MX2007015951A

MX2007015951A - Analogos de epitopes.

Info

Publication number: MX2007015951A
Application number: MX2007015951A
Authority: MX
Inventors: David C Diamond; Liping Liu; Adrian Bot; Jian Gong
Original assignee: Mannkind Corp
Priority date: 2005-06-17
Filing date: 2006-06-16
Publication date: 2008-03-07
Also published as: WO2006138562A2; CA2612494A1; EP2371850A2; EP1896498A2; US20070049533A1; US20130017213A1; US8653237B2; EP2371850A3; BRPI0611793A2; CN101273056A; EP2371852A3; AU2006259307B2; US7511119B2; US20070060524A1; EP1896498B1; JP2008543314A; EP2371852A2; KR20080028938A; IL188108A0; NZ590125A

Abstract

Algunas modalidades se refieren a analogos de peptidos que corresponden a los epitopes de la celulas T restringidos con MHC de la Clase I, y metodos para su generacion. Estos analogos pueden contener substituciones de aminoacidos en los residuos que directamente interactuan con las moleculas MHC, y pueden proporcionar propiedades inmunologicas mejoradas, modificadas y utiles. Adicionalmente, se revelan las clases de analogos, en las cuales varias substituciones comprenden la norleucina y/o norvalina de residuos no estandares.

Description

ANÁLOGOS DE EPITOPES REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica el beneficio de la fecha de presentación de la Solicitud de Patente Provisional de E.U. No. de Serie 60/691,889, presentada el 17 de Junio de 2005, el texto completo de la cual se incorpora en la presente mediante la referencia sin renuncia. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención En ciertas modalidades, la invención descrita en la presente se refiere a análogos de péptidos correspondientes a epitopes de célula T restringidos a MHC clase I y a métodos para su generación. Estos análogos pueden contener sustituciones de aminoácidos en residuos que interactúan directamente con moléculas MHC y pueden conferir propiedades inmunológicas mejoradas, modificadas o útiles. En particular, se identifican los análogos de epitope de los antigenos asociados a tumor SSX-2, NY-ESO-I, PRAME, PSMA, tirosinasa, y melan-A. Adicionalmente, se describen clases de análogos, en los cuales las diversas sustituciones comprenden los residuos no estándar norleucina y/o norvalina. Descripción de la Técnica Relacionada El Complejo de Mayor Histocompatibilidad y Reconocimiento de Objetivo de Célula T Los linfocitos T (células T) son células inmunes especificas de antigeno que funcionan en respuesta a señales de antigeno especificas. Los linfocitos B y los anticuerpos que producen, también son entidades especificas de antigeno. Sin embargo, a diferencia de los linfocitos B, las células T no responden a antigenos en una forma soluble o libre. Para que una célula T responda a un antigeno, requiere que el antigeno se enlace a un complejo de presentación comprendido de las proteinas complejas de mayor histocompatibilidad (MHC) . Las proteinas MHC proporcionan los medios por los cuales las células T diferencian las células nativas o "auto-células" de células externas. Las moléculas MHC son una categoría de receptores inmunes que presentan epitopes de péptido potenciales a monitorearse subsecuentemente por las células T. Existen dos tipos de MHC, MHC clase I y MHC clase II. Las células T CD4+ interactúan con proteinas MHC clase II y predominantemente tienen un fenotipo auxiliar mientras las células T CD8+ interactúan con proteinas MHC clase I y predominantemente tienen un fenotipo citolitico, pero cada una de ellas también exhibe función reguladora, particularmente supresiva. Ambos MHC clase I y II son proteinas de transmembrana con la mayoria de su estructura sobre la superficie externa de la célula. Adicionalmente, ambas clases de MHC tienen una hendidura de enlace a péptido en sus porciones externas. Es en esta hendidura que los fragmentos pequeños de proteinas, nativas o externas, se enlazan y se presentan al ambiente extracelular. Las células llamadas células que presentan antigeno (APCs) despliegan antigenos para células T utilizando MHC. Las células T pueden reconocer un antigeno, si está presente en MHC. Este requerimiento se llama restricción de MHC. Si un antigeno no se despliega por un MHC reconocible, la célula T no lo reconocerá y actuará sobre la señal de antigeno. Las células T especificas para el péptido enlazado a un MHC reconocible se enlazan a estos complejos de MHC-péptido y proceden a las siguientes etapas de la respuesta inmune. SUMARIO DE LA INVENCIÓN Modalidades del análogo SSX-241-49 Las modalidades incluyen análogos del epitope de célula T restringido a MHC clase I SSX-24?-4_, KASEKIFYV (SEQ ID NO. 1), polipéptidos que comprenden estos análogos que pueden procesarse por pAPC para presentar los análogos de epitope, y ácidos nucleicos que expresan los análogos. Los análogos pueden tener propiedades inmunológicas similares o mejoradas en comparación con el epitope tipo silvestre. Una modalidad particular se refiere a un péptido SSX-2 aislado que tiene una secuencia que comprende una o más sustituciones de aminoácidos de la secuencia KASEKIFYV (SEQ ID NO:l), en una cantidad suficiente para obtener la producción de citocma de una linea de células T generada por inmunización contra un epitope con la secuencia KASEKIFYV (SEQ ID N0:1) . En un aspecto, la cantidad suficiente es menor a 10 µM. En un aspecto adicional, la cantidad es menor a 3 µM. En todavía un aspecto adicional, la cantidad es menor a 1 µM. En un aspecto, la una o mas sustituciones de aminoácidos pueden incluir al menos una sustitución de aminoácido estándar. "Aminoácido estándar" como se utiliza en la presente incluye cualquiera de los 20 aminoácidos genéticamente codificados. De esta manera, en un aspecto, la al menos una sustitución de aminoácido estándar puede ser, por ejemplo Tyr, Val, Leu, Ala, lie, Met, Trp, Phe, Asp, Asn, o Ser. En un aspecto adicional, la una o mas sustituciones de aminoácidos pueden incluir al menos una sustitución de aminoácido no estándar. Los aminoácidos no estándar incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, cualquiera de los siguientes: norleucma (Nle) , norvalma (Nva), fenilglicma (Phg), 4-fluorofenilalanina (Phe (4-F)), 4-nitrofenilalanina (Phe (4-N02) ) , ácido -ammobutirico (Abu), acido a-aminoisobutirico (Aib) , metil-leucina (MeLeu) , metilvalma (MeVal), ß- ( 3-benzot?en?l) -alanina (ß-(3-benzotienil) Ala) , 0-met?lt?ros?na (O-metil-Tyr) , ciclohexilalamna (Cha), ß- ( 1-naftil) -alanina (Nal-1), ß-(2-naftil) -alanina (Nal-2), D-estereoisomero de un aminoácido estándar, o aminoácidos en donde la terminal carboxi se ha modificado a la amida (indicada por -NH2) . De esta manera, en ,un aspecto, la al menos una sustitución de aminoácido no estándar puede ser NIe, Nva, Abu, o un D-estereoisómero de un aminoácido estándar. En un aspecto adicional, la una o más sustituciones de aminoácidos pueden incluir un aminoácido de terminal modificada. En un aspecto, el aminoácido de terminal modificada puede ser un aminoácido de terminal C amidada. En un aspecto adicional al menos una de las sustituciones puede ser la adición de un aminoácido, en donde la adición es una adición de terminal C. En un aspecto adicional, el péptido puede incluir además la sustitución de aminoácidos conservados en cualquier sitio, pero preferentemente en los sitios P3, P5, o P7 que no se involucran de manera expresa en ninguna interacción MHC. Una modalidad adicional se refiere a un péptido aislado de 9 aminoácidos, Pl a P9, que puede incluir un aminoácido en cada sitio. Por ejemplo, Pl puede ser K, F, Y, W, Phg, Phe (4-F), Phe(4-N02), MeTyr, ß- (3-benzotienil) -Ala, o D-Lys; P2 puede ser A, L, V, I, M, D-Ala, Nal-2, Abu, Aib, NIe, o Nva; P3 puede ser'S; P4 puede ser E, Q, NIe, o Nva; P5 puede ser K; P6 puede ser I, L, V, NIe, o Nva; P7 puede ser F; P8 puede ser Y, F, Phe (4-F); y PO (P-omega) en P9 puede ser V, I, A, Nva, MeVal, o Abu. En algunos casos, la secuencia no es KASEKIFYV (SEQ ID NO. 1) . Una modalidad adicional se refiere a un péptido aislado de 9 aminoácidos, Pl a P9, que puede incluir un aminoácido en cada sitio. Por ejemplo, Pl puede ser K, F, Y, , Phg, Phe (4-F), Phe(4-N02), MeTyr, ß- (3-benzotienil) -Ala, o D-Lys; P2 puede ser V, L, M, Abu, NIe, o Nva; P3 puede ser S; P4 puede ser E, Q, Nle, o Nva; P5 puede ser K: P6 puede ser I, L, V, NIe, o Nva; P7 puede ser F; P8 puede ser Y, F, Phe (4-F); y PO en P9 puede ser V, I, A, Nva, MeVal, Abu, o V-NH2. Una modalidad adicional se refiere a un péptido aislado de 9 aminoácidos, Pl a P9, que puede incluir un aminoácido en cada sitio. Por ejemplo, Pl puede ser K, F, Y, W, Phg, Phe (4-F), Phe(4-N02), MeTyr, ß- (3-benzotienil) -Ala, o D-Lys; P2 puede ser A, L, V, M, Abu, NIe, o Nva; P3 puede ser S; P4 puede ser E, Q, NIe, o Nva; P5 puede ser K; P6 puede ser I, L, V, NIe, o Nva; P7 puede ser F; P8 puede ser Y, F, Phe (4-F); P9 puede ser V; y PO en PÍO puede ser I o L. Una modalidad adicional se refiere a un péptido aislado de 9 aminoácidos, Pl a P9, que puede incluir un aminoácido en cada sitio. Por ejemplo, Pl puede ser K, F, Y, , Phg, Phe (4-F), Phe(4-N02), MeTyr, ß- (3-benzotienil) -Ala, o D-Lys; P2 puede ser V; P3 puede ser S; P4 puede ser E, Q, NIe, o Nva; P5 puede ser K: P6 puede ser I, L, V, Nle, o Nva; P7 puede ser F; P8 puede ser Y, F, Phe (4-F); P9 puede ser V; y PO en PÍO puede ser I, L, V, o NIe. Una modalidad adicional se refiere a un péptido aislado de 9 aminoácidos, Pl a P9, que puede incluir un aminoácido en cada sitio. Por ejemplo, Pl puede ser K, F, Y, W, Phg, Phe(4-F), Phe(4-N02), MeTyr, ß- (3-benzotienil) -Ala, o D-Lys; P2 puede ser L; P3 puede ser S; P4 puede ser E, Q, NIe, o Nva; P5 puede ser K: P6 puede ser I, L, V, NIe, o Nva; P7 puede ser F; P8 puede ser Y, F, Phe (4-F); P9 puede ser V; y PO en PÍO puede ser I, L, V, NIe o Nva. Una modalidad adicional se refiere a un péptido aislado que tiene la secuencia: K{L, V, M, I, D-Ala, D-Val, Nal-2, Aib, Abu, NIe, o Nva.SEKIFYV (SEQ ID NO. 2); o {F, Phg, Y, Phe (4-F), Phe(4-N02), O-metil-Tyr, o ß-(3-benzotienil-Ala}ASEKIFYV (SEQ ID NO. 3); o {Y, F, o }{V, M, o IJSEKIFYV (SEQ ID NO. 4); o {F o WJLSEKIFYV (SEQ ID NO. 5); o K{A, V, o L}SEKIFYI (SEQ ID NO. 6); o K{L o V} SEKIFYV-NH2 (SEQ ID NO. 7); o FVSEKIFY.I, A, Nva, Abu, o MeVal} (SEQ ID NO. 8); o FVS{Q, NIe, o Nva}KIFYV (SEQ ID NO. 9); o FVSEK{L, V, NIe, o Nva}FYV (SEQ ID NO. 10); o FVSEKIF{F o Phe (4-F) }V (SEQ ID NO. 11); o KASEKIFYV{I o L} (SEQ ID NO. 12) ;o KVSEKIFYV {I, L, V, o NIe} (SEQ ID NO. 13); o KLSEKIFYV {L, V, NIe, o Nva} (SEQ ID NO. 14) . Una modalidad adicional se refiere a un péptido aislado que tiene la secuencia: K{L, V, M, Abu, Me, o Nva}SEKIFYV (SEQ ID NO. 15); o {F o Phg} A SEKIFYV (SEQ ID NO. 16; o YVSEKIFYV (SEQ ID NO. 17); o F{L, V, o I}SEKIFYV (SEQ ID NO. 18); o {L o I}SEKIFYV (SEQ ID NO. 19); o K{V o L}SEKIFYI (SEQ ID NO. 20); o FVSEKIFY{I o Nva} (SEQ ID NO. 21) . Una modalidad adicional se refiere a un péptido aislado que tiene la secuencia: K{V o L}SEKIFYV (SEQ ID NO. 22); o {F o Y}ASEKIFYV (SEQ ID NO. 23); o FVSEKIFYI (SEQ ID NO. 24) . Una modalidad adicional se refiere a un MHC clase I/complejo de péptido en donde el péptido tiene la secuencia de cualquiera de los péptidos en las modalidades descritas arriba y en cualquier parte en la presente. En un aspecto, el complejo puede ser reactivo con un receptor de célula T (TCR) que reconoce un MHC clase I/complejo de SSX-21_49. En un aspecto adicional, el complejo puede ser un complejo HLA-A2/SSX-241_49. Una modalidad adicional se refiere a una composición inmunogénica que puede incluir cualquiera de las modalidades de péptido descritas arriba y en cualquier parte en la presente. En un aspecto el péptido pueden tener, por ejemplo, la secuencia: K{L, V, M, Abu, NIe, o Nva}SEKIFYV (SEQ ID NO. 15); o {F o Phg}A SEKIFYV (SEQ ID NO. 16); o YVSEKIFYV (SEQ ID NO. 17); o F{L, V, o I}SEKIFYV (SEQ ID NO. 18); o {L o I.SEKIFYV (SEQ ID NO. 19); o K{V o L}SEKIFYI (SEQ ID NO. 20); o FVSEKIFY{I o Nva} (SEQ ID NO. 21), o K{V o L}SEKIFYV (SEQ ID NO. 22); o {F o Y}ASEKIFYV (SEQ ID NO. 23); o FVSEKIFYI (SEQ ID NO. 24).

Algunas modalidades adicionales se refieren a análogos del epitope de célula T restringido a MHC clase I NY-ESO-l_57-i65, SLLMWITQC (SEQ ID NO.25), los polipéptidos que incluyen estos análogos que pueden procesarse por pAPC para presentar los análogos 'de epitope, y ácidos nucleicos que expresan los análogos. Los análogos pueden tener propiedades inmunológicas similares o mejoradas en comparación con el epitope tipo silvestre. Una modalidad se refiere a un péptido NY-ESO-l?57_165 aislado que tiene una secuencia que comprende una o más sustituciones de aminoácidos de la secuencia SLLM ITQC (SEQ ID NO: 25), en una cantidad suficiente para producir producción de citocina de una linea de células T generada por inmunización contra un epitope con la secuencia SLLM ITQC (SEQ ID NO: 25) . Por ejemplo, en un aspecto, la cantidad suficiente puede ser menor a 10 µM. En un aspecto adicional, la cantidad puede ser menor a 3 µM. También, en un aspecto adicional, la cantidad puede ser menor a 1 µM. En un aspecto adicional, la cantidad es menor a 0.3 µM. En un aspecto, la una o más sustituciones de aminoácidos pueden incluir al menos un aminoácido estándar. En un aspecto adicional, la una o más sustituciones de aminoácidos pueden incluir al menos un aminoácido no estándar. En un aspecto adicional, la una o más sustituciones de aminoácidos pueden incluir un aminoácido de terminal modificada. En un aspecto, el aminoácido de terminal modificada puede ser un aminoácido de terminal C amidada. En un aspecto adicional, al menos una de las sustituciones puede ser la adición de un aminoácido, en donde la adición es una adición de terminal C. Una modalidad se refiere a un péptido aislado que tiene una secuencia en la cual: Pl es S, F, K, o W; P2 es L, I, V, NIe, o Nva; P3 es L; P4 es M, L, o N; P5 es W; P6 es I, A, L, V, o N; P7 es T; P8 es Q, E, D, o T; PO en P9 es C, V, I, L, A, Nva, NIe, V-NH2, o L-NH2; y en donde la secuencia no es SLLMWITQ{C, V, I, L, o A} (SEQ ID NO. 26), FVLM ITQA (SEQ ID NO. 27), o FILM ITQ{L o 1} (SEQ ID NO. 28) . Otra modalidad se refiere a un péptido aislado que tiene una secuencia en la cual: Pl es Y; P2 es L, V, I, NIe, o Nva; P3 es L; P4 es M, L, o N; P5 es ; P6 es I, A, L, V, o N; P7 es T; P8 es Q, E, D, o T; PO en P9 es V, I, L, Nva, NIe, V-NH2, o L-NH2; y en donde la secuencia no es YVLM ITL (SEQ ID NO. 29) o YLLM IT{I o L} (SEQ ID NO. 30). Una modalidad adicional se refiere a un péptido de decámero aislado que tiene una secuencia {S o Y}LLMWITQ{C o V} (L, I o NIe} (SEQ ID NO. 31) . Todavía otra modalidad se refiere a un péptido aislado que tiene una secuencia SILMWITQ{C, V, L, o A} (SEQ ID NO. 32), YLLM ITQ{Nva o NIe} (SEQ ID NO. 33), F{L o V}LMWITQ{V, L, o 1} (SEQ ID NO. 34), Y{I, Nva, o Nle}LM ITQV (SEQ ID NO. 35), YLLLWITQV (SEQ ID NO. 36), o TVLM ITQV (SEQ ID NO. 37) . Una modalidad adicional se refiere a un péptido aislado que tiene una secuencia {S o F}VLMWITQV (SEQ ID NO. 38), SLMWITQNva (SEQ ID NO. 39), o SNvaLM ITQV (SEQ ID NO. 40) . Aún otra modalidad se refiere a un péptido aislado que tiene una secuencia SNvaLM ITQV (SEQ ID NO. 40) . Algunas modalidades se refieren a un péptido aislado. El péptido puede incluir o consistir esencialmente de una secuencia en la cual: PO es X, XX, o XXX, en donde X especifica cualquier aminoácido o no aminoácido; y Pl es K, F, Y, W, Phg, Phe (4-F), Phe(4-N02), MeTyr, ß- ( 3-benzotienil) -Ala, o D-Lys; y P2 es A, L, V, I, M, D-Ala, Nal-2, Abu, Aib, NIe, o Nva ; y P3 es S; y P4 es E, Q, NIe, o Nva; y P5 es K; y P6 es I, L, V, NIe, o Nva; y P7 es F; y P8 es Y, F, Phe (4-F) ; y PO en P9 es V, I, A, Nva, MeVal, Abu, o V-NH2, o P9 es V, y PO en PÍO es I, L, V, NIe o Nva; y PO+1 es X, XX, o XXX, en donde X especifica cualquier aminoácido o no aminoácido; y en donde la secuencia no es KASEKIFYV (SEQ ID NO. i); El péptido aislado puede incluir o consistir esencialmente de la secuencia: K{L, V, M, I, D-Ala, D-Val, Nal-2, Aib, Abu, NIe, o Nva}SEKIFYV (SEQ ID NO. 2); o {F, Phg, Y, Phe (4-F), Phe(4-N02), O-metil-Tyr, o ß-(3-benzotienil-Ala}ASEKIFYV (SEQ ID NO. 3); o {Y, F, o W} {V, M, o I}SEKIFYV (SEQ ID NO. 4); o {F o }LSEKIFYV (SEQ ID NO. 5); o K{A, V, o L}SEKIFYI (SEQ ID NO. 6); o K{L o V}SEKIFYV-NH2 (SEQ ID NO. 7); o FVSEKIFY{I, A, Nva, Abu, o MeVal} (SEQ ID NO. 8); o FVS{Q, NIe, o Nva} KIFYV (SEQ ID NO. 9); o FVSEK{L, V, NIe, o Nva } FYV (SEQ ID NO. 10); o FVSEKIF{F o Phe(4-F)}V (SEQ ID NO. 11); o KASEKIFYV{I o L} (SEQ ID NO. 12) ;o KVSEKIFYV {I, L, V, o NIe} (SEQ ID NO. 13); o KLSEKIFYV {L, V, NIe, o Nva} (SEQ ID NO. 14) . El péptido aislado puede incluir o consistir esencialmente de la secuencia: K{L, V, M, Abu, NIe, o Nva}SEKIFYV (SEQ ID NO. 15); o {F o Phg}A SEKIFYV (SEQ ID NO. 16); o YVSEKIFYV (SEQ ID NO. 17); o F{L, V, o I}SEKIFYV (SEQ ID NO. 18); o W{L o I}SEKIFYV (SEQ ID NO. 19); o K{V o L}SEKIFYI (SEQ ID NO. 20); o FVSEKIFY{I o Nva} (SEQ ID NO. 21). También, el péptido aislado puede incluir o consistir esencialmente de la secuencia: K{V o L}SEKIFYV (SEQ ID NO. 22); o {F o YJASEKIFYV (SEQ ID NO. 23); o FVSEKIFYI (SEQ ID NO. 24); o KVSEKIFYV (SEQ ID NO. 41) .

Además, el péptido aislado puede incluir o consistir esencialmente de la secuencia KVSEKIFYV (SEQ ID NO. 41) . El péptido aislado puede tener afinidad para una hendidura de enlace de péptido de MHC clase I. MHC puede ser, por ejemplo, HLA-A2. Algunas modalidades se refieren a un MHC clase I/complejo de péptido en donde el péptido puede tener la secuencia de cualquiera de los péptidos descritos arriba o en cualquier parte en la presente. El MHC clase I/complejo de péptido puede ser reactivo con TCR que reconoce un MHC clase I/complejo de SSX-241.49. El MHC clase I/complejo de péptido puede ser un complejo HLA-A2/SSX-24i-49. Otras modalidades se refieren a un polipéptido que incluye un péptido como se describe arriba y en cualquier parte en la presente, incrustado dentro de una secuencia de liberación . Modalidades aún adicionales se refieren a composiciones inmunogénicas que incluyen un péptido como se describe arriba o en cualquier parte en la presente. Otras modalidades se refieren a ácidos nucleicos que codifican medios de ácido nucleico para expresar un polipéptido como se describe arriba o en cualquier parte en la presente. También, algunas modalidades se refieren a composiciones inmunogénicas que incluyen tales ácidos nucleicos o medios de ácido nucleico. Algunas modalidades se refieren a métodos para inducir, mantener, o amplificar una respuesta CTL. Los métodos pueden incluir administración intranodal de una composición como se describe arriba y en cualquier parte en la presente. Otras modalidades se refieren a métodos para inducir una respuesta de célula T restringida a MHC clase I, tales métodos pueden incluir administración intranodal de una composición como se describe arriba o en cualquier parte en la presente. Los métodos pueden incluir además administración de un agente de inmunopotenciación . Modalidades adicionales se refieren a métodos para inducir, mantener, o inducir una respuesta CTL, tales métodos pueden incluir administración intranodal de una composición como se describe arriba y en cualquier parte en la presente. Algunas modalidades se refieren a péptido aislados que incluyen 1 a 3 sustituciones de aminoácidos en la secuencia KASEKIFYY (SEQ ID NO. 1) que tiene una afinidad para una hendidura de enlace de MHC clase I que es similar o mayor que la afinidad de KASEKIFYY (SEQ ID NO. 1) para dicha Hendidura de enlace de MHC clase I . El tiempo medio de disociación puede ser similar o mayor que el tiempo medio de disociación de KASEKIFYV (SEQ ID NO. 1) de dicha hendidura de enlace de MHC clase I. El péptido aislado puede reconocerse por Células T con especificidad para el péptido KASEKIFYY (SEQ ID NO. 1) . Modalidades aún adicionales se refieren a péptidos aislados que incluyen o consisten esencialmente de una secuencia en la cual: Pl es K, F, Y, W, Phg, Phe (4-F), Phe(4-N02), MeTyr, ß- (3-benzotienil) -Ala, o D-Lys; y P2 es A, L, V, I, M, D-Ala, Nal-2, Abu, Aib, NIe, o Nva ; y P3 es S; y P4 es E, Q, NIe, o Nva; y P5 es K: y P6 es I, L, V, NIe, o Nva; y P7 es F; y P8 es Y, F, Phe (4-F) ; y PO en P9 es V, I, A, Nva, MeVal, o Abu; en donde la secuencia no es KASEKIFYV (SEQ ID NO. 1) ; o Pl es K, F, Y, , Phg, Phe (4-F), Phe(4-N02), MeTyr, ß- (3-benzotienil) -Ala, o D-Lys;' y P2 es V, L, M, Abu, NIe, o Nva; y P3 es S; y P4 es E, Q, NIe, o Nva; y P5 es K; y P6 es I, L, V, NIe, o Nva; y P7 es F; y P8 es Y, F, Phe (4-F) ; y PO en P9 es V, I, A, Nva, MeVal, Abu, o V-NH2; o Pl es K, F, Y, W, Phg, Phe (4-F), Phe(4-N02), MeTyr, ß- (3-benzotienil) -Ala, o D-Lys; y P2 es A, L, V, M, Abu, NIe, o Nva; y P3 es S; y P4 es E, Q, NIe, o Nva; y P5 es K; y P6 es I, L, V, Nle, o Nva; y P7 es F; y P8 es Y, F, Phe(4-F) ; y P9 es V; y PO en PÍO es I o L; o Pl es K, F, Y, W, Phg, Phe (4-F), Phe(4-N02), MeTyr, ß- (3-benzotienil) -Ala, o D-Lys; y P2 es V; y P3 es S; y P4 es E, Q, NIe, o Nva; y P5 es K; y P6 es I, L, V, Nle, o Nva; y P7 es F; y P8 es Y, F, Phe(4-F) ; y P9 es V; y PO en PÍO es I, L, V, o NIe; o Pl es K, F, Y, , Phg, Phe (4-F), Phe(4-N02), MeTyr, ß- ( 3-benzotienil) -Ala, o D-Lys; y P2 es L; y P3 es S; y P4 es E, Q, Nle, o Nva; y P5 es K; y P6 es I, L, V, NIe, o Nva; y P7 es F; y P8 es Y, F, Phe (4-F) ; y P9 es V; y PO en PÍO es I, L, V, NIe o Nva. Algunas modalidades se refieren a péptidos aislados que incluyen o consisten esencialmente de una secuencia en la cual : PO es X, XX o XXX, en donde X especifica cualquier aminoácido o no aminoácido; y Pl es S, F, K, W o Y; y P2 es L, I, V, NIe, o Nva; y P3 es L; y P4 es M, L, o N; y P5 es ; y P6 es I, A, L, V, o N; y P7 es T; y P8 es Q, E, D, o T; y PO en P9 es C, V, I, L, A, Nva, NIe, V-NH2, o L-NH2; y PO + 1 es X, XX, XXX, en donde X especifica cualquier aminoácido o no aminoácido; y en donde la secuencia no es SLLMWITQ{C, V, I, L, o A} (SEQ ID NO. 26), FVLM ITQA (SEQ ID NO. 27), FILM ITQ{L o 1} (SEQ ID NO. 28), YVLMWITL (SEQ ID NO. 29) o YLLMWIT{I o L} (SEQ ID NO. 30) . Pl es S, F, K, o W; P2 es L, I, V, NIe, o Nva; P3 es L; P4 es M, L, o N; P5 es W; P6 es I, A, L, V, o N; P7 es T; P8 es Q, E, D, o T; PO en P9 es C, V, I, L, A, Nva, NIe, V-NH2, o L-NH2; y en donde la secuencia no es SLLMWITQ{C, V, I, L, o A} (SEQ ID NO. 26), FVLMWITQA (SEQ ID NO. 27), o FILMWITQ{L o 1} (SEQ ID NO. 28) ; o Pl es Y; P2 es L, V, I, NIe, o Nva; P3 es L; P4 es M, L, o N; P5 es W; P6 es I, A, L, V, o N; P7 es T; P8 es Q, E, D, o T; PO en P9 es V, I, L, Nva, NIe, V, V-NH2, o L-NH2; y en donde la secuencia no es YVLMWITL (SEQ ID NO. 29) o YLLMWIT{I o L} (SEQ ID NO. 30). Una modalidad adicional se refiere a un MHC clase I/complejo de péptido en donde el péptido puede tener la secuencia de cualquiera de los péptidos en las modalidades descritas arriba ó en cualquier parte en la presente. En un aspecto, el complejo puede ser reactivo con un TCR que reconoce un MHC clase I/complejo de NY-ESO-l?57-?65. En un aspecto adicional, el complejo puede ser un complejo HLA- En un aspecto de las modalidades anteriores, el péptido puede tener afinidad para una Hendidura de enlace de péptido de MHC clase I, como HLA-A2. Una modalidad adicional se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de péptidos de cualquiera de las modalidades descritas en la presente en asociación con una secuencia de liberación. Una modalidad adicional se refiere a una composición inmunogénica que incluye cualquiera de las modalidades de péptido descritas en la presente. En un aspecto, el péptido puede tener una secuencia como se establece en la presente.

