MX2008003034A - Metodo para combatir una infeccion - Google Patents

Abstract

Un método para combatir una infección protozoaria parasítica de un organismo hospedero, el método comprende administrar tetrazicar al organismo hospedero;tetrazicar es el compuesto 5-(aziridin-I-il)-2,4-dinitrobenzamida (CB 1954), y la infección parasítica preferiblemente es una infección de Trypanosoma cruzi T. b. brucei, Leishmania spp., en particular L. Infantum, Cryptosporidium o Giardia spp.

Description

METODO PARA COMBATIR UNA INFECCION MEMORIA DESCRIPTIVA Esta invención se relaciona con un método para combatir infección y en particular con el tratamiento de infecciones protozoarias parasíticas. El listado o discusión de un documento publicado previamente en esta especificación no deberá tomarse necesariamente como un reconocimiento de que el documento es parte del estado de la técnica o es conocimiento general común. La incidencia de enfermedades protozoarias parasíticas resistentes a fármacos ha crecido significativamente en años recientes lo que resulta en un número mayor en muertes en países en vías de desarrollo como en el mundo occidental. Las estrategias que se están desarrollando para afrontar este problema incluyen el desarrollo de nuevos fármacos, la adopción de regimenes de tratamiento estrictos y un programa de educación amplio para el público. Un medio posible para suministrar agentes farmacológicos altamente activos a su sitio de acción con efectos secundarios mínimos no deseados en otras células y tejidos es el uso de profármacos. Los profármacos se conocen desde hace muchos años y se utilizan en varias indicaciones médicas. Pueden definirse como entidades químicas que se modifican mediante sistemas metabólicos o no metabólicos, que resultan en la formación o liberación de una especie con actividad farmacológica deseada. En muchos casos, las formas de profármacos se utilizan para modificar la farmacocinética de los fármacos mediante la alteración de una propiedad fisicoquímica del fármaco (como su grado lipofílico). En estos casos, la modificación del profármaco por lo general no es especifica y ocurre por procesos no enzimáticos de degradación o por la acción metabólica de enzimas ubicuas. No obstante, las formas de profármaco también pueden utilizarse para dirigir el agente farmacológico activo a sitios específicos únicamente, por lo general al explotar la distribución diferencial de enzimas capaces de catalizar la reacción de modificación del profármaco. En el campo de la quimioterapia de cáncer la activación de profármacos mediante enzimas específicas a un objetivo ha sido por largo tiempo una meta y se han sintetizado y probado muchos profármacos potenciales con la esperanza de que un enzima específica para un tumor fuera capaz de convertirlas específicamente en un potente agente antitumor. Muchos investigadores aún trabajan en esta área utilizando profármacos diseñados para activarse mediante una variedad de enzimas que incluyen ß-glucuronidasa (Woessner et al (2000) Anticancer Research 20, 2289-2296), DT diaforasa (Loadman et al (2000) Biochemical Pharmacology 59, 831 -837) y timidilato sintasa (Collins et al (1999) Clinical Cáncer Research 5, 1976-1981 ).

