pulmonares se determinaron. Para este propósito, los pulmones son homogenizados y los sobrenadantes virales se recolectaron después de centrifugación del homogenado a 1500 x g por 15 min y se congelaron a -80°C hasta análisis subsiguiente. Las diluciones de sobrenadantes virales de pulmones se agregaron a 3xl04 células MDCK/cavidad en una placa de fondo en forma de U de 96 cavidades por 24 horas a 37 °C; los medios se removieron de las cavidades y los medios libres de suero se agregaron. Cuatro días más tarde, los títulos de virus se determinaron usando curva estándar de concentración de virus conocida y el cálculo de Reed-Munch de TCID después de identificar la dilución a la cual los sobrenadantes de cultivo no aglutinan más tiempo glóbulos rojos de pollo.

Ejemplo 19: Porción CD40L Inmuno co-estimulante Las líneas de leucemia THP-1 monocítica humana y linfoma de célula B A20 de ratón usadas en este ejemplo se compraron de la Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC, Rockville, MD, USA) . Las células A20 se cultivaron en DMEM (GIBCO, Gaithersburg, MD, USA) suplementado con 10% suero de bovino fetal inactivado con calor (FBS; Valley Biomedical, Winchester, VA, USA), 12 mM L-glutamina , 100 U/ml de penicilina, 100 µ?/p?? de estreptomicina (todos de GIBCO) y 50 µ? 2-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO, USA) . Las células THP-1 se cultivaron en RP I suplementado con 5% FBS, 100 U/ml de penicilina y 0.1 mM amortiguador Hepes (GIBCO) a 37 °C en un incubador de 5% C02 humidificado . Las células crecieron en suspensión a 37 °C en 5% C02. Las lineas de ovario de hámster chino (CHO) y CHO transfectadas con CD154 de ratón estable (CHO-mCD40L) usadas en este ejemplo se proporcionaron por el Dr. Gail Bishop (Universidad de Iowa) y se mantuvieron en RPMI 1640 (GIBCO) que contiene 100 mM Hepes, 50 pg/ml de gentamicina y 5% FBS. Los monocitos primarios aislados por elutriación de contraflujo de células mononucleares de sangre periférica humana fueron un obsequio del Dr. Larry Wahl (NICDR) . Las lineas celulares de macrófago inmortalizado de ratones agónicos CD40 (linea celular CD40KO) fueron establecidas infectando las células de médula ósea con el retrovirus J2 recombinante murino que contiene los oncogenos v-myc and v-raf como se describió previamente. Véase, por ejemplo, Clemon-Miller et al., 2000, Immunobiol. 202: 477-92. Para la generación de transfectores que expresan CD40 human estable, las líneas transformadas J2 fueron electroporadas con 10 µg de ADN a 600 v, 20 µ seg, y 2 impulsor. Se agregó zeocina (100 µg/ml) al medio 24 horas después de la transfección y las colonias resistentes se mancharon para expresión de superficie de CD40. Las células de alta expresión de CD40 fueron clasificadas usando FACS Vantage SE (Becton Dickinson, San José CA, USA) y se mantuvieron para uso en. estos estudios. (a) Clonación y expresión de Porciones CSA-CD40L El gen que codifica CSA se clonó usando ADN genómico aislado de Streptomyces avidinii como un modelo y cebadores específicos en PCR (a y b en la figura 16) . El dominio extracelular de CD40L humana se clonó usando el primer ADNc de hebra generado de ARN total aislado de linfocitos de sangre periférica humana activados por fitohemaglutinina (PHA) como un modelo y cebadores específicos de CD40L (c y d en la figura 16) en PCR. La CD40L murina se clonó de la misma manera como CSA-hCD40L usando ARN total aislado de esplenocitos de ratón activados con concanavalina A (ConA) . El gen CSA/CD40L luego se subclonó en estructura en el vector inducible por CuS04 pMT/BiP/V5-His para expresión en el sistema de expresión S2 Drosophíla (DES; Invitrogeri, San Diego, CA, USA) . Las células S2 Drosophila fueron transfectadas con 20 µq del vector recomoinante usando kit de Transfección de Fosfato de Calcio de acuerdo con el protocolo del fabricante ( Invitrogen) . Los transfectores estables se establecieron por co-transfección con 1 µq de vector pCoHygro y mantenimiento en la presencia de 30G yg/ml de higromicina. La expresión de las proteínas recombinantes se logró usando sulfato de cobre a una concentración final de 500 µ . Los sobrenadantes de cultivo se colectaron 3 días después de la inducción, se precipitaron con 40% de persulfato de amonio, y se dializaron contra PBS. Las proteínas recombinantes se purificaron usando un método modificado de cromatografía de afinidad de ión metálico como se describió previamente. Véase, por ejemplo, Lehr et al., 2000, Protein Expression Purif., 19: 362-68. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo o proteínas precipitadas se pasaron a través de una columna Pharmacia XK 16 empacada con flujo rápido de sefarosa quelante (Pharmacia Biotech, Upsala, Suecia) y las proteínas recombinantes se eluyeron con 50 mM imidazol. La concentración de proteína se determinó usando método de enlace de tinte Bradford o ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) . (b) Caracterización de Porciones CSA-CD40L por Western blot y ELISA La expresión de CSA-hCD40L se detectó y cuantificó usando el inmunoensayo Quantquina CD40L, el cual usa Abs policlonales específicos para CD40L pre-revestida sobre una microplaca como se describe por las instrucciones del fabricante (R&D Systems) . Para análisis Western blot, los sobrenadantes de CSA-hCD40L y CSA-mCD40L fueron primero fraccionados por electroforesis de gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida bajo condiciones nativas y de [ desnaturalización y luego se transfirieron sobre membranas de difluoruro de polivinilideno usando un aparato de manchado semi-seco (BioRad, Hercules, CA, USA) . Las membranas primero se incubaron en amortiguador de bloqueo y luego en Ab anti-SA de cabra (Pierce, Rockford, IL, USA) a dilución de 1:1000 en el amortiguador de bloqueo por 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas luego se lavaron ; extensamente y se incubaron con anticuerpo anti-cabra ' conjugado con peroxidasa de rábano a diluciones 1:4000 por 1 hora. Finalmente, las proteínas se detectaron usando un sustrato quimioluminiscente de acuerdo con las i instrucciones del fabricante (ECL, Amersham Biosciences, ' UK) . Los transfectores expresaron altos niveles de porciones CSA-CD40L que formaron tetrámeros estables y estructuras de orden mayor bajo condiciones PAGE no desnaturalizadas. La disociación en monómeros ocurrió solamente bajo condiciones de desnaturalización después de calentamiento a 100°C, pero no 60°C. Estos datos demuestran que los polipéptidos CD40L de las porciones co-estimulantes inmunes no interfieren con ,1a expresión doblez apropiado, y existencia de CSA como oligomeros. (c) Ensayos de activación y enlace de receptor Un millón de células THP-1 de macrófago humano o linfoma de célula B A20 de ratón CD40 positivo se incubaron con 200 ng/ml de porciones de CSA-CD40L (humano o ratón) o proteina CSA de control a 4°C por 30 min. Después de varios lavados con PBS, las proteínas de unión se detectaron usando anticuerpo anti-estreptavidina conjugado con FITC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) en citometría de flujo. Se utilizó CSA como un control negativo para detectar el enlace no específico. El efecto de la estimulación con CSA-CD40L en la expresión de moléculas de CD80 y MHC clase II se determinó por cultivo de 0.5 x 106 células THP-1 con 100 ng/ml de CSA-hCD40L o CSA o co-cultivo con 0.5xl06 células CHO transfectadas con la forma de membrana de CD40L por 48 horas. Las células, luego se lavaron y mancharon concentraciones saturadas de anticuerpos anti-CD80 conjugado con FITC (L307.4) y HLA clase II (TU36) (BD-Phar ingen, San Diego, CA, USA) y se: analizaron por citometria de flujo. CSA-mCD40L unida a receptores CD40 tanto humanos como murinos (Figura 17A y B, linea oscura), como se determinó por citometria de flujo y mostró en la figura 17. En contraste, CSA-hCD40L' interactúa solamente con su receptor en células humanas, con enlace mínimo a no1 detectable a células murinas (figura. 