MX2008003296A

MX2008003296A - Canales quimericos hcn.

Info

Publication number: MX2008003296A
Application number: MX2008003296A
Authority: MX
Inventors: Michael R Rosen; Peter R Brink; Richard B Robinson; Ira S Cohen
Original assignee: Univ Columbia
Priority date: 2005-09-09
Filing date: 2006-09-11
Publication date: 2008-10-23
Also published as: JP2009507494A; CA2621973A1; EP1931783A1; US20070099268A1; WO2007030834A1

Abstract

Esta invención proporciona un polipéptido quimérico (HCN) regulado por nucleótidos cíclicos activados por hiperpolarización que consta de porciones de más de un tipo de canal HCN. La invención también proporciona métodos para tratar a un sujeto afectado con un trastorno de ritmo cardiaco que consiste de la manifestación del polipéptido quimérico HCN en una región de corazón seleccionada para así inducir una corriente de marcapasos en el corazón y por consiguiente tratar al sujeto.

Description

CANALES QUIMERICOS HCN La invención que aquí se revela se hizo con el apoyo del Gobierno de los Estados Unidos bajo la Concesión NIH No. HL-28958 de los Institutos Nacionales de Salud. Por consiguiente el Gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en esta invención.

Esta aplicación reivindica el beneficio de la Aplicación Provisional de los Estados Unidos Nos. 60/832,515, presentada el 21 de julio del 2006, 60/781 ,723 presentada el 14 de marzo del 2006, y 60/715,934, presentada el 9 de septiembre del 2005, y No. Serial de Estados Unidos 1 1/490,997, presentado el 21 de julio del 2006, el contenido completo de tales se encuentra incorporado en este documento como referencia. A través de esta aplicación, se hace referencia de varias publicaciones en paréntesis por nombre de autor y fecha, número de patente, o número de publicación de patente. Se pueden encontrar menciones completas de estas publicaciones al final de la especificación justo antes de las reivindicaciones. Las revelaciones de estas publicaciones en su totalidad se encuentran incorporadas como referencia en esta aplicación para poder describir completamente la vanguardia a aquellos expertos en la materia a partir de la fecha de la invención descrita y reivindicada aquí. Sin embargo, la mención de una referencia en este documento no se debe interpretar como un reconocimiento que tal referencia sea conocimiento previo a esta invención. Área de la Invención Esta invención se relaciona a polipéptidos quiméricos (HCN) regulados por nucleótidos cíclicos activados por hiperpolarización, que consta de porciones derivadas de más de una isoforma HCN, y a la manifestación de estos polipéptidos quiméricos en el corazón para inducir una corriente de marcapasos ahí mismo y por consiguiente tratar trastornos de ritmo cardiaco.

Antecedentes De La Invención El corazón mamífero genera un ritmo que es de origen miogénico. Todos los canales y transportadores que son necesarios para generar el ritmo del corazón residen en los miocitos. Variaciones regionales en la abundancia o características de estos elementos son tales que el ritmo se origina en una ubicación anatómica específica, el nódulo sinusal. El nódulo sinusal consiste de solamente unas miles de células de marcapasos eléctricamente activas las cuales generan impulsos eléctricos rítmicos espontáneos que subsecuentemente se propagan para inducir contracciones de músculo coordinadas de las aurículas y los ventrículos. El sistema nervioso autónomo modula el ritmo, pero no lo inicia.

El malfuncionamiento o pérdida de células de marcapasos puede ocurrir debido a una enfermedad o al envejecimiento. Por ejemplo, el infarto agudo de miocardio mata a millones de personas cada año y generalmente causa en sobrevivientes reducciones marcadas en número de miocitos y función de bombeo cardiaco. Los miocitos cardiacos de adultos raramente se dividen, y las reacciones usuales a la pérdida de célula de miocito incluyen hipertrofia compensatoria y/o insuficiencia cardiaca congestiva, una enfermedad con una mortandad anual significante.

Los marcapasos electrónicos son dispositivos que salvan vidas, los cuales proporcionan latidos del corazón regulares en configuraciones, donde el nódulo sinusal, la conducción auriculoventricular, o ambos, han fallado. También se han adaptado para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva. Una de las principales indicaciones para el tratamiento de marcapasos electrónico es el alto grado de bloqueo cardiaco, tal que un impulso del nódulo sinusal con función normal no puede propagarse al ventrículo. El resultado es un paro ventricular y/o fibrilación, y muerte. Otra indicación importante para el tratamiento de marcapasos electrónico es la disfunción del nódulo sinusal, en el que el nódulo sinusal falla en iniciar un latido de corazón normal, de ese modo comprometiendo el rendimiento cardiaco. A pesar de su utilidad para tratar el bloqueo cardiaco y/o disfunción del nódulo sinusal, los marcapasos electrónicos tienen ciertas desventajas, incluyendo el requerimiento de un monitoreo y mantenimiento regular, y su respuesta inadecuada a las exigencias de ejercicio o emoción (Rosen et al., 2004; Rosen, 2005; Cohén et al., 2005). Entonces, aunque los marcapasos electrónicos representan un excelente alivio médico, no son una cura (Rosen et al., 2004). Por lo tanto existe la necesidad de desarrollar alternativas que reproduzcan de una manera más completa su función normal, por ejemplo, mostrando receptividad autónoma, y finalmente proporcionar una cura (Rosen et al., 2004).

Como una solución terapéutica, un marcapasos biológico, basado en la manifestación de un canal iónico en el corazón, se puede usar para generar un ritmo espontáneo dentro del rango fisiológicamente aceptable. Uno de los puntos clave para avanzar en el campo del marcapasos biológico es la identificación de uno o más canales iónicos que (1) optimicen el ritmo cardiaco de tal forma que no ocurran pausas excesivamente largas seguidas de una falla repentina de ritmos endógenos, e (2) induzcan ritmos que tengan ritmos básales fisiológicamente bajos al mismo tiempo que mantengan una respuesta adecuada a las catecolaminas y a la acetilcolina. Estudios previos se han enfocado por dos razones en los canales iónicos HCN) regulados por nucleótidos cíclicos activados por hiperpolarización, responsables de la corriente de marcapasos Jf (Biel et al., 2002): primero, los canales de corriente iónica HCN inician la actividad de marcapasos en el corazón de un mamífero; y segundo, las catecolaminas aumentan la activación de estos canales y la acetilcolina la desacelera, haciendo a los canales autonómicamente receptivos. La receptividad autónoma claramente debe ser un punto principal de la actividad de marcapasos en el corazón; aunque, la falta de esto es una deficiencia clave de los marcapasos electrónicos.

Esta invención se relaciona a la producción de canales quiméricos HCN los cuales muestran características mejoradas, en comparación a los canales de tipo salvaje HCN, y al uso de estos canales quiméricos para los marcapasos biológicos y para el tratamiento de trastornos de ritmo cardiaco.

Breve Síntesis de la Invención La invención que se revela aquí proporciona un polipéptido quimérico HCN que consta de porciones derivadas de más de una isoforma de canal HCN. En representaciones preferidas, estas porciones son una porción de terminal amino, una porción intra membranosa, y una porción de terminal carboxílica. En ciertas representaciones, por lo menos una porción de la quimera HCN se deriva de una especie animal el cual es diferente a la especie animal del que se deriva por lo menos una de las otras dos porciones. En algunas representaciones, la porción intra membranosa se deriva de un canal HCNI, o es D140-L400 de hHCNI con la secuencia establecida en ID SEC No. , o es D129-L389 de mHCNI con la secuencia establecida en ID SEC No. . En ciertas representaciones, la porción de terminal amino se deriva de HCN2, HCN3 o HCN4 y la porción de terminal carboxílica se deriva de HCN2, JHLCN3 o HCN4. En una representación preferida, la porción de terminal amino se deriva de HCN2 y la porción de terminal carboxílica se deriva de HCN2. Preferiblemente, el polipéptido quimérico HCN proporciona una característica mejorada en comparación al canal de tipo salvaje HCN, seleccionado del grupo que consta de cinéticas más rápidas, una activación más positiva, expresión aumentada, estabilidad aumentada, receptividad cAMP mejorada, y respuesta neurohumoral mejorada. Las quimeras ejemplares incluyen mHCNI 12, mHCN212, mHCN312, mHCN412, mHCNI 14, mHCN214, mHCN314, mHCN414, hHCNI 12, hHCN212, hHCN312, hHCN412, hHCNI 14, hHCN214, hHCN314, o hHCN414.

En ciertas representaciones, porciones de las quimeras además contienen un canal muíante HCN. Por ejemplo, el canal muíanle HCN puede coníener una mutación en una región del canal seleccionado del grupo que consta del enlazador S3-S4, sensor de voltaje S4, enlazador S4-S5, S5, S6, y del enlazador S5-S6, enlazador C, y del dominio vinculante de nucleótido cíclico ("CNBD") íerminal C. Los canales muíanles ejemplares se derivan de mHCN2 con la secuencia establecida en ID SEC No. , e incluyen E324A-mHCN2, Y331A-mHCN2.

R339A-mHCN2, y Y331A, E324A-mHCN2. Canales mulantes ejemplares, que se derivan de mHCNI con la secuencia establecida en ID SEC No. , incluye mHCNI-???. Esta invención también proporciona un ácido nucleico que codifica cualquiera de los polipéptidos quiméricos HCN que se describen aquí y un vector que consta de dicho ácido nucleico. Además la invención proporciona una célula que contiene el ácido nucleico instantáneo, en donde la célula manifiesta el polipéptido quimérico HCN. En ciertas representaciones, la célula es una célula madre mesenquimal humana adulta (hMSC) la cual (a) se ha traspasado por lo menos 9 veces, (b) manifiesta marcadores de superficie clase I CD29, CD44, CD54, y HLA; y (c) no manifiesta marcadores de superficie clase II CD14, CD34, CD45, HLA. Además la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende de la célula, vector o ácido nucleico instantáneo.

Además, la invención proporciona un método para tratar a un sujeto afectado con trastorno de ritmo cardiaco que consiste de la administración de células que manifiestan un polipéptido quimérico HCN descrito aquí, en una región del corazón del sujeto, en donde la manifestación del polipéptido quimérico HCN en dicha región del corazón es efectiva para inducir una corriente de marcapasos en el corazón y por consiguiente tratar al sujeto.

Esta invención también proporciona un método para tratar a un sujeto afectado con trastorno de ritmo cardiaco que consiste de la transfección de una célula del corazón del sujeto con un ácido nucleico - que codifica un polipéptido quimérico HCN para así manifestar funcionalmente el polipéptido quimérico HCN en el corazón, en donde la manifestación del polipéptido es efectiva para inducir una corriente de marcapasos en el corazón y por consiguiente tratar al sujeto.

Además esta invención proporciona un método para producir un polipéptido quimérico HCN que consiste de (a) la generación de un ácido nucleico recombinante al unir un ácido nucleico que codifica una porción de terminal amino de un polipéptido HCN con un ácido nucleico que codifica una porción intra membranosa de un polipéptido HCN y unir dicho ácido nucleico que codifica la porción intra membranosa de un polipéptido HCN a un ácido nucleico que codifica una porción de terminal carboxílica de un polipéptido HCN, en donde las porciones codificadas del polipéptido HCN se derivan de más de una isoforma o muíante HCN de lo mismo, y (b) de manifestar funcionalmente el ácido nucleico recombinante en una célula para así producir el polipéptido quimérico HCN. Esta invención también proporciona un sistema tándem de marcapasos que consta de (1) un marcapasos electrónico, y (2) un marcapasos biológico, en donde el marcapasos biológico consiste de una célula implantable que manifiesta funcionalmente un canal iónico quimérico HCN, y en donde el canal quimérico HCN que se manifiesta genera una corriente de marcapasos efectiva cuando la célula se implanta en el corazón de un sujeto, y en donde el quimérico HCN comprende de porciones de más de un tipo de canal HCN. En representaciones preferidas, la célula implantable puede tener una comunicación con cardiomiocitos mediante nexos de unión. En otras representaciones, la célula se selecciona del grupo que consta de una célula madre, un cardiomiocito, una célula de músculo esquelético o fibroblasto diseñado para manifestar conexinas cardiacas, y una célula endotelial. En representaciones de mayor preferencia, la célula es una hMSC.

En representaciones preferidas, el marcapasos biológico del sistema tándem comprende de por lo menos 200,000 hMSCs, y preferentemente contiene por lo menos 700,000 hMSCs.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1. Representación esquemática de posibles canales quiméricos HCN. Se ilustran ejemplos de canales construidos a partir de elementos de HCN2 (mostrados en líneas claras) y HCNI (mostrados en líneas oscuras), y están diseñados para combinar las cinéticas de activación rápida de HCNI con la potente respuesta cAMP de HCN2. Este método se deriva del hecho que el dominio citoplásmico de la terminal C del canal HCN contiene el dominio vinculante del nucleótido cíclico y contribuye de manera significante con la receptividad de cAMP, en tanto que el dominio transmembranal contribuye significativamente con las características de activación periódica tales como las cinéticas de activación. De arriba hacia abajo se muestran: HCN2, HCN212 (en el cual la porción transmembranal media de HCN2 se reemplaza por la porción correspondiente de HCNI), HCNI 12 (en el cual la poción citoplásmica de terminal C de HCNI se reemplaza por la porción correspondiente de HCN2), y HCNI.

Figura 2. Comienzo de ritmos espontáneos por medio de células de marcapasos diseñadas genéticamente o de tipo salvaje así como por marcapasos de células madre diseñadas genéticamente. Arriba. Los impulsos eléctricos (inserción) inician por medio de una corriente interna que fluye a través de los canales transmembranales HCN en una célula nativa de marcapasos o en un miocito diseñado para incorporar la corriente de marcapasos por medio de transferencia de genes. Estos se abren cuando la membrana se repolariza a su potencial diastólico máximo y se cierran cuando la membrana se despolariza durante el impulso eléctrico. La corriente que fluye por medio de los nexos de unión hacia los miocitos adyacentes resulta en su estimulación y en la propagación de impulsos a través del sistema conductivo. Abajo. Se diseñó una célula madre para incorporar los canales HCN en su membrana. Estos canales sólo se pueden abrir, y la corriente sólo puede fluir a través de ellos (inserción) cuando la membrana está hiperpolarizada; tal hiperpolarización sólo se puede aplicar si un miocito adyacente se encuentra acoplada estrechamente a la célula madre por medio de los nexos de unión. En presencia de tal acoplamiento y de la apertura de los canales HCN para inducir un flujo de corriente local, el miocito adyacente se encontrará estimulado e iniciará un impulso eléctrico que después se propagará a través del sistema conductivo. La despolarización del impulso eléctrico dará como resultado el cierre de los canales HCN hasta que la siguiente repolarización restaure un alto potencial de membrana negativo. De esta manera, las células de marcapasos diseñadas genéticamente y de tipo salvaje incorporan toda la mecánica necesaria en cada célula para iniciar y propagar impulsos eléctricos. En cambio, en la unión célula madre-miocito, dos células juntas trabajan como una sola unidad funcional cuya operación es fundamentalmente dependiente de los nexos de unión que se forman entre los dos diferentes tipos de células.

Figura 3. El papel de If en la generación de potenciales de marcapasos en el nodulo sinusal (SAN) (de Biel et al., 2002). A, Potenciales de marcapasos en el SAN bajo condiciones controladas, y después de /3 -estimulación adrenérgica con noradrenalina (NE). Se indican las cuatro corrientes principales que controlan la generación del potencial del marcapasos: corriente k (producida por canales HCN regulados por nucleótidos cíclicos activados por hiperpolarización), corrientes de calcio tipo T (ICAT) y tipo L (ICEL), y corrientes K repolarizantes (IK). B, Esquema de una célula SAN mostrando la regulación del canal HCN por medio de una regulación al alza o a la baja de adenosina monofosfato cíclico-celular (cAMP). M2, receptor muscarínico tipo 2; Ach, acetilcolina; adenilato ciclasa AC5; Goá, proteína G una subunidad (inhibe AC); GPy, proteína G y subunidad; ß?-AR, receptor A-adrenérgico tipo 1 ; Gas, proteína G una subunidad (estimula AC); AV, cambio de la dependencia de voltaje de la activación de canal HCN inducido por el aumento o disminución de cAMP.

Figura 4. Alineación de secuencias polipéptidas mamíferas HCNI. Las secuencias de polipéptidos HCNI de ratón (ID SEC No. ), rata (ID SEC No. ), humano (ID SEC No. ), conejo (ID SEC No. ) y conejillo de indias (secuencia parcial ID SEC No. ) se alinean para una máxima consistencia.

Figura 5. Secuencia de amino ácido del canal quimérico humano HCN212. La porción sombreada de terminal N de la secuencia se deriva de hHCN2; la porción subrayada intramembranal de hHCNI; y la porción de terminal C (sin sombreado o subrayado) de hHCN2. La secuencia de amino ácido del canal quimérico hHCN212 está establecida en ID SEC No. . Esta secuencia de hHCN212 quimérica larga de amino ácido 889 muestra un 91.2% de identidad con la secuencia de mHCN212 larga de amino ácido 863 en 893 superposiciones de residuos cuando se alinean para una máxima consistencia.

Figura 6. Secuencia de amino ácido del canal quimérico HCN212 de ratón. La porción sombreada de terminal N de la secuencia se deriva de HCN2 de ratón; la porción subrayada intra membranosa de HCNI de ratón; y la porción de terminal C (sin sombreado o subrayado) de HCN2 de ratón. La secuencia de amino ácido del canal quimérico hHCN212 del ratón está establecida en ID SEC No. . Esta secuencia de mHCN212 quimérica larga de amino ácido 863 muestra un 91.2% de identidad con la secuencia de hHCN212 larga de amino ácido 889 en 893 superposiciones de residuos cuando se alinean para una máxima consistencia.

Figura 7. Alineación de secuencias de polpéptido HCN2 mamífero. Las secuencias de polipéptidos HCN2 de ratón (ID SEC No. ), rata (ID SEC No. ), humano (ID SEC No. ), y perro (secuencia parcial ID SEC No. ) se alinean para una máxima consistencia.

Figura 8. Alineación de secuencias de polpéptido HCN3 mamífero. Las secuencias de polipéptidos HCN3 de ratón (ID SEC No. ), y humano (ID SEC No. ) se alinean para una máxima consistencia y muestran un 94.6% de identidad en 780 superposiciones de residuos. Los asteriscos indican residuos idénticos y los puntos indican residuos que no son idénticos.

Figura 9. Alineación de secuencias de polpéptido HCN4 mamífero. Las secuencias de polipéptidos HCN4 de ratón (ID SEC No. ), rata (ID SEC No. ), humano (ID SEC No. ), conejo (ID SEC No. ) y perro (secuencia parcial ID SEC No. ) se alinean para una máxima consistencia.

Figura 10. Manifestación funcional de mHCN2 y mE324A en miocitos ventriculares de recién nacido. Rastros representativos de corriente de célula completa de miocitos ventriculares infectados con AdmHCN2 (A) o AdmE324A (B). Las corrientes se causaron al avanzar de un potencial de explotación de -10 mV a diferentes pasos de voltaje de hiperpolarización que van de -25 a -125 mV con incrementos de -10 mV. Las inserciones muestran los rastros de corriente registrados a -35, -45 y -55 mV en una escala expandida tanto para mHCN2 como para mE324A. C, Para propósitos ilustrativos los datos de activación principales de las corrientes de mHCN2 (cuadrados) y mE324A (círculos) se ajustaron a la ecuación Boltzmann (líneas). D, Dependencia de voltaje de constantes de tiempo de activación (símbolos rellenados) y desactivación (símbolos en blanco) de mHCN2 (cuadros) y mE324A (círculos). Los valores de activación principales se obtuvieron a partir de 14 células para mHCN2 y mE324A; los valores principales de constantes de tiempo se obtuvieron a partir de 8 y 7 células para mHCN2 y mE324A respectivamente.

Figura 1 1. Modulación de mHCN2 y mE324A por cAMP. Curvas principales de activación fraccional de mHCN2 (cuadros) y mE324A (círculos) obtenidos en la ausencia (símbolos en blanco) y en la presencia (símbolos rellenados) de 10 µ? cAMP en la solución de la pipeta. Los datos promedio se ajustaron a la ecuación Boltzmann para experimentos en la ausencia (líneas completas) y en la presencia (líneas entrecortadas) de cAMP. Los valores calculados para mHCN2 fueron W = -69.6 mV y -59.9 (cambio 9.7 mV) y s = 10.8 y 1 1.0 mV en la ausencia y presencia de cAMP respectivamente. Los valores calculados para mE324A fueron Vi 2 = -46.3 mV y —40.7 mV (5.6 mV) y s = 9.1 mV y 8.7 mV en la ausencia y presencia de cAMP respectivamente.

Figura 12. Activación de mHCN2 de tipo salvaje y mE324A muíante manifestados en oocitos. A y B, Activación de mHCN2 (A) o mE324A (B) manifestados. Paneles superiores: Registros típicos de la activación de mHCN2 y mE324A manifestados. La inserción muestra el protocolo de pulso utilizado. Para mHCN2, las corrientes se obtuvieron por medio de largos pulsos de hiperpolarización de 2-s entre -30 mV y -160 mV con incrementos de 10 mV, seguidos por un pulso de despolarización de 1-s a +15 mV. El potencial de explotación fue de -30 mV. Para mE324A, las corrientes se obtuvieron por medio de largos pulsos de hiperpolarización de 3-s entre +20 mV y -130 mV con incrementos de 10 mV, seguidos por un pulso de despolarización de 1-s a +50 mV. El potencial de explotación fue de +20 mV. Paneles intermedios: Las corrientes de cola correspondientes usadas para la construcción de curvas de activación en condición estable. Paneles inferiores: Las curvas de activación para mHCN2 o mE324A. Los datos se ajustaron a la ecuación Boltzmann (I/[I+exp((Fi/2-Ftest)/s)])). La activación máxima media (Fh) para mHCN2 fue de -92.7 mV ± 1.1 mV (n = 9 células), y corrientes saturadas alrededor de -130 mV. Se observó un umbral de activación más positivo para mE324A (alrededor de -30 mV) y la Fh fue de -57.3 mV ± 1.6 mV (n = 9 células). C y D, Constantes de tiempo de activación de mHCN2 y mE324A. Observar un cambio positivo en la dependencia de voltaje y en las cinéticas de activación más rápidas para mE324A.

Figura 13. Modulación de cAMP de ????? En oocitos inyectados con mHCN2 o mE324A. El ajuste Boltzmann de conductancia iónica normalizada mostró que la aplicación extracelular de 8-Br-cAMP (cAMP, 1 mM) cambió positivamente el potencial de la activación máxima media (Fh) de 7HCN2 tanto para mHCN2 (panel izquierdo) como para mE324A (panel derecho) por 7-8 mV.

Figura 14. La evaluación farmacológica y el potencial de reversión de JHPN? para mHCN2 y mE324A. A y B, Los lazos corriente/voltaje de 7HCN2 para mHCN2 /A) y mE324A (B). Paneles superiores: Los protocolos de voltaje para el registro del lazo corriente/voltaje de . Para mHCN2, la célula se mantuvo a -30 mV, la corriente se obtuvo por medio de una medida de voltaje de hiperpolarización de 2-s a -140 mV para saturar la activación, y seguida por medidas de voltaje de despolarización de 2-s entre -80 mV y +50 mV en incrementos de 10 mV. Para mE324A, la célula se mantuvo a +20 mV, la corriente se obtuvo por medio de una medida de voltaje de hiperpolarización de 1.5-s a -110 mV para saturar la activación, y luego seguida por medidas de voltaje de despolarización de 1.5-s entre -80 mV y +50 mV en incrementos de 10 mV para el registro de corrientes de cola. Paneles inferiores: Los rastros representativos utilizados para construir el lazo corriente/voltaje completamente activado de /HcN2 en presencia de condiciones de eliminación, Cs+ (5 mM) y control, respectivamente. Observar una gran inhibición de la I por Cs+ para mHCN2 y mE324A. C y D, Las curvas de corriente/voltaje completamente activadas para mHCN2 (C) y mE324A (D) en presencia de condiciones de eliminación, Cs+ (5 mM) y control. Los lazos de corriente/voltaje completamente activados se construyeron al dividir las magnitudes de corriente de cola entre el cambio en la variable de activación periódica la cual ocurrió entre los dos voltajes de prueba (obtenidos de las Figuras 15A y B). El potencial de reversión calculado de /HC 2 es de -41 mV para mHCN2 y -40 mV para mE324A.

Figura 15. Comparación de la magnitud de corriente de /wrw en oocitos inyectados con mHCN2 o mE324A. El /HCN2 se midió a -120 mV para mHCN2 (n = 10 células) y mE324A (n = 10 células). Observar la magnitud de corriente más pequeña para el mE324A manifestado (prueba-t, P < 0.01). Los protocolos de inserción se muestran en las inserciones. Para mHCN2, la corriente se obtuvo al aplicar un pulso de voltaje de hiperpolarización de 3-s a -120 mV desde un potencial de explotación de -30 mV. Para mE324A, la corriente se obtuvo al aplicar un pulso de voltaje de hiperpolarización de 3-s a -120 mV desde un potencial de explotación de +20 mV.

Figura 16. Los rastros de corriente en cultivos ventriculares neonatales de un If nativo y de HCN2 o HCN4 manifestado. A, Registros de un miocito de control (no transfectado). B, Registros de un miocito co-transfectado con pCI-mHCN2 y pEGFP-CI usando lipofectin. C, Registros de un miocito co-transfectado con pCI-mHCN4 y pEGFP-CI usando lipofectin. En todos los paneles, el voltaje de prueba cambió de -55 a -125 mV en incrementos de 10 mV. Observar que los rastros seleccionados se omiten del panel (A) para mayor claridad.

Figura 17. Relación activación/voltaje y cinéticas de HCN2 y HCN4 manifestados en ventrículo neonatal. A, Curvas I-V convertidas a una relación de activación usando una relación Boltzmann. La relación de activación para una corriente nativa (línea entrecortada) se toma de Qu et al. (2000). B, Constante de tiempo de activación de corriente para If nativo y para /HCN2 y /HCN4 manifestados.

Figura 18. Rastros de corriente de miocitos ventriculares adultos. A, Registros de un miocito extremadamente aislado. B, Registros de un miocito adulto que se mantuvo en cultivo por 48 horas. C, Registros de un miocito adulto infectado con AdHCN2 y que después se mantuvo en cultivo por 48 horas. D, Ilustración del protocolo de voltaje. Observar la escala vertical diferente en (C).

Figura 19. Efecto de la sobre-manifestación de HCN2 en la actividad espontánea del cultivo del ventrículo neonatal. El cultivo de capa unimolecular se infectó con AdHCN2 o AdGFP y subsecuentemente se registraron los impulsos eléctricos con electrodos de parche de la célula completa. A, Impulsos eléctricos espontáneos de un cultivo de capa unimolecular de control. B, Impulsos eléctricos espontáneos de un cultivo de capa unimolecular infectado con AdHCN2. C, Datos concisos comparando cultivos infectados con AdHCN2, cultivos infectados con AdGFP de control con respecto a una frecuencia espontánea, a un gradiente de despolarización fase 4 y a un potencial diastólico máximo (MDP). Es asterisco indica una diferencia significativa en relación con cultivo de control; n valores para el control fueron 16-17, para AdHCN2 infectado fueron 12- 16, y para AdGFP infectado fueron 6.

Figura 20. Modulación de la frecuencia por medio de isoproterenol en un cultivo de AdHCN2 infectado. A, Registros de impulsos eléctricos de frecuencia espontánea durante una superfusión de control. B, Registros del mismo cultivo durante una superfusión con isoproterenol, mostrando un aumento en la frecuencia espontánea de 48 latidos/min durante el registro de control a 63 latidos/min durante la exposición a la droga.

Figura 21. Modulación de la frecuencia por medio de carbacol en un cultivo de AdHCN2 infectado. A, Registros de impulsos eléctricos de frecuencia espontánea durante una superfusión de control. B, Registros del mismo cultivo durante una superfusión con carbacol, mostrando una disminución en la frecuencia espontánea de 54 latidos/min durante el registro de control a 45 latidos/min durante la exposición a la droga.

Figura 22. Modulación de la frecuencia por medio de ZD-7288 en un cultivo de AdHCN2 infectado. A, Registros de impulsos eléctricos de frecuencia espontánea durante una superfusión de control. B, Registros del mismo cultivo durante una superfusión con ZD-7288, mostrando una disminución en la frecuencia espontánea de 96 latidos/min durante el registro de control a 78 latidos/min durante la exposición a la droga.

Figura 23. Efecto de concentración de umbral de isoproterenol en la corriente manifestada HCN2 en un miocito ventricular neonatal. La exposición al isoproterenol aumentó la corriente para una medida de voltaje al punto medio de la curva de activación sin incrementar la corriente máxima obtenida con una segunda medida de voltaje al máximo de la curva de activación, demostrando que la naturaleza del efecto era la de cambiar la curva de activación a positiva en el eje de voltaje. Mediciones separadas indicaron que la magnitud del cambio en esta célula fue de aproximadamente 5 mV.

Figura 24. Relación de activación y cinéticas de h nativa en miocitos adultos. A, Relación de activación para If en miocitos ventriculares adultos cultivados y extremadamente disociados. B, Constante de tiempo de la activación de corriente para I[ nativo en miocitos ventriculares adultos cultivados y extremadamente aislados. Los datos neonatales de la Figura 17 se sobreponen como una línea entrecortada para comparación.

Figura 25. Relación de activación y cinéticas de /?G?? manifestado con AdHCN2 en 5 ventrículo adulto y neonatal. A, Relaciones de activación para cultivos de ventrículo adulto y neonatal como se midieron por las corrientes de cola. B, Constante de tiempo de activación (cuadros) y desactivación (círculos) para miocitos ventriculares y neonatales. Las líneas se generan por un mejor ajuste a la ecuación. l O Figura 26. Relación de regresión para Vm de la relación Boltzmann como una función de densidad de corriente HCN2 manifestada en miocitos adultos y neonatales. Los cultivos se infectaron con AdHCN2. Las líneas son regresiones lineales calculadas. Las barras de error horizontales y verticales representan S.E.M. de Vm y /HCN25 respectivamente. La inserción muestra la escala de tiempo expandido para densidades de corriente < 60 pA/pF. 15 Figura 27. Efecto de cAMP intracelular en la relación de activación de la corriente HCN2 manifestada en miocitos adultos y neonatales. Los datos anteriores con solución de pipeta de control (Fig. 25A) se muestran con líneas entrecortadas (neonatal) y punteadas (adulto). 0 Figura 28. Efecto de sobre-expresión de HCN2 en miocitos ventriculares adultos. A, Rastros de estimulación de corte de ánodo representativos a partir de un miocito de control (izquierda, incluyendo curso de tiempo de estímulo) y de un miocito infectado con AdHCN2 (derecha). El potencial de descanso en los dos ejemplos es de -66 y -60 mV, 5 respectivamente. B, Gráfica de la relación entre el potencial negativo máximo logrado durante la estimulación de ánodo como una función de la densidad de corriente de Jf o /HCN2 (medida al final de una etapa de 2-s a -125 mV). La inserción muestra un rango de densidad de corriente de 0-1.2 pA/pF en una base de tiempo expandido, con una regresión lineal calculada como línea sólida.

Figura 29. Manifestación funcional de canales HCNI y HCN2 con y sin minK y MiRP en oocitos de Xenopus. El potencial de explotación es de -35 mV, y el incremento de voltaje siempre es de 10 mV. A, Inyección de cRNA HCNI 5 ng y pulsos de prueba de 3-s de -65 mV a un voltaje máximo de -115 mV. B, Inyección de HCNI 5 ng más minK 0.2 ng con pulsos de prueba de 3-s desde un mínimo de -55 mV a un voltaje máximo de -1 15 mV.

C, Inyección de HCNI 5 ng más MiRPI 0.2 ng con pulsos de prueba de 3-s desde -55 mV a -1 15 mV. D, Inyección de cRNA HCN2 5 ng con pulsos de prueba de 8-s desde -55 mV a -95 mV. E, Inyección de HCN2 5 ng más minK 0.2 ng con pulsos de prueba de 8-s desde -65 mV a -105 mV. F, Inyección de HCN2 5 ng más MiRPI 0.2 ng con pulsos de prueba de 8-s desde -55 mV a -95 mV. G, La conductancia máxima de la corriente de colase obtuvo al dividir su amplitud entre la fuerza de impulsora en ese potencial.

Figura 30. Propiedades de activación periódica de los canales manifestados. A, Curvas de activación de HCNI solo y de HCNI co-manifestado con MiRPI. La inserción muestra las corrientes de cola representativas usadas para construir la curva de activación. B, Curvas de activación de HCN2 solo y de HCN2 co-manifestado con MiRPI. C, Datos de la muestra mostrando las cinéticas de activación de HCNI solo y HCNI co-manifestado con MiRPI. D, Datos de la muestra mostrando las cinéticas de activación de HCN2 solo y HCN2 co-manifestado con MiRPI. E, Esquema de constantes de tiempo de activación y desactivación (en recuadro) para HCNI solo y HCNI + MiRPI. F, Lo mismo que (E) pero para HCN2 y HCN2 + MiRPI.

Figura 31. Manifestación de mRNA MiRPI en conejo como se determinó por experimentos de protección RNase. A, Un ejemplo de un RPA representativo realizado en 2 µg de RNA total aislado del ventrículo izquierdo, aurícula derecha, nodulos sinusal y de todo el cerebro. B, Histograma que muestra la abundancia relativa de MiRPI. Los datos se normalizan al fragmento protegido de ciclofilina: los valores son los medios de tres muestras de mRNA independientes y las barras de error son SEM.

Figura 32. Western blots mostrando manifestación de proteína de subunidades de canal HCNI con y sin oocitos MiRPI de Xenopus seguido de inmunoprecipitación con la subunidad de canal iónico HCNI. A, Proteínas en membranas de oocitos fraccionadas y probadas con anticuerpo anti-HCNI. B, Proteína de membrana de oocito probada con anticuerpo anti-HA. C, Productos de reacciones IP por anticuerpo anti-HCNI de proteína de membrana de oocitos inyectados con HCNI, MiRPI o por ambas cRNAs probadas con 5 anticuerpo anti-HA.