Como una alternativa a esta estrategia monoterapéutica con profármaco, algunos investigadores han intentado suministrar la enzima deseada al tumor, previo a administrar un profármaco. Dicho enfoque, por lo general denominado terapia de profármaco de enzima dirigida a anticuerpos (ADEPT), se describió en WO88/07378. En este ejemplo la enzima se vincula a un anticuerpo monoclonal que es capaz de unirse a un antígeno asociado con un tumor. De esta forma la enzima se suministra al sitio del tumor en donde pueda actuar sobre un profármaco apropiado. Se describió una estrategia similar, por ejemplo en WO96/03151 , en la cual el gen que codifica una enzima se suministra al tumor y, una vez presente, expresa la enzima deseada. A esta estrategia se le denomina generalmente como terapia de profármaco de enzima dirigida a gen (GDEPT). Es un principio importante de muchas de estas estrategias dirigidas que la enzima suministrada al sitio de tumor no sea endógena para el hospedero (Aghi et al (2000) J Gene Med 2, 148-164). La presencia de enzimas endógenas llevaría a una activación no específica de los profármacos y a la toxicidad de tejidos normales. En consecuencia, la mayoría de estos estudios de terapia de enzima-profármaco se han llevado a cabo utilizando enzimas bacterianas como carboxipeptidasa G2, ß-lactamasa y nitroreductasa. Aunque mucho del trabajo a la fecha en el campo de la activación de profármacos específicas a un sitio se ha concentrado en terapia anticáncer, se han presentado esfuerzos recientes para adaptar esta tecnología para su uso en aplicaciones antibacterianas. Por ejemplo, WO 99/321 13 describe el uso de profármacos que consisten en una porción citotóxica y una porción de ß-lactama. En bacterias Gram negativas que contienen enzimas de ß-lactamasa dentro del espacio periplásmico, el profármaco es escindido para liberar la porción citotóxica que a su vez busca interrumpir funciones celulares vitales. Estos profármacos, empero, tienen un rango de aplicación limitado en el sentido que no todas las bacterias expresan ß-lactamasa y en que las bacterias Gram positivas tienden a excretar ß-lactamasa tales que muchos de los efectos benéficos de ubicación de toxinas del profármaco se perderán. En Smyth et al ((1998) J. Org Chem 63, 7600-7618), se presentan las S-aminosulfeniminopenicilinas. Estos compuestos son tanto inhibidores de ß-lactamasa como plantillas de profármacos potenciales para suministro de una variedad de agentes en bacterias ß-lactamasa positivas. Sin embargo, al igual que los derivados de ß-lactamasa discutidos arriba, estos compuestos probablemente tengan una utilidad limitada en bacterias Gram positivas y, debido a su lenta permeación a través de estructuras de porina de la membrana externa, pueden necesitar estar presentes en concentraciones extra celulares elevadas no deseadas para lograr efectos significativos en bacterias Gram negativas. Un ramal de las deficiencias potenciales de los profármacos dependientes de ß-lactamasa fue presentada por Wei y Pei ((2000) Bioorg. Med. Chem. Lett 10, 1073-1076). Estos científicos demostraron conceptualmente el uso de derivados 5'-dipeptidilo de agentes antibacterianos citotóxicos como profármacos que se activan mediante el péptido bacteriano deformilasa. Los resultados preliminares con el uso de estos profármacos sugirieron sin embargo una débil actividad antibacteriana y se asumió que esto pudiera deberse a una deficiente captación de los compuestos hacia las células. Las enfermedades parasíticas humanas son endémicas en muchas partes del mundo. Por ejemplo, la leishmaniasis (una enfermedad parasítica ocasionada por un protozoario intracelular obligado que se transmite por la picadura de algunas especies de jejenes) se encuentra en aproximadamente 90 países tropicales y subtropicales alrededor del mundo y en el sur de Europa. Más de 90% de los casos mundiales de leishmaniasis cutánea se encuentran en Afganistán, Argelia, Brasil, Irán, Irak, Perú, Arabia Saudita y Siria. Sin embargo, aproximadamente 75% de los casos que se evalúan en los Estados Unidos se presentaron en América Latina, en donde la leishmaniasis se presenta desde el norte de México (ocasionalmente en el sur rural de Texas) al norte de Argentina. Más de 90% de los casos mundiales de leishmaniasis viscerales se presentan en Brasil, Bangladesh, la India, Nepal y Sudán. De manera similar, la distribución geográfica de la enfermedad de Chagas (ocasionada por un parásito protozoario flagelado, Trypanosoma cruzi, que se transmite a los humanos mediante insectos triatominos) se extiende desde México al sur de Argentina. La enfermedad afecta a 16- 18 millones de personas y alrededor de 100 millones, es decir alrededor de 25% de la población de América Latina, está en riesgo de adquirir la enfermedad de Chagas. Incluso personas que permanecen por un corto plazo en áreas endémicas al parásito pueden infectarse y las enfermedades parasíticas se están convirtiendo en un problema en el mundo desarrollado como resultado del aumento global en viajes. Se ha reportado la resistencia a los fármacos utilizados en la actualidad. Los problemas de resistencia requieren el uso de fármacos más tóxicos y conforme los fármacos se hacen cada vez menos efectivos se necesita el descubrimiento de nuevos fármacos. Los inventores acaban de descubrir que, de manera sorprendente, las encimas de nitroreductasa también parecen expresarse en ciertos organismos protozoarios parasíticos y los inventores sugieren que el tetrazicar puede ser altamente efectivo contra la infestación de parásitos en animales (como humanos), ya que el hospedero animal (por ejemplo humano) es insensible a este agente mientras que el parásito se verá afectado tóxicamente. Los inventores han mostrado ahora que el tetrazicar es altamente efectivo contra ciertos parásitos protozoarios y también es un objeto de la invención proporcionar tetrazicar como un agente antiparasítico altamente efectivo. Un primer aspecto de la invención proporciona un método para combatir una infección protozoaria parasítica de un organismo hospedero, el método comprende administrar tetrazicar al organismo hospedero.