17C y D, línea ; oscura), demostrando su especificidad de especie. Estas interacciones fueron específicas de CD40 puesto que no existió enlace detectable cuando se utilizó CSA como una! proteína de control (figura 17, áreas rellenadas de gris). La expresión sobre-regulada de moléculas tanto MHC clase II como CD80 se detectó en la superficie de células THP-1 usando anticuerpos a moléculas HLA clase II 1 (figura 18A) y CD80 (figura 18B) en citometria de flujo en todas las concentraciones de proteína CSA-hCD40L probadas, ! con máxima sobre-regulación lograda a 100 ng proteína/5xl05 células después de 48 horas de estimulación. La CSA-hCD40L (líneas continuas delgadas) fue más efectiva que la forma unidad de membrana de CD40L expresada en células CHO (línea continua gruesa) en la sobre-regulación de moléculas HLA clase II (MFI de 55.8 contra 35.5). En contraste, la sobre-regulación de CD80 por ambas formas de CD40L fue casi comparable (MFI de 33.6 contra 36.2). La expresión sobre-' regulada fue específica para CSA-hCD40L puesto que la incubación con proteína CSA (histogramas continuos) no afectan significativamente la expresión de moléculas CD80 y HLA clase II sobre los niveles base. (d) Preparación de DCs derivadas de médula ósea La médula ósea se levantó de los fémures de ratones de 6 a 8 semanas, se dispersó en células únicas por pipeteado, y los glóbulos rojos fueron lisados con solución potásica de cloruro de amonio (ACK) . Las suspensiones de célula única luego se redujeron a células T y B usando un cóctel de sobrenadantes saturados de cultivo celular de hibridoma de TIB 105, TIB 146 y clon RL-172 por 30 minutos en hielo. (Los sobrenadantes de cultivo fueron un obsequio del Dr. Tatiana Zorina, Universidad de Pittsburgh, PA) . Las células fueron incubadas con complemento de conejo por 30 minutos a 37 °C y se cultivaron durante la noche (37 °C, 5% C02) en medio completo (RPMI 1640, 2 mM L-glutamina, 100 µ?/p?? de penicilina y estreptomicina, 10% FBS, 0.1 mM aminoácidos no esenciales, 1 mM piruvato de sodio, 1 g/ml de indometacina y 50 µ? N-metil-L-arginina) (Sigma) en placas de seis cavidades a una concentración de 106 células/ml. Las células no adherentes se colectaron por pipeteado suave, se contaron, y resuspendieron a una concentración de 105 células/ml en medio completo suplementado con factor estimulante de colonia de macrófagos-granulocitos murino recombinante (5 ng/ml) y mIL-4 (5 ng/ml) (Todos de US Biological, Swampscott, MA, USA) . Las células se cultivaron en placas de seis cavidades (4 ml/cavidad) por 5 días. En el quinto dia, las DCs presentes en el cultivo se tipearon para la expresión de MHC de superficie celular y moléculas co-estimulantes y se incubaron con concentraciones variadas (01-0.5 ug/106 células) de CA-rnCD40L, medio solo, o CSA. Las células se recolectaron en varios días y se analizaron para la expresión de marcadores de maduración usando anticuerpo monoclonal etiquetado con PE (HL3) contra mAba etiquetados con CDllc y FITC a CD80 (16-10A1) y CD86 (GLl) (todos de PharMingen) . Las células dendriticas inmaduras de cultivos de médula ósea murina de dia 5 que fueron incubadas con varias concentraciones de CSA-CD40L de ratón (01-0.5 g/106 células) por 48 horas mostraron expresión incrementada de moléculas co-estimulantes tanto de CD80 como CD86 (figura 19A y B) , con el efecto en la sobre-regulación de expresión de CD80 mayor que aquella para CD86 (3 contra 2 veces) a 0.2 µg de concentración de proteina por 106 células. Concentraciones mayores de proteínas de fusión CSA-CD40L o períodos de incubación más largos no resultan en sobre-regulación adicional (datos no mostrados) . Este efecto fue específico para la porción inmuno co-estimulante debido a que las células incubadas con proteína CSA tienen cambios mínimos a no detectables en la expresión de moléculas coestimulantes sobre niveles base. (e) Análisis de producción de citocina pro-inflamatoria Los monocitos humanos fueron colocados en placas en placas de microtitulación de 96 cavidades y estimulados usando 1 pg/ml de una CD40L humana recombinante trimérica comercialmente disponible (rhsCD40L) + 1 g/ml de mejorador (Alexis Biochemicals , San Diego, CA, USA) y 100 ng/ml de CSA-hCD40L, CSA-mCD40L, o CSA. Los sobrenadantes se recolectaron después de 18 horas de incubación y se valoraron por ELISA usando los equipos OptEIA™ para todas las citocinas (PharMingen) . El análisis se realizó usando lector de microplaca de precisión E-max (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) . : La ligación de monocitos humanos con CSA-hCD40L| resultó en una estimulación de 5 partes de producción de IL-?