Figura 33. Identificación de conexinas en nexos de unión de células madre mesenquimales humanas ChMSCsI Inmunomarcación de Cx43 (A), Cx40 (B) y Cx45 (Q). D, Análisis Western Blot de Cx43 en hMSCs y miocitos de ventrículo canino. Las lisis ¡ O celulares completas (120 µg) de las células de ventrículo o hMSCs se determinaron por SDS, transferidas a membranas, y eliminadas con anticuerpos Cx43. Se indican los marcadores de peso molecular.

Figura 34. Propiedades de canal simple y macroscópicas de nexos de unión entre pares 15 de hMSC. Las corrientes de nexo de unión (¾) que se obtuvieron de las hMSCs usando un protocolo de pulso bipolar simétrico (10 s, de ± 10 mV a ± 1 10 mV, Fh = 0 mV) mostraron dos tipos de desactivación de corriente dependiente de voltaje: simétrica (.4) y asimétrica (B). C, Esquemas de extractos de gj instantáneo normalizado (o) y en condición estable(») contra Fj. Panel izquierdo, relación cuasi simétrica de 5 pares; línea continua, ajuste 0 Boltzmann: Fj l0 = -70/65 mV, gj;min = 0.29/0.34, gj>max = 0.99/1.00, z = 2.2/2.3 para Fj negativo/positivo. Panel derecho, relación asimétrica de 6 pares; ajuste Boltzmann para Fj negativo: Fj io = -72 mV, gjimin = 0.25, gjimax = 0.99, z = 1.5. D y E, registros de canal simple de pares de hMSCs. Protocolo de pulso (Fj y F2) y corrientes multicanal asociadas (Z2) registrados a partir de un par de célula durante la Fj mantenida de ± 80 mV. Las distintas 5 etapas de corriente indican la apertura y cierre de los canales individuales. Línea entrecortada, nivel de corriente cero. Los histogramas de corriente de todos los puntos del lado derecho revelan una conductancia de -50 pS.

Figura 35. Propiedades macroscópicas de nexos en pares de células entre una célula 0 hMSC y una HeLa sólo manifestando Cx40, Cx43 ó Cx45. En todos los casos el acoplamiento de la célula HeLa a la hMSC se probó de 6 a 12 horas después de iniciar el co-cultivo. A, Ij obtenido en respuesta a una serie de etapas de voltaje de 5-s (Fj) en pares hMSC-HeLaCx43. Arriba, desactivación de corriente simétrica; abajo, dependencia de voltaje de corriente asimétrica. B, registros Jj macroscópicos de pares hMSC-HeLaCx40 muestran desactivación dependiente de voltaje simétrica (panel superior) y asimétrica (panel inferior). C, 7j asimétrico de par hMSC-HeLaCx43 muestran activación periódica dependiente de voltaje cuando el lado Cx45 se encuentra relativamente negativo. 7j registrado de hMSC. D, esquemas gjjSS contra Fj de pares entre células HeLa transfectadas y hMSC. Panel izquierdo, pares hMSC-HeLaCx43, relación cuasi simétrica (·) y relación asimétrica (o); las líneas continuas y entrecortadas son ajustes Boltzmann (ver texto para detalles). Panel central, relaciones simétricas (·) y asimétricas (o) de pares hMSC-HeLaCx40; las líneas continuas y entrecortadas corresponden a los ajustes Boltzmann (ver texto para detalles). Panel derecho, relación asimétrica de pares de célula hMSC-HeLaCx45; línea continua, ajuste Boltzmann para Fj positivo (ver texto para detalles). E, El Lucifer Amarillo (LY) de célula a célula se dispersa en pares de célula: de una hMSC a una hMSC (panel superior), de un HeLaCx43 a una hMSC (panel central), y de una hMSC a un HeLaCx43 (panel inferior). En todos los casos, se adjunto una pipeta con 2mM LY a la célula izquierda en la configuración de célula entera. Los micrógrafos epifluorescentes que se tomaron 12 minutos después de la inyección del colorante muestra que el LY se dispersa a la célula adyacente (lado derecho). La conductancia de cruce que se midió simultáneamente reveló g¡ de -13 nS, ~16 nS, y -18 nS de los pares respectivamente. El Rastreador de célula verde se utilizó para distinguir células hMSCs de células HeLa o viceversa en todos los experimentos.

Figura 36. Propiedades de canal simple y macroscópicas de nexos de unión entre pares de células hMSC de ventrículo canino. Los miocitos se laminaron entre 12 y 72 horas y se co-cultivaron con hMSCs de 6 a 12 horas antes de medir el acoplamiento. A, Localización de Cx43 para pares de células hMSC de ventrículo canino. La mayoría del Cx43 se localizó en los extremos de la célula ventricular y había una pequeña cantidad de Cx43 a lo largo de los bordes laterales. Las intensas manchas de Cx43 se detectaron entre el extremo de la célula ventricular en forma tubular (célula central) y la hMSC (célula derecha). No se detectan manchas de Cx43 entre la célula ventricular y la hMSC en el lado izquierdo. B, Parte superior, micrógrafo de contraste de fases de un par de miocitos ventriculares caninos hMSC. Parte inferior, protocolo de pulso monopolar (Fi y K2) y corrientes de cruce macroscópicas asociadas (J2) que muestran dependencia de voltaje asimétrica. C, Parte superior, la corriente de multicanal que se obtuvo por pulso bifásico simétrico 60 mV. Línea entrecortada, nivel de corriente cero; líneas punteadas, representan distintos pasos de corriente indicativos de apertura y cierre de canales. Los histogramas de corriente produjeron una conductancia de -40-50 pS. Parte inferior, registro multicanal durante la conservación V¡ de 60 mV. Los histogramas de corriente revelaron varias conductancias de 48-64 pS con algunos eventos de conductancia de 84 pS a 99 pS (flechas) los cuales se asemejan a la operación de Cx43, canales Cx40-Cx43 heterotípicos y/o Cx40 homotípicos.

Figura 37. Comparación de cinéticas de activación periódica de canales de mHCN2 y mHCN212 quimérico cuando se expresan en miocitos ventriculares de rata neonatal. Se muestran los resultados utilizando mHCN2 (cuadros sombreados) y un canal mHCN212 quimérico (círculos sombreados). Izquierda, Cinéticas de activación, determinadas al ajustar la primera porción de los rastros de corriente (después de omitir el retraso inicial) a una exponencial simple, para potenciales de prueba de hiperpolarización a los voltajes indicados en el eje X. Derecha, cinéticas de desactivación, determinadas al ajustar el rastro de corriente de los potenciales de prueba de despolarización a los voltajes indicados siguiendo un pre-pulso a un potencial negativo para activar completamente los canales. La posición de la constante de tiempo del ajuste exponencial simple se determina en el eje Y en cada caso, mostrando cinéticas más rápidas en todos los voltajes para mHCN212 comparado con mHCN2.

Figura 38. Comparación de la manifestación de eficiencia de los canales mHCN2 y mHCN212 quimérico en miocitos ventriculares de rata neonatal. Izquierda, La densidad de la corriente principal de la corriente que se manifiesta a un voltaje negativo que activa los canales en grado máximo. Derecha, Determinación de posición de la dependencia de voltaje de activación.

Figura 39. Comparación de las características de mHCN212 manifestadas en miocitos y células madre. Se midió la corriente generada a partir de la manifestación de HCN212 murino en miocitos ventriculares de rata neonatal y en células madre mesenquimales de humano adulto. Izquierda, dependencia de voltaje de activación; Derecha, Cinéticas de activación.

Figura 40. Propiedades de mHCN2 y de mHCNI 12 de tipo salvaje manifestadas en oocitos. Se describe la curva de activación en condición estable (A), las cinéticas de activación (B) y la modulación cAMP (C).

Figura 41. Comparación de características de activación periódica de los canales HCN2 y HCN212 quimérico cuando se manifiestan en células madre mesenquimales de humano adulto. Izquierda, La dependencia de voltaje de activación cambia significativamente a positivo para mHCN212 (círculos sombreados) en comparación al HCN2 (cuadros sombreados). Derecha, Las cinéticas de activación son en cualquier voltaje medido significativamente más rápidas para mHCN212 en comparación al HCN2.

Figura 42. Comparación de desempeño del marcapasos tándem biológico-electrónico contra el marcapasos electrónico. A, Porcentaje de latidos a bajo ritmo provocados electrónicamente que ocurre en corazones inyectados con solución salina e implementados con un marcapasos electrónico o inyectados con mHCN2 en conjunción con un marcapasos electrónico. En ambos grupos el marcapasos electrónico se ajustó a VVI 45 bpm. A través del periodo de 14 días el número de latidos iniciados electrónicamente fue mayor en el grupo inyectado con solución salina que en el grupo inyectado con HCN2 (P < 0.05) para comparaciones en cada punto de tiempo. B, Frecuencia cardiaca en reposo en los días 1-7 y 8-14 de los grupos inyectados con solución salina, mHCN2 o mE324A. La frecuencia en los dos últimos grupos fue significativamente más rápida que en el grupo con solución salina (P < 0.05).

Figura 43. Rastro representativo de la interacción de los componentes de la unidad tándem del marcapasos biológico y electrónico. A este animal se le administró mHCN2.

Existe una fina transición de la actividad del marcapasos biológico al electrónico y del electrónico de regreso al biológico.

Figura 44. Efectos de la infusión de epinefrina en el marcapasos tándem biológico-electrónico contra el marcapasos electrónico. Se suministraron infusiones intravenosas de 1.0, 1.5 y 2.0 µg/kg/min en el día 14 hasta que hubiera ya sea un aumento del 50% en la frecuencia del marcapasos que no fuera producida electrónicamente, que ocurriera una arritmia, o que se administrara una dosis máxima de 2 µg/kg/min por 10 minutos. A, Efectos de la epinefrina, 1 µg/kg/min, en ECGs en tres animales representativos. Observar el gran aumento de frecuencia en el animal al que se le administró mE324A. B, Un aumento del 50% en la frecuencia cardiaca como resultado de una función idioventricular del marcapasos, se muestra en gris. En el grupo de solución salina, el protocolo concluyó con todos los animales que tuvieran ya sea un aumento de <50% en la dosis más alta (75% de los animales) o una arritmia (25% de los animales). En el grupo de mHCN2, 50% de los animales tuvieron un aumento menor al 50% en la frecuencia: se concluyó la infusión en un animal debido a que se llevo a cabo la dosis más alta mientras que dos animales desarrollaron arritmias ventriculares. Del otro 50%, uno alcanzó el 50% de aumento en la frecuencia con la dosis más baja de epinefrina y los otros dos requirieron 1.5 ó 2 ug/kg/min. En cambio, el grupo mE324A, el 100% alcanzó un aumento del 50% en la frecuencia con la dosis de epinefrina más baja y no se observó ninguna arritmia.

Figura 45. Comparación de mHCN2 y de mHCN212 quimérico suministrado a miocitos de rata en un vector adenoviral. El mHCN212 demostró una frecuencia de señal en reposo más alta que el HCN2, y un potencial diastólico máximo menos negativo.

Figura 46. Receptividad autónoma de mHCN2 y de mHCN212 en miocitos de rata recién nacida. El mHCN212 muestra receptividad autónoma, demostrado por una frecuencia de señal aumentada después de ser expuesto al isoproterenol (un agonista receptor adrenérgico beta).

Figura 47. Manifestación de mHCN212 en células madre mesenquimales humanas. El panel A muestra que las hMSCs están manifestando GFP, la cual se co-manifestó con mHCN212. La GFP se puede ver en las diapositivas. Se aplico un potencial eléctrico a las células siguiendo el protocolo de voltaje que se muestra en el panel B. El panel C muestra que la respuesta de la corriente se bloqueó, como se esperaba, por el cesio.

Figura 48. Activación del mHCN212 que se manifestó en las células madre mesenquimales humanas (MSCs). El panel A muestra que la cantidad de corriente varía con la cantidad de potencial eléctrico que se aplica. El panel B muestra la relación entre el voltaje aplicado y la corriente generada.

Figura 49. Modulación cAMP del mHCN212 que se manifestó en las células madre mesenquimales humanas. Por un potencial eléctrico dado, cAMP aumentará la respuesta de corriente. Se observa un cambio positivo para la dependencia de voltaje en presencia de cAMP, el cual indica una buena receptividad autónoma.

Figura 50. La manifestación de mHCN212 en células madre mesenquimales humanas proporciona una densidad de corriente mayor que el mHCN2. "n" es igual al número de células en las que se experimentó.

Figura 51. Características de un marcapasos biológico. El mHCN2 y el mHCN212 manifiestan la densidad de la corriente (Panel A y B, respectivamente). El panel C muestra que el mHCN212 tiene una respuesta de corriente más positiva a un potencial eléctrico aplicado que el mHCN2. Los paneles D y E muestran las cinéticas y demuestran que el mHCN212 tiene cinéticas más rápidas que el mHCN2.

Figura 52. Las hMSCs que manifiestan mHCN2, proporcionan corriente de marcapasos para generar una frecuencia cardiaca estable para el día 12-14 después del implante. Al mismo tiempo que el número de hMSCs cargadas con HCN2 aumenta, también la frecuencia aumenta. Se llega a una condición estable apenas por encima de las 500,000 hMSCs.

Figura 53. El porcentaje de latidos desencadenados por el marcapasos electrónico disminuyó como una función de marcapasos biológico por las hMSCs en los días 12-42 después del implante. Se implementaron hMSCs manifestando mHCNl a perros. El marcapasos electrónico se programó para encenderse cuando la frecuencia cardiaca bajara a menos de 35 latidos por minuto. Como se demuestra en la figura, el número de latidos desencadenados por el marcapasos electrónico disminuyó con la implantación del marcapasos biológico consistiendo de aproximadamente 700,000 hMSCs diseñadas para manifestar el mHCN2.

Descripción Detallada de la Invención Las corrientes de catión activadas por hiperpolarización, denominadas If, Ia, o 7q se descubrieron en el corazón y en células nerviosas hace más de 20 años (para más información, ver DiFrancesco, 1993; Pape 1996). Estas corrientes, transportadas por iones Na+ y K+, contribuyen a un amplio rango de funciones fisiológicas, incluyendo actividad cardiaca y neuronal del marcapasos, el ajuste de impulsos en reposo, conductancia de entrada y constantes de longitud, e integración dendrítica (ver Robinson y Siegelbaum, 2003; Biel et al., 2002). La familia HCN regulado por nucleótidos cíclicos activados por hiperpolarización de subunidades de canal iónico fue identificada mediante clonación molecular (para más información, ver Clapham, 1998; Santoro y Tibbs, 1999; Biel et al., 2002), y cuando se manifiesta heterológicamente, cada una de las cuatro diferentes isoformas HCN (HCNI -4) generan canales con las propiedades principales del If original, confirmando que los canales HCN son las correlaciones moleculares de esta corriente. De esta manera los componentes moleculares de los canales presentan un objetivo natural para modular la frecuencia cardiaca. En términos generales, los polipéptidos HCN se pueden dividir en tres porciones principales: (1 ) un dominio terminal amino citoplásmico; (2) una porción intra membranosa que consta de los dominios que abarca la membrana y sus regiones vinculantes; y (3) un dominio de terminal carboxílica citoplásmica. Sin embargo, los dominios que abarca la membrana con sus regiones vinculantes juegan un papel importante para determinar las cinéticas de la activación periódica, mientras que el CNBD de la terminal C es en gran parte responsable de la capacidad del canal para responder a los sistemas nerviosos simpáticos y parasimpáticos que respectivamente aumentan y disminuyen los niveles cAMP celulares.

Canales quiméricos HCN Wang et al. (2001b) utilizó quimeras entre HCNI y HCN2 para investigar, las bases moleculares para la acción modulatoria de cAMP y para las diferencias en las propiedades funcionales de los dos canales. Esta invención abarca la manipulación de las propiedades de los canales HCN mediante la recombinación in vitro de secuencias nucleótidas que codifican porciones de las cuatro isoformas HCN para producir canales quiméricos HCN. Como se detalla en los ejemplos, ciertos de estos canales quiméricos muestran características que son favorables, en comparación con los canales de tipo salvaje, para generar corrientes de marcapasos para usarlas al tratar trastornos del corazón.

Como tal, ésta invención proporciona un polipéptido quimérico HCN que consta de porciones que se derivan de más de una isoforma HCN. Hay cuatro isoformas HCN: HCNl, HCN2, HCN3 y HCN4. Las cuatro isoformas se manifiestan en el cerebro; HCNl, HCN2 y HCN4 también se manifiestan de forma perceptible en el corazón, con HCN4 y HCNl predominando en el nodulo sinusal y HCN2 en el sistema conductivo especializado ventricular. "mHCN" designa el HCN murino o de ratón; "hHCN" designa el HCN humano. El canal HCN puede ser cualquier canal HCN que sea capaz de inducir actividad biológica de marcapasos.

En representaciones preferidas, las porciones son una porción de terminal amino, una porción intra membranosa, y una porción de terminal carboxílica, en otras representaciones, las porciones se derivan de isoformas HCN humanos. Como se usó en este documento, un "polipéptido quimérico HCN" o "quimera HCN" es un polipéptido que consta de porciones de más de una isoforma de canal HCN. Por consiguiente, una quimera puede comprender de porciones de HCNI y HCN2 o HCN3 o HCN4, y así sucesivamente. Por ejemplo, esta invención también proporciona un polipéptido quimérico HCN humano que consta de una porción de terminal amino de un canal HCNI humano o de un canal HCN2 humano contiguo con una porción intra membranosa de un canal HCN humano contiguo con una porción de terminal carboxílica de un canal HCN humano, en donde una porción se deriva de un canal HCN el cual es diferente del canal HCN de donde por lo menos se deriva una de las otras dos porciones.

En ciertas representaciones, por lo menos una porción de la quimera HCN se deriva de una especie animal la cual es diferente de la especie animal de donde por lo menos se deriva una de las otras dos porciones. Por ejemplo, una porción del canal se puede derivar de un humano y otra porción se puede derivar de una especie que no sea humana.

El término "HCNXYZ" (donde X, Y, y Z son cualquiera de los números enteros 1 , 2, 3 ó 4, con la condición que por lo menos uno de X, Y, y Z sea un número diferente de por lo menos uno de los otros números) es un polipéptido de canal HCN quimérico que consta de tres porciones contiguas en el orden XYZ, donde X es una porción de la terminal N, Y es una porción intra membranosa, y Z es una porción de la terminal C, y donde el número X, Y o Z designan el canal HCN de donde se deriva esa porción. Por ejemplo, el HCNI 12 es una quimera HCN con una porción de terminal N y una porción intra membranosa de HCNI y una porción de la terminal C del HCN2.

En otras representaciones del polipéptido quimérico HCN instantáneo, la porción intra membranosa se deriva de un canal HCNI. En representaciones adicionales, la porción intra membranosa es D140-L400 de hHCNI con la secuencia establecida en ID SEC No. (ver Figura 4). En otras representaciones adicionales, la porción intra membranosa es D129-L389 de mHCNI con la secuencia establecida en ID SEC No. (ver Figura 4).

En diferentes representaciones, la porción de terminal amino se deriva de HCN2, HCN3 o HCN4 y la porción de terminal carboxílica se deriva de HCN2, HCN3 o HCN4. En otras representaciones, la porción de terminal amino se deriva de HCN2 y la porción de terminal carboxílica se deriva de HCN2. - - - Representaciones preferidas de esta invención proporcionan un polipéptido quimérico HCN que muestra una característica mejorada, en comparación con un canal HCN de tipo salvaje, seleccionado de un grupo que consiste de cinéticas más rápidas, activación más positiva, niveles de manifestación aumentadas, estabilidad aumentada, receptividad cAMP mejorada, y respuesta neurohumoral mejorada. El HCN1 tiene las cinéticas más rápidas pero una deficiente receptividad para cAMP. El HCN2 tiene cinéticas más lentas y buena receptividad para cAMP. Por consiguiente, se estudiaron de manera experimental las quimeras de HCNI y HCN2 y la invención proporciona sistemas de marcapasos que consta de células que manifiestan estas y otras quimeras. Se muestra una representación esquemática de las quimeras HCNI/HCN2 en la Figura 1.

En otras representaciones, el polipéptido quimérico HCN instantáneo contiene mHCNI 12, mHCN212, mHCN312, mHCN412, mHCNI 14, mHCN214, mHCN314, mHCN414, hHCNI 12, hHCN212, hHCN312, hHCN412, hHCNI 14, hHCN214, hHCN314, o hHCN414.

La quimera HCNI 12 (que contiene el dominio de la terminal N del HCNI, dominios que abarcan la membrana de HCNI, y el dominio de la terminal C del HCN2; ver Figura 1) es un canal quimérico preferido para el marcapasos biológico ya que contiene los dominios que abarcan la membrana relevante del HCNI (manifestando cinéticas rápidas) y el dominio de la terminal C del HCN2 (manifestando buena receptividad cAMP). Debido a que la contribución del dominio de la terminal N a la activación periódica y la receptividad de cAMP no está definida, el HCN212 (ver Figura 3) también es un candidato preferido. De esta manera, en una representación preferida, el polipéptido quimérico HCN es hHCN212 con la secuencia establecida en ID SEC No. (ver Figura 5). En otra representación adicional preferida, el polipéptido quimérico HCN es mHCN212 con la secuencia establecida en ID SEC No. (ver Figura 6). Otras quimeras preferidas son HCN312 y HCN412. HCN4 también muestra cinética lentas y buena receptividad cAMP; de esta manera, HCNI 14, HCN214, HCN314 y HCN414 también son quimeras preferidas.

Dado que los canales HCN se definen previamente en términos de tres amplios dominios funcionales, existen múltiples ubicaciones en donde los bordes entre estos dominios en un canal quimérico se pueden determinar. Esta invención también abarca variantes de quimeras de HCN que se crearon al utilizar dominios con límites definidos de manera diferente que también sirven para recombinar las características bioquímicas y biofísicas que se desean de los canales HCN individuales.

En ciertas representaciones, la quimera HCN consta de una porción de terminal amino contigua a una porción de intramembrana contigua a una porción de terminal carboxílica, en donde cada porción es una porción de un canal HCN o una porción muíante de lo mismo, y en donde una porción se deriva de un canal HCN o un muíaníe de lo mismo el cual es diferente del canal HCN o muíaníe de lo mismo de donde por lo menos se deriva una de las oirás dos porciones, en varias represeníaciones, por lo menos una porción del polipépíido se deriva de un canal HCN el cual coníiene una muíación que proporciona una caracíerísíica mejorada, en comparación a una porción de un canal HCN de tipo salvaje, seleccionada de un grupo que consisíe de cinéticas más rápidas, una activación más positiva, expresión aumeníada, esíabilidad aumentada, receptividad cAMP mejorada, y respuesta neurohumoral mejorada, en ciertas representaciones, el canal HCN muíante contiene una mutación en una región del canal seleccionado del grupo que consta del enlazador S3-S4, sensor de voltaje S4, enlazador S4-S5, S5, S6 y enlazador S5-S6, enlazador C, y el CNBD de terminal C. En oirás representaciones, la porción mutante se deriva del mHCN2 con la secuencia establecida en ID SEC No. (ver Figura 7) y contiene E324A-mHCN2, Y331A-mHCN2, R339A-mHCN2, o Y331 A, E324A-mHCN2. En representaciones preferidas, la porción mutante consta de E324A-mHCN2. En oirás representaciones, la porción mulante consta de HCNI-A229-231, HCNl-A233-237, HCN1-?234-237, HCNI- ?235-237, HCNI- ?229- 231/ ?233-237, HCNI- ?229-231/ ?234-237, y HCNI- ?229-231/ ?235-237 (ver Tsang et al., 2004). En representaciones preferidas, la porción mutante consta de HCNl-A235-237 (también se hace referencia en este documento como HCNI - ? ? ?; ver Tse et al., 2006), el enlazador S3-S4 del que se redujo al eliminar los residuos 235-237 para favorecer la apertura del canal. Las mutaciones de polipépíidos que incluyen las susíiíuciones de aminoácidos se identifican en esíe documento mediante una designación la cual proporciona la abreviación de una sola leíra del residuo de aminoácido que experimentó la muíación, la posición de ese residuo dentro de un polipépíido, y la abreviación de una sola leíra del residuo de aminoácido al que se muíó el residuo. De esta manera, por ejemplo, E324A identifica un polipéptido mutante en el que el residuo glutámico (E) en la posición 324 mutó a alanina (A). Y331A, E324A-HCN2 indica un HCN2 de ratón con una mutación doble, una en la que la tirosina (Y) en la posición 331 se mutó a alanina (A), y la otra en la que el residuo glutámico en la posición 324 se mutó a alanina. Los HCN imitantes que resultan de las eliminaciones dentro del enlazador S3-S4 se identifican en este documento mediante una designación "?", en donde los residuos de aminoácidos eliminados se indican por sus posiciones numeradas dentro de la cadena de polipéptidos. De esta manera, por ejemplo, J3CN1 - ?229-231/?235-237 identifica un polipéptido mutante HCN cuyos residuos en las posiciones 229-231 y 235-237 se eliminaron. Ácidos nucleicos que codifican canales quiméricos HCN y vectores que contienen lo mismo.

Esta invención también proporciona un ácido nucleico que codifica cualquiera de los polipéptidos quiméricos HCN que se describen en este documento. El ácido nucleico puede ser un ADN, un ARN o una mezcla de lo mismo. El ADN puede ser un cDNA o un ADN genómico. Esta invención también proporciona un ácido nucleico capaz de hibridizarse específicamente bajo altas condiciones de rigor (amortiguador 0.5X SSC o SSPE, 1% SDS, a 68°C) a los ácidos nucleicos instantáneos. Además la invención proporciona un vector que consta de cualquiera de los ácidos nucleicos instantáneos. Como se usa en este documento, un "vector" es cualquier vector de ácido nucleico conocido en el medio. El vector puede ser un vector recombinante el cual comprende de un vector de manifestación que contiene el ácido nucleico insertado. Tales vectores incluyen, pero no están limitados a, vectores plásmidos, vectores cósmidos y vectores virales. En diferentes representaciones, el vector viral es un adenoviral, virus adeno asociado (AAV), o un vector retroviral. Varios plásmidos de expresión eucariótica, incluyendo pCI, pCMS-EGFP, pHygEGFP, pEGFP-CI, y plásmidos de enlace para la construcción del vector Cre-lox Ad, pDC515 y pDC516 se usan en conceptos que se describen aquí. Sin embargo, la invención no está limitada a estos vectores plásmidos o a sus derivados, y puede incluir otros vectores conocidos para aquellos calificados en el medio.

Células que manifiestan canales quiméricos HCN La invención también proporciona una célula que consta de cualquiera de los ácidos nucleicos o vectores recombinantes que se describen en este documento, en donde la célula manifiesta funcionalmente el ácido nucleico y por lo tanto manifiesta el polipéptido quimérico HCN codificado. En representaciones preferidas, la célula manifiesta el polipéptido quimérico HCN a un nivel efectivo para inducir una corriente de marcapasos en la célula. Una "célula" debe incluir una célula biológica, por ejemplo, una célula HeLa, una célula madre, o un miocito, y una célula no biológica, por ejemplo, una vesícula fosfolípida (liposoma) o un virión. Preferentemente los marcapasos biológicos de esta invención constan de una célula biológica capaz de juntar los cardiomiocitos con la comunicación que intercede con el empalme. Las células ejemplares incluyen, pero sin estar limitadas a, una célula madre, un cardiomiocito, un fibroblasto o célula del esqueleto diseñada para manifestar por lo menos una conexina cardiaca, o una célula endotelial. En representaciones preferidas, la célula madre es una célula madre mesenquimal adulta o una célula madre embrionaria, en donde la célula madre substancialmente incapaz de distinción. En una representación preferida la célula es una célula madre mesenquimal adulta (hMSC) o una célula madre embrionaria humana (hESC), en donde la célula madre substancialmente incapaz de distinción. En otras representaciones preferidas, la hMSC (a) se ha trasladado por lo menos nueve veces, más preferentemente de nueve a doce veces, y manifiesta marcadores de superficie CD29, CD44, CD54 y HLA clase I y no manifiesta marcadores de superficie CD14, CD34, CD45 y HLA clase II. En representaciones adicionales, la célula también manifiesta por lo menos una conexina cardiaca, y en otras representaciones, por lo menos una conexina cardiaca es Cx43, Cx40, o Cx45.

Como se usa en este documento, "manifestar funcionalmente" o "manifestar" un ácido nucleico es introducir el ácido nucleico en una célula o en otro sistema biológico de tal manera que permita la producción de un polipéptido funcional codificado por el ácido nucleico, para así producir el polipéptido funcional. Se puede decir que el polipéptido codificado en sí, se manifiesta funcionalmente.

En diferentes representaciones de esta invención, el ácido nucleico se introduce en una célula por medio de infección con un vector viral, transformación plásmida, transformación cósmida, electroporación, lipofección, transfección mediante un reactivo de transfección química, transfección de choque de calor, o microinyección. En representaciones adicionales, el vector viral es un adenoviral, un AAV, o un vector retroviral.

Existen reportes recientes de la entrega de médula ósea derivada y/o hMSCs distribuidas a los corazones de pacientes que sufrieron un infarto agudo de miocardio dando como resultado una mejora del desempeño mecánico (Strauer et al., 2002; Perin et al., 2003) en ausencia de una aparente toxicidad. La conjetura en estos y otros estudios animales (Orlic et al. ,2001) es que las hMSCs se integran en el sincitio cardiaco y después se diferencian en nuevas células del corazón que restauran la función mecánica. Sin embargo, no se observó ninguna diferencia de hMSCs después de un periodo de 42 días después de inyectar hMSCs transfectadas en el mHCN2, en el subepicardio LV de 6 perros adultos sin inmunosupresión (Plotnikov et al., 2005b). Por otra parte, se ha mostrado que las hMSCs trasladadas nueve veces o más, y de preferencia de nueve a doce veces, son substancialmente incapaces de mostrar una diferencia mientras se retienen marcadores de superficie liMSC incluyendo CD29, CD44, CD54 y HLA clase I y no manifiesta marcadores de superficie CD14, CD34, CD45 y HLA clase II. Ver Aplicación Provisional U.S. No. 60/832,518, presentada el 21 de julio del 2006.

Composiciones farmacéuticas Esta invención también proporciona una composición farmacéutica que incluye a cualquiera de los ácidos nucleicos, vectores, células, células madre, polipéptidos HCN y mutantes y quimeras de lo mismo descritos en este documento y un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables son bien conocidos para aquellos calificados en el medio e incluyen, pero sin estar limitados a, 0.01-0.1M y de preferencia 0.05M de amortiguador de fosfato, solución salina tratada con fosfato (PBS), ó 0.9% de solución salina. Tales portadores también incluyen emulsiones, suspensiones, y soluciones acuosas o no acuosas. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones acuosas/alcohólicas, emulsiones o suspensiones, solución salina y vehículos tratados. Ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tal como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables como oleato de etilo. Los conservadores y otros aditivos, como por ejemplo, antimicrobianos, anti oxidantes y quelantes también se pueden incluir con todos los portadores antes mencionados.

Marcapasos biológicos que constan de material biológico que manifiesta canales HCN Esta invención también proporciona un marcapasos biológico que consta de una célula implantable que manifiesta funcionalmente un ácido nucleico que codifica un polipéptido HCN, o un mutante o quimera de lo mismo, a un nivel efectivo para inducir una corriente de marcapasos en la célula, y el uso de estos marcapasos biológicos para tratar condiciones cardiacas.

Un "marcapasos biológico" es un material biológico que manifiesta o es capaz de causar la manifestación de un gen de canal iónico HCN, donde la introducción de este material biológico en un corazón genere una actividad de marcapasos biológico en el corazón. La "actividad del marcapasos biológico" es la generación rítmica de un impulso eléctrico que se origina por la introducción de material biológico en una célula o en una estructura sincicial que contiene la célula. Un "sincitio" o "estructura sincicial" es un tejido en donde hay un nexo de unión con continuidad que interviene entre las células constituyentes. Tal sincitio permite la propagación electrónica de señales eléctricas. "Inducir una corriente en una célula" es hacer que una célula produzca una corriente eléctrica. Un "canal iónico" es un canal en una membrana de célula creada por un polipéptido o una combinación de polipéptidos que localiza una membrana de célula y facilita el movimiento de iones a través de la membrana, de esta manera generando una corriente eléctrica transmembranal. Un "gene de canal iónico" es un polinucleótido que codifica una subunidad de un canal iónico, o más de una subunidad o un canal iónico entero. Una "corriente de marcapasos" es una corriente eléctrica rítmica generada por material biológico o un dispositivo electrónico.

Un "canal HCN" denota un canal iónico de nucleótidos cíclicos (HCN) activado por hiperpolarización responsable de las corrientes de cationes activadas por hiperpolarización que son reguladas directamente por cAMP y contribuyen a la actividad del marcapasos en el corazón y en el cerebro.

"Inducir actividad biológica de marcapasos" en un corazón o en un lugar seleccionado denota hacer que el corazón o el sitio seleccionado genere un impulso eléctrico. El canal HCN puede incluir, pero sin estar limitado a, un canal HCN homólogo o heterólogo de tipo salvaje, un canal quimérico HCN, un canal muíante HCN, un canal quimérico-mutante HCN, es decir, un canal quimérico HCN en el que una o más porciones se derivan de un canal muíante HCN.

Como una solución terapéutica, un marcapasos biológico se puede utilizar para generar una frecuencia de laíidos esponíánea denlro de un rango fisiológicamente aceptable que se origina desde su lugar de implantación en el corazón. La "frecuencia de latidos" es (1) el rango de contracción del corazón/miocardio, de ahí una porción, o una contracción o coníracciones individuales de miocilo en un periodo de liempo específico por una célula (por ejemplo, el número de contracciones o latidos por minuto), o (2) el rango de producción de un pulso elécírico o pulsos eléctricos en un periodo de íiempo dado por una célula. Esío se puede lograr ya sea al aumeníar la proporción del sitio de células cardiacas normalmente espontáneas, aunque de activación muy lenía, o al iniciar una acíividad espontánea en una región normalmente inactiva. Debido a que la incoación de un impulso mediante un marcapasos biológico nativo depende del equilibrio entre un número de canales iónicos y transportadores, de los cuales muchos eslán modulados hormonalmeníe, existen varios méíodos posibles para crear un marcapasos biológico.