Una modalidad adicional se refiere a un ácido nucleico que codifica cualquiera de las modalidades de péptido descritas en la presente, pero preferentemente aquellas que no tienen sustituciones de aminoácidos no estándar. En un aspecto adicional, el ácido nucleico puede codificarse en un vector. Una modalidad adicional se refiere a una composición inmunogénica que incluye un ácido nucleico que codifica cualquiera de las modalidades de péptido descritas en la presente. Una modalidad adicional se refiere a un método para inducir una respuesta CTL que comprende administrar intranodalmente cualquiera de las composiciones o péptidos de las modalidades descritas en la presente. En un aspecto adicional, el método puede permitir mantener una respuesta CTL. En un aspecto adicional, el método puede permitir amplificar una Respuesta de célula T restringida a MHC clase I. En un aspecto adicional, el método puede permitir inducir una respuesta de célula T restringida a MHC clase I . En un aspecto adicional, el método también pueden incluir administrar un agente de inmunopotenciación . Algunas modalidades se refieren a péptidos aislados que tienen una secuencia que comprende una a tres o cuatro sustituciones de aminoácidos en una secuencia de epitopes nativa, en donde una concentración del péptido requerida para producir producción de citocina de una linea de células T generada por inmunización contra un epitope con la secuencia no es más que una concentración particular, por ejemplo, 10 µM, 1 µM, 0.3 µM, y lo similar. La una a tres o cuatro sustituciones de aminoácidos pueden incluir al menos una sustitución de aminoácido estándar y/o al menos una sustitución de aminoácido no estándar, y lo similar. El al menos un aminoácido no estándar puede ser cualquiera de aquellos descritos en la presente, por ejemplo, un D-estereoisómero de un aminoácido estándar, Nva, o NIe. La una a tres o cuatro sustituciones de aminoácidos pueden incluir un aminoácido de terminal modificada, y el aminoácido de terminal modificada puede ser un -aminoácido de terminal C amidada. Una de las sustituciones puede ser la adición de un aminoácido, por ejemplo, la adición puede ser una adición de terminal C. Otras modalidades se refieren a péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que incluye al menos una diferencia de una secuencia de un segmento de un antigeno asociado al objetivo, el segmento que tiene afinidad conocida o predicha para la hendidura de enlace a péptido de una proteina MHC, en donde la al menos una diferencia puede ser un residuo NIe o Nva que reemplaza un residuo en una posición de sujeción de motivo de enlace a MHC en dicho segmento. La posición de sujeción puede ser una posición de sujeción primaria, por ejemplo, P2 o O. La posición de sujeción puede ser una posición de sujeción auxiliar. La diferencia puede incluir un residuo NIe o Nva que reemplaza un residuo hidrofóbico en dicho segmento. En algunos aspectos I, L, o V pueden ser un residuo preferido en la posición de sujeción de motivo de enlace a MHC. En algunos aspectos el péptido puede tener una longitud de aproximadamente 8 a aproximadamente 14 aminoácidos, o más preferentemente una longitud de 9 a 10 aminoácidos, por ejemplo. La proteina MHC puede ser una proteina MHC humana, por ejemplo, proteina HLA clase I. La proteina MHC puede ser, por ejemplo, un tipo como HLA-A2, A3, A24, A30, A66, A68, A69, B7, B8, B15, B27, B35, B37, B38, B39, B40, B48, B51, B52, B53, B 60, B61, B62, B63, B67, B70, B71, B75, B77, C4, Cwl, C 3, C 4, Cw6, C 7 , y CwlO. En algunos aspectos, la proteina MHC puede ser HLA-A2 o A24. MHC puede tener una cavidad de enlace a residuo de sujeción, en donde la cavidad es homologa a la cavidad B o F de HLA-A*0201. Los residuos MHC responsables de formar cavidades de enlace, y que las cavidades de enlace acomodan residuos de sujeción de epitope y de esta manera definen la especificidad de enlace de la molécula MHC, se entienden bien en la materia. Una compilación de tal información se encuentra en el sitio web FIMM (Functional Immunology) en el procedimiento de transferencia de hipertexto (http://) "sdmc. lit . org. sg : 8080/fimm/ . " (Ver también Schónbach C, Koh J.L. Y., Sheng X., Wong L., y V.Brusic. FIMM, una base de datos de inmunología molecular funcional. Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28, No. 1 222-224; Schonbach C, Koh JL, Flower DR, Wong L., y Brusic V. FIMM, una base de datos de inmunología molecular funciona; actualizada el 2002. Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No. 1 226-229; y Zhang, C. et al . , J. Mol Biol . 281:929-947, 1998; cada una de las cuales se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad) . También, el péptido puede tener al menos una característica de enlace que es substancialmente la misma que, o major que, una característica correspondiente de dicho segmento para dicho MHC. Por ejemplo, la característica de enlace puede elevarse en comparación con aquella de dicho segmento. En algunas modalidades, la característica de enlace puede ser afinidad y estabilidad de enlace, por ejemplo . El péptido puede tener una inmunogenicidad que es substancialmente la misma que, o mejor que, la inmunogenicidad del segmento. La inmunogenicidad puede incrementarse. La inmunogenicidad puede evocar una respuesta inmune que es reactiva con dicho segmento o puede evocar una respuesta CTL. La inmunogenicidad puede valorarse, por ejemplo, utilizando un ensayo de MHC-tetrámero, un ensayo de citocina, un ensayo de citotoxicidad, al medir una respuesta inmune que reconoce el péptido, al medir una respuesta inmune que reconoce dicho segmento, utilizando un sistema de inmunización in vi tro, o cualquier otro método adecuado. El sistema de inmunización puede incluir células humanas. La inmunogenicidad puede valorarse utilizando un sistema de inmunización in vivo, por ejemplo, uno que incluye un ratón transgénico. El péptido puede tener una al menos característica de enlace similar como dicho segmento para dicho MHC. Por ejemplo, en algunos aspectos lo que se considera ser "similar" puede determinarse en base a la presente descripción. En algunos aspectos particulares, "similitud" puede basarse en, por ejemplo, concentración de péptido para medio enlace máximo, afinidad relativa, estabilidad (tiempo medio de disociación) y reactividad cruzada/avidez funcional. Como un ejemplo, un péptido puede considerarse similar si tiene resultados o caracteristicas que están dentro de dos veces, aún tres veces, cuatro, cinco o 10 veces del valor para el péptido nativo. Por ejemplo, para reactividad cruzada/avidez funcional, un resultado similar puede ser uno donde los datos están dentro de tres y 10 veces del péptido nativo. Como otro ejemplo, el porcentaje de valores de enlace puede considerarse similar cuando está dentro de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 15 o 20% del péptido nativo. En algunos aspectos, los valores ED5_ pueden considerarse similares cuando están dentro de 2- o 3-veces de secuencia nativa. El tiempo medio similar de disociación puede ser, por ejemplo, dentro de 2- o 3-veces . Como aún otro ejemplo, un valor de reactividad cruzada que es aproximadamente 2 veces diferente del tipo silvestre puede considerarse similar. Estos valores similares son ejemplificativos solamente y se dan en el contexto de algunos aspectos de algunas modalidades. Otros valores "similares" pueden determinarse en base a los experimentos y enseñanzas en la presente. Los péptidos pueden reaccionarse inmunológicamente con el segmento. De esta manera, la reactividad cruzada puede valorarse al inmunizar con el segmento y ensayar el reconocimiento del péptido. Alternativamente, la reactividad cruzada puede valorarse al inmunizar con el péptido y ensayar el reconocimiento del segmento. El péptido como se describe arriba y en cualquier parte en la presente puede modificarse para incluir dos diferencias, por ejemplo. En algunos casos, cada diferencia independientemente puede incluir un Residuo NIe o Nva. En algunos casos, una diferencia no es una sustitución NIe o Nva. También, el péptido como se describe arriba y en cualquier parte en la presente puede incluir tres o más diferencias . El antigeno asociado al objetivo puede ser un antigeno asociado a tumor. El antigeno asociado al objetivo puede ser un antigeno asociado a patógeno. Otras modalidades se refieren a composición inmunogénica que incluye los presentes péptidos como se describe arriba y en cualquier parte en la presente. Las modalidades adicionales se refieren a métodos de inmunización que incluyen administrar tales composiciones a un mamifero, por ejemplo, administrar directamente al sistema linfático del mamifero. Todavía otras modalidades se refieren a métodos para hacer un análogo de epitope de célula T. Los métodos pueden incluir proporcionar una secuencia de aminoácidos de un segmento de un antigeno asociado al objetivo, el segmento pueden tener afinidad conocida o predicha para la hendidura de enlace a péptido de una proteina MHC; cambiar al menos un aminoácido de la secuencia correspondiente a una posición de sujeción de un motivo de enlace MHC a Nle o Nva; y sintetizar un péptido que comprende la secuencia cambiada. La sintesis puede ser, por ejemplo, sintesis química o cualquier otro método sintético. Algunas modalidades se refieren a análogos de péptido de epitope de célula T en donde el análogo difiere de un péptido por reemplazo de al menos un residuo nativo que corresponde a una posición de sujeción de un motivo de enlace MHC con un residuo NIe o Nva. Algunas modalidades se refieren a péptidos aislados que incluyen o consisten esencialmente de una secuencia en la cual : PO es X, XX, o XXX, en donde X especifica cualquier aminoácido o no aminoácido; y Pl es G, A, S, Abu, o Sar; y P2 es L, M, I, Q, V, Nva, Nle, o Abu; y P3 es P o W; y P4 es S; y P5 es I; y P6 es P; y P7 es V; y P8 es H; y P9 es P, A, L, S, o T; y PO en PÍO es I, L, V, Nva, o NIe; y PO+1 es X, XX, o XXX, en donde X especifica cualquier aminoácido o no aminoácido; y en donde la secuencia no es GLPSIPVHPI (SEQ ID NO. 42) . El péptido aislado puede incluir o consistir esencialmente de la secuencia: {S, Sar, o Abu}LPSIPVHPI (SEQ ID NO. 43); o G{M o Nle}PSIPVHPI (SEQ ID NO. 44); o G(L, I, Nva, o Nle)WSIPVHPI (SEQ ID NO. 45); o GLWSIPVHP {Nva o V} (SEQ ID NO. 46); o GLPSIPVH{A o S}I (SEQ ID NO. 47); o GLPSIPVHP{V, L, Nva, o NIe} (SEQ ID NO. 48); o G{Nle}PSIPVHP {Nva, o NIe} (SEQ ID NO. 49); o G{Nva}PSIPVHP{Nva} (SEQ ID NO. 50); o G{V, Nva, o Nle}PSIPVHPV (SEQ ID NO. 51); o {Sar o Abu}LPSIPVHP {V o Nva} (SEQ IDNO. 52); o A{V, I, Nva, o Nle}WSIPVHPI (SEQ ID NO. 53); o AVPSIPVHP{V o Nva} (SEQ ID NO. 54); o A{Nva}PSIPVHPV (SEQ ID NO. 55); o ALWSIPVHP{V o Nva} (SEQ ID NO. 56); o GVWSIPVHP{V o Nva} (SEQ ID NO. 57); o G{Nva}WSIPVHPV (SEQ ID NO. 58) . También, el péptido aislado puede incluir o consistir esencialmente de la secuencia: {Abu}LPSIPVHPI (SEQ ID NO. 59); o G{V, Nva, o Abu}PSIPVHPI (SEQ ID NO. 60); o GLPSIPVHP{V o Nva} (SEQ ID NO. 61); o GLWSIPVHP{I o Nva} (SEQ ID NO. 62); o G{Nle}PSIPVHP {Nva} (SEQ ID NO. 63); o G{Nle o Nva}PSIPVHPV (SEQ ID NO. 64); o {A o Abu}LPSIPVHP{V o Nva} (SEQ ID NO. 65); o . G{Nva}WPSIPVHP {I o V} (SEQ ID NO. 66); o A{Nva o Nle}WSIPVHPI (SEQ ID NO. 67); o A{V o Nva}PSIPVHPV (SEQ ID NO. 68). En particular, el péptido aislado puede incluir o consistir esencialmente de la secuencia: {Abu}LPSIPVHPI (SEQ ID NO. 59); o GLPSIPVHP{V o Nva} (SEQ ID NO. 61); o GLWSIPVHPI (SEQ ID NO. 69); o G{Nle}PSIPVHP {Nva} (SEQ ID NO. 63). Preferentemente, el péptido aislado puede incluir o consistir esencialmente de la secuencia: GLPSIPVHPV (SEQ ID NO. 70) . El péptido puede tener afinidad para una hendidura de enlace de péptido de MHC clase I, y MHC clase I puede ser, por ejemplo, HLA-A2. Modalidades adicionales se refieren a MHC clase I/complejo de péptidos en donde el péptido tiene la secuencia de un péptido como se describe arriba y en cualquier parte en la presente. El MHC clase I/complejo de péptido puede ser reactivo con una TCR que reconoce un MHC clase I/complejo de PSMA288-"297 • El MHC clase I/complejo de péptido puede ser un complejo HLA-A2/PSMA288-2.7 • Algunas modalidades se refieren a polipéptidos que incluyen una secuencia de péptidos como se describe arriba y en cualquier parte en la presente incrustados dentro de una secuencia de liberación. Modalidades adicionales se refieren a composiciones inmunogénicas que incluyen un péptido como se describe arriba y en cualquier parte en la presente. Aún otras modalidades se refieren a un ácido nucleico que codifica o un medio de ácido nucleico para expresar un polipéptido como se describe arriba y en cualquier parte en la presente, asi como también composiciones inmunogénicas que incluyen los ácidos nucleicos o medios de ácido nucleico. Algunas otras modalidades se refieren a métodos para inducir, mantener, o amplificar una respuesta CTL. Los métodos pueden incluir administración intranodal de una composición como se describe arriba y en cualquier parte en la presente. También, algunos métodos se refieren a métodos para inducir una respuesta de célula T restringida a MHC clase I, tales métodos pueden incluir administración intranodal de una composición como se describe arriba y en cualquier parte en la presente. Los métodos también pueden incluir la administración de un agente de inmunopotenciación . Otras modalidades se refieren a péptidos aislados que incluyen 1 a 3 sustituciones en la secuencia GLPSIPVHPI (SEQ ID NO. 42) y que tienen una afinidad para una hendidura de enlace de MHC clase I que es similar o mayor que la afinidad de GLPSIPVHPI (SEQ ID NO. 42) para la hendidura de enlace de MHC clase I. El tiempo medio de disociación puede ser similar o mayor que el tiempo medio de disociación de GLPSIPVHPI (SEQ ID NO. 42) de la hendidura de enlace de MHC clase I. El péptido aislado puede reconocerse por células T con especificidad para el péptido GLPSIPVHPI (SEQ ID NO. 42) . Algunas modalidades se refieren a péptidos aislados que incluyen o consisten esencialmente de una secuencia en la cual : PO es X, XX, o XXX, en donde X especifica cualquier aminoácido o no aminoácido; y Pl es S, K, F, Y, T, Orn, o Hse; y P2 es L, V, M, I, Nva, Nle, o Abu; y P3 es L, Nva, NIe o Abu; y P4 es Q; y P5 es H; y P6 es L, Nva, NIe, o Abu; y P7 es I; y P8 es G, A, S, o Sar; y PO en P9 es L, V, I, A, Nle, Nva, Abu, o L-NH2; y PO+1 es X, XX, o XXX, en donde X especifica cualquier aminoácido o no aminoácido; y en donde la secuencia no es SLLQHLIGL (SEQ ID NO. 71) . El péptido aislado puede incluir o consistir esencialmente de la secuencia: {K, F, Y, T, Orn, o Hse}LLQHLIGL (SEQ ID NO. 72); o S{V, M, I, Nva, NIe, o Abu}LQHLIGL (SEQ ID NO. 73); SL{Nva, NIe o Abu}QHLIGL (SEQ ID NO. 74); o SLLQH{Nva, Nle o Abu}IGL (SEQ ID NO. 75); o SLLQHLI{A, S, o Sar}L (SEQ ID NO. 76); o SLLQHLIG{V, I, A, NIe, Nva, Abu, o L-NH2} (SEQ ID NO. 77); o (F, Y, T, Orn, o Hse} {Nva, NIe, M, o IJLQHLIGL (SEQ ID NO. 78) ; o S{Nva, NIe, o M} LQHLIG{Nva, NIe, o V} (SEQ ID NO. 79); o {K, F, Y, T, Orn, o Hse}LLQHLIGV (SEQ ID NO. 80); o {F o T}LLQHLIG{Nle} (SEQ ID NO. 81); o {F o T}{Nva o M} LQHLIG {NIe } (SEQ ID NO. 82). También, el péptido aislado puede incluir o consistir esencialmente de la secuencia: {F, Y, T, Orn, o Hse}LLQHLIGL (SEQ ID NO. 83); o S{Nva, NIe, o MJLQHLIGL (SEQ ID NO. 84); o SLLQHLIG(Nle, Nva, o L-NH2) (SEQ ID NO. 85); o SLLQH {Nva o Abu}IGL (SEQ ID NO. 86); o S{Nva}LQHLIG(Nle} (SEQ ID NO. 87); o {F o T} {L o Nva}LQHLIG{Nle} (SEQ ID NO. 88). Además, el péptido aislado puede incluir o consistir esencialmente de la secuencia: S{L o Nva}LQHLIG{Nle} (SEQ ID NO. 89); o T{Nva}LQHLIG{Nle} (SEQ ID NO. 90) . Lo aislado puede incluir o consistir esencialmente de la secuencia S {Nva } LQHLIG (NIe} (SEQ ID NO. 87). El péptido aislado puede tener afinidad para una hendidura de enlace de péptido de MHC clase I, y por ejemplo, MHC clase I puede ser HLA-A2. Las modalidades se refieren a complejos de MHC clase I/péptido en donde el péptido puede tener la secuencia de un péptido como se trata arriba, y en cualquier parte en la presente. El MHC clase I/complejo de péptido puede ser reactivo con TCR que reconoce un MHC clase I/complejo de PRAME.J25-4-- • El MHC clase I/complejo de péptido puede ser un complejo HLA-A2/PRAME425-433. Otras modalidades se refieren a polipéptidos que incluyen un secuencia de péptidos como se describe arriba y se describen en cualquier parte en la presente en asociación con una secuencia de liberación. Modalidades adicionales se refieren a composiciones inmunogénicas que incluyen un péptido como se describe arriba y se describen en cualquier parte en la presente. Algunas modalidades se refieren a un ácido nucleico que codifica y un medio de ácido nucleico para expresar un polipéptido como se describe arriba y se describe en cualquier parte en la presente, asi como también composiciones inmunogénicas que incluyen tales ácidos nucleicos y medio. Aún otras modalidades se refieren a métodos para inducir, mantener, o amplificar una respuesta CTL, tales métodos pueden incluir administración intranodal de una composición como se describe arriba y se describe en cualquier parte en la presente. Algunas modalidades se refieren a métodos para inducir una respuesta de célula T restringida a MHC clase I, que pueden incluir administración intranodal de una composición como se describe arriba y se describen en cualquier parte en la presente. En algunas modalidades, los métodos incluyen además administración de un agente de inmunopotenciación . Algunas modalidades se refieren a péptidos aislados que incluyen 1 a 3 sustituciones en la secuencia SLLQHLIGL (SEQ ID NO. 71), que tienen una afinidad para una hendidura de enlace de MHC clase I que es similar o mayor que la afinidad de SLLQHLIGL (SEQ ID NO. 71) para dicha hendidura de enlace de MHC clase I . El tiempo medio de disociación puede ser similar o mayor que el tiempo medio de disociación de SLLQHLIGL (SEQ ID NO. 71) de dicha hendidura de enlace de MHC clase I. El péptido aislado puede reconocerse por células T con especificidad para el péptido SLLQHLIGL (SEQ ID NO. 71) . Modalidades adicionales se refieren a métodos para generar y composiciones resultantes que representan péptidos que son activos inmunes y llevan aminoácidos no naturales en uno o múltiples residuos de sujeción MHC. Una modalidad adicional de la presente invención se refiere al plásmido pSEM y péptidos inmunogénicos expresados por este plásmido correspondiente a epitopes Melan-A26-35 y/o tirosinasa369-377 • El plásmido pSEM codifica los epitopes Melan-A y tirosinasa en una manera que permite su expresión y presentación por pAPCs . Los detalles del plásmido pSEM se describen en la Publicación de Solicitud de Patente de E.U. No. 20030228634, que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. En modalidades particulares de la invención, se proporciona un análogo de péptido aislado de un péptido inmunogénico expresado por un plásmido pSEM que consiste esencialmente de la secuencia: E{A, L, Nva, o NIe } AGIGILT {V, Nva, o NIe} (SEQ ID NO. 91); o Y{M, V, Nva, o Nle } DGTMSQ{ V, Nva, o NIe} (SEQ ID NO. 92); y en donde la secuencia no es E{A o L}AGIGILTV (SEQ ID NO. 93) o YMDGTMSQV (SEQ ID NO. 94). El análogo de péptido aislado de la invención puede seleccionarse del grupo que consiste de ELAGIGILTNva (SEQ ID NO. 95), ENvaAGIGILTV (SEQ ID NO. 96), YVDGTMSQNva (SEQ ID NO. 97), YVDGTMSQV (SEQ ID NO. 98) y YMDGTMSQNva (SEQ ID NO. 99) . En otras modalidades el análogo de péptido aislado es un análogo que consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos ENvaAGIGILTV (SEQ ID NO. 96) . En todavía otras modalidades el análogo de péptido aislado es un análogo que consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos YMDGTMSQNva (SEQ ID NO. 97) . En modalidades adicionales el péptido tiene afinidad para una hendidura de enlace de péptido de MHC clase I. MHC clase I es HLA-A2. Otras modalidades de la invención se refieren a un análogo de péptido aislado que comprende una a tres sustituciones en la secuencia EAAGIGILTV (SEQ ID NO. 100) que tiene una afinidad para una hendidura de enlace de MHC clase I que es similar o mayor que la afinidad de EAAGIGILTV (SEQ ID NO. 100) para la hendidura de enlace de MHC clase I. En aún otras modalidades, el tiempo medio de disociación es similar o mayor que el tiempo medio de disociación de EAAGIGILTV (SEQ ID NO. 100) de la hendidura de enlace de MHC clase I. En otras modalidades, el péptido aislado se reconoce by Células T con especificidad para el péptido EAAGIGILTV (SEQ ID NO. 100) . En todavía otra modalidad, la invención se refiere a un análogo de péptido aislado que comprende una a tres sustituciones en la secuencia YMDGTMSQV (SEQ ID NO. 94) que tiene una afinidad para una hendidura de enlace de MHC clase I que es similar o mayor que la afinidad de YMDGTMSQV (SEQ ID NO. 94) para la hendidura de enlace de MHC clase I. En todavía otras modalidades, el tiempo medio de disociación es similar o mayor que el tiempo medio de disociación de YMDGTMSQV (SEQ ID NO. 94) de la hendidura de enlace de MHC clase I. En otras modalidades, el péptido aislado se reconoce por células T con especificidad para el péptido YMDGTMSQV (SEQ ID NO. 94) .