ß humana arriba de CSA sola, la cual es equivalente a los niveles inducidos por rhsCD40L (figura 20A y B) . De; manera similar, la estimulación de monocitos humanos con! CSA-mCD40L resultó en una estimulación robusta de IL-6 humana (figura 20C y D) . Por consiguiente, las proteínas de fusión CSA-CD40L humanas y murinas son ambas capaces de estimular CD40 en monocitos humanos para producir IL-?ß e IL-6. (f) Ensayo de protección AENsa El análisis de la síntesis de ARNm de citocina se realizó por ensayo de protección ARNsa. Las células se colocaron en placas en una placa de 6 cavidades y se estimularon vía CD40 usando porciones CSA-CD40L por 3 a 4, horas. Los transfectores CHO que expresan CD40L y rhsCD40L con mejorados se utilizaron como controles. El ARN se' extrajo usando Trizol como se describe por las instrucciones del fabricante (Invitrogen) . El ARN (5 g) se hibridizó con una sonda radioetiquetada generada del, conjunto de modelo de ARN/citocina humana, mCK-3b (RiboQuant, BD-PharMingen, San Diego, CA, USA), a 55°C durante la noche. El tratamiento con ARNsa se realizó a 37°C por 45 minutos, después del cual la sonda protegida se purificó y redisolvió por electroforesis usando un gel de, poliacrilamida a 5% (BioRad) en amortiguador TBE. El gel se secó y expuso a película de rayos X Kodak Biomax XL (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA) . Con la sonda no digerida como marcadores, una curva estándar se garficó como distancias de migración contra longitud de nucleótido en papel semi-logarítmico . La identidad de las bandas; protegidas con ARNsa en las muestras luego se extrapoló de^ la gráfica. Como se muestra en la figura 20D, la estimulación con CSA-hCD40L resultó en un incremento de 2.8 veces de ARNm de IL-6 sobre CSA sola. Tomando conjuntamente estos datos indican que las CSA-CD40L tanto humanas como murinas son capaces de inducir la señalización de CD40 en monocitos y macrofagos. (g) CSA-hCD40L Estimula la producción de iNOS en macrofagos cebados con IFN-? La ligación de CD40 de macrofagos cebados con IFN-? resulta en la estimulación de producción de óxido nítrico, el cual juega un papel crítico en las actividades microbicidas y citotóxicas de macrofagos. La óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) pertenece a una familia de óxido nítrico sintasa que cataliza la síntesis de óxido nítrico de L-arginina. Las células colaboradoras T Thl y Th2 pueden regular de manera diferencial el metabolismo de arginina en macrofagos. Las células Thl inducen la producción de iNOs por macrofagos mientras que las células Th2 inducen los macrofagos para producir arginasa la cual está asociada con la función anti-inflamatoria . Por consiguiente, la producción de iNOS por macrófago es un sello distintivo de un tipo Thl de respuesta inmune. La capacidad de las porciones CSA-CD40L para estimular la producción iNOS en macrófagos murinos se demostró como sigue. Células CD40 de CD40KO humana se cebaron por 24 horas con IFN-? y posteriormente se estimularon con CSA-hCD40L, rhsCD40L, o CSA sola por 24 h. Los lisados de célula se normalizaron y analizaron por Western blot usando Ab anti-iNOS. Como se demostró en la figura 21, la estimulación de macrófagos con CSA-hCD40L o rhsCD40L, pero no CSA, resultó en la estimulación de producción de iNOS. La estimulación con 1 yg/ml de rhsCD40L comercial resultó en una estimulación de 6 veces de iNOS sobre lo antecedente, mientras que la estimulación con 300 ng/ml de CSA-hCD40L resultó en una estimulación de 9 veces de iNOS sobre CSA sola. Estos datos indican que CSA-hCD40L es un estimulador potente de producción de iNOS por macrófago .