Estos métodos incluyen sobre-manifestación de receptores adrenérgicos beta-2 (pero sin estar limitados a la misma) para aumentar la frecuencia auricular endógena (Edelberg et al., 1998; 2001), manifestación de Kir2.1 AAA negativo dominante estruclura junto con el gen Kir2.1 de tipo salvaje para suprimir la corriente rectificadora interior, /?? (Miake eí al., 2002; 2003) sobre-manifestación de canales HCN2 para incrementar la corriente interna del marcapasos activada por hiperpolarización (If) y por lo tanto la frecuencia de iniciación de impulso (Qu et al., 2003; Plotnikov et al., 2004; Potapova et al., 2004), y crear nuevas células de marcapasos a partir de células embrionarias o células madre mesenquimales (Kehat et al., 2004; Xue et al., 2005). Estos métodos buscan manipular las determinantes básicas de la función original del marcapasos en corazones normales; esto es, cualquier intervención que aumente la potencia favorable, disminuye la corriente de re-polarización, y/o aumenta la corriente de despolarización durante la diástole debe aumentar la frecuencia de iniciación de impulso (Biel et al., 2002). Los métodos utilizados para lograr estos fines han involucrado la transferencia de genes mediante infección viral o transfección descubierta de plásmidos (Edelberg et al., 1998; 2001), el uso de células madre embrionarias incorporando un complemento de genes nativos (Kehat et al., 2004), o células madre mesenquimales de adulto (MSCs) diseñadas como plataformas para transportar genes de marcapasos (Potapova et al., 2004). La filosofía detrás del último método se muestra en la Figura 2. También se ha intentado la reproducción de impulsos eléctricos de marcapasos en células que no son cardiacas, y/o induciendo fusión a células cardiacas y no cardiacas (Cho et al., 2005). Cuando se selecciona una estrategia para los marcapasos biológicos, se debe considerar el potencial de una arritmogénesis. El método ideal crearía o incrementaría la actividad espontánea sin efectos secundarios no deseados. En este sentido, al incrementar la receptividad autónoma mediante el aumento de regulación de receptores adrenérgicos /3, presenta el problema de especificidad, ya que un incremento en el entorno favorable no es específico a una corriente iónica simple. El objetivo de las corrientes iónicas específicas, ya sea reduciendo la corriente rectificadora interior hiperpolarizante JKi o intensificando la corriente interna del marcapasos Jf, ambas dan como resultado un incremento en la corriente interna neta en la frecuencia de potenciales del marcapasos. Sin embargo, JRI también contribuye a la repolarización terminal, y su baja regulación resulta en un impulso eléctrico prolongado (Miake et al., 2002), el cual tiene posibilidades arrítmicas afines. Por el contrario, Jf solo fluye en potenciales diastólicos y no debe afectar la duración del impulso eléctrico. Por consiguiente, Jf es un objetivo molecular atractivo y es preferible para desarrollar marcapasos biológicos. Previamente se describió la generación de marcapasos biológicos basados en la manifestación de genes HCN. Ver por ejemplo, las Patentes U.S. Nos. 6,849,61 1 y 6,783,979. La Patente U.S. No. 6,849,61 1 muestra un canal iónico HCN que contiene una composición administrada a un sujeto que funciona como un sitio de iniciación de impulso donde la actividad del nodulo sinusal es anormal, así actuando como un marcapasos biológico para justificar el déficit en el nodulo sinusal. La Patente U.S. No. 6,783,979 muestra vectores que consisten de ácidos nucleicos que codifican canales iónicos HCN que se pueden aplicar a un tejido del corazón para así suministrar una corriente iónica en el tejido biológico del corazón. La administración apropiada de tales vectores puede proporcionar corrientes que actúen como marcapasos biológicos. También se describen en la Patente U.S. No. 6,783,979 los marcapasos biológicos basados en la manifestación de genes HCN en combinación con MiRPI. Todo el contenido de las patentes antes mencionadas se encuentran incorporadas en este documento como referencia en su totalidad. Las diferentes isoformas HCN muestran distintas propiedades biofísicas. Por ejemplo, en parches libres de células de oocitos de Xenopus, la curva de activación en estado estable de los canales HCN2 está 20 mV más hiperpolarizada que del HCNI. Además, mientras que la unión de cAMP a un CNBD cambia notablemente la curva de activación de HCN2 por 17mV a potenciales más positivos, la respuesta de HCNI es mucho menos pronunciada (cambio 4 mV). Los experimentos para generar actividad del marcapasos biológico se han enfocado en el HCN2 debido a que sus cinéticas son más favorables que aquellas del HCN4, y la receptividad de su cAMP es mayor que la del HCNI.

La figura 3 proporciona un punto de arranque para comprender el papel de los canales HCN y de la corriente Jf que llevan para iniciar el potencial del marcapasos. En pocas palabras, la despolarización fase 4 se inicia por una corriente de sodio hacia el interior activada con la hiperpolarización de la membrana celular y continúa y se mantiene por otras cuatro corrientes importantes (Biel et al., 2002). Lo anterior proporciona un equilibrio entre las corrientes que van hacia el interior impulsadas por el canal de calcio y el intercambiador de sodio/calcio y las corrientes que van hacia el exterior impulsadas por el potasio. La activación del potencial del marcapasos aumenta por las catecolaminas adrenérgicas /3 y se reduce por la acetilcolina a través de sus receptores acoplados de proteína G respectivos y el segundo sistema mensajero de adenilato ciclasa cAMP.

Los cDNAs completos que codifican las isoformas HCNI-4 fueron clonados a partir de diferentes especies y fueron tipificados funcionalmente por su manifestación en líneas celulares mamíferas.

Ver, por ejemplo, Santoro et al. (1998) y Ludwig et al. (1998) describiendo la clonación y la tipificación funcional del HCNI-3 de un cerebro de ratón; Ludwig et al. (1999) describiendo la clonación y la tipificación funcional del HCN2 y HCN4 de un corazón humano; Ishii et al. (1999) describiendo la clonación y la tipificación funcional del HCN4 de un corazón de conejo; Monteggia et al. (2000) describiendo la clonación del HCNI-4 en un cerebro de rata; y Steiber et al. (2005) describiendo la clonación y la tipificación funcional del HCN3 de un cerebro humano.

La Figura 4 muestra las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos HCNI de ratón (ID SEC No. ), rata (ID SEC No. ), humano (ID SEC No. ), conejo (ID SEC No. ) y conejillo de indias (secuencia parcial; ID SEC No. ), alineadas para una consistencia máxima.

Alineaciones similares para HCN2, HCN3 y HCN4 de una variedad de especies mamíferas se describen en las Figuras 7, 8 y 9 respectivamente. La identidad de aminoácido entre diferentes isoformas HCN en una especie varía alrededor de 45-60%, con diferencias en primer lugar debido a la identidad de baja secuencia en las regiones terminales N y C. Por ejemplo, las secuencias primarias de HCNI-3 tienen una identidad de aminoácido en conjunto de aproximadamente 60% (Ludwig et al., 1999), y el hHCN3 tiene 46-56% de homología con los otros hHCNs (Stieber et al., 2005). En cambio, se observaron grados de homología significativamente más elevados entre isoformas semejantes en diferentes especies. Por ejemplo, Ludwig et al. (1999) describe que el clon cDNA hHCN2 tiene 94% de identidad de secuencia en conjunto con un clon mHCN2; Stieber et al. (2005) describe que hHCN3 tiene 94.5% de homología de aminoácido con mHCN3; y en un análisis de los canales HCN, Biel et al. (2002) da a conocer que las secuencias primarias de los tipos de canales HCN individuales muestran 90% de identidad de secuencia en mamíferos.

Tabla 1 , adaptada de Stieber et al. (2005), Tabla de Suplemento S2, muestra la homología del aminoácido del hHCN3 con los otros hHCNs y con el mHCN3. Es especialmente notable el cerca del 100% de homología de las secuencias del hHCN3 y del mHCN3 en el área de la transmembrana del núcleo y el área vinculante del nucleótido cíclico. Las regiones terminales N y C del hHCN3 y del mHCN3 son 81 y 91% homologas, respectivamente, las cuales son más bajas que el grado de homología en las regiones de la transmembrana y del CNBD, pero aún más elevadas de forma considerable que el 22-35% de homología entre la terminal N del hHCN3 y las regiones de la terminal N de las otras isoformas hHCN, 17-27% de homología en las regiones de la terminal C, y 46-56% de homología en conjunto entre el hHCN3 y otras isoformas hHCN.

Tabla 1. Homología de Aminoácido entre hHCN3 y hHCNl , 2 y 4 y mHCN3 Para esta comparación, los aminoácidos idénticos y similares se consideran homólogos. 2 Dominio vinculante de nucleótido cíclico.

Los datos de homología anteriores sugieren que las isoformas HCN semejantes de diferentes especies se pueden sustituir eficazmente en esta invención; por ejemplo, el hHCN2 o pociones del mismo se pueden sustituir por mHCN2 o por porciones correspondientes del mismo. Por consiguiente, en esta invención, un marcapasos biológico o método que consista en el uso de HCN2 o porciones del mismo de una especie, por ejemplo un ratón, incluye el uso de HCN2 o de las porciones correspondientes del mismo de otras especies, de preferencia especies mamíferas, incluyendo, pero sin limitarse a, un humano, una rata, un perro, un conejo, o un conejillo de Indias. Del mismo modo, un marcapasos biológico o método que consista en el uso de HCNI, HCN3 o HCN4 de ratón o porciones de los mismos incluye el uso de HCNI, HCN3 o HCN4, o de las porciones correspondientes de los mismos, respectivamente, a partir de otras especies, preferentemente de otras especies de mamíferos.

Más generalmente, un marcapasos biológico o método que consista en el uso de una isoforma HCN en particular incluye el uso de un canal HCN mostrando por lo menos 75%, preferentemente por lo menos 85%, más preferentemente por lo menos 90%, y aún más preferentemente por lo menos 95% de homología en conjunto con esa isoforma. En representaciones de la invención que comprendan de porciones de una isoforma HCN, el uso de una porción de terminal N de una isoforma HCN en particular incluye el uso de una porción de terminal N de una canal HCN mostrando por lo menos 60%, preferentemente por lo menos 70%, más preferentemente por lo menos 80% de homología con la terminal N de esa isoforma. Además, el uso de una porción de la terminal C de una isoforma HCN en particular incluye el uso de una porción de terminal C de un canal HCN mostrando por lo menos 60%, preferentemente por lo menos 70%, más preferentemente por lo menos 80%, y aún más preferentemente por lo menos 90% de homología con la terminal C de esa isoforma.

El porcentaje de "homología" entre las secuencias de péptidos es el grado, expresado como porcentaje, al cual los residuos de aminoácidos en posiciones equivalentes en los péptidos son idénticos o funcionalmente similares cuando se alinean para una relación máxima.

Ejemplos de aminoácidos similares funcionalmente incluyen glutamina y asparagina; serina y treonina; y valina, leucina e isoleucina. El porcentaje de "identidad de aminoácidos" o el porcentaje de "identidad de secuencia" entre las secuencias de péptidos es el grado, expresado como porcentaje, al cual los residuos de aminoácidos en posiciones equivalentes en los péptidos son idénticos cuando se alinean para una relación máxima. Para péptidos, el porcentaje de homología es usualmente mayor que el porcentaje de identidad de secuencia. Para ácidos nucleicos, el porcentaje de "homología" es el mismo que el porcentaje de "identidad de secuencia", el cual es un grado, expresado como porcentaje, al cual los nucleótidos en posiciones equivalentes en los ácidos nucleicos son idénticos cuando se alinean para una relación máxima Para propósitos de la invención, dos secuencia que comparten homología, en otras palabras, un polinucleotido determinado y una secuencia de objetivo, puede hibridizarse cuando forman un complejo de doble cadena en una solución de hibridación de 6xSSC, 0.5% SDS, 5x de solución de Denhardt y 100 g de un portador de ADN no específico. Ver Ausubel et al., sección 2.9, suplemento 27 (1994). Tal secuencia puede hibridizarse a una "austeridad moderada", la cual se define como una temperatura de 60°C en una solución de hibridación de 6xSSC, 0.5% SDS, 5x de solución de Denhardt y 100 µg de un portador de ADN no específico. Para una hibridación de "austeridad alta", se aumenta la temperatura a 68°C. Siguiendo la reacción de hibridación de austeridad moderada, los nucleótidos se lavan en una solución de 2xSSC más 0.05% SDS cinco veces a temperatura ambiente, con lavados subsecuentes con O. lx SSC más 0.1% SDS a 60°C por una hora. Para austeridad alta, se aumenta la temperatura de lavado a aproximadamente 68°C. Los nucleótidos hibridizados pueden ser aquellos que se detectan al utilizar 1 ng de una sonda radiomarcada que tiene una radioactividad específica de 10,000 cpm/ng, en donde los nucleótidos hibridizados son claramente visibles después de una exposición de rayos X a -70°C por no más de 72 horas. Los métodos de alineación de secuencias para su comparación son bien conocidos en el medio.

La alineación de secuencias óptimo para su comparación se pueden llevar a cabo por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981); por el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970); por la búsqueda de método de similitud de Pearson y Lipman; Proc. Nati. Acad. Sci. 85: 2444 (1988); por implementaciones computarizadas de estos algoritmos, incluyendo: CLUSTAL en el programa de Genes de PC por Intelligenetics, Mountain View, California; GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Software de Genéticas de Wisconsin, Grupo de Computación de Genética (GCG), Science Dr. 575, Madison, Wisconsin, EE.UU.; Higgins y Sharp describen bien el programa CLUSTAL, Gen 73: 237-244(1988); Higgins y Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989); Corpet, et al., Investigación de Ácidos Nucleicos 16: 10881-90 (1988); Huang, et al., Aplicaciones de Computación en las Biociencias 8: 155-65 (1992), y Pearson et al., Métodos en Biología Molecular 24: 307-331 (1994).

La familia de programas BLAST, la cual se puede usar búsqueda de similitud de bases de datos incluye: BLASTN para secuencias de consulta de nucleótidos contra secuencias de bases de datos de nucleótidos; BLASTX para secuencias de consulta de nucleótidos contra secuencias de bases de datos de proteínas; BLASTP para secuencias de consulta de proteínas contra secuencias de bases de datos de proteínas; TBLASTN para secuencias de consulta de proteínas contra secuencias de bases de datos de nucleótidos; y TBLASTX para secuencias de consulta de nucleótidos contra secuencias de bases de datos de nucleótidos. Ver, Protocolos Actuales en Biología Molecular, Capítulo 19, Ausubel, et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990); y, Altschul et al., Res. Ácidos Nucleicos 25: 3389-3402 (1997). El software para ejecutar análisis BLAST está disponible al público, por ejemplo, a través del Centro Nacional para Información de Biotecnología (http://w w.ncbi¦nlm.nih¦gov ¦ Este algoritmo incluye la identificación de pares de secuencia de alto puntaje (HSPs) al identificar palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, las cuales son iguales o satisfacen algunos puntajes T de umbral con valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. La T se refiere al umbral de puntaje de la palabra vecina. Esta palabra vecina inicial acierta en la acción como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSPs más largas que las contengan. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde el puntaje de alineación acumulativo se pueda incrementar. Los puntajes acumulativos se calculan utilizando, los parámetros M (puntaje de compensación para un par de residuos que sean iguales, siempre >0) y N (puntaje de penalización para residuos que no sean iguales; siempre <0) para las secuencias de nucleótidos. Para las secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntaje para calcular el puntaje acumulativo. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se suspende cuando: el puntaje de alineación acumulativo desciende por la cantidad X de su máximo valor realizado; el puntaje acumulativo baja a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos con puntaje negativo; o se llega al final de cualquier secuencia. Los parámetros de algoritmo BLAST W, T, y X determinan las perceptibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza como predeterminado una longitud de palabra (W) de 1 1, una expectativa (E) de 10, un límite de 100, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como predeterminado una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntaje BLOSUM62 (Ver Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 89: 10915).

Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también desempeña un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, por ejemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 90:5873-5877 (1993)). Una medida de similitud provista por el algoritmo BLAST es la menor probabilidad de cantidad (P(N)), la cual proporciona una indicación de la probabilidad por la cual una igualdad entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos podría ocurrir por casualidad. Las búsquedas de BLAST asumen que las proteínas se pueden modelar como secuencias al azar.

Sin embargo, muchas proteínas auténticas comprenden de secuencias que no son aleatorias que pueden ser conductos homopoliméricos, repeticiones de periodos cortos, o regiones enriquecidas con uno a más aminoácidos. Tales regiones de baja complejidad se pueden alinear entre proteínas que no estén relacionadas aún cuando otras regiones de la proteína sean diferentes por completo. Se pueden utilizar un número de programas de filtro de baja complejidad para reducir tales alineaciones de baja complejidad. Por ejemplo, los filtros de baja complejidad de SEG (Wooten y Federen, Comput. Chem., 17: 149-163 (1993)) y de XNU (Claverie y States, Comput. Chem., 17: 191-201 (1993)) se pueden emplear por sí mismos o combinados.

La alineación múltiple de secuencias se puede llevar a cabo utilizando el método de alineación CLUSTAL (Higgins y Sharp (1989) CABIOS. 5: 151-153) con los parámetros predeterminados (SANCIÓN DE DIFERENCIA = 10, SANCIÓN DE LONGITUD = 10). Los parámetros predeterminados para alineaciones en pares que utilizan el método CLUSTAL son KTUPLE 1, SANCIÓN DE DIFERENCIA = 3, VENTANA = 5 y DIAGONALES CONSERVADAS = 5.

Marcapasos biológicos que constan de células que manifiestan canales quiméricos HCN Como se reveló anteriormente, esta invención proporciona células que manifiestan funcionalmente una variedad de polipéptidos quiméricos HCN a un nivel efectivo para inducir la corriente de marcapasos en las células. Tales células constituyen los marcapasos biológicos, donde el uso de ciertas quimeras otorga características benéficas para el marcapasos biológico (ver Ejemplo 6).

Marcapasos biológicos que constan de células que manifiestan canales imitantes HCN Esta invención también proporciona marcapasos biológicos que constan de una célula que manifiesta funcionalmente un polipéptido HCN mutante a un nivel eficaz para inducir una corriente de marcapasos en la célula. Casi todo lo que se conoce acerca de la activación de voltaje de canales iónicos proviene de estudios de canales activados por voltaje K+ (Kv). Aunque los canales HCN se abren en respuesta a la hiperpolarización de la membrana en vez de a la despolarización como en los canales Kv, los canales HCN tienen una topología transmembranal que es muy similar a los canales Kv. Todos estos canales iónicos tienen cuatro subunidades, las cuales tienen seis segmentos transmembranales cada una, S1-S6: el área S4 que está cargada positivamente forma el sensor de voltaje mayor, mientras que el S5 y S6, junto con el enlazador S5-S6 conectando a los dos, forman el área del poro que contiene el camino de impregnación de iones y las compuertas que controlan el flujo de iones (Larsson, 2002). La compuerta de activación está formada por el cruce del extremo de la terminal C de las espirales S6 (Decher et al., 2004). Se ha progresado mucho, basado en experimentos biofísicos y en las estructuras recientemente descritas de canales K+ bacteriales, para comprender las bases físicas para la activación y desactivación de compuertas, la permeabilidad selectiva de iones, y de mecanismos sensores de voltaje de canales iónicos. Sin embargo, aún no se comprenden en gran medida, los mecanismos moleculares por medio de los cuales los cambios en voltaje abren y cierran estos canales, y de igual manera, los mecanismos de acoplado entre los sensores de voltaje y las compuertas. En concreto, permanece poco claro como el mecanismo de acoplado da lugar a la dependencia de voltaje de activación opuesta para los canales HCN y Kv.

El acoplamiento del movimiento del sensor de voltaje para la apertura y cierre del poro del canal HCN podría implicar una reestructuración global de las áreas transmembranales S4, S5 y S6 sin la necesidad de interacciones específicas de aminoácidos. Sin embargo, estudios recientes sugieren que el acoplamiento físico puede incluir interacciones específicas entre aminoácidos en el enlazador S4-S5 y el área S6 (Chen et al., 2001a; Decher et al., 2004). Estos estudios sugieren que el enlazador S4-S5 es un componente importante del mecanismo de acoplamiento que media la apertura activada por hiperpolarización de los canales HCN.

La mutación puede alterar la detección de voltaje y la activación de los canales HCN. Por ejemplo, la mutagénesis por exploración de alanina del enlazador S4-S5 en el HCN2 reveló que tres aminoácidos eran especialmente críticos para la activación periódica normal (Chen et al., 2001a). La mutación de Y331 o de R339, y en menor grado, de E324, afecto el cierre del canal. La mutación de un residuo básico en el área S4 (R318Q) impidió la apertura del canal. Por el contrario, los canales con mutaciones dobles Y331 S y R328Q estaban constitutivamente abiertos.

Decher et al., (2004) identificó cinco residuos que eran importantes para la activación periódica normal mientras que las mutaciones afectaban el cierre del canal, utilizando mutagénesis por exploración de alanina del extremo de la terminal C de S6 y del enlazador C que conecta S6 con el CNBD. Análisis de mutación posteriores indicaron que una interacción electrostática específica entre R339 del enlazador S4-S5 y D443 del enlazador C estabiliza la condición cerrada y así participa en el acoplamiento de la detección de voltaje y de la activación periódica en los canales HCN. También se ha mostrado que las interacciones entre los residuos en el enlazador S4-S5 y el extremo de la terminal C del área S6 son importantes para la estabilización de los canales hERG y éter-á-go-go en una condición cerrada (Ferrer et al., 2006). Estos estudios de mutación indican que las mutaciones en el sensor de voltaje S4, el enlazador S4-S5 implicado en el acoplamiento de la detección de voltaje para la apertura y cierre del poro, el S5, S6 y el enlazador S5-S6 los cuales forman el poro, el enlazador C, y el CNBD, pueden ser particularmente importantes para afectar la actividad del canal HCN.

También se mostró que el enlazador S3-S4 (residuos 229EKGMDSEVY237 de HCNI) es importante para influenciar los fenotipos de activación de los canales HCN (Tsang et al., 2004). Específicamente, la eliminación completa del enlazador S3-S4 (?229-237), así como las eliminaciones ?229-234, ?232-234, y ?232-237, abolieron la actividad de corriente normal. Por otra parte, ?229-231, ?233-237, ?234-237, ?235-237, ?229-231/ ?233-237, ?229- 231/?234-237, y ?229-231/ ?235-237 produjeron corrientes internas activadas por hiperpolarización, dando a entender que las manipulaciones de la longitud del enlazador S3-S4 puede proporcionar una forma flexible para adaptar la activación periódica de HCN para ajustar la actividad eléctrica de células endógenas y diseñadas que manifiestan el HCN. Recientemente, se mostró que la manifestación de mHCNI- ?235-237 (HCNI-???) en la aurícula izquierda de cerdos con síndrome de seno enfermo, consistentemente induce actividad estable de marcapasos biológico receptivo a la catecolamina en el corazón porcino transfectado in situ (Tse et al., 2006). Este marcapasos biológico mostró una frecuencia cardiaca fisiológica y fue capaz de dar ritmo confiadamente al miocardio, reduciendo sustancialmente el ritmo electrónico por medio de un marcapasos electrónico implantado de cámara doble (Tse et al., 2006).

Por consiguiente, esta invención proporciona un marcapasos biológico, donde el marcapasos biológico consta de una célula implantable que manifiesta fiincionalmente un canal iónico HCN muíante a un nivel eficaz para inducir una corriente efectiva del marcapasos en la célula. En representaciones preferidas el canal HCN muíante proporciona una caracíerísíica mejorada, en comparación con un canal HCN de lipo salvaje, incluyendo, pero sin limiíarse a, cinéíicas más rápidas, activación más posiíiva, niveles de manifesíación aumenlados, esíabilidad aumentada, recepíividad cAMP mejorada, y respuesía neurohumoral mejorada. En ciertas represeníaciones de esía invención, el canal HCN muíanle lleva por lo menos una muíación en el sensor de voltaje S4, en el enlazador S4-S5, en el S5, S6, en el enlazador S5-S6, y/o en el enlazador C, y en el CNBD, tales mutaciones dan como resultado una o más de las características planteadas previamente. En otras representaciones, el mulante HCN es E324A-HCN2, Y331A-HCN2, R339A-HCN2, o Y331A,E324A-HCN2. En representaciones preferidas, el canal HCN mutaníe es E324A-HCN2. Además de las muíaciones que se observaron anteriormente, se reportaron muchas mutaciones en diferentes isoformas HCN. Chen et al. (2001a) reportó R318Q, W323A, E324A, E324D, E324K, E324Q, F327A, T330A y Y331A, Y331D, Y331F, Y331K, D332A, M338A, R339A, R339C, R339D, R339E y R339Q en el HCN2 para investigar con mayor detalle el papel de los residuos E324, Y331 y R339 en la detección y activación de voltaje. Chen eí al. (2001b) íambién reportó las muíaciones R538E y R591E en el mHCNI; Tsang eí al. (2004) reportó G231A y M232 en el mHCNI; Vemana eí al.(2004) reportó R247C, T249C, K250C, 1251C, L252C, S253C, L254C, L258C, R259C, L260C, S261C, C318S, S338C en el mHCN2; Marci y Accili (2004) íambién reportaron S306Q, Y331D y G404S en el mHCN2; y Decher eí al. (2004) reportó Y331A, Y331D, Y331S, R331FD, R339E, R339Q, I439A, S441A, S441T, D443A, D443C, D443E, D443K, D443N, D443R, R447A, R447D, R447E, R447Y, Y449A, Y449D, Y449F, Y449G, Y449W, Y453A, Y453D, Y453F, Y453L, Y453W, P466Q, P466V, Y476A, Y477A y Y481A en el mHCN2. El contenido complelo de íodas las publicaciones antes mencionadas se encuentran incorporadas aquí para referencia. Algunas de las mutaciones reportadas en la lisia previa pueden otorgar, de manera individual o en combinación, características benéficas en el canal HCN en cuanío a la creación de un marcapasos biológico. La invención que aquí se da a conocer abarca íodas las muíaciones en los canales HCN, individualmente o en combinaciones, lo cual mejora la acíividad del marcapasos del canal al proporcionar cinéticas más rápidas, activación más positiva, manifestación y/o estabilidad aumentada, receptividad cAMP mejorada, y/o respuesta neurohumoral mejorada.

Los experimentos revelados aquí exploraron la mutación de E324A en mHCN2 la cual se reportó que muestra cinéticas más rápidas y una relación de activación más positiva (Chen et al., 2001 A). Ambas características deben mejorar el ritmo. Los ejemplos de la actividad de marcapasos de E324A comparada con HCN2 cuando se manifiesta en miocitos, oocitos de Xenopus, y en corazones de perros en situ, se proporcionan en el Ejemplo 1.

Otro método para aumentar la actividad del marcapasos biológico de un canal HCN al incrementar la magnitud de la corriente manifestada y/o al acelerar sus cinéticas de activación, es co-manifestar el HCN con su subunidad beta, MiRPI. Como se describe en el Ejemplo 3, la infección de cultivos de miocitos con un adenovirus HCN2 y un segundo adenovirus que era una forma marcada HA de MiRPI resulta en un aumento significativo en la magnitud de la corriente y en la aceleración de la activación y desactivación de las cinéticas. Ver también la Patente U.S. 6,783,979 y Qu et al., (2004), todo el contenido se encuentra aquí como referencia. Se reportaron muchas mutaciones MiRPI (ver, por ejemplo, Mitcheson et al., 2000; Lu et al., 2003; Piper et al., 2005), y ciertas de estas mutaciones, o combinaciones de las mismas, pueden ser benéficas para incrementar la magnitud y las cinéticas de activación de la corriente manifestada por un canal HCN usado para crear un marcapasos biológico. La invención que se da a conocer incluye todas esas mutaciones, o combinaciones de las mismas, en MiRPI.

Entrega de genes de canal HCN a células para formar marcapasos biológicos Los genes o mutantes o quimeras usados para manifestar canales iónicos y conexinas cardiacas en marcapasos biológicos se deben enviar al corazón. Se conocen varios métodos en el medio para introducir ADN a las células, y de estos, existen por lo menos tres métodos generales para enviar ADN dentro de los corazones: uso de ADN descubierto, vectores virales, y células; entre el último se encuentran las hMSCs o las células madre embrionarias ESCs. Aunque la experimentación empleó hMSCs y ESCs, cualquier tipo de célula que manifieste los genes HCN y los genes de conexinas cardiacas, o se pueden crear para que lo hagan, puede funcionar como un sistema de entrega celular. Ejemplos de tipos alternativos de células que se pueden usar como plataformas de envío para genes de marcapasos incluyen, cualquier célula madre de traslado tardío, un cardiomiocito, un fibroblasto o célula del esqueleto diseñada para manifestar conexinas, o una célula endotelial.

Cada método de envío de genes tiene dificultades únicas. El ADN descubierto es mal utilizado y sus efectos sólo duran poco tiempo. Los vectores virales son mucho más eficientes pero el uso de adenovirus con replicación deficiente que tienen un bajo potencial infeccioso aumenta la probabilidad de una mejora transitoria en la función de marcapasos así como respuestas inflamatorias potenciales, mientras que el uso de retrovirus y otros vectores virales más persistentes corren el riesgo de carcinogeneidad e infectividad. Una manera de evitar el uso de vectores virales, es confiar en el tratamiento de la célula usando, por ejemplo, hESCs o hMSCs. Varios laboratorios se encuentran explorando el uso de ESCs que se puedan diferenciar a lo largo de una descendencia cardiaca y puedan proporcionar un control del ritmo cardiaco basado en la célula. Entre las ventajas de estas células es que crean nexos de unión funcionales y generan ritmos espontáneos (Rosen et al., 2004). Sin embargo, tales métodos aún se encuentran en su infancia y presentan problemas, incluyendo la inmunogenicidad de las células, identificación de descendencias celulares adecuadas, la posibilidad de diferenciación de células madre en líneas en lugar de células de marcapasos, y potencial para neoplasia (Rosen et al., 2004). Por otro lado, el emplear hMSCs adultas diseñadas genéticamente derivadas de médula ósea como plataformas para enviar los canales iónicos al corazón (Potapova et al., 2004), evita reacciones alérgicas pero aun así requiere de una manifestación persistente y segura del transgénico. En esta configuración, se consideraría a las células como un vector inerte biológicamente que podría enviar información molecular/genética al miocardio contiguo. Los experimentos descritos más adelante indican que las hMSCs proporcionan una plataforma conveniente para los canales iónicos de envío del marcapasos hacia el corazón. Otros tipos de células que pueden permitir el embalaje del material genético del marcapasos in vitro y enviar los canales iónicos del marcapasos dentro del corazón incluyen, pero no se encuentran limitados a cualquier célula madre de traslado tardío, fibroblastos que manifiestan conexinas, cardiomiocitos, células de músculo esquelético, y células endoteliales. La electroporación es un método in vitro preferido para células diseñadas genéticamente tales como las hMSCs para sobre manifestar If (canales HCN) para envío in vivo. La electroporación es una técnica en donde la exposición de las células a un breve pulso de alto voltaje abre temporalmente los poros en las membranas de la célula que permiten a las macromoléculas, tales como ADN y proteínas, entrar en la célula. Se ha demostrado que la electroporación también se puede aplicar in vivo para enviar ácidos nucleicos y proteínas a las células de los músculos de animales vivos incluyendo ratas, ratones y conejos (ver Patente U.S. No. 6,1 10, 161), y el método se ha usado para enviar ADN directamente al corazón de un pollito embrionario (Harrison et al., 1998) y a un miocardio mamífero antes del trasplante (Wang et al., 2001c).

Otros métodos para insertar los genes a una célula implantable para enviar al corazón incluyen la transfección viral usando, por ejemplo, adenovirus, AAV, y lentivirus, transfección por liposoma (lipofección), transfección utilizando un reactivo químico de transfección, transfección de choque térmico, o micro-inyección. AAV, un pequeño parvovirus asociado con el adenovirus que no se puede duplicar por sí mismo y requiere de una co-infección con adenovirus o herpesvirus para poder duplicarse. En ausencia del virus auxiliar, el AAV entra en una fase latente durante la cual se integra establemente en el genoma de la célula anfitriona. Esta fase latente hace al AVV conveniente para ciertas aplicaciones de tratamiento de genes incluyendo la transferencia de genes hasta cerca de 4.4kb, ya que el gene que se inserta al AVV puede durar en el genoma de la célula anfitriona por un largo periodo (Pfeifer y Verma, 2001). El lentivirus, un miembro de la familia retroviral, proporciona una alternativa potencialmente interesante (Amado y Chen, 1999; Trono, 2002). A diferencia de los adenovirus, la electroporación y el uso de vectores lentivirales permiten una manifestación transgénica persistente sin provocar respuestas inmunes del anfitrión.

La seguridad es factor que se tiene que demostrar especialmente con vectores virales. La ausencia de arritmias y neoplasia generada por vectores virales o células se debe demostrar junto con la ausencia de infección o injerto en sitios distantes. Una vez que se ha demostrado la seguridad y eficacia, también se deberá considerar el costo-beneficio. Aún si se superan los problemas de manifestación y de entrega, la persistencia a largo plazo de un marcapasos basado en células requiere de la ausencia de rechazo en caso de que se empleen células no autólogas. En este sentido, las hMSCs se pueden obtener de una fuente autóloga. Sin embargo, la evidencia que indica que estas células son inmunoprivilegiadas (Liechty et al. 2000) puede reducir la necesidad de fuentes autólogas. La extensión a largo plazo de este privilegio no se ha probado, pero ningún rechazo humoral o celular fue evidente seis semanas después de la inyección de hMSCs en los corazones caninos (Plotnikov et al., 2005b). El rechazo sigue siendo una especulación para las células madre embrionarias. Las soluciones alogénicas basadas en la condición inmunoprivilegiada de las hMSCs proporcionarían un modelo más favorable debido a que las células comerciales podrían estar listas para la implantación.

En diferentes representaciones de los sistemas de marcapasos y de los métodos que se describen aquí, el ácido nucleico se introduce directamente dentro de la célula del corazón mediante la infección con un vector viral, transformación plásmida, transformación cósmida, electroporación, lipofección, transfección mediante un reactivo de transfección química, transfección de choque de calor, o microinyección. En otras representaciones, el vector viral es un adenoviral, un AAV, o un vector retroviral. En otras representaciones adicionales, el vector se administra sobre o dentro del corazón mediante inyección o cateterización. En representaciones adicionales, el vector se administra sobre o dentro de una aurícula, en una pared de un ventrículo, en la rama de un ventrículo, o en el sistema conductivo LV cercano del corazón.