El organismo hospedero preferiblemente es un animal, más preferiblemente un mamífero y más preferiblemente un humano. Mamíferos no humanos para su tratamiento mediante el método de la invención incluyen caballos, vacas, cerdos, cabras, borregos, perros, gatos y similares. Al "combatir" la infección dada se incluye el significado de que la infección se erradica sustancialmente o que la infección se inhibe sustancialmente. Se apreciará que puede no ser necesaria la eliminación de todos los parásitos en el organismo hospedero para tratar de manera efectiva el organismo hospedero. Un segundo aspecto de la invención proporciona el uso de tetrazicar en la fabricación de un medicamento para combatir una infección protozoaria parasítica de un animal. El compuesto tetrazicar es (5-(aziridin-1 -il)-2,4-dinitrobenzamida (CB1954)), cuya estructura se muestra a continuación. El tetrazicar se ha utilizado previamente como agente anticancerígeno.

Tetrazicar tiene un número de registros C.A.S. No 21919-05-1 y su síntesis se describe en Khan & Ross (1969/70) "Tumour growth inhibitory nitrophenylazíridines and related compounds: structure-activíty relationships" Chem-Biol ¡nteractions 1 , 27-47 y en Cobb et al (1969) Biochem. Pharmacol. 18, 1519-1527. Este compuesto es capaz de erradicar un tumor de rata específico ("tumor Walter") aunque tiene escaso o nulo efecto sobre una variedad de otros tumores (Cobb eí al (1969) Biochem. Pharmacol. 18, 519-1527) y no muestra beneficio terapéutico en estudios clínicos de oncología (Knox et al (1993) Cáncer and Metástasis REv. 12, 195-212). Se ha mostrado que una enzima de nitroreductasa presente en el tumor Walter es capaz de activar CB1924 al reducir su grupo 4-nitro para formar el compuesto 5-az¡ridino-4-hidroxilamino-2-nitrobenzamina, un potente agente de entrelazamiento de ADN electrofílico en presencia de tioésteres intracelulares (Knox et al (1988) Biochem. Pharmacol. 37, 4661 -4669; Knox et al (1991 ) Biochem. Pharmacol. 42, 1691 -1697). La enzima correspondiente en células humanas tiene una cinética relativamente lenta de reducción, haciendo así a las células humanas insensibles a los efectos de CB1954 (Boland et al (1991 ) Biochem. Pharmacol. 41 , 867-875). En estudios mecanísticos en bacterias, se ha mostrado que CB1954 atenuó la toxicidad en cepas nitroreductasa negativas (Venitt y Crofton-Sleigh (1987) Mutagenesis 2, 375-381 ). El tetrazicar se activa para formar un agente antiparasítico mediante enzimas asociadas con parásitos protozoarios. El término "enzima asociada con parásito protozoario "quiere decir una enzima o isoforma de ésta que es, ya sea específica al parásito protozoario que constituye la infección o que se expresa de manera funcional a un grado tan bajo por parte del organismo hospedero como para hacer cualquier activación de tetrazicar por esta última insuficiente para ocasionar una toxicidad inaceptable en el hospedero, pero cuya enzima se expresa mediante el parásito protozoario. Por lo general la enzima asociada con el parásito es al menos 10 veces ó 20 veces ó 50 veces ó 100 veces ó 500 veces ó 1000 veces más activa para activar el compuesto que una enzima presente en el organismo hospedero. Se observará que tetrazicar permanece sustancialmente sin cambios por parte de enzimas endógenas al organismo hospedero y que se activa sustancialmente mediante una o más enzimas en el parásito protozoario. "Se activa para formar un agente antiparasítico" se incluye el significado de que el tetrazicar se convierte a una forma que sea citotóxica, en particular para el parásito protozoario. De manera similar, se observará que los métodos y medicamentos de las invención son particularmente adecuados para combatir la infección por parásitos protozoarios en donde el parásito protozoario es uno que contiene un sistema de enzimas que es capaz de activar el tetrazicar en una forma sustancialmente citotóxica. Un método para determinar si un parásito protozoario responde al tetrazicar se describe en el ejemplo. Tales parásitos protozoarios pueden ser destruidos por el tetrazicar. De manera idónea, las infecciones parasíticas protozoarias que pueden tratarse con tetrazicar son aquellas para las cuales el tetrazicar tiene un IC5o menor a 10 micromolar, preferiblemente menor a 5 micromolar y más preferiblemente menor a 1 micromolar. Otros métodos para determinar si un parásito protozoario contiene una enzima capaz de activar el tetrazicar a una forma sustancialmente citotóxica los conocerán los expertos en la técnica. Éstos incluyen, sin restricción, el uso de programas de computadora adecuados, por ejemplo el programa GAP del Grupo de Computación Genética de la Universidad de Wisconsin, para comparar la secuencia génica de los protozoarios con la de la especies conocidas que contienen nitroreductasa o el uso de técnicas clásicas con las cuales se detecta la enzima relevante, se aisla y purifica previo a las pruebas con tetrazicar. Se cree que tetrazicar es capaz de entrelazar covalentemente