Ejemplo 20: Respuesta de Aniquilación In Vivo Inducida por CSA-4-1BBL Ratones C57BL/6 fueron inmunizados intravenosamente con 50 yg de ovalbúmina (OVA) como el antigeno, y dos dosis (12.5 yg y 25 g, respectivamente) de CSA-4-1BBL o LPS como un adyuvante. Los animales naive se utilizaron como un control. Siete dias más tarde, todos los ratones recibieron células objetivo etiquetadas con CFSE, las cuales fueron preparadas como sigue. Los esplenocitos de ratones C57BL/6 naive fueron divididos en dos poblaciones. La primer población se etiquetó con 0.25 µ? CFSE (CFSElow) y la segunda población se etiquetó con 2.5 µ? CFSE y luego fue sometida a impulsos con 2 ug/ml de péptido OV .2S7-26 (SIINFEKL) por 1 hora (CFSEhi) . Las células se mezclaron a una relación de 1:1 y un total de lxlO7 células se inyectaron intravenosamente en animales receptores. Los bazos fueron recolectados 48 horas más tarde, y la intensidad de fluorescencia CFSE se analizó por citometria de flujo. Los resultados se muestran en la figura 22, expresados como el porcentaje de lisis del pico de CFSEhl impulsado por péptido cuando se compara con el pico de CFSElow de referencia, normalizado a animales naive. Como se muestra en la figura 22, la inmunización con OVA y CSA-4-1BBL generó una respuesta de aniquilación in vivo potente en células objetivo, y CSA-4-1BBL demostró un efecto adyuvante más fuerte que LPS a ambas concentraciones probadas .

Ejemplo 21: La co-estimulación con 4-1BBL mejoró grandemente la respuesta inmune a protel.na E7 de HPV16 en ratones, tumores TC-1 controlados, y memoria anti-tumor inducida . Ratones B6 naive fueron inmunizados subcutáneamente en el flanco derecho con lxlO5 células TC-1 vivas las cuales expresan de manera estable la proteina E7 de virus de papiloma humano-16, en un protocolo de vacunación basado en la administración del epitope de célula T CD8+ del epitope Pl de E7 de HPV16 (que tiene la secuencia de aminoácido RAHYNIVTF) . La figura 23 muestra la supervivencia de ratones en este modelo de tumor TC-1. Después de 10 dias, los ratones recibieron una inyección subcutánea ya sea de (i) PBS (?, n=20); (ii) 50 g P1+ 12.5 g CSA (¦, n=6) (iii) 25 pg CSA-4-1BBL (A, n=10); (iv) 50 g P1+ 25 ug CSA-4-1BBL (?, n=13), o (v) 50 ug P1+ 10 yg CpG (?, n=7) . Como se muestra en la figura 23, la inmunización con Pl o CSA-4-1BBL logró alguna inmunoterapia exitosa, pero mejores resultados (incluyendo supervivencia mejorada) se lograron por inmunización tanto con Pl como CSA-4-1BBL. Todos los animales que recibieron solamente PBS desarrollaron tumores. Los animales sobrevivientes se volvieron a inmunizar el día 60 (flecha negra). El crecimiento de tumor se monitoreó 3 veces una semana. La administración de CSA-4-1BBL y Pl conjuntamente después de que el tumo inmunizado significativamente incrementa la supervivencia de animales comparados a Pl o CSA-4-1BBL solo, o Pl y CpG. De manera importante, ninguno de los animales sobrevivientes en el grupo Pl + CSA-4-1BBL desarrolló tumor en la segunda inmunización, demostrando memoria inmunológica .

Ejemplo 22: Vacunación con 0VA/CSA-4-1BBL Previene el Crecimiento del Tumor Los ratones na ve C57BL/6 se inmunizaron con 50 µg OVA o 50 pg de OVA biotinilado conjugado a 25 µg de CSA-4-1BBL. Algunos animales no fueron tratados como controles. Después de 7 días, los ratones se inmunizaron subcutáneamente en el flanco derecho con lxlO5 células de tumor EG.7 que expresan OVA. El crecimiento de tumor se monitoreó tres veces una semana usando calibradores. Los resultados (supervivencia libre de tumor) como se muestra en la Figura 24. Como se muestra, todos los animales de control y animales vacunados con OVA desarrollaron tumores, mientras que todos los animales vacunados con OVA/CSA-4-1BBL biotinilado no desarrollaron tumores, demostrando1 que la vacunación con OVA/CSA-4-1BBL biotinilado resulta en 100% de prevención del crecimiento de tumores de, tioma .