En ciertas representaciones, el ácido nucleico se introduce dentro de una célula para así inducir una corriente en ese lugar, cuya célula se administra en el corazón. Preferentemente, la célula forma un sincitio funcional con el corazón y es una célula madre, cardiomiocito, fibroblasto o célula de músculo de esqueleto diseñada para manifestar por lo menos una conexina cardiaca, o una célula endotelial. En ciertas representaciones, la célula madre es una MSC o una ESC que es substancialmente incapaz de diferenciarse. En representaciones preferidas, la célula madre es una hMSC o una KESC que es substancialmente incapaz de diferenciarse. En representaciones adicionales, las hMSCs adultas que son substancialmente incapaces de diferenciarse se traspasaron por lo menos 9 veces, y en algunas representaciones preferentemente de 9 a 12 veces.

El ácido nucleico se puede introducir en la célula madre mediante la electroporación, infección con un virus incluyendo, pero sin limitarse a, adenovirus, AAV o lentivirus, transformación plásmida, transformación cósmida, lipofección, transfección mediante un reactivo de transfección química, transfección de choque de calor, o microinyección.

Asumiendo la seguridad y persistencia de la manifestación transgénica, un marcapasos biológico basado en una célula también requiere envío focal o de sitio específico. Hay varios métodos factibles para lograr una entrega focal; por ejemplo, el uso de catéteres y agujas, y/o el crecimiento en una matriz y un "adhesivo". Sin importar que método se seleccione, las células entregadas no deben dispersarse demasiado lejos del sitio objetivo. Tal dispersión podría presentar efectos eléctricos no deseados dentro del corazón o en otros órganos. Es notable que en un estudio preliminar concerniente a una inyección de hasta ~106 hMSCs transfectadas HCN2 dentro del subepicardio LV de seis perros adultos, se encontraron consistentemente nidos de hMSCs junto al sitio de la inyección pero no a distancia (Plotnikov et al., 2005b).

En varias representaciones de los métodos y sistemas de marcapasos instantáneos, las células implantables se administran sobre o dentro del corazón mediante una inyección, cateterización, inserción quirúrgica, o fijación quirúrgica. El sitio de entrega se determina en el momento de la administración, basado en la patología del paciente, para dar una activación óptima y una respuesta hemodinámica. Así, el sitio seleccionado podría ser el nodulo sinusal (SA), el haz de Bachmann, la región de cruce auriculoventricular, haz de His, la rama izquierda o derecha, fibras de Purkinje, músculo ventricular o músculo auricular izquierdo o derecho, el sitio apropiado que sea bien conocido por alguien con capacidad en el medio. El tipo de canal iónico HCN que se manifiesta en el corazón también puede cambiar dependiendo del sitio de entrega. Además, los diferentes niveles de manifestación del gen del canal iónico puede ser conveniente en diferentes sitios de entrega. Tales niveles diferentes de manifestación se pueden obtener utilizando diferentes promotores para impulsar la manifestación.

En otra representación, la célula se administra localmente por inyección o cateterización directamente sobre o dentro del corazón. En representaciones adicionales, la célula se administra sistemáticamente por inyección o cateterización en un vaso sanguíneo coronario o en un vaso sanguíneo cercano al corazón. Aún en representaciones adicionales, la célula se inyecta sobre o dentro de un área de una aurícula o ventrículo del corazón. En otras representaciones, la célula se inyecta sobre o dentro de la aurícula izquierda, en una pared de un ventrículo, en una bolsa de bulto de un ventrículo, o en el sistema conductivo LV cercano del corazón.

Sistema tándem que consta de marcapasos electrónicos y biológicos. Esta invención incluye un sistema tándem de marcapasos para tratar trastornos de ritmo cardiaco que comprenden de la combinación de cualquiera de los marcapasos biológicos con un marcapasos electrónico que se describen en este documento. La Aplicación Provisional U.S. Nos. 60/701,312 presentado el 21 de julio del 2005; 60/781,723 presentado el 14 de marzo del 2006, y Serial U.S. No. 1 1/490,997, presentado el 21 de julio del 2006, proporcionan datos experimentales que muestran, inter alia, que los marcapasos biológicos basados en la manifestación de genes HCN o quimeras o mutantes de lo mismo operan perfectamente en conjunto con los marcapasos electrónicos para prevenir que la frecuencia cardiaca caiga por debajo de una frecuencia mínima seleccionada. El sistema tándem también conserva el número total de latidos electrónicos enviados, y proporciona una frecuencia cardiaca más elevada, más fisiológica y receptiva a la catecolamina que es el caso con sólo el marcapasos electrónico. Los contenidos de la Aplicación Provisional U.S. Nos. 60/701 ,312 presentado el 21 de julio del 2005; 60/781,723 presentado el 14 de marzo del 2006, y Serial U.S. No. 1 1/490,997, presentado el 21 de julio del 2006, están incorporados en este documento como referencia en su totalidad.

Los marcapasos electrónicos son conocidos en el medio. Los marcapasos electrónicos ejemplares se describen en la Patente U.S. Nos. 5,983,138, 5,318,597 y 5,376,106; Hayes (2000); y Moses et al. (2000), todo el contenido está incorporado aquí por referencia. Puede ser que ya le hayan adaptado un marcapasos electrónico al sujeto, o puede ser acondicionado con uno simultáneamente o después de la colocación del marcapasos biológico. El sitio apropiado para el marcapasos electrónico sería bien conocido para un practicante capacitado, dependiendo de la condición del sujeto y de la colocación del marcapasos biológico de esta invención. Por ejemplo, si el sujeto tuviera un nodulo sinusal funcional, pero que tuviera un bloqueo entre el nodulo sinusal y el nodulo uriculoventricular, sería preferible administrar el marcapasos biológico en el nodulo auriculoventricular. Los sitios de inserción preferidos incluyen, pero sin estar limitados a, el haz de Bachmann, el nodulo sinusal, la región de cruce auriculoventricular, haz de His, la rama izquierda o derecha, fibras de Purkinje, el músculo auricular izquierdo o derecho, o el músculo ventricular del corazón del sujeto.

En representaciones preferidas de esta invención, el marcapasos electrónico está programado para producir su señal de marcapasos cuando sea necesario, es decir, para detectar los latidos generados biológicamente y para descargar eléctricamente cuando el marcapasos biológico falle en dispararse y/o el puente de bypass dirija la corriente por más de un intervalo de tiempo programado. En este momento, el marcapasos electrónico tomará el control de la función del marcapasos hasta que el marcapasos biológico reanude su actividad. Por consiguiente, se debe determinar cuando el marcapasos electrónico producirá su señal de marcapasos. Los marcapasos de vanguardia tienen la capacidad de detectar cuando disminuye la frecuencia cardiaca por debajo de un nivel en respuesta al cual un marcapasos electrónico debe producir una señal. El nivel puede ser un número fijo, pero de preferencia varía dependiendo de la actividad del paciente, como actividad física o estado emocional. Por ejemplo, cuando el paciente se encuentra descansando o mantiene una actividad ligera, la frecuencia cardiaca base puede estar en 60-80 latidos por minuto (bpm) (personalizado para cada paciente). Esta frecuencia cardiaca base varía dependiendo de la edad y de la condición física del paciente, con pacientes atléticos que típicamente tienen frecuencias cardiacas base más bajas. El marcapasos electrónico se puede programar para producir una señal de marcapasos cuando la frecuencia cardiaca real del paciente (incluyendo la inducida por cualquier marcapasos biológico) caiga por debajo de cierto nivel base de frecuencia cardiaca, cierta diferencia, u otras formas conocidas por aquellos capacitados en el medio. Cuando el paciente está descansando la frecuencia cardiaca base será la frecuencia cardiaca en reposo. La frecuencia cardiaca base probablemente cambiará dependiendo del nivel de la actividad física o estado emocional del paciente. Por ejemplo, si la frecuencia cardiaca base es de 80 bpm, el marcapasos electrónico se puede programar para producir una señal de marcapasos cuando se detecte que la frecuencia cardiaca real esté cerca de los 64 bpm (es decir, 80% de 80 bpm).

El componente electrónico también se puede programar para intervenir en momentos de ejercicio en caso de que el componente biológico falle, interviniendo a una frecuencia cardiaca elevada y después reduciéndola gradualmente a un ritmo base. Por ejemplo, si la frecuencia cardiaca aumenta a 120 bpm debido a una actividad física o estado emocional, el nivel puede aumentarse a 96 bpm (80% de 120 bpm). La porción biológica de esta terapia toma en cuenta la receptividad autónoma y el margen de frecuencias cardiacas que caracterizan a los marcapasos biológicos y a las frecuencias base que funcionan como una red de seguridad, caracterizando al marcapasos electrónico. El marcapasos electrónico se puede ajustar para enviar señales de marcapasos cuando sea que exista una pausa de un intervalo de X% (es decir, 20%) más elevado que el intervalo anterior, mientras que el intervalo anterior no sea debido a una señal del marcapasos electrónico y que fuera de una frecuencia mayor que alguna frecuencia mínima (por ejemplo, 50 bpm).

Por consiguiente, en una representación de estos sistemas de marcapasos, el marcapasos electrónico detecta la frecuencia cardiaca y produce una señal de marcapasos cuando la frecuencia cardiaca cae por debajo de un nivel específico. En una representación adicional, el nivel especificado es una porción específica de la frecuencia cardiaca experimentada por el corazón en un intervalo de tiempo de referencia. En otra representación adicional, el intervalo de referencia es un periodo de tiempo que precede inmediatamente de una duración específica. Como se describe en este documento, los marcapasos biológicos implantados se probaron en conjunto con los marcapasos electrónicos en estudios caninos.

El marcapasos electrónico se programó a un intensidad de liberación predesignado y se monitoreó la frecuencia de los latidos del corazón que arrancan electrónicamente contra los que arrancan biológicamente. De esta manera, el componente electrónico mide la eficacia del componente biológico de una unidad tándem de marcapasos. Se espera que tales marcapasos tándem biológicos-electrónicos no sólo cumplir con los estándares de protección del paciente que se requieren en la Fase 1 y 2 de las pruebas clínicas, pero que también ofrezcan ventajas terapéuticas sobre los marcapasos totalmente electrónicos. Es decir, el componente biológico del sistema tándem funcionará para hacer que la frecuencia cardiaca varíe sobre el rango requerido por el ejercicio o estado emocional del paciente, mientras que el componente electrónico proporcionara una red de seguridad en caso de que el componente biológico llegara a fallar parcial o totalmente. Además, al reducir la frecuencia de los latidos electrónicos que se producirían con el transcurso del tiempo por un marcapasos electrónico solamente, la unidad tándem extenderá la vida útil de la batería del componente electrónico. Esto podría incrementar profundamente el intervalo de reemplazo requerido de las baterías. Por lo tanto, los componentes del sistema tándem de marcapasos operan sinérgicamente para maximizar la oportunidad de un control de ritmo cardiaco fisiológico y seguro.

Métodos de Tratamiento con el Sistema Tándem de Marcapasos El concepto tándem de marcapasos plantea varios puntos con respecto a aplicaciones clínicas. Primero, el sistema es redundante por diseño y tendría dos modos de falla no relacionados ente sí. Dos sitios de implante independientes y fuentes de energía independientes proporcionarían un mecanismo seguro en caso de pérdida de captura (por ejemplo, debido a un infarto al miocardio). Segundo, el marcapasos electrónico proveería no sólo una red de seguridad base, sino una bitácora continua de todos los latidos del corazón para que los médicos los revisen, así proporcionando una visión de la fisiología en desarrollo del paciente y del desempeño des sus sistemas tándem de marcapasos. Tercero, debido a que el marcapasos biológico se diseñará para llevar a cabo la mayoría del ritmo cardiaco, la longevidad del marcapasos electrónico podría mejorar considerablemente. Por otro lado, la longevidad se puede mantener si después se pudiera reducir el tamaño del marcapasos electrónico. Finalmente, el componente biológico de un sistema tándem proporcionaría receptividad autónoma veraz, un objetivo que ha eludido más de 50 años de investigación y desarrollo del marcapasos electrónico.

Esta invención también proporciona un método para tratar a un sujeto afectado con un trastorno de ritmo cardiaco, tal método consta de la administración de un sistema tándem de marcapasos de esta invención al sujeto. Se suministra un marcapasos biológico al corazón del sujeto para generar una corriente efectiva de marcapasos biológico. También se proporciona un marcapasos electrónico al corazón del sujeto para trabajar en conjunto con el marcapasos biológico para tratar el trastorno del ritmo cardiaco. El marcapasos electrónico se puede proveer antes, simultáneamente o después del marcapasos biológico. Los marcapasos electrónico y biológico se proporcionan al área del corazón mejor situada para compensar/tratar el trastorno del ritmo cardiaco. Por ejemplo, el marcapasos biológico se puede administrar en, pero sin estar limitado a, el haz de Bachmann, el nodulo sinusal, la región de cruce auriculoventricular, haz de His, el músculo auricular o ventricular izquierdo o derecho, la rama izquierda o derecha, o las fibras de Purkinje del corazón del sujeto. El marcapasos biológico es como se describe previamente y preferiblemente mejora la receptividad adrenérgica beta del corazón, disminuye la corriente saliente ??? de potasio, y/o aumenta la corriente de entrada If.

El marcapasos electrónico trabaja en conjunto con el marcapasos biológico como se describe previamente. Por ejemplo, el marcapasos electrónico está programado para detectar la frecuencia de latidos del corazón del sujeto y para producir una señal de marcapasos cuando la frecuencia de latidos del corazón cae por debajo de una frecuencia de latidos del corazón seleccionada. En otras representaciones, la frecuencia de latidos elegida es una proporción seleccionada de la frecuencia de latidos experimentada por el corazón en un intervalo de tiempo de referencia. En otras representaciones, el intervalo de tiempo de referencia es un periodo de tiempo que precede inmediatamente de una duración específica. Como tal, la vida útil de la batería del marcapasos electrónico se preserva o dura más ya que no necesita "ponerse en marcha" o enviar señales de fijación de ritmo tan seguido ya que el marcapasos biológico genera una señal efectiva de fijación de ritmo en el sistema tándem.

Un trastorno de ritmo cardiaco es cualquier trastorno que afecta la frecuencia cardiaca del corazón y hace que varíe de una frecuencia cardiaca normal saludable. Por ejemplo, el trastorno puede ser, disfunción del nodulo sinusal, bradicardia sinusal, actividad marginal del marcapasos, síndrome del seno enfermo, insuficiencia cardiaca, taquiarritmia, taquicardia de reingreso del nodulo sinusal, taquicardia auricular a partir de un foco ectópico, flúter auricular, fibrilación auricular, o una bradiarritmia. En tales situaciones, el marcapasos biológico se administra preferentemente en el músculo auricular derecho o izquierdo, en el nodulo sinusal o en la región de cruce auriculoventricular del corazón del sujeto.

En cierta representación de estos métodos para tratar trastornos de ritmo cardiaco, se separa la fuente preexistente de actividad de marcapasos en el corazón, para no estar en conflicto con el marcapasos biológico y/o el marcapasos electrónico.

Esta invención además proporciona un método para inhibir los síntomas iniciales de un trastorno de ritmo cardiaco en un sujeto propenso a tal trastorno que consta de (a) inducir la actividad del marcapasos biológico en el corazón del sujeto al manifestar en el corazón uno de (1) un ácido nucleico codificando un canal iónico HCN o un muíante o quimera de lo mismo, (2) un ácido nucleico codificando una subunidad beta MiRPI o un muíante de lo mismo, y (3) un ácido nucleico codificando ambos (i) un canal iónico HCN o un muíaníe o quimera de lo mismo y (ii) una subunidad beía MiRPI o un muíanle de lo mismo, a un nivel eficaz para inducir una acíividad del marcapasos en el corazón; y (b) implaníar un marcapasos electrónico en el corazón, para así por consiguiente inhibir los síntomas iniciales del trastorno en el sujeto. En ciertas representaciones se provee de un marcapasos biológico de esta invención al sujeto.

Esta invención también proporciona un método para inducir en una célula, una corrienle capaz de eslimular una acíividad de marcapasos biológica que comprende de la administración al corazón de cualquiera de los marcapasos biológicos descritos aquí y por consiguiente manifestar un canal iónico HCN o un mutante o quimera de lo mismo en el corazón, y/o una subunidad beta MiRPI o un mutante de lo mismo en el corazón, a un nivel eficaz para inducir en la célula una corriente capaz de estimular la actividad de marcapasos biológica, para así por consiguiente inducir tal corriente en la célula.

La invención revelada aquí también proporciona un método para aumentar la frecuencia cardiaca en un sujeto, el cual consta de la administración al corazón de cualquiera de los marcapasos biológicos descritos aquí y por consiguiente manifestar un canal iónico HCN o un mutante o quimera de lo mismo en el corazón, y/o una subunidad beta MiRPI o un mutante de lo mismo en el corazón del sujeto, a un nivel eficaz para reducir la constante de tiempo de activación de la célula, para así aumentar la frecuencia cardiaca en el sujeto.

Los pasos identificados previamente en el método anterior también se pueden usar en métodos para causar una contracción de la célula, para reducir el tiempo requerido para activar una célula, y para cambiar el potencial de membrana de una célula.

Otros métodos Los pasos del método anterior también se pueden utilizar para preservar la vida útil de la batería de un marcapasos electrónico implantado en el corazón de un sujeto, y para mejorar la función de ritmo cardiaco de un marcapasos electrónico implantado en el corazón de un sujeto. Esta invención también proporciona un método para monitorear señales cardiacas con un marcapasos electrónico al tener funciones de detección implantado en el corazón de un sujeto, el cual consta de (a) seleccionar un sitio sobre o dentro del corazón, (b) inducir la actividad del marcapasos biológico en un sitio seleccionado por cualquiera de los métodos que se describen aquí para así mejorar la actividad natural del marcapasos en el corazón, (c) monitorear las señales del corazón con el marcapasos electrónico, y (d) almacenar las señales del corazón.

Esta invención también provee un método para mejorar la función de ritmo cardiaco de un marcapasos electrónico al tener funciones de detección y de demanda de ritmo implantado en el corazón de un sujeto, el cual consta de (a) seleccionar un sitio sobre o dentro del corazón, (b) inducir la actividad del marcapasos biológico en un sitio seleccionado por cualquiera de los métodos que se describen aquí para así mejorar la actividad natural del marcapasos en el corazón, (c) monitorear las señales del corazón con el marcapasos electrónico, (d) determinar cuando el corazón debe ir al ritmo basado en las señales del corazón, y (e) estimular selectivamente el corazón con el marcapasos electrónico cuando la actividad natural del marcapasos en conjunto con la actividad del marcapasos biológico no capta al corazón.

Esta invención también proporciona un método para tratar a un sujeto afectado con un trastorno de ritmo cardiaco que consta de la administración en una región del corazón del sujeto, de cualquiera de las células que manifiestan un polipéptido HCN de los descritos en este documento, en donde la manifestación del polipéptido HCN en dicha región del corazón sea efectiva para inducir una corriente de marcapasos en el corazón y por lo tanto tratar al sujeto.

Esta invención además proporciona un método para inhibir los síntomas iniciales de un trastorno de ritmo cardiaco en un sujeto propenso a tal trastorno que consta de la administración en una región del corazón del sujeto, de cualquiera de las células que manifiestan un polipéptido HCN de los descritos en este documento, en donde la manifestación del polipéptido HCN en el corazón sea efectiva para inducir una corriente de marcapasos en el corazón y por lo tanto inhibir los síntomas iniciales del trastorno en el sujeto. En representaciones preferentes de los métodos instantáneos, el polipéptido HCN es un polipéptido quimérico HCN.

Como se usa en este documento, "tratar" a un sujeto afectado por un trastorno es hacer que el sujeto experimente una reducción, remisión o regresión del trastorno y/o de sus síntomas. En una representación, se previene la reincidencia del trastorno y/o de sus síntomas. En una representación preferida, se cura al sujeto del trastorno y/o de sus síntomas.

"Inhibir" es aminorar la posibilidad de, o retrasar, el síntoma inicial del trastorno, o prevenir el síntoma inicial del trastorno por completo. En una representación preferida, inhibir el síntoma inicial de un trastorno significa prevenir su síntoma inicial en su totalidad.

"Inhibir el síntoma inicial" de un trastorno es aminorar la posibilidad de, o retrasar, el síntoma inicial del trastorno, o prevenir el síntoma inicial del trastorno por completo. En una representación preferida, inhibir el síntoma inicial de un trastorno significa prevenir su síntoma inicial en su totalidad.

"Administrar" es enviar en una manera que se efectúe o lleve a cabo utilizando cualquiera de los diferentes métodos y sistemas de envío conocidos por aquellas personas capacitadas en el medio. La administración se puede realizar, por ejemplo, pericardialmente, intracardialmente, subepicardialmente, transendocardialmente, mediante implante, mediante catéter, intracoronariamente, endocardialmente, intravenosamente, intramuscularmente, mediante toracoscopía, subcutáneamente, parenteralmente, tópicamente, oralmente, intraperitonealmente, intralinfáticamente, intralesionalmente, epiduralmente, o por electroporación in vivo. La administración también se puede realizar, por ejemplo, una vez, varias veces, y/o por uno o más periodos prolongados.

Un "sujeto" es cualquier animal o animal modificado artificialmente. Los animales pueden ser, pero sin estar limitados a, humanos, primates no humanos, perros, gatos, vacas, caballos, ovejas, puercos, conejos, hurones, roedores tales como ratones, ratas, conejillo de indias, y aves tales como gallinas y guajolotes. Los animales modificados artificialmente incluyen, pero sin estar limitados a, ratones SCID con sistemas inmunes humanos. En una representación preferida, el sujeto es un humano.

En una representación de cualquiera de los métodos que se describen en este documento para tratar o inhibir los síntomas iniciales de un trastorno de ritmo cardiaco, se elimina una fuente pre-existente de actividad de marcapasos en el corazón, por ejemplo mediante cirugía o químicamente. En otra representación, la célula administrada al corazón forma un sincitio funcional con el corazón. En otras representaciones, la célula se administra en la región del corazón del sujeto mediante una inyección, cateterización, inserción quirúrgica, o fijación quirúrgica. También en otras representaciones, la célula se administra localmente mediante inyección o cateterización directamente dentro o sobre el corazón. En representaciones adicionales, la célula se administra sistemáticamente por inyección o cateterización en por lo menos un vaso sanguíneo coronario o en un vaso sanguíneo cercano al corazón. Aún en representaciones adicionales, la célula se administra en una región de una aurícula o ventrículo del corazón.

En ciertas representaciones de los métodos instantáneos, el trastorno puede ser, disfunción del nodulo sinusal, bradicardia sinusal, actividad marginal del marcapasos, síndrome del seno enfermo, taquiarritmia, taquicardia de reingreso del nodulo sinusal, taquicardia auricular a partir de un foco ectópico, flúter auricular, fibrilación auricular, bradiarritmia, o insuficiencia cardiaca, y la célula se administra en el músculo auricular derecho o izquierdo, en el nodulo sinusal o en la región de cruce auriculoventricular del corazón del sujeto. En otras representaciones, el trastorno es un bloqueo de conducción, bloqueo auriculoventricular completo, bloqueo auriculoventricular incompleto, o bloqueo de rama, y la célula se administra en una región del corazón del sujeto para compensar la conducción deteriorada en el corazón. Esta región puede ser un septo ventricular o una pared disponible, una unión ariculoventricular, o una rama del ventrículo.

Además esta invención proporciona un método para tratar a un sujeto afectado con un trastorno de ritmo cardiaco el cual consta de transfectar a una célula del corazón del sujeto con cualquiera de los ácidos nucleicos que manifiestan un polipéptido HCN descrito en este documento para manifestar funcionalmente el polipéptido quimérico HCN en el corazón, en donde la manifestación del polipéptido es efectiva para inducir una corriente de marcapasos en el corazón y por lo tanto tratar al sujeto.

Esta invención además proporciona un método para inhibir los síntomas iniciales de un trastorno de ritmo cardiaco en un sujeto propenso a tal trastorno que consta de transfectar una célula del corazón del sujeto con cualquiera de los ácidos nucleicos que manifiestan un polipéptido HCN descrito en este documento para manifestar funcionalmente el polipéptido quimérico HCN en el corazón, en donde la manifestación del polipéptido es efectiva para inducir una corriente de marcapasos en el corazón y por lo tanto inhibir los síntomas iniciales en el sujeto. En una representación de cualquiera de los métodos de tratamiento que se revelan en este documento, se elimina una fuente pre-existente de actividad de marcapasos en el corazón, por ejemplo mediante cirugía o químicamente.

En otras representaciones, la célula del corazón se encuentra en una aurícula o ventrículo del corazón. En ciertas representaciones, el trastorno es, disfunción del nodulo sinusal, bradicardia sinusal, actividad marginal del marcapasos, síndrome del seno enfermo, taquiarritmia, taquicardia de reingreso del nodulo sinusal, taquicardia auricular a partir de un foco ectópico, flúter auricular, fibrilación auricular, bradiarritmia, o una insuficiencia cardiaca, y se transfecta una célula en el músculo auricular izquierdo o derecho, nodulo sinusal, o región de unión auriculoventricular del corazón del sujeto. En otras representaciones, el trastorno es un bloqueo de conducción, bloqueo auriculoventricular completo, bloqueo auriculoventricular incompleto, o bloqueo de rama, y una célula se transfecta en una región del corazón del sujeto para compensar la conducción deteriorada en el corazón. Esta región puede ser un septo ventricular o una pared disponible, una unión ariculoventricular, o una rama del ventrículo. Esta invención también proporciona un método para producir cualquiera de los polipéptidos quiméricos HCN que se revelan en este documento, que consiste de (a) la generación de un ácido nucleico recombinante al unir un ácido nucleico que codifica una porción de terminal amino de un polipéptido HCN con un ácido nucleico que codifica una porción intra membranosa de un polipéptido HCN y unir dicho ácido nucleico que codifica la porción intra membranosa de un polipéptido HCN a un ácido nucleico que codifica una porción de terminal carboxílica de un polipéptido HCN, en donde las porciones codificadas del polipéptido HCN se derivan de más de una isoforma o mutante HCN de lo mismo, y (b) de manifestar funcionalmente el ácido nucleico recombinante en una célula para así producir el polipéptido quimérico HCN.

Además la invención proporciona un método para hacer que cualquiera de los polipéptidos quiméricos HCN instantáneos que constan de un empalme de una porción de terminal amino de un canal HCN, sea contiguo con una porción intramembranal de un canal HCN, contiguo con una porción de terminal carboxílica de un canal HCN humano, donde por lo menos una de las porciones se deriva de una isoforma HCN que es diferente de la isoforma HCN de la que por lo menos se deriva una de las otras dos porciones. Una anomalía importante de los marcapasos electrónicos es su respuesta inadecuada a las demandas de ejercicio y emoción. Una ventaja adicional de los métodos para tratar o inhibir los síntomas iniciales de trastornos cardiacos revelados en este documento es que los métodos constan de mejorara la receptividad beta-adrenérgica del corazón. Estos métodos también constan de la disminución de la corriente de potasio externa, JRJ, y aumento de la corriente interna, k Los siguientes Ejemplos se presentan para ayudar en el entendimiento de la invención, y no son intencionados, y no se deben interpretar, para limitar de cualquier manera la invención establecida en las reivindicaciones que siguen posteriormente. Estos Ejemplos no incluyen descripciones detalladas de los métodos experimentales que son bien conocidos para aquellos con aptitudes ordinarias en el medio, tales como métodos usados en la construcción de vectores de ácido nucleico recombinantes, transfección de células anfitrionas con tales vectores recombinantes, y la manifestación funcional de genes en células transfectadas. Las descripciones detalladas de tales métodos convencionales se encuentran en numerosas publicaciones, incluyendo Sambrook et al. (1989), cuyo contenido se encuentra incorporado aquí en su totalidad.

EJEMPLO 1 Manifestación y Caracterización Electrofísiológica de Canales HCN en Células Cultivadas Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos y oocitos Xenopus laevis. Se anestesiaron ratas adultas con ketamina-xylazina antes de la cardiotomía, y se decapitaron ratas neonatales de acuerdo a los protocolos del Institutional Animal Care and Use Committee (Comité del Uso y Cuidado de Animales Institucionales) de la Universidad de Columbia. Se prepararon los cultivos de miocitos ventriculares de ratas recién nacidas como se describió previamente (Protas y Robinson, 1999). Brevemente, se practicó la eutanasia en ratas Wistar de 1-2 días de edad, se retiraron los corazones rápidamente y se disociaron los ventrículos utilizando un procedimiento estándar de tripsinización. Los miocitos se recolectaron, se prelaminaron para reducir la proliferación de fibroblastos, inicialmente se cultivaron en un medio que contiene suero (excepto cuando se transfecta con plásmidos como se describe abajo), y luego se incubaron en un medio libre de suero (SFM) a 37°C, 5% C02 después de 24 horas. Se llevaron a cabo estudios de impulso eléctricos en cultivos de capa unimolecular de 4 días laminados directamente sobre cubiertas de vidrio de 9 x 22 mm revestidas con fibronectina. Para experimentos de abrazadera de voltaje, los cultivos unimoleculares de 4-6 días se resuspendieron por una breve (2-3 min) exposición a 0.25% de tripsina, luego se relaminaron sobre cubiertas de vidrio revestidas con fibronectina y se estudiaron de 2-8 horas.

Se prepararon miocitos ventriculares adultos recién aislados usando el procedimiento descrito por Kuznetsov et al. (1995). Esto conllevó a una perfusión Langendorff de colagenaza, y después se cortaron las aurículas. El tejido restante se picó en trozos y se disoció en una solución de colagenaza adicional. Los miocitos aislados se suspendieron en un SFM luego se laminaron sobre unas cubiertas de vidrio de 9 x 22 mm a 0.5-1 x 10 células/mm . Dos o tres horas más tarde, después de que los miocitos se adhirieron a las cubiertas de vidrio, comenzó el procedimiento de infección adenoviral (ver más adelante).

Para la preparación de miocitos caninos, se sacrificaron perros adultos de sexo no especificado utilizando un protocolo aprobado mediante una inyección de pentobarbital sódico (80 mg kg"1 peso corporal). Los cardiomiocitos se aislaron del ventrículo canino como se describió previamente (Yu et al., 2000). Se adaptó un método de cultivo primario de cardiomiocitos caninos a partir del procedimiento descrito para los cardiomiocitos de ratón (Zhou et al., 2000). Los cardiomiocitos se laminaron a 0.5-1 (104 células cm"2 en un medio esencial mínimo (MEM) conteniendo 2.5% de suero de bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina (PS) en las cubiertas de vidrio revestidas de laminina de ratón (10 µg mi"1). Después de una hora de cultivo en una incubadora con 5% C02 a 37°C, se cambió el medio a MEM libre de FBS. Las células madre se añadieron después de 24 horas y el co-cultivo se mantuvo en un medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 5% de FBS.

El Rastreador de Célula Verde (Sensores Moleculares, Eugene, OR) se usó para distinguir las hMSCs de las células HeLa en el co-cultivo en todos los experimentos (Valiunas et al., 2000).

Los oocitos se prepararon a partir de una Xenopus laevis hembra madura de acuerdo a un protocolo aprobado como se describió previamente (Yu et al., 2004). Manifestación de canales HCN mutantes y de tipo salvaje en cardiomiocitos y oocitos. Los cDNAs que codifican HCN2 (mHCN2, GenBank AJ225122) o HCN4 (mHCN4, GenBank deposito en progreso) de ratón se subclonaron en el vector de expresión mamífero pCI (Promega, Madison, WI). Los plásmidos resultantes (pCI-mHCN2 o pCI-mHCN4) se utilizaron para la transfección de miocito ventricular de rata neonatal, como se indicó. Se incluyó en todos los experimentos de transfección, un plásmido separado (pEGFP-CI; Clontech, Palo Alto, California) que manifiesta el gen de proteína fluorescente verde mejorado (EGFP) como un marcador visual para la transferencia exitosa de ADN. Para la transfección, primero se incubaron 2 µg de pCI-mHCN y 1 pg de pEGFP-CI en 200 µ? de SFM conteniendo 10 µ? de lipofectin (Gibco Life Technologies, Rockville, MD) a temperatura ambiente por 45 minutos. Después la mezcla se añadió a un plato Petri de 35 mm con 106 células suspendidas en 0.8 mi de SFM. Después de estar en incubación toda una noche a 37°C en una incubadora de C02, se desechó el medio que contenía los plásmidos y el lipofectin, y el plato se rellenó con 2 mi de SFM fresco. Los experimentos de control en parche se llevaron a cabo en células resuspendidas manifestando niveles perceptibles de GFP por medio de microscopía de fluorescencia 3-5 días después de la transfección.

Para una eficiencia de expresión aumentada, se preparó un constructo adenoviral para mHCN2. Los procedimientos de transferencia y entrega de genes siguieron los métodos previamente publicados (Ng et al., 2000; He et al., 1998). Un fragmento de ADN (entre los sitios de restricción EcoRI y Xbal) que incluía ADN mHCN2 corriente abajo del promotor CMV se obtuvo del plásmido pTR-mHCN2 (Santoro y Tibbs, 1999) y se subclonó en el vector de enlace pDC516 (AdMaxTM, Microbix Biosystems, Toronto, Canadá). El plásmido de enlace pDC516-mHCN2 resultante se co-transfectó con un plásmido genómico Ad suprimido de El 35.5 kb pBHGAEI,3FLP (AdMaxTM) dentro de células HEK293 complementando El. La recombinación exitosa de los dos vectores dio como resultado la producción del adenovirus mHCN2 (AdmHCN2), el cual fue posteriormente purificado de placa, amplificado en células HEK293, y recolectado después de agrupar CsCl para conseguir un título de por lo menos 10u ffu/ml.

Como se describió previamente (Qu et al., 2001), también se preparó un constructo adenoviral de ratón mHCN2 (AdmHCN2). La mutación de punto mE324A se introdujo en la secuencia mHCN2 con el Paquete de Mutagénesis Dirigido al Sitio XL QuikChange® (Stratagene, La Jolla, California) y se agrupó en el vector de enlace pDC515 (AdMax™, Microbix Biosystems) para crear pDC515mE324A. Después se co-transfectó el pDC515mE324A con pBHGfrtAEI,3 FLP en células HE 293 complementando El . Posteriormente se recolectó el constructo adenoviral AdmE324A y se purificó de CsCl. Para mantener la consistencia con estudios anteriores (Qu et al., 2003), cuando se preparan muestras para inyección in vivo, se mezclaron 3x1010 ffu de cada adenovirus con una cantidad igual de un adenovirus GFP (AdGFP) en un volumen total de 700 µ?.