Las modalidades de la invención también se refieren a un MHC clase I/complejo de péptido en donde el péptido tiene la secuencia del péptido de: E{A, L, Nva, o Nle}AGIGILT{V, Nva, o NIe} (SEQ ID NO. 91); o Y{M, V, Nva, o Nle}DGTMSQ{V, Nva, o NIe} (SEQ ID NO. 92); y en donde la secuencia no es E{A o L}AGIGILTV (SEQ ID NO. 93) o YMDGTMSQV (SEQ ID NO. 94) . En otras modalidades, el MHC clase I/complejo de péptido es reactivo con TCR que reconoce un MHC clase I/complejo de Melan-A2g-35. El MHC clase I/complejo de péptido es un complejo HLA-A2/Melan-A26-35. En aún otra modalidad, el MHC clase I/complejo de péptido es reactivo con TCR que reconoce un MHC clase I/complejo de Tirosinasa369-377. El MHC clase I/complejo de péptido es un complejo de HLA-A2/Tirosinasa369-377. Algunas modalidades de la invención se refieren a un polipéptido que comprende la secuencia de péptidos de E{A, L, Nva, o Nle}AGIGILT{V, Nva, o NIe} (SEQ ID NO. 91); o Y{M, V, Nva, o Nle}DGTMSQ{V, Nva, o NIe} (SEQ ID NO. 92) incrustado dentro de una secuencia de liberación; en donde la secuencia no es E{A o LJAGIGILTV (SEQ ID NO. 93) o YMDGTMSQV (SEQ ID NO. 94) . En todavía una modalidad adicional, la invención se refiere a una composición inmunogénica que comprende cualquiera de los péptidos de E{A, L, Nva, o Nle} AGIGILT{V, Nva, o NIe} (SEQ ID NO. 91); o Y{M, V, Nva, o Nle}DGTMSQ{V, Nva, o NIe} (SEQ ID NO. 92); y en donde la secuencia no es E{A o L}AGIGILTV (SEQ ID NO. 93) o YMDGTMSQV (SEQ ID NO. 94) . La invención también se refiere a una composición inmunogénica que comprende un polipéptido que comprende cualquiera de los péptidos de E{A, L, Nva, o Nle}AGIGILT{V, Nva, o NIe} (SEQ ID NO. 91); o Y{M, V, Nva, o Nle}DGTMSQ{V, Nva, o NIe} (SEQ ID NO. 92), y a un ácido nucleico que codifica tal un polipéptido. Las modalidades de la invención además se refieren a una composición inmunogénica que comprende el ácido nucleico. Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden administrarse como la porción de inducción de una estrategia de inmunización contra un cáncer como glioblastoma y melanoma, pero no se limita a tal. Además, los péptidos correspondientes a los epitopes Melan-A26_35 y turosinasa369-377 y análogos de epitope pueden administrarse como la porción de amplificación de la misma estrategia de inmunización. En modalidades preferidas, los análogos de péptido E{A, L, Nva, o NIe} AGIGILT{V, Nva, o NIe} (SEQ ID NO. 91); o Y{M, V, Nva, o Nle}DGTMSQ{V, Nva, o NIe} (SEQ ID NO. 92) pueden utilizarse en la etapa de amplificación. El procedimiento de inducción y amplificación empleado en presente invención es como se describe en mayor detalle en la Publicación de Patente de E.U. No. 20050079152, y Solicitud de Patente Provisional de E.U. No. 60/640,402, ambas tituladas METHODS TO ELICIT, ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNE RESPONSES AGAINST MHC CLASS I-RESTRICTED EPITOPES, FOR PROPHYLACTIC O THERAPEUTIC PURPOSES, cada una de las cuales se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. De esta manera, se proporciona en una modalidad, un método para inducir, mantener, o amplificar una respuesta CTL. El método pueden incluir administración intranodal de una composición inmunogénica que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de péptidos de un péptido inmunogénico expresado por un plásmido pSEM que consiste esencialmente de la secuencia: E{A, L, Nva, o Nle}AGIGILT{V, Nva, o NIe} (SEQ ID NO. 91); o Y{M, V, Nva, o Nle}DGTMSQ{V, Nva, o NIe} (SEQ ID NO. 92). En modalidades adicionales, se proporciona un método para inducir una respuesta de célula T restringida a MHC clase I que comprende la administración intranodal de la composición inmunogénica y un agente de inmunopotenciación . En todavía otras modalidades, se proporciona un método para inducir, mantener, o inducir una respuesta CTL que comprende la administración intranodal de cualquier composición inmunogénica descrita en la presente. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figuras ÍA y B resumen sustituciones para análogos SSX-24_-9 en cada posición de aminoácido individual para nonámeros y decámeros, respectivamente. Figure 2 es un diagrama esquemático de la metodología de una modalidad preferida para identificar análogos . Figure 3 es una tabla que muestra la reactividad cruzada y avidez funcional de análogos SSX-24?-49 substituidos en una posición única. Figure 4 es una tabla que muestra la reactividad cruzada y avidez funcional de análogos SSX-24?-49 substituidos en dos posiciones. Figure 5 es una tabla que muestra la reactividad cruzada y avidez funcional de análogos SSX-24?-49 substituidos en más de dos posiciones. Figure 6 es una tabla que muestra la reactividad cruzada y avidez funcional de análogos de decámero SSX-24_-49 que comprenden el péptido nominal 41-49. Figure 7 es una linea de tiempo que muestra el horario de inyección de los análogos SSX-24?_49. Figure 8 es una gráfica de barras que muestra la actividad de los análogos SSX-24?-49 A42V, A42L y tipo silvestre en lisis de células tumorales. Figure 9 es una linea de tiempo que muestra el horario de inyecciones para estudios de citotoxicidad in vivo y estudios de citotoxicidad ex vivo asi como también el péptido de análogo SSX-24_-49 utilizado para el refuerzo. Figure 10 es una tabla que muestra los resultados de lisis especifica in vivo para un número de los análogos en comparación con un control (péptido tipo silvestre) y EAA (Melan A 26-35) . Figure 11 es una tabla que muestra los resultados de lisis especifica in vivo para un número de los análogos SSX-24?_49 en comparación con un control (péptido tipo silvestre) y EAA asi como también enlace de MHC y estabilidad de MHC. Figure 12 es una gráfica de barras que muestra el por ciento de lisis especifica de células tumorales (624.38 células tumorales de humano) lograda después de la inmunización con un número de análogos en comparación con un control tipo silvestre. Figuras 13A-C son tablas que resumen las sustituciones en cada posición de aminoácido individual para nonámeros y decámeros, respectivamente, asi como también los resultados obtenidos para cada uno. Figure 14 es una linea de tiempo que muestra el horario de inyección utilizado para análisis y prueba de los análogos NY-ESO-1. Figuras 15A-C muestran la eliminación especifica de células objetivo según se mide al remover los bazos y PBMC de animales con retos y medir la fluorescencia CFSE por citometria de flujo. Figuras 16A y B son gráficas de barras que muestran la citotoxicidad in vivo contra células objetivo revestidas con péptido tipo silvestre después del refuerzo con análogos NY-ESO-1. Figuras 17A y B son gráficas de barras que muestran un análisis ex vivo de la capacidad de los análogos para activar la inmunidad mejorada contra el epitope tipo silvestre según se valora por la producción de citocina. Figure 18 ilustra un procedimiento para validar la antigenicidad del epitope PS A288-297' asi como también los resultados de la prueba. Figure 19 es una tabla que muestra la reactividad cruzada y avidez funcional de análogos PSMA288-297 substituidos en una posición única. Figure 20 es una tabla que muestra la reactividad cruzada y avidez funcional de análogos PSMA288-297 substituidos en dos posiciones. Figure 21 es una tabla que muestra la reactividad cruzada y avidez funcional de análogos PSMA288-297 substituidos en más de dos posiciones. Figure 22 es una gráfica de barras que muestran la inmunogenicidad de varios análogos PSMA288-297 medida por Elispot . Figure 23 es una gráfica de lineas que muestra la amplificación de respuesta anti-PSMA288-297 por el análogo I297V medido por Elispot. Figure 24 es una gráfica de barras que muestran los resultados de refuerzo con el análogo I297V. El ensayo mostró que el refuerzo resultó en inmunidad citotóxica contra una linea de tumor humana PSMAX Figure 25 ilustra un procedimiento para validar la antigenicidad del epitope PRAME425-.33, asi como también los resultados de la prueba. Figure 26 es una tabla que muestra la reactividad cruzada y avidez funcional de análogos PRAME425-33 substituidos en una posición única. Figuras 27A y B son tablas que muestran la reactividad cruzada y avidez funcional de análogos PRAME425_433 substituidos en dos posiciones. Figure 28 es una tabla que muestra la reactividad cruzada y avidez funcional de análogos PRAME425-433 substituidos en más de dos posiciones. Figure 29 es una gráfica de barras que muestran la inmunogenicidad de un análogo PRAME425-43 medida por Elispot. Figure 30 muestra los resultados de refuerzo con el análogo L426Nva L433Nle. El ensayo mostró que el refuerzo resultó en inmunidad citotóxica contra células revestidas con epitope nativo. Figure 31 muestra un procedimiento para la evaluación in vivo de análogos PRAME, asi como también una gráfica de barra que muestra los resultados de la evaluación. Figure 32 muestra un procedimiento para la estimulación ex vivo de producción de citocina células T re-estimuladas de epitope nativo, inducidas por análogo y una gráfica de barra que muestra los resultados de la evaluación. Figure 33 es una gráfica de barras que muestra los resultados de refuerzo con el análogo L426Nva L433Nle. El ensayo mostró que el refuerzo resultó en inmunidad citotóxica contra una linea de células de tumor de humano. Figure 34 representa un procedimiento para inmunización in vi tro a PRAME2s_433. Figure 35 muestra los resultados del análisis de tetrámero después de la inmunización in vi tro con análogos PRAME425-433. Figure 36 representa la estructura del plásmido, pCTLR2, un plásmido que expresa el epitope PRAME425-433. Figure 37 es una gráfica de barras que muestra los resultados de ensayo para un experimento en el cual células de tumor de humano (624.38) se lisan por células T cebadas con ADN de plásmido y se refuerzan con péptidos. Figure 38 es una gráfica de barras que muestra los resultados del análisis de tetrámero después del cebado con plásmido con Tyr369-377 y refuerzo de péptido con el análogo V377Nva. Figure 39 es una gráfica de barras que muestra respuesta in vivo contra análogos de epitopes de Tirosinasa y Melan A.

Figure 40 es una linea de tiempo que muestra un procedimiento de evaluación de inmunogenicidad de análogos de Tirosinasa . Figure 41 es una gráfica de barras que muestra los resultados de respuesta inmune contra 624.38 células contactadas con células efectoras de HHD cebado con plásmido y reforzado con análogos Tyr369_377. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA MODALIDAD PREFERIDA Los péptidos que comprenden epitopes de célula T son usualmente inmunógenos deficientes o moduladores inmunes debido a uno de múltiples factores: un perfil farmacocinético subóptimo, enlace restringido a moléculas MHC (Kencendida reducida Kapagada incrementada) , reconocimiento intrínseco disminuido por células T presentes en el repertorio inmune normal (e.g., a través de varias formas de tolerancia). Varias estrategias se han perseguido para mejorar las propiedades inmunológicas de péptidos, particularmente la selección y uso de péptidos en los cuales la secuencia difiere del epitope natural. Tales análogos se conocen por varios nombres en la materia, tales como péptidos heteroclíticos y ligandos de péptido alterados (APL} . La generación de tales análogos tiene aminoácidos más frecuentemente utilizados del conjunto estándar de residuos genéticamente codificados (ver por ejemplo Valmori, D. et al , J. Immunol . 160:1750-1758, 1998). Uso de aminoácidos no estándar se ha asociado tipicamente con esfuerzos para mejorar la estabilidad bioquímica del péptido (ver, por ejemplo, Blanchet, J.-S. et al . , J. Immunol . 167:5852-5861, 2001) . Generalmente, los análogos pueden categorizarse en las siguientes dos clases principales: (1) modificación de residuos de sujeción de péptido para lograr mejores perfiles de enlace a HLA y respuestas inmunes más altas, y (2) modificación de residuos de sujeción de péptido y residuos de contacto TCR para sortear la tolerancia de célula T para auto-antigenos . Algunas modalidades de la invención descritas en la presente se refieren a análogos que tienen al menos una de las siguientes propiedades retenidas o mejoradas, incluyendo pero no limitándose a: 1. Reactividad cruzada y avidez funcional a TCR; 2. Afinidad para y estabilidad de enlace a MHC clase I ; 3. Efecto in vivo en inmunidad valorada por citotoxicidad; 4. Efecto in vivo en inmunidad valorada por producción ex vivo de IFN-gamma; y/o 5. Resistencia incrementada a proteolisis. Algunas modalidades se refieren a secuencias de péptidos, incluyendo análogos, en donde los aminoácidos de la secuencia se refieren con un diseñador de posición, por ejemplo Pl, P2, P3, PO, etc. Además, las secuencias de péptidos pueden referirse como incluyendo un designador PO y/o PO + 1. En algunos aspectos, PO puede ser X, XX, o XXX, en donde X es cualquier aminoácido o no aminoácido. Similarmente, en algunos aspectos, PO + 1 puede ser X, XX, o XXX, en donde X es cualquier aminoácido o no aminoácido. De esta manera, por ejemplo, XXX puede significar cualquier combinación de cualquier residuo de aminoácido o residuos de no aminoácido. De esta manera, estas modalidades pueden comprender polipeptidos que tienen hasta tres aminoácidos adicionales (con cualquier combinación de residuos de aminoácido) en el término N o término C de la secuencia especificada. También, en algunos aspectos, las modalidades pueden comprender residuos de no aminoácido adicionales en el término N o término C. Los residuos MHC responsables de formar cavidades de enlace, y tales cavidades de enlace acomodan los residuos de sujeción y de esta manera definen la especificidad de enlace de la molécula MHC, se entienden bien en la materia. Una compilación de tal información se encuentra en el sitio de red FIMM (Functional Immunology) en el procedimiento de transferencia de hipertexto (http://) "sdmc . lit . org . sg : 8080/fímm/" , que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. (Ver también Schónbach C, Koh J.L. Y., Sheng X., Wong L., y V. Brusic. FIMM, una base de datos de inmunología molecular funcional; actualizada el 2002. Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28, No. 1222-224; y Schónbach C, Koh JL, Flower DR, Wong L., y Brusic V. FIMM, una base de datos de inmunología molecular funcional; actualizada el 2002. Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No. 1 226-229; cada una de las cuales se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad) . La frase "secuencia de liberación, " como se utiliza en la presente, se refiere a un péptido que comprende o que codifica un epitope o un análogo, que se incrusta en una secuencia más larga que proporciona un contexto que permite al epitope o análogo liberarse por procesamiento inmunoproteasomal, directamente o en combinación con recorte de terminal N u otros procesos fisiológicos. En algunos aspectos, el análogo o epitope pueden designarse o formarse. Otras modalidades se refieren a conjuntos de epitopes y otros polipéptidos que incluyen las secuencias análogas de epitope que pueden procesarse para liberar el análogo. Modalidades adicionales se refieren a ácidos nucleicos, particularmente plásmidos de ADN, que codifican tales polipéptidos, o simplemente un análogo, y su expresión de los mismos. Los análogos, los polipéptidos que los comprenden, y los ácidos nucleicos de codificación todos pueden ser componentes de composiciones inmunogénicas, particularmente composiciones adecuadas para suministro intralinfático, todos de los cuales se refieren a modalidades adicionales . Los análogos de péptido con propiedades inmunológicas mejoradas pueden diseñarse al modificar los residuos de sujeción incluidos en la interacción con moléculas MHC, para incrementar el enlace y estabilizar la formación de complejos de MHC-péptido. Tales modificaciones pueden guiarse por conocimiento del motivo de enlace u otros residuos de sujeción preferidos de la molécula MHC de restricción. También existen varias reglas, Índices y algoritmos que pueden utilizarse para predecir las propiedades de análogos que llevan varias sustituciones con la limitación que la sustitución se selecciona del conjunto estándar de aminoácidos genéticamente codificables. Sin embargo, no existen bases de datos o algoritmos para predecir el resultado de los residuos de sujeción de reemplazo con aminoácidos no estándar y su utilidad no se explora previamente. Se describe en la presente que los aminoácidos no estándar norleucina (NIe) y norvalina (Nva) pueden substituirse ventajosamente en las posiciones de residuo de sujeción de péptidos de enlace a MHC. Se prefiere que se coloquen en una posición favorablemente ocupada por un aminoácido hidrofóbico o uno grande, especialmente I, L, o V. Los motivos de enlace a MHC se definen generalmente en términos de cadenas laterales de residuo preferidas en posiciones nominales dentro de un espacio de 8 a 10 aminoácidos (ver por ejemplo Rammensee et al . , "MHC Ligands and Peptide Motifs," (Molecular Biology Intelligence Unit), Springer-Verlag, Alemania, 1997 Landes Bioscience, Austin, Texas; y Parker, et al., "Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains, " J. Im unol . 152:163-175. Los algoritmos del sitio de red también están disponibles, los cuales pueden utilizarse para predecir enlace MHC. Ver por ejemplo, la página de red mundial de Hans-Georg Rammensee, Jutta Bachmann, Nlels Emmerich, Stefan Stevanovic: SYFPEITHI : An Internet Datábase for MHC Ligands and Peptide Motifs (procedimiento de transferencia de hipertexto acceso a través: syfpeithi. bmi-heidelberg.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm) y "bimas. dcrt. nih. gov / molbio/ hla_bind.". Para epitopes restringidos a clase I, la posición de terminal C, PO, es tipicamente una sujeción primaria. La 2da posición, P2, también es con frecuencia una sujeción primaria o, alternativamente, P3 y/o P5 pueden servir a este papel. Las posiciones P2 a P7 se han reconocido todas como posiciones de sujeción, secundarias y auxiliares para una y otra MHC (ver Rammensee et al . , y ver Tabla 6 de la Publicación de Solicitud de Patente de E.U. No. 20030215425 (Solicitud de Patente de E.U. No. 10/026,066, presentada el 7 de Diciembre de 2001, titulada EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS; que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad para toda su descripción) . Para epitopes restringidos a clase II, Pl, P4, P6, P7, y P9 se han reconocido como posiciones de sujeción. Lo anterior se propone como una guía general y debe considerarse ejemplificativo y no exhaustivo o limitante. Muchos análisis y compilaciones de motivos de enlace, residuos de sujeción, y lo similar están disponibles en la literatura de patente y científica y en el Internet. Sus convenciones y resultados proporcionan además a aquellos de experiencia en la materia guía útil que considera el diseño de análogos de epítope, cuando se acoplan con la enseñanza en la presente. La longitud del péptido actualmente enlazado a la molécula MHC de presentación puede ser más larga que la secuencia de motivo nominal . Los extremos de la hendidura de enlace para moléculas MHC clase II se abren de manera que el péptido enlazado puede extenderse en cualquier extremo del motivo de núcleo. En contraste, la hendidura de enlace está cerrada en ambos extremos en moléculas MHC clase I de manera que los extremos del péptido enlazado deben corresponder generalmente al motivo, sin embargo, la variación significativa en longitud puede acomodarse a través de protuberancia y doblez de la región central del péptido enlazado, de manera que los péptidos de hasta al menos aproximadamente 14 aminoácidos en longitud pueden presentarse (ver por ejemplo Probst-Kepper , M. et al , J. Immunol . 173:5610-5616, 2004) . Los análogos de epítope pueden tener Kencend?da y Kapagada mejorada relacionadas con la interacción con moléculas MHC clase I, así como también interacción conservada o incrementada con receptores de célula T que reconocen el epítope original, actividad in vivo o ex vivo modificada o mejorada reflejada en expansión mejorada de poblaciones de célula T específicas, producción de citocina mejorada por células T especificas, o citotoxicidad in vivo o ex vivo contra objetivos que llevan epitopes naturales, mediada por células T que se reaccionan con el péptido. Además, tales análogos pueden interactuar en una manera más óptima con múltiples moléculas de MHC clase I distintas. Tales análogos de péptido con propiedades inmunes mejoradas pueden comprender una o múltiples sustituciones, incluyendo una o múltiples sustituciones de aminoácidos no estándar. Entre las sustituciones de aminoácidos no estándar, sustituciones para residuos de sujeción primarios que consisten de norvalina o norleucina se prefieren, debido a que, como se ejemplifica abajo, no solamente pueden mejorar la interacción con MHC clase I, sino que también pueden conservar la reactividad cruzada con TCR específica para el epitope nativo y muestran perfil inmune in vivo mejorado. Por ejemplo, la mutación del residuo de aminoácido P2 de A, L o V en norvalina o norleucina mejoró las propiedades inmunes y de esta manera se prefiere. Además, la modificación del residuo de terminal C en norvalina o preferentemente norleucina, mejoró las características inmunes de los análogos. Además, los análogos que comprenden múltiples sustituciones en residuos de sujeción primarios y/o secundarios incluyendo norvalina y/o norleucina en P2 o PO pueden asociarse con propiedades inmunes mejoradas. Ciertos usos de norvalina (Nva) y norleucina (NIe) se mencionan en la Patente de E.U. No. 6,685,947; Publicaciones PCT Nos. WO 03/076585 A2 y WO 01/62776 Al; y Publicación de Patente de E.U. No. 20040253218A1. Ninguna de estas referencias enseña la utilidad general de Nva o Nle substituida en una posición de sujeción de un péptido de enlace a MHC para mejorar una propiedad inmunológica. La publicación '218 enseña que los residuos substituidos deben incorporarse en posiciones de interacción de TCR y no en posiciones de interacción de MHC. En aún otra modalidad de la invención, el péptido es un análogo de un péptido derivado de un antígeno específico a NS que es inmunogénico pero no encefalitogénico . Los péptidos más adecuados para este propósito son aquellos en los cuales un auto-péptido encefalitogénico se modifica en sitio de enlace al receptor de célula T (TCR) y no en el (los) sitio (s) de enlace a MHC, de manera que la respuesta inmune se activa pero no energiza (Karin et al . , 1998; Vergelli et al , 1996) . Otros han sugerido que una variedad de aminoácidos no estándar pueden substituirse sin destruir la utilidad del péptido (ver por ejemplo WO 02/102299A) . Los aminoácidos no estándar también se han utilizado para investigar la interacción entre TCR y el Complejo de MHC-péptido (ver por ejemplo WO 03/076585A y Sasada, T. et al . Eur. J. Immunol . 30:1281-1289, 2000). Baratin mostró alguna utilidad de NIe y Abu en posiciones de no sujeción y NIe en una posición de sujeción en un péptido p53 presentado por la molécula MHC de murino H2-Db (J. Peptide Sci. 8:327-334, 2002). Cada uno de estos documentos anteriores se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. Los péptidos restringidos a HLA-A2.1 que incorporan NIe descritos en WO 01/62776 se derivan de CEA, p53, y MAGE-3. En el péptido de CEA l(Nle}GVLVGV y el péptido p53 S (NleJPPPGTRV (SEQ ID NO. 101), NIe está presente en la posición P2. Ninguna enseñanza acerca de la utilidad general de norleucina se proporciona y no se proporciona una descripción que indica como o si estas sustituciones alteran las propiedades de los análogos en comparación con la secuencia nativa.