Ejemplo 23: 4-1BBL mejora fuertemente la respuesta in vivo' de CTL especifica al antigeno. Los ratones na'i've C57BL/6 se inmunizaron intravenosamente con (i) 50 pg de OVA, (ii) 50 \iq de OVA y de CSA-4 -1BBL, (iii) 50 µg de OVA y 25 g de anticuerpo de anti-CD137 o (iv) 50 µ? de OVA y 25 ? de LPS. Los animales naive se usaron como control. Algunos días más tarde, todos los ratones recibieron células objetivo etiquetadas con CFSE. Brevemente, los esplenocitos de naive C57BL/6 se dividieron en dos poblaciones. La primera población se etiquetó con 0.25 µ? de CFSE (CFSElow) . La segunda población se etiquetó con 2.5 µ? de CFSE y luego se impulsaron con 2 yg/ml del péptido SIINFEKL OVA257-264 por 1 hora (CFSEhi) . Las células se mezclaron a una relación de 1:1 y un total de IxlO7 células se' i inyectaron intravenosamente en animales receptores. Los bazos se recolectaron 48 horas más tarde y la intensidad fluorescente de CFSE se analizó por citometria de flujo, con los resultados mostrados en la Figura 25. Los resultados se expresaron en la esquina de cada panel como porcentaje de lisis del pico de CFSEhi impulsado con! péptido cuando se compara con el pico de CFSElow de; referencia normalizado al animal naive. Este ensayo revela. que 4-lBBL podría mejorar la respuesta de CTL específica de^ antígeno a niveles superiores (95%) comparado con el antígeno (OVA) solo (24.2%), o antígeno y LPS (35%),: resultando en la aniquilación de la mayoría de células objetivo .

Ejemplo 24: La co-estimulación de 4-1BBL incrementa la presentación de antigeno a células T CD8+ en vivo. Los animales nalve ?ß-SJL (CD45.1+) se inmunizaron intravenosamente con (i) 10 µg de OVA, (ii) 10 g de OVA y 5 g de 4-1BBL, o (iii) se dejaron sin tratar. Después de 2 días, los animales recibieron 1x106 células OT-1 etiquetadas con CFSE (CD45.2+) por inyección intravenosa. El bazo se recolectó 3 días más tarde y la proliferación de células OT-1 se analizaron usando citometria de flujo, como se muestra en la Figura 26. La administración de 4-1BBL conjuntamente con el antigeno incrementa la presentación de antigeno a células T CD8+ como se demuestra por la proliferación de mayoría de células OT-1. (83.2% para OVA + 4-1BBL; 13.7% para OVA; 8.8% sin tratamiento).

Ejemplo 25: La coestimulación de 4-1BBL incrementa la absorción de antígeno por células dendríticas Los ratones na'i've BALB/c se inyectaron subcutáneamente con 25 g de OVA-FITC, 25 yg de OVA-FITC y 10 iq CSA, o 25 \iq de OVA-FITC y 25 µ? de CSA-4-1BBL. Después de 3 horas, los nodos linfáticos inguiniales en el sitio de inyección se recolectaron. Las células FITC+ en población CDllc+ se analizaron usando citometria de flujo para determinar in vivo la actualización del antígeno fluorescentemente etiquetado, como se observa en la Figura 27. Como se muestra, la señalización de 4-1BBL incrementa la absorción de antígeno por CDllc+ DCs mientras que la proteína de CSA de control no tuvo efecto. Aunque la invención se ha descrito y ejemplificado con suficiente detalle por aquellos expertos en esta técnica para hacer y usarla, varias alternativas, modificaciones, y mejoramientos deberán ser evidentes sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Los ejemplos provistos en la presente son representativos de modalidades preferidas, son ejemplares, y no se proponen como limitaciones en el alcance de la invención. Las modificaciones en la presente y otros usos ocurrirán para aquellos expertos en la técnica. Estas modificaciones se incluyen dentro del espíritu de la invención y se definen por el alcance de las reivindicaciones. Será fácilmente evidente para una persona experta en la técnica que sustituciones y modificaciones diversas se pueden hacer a la invención descrita en la presente sin apartarse del alcance y espíritu de la invención. Todas las patentes , y publicaciones mencionadas en la especificación son indicativas de los niveles de aquellos de experiencia ordinaria en la técnica a la cual la invención pertenece. Todas las patentes y publicaciones se incorporan en la presente como referencia a la misma extensión como si cada publicación individual fue indicada de manera especifica e individualmente para ser incorporada como referencia. La invención descrita ilustrativamente en la presente convenientemente puede ser practicada en la ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones las cuales no se describen específicamente en la presente. Así, por