el ácido nucleico del parásito protozoario una vez que ha sido activado por un sistema de enzimas presente en el parásito a la forma citotóxica. Ya que el tetrazicar sólo se hace capaz de tal manera con la activación por parte de una enzima asociada con un parásito, la presencia de tetrazicar en células hospederas se piensa no plantea peligro ya que no posee actividad compatible con las enzimas. La unión de tetrazicar a componentes de célula hospedera mediante el grupo aziridina (o de mostaza) presentará sólo un riesgo menor de interrupción celular ya que se cree que cualquier compuesto unido monofuncionalmente es escindible mediante procesos enzimáticos de reparación de hospedero (Knox et al (2003) Current Pharmaceutical Design 9, 2091 -2104). Se cree que la enzima asociada con el parásito responsable de activar el compuesto tiene actividad de nitroreductasa, por ejemplo bajo condiciones óxicas e hipóxicas. En una modalidad, el tetrazicar puede utilizarse para inhibir de manera selectiva aquellos parásitos que han desarrollado resistencia a uno o más antibióticos utilizados en la actualidad. En una modalidad de la invención, al animal también se administran uno o más compuestos conocidos como útiles para combatir una infección parasítica. El tetrazicar y uno o más compuestos como se manifiesta pueden administrarse juntos o en secuencia. Los compuestos que se sabe son útiles para combatir una infección parasítica incluyen misonidazol, nitroheterocíclicos como Nifurtimox y RSU 1069, antimoniales de benzinidazol como estibogluconato, y derivados de acetilcolina como miltefosina. Así, aspectos adicionales de la invención ofrecen el uso de una combinación de tetrazicar y uno o más compuestos que se conoce son útiles para combatir una infección parasítica de un animal en la fabricación de un medicamento para combatir una infección parasítica de un animal; así como el uso de tetrazicar en la fabricación de un medicamento para combatir una infección parasítica de un animal, en donde al animal se le administran uno o más compuestos que se conoce son útiles para combatir una infección parasítica de un animal; así como el uso de uno o más compuestos conocidos como útiles para combatir una infección parasítica de un animal en la fabricación de un medicamento para combatir una infección parasítica de un animal, en donde el animal recibe tetrazicar. Los métodos y medicamentos de la invención encuentran uso particular para combatir infecciones con uno o más de Trypanasoma cruzi, T. brucei, Leishmania spp. en particular L. infaritum, Cryptosporidium spp. y Giardia spp. Un aspecto adicional de la invención proporciona la combinación de tetrazicar con uno o más compuestos que se sabe son útiles para combatir una infección parasítica protozoaria de un organismo hospedero. La combinación puede estar en paquete y presentarse para su uso en medicina. En una modalidad adicional, la combinación puede mezclarse aún más con un portador farmacéuticamente aceptable para formar una composición farmacéutica. Una composición farmacéutica puede incluir, por ejemplo, tetrazicar y agua estéril libre de pirógenos. Por lo general, la composición farmacéutica está en forma líquida en polietilenglicol/A/-metilpirrolidona (PEG/NMP) diluido con solución salina (Cheng-Faye et al (2001 ) Clinical Cáncer Research 7, 2662-2668). Una modalidad preferida es una composición farmacéutica para administración oral. De manera conveniente, la composición farmacéutica es una cápsula de gelatina que contiene el tetrazicar. De manera típica, la composición farmacéutica es una cápsula o tableta que permite la liberación entérica, por ejemplo en virtud de un revestimiento que se disuelve en el intestino. Se conocen bien en la técnica métodos para hacer tales cápsulas y tabletas. El uno o más compuestos como se definen pueden administrarse al organismo hospedero en cualquier forma adecuada y en cualquier cantidad efectiva para combatir la infección. De manera idónea, el veterinario tratante (en el caso de animales no humanos) o médico tratante (en el caso de humanos) puede analizar la ruta de administración apropiada y la dosis o régimen de dosificación apropiados. Una cantidad de tetrazicar se administra, ya sea como una sola dosis o múltiples, en una cantidad efectiva para combatir la infección parasítica. Para su administración a un mamífero (incluyendo humanos), rutas de administración apropiadas incluyen sin restricción intravenosa, transdérmica y por inhalación. Por lo general, para su administración a un humano mediante infusión, el tetrazicar podría administrarse en una dosis de hasta 30 mg/m2. La administración oral también es adecuada, como utilizar una cápsula de gelatina como se discutió antes. El tetrazicar puede darse mediante una variedad de rutas dependiendo de la naturaleza y ubicación del agente infeccioso. En consecuencia, se proporciona una variedad de composiciones de diferente forma farmacéutica, como lo entendería un experto en la técnica.

