MX2008002369A

MX2008002369A - Moleculas cortas de acidos nucleicos de interferencia quimicamente modificadas que actuan de mediadoras de la interferencia del acido ribonucleico.

Info

Publication number: MX2008002369A
Application number: MX2008002369A
Authority: MX
Inventors: Leonid Beigelman; David Morrisey; James Mcswiggen
Original assignee: Sirna Therapeutics Inc
Priority date: 2005-08-17
Filing date: 2006-08-17
Publication date: 2008-03-18
Also published as: NO20081376L; BRPI0614407A2; NZ565712A; JP2009504190A; IL189540A0

Abstract

La presente invencion se refiere a compuestos, composiciones, y procedimientos para el estudio, diagnostico, y tratamiento de rasgos, enfermedades y afecciones que responden a la modulacion de la expresion y/o actividad genicas; la presente invencion tambien se refiere a compuestos, composiciones, y procedimientos relacionados con rasgos, enfermedades y afecciones que responden a la modulacion de la expresion y/o actividad de genes implicados en las rutas de la expresion genetica u otros procesos celulares que actuan de mediadores del mantenimiento o desarrollo de dichos rasgos, enfermedades y afecciones; de forma especifica, la invencion se refiere a moleculas bicatenarias de acido nucleico que incluyen moleculas cortas de acido nucleico, tales como moleculas de acido nucleico corto de interferencia (siNA), ARN corto de interferencia (siARN), ARN bicatenario (dsARN), micro-ARN (miARN), y ARN corto en horquilla (shARN) con capacidad de actuar de mediadoras de la interferencia del ARN (ARNi) contra la expresion genica, que incluye cocteles de dichas moleculas cortas de acido nucleico y formulaciones en nanoparticulas lipidicas (LNP) de dichas moleculas cortas de acido nucleico; la presente invencion tambien se refiere a moleculas cortas de acido nucleico; tales como siNA, siARN, y otras que pueden inhibir la funcion de moleculas endogenas de ARN, tales como micro-ARN (miARN) endogeno (por ejemplo, inhibidores de miARN) o ARN corto de interferencia (siARN) endogeno, (por ejemplo, inhibidores de siARN) o que pueden inhibir la funcion de RISC (por ejemplo, inhibidores de RISC), para modular la expresion genica interfiriendo con la funcion reguladora de dichos ARN endogenos o de las proteinas asociadas a dichos ARN endogenos (por ejemplo, RISC), que incluyen cocteles de dichas moleculas cortas de acido nucleico y formulaciones en nanoparticulas lipidicas (LNP) de dichas moleculas cortas de acido nucleico; dichas moleculas cortas de acido nucleico son de utilidad por ejemplo, para proporcionar composiciones para prevenir, inhibir, o reducir enfermedades, rasgos y afecciones que estan asociados a la expresion o actividad genica en un sujeto u organismo.

Description

MOLÉCULAS CORTAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS DE INTERFERENCIA QUÍMICAMENTE MODIFICADAS QUE ACTÚAN DE MEDIADORAS DE LA INTERFERENCIA DEL ACIDO RIBONUCLEICO Esta solicitud de patente es una continuación en parte de la solicitud de patente de Estados Unidos nJ 11/299,254, presentada el 8 de diciembre de 2005, que es una continuación en parte de la solicitud de patente de Estados Unidos nJ 11/234,730, presentada el 23 de septiembre de 2005, que es una continuación en parte de la solicitud de patente de Estados Unidos nJ 11/205,646, presentada el 17 de agosto de 2005, que es una continuación en parte de la solicitud de patente de Estados Unidos nJ 11/098,303, presentada el 4 de abril de 2005, que es una continuación en parte de la solicitud de patente de Estados Unidos nJ 10/923,536, presentada el 20 de agosto de 2004, que es una continuación en parte de la solicitud de patente internacional n.J PCT/US04/16390, presentada el 24 de mayo de 2004, que es una continuación en parte de la solicitud de patente de Estados Unidos nJ 10/826,966, presentada el 16 de abril de 2004, que es una continuación en parte de la solicitud de patente de Estados Unidos nJ 10/757,803, presentada el 14 de enero de 2004, que es una continuación en parte de la solicitud de patente de Estados Unidos nJ 10/720,448, presentada el 24 de noviembre de 2003, que es una continuación en parte de la solicitud de patente de Estados Unidos nJ 10/693,059, presentada el 23 de octubre de 2003, que es una continuación en parte de la solicitud de patente de Estados Unidos nJ 10/444,853, presentada el 23 de mayo de 2003, que es una continuación en parte de la solicitud de patente internacional nJ PCT/US03/05346, presentada el 20 de febrero de 2003, y una continuación en parte de la solicitud de patente internacional nJ PCT/US03/05028, presentada el 20 de febrero de 2003, que reivindican ambas el derecho de prioridad de la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/358,580 presentada el 20 de febrero de 2002, la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/363,124 presentada el 11 de marzo de 2002, la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/386,782 presentada el 6 de junio de 2002, la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/406,784 presentada el 29 de agosto de 2002, la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/408,378 presentada el 5 de septiembre de 2002, la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/409,293 presentada el 9 de septiembre de 2002, y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/440,129 presentada el 15 de enero de 2003. Esta solicitud de patente también es una continuación en parte de la solicitud de patente internacional nJ PCT/US04/13456, presentada el 30 de abril de 2004, que es una continuación en parte de la solicitud de patente de Estados Unidos nJ 10/780,447, presentada el 13 de febrero de 2004, que es una continuación en parte de la solicitud de patente de Estados Unidos nJ 10/427,160, presentada el 30 de abril de 2003, que es una continuación en parte de la solicitud de patente internacional nJ. PCT/US02/15876 presentada el 17 de mayo de 2002, que reivindica el derecho de prioridad de la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/292,217, presentada el 18 de mayo de 2001 , la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/362,016, presentada el 6 de marzo de 2002, la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/306,883, presentada el 20 de julio de 2001 , y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/311 ,865, presentada el 13 de agosto de 2001. Esta solicitud de patente también es una continuación en parte de la solicitud de patente de Estados Unidos nJ 10/727,780 presentada el 3 de diciembre de 2003. Esta solicitud de patente también es una continuación en parte de la solicitud de patente internacional nJ PCT/US05/04270, presentada el 9 de febrero de 2005 que reivindica el derecho de prioridad de la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/543,480, presentada el 10 de febrero de 2004. Esta solicitud de patente es también una continuación en parte de la solicitud de patente de Estados Unidos nJ 11/353,630, presentada el 14 de febrero de 2006, que reivindica el derecho de prioridad de la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/652,787 presentada el 14 de febrero de 2005, la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/678,531 presentada el 6 de mayo de 2005, la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/703,946, presentada el 29 de julio de 2005, y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/737,024, presentada el 15 de noviembre de 2005. La presente solicitud de patente reivindica el derecho de prioridad de todas las solicitudes de patente que se enumeran, que se incorporan por la presente por referencia en su totalidad, incluidos los dibujos.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a compuestos, composiciones, y procedimientos para el estudio, diagnóstico, y tratamiento de rasgos, enfermedades y afecciones que responden a la modulación de la expresión y/o actividad génicas. La presente invención también se refiere a compuestos, composiciones, y procedimientos relacionados con rasgos, enfermedades y afecciones que responden a la modulación de la expresión y/o actividad de genes implicados en las rutas de la expresión génica u otros procesos celulares que actúan de mediadores del mantenimiento o desarrollo de dichos rasgos, enfermedades y afecciones. De forma específica, la invención se refiere a moléculas bicatenarias de ácido nucleico que incluyen moléculas cortas de ácido nucleico, tales como moléculas de ácido nucleico corto de interferencia (siNA), ARN corto de interferencia (siARN), ARN bicatenario (dsARN), micro-ARN (miARN), y ARN corto en horquilla (shARN) con capacidad de actuar de mediadoras de la interferencia del ARN (ARNi) contra la expresión génica, que incluye cócteles de dichas moléculas cortas de ácido nucleico y formulaciones en nanopartículas lipídicas (LNP) de dichas moléculas cortas de ácido nucleico. La presente invención también se refiere a moléculas cortas de ácido nucleico, tales como siNA, siARN, y otras que pueden inhibir la función de moléculas endógenas de ARN, tales como micro-ARN (miARN) endógeno (por ejemplo, inhibidores de miARN) o ARN corto de interferencia (siARN) endógeno, (por ejemplo, inhibidores de siARN) o que pueden inhibir la función de RISC (por ejemplo, inhibidores de RISC), para modular la expresión génica interfiriendo con la función reguladora de dichos ARN endógenos o de las proteínas asociadas a dichos ARN endógenos (por ejemplo, RISC), que incluyen cócteles de dichas moléculas cortas de ácido nucleico y formulaciones en nanopartículas lipídicas (LNP) de dichas moléculas cortas de ácido nucleico. Dichas moléculas cortas de ácido nucleico son de utilidad, por ejemplo, para proporcionar composiciones para prevenir, inhibir, o reducir diversas enfermedades, rasgos y afecciones que están asociados a la expresión o actividad génica en un sujeto u organismo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN A continuación se incluye una descripción de la técnica relevante relacionada con la ARNi. La descripción se proporciona únicamente para la comprensión de la invención siguiente. El resumen no es una admisión de que ninguna parte del trabajo que se describe a continuación sea técnica anterior de la invención que se reivindica. La interferencia del ARN se refiere al proceso de silenciamiento de genes postranscripcional en animales mediada por los ARN cortos de interferencia (siARN) (Zamore y cois., 2000, Cell, 101 , 25-33; Fire y cois., 1998, Nature, 391 , 806; Hamilton y cois., 1999, Science, 286, 950-951 ; Lin y cois., 1999, Nature, 402, 128-129; Sharp, 1999, Genes & Dev., 13:139-141 ; y Strauss, 1999, Science, 286, 886). El proceso correspondiente en plantas (Heifetz y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 99/61631) se denomina habitualmente silenciamiento génico postranscripcional o silenciamiento de ARN y también se denomina represión en los hongos. Se cree que el proceso del silenciamiento génico postranscripcional es un mecanismo de defensa celular conservado evolutivamente para evitar la expresión de genes exógenos y habitualmente es compartido por diversa flora y filos (Fire y cois., 1999, Trends genet., 15, 358). Dicha protección contra la expresión génica exógena puede haber evolucionado como respuesta a la producción de ARN bicatenarios (dsARN) derivados de una infección vírica o de la integración aleatoria de elementos de transposones en un genóma hospedador mediante una respuesta celular que destruye de forma específica el ARN monocatenario homólogo o el ARN genómico vírico. La presencia de dsARN en las células desencadena la respuesta de la ARNi a través de un mecanismo que todavía no se ha caracterizado por completo. Este mecanismo parece ser diferente de otros mecanismos conocidos que implican ribonucleasas específicas de ARN bicatenario, tales como la respuesta de los interferones que provoca la activación mediada por dsARN de la proteína cinasa PKR y 2,,5'-oligoadenilato sintetasa que provoca una escisión no específica, del mARN por la ribonucleasa L (véanse por ejemplo las patentes de Estados Unidos NJ 6,107,094; 5,898,031 ; Clemens y cois., 1997, J. Interferon & Cytokine Res., 17, 503-524; Adah y cois., 2001 , Curr. Med. Chem., 8, 1189). La presencia de dsARN largos en las células estimula la actividad de una enzima ribonucleasa lll denominada Dicer (cortadora en inglés) (Bass, 2000, Cell, 101 , 235; Zamore y cois., 2000, Cell, 101 , 25-33; Hammond y cois., 2000, Nature, 404, 293). La Dicer está implicada en el procesamiento del dsARN produciendo tramos cortos de dsARN conocidos como ARN cortos de interferencia (siARN) (Zamore y cois., 2000, Cell, 101 , 25-33; Bass, 2000, Cell, 101 , 235; Berstein y cois., 2001 , Nature, 409, 363). Los ARN cortos de interferencia derivados por la actividad de la Dicer habitualmente tienen de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos de longitud y comprenden moléculas bicatenarias de aproximadamente 19 pares de bases (Zamore y cois., 2000, Cell, 101 , 25-33; Elbashir y cois., 2001 , Genes Dev., 15, 188). La Dicer también se ha implicado en la escisión de ARN temporales cortos de 21 y 22 nucleótidos (stARN) del ARN precursor de estructura conservada que están implicados en el control de la traducción (Hutvagner y cois., 2001 , Science, 293, 834). La respuesta de ARNi también presenta un complejo de endonucleasas, habitualmente denominado complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que actúa de mediador de la escisión de ARN monocatenario que tiene una secuencia complementaria a la hebra no codificante de la molécula bicatenaria de siARN. La escisión del ARN objetivo se produce en mitad de la región complementaria a la hebra no codificante de la molécula bicatenaria de siARN (Elbashir y cois., 2001 , Genes Dev., 15, 188). La ARNi se ha estudiado en una variedad de sistemas. Fire y cois., 1998, Nature, 391 , 806, fueron los primeros en observar la ARNi en C. elegans. Bahramian y Zarbl, 1999, Molecular and Cellular Biology, 19, 274-283 y Wianny y Goetz, 1999, Nature Cell Biol., 2, 70, describen la ARNi mediada por dsARN en sistemas mamíferos. Hammond y cois., 2000, Nature, 404, 293, describen la ARNi en células de Drosophila transfectadas con dsARN. Elbashir y cois., 2001 , Nature, 411 , 494 y Tuschl y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 01/75164, describen la ARNi inducida por la introducción de moléculas bicatenarias de ARN sintéticos de 21 nucleótidos en células de mamífero cultivadas que incluyen células renales embrionarias humanas y células HeLa. Estudios recientes en lisados embrionarios de Drosophila (Elbashir y cois., 2001 , EMBO J., 20, 6877 y Tuschl y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 01/75164) han revelado ciertos requisitos en cuanto a la longitud, estructura, composición química y secuencia de los siARN que son esenciales para mediar una actividad eficaz de ARNi. Estos estudios han demostrado que las moléculas bicatenarias de siARN de 21 nucleótidos son más activas cuando contienen colgaduras de dinucleótidos en el extremo 3'. Además, la sustitución completa de una o de ambas hebras de siARN con nucleótidos 2'-desoxi (2'-H) o 2'-O-metilo suprime la actividad de ARNi, mientras que se demostró que la sustitución de los nucleótidos de colgadura del extremo 3' de siARN con nucleótidos 2'-desoxi (2'-H) era tolerada. También se demostró que las secuencias con un único emparejamiento erróneo en el centro de la molécula bicatenaria de siARN suprimen la actividad de ARNi. Además, estos estudios también indican que la posición del sitio de escisión en el ARN objetivo está definida por el extremo 5' de la secuencia de guía del siARN en lugar de por el extremo 3' de la secuencia de guía (Elbashir y cois., 2001 , EMBO J., 20, 6877). Otros estudios han indicado que es necesario un 5'-fosfato en la hebra complementaria objetivo de una molécula bicatenaria de siARN para la actividad de siARN y que se utiliza ATP para mantener el resto 5'-fosfato en el siARN (Nykanen y cois., 2001 , Cell, 107, 309). Los estudios han demostrado que la sustitución de los segmentos colgantes de nucleótidos del extremo 3' de una molécula bicatenaria de siARN 21-mérica que tiene colgaduras de dos nucleótidos en 3' con desoxirribonucleótidos no tiene un efecto adverso sobre la actividad de ARNi. Se ha reseñado que la sustitución de hasta cuatro nucleótidos en cada extremo del siARN con desoxir bonucleótidos se tolera bien, mientras que la sustitución completa con desoxirribonucleótidos provoca la falta actividad de ARNi (Elbashir y cois., 2001, EMBO J., 20, 6877 y Tuschl y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 01/75164). Además, Elbashir y cois., referencia anterior, también reseñan que la sustitución de siARN con nucleótidos de 2'-O-metilo suprime completamente la actividad de ARNi. Li y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 00/44914, y Beach y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 01/68836 sugieren de forma preliminar que el siARN puede incluir modificaciones o en el esqueleto de fosfato-azúcar o en el nucleósido para inducir al menos uno de un heteroátomo de nitrógeno o azufre, sin embargo, ninguna de las dos solicitudes de patente postula hasta qué punto dichas modificaciones serían toleradas en las moléculas de siARN, ni proporciona ninguna guía ni ejemplos de dicho siARN modificado. Kreutzer y cois., solicitud de patente canadiense nJ 2,359,180, también describen ciertas modificaciones químicas para usar en construcciones de dsARN para contrarrestar la activación de la proteína cinasa PKR dependiente de ARN bicatenario, específicamente los nucleótidos de 2'-amino o de 2'-O-metilo, y los nucleótidos que contienen un puente de metileno en 2'-O o 4'-C. Sin embargo, Kreutzer y cois, de forma similar no proporcionan ejemplos ni guía sobre hasta qué punto estas modificaciones serían toleradas en moléculas de dsARN. Parrish y cois., 2000, Molecular Cell, 6, 1077-1087, analizaron ciertas modificaciones químicas dirigidas al gen unc-22 en C. elegans usando transcritos largos (>25 nt) de siARN. Los autores describen la introducción de restos tiofosfato en estos transcritos de siARN mediante la incorporación de análogos de nucleótidos con tiofosfato con ARN polimerasa de T7 y T3 y observaron que los ARN con dos bases modificadas con fosforotioato también presentaban unas disminuciones sustanciales en la eficacia como ARNi. Además, Parrish y cois, reseñaron que la modificación con fosforotioato de más de dos restos desestabilizaba mucho los ARN in vitro de tal forma que no podían observarse actividades de interferencia mediante ensayos. Id. en 1081. Los autores también analizaron ciertas modificaciones en la posición 2' del azúcar nucleotídica en los transcritos largos de siARN y encontraron que la sustitución de ribonucleótidos por desoxinucleótidos producía un descenso sustancial en la actividad de interferencia, especialmente en el caso de sustituciones de una uridina a timina y/o citidina a desoxicitidina. Id. Además, los autores analizaron ciertas modificaciones de bases, que incluían la sustitución en las hebras codificante y no codificante del siARN, de 4-tiouracilo, 5-bromouracilo, 5-yodouracilo y 3-(aminoalil)uracilo por uracilo, e inosina por guanosina. Aunque parecía que la sustitución de 4-tiouracilo y 5-bromouracilo se toleraban, Parrish reseñó que la inosina producía un aumento sustancial de la actividad de interferencia cuando se incorporaba a cualquiera de las dos hebras. Parrish también reseñó que la incorporación de 5-yodouracilo y 3-(aminoalil)uracilo en la hebra no codificante provocaba un descenso sustancial también en la actividad de ARNi. Se ha descrito el uso de dsARN más largos. Por ejemplo, Beach y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 01/68836, describen procedimientos específicos para atenuar la expresión génica usando dsARN derivados de forma endógena. Tuschl y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 01/75164, describen un sistema de ARNi de Drosophila in vitro y el uso de moléculas específicas de siARN para ciertas aplicaciones genómicas funcionales y ciertas aplicaciones terapéuticas; aunque Tuschl, 2001 , Chem. Biochem., 2, 239-245, duda de que pueda usarse ARNi para curar enfermedades genéticas o una infección vírica debido al peligro de activar la respuesta de los interferones. Li y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 00/44914, describen el uso de dsARN largos (141 pb-488 pb) de síntesis enzimática o expresados a partir de vectores para atenuar la expresión de ciertos genes objetivo. Zernicka-Goetz y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 01/36646, describen ciertos procedimientos para inhibir la expresión de genes particulares en células de mamífero usando ciertos dsARN largos (550 pb-714 pb) de síntesis enzimática o expresados a partir de vectores. Fire y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 99/32619, describen procedimientos particulares para introducir ciertas moléculas largas de dsARN en células para usar en la inhibición de la expresión génica en nemátodos. Plaetinck y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 00/01846, describen ciertos procedimientos para identificar genes específicos responsables de conferir un fenotipo particular a una célula usando moléculas largas específicas de dsARN. Mello y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 01/29058, describen la identificación de genes específicos implicados en ARNi mediados por dsARN. Pachuck y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 00/63364, describen ciertas construcciones de dsARN largas (al menos de 200 nucleótidos). Deschamps Depaillette y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 99/07409, describen composiciones específicas constituidas por moléculas particulares de dsARN combinadas con ciertos agentes antivirales. Waterhouse y cois., publicación de patente internacional PCT nJ 99/53050 y 1998, PNAS, 95, 13959-13964, describen ciertos procedimientos para disminuir la expresión fenotípica de un ácido nucleico en células vegetales usando ciertos dsARN. Driscoll y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 01/49844, describen construcciones específicas para la expresión de DNA a usar para facilitar el silenciamiento génico en organismos objetivo. Otros han escrito sobre diversos sistemas de ARNi y silenciamiento génico. Por ejemplo, Parrish y cois., 2000, Molecular Cell, 6, 1077-1087, describen construcciones de dsARN modificadas químicamente dirigidas al gen unc-22 de C. elegans. Grossniklaus, publicación de patente internacional PCT nJ WO 01/38551 , describe ciertos procedimientos para regular la expresión génica de polycomb en plantas usando ciertos dsARN. Churikov y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 01/42443, describen ciertos procedimientos para modificar las caracteristicas genéticas de un organismo usando ciertos dsARN. Cogoni y cois, publicación de patente internacional PCT nJ WO 01/53475, describen ciertos procedimientos para aislar un gen de silenciamiento de Neurospora y sus usos. Reed y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 01/68836, describen ciertos procedimientos para el silenciamiento génico en plantas. Honer y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 01/70944, describen ciertos procedimientos de cribado de fármacos usando nemátodos transgénicos como modelos de enfermedad de Parkinson usando ciertos dsARN. Deak y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 01/72774, describen ciertos productos génicos derivados de Drosophila que pueden estar relacionados con ARNi en Drosophila. Arndt y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 01/92513 describen ciertos procedimientos para mediar la supresión génica mediante el uso de factores que potencian la ARNi. Tuschl y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 02/44321 , describen ciertas construcciones sintéticas de siARN. Pachuk y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 00/63364, y Satishchandran y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 01/04313, describen ciertos procedimientos y composiciones para inhibir la función de ciertas secuencias polinucleotídicas usando ciertos dsARN largos (más de 250 pb) expresados en vectores. Echeverri y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 02/38805, describen ciertos genes de C. elegans identificados mediante ARNi. Kreutzer y cois., publicaciones de patentes internacionales nJ WO 02/055692, WO 02/055693, y EP 1144623 B1 describen ciertos procedimientos para inhibir la expresión génica usando dsARN. Graham y cois., publicaciones de patentes internacionales nJ WO 99/49029 y WO 01/70949, y AU 4037501 describen ciertas moléculas de siARN expresadas en vectores. Fire y cois., documento US 6,506,559, describen ciertos procedimientos para inhibir la expresión génica in vitro usando ciertos construcciones de dsARN largas (299 pb-1033 pb) que actúan de mediadoras de la ARNi. Martínez y cois., 2002, Cell, 110, 563-574, describen ciertas construcciones de siARN monocatenarias, que incluyen ciertas siARN monocatenarias fosforiladas en 5' que actúan de mediadoras de la interferencia del ARN en células Hela. Harborth y cois., 2003, Antisense & Nucleic Acid Drug Development, 13, 83-105, describen ciertas moléculas de siARN modificadas química y estructuralmente. Chiu y Rana de 2003, ARN, 9, 1034-1048, describen ciertas moléculas de siARN modificadas química y estructuralmente. Woolf y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 03/064626 y WO 03/064625 describen ciertas construcciones de siARN modificadas químicamente. Hornung y cois. 2005, Nature Medicine, 11 , 263 -270, describen la potente inducción específica de secuencia de IFN-alfa por ARN corto de interferencia en células dendríticas plamacitoides a través de TLR7. Judge y cois, de 2005, Nature Biotechnology, publicado oniine: el 20 de marzo de 2005, describen la estimulación dependiente de secuencia de la respuesta inmunológica innata de mamífero mediante siARN sintético. Yuki y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 05/049821 y WO 04/048566, describen ciertos procedimientos para diseñar secuencias de ARN corto de interferencia y ciertas secuencias de ARN corto de interferencia con actividad optimizada. Saigo y cois., publicación de solicitud de patente de Estados Unidos nJ US20040539332, describen ciertos procedimientos para diseñar secuencias de oligonucleótidos o polinucleótidos, que incluyen secuencias de ARN corto de interferencia, para lograr la interferencia del ARN. Tei y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 03/044188, describen ciertos procedimientos para inhibir la expresión de un gen objetivo, que comprenden transfectar una célula, tejido u organismo individual con un polinucleótido bicatenario que comprende DNA y ARN que tiene una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica a al menos una secuencia de nucleótidos parcial del gen objetivo. Mattick, 2005, Science, 309, 1527-1528; Claverie, 2005, Science, 309, 1529-1530; Sethupathy y cois., 2006, ARN, 12, 192-197; y Czech, 2006 NEJM, 354, 11 : 1194-1195; Hutvagner y cois., documento US 20050227256, y Tuschl y cois., documento US 20050182005, todos describen moléculas no codificantes que pueden inhibir la función de miARN mediante bloqueo estérico y todos se incorporan por referencia en su totalidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a compuestos, composiciones, y procedimientos de utilidad para modular la expresión de genes, tales como los genes asociados al desarrollo o mantenimiento de enfermedades, rasgos y afecciones que están relacionados con la expresión o actividad génica, mediante interferencia del ARN (ARNi), usando moléculas de ácido nucleico corto de interferencia (siNA). Esta invención también se refiere a compuestos, composiciones, y procedimientos de utilidad para modular la expresión y actividad de uno o más genes implicados en las rutas de la expresión y/o actividad génicas mediante interferencia del ARN (ARNi) usando moléculas cortas de ácido nucleico. En particular, la presente invención presenta moléculas cortas de ácido nucleico, tales como ácido nucleico corto de interferencia (siNA), ARN corto de interferencia (siARN), ARN bicatenario (dsARN), micro-ARN (miARN), y ARN corto en horquilla (shARN) y procedimientos que se usan para modular la expresión de genes y/u otros genes implicados en las rutas de la expresión y/o actividad génicas. La presente invención también se refiere a moléculas cortas de ácido nucleico, tales como siNA, siARN, y otras que pueden inhibir la función de moléculas endógenas de ARN, tales como micro-ARN (miARN) endógeno (por ejemplo, inhibidores de miARN) o ARN corto de interferencia (siARN) endógeno, (por ejemplo, inhibidores de siARN) o que pueden inhibir la función de RISC (por ejemplo, inhibidores de RISC), para modular la expresión génica interfiriendo con la función reguladora de dichos ARN endógenos o de las proteínas asociadas a dichos ARN endógenos (por ejemplo, RISC). Dichas moléculas se denominan de forma colectiva en el presente documento inhibidores de ARNi. Un siNA o inhibidor de ARNi de la invención puede estar sin modificar o modificado químicamente. Un siNA o inhibidor de ARNi de la presente invención puede sintetizarse químicamente, expresarse a partir de un vector o sintetizarse enzimáticamente. La presente invención también presenta diversas moléculas de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) sintéticas modificadas químicamente con capacidad de modular la expresión objetivo o la actividad génica en células mediante interferencia del ARN (ARNi). La presente invención también presenta diversas moléculas cortas de ácido nucleico (siNA) sintéticas modificadas químicamente con capacidad de modular la actividad de ARNi en células mediante la interacción con miARN, siARN, o RISC, y por lo tanto de regular por disminución o inhibir la interferencia del ARN (ARNi), mediante inhibición de la traducción, o silenciamiento traslacional en una célula u organismo. El uso de siNA y/o inhibidores de ARNi modificados químicamente mejora diversas propiedades de las moléculas de siNA nativas y/o de los inhibidores de ARNi a través de una mayor resistencia a la degradación por nucleasas in vivo y/o a través de captación celular mejorada. Además, al contrario que los estudios publicados anteriormente, las moléculas de siNA de la invención que tienen múltiples modificaciones químicas, que incluyen siNA completamente modificado, mantienen su actividad de ARNi. Por lo tanto, el solicitante enseña en el presente documento siARN químicamente modificado (de forma general denominado en el presente documento siNA) que mantiene o mejora la actividad de siARN nativo. Las moléculas de siNA de la presente invención proporcionan reactivos y procedimientos de utilidad para una variedad de aplicaciones terapéuticas, profilácticas, veterinarias, diagnósticas, de validación de objetivos, de descubrimiento genómico, de ingeniería genética y farmacogenómicas. En una modalidad, la invención presenta una o más moléculas de siNA y/o inhibidores de ARNi y procedimientos que independientemente o en combinación modulan la expresión de genes objetivo que codifican proteínas, tales como proteínas que están asociadas al mantenimiento y/o desarrollo de enfermedades, rasgos, trastornos, y/o afecciones tal como se describen en el presente documento o conocidos por otros medios en la técnica, tal como genes que codifican secuencias que comprenden las secuencias con el nJ de acceso de GenBank que se refleja en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/363,124, los documentos USSN 10/923,536, y PCT/US03/05028 todos los cuales se incorporan por referencia al presente documento, denominado en el presente documento de forma general secuencias "objetivo". La siguiente descripción de los diversos aspectos y modalidades de la invención se proporciona haciendo referencia a genes objetivo ejemplares denominados en el presente documento genes objetivo. La presente invención también se refiere a compuestos, composiciones, y procedimientos relacionados con rasgos, enfermedades y afecciones que responden a la modulación de la expresión y/o actividad de genes implicados en las rutas de la expresión génica u otros procesos celulares que actúan de mediadores del mantenimiento o desarrollo de dichos rasgos, enfermedades y afecciones. Sin embargo, dicha referencia se pretende que sea únicamente ejemplar y los diversos aspectos y modalidades de la invención también se refieren a otros genes que expresan genes objetivo alternativos, tales como genes objetivo mutantes, variantes de ayuste de genes objetivo, variantes de genes objetivo entre especies o entre sujetos, y otros genes de rutas objetivo que se describen en el presente documento o conocidos por otros medios en la técnica. Dichos genes adicionales pueden analizarse para determinar los sitios objetivo usando los procedimientos que se describen en el presente documento para los genes objetivo y las secuencias ejemplares del presente documento. Así, la modulación y los efectos de dicha modulación de los otros genes puede realizarse tal como se describe en el presente documento. En otras palabras, los términos "objetivo" y "gen objetivo" tal como se definen en el presente documento más adelante y se citan en las modalidades que se describen, se pretende que engloben los genes asociados al desarrollo y/o mantenimiento de enfermedades, rasgos y afecciones del presente documento, tal como genes que codifican polipéptidos, polinucleótidos reguladores (por ejemplo, miARN y siARN), genes mutantes y variantes de ayuste de genes, así como otros genes implicados en las rutas de la expresión y/o actividad génicas. Así, cada unas de las modalidades que se describen en el presente documento con referencia al término "objetivo" son aplicables a todas las moléculas de proteina, péptido, polipéptido, y/o polinucleótido que abarca el término "objetivo", tal y como se define ese término en el presente documento. En conjunto, dichos genes objetivo también se denominan en el presente documento de forma general secuencias "objetivo". En una modalidad, la invención presenta una composición que comprende dos o más moléculas diferentes de siNA y/o inhibidores de ARNi de la invención (por ejemplo, siNA, siNA de formación de moléculas bicatenarias, o siNA multifuncional o cualquier combinación de las mismas) dirigidas a diferentes objetivos polinucleotídicas, tales como diferentes regiones de un ARN o DNA objetivo (por ejemplo, dos sitios objetivo diferentes tal como se proporciona en el presente documento o cualquier combinación de objetivos o rutas objetivo) o tanto objetivos codificantes como no codificantes. Dichos conjuntos de moléculas de siNA pueden proporcionar un mayor efecto terapéutico. En una modalidad, la invención presenta un conjunto de dos o más moléculas diferentes de siNA de la invención (por ejemplo, siNA, siNA de formación de moléculas bicatenarias, o siNA multifuncional o cualquier combinación de las mismas) que tienen especificidad por diferentes objetivos polinucleotídicas, tales como diferentes regiones de ARN o DNA objetivo (por ejemplo, dos sitios objetivo diferentes en el presente documento o cualquier combinación de objetivos o rutas objetivos) o tanto objetivos codificantes como no codificantes, en las que el conjunto comprende moléculas de siNA dirigidas a aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más objetivos diferentes. Debido al potencial de variabilidad de las secuencia en el genoma entre diferentes organismos o diferentes sujetos, la selección de moléculas de siNA para aplicaciones terapéuticas amplias probablemente implicará las regiones conservadas del gen. En una modalidad, la presente invención se refiere a moléculas de siNA y/o inhibidores de ARNi que se dirigen a regiones conservadas del genoma o a regiones que están conservadas entre diferentes objetivos. Las moléculas de siNA y/o los inhibidores de ARNi diseñados para dirigirse a regiones conservadas de diversas objetivos permiten una inhibición eficaz de la expresión de genes objetivo en diversas poblaciones de pacientes. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico, tal como una molécula de siNA, en la que una de las hebras comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos predeterminada en una molécula de ácido nucleico objetivo, o una porción de la misma. La secuencia de nucleótidos predeterminada puede ser una secuencia de nucleótidos objetivo, tal como una secuencia que se describe en el presente documento o conocida en la técnica. En otra modalidad, la secuencia de nucleótidos predeterminada es una secuencia objetivo o secuencia de ruta objetivo tal como es sabido en la técnica. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) que regula por disminución la expresión de un gen objetivo o que dirige la escisión de un ARN objetivo, en el que dicha molécula de siNA comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 28 pares de bases. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) que dirige la escisión de un ARN objetivo, en el que dicha molécula de siNA comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 28 pares de bases. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) que dirige la escisión de un ARN objetivo mediante la interferencia del ARN (ARNi), en el que la molécula bicatenaria de siNA comprende una primera hebra y una segunda hebra, cada hebra de la molécula de siNA tiene de aproximadamente 18 a aproximadamente 28 (por ejemplo, aproximadamente 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, o 28) nucleótidos de longitud, la primera hebra de la molécula de siNA comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una complementariedad suficiente con el ARN objetivo por la molécula de siNA para dirigir la escisión del ARN objetivo mediante interferencia del ARN, y la segunda hebra de dicha molécula de siNA comprende la secuencia de nucleótidos que es complementaria a la primera hebra. En una modalidad específica, por ejemplo, cada hebra de la molécula de siNA tiene de aproximadamente 18 a aproximadamente 27 nucleótidos de longitud. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) que dirige la escisión de un ARN objetivo mediante la interferencia del ARN (ARNi), en el que la molécula bicatenaria de siNA comprende una primera hebra y una segunda hebra, cada hebra de la molécula de siNA tiene de aproximadamente 18 a aproximadamente 23 (por ejemplo, aproximadamente 18, 19, 20, 21 , 22, 23) nucleótidos de longitud, la primera hebra de la molécula de siNA comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una complementariedad suficiente con el ARN objetivo por la molécula de siNA para dirigir la escisión del ARN objetivo mediante interferencia del ARN, y la segunda hebra de dicha molécula de siNA comprende la secuencia de nucleótidos que es complementaria a la primera hebra. En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) bicatenaria sintetizada químicamente que dirige la escisión de un ARN objetivo mediante interferencia del ARN (ARNi), en la que cada hebra de la molécula de siNA tiene de aproximadamente 18 a aproximadamente 28 nucleótidos de longitud; y una hebra de la molécula de siNA comprende una secuencia de nucleótidos que tiene complementariedad suficiente con el ARN objetivo para que la molécula de siNA dirija la escisión del ARN objetivo mediante interferencia del ARN. En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) bicatenaria sintetizada químicamente que dirige la escisión de un ARN objetivo mediante interferencia del ARN (ARNi), en la que cada hebra de la molécula de siNA tiene de aproximadamente 18 a aproximadamente 23 nucleótidos de longitud; y una hebra de la molécula de siNA comprende una secuencia de nucleótidos que tiene complementariedad suficiente con el ARN objetivo para que la molécula de siNA dirija la escisión del ARN objetivo mediante interferencia del ARN. En una modalidad, la invención presenta una molécula de siNA que regula por disminución la expresión de un gen objetivo o que dirige la escisión de un ARN objetivo, por ejemplo, en la que el gen o ARN objetivo comprende una secuencia que codifica proteína. En una modalidad, la invención presenta una molécula de siNA que regula por disminución la expresión de un gen objetivo o que dirige la escisión de un ARN objetivo, por ejemplo, en la que el gen o ARN objetivo comprende una secuencia no codificante o elementos reguladores implicados en la expresión del gen objetivo (por ejemplo, ARN, miARN, stARN etc. no codificantes). En una modalidad, un siNA de la invención se usa para inhibir la expresión de genes objetivo o de una familia de genes objetivo, en la que las secuencias de genes o de las familias génicas comparten homología entre las secuencia. Dichas secuencias homologas pueden identificarse tal como es conocido en la técnica, por ejemplo usando alineación de secuencia. Las moléculas de siNA pueden diseñarse para dirigirse a dichas secuencias homologas, por ejemplo usando secuencias perfectamente complementarias o incorporando pares de bases no canónico, por ejemplo emparejamientos erróneos y/o pares de bases inestables, que pueden proporcionar secuencias objetivo adicionales. En los casos en los que se identifican los emparejamientos erróneos, pueden usarse pares de bases no canónicos (por ejemplo, emparejamientos erróneos y/o bases inestables) para generar moléculas de siNA que se dirigen a más de una secuencia génica. En un ejemplo no limitante, se usan pares de bases no canónicos tales como UU y CC pares de bases para generar moléculas de siNA que presentan capacidad de dirigirse a secuencias para diferenciar entre las objetivos polinucleotídicas que comparten homología entre las secuencias. Como tal, una ventaja del uso de los siNA de la invención es que puede diseñarse un único siNA que incluya una secuencia de ácido nucleico que sea complementaria a la secuencia de nucleótidos conservada entre los genes homólogos. En esta estrategia, puede usarse un único siNA para inhibir la expresión de más de un gen en lugar de usar más de una molécula de siNA para dirigirse a los diferentes genes. En una modalidad, la invención presenta una molécula de siNA que tiene actividad de ARNi contra un ARN objetivo (por ejemplo, ARN codificante o no codificante), en la que la molécula de siNA comprende una secuencia complementaria a cualquier secuencia de ARN, tal como las secuencias que tienen el nJ de acceso de GenBank que se muestra en el documento PCT/US03/05028, la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/363,124, y/o el documento USSN 10/923,536, todos los cuales se incorporan por referencia al presente documento. En otra modalidad, la invención presenta una molécula de siNA que tiene actividad de ARNi contra un ARN objetivo, en la que la molécula de siNA comprende una secuencia complementaria a un ARN que tiene una secuencia que codifica variantes, por ejemplo otros genes mutantes que se conoce en la técnica que están asociados al mantenimiento y/o desarrollo de enfermedades, rasgos, trastornos, y/o afecciones que se describen en el presente documento o conocidos por otros medios en la técnica. Las modificaciones químicas que se muestran en el cuadro I o que se describen por otros medios en el presente documento pueden aplicarse a cualquier construcción de siNA de la invención. En otra modalidad, una molécula de siNA de la invención incluye una secuencia de nucleótidos que puede interactuar con la secuencia de nucleótidos de un gen objetivo y así actuar de mediadora del silenciamiento de la expresión del gen objetivo, por ejemplo, en la que el siNA actúa de mediador en la regulación de la expresión del gen objetivo mediante procesos celulares qué modulan la estructura de la cromatina o patrones de metilación del gen objetivo y previenen la transcripción del gen objetivo. En una modalidad, las moléculas de siNA de la invención se usan para regular por disminución o inhibir la expresión de proteínas que surgen debido a polimorfismos de los aplotipos que están asociadas con un rasgo, enfermedad o afección de un sujeto u organismo. El análisis de genes, o de los niveles de proteína o ARN pueden usarse para identificar sujetos con dichos polimorfismos o los sujetos que presentan riesgo de desarrollar los rasgos, afecciones, o enfermedades que se describen en el presente documento. Estos sujetos pueden someterse a tratamiento, por ejemplo, tratamiento con moléculas de siNA de la invención y cualquier otra composición de utilidad en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la expresión del gen objetivo. Como tal, el análisis de los niveles de proteína o ARN puede usarse para determinar el tipo de tratamiento y el curso del tratamiento para tratar un sujeto. El control de los niveles de proteína o ARN puede usarse para predecir el resultado del tratamiento y para determinar la eficacia de los compuestos y composiciones que modulan el nivel y/o actividad de ciertas proteínas asociadas a un rasgo, trastorno, afección, o enfermedad. En una modalidad de la invención una molécula de siNA comprende una hebra no codificante que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos o una porción de la misma que codifican una proteína objetivo. El siNA comprende además una hebra codificante, en la que dicha hebra codificante comprende una secuencia de nucleótidos de un gen objetivo o una porción de la misma. En otra modalidad, una molécula de siNA comprende una región no codificante que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos que codifican una proteína objetivo o una porción de la misma. La molécula de siNA comprende además una región codificante, en la que dicha región codificante comprende una secuencia de nucleótidos de un gen objetivo o una porción de la misma. En otra modalidad, la invención presenta una molécula de siNA que comprende una secuencia de nucleótidos, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos en la región no codificante de la molécula de siNA que es complementaria a una secuencia de nucleótidos o porción de secuencia de un gen objetivo. En otra modalidad, la invención presenta una molécula de siNA que comprende una región, por ejemplo, la región no codificante de la construcción de siNA, complementaria a una secuencia que comprende una secuencia de un gen objetivo o una porción de la misma. En una modalidad, la región codificante o hebra codificante de una molécula de siNA de la invención es complementaria a esa porción de la región no codificante o hebra no codificante de la molécula de siNA que es complementaria a una secuencia de polinucleótidos objetivo. Todavía en otra modalidad, la invención presenta una molécula de siNA que comprende una secuencia, por ejemplo, la secuencia no codificante de la construcción de siNA, complementaria a una secuencia o porción de secuencia que comprende la secuencia que se representa mediante el nJ de acceso de GenBank que se muestra en el documento PCT/US03/05028, la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/363,124, y/o el documento USSN 10/923,536, todos los cuales se incorporan por referencia al presente documento. Pueden aplicarse las modificaciones químicas del cuadro I y que se describen en el presente documento a cualquier construcción de siNA de la invención. Las formulaciones de LNP que se describen en el cuadro IV pueden aplicarse a cualquier molécula de siNA o combinación de moléculas de siNA en el presente documento. En una modalidad de la invención una molécula de siNA comprende una hebra no codificante que tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) nucleótidos, en la que la hebra no codificante es complementaria a una secuencia de ARN objetivo o a una porción de la misma, y en la que dicho siNA comprende además una hebra codificante que tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) nucleótidos, y en la que dicha hebra codificante y dicha hebra no codificante son secuencias de nucleótidos diferentes donde al menos aproximadamente 15 nucleótidos de cada hebra son complementarios a la otra hebra. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención (por ejemplo, una molécula bicatenaria de ácido nucleico) comprende una hebra no codificante (guía) que tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) nucleótidos que son complementarios a una secuencia de ARN objetivo o una porción de la misma. En una modalidad, al menos 15 nucleótidos (por ejemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 nucleótidos) de una secuencia de ARN objetivo son complementarios a la hebra no codificante (guía) de una molécula de siNA de la invención. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención (por ejemplo, una molécula bicatenaria de ácido nucleico) comprende una hebra codificante (pasajera) que tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) nucleótidos que comprenden una secuencia de un ARN objetivo o una porción de la misma. En una modalidad, al menos 15 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) nucleótidos de una secuencia de ARN objetivo comprenden la hebra codificante (pasajera) de una molécula de siNA de la invención. En otra modalidad de la invención una molécula de siNA de la invención comprende una región no codificante que tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) nucleótidos, en la que la región no codificante es complementaria a una secuencia de DNA objetivo, y en la que dicho siNA comprende además una región codificante que tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) nucleótidos, en la que dicha región codificante y dicha región no codificante están comprendidas en una molécula linear donde la región codificante comprende al menos aproximadamente 15 nucleótidos que son complementarios a la región no codificante.

En una modalidad, una molécula de siNA de la invención tiene actividad de ARNi que modula la expresión de ARN codificada por un gen. Debido a que los genes pueden compartir algún grado homología de las secuencias entre sí, las moléculas de siNA pueden diseñarse para que se dirijan a una clase de genes seleccionando las secuencias que o se comparten entre las diferentes objetivos o de forma alternativa que son únicas para una objetivo específica. Por lo tanto, en una modalidad, la molécula de siNA puede diseñarse para dirigirse a regiones conservadas de secuencias de polinucleótidos objetivo que presentan homología entre diversas variantes génicas de forma que se dirigen a una clase de genes con una molécula de siNA. Por consiguiente, en una modalidad, la molécula de siNA de la invención modula la expresión de una o más isoformas del gen objetivo o sus variantes en un sujeto u organismo. En otra modalidad, la molécula de siNA puede diseñarse para que se dirija a una secuencia que sea única para una secuencia de polinucleótidos específica (por ejemplo, una única isoforma del gen objetivo o polimorfismo de nucleótido único (SNP)) debido al alto grado de especificidad que requiere la molécula de siNA para mediar en la actividad de ARNi. En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención que actúan como mediadoras de la respuesta de silenciamiento génico de interferencia de ARN son moléculas de ácido nucleico bicatenarias. En otra modalidad, las moléculas de siNA de la invención están constituidas por moléculas bicatenarias de ácido nucleico que contienen de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 pares de bases entre oligonucleótidos que comprenden de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) nucleótidos. Todavía en otra modalidad, las moléculas de siNA de la invención comprenden moléculas bicatenarias de ácido nucleico con extremos en colgadura de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2 ó 3) nucleótidos, por ejemplo, aproximadamente 21 nucleótidos en moléculas bicatenarias con aproximadamente 19 pares de bases y colgaduras de mononucleótido, dinucleótido, o trinucleótido en el extremo 3'. Todavía en otra modalidad, las moléculas de siNA de la invención comprenden moléculas bicatenarias de ácido nucleico con extremos romos, en los que ambos extremos son romos o, de forma alternativa donde uno de los extremos es romo. En una modalidad, una molécula bicatenario de ácido nucleico (por ejemplo, siNA) comprende colgaduras nucleotídicas o no nucleotídicas. Por "colgadura" se quiere decir una porción terminal de la secuencia de nucleótidos que no tiene bases pareadas entre las dos hebras de una molécula bicatenaria de ácido nucleico (véase por ejemplo las Figuras 5A-5C). En una modalidad, una molécula bicatenaria de ácido nucleico de la invención puede comprender colgaduras nucleotídicas o no nucleotídicas en el extremo 3' de una o ambas hebras de la molécula bicatenaria de ácido nucleico. Por ejemplo, una molécula bicatenaria de ácido nucleico de la invención puede comprender una colgadura nucleotidica o no nucleotídica en el extremo 3' de la hebra guía o de la hebra/región no codificante, el extremo 3' de la hebra pasajera o hebra/región codificante, o tanto de la hebra guía o hebra/región no codificante como de la hebra pasajera o hebra/región codificante de la molécula bicatenaria de ácido nucleico. En otra modalidad, la porción de colgadura nucleotídica de una molécula bicatenaria de ácido nucleico (siNA) de la invención comprende nucleótidos con 2'-O-metilo, 2'-desoxi, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-desoxi-2'-fluoroarabino (FANA), 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-0-etil-trifluorometoxi, 2'-O-difluorometoxi-etoxi, base universal, acíclicos o con 5-C-metilo. En otra modalidad, la porción de colgadura no nucleotidica de una molécula bicatenaria de ácido nucleico (siNA) de la invención comprende no nucleótidos de glicerilo, abásicos o desoxi abásicos invertidos. En una modalidad, los nucleótidos que comprenden las porciones de colgadura de una molécula bicatenaria ácido nucleico (por ejemplo, siNA) de la invención corresponden a los nucleótidos que comprenden la secuencia objetivo de polinucleótidos de la molécula de siNA. Por consiguiente, en dichas modalidades, los nucleótidos que comprenden la porción de colgadura de una molécula de siNA de la invención comprenden una secuencia que se basa en la secuencia de polinucleótidos objetivo en la que los nucleótidos que comprenden la porción de colgadura de la hebra guía o de la hebra/región no codificante de una molécula de siNA de la invención puede ser complementaria a los nucleótidos de la secuencia objetivo de polinucleótidos y nucleótidos que comprenden la porción de colgadura de la hebra pasajera o la hebra/región codificante de una molécula de siNA de la invención que puede comprender los nucleótidos de la secuencia de polinucleótidos objetivo. Dichas colgaduras nucleotídicas comprenden la secuencia que resultaría de procesar con Dicer un dsARN nativo para producir siARN. En una modalidad, los nucleótidos que comprenden la porción de colgadura de una molécula bicatenaria de ácido nucleico (por ejemplo, siNA) de la invención son complementarios a la secuencia de polinucleótidos objetivo y opcionalmente están modificadas químicamente tal como se describe en el presente documento. Como tal, en una modalidad, los nucleótidos que comprenden la porción de colgadura de la hebra guía o hebra/región no codificante de una molécula de siNA de la invención pueden ser complementarios a los nucleótidos de la secuencia de polinucleótidos objetivo, es decir aquellas posiciones de nucleótidos en la secuencia de polinucleótidos objetivo que son complementarias a las posiciones de nucleótidos de los nucleótidos de colgadura de la hebra guía o hebra/región no codificante de una molécula de siNA. En otra modalidad, los nucleótidos que comprenden la porción de colgadura de la hebra pasajera o hebra/región codificante de una molécula de siNA de la invención pueden comprender los nucleótidos de la secuencia de polinucleótidos colgadura, es decir aquellas posiciones de nucleótidos de la secuencia de polinucleótidos objetivo que corresponden a las mismas posiciones de nucleótidos de los nucleótidos de colgadura de la hebra pasajera o hebra/región codificante de una molécula de siNA. En una modalidad, la colgadura comprende una colgadura de dos nucleótidos (por ejemplo, 3'-GA; 3'-GU; 3'-GG; 3'GC; 3'-CA; 3'-CU; 3'-CG; 3'CC; 3'-UA; 3'-UU; 3'-UG; 3'UC; 3'-AA; 3'-AU; 3'-AG; 3'-AC; 3'-TA; 3'-TU; 3'-TG; 3'-TC; 3'-en; 3'-UT; 3'-GT; 3'-CT) que es complementaria a una porción de la secuencia de polinucleótidos objetivo. En una modalidad, la colgadura comprende una colgadura de dos nucleótidos (por ejemplo, 3'-GA; 3'-GU; 3'-GG; 3'GC; 3'-CA; 3'-CU; 3'-CG; 3'CC; 3'-UA; 3'-UU; 3'-UG; 3'UC; 3'-AA; 3'-AU; 3'-AG; 3'-AC; 3'-TA; 3'-TU; 3'-TG; 3'-TC; 3'-en; 3'-UT; 3'-GT; 3'-CT) que no es complementaria a una porción de la secuencia de polinucleótidos objetivo. En otra modalidad, los nucleótidos de la colgadura de una molécula de siNA de la invención son nucleótidos de 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoroarabino, y/o nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro. En otra modalidad, los nucleótidos de colgadura de una molécula de siNA de la invención son nucleótidos de 2'-O-metilo en el caso en el que los nucleótidos de colgadura sean nucleótidos con purinas y/o nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro o 2'-desoxi-2'-fluoroarabino nucleótidos en el caso en el que los nucleótidos de colgadura sean nucleótidos con pirimidinas. En otra modalidad, el nucleótido con purina (cuando está presente) en una colgadura de una molécula de siNA de la invención es un 2'-O-metil nucleótido. En otra modalidad, el nucleótido con pirimidina (cuando está presente) en una colgadura de una molécula de siNA de la invención es un 2'-desoxi-2'-fluoro o 2'-desoxi-2'-fluoroarabino nucleótido. En una modalidad, los nucleótidos que comprenden la porción de colgadura de una molécula bicatenaria de ácido nucleico (por ejemplo, siNA) de la invención no son complementarios a la secuencia de polinucleótidos objetivo y opcionalmente están modificadas químicamente tal como se describe en el presente documento. En una modalidad, la colgadura comprende una colgadura 3'-UU que no es complementaria a una porción de la secuencia de polinucleótidos objetivo. En otra modalidad, los nucleótidos que comprenden la porción de la colgadura de una molécula de siNA de la invención son nucleótidos de 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoroarabino, y/o nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro. En una modalidad, la molécula bicatenaria nucleica (por ejemplo siNA) de la invención comprende una colgadura de dos o tres nucleótidos, en la que los nucleótidos de la colgadura son iguales o diferentes. En una modalidad, la molécula bicatenaria nucleica ( por ejemplo siNA) de la invención comprende una colgadura de dos o tres nucleótidos, en la que los nucleótidos de la colgadura son iguales o diferentes y en la que uno o más nucleótidos de la colgadura están químicamente modificadas en la base, azúcar y/o esqueleto de fosfato. En una modalidad, la invención presenta una o más construcciones de siNA modificadas químicamente que tienen especificidad por moléculas de ácido nucleico objetivo, tales como DNA, o ARN que codifican una proteína o ARN no codificante asociado a la expresión de genes objetivo. En una modalidad, la invención presenta una molécula de siNA con base de ARN (por ejemplo, un siNA que comprende nucleótidos de 2'-OH) que tiene especificidad por moléculas de ácido nucleico que incluyen una o más modificaciones químicas ques se describen en el presente documento. Ejemplos no limitantes de dichas modificaciones químicas incluyen sin limitación enlaces internucleotídicos de fosfotioato, 2'-desoxirribonucleótidos, 2'-O-metil ribonucleótidos, 2'-desoxi-2'-fluoro ribonucleótidos, 4'-tio ribonucleótidos, nucleótidos de 2'-O-trifluorometilo, nucleótidos de 2'-0-etil-trifluorometoxi, nucleótidos de 2'-O-difluorometoxi-etoxi (véase por ejemplo el documento USSN 10/981 ,966 presentado el 5 de noviembre de 2004, que se incorpora por referencia al presente documento), nucleótidos de "base universal", nucleótidos "acíclicos", 5-C-metil nucleótidos, 2'-desoxi-2'-fluoroarabino (FANA, véase por ejemplo Dowler y cois., 2006, Nucleic Acid Research, 34, 1669-1675) e incorporación de glicerilo terminal y/o restos desoxiabásicos invertidos. Estas modificaciones químicas, cuando se usan en diversas construcciones de siNA, (por ejemplo, construcciones de siNA con base de ARN), se ha demostrado que conservan la actividad de ARNi en las células mientras que a la misma vez aumentan la estabilidad en suero de estos compuestos. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende las modificaciones químicas descritas en el presente documento (por ejemplo, 2'-O-metil ribonucleótidos, 2'-desoxi-2'-fluoro ribonucleótidos, 4'-tio ribonucleótidos, nucleótidos de 2'-O-trifluorometilo, nucleótidos de 2'-0-etil-trifluorometoxi, nucleótidos de 2'-O-difluorometoxi-etoxi, LNA) en las posiciones internas de la molécula de siNA. Por "posición interna" se quiere decir las posiciones de bases pareadas de una molécula bicatenaria de siNA. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende nucleótidos modificados a la vez que mantiene la capacidad de mediar en la ARNi. Los nucleótidos modificados pueden usarse para mejorar las características in vitro o in vivo tales como estabilidad, actividad, toxicidad, respuesta inmunitaria, y/o biodisponibilidad. Por ejemplo, una molécula de siNA de la invención puede comprender nucleótidos modificados en un porcentaje del número total de nucleótidos presentes en la molécula de siNA. Como tal, una molécula de siNA de la invención de forma general puede comprender de aproximadamente 5% a aproximadamente 100% de nucleótidos modificados (por ejemplo, aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de nucleótidos modificados). Por ejemplo, en una modalidad, entre aproximadamente 5% y aproximadamente 100% (por ejemplo, aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de nucleótidos modificados) de las posiciones de nucleótidos en una molécula de siNA de la invención comprenden una modificación del azúcar del ácido nucleico, tal como una modificación de la 2'-azúcar, por ejemplo, nucleótidos de 2'-O-metilo, nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-desoxi-2'-fluoroarabino, nucleótidos de 2'-O-metoxietilo, nucleótidos de 2'-O-trifluorometilo, nucleótidos de 2'-O-etil-trifluorometox¡, nucleótidos de 2'-O-difluorometoxi-etoxi, o nucleótidos de 2'-desoxi. En otra modalidad, entre aproximadamente 5% y aproximadamente 100% (por ejemplo, aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de nucleótidos modificados) de las posiciones de nucleótidos en una molécula de siNA de la invención comprenden una modificación de la base del ácido nucleico, tal como modificaciones de inosina, purina, piridin-4-ona, piridin-2-ona, fenilo, pseudouracilo, 2, 4, 6-trimetoxi benceno, 3-metil uracilo, dihidrouridina, naftilo, aminofenilo, 5-alquilcitidinas (por ejemplo, 5-metilcitidina), 5-alquiluridinas (por ejemplo, ribotimina), 5-halouridina (por ejemplo, 5-bromouridina) o 6-azapirimidinas o 6-alquilpirimidinas (por ejemplo 6-metiluridina), o propino. En otra modalidad, entre aproximadamente 5% y aproximadamente 100% (por ejemplo, aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de nucleótidos modificados) de las posiciones de nucleótidos en una molécula de siNA de la invención comprenden una modificación en el esqueleto del ácido nucleico, tal como una modificación del esqueleto que tiene la Fórmula I en el presente documento. En otra modalidad, entre aproximadamente 5% y aproximadamente 100% (por ejemplo, aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de nucleótidos modificados) de las posiciones de nucleótidos en una molécula de siNA de la invención comprenden una modificación en el azúcar, base, o esqueleto del ácido nucleico o cualquier combinación de las mismas (por ejemplo, cualquier combinación de las modificaciones de azúcar, base, esqueleto o no nucloetidicas del presente documento). En una modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende al menos aproximadamente 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de nucleótidos modificados. El porcentaje real de los nucleótidos modificados presentes en una molécula de siNA dada dependerá del número total de nucleótidos presentes en el siNA. Si la molécula de siNA es monocatenaria, la modificación porcentual puede basarse en el número total de nucleótidos presentes en las moléculas de siNA monocatenarias. Del mismo modo, si la molécula de siNA es bicatenaria, la modificación porcentual puede basarse en el número total de nucleótidos presentes en la hebra codificante, en la hebra no codificante, o tanto en la hebra codificante como en la no codificante. una molécula de siNA de la invención puede comprender nucleótidos modificados en diversas localizaciones dentro de la molécula de siNA. En una modalidad, una molécula bicatenaria de siNA de la invención comprende nucleótidos modificados en las posiciones de bases internas pareadas dentro de la molécula bicatenaria de siNA. Por ejemplo, las posiciones internas pueden comprender posiciones de aproximadamente 3 a aproximadamente 19 nucleótidos desde el extremo 5' de la hebra o región codificante o no codificante de una molécula bicatenaria de siNA de 21 nucleótidos que tiene 19 pares de bases y colgaduras en 3' de dos nucleótidos. En otra modalidad, una molécula bicatenaria de siNA de la invención comprende nucleótidos modificados en las posiciones de bases internas no pareadas o colgaduras de la molécula de siNA. Por "sin bases pareadas" se quiere decir que los nucleótidos no están pareados por bases entre la hebra codificante o región codificante y la hebra no codificante o región no codificante o la molécula de siNA. Los nucleótidos de colgadura pueden ser complementarios o estar pareados por bases en una secuencia de polinucleótidos objetivo correspondiente (véase por ejemplo la Figura 5C). Por ejemplo, las posiciones de colgadura pueden comprender posiciones de aproximadamente 20 a aproximadamente 21 nucleótidos desde el extremo 5' de la hebra o región codificante o no codificante de una molécula bicatenaria de siNA de 21 nucleótidos que tiene 19 pares de bases y colgaduras en 3' de dos nucleótidos. En otra modalidad, una molécula bicatenaria de siNA de la invención comprende nucleótidos modificados en las posiciones terminales de la molécula de siNA. Por ejemplo, dichas regiones terminales incluyen la posición 3', la posición 5', para las posiciones 3' y 5' de la hebra o región codificante y/o no codificante de la molécula de siNA. En otra modalidad, una molécula bicatenaria de siNA de la invención comprende nucleótidos modificados en las posiciones pareadas internas, sin bases pareadas o regiones de colgadura y/o regiones terminales o cualquier combinación de las mismas. Un aspecto de la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) que regula por disminución la expresión de un gen objetivo o que dirige la escisión de un ARN objetivo. En una modalidad, la molécula bicatenaria de siNA comprende una o más modificaciones químicas y cada hebra del siNA bicatenario tiene de aproximadamente 21 nucleótidos de longitud. En una modalidad, la molécula bicatenaria de siNA no contiene ningún ribonucleótido. En otra modalidad, la molécula bicatenaria de siNA comprende uno o más ribonucleótidos. En una modalidad, cada hebra de la molécula bicatenaria de siNA independientemente comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) nucleótidos, en la que cada hebra comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) nucleótidos que son complementarios a los nucleótidos de la otra hebra. En una modalidad, una de las hebras de la molécula bicatenaria de siNA comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos o a una porción de la misma del gen objetivo, y la segunda hebra de la molécula bicatenaria de siNA comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente similar a la secuencia de nucleótidos del gen objetivo o a una porción de la misma. En otra modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) que regula por disminución la expresión de un gen objetivo o que dirige la escisión de un ARN objetivo, que comprende una región no codificante, en la que la región no codificante comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos del gen objetivo o a una porción de la misma, y una región codificante, en la que la región codificante comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente similar a la secuencia de nucleótidos del gen objetivo o una porción de la misma. En una modalidad, la región no codificante y la región codificante independientemente comprenden de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) nucleótidos, en la que la región no codificante comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) nucleótidos que son complementarios a nucleótidos de la región codificante. En otra modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) que regula por disminución la expresión de un gen objetivo o que dirige la escisión de un ARN objetivo, que comprende una región codificante y una región no codificante, en la que la región no codificante comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de ARN codificada por el gen objetivo o una porción de la misma y la región codificante comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la región no codificante. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende extremos romos, es decir, extremos que no incluyen nucleótidos en colgadura. Por ejemplo, una molécula de siNA— que comprende modificaciones que se describen en el presente documento (por ejemplo, que comprende nucleótidos que tienen las Fórmulas l-VII o construcciones de siNA que comprenden "Estab 00"-"Estab 36" o "Estab 3F"-"Estab 36F" (Tabla I) o cualquier combinación de las mismas) y/o cualquier longitud que se describe en el presente documento puede comprender extremos romos o extremos sin nucleótidos en colgadura. En una modalidad, cualquier molécula de siNA de la invención puede comprender uno o más extremos romos, es decir donde un extremo romo no tiene ningún nucleótido en colgadura. En una modalidad, la molécula de siNA de extremos romos tiene un número de pares de bases igual al número de nucleótidos presente en cada hebra de la molécula de siNA. En otra modalidad, la molécula de siNA comprende un extremo romo, por ejemplo en la que el extremo 5' de la hebra no codificante y el extremo 3' de la hebra codificante no tienen nucleótidos en colgadura. En otro ejemplo, la molécula de siNA comprende un extremo romo, por ejemplo, en la que el extremo 3' de la hebra no codificante y el extremo 5' de la hebra codificante no tienen nucleótidos en colgadura. En otro ejemplo, una molécula de siNA comprende dos extremos romos, por ejemplo, en la que el extremo 3' de la hebra no codificante y el extremo 5' de la hebra codificante así como el extremo 5' de la hebra no codificante y el extremo 3' de la hebra codificante no tienen nucleótidos en colgadura. Una molécula de extremos romos de siNA puede comprender, por ejemplo, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 nucleótidos). Otros nucleótidos presentes en una molécula de siNA de extremos romos puede comprender, por ejemplo, emparejamientos erróneos, protuberancias, bucles, o pares de bases inestables para modular la actividad de la molécula de siNA para mediar en la interferencia del ARN. Por "extremos romos" se quiere extremos simétricos o extresmos de una molécula bicatenaria de siNA que no tienen nucleótidos en colgadura. Las dos hebras de una molécula bicatenaria de siNA se alinean entre sí sin nucleótidos colgantes en los extremos. Por ejemplo, una construcción de siNA de extremos romos comprende nucleótidos en los extremos que son complementarios entre las regiones codificantes y no codificantes de la molécula de siNA. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) que regula por disminución la expresión de un gen objetivo o que dirige la escisión de un ARN objetivo, en la que la molécula de siNA se monta a partir de dos fragmentos oligonucleotídicos separados en la que un fragmento comprende la región codificante y el segundo fragmento comprende la región no codificante de la molécula de siNA. La región codificante puede conectarse a la región no codificante mediante una molécula enlazadora, tal como un enlace polinucleotídico o un enlace no polinucleotídico. En una modalidad, una molécula bicatenaria de ácido nucleico (por ejemplo, siNA) de la invención comprende ribonucleótidos en las posiciones que mantienen o potencian la actividad de ARNi. En una modalidad, los ribonucleótidos están presentes en la hebra codificante o región codificante de la molécula de siNA, que pueden proporcionar actividad de ARNi al permitir la escisión de la hebra codificante o región codificante por una enzima dentro de RISC (por ejemplo, ribonucleótidos presentes en la posición de la hebra pasajera, la hebra codificante, o la escisión de la región codificante, tal como la posición 9 de la hebra pasajera de una molécula bicatenaria de 19 pares de bases, que se escinde del RISC mediante una enzima AGO2, véase, por ejemplo, Matranga y cois, de 2005, Cell, 123:1-114 y Rand y cois, de 2005, Cell, 123:621-629). En otra modalidad, uno o más (por ejemplo 1 , 2, 3, 4 ó 5) de los nucleótidos del extremo 5' de la hebra guía o de la región guía (también conocida como hebra no codificante o región no codificante) de la molécula de siNA son ribonucleótidos. En una modalidad, una molécula bicatenaria de ácido nucleico (por ejemplo, siNA) de la invención comprende uno o más ribonucleótidos en posiciones de la hebra pasajera o región pasajera (también conocida como hebra codificante o región codificante) que permite la escisión de la hebra pasajera o de la región pasajera mediante una enzima en el complejo RISC, (por ejemplo, ribonucleótidos presentes en una posición de hebra pasajera, tal como la posición 9 de la hebra pasajera de una molécula bicatenaria de 19 pares de bases que se escinde en el RISC, véase, por ejemplo, Matranga y cois, de 2005, Cell, 123:1-114 y Rand y cois, de 2005, Cell, 123:621-629). En una modalidad, una molécula de siNA de la invención contiene al menos 2, 3, 4, 5, o más modificaciones químicas que pueden ser iguales o diferentes. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención contiene al menos 2, 3, 4, 5, o más modificaciones químicas diferentes. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención es un ácido nucleico corto de interferencia (siNA) bicatenario, en la que la molécula bicatenaria de ácido nucleico comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) pares de bases, y en la que uno o más (por ejemplo, al menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) de las posiciones de nucleótidos en cada hebra de la molécula de siNA comprende una modificación química. En otra modalidad, el siNA contiene al menos 2, 3, 4, 5, o más modificaciones químicas diferentes. En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) bicatenaria que regula por disminución la expresión de un gen objetivo o que dirige la escisión de un ARN objetivo, en la que la molécula de siNA comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) pares de bases, y en la que cada hebra de la molécula de siNA comprende una o más modificaciones químicas. En una modalidad, cada hebra de la molécula bicatenaria de siNA comprende al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o más) modificaciones químicas diferentes, por ejemplo, diferentes modificaciones de nucleótidos, azúcares, bases o esqueleto. En otra modalidad, una de las hebras de la molécula bicatenaria de siNA comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de un gen objetivo o a una porción de la misma, y la segunda hebra de la molécula bicatenaria de siNA comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente similar a la secuencia de nucleótidos o a una porción de la misma del gen objetivo. En otra modalidad, una de las hebras de la molécula bicatenaria de siNA comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de un gen objetivo o a una porción de la misma, y la segunda hebra de la molécula bicatenaria de siNA comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente similar a la secuencia de nucleótidos o a una porción de la misma del gen objetivo. En otra modalidad, cada hebra de la molécula de siNA comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) nucleótidos, y cada hebra comprende al menos de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) nucleótidos que son complementarios a los nucleótidos de la otra hebra. El gen objetivo puede comprender, por ejemplo, secuencias a las que se hace referencia en el presente documento o que se incorporan al presente documento por referencia. El gen puede comprender, por ejemplo, secuencias denominado según el número de acceso de GenBank en el presente documento. En una modalidad, cada hebra de una molécula bicatenaria de siNA de la invención comprende un patrón de modificaciones químicas diferente, tal como cualquier patrón de modificación de "Estab 00"-"Estab 36" o "Estab 3F"-"Estab 36F" (Tabla I) del presente documento o cualquier combinación de las mismas. Ejemplos no limitantes de hebras codificantes y no codificantes de dichas moléculas de siNA que tienen diversos patrones de modificación se muestran en el cuadro II y en las Figuras 3A-3F y 4A-4F. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención no comprende ribonucleótidos. En otra modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende uno o más ribonucleótidos (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más ribonucleótidos). En una modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende una región no codificante que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de un gen objetivo o una porción de la misma, y el siNA comprende además una región codificante que comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente similar a la secuencia de nucleótidos del gen objetivo o una porción de la misma. En otra modalidad, la región no codificante y la región codificante cada una comprenden de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) nucleótidos y la región no codificante comprende al menos de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) nucleótidos que son complementarios a los nucleótidos de la región codificante. En una modalidad, cada hebra de la molécula bicatenaria de siNA comprende al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o más) modificaciones químicas diferentes, por ejemplo, diferentes modificaciones de nucleótidos, azúcares, bases o esqueleto. El gen objetivo puede comprender, por ejemplo, secuencias a las que se hace referencia en el presente documento o que se incorporan al presente documento por referencia. En otra modalidad, el siNA es una molécula bicatenaria de ácido nucleico, donde cada una de las dos hebras de la molécula de siNA independientemente comprenden de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 (por ejemplo aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 23, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ó 40) nucleótidos, y donde una de las hebras de la molécula de siNA comprende al menos aproximadamente 15 (por ejemplo aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24 o 25 o más) nucleótidos que son complementarios a la secuencia de ácido nucleico del gen objetivo o una porción de la misma. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende una región codificante y una región no codificante, en la que la región no codificante comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de ARN codificada por un gen objetivo, o una porción de la misma, y la región codificante comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la región no codificante. En una modalidad, la molécula de siNA se monta a partir de dos fragmentos oligonucleotídicos diferentes, en la que un fragmento comprende la región codificante y el segundo fragmento comprende la región no codificante de la molécula de siNA. En otra modalidad, la región codificante se conecta a la región no codificante mediante una molécula enlazadora. En otra modalidad, la región codificante se conecta a la región no codificante mediante una molécula enlazadora, tal como un enlace nucleotídico o no polinucleotídico. En una modalidad, cada hebra de la molécula bicatenaria de siNA comprende al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o más) modificaciones químicas diferentes, por ejemplo, diferentes modificaciones de nucleótidos, azúcares, bases o esqueleto. El gen objetivo puede comprender, por ejemplo, secuencias a las que se hace referencia en el presente documento o que se incorporan al presente documento por referencia. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende una o más (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) modificaciones de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina (por ejemplo, donde una o más o todas las posiciones de pirimidina (por ejemplo, U o C) del siNA están modificadas con nucleótidos de 2'-desox¡-2'-fluoro). En una modalidad, las modificaciones de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina están presentes en la hebra codificante. En una modalidad, las modificaciones de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina están presentes en la hebra no codificante. En una modalidad, las modificaciones de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina están presentes tanto en la hebra codificante como en la hebra no codificante de la molécula de siNA. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende una o más (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) modificaciones 2'-O-metil purina (por ejemplo, donde una o más o todas las posiciones de purina (por ejemplo, A o G) del siNA están modificadas con nucleótidos de 2'-O-metilo). En una modalidad, las modificaciones de 2'-O-metil purina están presentes en la hebra codificante. En una modalidad, las modificaciones de 2'-O-metil purina están presentes en la hebra no codificante. En una modalidad, las modificaciones de 2'-O-metil purina están presentes tanto en la hebra codificante como en la hebra no codificante de la molécula de siNA. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende una o más (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) modificaciones 2'-desoxi purina (por ejemplo, donde una o más o todas las posiciones de purina (por ejemplo, A o G) del siNA están modificadas con 2'-desoxi nucleótidos). En una modalidad, las modificaciones de 2'-desoxi purina están presentes en la hebra codificante. En una modalidad, las modificaciones de 2'-desoxi purina están presentes en la hebra no codificante. En una modalidad, las modificaciones de 2'-desoxi purina están presentes tanto en la hebra codificante como en la hebra no codificante de la molécula de siNA. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) que regula por disminución la expresión de un gen objetivo o que dirige la escisión de un ARN objetivo, que comprende una región codificante y una región no codificante, en la que la región no codificante comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de ARN codificada por el gen objetivo o una porción de la misma y la región codificante comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la región no codificante y en la que la molécula de siNA tiene uno o más nucleótidos de pirimidina y/o purina. En una modalidad, cada hebra de la molécula bicatenaria de siNA comprende al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o más) modificaciones químicas diferentes, por ejemplo, diferentes modificaciones de nucleótidos, azúcares, bases o esqueleto. En una modalidad, los nucleótidos de pirimidina en la región codificante son nucleótidos de 2'-O-metil pirimidina o nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina y los nucleótidos de purina presentes en la región codificante son nucleótidos de 2'-desoxi purina. En otra modalidad, los nucleótidos de pirimidina de la región codificante son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina y los nucleótidos de purina presentes en la región codificante son nucleótidos de 2'-O-metil purina. En otra modalidad, los nucleótidos de pirimidina de la región codificante son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina y los nucleótidos de purina presentes en la región codificante son nucleótidos de 2'-desoxi purina. En una modalidad, los nucleótidos de pirimidina de la región no codificante son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina y los nucleótidos de purina presentes en la región no codificante son nucleótidos de 2'-O-metilo o 2'-desoxi purina. En otra modalidad de cualquiera de las moléculas de siNA descritas anteriormente, cualesquiera nucleótidos presentes en una región no complementaria de la hebra codificante (por ejemplo región de colgadura) son región de 2'-desoxi.

En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) que regula por disminución la expresión de un gen objetivo o que dirige la escisión de un ARN objetivo, en la que la molécula de siNA se monta a partir de dos fragmentos oligonucleotídicos separados en la que un fragmento comprende la región codificante y el segundo fragmento comprende la región no codificante de la molécula de siNA, y en la que el fragmento que comprende la región codificante incluye un resto caperuza terminal en el extremo 5', el extremo 3', o en ambos de los extremos 5' y 3' del fragmento. En una modalidad, el resto caperuza terminal es un resto desoxiabásico invertido o un resto glicerilo. En una modalidad, cada uno de los dos fragmentos de la molécula de siNA independientemente comprenden de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) nucleótidos. En otra modalidad, cada uno de los dos fragmentos de la molécula de siNA independientemente comprenden de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 (por ejemplo aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 23, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ó 40) nucleótidos. En un ejemplo no limitante, cada uno de los dos fragmentos de la molécula de siNA comprenden aproximadamente 21 nucleótidos. En una modalidad, la invención presenta una molécula de siNA que comprende al menos un nucleótido modificado, en la que el nucleótido modificado es un nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-desoxi-2'-fluoroarabino, nucleótido de 2'-O-trifluorometilo, nucleótido de 2'-O-etil-trifluorometoxi o nucleótido de 2'-O-difluorometoxi-etox¡ o cualquier otro nucleósido/nucleótido modificado que se describe en el presente documento y en el documento USSN 10/981 ,966, presentado 5 de noviembre de 2004, que se incorpora por referencia al presente documento. En una modalidad, la invención presenta una molécula de siNA que comprende al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9J0, o más) nucleótidos modificados, en la que el nucleótido modificado se selecciona del grupo constituido por nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoro, nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoroarabino, nucleótido de 2'-O-trifluorometilo, nucleótido de 2'-O-etil-trifluorometoxi o nucleótido de 2'-O-difluorometoxi-etoxi o cualquier otro nucleósido/nucleótido modificado que se describe en el presente documento y en el documento USSN 10/981 ,966, presentado 5 de noviembre de 2004, que se incorpora por referencia al presente documento. El nucleótido/nucleósido modificado puede ser igual o diferente. El siNA puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 nucleótidos de longitud. En una modalidad, todos los nucleótidos de pirimidina presentes en el siNA son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-desoxi-2'-fluoroarabino, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi, 4'-tio pirimidina. En una modalidad, los nucleótidos modificados del siNA incluyen al menos un nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoro citidina o 2'-desoxi-2'-fluoro uridina. En otra modalidad, los nucleótidos modificados del siNA incluyen al menos un nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoro citidina y al menos uno de 2'-desoxi-2'-fluoro uridina. En una modalidad, todos los nucleótidos de uridina presentes en el siNA son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro uridina. En una modalidad, todos los nucleótidos de citidina presentes en el siNA son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro citidina. En una modalidad, todos los nucleótidos de adenosina presentes en el siNA son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro adenosina. En una modalidad, todos los nucleótidos de guanosina presentes en el siNA son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro guanosina. El siNA puede comprender además al menos un enlace internucleotídico modificado, tal como un enlace fosforotioato. En una modalidad, los nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro están presentes en localizaciones del siNA seleccionadas específicamente que son sensibles a la escisión por las ribonucleasas, tales como localizaciones que tienen nucleótidos de pirimidina. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento de aumentar la estabilidad de una molécula de siNA contra la escisión por las ribonucleasas que comprende introducir al menos un nucleótido modificado en la molécula de siNA, en la que el nucleótido modificado es un nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoro. En una modalidad, todos los nucleótidos de pirimidina presentes en el siNA son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina. En una modalidad, los nucleótidos modificados del siNA incluyen al menos un nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoro citidina o 2'-desoxi-2'-fluoro uridina. En otra modalidad, los nucleótidos modificados del siNA incluyen al menos un nucleótido de 2'-fluoro citidina y al menos uno de 2'-desoxi-2'-fluoro uridina. En una modalidad, todos los nucleótidos de uridina presentes en el siNA son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro uridina. En una modalidad, todos los nucleótidos de citidina presentes en el siNA son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro citidina. En una modalidad, todos los nucleótidos de adenosina presentes en el siNA son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro adenosina. En una modalidad, todos los nucleótidos de guanosina presentes en el siNA son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro guanosina. El siNA puede comprender además al menos un enlace internucleotídico modificado, tal como un enlace fosforotioato. En una modalidad, los nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro están presentes en localizaciones del siNA seleccionadas específicamente que son sensibles a la escisión por las ribonucleasas, tales como localizaciones que tienen nucleótidos de pirimidina. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento de aumentar la estabilidad de una molécula de siNA contra la escisión por las ribonucleasas que comprende introducir al menos un nucleótido modificado en la molécula de siNA, en la que el nucleótido modificado es un nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoroarabino. En una modalidad, todos los nucleótidos de pirimidina presentes en el siNA son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoroarabino pirimidina. En una modalidad, los nucleótidos modificados del siNA incluyen al menos un nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoroarabino citidina o 2'-desoxi-2'-fluoro uridina. En otra modalidad, los nucleótidos modificados del siNA incluyen al menos un nucleótido de 2'-fluoro citidina y al menos uno de 2'-desoxi-2'-fluoroarabino uridina. En una modalidad, todos los nucleótidos de uridina presentes en el siNA son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoroarabino uridina. En una modalidad, todos los nucleótidos de citidina presentes en el siNA son nucleótidos de 2'- desoxi-2'-fluoroarabino citidina. En una modalidad, todos los nucleótidos de adenosina presentes en el siNA son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoroarabino adenosina. En una modalidad, todos los nucleótidos de guanosina presentes en el siNA son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoroarabino guanosina. El siNA puede comprender además al menos un enlace internucleotidico modificado, tal como un enlace fosforotioato. En una modalidad, los nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoroarabino están presentes en localizaciones del siNA seleccionadas específicamente que son sensibles a la escisión por las ribonucleasas, tales como localizaciones que tienen nucleótidos de pirimidina. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) que regula por disminución la expresión de un gen objetivo o que dirige la escisión de un ARN objetivo, que comprende una región codificante y una región no codificante, en la que la región no codificante comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de ARN codificada por el gen objetivo o una porción de la misma y la región codificante comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la región no codificante y en la que los nucleótidos de purina presentes en la región no codificante comprende nucleótidos de 2'-desoxi-purina. En una modalidad alternativa, los nucleótidos de purina presentes en la región no codificante comprenden nucleótidos de 2'-O-metil purina. En cualquiera de las modalidades anteriores, la región no codificante puede comprender un enlace internucleotídico de fosforotioato en el extremo 3' de la región no codificante.