La infección AdHCN2 de los miocitos ventriculares de rata se realizaron 2-3 horas después de que las células aisladas se laminaron sobre las cubiertas de vidrio. Se retiró el medio de cultivo de los platillos (35-mm) y se añadió la vacuna de 0.2-0.3 ml/platillo, conteniendo AdHCN2.

El valor de m.o.i. (multiplicidad de infección - el índice de unidades virales a células) fue de 15-100. La vacuna se dispersó sobre las células cada 20 minutos al inclinar delicadamente los platillos para que las células se expusieran uniformemente a las partículas virales. Los platillos se mantuvieron a 37°C en una incubadora de C02 durante el periodo de absorción de 2 horas, después se desechó la vacuna y se lavaron los platillos y se rellenaron con el medio de cultivo adecuado. Los platillos permanecieron en la incubadora de 24 a 48 horas antes de realizar experimentos electrofisiológicos.

La infección adenoviral de los miocitos ventriculares de recién nacidos se llevo a cabo en cultivos de capa unimolecular de célula 4 días después del laminado inicial. Las células se expusieron a una mezcla que contenía virus (m.o.i. 20, en 250 µ? de medio de cultivo) por 2 horas, se enjuagaron dos veces y se incubaron en SFM a 37°C, 5% C02 de 24 a 48 horas antes de resuspender las células como se describe anteriormente para el estudio electrofísiológico. En experimentos anteriores, se empleaba AdGFP pero debido a que se detectó que >90% de las células expuestas al AdmHCN2 in vitro manifestaban la corriente (Qu et al., 2001), en experimentos posteriores no se co-infectaron las células con AdGFP para ayudar en la selección de células infectadas.

Para la manifestación de HCN en oocitos de Xenopus, se inyectaron los oocitos con 5 ng de cR A hecho de mHCN2 de tipo salvaje de ratón y plásmidos (E324A) mHCN2 muíante.

Los oocitos inyectados se incubaron a 18°C de 24 a 48 horas antes del análisis electrofísiológico.

Medición electrofisiológica en cardiomiocitos y oocitos cultivados. Las señales de voltaje y de corriente se registraron usando amplificadores de control en parche (Axopatch 200). Las señales de corriente se digitalizaron con un convertidor A/D de 16 bits (Digidata 1322 A, Axon Instruments, Union City, CA) y se almacenaron con una computadora personal. La adquisición de datos y análisis se llevo a cabo con el software pCLAMP 8 (Axon Instruments). El ajuste de curvas y los análisis estadísticos se realizaron usando SigmaPlot y SigmaStat respectivamente (SPSS, Chicago, IL). La técnica de control de parche de la célula entera se empleó para registrar la corriente mHCN2 de los miocitos cultivados. Los experimentos se llevaron a cabo en células superfündidas a 35°C. La solución externa contenía (niM): NaCl, 140; NaOH, 2.3; MgCl2, 1 ; KC1, 10; CaCl2, 1 ; HEPES, 5; glucosa, 10; pH 7.4. Se añadieron MnCl2 (2 raM) y BaCl2 (4 mM) para bloquear otras corrientes. La solución de la pipeta contenía (mM): ácido aspártico, 130; KOH, 146; NaCl, 10; CaCl2, 2; EGTA-KOH, 5; Mg-ATP, 2; HEPES-KOH, 10; pH 7.2.

Se empleó un protocolo estándar de dos pasos para medir la curva de activación de HCN. Los pasos de hiperpolarización de -25 a -135 mV para mHCN2 y de -5 ó -15 a -135 mV para mE324A se aplicaron a partir de un potencial de explotación de -10 mV, seguido por un paso de corriente de cola (a -125 ó —135 mV). La duración de los pasos de prueba fue más largo a un potencial hiperpolarizado menor para los canales mHCN2, para estar más próximo a una activación estable en todos los voltajes. La determinación normalizada de la posición de la corriente de cola versus el voltaje de prueba se ajustó con una función Boltzmann y luego el voltaje de la activación máxima media (V1/2) y el o los factores de inclinación se definieron a partir del ajuste. Las cinéticas de activación se determinaron de los mismos indicios, mientras que las cinéticas de desactivación se determinaron de los indicios registrados en cada potencial de prueba después de conseguir una activación completa por un prepulso a -135 mV. Después se obtuvieron las constantes de tiempo al ajustar el curso de activación anterior o los indicios de corriente de desactivación con una función monoexponencial; se ignoró el retraso inicial y cualquier fase lenta de activación o desactivación (Qu et al., 2001 ; Ahornare et al., 2001). Las densidades de corriente se manifiestan como el valor del componente dependiente de tiempo de la amplitud de corriente, medido al final del potencial de prueba y normalizado a la capacitancia de la membrana de la célula. Los registros no eran correctos para el potencial de cruce líquido, el cual se determinó previamente ser 9.8 mV bajo estas condiciones (Qu et al., 2001).

Para mediciones en oocitos Xenopus, se aplicó voltaje a los oocitos usando una técnica con pinzas de voltaje con dos micro electrodos. La solución de registro extracelular (OR2) contenía (en mM): NaCl, 80; KC1, 2; MgCl2, 1 ; y Na-HEPES, 5 (pH 7.6). Para el registro de activación de condición estable de Wt mHCN2 manifestado, se obtuvieron corrientes por pulsos largos de hiperpolarización de 2-s entre -30 mV y -160 mV con incrementos de 10 mV, seguidos por un pulso de despolarización de 1-s a +15 mV. El potencial de explotación fue de -30 mV. En cuanto a mHCN2 (E324A), se obtuvieron corrientes por pulsos largos de hiperpolarización de 3-s entre +20 mV y -130 mV con incrementos de 10 mV, seguidos por un pulso de despolarización de 1 segundo a +50 mV. El potencial de explotación fue de +20 mV. Para construir la relación corriente/voltaje para mHCN2 de tipo salvaje (Wt), se mantuvo la célula a -30 mV, la corriente se obtuvo por una medida de voltaje de hiperpolarización de 2-s a -140 mV para saturar la activación, y seguido por medidas de voltaje de despolarización de 2-s entre -80 mV y +50 mV en incrementos de 10 mV. Para mHCN2 (E324A), se mantuvo la célula a +20 mV, la corriente se obtuvo por una medida de voltaje de hiperpolarización de 1.5-s a -110 mV para saturar la activación, y luego seguido por medidas de voltaje de despolarización de 1.5-s entre -80 mV y +50 mV en incrementos de 10 mV para el registro de corrientes de cola. Para registrar las amplitudes de corriente para Wt mHCN2, se provocó la corriente al aplicar un pulso de voltaje de hiperpolarización de 3 -s a -120 mV a partir de un potencial de explotación de -30 mV. Para mHCN2 (E324A), se provocó la corriente al aplicar un pulso de voltaje de hiperpolarización de 3-s a -120 mV a partir de un potencial de explotación de +20 mV.

Los datos se presentaron como medio ±SEM. Se compararon los datos experimentales utilizando una prueba t de Student o una prueba de chi-cuadrado con corrección de Yates, según sea pertinente. Al hacer las comparaciones, se utilizaron células coincidentes de los mismos cultivos, y se reunieron datos de por lo menos 3 cultivos diferentes para cada comparación.

Corrientes de marcapasos inducidas por mHCN2 y E324A en cardiomiocitos.

Experimentos previos han mostrado que la sobremanifestación de HCN2 en miocitos de rata neonatal en cultivo inducía una corriente de marcapasos la cual incrementaba la frecuencia cardiaca, y que las mutaciones en el gen de marcapasos HCN2 y/o la adición de subunidades de canal accesorias adecuadas, alteraban las características de la corriente manifestada en formas que se esperaría que mejorara la frecuencia cardiaca (Patente U.S.

No. 6,849,61 1 ; Qu et al., 2001 ; Qu et al., 2004). La infección con un Ad manifestando HCN2 también incremento de manera significante la frecuencia cardiaca espontánea de cultivos de capa unimolecular de frecuencia sincrónicamente (Patente U.S. No. 6,849,61 1 ; Qu et al., 2001). También se infectaron los cultivos de miocitos con el adenovirus HCN2 y un segundo virus portando GFP o una forma marcada HA de MiRPI el cual es una subunidad beta para HCN2. El resultado fue un aumento significante en la magnitud de corriente y en la aceleración de las cinéticas de activación y desactivación (Qu et al., 2004). En los experimentos de aplicación de voltaje en la célula entera que se describen aquí, los miocitos que manifiestan mHCN2 y mE324A dieron origen a una corriente interna en respuesta a voltajes hiperpolarizantes. Los indicios de corriente normalizados representativos que se obtuvieron en potenciales de prueba que abarcan desde -25 a -125 mV, de un potencial de explotación de -10 mV, se muestran en las Figuras 10A y B. Está claro que de las corrientes ampliadas en las inserciones, el umbral de activación de los canales mE324A es menos negativo que el de los canales mHCN2.

La diferencia en la dependencia de voltaje de activación entre mHCN2 y mE324A es más evidente que las relaciones principales corriente-voltaje que se muestran en la Figura 10C. Las curvas se obtuvieron de las corrientes de cola, como se describe previamente. Las curvas de activación individuales se ajustaron a la ecuación Boltzmann y se promedió y comparó estadísticamente el punto medio calculado (Fy2) y el o los factores de inclinación de todas las células. Los parámetros promedio para las células que se manifiestan en mHCN2 (n=14) y mE324A (n=16) fueron, respectivamente: Fy2 = -66.1 ± 1.5 mV y -46.9 = 1.2 mV (PO.05) y s = 10.7 ± 0.5 mV y 9.6 ± 0.4 mV (p>0.05). Por lo tanto, de acuerdo con los datos obtenidos previamente sobre los oocitos (Chen et al., 2001), y confirmados aquí (ver Figuras 12-15), la mutación mE324A dio como resultado un cambio positivo de la curva de activación con relación al de mHCN2 cuando ambos constructos se manifestaron en los miocitos de recién nacidos.

Las cinéticas de activación de los canales mE324A aparecieron más rápido que aquellas de mHCN2 (Figuras 10A, B inserciones). Para demostrar esta diferencia, se midieron y promediaron las constantes de tiempo de activación y desactivación a diferentes voltajes como se describe previamente (Figura 10D). Estos datos muestran que las cinéticas de activación más rápidas que se observaron para los canales mE324A fueron debido a un cambio positivo de la dependencia de voltaje de las cinéticas de activación periódica. La dependencia de voltaje tanto de la activación como de la desactivación cambió positivamente, para que a los voltajes positivos a los que se midió la desactivación, ésta fue más lenta para mE324A que para mHCN2. Por otra parte, este cambio es comparable al de la relación corriente-voltaje. De hecho los valores máximos relativos de las relaciones cinética- voltaje fueron consistentes con los valores previamente determinados Vm.

Se esperaría que el cambio positivo en las cinéticas y en la relación de activación dieran como resultado más corriente que pasara antes en el ciclo cardiaco con mE324A en comparación a mHCN2. Sin embargo, para ser benéfico como un marcapasos biológico, también es necesario preservar la receptividad autónoma. Para evaluar esto, se compararon las curvas de activación de mHCN2 y de mE324A en ausencia y en presencia de cAMP en la solución de la pipeta (Figura 1 1). Ambos canales respondieron a la presencia de cAMP intracelular como se detalla en la breve descripción de la Figura 1 1.

También se investigó si el canal muíante manifestó corriente, así como el canal de tipo salvaje. El porcentaje de miocitos que manifestaron corriente mE324A fue significantemente más pequeña que el porcentaje que manifestó mHCN2 (36.6% de 93 células contra 74.5% de 47 células respectivamente, P < 0.05) en 6 cultivos de células coincidentes. Por otra parte, en las células que sí manifestaron corriente, la densidad de la corriente de mE324A (medida a -135 mV) fue aproximadamente 2.5 veces más pequeña que la de mHCN2 (21.0 ± 3.5 pA/pF, n = 12, vs. 53.5 ± 8.7 pA/pF, n = 10, respectivamente, P < 0.05).

Corriente inducidas por mHCN2 y E324A en oocitos de Xenopus La Figura 12 muestra las cinéticas y las propiedades de activación de la corriente manifestada heterológicamente. En oocitos, el mHCN2 se activa 35 mV más negativamente que mE324A. Esta activación más positiva está acompañada por un cambio en la dependencia de voltaje de las cinéticas de activación así como de cinéticas más rápidas en el punto medio de activación para mE324A. Tanto mHCN2 como mE324A respondieron a la aplicación de 8-Br-cAMP (1 mM) con un cambio positivo en activación (Figura 13). Para mHCN2, cAMP cambió el F por aproximadamente 8 mV (los valores F fueron -92.7 mV ± 1.1 mV para control y -84.9 mV ± 0.7 mV para cAMP (n = 6, P < 0.01) y los valores de inclinación correspondientes fueron 13.9 mV ± 1.0 mV y 9.5 mV ± 0.6 mV (n = 6, p > 0.05). Para mE324A, cAMP cambió positivamente el Fj i por aproximadamente 7 mV (los valores Fh fueron -57.3 mV ± 1.6 mV para control y -48.9 mV ± 1.8 mV para cAMP (n = 9, P < 0.01) y los valores de inclinación correspondientes fueron 15.2 mV ± 1.3 mV y 19.7 mV ± 0.1 mV (n = 9, p > 0.05).

Tanto mHCN2 como mE324A generaron corrientes internas bloqueadas por 5 mM Cs+ con potenciales de reversión de aproximadamente -40 mV (Figura 14). Finalmente, se aplicó un pulso de voltaje sencillo cerca de la saturación (-120 mV) para comparar los niveles de manifestación de mHCN2 y de mE324A. La corriente que mHCN2 indujo fue de 912.7 ± 63.7 nA, n = 9, mientras que la corriente que E324A indujo fue de 579.8 ± 18.2 nA, n = 9 (P < 0.01). Por lo tanto, hubo una manifestación reducida de manera significante para aquellos oocitos que manifiestan mE324A (ver Figura 15).

EJEMPLO 2 Efectos del Medio Ambiente Celular de Miocitos Ventriculares de Recién Nacidos y Adultos en la Activación Periódica y Excitabilidad de los Canales HCN.

Dependencia de voltaje de isoformas HCN en diferentes tipos de células. Actualmente se conocen cuatro miembros de la familia de genes HCN (Santoro et al., 1997; Ludwig et al., 1998; Santoro et al., 1998). Tres de estos (HCNI, HCN2 y HCN4) se encuentran en el corazón, pero el nivel de mensaje relativo de las tres isoformas varía en región y edad (Shi et al., 1999; Ishii et al., 1999; Ludwig et al., 1999). El nodulo sinusal y las fibras de Purkinje, en las que If se activa en potenciales menos negativos, contienen en gran parte HCNI y HCN4. Los ventrículos contienen HCN2 y HCN4, con la proporción de mRNA de HCN2 relativo a HCN4 mayor en el ventrículo adulto que en el de recién nacido. Esto da a entender que el HCN2 es una isoforma de activación negativa por naturaleza cuya abundancia relativa determina el umbral de activación en diferentes regiones del corazón o a diferentes edades. Sin embargo, estudios de manifestación heterólogos no apoyan esta simple explicación. Aunque existe variabilidad entre laboratorios, cuando el HCN2 y HCN4 se manifiestan en líneas de células mamíferas, los voltajes de activación difieren por menos de 10 mV (Ludwig et al., 1999; Moosmang et al., 2001 ; Ahornare et al., 2001). Por lo tanto, las características intrínsecas de la isoforma HCN específica manifestada no parece, por sí misma, ser una explicación suficiente para la dependencia de voltaje diversa del If nativo, ya sea regionalmente en el corazón adulto o desarrolladamente en el ventrículo.

Una hipótesis alternativa es que el medio ambiente celular en el que se manifiesta una isoforma en particular influye su dependencia de voltaje. El medio ambiente celular puede incluir la presencia o ausencia de subunidades beta, elementos citoesqueletales, quinazas, fosfatasas u otros factores. Debido a estas diferencias potenciales, la dependencia de voltaje de HCN2 y/o HCN4 puede diferir cuando se manifiesta en miocitos en lugar de en un sistema de manifestación heterólogo. Por la misma razón, una o ambas isoformas pueden ser sensibles al estado madurado del miocito, mostrando dependencia de voltaje distinta cuando se manifiesta en células ventriculares de recién nacido en comparación a las células ventriculares adultas. Se presentan los datos para abordar estos temas.

Manifestación de isoformas HCN en células cultivadas Los miocitos ventriculares de rata neonatal y adulta se aislaron y cultivaron como se describe en el Ejemplo 1. El HCN2 y HCN4 de ratón se subclonaron en el pCI y en los vectores adenovirales y se manifestaron en estos miocitos cultivados como también se describe en el Ejemplo 1. Mediciones electrofisiológicas.

La técnica de abrazadera de voltaje de la célula entera se empleó para registrar la I¡ nativa o JHCN2 O /HCN4 manifestadas. Los impulsos eléctricos se registraron en la modalidad de abrazadera de corriente, de nuevo utilizando un electrodo de parche de célula entera. Los experimentos se llevaron a cabo en células superfundidas a 35°C. La solución extracelular contenía (niM): NaCl, 140; NaOH, 2.3; MgCl2, 1 ; KC1, 5.4; CaCl2, 1.0; HEPES, 5; glucosa, 10; pH 7.4. Para registrar de miocitos que manifiestan corrientes nativas (If), los miocitos que manifiestan HCN2 (ZHCN2) o HCN4 (2HCN4)> [K+]0 aumentaron a 10 mM, y se añadieron MnCl2 (2 mM) y BaCl2 (4 mM) a para eliminar corrientes (J Í) rectificadoras internas y de calcio. En algunos experimentos se usó CsCI (4 mM) extracelularmente para identificar la corriente de marcapasos como la corriente sensible a Cs. La solución de la pipeta contenía (mM): ácido aspártico, 130; KOH, 146; NaCl, 10; CaCl2, 2; EGTA-KOH, 5; Mg-ATP, 2; HEPES-KOH, 10; pH 7.2. Se incluyen 10 µ? cAMP en la solución de la pipeta donde se indica. Un mecanismo de cambio de solución rápido acelera los protocolos experimentales. La resistencia de la pipeta era normalmente de 1 -3 M. Se utilizó un amplificador Axopatch 200B y un software pClampS (Axon Instruments) para la adquisición y análisis de datos. La corriente de marcapasos (Jf, 7HC 2 o THCW) se definió como el componente dependiente de tiempo tomado al final de una etapa de hiperpolarización para voltajes en el rango de -35 a -145 mV, mientras el impulso eléctrico era de -35 mV a menos que se indicara lo contrario. Para las mediciones de If y 7HCN2, los pulsos de prueba de hiperpolarización fueron de 3 ó 6 s a través del rango de voltaje. Para registrar con precisión las corrientes en condición estable para el 7HCN4 de activación más lenta, los voltajes de prueba variaron en longitud de 6 segundos a -125 mV a 60 segundos a -55 mV. Cuando se registraron las corrientes de cola, los pulsos de prueba fueron seguidos por un voltaje de 8-s a -125 mV. En todos los protocolos de corriente de marcapasos, cada episodio terminaba con un pulso de -5 mV por 0.5 s para asegurar una desactivación completa.

La relación de activación de la corriente nativa o manifestada se puede determinar a partir de la relación I-V de condición estable. En este caso, el potencial de reversión (Ff) se determinó de forma separada de la relación I-V completamente activada (Accili et al., 1991) y se usó para generar la relación de activación (y = I / (gmax * (v - Vf)), donde gmax es la conductancia máxima). Este método se utilizó en los estudios iniciales de manifestación con plásmido HCN2 o HCN4 en células ventriculares de rata neonatal. Los estudios subsecuentes de If o /HCN2 usaron las mediciones de la corriente de cola. La corriente de cola suministró la conductancia máxima y la relación de activación/voltaje después de que se determinó la posición contra el voltaje de prueba. Esta relación se normalizó mediante la conductancia máxima y se ajustó a la función de Boltzmann (y = 1 / (1 + exp ((V - Vy2) / K))) para determinar el voltaje de la activación máxima media (Fl/2) y el factor de inclinación (K). Las corrientes de voltaje se midieron a un voltaje negativo (-125 mV) para evitar la contaminación mediante una transiente de salida y otras corrientes a voltajes menos negativos.

Las cinéticas de activación se determinaron mediante un ajuste exponencial sencillo del curso anterior de la corriente activada por pulsos de hiperpolarización. Tanto el retraso inicial como cualquier activación lenta se ignoraron. Las cinéticas de desactivación se determinaron mediante un ajuste exponencial sencillo del curso de tiempo del rastro de la corriente en cada voltaje de prueba después de la activación máxima por un pulso de condicionamiento a -125 mV. Tanto para la activación como para la desactivación, la longitud del rastro de la corriente que se ajustó fue por lo menos tres veces tan larga como la constante de tiempo medida para asegurar la precisión. Todos los datos se presentaron como ± S.E.M. El trasfondo estadístico se examinó mediante el test F para comparaciones emparejadas y ANOVA para comparaciones múltiples, y se determinaron a P < 0.05. Comparación de miocitos ventriculares neonatales manifestando HCN2 y HCN4. Previamente se reportó que las células en cultivo de ventrículo de rata neonatal muestran una If pequeña que se activa con un voltaje de umbral de alrededor de -70 mV (Robinson et al., 1997; Cerbai et al., 1999). La Figura 16A proporciona una familia representativa de rastros de corriente del If nativo en una célula en cultivo de ventrículo de rata neonatal. Un componente de corriente interna dependiente de tiempo es apreciable para los pasos de voltaje de -65 mV o más negativo. Los estudios de niveles de mensaje mediante el ensayo de protección Rnase indicaron que tanto el HCN2 y HCN4 están presentes en el ventrículo de recién nacido, con niveles de mensaje relativos de aproximadamente 5: 1 (Shi et al., 1999). Por lo tanto, cada una de estas isoformas se manifestaron de forma separada en los cultivos de ventrículo neonatal. Como se describió previamente, se empleó un método de transfección de lipofectin y los plásmidos HCN se co-transfectaron con pEGFP-CI para ayudar en la identificación de las células que se manifiestan. La eficiencia de manifestación fue menor del 5%, basado en el número de células fluorescentes detectadas visualmente. Más del 90% de las células fluorescentes tenían una corriente de tipo If por lo menos 10 veces mayor en magnitud que la corriente nativa. Las Figuras 16B y C muestran rastros de corriente manifestadas representativas de miocitos transfectados con HCN2 y HCN4, respectivamente. La magnitud de la corriente es tal que se puede distinguir claramente la corriente manifestada de la corriente nativa. Además, las cinéticas más lentas del HCN4 manifestado, en comparación al HCN2, son apreciables (observar la escala de tiempo diferente en la Figura 16C). También se reportaron cinéticas más lentas de HCN4 en estudios de manifestación heterólogos. determinaron mediante un ajuste exponencial sencillo del curso de tiempo del rastro de la corriente en cada voltaje de prueba después de la activación máxima por un pulso de condicionamiento a -125 mV. Tanto para la activación como para la desactivación, la longitud del rastro de la corriente que se ajustó fue por lo menos tres veces tan larga como la constante de tiempo medida para asegurar la precisión. Todos los datos se presentaron como ± S.E.M. El trasfondo estadístico se examinó mediante el test F para comparaciones emparejadas y ANOVA para comparaciones múltiples, y se determinaron a P < 0.05. Comparación de miocitos ventriculares neonatales manifestando HCN2 y HCN4. Previamente se reportó que las células en cultivo de ventrículo de rata neonatal muestran una /f pequeña que se activa con un voltaje de umbral de alrededor de -70 mV (Robinson et al., 1997; Cerbai et al., 1999). La Figura 16A proporciona una familia representativa de rastros de corriente del If nativo en una célula en cultivo de ventrículo de rata neonatal. Un componente de corriente interna dependiente de tiempo es apreciable para los pasos de voltaje de -65 mV o más negativo. Los estudios de niveles de mensaje mediante el ensayo de protección Rnase indicaron que tanto el HCN2 y HCN4 están presentes en el ventrículo de recién nacido, con niveles de mensaje relativos de aproximadamente 5: 1 (Shi et al., 1999). Por lo tanto, cada una de estas isoformas se manifestaron de forma separada en los cultivos de ventrículo neonatal. Como se describió previamente, se empleó un método de transfección de lipofectin y los plásmidos HCN se co-transfectaron con pEGFP-CI para ayudar en la identificación de las células que se manifiestan. La eficiencia de manifestación fue menor del 5%, basado en el número de células fluorescentes detectadas visualmente. Más del 90% de las células fluorescentes tenían una corriente de tipo If por lo menos 10 veces mayor en magnitud que la corriente nativa. Las Figuras 16B y C muestran rastros de corriente manifestadas representativas de miocitos transfectados con HCN2 y HCN4, respectivamente. La magnitud de la corriente es tal que se puede distinguir claramente la corriente manifestada de la corriente nativa. Además, las cinéticas más lentas del HCN4 manifestado, en comparación al HCN2, son apreciables (observar la escala de tiempo diferente en la Figura 16C). También se reportaron cinéticas más lentas de HCN4 en estudios de manifestación heterólogos.

Los registros de corrientes como los que se muestran en la Figura 16 se usaron para determinar la relación I-V en condición cuasi estable. Para la corriente nativa y el HCN2 manifestado, pasos de voltaje de 3-s fueron suficientes para aproximar la condición estable a la mayoría de los voltajes de prueba, aunque la corriente no obtuvo una condición estable en los pasos más negativos. Se requirieron de pulsos significativamente más largos para un análisis adecuado del HCN4. En cada caso se determinó el potencial de reversión de forma separada, y se usó para convertir la relación I-V a la relación de activación correspondiente de la corriente nativa y de la corriente manifestada. En la Figura 17A se muestran las relaciones de activación promedio de la corriente nativa (tomada de Qu et al., 2001) y de las corrientes manifestadas. Los experimentos se llevaron a cabo en cultivos de 4-6 días que fueron transfectados el mismo día que las células se disociaron. Los miocitos neonatales que manifiestan HCN2 mostraron corrientes que se activaron en voltajes más negativos que aquellos que manifiestan HCN4, y ésta diferencia fue estadísticamente significante (Vm de -78.4 ± 1.4mV, n = 17, y -66.3 ± 2.0 mV, n = 14, respectivamente; P = 0.001). Los factores de inclinación (K) no difirieron (7.7 ± 0.7 mV y 6.7 ± 0.7 mV; P = 0.348). Aunque es estadísticamente diferente, la diferencia de 8.5 mV en el punto medio de activación de HCN2 y HCN4, es considerablemente menor que la diferencia de 40 mV (basado en mediciones de umbral) entre ventrículo adulto y neonatal. Esto indica que, aunque un aumento evolutivo en la proporción de HCN2/HCN4 pueda contribuir con el cambio negativo dependiente de la edad en la activación de Jf, no puede explicar el cambio por completo. La Figura 17B compara las cinéticas de activación de las corrientes registradas de miocitos ventriculares neonatales que manifiestan HCN2 (n = 6-9) y HCN4 (n = 4-5). Para la mayoría de los voltajes, las cinéticas de activación del HCN4 son notablemente más lentas que aquellas del HCN2. Debido a que el HCN4 se activa en voltajes menos negativos que el HCN2, esto no se puede explicar mediante un cambio en la dependencia de voltaje de activación. Más bien, representa una diferencia básica en las cinéticas de las dos isoformas, como también se ha reportado en experimentos de manifestación heterólogos (Ludwig et al., 1999; Ahornare et al., 2001). La Jf nativa (n = 8) cinéticas de activación intermedias entre aquellas de HCN2 y HCN4, pero la pequeña magnitud de la corriente nativa hizo que el obtener datos confiables de cinéticas en voltajes menos negativos fuera impráctico, donde el comportamiento de las dos isoformas manifestadas difirieran notablemente.

Comparación de miocitos ventriculares adultos y neonatales que manifiestan HCN2. Debido a que los experimentos anteriores indicaron que un cambio de isoformas HCN4/HCN2 no era probable que justificara por completo las diferencias en el Jf nativo entre el ventrículo adulto y neonatal, se compararon las características de HCN2 (la isoforma ventricular HCN principal, a nivel de mensaje, en ambas edades (Shi et al., 1999) cuando se manifiesta en miocitos ventriculares adultos versus neonatales. Esto requirió mantener las células ventriculares de adulto en cultivo por 48 h. Un reporte anterior indicó que las condiciones de cultivo más prolongadas podrían dar como resultado un cambio positivo notable en la dependencia de voltaje de activación de la corriente nativa (Fares et al., 1998). Por lo tanto, primero se comparó la corriente nativa en células extremadamente disociadas con el de las células que se mantuvieron en cultivo en un medio libre de suero por 2 días. Se empleó un protocolo de abrazadera de voltaje que permitió una construcción directa de la relación de activación sin la necesidad de una determinación separada del potencial de reversión. Después de una medida de hiperpolarización para varios voltajes de prueba, una segunda medida de -125 mV generó una corriente de cola, cuya amplitud se utilizó para determinar la relación de activación. Las Figuras 18 A y B proporcionan rastros de corrientes representativas de células ventriculares de rata adulta extremadamente disociadas y cultivadas. En ambos casos, las células eran en forma de bastoncillo e inactivas y, como se ve en la Figura, en ambos casos el voltaje de umbral (es decir, la primer medida de voltaje donde una corriente dependiente de tiempo es aparente) es más negativo de cómo se vio de la corriente nativa en el neonato (Figura 16). El método de transfección de lipofectin, con su poca eficiencia, fue inadecuado para los estudios de la manifestación de HCN en miocitos adultos. Por lo tanto, se preparó un constructo adenoviral (AdHCN2) que contenía la secuencia HCN2 de ratón. El tratamiento de las células adultas con este constructo adenoviral dio como resultado una manifestación de altos niveles de corriente (Figura 18C, observar la escala diferente). En miocitos ventriculares adultos que manifiestan el HCN2, la corriente registrada se activó con un umbral más negativo que el que se observó previamente en las células neonatales (Figura 16B).

La subunidad alfa de HCN2 se usó debido a que muestra cinéticas y sensibilidad de cAMP en los miocitos neonatales (Qu et al., 2001) que aproxima la corriente de marcapasos del nodulo sinusal nativo. Sin embargo, los datos indican que la subunidad alfa de HCN4 transporta predominantemente la corriente nativa en el nodulo sinusal, pero las subunidades alfa de HCNI y HCN2 (Shi et al., 2000) y la subunidad beta MiKPI (Yu et al., 2001) también se encuentran presentes. Por lo tanto, los constructos adenovirales de estas otras subunidades alfa y beta, solas o en combinación, se pueden sobre-manifestar en células excitables en cultivo y se pueden emplear en experimentos de frecuencia basados en las células. Este constructo consta de HCN2 bajo el control de del promotor CMV el cual dirige una manifestación de alto nivel en células mamíferas, pero los constructos también pueden estar preparados al usar promotores regulables para proporcionar un mejor control sobre el nivel de manifestación.

Se emplearon células de ventrículo de rata neonatal ya que muestran muchas de las otras corrientes relevantes de ritmo cardiaco. Esto incluye la presencia de corrientes de calcio tipo T y tipo L y una baja densidad de corriente rectificadora interna. Además, incluyen corriente de marcapasos, con un umbral de activación en o cerca del rango de voltaje fisiológico (Qu et al., 2000). La corriente de marcapasos nativa en estas células es pequeña, pero el hecho de que se activa con voltajes relevantes fisiológicamente en el ventrículo neonatal (comparado con el ventrículo adulto, donde se activa de forma negativa al potencial de reversión) (Robinson et al., 1997) indicó que la corriente sobre-manifestada también se activaría en el rango de voltaje fisiológico. Esta predicción se confirmó (Qu et al., 2001). De hecho, se demostró que tanto el HCN2 como el HCN4 se activan con voltajes relevantes fisiológicamente cuando se manifiestan en miocitos ventriculares de rata neonatal (Figuras 16 y 17). Estos estudios iniciales emplearon un método de transfección de baja eficiencia para sobre-manifestar HCN2 o HCN4 en un pequeño porcentaje de miocitos en cultivo. Aunque este método permitió la caracterización de la corriente, no afectó los latidos espontáneos del cultivo de capa unimolecular contigua ya que muy pocas células manifestaron la corriente a una alta densidad. Sin embargo, la infección de estos cultivos con un constructo adenoviral de HCN2 permite la sobre-manifestación de la corriente en >90% de las células y por consiguiente altera la despolarización diastólica y la frecuencia cardiaca de todo el cultivo.

La Figura 19 (panel A) muestra que estos cultivos, cuando no sobre-manifiestan el HCN2, laten espontáneamente pero carecen de la característica de despolarización diastólica lenta del nodulo sinusal cardiaco normal. Además, la duración del ciclo es variable. En cambio, un cultivo que sobre-manifiesta HCN2 late a un ritmo más rápido, con una duración de ciclo constante y una despolarización diastólica pronunciada (panel B).

El marcapasos cardiaco normal late independientemente pero está regulado por neurotransmisores liberados de las neuronas simpáticas y parasimpáticas. Lo anterior libera noradrenalina, la cual actúa en los receptores beta-adrenérgicos para incrementar la concentración de cAMP y aumentar la frecuencia cardiaca. Esto último libera acetilcolina, el cual actúa en receptores muscarínicos para reducir la concentración de cAMP y disminuir la frecuencia cardiaca. La Figura 20 muestra que el isoproterenol agonista beta-adrenérgico causa el aumento previsto en la frecuencia cardiaca en el cultivo de célula que sobre-manifiesta HCN2. La Figura 21 muestra que el carbacol agonista muscarínico causa la disminución prevista en la frecuencia cardiaca en el cultivo de célula que sobre-manifiesta HCN2. La Figura 22 muestra que el ZD-7288, un bloqueador selectivo de la corriente de marcapasos que disminuye la frecuencia del seno, también disminuye la frecuencia del cultivo de célula que sobre-manifiesta HCN2.