La invención se describirá ahora en más detalle mediante referencia a las siguientes figuras y ejemplo no restrictivo. La figura 1 muestra la actividad de tetrazicar contra HU3 de L. donovani en ratones BALB/c (administración diaria IP). La figura 2 muestra la actividad de tetrazicar contra HU3 de L. donovani en ratones BALLB/c (administración diaria IV). La figura 3 muestra la actividad de tetrazicar contra HU3 de L. donovani en ratones SCID (administración diaria IV).

EJEMPL0 1 Actividad antiparasítica de tetrazicar Actividad in vitro Se analizó el tetrazicar contra una serie de organismos parasíticos utilizando un sistema de análisis integrado in vitro y se comparó contra el tratamiento de elección contra ese organismo (cuadro 1 ). Como se muestra en el cuadro 1 , el tetrazicar es extremadamente activo contra Leishmania infantum y Trypanasoma cruzi y es mucho más activo que los agentes establecidos. Los ensayos de citotoxicidad contra una gama de líneas celulares de humanos siempre da un valor IC50 >50µ? y las relaciones terapéuticas contra estos dos organismos son dramáticas (>16,000 para T. cruzi y >625 para L. infantum). Aunque no es tan potente como el suramin, el tetrazicar fue activo contra T. brucei con una relación terapéutica >10. No se observó actividad contra las cepas probadas de T. colubriformis o Plasmodium falciparum en teoría porque no expresa un sistemas de enzimas que sea capaz de activar tetrazicar en una forma citotóxica. Dada la aceptabilidad clínica probada del tetrazicar, este agente representa un enfoque de profármaco novedoso para el tratamiento de infestación parasítica, en particular leishmaniasís y la enfermedad de Chagas.