De forma alternativa, en cualquiera de las modalidades anteriores, la región no codificante puede comprender una modificación de glicerilo en el extremo 3' de la región no codificante. En otra modalidad de cualquiera de las moléculas de siNA descritas anteriormente, cualesquiera nucleótidos presentes en una región no complementaria de la hebra no codificante (por ejemplo región de colgadura) son región de 2'-desoxi. En una modalidad, la región no codificante de una molécula de siNA de la invención comprende una secuencia complementaria a una porción de un transcrito endógeno que tiene una secuencia única para un alelo relacionado con una enfermedad o rasgo particular en un sujeto u organismo, comprendiendo dicha secuencia a polimorfismo nucleotídico único (SNP) asociado al alelo específico de la enfermedad o rasgo. Como tal, la región no codificante de una molécula de siNA de la invención puede comprender una secuencia complementaria a secuencias que son exclusivas de un alelo particular para proporcionar especificidad en la mediación de ARNi selectiva contra el alelo relacionado con la enfermedad, afección o rasgo. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) que regula por disminución la expresión de un gen objetivo o que dirige la escisión de un ARN objetivo, en la que la molécula de siNA se monta a partir de dos fragmentos oligonucleotidicos separados en la que un fragmento comprende la región codificante y el segundo fragmento comprende la región no codificante de la molécula de siNA. En una modalidad, cada hebra de la molécula bicatenaria de siNA tiene de aproximadamente 21 nucleótidos de longitud donde aproximadamente 19 nucleótidos de cada fragmento de la molécula de siNA están emparejados con los nucleótidos complementarios del otro fragmento de la molécula de siNA, en la que al menos dos nucleótidos del extremo 3' de cada fragmento de la molécula de siNA no están emparejados a los nucleótidos del otro fragmento de la molécula de siNA. En otra modalidad, la molécula de siNA es una molécula bicatenaria de ácido nucleico, donde cada hebra tiene de aproximadamente 19 nucleótido de longitud y donde los nucleótidos de cada fragmento de la molécula de siNA están emparejados con los nucleótidos complementarios del otro fragmento de la molécula de siNA formando al menos aproximadamente 15 (por ejemplo, 15, 16, 17, 18, o 19) pares de bases, en la que uno o ambos extremos de la molécula de siNA son extremos romos. En una modalidad, cada uno de los dos nucleótidos del extremo 3' de cada fragmento de la molécula de siNA es un nucleótido de 2'-desoxi-pirimidina, tal como una 2'-desoxi-timina. En una modalidad, cada uno de los dos nucleótidos del extremo 3' de cada fragmento de la molécula de siNA es un nucleótido de 2'-O-metil pirimidina, tal como una 2'-O-metil uridina, citidina o timina. En otra modalidad, todos los nucleótidos de cada fragmento de la molécula de siNA están emparejados con los nucleótidos complementarios del otro fragmento de la molécula de siNA. En otra modalidad, la molécula de siNA es una molécula bicatenaria de ácido nucleico de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 pares de bases que tiene una región codificante y una región no codificante, donde aproximadamente 19 nucleótidos de la región no codificante están emparejados con la secuencia de nucleótidos o con una porción de la misma del ARN codificado por el gen objetivo. En otra modalidad, aproximadamente 21 nucleótidos de la región no codificante están emparejados con la secuencia de nucleótidos o una porción de la misma del ARN codificado por el gen objetivo. En cualquiera de las modalidades anteriores, el extremo 5' del fragmento que comprende dicha región no codificante opcionalmente puede incluir un grupo fosfato. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) que inhibe la expresión de una secuencia de ARN objetivo, en la que la molécula de siNA no contiene ningún ribonucleótido y en la que cada hebra de la molécula bicatenaria de siNA tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos. En una modalidad, la molécula de siNA es de 21 nucleótidos de longitud. Ejemplos de construcciones de siNA que no contienen ribonucleótidos son las combinaciones de las estructuras de estabilización que se muestran en el cuadro I en cualquier combinación de estructuras codificantes/no codificantes, tales como Estab 7/8, Estab 7/11 , Estab 8/8, Estab 18/8, Estab 18/11 , Estab 12/13, Estab 7/13, Estab 18/13, Estab 7/19, Estab 8/19, Estab 18/19, Estab 7/20, Estab 8/20, Estab 18/20, Estab 7/32, Estab 8/32, o Estab 18/32 (por ejemplo, cualquier siNA que tiene Estab 7, 8, 11 , 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20 ó 32 hebras codificantes o no codificantes o cualquier combinación de las mismas). En el presente documento, las estructuras de Estab numéricas pueden incluir tanto versiones de 2'-fluoro como de 2'-OCF3 de las estructuras que se muestran en el cuadro I. Por ejemplo, "Estab 7/8" se refiere tanto a Estab 7/8 como a Estab 7F/8F etc. En una modalidad, la invención presenta a molécula de ARN bicatenario sintetizada químicamente que dirige la escisión de un ARN objetivo mediante interferencia del ARN, en la que cada hebra de dicha molécula de ARN tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud; una hebra de la molécula de ARN comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una complementariedad suficiente con el ARN objetivo para que la molécula de ARN dirija la escisión del ARN objetivo mediante interferencia del ARN; y en la que al menos una hebra de la molécula de ARN opcionalmente comprende uno o más nucleótidos químicamente modificados que se describen en el presente documento, tal como sin limitación los desoxinucleótidos, nucleótidos de 2'-O-metilo, nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoroarabino, nucleótidos de 2'-O-metoxietilo, nucleótidos de 4'-tio, nucleótidos de 2'-O-trifluorometilo, nucleótidos de 2'-O-etil-trifluorometoxi, nucleótidos de 2'-O-difluorometoxi-etoxi, etc. o cualquier combinación de los mismos. En una modalidad, un ARN objetivo de la invención comprende una secuencia que codifica una proteína. En una modalidad, el ARN objetivo de la invención comprende una secuencia de ARN no codificante (por ejemplo, miARN, snARN, siARN etc.), véase por ejemplo Mattick de 2005, Science, 309, 1527-1528; Claverie de 2005, Science, 309, 1529-1530; Sethupathy y cois., 2006, ARN, 12, 192- 197; y Czech, 2006 NEJM, 354, 11 : 1194-1195. En una modalidad, la invención presenta un medicamento que comprende una molécula de siNA de la invención. En una modalidad, la invención presenta un principio activo que comprende una molécula de siNA de la invención. En una modalidad, la invención presenta el uso de una molécula bicatenaria de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) para inhibir, regular por disminución, o reducir la expresión de un gen objetivo, en la que la molécula de siNA comprende una o más modificaciones químicas y cada hebra del siNA bicatenario es independientemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 o más (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 o más) nucleótidos de longitud. En una modalidad, la molécula de siNA de la invención es una molécula bicatenaria de ácido nucleico que comprende una o más modificaciones químicas, donde cada uno de los dos fragmentos de la molécula de siNA independientemente comprenden de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 (por ejemplo aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 23, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ó 40) nucleótidos y donde una de las hebras comprende al menos 15 nucleótidos que son complementarios a una secuencia de nucleótidos de ARN que codifica una objetivo o una porción de la misma. En un ejemplo no limitante, cada uno de los dos fragmentos de la molécula de siNA comprenden aproximadamente 21 nucleótidos. En otra modalidad, la molécula de siNA es una molécula bicatenaria de ácido nucleico que comprende una o más modificaciones químicas, donde cada hebra es aproximadamente de 21 nucleótidos de longitud y donde aproximadamente 19 nucleótidos de cada fragmento de la molécula de siNA están emparejados con los nucleótidos complementarios del otro fragmento de la molécula de siNA, en la que al menos dos nucleótidos del extremo 3' de cada fragmento de la molécula de siNA no están emparejados a los nucleótidos del otro fragmento de la molécula de siNA. En otra modalidad, la molécula de siNA es una molécula bicatenaria de ácido nucleico que comprende una o más modificaciones químicas, donde cada hebra tiene de aproximadamente 19 nucleótido de longitud y donde los nucleótidos de cada fragmento de la molécula de siNA están emparejados con los nucleótidos complementarios del otro fragmento de la molécula de siNA formando al menos aproximadamente 15 (por ejemplo, 15, 16, 17, 18, o 19) pares de bases, en la que uno o ambos extremos de la molécula de siNA son extremos romos. En una modalidad, cada uno de los dos nucleótidos del extremo 3' de cada fragmento de la molécula de siNA es un nucleótido de 2'-desoxi-pirimidina, tal como una 2'-desoxi-timina. En una modalidad, cada uno de los dos nucleótidos del extremo 3' de cada fragmento de la molécula de siNA es un nucleótido de 2'-O-metil pirimidina, tal como una 2'-O-metil uridina, citidina o timina. En otra modalidad, todos los nucleótidos de cada fragmento de la molécula de siNA están emparejados con los nucleótidos complementarios del otro fragmento de la molécula de siNA. En otra modalidad, la molécula de siNA es una molécula bicatenaria de ácido nucleico de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 pares de bases que tiene una región codificante y comprende una o más modificaciones químicas y una región no codificante, donde aproximadamente 19 nucleótidos de la región no codificante están emparejados con la secuencia de nucleótidos o con una porción de la misma del ARN codificado por el gen objetivo. En otra modalidad, aproximadamente 21 nucleótidos de la región no codificante están emparejados con la secuencia de nucleótidos o una porción de la misma del ARN codificado por el gen objetivo. En cualquiera de las modalidades anteriores, el extremo 5' del fragmento que comprende dicha región no codificante opcionalmente puede incluir un grupo fosfato. En una modalidad, la invención presenta el uso de una molécula bicatenaria de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) que inhibe, regula por disminución, o reduce la expresión de un gen objetivo, en la que una de las hebras de la molécula bicatenaria de siNA es una hebra no codificante que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de ARN objetivo o a una porción de la misma, la otra hebra es una hebra codificante que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de la hebra no codificante. En una modalidad, cada hebra tiene al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o más) modificaciones químicas, que pueden ser iguales o diferentes, tal como modificaciones de nucleótidos, azúcares, bases, o esqueleto. En una modalidad, una mayoría de los nucleótidos de pirimidina presentes en la molécula bicatenaria de siNA comprende una modificación en el azúcar. En una modalidad, una mayoría de los nucleótidos de purina presentes en la molécula bicatenaria de siNA comprende una modificación en el azúcar. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) que inhibe, regula por disminución, o reduce la expresión de un gen objetivo, en la que una de las hebras de la molécula bicatenaria de siNA es una hebra no codificante que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de ARN objetivo o a una porción de la misma, en la que la otra hebra es una hebra codificante que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de la hebra no codificante. En una modalidad, cada hebra tiene al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o más) modificaciones químicas, que pueden ser iguales o diferentes, tal como modificaciones de nucleótidos, azúcares, bases, o esqueleto. En una modalidad, una mayoría de los nucleótidos de pirimidina presentes en la molécula bicatenaria de siNA comprende una modificación en el azúcar. En una modalidad, una mayoría de los nucleótidos de purina presentes en la molécula bicatenaria de siNA comprende una modificación en el azúcar. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) que inhibe, regula por disminución, o reduce la expresión de un gen objetivo, en la que una de las hebras de la molécula bicatenaria de siNA es una hebra no codificante que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de ARN objetivo que codifica una proteína o porción de la misma, la otra hebra es una hebra codificante que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de la hebra no codificante y en la que una mayoria de los nucleótidos de pirimidina presentes en la molécula bicatenaria de siNA comprende una modificación en el azúcar. En una modalidad, cada hebra de la molécula de siNA comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 o más (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 o más) nucleótidos, en la que cada hebra comprende al menos aproximadamente 15 nucleótidos que son complementarios a los nucleótidos de la otra hebra. En una modalidad, la molécula de siNA se monta a partir de dos fragmentos oligonucleotídicos, en la que un fragmento comprende la secuencia de nucleótidos de la hebra no codificante de la molécula de siNA y un segundo fragmento comprende la secuencia de nucleótidos de la región codificante de la molécula de siNA. En una modalidad, la hebra codificante se conecta a la hebra no codificante mediante una molécula enlazadora, tal como un enlace polinucleotídico o un enlace no polinucleotídico. En una modalidad adicional, los nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra codificante son nucleótidos de 2'-desoxi-2'fluoro pirimidina y los nucleótidos de purina presentes en la región codificante son nucleótidos de 2'-desoxi purina. En una modalidad adicional, los nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra codificante son nucleótidos de 2'-desoxi-2'fluoro pirimidina y los nucleótidos de purina presentes en la región codificante son nucleótidos de 2'-O-metil purina. En todavía otra modalidad, los nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra no codificante son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina y cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra no codificante son nucleótidos de 2'-desoxi purina. En otra modalidad, la hebra no codificante comprende uno o más nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina y uno o más nucleótidos de 2'-O-metil purina. En otra modalidad, los nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra no codificante son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina y cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra no codificante son nucleótidos de 2'-O-metil purina. En una modalidad adicional la hebra codificante comprende un extremo 3' y un extremo 5', en la que un resto caperuza terminal (por ejemplo, un resto desoxiabásico invertido o resto nucleotídico desoxi invertido tal como timina invertida) está presente en el extremo 5', el extremo 3', o ambos de los extremos 5' y 3' de la hebra codificante. En otra modalidad, la hebra no codificante comprende un enlace internucleotídico de fosforotioato en el extremo 3' de la hebra no codificante. En otra modalidad, la hebra no codificante comprende una modificación de glicerilo en el extremo 3'. En otra modalidad, el extremo 5' de la hebra no codificante opcionalmente incluye un grupo fosfato. En cualquiera de las modalidades descritas anteriormente de una molécula bicatenaria de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) que inhibe la expresión de un gen objetivo, en la que una mayoría de los nucleótidos de pirimidina presentes en la molécula bicatenaria de siNA comprende una modificación en el azúcar, cada una de las dos hebras de la molécula de siNA puede comprender de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 o más (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 o más) nucleótidos. En una modalidad, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 o más (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 o más) nucleótidos de cada hebra de la molécula de siNA están emparejados con los nucleótidos complementarios de la otra hebra de la molécula de siNA. En otra modalidad, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 o más (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 o más) nucleótidos de cada hebra de la molécula de siNA están emparejados con los nucleótidos complementarios de la otra hebra de la molécula de siNA, en la que al menos dos nucleótidos del extremo 3' de cada hebra de la molécula de siNA no están emparejados a los nucleótidos de la otra hebra de la molécula de siNA. En otra modalidad, cada uno de los dos nucleótidos del extremo 3' de cada fragmento de la molécula de siNA es una 2'-desoxi-pirimidina, tal como 2'-desoxi-timina. En una modalidad, cada hebra de la molécula de siNA está emparejada a los nucleótidos complementarios de la otra hebra de la molécula de siNA. En una modalidad, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) nucleótidos de la hebra no codificante están emparejados con la secuencia de nucleótidos del ARN objetivo o una porción de la misma. En una modalidad, de aproximadamente 18 a aproximadamente 25 (por ejemplo, aproximadamente 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24 ó 25) nucleótidos de la hebra no codificante están emparejados con la secuencia de nucleótidos del ARN objetivo o una porción de la misma. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) que inhibe la expresión de un gen objetivo, en la que una de las hebras de la molécula bicatenaria de siNA es una hebra no codificante que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de ARN objetivo o a una porción de la misma, la otra hebra es una hebra codificante que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de la hebra no codificante. En una modalidad, cada hebra tiene al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o más) modificaciones químicas diferentes, tales como modificaciones de nucleótidos, azúcares, bases o esqueleto. En una modalidad, una mayoría de los nucleótidos de pirimidina presentes en la molécula bicatenaria de siNA comprende una modificación en el azúcar. En una modalidad, una mayoría de los nucleótidos de purina presentes en la molécula bicatenaria de siNA comprende una modificación en el azúcar. En una modalidad, el extremo 5' de la hebra no codificante opcionalmente incluye un grupo fosfato. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) que inhibe la expresión de un gen objetivo, en la que una de las hebras de la molécula bicatenaria de siNA es una hebra no codificante que comprende la secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de ARN objetivo o a una porción de la misma, la otra hebra es una hebra codificante que comprende la secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de la hebra no codificante y en la que una mayoría de los nucleótidos de pirimidina presentes en la molécula bicatenaria de siNA comprende una modificación en el azúcar, y en la que la secuencia de nucleótidos o una porción de la misma de la hebra no codificante es complementaria a una secuencia de nucleótidos de la región sin traducir o una porción de la misma del ARN objetivo. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) que inhibe la expresión de un gen objetivo, en la que una de las hebras de la molécula bicatenaria de siNA es una hebra no codificante que comprende la secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de ARN objetivo o una porción de la misma, en la que la otra hebra es una hebra codificante que comprende la secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de la hebra no codificante, en la que una mayoría de los nucleótidos de pirimidina presentes en la molécula bicatenaria de siNA comprende una modificación en el azúcar, y en la que la secuencia de nucleótidos de la hebra no codificante es complementaria a una secuencia de nucleótidos del ARN objetivo o una porción de la misma que está presente en el ARN objetivo.

En una modalidad, la invención presenta una composición que comprende una molécula de siNA de la invención y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención presenta dos o más moléculas diferentes de siNA de la invención (por ejemplo moléculas de siNA que se dirigen contra diferentes regiones del ARN objetivo o moléculas de siNA que se dirigen contra el ARN de la ruta de SREBP1) y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En un ejemplo no limitante, la introducción de nucleótidos modificados químicamente en las moléculas de ácido nucleico proporciona una herramienta poderosa para superar las potenciales limitaciones de la estabilidad y biodisponibilidad in vivo inherentes a las moléculas de ARN nativo que se administran de forma exógena. Por ejemplo, el uso de moléculas de ácido nucleico modificadas químicamente puede permitir una dosis menor de una molécula particular de ácido nucleico para un efecto terapéutico dado ya que las moléculas de ácido nucleico modificadas químicamente tienden a tener una semivida mayor en suero. Además, ciertas modificaciones quimicas pueden mejorar la biodisponibilidad de las moléculas de ácido nucleico al dirigirse contra células o tejidos particulares y/o mejorar la captación celular de la molécula de ácido nucleico. Por lo tanto, incluso si se reduce la actividad de una molécula de ácido nucleico modificada químicamente comparada con la de una molécula de ácido nucleico nativa, por ejemplo, cuando se compara con una molécula de ácido nucleico formada totalmente por ARN, la actividad global de la molécula de ácido nucleico modificada puede ser superior a la de la molécula nativa debido a una mejor estabilidad y/o administración de la molécula. Al contrario que el siNA nativo sin modificar, el siNA modificado químicamente también puede minimizar la posibilidad de activar la actividad de interferones o de la inmunoestimulación en seres humanos. Estas propiedades por lo tanto mejoran la capacidad del siARN nativo o del siARN con modificaciones mínimas para actuar de mediador de la ARNi en diversos entornos in vitro e in vivo, que incluyen el uso tanto para aplicaciones de investigación como terapéuticas. El solicitante describe en el presente documento moléculas de siNA químicamente modificadas con actividad de ARNi mejorada comparada con moléculas de siARN sin modificar o mínimamente modificadas. Los motivos de siNA sin modificar o mínimamente modificados que se describen en el presente documento proporcionan la capacidad de mantener la actividad de ARNi que es sustancialmente similar a siARN sin modificar o mínimamente modificado (véase por ejemplo Elbashir y cois., 2001 , EMBO J., 20: 6877-6888) mientras que a la vez se proporciona resistencia a nucleasas y propiedades farmacocinéticas adecuadas para usar en aplicaciones terapéuticas. En cualquiera de las modalidades de moléculas de siNA que se describen en el presente documento, la región no codificante de una molécula de siNA de la invención puede comprender un enlace internucleotídico de fosforotioato en el extremo 3' de dicha región no codificante. En cualquiera de las modalidades de moléculas de siNA que se describen en el presente documento, la región no codificante puede comprender de aproximadamente uno a aproximadamente cinco enlaces internucleotídicos de fosfotioato en el extremo 5" de dicha región no codificante. En cualquiera de las modalidades de moléculas de siNA que se describen en el presente documento, las colgaduras nucleotídicas del extremo 3' de una molécula de siNA de la invención puede comprender ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos que están modificados químicamente en una azúcar, base, o esqueleto del ácido nucleico. En cualquiera de las modalidades de moléculas de siNA que se describen en el presente documento, las colgaduras nucleotídicas del extremo 3' pueden comprender uno o más ribonucleótidos base universales. En cualquiera de las modalidades de moléculas de siNA que se describen en el presente documento, las colgaduras nucleotídicas del extremo 3' pueden comprender uno o más nucleótidos acíclicos. Una modalidad de la invención proporciona un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una molécula de siNA de la invención de forma que permite la expresión de la molécula de ácido nucleico. Otra modalidad de la invención proporciona una célula de mamífero que comprende dicho vector de expresión. La célula de mamífero puede ser una célula humana. La molécula de siNA del vector de expresión puede comprender una región codificante y una región no codificante. La región no codificante puede comprender una secuencia complementaria a una secuencia de ARN o DNA que codifica una objetivo y la región codificante puede comprender una secuencia complementaria a la región no codificante. La molécula de siNA puede comprender dos hebras diferentes que tienen regiones codificantes y no codificantes complementarias. La molécula de siNA puede comprender una única hebra que tiene regiones codificantes y no codificantes complementarias. En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente con capacidad de mediar en la interferencia del ARN (ARNi) en el interior de una célula o un sistema reconstituido in vitro, en la que la modificación química comprende uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) nucleótidos que comprenden un enlace ¡nternucleotídico con esqueleto modificado que tiene la Fórmula I: w en la que cada R1 y R2 es independientemente cualquier nucleótido, no nucleótido, o polinucleótido que puede ser natural o modificado químicamente y que puede estar incluido en la estructura de la molécula de siNA o servir de punto de unión a la molécula de siNA, cada X e Y es independientemente O, S, N, alquilo, o alquilo sustituido, cada Z y W es independientemente O, S, N, alquilo, alquilo sustituido, O-alquilo, S-alquilo, alcarilo, aralquilo, o acetilo y en la que W, X, Y, y Z opcionalmente no son todos O. En otra modalidad, una modificación del esqueleto de la invención comprende un enlace internucleotídico fosfonoacetato y/o tiofosfonoacetato (véase por ejemplo Sheehan y cois, de 2003, Nucleic Acid Research, 31 , 4109-4118). Los enlaces internucleotídicos modificados químicamente que tienen la Fórmula I, por ejemplo, en la que cualquier Z, W, X, y/o Y independientemente comprenden un átomo de azufre, pueden estar presentes en una o ambas hebras oligonucleotídicas de la molécula bicatenaria de siNA, por ejemplo, en la hebra codificante, la hebra no codificante, o ambas hebras. Las moléculas de siNA de la invención pueden comprender uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) enlaces internucleotídicos modificados químicamente que tienen la Fórmula I en el extremo 3', el extremo 5', o ambos extremos 3' y 5' de la hebra codificante, la hebra no codificante, o ambas hebras. Por ejemplo, una molécula de siNA de la invención ejemplar puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, o más) enlaces internucleotídicos modificados químicamente que tienen la Fórmula I en el extremo 5' de la hebra codificante, la hebra no codificante, o ambas hebras. En otro ejemplo no limitante, una molécula de siNA de la invención ejemplar puede comprender uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) nucleótidos de pirimidina con enlaces internucleotídicos modificados químicamente que tienen la Fórmula I en la hebra codificante, la hebra no codificante, o ambas hebras. Todavía en otro ejemplo no limitante, una molécula de siNA de la invención ejemplar puede comprender uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) nucleótidos de purina con enlaces internucleotídicos modificados químicamente que tienen la Fórmula I en la hebra codificante, la hebra no codificante, o ambas hebras. En otra modalidad, una molécula de siNA de la invención que tiene enlace(s) internucleotídico(s) de la Fórmula I también comprende un nucleótido o no nucleótido modificado químicamente que tiene cualquiera de las Fórmulas I-VI I. En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente con capacidad de mediar en la interferencia del ARN (ARNi) en el interior de una célula o un sistema reconstituido in vitro, en la que la modificación química comprende uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) nucleótidos o no nucleótidos que tienen la Fórmula I: en la que cada R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10, R11 y R12 es independientemente H, OH, alquilo, alquilo sustituido, alcarilo o aralquilo, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCH3, OCN, O-alquilo, S-alquilo, N-alquilo, O-alquenilo, S-alquenilo, N-alquenilo, SO-alquilo, alquil-OSH, alquil-OH, O-alquil-OH, O-alquil-SH, S-alquil-OH, S-alquil-SH, alquil-S-alquilo, alquil-O-alquilo, ONO2, NO2, N3, NH2, aminoalquilo, aminoácido, aminoacilo, ONH2, O-aminoalquilo, O-aminoácido, O-aminoacilo, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, o un grupo que tiene cualquiera de las Fórmulas I, II, lll, IV, V, VI y/o Vil, cualquiera de las cuales puede estar incluida en la estructura de la molécula de siNA o servir de punto de unión a la molécula de siNA; R9 es O, S, CH2, S=O, CHF, o CF2, y B es una base nucleosídica tal como adenina, guanina, uracilo, citosina, timina, 2-aminoadenosina, 5-metilcitosina, 2,6-diaminopurina, o cualquier otra base no natural que puede ser complementaria o no complementaria a un ARN objetivo o una base no nucleosídica tal como fenilo, naftilo, 3-nitropirrol, 5-nitroindol, nebularina, piridona, piridinona, o cualquier otra base universal no natural que puede ser complementaria o no complementaria a un ARN objetivo. En una modalidad, R3 y/o R7 comprenden un resto conjugado y un enlazador (por ejemplo, un enlace polinucleotidico o no polinucleotídico tal como se describe en el presente documento o conocidos por otros medios en la técnica). Ejemplos no limitantes de restos conjugados incluyen ligandos para receptores celulares, tales como péptidos derivados a partir de ligandos proteínicos naturales; secuencias de localización de proteínas, que incluyen secuencias de código postal celulares; anticuerpos; aptámeros de ácidos nucleicos; vitaminas y otros cofactores, tales como folato y N-acetilgalactosamina; polímeros, tales como polietilenglicol (PEG); fosfolípidos; colesterol; esteroides, y poliaminas, tales como PEÍ, espermina o espermidina. En una modalidad, un nucleótido de la invención que tiene la Fórmula II es un nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoro. En una modalidad, un nucleótido de la invención que tiene la Fórmula II es un nucleótido de 2'-O-metilo. En una modalidad, un nucleótido de la invención que tiene la Fórmula II es un nucleótido de 2'-desoxi. El nucleótido o no nucleótido modificado químicamente de la Fórmula II puede estar presente en una o ambas hebras oligonucleotídicas de la molécula bicatenaria de siNA, por ejemplo en la hebra codificante, la hebra no codificante, o ambas hebras. Las moléculas de siNA de la invención pueden comprender uno o más nucleótidos o no nucleótidos modificados químicamente de la Fórmula II en el extremo 3', el extremo 5', o ambos extremos 3' y 5' de la hebra codificante, la hebra no codificante, o ambas hebras. Por ejemplo, una molécula de siNA de la invención ejemplar puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, o más) nucleótidos o no nucleótidos modificados químicamente de la Fórmula II en el extremo 5' de la hebra codificante, la hebra no codificante, o ambas hebras. En otro ejemplo no limitante, una molécula de siNA de la invención ejemplar puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, o más) nucleótidos o no nucleótidos modificados químicamente de la Fórmula II en el extremo 3' de la hebra codificante, la hebra no codificante, o ambas hebras. En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente con capacidad de mediar en la interferencia del ARN (ARNi) en el interior de una célula o un sistema reconstituido in vitro, en la que la modificación química comprende uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) nucleótidos o no nucleótidos que tienen la Fórmula II: en la que cada R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10, R11 y R12 es independientemente H, OH, alquilo, alquilo sustituido, alcarilo o aralquilo, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCH3, OCN, O-alquilo, S-alquilo, N-alquilo, O-alquenilo, S-alquenilo, N-alquenilo, SO-alquilo, alquil-OSH, alquil-OH, O-alquil-OH, O-alquil-SH, S-alquil-OH, S-alquil-SH, alquil-S-alquilo, alquil-O-alquilo, ONO2, NO2, N3, NH2, aminoalquilo, aminoácido, aminoacilo, ONH2, O-aminoalquilo, O-aminoácido, O-aminoacilo, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, o un grupo que tiene cualquiera de las Fórmulas I, II, lll, IV, V, VI y/o Vil, cualquiera de las cuales puede estar incluida en la estructura de la molécula de siNA o servir de punto de unión a la molécula de siNA; R9 es O, S, CH2, S=O, CHF, o CF2, y B es una base nucleosídica tal como adenina, guanina, uracilo, citosina, timina, 2-aminoadenosina, 5-metilcitosina, 2,6-diaminopurina, o cualquier otra base no natural que puede emplearse para ser complementaria o no complementaria a un ARN objetivo o una base no nucleosídica tal como fenilo, naftilo, 3-nitropirrol, 5-nitroindol, nebularina, piridona, piridinona, o cualquier otra base universal no natural que puede ser complementaria o no complementaria a un ARN objetivo. En una modalidad, R3 y/o R7 comprenden un resto conjugado y un enlazador (por ejemplo, un enlace polinucleotídico o no polinucleotídico tal como se describe en el presente documento o conocidos por otros medios en la técnica). Ejemplos no limitantes de restos conjugados incluyen ligandos para receptores celulares, tales como péptidos derivados a partir de ligandos proteínicos naturales; secuencias de localización de proteínas, que incluyen secuencias de código postal celulares; anticuerpos; aptámeros de ácidos nucleicos; vitaminas y otros cofactores, tales como folato y N-acetilgalactosamina; polímeros, tales como polietilenglicol (PEG); fosfolípidos; colesterol; esferoides, y poliaminas, tales como PEÍ, espermina o espermidina. El nucleótido o no nucleótido modificado químicamente de la Fórmula lll puede estar presente en una o ambas hebras oligonucleotídicas de la molécula bicatenaria de siNA, por ejemplo en la hebra codificante, la hebra no codificante, o ambas hebras. Las moléculas de siNA de la invención pueden comprender uno o más nucleótidos o no nucleótidos modificados químicamente de la Fórmula lll en el extremo 3', el extremo 5', o ambos extremos 3' y 5' de la hebra codificante, la hebra no codificante, o ambas hebras. Por ejemplo, una molécula de siNA de la invención ejemplar puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, o más) nucleótido(s) o no nucleótido(s) modificado(s) químicamente de la Fórmula lll en el extremo 5' de la hebra codificante, la hebra no codificante, o ambas hebras. En otro ejemplo no limitante, una molécula de siNA de la invención ejemplar puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, o más) nucleótidos o no nucleótidos modificados químicamente de la Fórmula lll en el extremo 3' de la hebra codificante, la hebra no codificante, o ambas hebras. En otra modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende un nucleótido que tiene la Fórmula II o lll, en la que el nucleótido que tiene la Fórmula II o lll está en una configuración invertida. Por ejemplo, el nucleótido que tiene la Fórmula II o lll se conecta a la construcción de siNA en una configuración 3'-3', 3'-2', 2'-3', o 5'-5', tal como en el extremo 3', el extremo 5', o ambos extremos 3' y 5' de una o ambas siNA hebras. En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente con capacidad de mediar en la interferencia del ARN (ARNi) en el interior de una célula o sistema reconstituido in vitro, en la que la modificación química comprende un grupo fosfato en el extremo 5' que tiene la Fórmula IV: en la que cada X e Y es independientemente O, S, N, alquilo, alquilo sustituido, o alquilhalo; en la que cada Z y W es independientemente O, S, N, alquilo, alquilo sustituido, O-alquilo, S-alquilo, alcarilo, aralquilo, alquilhalo, o acetilo; y en la que W, X, Y y Z opcionalmente no son todos O e Y actúa de punto de unión a la molécula de siNA. En una modalidad, la invención presenta una molécula de siNA que tiene un grupo fosfato en el extremo 5' que tiene la Fórmula IV en la hebra complementaria objetivo, por ejemplo, una hebra complementaria a un ARN objetivo, en la que la molécula de siNA comprende una molécula de siNA toda de ARN. En otra modalidad, la invención presenta una molécula de siNA que tiene un grupo fosfato en el extremo 5' que tiene la Fórmula IV en la hebra complementaria objetivo en la que la molécula de siNA también comprende colgaduras nucleotídicas de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2 ó 3) nucleótidos en el extremo 3' que tienen de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3 0 4) desoxirribonucleótidos en el extremo 3' de una o ambas hebras. En otra modalidad, un grupo fosfato en el extremo 5' que tiene la Fórmula IV está presente en la hebra complementaria objetivo de una molécula de siNA de la invención, por ejemplo una molécula de siNA que tiene modificaciones químicas que tienen cualquiera de las Fórmulas I-VI I. En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente con capacidad de mediar en la interferencia del ARN (ARNi) en el interior de una célula o sistema reconstituido in vitro, en la que la modificación química comprende uno o más enlaces internucleotidicos de fosfotioato. Por ejemplo, en un ejemplo no limitante, la invención presenta un ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificado químicamente que tiene aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más enlaces internucleotidicos de fosfotioato en una hebra del siNA. Todavía en otra modalidad, la invención presenta un ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificado químicamente que individualmente tiene aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más enlaces internucleotídicos de fosfotioato en ambas hebras de siNA. Los enlaces internucleotídicos de fosfotioato pueden estar presentes en una o ambas hebras oligonucleotídicas de la molécula bicatenaria de siNA, por ejemplo en la hebra codificante, la hebra no codificante, o ambas hebras. Las moléculas de siNA de la invención pueden comprender uno o más enlaces internucleotídicos de fosfotioato en el extremo 3', el extremo 5', o ambos extremos 3' y 5' de la hebra codificante, la hebra no codificante, o ambas hebras. Por ejemplo, una molécula de siNA de la invención ejemplar puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, o más) enlaces internucleotídicos de fosfotioato consecutivos en el extremo 5' de la hebra codificante, la hebra no codificante, o ambas hebras. En otro ejemplo no limitante, una molécula de siNA de la invención ejemplar puede comprender uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) enlaces internucleotídicos de pirimidina fosfotioato en la hebra codificante, la hebra no codificante, o ambas hebras. Todavía en otro ejemplo no limitante, una molécula de siNA de la invención ejemplar puede comprender uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) enlaces internucleotídicos de purina fosfotioato en la hebra codificante, la hebra no codificante, o ambas hebras. Cada hebra de la molécula bicatenaria de siNA puede tener una o más modificaciones químicas de tal forma que cada hebra comprende un patrón diferente de modificaciones químicas. En el presente documente se proporcionan diversos ejemplos no limitantes de esquemas de modificación que podrían dar lugar a diferentes patrones de modificaciones. En una modalidad, la invención presenta una molécula de siNA, en la que la hebra codificante comprende uno o más, por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más enlaces internucleotídicos de fosfotioato, y/o uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) 2'-desoxi, 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, 2'-O-difluorometoxi-etoxi y/o aproximadamente uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) nucleótidos modificados de bases universales, y opcionalmente una molécula caperuza terminal en el extremo 3', el extremo 5', o ambos extremos 3' y 5' de la hebra codificante; y en la que la hebra no codificante comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 o más, de forma específica aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más enlaces internucleotídicos de fosfotioato, y/o uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) 2'-desoxi, 2'-O-metilo, 2'- desoxi-2'-fluoro, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, 2'-O-difluorometoxi-etoxi, 4'-tio y/o uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) nucleótidos de bases universales modificados, y opcionalmente una molécula caperuza terminal en el extremo 3', el extremo 5', o ambos extremos 3' y 5' de la hebra no codificante. En otra modalidad, uno o más, por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más, nucleótidos de pirimidina de la hebra codificante y/o no codificante de siNA están modificados químicamente con nucleótidos de 2'-desoxi, 2'-O-metilo, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, 2'-O-difluorometoxi-etoxi, 4'-tio y/o 2'-desoxi-2'-fluoro, estando presentes o no uno o más, por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más, enlaces internucleotídicos de fosfotioato y/o una molécula caperuza terminal en el extremo 3', el extremo 5', o ambos extremos 3' y 5', en la misma hebra o en una diferente. En otra modalidad, la invención presenta una molécula de siNA, en la que la hebra codificante comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, de forma específica aproximadamente 1 , 2, 3, 4, o 5 enlaces internucleotídicos de fosfotioato, y/o uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, o más) 2'-desoxi, 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-et¡l-trifluorometoxi, 2'-O-difluorometoxi-etoxi, 4'-tio y/o uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, o más) nucleótidos de bases universales modificados, y opcionalmente una molécula caperuza terminal en el extremo 3', el extremo 5', o ambos extremos 3' y 5' de la hebra codificante; y en la que la hebra no codificante comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más, de forma específica aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, o más enlaces internucleotídicos de fosfotioato, y/o uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) 2'-desoxi, 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-trifluorometilo, 2'-0-etil-trifluorometoxi, 2'-O-difluorometoxi-etoxi, 4'-tio y/o uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) nucleótidos de bases universales modificados, y opcionalmente una molécula caperuza terminal en el extremo 3', el extremo 5', o ambos extremos 3' y 5' de la hebra no codificante. En otra modalidad, uno o más, por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más, nucleótidos de pirimidina de la hebra codificante y/o no codificante de siNA están modificados químicamente con 2'-desoxi, 2'-O-metilo, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, 2'-O-difluorometoxi-etoxi, 4'-tio y/o nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, estando presentes de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más, por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5 o más, enlaces internucleotídicos de fosfotioato y/o una molécula caperuza terminal en el extremo 3', el extremo 5', o ambos extremos 3' y 5', en la misma hebra o en una diferente. En una modalidad, la invención presenta una molécula de siNA, en la que la hebra no codificante comprende uno o más, por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más enlaces internucleotídicos de fosfotioato, y/o aproximadamente uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) 2'-desoxi, 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, 2'-O- difluorometoxi-etoxi, 4'-tio y/o uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) nucleótidos de bases universales modificados, y opcionalmente una molécula caperuza terminal en el extremo 3', el extremo 5', o ambos extremos 3' y 5' de la hebra codificante; y en la que la hebra no codificante comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 o más, de forma específica aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más enlaces internucleotídicos de fosfotioato, y/o uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) 2'-desoxi, 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, 2'-O-difluorometoxi-etoxi, 4'-tio y/o uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) nucleótidos de bases universales modificados, y opcionalmente una molécula caperuza terminal en el extremo 3', el extremo 5', o ambos extremos 3' y 5' de la hebra no codificante. En otra modalidad, uno o más, por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más, nucleótidos de pirimidina de la hebra codificante y/o no codificante de siNA están modificados químicamente con nucleótidos de 2'-desoxi, 2'-O-metilo, 2J-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, 2'-O-difluorometoxi-etoxi, 4'-tio y/o 2'-desoxi-2'-fluoro, estando presentes o no uno o más, por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más, enlaces internucleotídicos de fosfotioato y/o una molécula caperuza terminal en el extremo 3', el extremo 5', o ambos extremos 3' y 5', en la misma hebra o en una diferente. En otra modalidad, la invención presenta una molécula de siNA, en la que la hebra no codificante comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más, de forma específica aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5 o más enlaces internucleotídicos de fosfotioato, y/o uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) 2'-desoxi, 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, 2'-O-difluorometoxi-etoxi, 4'-tio y/o uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) nucleótidos de bases universales modificados, y opcionalmente una molécula caperuza terminal en el extremo 3', el extremo 5', o ambos extremos 3' y 5' de la hebra codificante; y en la que la hebra no codificante comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más, de forma específica aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5 o más enlaces internucleotídicos de fosfotioato, y/o uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) 2'-desoxi, 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, 2'-O-difluorometoxi-etoxi, 4'-tio y/o uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) nucleótidos de bases universales modificados, y opcionalmente una molécula caperuza terminal en el extremo 3', el extremo 5', o ambos extremos 3' y 5' de la hebra no codificante. En otra modalidad, uno o más, por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más, nucleótidos de pirimidina de la hebra codificante y/o no codificante de siNA están modificados químicamente con nucleótidos de 2'-desoxi, 2'-O-metilo, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, 2'-O-difluorometoxi-etoxi, 4'-tio y/o 2'-desoxi-2'-fluoro, estando presentes de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5 o más, enlaces internucleotídicos de fosfotioato y/o una molécula caperuza terminal en el extremo 3', el extremo 5', o ambos extremos 3' y 5', en la misma hebra o en una diferente. En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente que tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más (de forma específica aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5 o más) enlaces internucleotídicos de fosfotioato en cada hebra de la molécula de siNA. En otra modalidad, la invención presenta una molécula de siNA que comprende enlaces internucleotídicos 2'-5'. El/Ios enlace(s) internucleotídico(s) 2'-5' pueden estar en el extremo 3', el extremo 5', o ambos extremos 3' y 5' de una o ambas hebras de la secuencia de siNA. Además, los enlace(s) internucleotídico(s) 2'-5' pueden estar presentes en diversas posiciones diferentes dentro de una o ambas hebras de la secuencia de siNA, por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más que incluyen todos los enlaces internucleotídicos de un nucleótido de pirimidina en una o ambas hebras de la molécula de siNA pueden comprender un enlace internucleotídico 2'-5', o aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más que incluyen todos los enlaces internucleotídicos de un nucleótido de purina en una o ambas hebras de la molécula de siNA pueden comprender un enlace internucleotídico 2'-5'. En otra modalidad, una molécula de siNA modificada químicamente de la invención comprende una molécula bicatenaria que tiene dos hebras, uno o ambas de las cuales puede estar modificada químicamente, en la que cada hebra es independientemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) nucleótidos de longitud, en la que la molécula bicatenaria tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) pares de bases, y en la que la modificación química comprende una estructura que tiene cualquiera de las Fórmulas I-VI I. Por ejemplo, una molécula de siNA modificada químicamente ejemplar de la invención comprende una molécula bicatenaria que tiene dos hebras, uno o ambas de las cuales puede estar modificada químicamente con una modificación química que tiene cualquiera de las Fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas, en la que cada hebra está constituida por aproximadamente 21 nucleótidos, teniendo cada una 1 colgadura nucleotídica de 2 nucleótidos en el extremo 3' y en la que la molécula bicatenaria tiene aproximadamente 19 pares de bases. En otra modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende una estructura de horquilla monocatenaria, en la que el siNA tiene de aproximadamente 36 a aproximadamente 70 (por ejemplo, aproximadamente 36, 40, 45, 50, 55, 60, 65, o 70) nucleótidos de longitud que tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) pares de bases, y en la que el siNA puede incluir una modificación química que comprende una estructura que tiene cualquiera de las Fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, una molécula de siNA modificada químicamente ejemplar de la invención comprende un oligonucleótido lineal que tiene de aproximadamente 42 a aproximadamente 50 (por ejemplo, aproximadamente 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50) nucleótidos que está modificada químicamente con una modificación química que tiene cualquiera de las Fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas, en la que el oligonucleótido lineal forma una estructura de horquilla que tiene de aproximadamente 19 a aproximadamente 21 (por ejemplo, 19, 20 ó 21) pares de bases y una colgadura nucleotídica de 2 nucleótidos en el extremo 3'. En otra modalidad, una molécula de siNA de horquilla lineal de la invención contiene un motivo de bucle en tallo, en el que la porción de bucle de la molécula de siNA es biodegradable. Por ejemplo, una molécula de siNA de horquilla lineal de la invención se diseña de tal forma que la degradación de la porción de bucle de la molécula de siNA in vivo pueda generar una molécula bicatenaria de siNA con colgaduras en el extremo 3', tales como colgaduras nucleotídicas en el extremo 3' que comprenden aproximadamente 2 nucleótidos. En otra modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende una estructura de horquilla, en la que el siNA tiene de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 (por ejemplo, aproximadamente 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50) nucleótidos de longitud que tiene de aproximadamente 3 a aproximadamente 25 (por ejemplo, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24 ó 25) pares de bases, y en la que el siNA puede incluir una o más modificaciones quimicas que comprenden una estructura que tiene cualquiera de las Fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, una molécula de siNA modificada químicamente ejemplar de la invención comprende un oligonucleótido lineal que tiene de aproximadamente 25 a aproximadamente 35 (por ejemplo, aproximadamente 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, o 35) nucleótidos que está modificada químicamente con una o más modificaciones químicas que tienen cualquiera de las Fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas, en la que el oligonucleótido lineal forma una estructura de horquilla que tiene de aproximadamente 3 a aproximadamente 25 (por ejemplo, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24 ó 25) pares de bases y un grupo fosfato en el extremo 5' que puede estar químicamente modificado tal como se describe en el presente documento (por ejemplo un grupo fosfato en el extremo 5' que tiene la Fórmula IV). En otra modalidad, una molécula de siNA de horquilla lineal de la invención contiene un motivo de bucle en tallo, en el que la porción de bucle de la molécula de siNA es biodegradable. En una modalidad, una molécula de siNA de horquilla lineal de la invención comprende una porción de bucle que comprende un enlace no polinucleotídico. En otra modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende una estructura de horquilla asimétrica, en la que el siNA tiene de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 (por ejemplo, aproximadamente 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50) nucleótidos de longitud que tiene de aproximadamente 3 a aproximadamente 25 (por ejemplo, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24 ó 25) pares de bases, y en la que el siNA puede incluir una o más modificaciones químicas que comprenden una estructura que tiene cualquiera de las Fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, una molécula de siNA modificada químicamente ejemplar de la invención comprende un oligonucleótido lineal que tiene de aproximadamente 25 a aproximadamente 35 (por ejemplo, aproximadamente 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, o 35) nucleótidos que está modificada químicamente con una o más modificaciones químicas que tienen cualquiera de las Fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas, en la que el oligonucleótido lineal forma una estructura de horquilla asimétrica que tiene de aproximadamente 3 a aproximadamente 25 (por ejemplo, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24 ó 25) pares de bases y un grupo fosfato en el extremo 5' que puede estar químicamente modificado tal como se describe en el presente documento (por ejemplo un grupo fosfato en el extremo 5' que tiene la Fórmula IV). En otra modalidad, una molécula de siNA de horquilla lineal de la invención contiene un motivo de bucle en tallo, en el que la porción de bucle de la molécula de siNA es biodegradable. En otra modalidad, una molécula de siNA de horquilla asimétrica de la invención comprende una porción de bucle que comprende un enlace no polinucleotídico.

En otra modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende una estructura bicatenaria asimétrica que tiene diferentes hebras polinucleotídicas que comprenden regiones codificantes y no codificantes, en la que la región no codificante tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) nucleótidos de longitud, en la que la región codificante tiene de aproximadamente 3 a aproximadamente 25 (por ejemplo, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24 ó 25) nucleótidos de longitud, en la que la región codificante y la región no codificante tienen al menos 3 nucleótidos complementarios, y en la que el siNA puede incluir una o más modificaciones químicas que comprenden una estructura que tiene cualquiera de las Fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, una molécula de siNA modificada químicamente ejemplar de la invención comprende una estructura bicatenaria asimétrica que tiene diferentes hebras polinucleotídicas que comprenden regiones codificantes y no codificantes, en la que la región no codificante tiene de aproximadamente 18 a aproximadamente 23 (por ejemplo, aproximadamente 18, 19, 20, 21 , 22, o 23) nucleótidos de longitud y en la que la región codificante tiene de aproximadamente 3 a aproximadamente 15 (por ejemplo, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, o 15) nucleótidos de longitud, en la que la región codificante y la región no codificante tienen al menos 3 nucleótidos complementarios, y en la que el siNA puede incluir una o más modificaciones químicas que comprenden una estructura que tiene cualquiera de las Fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas. En otra modalidad, la molécula bicatenaria asimétrica de siNA también puede tener un grupo fosfato en el extremo 5' que puede estar químicamente modificado tal como se describe en el presente documento (por ejemplo un grupo fosfato en el extremo 5' que tiene la Fórmula IV). En otra modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende una molécula de ácido nucleico circular, en la que el siNA tiene de aproximadamente 38 a aproximadamente 70 (por ejemplo, aproximadamente 38, 40, 45, 50, 55, 60, 65, o 70) nucleótidos de longitud que tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) pares de bases, y en la que el siNA puede incluir una modificación química, que comprende una estructura que tiene cualquiera de las Fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, una molécula de siNA modificada químicamente ejemplar de la invención comprende un oligonucleótido circular que tiene de aproximadamente 42 a aproximadamente 50 (por ejemplo, aproximadamente 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50) nucleótidos que está modificada químicamente con una modificación química que tiene cualquiera de las Fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas, en la que el oligonucleótido circular forma una estructura con forma de pesa que tiene aproximadamente 19 pares de bases y 2 bucles. En otra modalidad, una molécula de siNA dumbbell de la invención contiene dos motivos de bucle, en la que una o ambas porciones de bucle de la molécula de siNA es biodegradable. Por ejemplo, una molécula de siNA circular de la invención se diseña de tal forma que la degradación de las porciones de bucle de la molécula de siNA in vivo pueda generar una molécula bicatenaria de siNA con colgaduras en el extremo 3', tales como colgaduras nucleotídicas en el extremo 3' que comprenden aproximadamente 2 nucleótidos. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende al menos uno (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) resto abásico, por ejemplo un compuesto que tiene la Fórmula V: en la que cada R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10, R11 , R12, y R13 es independientemente H, OH, alquilo, alquilo sustituido, alcarilo o aralquilo, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCH3, OCN, O-alquilo, S-alquilo, N-alquilo, O-alquenilo, S-alquenilo, N-alquenilo, SO-alquilo, alquil-OSH, alquil-OH, O-alquil-OH, O-alquil-SH, S-alquil-OH, S-alquil-SH, alquil-S-alquilo, alquil-O-alquilo, ON02, NO2, N3, NH2, aminoalquilo, aminoácido, aminoacilo, ONH2, O-aminoalquilo, O-aminoácido, O-aminoacilo, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, o un grupo que tiene cualquiera de las Fórmulas I, II, lll, IV, V, VI y/o Vil, cualquiera de las cuales puede estar incluida en la estructura de la molécula de siNA o servir de punto de unión a la molécula de siNA; R9 es O, S, CH2, S=O, CHF, o CF2. En una modalidad, R3 y/o R7 comprenden un resto conjugado y un enlazador (por ejemplo, un enlace polinucleotídico o no polinucleotídico tal como se describe en el presente documento o conocidos por otros medios en la técnica). Ejemplos no limitantes de restos conjugados incluyen ligandos para receptores celulares, tales como péptidos derivados a partir de ligandos proteínicos naturales; secuencias de localización de proteínas, que incluyen secuencias de código postal celulares; anticuerpos; aptámeros de ácidos nucleicos; vitaminas y otros cofactores, tales como folato y N-acetilgalactosamina; polimeros, tales como polietilenglicol (PEG); fosfolípidos; colesterol; esteroides, y poliaminas, tales como PEÍ, espermina o espermidina. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende al menos uno (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) resto abásico invertido, por ejemplo un compuesto que tiene la Fórmula VI: en la que cada R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10, R11 , R12, y R13 es independientemente H, OH, alquilo, alquilo sustituido, alcarilo o aralquilo, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCH3, OCN, O-alquilo, S-alquilo, N-alquilo, O-alquenilo, S-alquenilo, N-alquenilo, SO-alquilo, alquil-OSH, alquil-OH, O-alquil-OH, O-alquil-SH, S-alquil-OH, S-alquil-SH, alquil-S-alquilo, alquil-O-alquilo, ONO2, NO2, N3, NH2, aminoalquilo, aminoácido, aminoacilo, ONH2, O-aminoalquilo, O-aminoácido, O-aminoacilo, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, o un grupo que tiene cualquiera de las Fórmulas I, II, lll, IV, V, VI y/o Vil, cualquiera de las cuales puede estar incluida en la estructura de la molécula de siNA o servir de punto de unión a la molécula de siNA; R9 es O, S, CH2, S=O, CHF, o CF2, y cualquiera de R2, R3, R8 o R13 puede servir como puntos de unión a la molécula de siNA de la invención. En una modalidad, R3 y/o R7 comprenden un resto conjugado y un enlazador (por ejemplo, un enlace polinucleotídico o no polinucleotídico tal como se describe en el presente documento o conocidos por otros medios en la técnica). Ejemplos no limitantes de restos conjugados incluyen ligandos para receptores celulares, tales como péptidos derivados a partir de ligandos proteínicos naturales; secuencias de localización de proteínas, que incluyen secuencias de código postal celulares; anticuerpos; aptámeros de ácidos nucleicos; vitaminas y otros cofactores, tales como folato y N-acetilgalactosamina; polímeros, tales como polietilenglicol (PEG); fosfolípidos; colesterol; esteroides, y poliaminas, tales como PEÍ, espermina o espermidina.

En una modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende al menos uno (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) restos de polialquilo sustituidos, por ejemplo un compuesto que tiene la Fórmula Vil: en la que cada n es independientemente un número entero de 1 a 12, cada R1 , R2 y R3 es independientemente H, OH, alquilo, alquilo sustituido, alcarilo o aralquilo, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCH3, OCN, O-alquilo, S-alquilo, N-alquilo, O-alquenilo, S-alquenilo, N-alquenilo, SO-alquilo, alquil-OSH, alquil-OH, O-alquil-OH, O-alquil-SH, S-alquil-OH, S-alquil-SH, alquil-S-alquilo, alquil-O-alquilo, ONO2, NO2, N3, NH2, aminoalquilo, aminoácido, aminoacilo, ONH2, O-aminoalquilo, O-aminoácido, O-aminoacilo, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, o un grupo que tiene cualquiera de las Fórmulas I, II, lll, IV, V, VI y/o Vil, cualquiera de las cuales puede estar incluida en la estructura de la molécula de siNA o servir de punto de unión a la molécula de siNA. En una modalidad, R3 y/o R1 comprenden un resto conjugado y un enlazador (por ejemplo, un enlace polinucleotídico o no polinucleotídico tal como se describe en el presente documento o conocidos por otros medios en la técnica). Ejemplos no limitantes de restos conjugados incluyen ligandos para receptores celulares, tales como péptidos derivados a partir de ligandos proteínicos naturales; secuencias de localización de proteínas, que incluyen secuencias de código postal celulares; anticuerpos; aptámeros de ácidos nucleicos; vitaminas y otros cofactores, tales como folato y N-acetilgalactosamina; polimeros, tales como polietilenglicol (PEG); fosfolípidos; colesterol; esteroides, y poliaminas, tales como PEÍ, espermina o espermidina. Con secuencias de "código postal" se quiere decir, cualquier secuencia de péptido o proteína que está implicada en el transporte mediado por la señalización topógena celular (véase por ejemplo Ray y cois. 2004, Science, 306(1501): 1505). Cada nucleótido dentro de la molécula bicatenaria de siNA puede tener independientemente una modificación química que comprende la estructura de cualquiera de las Fórmulas I-VI II. Así, en una modalidad, una o más posiciones de nucleótidos de una molécula de siNA de la invención comprenden una modificación química que tiene la estructura de cualquiera de las Fórmulas l-VII o cualquier otra modificación del presente documento. En una modalidad, cada posición de nucleótido de una molécula de siNA de la invención comprende una modificación química que tiene la estructura de cualquiera de las Fórmulas l-VII o cualquier otra modificación del presente documento. En una modalidad, una o más posiciones de nucleótidos de una o ambas hebras de una molécula bicatenaria de siNA de la invención comprende una modificación química que tiene la estructura de cualquiera de las Fórmulas 1-VII o cualquier otra modificación del presente documento. En una modalidad, cada posición nucleotídica de una o ambas hebras de una molécula bicatenaria de siNA de la invención comprende una modificación química que tiene la estructura de cualquiera de las Fórmulas l-VII o cualquier otra modificación del presente documento. En otra modalidad, la invención presenta un compuesto que tiene la Fórmula Vil, en la que R1 y R2 son grupos hidroxilo (OH), n = 1 , y R3 comprende O y es el punto de unión al extremo 3', al extremo 5', o a ambos extremos 3' y 5' de una o ambas hebras de una molécula bicatenaria de siNA de la invención o a una molécula monocatenaria de siNA de la invención. Esta modificación se denomina en el presente documento "glicerilo" (por ejemplo modificación 6 en la Figura 10). En otra modalidad, un nucleósido o no nucleósido químicamente modificado (por ejemplo un resto que tiene cualquiera de las Fórmulas V, VI o Vil) de la invención está en el extremo 3', el extremo 5", o ambos extremos 3' y 5' de una molécula de siNA de la invención. Por ejemplo, el nucleósido o no nucleósido químicamente modificado (por ejemplo, un resto que tiene la Fórmula V, VI o Vil) puede estar presente en el extremo 3', el extremo 5', o ambos extremos 3' y 5' de la hebra no codificante, la hebra codificante, o ambas hebras no codificantes y codificantes de la molécula de siNA. En una modalidad, el nucleósido o no nucleósido químicamente modificado (por ejemplo, un resto que tiene la Fórmula V, VI o Vil) está presente en el extremo 5' y el extremo 3' de la hebra codificante y el extremo 3' de la hebra no codificante de una molécula bicatenaria de siNA de la invención. En una modalidad, el nucleósido o no nucleósido químicamente modificado (por ejemplo, un resto que tiene la Fórmula V, VI o Vil) está presente en la posición terminal del extremo 5' y del extremo 3" de la hebra codificante y el extremo 3' de la hebra no codificante de una molécula bicatenaria de siNA de la invención. En una modalidad, el nucleósido o no nucleósido químicamente modificado (por ejemplo, un resto que tiene la Fórmula V, VI o Vil) está presente en las dos posiciones terminales del extremo 5' y del extremo 3' de la hebra codificante y el extremo 3' de la hebra no codificante de una molécula bicatenaria de siNA de la invención. En una modalidad, el nucleósido o no nucleósido químicamente modificado (por ejemplo, un resto que tiene la Fórmula V, VI o Vil) está presente en la penúltima posición del extremo 5' y del extremo 3' de la hebra codificante y el extremo 3' de la hebra no codificante de una molécula bicatenaria de siNA de la invención. Además, un resto que tiene la Fórmula Vil puede estar presente en el extremo 3" o el extremo 5' de una molécula de siNA en horquilla tal como se describe en el presente documento. En otra modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende un resto abásico que tiene la Fórmula V o VI, en la que el resto abásico que tiene la Fórmula VI o VI se conecta a la construcción de siNA en una configuración 3'-3', 3'-2', 2'-3', o 5'-5', tal como en el extremo 3', el extremo 5', o ambos extremos 3' y 5' de una o ambas hebras de siNA. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA), por ejemplo, en el extremo 5', el extremo 3', en ambos extremos 5' y 3', o cualquier combinación de los mismos, de la molécula de siNA. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) nucleótidos de 4'-tio, por ejemplo, en el extremo 5', en en el extremo 3', en ambos extremos 5' y 3', o cualquier combinación de los mismos, de la molécula de siNA. En otra modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) nucleótidos acíclicos, por ejemplo, en el extremo 5', en el extremo 3', en ambos extremos 5' y 3', o cualquier combinación de los mismos, de la molécula de siNA. En una modalidad, una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente de la invención comprende una hebra codificante o región codificante que tiene una o más (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13,14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más) modificaciones químicas en 2'-O-alquil (por ejemplo 2'-O-metilo), 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-desoxi, FANA, o abásico o cualquier combinación de las mismas. En una modalidad, una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente de la invención comprende una hebra no codificante o región no codificante que tiene una o más (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13,14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más) modificaciones químicas en 2'-O-alquil (por ejemplo 2'-O-metilo), 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-desoxi, FANA, o abásicas o cualquier combinación de las mismas. En una modalidad, una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente de la invención comprende una hebra codificante o región codificante y una hebra no codificante o región no codificante, cada una de las cuales tiene una o más (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13,14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más) modificaciones químicas 2'-O-alquil (por ejemplo 2'-O-metilo), 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-desoxi, FANA, o abásicas o cualquier combinación de las mismas. |En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente de la invención que comprende una región codificante, en la que cualesquiera (por ejemplo, uno o más o todos) nucleótidos de pirimidina presentes en la región codificante son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina). En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente de la invención que comprende una región codificante, en la que cualesquiera (por ejemplo, uno o más o todos) nucleótidos de pirimidina presentes en la región codificante son nucleótidos de pirimidina FANA (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de pirimidina FANA o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de pirimidina FANA). En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente de la invención que comprende una región no codificante, en la que cualesquiera (por ejemplo, uno o más o todos) nucleótidos de pirimidina presentes en la región no codificante son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina). En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente de la invención que comprende una región codificante y una región no codificante, en la que cualesquiera (por ejemplo, uno o más o todos) nucleótidos de pirimidina presentes en la región codificante y la región no codificante son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina).

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente de la invención que comprende una región codificante, en la que cualesquiera (por ejemplo, uno o más o todos)nucleótidos de purina presentes en la región codificante son nucleótidos de 2'-desoxi purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-desoxi purina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-desoxi purina). En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente de la invención que comprende una región no codificante, en la que cualesquiera (por ejemplo, uno o más o todos)nucleótidos de purina presentes en la región no codificante son nucleótidos de 2'-O-metil purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metil purina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-O-metil purina). En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente de la invención que comprende una región codificante, en la que cualesquiera (por ejemplo, uno o más o todos) nucleótidos de pirimidina presentes en la región codificante son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina), y en la que cualesquiera (por ejemplo, uno o más o todos)nucleótidos de purina presentes en la región codificante son nucleótidos de 2'-desoxi purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-desoxi purina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-desoxi purina). En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente de la invención que comprende una región codificante, en la que cualesquiera (por ejemplo, uno o más o todos)nucleótidos de pirimidina presentes en la región codificante son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometox¡, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi pirimidina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi pirimidina), y en la que cualesquiera (por ejemplo, uno o más o todos)nucleótidos de purina presentes en la región codificante son nucleótidos de 2'-desoxi purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-desoxi purina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-desoxi purina), en la que cualesquiera nucleótidos que comprenden una colgadura nucleotídica en el extremo 3' que están presentes en dicha región codificante son nucleótidos de 2'-desoxi. En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente de la invención que comprende una región codificante, en la que cualesquiera (por ejemplo, uno o más o todos)nucleótidos de pirimidina presentes en la región codificante son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi pirimidina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi pirimidina), y en la que cualesquiera (por ejemplo, uno o más o todos)nucleótidos de purina presentes en la región codificante son nucleótidos de 2'-O-metil purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metilo, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi purina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metilo, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi purina). En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente de la invención que comprende una región codificante, en la que cualesquiera (por ejemplo, uno o más o todos)nucleótidos de pirimidina presentes en la región codificante son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi pirimidina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de pirimidina son 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi pirimidina), en la que cualesquiera (por ejemplo, uno o más o todos)nucleótidos de purina presentes en la región codificante son nucleótidos de 2'-O-metilo, 4'-tio, 2'-O-trífluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metilo, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi purina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metílo, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi purina), y en la que cualesquiera nucleótidos que comprenden una colgadura nucleotídica en el extremo 3' que están presentes en dicha región codificante son nucle?tidos de 2'-desoxi. En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente de la invención que comprende una región no codificante, en la que cualesquiera (por ejemplo, uno o más o todos)nucleótidos de pirimidina presentes en la región no codificante son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi pirimidina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de pirimidina son 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi pirimidina), y en la que cualesquiera (por ejemplo, uno o más o todos)nucleótidos de purina presentes en la región no codificante son nucleótidos de 2'-O-metilo, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2,-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etox¡ purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metilo, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi purina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metilo, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi purina). En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente de la invención que comprende una región no codificante, en la que cualesquiera (por ejemplo, uno o más o todos)nucleótidos de pirimidina presentes en la región no codificante son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trífluorometoxi, o 2'-O- difluorometoxi-etoxi pirimidina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de pirimidina son 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi pirimidina), en la que cualesquiera (por ejemplo, uno o más o todos)nucleótidos de purina presentes en la región no codificante son nucleótidos de 2'-O-metilo, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometox¡, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metilo, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi purina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metilo, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi purina), y en la que cualesquiera nucleótidos que comprenden una colgadura nucleotidica en el extremo 3' que están presentes en dicha región no codificante son nucleótidos de 2'-desoxi. En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente de la invención que comprende una región no codificante, en la que cualesquiera (por ejemplo, uno o más o todos)nucleótidos de pirimidina presentes en la región no codificante son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi pirimidina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometox¡-etoxi pirimidina), y en la que cualesquiera (por ejemplo, uno o más o todos)nucleótidos de purina presentes en la región no codificante son nucleótidos de 2'-desoxi purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-desoxi purina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-desoxi purina). En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente de la invención que comprende una región no codificante, en la que cualesquiera (por ejemplo, uno o más o todos)nucleótidos de pirimidina presentes en la región no codificante son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometox¡, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi pirimidina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de pirimidina son 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi pirimidina), y en la que cualesquiera (por ejemplo, uno o más o todos)nucleótidos de purina presentes en la región no codificante son nucleótidos de 2'-O-metilo, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'- O-metilo, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi purina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metilo, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi purina). En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente de la invención con capacidad de mediar en la interferencia del ARN (ARNi) en el interior de una célula o sistema reconstituido in vitro que comprende una región codificante, en la que uno o más nucleótidos de pirimidina presentes en la región codificante son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi pirimidina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi pirimidina), y uno o más nucleótidos de purina presentes en la región codificante son nucleótidos de 2'-desoxi purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-desoxi purina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-desoxi purina), y una región no codificante, en la que uno o más nucleótidos de pirimidina presentes en la región no codificante son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-0-etil- trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi pirimidina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi pirimidina), y uno o más nucleótidos de purina presentes en la región no codificante son nucleótidos de 2'-O-metilo, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metilo, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi purina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metilo, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi purina). La región codificante y/o la región no codificante pueden tener una modificación en la caperuza terminal, tal como cualquier modificación que se describe en el presente documento o que se muestra en la Figura 10, que está opcionalmente presente en el extremo 3', el extremo 5', o ambos extremos 3' y 5' de la secuencia codificante y/o no codificante. La región codificante y/o no codificante opcionalmente puede comprender además una colgadura nucleotídica en el extremo 3' que tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3 ó 4) 2'-desoxinucleótidos. Los nucleótidos de colgadura pueden comprender además uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4 o más) enlaces internucleotídicos de fosforotioato, fosf onoacetato, y/o tiofosfonoacetato. Ejemplos no limitantes de estos siNA modificados químicamente se muestran en las Figuras 3A-3F y 4A-4F y el cuadro II en el presente documento. En cualquiera de estas modalidades descritas, los nucleótidos de purina presentes en la región codificante son de forma alternativa nucleótidos de 2'-O-metilo, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metilo, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi purina o de forma alternativa una pluralidad de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metilo, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi purina) y uno o más nucleótidos de purina presentes en la región no codificante son nucleótidos de 2'-O-metilo, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metilo, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi purina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metilo, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi purina). También, en cualquiera de estas modalidades, uno o más nucleótidos de purina presentes en la región codificante son de forma alternativa ribonucleótidos de purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son ribonucleótidos de purina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de purina son ribonucleótidos de purina) y cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la región no codificante son nucleótidos de 2'-O-metilo, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometox¡, o 2'-O-difluorometoxi-etox¡ purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metilo, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi purina o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metilo, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi purina). De forma adicional, en cualquiera de estas modalidades, uno o más nucleótidos de purina presentes en la región codificante y/o presentes en la región no codificante se seleccionan de forma alternativa del grupo constituido por nucleótidos de 2'-desoxi, nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA), nucleótidos de 2'-metoxietilo, nucleótidos de 4'-tio, nucleótidos de 2'-O-trifluorometilo, nucleótidos de 2'-O-etil-trifluorometoxi, nucleótidos de 2'-O-difluorometoxi-etoxi y nucleótidos de 2'-O-metilo (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina se seleccionan del grupo constituido por nucleótidos de 2'-desoxi, nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA), nucleótidos de 2'-metoxietilo, nucleótidos de 4'-tio, nucleótidos de 2'-O-trifluorometilo, nucleótidos de 2'-O-etil-trifluorometoxi, nucleótidos de 2'-O-difluorometoxi-etoxi y nucleótidos de 2'-O-metilo o de forma alternativa una pluralidad (es decir más de uno) de nucleótidos de purina se seleccionan del grupo constituido por nucleótidos de 2'-desoxi, nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA), nucleótidos de 2'-metoxietilo, nucleótidos de 4'-tio, nucleótidos de 2'-O-trifluorometilo, nucleótidos de 2,-O-etil-trifluorometox¡, nucleótidos de 2'-O-difluorometoxi-etoxi y nucleótidos de 2'-O-metilo). En otra modalidad, cualesquiera nucleótidos modificados presentes en las moléculas de siNA de la invención, preferiblemente en la hebra no codificante de las moléculas de siNA de la invención, pero también opcionalmente en la hebra codificante y/o tanto en la hebra no codificante como codificante, comprenden nucleótidos modificados que tienen propiedades o características similares a los ribonucleótidos naturales. Por ejemplo, la invención presenta moléculas de siNA que incluyen nucleótidos modificados que tienen una conformación Northern (por ejemplo, Northern pseudorotation cycle, véase por ejemplo Saenger, Principies of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag ed., 1984) conocidos de forma alternativa como configuración de "tipo ribo" o "hélice de forma A". Así, los nucleótidos químicamente modificados presentes en las moléculas de siNA de la invención, preferiblemente en la hebra no codificante de las moléculas de siNA de la invención, pero también opcionalmente en la hebra codificante y/o tanto en la hebra codificante como no codificante, son resistentes a la degradación por nucleasas mientras que a la vez mantienen la capacidad de mediar ARNi. Ejemplos no limitantes de nucleótidos que tienen una configuración northern incluyen nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA) (por ejemplo, nucleótidos de 2'-O, 4'-C-metilen-(D-ribofuranosilo)); nucleótidos de 2'-metoxietoxi (MOE); nucleótidos de 2'-metil-t¡o-etilo, nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-desoxi-2'-cloro nucleótidos, nucleótidos de 2'-azido, nucleótidos de 2'-O-trifluorometilo, nucleótidos de 2'-0-etil-trifluorometoxi, nucleótidos de 2'-O-difluorometoxi-etoxi, nucleótidos de 4'-tio y nucleótidos de 2'-O-metilo. En una modalidad, la hebra codificante de una molécula bicatenaria de siNA de la invención comprende un resto caperuza terminal, (véase por ejemplo la Figura 10) tal como un resto desoxiabásico invertido, en el extremo 3', extremo 5', o tanto en el extremo 3' como 5' de la hebra codificante. En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente con capacidad de mediar en la interferencia del ARN (ARNi) en el interior de una célula o sistema reconstituido in vitro, en la que la modificación química comprende un conjugado unido covalentemente a la molécula de siNA modificada químicamente. Ejemplos no limitantes de conjugados contemplados por la invención incluyen conjugados y ligandos que se describen en Vargeese y cois., documento USSN 10/427,160, presentado el 30 de abril de 2003, que se incorpora por referencia al presente documento en su totalidad, incluidos los dibujos. En otra modalidad, el conjugado está unido covalentemente a la molécula de siNA modificada químicamente mediante un enlazador modificada químicamente. En una modalidad, la molécula conjugada está unida al extremo 3' de la hebra codificante, de la hebra no codificante, o de ambas hebras de la molécula de siNA modificada químicamente. En otra modalidad, la molécula conjugada está unida al extremo 5' de la hebra codificante, de la hebra no codificante, o de ambas hebras de la molécula de siNA modificada químicamente. Todavía en otra modalidad, la molécula conjugada está unida tanto al extremo 3' como al extremo 5' de la hebra codificante, de la hebra no codificante, o de ambas hebras de la molécula de siNA modificada químicamente, o cualquier combinación de las mismas. En una modalidad, una molécula conjugada de la invención comprende una molécula que facilita la administración de una molécula de siNA modificada químicamente a un sistema biológico, tal como una célula. En otra modalidad, la molécula conjugada unida a la molécula de siNA modificada químicamente es un ligando para un receptor celular, tal como péptidos derivados a partir de ligandos proteínicos naturales; secuencias de localización de proteínas, que incluyen secuencias de código postal celulares; anticuerpos; aptámeros de ácidos nucleicos; vitaminas y otros cofactores, tales como folato y N-acetilgalactosamina; polímeros, tales como polietilenglicol (PEG); fosfolípidos; colesterol; esteroides, y poliaminas, tales como PEÍ, espermina o espermidina. Ejemplos de moléculas conjugadas específicas contempladas por la presente invención que puede unirse a moléculas de siNA modificadas químicamente se describen en Vargeese y cois., documento U.S. con nJ de serie 10/201 ,394, presentado el 22 de julio de 2002 que se incorpora por referencia al presente documento. El tipo de conjugados que se usa y la magnitud de la conjugación de las moléculas de siNA de la invención puede evaluarse para determinar mejoras en los perfiles farmacocinéticos, biodisponibilidad, y/o estabilidad de las construcciones de siNA mientras que al mismo tiempo se mantiene la capacidad del siNA de actuar de mediador de la actividad de ARNi. Así, una persona de experiencia en la técnica puede cribar construcciones de siNA que están modificadas con diversos conjugados para determinar si el complejo de siNA conjugado posee propiedades mejoras manteniendo a la vez la capacidad de mediar la ARNi, por ejemplo en modelos animales tal como es conocido de forma general en la técnica. En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) de la invención, en la que el siNA comprende además un enlace nucleotídico, no nucleotidico o nucleotídico/no nucleotídico mixto que une la región codificante del siNA a la región no codificante del siNA. En una modalidad, se usa un enlace nucleotídico, no nucleotídico o nucleotídico/no nucleotídico mixto, por ejemplo, para unir un resto conjugado al siNA. En una modalidad, un nucleótido enlazador de la invención puede ser un enlazador de > 2 nucleótidos de longitud, por ejemplo de aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 nucleótidos de longitud. En otra modalidad, el nucleótido enlazador puede ser un aptámero de ácido nucleico. Por "aptámero" o "aptámero de ácido nucleico" tal como se usa en el presente documento se quiere decir una molécula de ácido nucleico que se une de forma específica a una molécula objetivo en la que la molécula de ácido nucleico tiene una secuencia que comprende una secuencia reconocida por la molécula objetivo en su entorno natural. De forma alternativa, un aptámero puede ser una molécula de ácido nucleico que se une a una molécula objetivo donde la molécula objetivo no se une de forma natural a un ácido nucleico. La molécula objetivo puede ser cualquier molécula de interés. Por ejemplo, el aptámero puede usarse para unirse a un dominio de unión de ligandos de una proteína, evitando así la interacción del ligando natural con la proteína. Este es un ejemplo no limitante y los expertos en la técnica reconocerán que fácilmente pueden generarse otras modalidades usando técnicas conocidas de forma general en la técnica. (Véase, por ejemplo, Gold y cois., 1995, Annu. Rev. Biochem., 64, 763; Brody y Gold, 2000, J. Biotechnol., 74, 5; Sun, 2000, Curr. Opin. Mol. Ther., 2, 100; Kusser, 2000, J. Biotechnol., 74, 27; Hermann y Patel, 2000, Science, 287, 820; y Jayasena, 1999, Clinical Chemistry, 45, 1628.) Todavía en otra modalidad, un enlace no polinucleotídico de la invención comprende un nucleótido abásico, poliéter, poliamina, poliamida, péptido, carbohidrato, lípido, polihidrocarbono, u otros compuestos poliméricos (por ejemplo polietilenglicoles tales como los que tienen entre 2 y 100 unidades de etilenglicol). Ejemplos específicos incluyen los que describen Seela y Kaiser, Nucleic Acid Res.. 1990, 18: 6353 y Nucleic Acid Res.. 1987, 75:3113; Cload y Schepartz, J. Am. Chem. Soc. 1991 , 773:6324; Richardson y Schepartz, J. Am. Chem. Soc. 1991 , 773:5109; Ma y cois., Nucleic Acid Res.. 1993, 27:2585 y Biochemistry 1993, 32:1751 ; Durand y cois., Nucleic Acid Res.. 1990, 78:6353; McCurdy y cois., Nucleosides & Nucleotides 1991 , 70:287; Jschke y cois., Tetrahedron Lett. 1993, 34:301 ; Ono y cois., Biochemistry 1991 , 30:9914; Arnold y cois., publicación de patente internacional nJ WO 89/02439; Usman y cois., publicación de patente internacional nJ WO 95/06731 ; Dudycz y cois., publicación de patente internacional nJ WO 95/11910 y Ferentz y Verdine, J. Am. Chem. Soc. 1991 , 773:4000, se incorporan todos por la presente por referencia al presente documento. Un grupo "no nucleotídico" quiere decir además cualquier grupo o compuesto que puede incorporarse a una cadena de ácido nucleico en lugar de una o más unidades de nucleótidos, que incluyen sustituciones de azúcar y/o fosfato, y permite que las bases restantes muestren su actividad enzimática. El grupo o compuesto puede ser abásico porque no contenga una base nucleotídica reconocida habitualmente, tal como adenosina, guanina, citosina, uracilo o timina, por ejemplo en la posición C1 del azúcar. En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) con capacidad de mediar en la interferencia del ARN (ARNi) en el interior de una célula o sistema reconstituido in vitro, en la que una o ambas hebras de la molécula de siNA que se unen a partir de dos oligonucleótidos diferentes no comprenden cualesquiera ribonucleótidos. Por ejemplo, una molécula de siNA puede montarse a partir de un único nucleótido donde las regiones codificantes y no codificantes del siNA comprenden diferentes oligonucleótidos que no tienen ribonucleótidos (por ejemplo, nucleótidos que tienen un grupo 2'-OH) presente en los oligonucleótidos. En otro ejemplo, una molécula de siNA puede montarse a partir de un único oligonucleótido donde las regiones codificantes y no codificantes del siNA se unen o se hacen circulares mediante un enlace polinucleotídico o no polinucleotídico tal como se describe en el presente documento, en la que el oligonucleótido no tiene cualesquiera ribonucleótidos (por ejemplo, nucleótidos que tienen un grupo 2'-OH) presentes en el oligonucleótido. El solicitante ha encontrado sorprendentemente que la presencia de ribonucleótidos (por ejemplo, nucleótidos que tienen un grupo 2'-hidroxilo) en la molécula de siNA no es necesaria ni esencial para mantener la actividad de ARNi. Asi, en una modalidad, todas las posiciones del siNA pueden incluir nucleótidos y/o no nucleótidos químicamente modificados tales como nucleótidos y/o no nucleótidos que tienen la Fórmula I, II, lll, IV, V, VI, o Vil o cualquier combinación de las mismas en una magnitud en la que se mantenga que la capacidad de la molécula de siNA de mantener la actividad de ARNi en una célula. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención es una molécula monocatenaria de siNA que actúa de mediadora de la actividad de ARNi en una célula o sistema reconstituido in vitro que comprende un polinucleótido monocatenario que tiene complementariedad con una secuencia de ácido nucleico objetivo. En otra modalidad, la molécula monocatenaria de siNA de la invención comprende un grupo fosfato en el extremo 5'. En otra modalidad, la molécula monocatenaria de siNA de la invención comprende un grupo fosfato en el extremo 5' y un grupo fosfato en el extremo 3' (por ejemplo, un 2',3'-fosfato cíclico). En otra modalidad, la molécula monocatenaria de siNA de la invención comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) nucleótidos.

Todavía en otra modalidad, la molécula monocatenaria de siNA de la invención comprende uno o más nucleótidos o no nucleótidos químicamente modificados que se describen en el presente documento. Por ejemplo, todos las posiciones en la molécula de siNA pueden incluir nucleótidos modificados químicamente tales como nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas I-VII, o cualquier combinación de las mismas en una magnitud que se mantenga la capacidad de la molécula de siNA de mantener la actividad de ARNi en una célula. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención es una molécula monocatenaria de siNA que actúa de mediadora de la actividad de ARNi o que de forma alternativa modula la actividad de ARNi en una célula o sistema reconstituido in vitro que comprende un polinucleótido monocatenario que tiene complementariedad con una secuencia de ácido nucleico objetivo, en la que uno o más nucleótidos de pirimidina presentes en el siNA son nucleótidos de 2,-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etox¡ pirimidina o de forma alternativa una pluralidad de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi pirimidina), y en la que cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la región no codificante son nucleótidos de 2'-O-metilo, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2,-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O- difluorometoxi-etoxi purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metilo, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi purina o de forma alternativa una pluralidad de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metilo, 4'-tio, 2'-0-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi purina), y una modificación de caperuza terminal, tal como cualquier modificación que se describe en el presente documento o que se muestra en la Figura 10, que está opcionalmente presente en el extremo 3', el extremo 5', o ambos extremos 3' y 5' de la secuencia no codificante. El siNA opcionalmente comprende además de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4 o más) nucleótidos de 2'-desoxi terminales en el extremo 3' de la molécula de siNA, en la que los nucleótidos terminales pueden comprender además uno o más (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4 o más) enlaces internucleotídicos fosforotioato, fosfonoacetato, y/o tiofosfonoacetato, y en la que el siNA opcionalmente comprende además un grupo fosfato terminal, tal como un grupo fosfato en el extremo 5'. En cualquiera de estas modalidades, cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la región no codificante son de forma alternativa nucleótidos de 2'-desoxi purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-desox¡ purina o de forma alternativa una pluralidad de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-desoxi purina). También, en cualquiera de estas modalidades, cualesquiera nucleótidos de purina presentes en el siNA (es decir, nucleótidos de purina presentes en la región codificante y/o no codificante) de forma alternativa pueden ser nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA) (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de LNA o de forma alternativa una pluralidad de nucleótidos de purina son nucleótidos de LNA). También, en cualquiera de estas modalidades, cualesquiera nucleótidos de purina presentes en el siNA son de forma alternativa nucleótidos de 2'-metoxietil purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-metoxietil purina o de forma alternativa una pluralidad de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-metoxietil purina). En otra modalidad, cualesquiera nucleótidos modificados presentes en las moléculas monocatenarias de siNA de la invención comprenden nucleótidos modificados que tienen propiedades o características similares a ribonucleótidos naturales. Por ejemplo, la invención presenta moléculas de siNA que incluyen nucleótidos modificados que tienen una conformación Northern (por ejemplo, Northern pseudorotation cycle, véase por ejemplo Saenger, Principies of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag ed., 1984). Asi, los nucleótidos químicamente modificados presentes en las moléculas monocatenarias de siNA de la invención son preferiblemente resistentes a la degradación por nucleasas mientras que al mismo tiempo mantienen la capacidad de mediar ARNi. En una modalidad, una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente de la invención comprende una hebra codificante o región codificante que tiene dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13,14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más) molécula monocatenarias 2'-O-alquilo (por ejemplo 2'-O-metilo) o cualquier combinación de las mismas. En otra modalidad, la modificación 2'-O-alquilo está en una posición alternante en la hebra codificante o región codificante del siNA, tal como la posición 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 etc. o la posición 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 etc. En una modalidad, una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente de la invención comprende una hebra no codificante o región no codificante que tiene dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13,14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más) molécula monocatenarias 2'-O-alquilo (por ejemplo 2'-O-metilo) o cualquier combinación de las mismas. En otra modalidad, la modificación 2'-O-alquilo está en una posición alternante en la hebra no codificante o región no codificante del siNA, tal como la posición 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 etc. o la posición 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 etc. En una modalidad, una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) modificada químicamente de la invención comprende una hebra codificante o región codificante y una hebra no codificante o región no codificante, cada una de las cuales tiene dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13,14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más) modificaciones químicas 2'-O-alquil (por ejemplo 2'-O-metilo), 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-desoxi, o abásicas o cualquier combinación de las mismas. En otra modalidad, la modificación 2'-O-alquilo está en una posición alternante en la hebra codificante o región codificante del siNA, tal como en la posición 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 etc. o en la posición 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 etc. En otra modalidad, la modificación 2'-O-alquilo está en una posición alternante en la hebra no codificante o región no codificante del siNA, tal como posición 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 etc. o la posición 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 etc. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende nucleótidos o no nucleótidos químicamente modificados (por ejemplo, que tienen cualquiera de las Fórmulas l-VII, tal como nucleótidos de 2'-desoxi, 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-0-etil-trifluorometoxi, 2'-O-difluorometoxi-etoxi o 2'-O-metilo) en las posiciones alternantes en una o más hebras o regiones de la molécula de siNA. Por ejemplo, dichas modificaciones químicas pueden introducirse en una de cada dos posiciones de una molécula de siNA con base de ARN, que se inicia o bien en el primer o en el segundo nucleótido a partir del extremo 3' o el extremo 5' del siNA. En un ejemplo no limitante, se presenta una molécula bicatenaria de siNA de la invención en la que cada hebra del siNA es de 21 nucleótidos de longitud, en la que las posiciones 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19 y 21 de cada hebra están químicamente modificadas (por ejemplo, con compuestos que tienen cualquiera de las Fórmulas l-VII, tales como nucleótidos de 2'-desoxi, 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, 2'-O-difluorometoxi-etoxi o 2'-O-metilo). En otro ejemplo no limitante, se presenta una molécula bicatenaria de siNA de la invención en la que cada hebra del siNA es de 21 nucleótidos de longitud en la que las posiciones 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, y 20 de cada hebra están químicamente modificadas (por ejemplo, con compuestos que tienen cualquiera de las Fórmulas l-VII, tales como nucleótidos de 2'-desoxi, 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, 2'-O-difluorometoxi-etoxi o 2'-O-metilo). En una modalidad, una hebra de la molécula bicatenaria de siNA comprende modificaciones químicas en las posiciones 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, y 20 y modificaciones químicas en las posiciones 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19 y 21. Dichas moléculas de siNA pueden comprender además restos caperuza terminales y/o modificaciones en el esqueleto tal como se describe en el presente documento. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende la siguiente característica: si los nucleótidos de purina están presentes en el extremo 5" (por ejemplo, en cualquiera de las posiciones de nucleótidos terminales 1 , 2, 3, 4, 5, o 6 desde el extremo 5') de la hebra no codificante o región no codificante (denominada de otro modo secuencia guía o hebra guía) de la molécula de siNA entonces dichos nucleósidos de purina son ribonucleótidos. En otra modalidad, los ribonucleótidos de purina, cuando están presentes, están emparejados con nucleótidos de la hebra codificante o región codificante (denominada de otro modo la hebra pasajera) de la molécula de siNA. Dichos ribonucleótidos de purina pueden estar presentes en un motivo de estabilización de siNA que sino comprende nucleótidos modificados. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende la siguiente característica: si los nucleótidos de pirimidina están presentes en el extremo 5' (por ejemplo, en cualquiera de las posiciones de nucleótidos terminales 1 , 2, 3, 4, 5, o 6 desde el extremo 5') de la hebra no codificante o región no codificante (denominada de otro modo secuencia guía o hebra guía) de la molécula de siNA entonces dichos nucleósidos de pirimidina son ribonucleótidos. En otra modalidad, los ribonucleótidos de pirimidina, cuando están presentes, están emparejados con nucleótidos de la hebra codificante o región codificante (denominada de otro modo la hebra pasajera) de la molécula de siNA. Dichos ribonucleótidos de pirimidina pueden estar presentes en un motivo de estabilización de siNA que sino comprende nucleótidos modificados. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende la siguiente característica: si los nucleótidos de pirimidina están presentes en el extremo 5' (por ejemplo, en cualquiera de las posiciones de nucleótidos terminales 1 , 2, 3, 4, 5, o 6 desde el extremo 5') de la hebra no codificante o región no codificante (denominada de otro modo secuencia guía o hebra guía) de la molécula de siNA entonces dichos nucleósidos de pirimidina son nucleótidos modificados. En otra modalidad, los nucleótidos modificados de pirimidina, cuando están presentes, están emparejados con nucleótidos de la hebra codificante o región codificante (denominada de otro modo la hebra pasajera) de la molécula de siNA. Ejemplos no limitantes de nucleótidos modificados de pirimidina incluyen los que tienen cualquiera de las Fórmulas l-VII, tales como nucleótidos de 2'-desoxi, 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometilo, 2'-O-etil-trifluorometoxi, 2'-O-difluorometoxi-etoxi o 2'-O-metilo. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene la estructura SI: B NX3 (N)X2 B -3' B (N)X1 NX4 [N]X5 -5' SI en la que cada N es independientemente un nucleótido; cada B es un resto caperuza terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos sin bases pareadas o de colgadura que pueden estar sin modificar o químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótidos en la que cualesquiera nucleótidos de purina cuando están presentes son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente números enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un número entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un número entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 y X5 esté entre 17-36; X5 es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; NX3 es complementaria a NX4 y NX5, y (a) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra no codificante (hebra inferior) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra no codificante (hebra inferior) distintos de los nucleótidos de purina en las posiciones [N] de los nucleótidos, son independientemente nucleótidos de 2'-O-metilo, 2'- desoxirribonucleótidos o una combinación de 2'- desoxirribonucleótidos y nucleótidos de 2'-O-metilo; (b) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra codificante (hebra superior) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'- fluoro; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra codificante (hebra superior) son independientemente 2'- desoxirribonucleótidos, nucleótidos de 2'-O-metilo o una combinación de 2'-desoxirribonucleótidos y nucleótidos de 2'-O- metilo; y (c) cualesquiera nucleótidos (N) son opcionalmente nucleótidos de 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, o desoxirribonucleótidos. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene la estructura Sil: B NX3 (N)?2 B -3' B (N)X1 NX4 [N]X5 -5' Sil en la que cada N es independientemente un nucleótido; cada B es un resto caperuza terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos sin bases pareadas o de colgadura que pueden estar sin modificar o químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótidos en la que cualesquiera nucleótidos de purina cuando están presentes son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente números enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un número entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un número entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 y X5 esté entre 17-36; X5 es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; NX3 es complementaria a NX4 y NX5, y (a) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra no codificante (hebra inferior) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra no codificante (hebra inferior) distintos de los nucleótidos de purina en las posiciones [N] de los nucleótidos, son nucleótidos de 2'-O- metilo; (b) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra codificante (hebra superior) son ribonucleótidos; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra codificante (hebra superior) son ribonucleótidos; y (c) cualesquiera nucleótidos (N) son opcionalmente nucleótidos de 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, o desoxirribonucleótidos.