Para confirmar adicionalmente que el canal HCN sobre-manifestado responda de manera similar al canal de marcapasos nativo en el nodulo sinusal y no abrume los procesos de señalización naturales de los miocitos, se midió el efecto de una concentración de umbral de isoproterenol en el HCN2 sobre-manifestado en un miocito de ventrículo neonatal. Se encontró que la concentración de umbral de isoproterenol en la corriente de marcapasos nativa en el nodulo sinusal era de aproximadamente 1 nM (Zaza et al., 1996). El efecto del isoproterenol es el de cambiar la curva de activación a positivo sin incrementar la corriente máxima. Este efecto se puede visualizar mediante un protocolo de voltaje de dos pasos, con el primer paso en el punto medio de la curva de activación y el segundo paso en la curva máxima. La Figura 23 emplea este protocolo de dos pasos para mostrar que esta concentración de umbral de isoproterenol cambia la curva de activación del HCN2 sobre-manifestado en una célula de ventrículo de rata neonatal. El cambio fue de aproximadamente 5 mV, compatible con los efectos en la corriente nativa.

Por consiguiente, el uso de constructos adenovirales para sobre-manifestar las subunidades alfa y beta de la corriente de marcapasos en las células ventriculares de rata neonatal da como resultado cultivos que laten espontáneamente a un ritmo regular con una fuerte despolarización diastólica. Además, el ritmo de estos cultivos modificados responde a las drogas en una manera similar como el marcapasos cardiaco normal en el nodulo sinusal. Esto proporciona una base biológica para una prueba de ritmo de alto rendimiento que se puede realizar al hacer crecer las células en una cámara de cavidades múltiples adecuada y usando colorantes sensibles al calcio o al voltaje para generar una señal de salida conveniente para que un lector de placa fluorescente la pueda detectar. Por otro lado, la célula puede crecer en una cámara de cavidades múltiples que incluye electrodos de registro integrados y actividad eléctrica medida directamente como una lectura del ritmo.

Las Figuras 24A y B comparan la relación de activación y las cinéticas del Jf nativo en células ventriculares adultas extremadamente disociadas y cultivadas. Un periodo de cultivo de dos días dio como resultado una diferencia no significante en Fy2, aunque la tendencia fue hacia un punto medo menos negativo después del cultivo (-105.3 ± 2.6 mV, n = 12, vs. -98.7 ± 1.8 mV, n = 7, en células extremadamente disociadas vs. cultivadas; P = 0.092), y tampoco hubo una diferencia significante en el factor de inclinación (10.9 ± 1.2 vs. 14.4 ± 1.9 mV). Las cinéticas de activación tampoco difirieron entre el ventrículo adulto extremadamente disociado y el cultivado. Los datos neonatales de la Figura 17 se superponen (líneas entrecortadas) para mostrar la diferencia neonatal/adulta en la dependencia de voltaje y las cinéticas de activación del If nativo. De esta manera, el cultivo de corto plazo no altera significantemente If, y la tendencia en la dependencia de voltaje es modesta en comparación con el efecto del desarrollo. La comparación del adulto versus el neonatal confirma el estudio de desarrollo anterior el cual reportó una diferencia dependiente de la edad en la dependencia de voltaje de activación (Robinson et al., 1997).

El constructo adenoviral se usó en ambas preparaciones para comparar las características del HCN2 en miocitos ventriculares adultos y neonatales. Los datos neonatales se pueden comparar con los resultados anteriores usando el método de lipofectin (Figura 17). La Figura 25 muestra las relaciones de activación promedio, a partir de las mediciones de la corriente de cola, que se obtuvieron de los miocitos que manifestaron HCN2 en las dos preparaciones de cultivo. Es evidente que, cuando la misma proteína se manifiesta en las preparaciones de miocitos adultos y neonatales, la corriente resultante se activa en voltajes significativamente más negativos en las células adultas. Los valores Vm para el HCN2 que se manifiesta en los miocitos adultos y neonatales fueron de -77.6 ± 1.6 mV (n = 24) y -95.9 ± 1.9 mV (n = 13), respectivamente (P < 0.001). Además, el factor de inclinación (K) también difirió significativamente (9.8 ± 0.6 mV vs. 6.5 ± 0.5 mV, P < 0.001), indicando una dependencia de voltaje más superficial en el neonato. La Figura 25B proporciona datos sobre la dependencia de voltaje de las cinéticas de activación/desactivación para el HCN2 manifestado. Los datos se ajustaron bien mediante un modelo de cinética estándar, y mostraron una pequeña diferencia en el valor máximo de la constante de tiempo de activación entre los dos cultivos. Sin embargo, la dependencia de voltaje de la relación se cambia a negativa en el adulto por una cantidad (21 mV) que se puede comparar con el cambio en la relación de activación (18 mV). Por otra parte, los picos relativos de las relaciones de cinéticas en las dos preparaciones de cultivos son consistentes con los valores Vm determinados previamente (flechas, Figura 25B). De esta manera, la diferencia en la dependencia de voltaje de las cinéticas de activación del HCN2, cuando se manifiesta en los miocitos adultos y neonatales, parece relacionada a la dependencia de voltaje de la relación de activación en condición estable.

Bases posibles para la diferencia entre miocitos adultos y neonatales que manifiestan HCN2. En una manifestación heteróloga de otras corrientes, las características biofísicas de las corrientes manifestadas a veces puede depender de la densidad de corriente obtenida (Cui et al., 1994; Guillemare et al., 1992; Honore et al., 1992). Se llevó a cabo un análisis de regresión linear de los datos para determinar si la diferencia en Vm del HCN2 entre adultos y neonatales fue resultado de este tipo de fenómeno (Figura 26). Los resultados indican que, mientras exista alguna correlación Of y2 con la densidad de corriente en los recién nacidos, las diferencias en los niveles de manifestación no pueden explicar la diferencia en la dependencia de voltaje de HCN2 entre los miocitos adultos y neonatales. Los miocitos neonatales mostraron un amplio rango de densidad de corriente de la corriente manifestada con un coeficiente de correlación para Vm de 0.51 (P = 0.01); la densidad de corriente fue menos variable en el adulto, sin ninguna correlación con el punto medio de la activación (coeficiente de correlación 0.043, P = 0.88). La corriente manifestada en los miocitos neonatales demostraron un Vm significantemente menos negativo que en los miocitos adultos (P < 0.001) para las densidades de corriente de ambas preparaciones (es decir, < 60 pA/pF, Figura 26 inserción).

Bien se sabe que tanto la 7f como la corriente manifestada responden a cAMP mediante un cambio independiente de fosforilación en la dependencia de voltaje de activación (DiFrancesco et al., 1991 ; Kaupp et al., 2001), aunque también se reportaron los mecanismos dependientes de la fosforilación (Chang et al., 2001 ; Yu et al., 1993; Accili et al., 1996). Es posible que la diferencia que se observó en la activación de HCN2 en los miocitos adultos y neonatales simplemente reflejaron un nivel cAMP basal diferente dentro de las dos preparaciones de células. Para poner a prueba esto, los experimentos que miden la relación de activación de la corriente manifestada con AdHCN2 en células adultas y neonatales se repitieron, pero esta vez los experimentos incluían 10 µ? cAMP en la solución de la pipeta para conseguir un cambio positivo máximo de la corriente y eliminar cualquier diferencia en los niveles cAMP intracelulares. Como se ve en la Figura 27, la corriente manifestada cambió a positivo por una cantidad comparable tanto en las preparaciones adultas como en las neonatales (los datos en ausencia de cAMP en la pipeta se representan por medio de las líneas entrecortadas y punteadas), y la gran diferencia en los valores Vm persistieron. De esta manera, la diferencia dependiente de la edad en la dependencia de voltaje de activación de HCN2 no surge de una diferencia en el nivel cAMP basal entre las dos preparaciones.

Efecto funcional de la sobre-manifestación del HCN2 El constructo adenoviral del HCN2 dio como resultado la manifestación de una gran corriente en la mayoría de las células (por lo menos 90% de las células de control de parche). Dado que la activación relativamente positiva de la corriente manifestada en las células neonatales, ponerlo dentro del rango fisiológico de los voltajes, después se determinó si la sobre-manifestación del HCN2 resultó en un cambio en la frecuencia espontánea de estos cultivos. Estos experimentos se realizaron usando cultivos de capa unimolecular de células con latidos sincronizados, con un electrodo de control de parche registrando desde una célula de la capa unimolecular contigua. Los cultivos de control (no infectados) laten espontáneamente, con una frecuencia de 48.4 ± 4.4 latidos por minuto (bpm, n = 17). Hubo poca o ninguna despolarización diastólica entre los impulsos eléctricos y la duración del ciclo tendió a variar de latido a latido (Figura 19A). El potencial diastólico máximo (MDP) fue de -65.2 ± 1.6 mV (n = 17). En cambio, os cultivos infectados con AdHCN2 mostraron un ritmo más regular y más rápido (Figura 19B), con un ritmo de 88.0 ± 5.4 bpm (n = 16). Además, estos cultivos marcaron una despolarización diastólica notable y un MPD menos negativo (Figura 19C). Las diferencias en la frecuencia, inclinación de fase 4, y MPD fueron estadísticamente significantes (P < 0.05). Los cultivos infectados con AdGFP (frecuencia: 45.8 ± 4.7 bpm; MDP: -59.5 ± 2.4 mV; n = 6) no difirieron de los cultivos de control no infectados, pero si difirieron significantemente de las células infectadas con AdHCN2.

Los cultivos adultos no latieron espontáneamente, ya sea bajo condiciones controladas o después de la infección con AdHCN2. Esto no fue sorprendente, dada la relación de activación relativamente negativa de la corriente manifestada en las células adultas. Sin embargo, Ranjan et al. (1998) propuso que la If nativa en el ventrículo mamífero adulto contribuye a la estimulación de corte de ánodo. El estímulo de hiperpolarización activa la en caso de que sea suficientemente fuerte. La corriente de cola interna resultante, combinado con el bloque dependiente de voltaje de iki, causa que el potencial de la membrana sobrepase el potencial restante en una dirección despolarizante sobre la terminación de la incitación, llevando a la estimulación. Por consiguiente, se comparó la susceptibilidad de la estimulación del corte de ánodo de los cultivos adultos de control y de aquellos infectados con AdHCN2. Utilizando un estímulo de 20-ms, se midió el potencial negativo máximo obtenido de una estimulación de ánodo de umbral. También se midió la densidad de If al final de una medida de voltaje de 2-s de hasta -125 mV en las mismas células. La Figura 28 demuestra que las células infectadas mostraron con mayor facilidad la estimulación de corte de ánodo. La Figura 28A muestra el control representativo (izquierda, con un curso de tiempo de estímulo arriba) y rastros infectados (derecha) de estímulo de ánodo y recorridos ascendentes de impulsos eléctricos resultantes. El retraso entre el final del estímulo del ánodo y el umbral del impulso eléctrico no fue estadísticamente diferente entre las células infectadas y las de control (45 ± 10 mV vs. 58 ± 9 ms, P > 0.05). La Figura 28B representa con gráficas la relación entre el potencial negativo máximo en el umbral y la densidad de If o 7HCN2 para control (símbolo en blanco) y las células infectadas (símbolo rellenado). Las células de control mostraron una correlación inversa entre el voltaje negativo máximo requerido para la estimulación del ánodo y la densidad de If (Figura 38B, inserción), apoyando la hipótesis de que la If nativa contribuye a la estimulación de corte de ánodo. Por otra parte, fue suficiente hiperpolarizar la membrana a -80 mV aproximadamente en las células infectadas, es decir, el umbral para la corriente HCN2 manifestada. El umbral de corte de ánodo fue independiente de la densidad de la corriente manifestada, indicando que la corriente manifestada fue lo suficientemente grande en todas las células infectadas para generar un exceso suficiente para lograr la estimulación en el umbral 7HCN2- Cuando se calculó la energía de estímulo requerida, como el integral del área desde el inicio del estímulo hasta el umbral del impulso eléctrico, hubo una diferencia significante entre las células de control y las células infectadas con AdHCN2 (3140 ± 279, n = 10, vs. 2149 ± 266 mV-ms, n = 12; P < 0.05). Ni la energía de estímulo requerida, ni la frecuencia espontánea de las células infectadas difirieron de las células de control (no se muestran datos), indicando que esto no fue simplemente un efecto de la infección adenoviral. Además, el potencial de descanso no difirió entre los miocitos de control, los infectados con AdHCN2 y los infectados con AdGFP (no se muestran datos).

Factores que afectan el voltaje de activación de los canales HCN en ventrículos adultos y neonatales.

Este estudio inicial investigó si el voltaje de activación distinto de If en el ventrículo adulto y neonatal fue resultado de una diferencia prominente en las propiedades biofísicas de las isoformas HCN2 y HCN4 cuando se manifiestan en los miocitos ventriculares, o fue debido a una influencia del estado de madurez del miocito en una isoforma individual, específicamente el HCN2. Los resultados indican que aunque el HCN4, el cual es más prevalente en el ventrículo neonatal que en el adulto, si se activa con voltajes menos negativos que le HCN2 cuando se manifiesta en el ventrículo neonatal, este efecto de la isoforma es modesto. En comparación, cuando la isoforma de HCN2 se manifiesta de manera separada en los miocitos ventriculares adultos y neonatales, los puntos medio de activación difieren por 18 mV, en comparación a una diferencia de 22 mV en los puntos medios de activación de la corriente Jf nativa en el ventrículo adulto y neonatal en cultivo. De esta manera, la diferencia de desarrollo en la dependencia de voltaje de la corriente de marcapasos bajo estas condiciones experimentales se justifica en gran medida por un efecto del estado de madurez del miocito en la isoforma HCN2 en lugar de un cambio de la isoforma HCN4/HCN2. Además, esta diferencia en el voltaje de activación resulta en una diferencia notable en el impacto fisiológico de la corriente HCN2 manifestada, debido a la posición relativa del umbral de corriente con al potencial diastólico máximo como una función del periodo. Al investigar la cuestión, primero se compararon las características biofísicas del HCN2 y HCN4 de ratón manifestados en los miocitos ventriculares de rata neonatal, en lugar de en un sistema de manifestación mamífero heterólogo como el de las células HEK293. Como en el caso de estudios anteriores de manifestación heterólogos, estos datos indican que una diferencia inherente en la dependencia de voltaje de HCN2 y HCN4, cuando se manifiestan en los miocitos, no se justifica por sí la diferencia dependiente de la edad en la dependencia de voltaje. En ambas edades, el HCN2 es la isoforma dominante basado en la protección RNase, aunque la proporción relativa del mensaje de HCN2/HCN4 aumenta desarrolladamente (Shi et al., 1999). El cambio negativo de 9 mV de la activación de HCN2, con relación a HCN4(-75 y -66 mV, respectivamente, usando el método de transfección lipofectin) en miocitos neonatales es mucho menor que la diferencia de desarrollo en la activación de corriente nativa. Además, las cinéticas de activación del If nativo son más rápidas en el neonato que en el adulto, mientras que las cinéticas de activación de HCN4 son más lentas que las de HCN2. De esta manera, una contribución dominante de HCN4 en el neonato, cambiando a una contribución dominante de HCN2 en el adulto, es inadecuada para explicar la diferencia de desarrollo ya sea en el voltaje de activación o en las cinéticas de activación.

Sin embargo, se debe observar que esto no excluye que un cambio de isoforma sea un componente necesario o contribuyente del cambio de desarrollo en la dependencia de voltaje. Podría ser que el HCN4 se activaría en voltajes menos negativos notablemente en el ventrículo adulto así como en el neonatal, es decir, que solo el HCN2 es sensible a estado de madurez del miocito. Sin embargo, parece poco probable, dados los resultados de manifestación heterólogos en relación a al HCN4, los cuales no indican que el HCN4 sea inherentemente positivo. Hay que reconocer, que es difícil comparar los voltajes de activación entre los estudios, aunque con la misma preparación surgen diferencias considerables entre los laboratorios como resultado de variaciones en la preparación de la célula y/o en los protocolos de registro. Aún así, es interesante que la manifestación de HCN4 en el ventrículo neonatal es mucho menos negativo que en cualquier otro estudio de manifestación mamífero reportado. Se observó un punto medio de -66 mV, en tanto que se reportaron valores en otros estudios de manifestación mamífera que van de -80 a -109 mV para esta isoforma (Shii et al., 1999; Ludwig et al., 1999; Moosmang et al., 2001 ; Ahornare et al., 2001). El HCN2 en el ventrículo neonatal también se activa con voltajes menos negativos que en otros sistemas mamíferos, con un punto medio de -78 mV (mediante medición de cola con infección adenoviral) en este estudio, comparado con valores que van de -83 a -97 mV (Ludwig et al., 1999; Moosmang et al., 2001 ; Ahornare et al., 2001 ; Moroni et al., 2000). En aquellos casos donde se midió en el mismo estudio el voltaje de activación de HCN2 y HCN4, el HCN2 se activó un poco menos negativamente (Ludwig et al., 1999), equivalentemente (Moosmang et al., 2001) o un poco más negativamente (Ahornare et al., 2001) que el HCN4. De esta manera, aunque los resultados coinciden en gran parte con otros estudios que solo reportaron una pequeña diferencia en el voltaje de activación entre el HCN2 y el HCN4, lo que se observó en general fue una activación menos negativa de ambas isoformas en el ventrículo neonatal, en comparación con otros sistemas de manifestación mamífera. Esto indica que el miocito neonatal posiblemente proporciona un medio ambiente único, en relación con sistemas de manifestación alternativos, permitiendo una activación menos negativa. Sin embargo, un estudio de manifestación de oocito (Santoro et al., 2000) reportó una activación de HCN2 equivalente a la de un ventrículo neonatal, con un punto medio de -78 mV, indicando que otros sistemas también pueden manifestar HCN2 con una dependencia de voltaje menos negativa (también ver Ejemplo 1).

Dado que no está claro si es el medio ambiente adulto o neonatal el que es único (o si solamente son dos puntos distintos en un continuo), está claro que el HCN2 muestra marcadamente una dependencia de voltaje diferente cuando se manifiesta en las dos preparaciones de células, y que esto pone en un plano paralelo la diferencia del desarrollo en la If nativa. Bajo estas condiciones experimentales, el punto medio de activación de la corriente nativa en el ventrículo adulto y de recién nacido difirió por aproximadamente 22 mV, menos que la diferencia previamente reportada en el valor de umbral de aproximadamente 40 mV (Robinson et al., 1997). Una porción de la diferencia puede ser el resultado de un periodo de cultivo de 48 horas, ya que los miocitos adultos aislados extremadamente tenían un punto medio de valor de activación que era 6 mV más negativo. Aunque estadísticamente esta no era una diferencia significante, está en consonancia con un estudio previo que encontró que el cultivo extendido bajo condiciones que causaron una desdiferenciación morfológica de los miocitos adultos dio como resultado un cambio positivo del voltaje de activación (Fares et al., 1998). Además, el estudio de desarrollo previo específicamente utilizó miocitos epicardiacos adultos (Robinson et al., 1997), mientras que el estudio actual usó todo el ventrículo del corazón adulto para obtener una producción más elevada de células viables para cultivo. Se observó una gradiente de activación de If, con epicardio más negativo que endocardio, en el corazón canino (Shi et al., 2000). En caso de que existiera una gradiente similar en el ventrículo de rata adulta, esto también podría contribuir a los valores adultos menos negativos que se observaron en este estudio.

Los puntos medios reales de la activación de la If nativa en el ventrículo fueron de -77 y -99 mV en el neonato y adulto, respectivamente, comparado con los valores para HCN2 de -78 y -96 mV en estas dos preparaciones. De esta manera, la activación explica en gran parte la dependencia de voltaje de la I nativa. La diferencia en la activación entre el ventrículo de adulto y neonatal no es secundario a las diferencias en los niveles de cAMP, ya que al saturar cAMP en la pipeta cambia la dependencia de voltaje de HCN2 por una cantidad comparable en los miocitos de neonatos y adultos (17 y 14 mV, respectivamente). Además de la eliminación del cAMP fundamental como un factor, la base para la diferencia dependiente de la edad en la dependencia de voltaje de HCN2 cuando se manifiesta en los miocitos no es clara. El rango de la dependencia de voltaje que se reportó para If en diferentes regiones cardiacas o como una función de edad o enfermedad es pronunciada, y puede reflejar una combinación de mecanismos. Los estudios de otros canales identificaron un número de factores que pueden alterar las propiedades biofísicas de la corriente nativa o manifestada, incluyendo subunidades beta (Melman et al., 2001 ; Tinel et al., 2000), la composición de la membrana local (Martens et al., 2000), interacciones citoesqueletales (Chauhan VS, et al., 2000), fosforilación/desfosforilación (Chang et al., 1991 ; Yu et al., 1993; Walsh et al., 1991) y otras modificaciones post-traslacional tal como truncamiento (Gerhardstein et al., 2000). La medida en que cualquiera de estos mecanismo contribuyen a la variación en la dependencia de voltaje de If o 7HCN2 es desconocida. En este contexto, es interesante que cuando se estudia la If nativa en una activación de parche macro libre de célula cambia notablemente a negativo, pero el tratamiento de la cara intracelular del parche con pronase cambia la activación de vuelta en la dirección positiva por 56 mV (Barbuti et al., 1999). Además, cuando se elimina una gran porción de HCN2 de terminal C que incluye el dominio vinculante de nucleótidos cíclicos, la activación cambia a positivo por 24 mV (Wahler, 1992).

Uno puede especular que a partir de estos resultados que las interacciones entre los elementos citoplásmicos de la proteína HCN pueden contribuir a una activación más negativa, pero que estas interacciones están minimizadas en la célula intacta, tal vez debido a la presencia de elementos citoesqueletales, una subunidad beta u otros factores. Está por determinarse la medida en que cualquiera de estos factores en realidad contribuyen a una variación regional o de desarrollo en el voltaje de activación. Sin embargo, si este razonamiento es correcto, entonces el o los factores que contribuyen a la activación menos negativa de HCN2 en el neonato no parecen ser limitados de sustratos, ya que no se observó un cambio negativo en el voltaje de activación en los niveles de manifestación que fueron 2-3 órdenes de magnitud mayor que aquella típica de la corriente nativa en esta preparación.

Las características cinéticas de la corriente nativa en el ventrículo adulto y de neonato también son en gran parte explicables por el HCN2, aunque tal vez no en su totalidad. En el neonato, la corriente nativa se activa con cinéticas que son intermedias entre aquellas del HCN2 y del HCN4 manifestado en estas mismas células. Cuando la relación completa de activación/desactivación del HCN2 manifestado se compara en neonato y adulto, la diferencia se atribuye en gran parte a la diferencia en la dependencia de voltaje de la activación. De esta manera, no parece haber un efecto del estado de madurez del miocito directamente en las cinéticas de activación de la corriente manifestada, independiente del efecto en la dependencia de voltaje de activación. Sin embargo, las cinéticas de la If nativa en el adulto parecen más lentas que las cinéticas del HCN2 manifestado (comparar Figuras 24B y 25B).

Como era de esperar, manifestar altos niveles de HCN2 en un cultivo neonatal resulta en un aumento notable en la frecuencia espontánea. A esto lo acompaña un potencial diastólico máximo menos negativo y una inclinación de la fase 4 más pronunciada. El potencial diastólico máximo en el cultivo infectado de HCN2 corresponde al voltaje de umbral de la corriente de HCN2, indicando que aún los niveles de umbral de la corriente manifestada son suficientes para equilibrar la contribución de ZKi (el cual es pequeño en los cultivos neonatales). El manifestar HCN2 en los miocitos adultos no da como resultado el automatismo, ya sea por el rango de activación más negativo en las células adultas o bien por la gran densidad JKi en esta etapa. Sin embargo, no aumenta la susceptibilidad a la estimulación de corte de ánodo. En los cultivos infectados de HCN2 de células adultas, el voltaje negativo máximo requerido durante la estimulación del ánodo para mostrar la estimulación de corte de ánodo corresponde al voltaje de umbral de la corriente HCN2. De esta manera, el impacto fisiológico de la sobre-manifestación de la familia de genes de HCN en el miocardio depende del voltaje de umbral de la corriente manifestada. Este umbral de voltaje, y por consiguiente el impacto fisiológico de la sobre-manifestación de HCN, depende hasta cierto punto de cual isoforma se manifiesta (es decir, HCN2 vs. HCN4 en neonato). Sin embargo, este efecto también depende del contexto, con un resultado distinto que depende del estado de madurez del tejido objetivo. Por la misma razón, es probable que el efecto dependa de la región cardiaca en la se manifiesta el canal y el estado de enfermedad del tejido, ya que la corriente nativa es afectada notablemente por estos factores. Esto tiene implicaciones obvias para cualquier esfuerzo futuro para alterar el ritmo cardiaco a través de la sobre-manifestación regional de las isoformas HCN selectivas. Esto indica que la frecuencia se puede mejorar al incrementar el nivel de la corriente, si la corriente manifestada se activa con un voltaje de umbral adecuado en el tejido objetivo. Como una perspectiva adicional que se obtuvo hacia los mecanismos que regulan la dependencia de voltaje de esta familia de genes, puede ser posible controlar tanto el nivel de la corriente como su voltaje de activación.

EJEMPLO 3 Efecto de la Composición Molecular de los Canales HCN en Niveles de Manifestación y Cinéticas de los Canales MiRPI: Subunidad beta del canal HCN que mejora la manifestación y acelera las cinéticas. La familia HCN de las subunidades del canal iónico se identificó como el concepto correlativo de las corrientes If en el corazón, y Tij y Jq en las neuronas (Ludwig et al., 1998; Santoro et al., 1998; Santoro et al., 1999). Sin embargo, un número de canales iónicos (incluyendo los canales HCN) son heteromultímeros de una gran subunidad a y subunidades jS más pequeñas. Los rectificadores de retraso cardiacos Ia (Abbot et al., 1999) y / S (Sanguinetti et al., 1996) son ejemplos de este principio básico. Sus subunidades a se derivan de las familias ERG y KCNQ respectivamente, pero ambas también contienen subunidades ß de una familia de una sola transmembrana que abarca las proteínas llamadas minK y MiRPs (péptidos relacionados a minK).

Los MiRPI mejoran la manifestación y aceleran las cinéticas de activación de la familia HCN de las subunidades del canal. Los ensayos de protección R ase (RPAs) muestran que MiRPI mRNA es prevalente en la región primaria de ritmo cardiaco, el nodulo sinusal, y apenas perceptible en el ventrículo. La co-inmunoprecipitación indica que MiRPI forma un complejo con HCNL Juntos, estos resultados indican que MiRPI es una subunidad ß de la familia HCN de las subunidades de proteína del canal iónico, y que es probable que sea un regulador importante de la actividad de marcapasos cardiaco. Se transcribió la manifestación heteróloga de las subunidades de HCN y MiRPI en el cRNA de los oocitos de Xenopus que codifican el HCNI o HCN2 de ratón, MiRPI de rata con o sin una etiqueta HA en la terminal carboxílica, y minK de rata al usar el kit mMessage mMachine (Ambion, Austin, TX). Los oocitos de Xenopus laevis se aislaron, se inyectaron con 2-5 ng (50-100 ni) de cRNA, y se mantuvieron en un medio de Barth a 18°C por 1-2 días. Para los experimentos en que se usaron tanto HCNI o HCN2 y MiRPI o minK, las cRNAs respectivas se inyectaron en una razón de 1 :0.04-l .

Los estudios electrofisiológicos en los oocitos emplearon la abrazadera de voltaje de dos microelectrodos. La solución de registro extracelular (OR2) contenía: 80mM NaCl, 2mM KC1, 1 mM MgCl2, y 5 mMJSfa-JELEPES (pH 7.6). Los datos de grupos se presentan como medios ± SEM. Se llevaron a cabo pruebas de trascendencia estadística para las curvas de activación de punto medio y de inclinación usando una prueba t de Student. P < 0.05 se considera significante. Ensayos de protección RNase Los procedimientos para la preparación del RNA total de los tejidos de corazón de conejo y el desempeño de los ensayos de protección RNase fue similar a los que se describieron previamente (Dixon y McKinnon, 1994). El RNA total de cerebro se obtuvo comercialmente de Clontech, y el RNA total se aisló del ventrículo izquierdo, de la aurícula derecha y del cerebro usando el Sistema RNA Total SV (Promega). Se usaron 2 µg de RNA total para cada experimento. Se utilizó una sonda de ciclofilina en cada experimento como un control interno sobre la pérdida de muestras. La manifestación de RNA se cuantificó directamente a partir de geles deshidratados de ensayos de protección RNase usando un Storm Phosphorimager (Molecular Dynamics), normalizado a la señal de ciclofilina en cada senda. La señal de MiRPI consiste de dos fragmentos protegidos en cada tejido de conejo donde se detectó el MiRPI. La presencia de dos bandas es probablemente el resultado de los iniciadores PCR, basado en las secuencias humanas y de ratón, usado para la clonación de las sondas RPA. La intensidad combinada de ambas bandas se utilizó en la cuantificación. Química de la proteína Todos los pasos para la preparación de la proteína de la membrana, se realizaron en hielo. Se lavaron 25 oocitos con una solución Ringer (96 mM NaCl, 1.8niM CaCl2, 5 mM Hepes (pH 7.4)) y se disolvieron al aplicar un efecto de vórtice con 1 mi de Lysis Buffer 1 (7.5 mM Na2HP04 (pH 7.4), 1 mM EDTA) con inhibidores de proteasa (aprotinina, leupeptina y pepstatina A, 5 µg/ml de cada uno, y 1 mM EDTA). El lisado se centrifugó por 5 min a 150 xg para remover las proteínas de la yema y subsecuentemente por 30 min a 14000 xg. El granulo de la membrana se lavó con Lysis Buffer 1 y se volvió a suspender en 1 mi de Lysis Buffer 2 (50 mM Tris-HCI (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 50 mM piro fosfato Na, 100 mM KH2P04, 10 mM molibdeno Na, 2 mM ortovanadato Na, 1% Tritón® X-100, 0.5% NP40) con el mismo conjunto de inhibidores de proteasa como en el Lysis Buffer 1. La concentración de proteínas de las fracciones de la membrana se determinó mediante el método Lowry. Para el análisis inmunoquímico por medio del western blot, se separaron las proteínas asociadas con las fracciones de la membrana del oocito en 10% SDS/PAGE (para HCNI) o en 16.5% SDS/PAGE Tricina (para MiRPI) (Sclagger y von Jagow, 1987); y electrosecado a membranas nitrocelulosas Hybond ECL™ (Amersham Pharmacia Biotech). El bloqueo y las incubaciones de anticuerpos se hicieron en PEST. Los anticuerpos HCNI de conejo (Quality Controlled Biochemicals) y los anticuerpos de alta afinidad anti-HA de rata (Roche Molecular Biochemicals) se usaron en una dilución a 1 :5000 y a 1 :500 respectivamente. Los fragmentos anti conejo secundario (Kirkegaard Perry Laboratories, Maryland, US) y los fragmentos Ig-POD anti rata (Boehringer Mannheim Biochemica) acoplados con peroxidasa de rábano se usaron en una dilución a 1 : 10000 ó 1 :2000 respectivamente. Las bandas de proteína inmunoreactivas se visualizaron utilizando Lumi-LightPLUS Western Blotting Substrate (Roche Molecular Biochemicals). Las reacciones de inmunoprecipitación se realizaron usando 250 /xg de fracciones de proteína de membrana y 10 µ? de anticuerpos HCNI entrelazados con la proteína A/G PLUS-Agarosa (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) con dimetilpimelimidate.

El MiRPI mejora la manifestación y la conductancia de los canales HCN manifestados en oocitos.

Los oocitos de Xenopus se emplearon como un sistema de manifestación heteróloga y se examinó la manifestación de HCNI y HCN2 individualmente y co-manifestado ya sea con minK (la proteína de canal K mínima, el primer miembro identificado de la familia de proteínas que abarcan la transmembrana simple) o con MiRPI. Los resultados se muestran en la Figura 29. Tanto el HCNI (Figura 29A) como el HCN2 (Figura 29D) manifiestan una corriente pequeña cuando se inyectan independientemente. La co-manifestación de HCNI (Figura 29B) o de HCN2 (Figura 29E) con minK resulta en niveles bajos y similares de la manifestación de la corriente. Sin embargo, se observa una corriente mucho más grande cuando el HCNI (Figura 29C) o el HCN2 (Figura 29F) se co-manifiesta con MiRPI. Ni la inyección de MiRPI por sí solo ni la inyección con 100 ni de H20 (no se muestra) indujo una corriente. Todo el conjunto de resultados de los estudios de manifestación de HCNI y de HCN2 con o sin minK y MiRPI se muestran en las Figuras 29G y H. La conductancia máxima se calcula al dividir el comienzo de la corriente en el potencial más negativo entre la fuerza motriz (el potencial de reversión se midió en cada oocito). Los resultados demuestran un incremento casi por el triple de la conductancia de HCNI cuando HCNI se co-manifiesta con MiRPI, en tanto que MiRPI incrementa la manifestación de HCN2 por más de cinco veces. La co-manifestación de HCNI o de HCN2 con minK no aumenta la manifestación de HCNI o de HCN2. De esta manera, el incremento de la manifestación es específica para MiRPI. La Figura 30 muestra las propiedades de activación periódica de MiRPI co-manifestado con HCNI o HCN2. Las curvas de activación isócronas se construyeron a partir de las corrientes de cola registradas a -10 mV en respuesta a pulsos de prueba de hiperpolarización de 3-s (para HCNI) u 8-s (para HCN2) de duración. Los resultados no demuestran una diferencia significante en el punto medio pero estadísticamente indican una inclinación más superficial para la activación de los canales HCN co-manifestados con MiRPI (Figuras 30A y B, para más detalles, ver la breve descripción de las figuras).

Las Figuras 30C-F muestran las cinéticas de activación y de desactivación. Se muestran los datos sin refinar para la activación tanto de HCNI (Figura 30C) como de HCN2 (Figura 30D). Como se muestra en las figuras, el MiRPI reduce la constante de tiempo de activación. El promedio de todos los resultados sobre la activación y la desactivación (indicados por la caja marcada por un círculo), proporcionados en la Figura 30E y F, indica que la co-manifestación con MiRPI acelera ambos procesos.

También se estudiaron las propiedades de rectificación del HCNI o HCN2 manifestados con o sin MiRPI. Tanto la manifestación de HCNI como de HCN2 con MiRPI no alteró la linealidad de la relación corriente- voltaje completamente activada (no se muestra).