Algunas de las presentes modalidades se refieren a análogos de epitope que incorporan Nva y/o NIe en una posición que promueve el enlace a MHC. Algunas modalidades específicamente excluyen el uso de NIe y/o Nva en epítopes restringidos a HLA-A2.1, epitopes HLA-A2.1 de CEA, p53, y/o MAGE-3, o otros péptidos derivados de MAGE-3, CEA, y/o p53. En algunas modalidades, una o más de las secuencias específicas como se describe en las referencias de patente de arriba se excluyen específicamente. En otras modalidades, los análogos de murino u otros epitopes restringidos a MHC no humanos se excluyen. Otras modalidades ejemplificativas incluyen el uso de NIe y/o Nva en las posiciones de sujeción P3, P5, y/o PO, en una posición de sujeción auxiliar, para hacer un análogo de un epitope restringido a no-A2- o no-A2.1-HLA, en una posición de sujeción de un péptido que no se deriva de un oncogén o proteina oncofetal, y en una posición de sujeción de un péptido derivado de un antigeno CT . En general, tales análogos pueden ser útiles para inmunoterapia y/o profilaxis de varias enfermedades, tales como infecciosas, cancerosas o inflamatorias, como agentes únicos o en terapias de combinación. Esto se debe a su interacción optimizada con moléculas MHC y receptores de célula T claves para el inicio y regulación de respuestas inmunes . Producción de análogo Los análogos pueden producirse utilizando cualquier método conocido por un experto en la materia, incluyendo la fabricación de los péptidos utilizando un método de sintesis de péptido o expresando ácidos nucleicos que codifican los análogos de péptido deseados. De esta manera, cuando los análogos incluyen uno o más aminoácidos no estándar, es probable que se producirán por un método de producción de péptido. Cuando los análogos incluyen solamente una o más sustituciones con aminoácidos estándar, pueden expresarse de un vector de expresión utilizando cualquier método conocido por un experto en la materia. Alternativamente, los péptidos pueden expresarse utilizando un método de terapia genética. Prueba de Análogos Para evaluar la utilidad y/o actividad, y/o propiedades mejoradas de los análogos y comparar los análogos en cualquier manera con el tipo silvestre, uno o más de los siguientes ensayos se conducen: afinidad de enlace a péptido para HLA-A* 0201; ensayo de estabilidad de complejo de péptido-HLA-A*0201; un ensayo de reactividad cruzada (reconocimiento de análogos de péptido por CTL específico de péptido, tipo silvestre o reconocimiento de péptido tipo silvestre por CTL generado utilizando análogos de péptido) ; un ensayo de inmunogenicidad, tal como un ensayo de secreción de IFN-?, un ensayo de citotoxicidad, y/o un ensayo Elispot; un ensayo de antigenicidad, tal como un ensayo de lisis celular de tumor in vi tro, una lisis de célula de tumor ex vivo, y una lisis de célula de tumor in vivo; y un ensayo de proteolisis para identificar la resistencia incrementada a proteolisis. Los detalles de ensayos ejemplificativos se presentan en los Ejemplos abajo. El uso de las metodologías anteriores, se identifican los análogos útiles y/o mejorados. Para ser útil, un análogo puede no necesariamente encontrarse estar mejorado en los ensayos identificados. Por ejemplo, un ' péptido útil puede contener otras propiedades tales como siendo útiles en un paciente con tolerancia o resistente a proteolisis. Para mejorarse, un péptido puede encontrarse que tiene una mejora clara en enlace a TCR, enlace a la molécula MHC, y una respuesta inmune mejorada o cualquier otra actividad biológica. En algunos casos, un péptido útil no parece estar mejorado cuando se utiliza un sistema de prueba de murino, pero debido a las diferencias en el sistema inmune humano, se determina que se mejore cuando se prueba en un humano. En algunos casos, la utilidad puede originarse de un potencial para interrumpir la tolerancia en un humano con tolerancia. En algunos casos, la utilidad puede originarse de la capacidad para utilizar el péptido como una base para sustituciones adicionales para identificar análogos mejorados . Usos de análogos Los métodos útiles para utilizar los análogos descritos para inducir, mantener, modular y amplificar respuestas de célula T restringida a MHC clase I, y particularmente respuestas de CTL de memoria y efectora a antigeno, se describen en las Patentes de E.U. Nos. 6,994,851 (2/7/06) y 6,977,074 (12/20/2005) ambas tituladas "A method of Inducmg a CTL response"; Solicitud Provisional de E.U. No. 60/479,393, presentada el 17 de Junio de 2003, titulada "METHODS TO CONTROL MHC CLASS I-RESTRICTED IMMUNE RESPONSE"; y Solicitud de Patente de E.U. No. 10/871,707 (Pub. No. 2005 0079152) y Solicitud de Patente de E.U. Provisional No. 60/640,402 presentada el 29 de Diciembre de 2004, ambas tituladas "METHODS TO ELICIT, ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNE RESPONSES AGAINST MHC CLASS I-RESTRICTED EPITOPES, FOR PROPHYLACTIC O THERAPEUTIC PURPOSE". Los análogos también pueden utilizarse en la búsqueda para obtener además análogos optimizados. Numerosos epítopes locales se proporcionan en las Solicitudes de E.U. Nos. 10/117,937, presentada el 4 de Abril de 2002 (Pub. No. 20030220239 Al), y 10/657,022 (20040180354), y en la Solicitud PCT No. PCT/US2003/027706 (Pub. No. WO04022709A2) , presentada el 5 de Septiembre de 2003; y Solicitudes Provisionales de E.U. Nos. 60/282,211, presentada el 6 de Abril de 2001; 60/337,017, presentada el 7 de Noviembre de 2001; 60/363,210 presentada el 7 de Marzo de 2002; y 60/409,123, presentada el 5 de Septiembre de 2002; cada una de tales aplicaciones se titula "EPITOPE SEQUENCES". Los análogos además pueden utilizarse en cualquiera de los diversos modos descritos en aquellas solicitudes. Los grupos de epítopes, que pueden comprender o incluir los presentes análogos, se describen y se definen de manera más completa en la Solicitud de Patente de E.U. No. 09/561,571, presentada el 28 de Abril de 2000, titulada EPITOPE CLUSTERS. Metodología para utilizar y suministrar los análogos presentes se describe en las solicitudes de Patente de E.U. 09/380,534 y 6977074 {emitidas el 20 de Diciembre de 2005) y en la Solicitud PCT No. PCTUS98/14289 (Pub. No. WO9902183A2 ) , each titulada A "METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE". Los principios de selección de epitope benéficos para tales inmunoterapéuticos se describen en las Solicitudes de Patente de E.U. Nos. 09/560,465, presentada el 28 de Abril de 2000, 10/026,066 (Pub. No. 20030215425 Al), presentada el 7 de Diciembre de 2001, y 10/005,905 presentada el 7 de Noviembre de 2001, todas tituladas "EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS"; 6,861,234 (emitida el 01 de Marzo de 2005; No. de Solicitud 09/561,074 ), titulada "METHOD OF EPITOPE DISCOVERY"; 09/561,571, presentada el 28 de Abril de 2000, titulada EPITOPE CLUSTERS; 10/094,699 (Pub. No. 20030046714 Al), presentada el 7 de Marzo de 2002, titulada "ANTI-NEOVASCULATURE PREPARATIONS FOR CÁNCER"; Nos. de Solicitudes 10/117,937 (Pub. No. 20030220239 Al) y PCTUS02/11101 (Pub.

No. WO02081646A2) , ambas presentadas el 4 de Abril de 2002, y ambas tituladas "EPITOPE SEQUENCES"; y Nos. de Solicitudes 10/657,022 y Solicitud PCT No. PCT/US2003/027706 (Pub. No. WO04022709A2) , ambas presentadas el 5 de Septiembre de 2003, y ambas tituladas "EPITOPE SEQUENCES". Los aspectos del diseño total de plásmidos de vacuna se describen en las Solicitudes de Patente de E.U. Nos. 09/561,572, presentada el 28 de Abril de 2000, titulada "EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS" y 10/292,413 (Pub. No.20030228634 Al), presentada el 7 de Noviembre de 2002, titulada "EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET- ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS FO THEIR DESIGN"; 10/225,568 (Pub No. 2003-0138808), presentada el 20 de Agosto de 2002, Solicitud PCT No. PCT/US2003/026231 (Pub. No. WO 2004/018666), presentada el 19 de Agosto de 2003, ambas tituladas "EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS"; y Patente de E.U. No. 6,709,844, titulada "AVOIDANCE OF UNDESIRABLE REPLICATION INTERMED1ATES IN PLASMID PROPAGATION". Las combinaciones antigénicas específicas de beneficio particular para dirigir una respuesta inmune contra cánceres particulares se describen en la Solicitud de patente de E.U. Provisional No. 60/479,554, presentada el 17 de Junio de 2003 y la Solicitud de Patente de E.U. No. 10/871,708, presentada el 17 de Junio de 2004 y Solicitud de Patente PCT No. PCT/US2004/019571 (Pub. No. WO 2004/112825), todas tituladas "COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN VACCINES FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS". Los antígenos asociados con neovasculatura de tumor (e.g., PSMA, VEGFR2, Tie-2) también son útiles en conexión con enfermedades cancerosas, como se describe en la Solicitud de Patente de E.U. No. 10/094,699 (Pub. No. 20030046714 Al), presentada el 7 de Marzo de 2002, titulada "ANTI-NEOVASCULATURE PREPARATIONS FOR CÁNCER". Métodos para activar, mantener, y manipular las respuestas inmunes por administración objetivo de modificadores de respuesta biológica se describen la Solicitud Provisional de E.U. No. 60/640,727, presentada el 29 de Diciembre de 2004. Métodos para desviar las células CD4+ en la inducción de una respuesta inmune se describen en la Solicitud Provisional de E.U. No. 60/640,821, presentada el 29 de Diciembre de 2004. Las enfermedades ejemplificativas, organismos y antígenos y epítopes asociados con organismos objetivo, las células y enfermedades se describen en la Solicitud de E.U. No. 6977074 (emitida el 20 de Diciembre de 2005) presentada el 2 de Febrero de 2001 y titulada "METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE". La metodología ejemplificativa se encuentra en la Solicitud Provisional de E.U. No. 60/580,969, presentada el 17 de Junio de 2004, y Solicitud de Patente de E.U. No. 2006-0008468-A1, publicada el 12 de Enero de 2006, ambas tituladas "COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN DIAGNOTISTICS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS". Metodología y composiciones también se describen en la Solicitud Provisional de E.U. No. 60/640,598, presentada el 29 de Diciembre de 2004, titulada "COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN COMPOSITIONS FOR VARIOUS TYPES OF CÁNCER". La integración de técnicas de diagnóstico para valorar y monitorear la respuesta inmune con los métodos de inmunización incluyendo utilizar los presentes análogos se trata más completamente en la Solicitud de Patente de E.U. Provisional No. 60/580,964 presentada el 17 de Junio de 2004 y Solicitud de Patente de E.U. No. US-2005-0287068-A1, publicada el 29 de Diciembre de 2005) ambas tituladas "IMPROVED EFFICACY OF ACTIVE IMMUNOTHERAPY BY INTEGRATING DIAGNOSTIC WITH THERAPEUTIC METHODS". El polipéptido inmunogénico que codifica vectores se describen en la Solicitud de Patente de E.U. No. 10/292,413 (Pub. No. 20030228634 Al), presentada el 7 de Noviembre de 2002, titulada EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN, y en la Solicitud Provisional de E.U. No. 60/691,579, presentada el 17 de Junio de 2005, y la Solicitud de Patente de E.U. correspondiente No. de Serie. (No. de Registro MANNK.053A presentada en la misma fecha que la presente solicitud) ambas tituladas "METHODS AND COMPOSITIONS TO ELICIT MULTIVALENT IMMUNE RESPONSES AGAINST DOMINANT AND SUBDOMINANT EPITOPES EXPRESSED ON CÁNCER CELLS AND TUMOR STROMA"). La descripción útil adicional, incluyendo métodos y composiciones de materia, se encuentra en la Solicitud Provisional de E.U. No 60/691,581, presentada el 17 de Junio de 2005, titulada "MULTIVALENT ENTRAIN-AND-AMPLIFY IMMUNOTHERAPEUTICS FOR CARCINOMA." Metodología adicional, composiciones, péptidos, y análogos de péptido se describen en las Solicitudes Provisionales de E.U. Nos. 60/581,001 y 60/580,962, ambas presentadas el 17 de Junio de 2004, y respectivamente tituladas "SSX-2 PEPTIDE ANALOGS" y "NY-ESO PEPTIDE ANALOGS." Cada una de las aplicaciones y patentes mencionadas en los párrafos anteriores se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad para todo lo que enseña. Los análogos adicionales, péptidos y métodos se describen en la Publicación de Solicitud de Patente de E.U. No 20060063913, titulada "SSX-2 PEPTIDE ANALOGS"; y Publicación de Patente de E.U. No. 2006-0057673 Al, publicada el 16 de Marzo de 2006, titulada "EPITOPE ANALOGS"; y Publicación de Solicitud PCT No. WO/2006/009920, titulada "EPITOPE ANALOGS"; todas presentadas el 17 de Junio de 2005, así como también en la Solicitud de Patente Provisional de E.U. No. 60/691,889, presentada el 17 de Junio de 2005 titulada EPITOPE ANALOGS; y Solicitud de Patente de E.U. No. / , titulada PRAME PEPTIDE ANALOGUES (No de Registro.

MANNK.052A), Solicitud de Patente de E.U. No. / , titulada PSMA PEPTIDE ANALOGUES (No. de Registro MANNK.052A2) , y Solicitud de Patente de E.U. No. titulada MELANOMA ANTIGEN PEPTIDE ANALOGUES (No. de Registro MANNK.052A3) , cada una de las cuales se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. Los productos inmunogénicos ejemplificativos se describen en la Solicitud de Patente Provisional de E.U. No. 60/691,581, presentada el 17 de Junio de 2005 y Solicitud de Patente de E.U. No. /_ (No. de Registro MANNK.054A), presentada en la misma fecha que la presente solicitud, cada una titulada MULTIVALENT ENTRAIN-AND-AMPLIFY IMMUNOTHERAPEUTICS FOR CARCINOMA, y cada una incorporada para referencia en su totalidad. Metodología adicional y composiciones se describen en la Solicitud Provisional de E.U. No. 60/581,001, presentada el 17 de Junio de 2004, titulada "SSX-2 PEPTIDE ANALOGS", y la Solicitud Provisional de E.U. No. 60/580,962, presentada el 17 de Junio de 2004, titulada "NY-ESO PEPTIDE ANALOGS"; cada una de las cuales se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. Otras aplicaciones que se incorporan de manera expresa en la presente para referencia son: Solicitud de Patente de E.U. No. de Serie 11/156,253 (Publication No. ), presentada el 17 de Junio de 2005, titulada "SSX-2 PEPTIDE ANALOGS"; Solicitud de Patente de E.U. No. de Serie 11/155,929, presentada el 17 de Junio de 2005, titulada "NY-ESO-I PEPTIDE ANALOGS" (Publication No. ); Solicitud de Patente de E.U. No. de Serie 11/321,967, presentada el 29 de Diciembre de 2005, titulada "METHODS TO TRIGGER, MAINTAIN AND MANIPÚLATE IMMUNE RESPONSES BY TARGETED ADMINISTRATION OF BIOLOGICAL RESPONSE MODIFIERS INTO LYMPHOID ORGANS"; Solicitud de Patente de E.U. No. de Serie 11/323,572, presentada el 29 de Diciembre de 2005, titulada "METHODS TO ELICIT ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNE REPONSES AGAINST MCH CLASS I RESTRICTED EPITOPES, FOR PROPHYLACTIC O THERAPEUTIC PURPOSES"; Solicitud de Patente de E.U. No. de Serie 11/323,520, presentada el 29 de Diciembre de 2005, titulada "METHODS TO BYPASS CD4+ CELLS IN THE INDUCTION OF AN IMMUNE RESPONSE"; Solicitud de Patente de E.U. No. de Serie 11/323,049, presentada el 29 de Diciembre de 2005, titulada "COMBINATION OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN COMPOSITIONS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS"; Solicitud de Patente de E.U. No. de Serie 11,323,964, presentada el 29 de Diciembre de 2005, titulada "COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN DIAGNOSTICS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS . " Como un ejemplo, sin limitarse al mismo cada referencia se incorpora para referencia para lo que enseña acerca de los epitopes restringidos a MHC clase I, análogos, el diseño de análogos, usos de epitopes y análogos, métodos para utilizar y hacer epítopes, el diseño y uso de vectores de ácido nucleico para su expresión, y formulaciones. Antigenos Existen muchos antigenos, epitopes de los cuales pueden reconocerse por células T en una manera restringida a MHC, para la cual la manipulación de una respuesta inmune dirigida contra ellas tiene potencial profiláctico o terapéutico. Los principios para hacer análogos de péptidos de enlace a MHC descritos en la presente son generalmente aplicables a cualquiera de estos antígenos y sus epítopes. Un enfoque particular de la presente descripción es epitopes de los antígenos asociados a tumor (TuAA) SSX-2, NY-ESO-1, PRAME, PSMA, tirosinasa, y Melan-A. SSX-2, también conocido como Hom-Mel-40, es un miembro de una familia de antígenos de testículos con cáncer altamente conservados (Gure, A. O. et al . In t . J. Cáncer 72:965-971 , 1997, que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad) . Su identificación como un antígeno de TuAA se enseña en la Patente de E.U. 6,025,191 titulada "ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULES THAT ENCODE A MELANOMA SPECIFIC ANTIGEN AND USES THEREOF", que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. Los antigenos de testículos con cáncer se encuentran en una variedad de tumores, pero generalmente están ausentes de tejidos adultos normales excepto testículos, SSX-2 se expresa en muchos tipos diferentes de tumores, incluyendo sarcomas sinoviales, melanoma, cánceres de cuello y cabeza, mama, colon y cánceres ováricos. Además de su expresión difundida en una variedad de cánceres, también es inmunogénica en pacientes con enfermedad en última etapa. Además, existe una evidencia de respuestas inmunes celulares y humorales espontáneas hacia este antigeno en pacientes con tumor metastático (Ayyoub M, et al , Cáncer Res . 63(17): 5601-6, 2003; Ayyoub M, et al J Immunol . 168(4): 1717-22, 2002), que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. Dos de los epítopes de célula T restringidos a HLA-A2 se han identificado recientemente utilizando inmunología de célula T inversa, principalmente SSX-24?-49 (Ayyoub M, et al . J Immunol . 168(4): 1717-22, 2002; Patente de E.U. No. 6,548,064, titulada "ISOLATED PEPTIDES CONSISTING OF AMINO ACID SEQUENCES FOUND IN SSX OR NY-ESO-1 MOLECULES, THAT BIND TO HLA MOLECULE"; Solicitud de Patente de E.U. No. 10/117,937 (No. de Publicación US 2003-0220239 Al), titulada "EPITOPE SEQUENCES") y SSX-2?03-??? (Wagner C, et al . Cáncer Immuni ty 3:18, 2003), cada una de las cuales se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. Los términos C de ambos epítopes pueden generarse eficientemente por digestión de proteasoma in ví tro . Las células T CD8+ de multímero+ HLA-A*0201/SSX-24?-49 aislado de nodos linf infiltrados por tumor de pacientes positivos en SSX-2; sin embargo, las respuestas inmunológicas que ocurren de manera espontánea no fueron suficientes para detener el crecimiento de tumor, posiblemente debido a que esta respuesta inmune no se desarrolla hasta casi después en la progresión de enfermedad, y las células T actividades no fueron suficientemente numerosas. Patente de E.U. No. 6,548,064 (que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad) además describe substituir un residuo T o A en tanto la posición P2 como PO de un epitope SSX-2. NY-ESO-1 es un antigeno de testículos con cáncer encontrado en una amplia variedad de tumores y también se conoce como CTAG-1 (Antígeno 1 de Testículos con Cáncer) y CAG-3 (Antigeno 3 de Cáncer) . NY-ESO-1 como un antígeno asociado a tumor (TuAA) se describe en la Patente de E.U. 5,804,381 titulada "ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULE ENCODING AN ESOPHAGEAL CÁNCER ASSOCIATED ANTIGEN, THE ANTIGEN ITSELF, AND USES THEREOF, " que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. Los antígenos que codifican el lugar parálogo con identidad de secuencia extensiva, LAGE-la/s y LAGE-lb/L, se han descrito en ensambles públicamente disponibles del genoma humano, y se ha concluido que se originan a través de empalme alterno. Adicionalmente, CT-2 (o CTAG-2 Antigeno de Testículos con Cáncer 2) parecer ser ya sea un alelo, un mutante, o una discrepancia de secuenciación de LAGE-lb/L. Debido a la identidad de secuencia extensiva, muchos epitopes de NY-ESO-1 también pueden inducir inmunidad a tumores que expresan estos otros antigenos. Las proteínas son virtualmente idénticas a través de aminoácido 70. De los residuos 71-134 la corrida más larga de identidad entre NY-ESO-1 y LAGE es de 6 residuos, pero potencialmente las secuencias reactivas están presentes. De los residuos 135-180, NY-ESO y LAGE-la/s son idénticos excepto para un residuo único, pero LAGE-lb/L no se relaciona debido al empalme alterno. Los antigenos CAMEL y LAGE-2 parecen derivarse del mARN de LAGE-1, pero de marcos de lectura alternos, de esta manera dando origen a secuencias de proteinas no relacionadas. Más recientemente, el Acceso de GenBank AF277315.5, clon de cromosoma X de Homo sapiens RP5-865E18, RP5-1087L19, secuencia completa, que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad, reporta tres lugares independientes en esta región que se marcan como LAGE1 (correspondiente a CTAG-2 en los ensambles de genoma) , más LAGE2-A y LAGE2-B (ambos correspondientes a CTAG-1 en los ensambles de genoma) . NY-ESO-I157-165 se identifica como un epítope restringido a HLA-A2 en la Patente de E.U. No. 6,274,145 titulada "ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULE ENCODING CÁNCER ASSOCIATED ANTIGEN, THE ANTIGEN ITSELF, AND USES THEREOF", y Solicitud de Patente de E.U. No. 10/117,937 (Pub. No. 20030220239) titulada "EPITOPE SEQUENCES" reporta que este término C se genera por la proteasoma local en un ensayo in vi tro . Los análogos substituyendo A, V, L, I, P, F, M, W, o G en PO, solos o en combinación con A en otra posición, se describen en las Patentes de E.U. Nos. 6,417,165 y 6,605,711, ambas tituladas "NY-ESO-1-PEPTIDE DERIVATIVES AND USES THEREOF". Cada una de las referencias descritas en este párrafo se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. PRAME, también conocido como MAPE, DAGE, y 0IP4, se observa originalmente como un antígeno de melanoma. Subsecuentemente, se ha reconocido como un antígeno CT, pero a diferencia de muchos antígenos CT (e.g., MAGE, GAGE, y BAGE) se expresa en leucemias mieloide agudas. PRAME es un miembro de la familia MAPE que consiste grandemente de proteínas hipotéticas con las cuales comparte similitud de secuencia restringida. La utilidad de PRAME como un TuAA se enseña en la Patente de E.U. No. 5,830,753 titulada "ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULES CODING FOR TUMOR REJECTION ANTIGEN PRECURSOR DAGE AND USES THEREOF", que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. Solicitud de Patente de E.U. No. 10/181,499 (No. de Publicación US 2003-0186355 Al), titulada "METHODS FOR SELECTING AND PRODUCING T CELL PEPTIDE EPITOPES AND VACCINES INCORPORATING SAID SELECTED EPITOPES" (que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad) identifica una variedad de epitopes potenciales, incluyendo PRAME425_433, utilizando digestión in vi tro con inmunoproteasoma . PSMA (antigeno de membranas especifico de próstata), un TuAA descrito en la Patente de E.U. 5,538,866 titulada "PROSTATE-SPECIFIC MEMBRANES ANTIGEN, " que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad, se expresa por epitelio de próstata normal y, a un nivel más alto, en cáncer prostático. También se ha encontrado en la neovasculatura de tumores no prostéticos. De esta manera PSMA puede formar la base de vacunas dirigidas tanto a cáncer de próstata como a la neovasculatura de otros tumores. Este último concepto se describe más completamente en la Publicación de Patente de E.U. No. 20030046714; Publicación PCT No. WO 02/069907; y una solicitud de Patente de E.U. provisional No. 60/274,063 titulada "ANTI-NEOVASCULAR VACCINES FOR CÁNCER", presentada el 7 de Marzo de 2001, y Solicitud de E.U. No. 10/094,699 (No. de Publicación US 2003-0046714 Al), presentada el 7 de Marzo de 2002, titulada "ANTI-NEOVASCULAR PREPARATIONS FOR CÁNCER, " cada una de las cuales se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. Las enseñanzas y modalidades descritas en dichas publicaciones y aplicaciones proporcionan principios de soporte y modalidades relacionadas con y útiles en conexión con la presente invención. brevemente, a medida que los tumores crecen se reclutan crecimiento interior de nuevos vasos sanguíneos. Esto se entiende por ser necesario para sostener el crecimiento a medida que los centros de tumores no vascularizados son generalmente necróticos y los inhibidores de angiogénesis se han reportado que causan regresión de tumor. Tales nuevos vasos sanguíneos, o neovasculatura, expresan antigenos no encontrados en vasos establecidos, y de esta manera pueden tenerse como objetivo específicamente. Al inducir CTL contra antígenos neovasculares los vasos pueden interrumpirse, interrumpiendo el flujo de nutrientes a (y retiro de desperdicios de) tumores, conduciendo a regresión. El empalme alterno del mARN de PSMA también conduce a una proteina con un inicio aparente en Metsa, eliminando asi la región de sujeción de membrana putativa de PSMA como se describe en la Patente de E.U. 5,935,818, titulada "ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULE ENCODING ALTERNATIVAMENTE SPLICED PROSTATE-SPECIFIC MEMBRANES ANTIGEN AND USES THEREOF" que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. Una proteina denominada proteína similar a PSMA, número de acceso de Genbank AF261715, que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad, es casi idéntica a aminoácidos 309-750 de PSMA y tiene un perfil de expresión diferente. De esta manera, los epitopes más preferidos son aquellos con un término N ubicado del aminoácido 58 a 308. PSMA288-297 se identifica como poseyendo un motivo de enlace a HLA-A2 en WO 01/62776, titulada "HLA BINDING PEPTIDES AND THEIR USES", que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. Su producción in vi tro por digestión con un proteasoma local y enlace actual a HLA-A2 se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de E.U. No. 20030220239 titulada "EPITOPE SEQUENCES". Tirosinasa es una enzima biosintética de melanina que se considera uno de los marcadores más específicos de diferenciación melanocítica . La tirosinasa se expresa en pocos tipos celulares, principalmente en melanocitos, y altos niveles con frecuencia se encuentran en melanomas. La utilidad de tirosinasa como un TuAA se enseña en la Patente de E.U. 5,747,271, titulada "METHOD FOR IDENTIFYING INDIVIDUALS SUFFERING FROM A CELLULAR ABNORMALITY SOME OF WHOSE ABNORMAL CELLS PRESENT COMPLEXES OF HLA-A2/TYROSINASE DERIVED PEPTIDES, y METHODS FO TREATING SAID INDIVIDUALS, " que se incorporan en la presente para referencia en su totalidad. Melan-A, también llamado MART-1 (Antígeno de Melanoma Reconocido por células T) , es otra proteína biosintética de melanina expresada a altos niveles en melanomas. La utilidad de Melan-A/MART-1 como un TuAA se enseña en las Patentes de E.U. Nos. 5,874,560 y 5,994,523, ambas tituladas "MELANOMA ANTIGENS AND THEIR USE IN DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC METHODS", asi como también la Patente de E.U. No. 5,620,886, titulada "ISOLATED NUCLEIC ACID SEQUENCE CODING FOR A TUMOR REJECTION ANTIGEN PRECURSOR PROCESSED TO AT LEAST ONE TUMOR REJECTION ANTIGEN PRESENTED BY HLA-A2", cada una de las cuales se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. El epitope restringido a HLA-A2 inmunodominante de este TuAA es Melan-A26-35. Se ha mostrado que se produce por el proteasoma local (Morel, S. et al . Immuni ty 12:107-117, 2000, que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad) . Varios análogos que incorporan aminoácidos estándar, incluyendo un análogo mejorado substituyendo L en P2, se describen en la Patente de E.U. No. 6,025,470, titulada "ISOLATED NONA- AND DECAPEPTIDES WHICH BIND TO HLA MOLECULES, y THE USE THEREOF", que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. El uso de análogos que incorporan aminoácidos no estándar con un objetivo primario de mejorar estabilidad bioquímica se reporta por Blanchet, J.-S. et al . J. Immunol . 167:5852-5861, 2001, que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. Análogos de SSX-2 41-49 Como se observa arriba, la respuesta inmune natural a SSX-2 en pacientes con cáncer, incluyendo la respuesta a SSX-24?-49, puede no ser efectiva para controlar cáncer. Adicionalmente, SSX-24?_49 tipo Silvestre es solamente un péptido moderadamente inmunogénico, que puede limitar además su potencial clínico. Las respuestas inmunes específicas de SSX-2 inducidas por el uso de análogos superagonistas resulta en beneficios clínicos para pacientes con tumores positivos SSX-2. De esta manera, en una modalidad, los análogos pueden utilizarse en composiciones para estimular la respuesta inmune de un sujeto para montar una respuesta inmune contra una célula objetivo que despliega el antigeno objetivo. La modalidad puede tener utilidad en el tratamiento y prevención de enfermedad neoplástica y viral. Debido a que SSX-24__49 tipo silvestre es solamente un péptido moderadamente inmunogénico, que puede prevenirse de eliminar tumores de manera efectiva in vivo, se utiliza un método para diseñar de novo variantes de SSX-241_49 que son más potentes o tuvieron una variedad de propiedades mejoradas. Al utilizar un péptido de análogo SSX-2 inmunogénico, fue posible estimular una respuesta inmune más fuerte y/o amplificar la respuesta inmune que ocurre de manera natural para lograr una mejor oportunidad de respuesta clínica. De esta manera, las propiedades de enlace (afinidad y estabilidad de complejos de HLA-A*0201/péptido) , inmunogenicidad, antigenicidad y reactividad cruzada al epitope tipo silvestre se analizan para cada uno de los análogos para identificar una propiedad mejorada. En algunas modalidades, por propiedad mejorada significa generalmente, que el análogo puede utilizarse mejor para algunos propósitos que el tipo silvestre. De esta manera, el análogo no necesita exhibir enlace mejorado, estabilidad, o actividad a mejorarse y puede mostrar aún una capacidad reducida para mediar ciertas partes del proceso, pero aún mejorarse para utilizarse en otra manera. Por ejemplo, los análogos que mantienen alguna actividad, pero ninguna actividad puede ser major en sistemas humanos que se hacen tolerantes al antigeno tipo silvestre. Previamente, las modificaciones de epitopes de péptido asociados a tumor naturales al incorporar los residuos de sujeción han generado análogos con perfiles de enlace mejorados con moléculas HLA e inmunogenicidad mejorada. Uno de los ejemplos más exitosos es el análogo de péptido A27L de epítope Melan-A 26-35. Valmori et al . , "Enhanced generation of specific tumor-reactive CTL in vitro by selected Melan-A/MART-I immunodominant peptide anaiogs," J Immunol . 1998, 160(4): 1750-8, que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. El epitope original fallo en formar un complejo estable con moléculas HLA-A2 debido a que carece de un residuo de aminoácido de sujeción óptima en la posición 2. El análogo de péptido A27L Melan A 26-35 modificado ha demostrado perfiles de enlace inequívocamente incrementados con moléculas HLA-A2 y mayor inmunogenicidad que su contraparte tipo silvestre. La inmunización de los pacientes con este análogo generó respuestas inmunes de célula T fuertes que fueron capaces de reconocer el epitope tipo silvestre presentado en las superficies celulares. Las modificaciones similares se han obtenido exitosamente con muchos otros epítopes asociados a tumor, como GP100 209-217 (Parkhurst et al . , "Improved induction of melanoma-reactive CTL with peptides from the melanoma antigen gplOO modified at HLA-A*0201-binding residues," J Immunol . 1996, 157(6): 2539-48; que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad) , y Her-2 369-377 (Vertuani et al . , "Improved immunogenicity of an immunodominant epitope of the HER-2/neu protooncogene by alterations of MHC contact residues," J Immunol . 2004, 172(6): 3501-8; que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad) . Se describen en la presente métodos que pueden utilizarse para la identificación y producción de análogos para una secuencia tipo silvestre de punto de interrupción de sarcoma X Sinovial (SSX-2). Utilizado los métodos descritos en la presente, un panel de 95 análogos de SSX-24?_49 nuevos en base a la secuencia tipo silvestre de aminoácidos 241-249 se identifican con una variedad de propiedades mejoradas. Las propiedades mejoradas incluyen, pero no se limitan a, enlace a moléculas de receptor de célula T (TCR) y MHC clase I, y respuestas biológicas como secreción IFN-?, citotoxicidad, y lisis de célula tumoral. Los péptidos con potencia mejorada que mantienen la reactividad cruzada con el epitope tipo silvestre también se identifican. Entre estos análogos, algunos se demuestran por ser variantes superagonistas del péptido SSX-24?-49 tipo silvestre, algunos de los cuales mostraron tener afinidad mucho mayor con la molécula HLA-A*0201, y el complejo de péptido-HLA pose estabilidad extendida. Estos análogos indujeron las respuestas inmunes CTL mejoradas en ratones transgénicos HHD inmunizados con ellos. Los CTLs resultantes podrían lisar efectivamente lineas de célula tumoral A2+ y SSX-2+ tanto in vivo como in vi tro, indicando que CTLs generados utilizando los análogos fueron capaces de reconocer el epitope SSX-24?_49 tipo silvestre que se presenta naturalmente en la superficie celular. En comparación con el epítope SSX-24_-49 tipo silvestre, los análogos son mejores candidatos para el desarrollo de vacunas de cáncer. De acuerdo con lo anterior, las modalidades de la invención descritas en la presente incluyen familias de uno o más péptidos de 9 o 10 aminoácidos en longitud relacionados por secuencia a los aminoácidos 41-49 de SSX-2 (SSX-24i-49) de antígeno de testículos de cáncer de humano (CT) . Las modalidades de péptido individuales tienen una a varias sustituciones de aminoácidos definidas en la secuencia tipo silvestre. Los aminoácidos substituidos son, diversamente, otros miembros del conjunto estándar de aminoácidos comúnmente codificados de manera genética, derivados de los mismos, sus D-estereoisómeros, u otros aminoácidos L no estándar. Estos análogos son útiles para investigar la interacción del epitope tipo silvestre con MHC clase I y moléculas TCR y otros componentes de la respuesta inmune, y para designar análogos adicionales con propiedades inmunológicas optimizadas adicionales. Algunas modalidades de los análogos tienen al menos propiedades inmunológicas similares al epitope tipo silvestre en el modelo de ratón transgénico HLA en el cual se han probado. Tales péptidos pueden ser útiles en humanos, como SSX-2 es un auto-antigeno al cual puede esperarse un grado de tolerancia, y las diferencias de aminoácido de los análogos pueden ayudar a estimular las poblaciones de células T que han evitado selección genitiva pero son reactivos con el epitope tipo silvestre. Varias modalidades de péptido pueden tener una o más propiedades inmunológicas mejoradas ya que poseen mayor afinidad para MHC o mayor estabilidad de enlace a MHC, producir mayor producción de citocina o requerir concentraciones de péptido inferiores para producir producción de citocina similar de células T que reconocen el epítope tipo silvestre, son más inmunogénicos, pueden inducir o amplificar una respuesta citolitica reactiva al epitope tipo silvestre, y/o pueden interrumpir la tolerancia. En una modalidad, los análogos pueden tener al menos una sustitución en un residuo seleccionado del grupo que consiste de, Pl, P2, P4, P6, P8, P9 y PÍO. En una modalidad adicional, los análogos pueden tener al menos dos sustituciones en residuos seleccionados del grupo que consiste de: Pl, P2, P4, P6, P8, P9 y PÍO. En una modalidad adicional, los análogos pueden tener al menos tres sustituciones en residuos seleccionados del grupo que consiste de: Pl, P2, P4, P6, P8, P9 y PÍO. En una modalidad adicional, los análogos pueden tener sustituciones en posiciones P2 y P9. En una modalidad adicional, los péptidos pueden tener sustituciones en residuos Pl, P2, y P9. En una modalidad adicional, los análogos de péptido pueden tener sustituciones en residuos Pl, P2, y P4. En una modalidad adicional, los análogos de péptido pueden tener sustituciones en residuos Pl, P2, y P6. En una modalidad adicional, los análogos de péptido pueden tener sustituciones en residuos Pl, P2, y P8. En una modalidad, dos sustituciones pueden producir propiedades mejoradas. En una modalidad adicional, una sustitución puede producir propiedades mejoradas. En una modalidad adicional, tres sustituciones pueden producir propiedades mejoradas. En una modalidad adicional, la una o más sustituciones pueden producir propiedades mejoradas pero aún reconocerse por TCR que reconoce la secuencia tipo silvestre (aún reactiva con la secuencia tipo silvestre) . Una modalidad se refiere a conjuntos de epitopes y otros polipéptidos que comprenden las secuencias de análogos de epitope que pueden procesarse para liberar el análogo. Las modalidades adicionales se refieren a ácidos nucleicos, particularmente plásmidos de ADN, que codifican tales polipéptidos, o simplemente un análogo, y su expresión. Los análogos, los polipéptidos que los comprenden, y los ácidos nucleicos de codificación pueden ser componentes de composiciones inmunogénicas, particularmente composiciones adecuadas para suministro intralinfático, que constituyen modalidades adicionales. Diseño de análogo Las modalidades se refieren a péptidos SSX-24?_49 que contienen sustituciones de la secuencia KASEKIFYV (SEQ ID NO. 1) (Ver Figure 1). En una modalidad adicional, el análogo puede ser generalmente un análogo del péptido de decámero SSX-24?-50 con la secuencia KASEKIFYVY (SEQ ID NO. 1) . Los residuos o aminoácidos que forman el péptido se refieren en la presente como P1-P9 o P1-P10 para designar la posición dentro del péptido como se enumera del término N al C, Pl correspondiente a la Lisina de terminal N y P9 correspondiente a la Valina de terminal C en el nonámero. Alternativamente, los residuos pueden referirse por la actividad primaria de la molécula en la que se incluyen. Por ejemplo, el residuo P2 se describe como la molécula de sujeción primaria de terminal N, mientras P9 (o PÍO en el decámero) se describe como la sujeción de terminal C primaria. Los residuos Residues P4, P6 y P8 se incluyen principalmente en interacciones TCR. Las sustituciones pueden utilizar cualquier aminoácido, incluyendo aminoácidos no estándar y estándar, conocidos por aquellos expertos en la materia. Un número de aminoácidos ejemplificativos se describen en la presente, sin embargo, las sustituciones descritas en la presente no significan ser una lista que incluye todas las sustituciones imaginadas, pero son ejemplificativas de las sustituciones que son posibles. Un experto en la materia puede encontrar un número de otros aminoácidos no estándar en catálogos y referencias que pueden comprarse o producirse químicamente para utilizarse con los análogos en la presente. Un número de posibles análogos se produce por la modificación de residuos de sujeción a péptido para lograr mejores perfiles de enlace HLA y respuestas inmunes más altas, incluyendo en la sujeción primaria de terminal N (posición P2 ) , en la sujeción secundaria de terminal N (posición Pl), en la sujeción primaria y secundaria de terminal N (posiciones Pl y P2), y en la sujeción primaria/secundaria de terminal N (posiciones Pl y P2) y sujeción primaria de terminal C (posición P9) . Además, los péptidos con modificaciones en los residuos de sujeción y residuos de contacto TCR se producen para sortear la tolerancia de célula T para auto-antigenos, estas modificaciones incluyeron modificaciones en la sujeción primaria/secundaria de terminal N (posiciones Pl y P2) y sitios de reconocimiento de TCR secundarios (posiciones P4, P6 y/o P8), modificaciones en las sujeciones primarias/secundarias de terminal N (posición Pl y P2), y modificaciones en al sujeción primaria de terminal C (P9) y en sitios de reconocimiento de TCR secundarios (posiciones P4, P6 y/o P8). Además, los análogos de decámero se producen . La elección de tales residuos produciría análogos con propiedades mejoradas incluidas en el análisis de estudios de interacciones de péptido MHC, estudios de interacciones de péptido TCR y análogos previos que se conocen en la materia. Algunos residuos se incluyen principalmente en una interacción específica y algunos se incluyen de manera secundaria o aún de manera terciaria. De esta manera, el conocimiento de como los residuos se incluyen en el enlace a estas molécula se incluye en el análisis. Además, algunos de los residuos tipo silvestre se prefieren, significando que trabajan bien para la interacción propuesta, mientras otros no se prefieren, significando que funcionan deficientemente para la interacción. De esta manera, en una modalidad, los residuos no preferidos pueden substituirse. Por ejemplo, la valina en el término C es generalmente un residuo de sujeción preferido debido a que produce una fuerte interacción con la molécula HLA y, de esta manera, es menos preferido substituir este residuo. Sin embargo, las modificaciones de epítopes de péptido asociados a tumor tipo Silvestre al incorporar residuos de sujeción favorables han generado análogos con perfiles de enlace mejorados con moléculas HLA e inmunogenicidad mejorada. Uno de los ejemplos más exitosos es el análogo de péptido A27L de epítope de Melan-A 26-35 (Valmori D, et al . , J Immunol . 160(4): 1750-8, 1998; que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad) . El epítope original falló en formar un complejo estable con moléculas HLA-A2 ya que carece de un residuo de sujeción óptimo en la posición 2. En contraste, el análogo de péptido Melan A26-35 A27L modificado demostró perfiles de enlace inequívocamente incrementados con moléculas HLA-A2 y mayor inmunogenicidad que su contraparte tipo silvestre. La inmunización del paciente con este análogo generó respuestas inmunes de célula T fuertes que fueron capaces de reconocer el epítope tipo silvestre presentado en las superficies celulares. Las modificaciones similares se obtienen exitosamente con muchos otros epítopes asociados a tumor como GP100 209-217 (Parkhurst MR, et al . J Immunol . 157(6): 2539-48, 1996; que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad), Her-2 369-377 (Vertuani S, et al . J Inmuno 1 . 172 ( 6) : 3501-8, 2004; que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad) . La elección de cuantos residuos para substituir incluye un deseo de substituir mejores residuos mientras aún mantiene suficientemente las cualidades del epítope, aún se reconocerá por las células T que reconocen el epítope tipo silvestre. De esta manera, en una modalidad, una o dos sustituciones pueden hacerse el péptido tipo silvestre. En una modalidad adicional, más de dos sustituciones pueden hacerse al péptido tipo silvestre, mientras aún mantiene la reactividad cruzada con el péptido tipo silvestre. Generalmente, la parte del péptido que se incluye en el reconocimiento TCR se substituye de manera deseable para producir inmunogenicidad mejorada mientras aún se reacciona con el epitope tipo silvestre. En un ejemplo, un péptido que muestra inmunogenicidad incrementada se prefiere. Debido a que la posición P2 o segundo aminoácido en el extremo de terminal N se cree que se incluye primero en el proceso para producir inmunogenicidad mejorada, principalmente a través de las propiedades de enlace mejoradas, es un sitio de sustitución preferido y un número de modificaciones se hacen en los análogos ejemplificativos para identificar sustituciones deseables. Las consideraciones similares se aplican a la posición de terminal carboxi, PO, que también pueden ser importantes para enlace MHC.