En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene la estructura Slll: B NX3 (N)X2 B -3' B (N)X1 NX4 [N]X5 -5' Slll en la que cada N es independientemente un nucleótido; cada B es un resto caperuza terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos sin bases pareadas o de colgadura que pueden estar sin modificar o químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótidos en la que cualesquiera nucleótidos de purina cuando están presentes son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente números enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un número entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un número entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 y X5 esté entre 17-36; X5 es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; NX3 es complementaria a NX4 y NX5, y (a) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra no codificante (hebra inferior) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra no codificante (hebra inferior) distintos de los nucleótidos de purina en las posiciones [N] de los nucleótidos, son nucleótidos de 2'-O- metilo; (b) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra codificante (hebra superior) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'- fluoro; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra codificante (hebra superior) son ribonucleótidos; y (c) cualesquiera nucleótidos (N) son opcionalmente nucleótidos de 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, o desoxirribonucleótidos. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene la estructura SIV: B NX3 (N)X2 B -3' B (N)X1 NX4 [N]X5 -5' SIV en la que cada N es independientemente un nucleótido; cada B es un resto caperuza terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos sin bases pareadas o de colgadura que pueden estar sin modificar o químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótidos en la que cualesquiera nucleótidos de purina cuando están presentes son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente números enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un número entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un número entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 y X5 esté entre 17-36; X5 es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; NX3 es complementaria a NX4 y NX5, y (a) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra no codificante (hebra inferior) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra no codificante (hebra inferior) distintos de los nucleótidos de purina en las posiciones [N] de los nucleótidos, son nucleótidos de 2'-O- metilo; (b) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra codificante (hebra superior) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'- fluoro; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra codificante (hebra superior) son desoxirribonucleótidos; y (c) cualesquiera nucleótidos (N) son opcionalmente nucleótidos de 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, o desoxirribonucleótidos.

En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene la estructura SV: B NX3 (N)X2 B -3' B (N)X1 NX4 [N]X5 -5' SV en la que cada N es independientemente un nucleótido; cada B es un resto caperuza terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos sin bases pareadas o de colgadura que pueden estar sin modificar o químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótidos en la que cualesquiera nucleótidos de purina cuando están presentes son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente números enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un número entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un número entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 y X5 esté entre 17-36; X5 es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; NX3 es complementaria a NX4 y NX5, y (a) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra no codificante (hebra inferior) son nucleótidos que tienen una configuración de tipo ribo (por ejemplo, configuración Northern o en hélice de forma A); cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra no codificante (hebra inferior) distintos de los nucleótidos de purina en las posiciones [N] de los nucleótidos, son nucleótidos de 2'-O-metilo; (b) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra codificante (hebra superior) son nucleótidos que tienen una configuración de tipo ribo (por ejemplo, configuración Northern o en hélice de forma A); cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra codificante (hebra superior) son nucleótidos de 2'-O-metilo; y (c) cualesquiera nucleótidos (N) son opcionalmente nucleótidos de 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, o desoxirribonucleótidos. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene la estructura SVI: B NX3 (N)X2 B -3' B (N)X1 NX4 [N]X5 -5' SVI en la que cada N es independientemente un nucleótido; cada B es un resto caperuza terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos sin bases pareadas o de colgadura que pueden estar sin modificar o químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótidos que comprenden una secuencia que hace que el extremo 5' de la hebra no codificante (hebra inferior) sea menos estable térmicamente que el extremo 5' de la hebra codificante (hebra superior); X1 y X2 son independientemente números enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un número entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un número entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 y X5 esté entre 17-36; X5 es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; NX3 es complementaria a NX4 y NX5, y (a) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra no codificante (hebra inferior) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra no codificante (hebra inferior) distintos de los nucleótidos de purina en las posiciones [N] de los nucleótidos, son independientemente nucleótidos de 2'-O-metilo, 2'- desoxirribonucleótidos o una combinación de 2'- desoxirribonucleótidos y nucleótidos de 2'-O-metilo; (b) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra codificante (hebra superior) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'- fluoro; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra codificante (hebra superior) son independientemente 2'- desoxirribonucleótidos, nucleótidos de 2'-O-metilo o una combinación de. 2'-desoxirribonucleótidos y nucleótidos de 2'-O- metilo; y (c) cualesquiera nucleótidos (N) son opcionalmente nucleótidos de 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, o desoxirribonucleótidos. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene la estructura SVII: B NX3 (N)X2 B -3' B (N)X1 NX4 5' SVII en la que cada N es independientemente un nucleótido; cada B es un resto caperuza terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos sin bases pareadas o de colgadura; X1 y X2 son independientemente números enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un número entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un número entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30; NX3 es complementaria a NX4, y cualesquiera nucleótidos (N) son nucleótidos de 2'-O-metilo y/o 2'-desoxi-2'-fluoro. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene la estructura SVIII: B NX7 — [N]X6 - NX3 (N)X2 B -3' B (N)X1 NX4 [N]X5 -5' SVIII en la que cada N es independientemente un nucleótido; cada B es un resto caperuza terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos sin bases pareadas o de colgadura que pueden estar sin modificar o químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótidos que comprenden una secuencia que hace que el extremo 5' de la hebra no codificante (hebra inferior) sea menos estable térmicamente que el extremo 5' de la hebra codificante (hebra superior); [N] representa posiciones de nucleótidos que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente números enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un número entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 15; X4 es un número entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 y X5 esté entre 17-36; X5 es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; X6 es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 4; X7 es un número entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 15; NX7, NX6, y NX3 son complementarios a NX4 y NX5, y (a) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra no codificante (hebra inferior) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra no codificante (hebra inferior) distintos de los nucleótidos de purina en las posiciones [N] de los nucleótidos, son independientemente nucleótidos de 2'-O-metilo, 2'- desoxirribonucleótidos o una combinación de 2'- desoxirribonucleótidos y nucleótidos de 2'-O-metilo; (b) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra codificante (hebra superior) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'- fluoro distintos de los nucleótidos [N]; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra codificante (hebra superior) son independientemente 2'-desoxirribonucleótidos, nucleótidos de 2'- O-metilo o una combinación de 2'-desoxirribonucleótidos y nucleótidos de 2'-O-metilo distintos de los nucleótidos [?/]; y 5 (c) cualesquiera nucleótidos (N) son opcionalmente nucleótidos de 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, o desoxirribonucleótidos. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene la estructura SIX: B NX3 (N)X2 B -3' i o B (N)X1 NX4 [N]X5 -5' SIX en la que cada N es independientemente un nucleótido; cada B es un resto caperuza terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos sin bases pareadas o de colgadura que pueden estar sin modificar 15 o químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótidos que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente números enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un número entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un número entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma 20 de X4 y X5 esté entre 17-36; X5 es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; NX3 es complementaria a NX4 y NX5, y (a) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra no codificante (hebra inferior) son nucleótídos de 2'-desoxi-2'-fluoro; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra no codificante (hebra inferior) distintos de los nucleótidos de purina en las posiciones [N] de los nucleótidos, son independientemente nucleótidos de 2'-O-metilo, 2'- desoxirribonucleótidos o una combinación de 2'- desoxirribonucleótidos y nucleótidos de 2'-0-metilo; (b) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra codificante (hebra superior) son nucleótidos de 2'-desox¡-2'- fluoro; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra codificante (hebra superior) son independientemente 2'- desoxirribonucleótidos, nucleótidos de 2'-O-metilo o una combinación de 2'-desoxirribonucleótidos y nucleótidos de 2'-O- metilo; y (c) cualesquiera nucleótidos (N) son opcionalmente nucleótidos de 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, o desoxirribonucleótidos. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene la estructura SX: B NX3 (N)X2 B -3' B (N)X1 NX4 [N]X5 -5' SX en la que cada N es independientemente un nucleótido; cada B es un resto caperuza terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos sin bases pareadas o de colgadura que pueden estar sin modificar o químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótidos que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente números enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un número entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un número entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 y X5 esté entre 17-36; X5 es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; NX3 es complementaria a NX4 y NX5, y (a) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra no codificante (hebra inferior) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra no codificante (hebra inferior) distintos de los nucleótidos de purina en las posiciones [N] de los nucleótidos, son nucleótidos de 2'-O- metilo; (b) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra codificante (hebra superior) son ribonucleótidos; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra codificante (hebra superior) son ribonucleótidos; y (c) cualesquiera nucleótidos (N) son opcionalmente nucleótidos de 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, o desoxirribonucleótidos. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene la estructura SXI: B NX3 (N)X2 B -3' B (N)X 1 NX4 [N]X5 -5' SXI en la que cada N es independientemente un nucleótido; cada B es un resto caperuza terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos sin bases pareadas o de colgadura que pueden estar sin modificar o químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótidos que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente números enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un número entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un número entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 y X5 esté entre 17-36; X5 es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; NX3 es complementaria a NX4 y NX5, y (a) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra no codificante (hebra inferior) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-f luoro; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra no codificante (hebra inferior) distintos de los nucleótidos de purina en las posiciones [N] de los nucleótidos, son nucleótidos de 2'-O- metilo; (b) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra codificante (hebra superior) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'- fluoro; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra codificante (hebra superior) son ribonucleótidos; y (c) cualesquiera nucleótidos (N) son opcionalmente nucleótidos de 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, o desoxirribonucleótidos. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene la estructura SXII: B NX3 (N)X2 B -3' B (N)X] NX4 [N]X5 -5' SXII en la que cada N es independientemente un nucleótido; cada B es un resto caperuza terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos sin bases pareadas o de colgadura que pueden estar sin modificar o químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótidos que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente números enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un número entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un número entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 y X5 esté entre 17-36; X5 es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; NX3 es complementaria a NX4 y NX5, y (a) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra no codificante (hebra inferior) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra no codificante (hebra inferior) distintos de los nucleótidos de purina en las posiciones [N] de los nucleótidos, son nucleótidos de 2'-O- metilo; (b) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra codificante (hebra superior) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'- fluoro; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra codificante (hebra superior) son desoxirribonucleótidos; y (c) cualesquiera nucleótidos (N) son opcionalmente nucleótidos de 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, o desoxirribonucleótidos. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene la estructura SXIII: B NX3 (N)X2 B -3' B ( )X] NX4 [N]X5 -5' SXIII en la que cada N es independientemente un nucleótido; cada B es un resto caperuza terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos sin bases pareadas o de colgadura que pueden estar sin modificar o químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótidos que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente números enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un número entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un número entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 y X5 esté entre 17-36; X5 es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; NX3 es complementaria a NX4 y NX5, y (a) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra no codificante (hebra inferior) son nucleótidos que tienen una configuración de tipo ribo (por ejemplo, configuración Northern o en hélice de forma A); cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra no codificante (hebra inferior) distintos de los nucleótidos de purina en las posiciones [N] de los nucleótidos, son nucleótidos de 2'-O-metilo; (b) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra codificante (hebra superior) son nucleótidos que tienen una configuración de tipo ribo (por ejemplo, configuración Northern o en hélice de forma A); cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra codificante (hebra superior) son nucleótidos de 2'-O-metilo; y (c) cualesquiera nucleótidos (N) son opcionalmente nucleótidos de 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, o desoxirribonucleótidos. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene la estructura SXIV: B NX7 — [?T|?6 _ NX3 (N)X2 B -3' B (N)X1 -NX4; [N]?s -5' SXIV en la que cada N es independientemente un nucleótido; cada B es un resto caperuza terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos sin bases pareadas o de colgadura que pueden estar sin modificar o químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótidos que son ribonucleótidos; [N] representa posiciones de nucleótidos que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente números enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un número entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 15; X4 es un número entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 y X5 esté entre 17-36; X5 es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; X6 es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 4; X7 es un número entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 15; NX7, NX6, y NX3 son complementarios a NX4 y NX5, y (a) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra no codificante (hebra inferior) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra no codificante (hebra inferior) distintos de los nucleótidos de purina en las posiciones [N] de los nucleótidos, son independientemente nucleótidos de 2'-O-metilo, 2'- desoxirribonucleótidos o una combinación de 2'- desoxirribonucleótidos y nucleótidos de 2'-O-metilo; (b) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra codificante (hebra superior) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'- fluoro distintos de los nucleótidos [?/j; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra codificante (hebra superior) son independientemente 2'-desoxirribonucleótidos, nucleótidos de 2'- O-metilo o una combinación de 2'-desoxirribonucleótidos y nucleótidos de 2'-O-metilo distintos de los nucleótidos [N]; y (c) cualesquiera nucleótídos (N) son opcionalmente nucleótidos de 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, o desoxirribonucleótidos. En una modalidad, una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, Slll, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII, o SXIV comprende un grupo fosfato terminal en el extremo 5' de la hebra no codificante o región no codificante de la molécula de ácido nucleico. En una modalidad, una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, Slll, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII, o SXIV comprende X5 = 1 , 2 ó 3; cada X1 y X2 = 1 ó 2; X3 = 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30, y X4 = 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 6 30. En una modalidad, una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, Slll, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII, o SXIV comprende X5 = 1 ; cada X1 y X2 = 2; X3 = 19, y X4 = 18. En una modalidad, una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, Slll, SIV, SV, SVI, SVM. SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII, o SXIV comprende X5 = 2; cada X1 y X2 = 2; X3 = 19, y X4 = 17 En una modalidad, una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, Slll, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII, o SXIV comprende X5 = 3; cada X1 y X2 = 2; X3 = 19, y X4 = 16. En una modalidad, una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, Slll, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII, o SXIV comprende B en los extremos 3' y 5' de la hebra codificante o región codificante. En una modalidad, una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, Slll, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII, o SXIV comprende B en el extremo 3' de la hebra no codificante o región no codificante. En una modalidad, una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, Slll, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII, o SXIV comprende B en los extremos 3' y 5' de la hebra codificante o región codificante y B en el extremo 3' de la hebra no codificante o región no codificante. En una modalidad, una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, Slll, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII, o SXIV comprende además uno o más enlaces internucleotídicos de fosfotioato en el primer (N) terminal del extremo 3' de la hebra codificante, hebra no codificante, o tanto en la hebra codificante como no codificante de la molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, una molécula bicatenaria de ácido nucleico puede comprender X1 y/o X2 = 2 que tiene posiciones de nucleótidos en colgadura con un enlace internucleotidico de fosforotioato, por ejemplo, (NsN) donde "s" indica fosforotioato.

En una modalidad, una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, Slll, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII, o SXIV comprende (N) nucleótidos que son nucleótidos de 2'-O-metilo. En una modalidad, una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, Slll, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SX lll, o SXIV comprende (N) nucleótidos que son nucleótidos de 2'-desoxi. En una modalidad, una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, Slll, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII, o SXIV comprende (N) nucleótidos en la hebra no codificante (hebra inferior) que son complementarios a nucleótidos en una secuencia objetivo de polinucleótidos que tiene complementariedad con los nucleótidos N y [N] de la hebra no codificante (inferior). En una modalidad, una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, Slll, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII, o SXIV comprende (N) nucleótidos en la hebra codificante (hebra superior) que comprenden una secuencia de nucleótidos contigua de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos de una secuencia objetivo de polinucleótidos. En una modalidad, una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, Slll, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII, o SXIV comprende (N) nucleótidos en la hebra codificante (hebra superior) que comprenden una secuencia de nucleótidos que corresponde a una secuencia objetivo de polinucleótidos que tiene complementariedad con la hebra no codificante (inferior) de tal forma que la secuencia de nucleótidos contiguos (N) y N de la hebra codificante comprende la secuencia de nucleótidos de la secuencia de ácido nucleico objetivo. En una modalidad, una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene cualquiera de las estructuras SVIII o SXIV comprende B solo en el extremo 5' de la hebra codificante (superior) de la molécula bicatenaria de ácido nucleico. En una modalidad, una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, Slll, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII, o SXIV comprende además un nucleótido terminal sin pareja en el extremo 5' de la hebra no codificante (inferior). El nucleótido sin pareja no es complementario a la hebra codificante (superior). En una modalidad, el nucleótido terminal sin pareja es complementario a una secuencia objetivo de polinucleótidos que tiene complementariedad con los nucleótidos N y [N] de la hebra no codificante (inferior). En otra modalidad, el nucleótido terminal sin pareja no es complementario a una secuencia objetivo de polinucleótidos que tiene complementariedad con los nucleótidos N y [N] de la hebra no codificante (inferior). En una modalidad, una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene cualquiera de las estructuras SVIII o SXIV comprende X6 = 1 y X3 = 10.

En una modalidad, una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene cualquiera de las estructuras SVIII o SXIV comprende X6 = 2 y X3 = 9. En una modalidad, la invención presenta una composición que comprende una molécula de siNA o molécula bicatenaria de ácido nucleico o inhibidor de ARNi formulada en forma de una cualquiera de las formulaciones LNP-051 ; LNP-053; LNP-054; LNP-069; LNP-073; LNP-077; LNP-080; LNP-082; LNP-083; LNP-060; LNP-061 ; LNP-086; LNP-097; LNP-098; LNP-099; LNP-100; LNP-101 ; LNP-102; LNP-103; o LNP-104 (véase el cuadro IV). En una modalidad, la invención presenta una composición que comprende un primer ácido nucleico bicatenario y una segunda molécula bicatenaria de ácido nucleico teniendo cada uno de los cuales una primera hebra y una segunda hebra que son complementarias entre sí, en la que la segunda hebra de la primera molécula bicatenaria de ácido nucleico comprende la secuencia complementaria a a una primera secuencia objetivo y la segunda hebra de la segunda molécula bicatenaria de ácido nucleico comprende la secuencia complementaria a una segunda secuencia objetivo o de ruta objetivo. En una modalidad, la composición comprende además un lípido catiónico, un lipido neutro, y un conjugado de polietilenglicol. En una modalidad, la composición comprende además un lípido catiónico, un lípido neutro, un conjugado de polietilenglicol, y un colesterol. En una modalidad, la composición comprende además un conjugado de polietilenglicol, un colesterol, y un tensioactivo. En una modalidad, el lípido catiónico se selecciona del grupo constituido por CLinDMA, pCLinDMA, eCLinDMA, DMOBA, y DMLBA. En una modalidad, el lípido neutro se selecciona del grupo constituido por DSPC, DOBA, y colesterol. En una modalidad, el conjugado de polietilenglicol se selecciona del grupo constituido por un PEG-dimiristoil glicerol y PEG-colesterol. En una modalidad, el PEG es 2KPEG. En una modalidad, el tensioactivo se selecciona del grupo constituido por alcohol de palmitilo, alcohol de estearilo, alcohol de oleilo y alcohol de linoleilo. En una modalidad, el lípido catiónico es CLinDMA, el lípido neutro es DSPC, el conjugado de polietilenglicol es 2KPEG-DMG, el colesterol es colesterol, y el tensioactivo es alcohol de linoleilo. En una modalidad, el CLinDMA, el DSPC, el 2KPEG-DMG, el colesterol, y el alcohol de linoleilo están presentes en una proporción molar de 43:38:10:2:7 respectivamente. En cualquiera de las modalidades en el presente documento, la molécula de siNA de la invención modula la expresión de una o más objetivos mediante interferencia del ARN o la inhibición de la interferencia del ARN. En una modalidad, la interferencia del ARN es LA escisión mediada por RISC de la objetivo (por ejemplo, interferencia del ARN mediada por siARN). En una modalidad, la interferencia del ARN es la inhibición de la traducción de la objetivo (por ejemplo, interferencia del ARN mediada por miARN). En una modalidad, la interferencia del ARN es la inhibición de la transcripción de la objetivo (por ejemplo, silenciamiento de la traducción mediado por miARN). En una modalidad, la interferencia del ARN se produce en el citoplasma. En una modalidad, la interferencia del ARN se produce en el núcleo.

En cualquiera de las modalidades del presente documento, la molécula de siNA de la invención modula la expresión de una o más objetivos mediante la inhibición de un ARN objetivo endógeno, tal como un mARN, siARN, miARN endógenos o, de forma alternativa, a través de la inhibición de RISC. En una modalidad, la invención presenta uno o más inhibidores de ARNi que modula la expresión de uno o más genes objetivo mediante inhibición de miARN, inhibición de siARN, o inhibición de RISC. En una modalidad, un inhibidor de ARNi de la invención es una molécula de siNA tal como se describe en el presente documento que tiene uno o más hebras que son complementarias a una o más moléculas de miARN o siARN objetivo. En una modalidad, el inhibidor de ARNi de la invención es una molécula no codificante que es complementaria a una molécula de miARN o siARN objetivo o una porción de la misma. Un inhibidor de ARNi no codificante de la invención puede ser de una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ó 40 nucleótidos de longitud). Un inhibidor de ARNi no codificante de la invención puede comprender uno o más nucleótidos o no nucleótidos modificados tal como se describen en el presente documento (véase por ejemplo las moléculas que tienen cualquiera de las Fórmulas l-VII en el presente documento o cualquier combinación de las mismas). En una modalidad, un inhibidor de ARNi no codificante de la invención puede comprender uno o más o todos los nucleótidos de 2'-O-metilo. En una modalidad, un inhibidor de ARNi no codificante de la invención puede comprender uno o más o todos los nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro. En una modalidad, un inhibidor de ARNi no codificante de la invención puede comprender uno o más o todos los nucleótidos de 2'-O-metoxi-etil (también conocidos como 2'-metoxietox¡ o MOE). En una modalidad, un inhibidor de ARNi no codificante de la invención puede comprender uno o más o todos los enlaces internucleotídicos de fosfotioato. En una modalidad, un inhibidor de ARNi no codificante de la invención puede comprender un resto caperuza terminal en el extremo 3', el extremo 5', o ambos extremos 5' y 3' de del inhibidor de ARNi no codificante. En una modalidad, un inhibidor de ARNi de la invención es un aptámero de ácido nucleico que tiene afinidad de unión por RISC, tal como un aptámero regulable (véase por ejemplo An y cois., 2006, ARN, 12:710-716). Un inhibidor de ARNi aptámero de la invención puede ser de una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 nucleótidos de longitud). Un inhibidor de ARNi aptámero de la invención puede comprender uno o más nucleótidos o no nucleótidos modificados tal como se describen en el presente documento (véase por ejemplo las moléculas que tienen cualquiera de las Fórmulas l-VII en el presente documento o cualquier combinación de las mismas). En una modalidad, un inhibidor de ARNi aptámero de la invención puede comprender uno o más o todos los nucleótidos de 2'-O-metilo. En una modalidad, un inhibidor de ARNi aptámero de la invención puede comprender uno o más o todos los nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro. En una modalidad, un inhibidor de ARNi aptámero de la invención puede comprender uno o más o todos los nucleótidos de 2'-O-metoxi-etilo (también conocidos como 2'-metoxietoxi o MOE). En una modalidad, un inhibidor de ARNi aptámero de la invención puede comprender uno o más o todos enlaces internucleotidicos de fosfotioato. En una modalidad, un inhibidor de ARNi aptámero o la invención puede comprender un resto caperuza terminal en el extremo 3', el extremo 5', o ambos extremos 5' y 3' del inhibidor de ARNi aptámero. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para modular la expresión de un gen objetivo en el interior de una célula que comprende: (a) sintetizar una molécula de siNA de la invención, que puede estar modificada químicamente o sin modificar, en la que una de las hebras de siNA comprende una secuencia complementaria al ARN del gen objetivo; y (b) introducir la molécula de siNA en una célula en condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión del gen objetivo en la célula. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para modular la expresión de un gen objetivo en el interior de una célula que comprende: (a) sintetizar una molécula de siNA de la invención, que puede estar modificada químicamente o sin modificar, en la que una de las hebras de siNA comprende una secuencia complementaria al ARN del gen objetivo y en el que la secuencia de la hebra codificante del siNA comprende una secuencia idéntica o sustancialmente similar a la secuencia del ARN objetivo; y (b) introducir la molécula de siNA en una célula en condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión del gen objetivo en la célula. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para modular la expresión de más de un gen objetivo en el interior de una célula que comprende: (a) sintetizar moléculas de siNA de la invención, que pueden estar modificadas químicamente o sin modificar, en las que una de las hebras de siNA comprende una secuencia complementaria al ARN de los genes objetivo; y (b) introducir las moléculas de siNA en una célula en condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión de los genes objetivo en la célula. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para modular la expresión de dos o más genes objetivo en el interior de una célula que comprende: (a) sintetizar una o más moléculas de siNA de la invención, que pueden estar modificadas químicamente o sin modificar, en las que las hebras del siNA comprenden secuencias complementarias al ARN de los genes objetivo y en el que las secuencias de la hebra codificante de los siNA comprenden secuencias idénticas o sustancialmente similares a las secuencias de los ARN objetivo; y (b) introducir las moléculas de siNA en una célula en condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión de los genes objetivo en la célula.

En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para modular la expresión de más de un gen objetivo en el interior de una célula que comprende: (a) sintetizar una molécula de siNA de la invención, que puede estar modificada químicamente o sin modificar, en la que una de las hebras de siNA comprende una secuencia complementaria al ARN del gen objetivo y en el que la secuencia de la hebra codificante del siNA comprende una secuencia idéntica o sustancialmente similar a las secuencias de los ARN objetivo; y (b) introducir la molécula de siNA en una célula en condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión de los genes objetivo en la célula. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para modular la expresión de un gen objetivo en el interior de una célula que comprende: (a) sintetizar una molécula de siNA de la invención, que puede estar modificada químicamente o sin modificar, en la que una de las hebras de siNA comprende una secuencia complementaria al ARN del gen objetivo, en el que la secuencia de la hebra codificante del siNA comprende una secuencia idéntica o sustancialmente similar a las secuencias del ARN objetivo; y (b) introducir la molécula de siNA en una célula en condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión del gen objetivo en la célula. En una modalidad, se usan las moléculas de siNA de la invención como reactivos en aplicaciones ex vivo. Por ejemplo, se introducen siNA reactivos en tejido o células que se trasplantan a un sujeto para un efecto terapéutico. Las células y/o tejido pueden derivarse de un organismo o sujeto que más tarde recibe el explante, o pueden derivarse de otro organismo o sujeto antes del trasplante. Las moléculas de siNA pueden usarse para modular la expresión de uno o más genes en las células o tejido, de tal forma que las células o tejido obtengan un fenotipo deseado o sean capaces de realizar una función cuando se trasplantan in vivo. En una modalidad, se extraen ciertas células objetivo de un paciente. Estas células extraídas se ponen en contacto con siNA dirigido a una secuencia de nucleótidos específica en el interior de las células en condiciones adecuadas para la captación de los siNA por estas células (por ejemplo usando reactivos de administración tales como lípidos catiónicos, liposomas y similares o usando técnicas tales como electroporación para facilitar la administración de siNA a las células). Las células entonces se vuelven a introducir en el mismo paciente o en otros pacientes. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento de modular la expresión de un gen objetivo en un explante de tejido que comprende: (a) sintetizar una molécula de siNA de la invención, que puede estar modificada químicamente, en la que una de las hebras de siNA comprende una secuencia complementaria al ARN del gen objetivo; y (b) introducir la molécula de siNA en una célula del explante de tejido derivado de un organismo particular en condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión del gen objetivo en el explante de tejido. En otra modalidad, el procedimiento comprende además introducir el explante de tejido otra vez en el organismo del que se derivó el tejido o en otro organismo en condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión del gen objetivo en ese organismo. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento de modular la expresión de un gen objetivo en un explante de tejido que comprende: (a) sintetizar una molécula de siNA de la invención, que puede estar modificada químicamente, en la que una de las hebras de siNA comprende una secuencia complementaria al ARN del gen objetivo y en el que la secuencia de la hebra codificante del siNA comprende una secuencia idéntica o sustancialmente similar a la secuencia del ARN objetivo; y (b) introducir la molécula de siNA en una célula del explante de tejido derivado de un organismo particular en condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión del gen objetivo en el explante de tejido. En otra modalidad, el procedimiento comprende además introducir el explante de tejido otra vez en el organismo del que se derivó el tejido o en otro organismo en condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión del gen objetivo en ese organismo. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento de modular la expresión de más de un gen objetivo en un explante de tejido que comprende: (a) sintetizar moléculas de siNA de la invención, que pueden estar modificadas químicamente, en las que una de las hebras de siNA comprende una secuencia complementaria al ARN de los genes objetivo; y (b) introducir las moléculas de siNA en una célula del explante de tejido derivado de un organismo particular en condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión de los genes objetivo en el explante de tejido. En otra modalidad, el procedimiento comprende además introducir el explante de tejido otra vez en el organismo del que se derivó el tejido o en otro organismo en condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión de los genes objetivo en ese organismo. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento de modular la expresión de un gen objetivo en un sujeto u organismo que comprende: (a) sintetizar una molécula de siNA de la invención, que puede estar modificada químicamente, en la que una de las hebras de siNA comprende una secuencia complementaria al ARN del gen objetivo; y (b) introducir la molécula de siNA en el sujeto u organismo en condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión del gen objetivo en el sujeto u organismo. El nivel de proteína o ARN objetivo puede determinarse usando diversos procedimientos notorios en la técnica. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento de modular la expresión de más de un gen objetivo en un sujeto u organismo que comprende: (a) sintetizar moléculas de siNA de la invención, que pueden estar modificadas químicamente, en las que una de las hebras de siNA comprende una secuencia complementaria al ARN de los genes objetivo; y (b) introducir las moléculas de siNA en el sujeto u organismo en condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión de los genes objetivo en el sujeto u organismo. El nivel de proteína o ARN objetivo puede determinarse tal como se conoce en la técnica.

En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para modular la expresión de un gen objetivo en el interior de una célula, que comprende: (a) sintetizar una molécula de siNA de la invención, que puede estar modificada químicamente, en la que el siNA comprende una secuencia monocatenaria que tiene complementariedad con el ARN del gen objetivo; y (b) introducir la molécula de siNA en una célula en condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión del gen objetivo en la célula. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para modular la expresión de más de un gen objetivo en el interior de una célula, que comprende: (a) sintetizar moléculas de siNA de la invención, que pueden estar modificadas químicamente, en las que el siNA comprende una secuencia monocatenaria que tiene complementariedad con el ARN del gen objetivo; y (b) poner en contacto la célula in vitro o in vivo con la molécula de siNA en condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión de los genes objetivo en la célula. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento de modular la expresión de un gen objetivo en un explante de tejido ((por ejemplo, cualquier órgano, tejido o célula que pueda ser trasplantado de un organismo a otro o de nuevo al mismo organismo del que se deriva el órgano, tejido o célula) que comprende: (a) sintetizar una molécula de siNA de la invención, que puede estar modificada químicamente, en la que el siNA comprende una secuencia monocatenaria que tiene complementariedad con el ARN del gen objetivo; y (b) poner en contacto una célula del explante de tejido derivado de un sujeto u organismo particular con la molécula de siNA en condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión del gen objetivo en el explante de tejido. En otra modalidad, el procedimiento comprende además introducir el explante de tejido otra vez en el sujeto u organismo del que se derivó el tejido o en otro sujeto u organismo en condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión del gen objetivo en ese sujeto u organismo. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento de modular la expresión de más de un gen objetivo en un explante de tejido (por ejemplo, cualquier órgano, tejido o célula que pueda ser trasplantado de un organismo a otro o de nuevo al mismo organismo del que se deriva el órgano, tejido o célula) que comprende: (a) sintetizar moléculas de siNA de la invención, que pueden estar modificadas químicamente, en las que el siNA comprende una secuencia monocatenaria que tiene complementariedad con el ARN del gen objetivo; y (b) introducir las moléculas de siNA en una célula del explante de tejido derivado de un sujeto u organismo particular en condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión de los genes objetivo en el explante de tejido. En otra modalidad, el procedimiento comprende además introducir el explante de tejido otra vez en el sujeto u organismo del que se derivó el tejido o en otro sujeto u organismo en condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión de los genes objetivo en ese sujeto u organismo. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento de modular la expresión de un gen objetivo en un sujeto u organismo que comprende: (a) sintetizar una molécula de siNA de la invención, que puede estar modificada químicamente, en la que el siNA comprende una secuencia monocatenaria que tiene complementariedad con el ARN del gen objetivo; y (b) introducir la molécula de siNA en el sujeto u organismo en condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión del gen objetivo en el sujeto u organismo. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento de modular la expresión de más de un gen objetivo en un sujeto u organismo que comprende: (a) sintetizar moléculas de siNA de la invención, que pueden estar modificadas químicamente, en las que el siNA comprende una secuencia monocatenaria que tiene complementariedad con el ARN del gen objetivo; y (b) introducir las moléculas de siNA en el sujeto u organismo en condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión de los genes objetivo en el sujeto u organismo. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento de modular la expresión de un gen objetivo en un sujeto u organismo que comprende poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención en condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión del gen objetivo en el sujeto u organismo. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno, rasgo o afección relacionada con la expresión o la actividad génicas en un sujeto u organismo que comprende poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen objetivo en el sujeto u organismo. La reducción de la expresión génica y así la reducción del nivel de la proteína/ARN respectivos alivia, en algún grado, los síntomas de la enfermedad, trastorno, rasgo o afección. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir cáncer en un sujeto u organismo que comprende poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen objetivo en el sujeto u organismo mediante lo cual puede lograrse el tratamiento o prevención del cáncer. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante la administración local a tejidos o células relevantes, tales como células y tejidos cancerosos. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante administración sistémica (tal como mediante administración intravenosa o subcutánea de siNA) a tejidos o células relevantes, tales como tejidos o células implicados en el mantenimiento o desarrollo del cáncer en un sujeto u organismo. La molécula de siNA de la invención puede formularse o conjugarse tal como se describe en el presente documento o según se conoce por otros medios en la técnica para dirigirse contra tejidos o células apropiados en el sujeto u organismo. La molécula de siNA puede combinarse con otros tratamientos y modalidades terapéuticas tal cornos se conoce en la técnica para el tratamiento o prevención de cáncer en un sujeto u organismo. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad o afección proliferativa en un sujeto u organismo que comprende poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen objetivo en el sujeto u organismo mediante lo cual puede lograrse el tratamiento o prevención de la enfermedad o afección proliferativa. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante la administración local a tejidos o células relevantes, tales como células y tejidos implicados en la enfermedad proliferativa. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante la administración sistémica (tal como mediante administración intravenosa o subcutánea de siNA) a tejidos o células relevantes, tales como tejidos o células implicados en el mantenimiento o desarrollo de la enfermedad o afección proliferativa en un sujeto u organismo. La molécula de siNA de la invención puede formularse o conjugarse tal como se describe en el presente documento o según se conoce por otros medios en la técnica para dirigirse contra tejidos o células apropiados en el sujeto u organismo. La molécula de siNA puede combinarse con otros tratamientos y modalidades terapéuticas tal cornos se conoce en la técnica para el tratamiento o prevención de enfermedades, rasgos, trastornos o afecciones proliferativos en un sujeto u organismo.

En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir el rechazo de transplantes y/o tejidos (rechazo de aloinjertos) en un sujeto u organismo que comprende poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen objetivo en el sujeto u organismo mediante lo cual puede lograrse el tratamiento o prevención del rechazo de transplantes y/o tejidos (rechazo de aloinjertos). En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante la administración local a tejidos o células relevantes, tales como células y tejidos implicados en rechazo de transplantes y/o tejidos (rechazo de aloinjertos). En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante administración sistémica (tal como mediante administración intravenosa o subcutánea de siNA) a tejidos o células relevantes, tales como tejidos o células implicados en el mantenimiento o desarrollo de rechazo de transplantes y/o tejidos (rechazo de aloinjertos) en un sujeto u organismo. La molécula de siNA de la invención puede formularse o conjugarse tal como se describe en el presente documento o según se conoce por otros medios en la técnica para dirigirse contra tejidos o células apropiados en el sujeto u organismo. La molécula de siNA puede combinarse con otros tratamientos y modalidades terapéuticas como se conoce en la técnica para el tratamiento o prevención de rechazo de transplantes y/o tejidos (rechazo de aloinjertos) en un sujeto u organismo.

En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno, rasgo o afección autoinmunitarios en un sujeto u organismo que comprende poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen objetivo en el sujeto u organismo mediante lo cual puede lograrse el tratamiento o prevención de la enfermedad, trastorno, rasgo o afección autoinmunitarios. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante la administración local a tejidos o células relevantes, tales como células y tejidos implicados en la enfermedad, trastorno, rasgo o afección autoinmunitarios. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante administración sistémica (tal como mediante administración intravenosa o subcutánea de siNA) a tejidos o células relevantes, tales como tejidos o células implicados en el mantenimiento o desarrollo de la enfermedad, trastorno, rasgo o afección autoinmunitarios en un sujeto u organismo. La molécula de siNA de la invención puede formularse o conjugarse tal como se describe en el presente documento o según se conoce por otros medios en la técnica para dirigirse contra tejidos o células apropiados en el sujeto u organismo. La molécula de siNA puede combinarse con otros tratamientos y modalidades terapéuticas tal cornos se conoce en la técnica para el tratamiento o prevención de enfermedades, rasgos, trastornos o afecciones autoinmunitarios en un sujeto u organismo.

En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno, rasgo o afección infecciosos en un sujeto u organismo que comprende poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen objetivo en el sujeto u organismo mediante lo cual puede lograrse el tratamiento o prevención de la enfermedad, trastorno, rasgo o afección infecciosos. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante la administración local a tejidos o células relevantes, tales como células y tejidos implicados en la enfermedad, trastorno, rasgo o afección infecciosos. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante administración sistémica (tal como mediante administración intravenosa o subcutánea de siNA) a tejidos o células relevantes, tales como tejidos o células implicados en el mantenimiento o desarrollo de la enfermedad, trastorno, rasgo o afección infecciosos en un sujeto u organismo. La molécula de siNA de la invención puede formularse o conjugarse tal como se describe en el presente documento o según se conoce por otros medios en la técnica para dirigirse contra tejidos o células apropiados en el sujeto u organismo. La molécula de siNA puede combinarse con otros tratamientos y modalidades terapéuticas tal cornos se conoce en la técnica para el tratamiento o prevención de enfermedades, rasgos o afecciones infecciosos en un sujeto u organismo.

En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir la infección por el virus de la hepatitis B (VHB) en un sujeto, que comprende administrar al sujeto Adefovir Dipivoxil combinado con una molécula de siNA de la invención; en el que el Adefovir Dipivoxil y la molécula de siNA se administran en condiciones adecuadas para reducir o inhibir el nivel de virus de la hepatitis B (VHB) en el sujeto comparado con un sujeto no tratado con el Adefovir Dipivoxil y la molécula de siNA. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención se formula en forma de una composición que se describe en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/678,531 y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/703,946 relacionada, presentada el 29 de julio de 2005, y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/737,024, presentada el 15 de noviembre de 2005 (Vargeese y cois.), todas los cuales se incorporan por referencia al presente documento en su totalidad. Dichas formulaciones de siNA de forma general se denominan "partículas lipídicas de ácido nucleico" (LNP). En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir la infección por el virus de la hepatitis B (VHB) en un sujeto, que comprende administrar al sujeto Lamivudina (3TC) combinada con una molécula de siNA de la invención; en el que la Lamivudina (3TC) y el siNA se administran en condiciones adecuadas para reducir o inhibir el nivel de virus de la hepatitis B (VHB) en el sujeto comparado con un sujeto no tratado con la Lamivudina (3TC) y la molécula de siNA. En una modalidad, la molécula de siNA o molécula bicatenaria de ácido nucleico de la invención se formula en forma de una composición que se describe en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/678,531 y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/703,946 relacionada, presentada el 29 de julio de 2005, y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/737,024, presentada el 15 de noviembre de 2005 (Vargeese y cois.). En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir la infección por el virus de la hepatitis B (VHB) en un sujeto, que comprende administrar al sujeto Adefovir Dipivoxil y Lamivudina (3TC) combinados con una molécula de siNA de la invención; en el que el Adefovir Dipivoxil y la Lamivudina (3TC) y la molécula de siNA se administran en condiciones adecuadas para reducir o inhibir el nivel de virus de la hepatitis B (VHB) en el sujeto comparado con un sujeto no tratado con el Adefovir Dipivoxil y la Lamivudina (3TC) y la molécula de siNA. En una modalidad, la molécula de siNA o molécula bicatenaria de ácido nucleico de la invención se formula en forma de una composición que se describe en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/678,531 y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/703,946 relacionada, presentada el 29 de julio de 2005, y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/737,024, presentada el 15 de noviembre de 2005 (Vargeese y cois.). En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir la infección por el virus de la hepatitis B (VHB) en un sujeto, que comprende administrar al sujeto Adefovir Dipivoxil combinado con una molécula bicatenaria de ácido nucleico sintetizada químicamente; en la que (a) la molécula bicatenaria de ácido nucleico comprende una hebra codificante y una hebra no codificante; (b) cada hebra de la molécula bicatenaria de ácido nucleico tiene de 15 a 28 nucleótidos de longitud; (c) al menos 15 nucleótidos de la hebra codificante son complementarios a la hebra no codificante(d) la hebra no codificante de la molécula bicatenaria de ácido nucleico tiene complementariedad con un ARN del virus de la hepatitis B (VHB) objetivo; y en el que el Adefovir Dipivoxil y la molécula bicatenaria de ácido nucleico se administran en condiciones adecuadas para reducir o inhibir el nivel de virus de la hepatitis B (VHB) en el sujeto comparado con un sujeto no tratado con el Adefovir Dipivoxil y la molécula bicatenaria de ácido nucleico. En una modalidad, la molécula de siNA o molécula bicatenaria de ácido nucleico de la invención se formula en forma de una composición que se describe en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/678,531 y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/703,946 relacionada, presentada el 29 de julio de 2005, y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/737,024, presentada el 15 de noviembre de 2005 (Vargeese y cois.). En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir la infección por el virus de la hepatitis B (VHB) en un sujeto, que comprende administrar al sujeto Lamivudina (3TC) combinada con una molécula bicatenaria de ácido nucleico sintetizada químicamente; en el que (a) la molécula bicatenaria de ácido nucleico comprende una hebra codificante y una hebra no codificante; (b) cada hebra de la molécula bicatenaria de ácido nucleico tiene de 15 a 28 nucleótidos de longitud; (c) al menos 15 nucleótidos de la hebra codificante son complementarios a la hebra no codificante(d) la hebra no codificante de la molécula bicatenaria de ácido nucleico tiene complementariedad con un ARN del virus de la hepatitis B (VHB) objetivo; y en el que la Lamivudina (3TC) y la molécula bicatenaria de ácido nucleico se administran en condiciones adecuadas para reducir o inhibir el nivel de virus de la hepatitis B (VHB) en el sujeto comparado con un sujeto no tratado con la Lamivudina (3TC) y la molécula bicatenaria de ácido nucleico. En una modalidad, la molécula de siNA o molécula bicatenaria de ácido nucleico de la invención se formula en forma de una composición que se describe en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/678,531 y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/703,946 relacionada, presentada el 29 de julio de 2005, y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/737,024, presentada el 15 de noviembre de 2005 (Vargeese y cois.). En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir la infección por el virus de la hepatitis B (VHB) en un sujeto, que comprende administrar al sujeto Adefovir Dipivoxil y Lamivudina (3TC) combinados con una molécula bicatenaria de ácido nucleico sintetizada químicamente; en el que (a) la molécula bicatenaria de ácido nucleico comprende una hebra codificante y una hebra no codificante; (b) cada hebra de la molécula bicatenaria de ácido nucleico tiene de 15 a 28 nucleótidos de longitud; (c) al menos 15 nucleótidos de la hebra codificante son complementarios a la hebra no codificante(d) la hebra no codificante de la molécula bicatenaria de ácido nucleico tiene complementariedad con un ARN del virus de la hepatitis B (VHB) objetivo; y en el que el Adefovir Dipivoxil y Lamivudina (3TC) y la molécula bicatenaria de ácido nucleico se administran en condiciones adecuadas para reducir o inhibir el nivel de virus de la hepatitis B (VHB) en el sujeto comparado con un sujeto no tratado con el Adefovir Dipivoxil y Lamivudina (3TC) y la molécula bicatenaria de ácido nucleico. En una modalidad, la molécula de siNA o molécula bicatenaria de ácido nucleico de la invención se formula en forma de una composición que se describe en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/678,531 y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/703,946 relacionada, presentada el 29 de julio de 2005, y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/737,024, presentada el 15 de noviembre de 2005 (Vargeese y cois.). En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir la infección por el virus de la hepatitis B (VHB) en un sujeto, que comprende administrar al sujeto Adefovir Dipivoxil combinado con una molécula bicatenaria de ácido nucleico sintetizada químicamente; en el que (a) la molécula bicatenaria de ácido nucleico comprende una hebra codificante y una hebra no codificante; (b) cada hebra de la molécula bicatenaria de ácido nucleico tiene de 15 a 28 nucleótidos de longitud; (c) al menos 15 nucleótidos de la hebra codificante son complementarios a la hebra no codificante(d) la hebra no codificante de la molécula bicatenaria de ácido nucleico tiene complementariedad con un ARN del virus de la hepatitis B (VHB) objetivo; (e) al menos 20% de los nucleótidos internos de cada hebra de la molécula bicatenaria de ácido nucleico son nucleósidos modificados que tienen una modificación química; y (f) al menos dos de las modificaciones químicas son diferentes entre sí, y en el que el Adefovir Dipivoxil y la molécula bicatenaria de ácido nucleico se administran en condiciones adecuadas para reducir o inhibir el nivel de virus de la hepatitis B (VHB) en el sujeto comparado con un sujeto no tratado con el Adefovir Dipivoxil y la molécula bicatenaria de ácido nucleico. En una modalidad, la molécula de siNA o molécula bicatenaria de ácido nucleico de la invención se formula en forma de una composición que se describe en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/678,531 y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/703,946 relacionada, presentada el 29 de julio de 2005, y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/737,024, presentada el 15 de noviembre de 2005 (Vargeese y cois.). En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir la infección por el virus de la hepatitis B (VHB) en un sujeto, que comprende administrar al sujeto Lamivudina (3TC) combinada con una molécula bicatenaria de ácido nucleico sintetizada químicamente; en el que (a) la molécula bicatenaria de ácido nucleico comprende una hebra codificante y una hebra no codificante; (b) cada hebra de la molécula bicatenaria de ácido nucleico tiene de 15 a 28 nucleótidos de longitud; (c) al menos 15 nucleótidos de la hebra codificante son complementarios a la hebra no codificante(d) la hebra no codificante de la molécula bicatenaria de ácido nucleico tiene complementariedad con un ARN del virus de la hepatitis B (VHB) objetivo; (e) al menos 20% de los nucleótidos internos de cada hebra de la molécula bicatenaria de ácido nucleico son nucleósidos modificados que tienen una modificación química; y (f) al menos dos de las modificaciones químicas son diferentes entre sí, y en el que la Lamivudina (3TC) y la molécula bicatenaria de ácido nucleico se administran en condiciones adecuadas para reducir o inhibir el nivel de virus de la hepatitis B (VHB) en el sujeto comparado con un sujeto no tratado con la Lamivudina (3TC) y la molécula bicatenaria de ácido nucleico. En una modalidad, la molécula de siNA o molécula bicatenaria de ácido nucleico de la invención se formula en forma de una composición que se describe en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/678,531 y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/703,946 relacionada, presentada el 29 de julio de 2005, y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/737,024, presentada el 15 de noviembre de 2005 (Vargeese y cois.). En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir la infección por el virus de la hepatitis B (VHB) en un sujeto, que comprende administrar al sujeto Adefovir Dipivoxil y Lamivudina (3TC) combinados con una molécula bicatenaria de ácido nucleico sintetizada químicamente; en el que (a) la molécula bicatenaria de ácido nucleico comprende una hebra codificante y una hebra no codificante; (b) cada hebra de la molécula bicatenaria de ácido nucleico tiene de 15 a 28 nucleótidos de longitud; (c) al menos 15 nucleótidos de la hebra codificante son complementarios a la hebra no codificante(d) la hebra no codificante de la molécula bicatenaria de ácido nucleico tiene complementariedad con un ARN del virus de la hepatitis B (VHB) objetivo; (e) al menos 20% de los nucleótidos internos de cada hebra de la molécula bicatenaria de ácido nucleico son nucleósidos modificados que tienen una modificación química; y (f) al menos dos de las modificaciones químicas son diferentes entre sí, y en el que el Adefovir Dipivoxil y la Lamivudina (3TC) y la molécula bicatenaria de ácido nucleico se administran en condiciones adecuadas para reducir o inhibir el nivel de virus de la hepatitis B (VHB) en el sujeto comparado con un sujeto no tratado con el Adefovir Dipivoxil y la Lamivudina (3TC) y la molécula bicatenaria de ácido nucleico. En una modalidad, la molécula de siNA o molécula bicatenaria de ácido nucleico de la invención se formula en forma de una composición que se describe en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/678,531 y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/703,946 relacionada, presentada el 29 de julio de 2005, y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/737,024, presentada el 15 de noviembre de 2005 (Vargeese y cois.). En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir la infección por el virus de la hepatitis B (VHB) en un sujeto, que comprende administrar al sujeto Adefovir Dipivoxil combinado con una molécula bicatenaria de ácido nucleico sintetizada químicamente; en el que (a) la molécula bicatenaria de ácido nucleico comprende una hebra codificante y una hebra no codificante; (b) cada hebra de la molécula bicatenaria de ácido nucleico tiene de 15 a 28 nucleótidos de longitud; (c) al menos 15 nucleótidos de la hebra codificante son complementarios a la hebra no codificante(d) la hebra no codificante de la molécula bicatenaria de ácido nucleico tiene complementariedad con un ARN del virus de la hepatitis B (VHB) objetivo; (e) al menos 20% de los nucleótidos internos de cada hebra de la molécula bicatenaria de ácido nucleico son nucleósidos modificados que tienen una modificación en el azúcar; y (f) al menos dos de las modificaciones de los azúcares son diferentes entre sí, y en el que el Adefovir Dipivoxil y la molécula bicatenaria de ácido nucleico se administran en condiciones adecuadas para reducir o inhibir el nivel de virus de la hepatitis B (VHB) en el sujeto comparado con un sujeto no tratado con el Adefovir Dipivoxil y la molécula bicatenaria de ácido nucleico. En una modalidad, la molécula de siNA o molécula bicatenaria de ácido nucleico de la invención se formula en forma de una composición que se describe en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/678,531 y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/703,946 relacionada, presentada el 29 de julio de 2005, y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/737,024, presentada el 15 de noviembre de 2005 (Vargeese y cois.). En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir la infección por el virus de la hepatitis B (VHB) en un sujeto, que comprende administrar al sujeto Lamivudina (3TC) combinada con una molécula bicatenaria de ácido nucleico sintetizada químicamente; en el que (a) la molécula bicatenaria de ácido nucleico comprende una hebra codificante y una hebra no codificante; (b) cada hebra de la molécula bicatenaria de ácido nucleico tiene de 15 a 28 nucleótidos de longitud; (c) al menos 15 nucleótidos de la hebra codificante son complementarios a la hebra no codificante(d) la hebra no codificante de la molécula bicatenaria de ácido nucleico tiene complementariedad con un ARN del virus de la hepatitis B (VHB) objetivo; (e) al menos 20% de los nucleótidos internos de cada hebra de la molécula bicatenaria de ácido nucleico son nucleósidos modificados que tienen una modificación en el azúcar; y (f) al menos dos de las modificaciones de los azúcares son diferentes entre sí, y en el que la Lamivudina (3TC) y la molécula bicatenaria de ácido nucleico se administran en condiciones adecuadas para reducir o inhibir el nivel de virus de la hepatitis B (VHB) en el sujeto comparado con un sujeto no tratado con la Lamivudina (3TC) y la molécula bicatenaria de ácido nucleico. En una modalidad, la molécula de siNA o molécula bicatenaria de ácido nucleico de la invención se formula en forma de una composición que se describe en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/678,531 y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/703,946 relacionada, presentada el 29 de julio de 2005, y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/737,024, presentada el 15 de noviembre de 2005 (Vargeese y cois.). En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir la infección por el virus de la hepatitis B (VHB) en un sujeto, que comprende administrar al sujeto Adefovir Dipivoxil y Lamivudina (3TC) combinados con una molécula bicatenaria de ácido nucleico sintetizada químicamente; en el que (a) la molécula bicatenaria de ácido nucleico comprende una hebra codificante y una hebra no codificante; (b) cada hebra de la molécula bicatenaria de ácido nucleico tiene de 15 a 28 nucleótidos de longitud; (c) al menos 15 nucleótidos de la hebra codificante son complementarios a la hebra no codificante(d) la hebra no codificante de la molécula bicatenaria de ácido nucleico tiene complementariedad con un ARN del virus de la hepatitis B (VHB) objetivo; (e) al menos 20% de los nucleótidos internos de cada hebra de la molécula bicatenaria de ácido nucleico son nucleósidos modificados que tienen una modificación en el azúcar; y (f) al menos dos de las modificaciones de los azúcares son diferentes entre sí, y en el que el Adefovir Dipivoxil y la Lamivudina (3TC) y la molécula bicatenaria de ácido nucleico se administran en condiciones adecuadas para reducir o inhibir el nivel de virus de la hepatitis B (VHB) en el sujeto comparado con un sujeto no tratado con el Adefovir Dipivoxil y la Lamivudina (3TC) y la molécula bicatenaria de ácido nucleico. En una modalidad, la molécula de siNA o molécula bicatenaria de ácido nucleico de la invención se formula en forma de una composición que se describe en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/678,531 y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/703,946 relacionada, presentada el 29 de julio de 2005, y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/737,024, presentada el 15 de noviembre de 2005 (Vargeese y cois.).

En una modalidad, la invención presenta una composición que comprende Adefovir Dipivoxil y una o más moléculas bicatenarias de ácido nucleico o moléculas de siNA de la invención en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención presenta una composición que comprende Adefovir Dipivoxil, Lamivudina, y una o más moléculas bicatenarias de ácido nucleico o moléculas de siNA de la invención en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno, rasgo o afección relacionados con el envejecimiento en un sujeto u organismo que comprende poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen objetivo en el sujeto u organismo mediante lo cual puede lograrse el tratamiento o prevención de la enfermedad, trastorno, rasgo o afección relacionados con el envejecimiento. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante la administración local a tejidos o células relevantes, tales como células y tejidos implicados en la enfermedad, trastorno, rasgo o afección relacionados con el envejecimiento. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante administración sistémica (tal como mediante administración intravenosa o subcutánea de siNA) a tejidos o células relevantes, tales como tejidos o células implicados en el mantenimiento o desarrollo de la enfermedad, trastorno, rasgo o afección relacionados con el envejecimiento en un sujeto u organismo. La molécula de siNA de la invención puede formularse o conjugarse tal como se describe en el presente documento o según se conoce por otros medios en la técnica para dirigirse contra tejidos o células apropiados en el sujeto u organismo. La molécula de siNA puede combinarse con otros tratamientos y modalidades terapéuticas tal cornos se conoce en la técnica para el tratamiento o prevención de enfermedades, rasgos, trastornos o afecciones relacionados con el envejecimiento en un sujeto u organismo. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno, rasgo o afección neurológicos o neurodegenerativos en un sujeto u organismo que comprende poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen objetivo en el sujeto u organismo mediante lo cual puede lograrse el tratamiento o prevención de la enfermedad, trastorno, rasgo o afección neurológicos o neurodegenerativos. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante la administración local a tejidos o células relevantes, tales como células y tejidos implicados en la enfermedad, trastorno, rasgo o afección neurológicos o neurodegenerativos. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante administración sistémica (tal como mediante administración intravenosa o subcutánea de siNA) a tejidos o células relevantes, tales como tejidos o células implicados en el mantenimiento o desarrollo de la enfermedad, trastorno, rasgo o afección neurológicos o neurodegenerativos en un sujeto u organismo. La molécula de siNA de la invención puede formularse o conjugarse tal como se describe en el presente documento o según se conoce por otros medios en la técnica para dirigirse contra tejidos o células apropiados en el sujeto u organismo. La molécula de siNA puede combinarse con otros tratamientos y modalidades terapéuticas tal cornos se conoce en la técnica para el tratamiento o prevención de enfermedades, rasgos, trastornos o afecciones neurológicos o neurodegenerativos en un sujeto u organismo. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno, rasgo o afección respiratorios en un sujeto u organismo que comprende poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen objetivo en el sujeto u organismo mediante lo cual puede lograrse el tratamiento o prevención de la enfermedad, trastorno, rasgo o afección respiratorios. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante la administración local a tejidos o células relevantes, tales como células y tejidos implicados en la enfermedad, trastorno, rasgo o afección respiratorios. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante administración sistémica (tal como mediante administración intravenosa o subcutánea de siNA) a tejidos o células relevantes, tales como tejidos o células implicados en el mantenimiento o desarrollo de la enfermedad, trastorno, rasgo o afección respiratorios en un sujeto u organismo. La molécula de siNA de la invención puede formularse o conjugarse tal como se describe en el presente documento o según se conoce por otros medios en la técnica para dirigirse contra tejidos o células apropiados en el sujeto u organismo. La molécula de siNA puede combinarse con otros tratamientos y modalidades terapéuticas tal cornos se conoce en la técnica para el tratamiento o prevención de enfermedades, rasgos, trastornos o afecciones respiratorios en un sujeto u organismo. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno, rasgo o afección oculares en un sujeto u organismo que comprende poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen objetivo en el sujeto u organismo mediante lo cual puede lograrse el tratamiento o prevención de la enfermedad, trastorno, rasgo o afección oculares. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante la administración local a tejidos o células relevantes, tales como células y tejidos implicados en la enfermedad, trastorno, rasgo o afección oculares. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante administración sistémica (tal como mediante administración intravenosa o subcutánea de siNA) a tejidos o células relevantes, tales como tejidos o células implicados en el mantenimiento o desarrollo de la enfermedad, trastorno, rasgo o afección oculares en un sujeto u organismo. La molécula de siNA de la invención puede formularse o conjugarse tal como se describe en el presente documento o según se conoce por otros medios en la técnica para dirigirse contra tejidos o células apropiados en el sujeto u organismo. La molécula de siNA puede combinarse con otros tratamientos y modalidades terapéuticas tal cornos se conoce en la técnica para el tratamiento o prevención de enfermedades, rasgos, trastornos o afecciones oculares en un sujeto u organismo. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno, rasgo o afección dermatológicos en un sujeto u organismo que comprende poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen objetivo en el sujeto u organismo mediante lo cual puede lograrse el tratamiento o prevención de la enfermedad, trastorno, rasgo o afección dermatológicos. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante la administración local a tejidos o células relevantes, tales como células y tejidos implicados en la enfermedad, trastorno, rasgo o afección dermatológicos. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante administración sistémica (tal como mediante administración intravenosa o subcutánea de siNA) a tejidos o células relevantes, tales como tejidos o células implicados en el mantenimiento o desarrollo de la enfermedad, trastorno, rasgo o afección dermatológicos en un sujeto u organismo. La molécula de siNA de la invención puede formularse o conjugarse tal como se describe en el presente documento o según se conoce por otros medios en la técnica para dirigirse contra tejidos o células apropiados en el sujeto u organismo. La molécula de siNA puede combinarse con otros tratamientos y modalidades terapéuticas tal cornos se conoce en la técnica para el tratamiento o prevención de enfermedades, rasgos, trastornos o afecciones dermatológicos en un sujeto u organismo. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno, rasgo o afección hepáticos (por ejemplo, hepatitis, HCV, VHB, diabetes, cirrosis, carcinoma hepatocelular etc.) en un sujeto u organismo que comprende poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen objetivo en el sujeto u organismo mediante lo cual puede lograrse el tratamiento o prevención de la enfermedad, trastorno, rasgo o afección hepáticos. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante la administración local a tejidos o células relevantes, tales como células y tejidos hepáticos implicados en la enfermedad, trastorno, rasgo o afección hepáticos. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante administración sistémica (tal como mediante administración intravenosa o subcutánea de siNA) a tejidos o células relevantes, tales como tejidos o células implicados en el mantenimiento o desarrollo de la enfermedad, trastorno, rasgo o afección hepáticos en un sujeto u organismo. La molécula de siNA de la invención puede formularse o conjugarse tal como se describe en el presente documento o según se conoce por otros medios en la técnica para dirigirse contra tejidos o células apropiados en el sujeto u organismo. La molécula de siNA puede combinarse con otros tratamientos y modalidades terapéuticas tal cornos se conoce en la técnica para el tratamiento o prevención de enfermedades, rasgos, trastornos o afecciones hepáticos en un sujeto u organismo. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno, rasgo o afección renales (por ejemplo, enfermedad renal poliquística, etc.) en un sujeto u organismo que comprende poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen objetivo en el sujeto u organismo mediante lo cual puede lograrse el tratamiento o prevención de la enfermedad, trastorno, rasgo o afección renales. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante la administración local a tejidos o células relevantes, tales como células y tejidos renales implicados en la enfermedad, trastorno, rasgo o afección renales. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante administración sistémica (tal como mediante administración intravenosa o subcutánea de siNA) a tejidos o células relevantes, tales como tejidos o células implicados en el mantenimiento o desarrollo de la enfermedad, trastorno, rasgo o afección renales en un sujeto u organismo. La molécula de siNA de la invención puede formularse o conjugarse tal como se describe en el presente documento o según se conoce por otros medios en la técnica para dirigirse contra tejidos o células apropiados en el sujeto u organismo. La molécula de siNA puede combinarse con otros tratamientos y modalidades terapéuticas tal cornos se conoce en la técnica para el tratamiento o prevención de enfermedades, rasgos, trastornos o afecciones renales en un sujeto u organismo. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno, rasgo o afección auditivos (por ejemplo, pérdida auditiva, sordera, etc.) en un sujeto u organismo que comprende poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen objetivo en el sujeto u organismo mediante lo cual puede lograrse el tratamiento o prevención de la enfermedad, trastorno, rasgo o afección auditivos. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante la administración local a tejidos o células relevantes, tales como células y tejidos del oido, oído interno u oído medio, implicados en la enfermedad, trastorno, rasgo o afección auditivos. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante administración sistémica (tal como mediante administración intravenosa o subcutánea de siNA) a tejidos o células relevantes, tales como tejidos o células implicados en el mantenimiento o desarrollo de la enfermedad, trastorno, rasgo o afección auditivos en un sujeto u organismo. La molécula de siNA de la invención puede formularse o conjugarse tal como se describe en el presente documento o según se conoce por otros medios en la técnica para dirigirse contra tejidos o células apropiados en el sujeto u organismo. La molécula de siNA puede combinarse con otros tratamientos y modalidades terapéuticas tal comos se conoce en la técnica para el tratamiento o prevención de enfermedades, rasgos, trastornos o afecciones auditivos en un sujeto u organismo. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir una o más enfermedades, rasgos, o afecciones metabólicos en un sujeto u organismo que comprende poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen objetivo en el sujeto u organismo mediante lo cual puede lograrse el tratamiento o prevención de la(s) enfermedad(es), rasgo(s), o afección(es) metabólico(s). En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante la administración local a tejidos o células relevantes. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante administración sistémica (tal como mediante administración intravenosa, intramuscular, subcutánea o Gl de siNA) a tejidos o células relevantes, tales como tejidos o células implicados en el mantenimiento o desarrollo de la enfermedad, rasgo o afección metabólicos en un sujeto u organismo (por ejemplo, tejido o células hepáticos, pancreáticos, del intestino delgado o adiposos). La molécula de siNA de la invención puede formularse o conjugarse tal como se describe en el presente documento o según se conoce por otros medios en la técnica para dirigirse contra tejidos o células apropiados en el sujeto u organismo (por ejemplo, tejido o células hepáticos, pancreáticos, del intestino delgado o adiposos). La molécula de siNA puede combinarse con otros tratamientos y modalidades terapéuticas tal comos se conoce en la técnica para el tratamiento o prevención de enfermedades, rasgos o afecciones metabólicos en un sujeto u organismo. En una modalidad, la enfermedad metabólica se selecciona del grupo constituido por hipercolesterolemia, hiperlipemia, dislipidemia, diabetes (por ejemplo, diabetes de tipo I y/o de tipo II), resistencia a la insulina, obesidad, o afecciones relacionadas, que incluyen pero sin limitación a apnea del sueño, hernia de hiato, esofagitis de reflujo, artrosis, gota, cánceres asociados a subida de peso, cálculos biliares, cálculos renales, hipertensión pulmonar, infertilidad, enfermedad cardiovascular, peso superior al normal, y niveles lipidíeos, niveles de ácido úrico o niveles de oxalato superiores a los normales. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir una o más enfermedades, rasgos, o afecciones metabólicos en un sujeto u organismo que comprende poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención en condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión de un inhibidor de la expresión génica en el sujeto u organismo. En una modalidad, el inhibidor de la expresión génica es un miARN. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir una o más enfermedades, rasgos, o afecciones cardiovasculares en un sujeto u organismo que comprende poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen objetivo en el sujeto u organismo mediante lo cual puede lograrse el tratamiento o prevención de la(s) enfermedad(es), rasgo(s), o afección(es) cardiovascular(es). En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante la administración local a tejidos o células relevantes, por ejemplo, tejidos o células hepáticos, pancreáticos, de intestino delgado o adiposos. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante la administración sistémica (tal como mediante administración intravenosa, intramuscular, subcutánea o Gl de siNA) a tejidos o células relevantes, tales como tejidos o células implicados en el mantenimiento o desarrollo de la enfermedad, rasgo, o afección cardiovasculares en un sujeto u organismo. La molécula de siNA de la invención puede formularse o conjugarse tal como se describe en el presente documento o según se conoce por otros medios en la técnica para dirigirse contra tejidos o células apropiados en el sujeto u organismo. La molécula de siNA puede combinarse con otros tratamientos y modalidades terapéuticas tal comos se conoce en la técnica para el tratamiento o prevención de enfermedades, rasgos o afecciones cardiovasculares en un sujeto u organismo. En una modalidad la enfermedad cardiovascular se selecciona del grupo constituido por hipertensión, trombosis coronaria, ictus, síndromes lipidíeos, hiperglucemia, hipertrigliceridemia, hiperlipemia, isquemia, insuficiencia cardiaca congestiva, e infarto de miocardio. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir una o más enfermedades, rasgos, o afecciones cardiovasculares en un sujeto u organismo que comprende poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención en condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión de un inhibidor de la expresión génica en el sujeto u organismo. En una modalidad, el inhibidor de la expresión génica es un miARN. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para la pérdida de peso en un sujeto u organismo que comprende poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen objetivo en el sujeto u organismo mediante lo cual puede lograrse la pérdida de peso. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante la administración local a tejidos o células relevantes, por ejemplo, tejidos o células hepáticos, pancreáticos, de intestino delgado o adiposos. En una modalidad, la invención presenta poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de siNA de la invención mediante administración sistémica (tal como mediante administración intravenosa, intramuscular, subcutánea o Gl de siNA) a tejidos o células relevantes. La molécula de siNA de la invención puede formularse o conjugarse tal como se describe en el presente documento o según se conoce por otros medios en la técnica para dirigirse contra tejidos o células apropiados en el sujeto u organismo. La molécula de siNA puede combinarse con otros tratamientos y modalidades terapéuticas como se conoce en la técnica para la pérdida de peso en un sujeto u organismo. En una modalidad, la molécula de siNA o molécula bicatenaria de ácido nucleico de la invención se formula en forma de una composición que se describe en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/678,531 y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/703,946 relacionada, presentada el 29 de julio de 2005, la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/737,024, presentada el 15 de noviembre de 2005, y el documento USSN 11/353,630, presentado el 14 de febrero de 2006 (Vargeese y cois.). En cualquiera de los procedimientos del presente documento para modular la expresión de una o más objetivos o para tratar o prevenir enfermedades, rasgos, afecciones, o fenotipos en una célula, sujeto, u organismo, la molécula de siNA de la invención modula la expresión de una o más objetivos mediante interferencia del ARN. En una modalidad, la interferencia del ARN es la escisión mediada por RISC de la objetivo (por ejemplo, interferencia del ARN mediada por siARN). En una modalidad, la interferencia del ARN es la inhibición de la traducción de la objetivo (por ejemplo, interferencia del ARN mediada por miARN). En una modalidad, la interferencia del ARN es la inhibición de la transcripción de la objetivo (por ejemplo, silenciamiento de la traducción mediado por miARN). En una modalidad, la interferencia del ARN se produce en el citoplasma. En una modalidad, la interferencia del ARN se produce en el núcleo. En cualquiera de los procedimientos de tratamiento de la invención, el siNA puede administrarse al sujeto en forma de una tanda de tratamiento, por ejemplo administración en diversos intervalos de tiempo, tales como una vez al día durante la tanda de tratamiento, una vez cada dos días durante la tanda de tratamiento, una vez cada tres días durante la tanda de tratamiento, una vez cada cuatro días durante la tanda de tratamiento, una vez cada cinco días durante la tanda de tratamiento, una vez cada seis días durante la tanda de tratamiento, una vez a la semana durante la tanda de tratamiento, una vez cada dos semanas durante la tanda de tratamiento, una vez al mes durante la tanda de tratamiento, etc. En una modalidad, la tanda de tratamiento es una vez cada 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 semanas. En una modalidad, la tanda de tratamiento tiene de aproximadamente una a aproximadamente 52 semanas o más (por ejemplo, de forma indefinida). En una modalidad, la tanda de tratamiento tiene de aproximadamente uno a aproximadamente 48 meses o más (por ejemplo, de forma indefinida). En una modalidad, una tanda de tratamiento implica una tanda de tratamiento inicial, tal como una vez cada 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más semanas durante un intervalo fijo (por ejemplo, 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x o más) seguido de una tanda de tratamiento de mantenimiento, tal como una vez cada 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, o más semanas durante un intervalo fijo adicional (por ejemplo, 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x o más). En cualquiera de los procedimientos de tratamiento de la invención, el siNA puede administrarse al sujeto por vía sistémica tal como se describe en el presente documento o por otros medios conocidos en la técnica, ya sea solo en monoterapia o combinado con terapias adicionales que se describen en el presente documento o como se conoce en la técnica. La administración sistémica puede incluir, por ejemplo, pulmonar (inhalación, nebulización etc.) intravenosa, subcutánea, intramuscular, cateterización, nasofaríngea, transdérmica, u administración oral/gastrointestinal tal como se conoce de forma general en la técnica. En una modalidad, en cualquiera de los procedimientos de tratamiento o prevención de la invención, el siNA puede administrarse al sujeto de forma local o a tejidos locales tal como se describe en el presente documento o por otros medios conocidos en la técnica, ya sea solo en monoterapia o combinado con terapias adicionales como se conoce en la técnica. La administración local puede incluir, por ejemplo, inhalación, nebulización, cateterización, implante, inyección directa, aplicación dérmica/transdérmica, por endoprótesis, gotas óticas, colirios o administración a la vena porta a los tejidos relevantes, o cualquier otra técnica, método o procedimiento de administración local, tal como se conoce de forma general en la técnica. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para administrar moléculas de siNA y composiciones de la invención al oído interno que comprende poner en contacto el siNA con células, tejidos, o estructuras del oído interno, en condiciones adecuadas para la administración. En una modalidad, la administración comprende procedimientos y dispositivos tal como se describen en las patentes de Estados Unidos NJ 5,421 ,818, 5,476,446, 5,474,529, 6,045,528, 6,440,102, 6,685,697, 6,120,484; y 5,572,594; todas las cuales se incorporan por referencia al presente documento y las enseñanzas de Silverstein, 1999, Ear Nose Throat J., 78, 595-8, 600; y Jackson y Silverstein, 2002, Otolaryngol Clin North Am., 35, 639-53, y adaptados para usar las moléculas de siNA de la invención. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento de modular la expresión de más de un gen objetivo en un sujeto u organismo que comprende poner en contacto el sujeto u organismo con una o más moléculas de siNA de la invención en condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión de los genes objetivo en el sujeto u organismo. Las moléculas de siNA de la invención pueden diseñarse para regular por disminución o inhibir la expresión del gen objetivo dirigiendo la ARNi de una variedad de moléculas de ácido nucleico. En una modalidad, las moléculas de siNA de la invención se usan para dirigirlas contra diversos DNA que corresponden a un gen objetivo, por ejemplo mediante silenciamiento heterocromático o inhibición de la transcripción. En una modalidad, las moléculas de siNA de la invención se usan para dirigirlas contra diversos ARN que corresponden a un gen objetivo, por ejemplo mediante escisión del ARN objetivo o inhibición de la traducción. Ejemplos no limitantes de dichos ARN incluyen ARN mensajero (mARN), ARN no codificante (ncARN) o elementos reguladores (véase por ejemplo Mattick, 2005, Science, 309, 1527-1528 y Claverie de 2005, Science, 309, 1529-1530) que incluyen miARN y otros ARN cortos, variantes alternativas del ayuste de ARN del (de los) gen(es) objetivo, ARN de gen(es) objetivo modificado postranscripcionalmente, pre-mARN de gen(es) objetivo, y/o plantillas de ARN. Si el ayuste alternativo produce una familia de transcritos que se distinguen usando exones apropiados, la presente invención puede usarse para inhibir la expresión génica a través de los exones apropiados para inhibir de forma específica o para distinguir entre las funciones de los miembros de la familia génica. Por ejemplo, una proteina que contiene un dominio transmembrana con ayuste alternativo puede expresarse tanto en la forma unida a la membrana como segregada. El uso de la invención para dirigirse contra el exón que contiene el dominio transmembrana puede usarse para determinar las consecuencias sobre la función de la dirección farmacéutica de la forma de la proteína unida a la membrana comparada con la forma segregada. Ejemplos no limitantes de aplicaciones de la invención referidas a la dirección de estas moléculas de ARN incluyen aplicaciones terapeuticofarmacéuticas, aplicaciones cosméticas, aplicaciones veterinarias, aplicaciones de descubrimiento de fármacos, diagnóstico molecular y aplicaciones de funciones génicas, y mapeo génico usando por ejemplo mapeo de polimorfismo nucleotídico único con moléculas de siNA de la invención. Dichas aplicaciones pueden implementarse usando secuencias génicas conocidas o a partir de secuencias parciales disponibles a partir de un marcador de secuencia expresado (EST). En otra modalidad, las moléculas de siNA de la invención se usan para dirigirse contra secuencias conservadas que corresponden a una familia génica o familias génicas tales como familias génicas que tienen secuencias homologas. Así, las moléculas de siNA que se dirigen contra genes múltiples o ARN objetivo pueden proporcionar un mayor efecto terapéutico. En una modalidad, la invención presenta la dirección (escisión o inhibición de la expresión o función) de más de una secuencia de un gen objetivo usando una única molécula de siNA, dirigiendo las secuencias conservadas del gen objetivo. En una modalidad, pueden usarse moléculas de siNA para caracterizar rutas de función génica en una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, la presente invención puede usarse para inhibir la actividad de gen(es) objetivo en una ruta para determinar la función de los gen(es) no caracterizado(s) en el análisis de la función génica, análisis de la función de mARN o análisis de la traducción. La invención puede usarse para determinar rutas de genes objetivo potenciales implicados en diversas enfermedades y afecciones para el desarrollo farmacéutico. La invención puede usarse para comprender las rutas de expresión génica implicadas, por ejemplo en las enfermedades, trastornos, rasgos y afecciones del presente documento o conocidos por otros medios en la técnica. En una modalidad, la molécula de siNA(s) y/o los procedimientos de la invención se usan para regular por disminución la expresión de gen(es) que codifican ARN denominados por su número de acceso de GenBank, por ejemplo, genes objetivo que codifican secuencia(s) de ARN denominados en el presente documento por el número de acceso de GenBank, por ejemplo, el nJ de acceso de GenBank que se describe en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/363,124, USSN 10/923,536 y PCT/US03/05028, todas las cuales se incorporan por referencia al presente documento. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento que comprende: (a) generar una colección de construcciones de siNA que tienen una complejidad predeterminada; y (b) ensayar las construcciones de siNA de (a) anterior, en condiciones adecuadas para determinar los sitios objetivo de ARNi en el interior de el la secuencia del ARN objetivo. En una modalidad, las moléculas de siNA de (a) tienen hebras de una longitud fija, por ejemplo, aproximadamente 23 nucleótidos de longitud. En otra modalidad, las moléculas de siNA de (a) son de diferente longitud, por ejemplo tienen hebras de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) nucleótidos de longitud. En una modalidad, el ensayo puede comprender un ensayo de siNA reconstituido in vitro siNA tal como se describe en el presente documento. En otra modalidad, el ensayo puede comprender un sistema de cultivo celular en el que se expresa el ARN objetivo. En otra modalidad, se analizan fragmentos de ARN objetivo para determinar niveles detectables de escisión, por ejemplo mediante electroforesis en gel, análisis por transferencia northern, o ensayos de protección contra ARNsas para determinar los sitio(s) objetivo más adecuados en el interior de la secuencia del ARN objetivo. La secuencia del ARN objetivo puede obtenerse tal como se conoce en la técnica, por ejemplo, mediante clonación y/o transcripción para los sistemas in vitro, y por expresión celular en los sistemas in vivo. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento que comprende: (a) generar una colección aleatoria de construcciones de siNA que tienen una complejidad predeterminada, tal como de ^. donde N representa el número de nucleótidos emparejados en cada de la construcción de hebras de siNA (por ejemplo para una construcción de siNA que tiene hebras codificante y no codificante de 21 nucleótidos con 19 pares de bases, la complejidad sería 4^9); y (b) evaluar las construcciones de siNA de (a) anterior, en condiciones adecuadas para determinar los sitios objetivo del ARNi en el interior de la secuencia del ARN objetivo. En otra modalidad, las moléculas de siNA de (a) tienen hebras de una longitud fija, por ejemplo, aproximadamente 23 nucleótidos de longitud. Todavía en otra modalidad, las moléculas de siNA de (a) son de diferente longitud, por ejemplo tienen hebras de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) nucleótidos de longitud. En una modalidad, el ensayo puede comprender un ensayo de siNA reconstituido in vitro siNA tal como se describe en el Ejemplo 6 en el presente documento. En otra modalidad, el ensayo puede comprender un sistema de cultivo celular en el que se expresa el ARN objetivo. En otra modalidad, se analizan fragmentos de ARN objetivo para determinar niveles detectables de escisión, por ejemplo mediante electroforesis en gel, análisis por transferencia northern, o ensayos de protección contra ARNsas para determinar los sitio(s) objetivo más adecuados en el interior de la secuencia del ARN objetivo. La secuencia del ARN objetivo puede obtenerse tal como se conoce en la técnica, por ejemplo, mediante clonación y/o transcripción para los sistemas in vitro, y por expresión celular en los sistemas in vivo. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento que comprende: (a) analizar la secuencia de un ARN objetivo codificada por un gen objetivo; (b) sintetizar uno o más conjuntos de moléculas de siNA que tienen una secuencia complementaria a una o más regiones del ARN de (a); y (c) ensayar las moléculas de siNA de (b) en condiciones adecuadas para determinar las objetivos de la ARNi en el interior de la secuencia del ARN objetivo. En una modalidad, las moléculas de siNA de (b) tienen hebras de una longitud fija, por ejemplo, aproximadamente 23 nucleótidos de longitud.

En otra modalidad, las moléculas de siNA de (b) son de diferente longitud, por ejemplo tienen hebras de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) nucleótidos de longitud. En una modalidad, el ensayo puede comprender un ensayo de siNA reconstituido in vitro siNA tal como se describe en el presente documento. En otra modalidad, el ensayo puede comprender un sistema de cultivo celular en el que se expresa el ARN objetivo. Se analizan fragmentos de ARN objetivo para determinar niveles detectables de escisión, por ejemplo mediante electroforesis en gel, análisis por transferencia northern, o ensayos de protección contra ARNsas para determinar los sitio(s) objetivo más adecuados en el interior de la secuencia del ARN objetivo. La secuencia del ARN objetivo puede obtenerse tal como se conoce en la técnica, por ejemplo, mediante clonación y/o transcripción para los sistemas in vitro, y por expresión en los sistemas in vivo. Con "sitio objetivo" se quiere decir una secuencia en el interior de un ARN objetivo que es el "objetivo" de la escisión mediada por una construcción de siNA que contiene secuencias en el interior de su región no codificante que son complementarias a la secuencia objetivo. Con "nivel de escisión detectable" se quiere decir escisión de ARN objetivo (y formación de ARN productos escindidos) en un grado suficiente para discernir los productos de escisión de los ARN de fondo producidos mediante degradación aleatoria del ARN objetivo. La producción de los productos de escisión a partir del 1-5% del ARN objetivo es suficiente para detectar sobre el fondo para la mayoría de los procedimientos de detección. En una modalidad, la invención presenta una composición que comprende una molécula de siNA de la invención, que puede estar modificada químicamente, en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende moléculas de siNA de la invención, que pueden estar modificadas químicamente, dirigidas a uno o más genes en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para diagnosticar una enfermedad, rasgo o afección en un sujeto que comprende administrar al sujeto una composición de la invención en condiciones adecuadas para el diagnóstico de la enfermedad, rasgo o afección en el sujeto. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad, rasgo o afección, tal como enfermedades, rasgos, afecciones, o trastornos metabólicos y/o cardiovasculares en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición de la invención en condiciones adecuadas para el tratamiento o prevención de la enfermedad, rasgo o afección en el sujeto, solos o junto con otro u otros compuestos terapéuticos. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para validar un gen objetivo, que comprende: (a) sintetizar una molécula de siNA de la invención, que puede estar modificada químicamente, en la que una de las hebras de siNA incluye una secuencia complementaria al ARN de un gen objetivo; (b) introducir la molécula de siNA en una célula, tejido, sujeto, u organismo en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen objetivo en la célula, tejido, sujeto, u organismo; y (c) determinar la función del gen mediante un ensayo para determinar cualquier cambio fenotípico en la célula, tejido, sujeto, u organismo. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para validar una objetivo que comprende: (a) sintetizar una molécula de siNA de la invención, que puede estar modificada químicamente, en la que una de las hebras de siNA incluye una secuencia complementaria al ARN de un gen objetivo; (b) introducir la molécula de siNA en un sistema biológico en condiciones adecuadas para modular expresión del gen objetivo en el sistema biológico; y (c) determinar la función del gen mediante un ensayo para determinar cualquier cambio fenotípico en el sistema biológico. Con "sistema biológico" se quiere decir, material, en forma purificada o no purificada, de fuentes biológicas que incluye, pero sin limitación, un ser humano o animal, en el que el sistema comprende los componentes necesarios para la actividad de ARNi. El término "sistema biológico" incluye, por ejemplo, una célula, tejido, sujeto, u organismo, o extracto de los mismos. El término sistema biológico también incluye sistemas de ARNi reconstituidos que pueden usarse en un entorno in vitro. Con "cambio fenotípico" se quiere decir cualquier cambio detectable a una célula que se produce en respuesta ala contacto o tratamiento con una molécula de ácido nucleico de la invención (por ejemplo, siNA). Dichos cambios detectables incluyen, pero sin limitación, cambios en forma, tamaño, proliferación, movilidad, expresión de proteínas o expresión de ARN u otros cambios físicos o químicos que puedan ensayarse mediante procedimientos conocidos en la técnica. Los cambios detectables también pueden incluir la expresión de genes testigo/moléculas tales como Proteína fluorescente verde (GFP) o diversos marcadores que se usan para identificar una proteína expresada o cualquier otro componente celular que pueda ensayarse. En una modalidad, la invención presenta un kit que contiene una molécula de siNA de la invención, que puede estar modificada químicamente, que puede usarse para modular la expresión de un gen objetivo en un sistema biológico, que incluye, por ejemplo, en una célula, tejido, sujeto, u organismo. En otra modalidad, la invención presenta un kit que contiene más de una molécula de siNA de la invención, que puede estar modificada quimicamente, que puede usarse para modular la expresión de más de un gen objetivo en un sistema biológico, que incluye, por ejemplo, en una célula, tejido, sujeto, u organismo. En una modalidad, la invención presenta una célula que contiene una o más moléculas de siNA de la invención, que pueden estar modificadas químicamente. En otra modalidad, la célula que contiene una molécula de siNA de la invención es una célula de mamífero. Todavía en otra modalidad, la célula que contiene una molécula de siNA de la invención es una célula humana.