Estudios previos que examinan la función potencial de MiRPI para generar Ia emplearon el análisis Northern Blot para demostrar la presencia de MiRPI mRNA en todo el corazón de rata (Abbott et al., 1999). Si MiRPI también regula la manifestación de la corriente If in vivo, el mRNA para MiRPI debe ser prominente en regiones donde las corrientes If son extensas. Los ensayos de protección RNase se utilizaron para cuantificar la distribución de transcritos de MiRPI en el nodulo SA, en la aurícula y ventrículo derecho del corazón de conejo. Como se muestra en la Figura 31 , los niveles de los transcritos de MiRPI son más elevados en el nodulo SA, los niveles de la aurícula son aproximadamente 40% de aquellos en el nodulo SA, mientras que los niveles ventriculares apenas se pueden detectar (< 4% del nivel en el nodulo SA).

Estos datos indican que probablemente exista un complejo entre miembros de la familia HCN y de MiRPI, y también indica que MiRPI pueda ser una subunidad ß para la familia HCN. Después se investigó esta hipótesis usando HCNI para el cual se dispone de anticuerpos. El anticuerpo HCNI reconoce un polipéptido simple con una masa molecular aparente de 145 kDa (posiblemente glicosilada) (Hansen et al., 1995). Los anticuerpos de alta afinidad anti-HA reconocieron al MiRPI, etiquetado HA epítope en el extremo de la terminal carboxílica, como una banda de 13.5 kDa. Ambas proteínas se localizaron en la fracción de la membrana, y se incrementó la manifestación de la proteína (aproximadamente el doble) cuando se co-manifestaron juntas (Figuras 32A y B).

Se realizaron experimentos de co-inmunoprecipitación usando fracciones de membrana de oocitos inyectados con cRNAs que codifican únicamente al HCNI, únicamente al MiRPI, o con ambos cRNAs, para probar si un complejo de HCNI y MiRPI pudiera existir en un sistema de manifestación heterólogo. La Figura 32C muestra los productos de inmunoprecipitación que probaron mediante un análisis western blot. La presencia de MiRPI en el anti-HCNI solo para oocitos inyectados por HCNI y MiRPI cRNAs, junto con la ausencia en los oocitos inyectados por cualquiera de estos cRNAs, indica que el anticuerpo anti-HCNI debilitó al MiRPI probablemente porque estaba en el complejo con HCNI.

Los resultados demuestran que las proteínas se encuentran co-localizadas como un complejo en la membrana e incrementan la manifestación mutuamente. Esto indica firmemente que MiRPI es una subunidad jS para la familia HCN de los canales iónicos. MiRPI es un miembro de una familia de proteínas individuales que abarcan la transmembrana, las cuales demostraron que alteran la manifestación y sirven como una subunidad ß de los miembros de la familia KCNQ (minK) y ERG (MiRPI) (Abbott et al., 1999; Dixon y McKinnon, 1994). En estos estudios previos, así como en éste estudio, el miembro de la familia minK alteró la activación periódica y se demostró que es una subunidad beta mediante la co-inmunoprecipitación.

En este estudio se mostró que minK no afecta las propiedades de los canales HCNI y HCN2 que se manifiestan en los oocitos de Xenopus. Por otro lado, MiRPI dramáticamente incrementa la manifestación de corriente de ambas subunidades HCN y acelera las cinéticas de activación y desactivación de la corriente. También se ve una aceleración de las cinéticas de desactivación cuando MiRPI se asocia con HERG para formar Ia (Abbott et al., 1999). Los datos que se presentan en este documento también muestran que MiRPI y HCNI probablemente forman un complejo en la membrana.

La actividad de marcapasos en el nodulo sinusal de conejo se genera por una corriente de entrada neta de solo pocos pA (Vasalle et al., 2000). Esta corriente de entrada neta se debe al balance de las corrientes de entrada y salida más que a una orden de una gran magnitud.

Aunque se conocen las propiedades biofísicas de las corrientes componentes, sigue sin saberse como se logra este fino balance. Los resultados que se presentan aquí muestran que una subunidad beta simple puede controlar la manifestación de dos corrientes de marcapasos importantes, la Ia de salida, y la If de entrada. Si este es el caso, es posible que el MiRPI sirva como un regulador importante de la frecuencia de marcapasos cardiaco.

EJEMPLO 4 Inducción de la Actividad de Marcapasos por Sobremanifestación de Canales HCN en Corazón In Situ HCN2 induce corriente de marcapasos en corazón in situ Se hizo la hipótesis de que la sobremanifestación de If en los tejidos secundarios de marcapasos del sistema conductivo especializado cardiaco o en células del miocardio que no son de marcapasos podrían proporcionar un nido de actividad de marcapasos para impulsar el corazón en una modalidad de "demanda" en la ausencia de la función de marcapasos dominante del nodulo sinusal o falla de propagación de impulso mediante el nodulo auriculoventricular. Se enfocó la atención en el HCN2 ya que sus cinéticas son más favorables que aquellas de HCN4 y su receptividad de cAMP es mayor que la de HCNI. Se llevaron a cabo experimentos iniciales en miocitos en cultivo de rata neonatal. Estos experimentos indicaron que no solo una corriente de marcapasos sobremanifestada pudiera incrementar la frecuencia cardiaca, sino que las mutaciones en el gen de marcapasos de HCN2 y/o el añadir subunidades de canal accesorias adecuadas podrían modificarlas características de la corriente manifestada en una manera que se pudiera esperar mejorara la frecuencia cardiaca (Patente U.S. No. 6,849,611 ; Qu et al., 2001 ; Qu et al., 2004; Chen et al., 2001b; Plotnikov et al., 2005a). Estos miocitos ventriculares neonatales manifiestan una pequeña corriente de marcapasos endógena y, cuando se infectan con un adenovirus con HCN2, expresan una corriente de marcapasos notablemente más grande. Cuando la frecuencia cardiaca espontánea de cultivos de capa unimolecular infectados con un Ad que manifiesta HCN2, y la proteína fluorescente verde (GFP) se comparó con un virus incorporando GFP como un control y marcador, los cultivos que manifiestan HCN2/GFP tienen latidos más rápidos significativamente (Qu et al., 2001).

Basado en los resultados prometedores y en las implicaciones del trabajo de cultivo de la célula, se probó el concepto de prueba al inyectar una pequeña cantidad de genes GFP y HCN2 en un vector adenoviral en la aurícula izquierda canina (Qu et al., 2003). Después de la recuperación de los animales, se estimuló el nervio vago derecho para inducir una desaceleración y/o bloqueo sinusal. En este contexto, la actividad de marcapasos se originó en la aurícula izquierda y se hizo el mapeado del ritmo hacia el sitio de la inyección adenoviral. Al incrementar la intensidad de la estimulación vagal y al también añadir estimulación vagal en el lado izquierdo se obtuvo el cese de actividad de marcapasos biológico, conllevando a una receptividad parasimpática. Los miocitos auriculares se separaron del sitio de inyección, se dejó constancia de una corriente de marcapasos sobremanifestada. En resumen, los resultados indican que tal corriente de marcapasos sobremanifestada podría proporcionar latidos de escape bajo circunstancias de desaceleración sinusal (Qu et al., 2003).

Los siguientes pasos involucran inyección de catéter del mismo constructo HCN2/GFP adenoviral en el sistema conductivo LV proximal canino, bajo control fluoroscópico (Plotnikov et al., 2004). Los animales inyectados demostraron ritmos idioventriculares con frecuencias de 50-60 bpm cuando la estimulación vagal eliminó el ritmo sinusal. Para el grupo HCN2, los ritmos trazaron una dirección hacia el sitio de inyección. Cuando los tejidos de la rama se removieron del corazón y se estudiaron con micro electrodos, se encontró que el automatismo de los que se inyectaron con HCN2 se excedía en las preparaciones de control, es decir, había una frecuencia espontánea significativamente mayor generada por las ramas inyectadas con HCN2 que por las inyectadas con solución salina o con virus solamente portando GFP (Plotnikov et al., 2004).

Propiedades biofísicas de corrientes iónicas como pronosticadores de la función de marcapasos biológico Los estudios en miocitos de rata neonatal (Figuras 10 y 1 1) y en oocitos Xenopus (Figuras 121 -15) dieron resultados concordantes en cuanto a la función de mHCN2 y mE324A, que la mutación mE324A indujo una activación de corriente de marcapasos más positiva y más rápida en estas configuraciones in vitro, se puede interpretar que el mHCN2 indica que el canal mutante daría como resultado una frecuencia de marcapasos más rápida y/o un intervalo de escape más corto después de una sobremarcha de ritmo que ocurrió en los corazones inyectados con solución salina o con mHCN2. Sin embargo, los corazones inyectados con solución salina y con mHCN2 mostraron tiempos de escape equivalentes a los de los corazones inyectados con mE324A. En cuanto a las frecuencias automáticas per se, estas fueron equivalentes para los corazones inyectados con mE324A y mHCN2, y ambas fueron significativamente más rápidas que los corazones inyectados con solución salina. En otras palabras, para dos descriptores importantes, frecuencia obtenida y eliminación de sobremarcha, no hubo una clara distinción entre los efectos de mHCN2 y de mE324A in situ.

Una explicación para esto puede ser que el porcentaje de miocitos que manifiestan la corriente mE324A fue significativamente menor que la que manifiesta mHCN2. Además, hubo una densidad de corriente menor en el grupo E324A. Por lo tanto, mientras un fracción mayor de los canales se activan más rápido a un voltaje determinado con mE324A comparado con mHCN2, el número total de canales disponibles o la corriente neta puede ser aproximadamente equivalente en voltajes relevantes fisiológicamente, tal como -55 mV (ver inserciones en la Figura 10).

A continuación se ve el límite al que los resultados biofísicos fueron predictivos de aquellos in situ: los datos biofísicos que indican que la densidad de mE324A es menor que la de mHCN2, y que la activación de mE324A es positiva y más rápida que la de mHCN2, sugerirían que para la frecuencia de marcapasos no tendría que existir ninguna ventaja en cualquiera de los constructos. La detección de que la respuesta cAMP de mE324A es positiva en comparación a la de mHCN2, daría a entender que la magnitud o sensibilidad de la respuesta de mE324A a la epinefrina in situ puede ser mayor que la de mHCN2. De hecho, los estudios in situ no mostraron ventaja de frecuencia alguna de los constructos con una mayor respuesta a la epinefrina del mE324A mutante. Esto no solo muestra una concordancia entre lo que se detectó biofísicamente y la implicación clínica, sino conduce a las siguientes hipótesis: primero, mientras exista suficiente densidad de corriente, la posición positiva de la curva de activación y/o cinéticas más rápidas son más importantes que la densidad absoluta de la corriente en la funcionalidad del marcapasos biológico; y segundo, la receptividad adrenérgica depende más de la posición final de la curva de activación en presencia de cAMP que de la magnitud del cambio de voltaje.

EJEMPLO 3 Terapia de Célula con Células Madre Mesenquimales Humanas Cultivos de células Las células madre mesenquimales humanas (hMSCs; células madre mesenquimales, médula ósea humana; Poietics™) se adquirieron de Clonetics/Bio Whittaker (Walkersville, MD, EE.UU), se cultivaron en un medio de crecimiento de célula madre mesenquimal (MCS) y se usaron en los conductos del 2 al 4. Las hMSCs aisladas y purificadas se pueden cultivar por muchos conductos (12) sin perder sus propiedades únicas, es decir, actividad normal de cariotipo y telomerasa (van den Bos et al., 1997; Pittenger et al., 1999) Las células HeLa que se transfectaron con la rata Cx40, rata Cx43 o con el ratón Cx45 se co-cultivaron con hMSCs. Las condiciones de producción, de caracterización y de cultivo de las células HeLa transfectadas se describieron previamente (Valiunas et al., 2000; 2002). Anticuerpos de anti-conexina, marcado inmunofluorescente, y análisis Western blot. Los anticuerpos monoclonales y policlonales de anti-conexina de ratón de Cx40, Cx43 y Cx45, los cuales están disponibles comercialmente (Chemicon International, Temecula, CA), se usaron para inmunomarcación y para Western blot como se describió previamente (Laing y Beyer, 1995). La IgG de cabra contra conejo o contra ratón conjugado con fluorescina (ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, CA) se usó como un anticuerpo secundario. Mediciones electrofisiológicas a través nexos de unión Cubiertas de vidrio con células adherentes se transfirieron a una cámara experimental inundada a temperatura ambiente (~22°C) con una solución de baño que contiene (mM): NaCl, 150; KC1, 10; CaCl2, 2; HEPES, 5 (pH 7.4); glucosa, 5. Las pipetas de parche se llenaron con una solución que contiene (mM): aspartato de potasio, 120; NaCl, 10; MgATP, 3; Hepes, 5 (pH 7.2); EGTA, 10 (pCa ~8); los cuales se filtraron a través de poros de 0.22 µ??. Cuando se llenaron, la resistencia de las pipetas midieron 1-2 ?O. Los experimentos se llevaron a cabo en pares de células utilizando una pinza de voltaje doble. Este método permitió el control del potencial de la membrana (Fm) y la medición de las corrientes de cruce asociadas (I¡).

Estudios de flujo de colorante. La transferencia de colorante a través de canales de nexo de unión se investigó usando pares de células.

El Lucifer Amarillo (LY; Sondas Moleculares) se disolvió en la solución de la pipeta para alcanzar una concentración de 2 mM. La propagación célula a célula de colorante fluorescente se procesó gráficamente al utilizar una cámara digital CCD de 16 bits de 64 000 pixeles de escala de grises (LYNXX 2000T, SpectraSource Instruments, Westlake Village, CA) (Valiunas et al., 2002). En experimentos con pares heterólogos, el LY siempre se inyectó en las células, las cuales se marcaron con Rastreador de Célula Verde. La intensidad de fluorescencia de la célula inyectada, derivada de LY es 10-15 veces mayor que la fluorescencia inicial del Rastreador de Célula Verde. MSCs humanas expresan conexinas Las conexinas, Cx43 y Cx40, se inmunolocalizaron, como se mostraron por coloración punteada típica, a lo largo de regiones de contacto estrecho de célula a célula y dentro de regiones del citoplasma de las hMSCs que crecieron en cultivo como capas unimoleculares (Figuras 33A, B). También se detectó la coloración de Cx45, pero a diferencia de Cx43 o Cx40, no era común de distribución de conexinas en las células. Más bien, se caracterizó por la fina coloración citoplásmica granular y de tipo reticular sin placas asociadas a la membrana fácilmente percatadas (Figura 33C). Esto no excluye la posibilidad que los canales Cx45 existan pero sí implica que su número en relación con los canales homotípicos, heterotípicos y heteroméricos de Cx43 y Cx45 es bajo. La Figura 33D muestra el análisis Western blot de hMSCs y miocitos de ventrículo canino con un anticuerpo policlonal Cx43 el cual añade prueba adicional de la presencia de Cx43 en la hMSCs.

Acoplamiento de nexos de unión entre hMSCs y varias líneas de células. El acoplamiento de nexos de unión entre las hMSCs se demuestra en la Figura 34. Las corrientes de cruce registradas entre pares de hMSC muestran dependencia de voltaje cuasi simétrica (Figura 34A) y asimétrica (Figura 34B) que surgen en respuesta a los pasos de voltaje de cruce simétricos 10-s (Fj) de igual amplitud pero de signo diferente empezando de ± 10 mV a ± 1 10 mV con incrementos de 20 mV. Estos comportamientos se observan normalmente en células que co-expresan Cx43 y Cx40 (Valiunas et al., 2001).

La Figura 34C resume los datos que se obtuvieron de los pares hMSCs. Los valores de las conductancias instantáneas normalizadas ^µ?5?, o) y en condición estable (gj,ss, ·) (determinados al principio y al final de cada paso Fj, respectivamente) se trazaron versus Fj. El panel izquierdo muestra una relación cuasi simétrica de cinco pares hMSC. Las curvas continuas representan el mejor ajuste de datos a la ecuación Boltzmann con los siguientes parámetros: voltaje de desactivación media, V¡,o = -70/65 mV; gj, gAjjm¡n mínimo = 0.29/0.34; gj, gj,max máximo = 0.99/1.00; carga de activación periódica, z = 2.2/2.3 para Fj negativo/positivo, respectivamente. Los esquemas ejemplificados de seis casos asimétricos se muestran en el panel derecho. Las gj)SS descendieron de manera sigmoidea en Fj negativo y mostraron una perceptibilidad de voltaje reducida a Fj positivo. El ajuste Boltzmann para Fj negativo reveló los siguientes valores: Fjj0 = -72 mV, gj;m¡n = 0.25, gj!ma = 0.99, z = 1.5. Las Figuras 34D y E muestran registros multicanal típicos de un par hMSC.

Al usar 120 mM de aspartato K como una solución de pipeta, se observaron los canales con conductancias unitarias con un rango de 28-80 pS. La operación de canales con conductancia ~50 pS (ver Figura 29D) es consistente con los valores previamente publicados (Valiunas et al., 1997; 2002) para canales homotípicos Cx43. Esto no excluye la presencia de otros tipos de canales, solamente indica que el Cx43 forma canales funcionales en las hMSCs.

Para definir aún más la naturaleza del acoplado, las hMSCs se co-cultivaron con células HeLa humanas que se transfectaron establemente con Cx43, Cx40 y Cx45 (Elfgang et al., 1995) y se encontró que las hMSCs se podían acoplar a todos estos transfectantes. La Figura 35A muestra un ejemplo de corrientes de cruce registradas entre una hMSC y pares de células HeLaCx43 que manifestaron corrientes dependientes de voltaje simétrica y asimétricamente en respuesta a una serie (de ± 10 mV a ± 1 10 mV) de pasos de voltaje de cruce simétricos (Vj). Los registros cuasi simétricos indican que el canal funcional dominante es Cx43 homotípico mientras que el registro asimétrico indica la actividad de otra conexina en la hMSC (probablemente Cx40 como se muestra por inmunohistoquímica, ver Figura 33) que puede ser ya sea una forma heterotípica o heteromérica o ambas. Estos registros son similares a aquellos publicados para células transfectadas: formas heterotípicas y mezcladas (heteroméricas) de Cx40 y Cx43 (Valiunas et al., 2000; 2001). El co-cultivo de las hMSCs con células HeLa transfectadas con Cx40 (Figura 35B) también revelaron corrientes de cruce dependientes de voltaje simétrico y asimétrico consistentes con la co-manifestación de Cx43 y Cx40 en las hMSCs similar a los datos para los pares hMSC-HeLa Cx43. Las células HeLa transfectadas con Cx45 acopladas con hMSCs siempre produjeron corrientes de cruce asimétricas con una pronunciada activación periódica de voltaje cuando el lado (HeLa) Cx45 era negativo (Figura 35C). Esto es consistente con las formas de canal dominantes en la hMSC siendo Cx43 y Cx40 ya que ambas producen corrientes asimétricas cuando forman canales heterotípicos con Cx45 (Valiunas et al., 2000; 2001). Esto no excluye a Cx45 como un canal funcional en las hMSCs pero sí indica que Cx45 es un contribuidor menor para el acoplamiento célula a célula en las hMSCs. La falta de placas visualizadas en la inmunomarcación para Cx45 (Figura 28) apoya esta interpretación más adelante. Los esquemas ejemplificados de gj;SS versus Vj de pares entre hMSC y células HeLa transfectadas se muestran en la Figura 35D. El panel izquierdo muestra los resultados de los pares hMSC-HeLaCx43. Para datos simétricos (·, cuatro preparaciones), los ajustes Boltzmann (líneas continuas) produjeron los siguientes parámetros: Vifi = -61/65 mV; gjimin = 0.24/0.33; gj;max = 0.99/0.99; z = 2.4/3.8 para V\ negativo/positivo. Para datos asimétricos (o, tres preparaciones), el ajuste Boltzmann (línea entrecortada) en valores Vj negativos revelaron los siguientes valores de parámetros: = -70 mV; gj;m¡n = 0.31 ; gj;max = 1.0; z = 2.2. El panel central muestra datos de pares hMSC-HeLaCx40 incluyendo tres relaciones gj>Ss-fj simétricas (·) y dos relaciones gjjSS-fj asimétricas (o). Las líneas continuas corresponden a un ajuste Boltzmann a datos simétricos (1.1/1.0; z = 1.4/2.3; Vj negativo/positivo) y la línea entrecortada es un ajuste para unos datos asimétricos (V¡iQ = -57/85 mV; gjjmin = 0.22/0.65; gj)max = 1.1/1.0; z = 1.3/2.2; Vj negativo/positivo). Los datos de los seis experimentos completos de los pares de célula hMSC-HeLaCx45 se muestran en el panel derecho. El esquema de g¡iSS versus Vj fue enfáticamente asimétrico y el mejor ajuste de los datos a la ecuación Boltzmann a valores IPj positivos revelaron los siguientes valores de parámetro: Fjj0 = 31 mV, gj;m¡n = 0.07, gjjmax = 1.2, z = 1.8.

La Figura 35E muestra transferencia de Lucifer Amarillo de una hMSC a una hMSC (panel superior), de una HeLaCx43 a una hMSC (panel central), y de una hMSC a una HeLaCx43 (panel inferior). La conductancia de cruce de los pares de célula se midió simultáneamente por medio de métodos descritos anteriormente (Valiunas et al., 2002) y conductancias reveladas de ~13, ~16 y ~18 nS, respectivamente. La transferencia de Lucifer Amarillo fue similar a la que se reportó previamente para Cx43 homotípico o Cx43 y Cx40 co-manifestadas en células HeLa (Valiunas et al., 2002). El Rastreador de Célula Verde (Sondas Moleculares) siempre se utilizó en una de las dos poblaciones de células para permitir la identificación de pares heterólogos (Valiunas et al., 2000). El Lucifer Amarillo siempre se envió a la célula que contenía rastreador de célula. La intensidad de fluorescencia generada por el Rastreador de Célula Verde fue 10-15 veces menor que la intensidad de fluorescencia producida por la concentración de Lucifer Amarillo enviada a la célula fuente. Las MSCs humanas también se co-cultivaron con miocitos ventriculares caninos adultos como se muestra en la Figura 36. La inmunomarcación para Cx43 se detectó entre los miocitos ventriculares en forma tubular y las hMSCs como se muestra en la Figura 36A. Las hMSCs se acoplan eléctricamente con los miocitos cardiacos. Se obtuvieron registros macroscópicos (Figura 36B) y de multicanal (Figura 36C). Las corrientes de cruce en la Figura 36B son asimétricas mientras que aquellas en la Figura 36C muestran eventos unitarios del rango de tamaño que resulta de la operación de los canales Cx43 homotípicos o Cx43-Cx40 heterotípicos o Cx40 homotípicos (Valiunas et al., 2000; 2001). Las formas heteroméricas también son posibles, cuyas conductancias son las mismas o similares a las formas homotípicas o hetero típicas.

Los estudios de pares de células han demostrado un acoplamiento efectivo de una hMSC a otra hMSC (13.8 ± 2.4 nS, n 0 14), a una HeLaCx43 (7.9 ± 2.1 nS, n = 7), a una HeLaCx40 (4.6 ± 2.6 nS, n = 5), a una HeLaCx45 (1 1 ± 2.6 nS, n =5), y a miocitos ventriculares (1.5 ± 1.3 nS, n = 4).

Uso de hMSCs como una Plataforma de Entrega para ritmo Biológico. Las MSCs humanas se consideran como una plataforma candidata favorable para enviar los marcapasos biológicos al corazón, en base, sugerida por Liechty et al. (2000), a que puedan ser inmunoprivilegiadas y como tal sería de esperar que no causaría una respuesta de rechazo. Esto es importante ya que en el balance marcapasos biológicos y electrónicos, cualquier necesidad de inmunodeficiencia usando el método anterior sería un perjuicio para los métodos de terapia de célula y clínicamente indeseable.

Las MSCs humanas se obtienen con facilidad comercialmente o de la médula ósea, y se identifican por la presencia de marcadores de superficie CD44 y CD29, así como por la ausencia de otros marcadores que son específicos para células progenitoras hematopoyé ticas. Utilizando un análisis de un fragmento de gen, se determinó que las hMSCs no llevan mensaje para isoformas HCN. Es importante destacar que también tienen un nivel de mensaje significante para la proteína de nexo de unión, conexina43. La última observación es crítica ya que la teoría detrás de la terapia de plataforma es que la hMSC estaría cargada con el gen de interés, por ejemplo, HCN2, y se implantaría en el miocardio (Rosen et al., 2004). Sin embargo, el tener una célula cargada con una señal no funcionaría a menos que la célula formara conexiones funcionales con sus vecinos. La filosofía que subyace el uso de las hMSCs como una plataforma de entrega se ejemplifica en la Figura 2. En pocas palabras, en el nodulo sinusal normal, la hiperpolarización de la membrana inicia una corriente interna (If) la cual genera una despolarización fase 4 y un ritmo automático. Los cambios en el potencial de la membrana dan como resultado un flujo de corriente por medio de los nexos de unión de baja resistencia, tal que el impulso eléctrico se propaga de una célula a la siguiente. El uso de las hMSCs como una plataforma incluye cargarla con el gen de interés, por ejemplo, HCN2, de preferencia por medio de electroporación, así evitando cualquier componente viral del proceso (Rosen et al., 2004; Rosen, 2005; Cohén et al., 2005; Potapova et al., 2004). Se tendría que acoplar de manera efectiva la hMSC al miocito adyacente. Si esto ocurriera, el alto potencial de membrana negativo de los miocitos acoplados hiperpolarizaría la hMSC, abriendo el canal HCN y permitiendo el flujo de la corriente interna. Esta corriente, a su vez, se propagaría a través de los nexos de unión 5 de baja resistencia, despolarizaría un miocito acoplado y lo llevaría a un nivel potencial, resultando en un impulso eléctrico que luego se propagaría aún más en el sistema conductivo. En otras palabras, tanto la hMSC como el miocito tendrían que llevar cada uno una pieza esencial de maquinaria: el miocito traería los componentes iónicos que generan un impulso eléctrico, la hMSC llevaría la corriente de marcapasos, y - si los nexos de unión \ o estuvieran presentes - las dos entidades estructurales separadas funcionarían como una sola unidad fisiológica uniforme. Entonces la pregunta clave es si los nexos de unión se forman entre las hMSCs y los miocitos. La respuesta es afirmativa, como lo muestran los datos experimentales revelados previamente. La Figura 33 muestra que las conexinas 43 y 40 se demuestran claramente en las hMSCs. Además, las hMSCs forman canales de nexo de 15 unión funcionales con líneas de células que manifiestan Cx43, Cx40 o Cx45 así como con cardiomiocitos ventriculares caninos (ver también Valiunas et al., 2004, del cual todo el contenido se encuentra incorporado aquí como referencia). El conducto de Lucifer Amarillo entre una hMSC y otra hMSC o una célula HeLaCx43 (ver Figura 35E) es también otro indicador de acoplamiento de nexo de unión sólido. La transferencia de Lucifer Amarillo 0 entre las hMSCs y las células HeLa transfectadas con Cx43 es similar a aquella de Cx43 homotípica o Cx43 y Cx40 co-manifestadas. Excluye Cx40 homotípico como un tipo de canal dominante ya que Cx40 es unas 5 veces menos permeable al Lucifer Amarillo que Cx43 (Valiunas et al., 2002). Además, la inyección de corriente hacia una hMSC cerca de un miocito da como resultado un flujo de corriente hacia el miocito (Figura 36), otro 5 indicativo para el establecimiento de nexos de unión funcionales.

Estos datos indican que las MSCs se deben integrar en sincitios eléctricos de muchos tejidos, promoviendo la reparación o sirviendo como el substrato para un sistema de entrega terapéutico. En concreto, los datos apoyan la posibilidad de usar las hMSCs como un 30 substrato terapéutico para la reparación de tejido cardiaco. Otros sincitios tales como un músculo liso vascular o células endoteliales también deberían poder acoplarse a las hMSCs debido a la ubicuidad de Cx43 y Cx40 (Wang et al., 2001a). De esta manera, también pueden ser asequible a terapéutica basada en hMSCs. Por ejemplo, las hMSCs se pueden transfectar para manifestar canales iónicos los cuales luego pueden influenciar el tejido sincitial circundante. Por otro lado, las hMSCs se pueden transfectar para manifestar genes que producen pequeñas moléculas terapéuticas capaces de impregnar los nexos de unión e influenciar células receptoras. Además, para terapia a corto plazo, las moléculas pequeñas se pueden cargar directamente en las hMSCs para entregar a las células receptoras. El éxito de tales métodos es dependiente de los canales de nexo de unión como el conducto final para la entrega del agente terapéutico a las células receptoras. La posibilidad del primer método se demostró aquí al entregar hMSCs transfectadas con HCN2 al corazón canino donde generan un ritmo espontáneo.

Otra cuestión tiene que ver con la receptividad autónoma de las hMSCs. Como Potapova et al. (2004) lo mostró, la adición de isoproterenol a las hMSCs cargadas con HCN2 dio como resultado un cambio en activación tal, que la corriente aumentada fluyó en potenciales más positivos. El resultado, como se esperaría para HCN2 nativo, sería una frecuencia de marcapasos aumentada. Potapova et al. (2004) también investigó la respuesta de If que las hMSCs manifiestan a la acetilcolina. La acetilcolina por sí sola no tuvo ningún efecto en la corriente, pero en presencia de isoproterenol antagonizó el efecto adrenérgico beta del más reciente. Esto es completamente consistente con el fenómeno fisiológico de antagonismo acentuado.

Las MSCs humanas cargadas con HCN2 también se inyectaron en sitios específicos en los corazones de perros en donde la estimulación vagal se usó para terminar la función del marcapasos sinusal y/o la conducción auriculoventricular (Potapova et al., 2004). Esto dio como resultado una función de marcapasos espontánea la cual se trazó el ritmo hacia el sitio de la inyección. Además, los tejidos que se retiraron del sitio mostraron una formación de nexos de unión entre elementos del miocito y de la hMSC. Finalmente, las células madre se marcaron de forma positiva para vimentina, indicando que eran mesenquimales, y de manera positiva para antígeno CD44 humano, indicando que eran hMSCs de origen humano (Potapova et al., 2004). En un estudio preliminar, Plotnikov et al. (2005b) siguió la función del ritmo de marcapasos biológico basado en hMSC por seis semanas después de la implantación y encontró que la frecuencia generada es estable. Igualmente de manera significativa, se usó la coloración de globulina inmune y de linfocitos caninos para determinar se existía rechazo de las hMSCs. No se encontró evidencia de rechazo humoral o celular en puntos de tiempo de 2 semanas y de 6 semanas. Esto es consistente con el trabajo previo de Liechty et al. (2000) que indica que las hMSCs pueden ser inmunoprivilegiadas. En caso de que una investigación más detallada muestre que este sea el caso, entonces esa investigación anularía cualquier necesidad de inmunodeficiencia.

Por lo tanto, en términos generales, las hMSCs parecen proporcionar una plataforma muy conveniente para la entrega de canales iónicos de marcapasos al corazón por varias razones: se pueden obtener en relativamente grandes cantidades a través de intervenciones clínicas estándar; se pueden expandir fácilmente en cultivo; evidencia preliminar indica que son capaces de una manifestación transgen de largo plazo; y su administración puede ser autóloga o por medio de almacenes de depósito (ya que son inmunoprivilegiadas). Dado que las hMSCs se pueden en teoría distinguir in vitro en células de tipo cardiaco capaces de tener una actividad espontánea, el método de ingeniería genética que se describe aquí no depende de la diferenciación a lo largo de una descendencia específica. Además, este método de transfección ex vivo permite la evaluación de la integración de ADN y la ingeniería de los portadores de células con mecanismos de fallecimiento a prueba de fallas.

Por consiguiente, las hMSCs adultas son una plataforma de entrega de canal iónico preferida para usarse en métodos para tratar sujetos afectados con trastornos de ritmo cardiacos que constan de la inducción de actividad de marcapasos biológico en el corazón del sujeto, y en hacer paquetes para su uso en tales métodos. Es importante enfatizar las diferencias conceptuales y prácticas entre el diseño de (1) terapia de genes, y (2) terapia de célula madre como se describe aquí. Dado que ambas tienen un punto final en común - la entrega de un marcapasos biológico - la terapia de gen usa isoformas HCN específicas para cambiar un miocito cardiaco en una célula de marcapasos, mientras que la terapia hMSC usa células madre como plataforma para llevar isoformas HCN y/o MiRPl específicas a un corazón cuyos miocitos mantienen su función original. La terapia de gen hace uso del acoplamiento célula a célula homeotípico preexistente entre miocitos para facilitar la propagación de los impulsos de marcapasos de aquellos miocitos en donde la corriente de marcapasos se sobremanifiesta para aquellos que mantienen su función original. En cambio, las células madre dependen del acoplamiento heterotípico de células con poblaciones un poco distintas de conexinas para enviar la corriente de marcapasos sola de una célula madre a un miocito cuya función permanece sin cambiar. Es importante destacar que, y a diferencia de las células del nodulo sinusal, las hMSCs transfectadas con HCN2 no son excitables, debido a que les faltan las otras corrientes necesarias para generar un impulso eléctrico. Sin embargo, cuando están transfectadas, estas células generan una corriente despolarizante, la cual se esparce a los miocitos acoplados, llevando a los miocitos al borde. De hecho, el miocito actúa como un cable de detonación cuya hiperpolarización inicia la corriente del marcapasos en la célula madre y cuya despolarización detiene la corriente. Los datos que se presentan aquí indican que mientras las hMSCs contengan el gen de marcapasos y se acoplen a los miocitos cardiacos por medio de nexos de unión, funcionarán como un marcapasos cardiaco en una forma análoga al nodulo sinusal del marcapasos primario normal.