ejemplo, en cada caso aquí cualquiera de los términos "que, comprende", "que consiste esencialmente de" y "que consiste de" puede ser remplazado con cualquiera de los otros dos términos. Los términos y expresiones los cuales se han empleado se usan como términos de descripción y no de limitación, y no existe intención de que en el uso de tales términos y expresiones se excluyan cualesquiera equivalentes de las características mostradas y descritas o porciones de las mismas, pero se reconoce p que varias modificaciones son posibles dentro del alcance de la invención reivindicada. Así, se entenderá que aunque la presente invención se ha descrito específicamente por modalidades preferidas y características opcionales, modificación y variación de los conceptos en la presente descritos pueden ser recurridos por aquellos expertos en la técnica, y que tales modificaciones y variaciones se considera que están dentro del alcance de esta invención como se define por las reivindicaciones anexadas. Otras modalidades ejemplares se describen posteriormente y en las reivindicaciones que siguen:

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN
Habiéndose descrito la presente se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:
REIVINDICACIONES 1. Una combinación, caracterizada porque comprende: (a) un primer conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado que comprende un primer polipéptido inmuno co-estimulante y (ii) un miembro de conjugado que comprende un primer miembro de un par de enlace; y (b) un segundo conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado que comprende un primer antigeno y (ii) un miembro de conjugado que comprende un segundo miembro del par de enlace. 2. La combinación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el primer miembro del par de enlace comprende avidina o estreptavidina y el segundo miembro del par de enlace comprende biotina. 3. La combinación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el primer polipéptido inmuno co-estimulante se selecciona del grupo que consiste de 4-iBBL, CD86, ICOSL, PD-L1, PD-L2, B7-H3,
B7-H4, OX40L, CD27L, CD30L, LIGHT , BAFF, APRIL, CD80 y' CD40L. 4. La combinación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el primer antigeno; se selecciona del grupo que consiste de antigenos asociados con un agente infeccioso y. antigenos asociados con. tumor.
5. Una combinación, caracterizada porque comprende : (a) un primer conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado que comprende un primer polipéptido inmuno co-est imulante y (ii) un. miembro de conjugado que comprende un primer miembro de un par de enlace; y (b) un segundo conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado que comrpende un antigeno asociado con un agente infeccioso o un agente infeccioso y (ii) un miembro de conjugado que comprende un segundo miembro del par de enlace.
6. La combinación de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el agente infeccioso se selecciona de bacterias, virus y parásitos.
7. Un método para generar o mejorar una respuesta inmune contra un tumor el cual expresa un primer antigeno asociado al tumor, caracterizado porque comprende administrar a un paciente con el tumor: (a) un primer conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado que comprende un primer polipéptido. inmuno co-estimulante y (ü) un miembro de conjugado que comprende un primer miembro de un par de enlace, y un segundo conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado que comprende el primer ant.ige.no asociado al tumor y (ii)' un miembro de conjugado que comprende un segundo miembro' del par de enlace; o (b) células inmune las cuales se han tratado in vitro con los primero y segundo conjugados.
8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el primer miembro del par de enlace comprende avidina o estreptavidina y el segundo miembro del par de enlace comprende biotina.
9. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el primer polipéptido inmuno coestimulante se selecciona del grupo que consiste de 4-1BBL, CD86, ICOSL, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, APRIL, CD80 y CD40L.
10. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el paciente se selecciona del grupo que consiste de especies equina, ovina, caprina, bovina, porcina, aviar, canina, felina y primate .
11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el paciente es humano .