En una modalidad, la síntesis de una molécula de siNA de la invención, que puede estar modificada quimicamente, comprende: (a) síntesis de dos hebras complementarias de la molécula de siNA; (b) hibridación de las dos hebras complementarias en condiciones adecuadas para obtener una molécula bicatenaria de siNA. En otra modalidad, la síntesis de las dos hebras complementarias de la molécula de siNA es mediante síntesis de oligonucleótidos en fase sólida. Todavía en otra modalidad, la síntesis de las dos hebras complementarias de la molécula de siNA es mediante síntesis de oligonucleótidos en fase sólida en tándem. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para sintetizar una molécula bicatenaria de siNA que comprende: (a) sintetizar una primera hebra de secuencia de oligonucleótidos de la molécula de siNA, en la que la primera hebra de la secuencia de oligonucleótidos comprende una molécula enlazadora escindible que puede usarse como armazón para la síntesis de la segunda hebra de la secuencia de oligonucleótidos del siNA; (b) sintetizar la segunda hebra de la secuencia de oligonucleótidos de siNA en el armazón de la primera hebra de la secuencia de oligonucleótidos, en el que la segunda hebra de la secuencia de oligonucleótidos comprende además un resto químico que puede usarse para purificar la molécula bicatenaria de siNA; (c) escindir la molécula enlazadora de (a) en condiciones adecuadas para que se hibriden las dos hebras oligonucleotídicas de siNA y formen una molécula bicatenaria estable; y (d) purificar la molécula bicatenaria de siNA utilizando el resto químico de la segunda hebra de la secuencia de oligonucleótidos. En una modalidad, la escisión de la molécula enlazadora en (c) anterior se produce durante la desprotección del oligonucleótido, por ejemplo, en condiciones de hidrólisis usando una base de alquilamina tal como metilamina. En una modalidad, el procedimiento de síntesis comprende síntesis en fase sólida sobre un soporte sólido tal como vidrio de poro controlado (CPG) o poliestireno, en el que la primera secuencia de (a) se sintetiza sobre un enlazador escindible, tal como un enlazador de succinilo, usando el soporte sólido como armazón. El enlazador escindible de (a) que se usa como armazón para sintetizar la segunda hebra puede comprender una reactividad similar a la del enlazador derivado sobre soporte sólido, de tal forma que la escisión del enlazador derivado sobre soporte sólido y del enlazador escindible de (a) se produce de forma concomitante. En otra modalidad, el resto químico de (b) que puede usarse para aislar la secuencia de oligonucleótidos unida comprende un grupo tritilo, por ejemplo un grupo dimetoxitritilo, que puede emplearse en una estrategia de síntesis sobre tritilo tal como se describe en el presente documento. Todavía en otra modalidad, el resto químico, tal como un grupo dimetoxitritilo, se elimina durante la purificación, por ejemplo, usando condiciones acidas. En una modalidad adicional, el procedimiento para síntesis de siNA es una sintesis en fase de solución o síntesis en fase híbrida en las que ambas hebras de la molécula bicatenaria de siNA se sintetizan en tándem usando un enlazador escindible unido a la primera secuencia que actúa de armazón para síntesis de la segunda secuencia. La escisión del enlazador en condiciones adecuadas para la hibridización de las hebras separadas de la secuencia de siNA provoca la formación de la molécula bicatenaria de siNA. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para sintetizar una molécula bicatenaria de siNA que comprende: (a) sintetizar una hebra de una secuencia de oligonucleótidos de la molécula de siNA, en la que la secuencia comprende una molécula enlazadora escindible que puede usarse como armazón para la síntesis de otra secuencia de oligonucleótidos; (b) sintetizar una segunda secuencia de oligonucleótidos que tiene complementariedad con la primera hebra de la secuencia del armazón de (a), en el que la segunda secuencia comprende la otra hebra de la molécula bicatenaria de siNA y en el que la segunda secuencia comprende además un resto químico que puede usarse para aislar la secuencia de oligonucleótidos unida; (c) purificar el producto de (b) utilizar el resto químico de la segunda hebra de la secuencia de oligonucleótidos en condiciones adecuadas para aislar la secuencia de longitud completa que comprende ambas hebras oligonucleotídicas de siNA conectadas mediante el enlazador escindible y en condiciones adecuadas para que se hibriden las dos hebras oligonucleotídicas de siNA y formen una molécula bicatenaria estable. En una modalidad, la escisión de la molécula enlazadora en (c) anterior se produce durante la desprotección del oligonucleótido, por ejemplo, en condiciones de hidrólisis. En otra modalidad, la escisión de la molécula enlazadora en (c) anterior se produce después de la desprotección del oligonucleótido. En otra modalidad, el procedimiento de síntesis comprende la síntesis en fase sólida sobre un soporte sólido tal como vidrio de poro controlado (CPG) o poliestireno, en el que la primera secuencia de (a) se sintetiza sobre un enlazador escindible, tal como un enlazador de succinilo, usando el soporte sólido como armazón. El enlazador escindible de (a) que se usa como armazón para sintetizar la segunda hebra puede comprender una reactividad similar o una reactividad diferente de la del enlazador derivado sobre soporte sólido, de tal forma que la escisión del enlazador derivado sobre soporte sólido y del enlazador escindible de (a) se produce o bien de forma concomitante bien secuencial. En una modalidad, el resto químico de (b) que puede usarse para aislar la secuencia de oligonucleótidos unida comprende un grupo tritilo, por ejemplo un grupo dímetoxitritilo. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para sintetizar una molécula bicatenaria de siNA en un único procedimiento sintético que comprende: (a) sintetizar un oligonucleótido que tiene una primera y una segunda secuencia, en el que la primera secuencia es complementaria a la segunda secuencia, y la primera secuencia de oligonucleótidos está unida a la segunda secuencia mediante un enlazador escindible, y en el que permanece un grupo protector en el extremo 5', por ejemplo, un grupo 5'-O-dimetoxitritilo (5'-O-DMT) en el oligonucleótido que tiene la segunda secuencia; (b) desproteger el oligonucleótido por la que la desprotección provoca la escisión del enlazador que une las dos secuencias de oligonucleótidos; y (c) purificar el producto de (b) en condiciones adecuadas para aislar la molécula bicatenaria de siNA, por ejemplo usando una estrategia de síntesis sobre tritilo tal como se describe en el presente documento. En otra modalidad, el procedimiento de síntesis de moléculas de siNA de la invención comprende las enseñanzas de Scaringe y cois., patentes de Estados Unidos NJ 5,889,136; 6,008,400; y 6,1 1 1 ,086, que se incorporan por referencia al presente documento en su totalidad. En una modalidad, la invención presenta construcciones de siNA que actúan de mediadoras de ARNi contra un polinucleótido objetivo (por ejemplo, ARN o DNA objetivo), en las que la construcción de siNA comprende una o más modificaciones químicas, por ejemplo, una o más modificaciones químicas que tienen cualquiera de las Fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas que aumenta la resistencia a nucleasas de la construcción de siNA. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para generar moléculas de siNA con mayor resistencia a nucleasas que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas en una molécula de siNA, y (b) ensayar la molécula de siNA de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de siNA que tienen mayor resistencia a nucleasas. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para generar moléculas de siNA con perfiles toxicológicos mejorados (por ejemplo, que tienen propiedades atenuadas o no inmunoestimuladoras) que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas I- Vil (por ejemplo, motivos de siNA a los que se refiere el cuadro I) o cualquier combinación de los mismos en una molécula de siNA, y (b) ensayar la molécula de siNA de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de siNA que tienen perfiles toxicológicos mejorados. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para generar formulaciones de siNA con perfiles toxicológicos mejorados (por ejemplo, que tiene propiedades atenuadas o no inmunoestimuladoras) que comprende (a) generar una formulación de siNA que comprende una molécula de siNA de la invención y un vehículo de administración o partícula de administración tal como se describe en el presente documento o por otros medios conocidos en la técnica, y (b) ensayar la formulación de siNA de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar formulaciones de siNA que tienen perfiles toxicológicos mejorados. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para generar moléculas de siNA que no estimulan una respuesta de interferones (por ejemplo, ninguna respuesta de interferones o una respuesta de interferones atenuada) en una célula, sujeto, u organismo, que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas l-VII (por ejemplo, los motivos de siNA a los que se hace referencia en el cuadro I) o cualquier combinación de las mismas en una molécula de siNA, y (b) ensayar la molécula de siNA de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de siNA que no estimulan una respuesta de interferones. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para generar formulaciones de siNA que no estimulan una respuesta de interferones (por ejemplo, ninguna respuesta de interferones o una respuesta de interferones atenuada) que comprende (a) generar una formulación de siNA que comprende una molécula de siNA de la invención y un vehículo de administración o particula de administración tal como se describe en el presente documento o por otros medios conocidos en la técnica, y (b) ensayar la formulación de siNA de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar formulaciones de siNA que no estimulan una respuesta de interferones. En una modalidad, el interferón comprende interferón alfa. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para generar moléculas de siNA que no estimulan una respuesta de citocinas inflamatorias o proinflamatorias (por ejemplo, ninguna respuesta de citocinas o una respuesta de citocinas atenuada) en una célula, sujeto, u organismo, que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas I-Vil (por ejemplo, motivos de siNA a los que se hace referencia en el cuadro I) o cualquier combinación de las mismas en una molécula de siNA, y (b) ensayar la molécula de siNA de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de siNA que no estimulan una respuesta de citocinas. En una modalidad, la citocina comprende una interleucina tal como interleucina-6 (IL-6) y/o factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a). En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para generar formulaciones de siNA que no estimulan una respuesta de citocinas inflamatorias o proinflamatorias (por ejemplo, ninguna respuesta de citocinas o una respuesta de citocinas atenuada) que comprende (a) generar una formulación de siNA que comprende una molécula de siNA de la invención y un vehículo de administración o partícula de administración tal como se describe en el presente documento o por otros medios conocidos en la técnica, y (b) ensayar la formulación de siNA de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar formulaciones de siNA que no estimulan una respuesta de citocinas. En una modalidad, la citocina comprende una interleucina tal como interleucina-6 (IL-6) y/o factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a). En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para generar moléculas de siNA que no estimulan una respuesta del receptor de tipo Toll (TLR) (por ejemplo, ninguna respuesta de TLR o una respuesta de TLR atenuada) en una célula, sujeto, u organismo, que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas l-VII (por ejemplo, motivos de siNA a los que se hace referencia en el cuadro I) o cualquier combinación de las mismas en una molécula de siNA, y (b) ensayar la molécula de siNA de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de siNA que no estimulan una respuesta de TLR. En una modalidad, el TLR comprende TLR3, TLR7, TLR8 y/o TLR9. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para generar formulaciones de siNA que no estimulan una respuesta del receptor de tipo Toll (TLR) (por ejemplo, ninguna respuesta de TLR o una respuesta de TLR atenuada) que comprende (a) generar una formulación de siNA que comprende una molécula de siNA de la invención y un vehículo de administración o partícula de administración tal como se describe en el presente documento o por otros medios conocidos en la técnica, y (b) ensayar la formulación de siNA de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar formulaciones de siNA que no estimulan una respuesta de TLR. En una modalidad, el TLR comprende TLR3, TLR7, TLR8 y/o TLR9. En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) bicatenaria sintetizada quimicamente que dirige la escisión de un ARN objetivo mediante interferencia del ARN (ARNi), en la que: (a) cada hebra de dicha molécula de siNA tiene de aproximadamente 18 a aproximadamente 38 nucleótidos de longitud; (b) una hebra de dicha molécula de siNA comprende la secuencia de nucleótidos que tiene complementariedad suficiente con dicho ARN objetivo para que la molécula de siNA dirija la escisión del ARN objetivo mediante interferencia del ARN; y (c) en la que las posiciones de nucleótidos en el interior de dicha molécula de siNA están químicamente modificadas para reducir las propiedades ¡nmunoestimuladoras de la molécula de siNA a un nivel por debajo del que corresponde a una molécula de siARN sin modificar. Se dice que dichas moléculas de siNA presentan un perfil toxicológico mejorado comparado con un siNA sin modificar o mínimamente modificado. Con "perfil toxicológico mejorado", se quiere decir que la construcción de siNA químicamente modificada o formulada muestra menor toxicidad en una célula, sujeto, u organismo comparada con un siNA sin modificar o sin formular, o con una molécula de siNA que tiene menos modificaciones o modificaciones que son menos eficaces para conferir una toxicología mejorada. Dichas moléculas de siNA también se considera que tienen una "actividad de ARNi mejorada". En un ejemplo no limitante, las moléculas de siNA y las formulaciones con perfiles toxicológicos mejorados se asocian a propiedades inmunoestimuladoras menores, tales como una respuesta inmunoestimuladora reducida, menor o atenuada en una célula, sujeto, u organismo comparada con un siNA sin modificar o sin formular, o con una molécula de siNA que tiene menos modificaciones o modificaciones que son menos eficaces para conferir una toxicología mejorada. Dicho perfil toxicológico mejorado se caracteriza una inmunoestimulación abrogada o reducida, tal como reducción o abrogación de la inducción de interferones (por ejemplo, interferón alfa), citocinas inflamatorias (por ejemplo, interleucinas tales como IL-6, y/o TNF-alfa), y/o receptores de tipo Toll (por ejemplo, TLR-3, TLR-7, TLR-8, y/o TLR-9). En una modalidad, una molécula de siNA o una formulación con un perfil toxicológico mejorado no comprende ribonucleótidos. En una modalidad, una molécula de siNA o formulación con un perfil toxicológico mejorado comprende menos de 5 ribonucleótidos (por ejemplo, 1 , 2, 3 ó 4 ribonucleótidos). En una modalidad, una molécula de siNA o una formulación con un perfil toxicológico mejorado comprende Estab 7, Estab 8, Estab 11 , Estab 12, Estab 13, Estab 16, Estab 17, Estab 18, Estab 19, Estab 20, Estab 23, Estab 24, Estab 25, Estab 26, Estab 27, Estab 28, Estab 29, Estab 30, Estab 31 , Estab 32, Estab 33, Estab 34, Estab 35, Estab 36 o cualquier combinación de las mismas (véase el cuadro I). En el presente documento, las estructuras de Estab numéricas incluyen tanto versiones de 2'-fluoro como de 2'-OCF3 de las estructuras que se muestran en el cuadro I. Por ejemplo, "Estab 7/8" se refiere tanto a Estab 7/8 como a Estab 7F/8F etc. En una modalidad, una molécula de siNA o una formulación con un perfil toxicológico mejorado comprende una molécula de siNA de la invención y una formulación tal como se describe en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos nJ 20030077829, que se incorpora por referencia al presente documento en su totalidad incluidos los dibujos. En una modalidad, el nivel de respuesta inmunoestimulatoria asociada a una molécula de siNA dada puede medirse tal como se describe en el presente documento o tal como se conoce por otros medios en la técnica, por ejemplo determinando el nivel de PKR/respuesta de interferones, proliferación, activación de linfocitos B y/o producción de citocinas en ensayos para cuantificar la respuesta inmunoestimulatoria de moléculas de siNA particulares (véase, por ejemplo, Leifer y cois, de 2003, J Immunother. 26, 313-9; y la patente de Estados Unidos nJ 5,968,909, que se incorpora en su totalidad por referencia). En una modalidad, la menor respuesta inmunoestimulatoria es de entre aproximadamente 10% y aproximadamente 100% comparada con una molécula de siARN sin modificar o mínimamente modificada, por ejemplo, aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de reducción en la respuesta inmunoestimulatoria. En una modalidad, la respuesta inmunoestimulatoria asociada a una molécula de siNA puede modularse mediante el grado de modificación química. Por ejemplo, una molécula de siNA que tiene entre aproximadamente 10% y aproximadamente 100%, por ejemplo, aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% o al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de las posiciones de nucleótidos en la molécula de siNA modificadas pueden seleccionarse para que tengan un grado de propiedades de inmunoestimulación correspondiente tal como se describe en el presente documento. En una modalidad, el grado de respuesta inmunoestimulatoria reducido se selecciona para una actividad de ARNi optimizada. Por ejemplo, puede preferirse mantener un cierto grado de inmunoestimulación para tratar una infección vírica, donde puede preferirse una reducción inferior al 100% de la inmunoestimulación para una actividad antiviral máxima (por ejemplo, una reducción de la inmunoestimulación de aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o 90%) mientras que puede preferirse la inhibición de la expresión de un gen objetivo endógeno con moléculas de siNA que poseen unas propiedades mínimas de inmunoestimulación para evitar la toxicidad no específica o efectos externos al objetivo (por ejemplo, una reducción en inmunoestimulación de aproximadamente 90% a aproximadamente 100%). En una modalidad, la invención presenta una molécula de siNA bicatenaria sintetizada químicamente que dirige la escisión de un ARN objetivo mediante interferencia del ARN (ARNi), en la que: (a) cada hebra de dicha molécula de siNA tiene de aproximadamente 18 a aproximadamente 38 nucleótidos de longitud; (b) una hebra de dicha molécula de siNA comprende la secuencia de nucleótidos que tiene complementariedad suficiente con dicho ARN objetivo para que la molécula de siNA dirija la escisión del ARN objetivo mediante interferencia del ARN; y (c) en la que uno o más nucleótidos en el interior de dicha molécula de siNA están químicamente modificados para reducir las propiedades inmunoestimuladoras de la molécula de siNA a un nivel por debajo del que corresponde a una molécula de siNA sin modificar. En una modalidad, cada hebra comprende al menos aproximadamente 18 nucleótidos que son complementarios a los nucleótidos de la otra hebra. En otra modalidad, la molécula de siNA que comprende nucleótidos modificados para reducir las propiedades de inmunoestimulación de la molécula de siNA comprende una región no codificante que tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de un gen objetivo o una porción del mismo y comprende además una región codificante, en la que dicha región codificante comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente similar a la secuencia de nucleótidos de dicho gen objetivo o porción del mismo. En una modalidad de la misma, la región no codificante y la región codificante comprenden de aproximadamente 18 a aproximadamente 38 nucleótidos, en la que dicha región no codificante comprende al menos aproximadamente 18 nucleótidos que son complementarios a los nucleótidos de la región codificante. En una modalidad de la misma, los nucleótidos de pirimidina de la región codificante son nucleótidos de 2'-O-metil pirimidina. En otra modalidad de la misma, los nucleótidos de purina en la región codificante son nucleótidos de 2'-desoxi purina. Todavía en otra modalidad de la misma, los nucleótidos de pirimidina presentes en la región codificante son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina. En otra modalidad de la misma, los nucleótidos de pirimidina de dicha región no codificante son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina. Todavía en otra modalidad de la misma, los nucleótidos de purina de dicha región no codificante son nucleótidos de 2'-O-metil purina. En todavía otra modalidad de la misma, los nucleótidos de purina presentes en dicha región no codificante comprenden nucleótidos de 2'-desoxi purina. En otra modalidad, la región no codificante comprende un enlace internucleotídico de fosforotioato en el extremo 3' de dicha región no codificante. En otra modalidad, la región no codificante comprende una modificación de glicerilo en un extremo 3' de dicha región no codificante. En otras modalidades, la molécula de siNA que comprende los nucleótidos modificados para reducir las propiedades de inmunoestimulación de la molécula de siNA puede comprender cualquiera de las caracteristicas estructurales de las moléculas de siNA que se describen en el presente documento. En otras modalidades, la molécula de siNA que comprende los nucleótidos modificados para reducir las propiedades de inmunoestimulación de la molécula de siNA puede comprender cualquiera de las modificaciones químicas de las moléculas de siNA que se describen en el presente documento. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para generar una molécula bicatenaria de siNA sintetizada químicamente que tiene nucleótidos químicamente modificados para reducir las propiedades de inmunoestimulación de la molécula de siNA, que comprende (a) introducir uno o más nucleótidos modificados en la molécula de siNA, y (b) ensayar la molécula de siNA de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar una molécula de siNA que tiene propiedades de inmunoestimulación menores comparadas con una molécula de siNA correspondiente que tiene nucleótidos sin modificar. Cada hebra de la molécula de siNA tiene de aproximadamente 18 a aproximadamente 38 nucleótidos de longitud. Una hebra de la molécula de siNA comprende la secuencia de nucleótidos que tiene complementariedad suficiente con el ARN objetivo para que la molécula de siNA dirija la escisión directa del ARN objetivo mediante interferencia del ARN. En una modalidad, las propiedades reducidas de inmunoestimulación comprenden una inducción abrogada o reducida de las citocinas inflamatorias o proinflamatorias, tales como interleucina-6 (IL-6) o factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), en respuesta al siNA que se introduce en una célula, tejido, u organismo. En otra modalidad, las propiedades de inmunoestimulación reducidas comprenden una inducción abrogada o reducida de los receptores de tipo Toll (TLRs), tales como TLR3, TLR7, TLR8 o TLR9, en respuesta al siNA que se introduce en una célula, tejido, u organismo. En otra modalidad, las propiedades de inmunoestimulación reducidas comprenden una inducción abrogada o reducida de los interferones, tales como interferón alfa, en respuesta al siNA que se introduce en una célula, tejido, u organismo.

En una modalidad, la invención presenta construcciones de siNA que actúan de mediadoras de la ARNi contra un polinucleótido objetivo, en las que la construcción de siNA comprende una o más modificaciones químicas descritas en el presente documento que modulan la afinidad de unión entre las hebras codificante y no codificante de la construcción de siNA. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para generar moléculas de siNA con mayor afinidad de unión entre las hebras codificante y no codificante de la molécula de siNA que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas en una molécula de siNA, y (b) ensayar la molécula de siNA de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de siNA que tienen mayor afinidad de unión entre las hebras codificante y no codificante de la molécula de siNA. En una modalidad, la invención presenta construcciones de siNA que actúan de mediadoras de la ARNi contra un polinucleótido objetivo, en las que la construcción de siNA comprende una o más modificaciones químicas descritas en el presente documento que modulan la afinidad de unión entre la hebra no codificante de la construcción de siNA y una secuencia de ARN complementaria del interior de una célula. En una modalidad, la invención presenta construcciones de siNA que actúan de mediadoras de la ARNi contra un polinucleótido objetivo, en las que la construcción de siNA comprende una o más modificaciones químicas descritas en el presente documento que modulan la afinidad de unión entre la hebra no codificante de la construcción de siNA y una secuencia de DNA complementaria del interior de una célula. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para generar moléculas de siNA con mayor afinidad de unión entre la hebra no codificante de la molécula de siNA y una secuencia complementaria del ARN objetivo que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas en una molécula de siNA, y (b) ensayar la molécula de siNA de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de siNA que tienen mayor afinidad de unión entre la hebra no codificante de la molécula de siNA y una secuencia complementaria del ARN objetivo. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para generar moléculas de siNA con mayor afinidad de unión entre la hebra no codificante de la molécula de siNA y una secuencia complementaria del DNA objetivo que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas en una molécula de siNA, y (b) ensayar la molécula de siNA de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de siNA que tienen mayor afinidad de unión entre la hebra no codificante de la molécula de siNA y una secuencia complementaria del DNA objetivo. En una modalidad, la invención presenta construcciones de siNA que actúan de mediadoras de la ARNi contra un polinucleótido objetivo, en las que la construcción de siNA comprende una o más modificaciones químicas descritas en el presente documento que modulan la actividad de polimerasa de una polimerasa celular con capacidad de generar moléculas de siNA endógenas adicionales que presentan homología de secuencias con la construcción de siNA modificada químicamente. En una modalidad, la invención presenta construcciones de siNA que actúan de mediadoras de la ARNi contra un polinucleótido objetivo, en las que la construcción de siNA comprende una o más modificaciones químicas descritas en el presente documento que modulan la actividad de polimerasa de una polimerasa celular con capacidad de generar moléculas de siNA endógenas adicionales que presentan homología de secuencias con la construcción de siNA modificada químicamente que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas en una molécula de siNA, y (b) ensayar la molécula de siNA de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de siNA con capacidad de mediar una mayor actividad de polimerasa de una polimerasa celular con capacidad de generar moléculas de siNA endógenas adicionales que presentan homología entre las secuencias con la molécula de siNA modificada químicamente. En una modalidad, la invención presenta construcciones de siNA modificadas químicamente que actúan de mediadoras de la ARNi contra un polinucleótido objetivo en una célula, en la que las modificaciones químicas no afectan significativamente a la interacción de siNA con una molécula de ARN, una molécula de DNA y/o proteínas objetivo u otros factores que son esenciales para la ARNi de un modo que aumentaría la eficacia de la ARNi mediada por dichas construcciones de siNA. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para generar moléculas de siNA con una especificidad mejorada de la ARNi contra objetivos polinucleotídicas que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas en una molécula de siNA, y (b) ensayar la molécula de siNA de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de siNA que tienen especificidad mejorada de ARNi. En una modalidad, la especificidad mejorada comprende tener menores efectos externos al objetivo comparada con una molécula de siNA sin modificar. Por ejemplo, la introducción de restos caperuza terminal en el extremo 3', extremo 5', o tanto en el extremo 3' como 5' de la hebra o región codificante de una molécula de siNA de la invención puede dirigir el siNA para que tenga una mejor especificidad evitando que la hebra codificante o región codificante actúen como plantilla para la actividad de ARNi contra una objetivo correspondiente que tiene complementariedad con la hebra codificante o región codificante. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para generar moléculas de siNA con una actividad mejorada de la ARNi contra una objetivo polinucleotídica que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas en una molécula de siNA, y (b) ensayar la molécula de siNA de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de siNA que tienen actividad mejorada de ARNi. Todavía en otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para generar moléculas de siNA con una actividad mejorada de la ARNi contra un ARN objetivo que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas en una molécula de siNA, y (b) ensayar la molécula de siNA de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de siNA que tienen actividad mejorada de ARNi contra el ARN objetivo. Todavía en otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para generar moléculas de siNA con una actividad mejorada de la ARNi contra un DNA objetivo que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas en una molécula de siNA, y (b) ensayar la molécula de siNA de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de siNA que tienen actividad mejorada de ARNi contra el DNA objetivo. En una modalidad, la invención presenta construcciones de siNA que actúan de mediadoras de la ARNi contra un polinucleótido objetivo, en las que la construcción de siNA comprende una o más modificaciones químicas descritas en el presente documento que modulan la captación celular de la construcción de siNA, tal como conjugación con colesterol del siNA. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para generar moléculas de siNA contra un polinucleótido objetivo con captación celular mejorada que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas en una molécula de siNA, y (b) ensayar la molécula de siNA de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de siNA que tienen captación celular mejorada. En una modalidad, la invención presenta construcciones de siNA que actúan de mediadoras de la ARNi contra un polinucleótido objetivo, en la que la construcción de siNA comprende una o más modificaciones químicas descritas en el presente documento que aumenta la biodisponibilidad de la construcción de siNA, por ejemplo, uniendo los conjugados poliméricos tales como polietilenglicol o conjugados equivalentes que mejoran la farmacocinética de la construcción de siNA, o uniendo conjugados que se dirigen contra tipos de tejidos o tipos de células específicos in vivo. Ejemplos no limitantes de dichos conjugados se describen en Vargeese y cois., documento U.S. con nJ de serie 10/201 ,394 que se incorpora por referencia al presente documento. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para generar moléculas de siNA de la invención con biodisponibilidad mejorada que comprende (a) introducir un conjugado en la estructura de una molécula de siNA, y (b) ensayar la molécula de siNA de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de siNA que tienen biodisponibilidad mejorada. Dichos conjugados pueden incluir ligandos para los receptores celulares, tales como péptidos derivados a partir de ligandos proteínicos naturales; secuencias de localización de proteínas, que incluyen secuencias de código postal celular; anticuerpos; aptámeros de ácido nucleico; vitaminas y otros cofactores, tales como folato y N-acetilgalactosamina; polímeros, tales como polietilenglicol (PEG); fosfolípidos; colesterol; derivados de colesterol, poliaminas, tales como espermina o espermidina; y otros. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) que comprende una primera secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de ARN objetivo o a una porción de la misma, y una segunda secuencia que tiene complementariedad con dicha primera secuencia, en la que dicha segunda secuencia está quimicamente modificada de forma que no pueda actuar como secuencia guía para mediar de forma eficaz en la interferencia del ARN y/o ser reconocida por las proteínas celulares que facilitan la ARNi. En una modalidad, la primera secuencia de nucleótidos del siNA está químicamente modificada tal como se describe en el presente documento. En una modalidad, la primera secuencia de nucleótidos del siNA no está modificada (por ejemplo, es todo ARN). En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) que comprende una primera secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de ARN objetivo o a una porción de la misma, y una segunda secuencia que tiene complementariedad con dicha primera secuencia, en la que la segunda secuencia está diseñada o modificada de tal forma que evita su acceso a la ruta de la ARNi como secuencia guía o como una secuencia que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ARN). En una modalidad, la primera secuencia de nucleótidos del siNA está químicamente modificada tal como se describe en el presente documento. En una modalidad, la primera secuencia de nucleótidos del siNA no está modificada (por ejemplo, es todo ARN). Es de esperar que dicho diseño o modificaciones mejoren la actividad de siNA y/o mejoren la especificidad de las moléculas de siNA de la invención. También es de esperar que estas modificaciones minimicen cualesquiera efectos externos al objetivo y/o toxicidad asociada. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) que comprende a una primera secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de ARN objetivo o una porción de la misma, y una segunda secuencia que tiene complementariedad con dicha primera secuencia, en la que dicha segunda secuencia es incapaz de actuar como secuencia guía para mediar en la interferencia del ARN. En una modalidad, la primera secuencia de nucleótidos del siNA está químicamente modificada tal como se describe en el presente documento. En una modalidad, la primera secuencia de nucleótidos del siNA no está modificada (por ejemplo, es todo ARN). En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) que comprende a una primera secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de ARN objetivo o una porción de la misma, y una segunda secuencia que tiene complementariedad con dicha primera secuencia, en la que dicha segunda secuencia no tiene un grupo 5'-hidroxilo (5'-OH) ni 5'-fosfato en el extremo. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) que comprende a una primera secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de ARN objetivo o una porción de la misma, y una segunda secuencia que tiene complementariedad con dicha primera secuencia, en la que dicha segunda secuencia comprende un resto caperuza terminal en el extremo 5' de dicha segunda secuencia. En una modalidad, el resto caperuza terminal comprende un resto nucleotídico invertido abásico, desoxiabásico invertido, un grupo que se muestra en la Figura 10, un grupo alquilo o cicloalquilo, un heterociclo, o cualquier otro grupo que evita la actividad de ARNi en la que la segunda secuencia actúa como secuencia guía o plantilla para la ARNi. En una modalidad, la invención presenta una molécula bicatenaria de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) que comprende a una primera secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de ARN objetivo o una porción de la misma, y una segunda secuencia que tiene complementariedad con dicha primera secuencia, en la que dicha segunda secuencia comprende un resto caperuza terminal en el extremo 5' y en el extremo 3' de dicha segunda secuencia. En una modalidad, cada resto caperuza terminal comprende de forma individual un resto nucleotídico invertido abásico, desoxiabásico invertido, un grupo que se muestra en la Figura 10, un grupo alquilo o cicloalquilo, un heterociclo, o cualquier otro grupo que evita la actividad de ARNi en la que la segunda secuencia actúa como secuencia guía o plantilla para la ARNi. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para generar moléculas de siNA de la invención con especificidad mejorada regulando por disminución o inhibiendo la expresión de un ácido nucleico objetivo (por ejemplo, un DNA o ARN tal como un gen o su ARN correspondiente), que comprende (a) introducir una o más modificaciones químicas en la estructura de una molécula de siNA, y (b) ensayar la molécula de siNA de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de siNA que tienen especificidad mejorada. En otra modalidad, la modificación química que se usa para mejorar la especificidad comprende modificaciones de caperuza terminal en el extremo 5', el extremo 3', o ambos extremos 5' y 3' de la molécula de siNA. Las modificaciones de caperuza terminal pueden comprender, por ejemplo, estructuras que se muestran en la Figura 10 (por ejemplo restos desoxiabásicos invertidos) o cualquier otra modificación química que hace que una porción de la molécula de siNA (por ejemplo la hebra codificante) sea incapaz de mediar en la interferencia del ARN contra una secuencia de ácido nucleico externa al objetivo. En un ejemplo no limitante, una molécula de siNA se diseña de tal forma que solo la secuencia no codificante de la molécula de siNA puede servir como secuencia guía para la degradación mediada por RISC de una secuencia del ARN objetivo correspondiente. Esto puede lograrse haciendo que la secuencia codificante del siNA sea inactiva introduciendo modificaciones químicas a la hebra codificante que eviten el reconocimiento de la hebra codificante como secuencia guía por la el aparato de la ARNi. En una modalidad, dichas modificaciones químicas comprenden cualquier grupo químico del extremo 5' de la hebra codificante del siNA, o cualquier otro grupo que actúa haciendo que la hebra codificante sea inactiva como secuencia guía para mediar en la interferencia del ARN. Estas modificaciones, por ejemplo, pueden producir una molécula en la que el extremo 5' de la hebra codificante ya no tenga un grupo d'-hidroxilo (5'-OH) libre o un grupo 5'-fosfato libre (por ejemplo, fosfato, difosfato, trifosfato, fosfato cíclico etc.). Ejemplos no limitantes de dichas construcciones de siNA se describen en el presente documento, tales como la estructuras "Estab 9/10", "Estab 7/8", "Estab 7/19", "Estab 17/22", "Estab 23/24", "Estab 24/25", y "Estab 24/26" (por ejemplo, cualquier siNA que tenga las hebras codificantes Estab 7, 9, 17, 23 ó 24) y sus variantes (véase el cuadro I) en las que el extremo 5' y el extremo 3' de la hebra codificante del siNA no comprenden un grupo hidroxilo o un grupo fosfato. En el presente documento, las estructuras de Estab numéricas incluyen tanto versiones de 2'-fluoro como de 2'-OCF3 de las estructuras que se muestran en el cuadro I.

Por ejemplo, "Estab 7/8" se refiere tanto a Estab 7/8 como a Estab 7F/8F etc. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para generar moléculas de siNA de la invención con especificidad mejorada regulando por disminución o inhibiendo la expresión de un ácido nucleico objetivo (por ejemplo, un DNA o ARN tal como un gen o su ARN correspondiente), que comprende introducir una o más modificaciones químicas en la estructura de una molécula de siNA que evita que una hebra o porción de la molécula de siNA actúe como plantilla o secuencia guía para la actividad de ARNi. En una modalidad, la hebra inactiva o región codificante de la molécula de siNA es la hebra codificante o región codificante de la molécula de siNA, es decir la hebra o región del siNA que no presenta complementariedad con la secuencia de ácido nucleico objetivo. En una modalidad, dichas modificaciones químicas comprenden cualquier grupo químico del extremo 5' de la hebra o región codificante del siNA que no comprende un grupo 5'-hidroxilo (5'-OH) o 5'-fosfato, o cualquier otro grupo que actúa haciendo que la hebra codificante o región codificante sea inactiva como secuencia guía para mediar en la interferencia del ARN. Ejemplos no limitantes de dichas construcciones de siNA se describen en el presente documento, tales como la estructuras "Estab 9/10", "Estab 7/8", "Estab 7/19", "Estab 17/22", "Estab 23/24", "Estab 24/25", y "Estab 24/26" (por ejemplo, cualquier siNA que tenga las hebras codificantes Estab 7, 9, 17, 23 ó 24) y sus variantes (véase el cuadro I) en las que el extremo 5' y el extremo 3' de la hebra codificante del siNA no comprenden un grupo hidroxilo o un grupo fosfato. En el presente documento, las estructuras de Estab numéricas incluyen tanto versiones de 2'-fluoro como de 2'-OCF3 de las estructuras que se muestran en el cuadro I. Por ejemplo, "Estab 7/8" se refiere tanto a Estab 7/8 como a Estab 7F/8F etc. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para cribar moléculas de siNA que son activas en la mediación de la interferencia del ARN contra una secuencia de ácido nucleico objetivo que comprende (a) generar una pluralidad de moléculas de siNA sin modificar, (b) cribar las moléculas de siNA de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de siNA que son activas en la mediación de la interferencia del ARN contra la secuencia de ácido nucleico objetivo, y (c) introducir modificaciones químicas (por ejemplo modificaciones químicas tales como las que se describen en el presente documento o por otros medios conocidos en la técnica) en las moléculas activas de siNA de (b). En una modalidad, el procedimiento comprende además recribar las moléculas de siNA quimicamente modificadas de la etapa (c) en condiciones adecuadas para aislar las moléculas de siNA químicamente modificadas que son activas para mediar la interferencia del ARN contra la secuencia de ácido nucleico objetivo. En una modalidad, la invención presenta un procedimiento para cribar moléculas de siNA químicamente modificadas que son activas en la mediación de la interferencia del ARN contra una secuencia de ácido nucleico objetivo que comprende (a) generar una pluralidad de moléculas de siNA quimicamente modificadas (por ejemplo moléculas de siNA tal como se describe en el presente documento o conocidas por otros medios en la técnica), y (b) cribar las moléculas de siNA de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de siNA químicamente modificadas que son activas en la mediación de la interferencia del ARN contra la secuencia de ácido nucleico objetivo. El término "ligando" se refiere a cualquier compuesto o molécula, tal como un fármaco, péptido, hormona, o neurotransmisor, que tenga capacidad de interactuar con otro compuesto, tal como un receptor, de forma directa o indirecta. El receptor que interactúa con un ligando puede estar presente en la superficie de una célula o de forma alternativa puede ser un receptor intercelular. La interacción del ligando con el receptor puede provocar una reacción bioquímica, o simplemente puede ser una interacción o asociación física. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para generar moléculas de siNA de la invención con biodisponibilidad mejorada que comprende (a) introducir una formulación excipiente en una molécula de siNA, y (b) ensayar la molécula de siNA de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de siNA que tienen biodisponibilidad mejorada. Dichos excipientes incluyen polímeros tales como ciclodextrinas, lípidos, lípidos catiónicos, poliaminas, fosfolípidos, nanopartículas, receptores, ligandos, y otros. En otra modalidad, la invención presenta un procedimiento para generar moléculas de siNA de la invención con biodisponibilidad mejorada que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas I-VII o cualquier combinación de las mismas en una molécula de siNA, y (b) ensayar la molécula de siNA de la etapa (a) en condiciones adecuadas para aislar moléculas de siNA que tienen biodisponibilidad mejorada. En otra modalidad, puede unirse covalentemente polietilenglicol (PEG) a compuestos de siNA de la presente invención. El PEG unido puede ser de cualquier peso molecular, preferiblemente de aproximadamente 100 a aproximadamente 50.000 daltons (Da). La presente invención puede usarse sola o como componente de un kit que tiene al menos uno de los reactivos necesarios para realizar la introducción in vitro o in vivo de ARN para analizar muestras y/o sujetos. Por ejemplo, los componentes preferidos del kit incluyen una molécula de siNA de la invención y un vehículo que promueve la introducción del siNA en células de interés tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, usando lípidos y otros procedimientos de transfección conocidos en la técnica, véase por ejemplo Beigelman y cois, documento US 6,395,713). El kit puede usarse para la validación de objetivos, tal como para determinar la función y/o actividad génicas, o en la optimización de fármacos, y en el descubrimiento de fármacos (véase por ejemplo Usman y cois., documento USSN 60/402,996). Dicho kit también puede incluir instrucciones para permitir al usuario del kit practicar la invención. El término "ácido nucleico corto de interferencia", "siNA", "ARN corto de interferencia", "siARN", "molécula de ácido nucleico corto de interferencia", "molécula oligonucleotídica corta de interferencia", o "molécula de ácido nucleico corto de interferencia modificada químicamente" tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico con capacidad de inhibir o regular por disminución la expresión génica o la replicación vírica mediando en la interferencia del ARN "ARNi" o silenciamiento génico de un modo específico de secuencia. Estos términos pueden referirse a ambas moléculas de ácido nucleico individuales, a una pluralidad de dichas moléculas de ácido nucleico, o a conjuntos de dichas moléculas de ácido nucleico. El siNA puede ser una molécula bicatenaria de ácido nucleico que comprende regiones codificantes y no codificantes autocomplementarias, en la que la región no codificante comprende la secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma y la región codificante que tiene la secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de ácido nucleico objetivo o a una porción de la misma. El siNA puede montarse a partir de dos oligonucleótidos separados, donde una hebra es la hebra codificante y la otra es la hebra no codificante, en el que las hebras no codificante y codificante son autocomplementarias (es decir, cada hebra comprende la secuencia de nucleótídos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de la otra hebra; tal como cuando la hebra no codificante y la hebra codificante forman una molécula bicatenaria o estructura bicatenaria, por ejemplo en la que la región bicatenaria tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 30, por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 pares de bases; la hebra no codificante comprende la secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma y la hebra codificante comprende la secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma (por ejemplo, de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 o más nucleótidos de la molécula de siNA son complementarios al ácido nucleico objetivo o a una porción del mismo). De forma alternativa, el siNA se monta a partir de un único oligonucleótido, donde las regiones codificantes y no codificantes autocomplementarias del siNA están enlazadas mediante un(os) enlazador(es) con base de ácido nucleico o no. El siNA puede ser un polinucleótido con una estructura secundaria de molécula bicatenaria, molécula bicatenaria asimétrica, horquilla u horquilla asimétrica, que tiene regiones codificantes y no codificantes autocomplementarias, en la que la región no codificante comprende la secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico objetivo distinta o a una porción de la misma y la región codificante que tiene la secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de ácido nucleico objetivo o a una porción de la misma. El siNA puede ser un polinucleótido circular monocatenario que tiene dos o más estructuras de bucle y un tallo que comprende regiones codificantes y no codificantes autocomplementarias, en el que la región no codificante comprende la secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma y la región codificante que tiene la secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de ácido nucleico objetivo o a una porción de la misma, y en el que el polinucleótido circular puede procesarse o in vivo o in vitro generando una molécula de siNA activa capaz de actuar de mediadora en la ARNi. El siNA también puede comprender un polinucleótido monocatenario que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma (por ejemplo, donde dicha molécula de siNA no requiere la presencia en el interior de la molécula de siNA de la secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de ácido nucleico objetivo o a una porción de la misma), en la que el polinucleótido monocatenario puede comprender además un grupo fosfato terminal, tal como un 5'-fosfato (véase por ejemplo Martínez y cois., 2002, Cell., 110, 563-574 y Schwarz y cois., 2002, Molecular Cell, 10, 537-568), o 5',3'-difosfato. En ciertas modalidades, la molécula de siNA de la invención comprende secuencias o regiones codificantes y no codificantes separadas, en la que las regiones codificantes y no codificantes están unidas covalentemente por moléculas enlazadoras nucleotídicas o no nucleotídicas tal como se conoce en la técnica, o de forma alternativa están unidas de forma no covalente mediante interacciones iónicas, enlaces de hidrógeno, interacciones de van der waals, interacciones hidrófobas y/o interacciones de apilamiento. En ciertas modalidades, las moléculas de siNA de la invención comprenden una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de un gen objetivo. En otra modalidad, la molécula de siNA de la invención interactúa con una secuencia de nucleótidos de un gen objetivo de un modo que provoca la inhibición de la expresión del gen objetivo. Tal como se usa en el presente documento, las moléculas de siNA no tienen que limitarse a las moléculas que contienen solo ARN, sino que comprenden además nucleótidos y no nucleótidos modificados químicamente. En ciertas modalidades, las moléculas cortas de ácidos nucleicos de interferencia de la invención carecen de nucleótidos que contienen 2'-hidroxi (2'-OH). El solicitante describe en ciertas modalidades ácidos nucleicos cortos de interferencia que no requieren la presencia de nucleótidos que tienen un grupo 2'-hidroxi para mediar la ARNi y asi, las moléculas cortas de ácidos nucleicos de interferencia de la invención opcionalmente no incluyen algún ribonucleótido (por ejemplo, nucleótidos que tienen un grupo 2'-OH). Dichas moléculas de siNA que no requieren la presencia de ribonucleótidos en el interior de la molécula de siNA para apoyar la ARNi sin embargo pueden tener un enlazador o enlazadores unidos u otros grupos, restos o cadenas unidos o asociados que contienen uno o más nucleótidos con grupos 2'-OH. Opcionalmente, las moléculas de siNA pueden comprender ribonucleótidos en aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, o 50% de las posiciones de nucleótidos. Las moléculas cortas de ácidos nucleicos de interferencia modificadas de la invención también pueden denominarse oligonucleótidos cortos modificados de interferencia "siMON." Tal como se usa en el presente documento, el término siNA se pretende que sea equivalente a otros términos que se usan para describir moléculas de ácido nucleico que tienen capacidad de mediar en la ARNi específica de secuencia, por ejemplo ARN corto de interferencia (siARN), ARN bicatenario (dsARN), micro-ARN (miARN), ARN corto en horquilla (shARN), oligonucleótido corto de interferencia, ácido nucleico corto de interferencia, oligonucleótido modificado corto de interferencia, siARN modificado químicamente, silenciamiento génico postranscripcional de ARN (ptgsARN), y otros. Ejemplos no limitantes de moléculas de siNA de la invención se muestran en las Figuras 3A-3F, 4A-4F y 5A-5C, y el cuadro II del presente documento. Dichas moléculas de siNA son diferentes de otras tecnologías de ácidos nucleicos conocidas en la técnica que actúan de mediadoras de la inhibición de la expresión génica, tales como ribozimas, oligonucleótidos no codificantes, de formación de moléculas tricatenarias, aptámeros, quimera 2,5-A, u oligonucleótidos simulados. Con "interferencia del ARN" o "ARNi" se quiere decir un proceso biológico de inhibir o regular por disminución de la expresión génica en una célula tal como es conocido de forma general en la técnica y que es mediada por moléculas cortas de ácidos nucleicos de interferencia, véase por ejemplo Zamore y Haley de 2005, Science, 309, 1519-1524; Vaughn y Martienssen de 2005, Science, 309, 1525-1526; Zamore y cois., 2000, Cell, 101 , 25-33; Bass, 2001 , Nature, 411 , 428-429; Elbashir y cois., 2001 , Nature, 411 , 494-498; y Kreutzer y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 00/44895; Zernicka-Goetz y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 01/36646; Fire, publicación de patente internacional PCT nJ WO 99/32619; Plaetinck y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 00/01846; Mello y Fire, publicación de patente internacional PCT nJ WO 01/29058; Deschamps-Depaillette, publicación de patente internacional PCT nJ WO 99/07409; y Li y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 00/44914; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe y cois., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; y Hall y cois., 2002, Science, 297, 2232-2237; Hutvagner y Zamore, 2002, Science, 297, 2056-60; McManus y cois., 2002, ARN, 8, 842-850; Reinhart y cois., 2002, gen & Dev., 16, 1616-1626; y Reinhart & Bartel, 2002, Science, 297, 1831). Además, tal como se usa en el presente documento, el término ARNi se pretende que sea equivalente a otros términos que se usan para describir la interferencia del ARN específica de secuencia, tal como silenciamiento génico postraslacional, inhibición de la traducción, inhibición de la transcripción, o epigenéticas. Por ejemplo, las moléculas de siNA de la invención pueden usarse para silenciar genes de forma epigenética tanto a nivel postranscripcional como a nivel pretranscripcional. En un ejemplo no limitante, la modulación epigenética de la expresión génica mediante moléculas de siNA de la invención puede producirse a partir de la modificación mediada por siNA de la estructura de la cromatina o de patrones de metilación para alterar la expresión génica (véase, por ejemplo, Verdel y cois. 2004, Science, 303, 672-676; Pal-Bhadra y cois. 2004, Science, 303, 669-672; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe y cois., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; y Hall y cois., 2002, Science, 297, 2232-2237). En otro ejemplo no limitante, la modulación de la expresión génica mediante moléculas de siNA de la invención puede producirse a través de la escisión de ARN mediada por siNA (ya sea ARN codificante o no codificante) mediante RISC, o de forma alternativa, mediante inhibición de la traducción tal como se conoce en la técnica. En otra modalidad, la modulación de la expresión génica mediante las moléculas de siNA de la invención puede producirse por la inhibición de la transcripción (véase por ejemplo Janowski y cois, de 2005, Nature Chemical Biology, 1 , 216-222). En una modalidad, una molécula de siNA de la invención es un oligonucleótido que forma una molécula bicatenaria "DFO", (véase por ejemplo las Figuras 11A-11 D y 12 y Vaish y cois., documento USSN 10/727,780 presentado el 3 de diciembre de 2003 y la solicitud de patente internacional PCT nJ US04/16390, presentada el 24 de mayo de 2004). En una modalidad, una molécula de siNA de la invención es un siNA multifuncional, (véase por ejemplo las Figuras 13A-13B y 25 y Jadhav y cois., documento USSN 60/543,480 presentado el 10 de febrero de 2004 y solicitud internacional PCT nJ US04/16390, presentada el 24 de mayo de 2004). En una modalidad, el siNA multifuncional de la invención puede comprender la dirección de secuencias, por ejemplo, dos o más regiones de ARN objetivo (véase por ejemplo secuencias objetivo en las Tablas II y lll). En una modalidad, el siNA multifuncional de la invención puede comprender dirigir la secuencia a una o más objetivos diferentes, que incluyen regiones codificantes y regiones no codificantes de SREBP1. Con "horquilla asimétrica" tal como se usa en el presente documento se quiere decir una molécula lineal de siNA que comprende una región no codificante, una porción de bucle que puede comprender nucleótidos o no nucleótidos, y una región codificante que comprende menos nucleótidos que la región no codificante en un grado tal que la región codificante tiene suficientes nucleótidos complementarios para formar pares de bases con la región no codificante y formar una molécula bicatenaria con bucle. Por ejemplo, una molécula de horquilla asimétrica de siNA de la invención puede comprender una región no codificante que tiene una longitud suficiente para mediar en la ARNi de un sistema celular o in vitro (por ejemplo de aproximadamente 15 a aproximadamente 30, o aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 nucleótidos) y una región bucle que comprende de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 (por ejemplo, aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 ó 12) nucleótidos, y una región codificante que tiene de aproximadamente 3 a aproximadamente 25 (por ejemplo, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24 ó 25) nucleótidos que son complementarios a la región no codificante. La molécula de horquilla asimétrica de siNA también puede comprender un grupo fosfato en el extremo 5' que puede estar químicamente modificado. La porción de bucle de la molécula de horquilla asimétrica de siNA puede comprender nucleótidos, no nucleótidos, moléculas enlazadoras o moléculas conjugadas tal como se describen en el presente documento. Con "molécula bicatenaria asimétrica" tal como se usa en el presente documento se quiere decir una molécula de siNA que tiene dos hebras separadas que comprenden una región codificante y una región no codificante, en la que la región codificante comprende menos nucleótidos que la región no codificante en un grado tal que la región codificante tiene suficientes nucleótidos complementarios para formar pares de bases con la región no codificante y formar una molécula bicatenaria. Por ejemplo, una molécula bicatenaria asimétrica de siNA de la invención puede comprender una región no codificante que tiene longitud suficiente para mediar en la ARNi de un sistema celular o in vitro (por ejemplo, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30, o aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 nucleótidos) y una región codificante que tiene de aproximadamente 3 a aproximadamente 25 (por ejemplo, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24 ó 25) nucleótidos que son complementarios a la región no codificante. Con "inhibidor de ARNi" se quiere decir cualquier molécula que puede regular por disminución, reducir o inhibir la función o actividad de interferencia del ARN en una célula u organismo. Un inhibidor de ARNi puede regular por disminución, reducir o inhibir la ARNi (por ejemplo, la escisión de un polinucleótido objetivo, inhibición de la traducción, o silenciamiento traslacional mediados por ARNi) mediante la interacción o interferencia de la función de cualquier componente de la ruta de ARNi, que incluye componentes proteínicos tales como RISC, o componentes de ácido nucleico tales como miARN o siARN. Un inhibidor de ARNi puede ser una molécula de siNA, una molécula no codificante, un aptámero, o una molécula corta que interactúa o interfiere con la función de RISC, un miARN, o un siARN o cualquier otro componente de la ruta de ARNi en una célula u organismo. Al inhibir la ARNi (por ejemplo, la escisión de un polinucleótido objetivo, inhibición de la traducción, o silenciamiento traslacional mediado por ARNi), un inhibidor de ARNi de la invención puede usarse para modular (por ejemplo, regular por aumento o regular por disminución) la expresión de un gen objetivo. En una modalidad, un inhibidor de ARN de la invención se usa para regular por aumento la expresión génica interfiriendo (por ejemplo, reduciendo o evitando) la regulación por inhibición o la inhibición de expresión génica endógenas a través de la inhibición de la traducción, silenciamiento traslacional, o escisión mediada por RISC de un polinucleótido (por ejemplo, mARN). Al interferir con los mecanismos de la represión, silenciamíento, o inhibición de la expresión génica endógenos, los inhibidores de ARNi de la invención por lo tanto pueden usarse para regular por aumento la expresión génica para el tratamiento de enfermedades, rasgos, o afecciones que se producen por una pérdida de la función. En una modalidad, el término "inhibidor de ARNi" se usa en lugar del término "siNA" en las diversas modalidades del presente documento, por ejemplo, con el efecto de aumentar la expresión génica par el tratamiento de enfermedades, rasgos, y/o afecciones de pérdida de función. Con "aptámero" o "aptámero de ácido nucleico" tal como se usa en el presente documento se quiere decir un polinucleótido que se une de forma específica a una molécula objetivo en la que la molécula de ácido nucleico tiene una secuencia que es diferente de la secuencia reconocida por la molécula objetivo en su entorno natural. De forma alternativa, un aptámero puede ser una molécula de ácido nucleico que se une a una molécula objetivo donde la molécula objetivo no se une de forma natural a un ácido nucleico. La molécula objetivo puede ser cualquier molécula de interés. Por ejemplo, el aptámero puede usarse para unirse a un dominio de unión de ligandos de una proteína, evitando así la interacción del ligando natural con la proteína. Este es un ejemplo no limitante y los expertos en la técnica reconocerán que fácilmente pueden generarse otras modalidades usando técnicas conocidas de forma general en la técnica, véase por ejemplo Gold y cois., 1995, Annu. Rev. Biochem., 64, 763; Brody y Gold, 2000, J. Biotechnol., 74, 5; Sun, 2000, Curr. Opin. Mol. Ther., 2, 100; Kusser, 2000, J. Biotechnol., 74, 27; Hermann y Patel, 2000, Science, 287, 820; y Jayasena, 1999, Clinical Chemistry, 45, 1628. Las moléculas de aptámeros de la invención pueden modificarse químicamente tal como es sabido de forma general en la técnica o tal como se describe en el presente documento. El término "ácido nucleico no codificante", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que se une un ARN objetivo mediante interacciones entre ARN-ARN o ARN-DNA o ARN-PNA (Protein nucleic acid; Egholm y cois., 1993 Nature 365, 566) y altera la actividad del ARN objetivo (para una revisión, véase Stein y Cheng, 1993 Science 261 , 1004 y Woolf y cois., patente de Estados Unidos nJ 5,849,902) mediante interacción estérica o mediante reconocimiento de objetivos mediadas por RNasa H. Habitualmente, las moléculas no codificantes son complementarias a una secuencia objetivo en una única secuencia contigua de la molécula no codificante. Sin embargo, en ciertas modalidades, una molécula no codificante puede unirse a un sustrato de tal forma que la molécula sustrato forme un bucle, y/o una molécula no codificante puede unirse de tal forma que la molécula no codificante forme un bucle. Así, la molécula no codificante puede ser complementaria a dos (o incluso más) secuencias sustrato no contiguas o dos (o incluso más) porciones de secuencia no contiguas de una molécula no codificante pueden ser complementarias a una secuencia objetivo o ambas. Para una revisión de las actuales estrategias no codificantes, véase Schmajuk y cois., 1999, J. Biol. Chem., 274, 21783-21789, Delihas y cois., 1997, Nature, 15, 751-753, Stein y cois., 1997, no codificante N. A. Drug Dev., 7, 151 , Crooke, 2000, Methods Enzymol., 313, 3-45; Crooke, 1998, Biotech. Genet. Eng. Rev., 15, 121 -157, Crooke, 1997, Ad. Pharmacol., 40, 1-49. Además, puede usarse DNA no codificante o no codificante modificado con 2'-MOE y otras modificaciones como se conoce en la técnica para dirigirse a ARN mediante las interacciones entre DNA-ARN, activando así RNasa H, que digiere el ARN objetivo en la molécula bicatenaria. Los oligonucleótidos no codificantes pueden comprender una o más regiones activadoras de ARNsa H, que tienen capacidad de activar la escisión por ARNsa H de un ARN objetivo. El DNA no codificante puede sintetizarse químicamente o expresarse mediante el uso de un vector de expresión de DNA monocatenario o su equivalente. Las moléculas no codificantes de la invención pueden modificarse químicamente tal como es sabido de forma general en la técnica o tal como se describe en el presente documento. Con "modular" se quiere decir que la expresión del gen, o el nivel de una molécula de ARN o moléculas de ARN equivalentes que codifican una o más proteínas o subunidades de proteínas, o la actividad de una o más proteínas o subunidades de proteínas se regula por aumento o se regula por disminución, de tal forma que la expresión, nivel o actividad es mayor o inferior que la que se observa en ausencia del modulador. Por ejemplo, el término "modular" puede significar "inhibir," pero el uso de la palabra "modular" no se limita a esta definición. Con "inhibir", "regular por disminución", o "reducir", se quiere decir que la expresión del gen, o nivel de moléculas de ARN o equivalentes de moléculas de ARN que codifican una o más proteínas o subunidades de proteínas, o la actividad de una o más proteínas o subunidades de proteínas, se reduce por debajo de la que se observa en ausencia de las moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, siNA) de la invención. En una modalidad, la inhibición, regulación por disminución o reducción con una molécula de siNA es inferior al nivel que se observa en presencia de una molécula inactiva o atenuada. En otra modalidad, la inhibición, regulación por disminución, o reducción con moléculas de siNA es inferior al nivel que se observa en presencia, por ejemplo, de una molécula de siNA con una secuencia enmarañada o con emparejamientos erróneos. En otra modalidad, la inhibición, regulación por disminución, o reducción de la expresión génica con una molécula de ácido nucleico de la presente invención es mayor en presencia de la molécula de ácido nucleico que en su ausencia. En una modalidad, la inhibición, regulación por disminución o reducción de la expresión génica está asociada al silenciamiento postraslacional, tal como la escisión mediada por ARNi de una molécula de ácido nucleico objetivo (por ejemplo ARN) o la inhibición de la traducción. En una modalidad, la inhibición, regulación por disminución, o reducción de la expresión génica se asocia al silenciamiento pretranscripcional, tal como mediante alteraciones de los patrones de metilación del DNA y la estructura de la cromatina de DNA. Con "regular por aumento", o "promover", se quiere decir que la expresión del gen, o nivel de moléculas de ARN o equivalentes de moléculas de ARN que codifican una o más proteínas o subunidades de proteínas, o la actividad de una o más proteínas o subunidades de proteínas, se aumenta por encima de la que se observa en ausencia de las moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, siNA) de la invención. En una modalidad, la regulación por aumento o promoción de la expresión génica con una molécula de siNA es superior al nivel que se observa en presencia de una molécula inactiva o atenuada. En otra modalidad, la regulación por aumento o promoción de la expresión génica con una molécula de siNA es superior al nivel que se observa en presencia, por ejemplo, de una molécula de siNA con una secuencia enmarañada o con emparejamientos erróneos. En otra modalidad, la regulación por aumento o promoción de la expresión génica con una molécula de ácido nucleico de la presente invención es mayor en presencia de la molécula de ácido nucleico que en su ausencia. En una modalidad, la regulación por aumento o promoción de la expresión génica está asociada a la inhibición del silenciamiento génico mediado por ARN, tal como la escisión o silenciamiento mediados por ARNi de una objetivo de ARN codificante o no codificante que regula por disminución, inhibe, o silencia la expresión del gen de interés a regular por aumento. La regulación por disminución de la expresión génica, por ejemplo, puede inducirse mediante un ARN codificante o su proteína codificada, tal como a través de retroalimentación negativa o efectos antagónicos. La regulación por disminución de la expresión génica puede inducirse, por ejemplo, mediante un ARN no codificante que ejerce el control regulador para un gen de interés, por ejemplo mediante silenciamiento de la expresión del gen mediante inhibición de la traducción, estructura de la cromatina, metilación, escisión de ARN mediada por RISC o inhibición de la traducción. Así, puede usarse la inhibición o la regulación por disminución de las objetivos que regulan por disminución, suprimen o silencian un gen de interés para regular por aumento o promover la expresión del gen de interés para el uso terapéutico. En una modalidad, un inhibidor de ARNi de la invención se usa para regular por aumento la expresión génica inhibiendo la ARNi o silenciamiento génico. Por ejemplo, un inhibidor de ARNi de la invención puede usarse para tratar las enfermedades y afecciones de pérdida de la función al aumentar la expresión génica, tal como en los casos de insuficiencia haplótica en la que un alelo de un gen particular alberga una mutación (por ejemplo, una mutación en el marco de lectura, de sentido alterado o sin sentido) que provoca la pérdida de una función de la proteína codificada por el alelo mutante. En tales casos, el inhibidor de ARNi puede usarse para regular por aumento la expresión de la proteína codificada por el alelo silvestre o funcional, corrigiendo así la haploinsuficiencia al compensar el alelo mutante o nulo. En otra modalidad, una molécula de siNA de la invención se usa para regular por disminución la expresión de un aumento tóxico de la función de un alelo mientras que un inhibidor de ARNi de la invención se usa de forma concomitante para regular por aumento la expresión del alelo de tipo silvestre o funcional, tal como en el tratamiento de enfermedades, rasgos, o afecciones del presente documento o por otros medios conocidos en la técnica (véase por ejemplo Rhodes y cois. 2004, PNAS USA, 101 : 1 1147-11152 y Meisler y cois. 2005, The Journal of Clinical Investigation, 115: 2010-2017). Con "gen", o "gen objetivo" o "DNA" objetivo, se quiere decir un ácido nucleico que codifica un ARN, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico que incluyen, pero sin limitación, genes estructurales que codifican un polipéptido. Un gen o gen objetivo también puede codificar un ARN funcional (fARN) o un ARN no codificante (ncARN), tal como ARN corto temporal (stARN), micro ARN (miARN), ARN corto nuclear (snARN), ARN corto de interferencia (siARN), ARN corto nucleolar (snARN), ARN ribosómico (rARN), ARN de transferencia (tARN) y sus ARN precursores. Dichos ARN no codificantes pueden servir como moléculas de ácido nucleico objetivo para la interferencia del ARN mediada por siNA para modular la actividad de fARN o ncARN implicados en los procesos celulares funcionales o reguladores. La actividad aberrante de fARN o ncARN que provoca una enfermedad por lo tanto puede modularse mediante las moléculas de siNA de la invención. Las moléculas de siNA dirigidas a fARN y ncARN también pueden usarse para manipular o alterar el genotipo o fenotipo de un sujeto, organismo o célula, interviniendo en procesos celulares tales como sellado genético, transcripción, traducción, o procesamiento de ácidos nucleicos (por ejemplo, transaminación, metilación etc.). El gen objetivo puede ser un gen derivado de una célula, un gen endógeno, un transgen, o genes exógenos tales como genes de un patógeno, por ejemplo un virus, que está presente en la célula después de su infección. La célula que contiene el gen objetivo puede derivarse o estar contenida en cualquier organismo, por ejemplo una planta, animal, protozoo, virus, bacteria u hongo. Ejemplos no limitantes de plantas incluyen monocotiledóneas, dicotiledóneas, o gimnospermas. Ejemplos no limitantes de animales incluyen vertebrados o invertebrados. Ejemplos no limitantes de hongos incluyen mohos o levaduras. Para una revisión, véase por ejemplo Snyder y Gerstein de 2003, Science, 300, 258-260. Con "par de bases no canónico" se quiere decir cualquier par de bases distintas de las de Watson-Crick, tales como emparejamientos erróneos y/o pares de bases titubeantes, que incluyen emparejamientos erróneos por f lip, emparejamientos erróneos de enlace de hidrógeno único, emparejamientos erróneos de tipo trans, interacciones de tres bases e interacciones de cuatro bases. Ejemplos no limitantes de tales pares de bases no canónicos incluyen, pero sin limitación, pares de bases con Hoogsteen inverso en AC, titubeo en AC, Hoogsteen inverso en AU, titubeo en GU, N7 amino en AA, 2-carbonil-amino(H1)-N3-amino(H2) en CC, rotura en GA, 4-carbonil-amino en UC, imino-carbonilo en UU, titubeo inverso en AC, Hoogsteen en AU, Watson Crick inverso en AU, Watson Crick inverso en CG, N3-amino-amino N3 en GC, N1-amino simétrico en AA, N7-amino simétrico en AA, N7-N1 amino-carbonilo en GA, carbonil-amino N7-N1 en GA+, N1-carbonil simétrico en GG, N3-amino simétrico en GG, carbonil-amino simétrico en CC, N3-amino simétrico en CC, 2-carbonil-imino simétrico en UU, 4-carbonil-imino simétrico en UU, amino-N3 en AA, N1-amino en AA, amino 2-carbonilo en AC, N3-amino en AC, N7-amino en AC, amino-4-carbonilo en AU, N1-imino en AU, N3-imino en AU, N7-imino en AU, carbonil-amino en CC, amino-N1 en GA, amino-N7 en GA, carbonil-amino en GA, N3-amino en GA, amino-N3 en GC, carbonil-amino en GC, N3-amino en GC, N7-amino en GC, amino-N7 en GC, carbonil-imino en GG, N7-amino en GG, amino-2-carbonilo en GU, carbonil-imino en GU, imino-2-carbonilo en GU, N7-imino en GU, imino-2-carbonilo en psiU, 4-carbonil-amino en UC, imino-carbonilo en UC, imino-4-carbonilo en UU, C2-H-N3 en AC, carbonil-C2-H en GA, imino-4-carbonil 2 carbonil-C5-H en UU, amino(A) N3(C)-carbonilo en AC, imino amino-carbonilo en GC, imino-2-carbonil amino-2- carbonilo en Gpsi, y imino amino-2-carbonil en GU. Con "objetivo" tal como se usa en el presente documento se quiere decir, cualquier proteína, péptido, o polipéptido objetivo tales como los codificados por los nJ de acceso de GenBank que se describen en el presente documento y/o en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/363,124, documentos USSN 10/923,536 y/o PCT/US03/05028, los cuales se incorporan por referencia al presente documento. El término "objetivo" también se refiere a secuencias de ácido nucleico o secuencia de polinucleótidos objetivo que codifican cualquier proteína, péptido, o polipéptido objetivo, tal como proteínas, péptidos, o polipéptidos codificados por secuencias que tienen los nJ de acceso de GenBank que se muestran en el presente documento y/o en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/363,124, documentos USSN 10/923,536 y/o USSN PCT/US03/05028. La objetivo de interés puede incluir secuencias de polinucleótidos objetivo, tales como DNA objetivo o ARN objetivo. El término "objetivo" también se pretende que incluya otras secuencias, tales como isoformas diferentes, genes mutantes objetivo, variantes de ayuste de polinucleótidos objetivo, polimorfismos objetivo, y secuencias de polinucleótidos no codificante (por ejemplo, ncARN, miARN, stARN) u otras reguladoras tales como las que se describen en el presente documento. Por lo tanto, en diversas modalidades de la invención, una molécula bicatenaria de ácido nucleico de la invención (por ejemplo, siNA) que tiene complementariedad con un ARN objetivo puede usarse para inhibir o regular por disminución la actividad de miARN u otro ncARN. En una modalidad, la inhibición de la actividad de miARN o ncARN puede usarse para regular por disminución o inhibir la expresión génica (por ejemplo, los genes objetivo que se describen en el presente documento o conocidos por otros medios en la técnica) que depende de la actividad de miARN o ncARN. En otra modalidad, la inhibición de la actividad de miARN o ncARN por las moléculas bicatenarias de ácido nucleico de la invención (por ejemplo siNA) que tienen complementariedad con el miARN o ncARN puede usarse para regular por aumento o promover la expresión del gen objetivo (por ejemplo, genes objetivo que se describen en el presente documento o conocidos por otros medios en la técnica) donde la expresión de dichos genes es regulado por disminución, suprimido o silenciado por el miARN o ncARN. Dicho aumento de la expresión génica puede usarse para tratar enfermedades y afecciones asociadas a una pérdida de función o haploinsuficiencia que son conocidas de forma general en la técnica (por ejemplo, distrofias musculares, fibrosis quística o enfermedades y afecciones neurológicas que se describen en el presente documento tal como epilepsia, que incluye epilepsia mioclónica grave de la infancia o síndrome de Dravet). Con "ruta objetivo" se quiere decir cualquier objetivo implicada en las rutas de expresión o actividad génica. Por ejemplo, cualquier objetivo puede tener rutas objetivo que pueden incluir genes corriente arriba, corriente abajo o genes modificadores en una ruta biológica. Estos genes de ruta objetivo pueden proporcionar efectos aditivos o sinérgicos en el tratamiento de enfermedades, afecciones, y rasgos del presente documento. En una modalidad, la objetivo es cualquier ARN objetivo o una porción del mismo. En una modalidad, la objetivo es cualquier DNA objetivo o una porción del mismo. En una modalidad, la objetivo es cualquier mARN objetivo o una porción del mismo. En una modalidad, la objetivo es cualquier miARN objetivo o una porción del mismo. En una modalidad, la objetivo es cualquier siARN objetivo o una porción del mismo. En una modalidad, la objetivo es cualquier stARN objetivo o una porción del mismo. En una modalidad, la objetivo es una objetivo y o ruta objetivo o una porción de la misma. En una modalidad, la objetivo es cualquiera (por ejemplo, una o más) de las secuencias objetivo que se describen en el presente documento y/o en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/363,124, documentos USSN 10/923,536 y/o PCT/US03/05028, o una porción de las mismas. En una modalidad, la objetivo es cualquiera (por ejemplo, una o más) de las secuencias objetivo que se muestran en el cuadro II o una porción de las mismas. En otra modalidad, la objetivo es un siARN, miARN, o stARN que corresponde a cualquier (por ejemplo, uno o más) secuencia objetivo, hebra superior, o hebra inferior que se muestra en el cuadro II o una porción de la misma. En otra modalidad, la objetivo es cualquier siARN, miARN, o stARN que corresponde a cualquier (por ejemplo, una o más) secuencia correspondiente a una secuencia del presente documento o que se describe en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/363,124, documentos USSN 10/923,536 y/o PCT/US03/05028. Con "secuencia homologa" se quiere decir, una secuencia de nucleótidos compartida por una o más secuencias de polinucleótidos, tales como genes, transcritos génicos y/o polinucleótidos no codificantes. Por ejemplo, una secuencia homologa puede ser una secuencia de nucleótidos compartida por dos o más genes que codifican proteínas relacionadas pero diferentes, tales como diferentes miembros de una familia génica, diferentes epítopos de la proteína, diferentes isoformas de proteínas o genes completamente divergentes, tales como una citocina y sus receptores correspondientes. Una secuencia homologa puede ser una secuencia de nucleótidos compartida por dos o más no polinucleótidos codificantes, tales como DNA o ARN no codificantes, secuencias reguladoras, intrones, y sitios de control o regulación de la transcripción. Las secuencias homologas también pueden incluir regiones conservadas de la secuencia, compartidas por más de una secuencia de polinucleótidos. La homología no tiene que ser una homología perfecta (por ejemplo, 100%), ya que las secuencias parcialmente homologas también se contemplan en la presente invención (por ejemplo, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80% etc.). Con "región conservada de una secuencia" se quiere decir que una secuencia de nucleótidos de una o más regiones de un polinucleótido no varía de forma significativa entre generaciones o de un sistema biológico, sujeto, u organismo a otro sistema biológico, sujeto, u organismo. El polinucleótido puede incluir ADN y ARN tanto codificante como no codificante. Con "región codificante" se quiere decir una secuencia de nucleótidos de una molécula de siNA que tiene complementariedad con una región no codificante de la molécula de siNA. Además, la región codificante de una molécula de siNA puede comprender una secuencia de ácido nucleico que tiene homología con una secuencia de ácido nucleico objetivo. En una modalidad, la región codificante de la molécula de siNA se denomina hebra codificante o hebra pasajera. Con "región no codificante" se quiere decir una secuencia de nucleótidos de una molécula de siNA que tiene complementariedad con una secuencia de ácido nucleico objetivo. Además, la región no codificante de una molécula de siNA opcionalmente puede comprender una secuencia de ácido nucleico que tiene complementariedad con una región codificante de la molécula de siNA. En una modalidad, la región no codificante de la molécula de siNA se denomina hebra no codificante o hebra guia. Con "ácido nucleico objetivo" o "polinucleótido objetivo" se quiere decir cualquier secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, cualquier objetivo y/o secuencia de ruta objetivo) cuya expresión o actividad va a modularse. El ácido nucleico objetivo puede ser ADN o ARN. En una modalidad, un ácido nucleico objetivo de la invención es ARN o ADN objetivo.

Con "complementariedad" se quiere decir que un ácido nucleico puede formar enlace(s) de hidrógeno con otra secuencia de ácido nucleico bien por el tradicional Watson-Crick o por otros tipos no tradicionales tal como se describe en el presente documento. En una modalidad, una molécula bicatenaria de ácido nucleico de la invención, tal como una molécula de siNA, en la que cada hebra tiene entre 15 y 30 nucleótidos de longitud, comprende entre aproximadamente 10% y aproximadamente 100% (por ejemplo, aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%. 70%, 80%, 90%, o 100%) de complementariedad entre las dos hebras de la molécula bicatenaria de ácido nucleico. En otra modalidad, una molécula bicatenaria de ácido nucleico de la invención, tal como una molécula de siNA, donde una hebra es la hebra codificante y la otra hebra es la hebra no codificante, en la que cada hebra tiene entre 15 y 30 nucleótidos de longitud, comprende entre al menos aproximadamente 10% y aproximadamente 100% (por ejemplo, al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100%) de complementariedad entre la secuencia de nucleótidos en la hebra no codificante de la molécula bicatenaria de ácido nucleico y la secuencia de nucleótidos de su correspondiente molécula de ácido nucleico objetivo, tal como un ARN objetivo o mARN objetivo o ARN vírico. En una modalidad, una molécula bicatenaria de ácido nucleico de la invención, tal como una molécula de siNA, donde una hebra comprende la secuencia de nucleótidos que se denomina la región codificante y la otra hebra comprende una secuencia de nucleótídos que se denomina región no codificante, en la que cada hebra tiene entre 15 y 30 nucleótidos de longitud, comprende entre aproximadamente 10% y aproximadamente 100% (por ejemplo, aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100%) de complementariedad entre la región codificante y la región no codificante de la molécula bicatenaria de ácido nucleico. En referencia a las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, la energía libre de unión para una molécula de ácido nucleico con su secuencia complementaria es suficiente para permitir que se produzca la función relevante del ácido nucleico, por ejemplo, la actividad de ARNi. La determinación de las energías libres de unión para las moléculas de ácido nucleico es notoria en la técnica (véase, por ejemplo, Turner y cois., 1987, CSH Symp. Quant. Biol. Lll páginas 123-133; Frier y cois., 1986, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83: 9373-9377; Turner y cois., 1987, J. Am. Chem. Soc. 109: 3783-3785). Un porcentaje de complementariedad indica el porcentaje de restos contiguos en una molécula de ácido nucleico que puede formar enlaces de hidrógeno (por ejemplo, emparejamiento de bases de Watson-Crick) con una segunda secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 nucleótidos de un total de 10 nucleótidos en el primer oligonucleótido que se empareja con una segunda secuencia de ácido nucleico que tiene 10 nucleótidos representa 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, y 100% de complementariedad respectivamente). En una modalidad, una molécula de siNA de la invención tiene una complementariedad perfecta entre la hebra codificante o región codificante y la hebra no codificante o región no codificante de la molécula de siNA. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención es perfectamente complementaria a una molécula de ácido nucleico objetivo correspondiente. "Perfectamente complementaria" quiere decir que todos los restos contiguos de una secuencia de ácido nucleico formarán puentes de hidrógeno con el mismo número de restos contiguos de una segunda secuencia de ácido nucleico. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 o más (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24. 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 o más) nucleótidos que son complementarios a una o más moléculas de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención tiene complementariedad parcial (es decir, menos del 100% de complementariedad) entre la hebra codificante o región codificante y la hebra no codificante o región no codificante de la molécula de siNA o entre la hebra no codificante o región no codificante de la molécula de siNA y una molécula de ácido nucleico objetivo correspondiente. Por ejemplo, la complementariedad parcial puede incluir diversos emparejamientos erróneos o nucleótidos sin emparejar (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5 o más emparejamientos erróneos o nucleótidos sin emparejar) en la estructura del siNA que pueden producir protuberancias, bucles, o colgaduras que se producen entre la hebra codificante o región codificante y la hebra no codificante o región no codificante de la molécula de siNA o entre la hebra no codificante o región no codificante de la molécula de siNA y una molécula de ácido nucleico objetivo correspondiente.

En una modalidad, una molécula bicatenaria de ácido nucleico de la invención, tal como la molécula de siNA, tiene complementariedad perfecta entre la hebra codificante o región codificante y la hebra no codificante o región no codificante de la molécula de ácido nucleico. En una modalidad, la molécula bicatenaria de ácido nucleico de la invención, tal como la molécula de siNA, es perfectamente complementaria a una molécula de ácido nucleico objetivo correspondiente. En una modalidad, la molécula bicatenaria de ácido nucleico de la invención, tal como la molécula de siNA, tiene complementariedad parcial (es decir, menos del 100% de complementariedad) entre la hebra codificante o región codificante y la hebra no codificante o región no codificante de la molécula bicatenaria de ácido nucleico o entre la hebra no codificante o región no codificante de la molécula de ácido nucleico y una molécula de ácido nucleico objetivo correspondiente. Por ejemplo, la complementariedad parcial puede incluir diversos emparejamientos erróneos o nucleótidos sin emparejar (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5 o más emparejamientos erróneos o nucleótidos sin emparejar, tales como protuberancias de nucleótidos) en la molécula bícatenaria de ácido nucleico, estructura que puede producir protuberancias, bucles, o colgaduras que se producen entre la hebra codificante o región codificante y la hebra no codificante o región no codificante de la molécula bicatenaria de ácido nucleico o entre la hebra no codificante o región no codificante de la molécula bicatenaria de ácido nucleico y una molécula de ácido nucleico objetivo correspondiente.

En una modalidad, la molécula bicatenaria de ácido nucleico de la invención es un microARN (miARN). Con "microARN" o "miARN" se quiere decir, un ARN bicatenario corto que regula la expresión de ARN mensajeros objetivo ya sea por escisión del mARN, represión/inhibición de la traducción o silenciamiento heterocromático (véase por ejemplo Ambros, 2004, Nature, 431 , 350-355; Bartelde 2004, Cell, 116, 281-297; Cullende 2004, Virus Research., 102, 3-9; He y cois. 2004, Nat. Rev. Genet., 5, 522-531 ; Ying y cois. 2004, gen, 342, 25-28; y Sethupathy y cois., 2006, ARN, 12:192-197). En una modalidad, el microARN de la invención, tiene complementariedad parcial (es decir, menos del 100% de complementariedad) entre la hebra codificante o región codificante y la hebra no codificante o región no codificante de la molécula de miARN o entre la hebra no codificante o región no codificante del miARN y una molécula de ácido nucleico objetivo correspondiente. Por ejemplo, la complementariedad parcial puede incluir diversos emparejamientos erróneos o nucleótidos sin emparejar (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5 o más emparejamientos erróneos o nucleótidos sin emparejar, tales como protuberancias de nucleótidos) en la molécula bicatenaria de ácido nucleico, estructura que puede producir protuberancias, bucles, o colgaduras que se producen entre la hebra codificante o región codificante y la hebra no codificante o región no codificante de la miARN o entre la hebra no codificante o región no codificante de la miARN y una molécula de ácido nucleico objetivo correspondiente.