De esta manera, en una modalidad, el análogo puede incluir una sustitución en el Residuo P2 que substituye un residuo más hidrofóbico para la alanina tipo silvestre. En una modalidad adicional, el residuo hidrofóbico también puede poseer una cadena lateral más voluminosa. En una modalidad adicional, el residuo en Pl puede substituirse con un residuo más hidrofóbico. En una modalidad adicional, los residuos Pl y P2 ambos pueden substituirse con residuos más hidrofóbicos. En modalidades adicionales, al menos un residuo en Pl, P2, y P9 puede substituirse. En una modalidad adicional, al menos dos residuos en Pl, P2 y P9 pueden substituirse. En una modalidad adicional al menos dos residuos en Pl, P2, P9, P4, y P6 pueden substituirse incluyendo uno o más residuos incluidos en enlace TCR. En algunas modalidades, las sustituciones de aquellos residuos solamente incluidas de manera secundaria en el enlace a TCR o la molécula MHC pueden ser ventajosas. Por ejemplo, la sustitución de aminoácidos de enlace a TCR secundarios puede generar análogos que aún enlazan y producen una respuesta y no interfieren con el enlace a la molécula MHC, pero preferentemente superan los campos de tolerancia de auto-antigenos. Esto es útil debido a que un paciente quien tiene cáncer puede tolerar parcialmente al antígeno. De esta manera, para superar esa tolerancia, un análogo que mantiene alguna actividad puede ser preferible para un análogo con inmunogenicidad más mejorada, debido a que probablemente se reconocerá como "auto" por el sistema inmune. Además de substituir los aminoácidos en varias posiciones del epitope nominal definido, las variantes de longitud también pueden utilizarse como análogos. Más típicamente, los residuos de aminoácido adicionales se agregan a o remueven de uno, el otro, o ambos extremos de un péptido. En algunos casos, los residuos terminales adicionales se remueven por proteolisis después de la administración a un sujeto, regenerando el epitope nominal o un análogo de la misma longitud antes de enlazarse con MHC. En otros casos, el péptido de longitud alterada es realmente reactivo de manera antigénica, como se describe en el Ejemplo 20 o ejemplifica por la relación entre Melan-A27-35 y Melan-A26-35. Debe entenderse que las modalidades individuales específicamente incluyendo o excluyendo cualquier aminoácido particular en cualquiera de estas posiciones de terminal adicionales (en algunos lugares en la presente denominadas PO y PO+1) están dentro del alcance de la invención descrita en la presente. Cuando un análogo se dice que consiste esencialmente de una secuencia debe entenderse que tales variantes de longitud corta que ya sea se cortan o que mantienen reactividad cruzada se proponen. ' En algunas modalidades, las inserciones de aminoácidos más pequeños (e.g., glicina, alanina, o serina), especialmente entre las posiciones de sujeción, pueden comportarse de manera similar a los cambios en los residuos de interacción TCR. 1. Modificación de sujeción primaria próxima de terminal N (P2) La sujeción primaria de terminal N es el segundo aminoácido de terminal N del péptido y es la sujeción primaria próxima de terminal N. Se incluye principalmente en la interacción con la molécula MHC y sustituciones puede resultar en estabilidad y enlace mejorado. Sin embargo, puede incluirse de manera secundaria en interacciones TCR también. De esta manera, las sustituciones en este sitio pueden resultar en un péptido con interacción mejorada con moléculas MHC asi como también interacción mejorada con TCR. La alanina encontrada en esta posición en la secuencia tipo silvestre se cree generalmente que no se prefiere para la interacción con la molécula MHC. De esta manera, las modalidades preferidas de los análogos tienen una sustitución en esta posición. En una modalidad, Ala 42 encontrado original en la secuencia tipo silvestre puede substituirse con un aminoácido más hidrofóbico. Cualquier aminoácido más hidrofóbico puede utilizarse incluyendo cualquiera que está disponible o se conoce por un experto en la materia, incluyendo aminoácidos estándar y aminoácidos no estándar. En una modalidad adicional, Ala 42 original se substituye con un aminoácido más hidrofóbico también poseyendo una cadena lateral voluminosa. Los ejemplos de aminoácidos más hidrofóbicos incluyen, pero no se limitan a: Leu, Val, lie, Met, a-ácido aminobutírico, Norleucina y Norvalina. La Tabla 1 es un sumario de las modificaciones de sujeción primarias próximas de terminal N y los resultados para cada una. TABLA 1 MODIFICACIÓN DE SUJECIÓN PRIMARIA PRÓXIMA DE TERMINAL N 2. Modificación de sujeción secundaria de terminal N (Pl) La sujeción secundaria de terminal N es el primer aminoácido en el término N. Este residuo es Lys 41 y se define como un residuo de sujeción secundario para interactuar con la Molécula HLA-A*0201. Sin embargo, también se embraga en la interacción con los receptores de célula T a un cierto grado. Por lo tanto, las modificaciones de esta posición pueden generar algunos análogos heteroclíticos que son más inmunogénicos y más adecuados para El desarrollo de vacunas de tumor. Aunque la lisina en esta posición se considera generalmente favorecida, la sustituciones pueden resultar en propiedades altamente mejoradas. De esta manera, en una modalidad, el Lys 43 original encontrado en la secuencia tipo silvestre puede substituirse con un aminoácido más hidrofóbico. Cualquier aminoácido más hidrofóbico puede utilizarse, incluyendo cualquiera que esté disponible o conocido por el experto en la materia, incluyendo aminoácidos estándar y aminoácidos no estándar. En una modalidad adicional, Lys 43 puede substituirse con un aminoácido aromático. Ejemplos de aminoácidos más hidrofóbicos incluyen, pero no se limitan a: Phe, Tyr, Trp, y D-Lys. La Tabla 2 es un sumario de modificaciones de sujeción secundaria de terminal N y los resultados para cada una.

TABLA 2 MODIFICACIONES DE SUJECIÓN SECUNDARIAS DE TERMINAL N 3. Modificaciones primarias y secundarias de terminal N (P2 Y Pl) En una modalidad, ambos residuos de sujeción, primario y secundario, se substituyen para dar como resultado afinidad de enlace mejorada a la molécula HLA. En una modalidad adicional, la sustitución doble produjo estabilidad mejorada de enlace a la molécula HLA. En modalidades adicionales, el enlace y/o estabilidad no se mejoran y pudieron haberse reducido, pero otras propiedades de la molécula se mejoran, como actividad o reconocimiento por un individuo con tolerancia. La Tabla 3 es un sumario de modificaciones de sujeción, primaria y secundaria, de terminal N y los resultados para cada una. TABLA 3 MODIFICACIÓN DE SUJECIÓN PRIMARIA Y SECUNDARIA DE TERMINAL N 4. Sujeción primaria/secundaria de terminal N modificación primaria de terminal C (P2, Pl y P9) Val de terminal C del péptido tipo silvestre es generalmente un residuo de sujeción preferido y principalmente incluido en la interacción con la molécula MHC. Sin embargo, las sustituciones se llevan a cabo para identificar que aminoácidos mejoran los análogos que tienen modificaciones de terminal N, primaria y secundaria. Estas sustituciones de terminal C pueden utilizarse en la ausencia de una o más modificaciones de terminal N también. Se muestra que estas modificaciones mejoran la afinidad de enlace y estabilidad y en algunos casos resultan en análogos con reactividad cruzada disminuida. De esta manera, en algunas modalidades, la sustitución al término C resultó en un péptido con enlace y/o estabilidad mejorada sin reactividad cruzada disminuida. Sin embargo, en otras modalidades la sustitución al término C resultó en un péptido con enlace y/o estabilidad mejorada con reactividad cruzada disminuida o igual . Cada una de la moléculas puede ser de uso en ciertos casos o en ciertos pacientes. En una modalidad, la valina en el término C se substituye con un aminoácido alifático largo.

TABLA 4 SUJECIÓN PRIMARIA/SECUNDARIA DE TERMINAL N Y MODIFICACIONES PRIMARIAS DE TERMINAL C 5. Sujeción primaria/secundaria de terminal N y modificación de residuos TCR Sitios TCR se reconocen generalmente como residuos P4, P6, y P8 y son los residuos primarios incluidos en el enlace a TCR. Sin embargo, otros residuos también pueden incluirse en la interacción con un grado menor. En una modalidad, uno o más de los sitios principalmente incluidos en interacción TCR pueden substituirse para incrementar la interacción. Preferentemente, estas sustituciones pueden generar análogos heteroclíticos que no interfieren con el enlace a la molécula MHC, pero superan los campos de tolerancia de los péptidos péptido tipo silvestre. En una modalidad adicional, al menos una sustitución TCR puede incluirse con al menos una sustitución en la posición Pl, P2, y/o P9. En una modalidad adicional, la sustitución en cualquiera de una o más de las posiciones P4 , P6, y P8 puede ser un aminoácido polar. En una modalidad adicional, la sustitución puede ser un aminoácido aromático en la posición P8. En una modalidad adicional, la sustitución puede ser un aminoácido con una cadena lateral alifática larga en la posición P6. En una modalidad adicional, la sustitución puede ser un aminoácido que tiene una cadena lateral más larga para conservar la interacción. La Tabla 5 es un sumario de sujeción primaria/secundaria de terminal N y modificaciones de residuos TCR y resultados para cada una.