CUADRO 1 Datos in vitro para tetrazicar contra ciertos parásitos Actividad in vivo La actividad in vivo del tetrazicar contra L. donovani se probó en ratones BALB/c y SCID. La infección y tratamiento de los animales se realizó como lo describen Croft y Yardley y sus referencias (Croft & Yardley ( 1999) Animal models of viceral leishmaiasis. En Handbook of Animal Models of Infection, Zak, O. (ed) pp 783-787, Academia Press, Londres). Al final del tratamiento los ratones se pesaron para tener un estimado de toxicidad del fármaco. Se removió el hígado de animales recién sacrificados y se pesó. Se prepararon entonces frotis a partir de los hígados en placas para microscopio y se fijaron con metanol y se tiñeron con tinción Giemsa. El número de parásitos por 500 células de hígado se determinó microscópicamente para cada animal experimentado. Esta cifras se multiplica por el peso total del hígado (mg) y esta cifra (la unidad Leishman-Donovan (LDU)) se utiliza como base para calcular la diferencia en la carga de parásitos entre animales tratados y no tratados (Croft & Yardley, 1999 supra). Como lo muestran las figuras 1 a 3, existe una respuesta dramática log/lineal a la dosis de la inhibición de números parásitos con la concentración de tetrazicar. No se observó una toxicidad relacionada con el fármaco en función de la pérdida de peso corporal en estos experimentos y no se observó una toxicidad importante hasta que se empleó una dosis de 10 mg/kg x 5. Los valores ED5o obtenidos se muestran en el cuadro 2. La actividad equivalente de tetrazicar en ratones BALB/c y SCID inmunodeficientes muestra que la terapia no es inmunodependiente. Esto se pronosticaría a partir del mecanismo propuesto de acción. El estibogluconato en su MTD (15 mg/kg x 5 SC) se utilizó como el compuesto de control para estos experimentos. Esta dosis sólo logra una inhibición de 52±15.2% en conteo de parásitos en ratones BALB/c y escaso efecto en el modelo de ratón SCID. La eficacia in vivo de estibogluconato se sabe que depende los linfocitos T (Murray et al (1993) Antimicrob. Agents Chemother. 37, 1504- 505). La actividad de tetrazicar es notablemente mayor que la de fármacos estándares anti-leishmaniales en modelos de ratón (compare los datos en el cuadro 1 con los de (Croft & Yardley, 1999 supra). El tetrazicar también es efectivo contra T. cruz] in vivo. Como se muestra en el cuadro 3, ratones BALB/c infectados pero sin tratar sólo sobrevivieron un promedio de 13.8 días. En una dosis de 0.3 mg/kg (IP x 5, diarias) todos los ratones sobrevivieron por 50 días antes de que se terminara el experimento. Sin embargo a esta dosis, todavía se podían detectar parásitos en la sangre a los 13 días. Una dosis de 3.0 mg/kg (IP x 5, diaria) despejó todos los parásitos de la sangre. Se requirió una dosis de 45 mg/kg (p.o. x 5 diario) de benzinidazol para producir un efecto equivalente.

CUADRO 2 Actividad de tetrazicar contra HU3 de L. donovani CUADRO 3 Actividad de tetrazicar contra T cruzi Dada la aceptabilidad clínica aprobada de tetrazicar, este agente representa un enfoque de profármaco novedoso para el tratamiento de infestación parasítica, en particular leishmaniasis y la enfermedad de Chagas.