En una modalidad, se usan las moléculas de siNA de la invención que regulan por disminución o reducen la expresión del gen objetivo para prevenir o tratar enfermedades, trastornos, afecciones, o rasgos en un sujeto u organismo tal como se describe en el presente documento o conocidos por otros medios en la técnica. Con "enfermedad proliferativa" o "cáncer" tal como se usa en el presente documento se quiere decir, cualquier enfermedad, afección, rasgo, genotipo o fenotipo caracterizado por crecimiento o replicación celular no regulada tal como se conoce en la técnica; que incluye leucemias, por ejemplo, leucemia mielógena aguda (AML), leucemia mielógena crónica (CML), leucemia linfocítica aguda (ALL), y leucemia linfocítica crónica, cánceres relacionados con el SIDA tales como sarcoma de Kaposi; cánceres de mama; cánceres óseos tales como osteosarcoma, condrosarcomas, sarcoma de Ewing, fibrosarcomas, tumores de células gigantes, adamantinomas, y cordomas; cánceres de cerebro tales como meningiomas, glioblastomas, astrocitomas de grado inferior, oligodendrocitomas, tumores de pituitaria, schwannomas, y cánceres de cerebro metastásico; cánceres de la cabeza y cuello que incluyen diversos linfomas tales como linfoma de las células de la corteza cerebral, linfoma no de Hodgkin, adenoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma de laringe, cánceres de vesícula biliar y coledococo, cánceres de la retina tal como retinoblastoma, cánceres del esófago, cánceres gástricos, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer uterino, cáncer de tiroides, cáncer de testículos, cáncer de endometrio, melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de pulmón (que incluye carcinoma de pulmón no amicrocítico), cáncer pancreático, sarcomas, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, cáncer de cabeza y cuello, cánceres de piel, carcinoma nasofaríngeo, liposarcoma, carcinoma epitelial, carcinoma de células renales, adenocarcinoma de vesícula, adenocarcinoma paratiroideo, sarcoma de endometrio, cánceres resistentes a fármacos múltiples; y enfermedades y afecciones proliferativas, tales como neovascularización asociada a la angiogénesis tumoral, degeneración macular (por ejemplo, AMD húmeda/seca), neovascularización de la córnea, retinopatia diabética, glaucoma neovascular, degeneración miópica y otras enfermedades y afecciones proliferativas tales como restenosis y enfermedad renal poliquística, y cualquier otro cáncer o la enfermedad proliferativa, afección, rasgo, genotipo o fenotipo que puede responder a la modulación de la expresión génica relacionada con la enfermedad en una célula o tejido, sola o combinada con otras terapias. Con "enfermedad inflamatoria" o "afección inflamatoria" tal como se usa en el presente documento se quiere decir cualquier enfermedad, afección, rasgo, genotipo o fenotipo caracterizado por un proceso inflamatorio o alérgico tal como se conoce en la técnica, tal como inflamación, inflamación aguda, inflamación crónica, enfermedad respiratoria, aterosclerosis, soriasis, dermatitis, restenosis, asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, choque séptico, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad pélvica inflamatoria, dolor, enfermedad inflamatoria ocular, enfermedad celíaca, síndrome de Leigh, déficit de glicerol cinasa, eosinofilia familiar (FE), ataxia espástica autosómica recesiva, enfermedad inflamatoria de la laringe; tuberculosis, coleocistitis crónica, bronquiectasia, silicosis y otras pneumoconiosis, y cualquier otra enfermedad, afección, rasgo, genotipo o fenotipo inflamatorios que pueden responder a la modulación de la expresión génica relacionada con la enfermedad en una célula o tejido, sola o combinada con otras terapias. Con "enfermedad autoinmunitaria" o "afección autoinmunitaria" tal como se usa en el presente documento se quiere decir, cualquier enfermedad, afección, rasgo, genotipo o fenotipo caracterizado por la autoinmunidad tal como se conoce en la técnica, tal como esclerosis múltiple, diabetes mellitus, lupus, enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, síndrome de Guillain-Barre, esclerodermas, síndrome de Goodpasture, granulomatosis de Wegener, epilepsia autoinmunitaria, encefalitis de Rasmussen, esclerosis biliar primaria, colangitis esclerosante, hepatitis autoinmunitaria, enfermedad de Addison, tiroiditis de Hashimoto, fibromialgia, síndrome de Menier; rechazo de trasplante (por ejemplo, prevención de rechazo de aloinjertos) anemia perniciosa, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, dermatomoiositis, síndrome de Sjogren, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, miastenia grave, síndrome de Reiter, enfermedad de Grave y cualquier otra enfermedad, afección, rasgo, genotipo o fenotipo autoinmunitarios que pueden responder a la modulación de la expresión génica relacionada con la enfermedad en una célula o tejido, sola o combinada con otras terapias. Con "enfermedad infecciosa" se quiere decir cualquier enfermedad, afección, rasgo, genotipo o fenotipo asociados a un agente infeccioso, tal como un virus, bacteria, hongo, prión o parásito. Ejemplos no limitantes de diversos genes víricos que pueden ser el objetivo de moléculas de siNA de la invención incluyen virus de la hepatitis (HCV, por ejemplo nJ de acceso de GenBank: D11168, D50483.1 , L38318 y S82227), virus de la hepatitis B (VHB, por ejemplo nJ de acceso de GenBank AF100308.1), virus de inmunodeficiencia humano de tipo 1 (VIH-1 , por ejemplo nJ de acceso de GenBank U51188), virus de inmunodeficiencia humano de tipo 2 (VIH-2, por ejemplo nJ de acceso de GenBank X60667), virus del oeste del Nilo (WNV por ejemplo nJ de acceso de GenBank NC_001563), citomegalovirus (CMV por ejemplo nJ de acceso de GenBank NC_001347), virus sincicial respiratorio (RSV por ejemplo nJ de acceso de GenBank NC 001781), virus influenza (por ejemplo nJ de acceso de GenBank AF037412, rhinovirus (por ejemplo, nJ de acceso de GenBank: D00239, X02316, X01087, L24917, M16248, K02121 , X01087), papillomavirus (por ejemplo nJ de acceso de GenBank NC 001353), Virus Herpes simplex (HSV por ejemplo nJ de acceso de GenBank NC 001345), y otros virus tales como HTLV (por ejemplo nJ de acceso de GenBank AJ430458). Debido a la alta variabilidad entre las secuencias de muchos genomas virales, la selección de las moléculas de siNA para aplicaciones terapéuticas amplias probablemente implicaría las regiones conservadas del genoma vírico. Ejemplos no limitantes de regiones conservadas de los genomas virales incluyen pero sin limitación regiones 5' no codificantes (NCR), regiones 3' no codificantes (NCR) y/o sitios de entrada de ribosomas internos (IRES). Las moléculas de siNA diseñadas contra regiones conservadas de diversos genomas permitirá una inhibición eficaz de la replicación vírica en diversas poblaciones de pacientes y puede asegurar la eficacia de las moléculas de siNA contra especies cuasivíricas que evolucionan debido a mutaciones en las regiones no conservadas del genoma vírico. Ejemplos no limitantes de infecciones bacterianas incluyen actinomicosis, ántrax, aspergilosis, bacteremia, infecciones y micosis bacterianas, infecciones por Bartonella, botulismo, brucelosis, infecciones por Burkholderia, infecciones por Campylobacter, candidiasis, enfermedad del arañazo de gato, infecciones por Chlamydia, cólera, infecciones por Clostridium, coccidioidomicosis, infección cruzada, ciyptococcosis, dermatomicosis, dermatomicosis, difteria, erliquiosis, infecciones por Escherichia coli, fasciitis, necrosis, infecciones por Fusobacterium, gangrena, infecciones por bacterias gram negativas, infecciones por bacterias gram positivas, histoplasmosis, impetigo, infecciones por Klebsiella, legionelosis, lepra, leptoespirosis, infecciones por Listeria, enfermedad de Lyme, maduromicosis, melioidosis, infecciones por Mycobacterium, infecciones por Mycoplasma, micosis, infecciones por Nocardia, onicomicosis, ornitosis, plaga, infecciones por pneumococos, infecciones por Pseudomonas, fiebre Q, fiebre por mordedura de rata, fiebre recidivante, fiebre reumática, infecciones por Rickettsia, fiebre manchada de las Montañas Rocosas, infecciones por Salmonella, fiebre escarlatina, tifus, septicemia, enfermedades de transmisión sexual bacterianas, enfermedades bacterianas de la piel, infecciones por estafilococos, infecciones por estreptococos, tétanos, enfermedades portadas por las garrapatas, tuberculosis, tularemia, fiebre tifoidea, tifus, epidemias transmitidas por piojos, infecciones por Vibrio, treponematosis, infecciones por Yersinia, zoonosis, y zigomicosis. Ejemplos no limitantes de infecciones fúngicas incluyen aspergilosis, blastomicosis, coccidioidomicosis, criptococcosis, infecciones fúngicas de las uñas de manos y pies, sinusitis fúngica, histoplasmosis, histoplasmosis, mucormicosis, infección fúngica de las uñas, paracoccidioidomicosis, sporotricosis, fiebre del valle (coccidioidomicosis), y alergia al moho. Con "enfermedad neurológica" se quiere decir cualquier enfermedad, trastorno, o afección que afecta al sistema nervioso central o periférico, que incluye ADHD, SIDA - Complicaciones neurológicas, ausencia de Septum Pellucidum, afasia epileptiforme adquirida, encefalomielitis diseminada aguda, adrenoleucodistrofia, agénesis del Corpus Callosum, agnosia, síndrome de Aicardi, enfermedad de Alexander, enfermedad de Alpers, hemiplegia alternante, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, anencefalia, aneurisma, síndrome de Angeman, angiomatosis, anoxia, afasia, apraxia, quistes aracnoides, aracnoiditis, malformación de Arnold-Chiari, malformación arteriovenosa, aspartamo, síndrome de Asperger, ataxia telangiectasia, ataxia, trastorno de hiperactividad con déficit de atención, autismo, disfunción autonómica, dorsalgia, síndrome de Barth, enfermedad de Batten, enfermedad de Behcet, parálisis de Bell, blefaroespasmo esencial benigno, amiotrofia focal benigna, hipertensión intracraneal benigna, síndrome de Bernhardt-Roth, enfermedad de Binswanger, blefarospasmo, síndrome de Bloch-Sulzberger, lesiones del plexo braquial en el nacimiento, lesiones del plexo braquial, síndrome de Bradbury-Eggleston, aneurisma cerebral, lesión cerebral, tumores cerebrales y de la médula espinal, síndrome de Brown-Sequard, atrofia muscular bulboespinal, enfermedad de Canavan, síndrome del túnel carpiano, causalgia, cavernomas, angioma cavernoso, malformación cavernosa, síndrome del cordón cervical central, síndrome del cordón central, síndrome de dolor central, trastornos cefálicos, degeneración cerebelar, hipoplasia cerebelar, aneurisma cerebral, arteriosclerosis cerebral, atrofia cerebral, Beriberi cerebral, gigantismo cerebral, hipoxia cerebral, parálisis cerebral, síndrome cerebro-oculo-facio-esquelético, trastorno de Charcot-Marie-Tooth, malformación de Chiari, corea, coreoacantocitosis, polineuropatia desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), intolerancia ortostática crónica, dolor crónico, síndrome de Cockayne de tipo II, síndrome de Coffin Lowry, coma, que incluye estado vegetativo persistente, síndrome de dolor regional complejo, displegia facial congénita, miastenia congénita, miopatía congénita, malformaciones vasculares cavernosas congénitas, degeneración corticobasal, arteritis craneal, craniosinostosis, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, trastornos traumáticos acumulados, síndrome de Cushing, enfermedad de inclusión de cuerpos citomegálicos (CIBD), infección por Cytomegalovirus, síndrome de ojos y pies saltatorios, síndrome de Dandy-Walquer, enfermedad de Dawson, síndrome de De Morsier, parálisis de Dejerine-Klumpke, demencia por infartos múltiples, demencia subcortical, demencia con cuerpos de Lewy, dermatomiositis, dispraxia del desarrollo, síndrome de Devic, neuropatía diabética, esclerosis difusa, síndrome de Dravet, disautonomia, disgrafia, dislexia, disfagia, dispraxia, distonías, encefalopatía epiléptica infantil temprana, síndrome de Empty Sella, encefalitis letárgica, encefalitis y meningitis, encefaloceles, encefalopatía, angiomatosis encefalotrigémica, epilepsia, parálisis de Erb, parálisis de Erb-Duchenne y Dejerine-Klumpke, enfermedad de Fabry, síndrome de Fahr, desmayos, disautonomía familiar, hemangioma familia, calcificación de los ganglios básales idiopatía familiar, parálisis espástica familiar, ataques febriles (por ejemplo, GEFS y GEFS plus), síndrome de Fisher, síndrome Floppy de la infancia, ataxia de Friedreich, enfermedad de Gaucher, síndrome de Gerstmann, enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, arteritis de células gigantes, enfermedad de inclusión de células gigantes, leucodistrofia de células globoides, neuralgia glosofaríngea, síndrome de Guillain-Barre, mielopatía asociada a HTLV-1 , enfermedad de Hallervorden-Spatz, lesión craneal, cefalea, hemicrania continua, espasmo hemifacial, hemiplegia alterans, neuropatías hereditarias, paraplegia espástica hereditaria, heredopática atáctica polineuritiforme, Herpes zoster oticus, Herpes Zoster, síndrome de Hirayama, holoprosencefalia, enfermedad de Huntington, hidranencefalia, hidrocefalia con presión normal, hidrocefalia, hidromielia, hipercortisolismo, hipersomnia, hipertonía, hipotonia, hipoxia, encefalomielitis inmunomediada, miositis de inclusión de cuerpos, incontinencia pigmenti, hipotonia de la infancia, enfermedad de almacenamiento de ácido fitálico de la infancia, enfermedad de Refsum de la infancia, espasmos en la infancia, miopatía inflamatoria, lipodistrofia intestinal, quistes intracraneales, hipertensión intracraneal, síndrome de Isaac, síndrome de Joubert, síndrome de Kearns-Sayre, enfermedad de Kennedy, síndrome de Kinsbourne, síndrome de Kleine-Levin, síndrome de Klippel Feil, síndrome de Klippel-Trenaunay (KTS), síndrome de Klüver-Bucy, síndrome amnésico de Korsakoff, enfermedad de Krabbe, enfermedad de Kugelberg-Welander, Kuru, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, síndrome de Landau-Kleffner, compresión del nervio cutáneo femoral lateral, síndrome medular lateral, dificultades de aprendizaje, enfermedad de Leigh, síndrome de Lennox-Gastaut, síndrome de Lesch-Nyhan, leucodistrofia, síndrome de Levine-Critchley, demencia con cuerpos de Lewy, lisencefalia, síndrome de enclaustramiento, enfermedad de Lou Gehrig, secuelas neurológicas del lupus, complicaciones neurológicas de la enfermedad de Lyme, enfermedad de Machado-Joseph, macroencefalía, megaencefalía, síndrome de Melkersson-Rosenthal, meningitis, enfermedad de Menkes, meralgia parestésica, leucodistrofia metacromática, microcefalia, migraña, síndrome de Miller Fisher, mini-ictus, miopatías mitocond ríales, síndrome de Mobius, amiotrofia monomélica, enfermedades de las neuronas motoras, enfermedad de Moyamoya, mucolipidosis, mucopolisacaridosis, demencia multiinfarto, neuropatía motora multifocal, esclerosis múltiple, atrofia multisistémica con hipotensión ortostática, atrofia multisistémica, distrofia muscular, miastenia congénita, miastenia grave, esclerosis difusa mielinoclástica, encefalopatía mioclónica de la infancia, mioclonus, miopatía congénita, miopatía tirotóxica, miopatía, miotonía congénita, miotonia, narcolepsia, neuroacantocitosis, neurodegeneración con acumulación cerebral de hierro, neurofibromatosis, síndrome maligno neuroléptico, complicaciones neurológicas del SIDA, manifestaciones neurológicas de la enfermedad de Pompe, neuromielitis óptica, neuromiotonía, lipofuscinosis ceroide neuronal, trastornos de migración neuronal, neuropatía hereditaria, neurosarcoidosis, neurotoxicidad, nevo cavernoso, enfermedad de Niemann-Pick, síndrome de O'Sullivan-McLeod, neuralgia occipital, secuencia de disrafismo espinal oculto, síndrome de Ohtahara, atrofia olivopontocerebelar, mioclonus opsoclonus, hipotensión ortostática, síndrome de uso excesivo, dolor crónico, síndromes paraneoplásicos, parestesia, enfermedad de Parkinson, parmiotonía congénita, coreoatetosis paroxística, hemicrania paroxística, Parry-Romberg, enfermedad de Pelizaeusmerozbacher, síndrome de Pena Shokeir II, quistes perineurales, parálisis periódicas, neuropatía periférica, leucomalacia periventricular, estado vegetativo persistente, trastornos generalizados del desarrollo, enfermedad de almacenamiento de ácido fitánico, enfermedad de Pick, síndrome piriforme, tumores de la pituitaria, polimiositis, enfermedad de Pompe, porencefalía, síndrome tras la polio, neuralgia posherpética, encefalomielitis postinfecciosa, hipotensión postural, síndrome de taquicardia ortostática postural, síndrome de taquicardia postural, esclerosis lateral primaria, enfermedades por priones, atrofia hemifacial progresiva, ataxia locomotora progresiva, leucoencefalopatía multifocal progresiva, polidistrofia esclerosante progresiva, parálisis supranuclear progresiva, pseudotumor cerebral, trastornos de ataques dependientes de piridoxina y que responden a piridoxina, síndrome de Ramsay Hunt de tipo I, síndrome de Ramsay Hunt de tipo II, encefalitis de Rasmussen y otras epilepsias autoinmunitarias, síndrome de distrofia simpática refleja, enfermedad de Refsum - enfermedad de Refsum de la infancia, trastornos cinéticos repetitivos, lesiones por estrés repetitivo, síndrome de piernas inquietas, mielopatía asociada a retrovirus, síndrome de Rett, síndrome de Reye, síndrome de Riley-day, cefalea SUNCT, quistes en la raíz del nervio sacro, baile de San Vito, enfermedad de las glándulas salivares, enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Schilder, esquizoencefalía, trastornos de ataques, displasia septo-óptica, epilepsia mioclónica grave de la infancia (SMEI), síndrome del niño maltratado, zóster, síndrome de Shy-Drager, síndrome de Sjogren, apnea del sueño, enfermedad del sueño, síndrome de Soto, espasmos, espina bífida, infarto de la médula espinal, lesión en la médula espinal, tumores en la médula espinal, atrofia muscular espinal, atrofia espinocerebelar, síndrome de Steele-Richardson-Olszewski, síndrome de Stiff-Person, degeneración estriatonigral, ictus, síndrome de Sturge-Weber, panencefalitis esclerosante subaguda, encefalopatía ateroesclerótica subcortical, trastornos al tragar, corea de Sydenham, síncope, esclerosis espinal sifilítica, siringohidromielia, siringomielia, lupus eritematoso sistémico, tabes dorsalis, discinesia tardía, quistes de Tarlov, enfermedad de Tay-Sachs, arteritis temporal, síndrome de la médula espinal anclada, enfermedad de Thomsen, síndrome de la abertura torácica, miopatía tirotóxica, tic doloroso, parálisis de Todd, síndrome de la Tourette, ataque isquémico transitorio, encefalopatías espongiformes transmisibles, mielitis transversa, lesión cerebral traumática, temblor, neuralgia del trigémino, paraparesis espástica tropical, esclerosis tuberosa, tumor eréctil vascular, vasculitis que incluye arteritis temporal, enfermedad de Von Ecónomo, enfermedad de Von Hippel-Lindau (VHL), enfermedad de Von Reckiinghausen, síndrome de Wallenberg, enfermedad de Werdnig-Hoffman, síndrome de Wernicke-Korsakoff, síndrome de West, enfermedad de Whipple, síndrome de Williams, enfermedad de Wilson, atrofia muscular espinal y bulbar ligada al cromosoma X, y síndrome de Zellweger. Con "enfermedad respiratoria" se quiere decir, cualquier enfermedad o afección que afecta al tracto respiratorio, tal como asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica o "COPD", rinitis alérgica, sinusitis, vasoconstricción pulmonar, inflamación, alergias, respiración impedida, síndrome disneico, fibrosis quística, hipertensión pulmonar, vasoconstricción pulmonar, enfisema, y cualquier otra enfermedad, afección, rasgo, genotipo o fenotipo respiratorio que pueden responder a la modulación de la expresión génica relacionada con la enfermedad en una célula o tejido, sola o combinada con otras terapias.

Con "enfermedad ocular" tal como se usa en el presente documento se quiere decir, cualquier enfermedad, afección, rasgo, genotipo o fenotipo del ojo y estructuras relacionadas tal como se conoce en la técnica, tal como edema macular quistoide, hialosis asteroide, miopía patológica y estafiloma posterior, toxocariasis (larva migrans ocular), oclusión de las venas retinianas, desprendimiento vitreo posterior, desgarros retiñíanos por tracción, membrana epirretiniana, retinopatía diabética, degeneración de la matriz, oclusión de las venas retinianas, oclusión de la arteria retiniana, degeneración macular (por ejemplo, degeneración macular relacionada con el envejecimiento tal como AMD húmeda o AMD seca), toxoplasmosis, melanoma de las coroides, retinosquisis adquirida, plaga de Hollenhorst, coriorretinopatía serosa central idiopática, orificio macular, síndrome de presunta histoplasmosis ocular, macroaneurisma retiniano, tetinitis pigmentosa, desprendimiento de retina, retinopatia hipertensa, desprendimiento del epitelio pigmentado retiniano (RPE), papiloflebitis, síndrome isquémico ocular, enfermedad de Coats, aneurisma Leber iliary, neoplasmas de la conjuntiva, conjuntivitis alérgica, conjuntivitis estacional, conjuntivitis bacteriana aguda, conjuntivitis alérgica y queratoconjuntivitis estacional, conjuntivitis vírica, conjuntivitis bacteriana, conjuntivitis por clamidia y gonococos, laceración de la conjuntiva, epiescleritis, escleritis, pingueculitis, pterigium, queratoconjuntivitis límbica superior (SLK de Theodore), conjuntivitis tóxica, conjuntivitis con pseudomembrana, conjuntivitis de las papilares gigantes, degeneración marginal de Terrien, queratitis por acanthamoeba, queratitis fúngica, queratitis filamentosa, queratitis bacteriana, queratitis seca/síndrome del ojo seco, queratitis bacteriana, queratitis por Herpes simplex, infiltraciones corneales estériles, flictenulosis, abrasión de la córnea & erosión corneana recurrente, cuerpo extraño en la cornea, quemaduras por sustancias químicas, distrofia de la membrana basal epitelial (EBMD), queratopatia por punción superficial de Thygeson, laceración corneana, degeneración nodular de Salzmann, distrofia endotelial de Fuchs, subluxación de la lente del cristalino, glaucoma de Ciliary-Block, glaucoma primario de ángulo abierto, síndrome de dispersión pigmentaria y glaucoma pigmentario, síndrome de pseudoexfoliación y glaucoma pseudoesfoliativo, uveitis anterior, glaucoma primario de ángulo abierto, glaucoma por uveitis y crisis galucomatociclítica, síndrome de dispersión pigmentaria & glaucoma pigmentario, glaucoma de cierre del ángulo agudo, uveitis anterior, hifema, glaucoma por recesión angular, glaucoma inducido lenticular, síndrome de pseudoexfoliación y glaucoma de pseudoexfoliación, síndrome de Axenfeld-Rieger, glaucoma neovascular, pars planitis, ruptura de las coroides, síndrome de retracción de Duane, neuropatía óptica tóxica/nutricional, regeneración aberrante del nervio craneal lll, lesiones de las masa intracraneales, fístula de los senos cavernosos de las caróticas, neuropatía óptica isquémica anterior, edema de los discos ópticos y papiledema, parálisis del par lll de nervios craneales, parálisis del par IV de nervios craneales, parálisis del par VI de nervios craneales, parálisis del par Vil de nervios craneales (nervio facial), síndrome de Horner, oftalmoplegia internuclear, hipoplasia craneal del nervio óptico, fosa óptica, pupila tónica, Drusen craneal del nervio óptico, neuropatía óptica desmielinante (neuritis óptica, neuritis óptica retrobulbar), amaurosis fugax y ataque isquémico transitorio, pseudotumor cerebral, adenoma de la pituitaria, molluscum contagiosum, canaliculitis, verruga y papiloma, pediculosis, ptiriasis, blefaritis, hordeolum, celulitis preséptica, chalazión, carcinoma de células básales, Herpes zoster oftálmico, pediculosis y ptiriasis, fractura abierta, epifora crónica, dacriocistitis, blefaritis por Herpes simplex, celulitis orbital, entropión senil y carcinoma de células escamosas. Con "enfermedad dermatológica" se quiere decir cualquier enfermedad o afección de la piel, dermis, o cualquiera de sus subestructuras tal como pelo, folículos, etc. Las enfermedades, trastornos, afecciones, y rasgos dermatológicos pueden incluir soriasis, dermatitis ectópica, cánceres de piel tales como melanoma y carcinoma de células básales, pérdida capilar, remoción del pelo, alteraciones de la pigmentación, y cualquier otra enfermedad, afección, o rasgo asociados a la piel, dermis, o sus estructuras. Con "enfermedad auditiva" se quiere decir cualquier enfermedad o afección del sistema auditivo, que incluye el oído, tal como el oído interno, el oído medio, el oído externo, el nervio auditivo y cualquiera de sus subestructuras. Las enfermedades, trastornos, afecciones, y rasgos auditivos pueden incluir pérdida de audición, sordera, tínitus, enfermedad de Meniere, vértigo, trastornos del equilibrio y cinéticos, y cualquier otra enfermedad, afección, o rasgo asociados al oído o a sus estructuras.

Con "enfermedad metabólica" se quiere decir cualquier enfermedad o afección que afecta a las rutas metabólicas tal como se conoce en la técnica. La enfermedad metabólica puede provocar un proceso metabólico anormal, ya sea congénito debido a una anormalidad enzimática heredada (errores metabólicos congénitos) o adquirido debido a una enfermedad de un órgano endocrino o insuficiencia de un órgano metabólicamente importante tal como el hígado. En una modalidad, la enfermedad metabólica incluye hiperlipemia, hipercolesterolemia, enfermedad cardiovascular, ateroesclerosis, hipertensión, diabetes (por ejemplo, diabetes de tipo I y/o de tipo II), resistencia a la insulina, y/u obesidad. Con "enfermedad cardiovascular" se quiere decir una enfermedad o afección que afecta al corazón y la vasculatura, que incluye pero sin limitación a, una enfermedad cardiaca coronaria (CHD), enfermedad cerebrovascular (CVD), estenosis aórtica, enfermedad vascular periférica, aterosclerosis, arteriesclerosis, infarto de miocardio (ataque al corazón), enfermedades cerebrovasculares (ictus), ataques isquémicos transitorios (TÍA), angina (estable e inestable), fibrilación del atrio, arritmia, enfermedad de las válvulas, insuficiencia cardiaca congestiva, hipercolesterolemia, hiperlipoproteinemia de tipo I, hiperlipoproteinemia de tipo II, hiperlipoproteinemia de tipo lll, hiperlipoproteinemia de tipo IV, hiperlipoproteinemia de tipo V, hipertrigliceridemia secundaria, y déficit de lecitin colesterol aciltransferasa familiar.

En una modalidad de la presente invención, cada secuencia de una molécula de siNA de la invención tiene independientemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, en modalidades específicas aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 nucleótidos de longitud. En otra modalidad, las moléculas de siNA bicatenarias de la invención independientemente comprenden de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 pares de bases (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30). En otra modalidad, una o más hebras de la molécula de siNA de la invención independientemente comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30) que son complementarios a una molécula de ácido nucleico objetivo. Todavía en otra modalidad, las moléculas de siNA de la invención que comprenden estructuras de horquilla o circulares son de aproximadamente 35 a aproximadamente 55 (por ejemplo, aproximadamente 35, 40, 45, 50 o 55) nucleótidos de longitud, o de aproximadamente 38 a aproximadamente 44 (por ejemplo, aproximadamente 38, 39, 40, 41 , 42, 43 ó 44) nucleótidos de longitud y comprenden de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24 ó 25) pares de bases. Las moléculas ejemplares de siNA de la invención se muestran en el cuadro II y/o las Figuras 3A-3F y 4A-4F.

Tal como se usa en el presente documento "célula" se usa en su sentido biológico habitual y no se refiere a un organismo multicelular completo, por ejemplo, de forma especifica no se refiere a un ser humano. Las células pueden estar presentes en un organismo, por ejemplo, pájaros, plantas y mamíferos tales como seres humanos, vacas, ovejas, simios, monos, cerdos, perros y gatos. La célula puede ser procariota (por ejemplo, célula bacteriana) o eucariota (por ejemplo, célula de mamífero o vegetal). El origen de la célula puede somático o germinal, totipontente o pluripotente, divisible o no. La célula también puede derivarse o puede comprender un gameto o embrión, una célula madre o una célula diferenciada. La célula puede ser una célula aislada, una célula purificada, o una célula sustancialmente purificada tal como se reconoce de forma general en la técnica. Las moléculas de siNA de la invención se añaden de forma directa, o pueden formar complejos con lípidos catiónicos, introducirse en liposomas, o administrarse por otros medios a las células o tejidos objetivo. El ácido nucleico o los complejos de ácido nucleico pueden administrarse de forma local a los tejidos relevantes ex vivo, o in vivo mediante la administración local al pulmón, incorporados o no a biopolímeros. En modalidades particulares, las moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden unas secuencias que se muestra en el cuadro II y/o en las Figuras 3A-3F y 4A-4F. Ejemplos de dichas moléculas de ácido nucleico consisten esencialmente en secuencias que se definen en estos cuadros y figuras. Además, las construcciones químicamente modificadas que se describen en Cuadro I y las formulaciones en nanopartículas lipídicas (LNP) que se muestran en el cuadro IV pueden aplicarse a cualquier secuencia de siNA o grupo de secuencias de siNA de la invención. En otro aspecto, la invención proporciona células de mamífero que contienen una o más moléculas de siNA de esta invención. La una o más moléculas de siNA pueden dirigirse independientemente al mismo sitio o a sitios diferentes en el interior de un polinucleótido objetivo de la invención. Con "ARN" se quiere decir una molécula que comprende al menos un resto ribonucleotídico. Con "ribonucleótido" se quiere decir un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2' de un resto ß-D-ribofuranosa. Los términos incluyen ARN bicatenario, ARN monocatenario, ARN aislado tal como ARN parcialmente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético, ARN producido de forma recombinante, así como ARN alterado que difiere del ARN natural por la adición, deleci?n, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como al (a los) extremo(s) del siNA o de forma interna, por ejemplo en uno o más nucleótidos del ARN. Los nucleótidos en de las moléculas de ARN de la presente invención también pueden comprender nucleótidos no estándar, tales como nucleótidos no naturales o nucleótidos o desoxinucleótidos sintetizados químicamente. Estos ARN alterados pueden denominarse análogos o análogos de ARN natural.

Con "sujeto" se quiere decir un organismo, que es un donante o receptor de células explantadas o las células en sí. "Sujeto" también se refiere a un organismo al que pueden administrarse las moléculas de ácido nucleico de la invención. Un sujeto puede ser un mamífero o células de mamífero, que incluye un ser humano o célula humana. En una modalidad, el sujeto es un bebé (por ejemplo, sujetos que tienen menos de 1 mes, o 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11 , o 12 meses). En una modalidad, el sujeto es un niño (por ejemplo, de 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6 años). En una modalidad, el sujeto es un anciano (por ejemplo, cualquier persona con una edad de aproximadamente 65 años). Con "modificación química" tal como se usa en el presente documento se quiere decir cualquier modificación de la estructura química de los nucleótidos que difiere de los nucleótidos de siARN o ARN nativo. El término "modificación química" engloba la adición, sustitución, o modificación de nucleósidos y nucleótidos de siARN o ARN nativos con nucleósidos y nucleótidos modificados tal como se describe en el presente documento o tal como se conoce por otros medios en la técnica. Ejemplos no limitantes de dichas modificaciones químicas incluyen sin limitación composiciones que tienen cualquiera de las Fórmulas I, II, lll, IV, V, VI, o Vil del presente documento, enlaces internucleotídicos de fosfotioato, 2'-desoxirribonucleótidos, 2'-O-metil ribonucleótidos, 2'-desoxi-2'-fluoro ribonucleótidos, 4'-tio ribonucleótidos, nucleótidos de 2'-O-trifluorometilo, nucleótidos de 2'-O-etil-trifluorometoxi, nucleótidos de 2'-O-difluorometoxi-etoxi (véase por ejemplo documento USSN 10/981 ,966 presentado el 5 de noviembre de 2004, que se incorpora por referencia al presente documento), FANA, nucleótidos "base universal", nucleótidos "acíclicos", nucleótidos de 5-C-metilo, incorporación de glicerilo terminal y/o restos desoxiabásicos invertidos, o una modificación que tiene cualquiera de las Fórmulas l-VII del presente documento. En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención (por ejemplo, dsARN, siNA etc.) están parcialmente modificadas (por ejemplo, modificadas aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95%) con modificaciones químicas. En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención (por ejemplo, dsARN, siNA etc.) están completamente modificadas (por ejemplo, modificadas en aproximadamente 100%) con modificaciones químicas. El término "fosforotioato" tal como se usa en el presente documento se refiere a un enlace internucleotídico que tiene la Fórmula I, en la que Z y/o W comprenden un átomo de azufre. Por lo tanto, el término fosforotioato se refiere a enlaces internucleotídicos tanto de fosforotioato como de fosforoditioato. El término "fosfonoacetato" tal como se usa en el presente documento se refiere a un enlace internucleotídico que tiene la Fórmula I, en la que Z y/o W comprenden un grupo acetilo o acetilo protegido. El término "tiofosfonoacetato" tal como se usa en el presente documento se refiere a un enlace internucleotídico que tiene la Fórmula I, en la que Z comprende un acetilo o grupo acetilo protegido y W comprende un átomo de azufre o de forma alternativa W comprende un acetilo o grupo acetilo protegido y Z comprende un átomo de azufre. El término "base universal" tal como se usa en el presente documento se refiere a análogos de bases nucleotídicas que forman pares de bases con cada una de las bases de ADN/ARN naturales con poca discriminación entre ellas. Ejemplos no limitantes de bases universales incluyen C-fenilo, C-naftilo y otros derivados aromáticos, inosina, carboxamidas de azol, y derivados de nitroazol tales como 3-nitropirrol, 4-nitroindol, 5-nitroindol, y 6-nitroindol tal como es conocido en la técnica (véase por ejemplo Loakes, 2001 , Nucleic Acid Research, 29, 2437-2447). El término "nucleótido aciche" tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier nucleótido que tiene un azúcar ribosa acíclica, por ejemplo donde cualquiera de los carbonos de ribosa (C1 , C2, C3, C4, o C5), están independientemente o de forma combinada ausentes del nucleótido. Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, individualmente, o combinadas o junto con otros fármacos, pueden usarse para prevenir o tratar enfermedades, trastornos, afecciones, y rasgos que se describen en el presente documento o conocidos por otros medios en la técnica, en un sujeto u organismo. En una modalidad, las moléculas de siNA de la invención pueden administrarse a un sujeto o pueden administrarse a otras células apropiadas evidentes para los expertos en la técnica, de forma individual o combinadas con uno o más fármacos en condiciones adecuadas para el tratamiento. En una modalidad adicional, las moléculas de siNA pueden usarse combinadas con otros tratamientos conocidos para prevenir o tratar enfermedades, trastornos, o afecciones en un sujeto u organismo. Por ejemplo, las moléculas que se describen podrían usarse combinadas con uno o más compuestos, tratamientos, o procedimientos conocidos para prevenir o tratar enfermedades, trastornos, afecciones, y rasgos que se describen en el presente documento en un sujeto u organismo como se conoce en la técnica. En una modalidad, la invención presenta un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una molécula de siNA de la invención, de un modo que permite la expresión de la molécula de siNA. Por ejemplo, el vector puede contener secuencia(s) que codifican ambas hebras de una molécula de siNA que comprende una molécula bicatenaria. El vector también puede contener secuencia(s) que codifican una única molécula de ácido nucleico que es autocomplementaria y así forma una molécula de siNA. Ejemplos no limitantes de dichos vectores de expresión se describen en Paul y cois., 2002, Nature Biotechnology, 19, 505; Miyagishi y Taira, 2002, Nature Biotechnology, 19, 497; Lee y cois., 2002, Nature Biotechnology, 19, 500; y Novina y cois., 2002, Nature Medicine, publicación oniine doi:10.1038/nm725.

En otra modalidad, la invención presenta una célula de mamífero, por ejemplo, célula humana, que incluye un vector de expresión de la invención. Todavía en otra modalidad, el vector de expresión de la invención comprende una secuencia para una molécula de siNA que tiene complementariedad con una molécula de ARN a las que se hace referencia por el nJ de acceso de GenBank, por ejemplo los nJ de acceso de GenBank que se describen en el presente documento o en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/363,124, documentos USSN 10/923,536 y/o PCT/US03/05028. En una modalidad, un vector de expresión de la invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica dos o más moléculas de siNA, que pueden ser iguales o diferentes. En otro aspecto de la invención, las moléculas de siNA que interactúan con moléculas de ARN objetivo y regulan por disminución el gen que codifica las moléculas de ARN objetivo (por ejemplo moléculas de ARN objetivo a las que se hace referencia por el nJ de acceso de GenBank en el presente documento) se expresan a partir de unidades de transcripción insertadas en vectores de ADN o ARN. Los vectores recombinantes pueden ser plásmidos o vectores víricos de ADN. Los vectores víricos que expresan siNA pueden construirse basándose, pero sin limitación, en virus adenoasociados, retrovirus, adenovirus, o alfavirus. Los vectores recombinantes con capacidad de expresar las moléculas de siNA pueden administrarse tal como se describe en el presente documento, y persistir en células objetivo. De forma alternativa, pueden usarse vectores víricos que proporcionan la expresión transitoria de las moléculas de siNA. Dichos vectores puede administrarse de forma repetida si fuera necesario. Una vez expresadas, las moléculas de siNA se unen y regulan por disminución la función o expresión génicas mediante interferencia del ARN (ARNi). La administración de vectores que expresan siNA puede ser sistémica, tal como mediante administración intravenosa o intramuscular, mediante administración a células objetivo explantadas de un sujeto seguido de reintroducción en el sujeto, o mediante cualquier otro medio que podría permitir su introducción en las células objetivo deseadas. Con "vectores" se quiere decir cualquier ácido nucleico y/o técnica basada en virus que se usa para administrar un ácido nucleico deseado. Otras características y ventajas de la invención serán obvias a partir de la siguiente descripción de las modalidades preferidas de la misma y a partir de las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra un espectro de masas por MALDI-TOF de una molécula bicatenaria de siNA purificada sintetizada mediante un procedimiento de la invención. Los dos picos que se muestran corresponden a la masa prevista de las hebras separadas de la secuencia de siNA. Este resultado demuestra que la molécula bicatenaria de siNA generada a partir de la síntesis en tándem puede purificarse como una única entidad usando una metodología simple de purificación sobre tritilo. La Figura 2 muestra una representación mecanística propuesta no limitante de la degradación del ARN objetivo implicada en la ARNi. El ARN bicatenario (dsARN), que se genera mediante ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP) del ARN monocatenario exógeno, por ejemplo ARN vírico, de transposones o exógeno, activa la enzima DICER (Plasterk, 2002, Science, 296, 1263-1265) que a su vez genera moléculas de siNA bicatenarias. De forma alternativa, puede introducirse siNA sintético o expresado de forma directa en una célula por medios apropiados. Se forma un complejo de siNA activo que reconoce un ARN objetivo, provocando la degradación del ARN objetivo por el complejo de endonucleasa y RISC o en la síntesis de ARN adicional mediante la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP), que puede activar DICER y producir moléculas adicionales de siNA, amplificando así la respuesta de ARNi. Las figuras 3A-3F muestran ejemplos no limitantes de construcciones de siNA modificadas químicamente de la presente invención. En la figura, N representa cualquier nucleótido (adenosina, guanosina, citosina, uridina, u opcionalmente timina, por ejemplo la timina puede sustituirse en las regiones de colgadura que se marcan mediante paréntesis (N N). Se muestran diversas modificaciones para las hebras codificante y no codificante de las construcciones de siNA. Las posiciones de nucleótidos (N N) pueden modificarse químicamente tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro etc.) y pueden derivarse de una secuencia de ácido nucleico correspondiente objetivo o no (véase por ejemplo la Figura 5C). Además, las secuencias que se muestran en las figuras 3A-3F opcionalmente pueden incluir un ribonucleótido en la 9a posición desde el extremo 5' de la hebra codificante o la 11a posición basándose en el extremo 5' de la hebra guía contando 11 posiciones de nucleótidos a partir del extremo 5' de la hebra guía (véase la Figura 5C). Figura 3A: la hebra codificante comprende 21 nucleótidos en la que los dos nucleótidos del extremo 3' opcionalmente están emparejados y en la que todos los nucleótidos presentes son ribonucleótidos excepto los nucleótidos (N N), que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas descritas en el presente documento. La hebra no codificante comprende 21 nucleótidos, que opcionalmente tienen un resto glicerilo en el extremo 3' en la que los dos nucleótidos 3' del extremo son opcionalmente complementarios a la secuencia del ARN objetivo, y en la que todos los nucleótidos presentes son ribonucleótidos excepto los nucleótidos (N N), que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas descritas en el presente documento. Un enlace internucleotídico modificado, tal como un enlace fosforotioato, fosforoditioato u otro enlace internucleotídico modificado tal como se describe en el presente documento, que se designa "s", opcionalmente conecta los nucleótidos (N N) de la hebra no codificante. Figura 3B: la hebra codificante comprende 21 nucleótidos en la que los dos nucleótidos del extremo 3' están opcionalmente emparejados y en la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos de 2'desoxi-2'-fluoro modificados y todos los nucle?tidos de purina que pueden estar presentes son nucleótidos de 2'-O-metilo modificados excepto los nucleótidos (N N), que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas descritas en el presente documento. La hebra no codificante comprende 21 nucleótidos, opcionalmente tiene un resto glicerilo en el extremo 3' y en la que los dos nucleótidos del extremo 3' son opcionalmente complementarios a la secuencia del ARN objetivo, y en la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro modificados y todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son nucleótidos de 2'-O-metilo modificados excepto los nucleótidos (N N), que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas descritas en el presente documento. Un enlace internucleotídico modificado, tal como un enlace fosforotioato, fosforoditioato u otro enlace internucleotídico modificado tal como se describe en el presente documento, que se designa "s", opcionalmente conecta los nucleótidos (N N) de la hebra codificante y no codificante.

Figura 3C: la hebra codificante comprende 21 nucleótidos que tienen restos caperuza terminal en 5" y 3' en la que los dos nucleótidos del extremo 3' están opcionalmente emparejados y en la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos de 2'-O-metilo o 2'-desoxi-2'-fluoro modificados excepto los nucleótidos (N N), que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas descritas en el presente documento. La hebra no codificante comprende 21 nucleótidos, opcionalmente tiene un resto glicerilo en el extremo 3' y en la que los dos nucleótidos del extremo 3' son opcionalmente complementarios a la secuencia del ARN objetivo, y en la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro modificados excepto los nucleótidos (N N), que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas descritas en el presente documento. Un enlace internucleotídico modificado, tal como un enlace fosforotioato, fosforoditioato u otro enlace internucleotídico modificado tal como se describe en el presente documento, que se designa "s", opcionalmente conecta los nucleótidos (N N) de la hebra no codificante. Figura 3D: la hebra codificante comprende 21 nucleótidos que tienen restos caperuza terminal en 5' y 3' en la que los dos nucleótidos del extremo 3' están opcionalmente emparejados y en la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro modificados excepto los nucleótidos (N N), que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas descritas en el presente documento y en la que y todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son nucleótidos de 2'-desoxi. La hebra no codificante comprende 21 nucleótidos, opcionalmente tiene un resto glicerilo en el extremo 3' y en la que los dos nucleótidos del extremo 3' son opcionalmente complementarios a la secuencia del ARN objetivo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro modificados y todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son nucleótidos de 2'-O-metilo modificados excepto los nucleótidos (N N), que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas descritas en el presente documento. Un enlace internucleotídico modificado, tal como un enlace fosforotioato, fosforoditioato u otro enlace internucleotídico modificado tal como se describe en el presente documento, que se designa "s", opcionalmente conecta los nucleótidos (N N) de la hebra no codificante. Figura 3E: la hebra codificante comprende 21 nucleótidos que tienen restos caperuza terminal en 5' y 3' en la que los dos nucleótidos del extremo 3' están opcionalmente emparejados y en la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro modificados excepto los nucleótidos (N N), que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas descritas en el presente documento. La hebra no codificante comprende 21 nucleótidos, opcionalmente tiene un resto glicerilo en el extremo 3' y en la que los dos nucleótidos del extremo 3' son opcionalmente complementarios a la secuencia del ARN objetivo, y en la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro modificados y todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son nucleótidos de 2'-O-metilo modificados excepto los nucleótidos (N N), que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas descritas en el presente documento. Un enlace internucleotídico modificado, tal como un enlace fosforotioato, fosforoditioato u otro enlace internucleotídico modificado tal como se describe en el presente documento, que se designa "s", opcionalmente conecta los nucleótidos (N N) de la hebra no codificante. Figura 3F: la hebra codificante comprende 21 nucleótidos que tienen restos caperuza terminal en 5' y 3' en la que los dos nucleótidos del extremo 3' están opcionalmente emparejados y en la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro modificados excepto los nucleótidos (N N), que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas descritas en el presente documento y en la que y todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son nucleótidos de 2'-desoxi. La hebra no codificante comprende 21 nucleótidos, opcionalmente tiene un resto glicerilo en el extremo 3' y en la que los dos nucleótidos del extremo 3' son opcionalmente complementarios a la secuencia del ARN objetivo, y que tiene un enlace internucleotídico de fosforotioato en el extremo 3' y en la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro modificados y todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son nucleótidos de 2'-desoxi excepto los nucleótidos (N N), que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas descritas en el presente documento. Un enlace internucleotídico modificado, tal como un enlace fosforotioato, fosforoditioato u otro enlace internucleotidico modificado tal como se describe en el presente documento, que se designa "s", opcionalmente conecta los nucleótidos (N N) de la hebra no codificante. La hebra no codificante de construcciones A-F comprende una secuencia complementaria a cualquier secuencia de ácido nucleico objetivo de la invención. Además, cuando hay un resto glicerilo (L) en el extremo 3' de la hebra no codificante para cualquier construcción que se muestra en las Figuras 3A-3F, el enlace internucleotídico modificado es opcional. Las Figuras 4A-4F muestran ejemplos no limitantes de secuencias de siNA modificadas químicamente específicas de la invención. A-F aplica las modificaciones químicas que se describen en las figuras 3A-3F a una secuencia de siNA ejemplar. Dichas modificaciones químicas pueden aplicarse a cualquier secuencia de siNA para cualquier objetivo. Además, las secuencias que se muestran en la Figura 5 opcionalmente pueden incluir un ribonucleótido en la 9a posición desde el extremo 5' de la hebra codificante o la 11a posición basándose en el extremo 5' de la hebra guía contando 11 posiciones de nucleótidos a partir del extremo 5' de la hebra guía (véase la Figura 5C). Además, las secuencias que se muestran en las Figuras 4A-4F opcionalmente pueden incluir ribonucleótidos terminales hasta aproximadamente 4 posiciones en el extremo 5' de la hebra no codificante (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3 ó 4 ribonucleótidos terminales en el extremo 5' de la hebra no codificante). Las Figuras 5A-5C muestran ejemplos no limitantes de diferentes construcciones de siNA de la invención. Los ejemplos que se muestran en la Figura 5A (construcciones 1 , 2, y 3) tienen 19 pares de bases representativos; sin embargo, las diferentes modalidades de la invención incluyen cualquier número de pares de bases que se describe en el presente documento. Las regiones entre corchetes representan colgaduras nucleotídicas, por ejemplo, que comprenden aproximadamente 1 , 2, 3 ó 4 nucleótidos de longitud, preferiblemente aproximadamente 2 nucleótidos. Las construcciones 1 y 2 pueden usarse independientemente para obtener actividad de ARNi. La construcción 2 puede comprender un enlace polinucleotídico o no polinucleotídico, que opcionalmente puede diseñarse como un enlazador biodegradable. En una modalidad, la estructura de bucle que se muestra en la construcción 2 puede comprender un enlazador biodegradable que produce la formación de la construcción 1 in vivo y/o in vitro. En otro ejemplo, puede usarse la construcción 3 para generar la construcción 2 bajo el mismo principio en el que un enlazador se usa para generar la construcción activa de siNA 2 in vivo y/o in vitro, que opcionalmente puede utilizar otro enlazador biodegradable para generar la construcción activa de siNA 1 in vivo y/o in vitro. Así, la estabilidad y/o actividad de las construcciones de siNA puede modularse basándose en el diseño de la construcción de siNA para usar in vivo o in vitro lo in vitro. Los ejemplos que se muestran en la Figura 5B representan diferentes variaciones de molécula bicatenaria de ácido nucleico de la invención, tal como microARN, que pueden incluir colgaduras, protuberancias, bucles, y tallos con bucles provocados por una complementariedad parcial. Dichos motivos que tienen protuberancias, bucles, y tallos con bucles son generalmente característicos del miARN. Las protuberancias, bucles, y tallos con bucles pueden producirse por cualquier grado de complementariedad parcial, tal como emparejamientos erróneos o protuberancias de aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más nucleótidos en una o ambas hebras de la molécula bicatenaria de ácido nucleico de la invención. El ejemplo que se muestra en la Figura 5C representa una molécula bicatenaria de ácido nucleico modelo de la invención que comprende una molécula bicatenaria de 19 pares de bases de dos secuencias de 21 nucleótidos que tienen colgaduras de dinucleótidos en 3'. La hebra superior (1) representa la hebra codificante (hebra pasajera), la hebra media (2) representa la no codificante (hebra guía), y la hebra inferior (3) representa una secuencia objetivo de polinucleótidos. Las colgaduras de dinucleótidos (NN) pueden comprender secuencias derivadas del polinucleótido objetivo. Por ejemplo, la secuencia 3'-(NN) en la hebra guía puede ser complementaria a la secuencia 5'-[NN] de un polinucleótido objetivo. Además, la secuencia 5'-(NN) de la hebra pasajera puede comprender la misma secuencia que la secuencia 5'-[NN] de la secuencia de polinucleótidos objetivo. En otras modalidades, la colgaduras (NN) no se derivan de la secuencia de polinucleótidos objetivo, por ejemplo donde la secuencia 3'-(NN) en la hebra guía no es complementaria a la secuencia 5'-[NN] del polinucleótido objetivo y la secuencia 5'-(NN) de la hebra pasajera puede comprender una secuencia diferente de la secuencia 5'-[NN] de la secuencia de polinucleótidos objetivo. En modalidades adicionales, cualesquiera nucleótidos (NN) están químicamente modificados, por ejemplo, con modificaciones 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, y/u otras en el presente documento. Además, la hebra pasajera puede comprender un posición ribonucleotídica N de la hebra pasajera. Para la molécula bicatenaria 21 mera de 19 pares de bases representativa que se muestra, la posición N puede tener 9 nucleótidos desde el extremo 3' de la hebra pasajera. Sin embargo, en las moléculas bicatenarias de diferente longitud, se determina la posición N basándose en el extremo 5' de la hebra guía contando 11 posiciones de nucleótidos desde el extremo 5' de la hebra guía y escogiendo el nucleótido emparejado correspondiente de la hebra pasajera. La escisión mediante Ago2 se produce entre las posiciones 10 y 11 tal como indica la flecha. En modalidades adicionales, hay dos ribonucleótidos, NN, en las posiciones 10 y 11 basándose en el extremo 5' de la hebra guía contando 10 y 11 posiciones de nucleótidos desde el extremo 5' de la hebra guía y escogiendo los nucleótidos emperejados correspondientes de la hebra pasajera. En esta figura, la hebra guía es complementaria a la secuencia objetivo y la hebra pasajera es complementaria a la hebra guía. Los nucleótidos emparejados (NN) en la hebra guía pueden ser complementarios a los nucleótidos [NN] en la secuencia objetivo. Los nucleótidos emparejados (NN) en la hebra pasajera pueden comprender nucleótidos [NN] en la secuencia objetivo. La posición N de la hebra pasajera puede comprender un ribonucleótido. Para el doble 21 del par de base 19 representativo, la posición N son 9 nucleótidos en forma del extremo 3' de la hebra pasajera. Sin embargo, en los dobles que tienen diferente longitud, la posición N se determina basándose en el extremo 5' de la hebra guía contando 11 posiciones de nucleótido en forma del término 5' de la hebra guia y recogiendo el nucleótido vareado de base correspondiente en la hebra pasajera. La escisión por Ago2 se lleva a cabo entre las posiciones 10 y 11 como lo indica la flecha. Se muestran los colgantes de nucleótido 2 representativos, pero pueden variar, por ejemplo, de 0 a aproximadamente 4 nucleótidos. B= tapa terminal que puede estar presente o ausente. Este motivo generalizado se puede aplicar a todas las químicas Stab 00-34 en la presente.

Las Figuras 6A-6C es una representación diagramática de un esquema que se utiliza para generar un cásete de expresión para generar construcciones de siNA en horquilla. Figura 6A: Se sintetiza un oligómero de ADN con una secuencia con un sitio de restricción en 5' (R1) seguido de una región que tiene una secuencia idéntica (región codificante de siNA) a una secuencia objetivo predeterminada, en el que la región codificante comprende, por ejemplo, aproximadamente 19, 20, 21 ó 22 nucleótidos (N) de longitud, seguido de una secuencia en bucle de secuencia definida (X), que comprende, por ejemplo, de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 nucleótidos. Figura 6B: La construcción sintética se extiende entonces mediante ADN polimerasa generando una estructura de horquilla que tiene una secuencia autocomplementaria que producirá un transcrito de siNA que tiene especificidad por una secuencia objetivo y que tiene regiones codificantes y no codificantes autocomplementarias. Figura 6C: La construcción se calienta (por ejemplo a aproximadamente 95 °C) para linearizar la secuencia, permitiendo así la extensión de una segunda hebra de ADN complementaria usando un cebador para la secuencia de restricción 3' de la primera hebra. Entonces se inserta el ADN bicatenario en un vector apropiado para su expresión en células. La construcción puede diseñarse de tal forma que se produzca una colgadura nucleotídica en el extremo 3' de la transcripción, por ejemplo, diseñando sitios de restricción y/o utilizando una región de poli-U caperuza tal como se describe en Paul y cois., 2002, Nature Biotechnology, 29, 505-508. Las Figura 7A-7C son una representación diagramática de un esquema que se utiliza para generar un cásete de expresión para generar construcciones de siNA bicatenarias. Figura 7A: Se sintetiza un oligómero de ADN con una secuencia con un sitio de restricción en 5' (R1) seguido de una región que tiene una secuencia idéntica (región codificante de siNA) a una secuencia objetivo predeterminada, en el que la región codificante comprende, por ejemplo, aproximadamente 19, 20, 21 ó 22 nucleótidos (N) de longitud, seguido de un sitio de restricción en 3' (R2) que está adyacente a una secuencia en bucle de secuencia definida (X). Figura 7B: La construcción sintética se extiende entonces mediante la ADN polimerasa generando una estructura de horquilla que tiene una secuencia autocomplementaria. Figura 7C: La construcción se procesa mediante enzimas de restricción específicas para R1 y R2 generando un ADN bicatenario que se inserta después en un vector apropiado para su expresión en células. El cásete de transcripción se diseña de tal forma que una región promotora U6 flanquea cada lado del dsADN que genera las hebras codificante y no codificante separadas del siNA. Pueden añadirse secuencias de terminación en poli T para generar colgaduras en U en el transcrito resultante.

Las Figuras 8A-8E son una representación diagramática de un procedimiento que se usa para determinar los sitios objetivo para la ARNi mediada por U en una secuencia de ácido nucleico objetivo particular, tal como ARN mensajero. Figura 8A: se sintetiza un conjunto de oligonucleótidos de siNA en el que la región no codificante de las construcciones de siNA tiene complementariedad con sitios objetivo a lo largo de la secuencia de ácido nucleico objetivo, y en la que la región codificante comprende la secuencia complementaria a la región no codificante del siNA. Figura 8B&C: (Figura 8B) las secuencias se juntan y se insertan en vectores de tal forma que (Figura 8C) la transfección de un vector a las células produce la expresión del siNA. Figura 8D: las células se separan basándose en el cambio fenotípico que se asocia a la modulación de la secuencia de ácido nucleico objetivo. Figura 8E: se aisla el siNA de las células separadas y se secuencia para identificar sitios objetivo eficaces en la secuencia de ácido nucleico objetivo. La Figura 9 muestra un ejemplo no limitante de una estrategia que se usa para identificar construcciones de siNA quimicamente modificadas de la invención que son resistentes a nucleasa a la vez que mantienen la capacidad de mediar la actividad de ARNi. Las modificaciones químicas se introducen en la construcción de siNA basándose en parámetros de diseño fundamentados (por ejemplo introducción de modificaciones en 2', modificaciones de bases, modificaciones de la base, modificaciones en la caperuza terminal, etc.). La construcción modificada se analiza en un sistema apropiado (por ejemplo suero humano para determinar la resistencia a nucleasas, que se muestra, o un modelo animal para determinar los parámetros de PK administración). En paralelo, se analiza la construcción de siNA para determinar la actividad de ARNi, por ejemplo en un sistema de cultivo celular tal como un ensayo con testigo de luciferasa). Entonces se identifican las construcciones de siNA que poseen una característica particular a la vez que mantienen la actividad de ARNi, y puede modificarse y ensayarse de nuevo. Esta misma estrategia puede usarse para identificar molécula conjugadas con siNA con perfiles farmacocinéticos, administración, y actividad de ARNi mejorados. La Figura 10 muestra ejemplos no limitantes de moléculas de siNA fosforiladas de la invención, que incluyen construcciones lineales y de molécula bicatenaria y sus derivados asimétricos. La Figura 11A muestra un ejemplo no limitante de metodología que se usa para diseñar construcciones de DFO autocomplementarias utilizando palíndromo y/o secuencias de ácido nucleico repetidas que se identifican en una secuencia de ácido nucleico objetivo, (i) Se identifica un palíndromo o secuencia repetida en una secuencia de ácido nucleico objetivo en el extremo 5' (ej. con una longitud de 14 a 24 nucleótidos) (porción punteada), (ii) Se diseña una secuencia que es complementaria a la secuencia de ácido nucleico objetivo y a la secuencia palíndromo anterior de (i), (iii) Se le anexa una secuencia repetida inversa de la porción no palindrómica/repetida de la secuencia complementaria de (ii) al extremo 3' de la secuencia complementaria para generar una molécula de DFO autocomplementaria que comprende la secuencia complementaria al ácido nucleico objetivo, (iv) La molécula de DFO puede autoensamblarse formando un oligonucleótido bicatenario. Se autoensamblan las hebras complementarias para formar una construcción doble. La Figura 11 B muestra un ejemplo representativo no limitante de una secuencia de oligonucleótidos que forma molécula bicatenaria (i) Identificar la secuencia de ácido nucleico objetivo (ej., con una longitud de 14 a 24 nucleótidos) que contiene la secuencia palindrómica/repetida en el extremo 5' (porción punteada), (ii) Diseñar una secuencia complementaria a la secuencia de ácido nucleico objetivo anterior de (i), (¡ii) Agregar una secuencia inversa de la secuencia complementaria no palindrómica de (ii) al extremo 3' de la secuencia complementeria. (iv) Autoensamble de hebras auto complementarias para formar una construcción doble (extremos truncos). La Figura 11C muestra un ejemplo no limitante del esquema de autoensamblado de una molécula bicatenaria representativa que forma una secuencia de oligonucleótidos. La Figura 11 D muestra un ejemplo no limitante del esquema de autoensamblado de una molécula bicatenaria representativa que forma una secuencia de oligonucleótidos seguido de la interacción con una secuencia de ácido nucleico objetivo que produce la modulación de expresión génica.

La Figura 12 muestra un ejemplo no limitante del diseño de construcciones de DFO autocomplementarias utilizando palíndromo y/o secuencias de ácido nucleico repetidas que se incorporan en las construcciones DFO que tienen una secuencia complementaria a cualquier secuencia de ácido nucleico objetivo de interés. La incorporación de estos palíndromos/secuencias repetidas permite diseñar las construcciones de DFO que forman moléculas bicatenarias en las que cada hebra tiene capacidad de mediar en la modulación de la expresión del gen objetivo, por ejemplo por ARNi. Por lo tanto, esta figura presenta lo siguiente: Identificación de la secuencia de ácido nucleico objetivo (ej. longitud de 14 a 24 oligonucleótidos). Diseño de la secuencia complementaria y utilización de los nucleótidos modificados (mostrados como X, Y) que interactúan con una porción de la secuencia objetivo y dan como resultado la formación de una secuencia palindrómica/repetida (ej. de 2 a 12 nucleótidos) en el extremo 3' (porción punteada). Agregación de la secuencia inversa de la región complementeria en el extremo 3' de la secuencia palindrómica/repetida. Hibridación de hebras auto complementarias para formar una construcción de siNA doble. Primero, se identifica la secuencia objetivo. Después se genera una secuencia complementaria en la que se introducen modificaciones nucleotídicas o no nucleotídicas (que se designan X o Y) en la secuencia complementaria que genera un palíndromo artificial (que se designa XYXYXY en la Figura). Se le anexa una secuencia repetida inversa de la porción no palindrómica/repetida de la secuencia complementaria al extremo 3' de la secuencia complementaria para generar un DFO autocomplementario que comprende la secuencia complementaria al ácido nucleico objetivo. El DFO puede autoensamblarse formando un oligonucleótido bicatenario. Las Figuras 13A y 13B muestran ejemplos no limitantes de moléculas de siNA multifuncionales de la invención que comprenden dos secuencias de polinucleótidos separadas que cada una tiene capacidad de mediar la escisión dirigida por ARNi de distintas secuencias de ácido nucleico objetivo. La Figura 13A muestra un ejemplo no limitante de una molécula de siNA multifuncional que tiene una primera región que es complementaria a una primera secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 1) y una segunda región que es complementaria a una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 2), en la que la primera y segunda regiones complementarias están situadas en los extremos 3' de cada secuencia de polinucleótidos en el siNA multifuncional. Las porciones con línea discontinua de cada secuencia de polinucleótidos de la construcción de siNA multifuncional tienen complementariedad con respecto a porciones correspondientes de la molécula bicatenaria de siNA, pero no tienen complementariedad con las secuencias de ácido nucleico objetivo. La Figura 13B muestra un ejemplo no limitante de una molécula de siNA multifuncíonal que tiene una primera región que es complementaria a una primera secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 1) y una segunda región que es complementaria a una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 2), en la que la primera y segunda regiones complementarias están situadas en los extremos 5' de cada secuencia de polinucleótidos en el siNA multifuncional. Las porciones con línea discontinua de cada secuencia de polinucleótidos de la construcción de siNA multifuncional tienen complementariedad con respecto a porciones correspondientes de la molécula bicatenaria de siNA, pero no tienen complementariedad con las secuencias de ácido nucleico objetivo. Las Figuras 14A y 14B muestra ejemplos no limitantes de moléculas de siNA multifuncionales de la invención que comprenden una única secuencia de polinucleótidos con diferentes regiones cada una de las cuales tiene capacidad de mediar la escisión dirigida por ARNi de diferentes secuencias de ácido nucleico objetivo. La Figura 14A muestra un ejemplo no limitante de una molécula de siNA multifuncional que tiene una primera región que es complementaria a una primera secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 1) y una segunda región que es complementaria a una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 2), en la que la segunda región complementaria está situada en el extremo 3' de cada secuencia de polinucleótidos en el siNA multifuncional. Las porciones con línea discontinua de cada secuencia de polinucleótidos de la construcción de siNA multifuncional tienen complementariedad con respecto a porciones correspondientes de la molécula bicatenaria de siNA, pero no tienen complementariedad con las secuencias de ácido nucleico objetivo. La Figura 14B muestra un ejemplo no limitante de una molécula de siNA multifuncional que tiene una primera región que es complementaria a una primera secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 1) y una segunda región que es complementaria a una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 2), en la que la primera región complementaria está situada en el extremo 5' de cada secuencia de polinucleótidos en el siNA multifuncional. Las porciones con línea discontinua de cada secuencia de polinucleótidos de la construcción de siNA multifuncional tienen complementariedad con respecto a porciones correspondientes de la molécula bicatenaria de siNA, pero no tienen complementariedad con las secuencias de ácido nucleico objetivo. En una modalidad, estas construcciones de siNA multifuncionales se procesan in vivo o in vitro para generar construcciones de siNA multifuncionales como se muestra en las Figuras 13A y 13B. Las Figuras 15A y 15B muestran ejemplos no limitantes de moléculas de siNA multifuncionales de la invención que comprenden dos secuencias de polinucleótidos diferentes que tienen cada una capacidad de mediar la escisión dirigida por ARNi de diferentes secuencias de ácido nucleico objetivo y en la que la construcción de siNA multifuncional comprende además una región autocomplementaria, palíndromo, o repetida, permitiendo así construcciones de siNA bifuncionales más cortas que pueden actuar de mediadoras de la interferencia del ARN contra diferentes secuencias de ácido nucleico objetivo. La Figura 15A muestra un ejemplo no limitante de una molécula de siNA multifuncional que tiene una primera región que es complementaria a una primera secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 1) y una segunda región que es complementaria a una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 2), en la que la primera y segunda regiones complementarias están situadas en los extremos 3" de cada secuencia de polinucleótidos del siNA multifuncional, y en la que la primera y segunda regiones complementarias comprenden además una región autocomplementaria, palíndromo, o repetida. Las porciones con línea discontinua de cada secuencia de polinucleótidos de la construcción de siNA multifuncional tienen complementariedad con respecto a porciones correspondientes de la molécula bicatenaria de siNA, pero no tienen complementariedad con las secuencias de ácido nucleico objetivo. La Figura 15B muestra un ejemplo no limitante de una molécula de siNA multifuncional que tiene una primera región que es complementaria a una primera secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 1) y una segunda región que es complementaria a una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 2), en la que la primera y segunda regiones complementarias están situadas en los extremos 5' de cada secuencia de polinucleótidos en el siNA multifuncional, y en la que la primera y segunda regiones complementarias comprenden además una región autocomplementaria, palíndromo, o repetida. Las porciones con línea discontinua de cada secuencia de polinucleótidos de la construcción de siNA multifuncional tienen complementariedad con respecto a porciones correspondientes de la molécula bicatenaria de siNA, pero no tienen complementariedad con las secuencias de ácido nucleico objetivo.

Las Figuras 16B y 16B muestra ejemplos no limitantes de moléculas de siNA multifuncionales de la invención que comprenden una única secuencia de polinucleótidos que comprende regiones diferentes que tienen cada una capacidad de mediar la escisión dirigida por ARNi de diferentes secuencias de ácido nucleico objetivo y en la que la construcción de siNA multifuncional comprende además una región autocomplementaria, palíndromo, o repetida, permitiendo así construcciones de siNA bifuncionales más cortas que pueden actuar de mediadoras de la interferencia del ARN contra diferentes secuencias de ácido nucleico objetivo. La Figura 16A muestra un ejemplo no limitante de una molécula de siNA multifuncional que tiene una primera región que es complementaria a una primera secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 1) y una segunda región que es complementaria a una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 2), en la que la primera región complementaria está situada en el extremo 3' de cada secuencia de polinucleótidos en el siNA multifuncional, y en la que las regiones complementarias primera y segunda comprenden además una región autocomplementaria, palíndromo, o repetida. Las porciones con linea discontinua de cada secuencia de polinucleótidos de la construcción de siNA multifuncional tienen complementariedad con respecto a porciones correspondientes de la molécula bicatenaria de siNA, pero no tienen complementariedad con las secuencias de ácido nucleico objetivo. La Figura 16B muestra un ejemplo no limitante de una molécula de siNA multifuncional que tiene una primera región que es complementaria a una primera secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 1) y una segunda región que es complementaria a una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 2), en la que la segunda región complementaria está situada en el extremo 5' de cada secuencia de polinucleótidos en el siNA multifuncional, y en la que las regiones complementarias primera y segunda comprenden además una región autocomplementaria, palíndromo, o repetida. Las porciones con linea discontinua de cada secuencia de polinucleótidos de la construcción de siNA multifuncional tienen complementariedad con respecto a porciones correspondientes de la molécula bicatenaria de siNA, pero no tienen complementariedad con las secuencias de ácido nucleico objetivo. En una modalidad, estas construcciones de siNA multifuncionales se procesan in vivo o in vitro para generar construcciones de siNA multifuncionales como se muestra en las Figuras 15A y 15B. La Figura 17 muestra un ejemplo no limitante de cómo las moléculas de siNA multifuncionales de la invención pueden dirigirse contra dos moléculas de ácido nucleico objetivo distintas, tales como distintas moléculas de ARN que codifican diferentes proteínas (por ejemplo, cualquiera de las objetivos del presente documento), por ejemplo, una citocina y su receptor correspondiente, diferentes cepas víricas, un virus y una proteína implicados en la infección o replicación víricas, o diferentes proteínas implicadas en una ruta biológica común o divergente que está implicada en el mantenimiento o progresión de la enfermedad. Cada hebra de la construcción de siNA multifuncional comprende una región que tiene complementariedad con distintas moléculas de ácido nucleico objetivo. La molécula de siNA multifuncional se diseña de tal forma que cada hebra del siNA puede ser utilizada por el complejo RISC para iniciar la escisión mediada por la interferencia del ARN de su objetivo correspondiente. Estos parámetros del diseño pueden incluir desestabilización de cada extremo de la construcción de siNA (véase por ejemplo Schwarz y cois, de 2003, Cell, 115, 199-208). Dicha desestabilización puede lograrse por ejemplo usando pares de bases de guanosina-citidina, pares de bases alternos (por ejemplo, titubeos), o nucleótidos químicamente modificados desestabilizantes en posiciones de nucleótidos terminales tal como se conoce en la técnica. La Figura 18 muestra un ejemplo no limitante de cómo las moléculas de siNA multifuncionales de la invención pueden dirigirse contra dos secuencias diferentes de ácido nucleico objetivo en la misma molécula de ácido nucleico objetivo, tal como regiones codificantes alternas de un ARN, regiones codificantes y no codificantes de un ARN, o regiones de variante de ayuste alternas de un ARN. Cada hebra de la construcción de siNA multifuncional comprende una región que tiene complementariedad con las distintas regiones de la molécula de ácido nucleico objetivo. La molécula de siNA multifuncional se diseña de tal forma que cada hebra del siNA puede ser utilizada por el complejo RISC para iniciar la escisión mediada por la interferencia del ARN de su región objetivo correspondiente. Estos parámetros del diseño pueden incluir desestabilización de cada extremo de la construcción de siNA (véase por ejemplo Schwarz y cois, de 2003, Cell, 115, 199-208). Dicha desestabilización puede lograrse por ejemplo usando pares de bases de guanosina-citidina, pares de bases alternos (por ejemplo, titubeos), o nucleótidos químicamente modificados desestabilizantes en posiciones de nucleótidos terminales tal como se conoce en la técnica. Las Figuras 19A-19H muestran ejemplos no limitantes de construcciones de siNA multifuncionales ancladas de la invención. En los ejemplos que se muestran, un enlazador (por ejemplo, enlace polinucleotídico o no polinucleotídico) conecta dos regiones de siNA (por ejemplo, dos regiones codificantes, dos no codificantes, o de forma alternativa una codificante y una no codificante. Se hibridan secuencias codificantes (o codificantes y no codificantes) separadas que corresponden a una primera secuencia objetivo y una segunda secuencia objetivo a su secuencias codificante y/o no codificante correspondientes en el siNA multifuncional. Además, pueden unirse diversos conjugados, ligandos, aptámeros, polímeros o moléculas testigo a la región enlazadora para una administración y/o propiedades farmacocinéticas selectivas o mejoradas. En estas figuras S = codificadora, AS = no codificadora. La región enlazadora puede ser un enlazador nucleotídico o no nucleotídico, y puede estar decorada opcionalmente, por ejemplo, con polímeros o aptámeros conjugados, como para propósitos de suministro. La Figura 20 muestra un ejemplo no limitante de diversos diseños de siNA multifuncional basados en dendrímeros.

La Figura 21 muestra un ejemplo no limitante de diversos diseños supramoleculares de siNA multifuncionales. La Figura 22 muestra un ejemplo no limitante de un diseño multifuncional de siNA posibilitado por Dicer usando una construcción precursora de siNA de 30 nucleótidos. Una molécula bicatenaria de 30 pares de bases se escinde mediante Dicer en productos de 22 y 8 pares de bases desde cada extremo (los fragmentos de 8 pb no se muestran). Para una presentación más fácil las colgaduras que se generan mediante Dicer no se muestran - pero pueden compensarse. Se muestran tres secuencias dirigidas. La identidad de la secuencia requerida superpuesta se indica mediante cajas grises. Las N del siNA progenitor de 30 pb son los sitios que se sugieren para las posiciones de 2'-OH para permitir la escisión por Dicer si se analiza en estructuras estabilizadas. Obsérvese que el procesamiento de una molécula 30mera bicatenaria mediante la RNasa lll Dicer no proporciona una escisión de 22 + 8 precisa, sino que produce una serie de productos muy similares (siendo 22 + 8 el sitio principal). Por lo tanto, el procesamiento mediante Dicer proporcionará una serie de siNA activas. La Figura 23 muestra un ejemplo no limitante de un diseño multifuncional de siNA posibilitado por Dicer usando una construcción precursora de siNA de 40 nucleótidos. Se escinde una molécula bicatenaria de 40 pares de bases mediante Dicer en productos de 22 pares de bases desde cada extremo. Para una presentación más fácil las colgaduras que se generan mediante Dicer no se muestran - pero pueden compensarse. Se muestran cuatro secuencias dirigidas. Las secuencias objetivo que presentan homología se incluyen en recuadros. El formato del diseño puede extenderse a ARN más grandes. Si los siNA químicamente estabilizados se unen a Dicer, entonces los enlaces ribonucleotídicos localizados de forma estratégica pueden permitir diseñar productos de escisión que permitan un repertorio de diseños multifuncionales más extenso. Por ejemplo los productos de escisión que no se limitan al patrón de Dicer de aproximadamente 22 nucleótidos pueden permitir construcciones de siNA multifuncionales con una coincidencia en la identidad entre secuencias objetivo que varía en el intervalo, por ejemplo, de aproximadamente 3 a aproximadamente 15 nucleótidos. La Figura 24 muestra un ejemplo no limitante de una construcción adicional de diseños de siNA multifuncionales de la invención. En un ejemplo, un conjugado, ligando, aptámero, marcador u otro resto se une a una región del siNA multifuncional para permitir una administración o perfil farmacocinético mejorados. La Figura 25 muestra un ejemplo no limitante de una construcción adicional de diseños de siNA multifuncionales de la invención. En un ejemplo, un conjugado, ligando, aptámero, marcador u otro resto se une a una región del siNA multifuncional para permitir una administración o perfil farmacocinético mejorados. La Figura 26 muestra un ejemplo no limitante de inhibición del antígeno S de VHB (HBsAg) in vitro usando diversas construcciones de síNA que tienen patrones de modificación selectos que incluyen ribonucleótidos en posiciones seleccionadas y que se dirigen al sitio 262 del ARN de VHB. La Figura 27 muestra un ejemplo no limitante de inhibición del antígeno S de VHB (HBsAg) in vitro usando diversas construcciones de siNA que tienen patrones de modificación selectos que incluyen ribonucleótidos en posiciones seleccionadas y que se dirigen al sitio 263 del ARN de VHB. La Figura 28 muestra un ejemplo no limitante de inhibición del antígeno S de VHB (HBsAg) in vitro usando diversas construcciones de siNA que tienen patrones de modificación selectos que incluyen ribonucleótidos en posiciones seleccionadas y que se dirigen al sitio 1583 del ARN de VHB. La Figura 29 muestra un ejemplo no limitante de inhibición dependiente de la dosis del antígeno S de VHB (HBsAg) in vitro usando dos construcciones diferentes de síNA que tienen patrones de modificación selectos que incluyen ribonucleótidos en posiciones seleccionadas y que se dirigen al sitio 1583 del ARN de VHB. La Figura 30 muestra un ejemplo no limitante de inhibición dependiente de la dosis del antígeno S de VHB (HBsAg) in vitro usando dos construcciones diferentes de siNA que tienen patrones de modificación selectos que incluyen ribonucleótidos en posiciones seleccionadas y que se dirigen al sitio 1583 del ARN de VHB. La Figura 31 muestra un ejemplo no limitante de inhibición del antígeno S de VHB (HBsAg) in vitro usando diversas construcciones de siNA que tienen patrones de modificación selectos que incluyen ribonucleótídos en posiciones seleccionadas y que se dirigen a los sitios 262 y 263 del ARN de VHB. La Figura 32 muestra un ejemplo no limitante de inhibición dependiente de la dosis de la expresión del ARN de HCV in vitro usando las construcciones de siNA Estab 25 y Estab 29 dirigidas al ARN de los sitios 327, 282, y 304. La Figura 33 muestra un ejemplo no limitante de la inhibición in vivo de ADN de VHB en ratones usando las moléculas de siNA de la invención formuladas en LNP-086 y LNP-061 con diferentes grupos de colgadura. Las construcciones activas de siNA en LNP-086 y LNP-061 se evaluaron comparando con control de PBS, con grupos de control invertidos. Tal como se muestra en la figura, las construcciones de siNA con colgaduras 2'-O-metilo proporcionan una potente actividad contra VHB en este modelo. Las Figuras 34A y 34B muestra un ejemplo no limitante de la reducción mediada por HBV263M-LNP-086 de los niveles en suero de ADN de VHB in vivo en ratones que replican VHB que se trataron con dosis de 0.3, 1 , o 3 mg/kg/día durante tres días comparado con grupos de siNA o PBS de control. Los niveles de ADN de HBV en suero eran equivalentes en los grupos tratados con siNA de control y PBS, demostrando la especificidad de la secuencia de la actividad contra VHB y la ausencia de efectos no específicos de los lípidos. La Figura 35 muestra un ejemplo no limitante de la reducción mediada por HBV263M-LNP-086 de los niveles en suero de HBsAg de VHB in vivo en ratones que replican VHB que se trataron con dosis de 0.3, 1 , o 3 mg/kg/día durante tres días comparado con grupos de siNA o PBS de control. Los niveles de HBsAg de control en suero eran equivalentes en los grupos tratados con siNA de control y PBS, demostrando la especificidad de la secuencia de la actividad contra VHB y la ausencia de efectos no específicos de los lípidos. La Figura 36 muestra un ejemplo no limitante de la duración de las reducciones mediadas por siNA de los niveles de VHB en un modelo de ratón de infección por VHB. Los ratones con VHB replicantes se trataron con HBV263M-LNP-086 o HBV263Minv-LNP-086 en dosis de 3 mg/kg/día durante tres días, seguido de análisis de valoraciones de VHB en suero los días 3, 7, y 14 después de la última dosis. Tal como se muestra en la figura, la actividad contra VHB fue persistente, observándose una actividad todavía significativa el día 7 (reducción de 2.0 loglO) y el día 14 (reducción de 1.5 loglO). La Figura 37 muestra un ejemplo no limitante de la escisión ARN de VHB específico de hígado mediado por la formulación HBV263M-LNP-086 activa en un modelo de ratón de infección por VHB. Los ratones con VHB replicantes se trataron con dosis de HBV263M-LNP-086 a 0.3, 1 , 3, 10 mg/kg/día o el control HBV263invM-LNP a 10 mg/kg durante tres días, y se determinaron los niveles de ARN de VHB 3 días después de la última dosis. Se observó reducción dependiente de la dosis del ARN de VHB hepático, con descensos de 90%, 66.5%, 18%, y 4% que se observaron en los grupos de tratamiento con 10, 3, 1 , y 0.3 mg/kg de HBV263M-LNP respectivamente comparado con el control con HBV263invM-LNP-086 a 10 mg/kg. La Figura 38 muestra un ejemplo no limitante de la demostración de que la reducción del ARN de VHB hepático se debe a una escisión mediada por ARNi de ARN de VHB. Se usó el análisis de amplificación rápida de los extremos 5' de cADN (RACE) para detectar la escisión del ARN de VHB en el sitio previsto. Los ratones con VHB replicantes se trataron con HBV263M-LNP-086 o HBV263Minv-LNP-086 en una dosis de 3 mg/kg/d durante 3 días. Los animales se sacrificaron a los 3, 7, o 14 días de la última dosis, y se aisló el ARN hepático total. Era de esperar que el ligado de una secuencia adaptadora a los extremos 5' libres de la población de ARN y la posterior RT-PCR con adaptador y cebadores específicos de VHB diera un producto de la PCR de 145 pb si el ARN de VHB hubiera sido escindido en el sitio objetivo previsto. Tal como se muestra la figura, se observó el producto de amplificación esperado en las muestras tratadas con siNA activo en HBV263 en cada tiempo, pero no en las muestras tratadas con el control de HBV263. Después se subclonaron los productos de la PCR y se secuenciaron, confirmando la unión correcta entre la secuencia adaptadora y el sitio de escisión previsto del siNA en HBV263. Este resultado establece que la reducción en ARN de VHB que se observa en el hígado se debía a una escisión específica mediada por ARNi del ARN de VHB en el higado. Además, la detección de los productos de escisión del ARN de VHB en los días 7 y 14 demuestran que la duración la actividad del siNA contra VHB se debe a una escisión continuada del ARN de VHB. La Figura 39 muestra un ejemplo no limitante de las propiedades farmacocinéticas de HBV263M-LNP-086 según se determinaron en ratones después de una única dosis de 3 mg/kg. Se usó un procedimiento para detectar el siNA HBV263M en plasma e hígado en función del tiempo. El HBV263M se eliminó rápidamente del plasma con un T1 2 de eliminación de aproximadamente 1.7 h. Sin embargo, se detectó HBV263M en el hígado durante todo el periodo de muestreo de 14 d y presentaba un T? 2 de eliminación de 4 días. Se observó una concentración máxima de 31.3 ± 17.8 ng/mg (media ± desviación típica) en el hígado en 1 hora y correspondía a 65 ± 32% de la dosis de siNA. A los 14 dias, 1.4 ± 0.7% de la dosis permanecía intacta en el hígado. La prolongada actividad contra VHB mediada por siNA que se observa en el modelo en ratones presenta una buena correlación con este tiempo de permanencia prolongado del siNA en el hígado.

Ejemplos no limitantes de qrupos con fosfato terminal quimicamente modificados de la invención o o ualquier ón de otras modificaciones en la presente EJEMPLO DE CONJUGADO DE COLESTEROL Eiemplo no limitante de una fosforamidita ligada a colesterol que puede usarse para sintetizar moléculas de siNA coniugadas con colesterol de la invención HEBRA CODIFICANTE C48H86N3?8P Masa exacta' 863.62 Peso molecular 864 19 C, 66 71 ; H, 10 03; N, 4 86; O, 14 81 ; P, 3.38 Se muestra un ejemplo con el resto de colesterol ligado al extremo 5' de la hebra codificante de una molécula de siNA.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Mecanismo de acción de las moléculas de ácido nucleico de la invención La descripción siguiente describe el mecanismo propuesto para la interferencia del ARN mediado por ARN corto de interferencia tal como se conoce actualmente y no se pretende que sea limitante y no se admite que sea técnica anterior. El solicitante demuestra en el presente documento que los ácidos nucleicos cortos de interferencia modificados quimicamente poseen una capacidad similar o mejorada de mediar en la ARNi que las moléculas de siARN y se espera que posean una estabilidad y actividad mejoradas in vivo; por lo tanto, no se pretende que esta descripción se limite únicamente a siARN y puede aplicarse a siNA en conjunto. Con "capacidad mejorada de mediar ARNi" o "actividad mejorada de ARNi" se quiere incluir la actividad de ARNi medida in vitro y/o in vivo donde la actividad de ARNi es un reflejo tanto de la capacidad del siNA de mediar en la ARNi como de la estabilidad de los siNA de la invención. En esta invención, el producto de estas actividades puede aumentarse in vitro y/o in vivo comparado con un siARN todo de ARN o un siNA que contiene una pluralidad de ribonucleótidos. En algunos casos, la actividad o estabilidad de la molécula de siNA puede ser menor (es decir, menos de diez veces), pero la actividad total de la molécula de siNA se mejora in vitro y/o in vivo.

La interferencia del ARN se refiere al proceso de silenciamiento génico postranscripcional específico de secuencia en animales mediada por los ARN cortos de interferencia (siARN) (Fire y cois., 1998, Nature, 391 , 806). El proceso correspondiente en plantas se denomina habitualmente silenciamiento génico postranscripcional o silenciamiento de ARN y también se denomina represión en los hongos. Se cree que el proceso del silenciamiento génico postranscripcional es un mecanismo de defensa celular conservado evolutivamente para evitar la expresión de genes exógenos que habitualmente es compartido por diversa flora y filos (Fire y cois., 1999, Trends genet., 15, 358). Dicha protección contra la expresión génica exógena puede haber evolucionado como respuesta a la producción de ARN bicatenarios (dsARN) derivados de una infección vírica o de la integración aleatoria de elementos de transposones en un genoma hospedador mediante una respuesta celular que destruye de forma específica el ARN monocatenario homólogo o el ARN genómico vírico. La presencia de dsARN en las células desencadena la respuesta de la ARNi a través de un mecanismo que todavía tiene que caracterizarse por completo. Este mecanismo parece ser diferente de la respuestas a los interferones que provoca la activación mediada por dsARN de la proteína cinasa PKR y 2', 5'-oligoadenilato sintetasa que provoca una escisión no específica del mARN por la ribonucleasa L. La presencia de dsARN largos en células estimula la actividad de una enzima ribonucleasa lll denominada Dicer. La Dicer está implicada en el procesamiento del dsARN a tramos cortos de dsARN conocidos como ARN cortos de interferencia (siARN) (Berstein y cois., 2001 , Nature, 409, 363). Los ARN cortos de interferencia derivados por la actividad de la Dicer habitualmente son de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos de longitud y comprenden moléculas bicatenarias de aproximadamente 19 pares de bases. La Dicer también se ha implicado en la escisión de ARN temporales cortos de 21 y 22 nucleótidos (stARN) del ARN precursor de estructura conservada que están implicados en el control de la traducción (Hutvagner y cois., 2001 , Science, 293, 834). La respuesta de la ARNi también presenta un complejo de endonucleasas que contiene un siARN, habitualmente denominado un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que actúa de mediador de la escisión de ARN monocatenario que tiene una secuencia homologa al siARN. La escisión del ARN objetivo se produce en mitad de la región complementaria a la secuencia guía de la molécula bicatenaria de siARN (Elbashir y cois., 2001 , Genes Dev., 15, 188). Además, la interferencia del ARN también puede implicar silenciamiento génico mediado por ARN corto (por ejemplo, micro-ARN o miARN), presumiblemente a través de mecanismos celulares que regulan la estructura de la cromatina y así evitan la transcripción de las secuencias génicas objetivo (véase por ejemplo Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe y cois., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; y Hall y cois., 2002, Science, 297, 2232-2237). Así, las moléculas de siNA de la invención pueden usarse para mediar el silenciamiento génico mediante interacción con transcritos de ARN o de forma alternativa mediante interacción con secuencias génicas particulares, en las que dicha interacción produce silenciamiento génico ya sea a nivel transcripcional o postranscripcional. La ARNi se ha estudiado en una variedad de sistemas. Fire y cois., 1998, Nature, 391 , 806, fueron los primeros en observar la ARNi en C. elegans. Wianny y Goetz, 1999, Nature Cell Biol., 2, 70, describen ARNi mediada por dsARN en embriones de ratón. Hammond y cois., 2000, Nature, 404, 293, describen ARNi en células de Drosophila transfectadas con dsARN. Elbashir y cois., 2001 , Nature, 411 , 494, describen ARNi inducida por la introducción de moléculas bicatenarias de ARN sintéticos de 21 nucleótidos en células de mamífero cultivadas que incluyen células renales embrionarias humanas y células HeLa. Estudios recientes en lisados embrionarios de Drosophila han revelado ciertos requisitos en cuanto a la longitud, estructura, composición química y secuencia de los siARN que son esenciales para mediar una actividad eficaz de ARNi. Estos estudios han demostrado que las moléculas bicatenarias de siARN de 21 nucleótidos son más activas cuando contienen dos colgaduras de 2-nucleótidos en el extremo 3'. Además, la sustitución de una o ambas hebras de siARN con nucleótidos de 2'-desoxi o de 2'-O-metilo suprime la actividad de ARNi, mientras que se demostró que la sustitución de los nucleótidos siARN del extremo 3' con desoxi nucleótidos era tolerada. También se demostró que las secuencias con emparejamientos erróneos en el centro de la molécula bicatenaria de siARN suprimen la actividad de ARNi. Además, estos estudios también indican que la posición del sitio de escisión en el ARN objetivo está definida por el extremo 5' del siARN en lugar de por el extremo 3' de la secuencia de guía (Elbashir y cois., 2001 , EMBO J., 20, 6877). Otros estudios han indicado que es necesario un 5'-fosfato en la hebra complementaria objetivo de una molécula bicatenaria de siARN para la actividad de siARN y que se utiliza ATP para mantener el resto 5'-fosfato en el siARN (Nykanen y cois., 2001 , Cell, 107, 309); sin embargo, las moléculas de siARN que carecen de un 5'-fosfato son activas cuando se introducen exógenamente, lo que sugiere que la d'-fosforilación de las construcciones de siARN pueden producirse in vivo.