TABLA 5 SUJECIÓN PRIMARIA/SECUNDARIA DE TERMINAL N Y MODIFICACIÓN DE SITIOS TCR 174175 En algunas modalidades, el residuo de terminal C puede modificarse para contener una amida en lugar del ácido carboxílico libre. De esta manera, por ejemplo, si el péptido es un 9-mer (nonámero) el residuo P9 puede modificarse. Si el péptido es un 10-mer (decámero) el residuo PÍO puede modificarse. Preferentemente esto resulta en un péptido o análogo que tiene estabilidad incrementada en medios biológicos, incluyendo pero no limitándose a sangre, linf y CNS. Preferentemente, los péptidos pueden retener las otras actividades necesarias para dar como resultado un análogo utilizable para vacunación o como un inmunógeno. La Tabla 6 es un sumario de modificaciones de amida de terminal C y los resultados para cada una. TABLA 6 AMIDA DE TERMINAL C 7. Decámeros La longitud típica de péptidos de enlace a MHC puede variar de aproximadamente 8 a aproximadamente 11 aminoácidos en longitud. Sin embargo, la mayoría de la HLA- A*0201 previamente utilizada son 9-mers (nonámeros) o 10-mers (decámeros) . De esta manera, en una modalidad, el análogo puede ser un análogo de la secuencia tipo silvestre SSX-241-50. Sin embargo, debido a que 10-mer tipo Silvestre no tiene el motivo de enlace correcto y no mostró actividad inmunológica, un 10-mer se crea al substituir aminoácidos en la posición PÍO e identificar el efecto de varios tipos silvestres y análogos (ver Figure IB) . 8. Residuos Restantes Con referencia a las Figuras ÍA y IB, cualquier residuo también puede substituirse con aminoácidos conservadores. Las sustituciones conservadoras pueden formarse en pares con cualquiera de las sustituciones anteriores que pueden producir un efecto. Alternativamente, las sustituciones conservadoras pueden estar específicamente en los residuos que no se cree que se incluyen en ninguna de las actividades en un nivel primario, secundario, o aún terciario. Tales residuos incluyen P3, P5 y P7. Por ejemplo, la Serina en la posición P3 puede substituirse con una alanina o Treonina para producir un análogo. Típicamente, tales sustituciones conservadoras no afectan de manera significativa la actividad del análogo, sin embargo, en algunas modalidades pueden incrementar ciertas actividades o disminuir ciertas actividades. Análogos NY-ESO-l?57-i65

[0195] Muchas caracteristicas que consideran una variedad de modalidades y aspectos del diseño de análogo se describen arriba, ya sea generalmente o como se aplica al epitope SSX-2. Debe entenderse que tal descripción también es aplicable a esto y epítopes subsiguientes. El reestablecimiento explícito de tal descripción se minimizará en vista de brevedad. Las modalidades se refieren a análogos del epitope de célula T restringido a MHC clase I NY-ESO-l?57-?65, SLLM ITQC (SEQ ID NO. 25), polipéptidos que comprenden estos análogos que pueden procesarse por pAPC para presentar los análogos de epitope, y ácidos nucleicos que expresan los análogos. Los análogos pueden tener propiedades inmunológicas similares o mejoradas en comparación con el epitope tipo silvestre. Una modalidad se refiere a métodos para derivar y mejorar análogos de NY-ESO-I157-165, junto con secuencias específicas que comprenden sustituciones. Los análogos pueden contener al menos una sustitución, pero pueden tener múltiples sustituciones que comprenden aminoácidos estándar y no estándar únicamente o en varias combinaciones . Los análogos pueden resultar en péptidos con propiedades mejoradas o retenidas. El epitope NY-ESO-l157-.165 se ha mostrado que se presenta por lineas de célula que expresan NY-ESO-1, al medir la actividad de célula T específica de epítope contra tales células (Jaeger, E. et al . , J. Exp . Med. 187:265-270, 1998; Patente de E.U. No. 6,274,145, titulada "ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULE ENCODING CÁNCER ASSOCIATED ANTIGEN, THE ANTIGEN ITSELF, AND USES THEREOF", cada una de las cuales se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. Las metodologías para mejorar las propiedades fisicoquímicas del péptido NY-ESO-I157-165 se han descrito en la Patente de E.U. No. 6,417,165, titulada "NY-ESO-1-PEPTIDE DERIVATIVES, AND USES THEREOF", que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad, y puede consistir del reemplazo de la cisteína terminal con otros aminoácidos que conservan o mejoran la interacción con MHC y están desprovistos de la propiedad dañina de la formación de enlace C-C de disulfuro que interfiere con la actividad. Sin embargo, la manipulación única del residuo de cisteina de terminal C ignora las ventajas de optimizar múltiples residuos por todo el péptido para mayor histocompatibilidad (MHC) y/o enlace del Receptor de célula T (TCR) . De esta manera, más allá de lo práctico de mutar el residuo Cys, existe una oportunidad considerable en mutar aminoácidos adicionales por todo el péptido. Por ejemplo, las sustituciones pueden utilizarse para optimizar además el enlace a MHC y/o TCR en una manera que permite más aplicación efectiva en clínica. Las modalidades se refieren a familias de uno o más péptidos de 9 o 10 aminoácidos en longitud relacionados por la secuencia a aminoácidos 157-165 del antígeno de testículos de cáncer humano (CT) NY-ES 0-1 (NY-ESO-l_57-_6s) • Diseño del análogo El análogo es generalmente un análogo de NY-ESO-Ii57-i65, con la secuencia SLLMWITQC (SEQ ID NO: 25) . El análisis de si los aminoácidos tipo silvestre se prefieren o no se prefieren, utilizó análisis previos de las otras interacciones TCR o péptido-MHC. Por ejemplo, la Cisteína en el término C generalmente es un residuo de sujeción no preferido debido a que no produce una fuerte interacción con la molécula HLA y, de esta manera, fue altamente preferido substituir este residuo. Sin embargo, aunque la Serina en la posición Pl es generalmente preferida, se encontró que substituir un aromático produciría un péptido con propiedades mejoradas. Además la Leucina en la posición P2 es generalmente aceptable, pero la sustitución de un aminoácido hidrofóbico y/o voluminoso resultó en un péptido con propiedades mejoradas. Los residuos se incluyen principalmente en la interacción con TCR (P4, P6 y P8) lo que mostró una preferencia generalmente para alguna polaridad, y en el caso de P8 un aromático generalmente produjo péptidos con propiedades favorables. Una modalidad preferida se refiere a un análogo que tiene una sustitución en la Posición P2. En tal modalidad, la sustitución puede ser un residuo hidrofóbico. En una modalidad adicional, la sustitución puede ser un residuo hidrofóbico voluminoso. En otra modalidad, el residuo en Pl puede substituirse con un residuo más hidrofóbico. En una modalidad adicional, los residuos Pl y P2 puede ser ambos substituidos con residuos más hidrofóbicos. En modalidades adicionales, al menos un residuo en Pl, P2, y P9 puede substituirse. En una modalidad adicional, al menos dos residuos en Pl, P2 y P9 pueden substituirse. En una modalidad adicional, al menos dos residuos en Pl, P2, P9, P4, y P6 puede substituirse, incluyendo uno o más residuos incluidos en el enlace TCR. En una modalidad adicional, el residuo en P8 puede substituirse con un residuo aromático. Ejemplos de las siguientes sustituciones se muestran en las Figuras 13A-13C. 1. Modificación de sujeción primaria próxima de terminal N(P2) La sujeción primaria de terminal N es el segundo aminoácido de terminal N del péptido, de esta manera, es la sujeción primaria próxima de terminal N. Aunque la Leucina 158 original no se considera "no preferida" para enlazarse a la molécula MHC, las sustituciones pueden producir un péptido con enlace mejorado. De esta manera, en una modalidad, la Leu 158 original encontrada en la secuencia tipo silvestre puede substituirse con un aminoácido similarmente o más hidrofóbico. Cualquier aminoácido hidrofóbico puede utilizarse, incluyendo uno que está disponible para o que se conoce por un experto en la materia, incluyendo aminoácidos estándar y aminoácidos no estándar. En una modalidad adicional, la Leu 158 original puede substituirse con un aminoácido más hidrofóbico también poseyendo una cadena lateral voluminosa. Ejemplos de aminoácidos más hidrofóbicos incluyen, pero no se limitan a: Leu, Val, lie, Met, a-ácido aminobutírico, Norleucina y Norvalina. Además, una cadena lateral de naftal también puede substituirse. Preferentemente, la sustitución resulta en enlace mejorado y estabilidad con la molécula HLA. Sin embargo, este residuo puede incluirse de manera secundaria o terciaria en interacciones TCR, y las sustituciones también pueden resultar en reconocimiento mejorado por TCR. 2. Modificación de sujeción secundaria de terminal N (Pl) La sujeción secundaria de terminal N es el primer aminoácido en el término N o Pl. Este residuo se incluye en un número de interacciones. El residuo de Ser 157 se define como un residuo de sujeción secundario para interactuar con la molécula HLA-A*0201. También se embraga en la interacción con los receptores de célula T a un cierto grado. Por lo tanto, las modificaciones de esta posición generan algunos análogos heteroclíticos que son más inmunogénicos y más adecuados para el desarrollo de vacunas de tumor. De esta manera, las sustituciones pueden resultar en una variedad de cualidades mejoradas. Aunque la Serina no se considera "no preferida", un número de sustituciones puede resultar en cualidades mejoradas del péptido. De esta manera, en una modalidad, Ser 157 original encontrada en la secuencia tipo silvestre puede substituirse con un aminoácido más hidrofóbico. Cualquier aminoácido más hidrofóbico puede utilizarse, incluyendo uno que está disponible para o que se conoce por un experto en la materia, incluyendo aminoácidos estándar y aminoácidos no estándar. Ejemplos de aminoácidos más hidrofóbicos incluyen, pero no se limitan a: Phe, Tyr, Trp, y D-Lys. 3. Modificaciones primarias y secundarias de terminal N (P2 y Pl) En una modalidad, ambos residuos de sujeción, primario y secundario, se substituyen para dar como resultado afinidad de enlace mejorada a la molécula HLA. En una modalidad adicional, la sustitución doble produjo estabilidad mejorada de enlace a la molécula HLA. En modalidades adicionales, el enlace y/o estabilidad no se mejoran y pudieron haberse reducido, pero otras propiedades de la molécula se mejoran, como actividad o reconocimiento por un individuo con tolerancia. 4. Sujeción primaria/secundaria de terminal N y modificación primaria de terminal C (P2, Pl y P9) La cisteína de terminal C del péptido tipo silvestre es generalmente un residuo de sujeción no preferido. Debido a que este residuo generalmente se incluye principalmente en la interacción con la molécula MHC, puede preferido para substituir residuos que resultan en una interacción más fuerte con la molécula MHC. De esta manera, las sustituciones se muestran para mejorar afinidad de enlace y estabilidad y en algunos casos resultan en análogos con reactividad cruzada disminuida. En algunas modalidades, la sustitución al término C puede resultar en un péptido con enlace y/o estabilidad mejorada sin reactividad cruzada disminuida. Sin embargo, en otras modalidades, la sustitución al término C puede resultar en un péptido con enlace y/o estabilidad mejorada with reactividad cruzada disminuida o igual. Debido a que la sustitución de este residuo se ha mostrado previamente por proporcionar péptidos mejorados, puede ser preferible producir péptidos que se mejoran más en la interacción con la molécula MHC asi como también otras interacciones, como el reconocimiento por TCR. De esta manera, en algunas modalidades, la sustitución de terminal C puede formarse en pares con al menos otra sustitución. Ejemplos de sustituciones de aminoácidos al término C incluyen, pero no se limitan a, valina, lisina, alanina, e isoleucina. 5. Sujeción primaria/secundaria de terminal N y modificación de residuo TCR Los residuos primarios incluidos en la interacción con TCR generalmente se reconocen como residuos P4 , P6, y P8. Sin embargo, otros residuos también pueden incluirse en la interacción a un menor grado. En una modalidad, uno o más de los sitios primeramente incluidos en la interacción TCR puede substituirse para resultar en una interacción mejorada. Preferentemente, estas sustituciones generan análogos heteroclíticos que no interfieren con el enlace a la molécula MHC, pero superan los campos de tolerancia del péptido tipo silvestres. En una modalidad, al menos una sustitución TCR puede incluirse con al menos una sustitución en la posición Pl, P2, y/o P9. En una modalidad, los aminoácidos con alguna polaridad pueden substituirse en P4, P6, y P8. En una modalidad adicional, los aminoácidos aromáticos pueden substituirse en la posición P8 posición. 6. Amida de terminal C En algunas modalidades, el residuo de terminal C puede modificarse para contener una amida en el lugar del ácido carboxilico libre. De esta manera, por ejemplo si el péptido es un 9-mer (nonámero) el residuo P9 puede modificarse. Si el péptido es un 10-mer (decámero) el residuo PÍO puede modificarse. Preferentemente, esto resulta en un péptido o análogo que tiene estabilidad incrementada en medios biológicos, incluyendo pero no limitándose a sangre, linf, y CNS. Preferentemente, los péptidos retienen sus otras actividades para dar como resultado un análogo útil para la vacunación o como un inmunógeno. 7. Decámeros La longitud de los péptidos de enlace MHC típicos varía de aproximadamente 8 a aproximadamente 11 aminoácidos en longitud. Sin embargo, la mayoria de la HLA-A*0201 previamente utilizada son 9-mers (nonámeros) o 10-mers (decámeros). De esta manera, en una modalidad, el análogo puede ser un 10-mer de la secuencia tipo silvestre NY-ESO-Ii57-i66- Sin embargo, debido a que 10-mer tipo silvestre no tiene el motivo de enlace correcto y no mostró actividad inmunológica, se crea un 10-mer al substituir los aminoácidos en la posición PÍO e identificar el efecto de varias modificaciones (ver Figuras 13A-13C) . En una modalidad, los residuos que se agregan o substituyen para el tipo silvestre en el término C pueden seleccionarse del grupo que consiste de norvalina, leucina, isoleucina, valina, y alanina. 8. Residuos restantes Con referencia a las Figuras 13A y 13C, cualquier residuo también puede substituirse con aminoácidos conservadores. Las sustituciones conservadoras pueden formarse en pares con cualquiera de las sustituciones anteriores que pueden producir un efecto. Alternativamente, las sustituciones conservadoras pueden estar específicamente en residuos que no se cree estar incluidos en cualquiera de las actividades en un nivel primario, secundario o aún terciario. Tales residuos pueden incluir P3, P5 y/o P7. Las sustituciones conservadoras se conocen por aquellos de experiencia en la materia, pero por ejemplo, la Leucina en la posición P3 puede substituirse con una alanina o Treonina para producir un análogo. Típicamente, tales sustituciones conservadoras no afectan de manera significativa la actividad del análogo. Sin embargo, en algunas modalidades pueden incrementar ciertas actividades o disminuir ciertas actividades. Debido a las interacciones conocidas, no es probable que tales sustituciones conservadoras tendrán un efecto significativo en cualquiera de las actividades. Análogos PSMA288-297 Muchas caracteristicas considerando la variedad de modalidades y aspectos del diseño del análogo se describen arriba, ya sea generalmente o como se aplica a epítopes particulares. Debe entenderse que tal descripción también es aplicable a este y epítopes subsiguientes. El reestablecimiento explícito de tal descripción se minimizará en vista de claridad. Algunas modalidades se refieren a análogos del epitope de célula T restringido a MHC clase I PSMA288_297, GLPSIPVHPI (SEQ ID NO. 42), polipéptidos que comprenden estos análogos que pueden procesarse por pAPC para presentar los análogos de epítope, y ácidos nucleicos que expresan los análogos. Los análogos pueden tener propiedades inmunológicas similares o mejoradas en comparación con el epitope tipo silvestre. La evidencia que valida la presentación de este epítope por células cancerígenas de humano se presenta en el Ejemplo 32 abajo. Una modalidad se refiere a métodos para derivar y mejorar análogos de PSMA288-297, junto con secuencias específicas que comprenden sustituciones. Los análogos pueden contener al menos una sustitución, pero pueden tener múltiples sustituciones que comprenden aminoácidos estándar o no estándar únicamente o en varias combinaciones. Los análogos pueden resultar en péptidos con propiedades retenidas o mejoradas. Las modalidades se refieren a familias de uno o más péptidos de 9 o 10 aminoácidos en longitud relacionados por secuencia a aminoácidos 288-297 del PSMA de humano. Diseño del análogo En algunas modalidades, el análogo PSMA288_297 puede contener sustituciones de la secuencia GLPSIPVHPI (SEQ ID NO. 42) . La referencia a los datos de motivo de enlace, como se presentan en la Tabla 7 en el ejemplo 2 abajo, indica que el residuo de sujeción P2 puede hacer la contribución individual más larga a afinidad de cualquier posición en un epítope restringido a A2.1. En este caso, el aminoácido en la posición P2 es la leucina óptimamente preferida. El residuo de sujeción PO, isoleucina, es favorable. Los estudios de enlace in vi tro utilizando el sistema de ensayo de célula T2 (no mostrado) han indicado que el péptido nativo tiene características de enlace generalmente superiores, particularmente, en comparación con los epitopes SSX-2 y NY-ESO-1. El epitope mostró enlace significativo a concentraciones relativamente bajas, aunque este se formó en pares con un aumento relativamente superficial hacia saturación. Los análisis tales como aquellos representados por las Tablas 7 y 8 son promedios y la conducta de un residuo dado en una secuencia particular puede divergir del promedio. Consistente con los resultados favorables obtenidos con Nle y Nva para los epitopes SSX-2 y NY-ESO-1 tratados arriba, NIe y Nva también pueden utilizarse de manera exitosa para el presente epitope PSMA. Finalmente, las características de enlace aún similares, si se forman en pares con alteraciones que ayudan a sortear cualquier tolerancia al epítope pueden existir, pueden incrementar la inmunogenicidad efectiva del péptido. En el modelo de ratón transgénico, el péptido nativo es deficientemente inmunogénico (ver Ejemplo 35 por ejemplo) que puede reflejar tolerancia al epítope; la región de PSMA de la cual este epitope se deriva es idéntica entre PSMA de humano y ratón. 1. Modificación de sujeción primaria próxima de término N (P2) Como se observa arriba, aunque el residuo nativo en la posición P2 de este epitope es generalmente el residuo óptimo entre aminoácidos genéticamente codificados. El efecto de substituir otros residuos hidrofóbicos voluminosos o preferidos se examinan para mejora potencial de enlace, interrumpiendo la tolerancia e inmunidad reactiva cruzada. Las sustituciones ejemplificativas pueden incluir Met, lie, Gln, Val, Nva, NIe, y ácido aminobutírico (Abu). 2. Modificación de sujeción secundaria de terminal N (Pl) La sujeción secundaria de terminal N es el primer aminoácido en el término N. Gly nativo es solamente preferido de manera marginal en esta posición. Varias observaciones (ver Tablas 7 y 8 por ejemplo) muestran que los aminoácidos con potencial para mejorar el epitope incluyen Ala, Ser, Abu y sarcosina (Sar, que es, N-metilglicina) . 3. Modificación de sujeción primaria de terminal C (PO) lie nativo en esta posición es generalmente un residuo preferido pero no óptimo. La sustitución en esta posición puede mejorar el enlace. Las sustituciones ejemplificativas pueden incluir Val, Leu, Nva, y NIe. 4. Sujeciones secundarias y exploración TCR La posición penúltima (PO-1) puede servir tanto como una sujeción secundaria como una posición de interacción TCR. La sustitución de Ala, Leu, Ser, o Thr puede tener un efecto primario en interacción TCR, a través de la cual también puede contribuir a enlace mejorado. P3 es otra posición que puede efectuar tanto el enlace como la inmunogenicidad. La sustitución de Trp en esta posición puede mejorar ambas. Análogos PRAME425-433 Muchas características considerando una variedad de modalidades y aspectos de diseño del análogo se describen arriba, ya sea generalmente o como se aplica a epitopes particulares. Debe entenderse que tal descripción también es aplicable a este y epitopes subsiguientes. El reestablecimiento explícito de tal descripción se minimizará en vista de claridad. Las modalidades incluyen análogos del epitope de célula T restringido a MHC clase I PRAME425-433, SLLQHLIGL (SEQ ID NO. 71), los polipéptidos que comprenden estos análogos que pueden procesarse por pAPC para presentar los análogos de epítope, y ácidos nucleicos que expresan los análogos. Los análogos pueden tener propiedades inmunológicas similares o mejoradas en comparación con el epítope tipo silvestre. La evidencia que valida la presentación de este epítope por células cancerígenas de humano se presenta en el Ejemplo 39 abajo. Una modalidad se refiere a métodos para derivar y mejorar análogos de PRAME_5_433, junto con secuencias especificas que comprenden sustituciones. Los análogos pueden contener al menos una sustitución, pero pueden tener múltiples sustituciones que comprenden aminoácidos estándar o no estándar únicamente o en varias combinaciones. Los análogos pueden resultar en péptidos con propiedades retenidas o mejoradas. Algunas modalidades se refieren a familias de uno o más péptidos de 9 o 10 aminoácidos en longitud relacionados por secuencia a aminoácidos 425-433 de la secuencia PRAME de humano . Diseño del análogo Algunas modalidades se refieren a análogos de PRAME425-433 que pueden contener sustituciones de la secuencia SLLQHLIGL (SEQ ID NO. 71) . La referencia a datos de motivo de enlace, como aquellos presentados en la Tabla 7 en el ejemplo 2 abajo, indica que el residuo de sujeción P2 puede hacer la contribución individual más larga a afinidad de cualquier posición en un epitope restringido a A2.1. En este caso, el aminoácido en la posición P2 es la leucina óptimamente preferida. El residuo de sujeción PO, leucina, es favorable, aunque no tan fuertemente preferido, ni es el residuo PO tipo silvestre necesariamente el más preferido para esa posición. Los análisis tales como aquellos reportados en las Tablas 7 y 8 son promedios y la conducta de un residuo dado en una secuencia particular puede divergir del promedio. Consistente con los resultados favorables obtenidos con NIe y Nva para los otros epítopes, mejoras similares pueden obtenerse substituyendo NIe y Nva con esta secuencia. Finalmente, las características de enlace aún similares, si se forman en pares con alteraciones que ayudan a sortear cualquier tolerancia al epítope que exista, pueden incrementar la inmunogenicidad efectiva del péptido. Lo racional para varias sustituciones se ha establecido arriba. Las sustituciones particulares investigaron el epítope PRAME425-433 siguen la misma lógica y se describen en los Ejemplos 40-48 y Figuras 25-27. Las sustituciones se hacen en las posiciones de sujeción primarias P2 y PO (P9), las posiciones de sujeción secundarias Pl y PO-1 (P8). Las sustituciones también se hacen en las posiciones de interacción TCR (además de posiciones de sujeción secundarias) P3 y P6. Las sustituciones seleccionadas tienen impacto en el enlace y/o estabilidad de complejos de MHC clase I-péptido; una característica clave para determinar las propiedades inmunológicas de péptidos. Además, debido a las consideraciones del repertorio de célula T y para sortear los mecanismos responsables para la inmunidad restringida a epítopes nativos, las sustituciones que retienen la capacidad de análogos para interactuar con los receptores de célula T reconociendo los péptidos nativos pueden ser de valor práctico. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos proporcionan análogos y métodos para identificar análogos. Los análogos pueden utilizarse, por ejemplo, como inmunógenos, vacunas, y/o para el tratamiento de una variedad de cánceres. Los análogos se producen como en el Ejemplo 1. Los análogos SSX-24__49 se identifican como se muestra en el Ejemplo 2 y se enlistan en el Ejemplo 3. Los análogos se prueban para propiedades mejoradas como se muestra en los Ejemplos A-21. La prueba de análogos NY-ESO-I157-165 para propiedades mejoradas se presenta en los Ejemplos 22-30. La prueba de análogos PSMA para propiedades mejoradas se presenta en los Ejemplos 33-38. La prueba de análogos PRAME425-433 para propiedades mejoradas se presenta en los Ejemplos 40-48. E.JEMPLO 1 SÍNTESIS DE PÉPTIDO, PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN Los péptidos se sintetizan en ya sea un sintetizador de péptido múltiple Symphony (PTI Technologies, MA) o un sintetizador de péptido ABl 433 (Applied Biosystems, Foster City, CA) a escala 0.05-0.1 mmol utilizando química de fase sólida Fmoc estándar. Los péptidos de ácido libre de terminal C se sintetizan utilizando resinas PEG-PS de precarga (en Symphony) o resina Wang (en ABl) . Los péptidos amidados de terminal C se sintetizan en resina Fmoc-PAL-PEG-PS . Todas las resinas se compran de Applied Biosystems (Foster City, CA) . Los aminoácidos de Fmoc utilizados en las síntesis de péptido se compran de Novabiochem (San Diego, CA) y AnaSpec (San José, CA) . El desdoblamiento post-sintesis se lleva a cabo por el procedimiento estándar. La purificación de péptido se lleva a cabo en ya sea columnas HPLC semi-preparativas o cartuchos SPE (Phenomenex, Torrance, CA) . La pureza de todos los péptidos fue >90%. La identidad de cada péptido se verifica por Maldi-TOF MS (Voyager OF, Applied Biosystems) y HPLCs analíticos (Varian o Shimazu) utilizando una columna Synergi C12 (Phenomenex, Torrance, CA) . E.TEMPLO 2 ANÁLOGOS SSX-24?