12. Un método para modificar células inmunes para generar o mejorar una respuesta inmune a un tumor que expresa un antigeno asociado al tumor o a un agente infeccioso, caracterizado porque comprende poner en contacto las células inmunes que expresan un receptor para un primer polipéptido inmuno co-estimulante con: (a.) un primer conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado que comprende el primer polipéptido! inmuno co-estimulante y (ii) un miembro de conjugado que comprende un primer miembro de un par de enlace; y (b) un segundo conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado que comprende un antigeno asociado con el tumor o agente infeccioso o el agente infeccioso y (ii) un miembro de conjugado que comprende un segundo miembro del par de enlace, en donde el primer conjugado se conjuga a las células inmunes vía el enlace entre el polipéptico inmuno co-estimulante y el receptor, y el segundo cojugado se conjuga a la célula inmune vía el enlace entre los primer y segundo miembros de par de enlace.
13. Una célula inmune modificada que expresa un receptor para un primer polipéptido inmuno co-estimulante, caracterizada porque la célula inmune modificada comprende: a) un primer conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado que comprende el primer polipéptido inmuno co-estimulante y (ii) un miembro de conjugado que comprende un primer miembro de un par de enlace; y (b) un segundo conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado que comprende un primer antigeno o agente infeccioso y (ii) un miembro de conjugado que comprende un segundo miembro del par de enlace, en donde el primer conjugado es conjugado a la célula inmune vía el enlace entre el polipéptido inmuno co-estimulante y el receptor, y el segundo conjugado se conjuga a la célula inmune vía el enlace entre los primer y segundo miembros de par de enlace.
14. Un método para inducir o mejorar una respuesta inmune contra un agente infeccioso, caracterizado porque comprende administrar a un paciente que sufre o está en riesgo de infección con el agente infeccioso: a) un primer conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado que comprende un primer polipéptido inmuno co-estimulante y (ii) un miembro de conjugado que comprende un primer miembro de un par de enlace; y b) un segundo conjugado que comprende (i) un miembro de conjugado que comprende un primer antígeno asociado con el agente infeccioso o que comrpende el agente infeccioso y (ii) un miembro de conjugado que comprende un segundo miembro del par de enlace.
15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el paciente se selecciona del grupo que consiste de especies equina, ovina, caprina, bovina, porcina, aviar, canina, felina y, primate.
16. El método de conformidad con la: reivindicación 15, caracterizado porque el paciente es humano .
17. Un conjugado que comprende un polipéptido' inmuno co-estimulante y avidina o estreptavidina, caracterizado porque el polipéptido inmuno co-estimulante se selecciona del grupo que consiste de 4-1BBL, CD86, ICOSL, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, 0X 0L, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, APRIL, C.D80 y CD40L.
18. Un método para inducir una respuesta inmunoest imulante en un animal, caracterizado porque comprende administrar al animal un conjugado que comprende un polipéptido inmuno co-estimulante y avidina o estreptavidina .
19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el método adicionalmente comprende administrar un antigeno al animal.
20. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el animal se selecciona del grupo que consiste de especies equina, ovina, caprina, bovina, porcina, aviar, canina, felina y primate .
21. Una combinación, caracterizada porque comprende : (a) un conjugado que comprende un polipéptido inmuno co-estimulante 4-lBBL y avidina o estreptavidina y (b) un antigeno.
22. La combinación de conformidad con la revindicación 21, caracterizada porque el antigeno se selecciona del grupo que consiste de (a) un antigeno asociado al tumor y (b) un agente infeccioso o un antigeno asociado con un agente infeccioso.
23. La combinación de conformidad con la reivindiación 21, caracterizada porque el antigeno se une al conjugado 4-lBBL.
24. La combinación de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el antigeno se conjuga a una porción biotina, para formar un conjugado de antígeno-biotina , y adicionalmente en donde el conjugado de antigeno-biotina se une al conjugado 4-lBBL via la porción biotina .
25. La combinación de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el antigeno no se une al conjugado 4-lBBL.
26. Un conjugado, caracterizado porque comprende un polipéptido inmuno co-estimulante 4-1BBL y avidina o estreptavidina .
27. El conjugado de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 8.
28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7, 12, 13 ó 14, caracterizado porque: el primer conjugado comprende 4-l.BBL conjugado a avidina o estreptavidina.
29. El método de conformidad con la' reivindicación 18, caracterizado porque el polipéptido inmuno co-estimulante es 4-1BBL.