Oligonucleótidos de formación de moléculas bicatenarias (DFO) de la invención En una modalidad, la invención presenta moléculas de siNA que comprenden oligonucleótidos que forman moléculas bicatenarias (DFO) que pueden autoensamblarse formando oligonucleótidos bicatenarios. Los oligonucleótidos que forman moléculas bicatenarias de la invención pueden sintetizarse químicamente o expresarse a través de unidades y/o vectores de transcripción. Las moléculas de DFO de la presente invención proporcionan reactivos y procedimientos de utilidad para una variedad de aplicaciones terapéuticas, diagnósticas, agrícolas, veterinarias, de validación de objetivos, de descubrimiento genómico, de ingenieria genética y farmacogenómicas. El solicitante demuestra en el presente documento que ciertos oligonucleótidos, a los que se denomina en el presente documento, por conveniencia pero sin limitación, oligonucleótidos que forman moléculas bicatenarias o moléculas DFO, son mediadores potentes de la regulación específica de secuencia de la expresión génica. Los oligonucleótidos de la invención son diferentes de otras secuencias de ácido nucleico conocidas en la técnica (por ejemplo, siARN, miARN, stARN, shARN, oligonucleótidos no codificantes etc.) porque representan una clase de secuencias de polinucleótidos lineales que están diseñadas para autoensamblarse formando oligonucleótidos bicatenarios, donde cada hebra de los oligonucleótidos bicatenarios comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una molécula de ácido nucleico objetivo. Las moléculas de ácido nucleico de la invención así pueden autoensamblarse formando moléculas bicatenarias funcionales en las que cada hebra de la molécula bicatenaria comprende la misma secuencia de polinucleótidos y cada hebra comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una molécula de ácido nucleico objetivo. De forma general, los oligonucleótidos bicatenarios se forman mediante el ensamblaje de dos secuencias de oligonucleótidos diferentes donde la secuencia de oligonucleótidos de una hebra es complementaria a la secuencia de oligonucleótidos de la segunda hebra; dichos oligonucleótidos bicatenarios se ensamblan a partir de dos oligonucleótidos diferentes o a partir de una única molécula que se pliega formando una estructura bicatenaria, a menudo denominada en el campo estructura en horquilla con tallo y bucle (por ejemplo, shARN o ARN corto en horquilla). Estos oligonucleótidos bicatenarios conocidos en la técnica todos tienen una característica común ya que cada hebra de la molécula bicatenaria tiene una secuencia de nucleótidos distinta. Los solicitantes, al contrario que las moléculas bicatenarias de ácido nucleico conocidas en la técnica, han desarrollado un procedimiento novedoso, potencialmente rentable y simplificado de formar una molécula bicatenaria de ácido nucleico a partir de un oligonucleótido monocatenario o linear. Las dos hebras del oligonucleótido bicatenario que se forma de acuerdo con la presente invención tienen la misma secuencia de nucleótidos y están unidos de forma covalente entre sí. Dichas moléculas oligonucleotídicas bicatenarias pueden unirse fácilmente postsintéticamente mediante procedimientos y reactivos conocidos en la técnica y están dentro del alcance de la invención. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario de la invención (el oligonucleótido que forma una molécula bicatenaria) que forma un oligonucleótido bicatenario comprende una primera región y una segunda región, donde la segunda región incluye una secuencia de nucleótidos que es una repetición invertida de la secuencia de nucleótidos de la primera región, o una porción de la misma, de tal forma que el oligonucleótido monocatenario se autoensambla formando una molécula de oligonucleótido bicatenario en el que la secuencia de nucleótidos de una hebra de la molécula bicatenaria es la misma que la secuencia de nucleótidos de la segunda hebra. Ejemplos no limitantes de dicho oligonucleótido que forma una molécula bicatenaria se ilustran en las Figuras 11A-11 D y 12. Estos oligonucleótidos que forman moléculas bicatenarias (DFO) opcionalmente pueden incluir ciertos palíndromos o secuencias repetidas donde dichos palíndromos o secuencias repetidas están presentes entre la primera región y la segunda región del DFO. En una modalidad, la invención presenta un oligonucleótido que forma una molécula bicatenaria (DFO), en la que el DFO comprende una molécula bicatenaria que forma una secuencia autocomplementaria de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de ácido nucleico objetivo. La molécula de DFO puede comprender una única secuencia autocomplementaria o una molécula bicatenaria producida por el ensamblaje de dichas secuencias autocomplementarias. En una modalidad, un oligonucleótido que forma una molécula bicatenaria (DFO) de la invención comprende una primera región y una segunda región, en la que la segunda región comprende una secuencia de nucleótidos que comprende una repetición invertida de la secuencia de nucleótidos de la primera región de tal forma que la molécula de DFO puede ensamblarse formando un oligonucleótido bicatenario. Dichos oligonucleótidos bicatenarios pueden actuar como un ácido nucleico corto de interferencia (siNA) para modular la expresión génica. Cada hebra del oligonucleótido bicatenario formado por moléculas de DFO de la invención puede comprender una región de una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la misma secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ARN objetivo).

En una modalidad, la invención presenta un DFO monocatenario que can ensamblarse formando un oligonucleótido bicatenario. El solicitante ha encontrado sorprendentemente un oligonucleótido monocatenario con regiones nucleotídicas de autocomplementariedad pueden ensamblarse fácilmente formando construcciones de moléculas bicatenarias de oligonucleótidos. Dichos DFO pueden ensamblarse produciendo moléculas bicatenarias que pueden inhibir la expresión génica de un modo específico de secuencia. Las moléculas de DFO de la invención comprenden una primera región con secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de una segunda región y donde la secuencia de la primera región es complementaria a un ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ARN). El DFO puede formar un oligonucleótido bicatenario en el que una porción de cada hebra del oligonucleótido bicatenario comprende una secuencia complementaria a una secuencia de ácido nucleico objetivo. En una modalidad, la invención presenta un oligonucleótido bicatenario, en el que las dos hebras del oligonucleótido bicatenario no están unidos covalentemente entre sí, y en la que cada hebra del oligonucleótido bicatenario comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la misma secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma (por ejemplo, ARN objetivo). En otra modalidad, las dos hebras del oligonucleótido bicatenario comparten una secuencia de nucleótidos idéntica de al menos aproximadamente 15, preferiblemente al menos aproximadamente 16, 17, 18, 19, 20 ó 21 nucleótidos. En una modalidad, una molécula de DFO de la invención comprende una estructura que tiene la Fórmula DFO-I: 5'-p-X Z X'-3' en la que Z comprende un palíndromo o secuencia repetida de ácido nucleico opcionalmente con uno o más nucleótidos modificados (por ejemplo, nucleótido con una base modificada, tal como 2-amino purina, 2-amino-1 ,6-dihidro purina o una base universal), por ejemplo con una longitud de aproximadamente 2 a aproximadamente 24 nucleótidos en números pares (por ejemplo, aproximadamente 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, o 22 ó 24 nucleótidos), X representa una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo con una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 21 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ó 21 nucleótidos), X' comprende una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo con una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 21 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ó 21 nucleótidos) que tiene complementariedad de secuencia nucleotídica con una secuencia X o una porción de la misma, p comprende un grupo fosfato terminal que puede estar presente o ausente, y en la que la secuencia X y Z, de forma independiente o conjunta, comprenden una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico objetivo o a una porción de la misma y es de longitud suficiente para interactuar (por ejemplo, formar pares de bases con la secuencia de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma (por ejemplo, ARN objetivo). Por ejemplo, X independientemente puede comprender una secuencia de aproximadamente 12 a aproximadamente 21 o más (por ejemplo, aproximadamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , o más) nucleótidos de longitud que es complementaria a una secuencia de nucleótidos en un ARN objetivo o una porción del mismo. En otro ejemplo no limitante, la longitud de la secuencia de nucleótidos de X y Z juntos, cuando X está presente, es decir complementaria al objetivo o a una porción de la misma (por ejemplo, ARN objetivo) tiene de aproximadamente 12 a aproximadamente 21 o más nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , o más). Todavía en otro ejemplo no limitante, cuando X está ausente, la longitud de la secuencia de nucleótidos de Z que es complementaria al objetivo o una porción de la misma tiene de aproximadamente 12 a aproximadamente 24 o más nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, o más). En una modalidad X, Z y X' son independientemente oligonucleótidos, donde X y/o Z comprenden una secuencia de nucleótidos de longitud suficiente para interactuar (por ejemplo, formar pares de bases con una secuencia de nucleótidos en el objetivo o una porción de la misma (por ejemplo, ARN objetivo). En una modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos X y X' son idénticas. En otra modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos X y X' no son idénticas. En otra modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos X y Z, o Z y X', o X, Z y X' son idénticas o diferentes. Cuando una secuencia se describe en esta memoria descriptiva como que tiene "suficiente" longitud para interactuar (es decir, formar pares de bases) con otra secuencia, se quiere decir que la longitud es tal que el número de enlaces (por ejemplo, enlaces de hidrógeno) que se forman entre las dos secuencias es suficiente para permitir que las dos secuencias formen una molécula bicatenaria en las condiciones de interés. Dichas condiciones pueden ser in vitro (por ejemplo, con fines de diagnóstico o ensayo) o in v/Vo(por ejemplo, con fines terapéuticos). Es una forma simple y rutinaria de determinar dichas longitudes. En una modalidad, la invención presenta una construcción de oligonucleótido bicatenario que tiene la Fórmula DFO-I(a): 5'-p-X Z X'-3' 3'-X' Z X-p-5' en la que Z comprende un palíndromo o secuencia repetida de ácido nucleico o un palíndromo o secuencia de tipo repetida de ácido nucleico con uno o más nucleótidos modificados (por ejemplo, nucleótidos con una base modificada, tal como 2-amino purina, 2-amino-1 ,6-dihidro purina o una base universal), por ejemplo con una longitud de aproximadamente 2 a aproximadamente 24 nucleótidos en números pares (por ejemplo, aproximadamente 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 ó 24 nucleótidos), X representa una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo con una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 21 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ó 21 nucleótidos), X' comprende una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo con una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 21 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ó 21 nucleótidos) que tiene complementariedad de secuencia nucleotídica con una secuencia X o una porción de la misma, p comprende un grupo fosfato terminal que puede estar presente o ausente, y en la que cada X y Z independientemente comprenden una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma (por ejemplo, ARN objetivo) y es de longitud suficiente para interactuar con la secuencia de ácido nucleico objetivo de una porción de la misma (por ejemplo, ARN objetivo). Por ejemplo, la secuencia X independientemente puede comprender una secuencia de aproximadamente 12 a aproximadamente 21 o más nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , o más) de longitud que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de un objetivo o una porción de la misma (por ejemplo, ARN objetivo). En otro ejemplo no limitante, la longitud de la secuencia de nucleótidos de X y Z juntos (cuando X está presente) es decir complementaria al objetivo o a una porción de la misma tiene de aproximadamente 12 a aproximadamente 21 o más nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , o más). Todavía en otro ejemplo no limitante, cuando X está ausente, la longitud de la secuencia de nucleótidos de Z que es complementaria al objetivo o una porción de la misma tiene de aproximadamente 12 a aproximadamente 24 o más nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o más). En una modalidad X, Z y X' son independientemente oligonucleótidos, donde X y/o Z comprenden una secuencia de nucleótidos de longitud suficiente para interactuar (por ejemplo, formar pares de bases con una secuencia de nucleótidos en el objetivo o una porción de la misma (por ejemplo, ARN objetivo). En una modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos X y X' son idénticas. En otra modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos X y X' no son idénticas. En otra modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos X y Z, o Z y X', o X, Z y X' son idénticas o diferentes. En una modalidad, la construcción de oligonucleótido bicatenario de la Fórmula l(a) incluye uno o más, de forma específica 1 , 2, 3 ó 4, emparejamientos erróneos, en tanto en cuanto dichos emparejamientos erróneos no disminuyan significativamente la capacidad del oligonucleótido bicatenario de inhibir la expresión del gen objetivo. En una modalidad, una molécula de DFO de la invención comprende una estructura que tiene la Fórmula DFO-II: 5'-p-X Xf-3f en la que cada X y X' son independientemente oligonucleótidos con una longitud de aproximadamente 12 nucleótidos a aproximadamente 21 nucleótidos, en la que X comprende, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico con una longitud de aproximadamente 12 a aproximadamente 21 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ó 21 nucleótidos), X' comprende una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo con una longitud de aproximadamente 12 a aproximadamente 21 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ó 21 nucleótidos) que tiene complementariedad de secuencia nucleotídica con una secuencia X o una porción de la misma, p comprende un grupo fosfato terminal que puede estar presente o ausente, y en la que X comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ARN objetivo) o una porción de la misma y es de longitud suficiente para interactuar (por ejemplo, formar pares de bases con la secuencia de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma. En una modalidad, la longitud de los oligonucleótidos X y X' es idéntica. En otra modalidad, la longitud de los oligonucleótidos X y X' no es idéntica. En una modalidad, la longitud de los oligonucleótidos X y X' es suficiente para formar un oligonucleótido bicatenario relativamente estable. En una modalidad, la invención presenta una construcción de oligonucleótido bicatenario que tiene la Fórmula DFO-ll(a): 5f-p-X X'-3f 3'-X' X-p-51 en la que cada X y X' son independientemente oligonucleótidos con una longitud de aproximadamente 12 nucleótidos a aproximadamente 21 nucleótidos, en la que X comprende una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo con una longitud de aproximadamente 12 a aproximadamente 21 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ó 21 nucleótidos), X' comprende una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo con una longitud de aproximadamente 12 a aproximadamente 21 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ó 21 nucleótidos) que tiene complementariedad de secuencia nucleotidica con una secuencia X o una porción de la misma, p comprende un grupo fosfato terminal que puede estar presente o ausente, y en la que X comprende la secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma (por ejemplo, ARN objetivo) y es de longitud suficiente para ¡nteractuar (por ejemplo, formar pares de bases con la secuencia de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ARN objetivo) o una porción de la misma. En una modalidad, las longitudes de los olígonucleótidos X y X' son idénticas. En otra modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos X y X' no son idénticas. En una modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos X y X' son suficiente para formar un oligonucleótido bicatenario relativamente estable. En una modalidad, la construcción de oligonucleótido bicatenario de la Fórmula ll(a) incluye uno o más, de forma específica 1 , 2, 3 ó 4, emparejamientos erróneos, en tanto en cuanto dichos emparejamientos erróneos no disminuyan significativamente la capacidad del oligonucleótido bicatenario de inhibir la expresión del gen objetivo. En una modalidad, la invención presenta a molécula de DFO que tiene la Fórmula DFO-I(b): 5'-p-Z-3' donde Z comprende un palíndromo o secuencia repetida de ácido nucleico que opcionalmente incluye uno o más nucleótidos no estándar o modificados (por ejemplo, nucleótido con una base modificada, tal como 2-amino purina o una base universal) que puede facilitar la formación de pares de bases con otros nucleótidos. Z puede ser, por ejemplo, de longitud suficiente para interactuar (por ejemplo, formar pares de bases con la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ARN objetivo), preferiblemente de longitud de al menos 12 nucleótidos, de forma específica de aproximadamente 12 a aproximadamente 24 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 12, 14, 16, 18, 20, 22 ó 24 nucleótidos). p representa un grupo fosfato terminal que puede estar presente o ausente. En una modalidad, una molécula de DFO que tiene cualquiera de las Fórmulas DFO-I, DFO-I(a), DFO-I(b), DFO-ll(a) o DFO-II puede comprender modificaciones químicas tal como se describen en el presente documento sin limitación, tal como, por ejemplo, nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas I-VI I, estructuras de estabilización tal como se describen en el cuadro I, o cualquier otra combinación de nucleótidos y no nucleótidos modificados tal como se describen en las diversas modalidades en el presente documento. En una modalidad, el palíndromo o secuencia repetida o nucleótido modificado (por ejemplo, nucleótido con una base modificada, tal como 2-amino purina o una base universal) en Z de las construcciones de DFO que tienen la Fórmula DFO-I, DFO-I(a) y DFO-I(b), comprende nucleótidos químicamente modificados que tienen capacidad de interactuar con una porción de la secuencia de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, análogos con bases modificadas que pueden formar pares de bases Watson Crick o pares de bases distintas de Watson Crick). En una modalidad, una molécula de DFO de la invención, por ejemplo un DFO que tiene la Fórmula DFO-I o DFO-II, comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ó 40 nucleótidos). En una modalidad, una molécula de DFO de la invención comprende una o más modificaciones químicas. En un ejemplo no limitante, la introducción de nucleótidos y/o no nucleótidos químicamente modificados en moléculas de ácido nucleico de la invención proporciona una herramienta poderosa para solventar las potenciales limitaciones de la estabilidad y biodisponibilidad in vivo inherentes a moléculas de ARN sin modificar que se administran de forma exógena. Por ejemplo, el uso de moléculas de ácido nucleico modificadas químicamente puede permitir una dosis menor de una molécula particular de ácido nucleico para un efecto terapéutico dado ya que las moléculas de ácido nucleico modificadas quimicamente tienden a tener una semivida mayor en suero o en células o tejidos. Además, ciertas modificaciones químicas pueden mejorar la biodisponibilidad y/o potencia de las moléculas de ácido nucleico no solo mejorando la semivida sino también facilitando la dirección de moléculas de ácido nucleico a órganos, células o tejidos particulares y/o mejorando la captación celular de las moléculas de ácido nucleico. Por lo tanto, incluso si se reduce la actividad de una molécula de ácido nucleico químicamente modificada in vitro comparada con una molécula de ácido nucleico nativa/sin modificar, por ejemplo cuando se compara con una molécula de ARN sin modificar, la actividad total de la molécula de ácido nucleico modificada puede ser mayor que la de la molécula de ácido nucleico nativa o sin modificar debido a una estabilidad, potencia, duración del efecto, biodisponibilidad y/o administración mejoradas de la molécula.

Moléculas de siNA de la invención multifuncionales o con objetivos múltiples En una modalidad, la invención presenta moléculas de siNA que comprenden moléculas de ácido nucleico corto de interferencia multifuncionales (siNA multifuncional) que modulan la expresión de uno o más genes objetivo en un sistema biológico, tal como una célula, tejido, u organismo. Las moléculas de ácido nucleico corto de interferencia multifuncional (siNA multifuncional) de la invención pueden dirigirse contra más de una región de la secuencia de ácido nucleico objetivo o pueden dirigirse contra secuencias objetivo de más de una molécula de ácido nucleico objetivo diferentes (por ejemplo, secuencias de ARN objetivo y/o ruta objetivo y/o ADN objetivo). Las moléculas de siNA multifuncionales de la invención pueden sintetizarse químicamente o expresarse a través de unidades y/o vectores de transcripción. Las moléculas de siNA multifuncionales de la presente invención proporcionan reactivos y procedimientos de utilidad para una variedad de aplicaciones en seres humanos terapéuticas, diagnósticas, agrícolas, veterinarias, de validación de objetivos, de descubrimiento genómico, de ingeniería genética y farmacogenómicas. El solicitante demuestra en el presente documento que ciertos olígonucleótidos, a los que se denomina en el presente documento, por conveniencia pero sin limitación, moléculas de ácido nucleico corto de interferencia multifuncional o siNA multifuncional, son mediadores potentes de la regulación específica de secuencia de la expresión génica. Las moléculas de siNA multifuncionales de la invención son diferentes de otras secuencias de ácido nucleico conocidas en la técnica (por ejemplo, siARN, miARN, stARN, shARN, oligonucleótidos no codificantes, etc.) porque representan una clase de moléculas polinucleotídicas que se diseñan de tal forma que cada hebra de la construcción de siNA multifuncional comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia diferente de ácido nucleico en una o más moléculas de ácido nucleico objetivo. Una única molécula de siNA multifuncional (de forma general una molécula bicatenaria) de la invención así puede dirigirse a más de una (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o más) moléculas de ácido nucleico objetivo diferentes. Las moléculas de ácido nucleico de la invención también puede dirigirse contra más de una (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o más) región de la misma secuencia de ácido nucleico objetivo. Así, las moléculas de siNA multifuncionales de la invención son de utilidad para regular por disminución o inhibir la expresión de una o más moléculas de ácido nucleico objetivo. Al reducir o inhibir la expresión de más de una molécula de ácido nucleico objetivo con una construcción de siNA multifuncional, las moléculas de siNA multifuncionales de la invención representan una clase de potentes agentes terapéutico que pueden proporcionar una inhibición simultánea de múltiples objetivos en una ruta relacionada con la enfermedad (por ejemplo, angiógena). Dicha inhibición simultánea puede proporcionar estrategias de tratamiento terapéutico sinérgico sin necesidad de separar los esfuerzos de desarrollo preclínicos y clínicos ni de un complejo proceso de autorización reguladora. El uso de las moléculas de siNA multifuncionales que se dirigen contra más de una región de una molécula de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ARN o ADN objetivo) se espera que proporcionen una potente inhibición de la expresión génica. Por ejemplo, una única construcción de siNA multifuncional de la invención puede dirigirse tanto contra regiones conservadas como variables de una molécula de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ARN o ADN objetivo), permitiendo así la regulación por disminución o la inhibición, por ejemplo, de diferentes isoformas o variantes objetivo para optimizar la eficacia terapéutica y minimizar la toxicidad, o permitir dirigirse contra tanto contra la región codificante como no codificante de la molécula de ácido nucleico objetivo. De forma general, los oligonucleótidos bicatenarios se forman mediante el ensamblaje de dos oligonucleótidos diferentes donde la secuencia de oligonucleótidos de una hebra es complementaria a la secuencia de oligonucleótidos de la segunda hebra; dichos oligonucleótidos bicatenarios se ensamblan a partir de dos oligonucleótidos diferentes (por ejemplo, siARN). De forma alternativa, puede formarse una molécula bicatenaria a partir de una única molécula que se pliega sobre sí misma (por ejemplo, shARN o ARN corto en horquilla). En la técnica se sabe que estos oligonucleótidos bicatenarios actúan de mediadores de la interferencia del ARN y todos tienen una característica común en la que solo una región de la secuencia de nucleótidos (secuencia guía o la secuencia no codificante) tiene complementariedad con una secuencia de ácido nucleico objetivo, y la otra hebra (secuencia codificante) comprende la secuencia de nucleótidos que es homologa a la secuencia de ácido nucleico objetivo. De forma general, la secuencia no codificante se retiene en el complejo RISC activo y guía a RISC a la secuencia objetivo de nucleótidos mediante formación de pares de bases complementarias de la secuencia no codificante con la secuencia objetivo para actuar de mediadora de la interferencia del ARN específica de secuencia. Es sabido en la técnica que en algunos sistemas de cultivo celular, ciertos tipos de siARN sin modificar pueden exhibir efectos "externos al objetivo". La hipótesis propuesta es que este efecto externo al objetivo implica la participación de la secuencia sin modificar en lugar de la secuencia no codificante del siARN en el complejo RISC (véase por ejemplo Schwarz y cois, de 2003, Cell, 115, 199-208). En este caso, se cree que la secuencia codificante dirige el complejo RISC a una secuencia (secuencia externa al objetivo) que es diferente de la secuencia objetivo que se pretendía, provocando la inhibición de la secuencia externa al objetivo. En estas moléculas bicatenarias de ácido nucleico, cada hebra es complementaria a una secuencia diferente de ácido nucleico objetivo. Sin embargo, las objetivos externas que se ven afectadas por estos dsARN no son enteramente predecibles y no son específicas. Los solicitantes, al contrario que las moléculas bicatenarias de ácido nucleico conocidas en la técnica, han desarrollado un procedimiento novedoso, potencialmente rentable y simplificado de regular por disminución o inhibir la expresión de más de una secuencia de ácido nucleico objetivo usando una única construcción de siNA multifuncional. Las moléculas de siNA multifuncionales de la invención se diseñan para que sean bicatenarias o parcialmente bicatenario, de tal forma que una porción de cada hebra o región del siNA multifuncional sea complementaria a una secuencia de ácido nucleico objetivo elegida. Así, las moléculas de siNA multifuncionales de la invención no se limitan a dirigirse contra secuencias que son complementarias entre sí, sino a dos secuencias de ácido nucleico objetivo cualesquiera. Las moléculas de siNA multifuncionales de la invención se diseñan de tal forma que cada hebra o región de la molécula de siNA multifuncional, que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico objetivo dada, es de longitud adecuada (por ejemplo, de aproximadamente 16 a aproximadamente 28 nucleótidos de longitud, preferiblemente de aproximadamente 18 a aproximadamente 28 nucleótidos de longitud) para mediar en la interferencia del ARN contra la secuencia de ácido nucleico objetivo. La complementariedad entre la secuencia de ácido nucleico objetivo y una hebra o región del siNA multifuncional debe ser suficiente (al menos aproximadamente 8 pares de bases) para la escisión de la secuencia de ácido nucleico objetivo mediante interferencia del ARN. Es de esperar que el siNA multifuncional de la invención minimice los efectos externos al objetivo que se observan con ciertas secuencias de siARN, tales como las que se describen en Schwarz y cois., referencia anterior. Se ha reseñado que los dsARN de longitud entre 29 pares de bases y 36 pares de bases (Tuschl y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 02/44321) no actúan de mediadores de la ARNi. Una razón por la que estos dsARN son inactivos pueda ser la falta de recambio o disociación de la hebra que interactúa con la secuencia del ARN objetivo, de tal forma que el complejo RISC no tiene capacidad de interactuar de forma eficaz con copias múltiples del ARN objetivo produciendo un descenso significativo de la potencia y eficacia del proceso de ARNi. El solicitante sorprendentemente ha encontrado que los siNA multifuncionales de la invención pueden superar esta barrera y tienen capacidad de potenciar la eficacia y potencia del proceso de ARNi. Así, en ciertas modalidades de la invención, pueden diseñarse siNA multifuncionales con una longitud de aproximadamente 29 a aproximadamente 36 pares de bases de tal forma que, una porción de cada hebra de la molécula de siNA multifuncional comprenda una región de la secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico objetivo de longitud suficiente para actuar de mediadora de la eficacia de ARNi (por ejemplo, de aproximadamente 15 a aproximadamente 23 pares de bases) y una región de una secuencia de nucleótidos que no es complementaria al ácido nucleico objetivo. Al tener tanto porciones complementaria como no complementarias en cada hebra del siNA multifuncional, el siNA multifuncional puede actuar de mediador de la interferencia del ARN contra una secuencia de ácido nucleico objetivo sin ser prohibitivo para el recambio o la disociación (por ejemplo, cuando la longitud de cada hebra es demasiado grande para mediar la ARNi contra la secuencia de ácido nucleico objetivo respectiva). Además, el diseño de las moléculas de siNA multifuncionales de la invención con regiones internas superpuestas permite a las moléculas de siNA multifuncionales tener un tamaño favorable (menor) para mediar en la interferencia del ARN y el tamaño que es adecuado para su uso como agente terapéutico (por ejemplo, en la que cada hebra es independientemente de aproximadamente 18 a aproximadamente 28 nucleótidos de longitud). En las Figuras 13A y 13B hasta la figura 22 se ilustran ejemplos no limitantes. En una modalidad, una molécula de siNA multifuncional de la invención comprende una primera región y una segunda región, donde la primera región del siNA multifuncional comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de ácido nucleico de una primera molécula de ácido nucleico objetivo, y la segunda región del siNA multifuncional comprende la secuencia de ácido nucleico complementaria a una secuencia de ácido nucleico de una segunda molécula de ácido nucleico objetivo. En una modalidad, una molécula de siNA multifuncional de la invención comprende una primera región y una segunda región, donde la primera región del siNA multifuncional comprende la secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de ácido nucleico de la primera región de una molécula de ácido nucleico objetivo, y la segunda región del siNA multifuncional comprende la secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de ácido nucleico de una segunda región de a la molécula de ácido nucleico objetivo. En otra modalidad, la primera región y la segunda región del siNA multifuncional puede comprender secuencias diferentes de ácido nucleico que comparten algún grado de complementariedad (por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 nucleótidos complementarios). En ciertas modalidades, las construcciones de siNA multifuncionales que comprenden secuencias de ácido nucleico diferentes pueden ligarse fácilmente postsintéticamente mediante procedimientos y reactivos conocidos en la técnica y dichas construcciones ligadas están dentro del alcance de la invención. De forma alternativa, la primera región y la segunda región del siNA multifuncional pueden comprender una única secuencia de ácido nucleico que tiene algún grado de autocomplementariedad, tal como en una estructura de horquilla o tallo y bucle. Ejemplos no limitantes de dichos ácidos nucleicos corto de interferencia multifuncionales bicatenarios y de horquilla se ilustran en las Figuras 13A-13B y 14A-14B respectivamente. Estos ácidos nucleicos cortos de interferencia multifuncionales (siNA multifuncionales) opcionalmente pueden incluir cierta secuencia de nucleótidos superpuesta donde dicha secuencia de nucleótidos superpuesta está presente entre la primera región y la segunda región del siNA multifuncional (véase por ejemplo las Figuras 15A-15B y 16A-16B). En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia multifuncional (siNA multifuncional), en la que cada hebra del siNA multifuncional independientemente comprende una primera región de secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico objetivo diferente y la segunda región de secuencia de nucleótidos que no es complementaria a la secuencia objetivo. La secuencia de ácido nucleico objetivo de cada hebra es en la misma molécula de ácido nucleico objetivo o moléculas de ácido nucleico objetivo diferentes. En otra modalidad, el siNA multifuncional comprende dos hebras, donde: (a) la primera hebra comprende una región que tiene complementariedad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 1) y una región que no tiene complementariedad de secuencia con la secuencia objetivo de nucleótidos (región no complementaria 1); (b) la segunda hebra del siNA multifunción comprende una región que tiene complementariedad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico objetivo que es diferente de la secuencia objetivo de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la primera hebra (región complementaria 2), y una región que no tiene complementariedad de secuencia con la secuencia objetivo de nucleótidos de la región complementaria 2 (región no complementaria 2); (c) la región complementaria 1 de la primera hebra comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos en la región no complementaria 2 de la segunda hebra y la región complementaria 2 de la segunda hebra comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos en la región no complementaria 1 de la primera hebra. La secuencia de ácido nucleico objetivo de la región complementaria 1 y de la región complementaria 2 es en la misma molécula de ácido nucleico objetivo o moléculas de ácido nucleico objetivo diferentes. En otra modalidad, el siNA multifuncional comprende dos hebras, donde: (a) la primera hebra comprende una región que tiene complementariedad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico objetivo derivado de un gen (por ejemplo, un gen primero) (región complementaria 1) y una región que no tiene complementariedad de secuencia con la secuencia objetivo de nucleótidos de la región complementaria 1 (región no complementaria 1); (b) la segunda hebra del siNA multifunción comprende una región que tiene complementariedad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico objetivo derivada de un gen (por ejemplo, un gen segundo) que es diferente del gen de la región complementaria 1 (región complementaria 2), y una región que no tiene complementariedad de secuencia con la secuencia objetivo de nucleótidos de la región complementaria 2 (región no complementaria 2); (c) la región complementaria 1 de la primera hebra comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de la región no complementaria 2 de la segunda hebra y la región complementaria 2 de la segunda hebra comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de la región no complementaria 1 de la primera hebra. En otra modalidad, el siNA multifuncional comprende dos hebras, donde: (a) la primera hebra comprende una región que tiene complementariedad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico objetivo derivada de un gen (por ejemplo, gen) (región complementaria 1) y una región que no tiene complementariedad de secuencia con la secuencia objetivo de nucleótidos de la región complementaria 1 (región no complementaria 1); (b) la segunda hebra del siNA multifunción comprende una región que tiene complementariedad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico objetivo diferente de la secuencia de ácido nucleico objetivo de la región complementaria 1 (región complementaria 2), con la condición de que, sin embargo, la secuencia de ácido nucleico objetivo para la región complementaria 1 y la secuencia de ácido nucleico objetivo para la región complementaria 2 ambas se deriven del mismo gen, y una región que no tiene complementariedad de secuencia con la secuencia objetivo de nucleótidos de la región complementaria 2 (región no complementaria 2); (c) la región complementaria 1 de la primera hebra comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de la región no complementaria 2 de la segunda hebra y la región complementaria 2 de la segunda hebra comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de la región no complementaria 1 de la primera hebra. En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia multifuncional (siNA multifuncional), en la que el siNA multifuncional comprende dos secuencia complementarias de ácido nucleico en que la primera secuencia comprende una primera región que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos de una primera molécula de ácido nucleico objetivo, y en que la segunda secuencia comprende una primera región que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos diferente de la misma molécula de ácido nucleico objetivo. Preferiblemente, la primera región de la primera secuencia es también complementaria a la secuencia de nucleótidos de la segunda región de la segunda secuencia, y donde la primera región de la segunda secuencia es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la segunda región de la primera secuencia. En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia multifuncional (siNA multifuncional), en la que el siNA multifuncional comprende dos secuencia complementarias de ácido nucleico en que la primera secuencia comprende una primera región que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos de una primera molécula de ácido nucleico objetivo, y en que la segunda secuencia comprende una primera región que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos diferente de una segunda molécula de ácido nucleico objetivo. Preferiblemente, la primera región de la primera secuencia es también complementaria a la secuencia de nucleótidos de la segunda región de la segunda secuencia, y donde la primera región de la segunda secuencia es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la segunda región de la primera secuencia. En una modalidad, la invención presenta una molécula de siNA multifuncional que comprende una primera región y una segunda región, donde la primera región comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene de aproximadamente 18 a aproximadamente 28 nucleótidos complementarios a una secuencia de ácido nucleico de una primera molécula de ácido nucleico objetivo, y la segunda región comprende la secuencia de nucleótidos que tiene de aproximadamente 18 a aproximadamente 28 nucleótidos complementarios a una secuencia diferente de ácido nucleico de una segunda molécula de ácido nucleico objetivo. En una modalidad, la invención presenta una molécula de siNA multifuncional que comprende una primera región y una segunda región, donde la primera región comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene de aproximadamente 18 a aproximadamente 28 nucleótidos complementarios a una secuencia de ácido nucleico de una molécula de ácido nucleico objetivo, y la segunda región comprende la secuencia de nucleótidos que tiene de aproximadamente 18 a aproximadamente 28 nucleótidos complementarios a una secuencia diferente de ácido nucleico de la misma molécula de ácido nucleico objetivo. En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia multifuncional (siNA multifuncional) bicatenaria, en la que una hebra del siNA multifuncional comprende una primera región que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una primera secuencia de ácido nucleico objetivo, y la segunda hebra comprende una primera región que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo. La primera y segunda secuencias de ácido nucleico objetivo pueden estar presentes en moléculas de ácido nucleico objetivo diferentes o pueden ser diferentes regiones de la misma molécula de ácido nucleico objetivo. Así, las moléculas de siNA multifuncionales de la invención pueden usarse para dirigirse contra la expresión de diferentes genes, variantes de ayuste del mismo gen, tanto a regiones mutantes como conservadas de uno o más transcritos génicos, o tanto las secuencias codificantes como no codificantes del mismo o de diferentes genes o transcritos génicos. En una modalidad, una molécula de ácido nucleico objetivo de la invención codifica una única proteína. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico objetivo codifica más de una proteina (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5 o más proteínas). Así, una construcción de siNA multifuncional de la invención puede usarse para regular por disminución o inhibir la expresión de varias proteínas. Por ejemplo, una molécula de siNA multifuncional que comprende una región de una hebra que tiene complementariedad de secuencia nucleotídica con una primera secuencia de ácido nucleico objetivo derivado de un objetivo, y la segunda hebra que comprende una región con complementariedad de secuencia de nucleótidos con una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo presente en moléculas de ácido nucleico objetivo de genes que codifican dos proteínas (por ejemplo, dos proteínas diferentes), que pueden usarse para regular por disminución, inhibir, o terminar una ruta biológica particular al dirigirse contra múltiples genes objetivo de la ruta. En una modalidad la invención se aprovecha de las secuencias de nucleótidos conservadas presentes en diferente variantes génicas. Al diseñar siNA multifuncionales de un modo en el que una hebra incluya una secuencia que sea complementaria a una o más secuencias de ácido nucleico objetivo que se conservan entre diversos miembros de la familia génica objetivo y la otra hebra opcionalmente incluye una secuencia que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico de una ruta objetivo, es posible inhibir de forma selectiva y eficaz un gen objetivo de una ruta biológica relacionada con la enfermedad usando un único siNA multifuncíonal. En una modalidad, un ácido nucleico corto de interferencia multifuncional (siNA multifuncional) de la invención comprende una primera región y una segunda región, en la que la primera región comprende la secuencia de nucleótidos complementaria a un primer ARN objetivo de una primera objetivo y la segunda región comprende la secuencia de nucleótidos complementaria a un segundo ARN objetivo de una segunda objetivo. En una modalidad, la primera y segunda regiones pueden comprender secuencias de nucleótidos complementarias a secuencias de ARN compartidas o conservadas de diferentes sitios objetivo de la misma secuencia objetivo o compartidos por diferentes secuencias objetivo. En una modalidad, una molécula de siNA multifuncional bicatenaria de la invención comprende una estructura que tiene la Fórmula MF-I: 5'-p-X Z X'-3' 3'-Y' Z Y-p-5' en la que cada 5'-p-XZX'-3' y 5'-p-YZY'-3' son independientemente un oligonucleótido con una longitud de aproximadamente 20 nucleótidos a aproximadamente 300 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 200 nucleótidos, de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 nucleótidos, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nucleótidos, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nucleótidos, de aproximadamente 24 a aproximadamente 38 nucleótidos, o de aproximadamente 26 a aproximadamente 38 nucleótidos; XZ comprende una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una primera secuencia de ácido nucleico objetivo; YZ es un oligonucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo; Z comprende la secuencia de nucleótidos con una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 24 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, o 24 nucleótidos) que es autocomplementaria; X comprende la secuencia de nucleótidos con una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 21 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ó 21 nucleótidos) que es complementaria a una secuencia de nucleótidos presentes en la región Y'; Y comprende la secuencia de nucleótidos con una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 21 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ó 21 nucleótidos) que es complementaria a una secuencia de nucleótidos presentes en la región X'; cada p comprende un grupo fosfato terminal que independientemente está presente o ausente; cada XZ e YZ es independientemente de longitud suficiente para interactuar de forma estable (es decir, formar pares de bases) con la primera y segunda secuencias de ácido nucleico objetivo, respectivamente, o una porción de la misma. Por ejemplo, cada secuencia X e Y independientemente puede comprender una secuencia de aproximadamente 12 a aproximadamente 21 o más nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , o más) que es complementaria a una secuencia de nucleótidos objetivo en moléculas de ácido nucleico objetivo diferentes, tales como ARN objetivo o una porción del mismo. En otro ejemplo no limitante, la longitud de la secuencia de nucleótidos de X y Z juntos que es complementaria a la primera secuencia de ácidos nucleicos objetivo o a una porción de la misma tiene de aproximadamente 12 a aproximadamente 21 o más nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , o más). En otro ejemplo no limitante, la longitud de la secuencia de nucleótidos de Y y Z juntos que es complementaria a la primera secuencia de ácidos nucleicos objetivo o a una porción de la misma tiene de aproximadamente 12 a aproximadamente 21 o más nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , o más). En una modalidad, la primera secuencia de ácido nucleico objetivo y la segunda secuencia de ácido nucleico objetivo están presentes en la misma molécula de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ARN objetivo o ARN ruta objetivo). En otra modalidad, la primera secuencia de ácido nucleico objetivo y la segunda secuencia de ácido nucleico objetivo están presentes en moléculas de ácido nucleico objetivo diferentes (por ejemplo, ARN objetivo y ARN de ruta objetivo). En una modalidad, Z comprende un palíndromo o una secuencia repetida. En una modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos X y X' son idénticas. En otra modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos X y X' no son idénticas. En una modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos Y e Y' son idénticas. En otra modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos Y e Y' no son idénticas. En una modalidad, la construcción de oligonucleótido bicatenario de la Fórmula l(a) incluye uno o más, de forma específica 1 , 2, 3 ó 4, emparejamientos erróneos, en tanto en cuanto dichos emparejamientos erróneos no disminuyan significativamente la capacidad del oligonucleótido bicatenario de inhibir la expresión del gen objetivo. En una modalidad, una molécula de siNA multifuncional de la invención comprende una estructura que tiene la Fórmula MF-II: 5'-p-X X'-3' 3'-Y' Y-p-5' en la que cada 5'-p-XX'-3' y 5'-p-YY'-3' son independientemente un oligonucleótido con una longitud de aproximadamente 20 nucleótidos a aproximadamente 300 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 200 nucleótidos, de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 nucleótídos, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nucleótidos, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nucleótidos, de aproximadamente 24 a aproximadamente 38 nucleótidos, o de aproximadamente 26 a aproximadamente 38 nucleótidos; X comprende una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una primera secuencia de ácido nucleico objetivo; Y es un oligonucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo; X comprende una secuencia de nucleótidos con una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 21 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ó 21 nucleótidos) que es complementaria a una secuencia de nucleótidos presentes en la región Y'; Y comprende la secuencia de nucleótidos con una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 21 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ó 21 nucleótidos) que es complementaria a una secuencia de nucleótidos presentes en la región X'; cada p comprende un grupo fosfato terminal que está independientemente presente o ausente; cada X e Y independientemente son de longitud suficiente para interactuar de forma estable (es decir, formar pares de bases) con la primera y segunda secuencias de ácido nucleico objetivo, respectivamente, o una porción de las mismas. Por ejemplo, cada secuencia X e Y independientemente puede comprender una secuencia de aproximadamente 12 a aproximadamente 21 o más nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , o más) que es complementaria a una secuencia de nucleótidos objetivo en moléculas de ácido nucleico objetivo diferentes, tales como ARN objetivo o una porción del mismo. En una modalidad, la primera secuencia de ácido nucleico objetivo y la segunda secuencia de ácido nucleico objetivo están presentes en la misma molécula de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ARN objetivo o ARN ruta objetivo). En otra modalidad, la primera secuencia de ácido nucleico objetivo y la segunda secuencia de ácido nucleico objetivo están presentes en moléculas de ácido nucleico objetivo diferentes (por ejemplo, ARN objetivo y ARN de ruta objetivo). En una modalidad, Z comprende un palíndromo o una secuencia repetida. En una modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos X y X" son idénticas. En otra modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos X y X' no son idénticas. En una modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos Y e Y' son idénticas. En otra modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos Y e Y' no son idénticas. En una modalidad, la construcción de oligonucleótido bicatenario de la Fórmula l(a) incluye uno o más, de forma específica 1 , 2, 3 ó 4, emparejamientos erróneos, en tanto en cuanto dichos emparejamientos erróneos no disminuyan significativamente la capacidad del oligonucleótido bicatenario de inhibir la expresión del gen objetivo. En una modalidad, una molécula de siNA multifuncional de la invención comprende una estructura que tiene la Fórmula MF-lll: X X' Y' V-Y en la que cada X, X', Y, e Y' es independientemente un oligonucleótido con una longitud de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 50 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 18 a aproximadamente 40 nucleótidos, o de aproximadamente 19 a aproximadamente 23 nucleótidos; X comprende la secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos presentes en la región Y'; X' comprende la secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótídos presentes en la región Y; cada X y X' es independientemente de longitud suficiente para interactuar de forma estable (es decir, formar pares de bases) con una primera y una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo, respectivamente, o una porción de la misma; W representa un enlace polinucleotídico o no polinucleotídico que conecta las secuencias Y' e Y; y el siNA multifuncional dirige la escisión de la primera y segunda secuencias objetivo mediante interferencia del ARN. En una modalidad, la primera secuencia de ácido nucleico objetivo y la segunda secuencia de ácido nucleico objetivo están presentes en la misma molécula de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ARN objetivo o ARN ruta objetivo). En otra modalidad, la primera secuencia de ácido nucleico objetivo y la segunda secuencia de ácido nucleico objetivo están presentes en moléculas de ácido nucleico objetivo diferentes (por ejemplo, ARN objetivo y ARN de ruta objetivo). En una modalidad, la región W conecta el extremo 3' de la secuencia Y' con el extremo 3' de la +secuencia Y. En una modalidad, la región W conecta el extremo 3' de la secuencia Y' con el extremo 5' de la +secuencia Y. En una modalidad, la región W conecta el extremo 5' de la secuencia Y' con el extremo 5' de la +secuencia Y. En una modalidad, la región W conecta el extremo 5' de la secuencia Y' con el extremo 3" de la +secuencia Y. En una modalidad, hay un grupo fosfato terminal en el extremo 5' de la secuencia X. En una modalidad, hay un grupo fosfato terminal en el extremo 5' de la secuencia X'. En una modalidad, hay un grupo fosfato terminal en el extremo 5' de la secuencia Y. En una modalidad, hay un grupo fosfato terminal en el extremo 5' de la secuencia Y'. En una modalidad, W conecta las secuencias Y e Y' mediante un enlazador biodegradable. En una modalidad, W comprende además un conjugado, marcador, aptámero, ligando, lípido, o polimero. En una modalidad, una molécula de siNA multifuncional de la invención comprende una estructura que tiene la Fórmula MF-IV: X X1 Yf-W-Y en la que cada X, X', Y, e Y' es independientemente un oligonucleótido con una longitud de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 50 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 18 a aproximadamente 40 nucleótidos, o de aproximadamente 19 a aproximadamente 23 nucleótidos; X comprende la secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos presentes en la región Y'; X' comprende la secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos presentes en la región Y; cada Y e Y' es independientemente de longitud suficiente para interactuar de forma estable (es decir, formar pares de bases) con una primera y una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo, respectivamente, o una porción de la misma; W representa un enlace polinucleotídico o no polinucleotídico que conecta las secuencias Y' e Y; y el siNA multifuncional dirige la escisión de la primera y segunda secuencias objetivo mediante interferencia del ARN. En una modalidad, la primera secuencia de ácido nucleico objetivo y la segunda secuencia de ácido nucleico objetivo están presentes en la misma molécula de ácido nucleico objetivo. En otra modalidad, la primera secuencia de ácido nucleico objetivo y la segunda secuencia de ácido nucleico objetivo están presentes en moléculas de ácido nucleico objetivo diferentes. En una modalidad, la región W conecta el extremo 3' de la secuencia Y' con el extremo 3' de la +secuencia Y. En una modalidad, la región W conecta el extremo 3' de la secuencia Y' con el extremo 5' de la +secuencia Y. En una modalidad, la región W conecta el extremo 5' de la secuencia Y' con el extremo 5' de la +secuencia Y. En una modalidad, la región W conecta el extremo 5' de la secuencia Y' con el extremo 3' de la +secuencia Y. En una modalidad, hay un grupo fosfato terminal en el extremo 5' de la secuencia X. En una modalidad, hay un grupo fosfato terminal en el extremo 5' de la secuencia X'. En una modalidad, hay un grupo fosfato terminal en el extremo 5' de la secuencia Y. En una modalidad, hay un grupo fosfato terminal en el extremo 5' de la secuencia Y'. En una modalidad, W conecta las secuencias Y e Y' mediante un enlazador biodegradable. En una modalidad, W comprende además un conjugado, marcador, aptámero, ligando, lípido, o polímero. En una modalidad, una molécula de siNA multifuncional de la invención comprende una estructura que tiene la Fórmula MF-V: X Xf Y'-W-Y en la que cada X, X', Y, e Y' es independientemente un oligonucleótido con una longitud de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 50 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 18 a aproximadamente 40 nucleótidos, o de aproximadamente 19 a aproximadamente 23 nucleótidos; X comprende la secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos presentes en la región Y'; X' comprende la secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos presentes en la región Y; cada X, X', Y e Y' es independientemente de longitud suficiente para interactuar de forma estable (es decir, formar pares de bases) con una primera, segunda, tercera o cuarta secuencia de ácido nucleico objetivo, respectivamente, o una porción de la misma; W representa un enlace polinucleotídico o no polinucleotídico que conecta las secuencias Y' e Y; y el siNA multifuncional dirige la escisión de la primera, segunda, tercera y/o cuarta secuencias objetivo mediante interferencia del ARN. En una modalidad, la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de ácido nucleico objetivo están todas presentes en la misma molécula de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ARN objetivo o ARN de ruta objetivo). En otra modalidad, la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de ácido nucleico objetivo independientemente están presentes en moléculas de ácido nucleico objetivo diferentes (por ejemplo, ARN objetivo y ARN de ruta objetivo). En una modalidad, la región W conecta el extremo 3' de la secuencia Y' con el extremo 3' de la +secuencia Y. En una modalidad, la región W conecta el extremo 3' de la secuencia Y' con el extremo 5' de la +secuencia Y. En una modalidad, la región W conecta el extremo 5' de la secuencia Y' con el extremo 5' de la +secuencia Y. En una modalidad, la región W conecta el extremo 5' de la secuencia Y' con el extremo 3' de la +secuencia Y. En una modalidad, hay un grupo fosfato terminal en el extremo 5' de la secuencia X. En una modalidad, hay un grupo fosfato terminal en el extremo 5' de la secuencia X'. En una modalidad, hay un grupo fosfato terminal en el extremo 5' de la secuencia Y. En una modalidad, hay un grupo fosfato terminal en el extremo 5' de la secuencia Y'. En una modalidad, W conecta las secuencias Y e Y' mediante un enlazador biodegradable. En una modalidad, W comprende además un conjugado, marcador, aptámero, ligando, lípido, o polímero. En una modalidad, las regiones X e Y de la molécula de siNA multifuncional de la invención (por ejemplo, que tiene cualquiera de las Fórmulas MF-I - MF-V), son complementarias a diferentes secuencias de ácido nucleico objetivo que son porciones de la misma molécula de ácido nucleico objetivo. En una modalidad, dichas secuencias de ácido nucleico objetivo están en diferentes localizaciones de la región codificante de un transcrito de ARN. En una modalidad, dichas secuencias de ácido nucleico objetivo comprenden regiones codificantes y no codificantes del mismo transcrito de ARN. En una modalidad, dichas secuencias de ácido nucleico objetivo comprenden regiones transcritos con ayustes alternativos o precursores de dichos transcritos con ayustes alternativos. En una modalidad, una molécula de siNA multifuncional que tiene cualquiera de las Fórmulas MF-I - MF-V puede comprender modificaciones químicas tal como se describe en el presente documento sin limitación, tal como, por ejemplo, nucleótidos que tienen cualquiera de las Fórmulas l-VII que se describen en el presente documento, estructuras de estabilización tal como se describe en el cuadro I, o cualquier otra combinación de nucleótidos y no nucleótidos modificados tal como se describe en las diversas modalidades del presente documento. En una modalidad, el palíndromo o secuencia repetida o nucleótido modificado (por ejemplo, nucleótido con una base modificada, tal como 2-amino purina o una base universal) en Z de las construcciones de siNA multifuncional que tienen la Fórmula MF-I o MF-II, comprende nucleótidos químicamente modificados que tienen capacidad de interactuar con una porción de la secuencia de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, análogos con bases modificadas que pueden formar pares de bases Watson Crick o pares de bases distintas de Watson Crick). En una modalidad, una molécula de siNA multifuncional de la invención, por ejemplo cada hebra de un siNA multifuncional que tiene MF-I -MF-V, independientemente comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ó 40 nucleótidos). En una modalidad, una molécula de siNA multifuncional de la invención comprende una o más modificaciones químicas. En un ejemplo no limitante, la introducción de nucleótidos y/o no nucleótidos químicamente modificados en moléculas de ácido nucleico de la invención proporciona una herramienta poderosa para solventar las potenciales limitaciones de la estabilidad y biodisponibilidad in vivo inherentes a moléculas de ARN sin modificar que se administran de forma exógena. Por ejemplo, el uso de moléculas de ácido nucleico modificadas químicamente puede permitir una dosis menor de una molécula particular de ácido nucleico para un efecto terapéutico dado ya que las moléculas de ácido nucleico modificadas químicamente tienden a tener una semivida mayor en suero o en células o tejidos. Además, ciertas modificaciones químicas pueden mejorar la biodisponibilidad y/o potencia de las moléculas de ácido nucleico no solo mejorando la semivida sino también facilitando la dirección de moléculas de ácido nucleico a órganos, células o tejidos particulares y/o mejorando la captación celular de las moléculas de ácido nucleico. Por lo tanto, incluso si se reduce la actividad de una molécula de ácido nucleico químicamente modificada in vitro comparada con una molécula de ácido nucleico nativa/sin modificar, por ejemplo cuando se compara con una molécula de ARN sin modificar, la actividad total de la molécula de ácido nucleico modificada puede ser mayor que la de la molécula de ácido nucleico nativa o sin modificar debido a una estabilidad, potencia, duración del efecto, biodisponibilidad y/o administración mejoradas de la molécula. En otra modalidad, la invención presenta siNA multifuncionales, en los que los siNA multifuncionales se ensamblan a partir de dos siNA bicatenarios separados, con uno de los extremos de cada hebra codificante anclado al extremo de la hebra codificante de la otra molécula de siNA, de tal forma que las dos hebras no codificantes de siNA se hibridan a su hebra codificante correspondiente que están ancladas entre sí en un extremo (véase las Figuras 19A-19D). Los enclavadores o enlazadores pueden ser enlazadores con base nucleotídica o no nucleotídica tal como se conoce de forma general en la técnica y tal como se describe en el presente documento. En una modalidad, la invención presenta un siNA multifuncional, en el que el siNA multifuncional se monta a partir de dos siNA bicatenarios separados, con el extremo 5' de una hebra codificante del siNA anclado al extremo 5' de la hebra codificante de la otra molécula de siNA, de tal forma que los extremos 5' de las dos hebras no codificantes de siNA se hibridan a su hebra codificante correspondiente que están ancladas entre sí en un extremo, de espaldas (en direcciones opuestas) la una a la otra (véase la Figura 19 (A)). Los enclavadores o enlazadores pueden ser enlazadores con base nucleotídica o no nucleotídica tal como se conoce de forma general en la técnica y tal como se describe en el presente documento. En una modalidad, la invención presenta un siNA multífuncional, en el que el siNA multifuncional se monta a partir de dos siNA bicatenarios separados, con el extremo 3' de una hebra codificante del siNA anclado al extremo 3' de la hebra codificante de la otra molécula de siNA, de tal forma que los extremos 5' de las dos hebras no codificantes de siNA se hibridan a su hebra codificante correspondiente que están ancladas entre sí en un extremo, mirándose la una a la otra (véase la Figura 19(B)). Los enclavadores o enlazadores pueden ser enlazadores con base nucleotídica o no nucleotídica tal como se conoce de forma general en la técnica y tal como se describe en el presente documento.

En una modalidad, la invención presenta un siNA multifuncional, en el que el siNA mulfifuncional se monta a partir de dos siNA bicatenarios separados, con el extremo 5' de una hebra codificante del siNA anclado al extremo 3' de la hebra codificante de la otra molécula de siNA, de tal forma que los extremos 5' de las una de las dos hebras no codificantes de siNA se hibridan a su hebra codificante correspondiente que están ancladas entre si en un extremo, de frente al extremo 3' de la otra hebra no codificante (véase las Figuras 19A-19H). Los enclavadores o enlazadores pueden ser enlazadores con base nucleotídíca o no nucleotídica tal como se conoce de forma general en la técnica y tal como se describe en el presente documento. En una modalidad, la invención presenta un siNA multifuncional, en el que el siNA multifuncional se monta a partir de dos siNA bicatenarios separados, con el extremo 5' de una hebra no codificante del siNA anclado al extremo 3' de la hebra no codificante de la otra molécula de siNA, de tal forma que los extremos 5' de las una de las hebras codificantes de siNA se hibridan a su hebra no codificante correspondiente que están ancladas entre sí en un extremo, de frente al extremo 3' de la otra hebra codificante (véase la Figura 19(G-H)). En una modalidad, el enlace entre el extremo 5' de la primera hebra no codificante y el extremo 3' de la segunda hebra no codificante se diseña de tal forma que pueda escindirse fácilmente (por ejemplo, un enlazador biodegradable) de tal forma que el extremo 5' de cada hebra no codificante del siNA multifuncíonal tenga un extremo 5' libre adecuado para mediar la escisión del ARN objetivo que se basa en la interferencia del ARN. Los enclavadores o enlazadores pueden ser enlazadores con base nucleotídica o no nucleotídica tal como se conoce de forma general en la técnica y tal como se describe en el presente documento. En una modalidad, la invención presenta un siNA multifuncional, en el que el siNA multifuncional se monta a partir de dos siNA bicatenarios separados, con el extremo 5' de una hebra no codificante del siNA anclado al extremo 5' de la hebra no codificante de la otra molécula de siNA, de tal forma que los extremos 3' de las una de las hebras codificantes de siNA se hibridan a su hebra no codificante correspondiente que están ancladas entre sí en un extremo, de frente al extremo 3' de la otra hebra codificante (véase la Figura 22 (E)). En una modalidad, el enlace entre el extremo 5' de la primera hebra no codificante y el extremo 5' de la segunda hebra no codificante se diseña de tal forma que pueda escindirse fácilmente (por ejemplo, un enlazador biodegradable) de tal forma que el extremo 5' de cada hebra no codificante del siNA multifuncional tenga un extremo 5' libre adecuado para mediar la escisión del ARN objetivo que se basa en la interferencia del ARN. Los enclavadores o enlazadores pueden ser enlazadores con base nucleotídica o no nucleotídica tal como se conoce de forma general en la técnica y tal como se describe en el presente documento. En una modalidad, la invención presenta un siNA multifuncional, en el que el siNA multifuncional se monta a partir de dos siNA bicatenarios separados, con el extremo 3' de una hebra no codificante del siNA anclado al extremo 3' de la hebra no codificante de la otra molécula de siNA, de tal forma que los extremos 5' de las una de las hebras codificantes de siNA se hibridan a su hebra no codificante correspondiente que están ancladas entre sí en un extremo, de frente al extremo 3' de la otra hebra codificante (véase la Figura 22 (F)). En una modalidad, el enlace entre el extremo 5' de la primera hebra no codificante y el extremo 5' de la segunda hebra no codificante se diseña de tal forma que pueda escindirse fácilmente (por ejemplo, un enlazador biodegradable) de tal forma que el extremo 5' de cada hebra no codificante del siNA multifuncional tenga un extremo 5' libre adecuado para mediar la escisión del ARN objetivo que se basa en la interferencia del ARN. Los enclavadores o enlazadores pueden ser enlazadores con base nucleotídica o no nucleotídica tal como se conoce de forma general en la técnica y tal como se describe en el presente documento. En cualquiera de las modalidades anteriores, una primera secuencia de ácido nucleico objetivo o una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo pueden comprender independientemente ARN o ADN objetivo o una porción de los mismos. En una modalidad, la primera secuencia de ácido nucleico objetivo es un ARN o ADN objetivo o una porción de los mismos y la segunda secuencia de ácido nucleico objetivo es un ARN o ADN objetivo o una porción de los mismos. En una modalidad, la primera secuencia de ácido nucleico objetivo es un ARN o ADN objetivo o una porción de los mismos y la segunda secuencia de ácido nucleico objetivo es a otro ARN o ADN objetivo o una porción de los mismos.

Síntesis de moléculas de ácido nucleico La sintesis de ácidos nucleicos de más de 100 nucleótidos de longitud es difícil usando procedimientos automatizados, y el coste terapéutico de dichas moléculas es prohibitivo. En esta invención, preferiblemente se usan motivos de ácido nucleico cortos ("cortos" se refiere a motivos de ácido nucleico de no más de 100 nucleótidos de longitud, preferiblemente de no más de 80 nucleótidos de longitud, y lo más preferiblemente de no más de 50 nucleótidos de longitud; por ejemplo, secuencias oligonucleotídicas de siNA individuales o secuencias de siNA sintetizadas en tándem) para la administración exógena. La simple estructura de estas moléculas aumenta la capacidad del ácido nucleico de invadir las regiones objetivo de la estructura de la proteína y/o ARN. Las moléculas ejemplares de la presente invención se sintetizan químicamente y es posible sintetizar otras de forma similar. Los oligonucleótidos (por ejemplo, ciertos oligonucleótidos modificados o porciones de oligonucleótidos que carecen de ribonucleótidos) se sintetizan usando protocolos conocidos en la técnica, por ejemplo tal como se describe en Caruthers y cois., 1992, Methods in Enzymology 211 , 3-19, Thompson y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 99/54459, Wincott y cois., 1995, Nucleic Acid Res.. 23, 2677-2684, Wincott y cois., 1997, Methods Mol. Bio., 1A, 59, Brennan y cois., 1998, Biotechnol Bioeng., 61 , 33-45, y Brennan, patente de Estados Unidos nJ 6,001 ,311. Todas estas referencias se incorporan al presente documento por referencia. La síntesis de oligonucleótidos emplea grupos protectores y de acoplamiento de ácidos nucleicos habituales, tales como dimetoxitritilo en el extremo 5', y fosforamiditas en el extremo 3'. En un ejemplo no limitante, se realizan síntesis a pequeña escala en un sintetizador 394 de Applied Biosystems, Inc. usando un protocolo de escala 0.2 µmol con una etapa de acoplamiento de 2.5 min. para los nucleótidos 2'-O-metilados y una etapa de acoplamiento de 45 segundos para los nucleótidos de 2'-desoxi o para los nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro. El cuadro lll resume las cantidades y los tiempos de contacto de los reactivos que se usan en el ciclo de síntesis. De forma alternativa, la síntesis a escala de 0.2 µmol puede realizarse en un sintetizador de placas de 96 pocilios, tal como el instrumento producido por Protogene (Palo Alto, CA) con una modificación mínima del ciclo. Puede usarse un exceso de 33 veces (60 µl de 0.11 M = 6.6 µmol) de 2'-O-metil fosforamidita y un exceso de 105 veces de S-etil-tetrazol (60 µl de 0.25 M = 15 µmol) en cada ciclo de acoplamiento de restos de 2'-O-metilo relativos a 5'-hidroxilo unido a polímero. Puede usarse un exceso de 22 veces (40 µl de 0.11 M = 4.4 µmol) de desoxi fosforamidita y un exceso de 70 veces de S-etil tetrazol (40 µl de 0.25 M = 10 µmol) en cada ciclo de acoplamiento de restos desoxi relativos a 5'-hidroxilo unido a polímero. Los rendimientos de acoplamiento medios en el sintetizador 394 de Applied Biosystems, Inc. determinados mediante cuantificación colorimétrica de las fracciones de trifilo, son habitualmente de 97.5-99%. Otros reactivos para la síntesis de oligonucleótidos para el sintetizador 394 de Applied Biosystems, Inc. incluyen los siguientes: la solución de destritilación es de 3% de TCA en cloruro de metileno (ABl); la introducción de la caperuza se realiza con 16% de ?/-metil imidazol en THF (ABl) y 10% de anhídrido acético/10% de 2,6-lutidina en THF (ABl); y la solución de destritilación es l2 16.9 mM, piridina 49 mM, 9% de agua en THF (PerSeptive Biosystems, Inc.). Se usa acetonitrilo de calidad de síntesis de Burdick & Jackson directamente del frasco del reactivo. Se prepara la solución de S-etiltetrazol (0.25 M en acetonitrilo) a partir del sólido obtenido de American International Chemical, Inc. De forma alternativa, para la introducción de los enlaces de fosforotioato, se usa reactivo Beaucage (1 ,1-dióxido de 3H-1 ,2-benzoditiol-3-ona, 0.05 M en acetonitrilo). La desprotección de los oligonucleótidos con base de ADN se realiza de la forma siguiente: el oligorribonucleótido sobre tritilo unido a polímero se transfiere a un vial de cristal de 4 ml con tapa a rosca y se suspende en una solución de 40% de metilamina acuosa (1 ml) a 65 °C durante 10 minutos. Después de enfriar a -20 °C, se retira el sobrenadante del soporte polimérico. El soporte se lava tres veces con 1 ,0 ml de EtOH:MeCN:H2O/3:1 :1 , se agita en vórtice y después se añade el sobrenadante al primer sobrenadante. Los sobrenadantes combinados, que contenían el oligorribonucleótido, se secan a un polvo blanco. En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención se sintetizan, se desprotegen y se analizan de acuerdo con procedimientos que se describen en los documentos US 6,995,259, US 6,686,463, US 6,673,918, US 6,649,751 , US 6,989,442, y USSN 10/190,359, todos los cuales se incorporan por referencia al presente documento en su totalidad.

El procedimiento de síntesis que se usa para el ARN que incluye ciertas moléculas de siNA de la invención sigue el procedimiento que se describe en Usman y cois., 1987, J. Am. Chem. Soc, 109, 7845; Scaringe y cois., 1990, Nucleic Acid Res.., 18, 5433; y Wincott y cois., 1995, Nucleic Acid Res.. 23, 2677-2684 Wincott y cois., 1997, Methods Mol. Bio., 74, 59, y emplea grupos protectores y de acoplamiento de ácidos nucleicos habituales, tales como dimetoxitritilo en el extremo 5', y fosforamiditas en el extremo 3'. En un ejemplo no limitante, se realizan síntesis a pequeña escala en un sintetizador 394 de Applied Biosystems, Inc. usando un protocolo de escala 0.2 µmol con una etapa de acoplamiento de 7.5 min. para los nucleótidos protegidos con alquilsililo y una etapa de acoplamiento de 2.5 minutos para los nucleótidos 2'-O-metilados. El cuadro lll resume las cantidades y los tiempos de contacto de los reactivos que se usan en el ciclo de síntesis. De forma alternativa, la síntesis a escala de 0.2 µmol puede realizarse en un sintetizador de placas de 96 pocilios, tal como el instrumento producido por Protogene (Palo Alto, CA) con una modificación mínima del ciclo. Puede usarse un exceso de 33 veces (60 µl de 0.11 M = 6.6 µmol) de 2'-0-metil fosforamidita y un exceso de 75 veces de S-etil-tetrazol (60 µl de 0.25 M = 15 µmol) en cada ciclo de acoplamiento de restos de 2'-0-metilo relativos a 5'-hidroxilo unido a polimero. Puede usarse un exceso de 66 veces (120 µl de 0.11 M = 13.2 µmol) de fosforamidita protegida con alquilsilil(rribo)y un exceso de 150 veces de S-etil tetrazol (120 µl de 0.25 M = 30 µmol) en cada ciclo de acoplamiento de restos ribo relativos a 5'-hidroxilo unido a polímero. Los rendimientos de acoplamiento medios en el sintetizador 394 de Applied Biosystems, Inc. determinados mediante cuantificación colorimétrica de las fracciones de tritilo, son habitualmente de 97.5-99%. Otros reactivos para la síntesis de oligonucleótidos para el sintetizador 394 de Applied Biosystems, Inc. incluyen los siguientes: la solución de destritilación es de 3% de TCA en cloruro de metileno (ABl); la introducción de la caperuza se realiza con 16% de ?/-metil imidazol en THF (ABl) y 10% de anhídrido acético/10% de 2,6-lutidina en THF (ABl); la solución de destritilación es l2 16.9 mM, piridina 49 mM, 9% de agua en THF (PerSeptive Biosystems, Inc.). Se usa acetonitrilo de calidad de síntesis de Burdick & Jackson directamente del frasco del reactivo. Se prepara la solución de S-etiltetrazol (0.25 M en acetonitrilo) a partir del sólido obtenido de American International Chemical, Inc. De forma alternativa, para la introducción de los enlaces de fosforotioato, se usa reactivo Beaucage (1 ,1 -dióxido de 3H-1 ,2-benzoditiol-3-ona, 0.05 M en acetonitrilo). La desprotección del ARN se realiza usando un protocolo de un único recipiente o de dos recipientes. Para el protocolo de dos recipientes el oligorribonucleótido sobre tritilo unido a polímero se transfiere a un vial de cristal de 4 ml con tapa a rosca y se suspende en una solución de 40% de metilamina acuosa (1 ml) a 65 °C durante 10 min.. Después de enfriar a -20 °C, se retira el sobrenadante del soporte polimérico. El soporte se lava tres veces con 1.0 ml de EtOH:MeCN:H2O/3:1 :1 , se agita en vórtice y después se añade el sobrenadante al primer sobrenadante. Los sobrenadantes combinados, que contenían el oligorribonucleótido, se secan a un polvo blanco. El oligorribonucleótido desprotegido con base se resuspende en solución de TEA anhidro/HF/NMP (300 µl de una solución de 1.5 ml N-metilpirrolidinona, 750 µl de TEA y 1 ml de TEA*3HF proporcionando una concentración 1.4 M de HF) y se calienta a 65 °C. Después de 1.5 h, el oligómero se inactiva con NH4HCO3 1.5 M. En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención se sintetizan, se desprotegen y se analizan de acuerdo con procedimientos que se describen en los documentos US 6,995,259, US 6,686,463, US 6,673,918, US 6,649,751 , US 6,989,442, y USSN 10/190,359, todos los cuales se incorporan por referencia al presente documento en su totalidad. De forma alternativa, para el protocolo de recipiente único, el oligorribonucleótido sobre tritilo unido a polímero se transfiere a un vial de cristal de 4 ml con tapa a rosca y se suspende en una solución de 33% de metilamina etanólica/DMSO 1/1 (0.8 ml) a 65 °C durante 15 minutos. eL vial se lleva a temperatura ambiente, se añade TEA-3HF (0.1 ml) y el vial se calienta a 65 °C durante 15 minutos. La muestra se enfría a -20 °C y después se inactiva con NH4HCO3 1.5 M. Para la purificación de los oligómeros sobre tritilo, la solución de NH4HCO3 inactivada se carga en un cartucho que contiene C-18 que se ha prelavado con acetonitrilo seguido de TEAA 50 mM. Después de lavar el cartucho cargado con agua, se destritila el ARN con 0.5% de TFA durante 13 minutos. Después el cartucho se lava de nuevo con agua, se realiza el intercambio salino con NaCI 1 M y se lava con agua de nuevo. Después el oligonucleótido se diluye con 30% de acetonitrilo. Los rendimientos medios del acoplamiento por etapas son habitualmente de >98% (Wincott y cois., 1995 Nucleic Acid Res.. 23, 2677-2684). Las personas de experiencia ordinaria en la técnica reconocerán que la escala de síntesis puede adaptarse para que sea mayor o menor que el ejemplo que se describe anteriormente que incluye pero sin limitación un formato de 96 pocilios. De forma alternativa, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden sintetizarse por separado y unirse postsintéticamente, por ejemplo, por ligado (Moore y cois., 1992, Science 256, 9923; Draper y cois., publicación internacional PCT nJ WO 93/23569; Shabarova y cois., 1991 , Nucleic Acid Research 19, 4247; Bellon y cois., 1997, Nucleosides & Nucleotides, 16, 951 ; Bellon y cois., 1997, Bioconjugate Chem. 8, 204), o mediante hibridización tras la sintesis y/o desprotección. Las moléculas de siNA de la invención también pueden sintetizarse por una metodología de síntesis en tándem tal como se describe en el Ejemplo 1 del presente documento, en la que ambas hebras de siNA se sintetizan en forma de un único fragmento o hebra oligonucleotídicos continuos separados por un enlazador escindible que posteriormente se escinde proporcionando fragmentos o hebras de siNA separados que se hibridan y permiten la purificación de la molécula bicatenaria de siNA. El enlazador puede ser un enlace polinucleotídico o un enlace no polinucleotídico. La sintesis en tándem de siNA tal como se describe en el presente documento puede ser adaptarse fácilmente a la sintesis en plataformas tanto de múltiples pocilios como de placas múltiples tales como de 96 pocilios o de forma similar plataformas más grandes de pocilios múltiples. La síntesis en tándem de siNA tal como se describe en el presente documento también puede adaptarse fácilmente a las plataformas de sintesis a gran escala que emplean reactores de lotes, columnas de síntesis y similares. Una molécula de siNA también puede ensamblarse a partir de dos hebras o fragmentos de ácido nucleico diferentes en las que un fragmento incluye la región codificante y el segundo fragmento incluye la región no codificante de la molécula de ARN. Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden modificarse extensamente para potenciar la estabilidad mediante la modificación con grupos resistentes a nucleasas, por ejemplo, 2'-amino, 2'-C-alilo, 2'-fluoro, 2'-O-metilo, 2'-H (para una revisión véase Usman y Cedergren, 1992, TIBS 17, 34; Usman y cois., 1994, Nucleic Acid Symp. Ser. 31 , 163). Las construcciones de siNA pueden purificarse mediante electroforesis en gel usando procedimientos generales o puede purificarse mediante cromatografía líquida a presión elevada (HPLC; véase Wincott y cois., referencia anterior, cuya totalidad se incorpora por la presente al presente documento por referencia) y se resuspende en agua.

En otro aspecto de la invención, las moléculas de siNA de la invención se expresan a partir de unidades de transcripción que se insertan en vectores de ADN o ARN. Los vectores recombinantes pueden ser plásmidos o vectores víricos de ADN. Los vectores víricos que expresan siNA pueden construirse basándose, pero sin limitación a, en virus adenoasociados, retrovirus, adenovirus, o alfavirus. Los vectores recombinantes con capacidad de expresar las moléculas de siNA pueden administrarse tal como se describe en el presente documento, y persistir en células objetivo. De forma alternativa, pueden usarse vectores víricos que proporcionan la expresión transitoria de las moléculas de siNA.

Optimización de la actividad de la molécula de ácido nucleico de la invención. La síntesis química de las moléculas de ácido nucleico con modificaciones (base, azúcar y/o fosfato) puede evitar su degradación mediante ribonucleasas de suero, que pueden aumentar su potencia (véase por ejemplo, Eckstein y cois., publicación de patente internacional nJ WO 92/07065; Perrault y cois., 1990 Nature 344, 565; Pieken y cois., 1991 , Science 253, 314; Usman y Cedergren, 1992, Trends en Biochem. Sci. 17, 334; Usman y cois., publicación de patente internacional nJ WO 93/15187; y Rossi y cois., publicación de patente internacional nJ WO 91/03162; Sproat, U.S. Estados Unidos nJ 5,334,711 ; Gold y cois., patente de Estados Unidos nJ 6,300,074; y Burgin y cois., referencia anterior; todos los cuales se incorporan por referencia al presente documento). Todas las referencias anteriores describen diversas modificaciones químicas que pueden realizarse en los restos de base, fosfato y/o azúcar de las moléculas de ácido nucleico tal como se describe en el presente documento. Las modificaciones que potencian su eficacia en las células, y la eliminación de las bases de las moléculas de ácido nucleico para acortar los tiempos de síntesis de los oligonucleótido y reducir las necesidades de sustancias químicas son deseables. Existen diversos ejemplos en la técnica que describen modificaciones de azúcar, base y fosfato que pueden introducirse en las moléculas de ácido nucleico con potenciación significativa de su estabilidad y eficacia como nucleasas. Por ejemplo, los oligonucleótidos se modifican para potenciar la estabilidad y/o potenciar la actividad biológica mediante modificación con grupos resistentes a nucleasas, por ejemplo, modificaciones 2'-amino, 2'-C-alilo, 2'-fluoro, 2'-O-metilo, 2'-O-alilo, 2'-H, en las bases de los nucleótidos (para una revisión véase Usman y Cedergren, 1992, TIBS. 17, 34; Usman y cois., 1994, Nucleic Acid Symp. Ser. 31 , 163; Burgin y cois., 1996, Biochemistry, 35, 14090). La modificación de los azúcares de las moléculas de ácido nucleico se ha descrito extensamente en la técnica (véase Eckstein y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 92/07065; Perrault y cois. Nature, 1990, 344, 565-568; Pieken y cois. Science, 1991 , 253, 314-317; Usman y Cedergren, Trends en Biochem. Sci., 1992, 11, 334-339; Usman y cois, publicación de patente internacional PCT nJ WO 93/15187; Sproat, patente de Estados Unidos nJ 5,334,711 y Beigelman y cois., 1995, J. Biol. Chem., 270, 25702; Beigelman y cois., publicación internacional PCT n.° WO 97/26270; Beigelman y cois., patente de Estados Unidos nJ 5,716,824; Usman y cois., patente de Estados Unidos nJ 5,627,053; Woolf y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 98/13526; Thompson y cois., documento USSN 60/082,404 que se presentó el 20 de abril de 1998; Karpeisky y cois., 1998, Tetrahedron Lett., 39, 1131 ; Earnshaw y Gait, 1998, Biopollymers (Nucleic Acid Sciences), 48, 39-55; Verma y Eckstein, 1998, Annu. Rev. Biochem., 67, 99-134; y Burlina y cois., 1997, Bioorg. Med. Chem., 5, 1999-2010; todas las referencias se incorporan por la presente en su totalidad por referencia al presente documento). Dichas publicaciones describen procedimientos y estrategias generales para determinar la localización de la incorporación de las modificaciones de azúcar, base y/o fosfato y similares en la catálisis de moléculas de ácido nucleico sin modular y se incorporan por referencia al presente documento. A la vista de dichas enseñanzas, pueden usarse modificaciones similares tal como se describe en el presente documento para modificar las moléculas de ácido nucleico de modificaciones de la presente invención en tanto que no se inhiba de forma significativa la capacidad de siNA de promover la ARNi en las células. En una modalidad, una molécula de ácido nucleico de la invención se modifica químicamente tal como se describe en el documento US 20050020521 , que se incorpora por referencia al presente documento en su totalidad.

Aunque la modificación química de los enlaces internucleotídicos de los oligonucleótidos con enlaces fosforotioato, fosforoditioato, y/o 5'-metilfosfonato mejora la estabilidad, las modificaciones excesivas pueden provocar alguna toxicidad o menor actividad. Por lo tanto, cuando se diseñan moléculas de ácido nucleico, debería minimizarse la cantidad de estos enlaces internucleotídicos. La reducción de la concentración de estos enlaces debería reducir la toxicidad, produciendo una mayor eficacia y especificidad de estas moléculas. Se proporcionan moléculas de ácido nucleico corto de interferencia (siNA) que tienen modificaciones químicas que mantienen o mejoran la actividad. Ese ácido nucleico también de forma general es más resistente a nucleasas que un ácido nucleico sin modificar. Por consiguiente, no debería reducirse significativamente la actividad in vitro y/o in vivo. En los casos en los que el objetivo es la modulación, las moléculas de ácido nucleico terapéuticas administradas exógenamente deberían ser óptimamente estables en el interior de las células hasta que la traducción del ARN objetivo haya sido modulada lo suficiente para reducir los niveles de la proteína no deseable. Este periodo de tiempo varía de horas a dias dependiendo del estado de enfermedad. Las mejoras de la síntesis química de ARN y ADN (Wincott y cois., 1995, Nucleic Acid Res.. 23, 2677; Caruthers y cois., 1992, Methods in Enzymology 211 , 3-19 (que se incorpora por referencia al presente documento)) han expandido la capacidad de modificar las moléculas de ácido nucleico introduciendo modificaciones nucleotídicas para potenciar su estabilidad contra las nucleasas, tal como se describe anteriormente. En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) nucleótidos G-clamp. Un nucleótido G-clamp es un análogo de citosina modificado en el que las modificaciones confieren la capacidad de formar enlaces de hidrógeno de ambas caras, Watson-Crick y Hoogsteen, de una guanina complementaria en una molécula bicatenaria, véase por ejemplo Lin y Matteucci, 1998, J. Am. Chem. Soc, 120, 8531-8532. Una única sustitución de análogo de G-clamp en un oligonucleótido puede producir una estabilidad térmica sustancialmente mejorada y discriminación de emparejamientos erróneos cuando se hibrida a oligonucleótidos complementarios. La inclusión de dichos nucleótidos en moléculas de ácido nucleico de la invención produce tanto mayor afinidad como especificidad contra las objetivos de ácido nucleico, secuencias complementarias, o hebras de plantilla. En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) LNA nucleótidos de "ácido nucleico bloqueado" tales como un 2', 4'-C metilembiciclonucleótido (véase por ejemplo Wengel y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 00/66604 y WO 99/14226). En otra modalidad, la invención presenta conjugados y/o complejos de moléculas de siNA de la invención. Dichos conjugados y/o complejos pueden usarse para facilitar la administración de moléculas de siNA en un sistema biológico, tal como una célula. Los conjugados y complejos que proporciona la presente invención pueden conferir actividad terapéutica al transferir compuestos terapéuticos a través de membranas celulares, alterando la farmacocinéticas y/o modular la localización de moléculas de ácido nucleico de la invención. La presente invención engloba el diseño y sintesis de conjugados y complejos novedosos para la administración de moléculas, que incluyen, pero sin limitación, moléculas cortas, lípidos, colesterol, fosfolípidos, nucleósidos, nucleótidos, ácidos nucleicos, anticuerpos, toxinas, polímeros con cargas negativas y otros polímeros, por ejemplo proteínas, péptidos, hormonas, carbohidratos, polietilenglicoles, o poliaminas, a través de membranas celulares. En general, los transportadores que se describen están diseñados para usarse o bien individualmente o como parte de un sistema multicomponente, con o sin enlazadores degradables. Es de esperar que estos compuestos mejoren la administración y/o localización de moléculas de ácido nucleico de la invención en un número de tipos de células que se originan en diferentes tejidos, en presencia o ausencia de suero (véase Sullenger y Cech, patente de Estados Unidos nJ 5,854,038). Los conjugados de las moléculas que se describen en el presente documento pueden estar unidos a moléculas biológicamente activas mediante enlazadores que son biodegradables, tales como moléculas enlazadoras biodegradables de ácido nucleico. El término "enlazador biodegradable" tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula enlazadora de ácido nucleico o que no sea de ácido nucleico que se diseña como enlazador biodegradable para conectar una molécula a otra molécula, por ejemplo, una molécula biológicamente activa a una molécula de siNA de la invención o las hebras codificante y no codificante de una molécula de siNA de la invención. El enlazador biodegradable se diseña de tal forma que puede modularse su estabilidad para un fin particular, tal como la administración a un tejido o tipo de célula particulares. La estabilidad de una molécula enlazadora biodegradable con base de ácido nucleico puede modularse usando diversos grupos químicos, por ejemplo combinaciones de ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, y nucleótidos modificados químicamente, tales como 2'-O-metilo, 2'-fluoro, 2'-amino, 2'-O-amíno, 2'-C-alilo, 2'-O-alilo, y otros nucleótidos modificados enm 2' o en la base. La molécula enlazadora biodegradable de ácido nucleico puede ser un dímero, trímero, tetrámero o molécula de ácido nucleico más larga, por ejemplo, un oligonucleótido de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 nucleótidos de longitud, o puede comprender un único nucleótido con un enlace con base de fósforo, por ejemplo, un enlace fosforamidato o fosfodiéster. La molécula enlazadora biodegradable de ácido nucleico también puede comprender modificaciones en el esqueleto de ácido nucleico, en el azúcar del ácido nucleico, o en la base del ácido nucleico. El término "biodegradable" tal como se usa en el presente documento, se refiere a la degradación en un sistema biológico, por ejemplo, degradación enzimática o degradación química.

El término "molécula biológicamente activa" tal como se usa en el presente documento se refiere a compuestos o moléculas que tienen capacidad de provocar o modificar una respuesta biológica en un sistema. Ejemplos no limitantes de moléculas de siNA biológicamente activas o solas o combinadas con otras moléculas contemplados por la presente invención incluyen moléculas terapéuticamente activas tales como anticuerpos, colesterol, hormonas, antivirales, péptidos, proteínas, sustancias quimioterapéuticas, moléculas cortas, vitaminas, cofactores, nucleósidos, nucleótidos, oligonucleótidos, ácidos nucleicos enzimáticos, ácidos nucleicos no codificantes, oligonucleótidos formadores de moléculas tricatenarias, quimeras 2.5-A, siNA, dsARN, alocimas, aptámeros, simulados y sus análogos. Las moléculas biológicamente activas de la invención también incluyen moléculas con capacidad de modular la farmacocinética y/o farmacodinámica de otras moléculas biológicamente activas, por ejemplo, lípidos y polímeros tales como poliaminas, poliamidas, polietilenglicol y otros poliéteres. El término "fosfolípido" tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula hidrófoba que comprende al menos un grupo de fósforo. Por ejemplo, un fosfolípido puede comprender un grupo que contiene fósforo y un grupo alquilo saturado o insaturado, opcionalmente sustituido con OH, COOH, oxo, amina, o grupos arilo sustituidos o insustituidos.

Las moléculas de ácido nucleico terapéuticas (por ejemplo, moléculas de siNA) que se administran de forma exógena óptimamente son estables en las células hasta que se ha modulado la transcripción inversa del ARN lo suficiente como para reducir los niveles del transcrito de ARN. Las moléculas de ácido nucleico son resistentes a nucleasas para funcionar como agentes terapéuticos intracelulares eficaces. Las mejoras de la síntesis química de moléculas de ácido nucleico que se describen en la presente invención y en la técnica han ampliado la capacidad de modificar las moléculas de ácido nucleico introduciendo modificaciones en los nucleótidos para potenciar su estabilidad como nucleasas tal como se describe anteriormente. Todavía en otra modalidad, se proporcionan moléculas de siNA que tienen modificaciones químicas que mantienen o potencian la actividad enzimática de las proteínas implicadas en la ARNi. Dichos ácidos nucleicos también de forma general son más resistentes a nucleasas que los ácidos nucleicos sin modificar. Así la actividad in vitro y/o in vivo no debería reducirse significativamente. El uso de las moléculas con base de ácido nucleico de la invención conducirán a mejores tratamientos al lograr la posibilidad de terapias combinadas (por ejemplo, múltiples moléculas de siNA dirigidas contra diferentes genes; moléculas de ácido nucleico acopladas a moduladores de molécula corta conocidos; o tratamiento intermitente con combinaciones de moléculas, que incluyen diferentes motivos y/u otras moléculas químicas o biológicas). El tratamiento de los sujetos con moléculas de siNA también puede incluir combinaciones de diferentes tipos de moléculas de ácido nucleico, tales como moléculas de ácido nucleico enzimáticas (ribozimas), alozimas, no codificantes, 2.5-A oligoadenilato, simuladas y aptámeros. En otro aspecto una molécula de siNA de la invención comprende una o más estructuras caperuza en 5' y/o 3', por ejemplo, solo en la hebra de siNA codificante, la hebra de siNA no codificante o ambas hebras de siNA. Con "estructura caperuza" se quiere decir modificaciones químicas, que se han incorporado a cualquiera de los extremos del oligonucleótido (véase, por ejemplo, Adamic y cois., patente de Estados Unidos nJ 5,998,203, que se incorpora por referencia al presente documento). Estas modificaciones terminales protegen la molécula de ácido nucleico de la exodegradación por nucleasas, y puede ayudar a la administración y/o localización en el interior de una célula. La caperuza puede estar presente en el extremo 5' (caperuza en 5) o en el extremo 3' (caperuza en 3') o puede estar presente en ambos extremos. En ejemplos no limitantes, la caperuza en 5' incluye, pero sin limitación, glicerilo, resto desoxiabásico invertido (resto); nucleótido de 4',5'-metileno; nucleótido de l-(beta-D-eritrofuranosilo), nucleótido de 4'-tio; nucleótido carbocíclico; nucleótido de 1 ,5-anhidrohexitol; nucleótidos L; nucleótidos alfa; nucleótido con bases modificadas; enlace fosforoditioato; nucleótido de freo-pentofuranosilo; nucleótido de 3',4'-seco acíclico; nucleótido de 3,4-dihidroxibutilo acíclico;Dnucleótido de 3,5-dihidroxipentilo acíclico; resto nucleotídico de 3'-3'-invertido; resto abásico 3'-3'-invertido; resto nucleotídico 3'-2'-invertido; resto abásico 3'-2'-invertido; 1 ,4-butanodiolfosfato; 3'-fosforamidato; hexilfosfato; aminohexilfosfato; 3'-fosfato; 3'-fosforotioato; fosforoditioato; o resto metilfosfonato de puente o no de puente. Ejemplos no limitantes de restos caperuza se muestran en la Figura 10. Ejemplos no limitantes de la caperuza 3' incluyen, pero sin limitación, glicerilo, resto desoxiabásico invertido (resto); nucleótido de 4", 5'-metileno; nucleótido de l-(beta-D-eritrofuranosilo), nucleótido de 4'-tio; nucleótido carbocíclico; nucleótido de 5'-amino-alquil fosfato; 1,3-diamino-2-propil fosfato; 3-aminopropil fosfato; 6-aminohexil fosfato; 1 ,2-aminododecil fosfato; hidroxipropil fosfato; nucleótido de ,5-anhidrohexitol; nucleótidos L; nucleótidos alfa; nucleótidos con bases modificadas; fosforoditioato; nucleótido de freo-pentofuranosilo; nucleótido de 3',4'-seco acíclíco; nucleótido de 3,4-dihidroxibutilo acíclico; nucleótido de 3,5-dihidroxipentilo, resto nucleotídico d'-d'-invertido; resto abásico 5'-5'-invertido; 5'-fosforamidato; 5'-fosforotioato; 1 ,4-butanodiol fosfato; 5'-amino; 5'-fosforamidato de puente o no de puente, fosforotioato y/o fosforoditioato, metilfosfonato de puente o no de puente y restos d'-mercapto (para más detalles véase Beaucage y lyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925; que se incorpora por referencia al presente documento).