-49 DISEÑADOS DE NOVO La modificación estructural de un péptido moderadamente antigénico puede mejorar de manera considerable el enlace de péptido-MHC, reconocimiento de CTL, y/o inmunogenicidad. Las directrices generales que consideran como modificar un epitope tipo silvestre para lograr un análogo de péptido con potencia mejorada se conocen en la materia. Una estrategia apreciada es optimizar los residuos en las así llamadas posiciones de sujeción para enlazar a la molécula MHC particular en el campo. En el caso de HLA-A2, una preferencia marcada para residuos hidrofóbicos en las posiciones P2 y PO se ha observado, particularmente L y M en P2, y V en PO. (PO denota el residuo de terminal C del epitope. Para HLA-A2, que es P9 o PÍO dependiendo de la longitud del péptido.) El reemplazo de la posición Pl con residuos aromáticos, como F, Y y W también puede ser ventajoso TABLA 7. Coeficiente utilizado por el algoritmo BIMAS ¡Algoritmo disponible por procedimiento de transferencia de hipertexto: //bimas . cit . nih . gov/molb?o/hla_b?nd/) TABLA 8 Patrón de puntuación para HLA-A*0201 utilizado por el Algoritmo SYFPEITH1 (9-mers) (Algoritmo disponible por procedimiento de transferencia de hipertexto ://sfypeithi. bmi .heidelberg . com/scripts/MHCServer . d 11/home . htm/) Adaptados de: Ármense, Bechmann, Stevanovic: MIC ligands and peptide motifs . Landes Bioscience 1997 EJEMPLO 3 Los siguientes análogos se producen utilizando las predicciones en el ejemplo 1. TABLA 9 Las abreviaciones para aminoácidos no estándar son como sigue: NIe, norleucina; Nva, norvalina; Phg, fenilglicina; Phe (4-F), 4-fluorofenilalanina; Phe(4-N02), 4-nitrofenilalanina; Abu, a-ácido aminobutírico; Aib, -ácido aminoisobutírico; MeLeu, metil-leucina; MeVal, metilvalina; ß- ( 3-benzotienil) Ala, ß- (3-benzotienil) -alanina; O-metil-Tyr, O-metiltirosina; Cha, ciclohexilalanina; Nal-1, ß- (1-naftil) -alanina; Nal-2, ß- (2-naftil) -alanina; -NH2 indica que la terminal carboxi se ha modificado a la amida. EJEMPLOS 4-21 PRUEBA DE ANÁLOGOS SSX-241-49 Los análogos producidos en el Ejemplo 3 se prueban para actividad, como efecto biológico y enlace como sigue en los Ejemplos 4-21: EJEMPLO 4 ENLACE DE PÉPTIDO UTILIZANDO CÉLULAS T2 La afinidad de análogos de péptido y el epitope tipo silvestre a HLA-A*0201 se evalúa utilizando un ensayo a base de célula T (Regner M, et al . , Exp Clin Immunogenet . 1996; 13 (1 ): 30-5; que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad) . Para el ensayo de enlace, en breve, las células T2 que carecen de expresión de TAP y de esta manera no ensamblan MHC clase I en la superficie celular, se impulsan con diferentes concentraciones de péptidos (controles y análogos) durante la noche a 37°C, enjuagan de manera extensiva, colorean con anticuerpo fluorescentemente marcado que reconoce MHC clase I (alelo A2 ) y corren a través de un analizador FacsScan. La diferencia entre MFl (intensidad de fluorescencia promedio) correspondiente a una concentración dada de análogo y el control negativo (sin aglutinante MHC) es una función de cuantos complejos estabilizados entre MHC y péptido se despliegan en la superficie de Células T2. De esta manera, a concentraciones limitantes de péptido, se encuentra una medición de Ken.en___a mayormente y a niveles de saturación de péptido se encuentra una medición de tanto Kencendida como Kapagada • el enlace se cuantifica por dos factores que se relacionan matemáticamente: enlace máximo medio (la concentración de péptido dando 50% de la señal correspondiente a saturación) y afinidad relativa (1/RA). La afinidad relativa, RA, se enlaza de manera normalizada a una referencia (péptido tipo silvestre); por ejemplo, la proporción entre enlace máximo medio de control relativo a análogo de péptido. Mientras más alto sea el Índice 1/RA y más bajo el enlace máximo medio, más alta será la Kencenida de la interacción entre el análogo y MHC. Cincuenta y tres análogos identificados con estos parámetros de enlace se determinan mejorados relativos al péptido tipo silvestre. Estos aglutinantes mejorados llevan una, dos, tres o múltiples sustituciones (incluyendo aminoácidos estándar y/o no estándar) incluyendo posiciones que se conocen por participar en la interacción con MHC y/o TCR. Sin embargo, el efecto total en enlace de MHC fue dependiente de la modificación. Tales análogos de péptido pueden ser útiles en composiciones terapéuticas o como una plataforma para derivar además composiciones terapéuticas. EJEMPLO 5 ESTABILIDAD DE PÉPTIDO UTILIZANDO CÉLULAS T2 Estabilidad de péptido (Kencendida) en MHC generalmente no puede inferirse de manera única del enlace (Kencendia) • Además del enlace, la estabilidad de los péptidos en MHC clase I es notoriamente importante con respecto a las propiedades inmunológicas de tales péptidos, ya que la activación de células T depende de la duración de "señal 1" (interacción de complejo de péptido MHC con receptor de célula T) . Para el ensayo de estabilidad, en breve, las células T2 que carecen de expresión de TAP, y de esta manera no ensamblan MHC clase I estable en la superficie celular, se impulsan con una concentración de péptido (controles o análogos) conocida por lograr carga máxima de MHC clase I ("saturación") durante la noche a 37°C, enjuagan de manera extensiva, y persiguen para diferentes intervalos en la presencia de emetina, que bloquea la sintesis de proteina endógena. Después de enjuague extensivo, las células se colorean con anticuerpo fluorescentemente marcado que reconoce MHC clase I (alelo A2) y corren a través de un analizador FacsScan. La diferencia entre MFl (intensidad de fluorescencia promedio) correspondiente a una concentración dada de análogo y el control negativo (sin aglutinante MHC) es una función de cuantos complejos estabilizados entre MHC y péptido se despliegan en la superficie de células T2. La decadencia de la señal con el tiempo se expresa matemáticamente como Índice de estabilidad 50% relativo al enlace a 0 horas (al comienzo del intervalo de seguimiento) . Tales análogos mejorados pueden llevar una, dos, tres o múltiples sustituciones (incluyendo aminoácidos estándar y/o no estándar) incluyendo posiciones que se conocen por participar en la interacción con MHC y/o TCR, con un efecto total en estabilidad de MHC que es dependiente de la modificación. Tales análogos de péptido pueden ser útiles en composiciones terapéuticas o como una plataforma para derivar además composiciones terapéuticas. Cuarenta y tres de los análogos tuvieron estabilidad incrementada relativa al péptido natural . Los análogos que mostraron tanto estabilidad como enlace mejorado son útiles en composiciones mejoradas o como una plataforma para generar composiciones mejoradas de beneficio terapéutico. EJEMPLO 6 EVALUACIÓN DE PROPIEDADES INMUNOLÓGICAS DE ANÁLOGOS :REACTIVIDAD CRUZADA Y AVIDEZ FUNCIONAL Las propiedades inmunológicas de péptidos pueden describirse como una función de enlace a moléculas MHC ( encenida y Kapagada) y TCR (afinidad de interacción entre TCR y complejos de MHC-péptido) . Las modificaciones de residuos de sujeción MHC primarios generalmente tienen un grado significativo de predicción con respecto al impacto total en el enlace a moléculas MHC. Las modificaciones de residuos de sujeción MHC secundarios pueden impactar la afinidad de interacción del complejo de MHC-péptido a análogo TCR con la KenCend?da y Kapagada relativas a interacción de péptido-MHC. Se contempla una metodología para permitir la selección rápida y racional de análogos de péptido en una manera coherente con los métodos propuestos de uso y moldear las propiedades inmunológicas totales (Kencendida y Kapagada relativas a interacción de MHC y propiedades de enlace a TCR en una manera integrada) . En algunos casos, el método incluye generar lineas de célula T contra un epítope natural (no mutado) (SSX-24_-49) , y utilizando una estrategia de inmunización lo suficientemente potente para generar una respuesta útil en ratones transgénicos que llevan MHC de humano (como el alelo A2 ) . Análogos de péptido se interrogan ex vivo en la presencia de APCs competentes y el impacto funcional de células T específicas para epítopes naturales (no mutados) se mide. La evaluación se hace a varias concentraciones de análogo, debido a que el efecto esperado fue bifásico en el caso de péptidos de reactividad cruzada (activándose a concentraciones restringidas e inhibiéndose a concentraciones más altas, debido a la muerte celular inducida por antígeno, AICD) . Las mediciones de los siguientes tres parámetros se utilizan para definir las características básicas y útiles de los análogos de péptido: 1. Concentración requerida mínima de análogo de péptido para activar los efectos indicativos de activación de célula T (e.g. producción de citocina); 2. Efecto máximo (valor pico) (e.g. producción de citocina) en cualquier concentración de análogo; 3. Concentración análoga en valor pico de efecto de activación (e.g., concentración de citocina) Por ejemplo, los análogos que resultan en valores reducidos asociados con los parámetros #1 y 3 pero incrementados #2, pueden ser útiles. El uso de epítope natural y péptidos no reactivos no relacionados como referencias es valuable para identificar clases de análogos de valor potencial. Los análogos que despliegan propiedades cuantitativamente comparables con o aún modestamente atenuados de aquellos de epitopes naturales aún parecen ser útiles en vista del hecho de que mientras mantienen la reactividad cruzada, pueden desplegar propiedades inmunológicas que son distintas de aquella del péptido natural, por ejemplo, propensión inferior a inducir AICD o capacidad de interrumpir la tolerancia o restaurar la respuesta in vivo . Algunas ventajas de esta estrategia de selección incluyen la practicidad y rapidez, uso de líneas de célula T más relevantes en lugar de clones de célula T potencialmente desviados como una lectura, y el valor compuesto, integrando parámetros como Kencendida/ Kapagada y afinidad TCR que pueden traducirse en reactividad cruzada y avidez funcional de complejos de péptido-MHC relativos a TCR. Estos parámetros pueden ser predictivos de las propiedades inmunológicas in vivo y de esta manera pueden delinear los paneles útiles de análogos de péptido para experimentar evaluación adicional, optimización y aplicaciones prácticas. Se predice que análogos que se enlazan a MHC y retienen la reactividad cruzada contra TCR especifica para el péptido tipo silvestre nominal activan un efecto medible en este ensayo. La metodología total se presenta en la Figura 2. „ El método utilizado para la generación de lineas de célula T fue el siguiente: ratones transgénicos HHD llevando un alelo humano A2 (Pascólo et al . , J. Exp Med. 185 ( 12 ): 2043-51, 1997, que se incorpora en la presente para referencia en su totalidad) se inmunizan con 50µg de epítope natural SSX-2 (41-49) mezclado con 25 µg de pIpC el día 0, 4, 14 y 18 por administración bilateral en los nodos linf inguinales. 7 dias después del ultimo refuerzo, los ratones se sacrifican y una suspensión de esplenocitos preparada a 5xlOd millones de células/ml en medio HL-1 completo. Las células se incuban con diferentes concentraciones de péptido por 48 horas en placas de 96 cavidades de fondo plano (200µl/cavidad) y por un adicional de 24 horas con rIL-2 a lOU/ml agregado a las cavidades. El sobrenadante se recolecta y la concentración de IFN-gamma se valora por métodos estándar como ELISA. EJEMPLO 7 REACTIVIDAD CRUZADA Y AVIDEZ FUNCIONAL DE ANÁLOGOS SUBSTITUIDOS EN POSICIÓN ÚNICA La estrategia de arriba (Ejemplo 6, Figure 2) se aplica para explorar a través de una biblioteca de análogos que llevan sustituciones únicas relativas al epitope SSX-24?-49 natural (KASEKIFYV (SEQ ID NO. 1)) en su versión tipo silvestre (Figure 3) . La correlación inversa fuerte se encuentra entre la cantidad requerida mínima de análogo para producir producción de IFN-gamma ex vivo y la cantidad máxima de producción de citocina en cualquier concentración de análogo. La sustitución de A42 con L, V o M mejoró las propiedades inmunológicas del péptido valorado en este ensayo. Los mutantes de L y V fueron activos. M fue más activo que el epítope natural. El mutante I mantuvo la reactividad cruzada al TCR que reconoce el epítope tipo silvestre . El reemplazo de A en la posición 42 con aminoácidos no estándar Abu, NIe o Nva mejoró las propiedades inmunológicas del péptido relativo al epítope tipo silvestre, ambos en términos de la cantidad mínima de análogo requerido para activar la producción de citocina y la cantidad máxima de citocina producida. Los mutantes que comprenden D-Ala, D-Val, Nal-2 o Aib despliegan reactividad cruzada retenida y actividad inmune reducida en este ensayo relativas al péptido natural, pero aún pueden ser útiles para derivación adicional para ajustar o mejorar sus propiedades. Un Nal-1 en la posición 42 eliminó la actividad. Los cambios del primer residuo, K4? mostraron que, mientras el reemplazo con F o Phg mejoró la actividad, , D-Lys, y Cha eliminan las propiedades inmunológicas en este ensayo. El reemplazo con K con Y, Phe-4F, Phe(4-N02), 0-metil-Tyr o beta- ( 3-benzotienil-Ala) retuvo la actividad. La modificación de la posición V9 (residuo de terminal C) por reemplazo con I mantuvo la actividad a un nivel inferior en comparación con el epítope original. La modificación del último residuo por adición de una porción NH2 eliminó la actividad del péptido que se rescata subsecuentemente al modificar A en posición 42 con L o V. Esto ilustra directamente que los análogos con actividad que es inferior que aquella del péptido tipo silvestre aún son útiles para derivación adicional. EJEMPLO 8 REACTIVIDAD CRUZADA Y AVIDEZ FUNCIONAL DE ANÁLOGOS SUBSTITUIDOS EN DOS POSICIONES La estrategia del Ejemplo 6 (Figure 2) se aplica para explorar a través de una biblioteca de análogos que llevan dos sustituciones, relativos al epitope SSX-24i-49 tipo silvestre en su versión tipo silvestre (Figure 4). Las modificaciones coordinadas en la posición 1 y 2 tuvieron un efecto variable en la actividad de análogos. Por ejemplo, la sustitución de K41 con Y, F o se corroboró con sustitución de A42 con V, M o I, y resultó en actividad conservada o mejorada de los análogos relativos al péptido tipo silvestre. Tales péptidos doblemente mutados ofrecen una oportunidad incrementada para impactar la interacción con TCR en una manera que resulta en interrupción de tolerancia (de esta manera siendo útil para aplicación práctica), ya que el residuo Pl participa en un cierto grado en el enlace a TCR. Combinaciones entre los siguientes: Y (posición 41) con V (en la posición 42), (posición 41) con I o L (en la posición 42), y F (posición 41) con L, V, I (en la posición 42) resultó en análogos que fueron más activos relativos al péptido tipo silvestre. Combinaciones entre Y en la posición 41 y I en la posición 42, o W en la posición 41 y V o M en 42, confirió una actividad similar a aquella del péptido tipo silvestre. El reemplazo de K con D-lisina en la posición 41 reducida resultó en análogos con actividad retenida en este ensayo. Tales péptidos pueden ser muy útiles ya que la degradación metabólica de tales péptidos que comprenden aminoácidos no estándar se disminuye in vivo . Combinaciones entre V o L en la posición 42 e I en la posición 49 resultó en actividad incrementada sobre el péptido natural. EJEMPLO 9 REACTIVIDAD CRUZADA Y AVIDEZ FUNCIONAL DE ANÁLOGOS SUBSTITUIDOS EN MÚLTIPLES POSICIONES La estrategia del Ejemplo 6 (Figure 2) se aplica para explorar a través de una biblioteca de análogos que llevan tres o más sustituciones relativas al epitope SSX-24?_49 natural en su versión tipo silvestre (Figure 5) . F y V en las posiciones 41 y 42 respectivamente, combinadas con I o A en la posición 49 resultó en actividad mejorada o similar relativa al epitope tipo silvestre. En contraste, L o M en la posición 49 resultó en actividad altamente disminuida. Mutantes triples que comprenden los aminoácidos no estándar Nva, Abu o MeVal en la última posición resultó en retención o mejora de la actividad inmune. Tales péptidos son extremadamente útiles debido a la estabilidad in vivo incrementada y resistencia a degradación enzimática. La modificación de residuos de aminoácido dentro de la región de enlace TCR putativa puede resultar en péptidos de valor considerable • que retienen el enlace a MHC junto con reactividad cruzada. Tales péptidos son útiles para restauración de respuesta inmune o interrupción de tolerancia debido a que su conformación en la hendidura MHC es ligeramente diferente de aquella de los péptidos naturales. Las sustituciones adicionales en la posición 44 (Q, Nva o NIe}, posición 46 {L, V, NIe o Nva) o 48 {F o Phe-4F) resultaron en análogos activados, mientras D, N, S o T en la posición 44, M en 46 o T, S, Phg en la posición 48 o L en la posición 46 con T en 48 resultó en análogos desprovistos de actividad. Finalmente, dos análogos con 5 sustituciones no mostraron actividad (Figure 5). EJEMPLO 10 REACTIVIDAD CRUZADA Y AVIDEZ FUNCIONAL DE DECÁMEROS QUE COMPRENDEN EL PÉPTIDO NATURAL Y MUTADOS EN VARIAS POSICIONES La estrategia del Ejemplo 6 (Figure 2) se aplica para explorar a través de una biblioteca de análogos de un decámero que comprende el péptido SSX-24_-49 nominal (Figure 6) . El decámero SSX-24_-5o fue significativamente menos activo para estimular la linea de células T especifica para el nonámero 41-49, relativo al último. La modificación del residuo Y en la posición 50 a I o L, pero a un menor o nada grado a V, NIe o Nva, resultó en restauración de la actividad en este ensayo. Además, la optimización de la actividad de análogos decaméricos se obtiene por modificación de A en la posición 2 con L o V. La sustitución de A42L rescató la actividad del decámero Y50Nva. Los análogos de péptido de actividad similar o reducida in vi tro (pero con reactividad cruzada retenida) en comparación con el péptido natural aún son útiles para la inducción o refuerzo de respuestas inmunes debido a: 1) AICD más restringida; ii) actividad in vivo potencialmente más alta debido a estabilidad incrementada en MHC clase I y/o interacción ligeramente modificada con TCR que puede ser importante para interrupción de tolerancia. EJEMPLO 11 USO DE ANÁLOGOS PARA ACTIVAR INMUNIDAD MEJORADA CONTRA EPÍTOPE NATIRAL. ASSESSED EX VIVO Tres grupos de ratones (n=4) se inmunizan con un plásmido que expresa epítope natural SSX-24_-49 por inoculación directa en los nodos linf inguinales con 25µg en 25µl de PBS/cada nodo linf el dia 0, 3, 14 y 17. Esto se sigue por dos refuerzos de péptido adicionales (cantidad similar) el día 28 y 31. El horario de inmunización se muestra en la Figura 7. Una semana después del refuerzo, los esplenocitos se estimulan ex vivo con péptido natural SSX-24?_49 y se prueban contra células objetivo marcadas con 51Cr (células T2) en varias proporciones E:T (Figure 8). Los resultados mostraron que el análogo A42V activó una respuesta más alta contra células objetivo que expresan el péptido natural, en comparación con el análogo A42L o el péptido tipo silvestre por si mismo, como agentes de refuerzo. Esto se correlaciona con los parámetros de estabilidad y enlace determinados por experimentación ex vivo . EJEMPLO 12 USO DE ANÁLOGOS PARA ACTIVAR INMUNID- 3 MEJORADA CONTRA EPÍTOPE NATURAL, VALORADO IN VIVO Ocho grupos de ratones (n=4) se inmunizan con plásmido que expresa epitope natural SSX-24?-49, por inoculación directa en los nodos linf inguinales con 25µg en 25µl de PBS/cada nodo linf el dia 0, 3, 14 y 17. Esto se sigue por dos refuerzos de péptido adicionales (cantidad similar) el dia 28 y 31, utilizando un péptido de control negativo (Melan A 26-35 "EAA"), péptido natural o análogos como se muestra en la Figura 9. Para evaluar la respuesta in vivo contra péptido natural, los esplenocitos se aislan de ratones HHD de control cría e incuban con 20µg/mL o lµg/ml de péptido natural por 2 horas. Estas células se colorean entonces con fluorescencia CFSEhl (4. OµM o lµM por 15 minutos) e intravenosamente coinyectan en ratones inmunizados con un número igual de esplenocitos control coloreados con fluorescencia CFSE10 (0.4µM). Dieciocho horas después se mide la eliminación específica de células objetivo al remover el bazo y PBMC de los animales con retos y medir la fluorescencia CFSE por citometría de flujo. La eliminación relativa de las poblaciones correspondientes a esplenocitos cargados con péptido se calcula relativa a la población control (sin cargar) y expresa como % lisis especifica. Figure 10 (bazo) y 11 (sangre) muestran la citotoxicidad in vivo producida por los regímenes descritos en la Figura 7. Tres de los péptidos probados, A42V, K41F y K41Y, mostraron actividad incrementada relativa al péptido natural, tanto en bazo como sangre, contra células objetivo revestidas con 20µg/ml asi como también lµg/ml de péptido natural (Figure 11). EJEMPLO 13 USO DE ANÁLOGOS PARA ACTIVAR LAS RESPUESTAS MEJORADAS CONTRA CÉLULAS DE TUMOR Ocho grupos de ratones (n=4) se inmunizan con plásmido que expresa epítope natural SSX-24?_49 por inoculación directa en los nodos linf inguinales con 25ug en 25ul de PBS/cada nodo linf el dia 0, 3, 14 y 17. Esto se sigue por dos refuerzos de péptido adicionales (cantidad similar) el día 28 y 31, utilizando un péptido de control negativo (Melan A 26-35 "EAA"), péptido natural o análogos como se muestra en la Figura 9. Una semana después del refuerzo, los esplenocitos se estimulan ex vivo con péptido SSX-24_-49 tipo silvestre y prueban contra células de tumor de humano marcadas con slCr (624.38 células de melanoma) en varias proporciones E:T (Figura 12) . Los análogos A42V y K41F A42V V49I produjeron respuestas inmunes que median la citotoxicidad incrementada contra células de tumor de humano que expresan el epítope natural SSX-24?_49. EJEMPLO 14 MODIFICACIÓN DE SUJECIÓN PRIMARIA PRÓXIMA A TERMINAL N (2D0 AA) Cuando los análogos substitudos mostradas en la en Tabla 3 se prueban, los análogos mostraron perfiles de estabilidad y enlace mejorados en comparación con el epítope de péptido tipo silvestre. Sin embargo, la magnitud de mejora para cada análogo varió, y la sustitución de A42V mostró la mejora más alta en términos de afinidad de enlace con molécula HLA-A*0201. Además, la estabilidad del complejo de A42V-HLA-A*0201 fue mayor que el complejo formado entre péptido tipo silvestre y HLA-A*0201: el Tl/2 se extiende de 11.5 hrs a 20 hrs. Los péptidos con 42 A a L, V y M sustituciones fueron capaces de inducir la secreción de IFN-? de CTL específico de péptido tipo silvestre a concentraciones remarcadamente inferiores. 42A a sustitución I generó un análogo con perfil de estabilidad y enlace mejorado. El residuo en la posición P2 también puede embragarse en la interacción con TCR a un cierto grado. Esta observación también se soporta por los resultados con el 42 A a análogo Aib, que posee una afinidad de enlace similar con HLA-A*0201 relativa al epitope tipo silvestre. EJEMPLO 15 MODIFICACIÓN DE SUJECIÓN SECUNDARIA DE TERMINAL N (lerAA) La sujeción secundaria de terminal N es el primer aminoácido en el término N. De esta manera, en una modalidad, Lys 43 original encontrada en la secuencia tipo silvestre se substituye con un aminoácido voluminoso y más hidrofóbico. Cualquier aminoácido voluminoso y más hidrofóbico también puede utilizarse, incluyendo cualquiera disponible a o que se conoce por un experto en la materia, incluyendo aminoácidos estándar y aminoácidos no estándar. Ejemplos de aminoácidos más hidrofóbicos incluyen, pero no se limitan a: Phe, Tyr, Trp, y D-Lys. El residuo de Lys 41 se define como un residuo de sujeción secundario para interactuar con la molécula HLA-A*0201, y también se embraga en la interacción con los receptores de célula T a un cierto grado. Por lo tanto, las modificaciones- de esta posición pueden generar algunos análogos heteroclíticos que son más inmunogénicos y más adecuados para el desarrollo de vacunas de tumor. Como se muestra en la Tabla 3, el reemplazo de Lys 41 con derivados de Tyr, Phe o Phe ( Fenilglicina, Para-fluorofenilalanina, Para-nitrofenilalanina) resultó en análogos que tienen afinidad más alta con la molécula HLA-A*0201 y forman complejos más estables. Por el otro lado, los análogos de derivados Lys a Trp o Trp han mostrado afinidad significativamente disminuida con la molécula HLA-A*0201, aunque se basa en los algoritmos predichos, el análogo Trp debe tener una afinidad similar a aquella de los análogos Tyr y Phe. Los datos experimentales demuestran la limitación de los algoritmos predichos. Por ejemplo, Lys 41 para sustitución Phg resultó en un análogo con afinidad mejorada y estabilidad extendida con la molécula HLA-A*0201.