Métodos de análisis in vitro Enfermedad de Chagas: modelo de análisis in vitro de T.cruzi (MHOM/CL/00/Tulahuen); T. cruzi (MHOM/BR/00/Y) Cultivos de parásitos y celulares Se utilizó Trypanosoma cruzi (MHOM/CL/00/Tulahuen) transfectado con el gen de ß-galatosidasa (Lac Z) (Buckner et al ( 1996) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 40(1 1 ), 2592-2597. La cepa se mantuvo en una capa celular L-6 (línea celular de mioblastos esqueletales de rata que se obtuvo del Depósito Europeo de Cultivos Celulares Animales (ECACC, Salisbury, Reino Unido)) en RPMI 1640 sin medio rojo de fenol adicionado con 10% de suero de ternera fetal inactivado por calor. Todos los cultivos y ensayos se realizaron a 37°C bajo una atmósfera de 5% C02 en aire.

Ensayos de sensibilidad del fármaco Se prepararon soluciones madre de tetrazicar en 100% DMSO (dimetilsulfóxido) a 20 mg/ml. Las soluciones se mantuvieron a temperatura ambiente a oscuras previo a su uso. Para los ensayos, el compuesto se diluyó adicionalmente a la concentración apropiada utilizando un medio completo. Se realizaron los ensayos en placas microtituladoras de 96 pozos estériles, y cada pozo contenía 100 µ? de medio con 2x103 de células L- 6. Después de 24 horas se añadieron 50 µ? de una suspensión de Trypanosoma que contenía 5x103 de formas tripomastigote del cultivo a los pozos. 48 horas después se removió el medio de los pozos y se reemplazó con 100 µ? de medio fresco con o sin una dilución de fármaco en serie. Después de 72 horas de incubación las placas se inspeccionaron bajo un microscopio invertido para asegurar el crecimiento de los controles y su esterilidad, así como para determinar la concentración mínima inhibidora (MIC): ésta es la menor concentración de fármaco a la cual no pueden observarse Trypanosomas con morfología normal en comparación con los pozos de control. Nifurtimox se utilizó como el fármaco de referencia. Se añadió el sustrato CPRG/Nonidet (50 µ?) a todos los pozos. Una reacción de color se hizo visible a las 2-6 horas y se leyó fotométricamente a 540 nm. Los resultados, expresados como porcentaje de reducción en cargas de parásitos comparados con pozos de control se transfirieron a un programa de gráficos (EXCEL), se determinaron las curvas de inhibición sigmoideas y se calcularon los valores IC5o.

Análisis primario Los compuestos se probaron por triplicado en cuatro concentraciones (30-10-3-1 µg/ml). Se incluyó nifurtimox como el fármaco de referencia. El compuesto se clasifica como inactivo cuando IC50 es mayor a 15 µg/ml. cuando IC50 se encuentra entre 15 y 5 µg/ml, el compuesto se considera como moderadamente activo. Cuando IC50 es menor a 5 µg/ml, el compuesto se clasifica como altamente activo y se evalúa adicionalmente en un análisis secundario.

Análisis secundario Se utilizó el mismo protocolo y se determinó ICsoS utilizando una escala de dosis ampliada y ajustada según fuera apropiado.

Leishmaniasis: análisis in vitro Cultivos de parásitos y celulares Se utilizó una cepa de Leishmania spp. (Leishmania donovani MHOM/ET/67/L82, también conocida como LV9, HU3). Las cepas se mantienen en el hámster sirio (Mesocricetus auratus). Se recolectaron amastigotes del vaso de un hámster infectado y se evaluó la carga de parásitos en el bazo utilizando la técnica Stauber. Se recolectaron macrófagos peritoneales primarios de ratón (CDI) 1 ó 2 días después de una estimulación para producción de macrófagos con una inyección intraperitoneal de 2 mi de almidón soluble al 2%. Todos los cultivos y ensayos se llevaron a cabo a 37°C bajo una atmósfera de 5% C02.