Con el término "no nucleótidos" se quiere decir cualquier grupo "no nucleotídíco" quiere decir además cualquier grupo o compuesto que puede incorporarse a una cadena de ácido nucleico en lugar de una o más unidades de nucleótidos, que incluyen sustituciones de azúcar y/o fosfato, y permite que las bases restantes muestren su actividad enzimática. El grupo o compuesto es abásico porque no contiene una base nucleotídica reconocida habitualmente, tal como adenosina, guanina, citosina, uracilo o timina y por lo tanto carece de base en la posición 1 '. Un grupo "alquilo" se refiere a un hidrocarburo alifático saturado, que incluye grupos alquilo de cadena lineal, ramificada y cíclica. Preferiblemente, el grupo alquilo tiene de 1 a 12 carbonos. Más preferiblemente, es un alquilo inferior de 1 a 7 carbonos, más preferiblemente de 1 a 4 carbonos. El grupo alquilo puede estar sustituido o insustituido. Cuando está sustituido, el grupo(s) sustituido(s) es preferiblemente, hidroxilo, ciano, alcoxi, =O, =S, NO2 o N(CH3)2, amino, o SH. El término también incluye grupos alquenilo que son grupos hidrocarburo insaturados que contienen al menos un doble enlace carbono-carbono, que incluye grupos de cadena lineal, de cadena ramificada y cíclicos. Preferiblemente, el grupo alquenilo tiene de 1 a 12 carbonos. Más preferiblemente, es un alquenilo inferior de 1 a 7 carbonos, más preferiblemente de 1 a 4 carbonos. El grupo alquenilo puede estar sustituido o insustituido. Cuando está sustituido, el grupo(s) sustituido(s) es preferiblemente, hidroxilo, ciano, alcoxi, =O, =S, NO2, halógeno, N(CH3)2, amino, o SH. El término "alquilo" también incluye grupos alquinilo que son grupos hidrocarburo insaturados que contienen al menos un triple enlace carbono-carbono, que incluye grupos de cadena lineal, de cadena ramificada y cíclicos. Preferiblemente, el grupo alquinilo tiene de 1 a 12 carbonos. Más preferiblemente, es un alquinilo inferior de 1 a 7 carbonos, más preferiblemente de 1 a 4 carbonos. El grupo alquinilo puede estar sustituido o insustituido. Cuando está sustituido, el grupo(s) sustituido(s) es preferiblemente, hidroxilo, ciano, alcoxi, =O, =S, NO2 o N(CH3)2, amino, o SH. Dichos grupos alquilo también pueden incluir grupos arilo, alquilarilo, arilo carbocíclico, arilo heterocíclico, amida y éster. Un grupo "arilo" se refiere a un grupo aromático que tiene al menos un anillo que tiene un sistema de electrones pi conjugados e incluye grupos arilo carbocíclico, arilo heterocíclico y biarilo, todos los cuales puedan estar opcionalmente sustituidos. Los sustituyentes preferidos de los grupos arilo son grupos halógeno, trihalometilo, hidroxilo, SH, OH, ciano, alcoxi, alquilo, alquenilo, alquinilo, y amino. Un grupo "alquilarilo" se refiere a un grupo alquilo (tal como se describe anteriormente) unido covalentemente a un grupo arilo (tal como se describe anteriormente). Los grupos arilo carbocíclicos son grupos en los que los átomos del anillo aromático son todos átomos de carbono. Los átomos de carbono están opcionalmente sustituidos. Los grupos arilo heterocíclico son grupos que tienen de 1 a 3 heteroátomos como átomos del anillo en los que el anillo aromático y el resto de los átomos del anillo son átomos de carbono. Los heteroátomos adecuados incluyen oxígeno, azufre y nitrógeno e incluyen furanilo, tienilo, piridilo, pirrolilo, N-(alquil inferior)pirrolo, pirimidilo, pirazinilo, imidazolilo y similares, todos opcionalmente sustituidos. Una "amida" se refiere a un -C(O)-NH-R, donde R es alquilo, arilo, alquilarilo o hidrógeno. Un "éster" se refiere a un -C(O)-OR', donde R es alquilo, arilo, alquilarilo o hidrógeno. "Nucleótido" tal como se usa en el presente documento y se reconoce en la técnica incluye bases naturales (estándar), y modificas notorias en la técnica. Dichas bases de forma general están localizadas en la posición V de un resto de azúcar del nucleótido. Los nucleótidos de forma general comprenden una base, un azúcar y un grupo fosfato. Los nucleótidos pueden estar sin modificar o modificados en el resto azúcar, fosfato y/o base (también denominados de forma intercambiable análogos de nucleótidos, nucleótidos modificados, nucleótidos no naturales, nucleótidos no estándar y otros; véase, por ejemplo, Usman y McSwiggen, referencia anterior; Eckstein y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 92/07065; Usman y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 93/15187; Uhlman & Peyman, referencia anterior, todos se incorporan por la presente por referencia al presente documento). Hay varios ejemplos de bases de ácido nucleico modificadas conocidas en la técnica tal como resumen Limbach y cois., 1994, Nucleic Acid Res.. 22, 2183. Algunos de los ejemplos no limitantes de modificaciones de bases que pueden introducirse en las moléculas de ácido nucleico incluyen, inosina, purina, piridin-4-ona, piridin-2- ona, fenílo, pseudouracilo, 2, 4, 6-trimetoxi benceno, 3-metil uracilo, dihidrouridína, naftilo, aminofenilo, 5-alquilcitidinas (por ejemplo, 5-metilcitidina), 5-alquiluridinas (por ejemplo, ribotimina), 5-halouridina (por ejemplo, 5-bromouridina) o 6-azapirimidinas o 6-alquilpirimidinas (por ejemplo 6-metiluridina), propino, y otros (Burgin y cois., 1996, Biochemistry, 35, 14090; Uhlman & Peyman, referencia anterior). Con "bases modificadas" en este aspecto se quiere decir bases nucleotídicas distintas de adenina, guanina, citosina y uracilo en la posición 1' o sus equivalentes. En una modalidad, la invención presenta moléculas de siNA modificadas, con modificaciones de fosfato en el esqueleto que comprenden una o más sustituciones fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, fosfotriéster, morfolino, amidato, carbamato, carboximetilo, acetamidato, poliamida, sulfonato, sulfonamida, sulfamato, formacetal, tioformacetal, y/o alquilsililo. Para una revisión de las modificaciones oligonucleotídicas del esqueleto, véase Hunziker y Leumann, 1995 Nucleic Acid Analogues: Synthesis and Properties, en Modern Synthetic Methods, VCH, 331-417, y Mesmaeker y cois., 1994, Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides, en Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS, 24-39. Con "abásico" se quiere decir restos de azúcar que carecen de nucleobase o que tienen un átomo de hidrógeno (H) u otro grupo químico no nucleobásico en lugar de una nucleobase en la posición 1' del resto azúcar, véase por ejemplo Adamic y cois., patente de Estados Unidos nJ 5,998,203.

En una modalidad, un resto abásico de la invención es un azúcar ribosa, desoxirribosa, o didesoxirribosa. Con "azúcar de nucleósido" se quiere decir una de las bases adenina, citosina, guanina, timina, o uracilo unida al carbono 1' de ß-D-ribo-furanosa. Con "nucleósido modificado" se quiere decir cualquier nucleótido base que contiene una modificación en la estructura química de una base, azúcar y/o fosfato de nucleótido sin modificar. Ejemplos no limitantes de nucleótidos modificados se muestran mediante las Fórmulas I-VI I y/u otras modificaciones que se describen en el presente documento. En lo que se refiere a los nucleótidos modificados en 2' tal como se describen para la presente invención, con "amino" se quiere decir 2'-NH2 o 2'-0- NH2, que puede estar modificado o sin modificar. Dichos grupos modificados se describen, por ejemplo, en Eckstein y cois., patente de Estados Unidos nJ 5,672,695 y Matulic-Adamic y cois., patente de Estados Unidos nJ 6,248,878, que que se incorporan ambas por referencia en su totalidad. Pueden realizarse diversas modificaciones a una estructura de ácido nucleico de siNA para mejorar la utilidad de estas moléculas. Dichas modificaciones mejorarán la vida útil, la semivida in vitro, la estabilidad, y la facilidad de la introducción de dichos oligonucleótidos en el sitio objetivo, por ejemplo, para mejorar la penetración de las membranas celulares y conferir capacidad de reconocer y unirse a una céluel objetivo.

Administración de moléculas de ácido nucleico Una molécula de siNA de la invención puede adaptarse para usarse para prevenir o tratar enfermedades, rasgos, trastornos, y/o afecciones que se describen en el presente documento o que se sabe por otros medios en la técnica que están relacionados con la expresión génica de un gen objetivo o ruta objetivo, y/o cualquier otro rasgo, enfermedad, trastorno o condición que esté relacionado o que responda a los niveles de polinucleótidos o proteínas objetivo que se expresan a partir de ellos en una célula o tejido, solo o combinado con otras terapias. En una modalidad, las moléculas y formulaciones de siNA de la invención o sus composiciones se administran a una célula, sujeto, u organismo tal como se describe en el presente documento y como se conoce de forma general en la técnica. En una modalidad, una composición de siNA de la invención puede comprender un vehículo de administración, que incluye liposomas, para la administración a un sujeto, vehículos y diluyentes y sus sales, y/o pueden estar presentes en formulaciones farmacéuticamente aceptables. Los procedimientos para la administración de moléculas de ácido nucleico se describen en Akhtar y cois., 1992, Trends Cell Bio., 2, 139; Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995, Maurer y cois., 1999, Mol. Membr. Biol., 16, 129-140; Hofland y Huang, 1999, Handb. Exp. Pharmacol., 137, 165-192; y Lee y cois., 2000, ACS Symp. Ser., 752, 184-192, todos los cuales se incorporan al presente documento por referencia. Beigelman y cois., patente de Estados Unidos nJ 6,395,713 y Sullivan y cois., PCT WO 94/02595 describen adicionalmente los procedimientos generales para la administración de moléculas de ácido nucleico. Estos protocolos pueden utilizarse para la administración de virtualmente cualquier molécula de ácido nucleico. Las moléculas de ácido nucleico pueden administrarse a células mediante una variedad de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen, pero sin restricciones, encapsulación en liposomas, iontoforesis, o incorporación en otros vehículos, tales como polímeros biodegradables, hidrogeles, ciclodextrinas (véase por ejemplo González y cois., 1999, Bioconjugate Chem., 10, 1068-1074; Wang y cois., publicación internacional PCT nJ WO 03/47518 y WO 03/46185), ácido poli(láctico-coglicólico) (PLGA) y microesferas de PLCA (véase por ejemplo la patente de Estados Unidos 6,447,796 y la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos nJ US 2002130430), nanocápsulas biodegradable, y microesferas bioadhesivas, o mediante vectores proteinaceos (O'Hare y Normand, publicación de patente internacional PCT nJ WO 00/53722). En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención también pueden formularse o formar complejos con polietilenimina y sus derivados, tal como derivados de polietilenimina-polietilenglicol-N-acetilgalactosamina (PEI-PEG-GAL) o polietilenimina-polietilenglicol-tri-N-acetilgalactosamina (PEI-PEG-triGAL). En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención se formulan tal como se describe en publicación de solicitud de patente de Estados Unidos nJ 20030077829, que se incorpora por referencia al presente documento en su totalidad.

En una modalidad, una molécula de siNA de la invención se formula en forma de una composición que se describe en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/678,531 y en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ relacionada 60/703,946, presentada el 29 de julio de 2005, la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/737,024, presentada el 15 de noviembre de 2005, y el documento USSN 11/353,630, presentado el 14 de febrero de 2006 (Vargeese y cois.), todos los cuales se incorporan por referencia al presente documento en su totalidad. Dichas formulaciones de siNA de forma general se denominan "partículas lipídicas de ácido nucleico" (LNP). En una modalidad, una molécula de siNA de la invención se formula con una o más composiciones de LNP que se describen en el presente documento en el cuadro IV (véase el documento USSN 11/353,630 referencia anterior). En una modalidad, las moléculas de siNA de la invención y sus formulaciones o composiciones se administran a tejidos y células pulmonares tal como se describe en los documentos US 2006/0062758; US 2006/0014289; y US 2004/0077540. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención forma complejo con agentes que alteran la membrana tales como los que se describen en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos nJ 20010007666, que se incorpora por referencia al presente documento en su totalidad incluidos los dibujos. En otra modalidad, el agente o agentes que alteran la membrana y la molécula de siNA también forman complejos con un lípido catiónico o molécula lipídica cooperadora, tal como los lípidos que se describen en la patente de Estados Unidos nJ 6,235,310, que se incorpora por referencia al presente documento en su totalidad incluidos los dibujos. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención forma complejo con sistemas de administración tal como se describe en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos nJ 2003077829 y la publicación de patente internacional PCT nJ WO 00/03683 y WO 02/087541 , todos los cuales se incorporan por referencia al presente documento en su totalidad incluidos los dibujos. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención forma complejo con sistemas de administración como se se describe de forma general en las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos nJUS-20050287551 ; US-20050164220; US-20050191627; US-20050118594; US-20050153919; US-20050085486; y US-20030158133; todos los cuales se incorporan por referencia al presente documento en su totalidad incluidos los dibujos. En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención se administran a tejidos esqueléticos (por ejemplo, hueso, cartílago, tendón, ligamento) o tumores metastásicos óseos mediante formación de complejos o conjugación con atelocolágeno (véase por ejemplo Takeshita y cois, de 2005, PNAS, 102, 12177-12182). Por lo tanto, en una modalidad, la presente invención presenta una o más moléculas de dsiNA en forma de una composición que forma complejos con atelocolágeno. En otra modalidad, la presente invención presenta una o más moléculas de siNA conjugadas con atelocolágeno mediante un enlazador tal como se describe en el presente documento o conocido por otros medios en la técnica. En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención y sus formulaciones (por ejemplo, formulaciones de moléculas bicatenarias de ácido nucleico de la invención en LNP) se administran mediante administración pulmonar, tal como mediante inhalación de un aerosol o formulación secada por pulverización que se administra mediante un dispositivo o nebulizador de inhalación, proporcionando una captación local rápida de las moléculas de ácido nucleico en los tejidos pulmonares relevantes. Las composiciones sólidas en partículas que contienen partículas secas respirables de composiciones de ácido nucleico micronizadas pueden prepararse moliendo composiciones de ácido nucleico secas o líofilizadas y después pasando la composición micronizada a través, por ejemplo, de un tamiz de malla 400 para descomponer o separar los aglomerados grandes. Una composición sólida en partículas que comprende las composiciones de ácido nucleico de la invención opcionalmente puede contener un dispersante que actúa facilitando la formación de un aerosol así como otros compuestos terapéuticos. Un dispersante adecuado es lactosa, que puede mezclarse con el compuesto de ácido nucleico en cualquier proporción adecuada, tal como una proporción de 1 a 1 en peso. Los aerosoles de partículas líquidas que comprenden una composición de ácido nucleico de la invención pueden producirse por cualquier medio adecuado, tal como con un nebulizador (véase por ejemplo el documento US 4,501 ,729). Los nebulizadores son dispositivos disponibles comercialmente que transforman soluciones o suspensiones de un principio activo en un vaho de aerosol terapéutico ya sea mediante la aceleración de un gas comprimido, habitualmente aire u oxígeno, a través de un estrecho orificio venturi o mediante agitación por ultrasonidos. Las formulaciones adecuadas para usar en los nebulizadores comprenden el principio activo en un vehículo líquido en una cantidad de hasta el 40% p/p preferiblemente menos del 20% p/p de la formulación. El vehículo es habitualmente agua o solución alcohólica acuosa diluida, preferiblemente preparada isotónica a los fluidos corporales mediante la adición, por ejemplo, de cloruro sódico u otras sales adecuadas. Los aditivos opcionales incluyen conservantes, si la formulación no se prepara estéril, por ejemplo, hidroxibenzoato metílico, antioxidantes, aromas, aceites volátiles, agentes tamponadores y emulsionantes y otros tensioactivos de formulación. Del mismo modo pueden producirse aerosoles de partículas sólidas que comprenden la composición activa y el tensioactivo con cualquier generador de aerosoles con partículas sólidas. Los generadores de aerosoles para administrar compuestos terapéuticos de partículas sólidas a un sujeto producen partículas que pueden respirarse, tal como se explica anteriormente, y generan un volumen de aerosol que contiene una dosis medida predeterminada de una composición terapéutica en una cantidad adecuada para la administración a seres humanos.

En una modalidad, el generador de aerosol de partículas finas de la invención es un insuflador. Las formulaciones adecuadas para la administración mediante insuflación incluyen polvos finamente molidos que pueden derivarse mediante un insuflador. En el insuflador, el polvo, por ejemplo, una dosis dosificada del mismo eficaz para realizar los tratamientos que se describen en el presente documento, está contenida en cápsulas o cartuchos, habitualmente de gelatina o plástico, que o bien se perforan o se abren in situ y el polvo se administra mediante el aire que se fuerza a través del dispositivo tras la inhalación o mediante una bomba operada de forma manual. El polvo que se emplea en el insuflador está constituido bien exclusivamente por el principio activo o por una mezcla de polvo que comprende el principio activo, un diluyente en polvo adecuado, tal como lactosa, y un tensioactivo opcional. El principio activo habitualmente comprende de 0.1 a 100 p/p de la formulación. Un segundo tipo de generador de aerosol ilustrativo comprende un inhalador de dosis dosificadas. Los inhaladores de dosis dosificadas son dispensadores de aerosoles presurizados, que habitualmente contienen una formulación en suspensión o solución del principio activo en un propelente liquido. Durante el uso, estos dispositivos descargan la formulación a través de una válvula adaptada para administrar un volumen dosificado produciendo una pulverización de partículas finas que contiene el principio activo. Los propelentes adecuados incluyen ciertos compuestos de clorofluorocarbono, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano y sus mezclas. La formulación de forma adicional puede contener uno o más codisolventes, por ejemplo, etanol, emulsionantes y otros tensioactivos de formulación, tales como ácido oleico o trioleato de sorbitana, antioxidantes y agentes aromatizantes adecuados. Otro procedimientos para la administración pulmonar se describen, por ejemplo en la solicitud de patente de Estados Unidos nJ 20040037780, y las patentes de Estados Unidos NJ 6,592,904; 6,582,728; 6,565,885, todas las cuales se incorporan por referencia al presente documento. En una modalidad, las composiciones y formulaciones de siNA y LNP que proporciona el presente documento para usar en la administración pulmonar comprenden además uno o más tensíoactivos. Los tensioactivos o componentes tensioactivos para mejorar la captación de las composiciones de la invención incluyen formas sintéticas y naturales así como formas completas y truncadas de proteína A tensioactiva, proteína B tensioactiva, proteína C tensioactiva, proteína D tensioactiva y Proteína E tensioactiva, fosfatidilcolina disaturada (distinta de dipalmitoilo), dipalmitoilfosfatidilcolina, fosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina; ácido fosfatídico, ubiquinonas, lisofosfatidiletanolamina, lisofosfatidilcolina, palmitoil-lisofosfatidilcolina, deshidroepiandrosterona, dolicoles, ácido sulfatídico, glicerol-3-fosfato, dihidroxiacetona fosfato, glicerol, glicero-3-fosfocolina, dihidroxiacetona, palmitato, citidina difosfato (CDP) diacilglicerol, CDP colina, colina, colina fosfato; así como cuerpos laminares naturales y artificiales que son los vehículos transportadores naturales para los componentes de tensioactivo, ácidos grasos omega-3, ácido poliénico, ácido poliénoico, lecitina, ácido palmitinico, copolímeros de bloque no iónicos de óxidos de etileno o propileno, polioxipropileno, polioxietileno monomérico y polimérico, poli(vinil amina) monomérica y polimérica con dextrano y/o cadenas laterales de alcanoílo, Brij 35, Tritón X-100 y tensioactivos sintéticos ALEC, Exosurf, Survan y Atovaquone, entre otros. Estos tensioactivos pueden usarse como elementos únicos o como parte de un tensioactivo de componentes múltiples en una formulación, o en forma de adiciones unidas covalentemente a los extremos 5' y/o 3' del componente de ácido nucleico de una composición farmacéutica del presente documento. La composición de la presente invención pueden administrarse al sistema respiratorio en forma de una formulación que incluye partículas de tamaño respirable, por ejemplo partículas de un tamaño suficientemente pequeño para que pasen a través de la nariz, boca y laringe al inhalar y a través de los bronquios y alvéolos pulmonares. En general, las partículas respirables varían en el intervalo de aproximadamente 0.5 a 10 micrómetros de tamaño. Las partículas de tamaño no respirable que se incluyen en el aerosol tienden a depositarse en la garganta y a ser tragadas, y por lo tanto se minimiza la cantidad de partículas no respirables del aerosol. Para la administración nasal, se prefiere un tamaño de particula en el intervalo de 10-500 µm para asegurar la retención en la cavidad nasal. En una modalidad, las moléculas de siNA de la invención y sus formulaciones o composiciones se administran al hígado tal como se conoce de forma general en la técnica (véase por ejemplo Wen y cois. 2004, World J Gastroenterol., 10, 244-9; Murao y cois., 2002, Pharm Res., 19, 1808-14; Liu y cois, de 2003, Gen Ther., 10, 180-7; Hong y cois, de 2003, J Pharm Pharmacol., 54, 51-8; Herrmann y cois. 2004, Arch Virol., 149, 1611-7; y Matsuno y cois, de 2003, Gen Ther., 10, 1559-66). En una modalidad, la invención presenta el uso de procedimientos para administrar las moléculas de ácido nucleico de la presente invención al sistema nervioso central y/o sistema nervioso periférico. Los experimentos han demostrado la eficaz captación in vivo de los ácidos nucleicos por las neuronas. Como ejemplo de la administración local de ácidos nucleicos a las células nerviosas, Sommer y cois., 1998, Antisense Nuc. Acid Drug Dev., 8, 75, describen un estudio en el que una molécula de ácido nucleico de fosforotioato 15mero no codificante de c-fos se administra a ratas mediante microinyección en el cerebro. Las moléculas no codificantes marcadas con tetrametilrodamina-isotiocianato (TRITC) o isotiocianato de fluoresceína (FITC) fueron captadas exclusivamente por neuronas treinta minutos después de la inyección. En estas células se observó una tinción citoplasmática difusa y tinción nuclear. Como ejemplo de la administración sistémica de ácidos nucleicos a las células nerviosas, Epa y cois., 2000, Antisense Nuc. Acid Drug Dev., 10, 469, describen un estudio in vivo en ratones en el que se usaron conjugados de beta-cíclodextrina-adamantano-oligonucleótido para dirigirse contra el receptor de neurotropina p75 en células PC 12 diferenciadas neuronalmente. Después de una tanda de administración IP de dos semanas, se observó una pronunciada captación de receptor de neurotropina p75 no codificante en las células del ganglión radicular dorsal (DRG). Además, se observó una regulación por disminución de p75 marcada y consistente en las neuronas DRG. Estrategias adicionales a la dirección de ácido nucleico a las neuronas se describen en Broaddus y cois., 1998, J. Neurosurg., 88(4), 734; Karle y cois., 1997, Eur. J. Pharmocol., 340(2/3), 153; Bannai y cois., 1998, Brain Research, 784(1.2), 304; Rajakumar y cois., 1997, Synapse, 26(3), 199; Wu-pong y cois., 1999, BioPharm, 12(1), 32; Bannai y cois., 1998, Brain Res. Protoc, 3(1), 83; Simantov y cois., 1996, Neuroscience, 74(1), 39. Las moléculas de ácido nucleico de la invención por lo tanto pueden adaptarse a la administración y la captación por las células que expresan variantes alélicas repetidas para la modulación de la expresión génica de RE. Se proporciona la administración de moléculas de ácido nucleico de la invención, dirigidas a RE mediante una variedad de estrategias diferentes. Las estrategias tradicionales para la administración al SNC que pueden usarse incluyen, pero sin limitación, administración intratecal e intracerebroventricular, implantación de catéteres y bombas, inyección o perfusión directa en el sitio del daño o lesión, inyección en el sistema arterial cerebral o mediante apertura química u osmótica de la barrera hemocerebral. Otras estrategias pueden incluir el uso de diversos sistemas de transporte y vehículos, por ejemplo mediante el uso de conjugados y polímeros biodegradables. Además, pueden usarse estrategias de genoterapia, por ejemplo tal como se describe en Kaplitt y cois., documento US 6,180,613 y Davidson, documento WO 04/013280, para expresar las moléculas de ácido nucleico en el SNC. Se proporciona la administración de moléculas de ácido nucleico de la invención al SNC mediante una variedad de diferentes estrategias. Las estrategias tradicionales para la administración al SNC que pueden usarse incluyen, pero sin limitación, administración intratecal e intracerebroventricular, implantación de catéteres y bombas, inyección o perfusión directa en el sitio del daño o lesión, inyección en el sistema arterial cerebral o mediante apertura química u osmótica de la barrera hemocerebral. Otras estrategias pueden incluir el uso de diversos sistemas de transporte y vehículos, por ejemplo mediante el uso de conjugados y polímeros biodegradables. Además, pueden usarse estrategias de genoterapia, por ejemplo tal como se describe en Kaplitt y cois., documento US 6,180,613 y Davidson, documento WO 04/013280, para expresar las moléculas de ácido nucleico en el SNC. En una modalidad, se administra un compuesto, molécula, o composición para el tratamiento de afecciones oculares (por ejemplo, degeneración macular, retinopatía diabética, etc.) a un sujeto por vía intraocular o por medios intraoculares. En otra modalidad, se administra un compuesto, molécula, o composición para el tratamiento de afecciones oculares (por ejemplo, degeneración macular, retinopatía diabética, etc.) a un sujeto por vía periocular o por medios perioculares (véase por ejemplo Ahlheim y cois., publicación internacional PCT nJ WO 03/24420). En una modalidad, se administra una molécula de siNA y/o formulación o composición de la misma a un sujeto por vía intraocular o por medios intraoculares. En otra modalidad, se administra una molécula de siNA y/o formulación o composición de la misma por vía periocular o por medios perioculares. La administración periocular de forma general proporciona una estrategia menos invasiva para administrar moléculas de siNA y una formulación o composición de la misma a un sujeto (véase por ejemplo Ahlheim y cois., publicación internacional PCT nJ WO 03/24420). El uso de la administración periocular también minimiza el riesgo de desprendimiento de retina, permite una dosificación o administración más frecuente, proporciona una vía de administración clínicamente relevante para la degeneración macular y otras afecciones ópticas, y también proporciona la posibilidad de usar reservorios (por ejemplo, implantes, bombas u otros dispositivos) para la administración de fármacos. En una modalidad, los compuestos y composiciones de siNA de la invención se administran de forma local, por ejemplo, por medios intraoculares o perioculares, tales como inyección, iontoforesis (véase, por ejemplo, los documentos WO 03/043689 y WO 03/030989), o implante, aproximadamente cada 1-50 semanas (por ejemplo, aproximadamente cada 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 semanas), solos o combinados con otros compuestos y/o terapias en el presente documento. En una modalidad, los compuestos y composiciones de siNA de la invención se administran por vía sistémica (por ejemplo, por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, infusión, bomba, implante, etc.) aproximadamente cada 1-50 semanas (por ejemplo, aproximadamente cada 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 semanas), solos o combinados con otros compuestos y/o terapias que se describen en el presente documento y/o conocidos por otros medios en la técnica. En una modalidad, la invención presenta el uso de procedimientos para administrar las moléculas de ácido nucleico de la presente invención a células hematopoyéticas, que incluyen monocitos y linfocitos. Estos procedimientos se describen en detalle en Hartmann y cois., 1998, J. Phamacol. Exp. Ther., 285(2), 920-928; Kronenwett y cois., 1998, Blood, 91 (3), 852-862; Filion y Phillips, 1997, Biochim. Biophys. Acta., 1329(2), 345-356; Ma y Wei, 1996, Leuk. Res., 20(11/12), 925-930; y Bongartz y cois., 1994, Nucleic Acid Research, 22(22), 4681-8. Dichos procedimientos, tal como se describe anteriormente, incluyen el uso de oligonucleótidos libres, formulaciones en lípidos catiónicos, formulaciones en liposomas que incluyen liposomas sensibles a pH e inmunoliposomas, y bioconjugados que incluyen oligonucleótidos conjugados a péptidos fusógenos, para la transfección de células hematopoyéticas con oligonucleótidos. En una modalidad, las moléculas de siNA y composiciones de la invención se administran al oído interno poniendo en contacto el siNA con las células, tejidos, o estructuras del oído interno tales como la cóclea, en condiciones adecuadas para la administración. En una modalidad, la administración comprende procedimientos y dispositivos tal como se describen en las patentes de Estados Unidos NJ 5,421 ,818, 5,476,446, 5,474,529, 6,045,528, 6,440,102, 6,685,697, 6,120,484; y 5,572,594; todas las cuales se incorporan por referencia al presente documento y las enseñanzas de Silverstein, 1999, Ear Nose Throat J., 78, 595-8, 600; y Jackson y Silverstein, 2002, Otolaryngol Clin North Am., 35, 639-53, y adaptados para usar las moléculas de siNA de la invención. En una modalidad, las moléculas de siNA de la invención y las formulaciones o composiciones de la misma se administran directamente o por vía tópica (por ejemplo, de forma local) a la dermis o folículos tal como se conoce de forma general en la técnica (véase por ejemplo Brand, 2001 , Curr. Opin. Mol. Ther., 3, 244-8; Regnier y cois., 1998, J. Drug Target, 5, 275-89; Kanikkannan, 2002, BioDrugs, 16, 339-47; Wraight y cois., 2001 , Pharmacol. Ther., 90, 89-104; y Preat y Dujardin, 2001 , STP PharmaSciences, 11 , 57-68). En una modalidad, las moléculas de siNA de la invención y sus formulaciones o composiciones se administran por vía directa o tópica usando una formulación en gel hidroalcohólico que comprende un alcohol (por ejemplo, ehanol o isopropanol), agua, y que incluye opcionalmente agentes adicionales tales como miristato de isopropilo y carbómero 980. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención se administra iontoforéticamente, por ejemplo a un órgano o compartimento particular (por ejemplo, el ojo, el fondo del ojo, el corazón, hígado, riñon, vejiga, próstata, tumor, SNC etc.). Ejemplos no limitantes de administración iontoforética se describen, por ejemplo, en los documentos WO 03/043689 y WO 03/030989, que se incorporan por referencia en su totalidad al presente documento. En una modalidad, los compuestos y composiciones de siNA de la invención se administran ya sea por vía sistémica o de forma local aproximadamente cada 1-50 semanas (por ejemplo, aproximadamente cada 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 semanas), solo o combinado con otros compuestos y/o terapias del presente documento. En una modalidad, los compuestos y composiciones de siNA de la invención se administran por vía sistémica (por ejemplo, por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, infusión, bomba, implante, etc.) aproximadamente aproximadamente cada 1-50 semanas (por ejemplo, aproximadamente cada 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 semanas), solos o combinados con otros compuestos y/o terapias que se describen en el presente documento y/o conocidos por otros medios en la técnica. En una modalidad, los sistemas de administración de la invención incluyen, por ejemplo, geles acuosos y no acuosos, cremas, emulsiones múltiples, microemulsiones, liposomas, ungüentos, soluciones acuosas y no acuosas, lociones, aerosoles, bases y polvos hidrocarburados, y pueden contener excipientes tales como solubilizantes, potenciadores de la permeación (por ejemplo, ácidos grasos, esteres de ácidos grasos, alcoholes grasos y aminoácidos), y polímeros hidrófilos (por ejemplo, policarbófilo y polivinilpirrolidona). En una modalidad, el vehículo farmacéuticamente aceptable es un liposoma o un potenciador transdérmico. Ejemplos de liposomas que pueden usarse en esta invención incluyen los siguientes: (1) CelIFectin, 1 :1.5 (M/M) formulación en liposomas del lípido catiónico N,NI,NII,NIII-tetrametil-N,NI,NII,NIII-tetrapalmit-y-espermina y fosfatidiletanolamina de dioleoilo (DOPE) (GIBCO BRL); (2) Cytofectin GSV, 2:1 (M/M) formulación en liposomas de un lípido catiónico y DOPE (Glen Research); (3) DOTAP (N-[1-(2,3-dioleoiloxi)-N,N,N-tri-metil-amoniomefilsulfato) (Boehringer Manheim); y (4) Lipofectamine, 3:1 (M/M) formulación en liposomas del lípido policatiónico DOSPA y el lípido neutro DOPE (GIBCO BRL). En una modalidad, los sistemas de administración de la invención incluyen parches, comprimidos, supositorios, pesarios, geles y cremas, y pueden contener excipientes tales como solubilizantes y potenciadores (por ejemplo, propilenglicol, sales biliares y aminoácidos), y otros vehículos (por ejemplo, polietilenglicol, esteres de ácidos grasos y derivados, y polímeros hidrófilos tales como hidroxipropilmetilcelulosa y ácido hialurónico). En una modalidad, las moléculas de siNA de la invención se formulan o forman complejos con polietilenimina (por ejemplo, PEÍ lineal o ramificada) y/o derivados de polietilenimina, que incluyen por ejemplo PEÍ injertadas tales como galactosa PEÍ, colesterol PEÍ, anticuerpos derivatizados PEÍ, y polietilenglicol PEÍ (PEG-PEI) y sus derivados (véase por ejemplo Ogris y cois., 2001 , AAPA PharmSci, 3, 1-11 ; Furgeson y cois, de 2003, Bioconjugate Chem., 14, 840-847; Kunath y cois., 2002, Pharmaceutical Research, 19, 810-817; Choi y cois., 2001 , Bull. Korean Chem. Soc, 22, 46-52; Bettinger y cois., 1999, Bioconjugate Chem., 10, 558-561 ; Peterson y cois., 2002, Bioconjugate Chem., 13, 845-854; Erbacher y cois., 1999, Journal of gene Medicine Preprint, 1 , 1-18; Godbey y cois., 1999., PNAS USA, 96, 5177-5181 ; Godbey y cois., 1999, Journal of Controlled Reléase, 60, 149-160; Diebold y cois., 1999, Journal of Biological Chemistry, 274, 19087-19094; Thomas y Klibanov, 2002, PNAS USA, 99, 14640-14645; y Sagara, documento US 6,586,524, que se incorporan por referencia al presente documento. En una modalidad, una molécula de siNA de la invención comprende un bioconjugado, por ejemplo un conjugado de ácido nucleico tal como se describe en Vargeese y cois., documento USSN 10/427,160, presentado el 30 de abril de 2003; los documentos US 6,528,631 ; US 6,335,434; US 6, 235,886; US 6,153,737; US 5,214,136; US 5,138,045, todos los cuales se incorporan por referencia al presente documento. Así, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende uno o más ácido(s) nucleico(s) de la invención en un vehículo aceptable, tal como un estabilizante, tampón y similares. Los polinucleótidos de la invención pueden administrarse (por ejemplo, ARN, ADN o proteína) e introducirse en un sujeto por cualquier medio estándar, con o sin estabilizantes, tampones y similares, formando una composición farmacéutica. Cuando se desea usar un mecanismo de administración en liposomas, pueden seguirse protocolos estándar para la formación de liposomas. Las composiciones de la presente invención también pueden formularse y usarse en forma de cremas, geles, pulverizadorse, aceites y otras composiciones adecuadas para la administración tópica, dérmica o transdérmica tal como se conoce en la técnica. La presente invención también incluye formulaciones farmacéuticamente aceptables de los compuestos que se describen. Estas formulaciones incluyen sales de los compuestos anteriores, por ejemplo, sales de adición de ácidos, por ejemplo, sales de ácido clorhídrico, bromhídrico, acético y bencenosulfónico. Una composición o formulación farmacológica se refiere a una composición o formulación en una forma adecuada para la administración, por ejemplo, administración sistémica o local, a una célula o sujeto, que incluye por ejemplo un ser humano. Las formas adecuadas, dependen en parte del uso o de la vía de entrada, por ejemplo oral, transdérmica, o mediante inyección. Dichas formas no deberían impedir que la composición o formulación alcance una céluel objetivo (es decir, una célula a la que se desea administrar el ácido nucleico con carga negativa). Por ejemplo, las composiciones farmacológicas que se inyectan al torrente sanguíneo deberían ser solubles. Otros factores son conocidos en la técnica, e incluyen consideraciones tales como toxicidad y formas que evitan que la composición o formulación ejerza su efecto. En una modalidad, las moléculas de siNA de la invención se administran a un sujeto mediante administración sistémica en una composición o formulación farmacéuticamente aceptable. Con "administración sistémica" se quiere decir in vivo absorción sistémica o acumulación de fármacos en el torrente sanguíneo seguido de distribución por todo el cuerpo. Las vías de administración que conducen a una absorción sistémica incluyen, sin limitación: intravenosa, subcutánea, vena porta, intraperitoneal, inhalación, oral, intrapulmonar e intramuscular. Cada una de estas vías de administración expone las moléculas de siNA de la invención a un tejido enfermo accesible (por ejemplo, el pulmón). Se ha demostrado que la velocidad de entrada de un fármaco en la circulación está en función del peso o tamaño moleculares. El uso de un liposoma u otro vehículo para fármacos que comprenden los compuestos de la presente invención potencialmente puede localizar el fármaco, por ejemplo, en ciertos tipos de tejidos, tales como los tejidos del sistema endotelial reticular (RES). También es de utilidad una formulación en liposomas que puede facilitar la asociación del fármaco a la superficie de células, tales como, linfoticos y macrófagos. Esta estrategia puede proporcionar una administración mejorada del fármaco a las células objetivo aprovechándose de la especificidad del reconocimiento por el sistema inmunitario de los macrófagos y linfocitos de células anormales.

Con "formulación farmacéuticamente aceptable" o "composición farmacéuticamente aceptable" se quiere decir, una composición o formulación que permita la distribución eficaz de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención a la locación física más adecuada para la actividad que se desee. Ejemplos no limitantes de agentes adecuados para la formulación con las moléculas de ácido nucleico de la presente invención incluyen: inhibidores de glucoproteína P (tales como Pluronic P85), polímeros biodegradables, tales como microesferas de poli (DL-lactida-coglicolida) para la administración de liberación mantenida (Emerich, DF y cois, 1999, Cell Transplant, 8, 47-58); y nanopartículas cargadas, tales como las que se preparan a partir de polibutilcianoacrilato. Otro ejemplos no limitantes de estrategias de administración para las moléculas de ácido nucleico de la presente invención incluyen el material que se describe en Boado y cois., 1998, J. Pharm. Sci., 87, 1308-1315; Tiler y cois., 1999, FEBS Lett., 421 , 280-284; Pardridge y cois., 1995, PNAS USA., 92, 5592-5596; Boado, 1995, Adv. Drug administración Rev., 15, 73-107; Aldrian-Herrada y cois., 1998, Nucleic Acid Res.., 26, 4910-4916; y Tiler y cois., 1999, PNAS USA., 96, 7053-7058. La invención también presenta el uso de una composición que comprende liposomas con modificaciones superficiales que contienen lípidos de poli(etilenglicol) (modificados con PEG, o liposomas de circulación prolongada o liposomas stealth) y moléculas de ácido nucleico de la invención. Estas formulaciones ofrecen un procedimiento para aumentar la acumulación de fármacos (por ejemplo, siNA) en los tejidos objetivo. Esta clase de vehículos para fármacos resiste la opsonización y eliminación por el sistema fagocítico mononuclear (MPS o RES), permitiendo así unos tiempos más largos de circulación en sangre y una mayor exposición de los tejidos para el fármaco encapsulado (Lasic y cois. Chem. Rev. 1995, 95, 2601-2627; Ishiwata y cois., Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 1005-1011). Se ha demostrado que dichos liposomas se acumulan de forma selectiva en los tumores, presumiblemente por extravasación y captura en los tejidos objetivo neovascularizados (Lasic y cois., Science 1995, 267, 1275-1276; Oku y cois., 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1238, 86-90). Los liposomas de circulación prolongada potencian la farmacocinética y farmacodinámica del ADN y ARN, en particular comparados con los liposomas catiónicos convencionales que se sabe que se acumulan en los tejidos de los MPS (Liu y cois., J. Biol. Chem. 1995, 42, 24864-24870; Choi y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 96/10391 ; Ansell y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 96/10390; Holland y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 96/10392). También es probable que los liposomas de circulación prolongada protejan los fármacos de la degradación por nucleasas en un grado mayor que los liposomas catiónicos, basándose en su capacidad de evitar la acumulación en los tejidos MPS metabólicamente agresivos tales como el hígado y el bazo. En una modalidad, una formulación en liposomas de la invención comprende una molécula bicatenaria de ácido nucleico de la invención (por ejemplo, siNA) formulado o formando complejos con compuestos y composiciones que se describen en los documentos US 6,858,224; 6,534,484; 6,287,591 ; 6,835,395; 6,586,410; 6,858,225; 6,815,432; US 6,586,001 ; 6,120,798; US 6,977,223; US 6,998,115; 5,981 ,501 ; 5,976,567; 5,705,385; US 2006/0019912; US 2006/0019258; US 2006/0008909; US 2005/0255153; US 2005/0079212; US 2005/0008689; US 2003/0077829, US 2005/0064595, US 2005/0175682, US 2005/0118253; US 2004/0071654; US 2005/0244504; US 2005/0265961 y US 2003/0077829, todos los cuales se incorporan por referencia al presente documento en su totalidad. La presente invención también incluye composiciones preparadas para el almacenamiento o la administración que incluyen una cantidad farmacéuticamente eficaz de los compuestos deseados en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos o diluyentes aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985), que se incorpora por la presente por referencia al presente documento. Por ejemplo, pueden proporcionarse conservantes, estabilizantes, tintes y agentes aromatizantes. Estos incluyen benzoato sódico, ácido sórbico y esteres de ácido p-hidroxibenzoico. Además, pueden usarse antioxidantes y agentes de suspensión. Una dosis farmacéuticamente eficaz es la dosis necesaria para evitar, inhibir que se produzca o tratar (aliviar un síntoma en algún grado, preferiblemente todos los síntomas) de un estado de enfermedad. La dosis farmacéuticamente eficaz depende del tipo de enfermedad, la composición que se use, la vía de administración, el tipo de mamífero que se esté tratando, las características físicas del mamífero específico que se esté considerando, la medicación concurrente, y otros factores que reconocerán los expertos en la técnica médica. De forma general, se administra una cantidad de entre 0.1 mg/kg y 100 mg/kg de peso corporal/día de principios activos dependiendo de la potencia del polímero con carga negativa. Las moléculas de ácido nucleico de la invención y sus formulaciones pueden administrarse por vía oral, tópica, parenteral, por inhalación o pulverización, o por vía rectal en formulaciones monodosis que contienen transportadores, adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables no tóxicos. El término parenteral tal como se usa en el presente documento incluye técnicas de inyección o infusión percutánea, subcutánea, intravascular (por ejemplo, intravenosa), intramuscular, o intratecal y similares. Además, se proporciona una formulación farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una o más moléculas de ácido nucleico de la invención pueden estar presentes asociadas a uno en asociación con uno o más transportadores y/o adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptable no tóxicos, y si se desea otros principios activos. Las composiciones farmacéuticas que contienen moléculas de ácido nucleico de la invención pueden estar en una forma adecuada para el uso oral, por ejemplo, en forma de comprimidos, trociscos, pastillas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o granulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o blandas o jarabes o elixires. Las composiciones cuyo fin es el uso oral pueden prepararse de acuerdo con cualquier procedimiento conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas y dichas composiciones pueden contener uno o más agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y agentes conservantes para proporcionar preparaciones farmacéuticamente elegantes y agradables. Los comprimidos contienen el principio activo mezclado con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Estos excipientes por ejemplo pueden ser diluyentes inertes, tales como carbonato calcico, carbonato sódico, lactosa, fosfato calcico o fosfato sódico; agentes de granulación y disgregación, por ejemplo, almidón de maíz o ácido algínico; agentes aglutinantes, por ejemplo almidón, gelatina o goma arábiga, y agentes lubricantes, por ejemplo estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Los comprimidos pueden no estar recubiertos o recubrirse mediante técnicas conocidas. En algunos casos, los recubrimientos pueden prepararse por técnicas conocidas para retrasar la desintegración y la absorción en el tubo gastrointestinal y proporcionar así una acción mantenida durante un periodo más largo. Por ejemplo, puede emplearse un material retardador tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo. Las formulaciones para uso oral también pueden presentarse en forma de cápsulas de gelatina dura, en las que el principio activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato calcico, fosfato calcico o caolín o en forma de cápsulas de gelatina blanda en las que el principio activo se mezcla con agua o un medio oleoso, por ejemplo aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva. Las suspensiones acuosas contienen los principios activos mezclados con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Dichos excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato sódico, polivinil-pirrolidona, goma tragacanto y goma arábiga; los agentes dispersantes o humectantes pueden ser un fosfátido natural, por ejemplo lecitina o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo heptadecaetilenoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con esteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tales como monooleato de polioxietilensorbitol, o productos de condensación de óxido de etileno con esteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol por ejemplo monooleato de polietilensorbitano. Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservantes, por ejemplo p-hidroxibenzoato etílico o n-propílico, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes aromatizantes y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina.

Las suspensiones acuosas pueden formularse suspendiendo los principios activos en un aceite vegetal, por ejemplo aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina líquida Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo cera de abeja, parafina dura o alcohol cetílico. Pueden añadirse agentes edulcorantes y aromatizantes para proporcionar preparaciones oral agradables. Estas composiciones pueden conservarse mediante la adición de un antioxidante tal como ácido ascórbico. Los polvos y granulos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua proporcionan el principio activo mezclado con un agente dispersante o humectante, un agente de suspensión y uno o más conservantes. Los agentes dispersantes y humectantes adecuados y los agentes de suspensión se ejemplifican mediante los ya mencionados anteriormente. También puede haber presentes excipientes adicionales, por ejemplo agentes edulcorantes, aromatizantes y colorantes. Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal o un aceite mineral o mezclas de estos. Los agentes emulsionantes adecuados pueden ser gomas naturales, por ejemplo goma arábiga o goma tragacanto, fosfátidos naturales, por ejemplo soja, lecitina y esteres o esteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo monooleato de sorbitano, y productos de condensación de dichos esteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo monooleato de polioxietilensorbitano. Las emulsiones también pueden contener agentes edulcorantes y aromatizantes. Los jarabes y elixires pueden formularse con agentes edulcorantes, por ejemplo glicerol, propilenglicol, sorbitol, glucosa o sacarosa. Dichas formulaciones también pueden contener un demulcente, un conservante y agentes aromatizantes y colorantes. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una suspensión acuosa u oleosa inyectable estéril. Esta suspensión puede formularse de acuerdo con la técnica conocida usando los agentes dispersantes o humectantes y los agentes de suspensión conocidos que se han mencionado anteriormente. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo en forma de una solución en 1 ,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse está el agua, la solución de Ringer y la solución isotónica de cloruro sódico. Además, se emplean aceites fijos estériles convencionalmente en forma de medio disolvente o de suspensión. Para este fin puede emplearse cualquier aceite fijo suave que incluye monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Además, pueden usarse ácidos grasos tales como ácido oleico en la preparación de inyectables. Las moléculas de ácido nucleico de la invención también pueden administrarse en forma de supositorios, por ejemplo, para la administración rectal del fármaco. Estas composiciones pueden prepararse mezclando el fármaco con un excipiente no irritante adecuado que sea sólido a las temperaturas habituales pero líquido a la temperatura rectal y que por lo tanto se funda en el recto liberando el fármaco. Dichos materiales incluyen manteca de cacao y polietilenglicoles. Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden administrarse por vía parenteral en un medio estéril. El fármaco, dependiendo del vehículo y de la concentración que se use, puede suspenderse o disolverse en el vehículo. De forma ventajosa, pueden disolverse adyuvantes tales como anestésicos locales, conservantes y agentes tamponadores en el vehículo. Los niveles de dosis del orden de aproximadamente OJ mg a aproximadamente 140 mg por kilogramo de peso corporal al dia son de utilidad en el tratamiento de las afecciones que se indican anteriormente (de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 7 g por sujeto al día). La cantidad de principio activo que puede combinarse con los materiales de vehículo para producir una única forma farmacéutica varía dependiendo del huésped tratado y del modo de administración particular. Las formas monodosis de forma general contienen entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 500 mg de un principio activo. Se entiende que el nivel de dosis específico para cualquier sujeto particular depende de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto específico que se emplee, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administración, vía de administración, y velocidad de excreción, combinación de partículas y la gravedad de la enfermedad particular que se somete a terapia. Para la administración a animales no humanos, la composición también puede añadirse a la comida o al agua del animal. Puede ser conveniente formular las composiciones de la comida y agua del animal de forma que el animal ingiera una cantidad terapéuticamente apropiada de la composición junto con su dieta. También puede ser conveniente presentar la composición en forma de una premezcla para la adición a la comida o al agua. Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención también pueden administrarse a un sujeto combinadas con otros compuestos terapéuticos para aumentar el efecto terapéutico total. El uso de múltiples compuestos para tratar una indicación puede aumentar los efectos beneficiosos a la vez que reducen la presencia de efectos secundarios. En una modalidad, la invención comprende composiciones adecuadas para administrar moléculas de ácido nucleico de la invención a tipos celulares específicos. Por ejemplo, el receptor de asialoglucoproteína (ASGPr) (Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432) es exclusivo de los hepatocitos y se une glucoproteínas con extremos de galactosa ramificada, tales como asialoorosomucoides (ASOR). En otro ejemplo, el receptor de folato está hiperexpresado en muchas células cancerosas. La unión de dichas glucoproteínas, glucoconjugados sintéticos o folatos al receptor se produce con una afinidad que depende mucho del grado de ramificación de la cadena de oligosacáridos, por ejemplo, se encuentran estructuras tritemarias con mayor afinidad que las cadenas biternarias o monotemarias (Baenziger y Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620; Connolly y cois., 1982, J. Biol. Chem., 257, 939-945). Lee y Lee, 1987, Glycoconjugate J., A, 317-328, obtuvieron esta elevada especificidad mediante el uso de N-acetil-D-galactosamina como resto carbohidrato, que tiene una mayor afinidad por el receptor, comparado con galactosa. Este "efecto de arracimamiento" también se ha descrito para la unión y captación de glucoproteínas o glucoconjugados que terminan en manosilo (Ponpipom y cois., 1981 , J. Med. Chem., 24, 1388-1395). El uso de conjugados con base de galactosa, galactosamina, o folato para transportar compuestos exógenos a través de las membranas celulares puede proporcionar una estrategia de administración dirigida, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedad hepática, cánceres de higado u otros cánceres. El uso de bioconjugados también puede proporcionar una reducción de la dosis de compuestos terapéuticos necesaria para el tratamiento. Además, los parámetros de biodisponibilidad, farmacodinámica y farmacocinética terapéuticos pueden modularse a través del uso de bioconjugados de ácido nucleico de la invención. Ejemplos no limitantes de dichos bioconjugados se describen en Vargeese y cois., documento USSN 10/201 ,394, presentado el 31 de agosto de 2001 ; y Matulic-Adamic y cois., USSN 60/362,016, presentado el 6 de marzo de 2002. De forma alternativa, ciertas moléculas de siNA de la presente invención pueden expresarse en el interior de células a partir de promotores eucariotas (por ejemplo, Izant y Weintraub, 1985, Science, 229, 345; McGarry y Lindquist, 1986, Proc. Nati. Acad. Sci., USA 83, 399; Scanlon y cois., 1991 , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 10591-5; Kashani-Sabet y cois., 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15; Dropulic y cois., 1992, J. Virol., 66, 1432-41 ; Weerasinghe y cois., 1991 , J. Virol., 65, 5531-4; Ojwang y cois., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 10802-6; Chen y cois., 1992, Nucleic Acid Res.., 20, 4581-9; Sarver y cois., 1990 Science, 247, 1222-1225; Thompson y cois., 1995, Nucleic Acid Res.., 23, 2259; Good y cois., 1997, Gene Therapy, 4, 45. Los expertos en la técnica se darán cuenta de que puede expresarse cualquier ácido nucleico en células eucariotas a partir del vector de ADN/ARN apropiado. La actividad de dichos ácidos nucleicos puede aumentarse liberándolos del transcrito primario mediante un ácido nucleico enzimático (Draper y cois., PCT WO 93/23569, y Sullivan y cois., PCT WO 94/02595; Ohkawa y cois., 1992, Nucleic Acid Symp. Ser., 27, 15-6; Taira y cois., 1991 , Nucleic Acid Res.., 19, 5125-30; Ventura y cois., 1993, Nucleic Acid Res.., 21 , 3249-55; Chowrira y cois., 1994, J. Biol. Chem., 269, 25856. En otro aspecto de la invención, las moléculas de ARN de la presente invención pueden expresarse a partir de unidades de transcripción (véase por ejemplo Couture y cois., 1996, TIG., 12, 510) insertadas en vectores de ADN o ARN. Los vectores recombinantes pueden ser plásmidos o vectores víricos de ADN. Los vectores víricos que expresan siNA pueden construirse basándose, pero sin limitación a, en virus adenoasociados, retrovírus, adenovirus, o alfavirus. En otra modalidad, se usan construcciones basadas en pol lll para expresar moléculas de ácido nucleico de la invención (véase por ejemplo Thompson, patentes de Estados Unidos nJ 5,902,880 y 6,146,886). Los vectores recombinantes con capacidad de expresar las moléculas de siNA pueden administrarse tal como se describe anteriormente y persistir en células objetivo. De forma alternativa, pueden usarse vectores víricos que proporcionan la expresión transitoria de las moléculas de ácido nucleico. Dichos vectores puede administrarse de forma repetida sí fuera necesario. Una vez expresada, la molécula de siNA interactúa con el mARN objetivo y genera una respuesta de ARNi. La administración de vectores que expresan moléculas de siNA puede ser sistémica, tal como mediante administración intravenosa o intramuscular, mediante administración a células objetivo explantadas de un sujeto seguido de reintroduccíón en el sujeto, o mediante cualquier otro medio que podría permitir su introducción en la céluel objetivo deseada (para una revisión véase Couture y cois., 1996, 77G., 12, 510). En un aspecto la invención presenta un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una molécula de siNA de la presente invención. El vector de expresión puede codificar una o ambas hebras de una molécula bicatenaria de siNA, o una única hebra autocomplementaria que se autohibrida a una molécula bicatenaria de siNA. Las secuencias de ácido nucleico que codifican las moléculas de siNA de la presente invención pueden ligarse operablemente de un modo que permita la expresión de la molécula de siNA (véase por ejemplo Paul y cois., 2002, Nature Biotechnology, 19, 505; Miyagishi y Taira, 2002, Nature Biotechnology, 19, 497; Lee y cois., 2002, Nature Biotechnology, 19, 500; y Novina y cois., 2002, Nature Medicine, publicación oniine doi:10.1038/nm725). En otro aspecto, la invención presenta un vector de expresión que comprende: a) una región de inicio de la transcripción (por ejemplo, región de iniciación pol I, II o lll de eucariota); b) una región de terminación de la transcripción (por ejemplo, región de terminación eucariota pol I, II o lll); y c) una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una de las moléculas de siNA de la presente invención, en la que dicha secuencia está ligada operablemente a dicha región de iniciación y dicha región de terminación de un modo que permite la expresión y/o administración de la molécula de siNA. El vector opcionalmente puede incluir un marco de lectura abierto (ORF) para una proteína ligada operablemente en el extremo 5' o en el extremo 3" de la secuencia que codifica el siNA de la invención; y/o un intrón (secuencias de intervención). La transcripción de las secuencias de las moléculas de siNA pueden dirigirse a partir de un promotor para la ARN polimerasa I (pol I), ARN polimerasa II (pol II), o ARN polimerasa lll (pol lll) de eucariota. Los transcritos obtenidos a partir de los promotores pol II o pol lll se expresan en niveles elevados en todas las células; los niveles de un promotor pol II dado en un tipo de célula dado depende de la naturaleza de las secuencias de regulación génica (potenciadores, silenciadores, etc.) presentes cerca. También se usan promotores de ARN polimerasa procariotas, con la condición de que la enzima ARN polimerasa se exprese en las células apropiadas (Elroy-Stein y Moss, 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. U S A, 87, 6743-7; Gao y Huang 1993, Nucleic Acid Res.., 21 , 2867-72; Lieber y cois., 1993, Methods Enzymol., 217, 47-66; Zhou y cois., 1990, Mol. Cell. Biol., 10, 4529-37). Diversos investigadores han demostrado que las moléculas de ácido nucleico que se expresan a partir de dichos promoteres pueden funcionar en células de mamífero (por ejemplo Kashani-Sabet y cois., 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15; Ojwang y cois., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. U S A, 89, 10802-6; Chen y cois., 1992, Nucleic Acid Res.., 20, 4581-9; Yu y cois., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. U S A, 90, 6340-4; L'Huillier y cois., 1992, EMBO J., 11, 4411-8; Lisziewicz y cois., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A, 90, 8000-4; Thompson y cois., 1995, Nucleic Acid Res.., 23, 2259; Sullenger & Cech, 1993, Science, 262, 1566). De forma más específica, las unidades de transcripción tales como las derivadas de genes que codifican ARN nuclear corto U6 (snARN), ARN de transferencia (tARN) y ARN de adenovirus VA son de utilidad para generar altas concentraciones de las moléculas de ARN deseadas tales como siNA en las células (Thompson y cois., referencia anterior; Couture y Stinchcomb, 7996, referencia anterior; Noonberg y cois., 1994, Nucleic Acid Res., 22, 2830; Noonberg y cois., patente de Estados Unidos nJ 5,624,803; Good y cois., 1997, Gen Ther., A, 45; Beigelman y cois., publicación de patente internacional PCT nJ WO 96/18736. Las unidades de siNA anteriores pueden incorporarse a una variedad de vectores para la introducción en células de mamífero, que incluyen pero sin restricciones, vectores de ADN plasmídico, vectores de ADN vírico (tales como vectores de adenovirus o virus adenoasociados), o vectores de ARN víricos (tales como vectores retrovirales o alfavirus) (para una revisión véase Couture y Stinchcomb, 1996, referencia a nte rio ?. En otro aspecto la invención presenta un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una de las moléculas de siNA de la invención de un modo que permite la expresión de esa molécula de siNA. El vector de expresión comprende en una modalidad; a) una región de inicio de la transcripción; b) una región de terminación de la transcripción; y c) una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una hebra de la molécula de siNA, en la que la secuencia está ligada operablemente a la región de iniciación y a la región de terminación de un modo que permite la expresión y/o administración de la molécula de siNA. En otra modalidad el vector de expresión comprende: a) una región de inicio de la transcripción; b) una región de terminación de la transcripción; c) un marco de lectura abierto; y d) una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una hebra de una molécula de siNA, en la que la secuencia está ligada operablemente al extremo 3' del marco de lectura abierto y en la que la secuencia está ligada operablemente a la región de iniciación, el marco de lectura abierto y la región de terminación de un modo que permite la expresión y/o administración de la molécula de siNA. Todavía en otra modalidad, el vector de expresión comprende: a) una región de inicio de la transcripción; b) una región de terminación de la transcripción; c) un intrón; y d) una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una molécula de siNA, en la que la secuencia está ligada operablemente a la región de iniciación, el intrón y la región de terminación de un modo que permite la expresión y/o administración de la molécula de ácido nucleico. En otra modalidad, el vector de expresión comprende: a) una región de inicio de la transcripción; b) una región de terminación de la transcripción; c) un intrón; d) un marco de lectura abierto; y e) una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una hebra de una molécula de siNA, en la que la secuencia está ligada operablemente al extremo 3' del marco de lectura abierto y en la que la secuencia está ligada operablemente a la región de iniciación, el intrón, el marco de lectura abierto y la región de terminación de un modo que permite la expresión y/o administración de la molécula de siNA.

EJEMPLOS Los siguientes son ejemplos no limitantes que muestran la selección, aislamiento, síntesis y actividad de los ácidos nucleicos de la presente invención.

EJEMPLO 1 Síntesis en tándem de construcciones de siNA Las moléculas de siNA de la invención ejemplares se sintetizan en tándem usando un enlazador escindible, por ejemplo, un enlazador con base de succinilo. La síntesis en tándem tal como se describe en el presente documento se sigue con un proceso de purificación en una etapa que proporciona moléculas de ARNi en rendimiento elevado. Esta estrategia puede aplicarse muy bien a la síntesis de siNA para apoyar el cribado de ARNi de alto rendimiento, y puede adaptarse fácilmente a plataformas de sintesis en columnas múltiples o pocilios múltiples. Después de completar una síntesis en tándem de un oligo siNA y su complemento en el que el grupo dimetoxitritilo del el extremo 5' (5'-O-DMT) permanece intacto (síntesis sobre tritilo), los oligonucleótidos se desprotegen tal como se describe anteriormente. Tras la desprotección, se permite que las hebras de la secuencia de siNA se hibriden de forma espontánea. Esta hibridación proporciona una molécula bicatenaria en que una hebra mantiene el grupo 5'-O-DMT mientras que la hebra complementaria comprende un 5'-hidroxilo terminal. La molécula bicatenaria recién formada se comporta como una única molécula durante la purificación por extracción en fase sólida (purificación sobre tritilo) incluso si solo una molécula tiene un grupo dimetoxitritilo. Debido a que las hebras forman una molécula bicatenaria estable, este grupo dimetoxitritilo (o un grupo equivalente, tal como otros grupos tritilo u otros restos hidrófobos) es todo lo que es necesario para purificar el par de oligos, por ejemplo, usando un cartucho de C18. Se usan reacciones de síntesis con fosforamidita estándar hasta el momento de la introducción de un enlazador en tándem, tal como un succinato desoxiabásico invertido o un enlazador de succinato de glicerilo (véase el esquema A) o un enlazador escindible equivalente. Un ejemplo no limitante de condiciones de acoplamiento del enlazador que pueden usarse incluyen una base impedida tal como diisopropiletilamina (DIPA) y/o DMAP en presencia de un reactivo activador tal como hexaf lurorofosf ato de bromotripirrolidinofosfonio (PyBrOP). Después de que se a acoplado el enlazador, se utilizan reacciones de síntesis estándar para completar la síntesis de la segunda secuencia dejando intacto el 5'-O-DMT terminal. Tras la síntesis, el oligonucleótido resultante se desprotege de acuerdo con los procedimientos que se describen en el presente documento y se inactiva con un tampón adecuado, por ejemplo con NaOAc 50 mM o NH4H2CO3 1.5M. El esquema A muestra un ejemplo no limitante de un esquema para la síntesis de moléculas de siNA. Las hebras complementarias de la secuencia de siNA, hebra 1 y hebra 2, se sintetizan en tándem y se conectan mediante un enlace escindible, tal como un succinato nucleotídico o succinato abásico, que pueden ser iguales o diferentes del enlazador escindible que se usa para la síntesis en fase sólida sobre un soporte sólido. La síntesis puede ser o bien en fase sólida o en fase de solución, en el ejemplo que se muestra, la síntesis es una síntesis en fase sólida. La síntesis se realiza de tal forma que un grupo protector, tal como un grupo dimetoxitritilo, permanece intacto en el nucleótido terminal del oligonucleótido en tándem. Tras la escisión y desprotección del oligonucleótido, las dos hebras del siNA se hibridan de forma espontánea formando una molécula bicatenaria de siNA, que permite la purificación de la molécula bicatenaria utilizando las propiedades del grupo protector de siNA, por ejemplo aplicando un tritilo al procedimiento de purificación en el que solo se aislan moléculas bicatenarias/oligonucleótidos con el grupo protector terminal.

ESQUEMA A ??p.ij?.?-i--. ?-ii-Hi?m???n??i] — O-R PURIFICACIÓN (DESTRITILACION) siRNA BICATENARIO -m-.?.-???.. ??. u .si---.-?.-?.--.??? = SOPORTE SOLIDO R = GRUPO PROTECTOR TERMINAL POR EJEMPLO: DIMETOXITRITILO (DMT) (1) i? ???? ENLAZADOR ESCINDIBLE (POR EJEMPLO: SUCCINATO NUCLEOTÍDICO O SUCCINATO DESOXIABÁSICO INVERTIDO) (2) «?????? ENLAZADOR ESCINDIBLE (POR EJEMPLO: SUCCINATO NUCLEOTÍDICO O SUCCINATO DESOXIABÁSICO INVERTIDO) ENLACE DE SUCCINATO ENLACE DE SUCCINATO GLICERILICO DESOXIABÁSICO INVERTIDO La purificación de la molécula bicatenaria de siNA puede lograrse fácilmente usando extracción en fase sólida, por ejemplo, usando un cartucho Waters C18 SepPak de 1g acondicionado con 1 volumen de columna (CV) de acetonitrilo, 2 CV de H2O, y 2 CV de NaOAc 50 mM. La muestra se carga y después se lava con 1 CV de H2O o NaOAc 50 mM. Las secuencias malogradas se eluyen con 1 CV de 14% de ACN (acuoso con NaOAc 50 mM y NaCI 50 mM). Después se lava la columna, por ejemplo con 1 CV de H2O seguido de destritilación en columna, por ejemplo haciendo pasar 1 CV de 1 % de ácido trifluoroacético acuoso (TFA) por la columna, añadiendo después una segunda CV de 1% de TFA acuoso a la columna y dejando reposar durante aproximadamente 10 minutos. Se elimina el resto de la solución de TFA y la columna se lava con H2O seguido de 1 CV de NaCI 1 M y más H2O. La molécula bicatenaria de siNA producto se diluye después, por ejemplo, usando 1 CV de 20% CAN acuoso. Figura 1 proporciona un ejemplo de análisis de espectrometría de masas por MALDI-TOF de una construcción de siNA purificada en la que cada pico corresponde a la masa calculada de una hebra individual de siNA de la molécula bicatenaria de siNA. El mismo siNA purificado proporciona tres picos cuando se analiza mediante electroforesis en gel en capilar (CGE), un pico presumiblemente corresponde a la molécula bicatenaria de siNA, y dos picos presumiblemente corresponden a las hebras separadas de la secuencia de siNA. El análisis por HPLC de intercambio iónico de la misma construcción de siNA solo muestra un pico único. El análisis de la construcción de siNA purificada usando un ensayo con luciferasa como testigo que se describe más adelante demostró la misma actividad de ARNi que unas construcciones de siNA generadas a partir de hebras de secuencias de oligonucleótidos sintetizadas por separado.

EJEMPLO 2 Identificación de potenciales sitios objetivo de siNA en cualquier secuencia de ARN La secuencia de un ARN objetivo de interés, tal como un transcrito de mARN humano (por ejemplo, cualquiera de las secuencias a las que se hace referencia en el presente documento por su número de acceso de GenBank), se criba para determinar los sitios objetivo, por ejemplo usando un algoritmo de plegamiento por ordenador. En un ejemplo no limitante, se usa la secuencia de un gen o transcrito génico de ARN derivado de una base de datos, tal como Genbank, para generar siNA objetivo que tienen complementariedad con el objetivo. Dichas secuencias pueden obtenerse de una base de datos, o pueden determinarse experimentalmente tal como se conoce en la técnica. Los sitios objetivo que se sabe, por ejemplo, los sitios objetivo que se determina que son sitios objetivo eficaces basándose en estudios con otras moléculas de ácido nucleico, por ejemplo ribozimas o moléculas no codificantes, o las objetivos que se sabe que están asociadas a una enfermedad, rasgo o afección tal como los sitios que contienen mutaciones o deleciones, pueden usarse para diseñar moléculas de siNA dirigidas a esos sitios. Pueden usarse diversos parámetros para determinar qué sitios son los sitios objetivo más adecuados en la secuencia del ARN objetivo. Estos parámetros incluyen pero sin limitación la estructura de ARN secundaria o terciaria, la composición de bases nucleotídicas de la secuencia objetivo, el grado de homología entre diversas regiones de la secuencia objetivo, o la posición relativa de la secuencia objetivo en el transcrito de ARN. Basándose en estas determinaciones, puede elegirse cualquier número de sitios objetivo del transcrito de ARN para cribar moléculas de siNA para determinar la eficacia, por ejemplo usando ensayos de escisión de ARN in vitro, cultivo celular o modelos animales. En un ejemplo no limitante, se eligen de 1 a 1000 sitios objetivo del transcrito basándose en el tamaño de la construcción de siNA a emplear. Es posible desarrollar ensayos de cribado de alto rendimiento para cribar moléculas de siNA usando procedimientos conocidos en la técnica, tales como ensayos en pocilios múltiples o en placas múltiples para determinar la reducción eficaz de la expresión del gen objetivo.

EJEMPLO 3 Selección de sitios objetivo de moléculas de siNA en un ARN Pueden usarse las siguientes etapas no limitantes para realizar la selección de siNA dirigidos a una secuencia génica o transcrito dados. 1. La secuencia objetivo se analiza por ordenador en una lista de todos los fragmentos o subsecuencias de una longitud particular, por ejemplo fragmentos de 23 nucleótidos, contenidos en el interior de la secuencia objetivo. Esta etapa habitualmente se realiza usando un script Perl a medida, pero también pueden emplearse programas de análisis de secuencias comerciales tales como Oligo, MacVector, o el paquete de GCG Wisconsin. 2. En algunos casos los siNA corresponden a más de una secuencia objetivo; este sería el caso por ejemplo para dirigir diferentes transcritos del mismo gen, dirigir transcritos diferentes de más de un gen, o para dirigir tanto al gen humano como al homólogo animal. En este caso, se genera una lista de subsecuencias de una longitud particular para cada una de las objetivos, y después se comparan las listas para encontrar secuencias correspondientes en cada lista. Las subsecuencias se clasifican entonces de acuerdo con el número de secuencias objetivo que contiene la subsecuencia dada; y el objetivo es encontrar subsecuencias que estén presentes en la mayoría o todas de las secuencias objetivo. De forma alternativa, la clasificación puede identificar subsecuencias que son únicas para una secuencia objetivo, tal como una secuencia objetivo mutante. Dicha estrategia permitiría el uso de siNA para dirigir de forma específica la secuencia mutante y no realizar la expresión de la secuencia normal. 3. En algunos casos las subsecuencias de siNA están ausentes en una o más secuencias aunque están presentes en la secuencia objetivo deseada; este sería el caso si el siNA se dirige contra un gen con un miembro de familia parálogo que no debe ser objetivo. Al igual que en el caso 2 anterior, se genera una lista de subsecuencias de una longitud particular para cada una de las objetivos, y después se comparan las listas para encontrar secuencias correspondientes que están presentes en el gen objetivo pero están ausentes del parálogo que no debe ser objetivo. 4. Las subsecuencias de siNA clasificadas pueden analizarse adicionalmente y clasificarse de acuerdo con el contenido en GC. Puede otorgarse preferencia a los sitios que contienen 30-70% de GC, y mayor preferencia a los sitios que contienen 40-60% de GC. 5. Las subsecuencias de siNA clasificadas pueden analizarse adicionalmente y clasificarse de acuerdo con el autoplegamiento y horquillas internas. Se prefieren plegamientos internos más débiles, deben evitarse las estructuras en horquilla fuertes. 6. Las subsecuencias de siNA clasificadas pueden analizarse adicionalmente y clasificarse de acuerdo con si tienen trechos de GGG o CCC en la secuencia. GGG (o incluso más G) en cualquiera de las hebras puede hacer que la síntesis del oligonucleótido sea problemática y potencialmente puede interferir con la actividad de ARNi, de forma que debe evitarse cuando haya secuencias mejores disponibles. Se busca CCC en la hebra objetivo porque introducirá GGG en la hebra no codificante. 7. Las subsecuencias de siNA clasificadas pueden analizarse adicionalmente y clasificarse de acuerdo con si tienen el dinucleótído UU (dinucleótido de uridina) en el extremo 3' de la secuencia, y/o AA en el extremo 5' de la secuencia (proporcionando 3' UU en la secuencia no codificante). Estas secuencias permiten diseñar moléculas de siNA con dinucleótidos de timina TT en el extremo. 8. Se eligen cuatro o cinco sitios objetivo de la lista de subsecuencias clasificadas tal como se describe anteriormente. Por ejemplo, en las subsecuencias que tienen 23 nucleótidos, los 21 nucleótidos de la derecha de cada subsecuencia de 23meros se diseñan después y se sintetizan para la hebra superior (codificante) de la molécula bicatenaria de siNA, mientras que el complemento inverso de los 21 nucleótidos de cada subsecuencia de 23meros se diseñan después y se sintetizan por la hebra inferior (no codificante) de la molécula bicatenaria de siNA (véase el cuadro II). Si se desea tener restos TT en el extremo para la secuencia (tal como se describe en el párrafo 7), entonces se sustituyen los dos nucleótidos del extremo 3' tanto de la hebra codificante como no codificante por TT antes de sintetizar los oligos. 9. Las moléculas de siNA se criban en un cultivo de células in vitro, o en un sistema de modelo animal para identificar la molécula de siNA más activa o el sitio objetivo más preferido en la secuencia del ARN objetivo. 10. Pueden usarse otras consideraciones de diseño a la hora de seleccionar las secuencias de ácido nucleico objetivo, véase, por ejemplo, Reynolds y cois. 2004, Nature Biotechnology Advanced Oniine Publication, 1 de febrero de 2004, doi:10.1038/nbt936 y Ui-Tei y cois. 2004, Nucleic Acid Research, 32, doi:10.1093/nar/gkh247.

En una estrategia alternativa, se usa un conjunto de construcciones de siNA específicas de una secuencia se usa para cribar para determinar los sitios objetivo en células que expresan ARN objetivo, tal como células Jurkat, HeLa, A549 o 293T cultivadas. La estrategia general que se usa en este caso es la que se muestra en las Figuras 8A-8E. Las células que expresan el ARN objetivo se transfieren al conjunto de construcciones de siNA y se eligen las células que demuestran un fenotipo asociado a la inhibición del objetivo. El conjunto de construcciones de siNA puede expresarse a partir de casetes de transcripción insertados en vectores apropiados (véase por ejemplo las Figuras 6A-6C y las Figuras 7A-7C). El síNA de células que demuestran un cambio fenotípico positivo (por ejemplo, menor proliferación, niveles menores de mARN objetivo o menor expresión de proteínas objetivo), se secuencia para determinar el sitio(s) objetivo de la secuencia de ARN objetivo. En una modalidad, se seleccionan moléculas de siNA de la invención usando la siguiente metodología. Las siguientes directrices se compilaron para predecir los siNA hiperactivos que contienen modificaciones químicas descritas en el presente documento. Estas reglas surgieron de un análisis comparativo de los siNA hiperactivos (>75% de reducción de los niveles de mARN objetivo) e inactivos (<75% de reducción de los niveles de mARN objetivo) contra diversas objetivos diferentes. Se analizó un total de 242 secuencias de siNA. Se agruparon treinta y cinco siNA de los 242 en los grupos de hiperactivos y el resto de los siNA en los inactivos. Los siNA hiperactivos mostraron claramente una preferencia por ciertas bases en posiciones particulares de nucleótidos de la secuencia de siNA. Por ejemplo, la presencia de las nucleobases A o U era abrumadora en la posición 19 de la hebra codificante en los siNA hiperactivos y se cumplía lo contrario para los siNA inactivos. También se daba un patrón de una región rica en A/U (3 de 5 bases de A o U) entre las posiciones 15-19 y una región rica en G/C entre las posiciones 1-5 (3 de las 5 bases G o C) de la hebra codificante en los siNA hiperactivos. Tal como se muestra en el cuadro V, se identificaron 12 de dichos patrones que eran característicos de los siNA hiperactivos. Debe observarse que no todos los patrones estaban presentes en cada siNA hiperactivo. Así, para diseñar un algoritmo para predecir los siNA hiperactivos, se asignó una puntuación diferente a cada patrón. Dependiendo de la frecuencia con la que aparecían dichos patrones en los siNA hiperactivos comparados con los siNA inactivos, se asignaron los parámetros para puntuar, siendo 10 el mayor. Si no se prefiere una cierta nucleobase en una posición, entonces se asignaba una puntuación negativa. Por ejemplo, en las posiciones 9 y 13 de la hebra codificante, no se prefería un nucleótido G en los siNA hiperactivos y por lo tanto se les asignaba una puntuación de -3 (menos 3). La puntuación diferencial para cada patrón es proporciona en el cuadro V. Al patrón nJ 4 se le asignó una puntuación máxima de -100. Esto es principalmente para entresacar cualquier secuencia que contiene serie de 4 G o 4 C ya que pueden ser muy incompatibles para la síntesis y pueden permitir que las secuencias se autoagreguen, dejando así el siNA inactivo. Usando este algoritmo, la puntuación más alta posible para cualquier siNA es 66. Dado que hay numerosas secuencias de siNA posibles contra cualquier objetivo de tamaño razonable (-1000 nucleótidos) dada, este algoritmo es de utilidad para generar los siNA hiperactivos. En una modalidad, se usan las reglas 1-11 que se muestran en el cuadro V para generar moléculas de siNA activas de la invención. En otra modalidad, se usan las reglas 1-12 que se muestran en el cuadro V para generar moléculas de siNA activas de la invención.

EJEMPLO 4 Diseño de los siNA Se eligieron los sitios objetivo del siNA para analizar las secuencias del objetivo y opcionalmente para priorizar los sitios objetivo basándose en las reglas que se presentan en el Ejemplo 3 anterior, y de forma alternativa basándose en el plegamiento (la estructura de cualquier secuencia dada que se analiza para determinar la accesibilidad del siNA al objetivo), o usando una colección de moléculas de siNA tal como se describe en el Ejemplo 3, o de forma alternativa usando un sistema de siNA in vitro tal como se describe en el Ejemplo 6 en el presente documento. Se diseñaron moléculas de siNA que podían unirse a cada objetivo y se seleccionaron usando el algoritmo anterior y opcionalmente se analizaron individualmente mediante plegamiento por ordenador para evaluar si la molécula de siNA puede interactuar con la secuencia objetivo. Puede elegirse variar la longitud de las moléculas de siNA para optimizar la actividad. De forma general, se elige un número se analizaron de bases nucleotídicas complementarias para unirse, o para interactuar de otro modo, con el ARN objetivo, pero el grado de complementariedad puede modularse para acomodar las moléculas de siNA bicatenarias o variar la longitud o composición de las bases. Al usar dicha metodología, pueden diseñarse moléculas de siNA para dirigirlas contra sitios objetivo de cualquier secuencia de ARN conocida, por ejemplo las secuencias de ARN que corresponden a cualquier transcrito génico. Se analizan secuencias objetivo para generar objetivos a partir de las que se diseñan siNA bicatenarios (Cuadro II). Para generar construcciones de siNA sintéticas, se utiliza el algoritmo que se describe en el Ejemplo 3 para elegir construcciones bicatenarias activas y sus versiones químicamente modificadas. Por ejemplo, en el cuadro II, se muestra la secuencia objetivo, junto con la hebra superior (hebra codificante) e inferior (hebra no codificante) de la molécula bicatenaria de siNA. Se diseñan siNA multifuncionales buscando sitios homólogos entre diferentes secuencias objetivo (por ejemplo, regiones de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 nucleótidos de homología compartida) y permitiendo pares de bases no canónicos (por ejemplo emparejamiento con titubeo G:U) o pares de bases con emparejamiento erróneo. Las construcciones de siNA químicamente modificadas se diseñaron tal como se describe en el presente documento (véase por ejemplo el cuadro I) para proporcionar estabilidad de nucleasas para la administración sistémica in vivo y/o para unas propiedades mejoradas de farmacocinética, localización, y administración a la vez que se mantiene la capacidad a actuar de mediadora de la actividad de ARNi. Se introducen modificaciones químicas tal como se describen en el presente documento sintéticamente usando procedimientos de síntesis que se describen en el presente documento y las conocidas de forma general en la técnica. Las construcciones de siNA sintéticas se ensayan entonces para determinar la estabilidad contra nucleasas en suero y/o extractos celulares/tisulares (por ejemplo extractos hepáticos). Las construcciones de siNA sintéticas también se analizan en paralelo para determinar la actividad de ARNi usando un ensayo apropiado, tal como un ensayo con testigo de luciferasa tal como se describe en el presente documento u otro ensayo adecuado que puede cuantificar la actividad de ARNi. Las construcciones de siNA sintéticas que tanto estabilidad contra nucleasas como actividad de ARNi pueden modificarse adicionalmente y reevaluarse en ensayos de estabilidad y actividad. Las modificaciones quimicas de las construcciones de siNA activas estabilizadas entonces pueden aplicarse a cualquier siNA dirigiendo la secuencia contra cualquier ARN elegido y usarse, por ejemplo, en ensayos de cribado de objetivos para escoger compuestos de siNA directores para el desarrollo terapéutico (véase por ejemplo la Figura 9).