Masa de marcapasos biológico requerido para una función normal de marcapasos. Un marcapasos biológico necesita un tamaño óptimo (en términos de masa celular) y un acoplamiento célula a célula óptimo para una función normal a largo plazo. Fue fortuito en los estudios previos que los constructos de HCN usaron, y el número de las hMSCs transfectadas administradas al corazón canino in situ, acopladas a miocitos circundantes y funcionaron bien para generar una actividad de marcapasos significante y de fácil medición. Subsecuentemente se usó un modelo matemático para identificar los números de hMSC adecuados y los índices de acoplamiento necesarios para optimizar la función. El modelo matemático se utilizó para reconstruir una inyección de célula madre in vivo usando nanopartículas de punto cuántico (QD). Se inyectaron aproximadamente 120,000 hMSCs con QD en la pared disponible LV de rata (a z = 4.9 mm), y el animal murió una hora después de la inyección. Se cortaron y observaron secciones transversales 10-µ?? para la fluorescencia de QD a 655 nm con un revestimiento de contraste de fase para mostrar los bordes del tejido. Se encontraron QD dentro de las hMSCs enviadas y se visualizaron células QD+ simples en el miocardio en resoluciones más altas. Las regiones QD+ de las regiones transversales 10-µ?? serial 230 se identificaron y usaron para reconstruir la distribución 3D de grupos de QD en el corazón. Luego se modeló matemáticamente un marcapasos biológico tomando en cuenta las propiedades de If en una célula madre, los efectos de la geometría de la célula en la propagación de un impulso eléctrico, el número de células madre, las reducciones inducidas por el voltaje restante de Jf, y los requisitos para la propagación de un impulso eléctrico. Se asumió que el radio de una hMSC era de 7 µp?, lo que quiere decir que el radio de un grupo de 105 células madre es de 0.03 cm, y de 0.07 cm de 106 células madre.

El modelo indicó que: 105 ó más células madre generarían un impulso eléctrico muscular; la resistencia de entrada característica de un músculo se satura a aproximadamente 0.03 cm; debido a las reducciones dependientes de voltaje en If, la corriente que sale del grupo de células madre se satura a aproximadamente 0.03 cm, por lo que el potencial del marcapasos en el músculo se satura a aproximadamente 0.03 cm. Se concluyó que la propagación que se mantiene por sí misma de un impulso eléctrico en un músculo se garantiza esencialmente si un armazón de células de un radio de aproximadamente 0.03 cm o más grande alcanza el borde. Esto implica que si se inyectan 1 ,000,000 de células madre, solamente 10% necesitan sobrevivir para crear un marcapasos biológico. Estas conclusiones son consistentes con los resultados experimentales en la inducción de actividad de marcapasos en el tejido del corazón in situ revelados aquí.

EJEMPLO 6 Uso de Canales Quiméricos HCN para Ritmo de Marcapasos Biológico Constructos de canal quimérico HCN Debido a que la corriente de marcapasos If fluye solamente a potenciales diastólicos y no debe afectar la duración del potencial de acción, muchos estudios recientes sobre marcapasos biológicos consideran If como el objetivo molecular. Sin embargo, no se ha sugerido o demostrado previamente que la estructura molecular del canal HCN se pueda manipular para producir quimeras con propiedades preferidas para el ritmo de marcapasos biológico y para tratar trastornos de ritmo cardiaco. Como se describe más adelante, porciones de diferentes isoformas HCN que muestran características deseables se pueden recombinar en un canal quimérico teniendo una funcionalidad superior comparada con los canales HCN Wt, de donde se deriva la quimera. Para la construcción de quimeras HCN, primero se subclonan los genes HCN en vectores de expresión. Por ejemplo, los genes mamíferos que codifican HCN1-4 (Santoro et al., 1998; Ludwig et al., 1998; 1999; Ishii et al., 1999) se subclonan en vectores como pGH19 (Santoro et al., 2000) y pGHE (Chen et al., 2001b). Entonces la deleción y los mutantes quiméricos se hacen por medio de una estrategia de PCR/subclonación, y las secuencias resultantes de los constructos HCN mutantes se verifican mediante una secuencia de ADN.

Los canales HCN se pueden caracterizar en tres porciones principales, una porción de terminal N citoplásmica hidrófila (región 1), una porción que abarca la membrana (intramembranal) del núcleo S1-S6 de 6 miembros (porción 2) que contiene principalmente aminoácidos hidrófobos, y una porción de terminal C citoplásmica hidrófila (región 3). Alguien con las habilidades ordinarias en el medio puede determinar fácilmente los límites de estas porciones basándose en la estructura primaria de la proteína y en la hidrofilicidad o en la hidrofobicidad de los aminoácidos integrantes. Por ejemplo, en mHCNI, la porción de terminal C es D390-L910. La porción de terminal C para mHCN2 es D443-L863. Las secuencias de polinucleótidos que codifican todo el dominio de la terminal N, el dominio transmembranal del núcleo, o el dominio de la terminal C de cualquiera de HCNI, HCN2, HCN3 y HCN4, se pueden intercambiar. Las diferentes quimeras construidas se identifican al usar la nomenclatura HCNXYZ, donde X, Y, o Z es un número (ya sea 1 , 2, 3 ó 4) que se refiere a la identidad del dominio de la terminal N, dominio transmembranal del núcleo, o dominio de la terminal C, respectivamente. De esta manera, por ejemplo, en la quimera mHCNI 12 (ver Figura 1), la terminal N y las porciones intramembranales son de mHCNI, mientras que los aminoácidos D390-L910 de la terminal C de mHCNI son sustituidos por los aminoácidos D443-L863 de la terminal Carboxílica de mHCN2. Por el contrario, en mHCN221, los aminoácidos D443-L863 de la terminal Carboxílica de mHCN2 son sustituidos por los aminoácidos D390-L910 de la terminal Carboxílica de mHCNI. En mHCN21 1, los aminoácidos M1-S128 de la terminal amino de mHCNI son sustituidos por los aminoácidos M1-S181 de la terminal amino de mHCN2. Por el contrario, en mHCNI 22 los aminoácidos MI -SI 81 de mHCN2 son sustituidos por MI -SI 28 de mHCNI. En mHCN121, los aminoácidos D129-L389 del dominio transmembranal S1-S6 de mHCNI son sustituidos por los aminoácidos DI 82-L442 del dominio transmembranal de mHCN2. Por el contrario, en mHCN212 (Figura 1), los aminoácidos D182-L442 de mHCN2 (es decir, la porción intramembranal) son sustituidos por D129-L389 de mHCNI (ver Wang et al., 2001b). Para la preparación de canales HCN quiméricos humanos, se aplican los mismos principios con los cambios debidos, empleando dominios de canales HCN humanos. Por ejemplo, hHCNI 12 tienen un dominio de terminal amino y un dominio intramembranal de hHCNI, y un dominio de terminal carboxílica.

La manifestación de estas quimeras HCN se observa fácilmente en los oocitos de Xenopus. Por ejemplo, el cRNA se puede transcribir del ADN linearizado de Mel (para HCNI y mutantes basados en el antecedente de HCNI) o del ADN linearizado de >5>p/zl (para HCN2 y mutantes basados en el antecedente de HCN2) usando una polimerasa T7 RNA (Message Machine; Ambion, Austin, TX). Se inyecta 50 ng de cRNA en los oocitos de Xenopus como se describe previamente (Goulding et al., 1992). Canales HCN quiméricos aumentan el ritmo de marcapasos biológico Se llevaron a cabo experimentos para comparar las cinéticas de activación periódica de los canales HCN212 quiméricos y de HCN2 cuando se manifiestan en miocitos ventriculares de rata neonatal. La Figura 37 muestra los resultados que se obtuvieron al usar mHCN2 y un canal quimérico (mHCN212) creado al sustituir D182-L442 de HCN2 murino con D129-L389 de HCNI murino. El análisis de las cinéticas de activación y desactivación revela que mHCN212 muestra cinéticas más rápidas en todos los voltajes comparado con mHCN2.

En la Figura 38 se muestra una comparación de la eficiencia de manifestación de canales HCN212 quiméricos y HCN2 en miocitos ventriculares de rata neonatal. Los resultados indican que la manifestación del canal quimérico es por lo menos tan buena como la del canal de tipo salvaje. Además, el análisis de la dependencia de voltaje de la activación indica que no hay diferencia en la dependencia de voltaje de los canales HCN2 y HCN212 cuando se manifiestan en miocitos.

El HCN212 murino se manifestó en miocitos ventriculares de rata neonatal y posteriormente se estudiaron en cultivo las células madre mesenquimales de adulto humano y la corriente manifestada. No hay una diferencia significante en la dependencia de voltaje de la activación o de las cinéticas de activación cuando el canal mHCN212 quimérico se manifiesta en los dos diferentes tipos de células (ver Figura 39).

La Figura 40 muestra la condición estable de la curva de activación, las cinéticas de activación y la modulación cAMP de mHCNI 12 y mHCN2 de tipo salvaje en los oocitos. Los datos demuestran que el canal HCNI 12 quimérico logra cinéticas significativamente más rápidas que HCN2 al mismo tiempo que preserva una respuesta cAMP sólida.

Una comparación de las características de activación periódica de los canales mHCN212 quiméricos y mHCN2 que se manifestaron en hMSCs adultas (Figura 41) muestra que la dependencia de voltaje de la activación cambia significativamente a positiva, y las cinéticas de activación a cualquier voltaje medido son significativamente más rápidas, para mHCN212 comparado con HCN2. Estos datos indican que la quimera HCN212 tiene ventajas significantes sobre el canal HCN2 de tipo salvaje al inducir la actividad de marcapasos para aplicaciones terapéuticas. Es importante destacar que se esperaría que el cambio positivo y las cinéticas más rápidas resultaran en mayor corriente en menor tiempo para cualquier voltaje específico, y en particular, para voltajes en el rango potencial diastólico de células cardiacas (-50 a -90 mV).

De esta manera, se pueden emplear manipulaciones para crear canales HCN quiméricos que suprimen o mejoran actividades en comparación a los canales HCN nativos de donde se derivan, lo cual permite la selección de canales con diferentes características optimizadas para tratar afecciones cardiacas. Por ejemplo, las curvas de activación de la corriente del canal HCN se puede cambiar a potenciales más positivos o más negativos; la activación periódica por hiperpolarización se puede mejorar o suprimir; la perceptibilidad de los canales a nucleótidos cíclicos se puede aumentar o disminuir; y se pueden introducir las diferencias en la activación periódica basal. Más particularmente, los datos proporcionan evidencia que se puede obtener un canal de marcapasos con cinéticas rápidas y buena receptividad a cAMP (y por lo tanto, receptividad alterada a una estimulación autónoma) por medio de, por ejemplo, la selección de componentes de HCNI. También se pueden obtener cinética más lentas mediante, por ejemplo, la selección de componentes de HCN4 en la quimera. Aún no se reporta la creación de quimeras HCN mostrando características que son beneficiosas para tratar trastornos cardiacos.

EJEMPLO 7 Fijación de Ritmo mediante Marcapasos Biológicos y Electrónicos en Tándem In Situ Implantación de marcapasos biológicos y electrónicos en tándem en perros , Se llevaron a cabo experimentos en animales utilizando protocolos aprobados por el Comité Institucional del Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Columbia (Columbia University Institutional Animal Care and Use Committee) y acatando la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Publicación NIH No. 85-23, revisada 1996). Se anestesiaron perros mestizos con un peso de 22-25 kg con propofol 6 mg/hg IV e isoflurano inhalatorio (1.5% - 2.5%). Se inyectó solución salina (n = 5), AdmHCN2 (n = 6) o AdmE324A (n = 4) usando un catéter dirigible en la rama izquierda (LBB) como se describió previamente (Plotnikov et al., 2004). En 2 perros adicionales se inyectó AdmE324A en el miocardio septal LV como un control interno. Se indujo un bloqueo AV completo por medio de una ablación de radiofrecuencia y cada sitio de inyección se dosificó por medio de un catéter electrodo para distinguir electrocardiográficamente el origen del ritmo idioventricular durante el periodo de seguimiento.

Se implantó un marcapasos electrónico (Discovery II, Flextend lead; Guidant, Indianápolis, G?) y se ajustó a 45 bpm VVI. Se realizó un ECG, monitoreo Holter de 24 horas, revisión del registro de marcapasos, y sobremarcha de ritmo a 80 bpm diariamente por 14 días. Para evaluar la receptividad adrenérgica beta se inyectó epinefrina (1.0, 1.5 y 2.0 µg/kg/min por hasta 10 minutos cada uno) en el día 14 a un punto final de un incremento del 50% en frecuencia idioventricular o arritmia ventricular (latidos prematuros ventriculares individuales con una morfología aparte de la del ritmo idioventricular dominante o taquicardia ventricular), lo que ocurriera primero. Si no se observaba ninguna de las respuestas anteriores dentro de 10 minutos después del síntoma inicial de la dosis máxima de 2 se concluía la infusión.

Los datos se presentan como medios ± SEM. En los experimentos in situ, los 5 perros inyectados con solución salina y los 2 inyectados en el miocardio (en vez de la LBB) con AdmE324A no mostraron diferencias electrofisiológicas y se combinaron en un grupo de control para un análisis posterior. Se usó ANOVA unidireccional para evaluar el efecto de un constructo implantado sobre parámetros electrofisiológicos. Se realizó un análisis posterior usando la prueba de Bonferroni donde se asumieron variaciones iguales y la prueba de Games-Howell donde las variaciones eran desiguales. Se llevó a cabo un análisis de tabla de contingencia bidireccional para evaluar si la epinefrina tenía diferentes efectos entre los tres grupos. Los datos se analizaron usando SPSS para el software de Windows (SPSS, Inc.). Se consideró que P < 0.05 era significativo.

Operación de marcapasos tándem electrónicos y biológicos in situ. En un experimento preliminar, se probó in vivo la posibilidad que al inyectar un adeno virus con E3242A mutante, éste pudiera proporcionar una alternativa efectiva al HCN2. Se encontró que los perros infectados con E324A manifestaron frecuencias básales las cuales no varían significativamente de aquellas de animales infectados con HCN2, aunque su receptividad a la catecolamina fue mayor (Plotnikov et al., 2005a).

En los experimentos actuales, se usaron los vectores adenovirales con genes HCN2 y E324A, respectivamente, para generar actividad de marcapasos in vivo en conjunto con marcapasos electrónicos implantados, y el desempeño de los marcapasos en tándem se comparó con el de solo un marcapasos electrónico. Seis perros recibieron inyecciones de un vector adenoviral incorporando el gen HCN2 en 0.6 mi de solución salina en la rama izquierda (LBB) por medio de un catéter dirigible. El virus HCN2 se caracterizó en miocitos de rata neonatal de la siguiente manera: punto medio de activación = -69.3 mV (n = 5); a -65 mV de activación T = 639 ± 72 ms (n = 5); corriente manifestada a -135 mV = 53.5 ± 8.3 pA/pF (n = 10). Se les inyectó a cuatro perros con un vector adenoviral incorporando el gen E324A muíante en la LBB, y a otros dos perros se les inyectó en el 5 miocardio septal LV como un control interno. Como otro control, cinco perros recibieron 0.6 mi de solución salina inyectada en la LBB.

Se indujo un bloqueo AV completo por medio de una ablación de radiofrecuencia, y se implantaron marcapasos electrónicos en el endocardio apical ventricular derecho y se ajustó l o a 45 bpm VVI. Se realizó un ECG, monitoreo Holter de 24 horas diariamente por 14 días. La receptividad adrenérgica beta también se evaluó como se describe previamente. El marcapasos electrónico provocó 83 ± 5% de todos los latidos en los controles, en contraste (P < 0.05) a 26 ± 6% en el grupo de mHCN2 y 36 ± 7% en el grupo de E324A (para los dos últimos, P > 0.05). En la Figura 42A se muestra un análisis temporal de los 15 latidos puestos a ritmo electrónicamente para el tándem HCN2-electrónico versus el marcapasos electrónico. Es notable que un número de latidos significativamente más bajo se iniciara electrónicamente en el grupo de HCN2 a través del periodo de estudio. Los resultados de E324A (no se muestran) no difieren significativamente de los de HCN2. 0 El tiempo de escape se evaluó diariamente al realizar tres periodos de 30-s de sobremarcha de ritmo ventricular a 80 bpm seguido por un cese abrupto del ritmo. Después se determinó el tiempo promedio entre el último latido puesto a ritmo electrónicamente y el primer latido intrínseco. Los tiempos de escape oscilaron entre 1-5 s en los tres grupos e incorporaron una amplia variabilidad, tal que no se vieron diferencias significativas. Por lo tanto, ningún 5 grupo obtuvo ninguna ventaja en relación a los intervalos de escape. Sin embargo, hubo un resultado diferente en cuanto a las frecuencias cardiacas básales a través del periodo de 14 días. Como se muestra en la Figura 42B, la frecuencia del marcapasos electrónico (45 bpm) fue lo que determinó la frecuencia cardiaca promedio en los controles de solución salina. Esto fue significativamente más lento a través del estudio que el de los perros inyectados 0 con mHCN2 o mE324A, cuyos grupos no variaron el uno del otro.

En la Figura 43 se muestra un ejemplo de la interrelación entre los componentes biológicos y electrónicos del marcapasos en tándem. Es evidente que mientras el componente biológico desacelera, el electrónico toma el control, y que mientras el componente biológico acelera la frecuencia, el electrónico se suspende.

La Figura 44 demuestra la respuesta a la epinefrina en experimentos terminales. El panel A muestra ECGs representativos para los tres grupos antes de y durante la infusión de epinefrina, 1 µg/kg/min. Las frecuencias de control fueron 42, 44 y 52 bpm para los grupos de solución salina, mHCN2 y mE324A, respectivamente. Con la epinefrina, las frecuencias aumentaron a 44, 60 y 81 bpm. El panel B ejemplifica los cambios de frecuencia que ocurrieron en todas las dosis de epinefrina. Como se puede ver, todos los perros en el grupo de solución salina mostraron menos de un 50% de aumento en la frecuencia y/o despolarizaciones prematuras ventriculares a través de la variedad de concentraciones de epinefrina que se administraron. La mitad del grupo de mHCN2 generó un incremento del 50% o más en la frecuencia cardiaca, del cual 33% requirió la dosis más alta de epinefrina para alcanzar este aumento. El resto tuvo un incremento menor al 50% en la frecuencia cardiaca o el acontecimiento de despolarizaciones prematuras ventriculares. Finalmente, el grupo mE324A manifestó mucho más que el 50% de aumento en la frecuencia cardiaca con la dosis de epinefrina más baja administrada. Por lo tanto, hubo una perceptibilidad a la epinefrina mucho mayor en el grupo mE324A que en cualquiera de los otros grupos.

Tratamiento tándem como una alternativa para el ritmo de marcapasos electrónico o biológico. Los datos experimentales que se presentaron previamente mostraron, ínter alia, que los marcapasos biológicos basados en la manifestación de los genes mHCN2 y mE324A operan uniformemente en conjunto con los marcapasos electrónicos para prevenir que la frecuencia cardiaca caiga por debajo de una frecuencia cardiaca mínima seleccionada (Figura 42); hay conservación del número total de latidos electrónicos enviados (Figura 43); hay provisión de una frecuencia cardiaca más elevada, más fisiológica y receptiva a la catecolamina en el caso con sólo el marcapasos electrónico (Figura 44). Aunque se usó un vector adeno viral para introducir los genes de marcapasos en los corazones caninos, los datos que se presentaron aquí también indican que las hMSCs pueden proporcionar una plataforma efectiva para el envío de corrientes de canal iónico hacia el corazón. Los factores que favorecen el uso de hMSCs incluyen su capacidad demostrada de formar nexos de unión con una variedad de tipos de células, incluyendo cardiomiocitos (Figuras 33-36); su capacidad de generar actividad de marcapasos en el tejido del corazón que parece ser estable, por lo menos en un periodo de 6 semanas (Plotnikov et al., 2005b); y evidencia de que no hay rechazo humoral o celular después de 6 semanas (Plotnikov et al., 2005b), el cual si se confirmara a largo plazo, anularía cualquier necesidad de inmunodeficiencia en la terapia mediante hMSC. Los datos también indicaron que los dominios del canal HCN se pueden recombinar para producir canales HCN quiméricos que muestren características de activación periódica deseables para su uso al tratar afecciones cardiacas.

Los datos que se proporcionan aquí confirman la posibilidad de diseñar un marcapasos biológico para atender las necesidades depositadas en marcapasos electrónicos modernos, específicamente para proveer una frecuencia cardiaca basal fisiológica y un medio para elevar la frecuencia cardiaca en los momentos en que aumente la demanda. Los canales HCN quiméricos, mHCN2 y mE324A proporcionan marcapasos biológicos con diferentes características; demostraron el principio de que los marcapasos biológicos, como sus contrapartes electrónicos, se pueden adecuar para la frecuencia cardiaca basal y para la receptividad de catecolamina.

Previamente se consideraron las cualidades y debilidades de los marcapasos electrónicos (Rosen et al., 2004; Rosen, 2005; Cohén et al., 2005): claramente son dispositivos de vanguardia que salvan vidas para tratar un número de arritmias cardiacas y se están usando cada vez más para insuficiencias cardiacas. Estas ventajas superan por mucho sus desventajas (ver Antecedentes). Debido a que los marcapasos electrónicos representan una forma muy exitosa de paliación médica, no serán reemplazados fácilmente, pero el hecho de que no son completamente fisiológicos, los convierte en un objetivo para su mejora y al final para su reemplazo. Sin embargo, el tratamiento que los reemplace debe ser más duradero, tener menor potencial de causar daños, y ser más fisiológico. Esto es por lo que se están desarrollando los marcapasos biológicos. Se ha sugerido que los marcapasos biológicos deben tener el potencial de (1) crear un ritmo fisiológico estable y de larga duración sin la necesidad de reemplazo; (2) competir eficazmente con los marcapasos electrónicos para satisfacer la demanda para un ritmo base seguro, acoplado con receptividad autónoma para facilitar la misma a las exigencias del ejercicio y emoción; (3) ser implantados en sitios ajustados de un paciente a otro tal provoque la propagación a través de una vía de activación óptima y mejore la eficiencia de la contracción; (4) consultar que no hay riesgo de inflamación, neoplasia o rechazo; (5) no tener potencial arritmogénico. En otras palabras, no deben representar paliación, sino cura (Rosen et al., 2004; Rosen, 2005).

Existen dos razones para considerar el uso del tratamiento en tándem a diferencia del tratamiento basado en sólo los marcapasos biológicos o electrónicos: uno asociado con pruebas clínicas y el otro asociado con un uso clínico más amplio. Después de que se completa la prueba preclínica adecuada de seguridad y eficiencia, un estudio de puesta en ritmo en tándem en pacientes con bloqueo cardiaco completo y fibrilación auricular sería un punto de partida razonable para una prueba combinada fase 1/fase 2. Tal población tiene la necesidad de tratamiento de marcapasos y no es candidata para ritmo electrónico secuencial AV. El tratamiento de vanguardia se indicaría para tales pacientes - una forma de exigencia de ritmo ventricular electrónico - y también se podría hacer un implante biológico. Además, ajustar el componente electrónico a una frecuencia suficientemente baja aseguraría una "red de seguridad" en caso de que el marcapasos biológico fallara. Sin embargo, aunque las pruebas de la fase 1 y fase 2 proporcionen evidencia de seguridad y eficiencia del marcapasos biológico existe la necesidad de entender cuanto durará un marcapasos biológico. Y esto debería ser una cuestión que dure toda la vida en la primera generación de pacientes que los reciban, durante la cual debe haber un respaldo electrónico continuo.

Con respecto a una aplicación clínica más amplia del concepto de marcapasos en tándem existen varios puntos a considerar. Primero, el sistema es redundante por diseño y tendría dos modalidades de falla completamente no relacionadas. Dos sitios de implante independientes y fuentes de energía independientes suministrarían un mecanismo de seguridad en el caso de una pérdida de captura (por ejemplo, debido a un infarto al miocardio). Segundo, el marcapasos electrónico proveería no sólo una red de seguridad base, sino un registro continuo de todos los latidos del corazón para su revisión por parte de los médicos, de esta manera proporcionando una perspectiva de la fisiología en evolución del paciente y el desempeño de sus sistemas tándem de marcapasos. Tercero, debido a que el marcapasos biológico se diseñará para llevar a cabo la mayoría del ritmo cardiaco, se podría mejorar dramáticamente la longevidad del marcapasos electrónico. Por otro lado, se podría mantener la longevidad mientras se pudiera reducir aún más el tamaño del marcapasos electrónico. Finalmente, el componente biológico de un sistema tándem proporcionaría receptividad autónoma verdadera, un objetivo que ha eludido más de 40 años de investigación y desarrollo del marcapasos electrónico.

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Claims

REIVINDICACIONES Lo que se reivindica es:

1. Un polipéptido quimérico (HCN) regulado por nucleótidos cíclicos activados por hiperpolarización que consta de porciones derivadas de más de una isoforma de canal HCN.

2. El polipéptido HCN de la reivindicación 1, en el que las porciones son una porción de terminal amino, una porción intra membranosa, y una porción de terminal carboxílica.

3. El polipéptido quimérico HCN de la reivindicación 2, en el que las porciones se derivan de isoformas HCN humanas.

4. El polipéptido quimérico HCN de la reivindicación 2, en el que por lo menos una porción de la quimera HCN se deriva de una especie animal la cual es diferente de la especie animal de la que por lo menos se deriva una de las otras dos porciones.

5. El polipéptido quimérico HCN de la reivindicación 2, en el que la porción intra membranosa se deriva de un canal HCNI.

6. El polipéptido quimérico HCN de la reivindicación 5, en el que la porción intra membranosa es D140-L400 de HCNI con la secuencia establecida en ID SEC No.

7. El polipéptido quimérico HCN de la reivindicación 5, en el que la porción intra membranosa es D129-L389 de mHCNI con la secuencia establecida en ID SEC No.

8. El polipéptido quimérico HCN de la reivindicación 2, en el que la porción de la terminal amino se deriva de HCN2, HCN3 o HCN4 y la porción de la terminal carboxílica se deriva de HCN2, HCN3 o HCN4.

9. El polipéptido quimérico HCN de la reivindicación 2, en el que la porción de la terminal amino se deriva de HCN2 y la porción de la terminal carboxílica se deriva de HCN2.

10. El polipéptido quimérico HCN de la reivindicación 1, en el que el polipéptido proporciona una característica mejorada, en comparación al canal HCN de tipo salvaje, seleccionado del grupo que consiste de cinéticas más rápidas, una activación más positiva, expresión aumentada, estabilidad aumentada, receptividad cAMP mejorada, y respuesta neurohumoral mejorada.

11. El polipéptido quimérico HCN de la reivindicación 1, en el que el polipéptido consta de mHCN1 12, mHCN212, mHCN312, mHCN412, mHCN1 14, mHCN214, mHCN314, mHCN414, hHCN1 12, hHCN212, hHCN312, hHCN412, hHCN1 14, hHCN214, hHCN314, o hHCN414.

12. El polipéptido quimérico HCN de la reivindicación 1 1, en el que el polipéptido es hHCN212 con la secuencia establecida en ID SEC No.

13. El polipéptido quimérico HCN de la reivindicación 1 1, en el que el polipéptido es mHCN212 con la secuencia establecida en ID SEC No.

14. El polipéptido quimérico HCN de la reivindicación 1, en el que por lo menos una porción del polipéptido se deriva de un canal HCN que contiene una mutación la cual proporciona una característica mejorada, en comparación a una porción de un canal HCN de tipo salvaje, seleccionado del grupo que consiste de cinéticas más rápidas, una activación más positiva, expresión aumentada, estabilidad aumentada, receptividad cAMP mejorada, y respuesta neurohumoral mejorada.

15. El polipéptido quimérico HCN de la reivindicación 14, en el que el canal muíante HCN contiene una mutación en una región del canal seleccionado del grupo que consta del sensor de voltaje S-4, el enlazador S4-S5, S5, S6 y el enlazador S5-S6, el enlazador C y el CNBD.

16. El polipéptido quimérico HCN de la reivindicación 14, en el que la porción muíante se deriva de mHCN2 con la secuencia establecida en ID SEC No. y consta de E324A-mHCN2, Y331A-mHCN2, R339A-mHCN2, o Y331A, E324A-mHCN2.

17. El polipéptido quimérico HCN de la reivindicación 16, en el que la porción mutante consta de E324A-mHCN2.

18. Un ácido nucléico que codifica el polipéptido quimérico HCN de la reivindicación 12.

19. Una composición farmacéutica que consta del ácido nucléico de la reivindicación 18 y un portador farmacéuticamente aceptable.

20. Un vector que consta del ácido nucléico de la reivindicación 18.

21. El vector de la reivindicación 20, el cual es un vector viral, cósmido o plásmido.

22. Una composición farmacéutica que consta del vector de la reivindicación 18 y un portador farmacéuticamente aceptable.

23. Una célula que consta del ácido nucléico de la reivindicación 18, en la que la célula manifiesta el polipéptido quimérico HCN.

24. La célula de la reivindicación 23, la cual manifiesta el polipéptido quimérico HCN a un nivel efectivo para inducir una corriente de marcapasos en la célula.

25. La célula de la reivindicación 23, la cual es una célula madre, un cardiomiocito, un fibroblasto o una célula de músculo esquelético diseñada para manifestar por lo menos una conexina cardiaca, o una célula endotelial.

26. La célula de la reivindicación 25, en la que la célula madre es una célula madre mesenquimal adulta o una célula madre embrionaria.

27. La célula de la reivindicación 26, en la que la célula madre es una célula madre mesenquimal adulta humana.

28. La célula de la reivindicación 23, la cual adicionalmente manifiesta por lo menos una conexina cardiaca.

29. La célula de la reivindicación 28, en la que por lo menos una conexina cardiaca es Cx43, Cx40 o Cx45.

30. Una composición farmacéutica que consta de la célula de la reivindicación 27 y un portador farmacéuticamente aceptable.

31. Un método para tratar a un sujeto afectado con un trastorno de ritmo cardiaco que consta de la administración de la célula de la reivindicación 27 en una región del corazón del sujeto, en el que la manifestación del polipéptido quimérico HCN en dicha región del corazón es efectiva para inducir una corriente de marcapasos en el corazón y por consiguiente tratar al sujeto.

32. El método de la reivindicación 31, en el que se elimina una fuente pre-existente de actividad de marcapasos.

33. El método de la reivindicación 32, en el que la célula forma un sincitio funcional con el corazón.

34. El método de la reivindicación 32, en el que la célula se administra en una región del corazón por medio de una inyección, cateterización, inserción quirúrgica, o fijación quirúrgica.

35. El método de la reivindicación 4, en el que la célula se administra localmente por medio de una inyección o cateterización directamente sobre o dentro del tejido del corazón.

36. El método de la reivindicación 34, en el que la célula se administra por medio de una inyección o cateterización en por lo menos un vaso sanguíneo coronario u otro vaso sanguíneo cerca del corazón.

37. El método de la reivindicación 31, en el que la célula se administra en una región de una aurícula o ventrículo del corazón.

38. El método de la reivindicación 37, en el que el trastorno es una disfunción del nodulo sinusal, bradicardia sinusal, actividad marginal del marcapasos, síndrome del seno enfermo, taquiarritmia, taquicardia de reingreso del nodulo sinusal, taquicardia auricular a partir de un foco ectópico, flúter auricular, fibrilación auricular, bradiarritmia, o una insuficiencia cardiaca, y la célula se administra en el músculo auricular derecho o izquierdo, en el nodulo sinusal o en la región de cruce auriculoventricular del corazón del sujeto.

39. El método de la reivindicación 37, en el que el trastorno es un bloqueo de conducción, bloqueo auriculoventricular completo, bloqueo auriculoventricular incompleto, o bloqueo de rama, y la célula se administra en una región del corazón del sujeto para compensar la conducción deteriorada en el corazón.

40. El método de la reivindicación 39, en el que la célula se administra en un septo ventricular o una pared disponible, una unión ariculoventricular, o una rama del ventrículo.

41. Un método para inhibir los síntomas iniciales de un trastorno de ritmo cardiaco en un sujeto propenso a tal trastorno que consta de la administración de la célula de la reivindicación 27 en una región del corazón del sujeto, en el que la manifestación del polipéptido quimérico HCN en el corazón es efectiva para inducir una corriente de marcapasos en el corazón y por consiguiente inhibir el síntoma inicial del trastorno en el sujeto.

42. Un método para tratar a un sujeto afectado con un trastorno de ritmo cardiaco el cual consta de transfectar una célula del corazón del sujeto con el ácido nucléico de la reivindicación 18 para así manifestar funcionalmente el polipéptido quimérico HCN en el corazón, en el que la manifestación de dicho polipéptido es efectiva para inducir una corriente de marcapasos en el corazón y por consiguiente tratar al sujeto.

43. El método de la reivindicación 42, en el que se elimina una fuente pre-existente de actividad de marcapasos en el corazón.

44. El método de la reivindicación 42, en el que la célula del corazón se encuentra en una aurícula o ventrículo del corazón.

45. El método de la reivindicación 42, en el que el trastorno es una disfunción del nodulo sinusal, bradicardia sinusal, actividad marginal del marcapasos, síndrome del seno enfermo, taquiarritmia, taquicardia de reingreso del nodulo sinusal, taquicardia auricular a partir de un foco ectópico, flúter auricular, fibrilación auricular, bradiarritmia, o una insuficiencia cardiaca, y una célula se transfecta en el músculo auricular derecho o izquierdo, en el nodulo sinusal o en la región de cruce auriculoventricular del corazón del sujeto.

46. El método de la reivindicación 47, en el que el trastorno es un bloqueo de conducción, bloqueo auriculoventricular completo, bloqueo auriculoventricular incompleto, o bloqueo de rama, y la célula se transfecta en una región del corazón del sujeto para compensar la conducción deteriorada en el corazón.

47. El método de la reivindicación 46, en el que la célula se transfecta en un septo ventricular o una pared disponible, en una unión ariculoventricular, o en una rama del ventrículo. 5

48. Un método para inhibir los síntomas iniciales de un trastorno de ritmo cardiaco en un sujeto propenso a tal trastorno que consta de la transfección de una célula del corazón del sujeto con el ácido nucléico de la reivindicación 18 para así manifestar fiincionalmente el polipéptido quimérico HCN en el corazón, en el que la manifestación de dicho polipéptido es efectiva para inducir una corriente de marcapasos en el corazón y por ¡0 consiguiente inhibir el síntoma inicial del trastorno en el sujeto.

49. Un método para producir el polipéptido quimérico HCN de la reivindicación 2 que consiste de (a) la generación de un ácido nucleico recombinante al unir un ácido nucleico que codifica una porción de terminal amino de un polipéptido HCN con un ácido nucleico 15 que codifica una porción intra membranosa de un polipéptido HCN y unir dicho ácido nucleico que codifica la porción intra membranosa a un ácido nucleico que codifica una porción de terminal carboxílica de un polipéptido HCN, en el que las porciones codificadas del polipéptido HCN se derivan de más de una isoforma o muíante HCN de lo mismo, y (b) de manifestar fiincionalmente dicho ácido nucleico recombinante en una célula para así 0 producir el polipéptido quimérico HCN.