Ensayos de sensibilidad al fármaco Se prepararon 20 mg/ml de una solución madre de tetrazicar en 100% DMSO y se mantuvieron a temperatura ambiente a oscuras. La solución se prediluyó a 60 µg/ml en RPMI 1640 + suero de ternera fetal inactivado por calor al 10%. Los ensayos se realizaron en placas de cultivo para tejidos de 16 pozos estériles, cada una conteniendo 50 µ? de las diluciones del compuesto junto con 100 µ? del inoculo del macrófago/parásito (4x105 macrófagos/ml y 4x 06 parásitos/ml). El inoculo se preparó en medio RPMI-1640, se adicionó con suero de ternera fetal inactivado por calor al 10%. El crecimiento de los parásitos se comparó con los pozos de control (crecimiento de parásitos al 100%). Después de 5 días de incubación, se evaluó el crecimiento de los parásitos bajo microscopio después de teñir las células con una solución Giemsa al 10%. Se evaluó el nivel de infección/pozo al contar el número de macrófagos infectados por cada 100 macrófagos. Los resultados expresados como por ciento en reducción en la carga de parásitos en comparación con los pozos de control se transfirieron a un programa de gráficos (EXCEL), se determinaron las curvas de inhibición sigmoideas y se calcularon los valores IC5o.

Análisis primario Se sometieron a prueba los compuestos por cuadruplicados en cuatro concentraciones (30-10-3-1 µg/ml). Se incluyó Pentostam® (estibogluconato de sodio) como el fármaco de referencia.

El compuesto se clasifica como inactivo cuando IC50 es mayor a 15 µ?/?t??. Cuando IC50 se encuentre entre 15 y 5 µg/ml, el compuesto se considera como moderadamente activo. Cuando IC50 es menor a 5 µg/ml, el compuesto se clasifica como altamente activo y se evalúa adicionalmente en un segundo análisis.

Análisis secundario Se utilizó el mismo protocolo .y se determinó IC50 utilizando una gama ampliada de dosis y que se ajustará como fuera apropiado. Pentostam® se incluyó como el fármaco de referencia.

Claims (16)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- El uso de tretrazlcar en la fabricación de un medicamento útil para combatir una infección protozoaria parasítica de un animal. 2. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el animal es un mamífero. 3. - El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde el mamífero es un humano. 4. - El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el parásito que ocasiona lá infección está asociado con un sistema de enzimas capaz de activar tetrazicar en una forma citotóxica. 5.- El uso como se reclama en la reivindicación 4, en donde la enzima es una nitroreductasa. 6. - El uso como se reclama cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el animal es uno que no contiene endógenamente un sistema de enzimas que activa tetrazicar a un grado tal que ocasione una toxicidad inaceptable al animal. 7. - El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el parásito que ocasiona la infección es resistente a antibióticos. 8.- El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde la infección parasítica del animal es ocasionada por cualquiera o más de los siguientes parásitos: Trypanosoma cruzi, T. brucei, Leishmania spp.l en particular L. infantum, Cryptosporidium y Giardia ssp.. 9.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el medicamento es también adaptado para ser administrable con uno o más compuestos conocidos como útiles para combatir una infección parasítica. 10. - El uso de una combinación de tetrazicar y uno o más compuestos que se conocen son útiles para combatir una infección parasítica protozoaria de un animal en la fabricación de un medicamento útil para combatir una infección parasítica de un animal. 1 1 . - El uso de tetrazicar en la fabricación de un medicamento útil para combatir una infección parasítica protozoaria de un animal, en donde el medicamento es adaptado para ser administrable con uno o más compuestos que se conoce son útiles para combatir una infección parasítica de un animal. 12. - El uso de uno o más compuestos conocidos como útiles para combatir una infección parasítica protozoaria de un animal en la fabricación de un medicamento útil para combatir una infección parasítica de un animal, en donde al animal se le administra tetrazicar. 13.- Una combinación de tetrazicar y uno o más compuestos que se conoce son útiles para combatir una infección parasítica protozoaria de un organismo hospedero. 14. - La combinación de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque el organismo hospedero es un animal. 15. - Una combinación de conformidad con la reivindicación 14 para su uso en medicina. 16.- Una composición farmacéutica que comprende la combinación como se define en la reivindicación 14 y un portador farmacéuticamente aceptable.