EJEMPLO 5 Síntesis química y purificación de siNA Las moléculas de siNA pueden diseñarse para interactuar con diversos sitios del ARN mensajero, por ejemplo, secuencias objetivo de las secuencias de ARN tal como se describe en el presente documento. La secuencia de una hebra de la molécula de siNA(s) es complementaria a las secuencias de los sitios objetivo como se describe anteriormente. Las moléculas de siNA pueden sintetizarse químicamente usando procedimientos que se describen en el presente documento. Las moléculas inactivas de siNA que se usan como secuencias de control pueden sintetizarse alterando la secuencia de las moléculas de siNA de tal forma que no sea complementaria a la secuencia objetivo. De forma general, las construcciones de siNA pueden sintetizarse usando procedimientos de síntesis de oligonucleótidos en fase sólida tal como se describe en el presente documento (véase por ejemplo Usman y cois., patentes de Estados Unidos NJ 5,804,683; 5,831 ,071 ; 5,998,203; 6,117,657; 6,353,098; 6,362,323; 6,437,117; 6,469,158; Scaringe y cois, patentes de Estados Unidos NJ 6,111 ,086; 6,008,400; 6,111 ,086 todos los cuales se incorporan por referencia al presente documento en su totalidad). En un ejemplo no limitante, se sintetizan oligonucleótidos de ARN por etapas usando las reacciones de fosforamidita tal como se conoce en la técnica. Las reacciones de fosforamidita estándar implican el uso de nucleósidos que comprenden cualquiera de los grupos de 5'-O-dimetoxitritilo, 2'-O-terc-butildimetilsililo, 3'-O-2-cianoetil N,N-diisopropilfosforoamidita, y grupos exocíclicos de protección de amina (por ejemplo N6-benzoil adenosina, N4 acetil citidina, y N2-isobutiril guanosina). De forma alternativa, pueden usarse éteres de 2'-O-sililo junto con un grupos protectores de 2 -O-ortoéster lábiles al ácido en la síntesis de ARN tal como describe Scaringe referencia anterior. Diferentes grupos en 2' pueden necesitar diferentes grupos protectores, por ejemplo los nucleósidos de 2'-desoxi-2'-amino pueden utilizar protección en N-ftaloilo tal como describen Usman y cois, patentes de Estados Unidos 5,631 ,360, que se incorpora por referencia al presente documento en su totalidad). Durante la síntesis en fase sólida, se añade cada nucleótido de forma secuencial (en dirección 3'- a 5) al oligonucle?tido unido al soporte sólido. El primer nucleósido en el extremo 3'de la cadena está unido covalentemente a un soporte sólido (por ejemplo, vidrio con poro controlado o poliestireno) usando diversos enlazadores. El nucleótido precursor, una fosforamidita de nucleósido, y el activador se combinan provocando el acoplamiento de la segunda fosforamidita de ribonucleósido sobre el extremo 5' del primer nucleósido. El soporte se lava después y a todos los grupos 5 -hidroxilo sin reaccionar se les introduce una caperuza con un reactivo caperuza tal como anhídrido acético anhídrido proporcionando restos 5'-acetilo inactivos. El enlace de fósforo trivalente se oxida después al enlace fosfato más estable. Al final del ciclo de adición de nucleótidos, se escinde el grupo protector de 5'-O en condiciones adecuadas (por ejemplo, condiciones acidas para los grupos con base de tritilo y fluoruro para los grupos con base de sililo). El ciclo se repite para cada nucleótido posterior. La modificación de las condiciones de síntesis puede usarse para optimizar la eficacia de acoplamiento, por ejemplo usando distintos tiempos de acoplamiento, que difieren en las concentraciones de reactivo/fosforamidita, que difieren en los tiempos de contacto, que difieren en los grupos de los soportes sólidos y de los enlazadores para los soportes sólidos dependiendo de la composición química particular del siNA a sintetizar. La desprotección y purificación del siNA puede realizarse tal como se describe de forma general en Usman y cois, documentos US 5,831 ,071 , US 6,353,098, US 6,437,117, y Bellon y cois, US 6,054,576, US 6,162,909, US 6,303,773, o Scaringe referencia anterior, que se incorporan por referencia al presente documento en su totalidad. Además, pueden modificarse las condiciones de desprotección proporcionando el mejor rendimiento y pureza posibles para las construcciones de siNA. Por ejemplo, el solicitante ha observado que los oligonucleótidos que comprenden nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pueden degradarse en condiciones de desprotección inapropiadas. Dichos oligonucleótidos se desprotegen usando metilamina acuosa a aproximadamente 35 °C durante 30 minutos. Si el oligonucleótido que contiene 2'-desoxi-2'-fluoro también comprende ribonucleótidos, después de la desprotección con metilamina acuosa a aproximadamente 35 °C durante 30 minutos, se añade TEA-HF y la reacción se mantiene a aproximadamente 65 °C durante 15 minutos más. Las hebras de siNA monocatenarias desprotegidas se purifican mediante intercambio de aniones logrando una alta pureza a la vez que se mantiene un rendimiento elevado. Para formar la molécula bicatenaria de siNA, las hebras monocatenarias se combinan en proporciones molares iguales a una solución salina formando la molécula bicatenaria. La molécula bicatenaria siNA se concentra y desala mediante filtración tangencial antes de la liofilización EJEMPLO 6 Ensavo de ARNi in vitro para evaluar la actividad de siNA Se usa un ensayo in vitro que recapitula ARNi en un sistema sin células para evaluar las construcciones de siNA dirigidas contra ARN objetivo. El ensayo comprende el sistema que describen Tuschl y cois, 1999, Genes and Development, 13, 3191-3197 y Zamore y cois, 2000, Cell, 101 , 25-33 adaptado para usar con un ARN objetivo. Un extracto de Drosophila derivado de blastodermo sincitial se usa para reconstituir la actividad de ARNi in vitro. El ARN objetivo se genera mediante transcripción in vitro a partir de un objetivo apropiada que expresa el plásmido usando ARN polimerasa de T7 o mediante síntesis química tal como se describe en el presente documento. Se hibridan las hebras codificante y no codificante de siNA (por ejemplo 20 µM de cada una) mediante incubación en tampón (tal como acetato potásico 100 mM, HEPES-KOH 30 mM, a pH 7.4, acetato de magnesio 2 mM) durante 1 minuto a 90 °C seguido de 1 hora a 37 °C, después se diluye en tampón de lisis (por ejemplo acetato potásico 100 mM, HEPES-KOH 30 mM a pH 7.4, acetato de magnesio 2 mM). La hibridación puede controlarse mediante electroforesis en gel en un gel de 30 mM en tampón TBE y teñirse con bromuro de etidio. El lisado de Drosophila se prepara usando embriones de cero a dos horas de edad de mostas Oregon R sobre agar de melaza con levadura que se descorionan y se lisan. El lisado se centrifuga y se aisla el sobrenadante. El ensayo comprende una mezcla de reacción que contiene 50% de lisado [vol/vol], ARN (concentración final de 10-50 pM) y 10% [vol/vol] de tampón de lisis que contiene siNA (concentración final 10 nM). La mezcla de reacción también contiene fosfato de creatina 10 mM, fosfocinasa de creatina 10 µg/ml, GTP 100 µM, UTP 100 µM, CTP 100 µM, ATP 500 µM, DTT 5 mM, 0J U/µl de RNasin (Promega), y 100 µM de cada aminoácido. La concentración final de acetato potásico se ajusta a 100 mM. Las reacciones se montan previamente sobre hielo y se preincuban a 25° C durante 10 minutos antes de añadir ARN, después se incuban a 25° C durante 60 minutos más. Las reacciones se inactivan con 4 volúmenes de 1.25 x tampón Passive Lysís (Promega). La escisión del ARN objetivo se ensaya mediante análisis de ARN objetivo u otro procedimientos conocido en la técnica y se compara con las reacciones de control en las que se omite siNA de la reacción. De forma alternativa, se prepara ARN objetivo marcado internamente para el ensayo mediante transcripción in vitro en presencia de [alfa-32p] CTP, se pasa por una columna Sephadex G50 mediante cromatografía centrífuga y se usa como ARN objetivo sin purificación 32 adicional. Opcionalmente, el ARN objetivo se marca con P en el extremo 5' usando la enzima polinucleótido cinasa de T4. Los ensayos se realizan tal como se describe anteriormente y el ARN objetivo y los productos de escisión de ARN específicos que se generan mediante ARNi se visualizan sobre una autorradiografía de un gel. El porcentaje de escisión se determina mediante cuantifidación de bandas con PHOSPHOR IMAGER® (autorradiografía) que representa ARN de control intacto o ARN de reacciones de control sin siNA y los productos de escisión que genera el ensayo. En una modalidad, se usa este ensayo para determinar los sitios objetivo del ARN objetivo para la escisión de siNA mediada por siNA, en la que una pluralidad de construcciones de siNA se criban para determinar la escisión mediada por ARNi del ARN objetivo, por ejemplo, analizando la reacción del ensayo mediante electroforesis de ARN objetivo marcado o mediante transferencia northern, así como por otra metodología bien conocida en la técnica.

EJEMPLO 7 Inhibición mediante ácido nucleico de ARN objetivo Las moléculas de siNA dirigidas contra un ARN objetivo se diseñan y sintetizan tal como se describe anteriormente. Estas moléculas de ácido nucleico pueden analizarse para determinar la actividad de escisión in vivo, por ejemplo, usando los siguientes procedimientos. Las secuencias objetivo y la localización del nucleótido en el ARN objetivo se proporcionan en el cuadro II. Se usan dos formatos para analizar la eficacia de los siNA dirigidos contra cualquier secuencia objetivo. Primero se analizan los reactivos en cultivo celular usando células HepG2, Jurkat, HeLa, A549 o 293T, para determinar la magnitud de la inhibición del ARN y proteína. Los reactivos de siNA se seleccionan contral objetivo tal como se describe en el presente documento. La inhibición de siNA se mide después de la administración de estos reactivos mediante un agente de transfección adecuado, por ejemplo, a células HepG2, Jurkat, HeLa, A549 o 293T. Se miden las cantidades relativas de ARN objetivo comparadas con actina usando monitorización por PCR de la amplificación a tiempo real (por ejemplo, ABl 7700 TAQMAN®). Se realiza una comparación con una mezcla de secuencias de oligonucleótidos preparada contra objetivos no relacionadas o contra un siNA aleatorio de control con la misma longitud y grupos químicos totales, pero sustituidos de forma aleatoria en cada posición. Se eligen los reactivos primarios y secundarios directores paral objetivo y se realiza la optimización. Después de elegir una concentración óptima de agente de transfección, se realiza una tanda de inhibición de ARN con la molécula de siNA directora. Además, puede usarse un formato de plaqueo de células para determinar la inhibición del ARN.

Administración de siNA a las células Se siembran células (por ejemplo, células HepG2, Jurkat, HeLa, A549 o 293T), por ejemplo, a 1x10^ células por pocilio de una placa de seis pocilios en EGM-2 (BioWhittaker) el día anterior a la transfección. Se forman complejos de siNA (concentración final, por ejemplo de 20 nM) y lipido catiónico (por ejemplo, formulaciones en LNP del presente documento, u otro lípido adecuado tal como Lipofectamine, a una concentración final de 2 µg/ml) en medio basal EGM (Biowhittaker) a 37°C durante 30 minutos en tubos de poliestireno. Tras la agitación en vórtice, se añade el siNA formando complejos a cada pocilio y se incuba durante los tiempos que se indican. Para los experimentos de optimización iniciales, se siembran las células por ejemplo, a 1x10^ en placas de 96 pocilios y se añade complejo de siNA tal como se describe. La eficacia de administración de siNA a las células se determina usando un siNA fluorescente formando complejos con lípido. Las células en placas de 6 pocilios se incuban con siNA durante 24 horas, se enjuagan con PBS y se fijan en paraformaldehído al 2% durante 15 minutos a temperatura ambiente. La captación de siNA se visualiza usando a un microscopio de fluorescencia.

TAQMAN® (control de la amplificación por PCR en tiempo real) y cuantificación de mARN en Liqhtcvcler Se prepara el ARN total a partir de células tras la administración de siNA, por ejemplo, usando kits de purificación de ARN Qiagen para los ensayos de 6 pocilios o kits de extracción Rneasy para los ensayos en 96 pocilios. Para el análisis por TAQMAN® (control de la amplificación por PCR en tiempo real), se sintetizan sondas con marcado doble con el tinte testigo, FAM o JOE, ligado de forma covalente al extremo 5' y el tinte inactivador TAMRA conjugado en el extremo 3'. Se realizan amplificaciones por RT-PCR en una etapa, por ejemplo, en un detector de secuencias ABl PRISM 7700 usando reacciones de 50 µl constituidas por 10 µl de ARN total, cebador directo 100 nM, cebador inverso 900 nM, sonda 100 nM, tampón de reacción de PCR 1X TaqMan (PE-Applied Biosystems), MgCI2 5.5 mM, 300 µM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP, y dTTP, 10U de inhibidor de RNasas (Promega), 1.25 U de AMPLITAQ GOLD® (ADN polimerasa) (PE-Applied Biosystems) y 10 U de M-MLV Reverse Transcriptase (Promega). Las condiciones de ciclado térmico pueden consistir en 30 minutos a 48 °C, 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 15 segundos a 95 °C y 1 minuto a 60 °C. La cuantificación de los niveles de mARN se determina relativa a patrones generados a partir de ARN celular total (300, 100, 33, 11 ng/reacción) y normalizando con ß-actina o mARN de GAPDH en reacciones TAQMAN® paralelas (control de la amplificación por PCR en tiempo real). Para cada gen de interés se diseñan un cebador superior e inferior y una sonda marcada con fluorescencia. La incorporación en tiempo real de tinte SYBR Green I a un producto específico de la PCR puede medirse en tubos capilares de cristal usando un lightcycler. Se genera una curva de patrones para cada par de patrones usando cARN de control. Los valores se representan en términos de expresión relativa a GAPDH en cada muestra.

Transferencia Western Pueden prepararse extractos nucleares usando una técnica de micropreparación estándar (véase por ejemplo Andrews y Faller, 1991 , Nucleic Acid Research, 19, 2499). Se preparan extractos de proteína de los sobrenadantes, por ejemplo usando precipitación con TCA. Se añade un volumen igual de 20% de TCA al sobrenadante celular, se incuba sobre hielo durante 1 hora y se sedimenta por centrifugación durante 5 minutos. Los sedimentos se lavan en acetona, se secan y se resuspenden en agua. Los extractos de proteínas celulares se pasan por un gel de poliacrilamida de 10% de Bis-Tris NuPage (extractos nucleares) o 4-12% de Tris-Glicina (extractos de sobrenadante) y se transfieren sobre membranas de nitrocelulosa. La unión no específica puede bloquearse mediante incubación, por ejemplo, con 5% de leche desnatada durante 1 hora seguido de anticuerpo primario durante 16 horas a 4°C. Tras los lavados, se aplica el anticuerpo secundario, por ejemplo (dilución de 1 :10.000) durante 1 hora a temperatura ambiente y la señal se detecta con reactivo SuperSignal (Pierce).

EJEMPLO 8 Modelos de utilidad para evaluar la regulación por disminución de la expresión del gen objetivo La evaluación de la eficacia de las moléculas de siNA de la invención en modelos animales es un requisito previo importante para los ensayos clínicos en seres humanos. Pueden adaptarse diversos modelos animales de enfermedades, afecciones, o trastornos de cáncer, proliferativos, inflamatorios, autoinmunitarios, neurológicos, oculares, respiratorios, metabólicos, auditivos, dermatológicos, etc. como se conoce en la técnica para usar para la evaluación preclinica de la eficacia de las composiciones de ácido nucleico la invención para modular la expresión del gen objetivo hacia el uso terapéutico, cosmético o de investigación.

EJEMPLO 9 Inhibición mediada por ARNi de la expresión del gen objetivo Inhibición de ARN mediada por siNA objetivo in vitro Se analizan las construcciones de siNA para determinar la eficacia en la reducción de la expresión de ARN objetivo en células, (por ejemplo, células HEKn/HEKa, HeLa, A549, A375). Las células se plaquean aproximadamente 24 horas antes de la transfección a placas de 96 pocilios a 5.000-7.500 células/pocilio, 100 µl/pocillo, de tal forma que en el momento de la transfección las células muestran una confluencia del 70-90%. Para la transfección, se mezclan siNAs hibridados con el reactivo de transfección (Lipofectamine 2000, Invitrogen) en un volumen de 50 µl/pocillo y se incuban durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las mezclas de transfección de siNA se añaden a las células proporcionando una concentración final de siNA de 25 nM en un volumen de 150 µl. Cada mezcla de transfección de siNA se añade a 3 pocilios para los tratamientos de siNA por triplicado. Las células se incuban a 37° durante 24 horas en presencia continua de la mezcla de transfección de siNA. En 24 horas, se prepara el ARN de cada pocilio de células tratadas. Primero se retiran y desechan los sobrenadantes con las mezclas de transfección, después se lisan las células y se prepara el ARN de cada pocilio. Se evalúa la expresión del gen objetivo tras el tratamiento mediante RT-PCR para el gen objetivo y para un gen de control (36B4, una subunidad de ARN polímerasa) para la normalización. Se hace la media de los datos triplicados y se determinan las desviaciones típicas para cada tratamiento. Se representan los datos normalizados y se determina la reducción porcentual del mARN objetivo por los siNA activos comparados con sus siNA invertidos de control respectivos.

EJEMPLO 10 Eficacia de las construcciones de siNA estabilizadas con uno o más ribonucleótidos en posiciones seleccionadas Se generaron construcciones quiméricas de siNA (véase el cuadro II) que contenían bloques de 6-ribonucleótidos o bien en la hebra codificante (hebra pasajera) o en la hebra no codificante (guía) a la vez que se mantenían todos los otros nucleótidos químicamente modificados. Se observó la inactivación del mensajero de VHB objetivo midiendo los niveles de proteína (HBsAg) en lugar de los niveles de mARN. La presencia de un bloque de ribonucleótidos en el extremo 5' o 3' o bien de la hebra codificante o de la hebra guía de los siNA mostró una potente actividad de silenciamiento, al igual que las construcciones de siNA donde el bloque ribonucleotídico de los extremos también tenía un ribonucleótido complementario en la hebra opuesta. Los datos para las construcciones de siNA del sitio 262 de VHB se muestran en la Figura 26, construcciones de siNA del sitio 263 en la Figura 27, y las construcciones de siNA del sitio 1583 en la Figura 28. La determinación de los valores de IC50 en cultivo tisular reveló que los siNA quiméricos que contiene un bloque de 6 ribonucleótidos en las posiciones terminales de siNA para los sitios 262, 263 y 1583 de VHB (véanse las Figuras 33 y 34) mantenían la actividad. Se evaluaron construcciones adicionales, en las que el contenido en ribonucleótidos se había reducido a un único resto ribonucleotídico en la posición del extremo 5' de la secuencia de la hebra guía complementaria al sitio 263 de VHB para determinar su capacidad de mediar la ARNi. Los experimentos in vitro revelaron que un único resto ribonucleótidico en la posición del extremo 5' de la hebra guía mantenía la actividad de una molécula bicatenaria de siNA químicamente modificada (estructuras 7/23, 7/24 y/o 7/28, véase la Figura 31). Debido a que una molécula bicatenaria de siNA que contiene un único resto nucleotídico en la posición del nucleótido del extremo 5' de la hebra no codificante podía escindir el ARN objetivo de una forma catalítica, puede inferirse además que el grupo 2'-OH de la molécula de siARN no participa de forma directa en la escisión catalítica del ARN objetivo. Se evaluaron construcciones de siNA adicionales denominadas estructuras de estabilización Estab 7/23, 7/24, 7/25, 7/26, 7/27 y 7/28 (véase el cuadro I) para determinar su capacidad de mediar ARNi. La estabilidad en suero in vitro de la construcción de siNA 7/25 reveló que esta construcción tiene una semivida de >24 h en suero humano. El solicitante realizó ensayos de escisión por ARNi in vitro usando lisado celular HeLa como fuente de proteínas RISC para evaluar diversas construcciones de siNA para determinar su capacidad de inducir la escisión de ARN objetivo. Se evaluaron construcciones de siNA contra HCV dirigidas al sitio 304 de la configuración de siNA Estab 7/8 en el ensayo de escisión por ARNi in vitro (véase el cuadro II). La escisión específica de sitio de un ARN objetivo a 10 nucleótidos del extremo 5' de la secuencia de la hebra guia es diagnóstica de la escisión mediada por RISC. De hecho, se observó la escisión específica de sitio del ARN objetivo en la posición esperada con siNA contra HCV dirigido al sitio 304 de la configuración de siARN Estab 7/8. Esto muestra que el siARN completamente modificado opera a través de un mecanismo de ARNi y que no es necesaria la presencia de un grupo 2'-OH en el siNA para la escisión de ARN objetivo mediada por ARNi y que el grupo 2'-OH del siNA no participa en la escisión del ARN objetivo. Tal como se describe anteriormente, la presencia de restos de ribonucleótidos en las posiciones de nucleótidos del extremo 5' de la hebra guía produjo siARN con una fuerte actividad. Se evaluó la actividad de las construcciones de siARN en las que los primeros tres nucleótidos de la hebra guía que comprenden 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidinas y ribonucleótidos de purina. Esta estructura de estabilización se denomina Estab 29 (Cuadro I). Los siNA trabajaban igual de bien tanto en la estructura Estab 7/25 como en la Estab 7/29 (véase la Figura 32). Así, los restos de purina cuando están presentes en las posiciones de nucleótidos del extremo 5' pueden mantenerse como ribonucleótidos en la hebra guía y los nucleótidos de pirimidinas de la hebra guía pueden ser modificarse químicamente mientras mantienen una fuerte actividad de ARNi. Para establecer que estos siNA también funciona a través de la degradación específica de ARN mediada por RISC, se usó un ensayo de ARN in vitro usando lisado de células HeLa. La escisión específica de sitio del ARN objetivo a 10 nucleótidos del extremo 5' de la hebra guía es diagnóstica de la escisión mediada por RISC. De hecho, se observó la escisión específica de sitio del ARN objetivo en la posición esperada con los tres siNA de las configuraciones Estab 7/25 y 7/25. Esto sugiere que estas construcciones de siNA trabajan a través de un mecanismo de ARNi.

Materiales y métodos Síntesis y caracterización de oliponucleótidos Se sintetizaron oligonucleótidos siNA, se desprotegieron se purificaron tal como se describe en el presente documento. La integridad y pureza de los compuestos finales se confirmó por metodologías estándar de HPLC, CE y EM por MALDI OF.

Hibridación de siARN Se hibridaron hebras de siNA (20 µM cada hebra) en acetato potásico siNA, HEPES-KOH 30 mM a pH 7.4, acetato de magnesio 2 mM. La mezcla de hibridación primero se calentó a 90° C durante 1 min. y después se transfirió a 37 °C durante 60 minutos. La hibridación se confirmó mediante evaluación por PAGE no desnaturalizante y Tm en NaCI 150 mM.

Ensavo de estabilidad en suero Se diseñaron los oligonucleótidos de tal forma que los procedimientos de ligado estándar generaran hebras codificantes o no codificantes de longitud completa. Antes del ligado, se usaron procedimientos de cinasas estándar con [?-32P]ATP para generar un marcador 32P interno.

El material ligado se purificó en gel usando PAGE desnaturalizante. Se añadieron hebras codificantes (o no codificantes) marcadas internamente a material sin marcar para lograr una concentración final de 20 µM. La hebra complementaria sin marcar estaba presente a 35 µM. La hibridación se realizó tal como se describe anteriormente. La formación de moléculas bicatenarias se confirmó mediante PAGE sin modificar y posterior visualización en un Phosphoimager de Molecular Dynamics (Sunnyvale, CA). Se añadió siARN bicatenario o monocatenario marcado internamente a suero humano para lograr concentraciones finales de 90% de suero (Sigma, St. Louis, MO) y siARN bicatenario 2 µM con un exceso 1.5 µM del siARN monocatenario sin marcar. Las muestras se incubaron a 37° C. Las alícuotas se extrajeron en los momentos especificados y se inactivaron usando una digestión de cinco segundos con Proteinase K (20 µg) (Amersham, Piscataway, NJ) en Tris-HCl 50 mM a pH 7.8, EDTA 2.5 mM, 2.5% de SDS, seguido de la adición de a 6x el volumen de tampón de carga de formamida (90% de formamida, EDTA 50 mM, 0.015% de xileno cianol y azul bromofenol, oligonucleótido de búsqueda sin maracar 20 µM de la misma secuencia que la hebra radiomarcada). Las muestras se separaron mediante PAGE desnaturalizante y se visualizaron en un Phosphoimager de Molecular Dynamics. Para la cuantificación se empleó el programa ImageQuant (Molecular Dynamics).

Estudios en cultivo celular Las líneas celualres de hepatoblastoma humano Hep G2 se cultivaron en medio mínimo esencial de Eagle suplementado con 10% de suero de ternero fetal, glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0.1 mM, piruvato sódico 1 mM y Hepes 25 mM. Se generó cADN competente para la replicación excindiendo y religando las secuencias genómicas de VHB del vector psHBV-1. Se plaquearon las células Hep G2 (3 x 104 células/pocilio) en placas de microtitulación de 96 pocilios y se incubaron toda la noche. Se formó un complejo de lípido catiónico/ADN/s¡ARN que contenía (en concentraciones finales) lípido catiónico (11-15 µg/ml), psHBV-1 religado (4.5 µg/ml) y siARN (25 nM) en medio de crecimiento. Tras una incubación de 15 min. a 37°C, se añadieron 20 µl del complejo a las células Hep G2 plaqueadas en 80 µl de medio de cultivo sin antibióticos. Se eliminó el medio de las células 72 horas después de la transfección para el análisis de HBsAg. Todas las transfecciones se realizaron por triplicado.

Ensavo de HBsAa por ELISA Se determinaron los niveles de HBsAg usando el kit de ELISA para HBsAg de Genetic Systems/Bio-Rad (Richmond, VA), según las instrucciones del fabricante. Se usó la absorbancia de las células no trasnfectadas con el vector de HBsAg como ruido de fondo para el ensayo, y así se restó de los valores de las muestras experimentales.

EJEMPLO 12 Eficacia de las construcciones de siNA formuladas con diferentes grupos de colgadura en un modelo de infección por VHB crónica Para evaluar la actividad de composiciones de nanopartículas de siNA químicamente estabilizadas (véase Vargeese y cois, solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/678,531 y solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/703,946 relacionada, presentada el 29 de julio de 2005, y solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/737,024, presentada el 15 de noviembre de 2005, todas las cuales se incorporan por referencia al presente documento) se llevó a cabo una administración sistémica de la composición de siNA formulada (Formulación L-086 y L-061 , véase el cuadro IV y solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/737,024, presentada el 15 de noviembre de 2005) tras la inyección hidrodinámica (HDI) del vector de VHB en una cepa de ratón NOD.CB17-Prkdcscid/J (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Los ratones hembra tenían 5-6 semanas de edad y aproximadamente 20 gramos en el momento del estudio. El vector de VHB que se usó, pWTD, es un dímero de punta a punta del genoma completo de VHB. Para un ratón de 20 gramos, se inyectó una inyección total de 1.6 ml que contenía pWTD en solución salina, en la vena caudal en 5 segundos. Se inyectó un total de 0.3 µg del vector de VHB por ratón. Para permitir la recuperación del hígado de la alteración provocada por HDI, la administración de las composiciones de siNA formuladas se inició 6 días después de la HDI. Se administró siARN encapsulado activo o de control negativo a 3 mg/kg/día durante tres días mediante inyección IV estándar. Los animales se sacrificaron a los 10 días de la última dosis, y se midieron los niveles de ADN de VHB en suero. Las valoraciones de ADN de VHB se determinaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real y se expresaron en términos de media del loglO de copias /ml (± ETM). Se observaron reducciones significativas del ADN de VHB en suero (Figura 33) el día 10 en los grupos tratados con la composición de siNA formulada activa comparados con los grupos tanto de control con PBS como de control negativo.

Síntesis y caracterización de oligonucleótidos Todos los ARN se sintetizaron tal como se describe en el presente documento. Las hebras complementarias se hibridaron en PBS, se desalaron y se líofilizaron. Las secuencias de los siNA de VHB del sitio 263 se muestran a continuación y se les nombra de acuerdo con los números de compuestos Sima que se muestran en la Figura 33. Los siNA modificados que se usaron in vivo se nombran de acuerdo con su formulación en LNP, ya sea L-086 o L-061 (véase el cuadro IV y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nJ 60/737,024, presentada el 15 de noviembre de 2005).

Las secuencias de siNA para siNA de VHB activo son: hebra codificante: 5" B GGAcuucucucAAuuuucuTT B 3' (SEC ID NJ: 60) Compuesto nJ 33214 hebra no codificante: 5* AGAAAAuuGAGAGAAGuccUU 3' (SEC ID NJ: 61 ) Compuesto nJ 38749 hebra no codificante: 5' AGAAAAuuGAGAGAAGuccAC 3' (SEC ID NJ: 62) Compuesto nJ 47675 hebra no codificante: 5' AGAAAAuuGAGAGAAGuccTT 3' (SEC ID NJ: 63) Compuesto nJ 37793 hebra no codificante: 5' AGAAAAuuGAGAGAAGuccTsT 3' (SEC ID NJ: 64) Compuesto nJ 35092 Las secuencias de siNA para siNA de VHB invertido de control son: hebra codificante: 5' B ucuuuuAAcucucuuc GGTT B 3' (SEC ID NJ: 65) Compuesto nJ 33578 hebra no codificante: 5' ccuGAAGAGAGuuAAAAGATsT 3' (SEC ID NJ: 66) Compuesto nJ 46419 (donde minúsculas = 2'-desoxi-2'-flouro; Mayúsculas cursiva = 2'-desoxi; Mayúsculas subrayado = 2'-O-metilo; Mayúsculas negrita = ribonucleótido; T = timina; B = desoxiabásico invertido; y s = fosforotioato) Análisis del ADN de VHB Se extrajo ADN vírico de 50 µl de suero murino usando QIAmp 96 ADN Blood kit (Qiagen, Valencia, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se analizaron los niveles de ADN de VHB usando un detector de secuencias ABl Prism 7000 (Applied Bíosystems, Foster City, CA). La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó usando las siguientes secuencias de cebador y sonda: cebador directo 5'-CCTGTATTCCCATCCCATCGT (SEC ID NJ: 69, nucleótidos de VHB 2006-2026), cebador inverso 5'-TGAGCCAAGAGAAACGGACTG (SEC ID NJ: 70, nucleótidos de VHB 2063-2083) y sonda FAM 5'-TTCGCA AAATACCTATGGGAGTGGGCC (SEC ID NJ: 71 , nucleótidos de VHB 2035-2062). Se usó el vector psHBV-1 , que contiene el genoma completo de VHB, como curva de patrones para calcular las copias de VHB por ml de suero.

EJEMPL0 13 Actividad de siNA de VHB formulados en LNP en un modelo de infección por VHB en ratón El desarrollo de siARN terapéutico (siNA) por vías de administración sistémicas se fundamenta tanto en la modificación química de ARN para mejorar la estabilidad física como en las formulaciones para promover una dirección adecuada a los tejidos y captación celular. En este ejemplo, se encapsuló siNA químicamente modificado dirigido al virus de la hepatitis B humano (VHB) en una nanopartícula con base de lípido hepatotrófico y demostró una reducción de 2.5-3.0 Iog10 del ADN de VHB en circulación en ratones con VHB replicante. Además, se redujeron los niveles de ARN vírico en el hígado en >90% como consecuencia de la escisión del objetivo mediada por RISC tal como se determinó mediante análisis por RACE. Esto demuestra que la modificación química de siNA contra VHB es importante para la desactivación no mediada por citocinas del ARN vírico incluso con la administración mediada por nanopartículas. La formulación en nanopartículas proporciona el 65% de la dosis de siNA al hígado y el siNA puede detectarse en el hígado 14 días después de una única dosis. La administración de estos siNA formulados a ratones por inyección intravenosa se tolera bien según se midió por pruebas bioquímicas que incluyen los niveles de AST y ALT. Estos resultados apoyan el desarrollo terapéutico basado en siNA contra importantes patógenos víricos humanos del hígado tales como VHB y HCV. Tal como se describe en los ejemplos anteriores, se identificó un número de sitios objetivo activos para siNA en el genoma de VHB en estudios de cultivo celular, con un siNA particularmente potente que se iniciaba en el nucleótido 5' 263 (HBV263M) en la región S del ARN de VHB. La molécula de siNA HBV263 que se describe en el Ejemplo 12 anterior tiene una hebra codificante constituida por la SEC ID NJ: 60 y una hebra no codificante constituida por la SEC ID NJ: 64. hebra codificante: 5" B GGAcuucucucAAuuuucuTT B 3' (SEC ID NJ: 60) Compuesto nJ 33214 hebra no codificante: 5" AGAAAAuuGAGAGAAGuccTsT 3' (SEC ID NJ: 64) Compuesto nJ 35092 El trabajo que se describe en este estudio proporciona el uso de la tecnología de administración siNA en nanopartículas lipídícas novedosas (LNP) que conlleva una mayor administración de siNA al hígado, y que mejora drásticamente la potencia y duración de la actividad de siNA contra VHB in vivo, que incluye una reducción significativa del ARN de VHB en el hígado. Además, la reducción de ARN vírico se muestra que es una consecuencia directa de la escisión del objetivo mediada por siNA.

Formulación de sINA La formulación de LNP que se utiliza en el estudio es LNP-086 (véase el cuadro IV) Los siNA que se incorporan a las nanopartículas lipídicas con alta eficacia de encapsulación mezclando siNA en tampón en solución alcohólica de la mezcla lipídica, seguido de un proceso de diafiltración por etapas. La eficacia de encapsulación se determinó mediante procedimientos ortogonales usando HPLC (cromatografía por intercambio de aniones y de exclusión por tamaño) y ensayos RiboGreen (midiendo el cambio en la fluorescencia con y sin detergente). El tamaño de las partículas y las mediciones de la densidad de las cargas se realizaron usando un clasificador de partículas por tamaños Brookhaven (Holtsville, NY) ZetaPal.

Modelo de ratón basado en el vector de VHB Para evaluar la actividad de los siNA estabilizados químicamente contra VHB, se llevó a cabo la administración sistémica del siNA tras la inyección hidrodinámica (HDI) del vector de VHB en la cepa de ratones NOD.CB17-Pr/<dcsc'd/J (Jackson Labs, Bar Harbor, ME). Los ratones hembra tenían 5-6 semanas de edad y aproximadamente 20 gramos en el momento del estudio. El vector de VHB que se usó, pWTD, es un dímero de punta a punta del genoma completo de VHB. Para un ratón de 20 gramos, se inyectó una inyección total de 1.6 ml que contenía pWTD en solución salina, en la vena caudal en 5 segundos. Se inyectó un total de 0.3 µg del vector de VHB por ratón. La administración sistémica estándar de los siNA fue de 0.3 a 10 mg/kg/día. Para permitir la recuperación del hígado de la alteración provocada por HDI, la administración sistémica se inició 6 días después de la HDI.

Análisis del ADN de VHB Se extrajo ADN vírico de 50 µl de suero murino usando QIAmp 96 ADN Blood kit (Qiagen, Valencia, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se analizaron los niveles de ADN de VHB usando un detector de secuencias ABl Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA). La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó usando las siguientes secuencias de cebador y sonda: cebador directo 5'-CCTGTATTCCCATCCCATCGT (SEC ID NJ: 69, nucleótidos de VHB 2006-2026), cebador inverso 5'-TGAGCCAAGAGAAACGGACTG (SEC ID NJ: 70, nucleótidos de VHB 2063-2083) y sonda FAM d'-TTCGCA AAATACCTATGGGAGTGGGCC (SEC ID NJ: 71 , nucleótidos de VHB 2035-2062). Se usó el vector psHBV-1 , que contiene el genoma completo de VHB, como curva de patrones para calcular las copias de VHB por ml de suero.

Análisis del ARN de VHB Se aisló el ARN celular total a partir de aproximadamente 100 mg de tejido hepático de ratón usando Tri-Reagent (Sigma, St. Louis MO) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se cuantificaron los niveles de ARN de VHB y se normalizaron con ARN de GAPDH de ratón usando PCR por transcripción inversa en tiempo real (RT) en una reacción múltiple. Se calcularon las cantidades relativas tanto de VHB como de ARN de GAPDH a partir de una curva de patrones de ARN hepático total a partir de un ratón al que se había inyectado VHB (diluciones seriadas de factor 3 de 300 a 1 ng de ARN por reacción). Los cebadores y la sonda de VHB se describen anteriormente. Las secuencias de los cebadores y la sonda para el GAPDH de ratón son las siguientes: cebador directo 5'-GCATCTTGGGCTACAC TGAGG (SEC ID NJ: 72, nucleótidos de mGAPDH 855-875), cebador inverso 5'-GAAGGTGGAAGAGTGGGAGTTG (SEC ID NJ: 73, nucleótidos de mGAPDH 903-925), y sonda VIC 5'-ACCAGGTTGTCTCCTGCGACTTCAACAG (SEC ID NJ: 74, nucleótidos de mGAPDH 876-913). Los niveles de ARN de VHB hepático se expresan en términos de la proporción entre el ARN de VHB y GAPDH.

Ensavo de escisión de objetivos por RACE en 5' El análisis ARN se realizó de acuerdo con el protocolo del GeneRacer Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA), excepto que no se realizó el tratamiento anterior del ARN total. El ARN hepático total (5 µg) de animales tratados con siNA activo y de control se ligó a la molécula adaptadora del GeneRacer. El ARN ligado se transcribió inversamente usando un cebador específico de VHB (VSP1 : 5'-TGAGCCAAGAGAAACGGACTG, SEC ID NJ: 75). Esto se siguió con amplificación por PCR usando cebadores complementarios al adaptador (GR5'- 5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA, SEC ID NJ: 76) y a VHB (VSP2: 5'-GCATGGTCCCGTACTGGTTGT, SEC ID NJ: 77). El tamaño del producto escindico (145 pb) se confirmó adicionalmente mediante PCR anidada usando cebadores (GR5' anidado 5'-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA, SEC ID NJ: 78) y (VSP3: 5'CAGACACATCCAGCGATAACCAG, SEC ID NJ: 79) y electroforesis en PAGE nativa. El producto amplificado de -145 pb se purificó en gel, se clonó y se secuenció para revelar un sitio de escisión de siNA.

Análisis de la inmunoestimulación Se inyectó a ratones macho CD-1 de 5 a 6 semanas de edad (Charles River, Wilmington, MA) una única dosis de 3 mg/kg de HBV263M-LNP o de control de PBS mediante inyección intravenosa estándar en la vena caudal lateral. Los animales se sacrificaron mediante inhalación de CO2 seguido inmediatamente de extracción de la sangre a las 2.5 y 8 horas de la administración (n=5 por cada tiempo). La sangre se recolectó a través de la vena cava y se procesó en forma de suero para su análisis. Todas las citocinas se cuantificaron usando kits de ELISA en formato sandwich de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Estas eran IL-6, TNF-alfa, IFN-gamma y IFN-alfa murinas (todas de R&D Systems, Minneapolis, MN).

Farmacocinética Los ratones CD-1 macho se obtuvieron de Charles River (Wilmington, MA) y pesaban aproximadamente 30 g en el momento del estudio. Se administró HBV263M-LNP en forma embolada IV estándar (100-120 µl) en una dosis de aproximadamente 3 mg/kg en una vena caudal lateral. Los animales se sacrificaron en los tiempo seleccionados (2 y 15 min.; 1 , 3 y 6 horas; y 1 , 5, 10 y 14 días después de la administración) mediante inhalación de CO2 seguido inmediatamente de extracción de sangre. La sangre se recolectó mediante punción cardiaca y se recolectó en tubos de marca Microtainer® que contenían EDTA y se recolectó el plasma. Después de la extracción de sangre, se perfundió a los animales con solución salina de calidad veterinaria estéril en el corazón. El hígado se pesó y se introdujo una muestra (~100 mg) en un tubo de homogenización previamente pesado y se congeló sobre hielo carbónico. La cuantificación de siNA en plasma y en las muestras de hígado se realizó usando un ensayo de hibridización en sandwich con un intervalo de concentración de trabajo de 0.026-6,815 ng/ml para la hebra pasajera y 0.027-6.945 ng/ml para la guía. Las muestras de hígado se prepararon con una concentración de 100 mg/ml en tampón de homogenización tisular (isotiocianato de guanidina 3 M, NaCI 0.5 M, Tris 0.1 M a pH 7.5, EDTA 10 mM). Esta mezcla se homogeneizó una vez en Bio-101 Homogenizer (Savant, Carlsbad, CA) con un ajuste de velocidad de 6.0 y un tiempo de actuación de 10 segundos. Las soluciones de hígado homogeneizadas se diluyeron a 10 mg/ml en tampón GITC 1 M (isotiocianato de guanidina 1 M, NaCI 0.5 M, Tris 0J M a pH 7.5, EDTA 10 mM), después se usaron en el ensayo en una dilución adicional (1 :2 a 1 :10). Las muestras de plasma se diluyeron > 25 veces en tampón GITC 1 M. Se calcularon las concentraciones totales de siNA añadiendo concentraciones de las hebras pasajera y guía. Se usó WinNonLin Professional (ver 3.3) para realizar el análisis farmacocinético no compartimentado de los datos de la concentración en función del tiempo.

Evaluación de la toxicidad A veinte ratones CD-1 macho se les administró el HBV263M- LNP mediante una única inyección IV embolada en una dosis de 3 mg/kg (n=10) o PBS (n=10). Los pesos corporales se midieron antes de un estudio y antes de la recolección de las muestras 1 ó 14 días después de la administración. En los tiempos apropiados, se sacrificó a los ratones mediante inhalación de CO2 seguido inmediatamente de extracción de sangre (n=5/tiempo) y se recogió la sangre para el análisis de la bioquímica sérica. Además, se tomaron los pesos del hígado y bazo y se calculó la proporción entre los órganos y el peso corporal.

Resultados siNA de VHB formulado en LNP Se usó la formulación de LNP-086 (véase el cuadro IV) para encapsular siNA activo contra HBV263M con una hebra codificante constituida por la SEC ID NJ: 60 y una hebra no codificante constituida por la SEC ID NJ: 64 y una formulación de control invertida correspondiente de HBV263inv con una hebra codificante constituida por la SEC ID NJ: 65 y una hebra no codificante constituida por la SEC ID NJ: 66. hebra codificante: 5' B ucuuuuAAcucucuucAGGTT B 3' (SEC ID NJ: 65) Compuesto nJ 33578 hebra no codificante: 5' ccuGAAGAGAGuuAAAAGATsT 3' (SEC ID NJ: 66) Compuesto nJ 46419 Se desarrolló un procedimiento para incorporar los siNA a las nanopartículas lipidicas con eficacia elevada mezclando simultáneamente soluciones de lípido y siNA, seguido de diafiltración por etapas. Usando este procedimiento, se encapsularon los siNA de HBV263M y HBV263Minv de control en la formulación LNP-086. La eficacia de encapsulación media de siNA se encontró que era de 84 ± 2%, según se determinó mediante ensayos por HPLC y RiboGreen. El tamaño medio de partícula era de 167 ± 10 nm, con polidispersión de 0.15 ± 0.05. El LNP presentaba una densidad de carga positiva superficial de 30 ± 2 mV. El siNA de HBV263M químicamente modificado encapsulado con la formulación de LNP se evaluó inicialmente para determinar la actividad en un sistema de cultivo celular de VHB. Un único tratamiento de células Hep G2 que replicaban VHB con HBV263M-LNP provocó una reducción dependiente de la dosis de los niveles de HBsAg, con una IC50 de 1 nM (no se muestran datos).

Actividad in vivo de HBV263M encapsulado en LNP Para evaluar la actividad in vivo de siNA encapsulado en LNP, se usó un model murino de replicación de VHB en el que la inyección hidrodinámica (HDI) de un vector con a replicación competente de VHB produce la replicación vírica en los hepatocitos. En este modelo, VHB se replica en el hígado de ratones inmunocomprometidos durante hasta 80 días, produciendo niveles detectables de ARN de VHB y antígenos en el higado, así como valoraciones de ADN de VHB y antígenos en suero que son similares a los niveles que se encuentran en pacientes con infección crónica.

Para evaluar la potencia y especificidad de VHB de HBV263M-LNP-086, se comparó su actividad con el siNA HBV263invM-LNP-086 de control. Los ratones con VHB replicantes se trataron con dosis de 0.3, 1 , o 3 mg/kg/día durante tres días, y se determinaron los niveles de ADN de VHB en suero y HBsAg 3 días después de la última dosis. Se observó una reducción dependiente de la dosis tanto en las valoraciones de ADN de VHB como de HBsAg en suero. Se observó el descenso de las valoraciones de ADN de VHB (Figura 34A) en suero de 3.0. 2.3, y 1.1 loglO (p<0.0001) y las reducciones de los niveles de HBsAg en suero (Figura 34B) de 2.4, 2.2, y 1.5 loglO (p<0.0001) en los grupos de tratamiento con 3, 1 , y 0.3 mg/kg, comparadas con los grupos de control con siNA o PBS. Los niveles de ADN de VHB o de HBsAg en suero eran equivalentes en los grupos tratados con siNA de control y PBS, demostrando la especificidad de la secuencia de la actividad contra VHB y la ausencia de efectos no específicos de los lípidos. Se examinó la duración de las reducciones mediadas por siNA de los niveles de VHB en el modelo de ratón. Los ratones con VHB replicantes se trataron con HBV263M-LNP-086 o HBV263Minv-LNP-086 en dosis de 3 mg/kg/dia durante tres días, seguido de análisis de valoraciones de VHB en suero los días 3, 7, y 14 después de la última dosis. La figura, la actividad contra VHB fue persistente, observándose una actividad todavía significativa el día 7 (reducción de 2.0 Iog10 ) y el día 14 (reducción de 1.5 Iog10 (Figura 35)). Esta persistencia prolongada de la actividad de siNA contra VHB sugería que la administración infrecuente del compuesto podría ser eficaz. Se usó el modelo murino de VHB para evaluar el efecto de la administración semanal. Se trató a los ratones con HBV263M-LNP-086 o HBV263Minv-LNP-086 a 3 mg/kg/dia los días 1 y 4 de la primera semana y después una vez a la semana durante otras tres semanas más. Las valoraciones de ADN de VHB en suero se determinaron para los días 7, 14, 21 , y 28. Los grupos tratados con HBV263M-LNP-086 presentaban reducciones de las valoraciones de VHB en suero comparadas con los grupos tratados con PBS de 1.7, 1.7, 1.8, y 1.3 loglO los días 7, 14, 21 , y 28 respectivamente (Figura 36). Estos resultados sugieren que las reducciones en las valoraciones de VHB pueden mantenerse mediante la administración semanal de HBV263M-LNP-086.

Escisión específica de ARN de VHB hepático mediada por siNA Para examinar la escisión de ARN de VHB específica del hígado mediada por la formulación activa de HBV263M-LNP-086, se trataron ratones con VHB replicantes con dosis de HBV263M-LNP-086 a 0.3, 1 , 3, 10 mg/kg/día o el control HBV263invM-LNP a 10 mg/kg durante tres días, y se determinaron los niveles de ARN de VHB 3 días después de la última dosis.

Se observó reducción dependiente de la dosis del ARN de VHB hepático (Figura 37), con descensos de 90%, 66,5%, 18%, y 4% que se observaron en los grupos de tratamiento con 10, 3, 1 , y 0.3 mg/kg de HBV263M-LNP respectivamente comparado con el control con HBV263invM-LNP-086 a 10 mg/kg.

Para demostrar de forma directa que la reducción del ARN de VHB hepático que se observó en el modelo de ratón era debida a la escisión mediada por ARNi de ARN de VHB, se usó un análisis de amplificación rápida de los extremos 5' de cADN (RACE) para detectar la escisión del ARN de VHB en el sitio previsto. Los ratones con VHB replicantes se trataron con HBV263M-LNP-086 o HBV263Minv-LNP-086 en una dosis de 3 mg/kg/d durante 3 días. Los animales se sacrificaron a los 3, 7, o 14 días de la última dosis, y se aisló el ARN hepático total. Era de esperar que el ligado de una secuencia adaptadora a los extremos 5' libres de la población de ARN y la posterior RT-PCR con adaptador y cebadores específicos de VHB diera un producto de la PCR de 145 pb si el ARN de VHB hubiera sido escindido en el sitio objetivo previsto. Tal como se muestra la Figura 38, se observó el producto de amplificación esperado en las muestras tratadas con siNA activo en HBV263 en cada tiempo, pero no en las muestras tratadas con el control de HBV263. Después se subclonaron los productos de la PCR y se secuenciaron, confirmando la unión correcta entre la secuencia adaptadora y el sitio de escisión previsto del siNA en HBV263. Este resultado establece que la reducción en ARN de VHB que se observa en el higado se debía a una escisión específica mediada por ARNi del ARN de VHB en el hígado. Además, la detección de los productos de escisión del ARN de VHB en los dias 7 y 14 demuestran que la duración la actividad del siNA contra VHB se debe a una escisión continuada del ARN de VHB.

Análisis de la inmunoestimulación inducida por siNA Se ha demostrado que los siNA sintéticos sin modificar formulados para la administración inducían la síntesis de citocinas inflamatorias e interferones de una forma específica de secuencia, tanto en células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) in vitro como en ratones in vivo. Se investigó el potencial del siNA HBV263M-LNP-086 químicamente modificado de provocar este tipo de respuesta inmunitaria comparado con una versión sin modificar (HBV263R-LNP-086). hebra codificante: 5' B GGACUUCUCUCAAUUUUCUTT B 3' (SEC ID NJ: 67) Compuesto nJ 34526 hebra no codificante: 5' AGAAAAUUGAGAGAAGUCCTT 3' (SEC ID NJ: 68) Compuesto nJ 34527 Se inyectó una dosis de 3 mg/kg de HBV263M-LNP-086 o HBV263R-LNP-086 a ratones CD-1. Se sacrificó a los animales a las 2.5 u 8 horas después de la administración y se recolectó la sangre. Para detectar los niveles pico en sangre, se midieron IL-6 y TNF-a en el punto de tiempo de 2.5 horas, mientras que los niveles de IFN-? y IFN-a se analizaron 8 horas después de la inyección. En el grupo tratado con HBV263M-LNP-086, el nivel medio de IL-6 era de 33 ± 21 pg/ml, un nivel no significativamente diferente del grupo de control con PBS a 13 ± 4 (Cuadro Vil). Además, en el grupo tratado con HBV263M-LNP-086 no se observó inducción de TNF-a IFN-a ni IFN-?. Por el contrario, se observó una inducción significativa de las cuatro citocinas en los animales tratados con HBV263R-LNP-086 (Cuadro VI). Estos resultados muestran que el siNA HBV263M-LNP-086 modificado no indujo las citocinas en ratones, comparados con la muy fuerte respuesta provocada por el siNA HBV263R-LNP-086 sin modificar. La ausencia de la inducción de citocinas por HBV263M-LNP-086 indica además que la actividad contra VHB que se observó en el modelo murino se debe al silenciamiento específico mediado por siNA de la expresión génica de VHB.

Farmacocinéticas del siNA formulado con LNP Se determinaron las propiedades farmacocinéticas de HBV263M-LNP-086 según en ratones después de una única dosis de 3 mg/kg. Se usó un procedimiento de hibridación para detectar el siNA HBV263M en plasma e hígado en función del tiempo (Figura 39). El HBV263M se eliminó rápidamente del plasma con una T1 2 de eliminación de aproximadamente 1.7 h. Sin embargo, se detectó HBV263M en el hígado durante todo el periodo de muestreo de 14 d y presentaba una T-| 2 de eliminación de 4 días. Se observó una concentración máxima de 31.3 ± 17.8 ng/mg (media ± desviación típica) en el hígado en 1 hora y correspondía a 65 ± 32% de la dosis de siNA. A los 14 días, 1.4 ± 0.7% de la dosis permanecía intacta en el hígado. La prolongada actividad contra VHB mediada por siNA que se observa en el modelo en ratones presenta una buena correlación con este tiempo de permanencia prolongado del siNA en el hígado.

Evaluación de la toxicidad de HBV263M-LNP Se realizó un estudio de dosis única para determinar los potenciales efectos tóxicos de HBV263M-LNP-086. La administración de HBV263M-LNP-086 fue bien tolerada por los animales sin morbilidad ni mortalidad. No se observaron cambios en el peso corporal ni en la proporción entre peso del órgano y corporal para el hígado y el bazo 1 o 14 días después de administración de 3 mg/kg de HBV263M-LNP (Cuadro Vil). No se observaron cambios morfológicos macroscópicos en el higado o el bazo. Además, no se observaron cambios en la bioquímica en suero que pudieran atribuirse a la administración de HBV263M-LNP-086 (Cuadro VIII). En global, el siNA HBV263 encapsulado en LNP-086 es bien tolerado al nivel de dosis que se usa para mostrar una reducción significativa de las valoraciones víricas en el modelo de VHB en ratones. En este estudio, se describe el uso de una formulación lipídica novedosa para la administración de siNA, se demuestra una mejora significativa de la administración de siNA al hígado, que provoca una mayor potencia y duración de las reducciones en las valoraciones de VHB en un modelo en ratones de infección por VHB. Se observó una correlación excelente entre las caracteristicas farmacocinéticas del siNA formulado en LNP, y la potencia y duración de la actividad de siNA in vivo. Tres dosis a 3 mg/kg/día de HBV263M-LNP-086 redujeron el ADN de VHB en suero de 2.5 a 3.0 log 10 comparado con siNA de control. El tratamiento con HBV263M-LNP-086 produjo una duración significativa de la actividad contra VHB con una reducción de 2.0 loglO del ADN de VHB en suero que se observó el día 7 y una reducción de 1.3 loglO el día 14. Este estudio también demuestra que el uso de siARN químicamente modificado encapsulado en la formulación de LNP abroga la inducción de citocinas mediada por siARN in vivo. Tomadas conjuntamente, el favorable perfil farmacocinético y de potencia de siARN HBV263M-LNP-086 han creado un compuesto antiviral con potencial relevancia terapéutica. Esta formulación administra siARN de forma eficaz al hígado, y puede utilizarse para la inactivación de las objetivos hepáticas asociadas a enfermedades endógenas.

EJEMPLO 14 Indicaciones Las afecciones y estados de enfermedad particulares que pueden asociarse a la modulación de la expresión génica incluyen, pero sin limitación enfermedades, afecciones, o trastornos de cáncer, proliferativos, inflamatorios, autoinmunitarios, neurológicos, oculares, respiratorios, metabólicos, dermatológicos, auditivos, hepáticos, renales, infecciosos, etc. tal como se describen en el presente documento o conocidos por otros medios en la técnica, y cualesquiera otras enfermedades, afecciones o trastornos que estén relacionados o que responden a los niveles de un objetivo (por ejemplo, proteína objetivo o polinucleótido objetivo) en una célula o tejido, sola o combinada con otras terapias.

EJEMPLO 15 Inhibición mediante siNA multifuncional de la expresión de ARN objetivo Diseño de siNA multifuncional Una vez se han identificado los sitios objetivo para las construcciones de siNA multifuncionales, cada hebra del siNA se diseña con una región complementaria de longitud, por ejemplo, de aproximadamente 18 a aproximadamente 28 nucleótidos, que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico objetivo diferente. Cada región complementaria se diseña con una región flanqueante adyacente de aproximadamente 4 a aproximadamente 22 nucleótidos que no es complementaria a la secuencia objetivo, pero que comprende complementariedad con la región complementaria de la otra secuencia (véase por ejemplo las Figuras 13A y 13B). Las construcciones de horquilla pueden diseñarse del mismo modo (véase por ejemplo las Figuras 14A y 14B). Puede usarse la identificación de secuencias complementaria, palíndromos o repetidas compartidas entres las diferentes secuencias de ácido nucleico objetivo para acortar la longitud global de las construcciones de siNA multifuncionales (véase por ejemplo las Figuras 15A-15B y 16A-16B).

En un ejemplo no limitante, se presentan tres categorías adicionales de diseños multifuncionales de siNA que permiten que una única molécula de siNA silencie múltiples objetivos. El primer procedimiento utiliza enlazadores para unir un siNA (o un siNA multifuncional) de forma directa. Esto puede permitir unir los siNA más potentes sin crear un tramo de ARN largo y continuo que presente el potencial de desencadenar una respuesta de interferones. El segundo procedimiento es una extensión dendrímera del diseño superpuesto o enlazado multifuncional; o de forma alternativa la organización de siNA en un formato supramolecular. El tercer procedimiento usa longitudes de hélice superiores a 30 pares de bases. El procesamiento de estos siNA mediante Dicer revelará nuevos extremos 5' no codificantes activos. Por lo tanto, los siNA largos pueden dirigirse contra los sitios que se definen mediante los extremos 5' originales y los definidos por los nuevos extremos que crea el procesamiento mediante Dicer. Cuando se usa combinada con siNA multifuncionales tradicionales (donde las hebras codificante y no codificante definen cada una un objetivo) la estrategia puede usarse por ejemplo para dirigirse a 4 o más sitios. /. siNA bifuncionales anclados La idea básica es una estrategia novedosa para el diseño de siNA multifuncionales en los que dos hebras no codificantes de siNA se hibridan a una única hebra codificante. El oligonucleótido de la hebra codificante contiene un enlazador (por ejemplo, un enlazador no nucleotítidico tal como se describe en el presente documento) y dos segmentos que se hibridan a las hebras no codificantes de siNA (véase la Figura 22). Los enlazadores también opcionalmente pueden comprender enlazadores con base nucleotídica. Diversas ventajas y variaciones potenciales a esta estrategia incluyen, pero sin limitación: 1.- Los dos siNA no codificantes son independientes. Por lo tanto, la elección de los sitios objetivo no está constreñida por una necesidad de conservación de la secuencia entre dos sitios. Cualesquiera dos siNA muy activos pueden combinarse formando un siNA multifuncional. 2 - Cuando se usan combinados con sitios objetivo que presentan homología, los siNA dirigidos contra una secuencia presente en dos genes (por ejemplo, diferentes isoformas), puede usarse secuencia para dirigirlo a más de dos sitios. Por ejemplo, puede usarse un único siNA multifuncional para dirigirse contra ARN de dos ARN objetivo diferentes. 3.- Los siNA multifuncionales que usan tanto las hebras codificante como no codificante para dirigirse contra un gen también pueden incorporarse a un diseño multifuccional anclado. Esto deja abierta la posibilidad de dirigirse contra 6 o más sitios con un único complejo. A.- Puede ser posible hibridar más de dos hebras no codificantes de siNA a una única hebra codificante anclada. 5.- El diseño evita tramos continuos largos de dsARN. Por lo tanto, es menos probable que inicie una respuesta de interferones. 6.- El enlazador (o modificaciones unidas a él, tales como conjugados que se describen en el presente documento) puede mejorar las propiedades farmacocinéticas del complejo o mejorar su incorporación a liposomas. Las modificaciones introducidas en el enlazador no deberían tener el mismo grado de impacto sobre la actividad de siNA que el que tendría si estuviera unido de forma directa al siNA (véase por ejemplo las Figuras 27 y 28). 7 '.- La hebra codificante puede extenderse más allá de las hebras no codificantes hibridadas proporcionando sitios adicionales para la unión de conjugados. 8.- La polaridad del complejo puede cambiarse de tal forma que ambos extremos 3' no codificantes estén adyacentes al enlazador y los extremos 5' estén distales al enlazador o una combinación de ellos. siNA dendrímeros y supramoleculares En la estrategia de siNA dendrímero, la síntesis de siNA se inicia primero sintentizando la plantilla dendrímera seguido de unión de los diversos siNA funcionales. En la Figura 20 se representan diversas construcciones. El número de siNA funcionales que puede unirse sólo está limitado por las dimensiones del dendrímero que se usa.

Estrategia supramolecular para el siNA multifuncional El formato supramolecular simplifica los retos de la síntesis de dendrímeros. En este formato, las hebras del siNA se sintetizan mediante reacciones de ARN estándar, seguido de hibridación de diversas hebras complementarias. La síntesis de hebras individuales contiene una secuencia no codificante codificante de un siNA en el extremo 5' seguida de un enlazador de ácido nucleico o sintético, tal como hexaetilenglicol, que a su vez viene seguido por la hebra codificante de otro siNA en una dirección de 5' a 3'.

Así, la síntesis de hebras de siNA puede realizarse en una dirección estándar de 3' a 5'. Los ejemplos representativos de siNA trifuncionales y tetrafuncionales se representan en la Figura 21. Basándose en un principio similar, pueden diseñarse construcciones de siNA con más funciones en tanto se logre una hibridación eficaz de las diversas hebras. siNA multifuncional posibilitado por Dicer Usando análisis bioinformático de múltiples objetivos, pueden identificarse tramos de secuencias idénticas compartidos entre diferentes secuencias objetivo que varían desde aproximadamente dos a aproximadamente catorce nucleótidos de longitud. Estas regiones idénticas pueden diseñarse con forma de hélices de siNA mayores (por ejemplo, >30 pares de bases) de tal forma que el procesamiento mediante Dicer revele un sitio funcional secundario 5' no codificante (véase por ejemplo la Figura 22). Por ejemplo, cuando los primeros 17 nucleótidos de una hebra no codificante de siNA (por ejemplo, hebras de 21 nucleótidos en una molécula bicatenaria con colgaduras 3'-TT) son complementarios a un ARN objetivo, se observó un silenciamiento potente a 25 nM. Con una complementariedad de solo 16 nucleótidos se observó un 80% de silenciamiento en el mismo formato. La incorporación de esta propiedad a los diseños de siNA de aproximadamente 30 a 40 o más pares de bases produce construcciones de siNA multifuncionales adicionales. El ejemplo de la Figura 22 ¡lustra cómo una molécula bicatenaria de 30 pares de bases puede dirigirse a tres secuencias diferentes después del procesamiento mediante Dicer-RNasalll; estas secuencias pueden estar en el mismo mARN o en ARN diferentes, tales como mensajes víricos y de factores del huésped, o puntos múltiples en una ruta dada (por ejemplo, cascadas inflamatorias). Además, una molécula bicatenaria de 40 pares de bases puede combinarse con un diseño bifuncional en tándem, proporcionando una única molécula bicatenaria dirigida contra cuatro secuencias objetivo. Una estrategia incluso más extensa puede incluir el uso de secuencias homologas para permitir que una molécula bicatenaria multifuncional silencie cinco o seis objetivos. El ejemplo de la Figura 22 demuestra cómo puede lograrse esto. Se escinde una molécula bicatenaria de 30 pares de bases mediante Dicer en productos de 22 y 8 pares de bases desde cada extremo (los fragmentos de 8 pb no se muestran). Para una presentación más fácil las colgaduras que se generan mediante Dicer no se muestran - pero pueden compensarse. Se muestran tres secuencias dirigidas. La identidad de la secuencia requerida superpuesta se indica mediante cajas grises. Las N del siNA progenitor de 30 pb son los sitios que se sugieren para las posiciones de 2'-OH para permitir la escisión por Dicer si se analiza en estructuras estabilizadas. Obsérvese que el procesamiento de una molécula 30mera bicatenaria mediante la Dicer RNasa lll no proporciona una escisión 22+8 precisa, sino que produce una serie de productos muy relacionados (siendo 22+8 el sitio principal). Por lo tanto, el procesamiento mediante Dicer proporcionará una serie de siNA activas. Otro ejemplo no limitante se muestra en la Figura 23. Se escinde una molécula bicatenaria de 40 pares de bases mediante Dicer en productos de 22 pares de bases desde cada extremo. Para una presentación más fácil las colgaduras que se generan mediante Dicer no se muestran - pero pueden compensarse. Las cuatro secuencias de dirección se muestran en cuatro colores, azul, azul claro y rojo y naranja. La identidad de la secuencia requerida superpuesta se indica mediante cajas grises. El formato del diseño puede extenderse a ARN más grandes. Si los siNA químicamente estabilizados se unen a Dicer, entonces los enlaces ribonucleotídicos localizados de forma estratégica pueden permitir diseñar productos de escisión que permitan un repertorio de diseños multifuncionales más extenso. Por ejemplo los productos de escisión que no se limitan al patrón de Dicer de aproximadamente 22 nucleótidos pueden permitir construcciones de siNA multifuncionales con una coincidencia en la identidad entres secuencias objetivo que varía en el intervalo, por ejemplo, de aproximadamente 3 a aproximadamente 15 nucleótidos.

EJEMPLO 14 Usos diagnóstico Las moléculas de siNA de la invención pueden usarse en una variedad de aplicaciones diagnósticas, tales como en la identificación de objetivos moleculares (por ejemplo, ARN) en una variedad de aplicaciones, por ejemplo, en entornos clínicos, industriales, medioambientales, agrícolas y/o de investigación. Dicho uso diagnóstico de moléculas de siNA implica el uso de sistemas de ARNi reconstituidos, por ejemplo, usando lisados celulares o lisados celulares parcialmente purificados. Las moléculas de siNA de esta invención pueden usarse como herramientas de diagnóstico para examinar la deriva genética y las mutaciones en células enfermas o para detectar la presencia de ARN endógeno o exógeno, por ejemplo vírico en una célula. La cercana relación entre la actividad fde siNA y la estructura del ARN objetivo permite detectar mutaciones en cualquier región de la molécula, que altera la formación de pares de bases y la estructura tridimensional del ARN objetivo. Mediante el uso de múltiples moléculas de siNA que se describen en esta invención, puede mapearse los cambios de nucleótidos, que son importantes para la estructura y función del de ARN in vitro, así como en células y tejidos. La escisión de ARN objetivo con moléculas de siNA puede usarse para inhibir la expresión génica y definir el papel de los productos génicos especificados en la progresión de la enfermedad o infección. De este modo, pueden definirse otras objetivos genéticas como mediadores importantes de la enfermedad. Estos experimentos producirán un mejor tratamiento de la progresión de la enfermedad al conferir la posibilidad de terapias combinadas (por ejemplo, múltiples moléculas de siNA dirigidas contra diferentes genes, moléculas de siNA acopladas a inhibidores moleculares cortos conocidos o tratamiento intermitente con combinaciones moléculas de siNA y/u otras moléculas químicas o biológicas). Otros usos in vitro de las moléculas de siNA de esta invención son bien conocidos en la técnica, e incluyen la detección de la presencia de mARN asociados a una enfermedad, infección, o afección relacionada. Dicho ARN se detecta determinando la presencia de un producto de escisión después del tratamiento con un siNA usando metodologías estándar, por ejemplo, transferencia por emisión resonante de fluorescencia (FRET). En un ejemplo específico, se usan las moléculas de siNA que escinden sólo formas silvestres o mutantes del ARN objetivo para el ensayo. Las primeras moléculas de siNA (es decir, las que escinden únicamente las formas de tipo silvestre de ARN objetivo) se usan para identificar el ARN de tipo silvestre presente en la muestra y las segundas moléculas de siNA (es decir, las que escinden sólo las formas mutantes de ARN objetivo) se usan para identificar ARN mutante en la muestra. Como controles de la reacción, los sustratos sintéticos tanto del ARN de tipo silvestre como mutante son escindidos por ambas moléculas de siNA para demostrar las eficacias relativas de siNA en las reacciones y la ausencia de escisión de las especies de ARN "que no son objetivos". Los productos de escisión de los sustratos sintéticos también pueden servir para generar marcadores de tamaño para el análisis de los ARN de tipo salvaje y mutante en la población de muestra. Así, cada análisis requiere dos moléculas de siNA, dos sustratos y una muestra desconocida, que se combina en seis reacciones. La presencia de productos de escisión se determina usando un ensayo de protección contra RNasa de forma que pueden analizarse los fragmentos de longitud completa y de escisión de cada ARN en un carril de gel de poliacrilamida. No es absolutamente necesario cuantificar los resultados para comprender la expresión de ARN mutantes y el riesgo putativo de los cambios fenotípicos deseados en las células objetivo. La expresión de mARN cuyo producto proteínico está implicado en el desarrollo del fenotipo (es decir, relacionado con la enfermedad o la infección) es adecuada para establecer el riesgo. Si se usan sondas de actividad específica comparable para ambos transcritos, entonces una comparación cualitativa de los niveles de ARN es adecuada y disminuye el coste del diagnóstico inicial. Las proporciones más altas entre forma mutante y tipo silvestre se correlacionan con un mayor riesgo independientemente de si los niveles de ARN se comparan de forma cualitativa o cuantitativa. Todas las patentes y publicaciones que se mencionan en la memoria descriptiva son indicativas de los niveles de experiencia de los expertos en la técnica a que pertence la invención. Todas las referencias que se citan en esta descripción se incorporan por referencia con la misma eficacia que si cada referencia se hubiera incorporado por referencia en su totalidad individualmente. Una persona de experiencia en la técnica fácilmente apreciaría que la presente invención está bien adaptada para realizar los objetivos y obtener los fines y ventajas que se menciona, así como los inherentes a los mismos. Los procedimientos y composiciones que se describen en el presente documento como actualmente representativos de las modalidades preferidas son ejemplares y no se pretende que sean limitaciones del alcance de la invención. Los cambios en los mismos y otros usos que se les ocurrirán a los expertos en la técnica, que están incluidos en el espíritu de la invención, están definidos por el alcance de las reivindicaciones. Para una persona de experiencia en la técnica será fácilmente obvio que pueden realizarse sustituciones y modificaciones diferentes a la invención que se describe en el presente documento sin separarse del alcance y espíritu de la invención. Así, dichas modalidades adicionales están dentro del alcance de la presente invención y las siguientes reivindicaciones. La presente invención enseña a una persona de experiencia en la técnica a analizar diversas combinaciones y/o sustituciones de modificaciones químicas descritas en el presente documento para generar construcciones con actividad mejorada para mediar en la actividad de ARNi. Dicha actividad mejorada puede comprender una mejor estabilidad, mejor biodisponibilidad, y/o mejor activación de respuestas celulares que median la ARNi. Por lo tanto, las modalidades específicas que se describen en el presente documento no son limitantes y una persona de experiencia en la técnica puede apreciar fácilmente qué combinaciones específicas de las modificaciones que se describen en el presente documento pueden analizarse sin excesiva experimentación para identificar las moléculas de siNA con actividad de ARNi mejorada. La invención que se describe de forma ilustrativa en el presente documento puede practicarse de forma adecuada en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones que no estén descritos de forma específica en el presente documento. Así, por ejemplo, en cada caso del presente documento cualquiera de los términos "que comprende", "constituido esencialmente por", y "constituido por" pueden sustituirse por cualquiera de los otros dos términos. Los términos y expresiones que se han empleado se usan como términos descriptivos y no limitantes, y no existe ninguna intención en el uso de dichos términos y expresiones de excluir cualesquiera equivalentes de las características que se muestran y que se describen o porciones de las mismas, pero se reconoce que son posibles diversas modificaciones dentro del alcance de la invención que se reivindica. Así, debería entenderse que aunque la presente invención se ha descrito de forma específica mediante modalidades preferidas, los expertos en la técnica pueden recurrir a características opcionales, a la modificación y variación de los conceptos descritos en el presente documento, y que dichas modificaciones y variaciones se considera que están dentro del alcance de esta invención tal como se define mediante la descripción y las reivindicaciones anexas. Además, cuando se describen características o aspectos de la invención en términos de grupos Markush u otras agrupaciones de alternativas, los expertos en la técnica reconocerán que la invención también se describe por medio de ellos en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupoMarkush u otro grupo.

CUADRO I Ejemplos no limitantes de grupos de estabilización para construcciones de siNA químicamente modificadas Caperuza = cualquier caperuza terminal, véase por ejemplo la Figura 10. Todos los grupos de Estab 00-34 pueden comprender restos de timina en el extremo 3' (TT) Todos los grupos de Estab 00-34 habitualmente comprenden aproximadamente 21 nucleótidos, pero pueden variar tal como se describe en el presente documento. Todos los grupos 00-36 también pueden incluir un único ribonucleótido en la hebra codificante o no codificante de la posición de pares de bases 11a de la molécula bicatenaria de ácido nucleico determinada a partir del extremo 5' de la hebra no codificante o de guía (véase la Figura 5C) C = hebra codificante NC = hebra no codificante La *Estab 23 tiene un único ribonucleótido adyacente en el extremo 3' La *Estab 24 y la Estab 28 tienen un único ribonucleótido en el extremo 5' Las *Estab 25, Estab 26, Estab 27, Estab 35 y Estab 36 tienen tres ribonucleótidos en el extremo 5' En las *Estab 29, Estab 30, Estab 31 , Estab 33, y Estab 34 cualquier purina de las tres primeras posiciones de nucleótidos a partir del extremo 5' son ribonucleótidos p = enlace de fosforotioato tStab 35 tiene 2'-O-metilo U en las colgaduras en 3' y tres ribonucleótidos en el extremo 5' tStab 36 tiene colgaduras de 2'-O-metilo que son complementarias a la secuencia objetivo (colgaduras naturales) y tres ribonucleótidos en el extremo 5' Las químicas de estabilización 1-10 muestran ejemplos no limitantes de diferentes estructuras de estabilización (1-10) que pueden usarse, por ejemplo, para estabilizar el extremo 3' de las secuencias de siNA de la invención, que incluye n (1) [3-3']-desoxirribosa invertida; (2) desoxirribonucleótido; (3) [5'-3']-3'-desoxirribonucleótido; (4) [5'-3']-ribonucleótido; (5) [5'-3']-3'-O-metil ribonucleótido; (6) 3'-glicerilo; (7) [3'-5']-3'-desoxirribonucleótido; (8) [3'-3')-desoxirribonucleótido; (9) [5'-2'j-desoxirribonucleótido; y (10) [5-3']-didesoxirribonucleótido. Además de las estructuras de esqueleto modificadas y sin modificar que se indican en la figura, estas estructuras pueden combinarse con diferentes modificaciones en el esqueleto tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, modificaciones en el esqueleto que tienen la Fórmula I. Además, el 2'-desoxi nucleótido que se muestra en posición 5' respecto a las modificaciones terminales que se muestran puede ser otro nucleótido o no nucleótido modificado o sin modificar que se describe en el presente documento, por ejemplo modificaciones que tienen cualquiera de las Fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas.

QUÍMICAS DE ESTABILIZACIÓN 1-10 7 8 R = O, S, N, alquilo, alquilo sustituido, O-alquilo, S-alquilo, alcarilo o aralquilo. B = Independientemente cualquier base de nucleótido, ya sea natural o químicamente modificada, u opcionalmente H (abásico).

CUADRO n o n O 3 O id o » O o£ o - CUADRO A. Sintesis de Ciclador ABl 394 2.5 µmol B. Sintesis de 0.2 µmol Ciclador ABl 394 C. Síntesis de Ciclador 0,2 µmol en 96 pocilios • El tiempo de espera no incluye el tiempo de contacto durante la aplicación. • La síntesis en tándem utiliza el doble acoplamiento de la molécula enlazadora CUADRO IV Formulaciones de nanoparticulas lipídicas (LNP) Proporción de N/P = proporción entre nitrógeno y fósforo entre el lípido catíónico y el ácido nucleico Estructura de CLinDMA Estructura de pCLinDMA Estructura de eCLinDMA Estructura de PEG-n-DMG Estructura de DMOBA Estructura de DMOBA Estructura de DOBA DSPC Colesterol 2KPEG-Colesterol 2KPEG-DMG CUADRO V Algorimto Sirna que describe los patrones con sus puntuaciones relativas para predecir los siNA hiperactivos.

Todas las posiciones que se proporcionan son para la hebra codificante del siNA 19mero.

CUADRO VI Inmunoestimulación en ratones CD-1 tratados con una única inyección de 3 mg/kg de siARN formulado en LNP BLOD - Bajo el límite de detección Ol 3BLOQ - Bajo el límite de cuantificación Los niveles de IL-6 y TNF-a se midieron a las 2.5 horas de la inyección, mientras que los niveles de IFN-? y IFN- se midieron a las 8 horas del tratamiento. Los valores se muestran en términos de la media ± desviación típica, n=5 CUADRO VH Pesos corporales y de órganos 1 y 14 días después de la administración de 3 mg/kg de HBV263-LNP-086 o PBS en ratones OÍ N> Se sacrificaron cinco animales por cada grupo de administración para cada tiempo. El peso corporal se obtuvo justo antes de la eutanasia. Los valores se muestran en términos de la media ± desviación típica.

CUADRO VIII Valores analíticos en suero 1 y 14 días después de la administración de 3 mg/kg de HBV263-LNP-086 o PBS en ratones l CO Los valores se muestran en términos de la media ± desviación típica, n=5

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene la estructura SIX que comprende una hebra codificante y una hebra no codificante: B NX3 (N)X2 B -3' B (N)X1 NX4 [N]X5 -5' SIX en la que la hebra superior es la hebra codificante y la hebra inferior es la hebra no codificante de la molécula bicatenaria de ácido nucleico; dicha hebra no codificante comprende la secuencia complementaria a un ARN objetivo; cada N es independientemente un nucleótido; cada B es un resto caperuza terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos sin bases pareadas o de colgadura que pueden estar sin modificar o químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótidos que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente números enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un número entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un número entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 y X5 sea aproximadamente 17-36; X5 es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; y (a) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra no codificante son nucleótidos de 2'-desox¡-2'-fluoro; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra no codificante distintos de los nucleótidos de purina en las posiciones [N] de los nucleótidos, son independientemente nucleótidos de 2'-O-metilo, 2'-desoxirribonucleótidos o una combinación de 2'-desoxirribonucleótidos y nucleótidos de 2'-O-metilo; (b) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra codificante son nucleótídos de 2'-desoxi-2'-fluoro; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra codificante son independientemente 2'-desoxirribonucleótidos, nucleótidos de 2'-O-metilo o una combinación de 2'-desoxirribonucleótidos y nucleótidos de 2'-O-metilo; y (c) cualesquiera nucleótidos (N) son opcionalmente nucleótidos de nucleótidos de 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, o desoxirribonucleótidos. 2.- Una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene la estructura SX que comprende una hebra codificante y una hebra no codificante: B NX3 (N)X2 B -3' B (N)X1 NX4 [N]X5 -51 SX en la que la hebra superior es la hebra codificante y la hebra inferior es la hebra no codificante de la molécula bicatenaria de ácido nucleico; dicha hebra no codificante comprende la secuencia complementaria a un ARN objetivo; cada N es independientemente un nucleótido; cada B es un resto caperuza terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos sin bases pareadas o de colgadura que pueden estar sin modificar o químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótidos que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente números enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un número entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un número entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 y X5 sea aproximadamente 17-36; X5 es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; y (a) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra no codificante son nucleótidos de 2'-desox¡-2'-fluoro; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra no codificante distintos de los nucleótidos de purina en las posiciones [N] de los nucleótidos, son nucleótidos de 2'-O-metilo; (b) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra codificante son ribonucleótidos; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra codificante son ribonucleótidos; y (c) cualesquiera nucleótidos (N) son opcionalmente nucleótidos de 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, o desoxirribonucleótidos. 3.- Una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene la estructura SXI que comprende una hebra codificante y una hebra no codificante: B NX3 (N)X2 B -3- B (N)X1 NX4 [N]X5 -5' SXI en la que la hebra superior es la hebra codificante y la hebra inferior es la hebra no codificante de la molécula bicatenaria de ácido nucleico; dicha hebra no codificante comprende la secuencia complementaria a un ARN objetivo; cada N es independientemente un nucleótido; cada B es un resto caperuza terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos sin bases pareadas o de colgadura que pueden estar sin modificar o químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótidos que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente números enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un número entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un número entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 y X5 sea aproximadamente 17-36; X5 es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; y (a) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra no codificante son nucleótídos de 2'-desoxi-2'-fluoro; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra no codificante distintos de los nucleótidos de purina en las posiciones [N] de los nucleótidos, son nucleótidos de 2'-O-metilo; (b) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra codificante son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra codificante son ribonucleótidos; y (c) cualesquiera nucleótidos (N) son opcionalmente nucleótidos de 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, o desoxirribonucleótidos. 4.- Una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene la estructura SXII que comprende una hebra codificante y una hebra no c B NX3 (N)X2 B -3' B (N)X1 NX4 [N]X5 -5' SXII en la que la hebra superior es la hebra codificante y la hebra inferior es la hebra no codificante de la molécula bicatenaria de ácido nucleico; dicha hebra no codificante comprende la secuencia complementaria a un ARN objetivo; cada N es independientemente un nucleótido; cada B es un resto caperuza terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos sin bases pareadas o de colgadura que pueden estar sin modificar o químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótidos que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente números enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un número entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un número entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 y X5 sea aproximadamente 17-36; X5 es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; y (a) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra no codificante son nucleótidos de 2'-desox¡-2'-fluoro; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra no codificante distintos de los nucleótidos de purina en las posiciones [N] de los nucleótidos, son nucleótidos de 2'-O-metilo; (b) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra codificante son nucleótidos de 2'-desoxi-2'- fluoro; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra codificante son desoxirribonucleótidos; y (c) cualesquiera nucleótidos (N) son opcionalmente nucleótidos de 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, o desoxirribonucleótidos. 5.- Una molécula bicatenaria de ácido nucleico que tiene la estructura SXIII que comprende una hebra codificante y una hebra no codificante: B NX3 (N)X2 B -3' B (N)X1 NX4 [N]X5 -5' SXIII en la que la hebra superior es la hebra codificante y la hebra inferior es la hebra no codificante de la molécula bicatenaria de ácido nucleico; dicha hebra no codificante comprende la secuencia complementaria a un ARN objetivo; cada N es independientemente un nucleótido; cada B es un resto caperuza terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos sin bases pareadas o de colgadura que pueden estar sin modificar o químicamente modificados; [N] representa nucleótidos que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente números enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un número entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un número entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 y X5 sea aproximadamente 17-36; X5 es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; y (a) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra no codificante son nucleótidos que tienen una configuración de tipo ribo, Northern o de hélice en forma A; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra no codificante distintos de los nucleótidos de purina en las posiciones [N] de los nucleótidos, son nucleótidos de 2'-O-metilo; (b) cualesquiera nucleótidos de pirimidina presentes en la hebra codificante son nucleótidos que tienen una configuración de tipo ribo, Northern o de hélice en forma A; cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la hebra codificante son nucleótidos de 2'-O-metilo; y (c) cualesquiera nucleótidos (N) son opcionalmente nucleótidos de 2'-O-metílo, 2'-desoxi-2'-fluoro, o desoxirribonucleótidos. 6.- La molécula bicatenaria de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque X5 = 1 , 2 ó 3; cada X1 y X2 = 1 ó 2; X3 = 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30, y X4 = 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30. 1.- La molécula bicatenaria de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque X5 = 1 , 2 ó 3; cada X1 y X2 = 1 ó 2; X3 = 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30, y X4 = 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30. 8.- La molécula bicatenaria de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque X5 = 1 , 2 ó 3; cada X1 y X2 = 1 ó 2; X3 = 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30, y X4 = 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30. 9.- La molécula bicatenaria de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque X5 = 1 , 2 ó 3; cada X1 y X2 = 1 ó 2; X3 = 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30, y X4 = 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30. 10.- La molécula bicatenaria de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque X5 = 1 , 2 ó 3; cada X1 y X2 = 1 ó 2; X3 = 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30, y X4 = 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30. 11.- La molécula bicatenaria de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque B está presente en los extremos 3' y 5' de la hebra codificante y en el extremo 3" de la hebra no codificante. 12.- La molécula bicatenaria de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque B está presente en los extremos 3' y 5' de la hebra codificante y en el extremo 3' de la hebra no codificante. 13.- La molécula bicatenaria de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque B está presente en los extremos 3' y 5' de la hebra codificante y en el extremo 3' de la hebra no codificante. 14.- La molécula bicatenaria de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque B está presente en los extremos 3' y 5' de la hebra codificante y en el extremo 3' de la hebra no codificante. 15.- La molécula bicatenaria de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque B está presente en los extremos 3' y 5' de la hebra codificante y en el extremo 3' de la hebra no codificante. 16.- La molécula bicatenaria de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende uno o más enlaces internucleotídicos de fosfotioato en el primer (N) terminal del extremo 3' de la hebra codificante, de la hebra no codificante, o tanto de la hebra codificante como de la hebra no codificante de la molécula de siNA. 17.- La molécula bicatenaria de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque comprende uno o más enlaces internucleotídicos de fosfotioato en el primer (N) terminal del extremo 3' de la hebra codificante, de la hebra no codificante, o tanto de la hebra codificante como de la hebra no codificante de la molécula de siNA. 18.- La molécula bicatenaria de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque comprende uno o más enlaces internucleotídicos de fosfotíoato en el primer (N) terminal del extremo 3' de la hebra codificante, de la hebra no codificante, o tanto de la hebra codificante como de la hebra no codificante de la molécula de siNA. 19.- La molécula bicatenaria de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque comprende uno o más enlaces internucleotídicos de fosfotioato en el primer (N) terminal del extremo 3' de la hebra codificante, de la hebra no codificante, o tanto de la hebra codificante como de la hebra no codificante de la molécula de siNA. 20.- La molécula bicatenaria de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque comprende uno o más enlaces internucleotídicos de fosfotioato en el primer (N) terminal del extremo 3' de la hebra codificante, de la hebra no codificante, o tanto de la hebra codificante como de la hebra no codificante de la molécula de siNA. 21.- La molécula bicatenaria de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el ARN objetivo es ARN del virus de hepatitis B (HBV). 22.- Una composición que comprende la molécula bicatenaria de ácido nucleico de la reivindicación 1 en un vehiculo o diluyente farmacéuticamente aceptable. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a compuestos, composiciones, y procedimientos para el estudio, diagnóstico, y tratamiento de rasgos, enfermedades y afecciones que responden a la modulación de la expresión y/o actividad génicas; la presente invención también se refiere a compuestos, composiciones, y procedimientos relacionados con rasgos, enfermedades y afecciones que responden a la modulación de la expresión y/o actividad de genes implicados en las rutas de la expresión génica u otros procesos celulares que actúan de mediadores del mantenimiento o desarrollo de dichos rasgos, enfermedades y afecciones; de forma específica, la invención se refiere a moléculas bicatenarias de ácido nucleico que incluyen moléculas cortas de ácido nucleico, tales como moléculas de ácido nucleico corto de interferencia (síNA), ARN corto de interferencia (siARN), ARN bicatenario (dsARN), micro-ARN (miARN), y ARN corto en horquilla (shARN) con capacidad de actuar de mediadoras de la interferencia del ARN (ARNi) contra la expresión génica, que incluye cócteles de dichas moléculas cortas de ácido nucleico y formulaciones en nanopartículas lipídicas (LNP) de dichas moléculas cortas de ácido nucleico; la presente invención también se refiere a moléculas cortas de ácido nucleico, tales como siNA, siARN, y otras que pueden inhibir la función de moléculas endógenas de ARN, tales como microARN (miARN) endógeno (por ejemplo, inhibidores de miARN) o ARN corto de interferencia (siARN) endógeno, (por ejemplo, inhibidores de siARN) o que pueden inhibir la función de RISC (por ejemplo, inhibidores de RISC), para modular la expresión génica interfiriendo con la función reguladora de dichos ARN endógenos o de las proteínas asociadas a dichos ARN endógenos (por ejemplo, RISC), que incluyen cócteles de dichas moléculas cortas de ácido nucleico y formulaciones en nanopartículas lipídicas (LNP) de dichas moléculas cortas de ácido nucleico; dichas moléculas cortas de ácido nucleico son de utilidad, por ejemplo, para proporcionar composiciones para prevenir, inhibir, o reducir enfermedades, rasgos y afecciones que están asociados a la expresión o actividad génica en un sujeto u organismo. 6A P08/165F