Se muestra que el análogo de para-nitrofenilalanina induce la secreción de IFN-? del CTL especifico de péptido tipo silvestre a una concentración más inferior, aunque su afinidad con la molécula HLA-A*0201 fue aproximadamente la misma que aquella del péptido tipo silvestre. EJEMPLO 16 MODIFICACIÓN DE SUJECIÓN PRIMARIA/SECUNDARIA DE TERMINAL N Cuando ambos residuos de sujeción, primario y secundario, en la terminal N se modifican, una tendencia general fue que los análogos resultantes demostraron afinidad mejorada y estabilidad extendida con la molécula HLA-A*0201 (Tabla 3), con solamente unas pocas excepciones: (K41Y, A42V), (K41Y, A42M) y (K41 (D-Lys), A42V) . Adicionalmente, tienen muy buena reactividad cruzada con CTL específico de péptido tipo silvestre. La combinación de la sustitución K41W con A42V o A42L mejoró el perfil de enlace/estabilidad.

Estos análogos también tuvieron actividad de reactividad cruzada deseable con el péptido tipo silvestre. Las modificaciones de combinación de sujeción primaria de terminal N y sujeción secundaria cambiaron la estructura de péptido y conformación a un mayor grado. EJEMPLO 17 SUJECIÓN PRIMARIA/SECUNDARIA DE TERMINAL N Y MODIFICACIÓN PRIMARIA DE TERMINAL C Val de terminal C del péptido tipo silvestre fue un residuo de sujeción preferido. Sin embargo, la potencia mejorada se observa cuando se muta a lie, teniendo un grupo -CH2 adicional. La mejora similar también se observa con una sustitución Val a Abu. Los otros análogos mostraron afinidad de enlace mejorada y estabilidad con la molécula MHC. Los resultados de estos análogos indicaron que el residuo de sujeción de terminal C de péptido también juega un papel critico en el reconocimiento de células T (Tabla 4) . EJEMPLO 18 SUJECIÓN PRIMARIA/SECUNDARIA DE TERMINAL N Y MODIFICACIÓN DE SITIOS TCR Las sustituciones de residuos de aminoácido de enlace TCR secundarios generaron análogos heteroclíticos que no interfieren con el enlace a la molécula MHC, pero superan los campos de tolerancia de auto-antígenos . Al combinar las sustituciones de residuos de sujeción primaria/secundaria de terminal N (K41F y A42V) y los sitios TCR, los análogos se generan con afinidad de enlace mejorada y estabilidad (Tabla 6) . Algunos de estos análogos inducen la producción de IFN-? de CTL específico de péptido tipo silvestre a concentraciones inferiores, como mutantes K41F, A42V, E44 (Nva) / (NIe) y mutantes K41F, A42V, I46L/ (Nva) / (NIe) . EJEMPLO 19 AMIDA DE TERMINAL N Reemplazar el término C de ácido carboxílico libre del péptido con una amida mejoró la estabilidad del péptido en medio biológico al conferir estabilidad a proteolisis y confirió resistencia de carboxipeptidasa de dipeptidilo al péptido. Sin embargo, algunos de los análogos resultantes pierden una cantidad significativa de su afinidad con moléculas MHC, asi como también inmunogenicidad y antigenicidad. Inesperadamente, aunque los tres análogos descritos en la presente en la Tabla 7 pierden su capacidad de enlace con molécula MHC, SSX-24_-9-NH2 (A42V) mantuvo su reactividad con CTLs específicos de péptido tipo silvestre como se indica por su capacidad para inducir la secreción de IFN-? a una concentración similar a aquella del péptido tipo silvestre. SSX-24?-9—NH2 (A42L) fue, sin embargo, capaz de estimular la producción de IFN-? a una concentración inferior. EJEMPLO 20 DECÁMEROS La longitud de péptidos de enlace a MHC típicos varia de 8-mer a 11-mer, y la mayoria de los péptidos de enlace HLA-A*0201 son 9-mers o 10-mers. En observaciones previas, un 9-mer y 10-mer de una secuencia natural ambos se encuentran que poseen un motivo de enlace para el mismo MHC, y tuvieron el mismo término N. A partir del punto de vista de procesamiento proteasomal existen distintos epitopes, pero fueron sin embargo, antigénicamente reactivos. En el caso del epítope tipo silvestre SSX-24_-49, el epítope es un péptido 9-mer y el péptido 10-mer, SSX-24?-50, carece del motivo de enlace a MHC apropiado y no mostró actividad inmunológica . El epitope tipo silvestre fue por lo tanto alargado a 10-mer con aminoácidos que podrían crear el motivo de enlace apropiado. Como se muestra en la Tabla 8, mientras muchos análogos 10-mer tienen una afinidad de unión inferior con la molécula HLA-A*0201, los análogos SSX-241_50 (A42L, Y50L/V/Nle/Nva) mostraron afinidad de enlace mejorada con la molécula HLA-A*0201. Dos análogos 10-mer en particular, A42L y Y50 Nle/Nva, fueron capaces de inducir la producción de IFN-? de células T inmunizadas contra el péptido tipo silvestre en concentraciones inferiores que el péptido tipo silvestre . EJEMPLO 21 USO DE ANÁLOGOS PARA SUPERAR LA TOLERANCIA Un aspecto en el cual los análogos pueden representar una mejora sobre el epitope tipo silvestre está en inmunogenicidad incrementada en un sistema humano e interrupción de tolerancia. Las diferencias en el repertorio TCR, ya sea debido a las diferencias de línea germinal o diferencias en selección negativa, tienen el potencial de dar resultados anómalos. Para dirigir tales campos, los análogos se utilizan en una inmunización in vi tro de sangre de HLA-A2+ para generar CTL. Las técnicas para inmunización in vi tro, aún utilizando donadores puros, se conocen en el campo, por ejemplo, Stauss et al . , Proc . Na tl . Acad . Sci . USA 89:7871-7875, 1992; Salgaller et al . Cáncer Res . 55:4972-4979, 1995; Tsai et al . , J. Immunol . 158:1796-1802, 1997; y Chung et al . , J. Immunother . 22:279-287 , 1999; cada una de las cuales se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. Específicamente, PBMCs de donadores normales se purifican por centrifugación en Ficoll-Hypaque de revestimientos amortiguados. Todos los cultivos se llevan a cabo utilizando plasma antologo (AP) para evitar la exposición a patógenos xenogenéicos potenciales y reconocimiento de péptidos FBS. Para favorecer la generación in vi tro de CTL especifico de péptido, las células dendríticas autólogas (DCs) se emplean como APCs. DCs se generan y los CTLs se inducen con DCs y péptidos de PBMCs como se describe en Keogh et al . , 2001, que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. Brevemente, las fracciones celulares enriquecidas con monolito se cultivan por 5 dias con GM-CSF e IL-4 y se cultivan por 2 dias más en medio de cultivo con 2 µg/ml ligando CD40 para inducir la maduración. 2xl06 linfocitos T enriquecidos con CD8+/cavidad y 2xl05 DCs impulsados por péptido/cavidad se co-cultivan en placas de 24 cavidades en 2 ml RMPI complementado con 10% AP, 10 ng/ml IL-7 y 20 IU/ml IL-2. Los cultivos se estimulan en los dias 7 y 14 con DCs impulsados con péptido irradiados autólogos . La inmunogenicidad se ensaya utilizando la citotoxicidad in vi tro y los ensayos de producción de citocina descritos en la presente. EJEMPLOS 22-30 PRUEBA DE ANÁLOGOS NY-ESO-l?57-i65 Los análogos enlistados en la Figura 13 se prueban para actividad, como efecto biológico y enlace como sigue en los Ejemplos 22-30: EJEMPLO 22 REACTIVIDAD CRUZADA Y AVIDEZ FUNCIONAL DE ANÁLOGOS SUBSTITUIDOS EN UNA POSICIÓN ÚNICA (FIGURAS 13 A-C) La estrategia de arriba (Ejemplo 6) se aplica para explorar a través de una biblioteca de análogos que llevan sustituciones únicas relativas a al epitope NY-ESO-l?57-?65 tipo silvestre en su versión nativa (o tipo silvestre) (Figura 13). Una fuerte correlación inversa fue encontrada entre la cantidad mínima requerida de análogo para producir producción de IFN-gamma ex vivo y la cantidad máxima de citocina en cualquier concentración de análogo. La sustitución de S157 con F o K resultó en análogos que retienen parcialmente enlace de MHC y reactividad cruzada con las células T especificas para el epítope nominal. La sustitución de L158 con I mejoró las caracteristicas inmunológicas del péptido según se valora por esta metodología; mientras L158V resultó en retención parcial de actividad. La modificación de C165 con cualquiera de los aminoácidos V, L, A, o I resultó en propiedades inmunes mejoradas. Los péptidos que tienen sustituciones en la posición de terminal N o en cualquier parte, y presentes con actividad retenida pero no restringida en su ensayo relativo al péptido tipo silvestre, pueden ser útiles en humanos. Además, existe material para derivación adicional para mejorar sus propiedades, como se describe abajo. EJEMPLO 23 REACTIVIDAD CRUZADA Y AVIDEZ FUNCIONAL DE ANÁLOGOS SUBSTITUIDOS EN DOS POSICIONES (FIGURA 13A-C) La estrategia del Ejemplo 6 se aplica para explorar a través de una biblioteca de análogos que llevan dos sustituciones relativas a al epítope tipo silvestre NY-ESO- i57-i65- Las modificaciones semi-conservadoras simultáneas en la posición 2 y 9 se encontraron por tener efectos profundos en las propiedades inmunes de análogos, dependiendo de la identidad precisa de los análogos. La combinación de L158I con C165V o C165L además incremento la actividad relativa al péptido tipo silvestre. Similarmente, L158V mejoró en la actividad de los análogos C165V o C165L, además incrementó tal actividad relativa al péptido tipo silvestre. L158V retiene parcialmente la actividad de los análogos C165A o C165I, que muestran un efecto interesante de doble mutación de residuos de sujeción primarios. Similarmente, L1581 retienen parcialmente la actividad del análogo C165A. Las modificaciones simultáneas en las posiciones 1 y 9 tuvieron efectos profundos en la propiedades inmunes de análogos, dependiendo de la identidad precisa de los análogos. S157Y combinados con Cl65Nva (norvalina) o NIe (norleucina) en la posición 9 resultó en actividad substancialmente mejorada sobre S157Y solo o el péptido tipo silvestre. El mutante C165V también rescató la actividad del mutante S157Y. V-NH2 o L-NH2 en la posición 9 rescataron parcialmente la actividad del análogo S157Y, sin embargo, A-NH2 falló en hacerlo. Combinaciones entre S157F y V, L, I, y a un menor grado A en la posición 9 mantuvo fuerte actividad del análogo y puede ser más útil que los mutantes únicos en la posición 9 debido a la participación del primer resido en la interacción con TCR. Combinaciones entre S157K y V, L, I y a un menor grado A en la posición 9, mantuvo fuerte actividad del análogo y puede ser más útil que los mutantes únicos en la posición 9 debido a la participación del primer residuo en la interacción con TCR y el efecto benéfico total en la solubilidad de péptido de K en la posición 1. EJEMPLO 24 REACTIVIDAD CRUZADA Y AVIDEZ FUNCIONAL DE ANÁLOGOS SUBSTITUIDOS EN MÚLTIPLES POSICIONES (FIGURA 13A-C) La estrategia del Ejemplo 6 se aplica para explorar a través de una biblioteca de análogos que llevan múltiples sustituciones relativas al epitope NY-ESO-1 tipo silvestre. L158Nva o L158Nle considerablemente mejoró la actividad del mutante S157Y C165V. Combinaciones entre V o l en la posición 158 y V, L, A o I en 165 parcialmente restauró la potencia de análogos relativa al péptido tipo silvestre. S157Y L1581 C165V desplegó actividad incrementada relativa al péptido tipo silvestre y S157V con C165V o C1651; y S1571 con C165L o I mantuvo el enlace de MHC y reactividad cruzada con células T especificas para el péptido tipo silvestre. Sustituciones triples que comprenden Y y V en las posiciones 157 y 165, respectivamente, además de L o N en 160; A, L, V, o N en 162; o E, D o T en 164, mantuvo la actividad del péptido en este ensayo de reactividad cruzada, haciendo a estos análogos compuestos útiles para la interrupción de la tolerancia de célula T ín vivo a medida que las posiciones 160, 162 y 164 participan en la interacción con TCR. Sustituciones triples que comprenden 157F y 158V más V, L, o I en la posición 165 mostraron actividad en el ensayo descrito en el Ejemplo 2. Además, mutantes triples comprendiendo S157F y L1581 más V o A en la posición 165 mantuvo la actividad. Juntos, estos datos subrayan el complejo interactivo y naturaleza no lineal de múltiples sustituciones . Finalmente, los mutantes triples que comprenden S157 y a un mayor grado S157T junto con 158V y 165V, mostraron actividad incrementada o retenida, respectivamente, relativa al péptido tipo silvestre. EJEMPLO 25 REACTIVIDAD CRUZADA Y AVIDEZ FUNCIONAL DE DECÁMEROS COMPRENDIENDO EL PÉPTIDO TIPO SILVESTRE Y MUTADOS EN VARIAS POSICIONES (FIGURA 13A-C) La estrategia del Ejemplo 6 se aplica para explorar a través de una biblioteca de análogos de un decámero comprendiendo el péptido nominal NY-ESO-I157-165 • Mientras el decámero por si mismo carece de actividad significativa in vi tro actividad, varias sustituciones en esta posición rescataron parcialmente la actividad, como L en 166, o L, I, NIe en 166 combinadas con Y en 157 y V en 165. Análogos de péptido con actividad similar o reducida ín vi tro (pero con reactividad cruzada mantenida) en comparación con el péptido tipo silvestre son aún útiles para inducción o refuerzo de respuestas inmunes debido a: i) AICD más restringida (muerte celular inducida por antígeno); ii) actividad in vivo más alta debido a la estabilidad incrementada en MHC clase I y/o interacción ligeramente modificada con TCR. De esta manera, estos análogos son útiles para interrumpir la tolerancia. EJEMPLO 26 EVALUACIÓN DE PROPIEDADES INMUNOLÓGICAS DE ANÁLOGOS: PÉPTIDOS DE ENLACE A MOLÉCULAS DE MHC CLASE i (FIGURA 13A-C) La afinidad de análogos de péptido y el epitope tipo silvestre a HLA-A*0201 se evalúa por ensayo a base de célula T2 (Regner M, et al . , Exp Clin Immunogenet . 1996; 13 (l):30-5, que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad) . Para el ensayo de enlace, en resumen, las células T2 que carecen de expresión de TAP, y de esta manera no ensamblan MHC clase I estable en la superficie celular, se impulsan con diferentes concentraciones de péptidos (controles o análogos) durante la noche a 37°C, enjuagan de manera extensiva, colorean con anticuerpo fluorescentemente marcado que reconoce MHC clase I (alelo A2), y corren a través un analizador FacsScan. Los péptidos que enlazan A2 estabilizan su presencia en la superficie celular. La diferencia entre MFl (intensidad de fluorescencia promedio) correspondiente a una concentración dada de análogo y el control negativo (un péptido de enlace a no MHC) es una función de cuantos complejos entre MHC y péptido se despliegan en la superficie de células T2. De esta manera, a concentraciones limitantes de péptido, esto es una medición de Kencendida mayormente y a niveles de saturación de péptido es una medición de ambas, Kencendida y Kapagada .

En la Figura 13, el enlace se cuantifica por dos factores que se relacionan matemáticamente: enlace máximo medio (la concentración de péptido dando 50% de la señal correspondiente a saturación) y afinidad relativa (1/RA), que se enlaza de manera normalizada a una referencia (péptido tipo silvestre) — es decir, la proporción entre enlace máximo medio de control relativo a análogo de péptido. Mientras más alto sea el Índice 1/RA y más bajo el enlace máximo medio, más alta será la Kencenida de la interacción entre un análogo y las moléculas MHC. En la Figura 13, hay 39 análogos descritos con tales parámetros de enlace mejorados relativos al péptido tipo silvestre. Tales aglutinantes mejorados llevan una, dos, tres, o más sustituciones de aminoácidos estándar y/o no estándar en las posiciones que se conocen por participar en la interacción con MHC y/o TCR, con un efecto total en enlace a MHC que depende de la modificación precisa/conjugada. Tales análogos de péptido son útiles en las composiciones terapéuticas o como una plataforma para derivar además composiciones terapéuticas. EJEMPLO 27 MÉTODO DE INMUNIZACIÓN (FIGURA 14) Ocho grupos de ratones (n=4) se inmunizan con un plásmido que expresa el epitope tipo silvestre NY-ESO-li57-?65 por inoculación directa en los nodos linf inguinales con 25 µg en 25 µl de PBS en cada nodo linf los dias 0, 3, 14 y 17.

Esto se sigue por dos refuerzos de péptido (cantidad similar) el dia 28 y 31, utilizando un péptido de control negativo (HBVc) , péptido tipo silvestre o análogo como se muestra en la Figura 14. EJEMPLO 28 USO DE ANÁLOGOS PARA ACTIVAR INMUNIDAD MEJORADA CONTRA EPÍTOPE TIPO SILVESTRE, VALORADO IN VIVO (FIGURAS 15A-C) Para evaluar las respuesta in vivo obtenidas contra el epitope tipo silvestre, los esplenocitos se aislan de ratones HHD de control cría e incuban con 20µg/mL o lµg/ml de péptido tipo silvestre por 2 horas. Estas células se colorean entonces con fluorescencia CFSEhl y CFSEmed (4. OµM o lµM, respectivamente, por 15 minutos) e intravenosamente coinyectan en ratones inmunizados con un número igual de esplenocitos control coloreados con fluorescencia CFSE10 (0.4µM). Dieciocho horas después la eliminación especifica de células objetivo se mide al remover los bazos y PBMC de animales con retos y medir fluorescencia CFSE por citometria de flujo. La eliminación relativa de las poblaciones correspondientes a un péptido cargado con esplenocitos se calcula relativa a la población control (sin cargar) y se expresa como % lisis específica. Figura 15A muestra la falta de citotoxicidad in vivo en ratones recibiendo el péptido control negativo. Figura 15B muestra la citotoxicidad variable en ratones inmunizados con plásmido y amplificados con péptido tipo silvestre. Figura 15C muestra la citotoxicidad constante substancial en ratones inmunizados con plásmido y amplificados con el análogo Ll58Nva C165V. EJEMPLO 29 COMPARACIÓN DE VARIOS ANÁLOGOS EN ACTIVACIÓN DE INMUNIDAD MEJORADA CONTRA EL EPÍTOPE TIPO SILVESTRE, VALORADA JN VIVO (FIGURAS 16A-B) En el contexto del procedimiento de inmunización descrito en el Ejemplo 8 y utilizando la metodología descrita en el Ejemplo 9, citotoxicidad in vivo contra células objetivo revestidas con cantidades restringidas (lµM; Figura 16A) o supraóptimas de péptido tipo silvestre (20µM, Figura 16B) se evalúa subsiguiente al procedimiento de inducción y amplificación utilizando análogo de péptido y plásmido respectivamente para las dos etapas. Los resultados expresados como %lisis especifica promedio +/- SE mostraron que el análogo L158V C165?va indujo la actividad más alta y que los análogos L158V C165V, L158V C165?va y S157KL 158VC 165V mostraron un efecto en el mismo rango con péptido tipo silvestre o mutante C165V. Debido a que múltiples sustituciones pueden alterar el sitio de enlace a TCR, tales análogos pueden ser más útiles que el péptido tipo silvestre en la interrupción de la tolerancia contra un auto-epitope . Además, el mutante triple S157K puede mejorar la deficiente solubilidad del péptido tipo silvestre u otros análogos con implicaciones prácticas directas. EJEMPLO 30 USO DE ANÁLOGOS PARA ACTIVAR LA INMUNIDAD MEJORADA CONTRA EL EPÍTOPE TIPO SILVESTRE, VALORAADO IN VIVO POR PRODUCCIÓN DE CITOCINA (FIGURAS 17A-B) En el contexto del procedimiento de inmunización descrito en el Ejemplo 27, y siguiendo el reto descrito en el Ejemplo 28, los esplenocitos se aislan, agrupan y estimulan in vi tro con lOµM de péptido tipo silvestre NY-ESO-l?57-?65 por 3 y 6 días, respectivamente. Los sobrenadantes se recolectan y la concentración de IFN-? se mide por ELISA. El análogo L158Nva C165V indujo las células T que producen grandes niveles de IFN-gamma más rápidamente en la estimulación ex vivo (Figura 17A) . Otros análogos tales como S157F L158V C165V, L158V C165Nva, y L158V C165V indujeron células T que produjeron cantidades incrementadas de IFN-gamma en la re-estimulación ex vivo con péptido tipo silvestre (Figura 17B) . En contraste, C165V falló en inducir la capacidad incrementada de células T para producir IFN-?, relativo al péptido tipo silvestre siguiendo los procedimientos descritos en los Ejemplos 27-28. EJEMPLO 31 CARACTERIZACIÓN DE ENLACE Y ESTABILIDAD POR ELISA (PRUEBA ITOPIA) Las placas de microconcentración revestidas con avidita que contienen monómero clase I cargado con un asi llamado péptido de permanencia en su lugar se utilizan para evaluar el enlace de péptido, afinidad y off-rate. Las placas revestidas de monómero se suministran como parte del Kit de Sistema de Descubrimiento de Epitope iTopia (Beckman Coulter, Inc., San Diego, CA, USA). Los reguladores de ensayo, anti-MHC-FITC mAb y beta2-microglobulina y péptidos control también se suministran con los kits. Ensayos de enlace: El péptido nativo y análogos se evalúan primero por su habilidad para enlazar cada molécula MHC por ensayo de enlace. Este ensayo mide la capacidad de los péptidos individuales para enlazar las moléculas HLA bajo condiciones de enlace óptimas estandarizadas. Las placas revestidas con monómero se separan primero, liberando el péptido de permanencia en su lugar y dejando solamente la cadena pesada MHC enlazada a la placa. Los péptidos prueba se introducen entonces bajo condiciones de doblez óptimas, junto con anti-MHC-FITC mAb. Las placas se incuban por 18 horas a 21°C. anti-MHC-FITC mAb se enlaza preferentemente a un complejo MHC redoblado. Por lo tanto, la intensidad de fluorescencia resultando de cada péptido se relaciona con la capacidad del péptido para formar complejo con molécula MHC. Cada enlace del péptido se evalúa relativa al péptido control positivo proporcionado en el kit, y los resultados se expresan "% de enlace". Los análogos identificados como vmejores aglutinantes' relativos al péptido nativo se analizan subsecuentemente en la afinidad y ensayos off-rate. Ensayo de Afinidad: Para el ensayo de afinidad, después de la separación inicial del péptido de permanencia en su lugar, las concentraciones crecientes (rango 10"4 a 10~8 M) de cada péptidos prueba para un alelo dado se agregan a una serie de cavidades e incuban bajo las condiciones descritas previamente. Las placas se leen en el fluorómetro. Las curvas de respuesta de dosis sigmoidal se generan utilizando software Prism. La cantidad de péptido requerida para lograr 50% del máximo se registra como valor ED50. Ensayo Off-rate Para el ensayo off-rate, las placas se enjuagan después de 18 hrs de incubación a 21°C para remover el péptido en exceso. Las placas se incuban entonces en las placas de monómero especificas de alelo a 37°C. Las placas se miden en múltiples puntos en el tiempo (0, 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 6 y 8 hrs) para intensidad de fluorescencia relativa. El tiempo requerido para 50% del péptido para disasociarse del monómero MHC se define como el valor Tl/2 (hrs). Cálculo iScore: iScore es un cálculo de múltiples parámetros proporcionado dentro del software iTopia. Su valor se calcula en base a los datos de enlace, afinidad y estabilidad. EJEMPLO 32 VALIDACIÓN DE LA ANTIGENICIDAD DE PSMA288-297 Los ratones transgénicos HHD (n=4) se inmunizan con péptido PSMA288-297 (25µg en 25µl de PBS, más 12.5µg de pI:C para cada nodo linf) el dia 0, 3, 14 y 17. Una semana después del refuerzo, los esplenocitos se estimulan ex vi vo con el péptido nativo PSMA288-297 y se prueban contra células de tumor de humano marcadas con 51Cr (células PSMA+ A2+ LnCap, o como control negativo, las células LnCap revestidas con anticuerpo de bloqueo de MCH clase I) en varias proporciones E:T. Los resultados, expresados como % lisis específica (promedio+SEM) , mostraron que células T específicas de PSMA fueron capaces de lisar las células de tumor de humano en una manera dependiente de la disponibilidad de MHC clase I, confirmando el despliegue del epitope PSMA en MHC clase I de células de tumor en una manera que permite el ataque mediado inmune (Figura 18) . EJEMPLOS 33-38 PRUEBA DE ANÁLOGOS PSMA288-297 Los análogos enlistados en las Figuras 19 y 20 se prueban para varias propiedades como afinidad mejorada y estabilidad de enlace, reactividad cruzada con el epitope nativo, e inmunogenicidad como sigue en los Ejemplos 33-38.

EJEMPLO 33 REACTIVIDAD CRUZADA Y AVIDEZ FUNCIONAL DE ANÁLOGOS SUBSTITUIDOS EN POSICIÓN ÚNICA Utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 31, las caracteristicas de enlace de PSMA288_297 y análogos se valoran en comparación entre si (ver Figura 19) . El control positivo para enlace fue melan-A26-3s A27L. La reactividad cruzada con el epitope nativo se valora al utilizar los péptidos análogos para estimular la secreción de IFN-gamma de una linea de células T específica para el epítope nativo, esencialmente como se describe en el Ejemplo 6. Los datos mostrados en la Figura 19 se generan al estimular con lOµg/ml de análogo (aproximadamente lOµM) . Esta concentración generalmente resultó en producción máxima o casi máxima de IFN-gamma para los análogos y de esta manera se eligen para representan la reactividad cruzada. Las afinidades observadas de los análogos se reportan en la Figura 19 como ED50s. Met, lie, Gln, Val, Nva, NIe, y Abu son substituidos en la posición P2, y generalmente resultaron en afinidad similar. Las sustituciones NIe y Met también mantuvieron estabilidad similar de enlace, medida como medio tiempo de disociación en horas. Los análogos Val, Nva, y Abu produjeron un nivel similar de producción de IFN-gamma . Val, Leu, Nva, y NIe se substituyen por lie en la posición de sujeción primaria PO. Los cuatro tuvieron afinidad de enlace similar. Las 'sustituciones Val y Nva mejoraron la estabilidad de enlace e incrementaron la cantidad de IFN-gamma producido, indicando la reactividad cruzada y que los análogos pueden tener inmunogenicidad mejorada. ' Las sustituciones Ser, Ala, Sar, y Abu en Pl mantuvieron caracteristicas de enlace similares pero tuvieron reactividad cruzada marginalmente similar. Las sustituciones Ala, Leu, Ser, y Thr en la posición PO-1 también mantuvieron características de enlace similares. Finalmente, la sustitución Trp en P3 mostró afinidad y estabilidad de enlace que ambas se incrementaron dos veces e la producción de IFN-gamma que estuvo dentro de las dos veces del péptido nativo, son todas de valores similares. EJEMPLO 34 REACTIVIDAD CRUZADA Y AVIDEZ FUNCIONAL DE ANÁLOGOS SUBSTITUIDOS EN DOS POSICIONES El patrón observado arriba, que las sustituciones en este epítope no imparten grandemente afinidad de enlace, continuaron con las sustituciones dobles examinadas (Figura 20) que despliegan de manera uniforme afinidad de enlace mejorada o similar en comparación con el péptido nativo. Entre los análogos con sustituciones en ambas posiciones de sujeción primarias, aquellas con Nva de NIe en P2 y Val en PO, y Val en P2 y Nva en PO desplegaron estabilidad de enlace mejorada y las dos anteriores incrementaron la producción de IFN-gamma (datos no mostrados para el 3er análogo) . Las sustituciones Val y Nva en PO también se forman en pares con sustituciones Ala y Abu en Pl . Estos análogos tuvieron estabilidad de enlace robusta y producción de IFN-gamma que se mejora en comparación con las sustituciones PO únicas, mejorando así además las sustituciones Pl. La sustitución PO Nva también fue capaz de mantener mejor reactividad cruzada que PO V cuando se combina con la sustitución Trp P3, aunque los diversos parámetros de enlace fueron generalmente similares . EJEMPLO 35 REACTIVIDAD CRUZADA Y AVIDEZ FUNCIONAL DE ANÁLOGOS SUBSTITUIDOS EN TRES POSICIONES Sustituciones triples en Pl, P2, y P3; Pl, P2, y PO; P2, P3, y PO; y Pl, P3, y PO se hacen (Figura 21) . En todos los casos, la sustitución Pl fue Ala, la sustitución P3 fue Tip, y la sustitución PO Val o Nva. Como arriba, la afinidad al menos similar al péptido nativo se mantiene. Para Pl, P2, P3 clase Nva y NIe en P2 mejoró la estabilidad de enlace. Este análogo P2 Nva produjo una cantidad similar de IFN-gamma mientras el análogo NIe mostró un incremento substancial . Para la clase Pl, P2, PO, Nva y Val en P2 y PO en cualquier combinación mejoró la estabilidad de enlace. Este análogo P2 Nva PO Val también mostró un incremento substancial en producción de IFN-gamma. (Datos no mostrados) . Val en ambos P2 y PO en esta triple sustitución mostró estabilidad de enlace y producción de IFN-gamma que fue casi la mitad de aquella del péptido nativo. Para el grupo P2, P3, PO, solamente el análogo Nva/W/V mostró enlace mejorado de producción de IFN-gamma. Para los dos análogos Pl, P3, PO examinados por PO de Val o Nva mejoró la estabilidad de enlace. EJEMPLO 36 INMUNOGENICIDAD REACTIVA CRUZADA DE VARIOS ANÁLOGOS Los grupos de Ratones transgénicos HHD (n=8) se inmunizan con péptido (epítope natural PSMA288-297/ o análogos que llevan sustituciones en residuos de sujeción primarios y secundarios) por inoculación directa en los nodos linf inguinales, con 25µg en 25µl de PBS + 12.5µg de pI:C a cada nodo linf el día 0, 3, 14 y 17. Los ratones se sacrifican 10 días después del último refuerzo, y los esplenocitos se preparan y valoran para producción de IFN-? por análisis ELISPOT. Varios números de esplenocitos/cavidad se estimulan con lOµg/ml de péptido nativo en Placas ELISPOT revestidas con anticuerpo anti-IFN-?. 48 horas después de la incubación, el ensayo se desarrolla y la frecuencia de células T que producen citocina que reconocen péptido nativo PSMA288-297 se cuenta automáticamente. Los datos se representan en la Figura 22 como el número de colonias formadoras de mancha/cavidad (promedio de triplicados+SD) . Los datos muestran cebado incrementado de respuestas inmunes contra el epítope nativo logradas por los análogos I297V y P290 , con los otros análogos mostrando actividad ligeramente más alta (pero significativa) que el péptido nativo (l297Nva o G288Abu o L289Nle I297Nva). Al grado que la inmunogenicidad deficiente del epitope nativo refleja tolerancia, la actividad mejorada de estos análogos representa interrupción de tolerancia. EJEMPLO 37 AMPLIFICACIÓN POR EL ANÁLOGO I297V DE LA RESPUESTA A PSMA288- 297 INDUCIDA POR PLÁSMIDO Dos grupos de ratones transgénicos HHD (n=8) se inmunizan con plásmido que expresa PSMA28s-297 por inoculación directa en los nodos linf inguinales con 25µg en 25µl de PBS a cada nodo linf el día 0, 3, 14 y 17. Esto se sigue por dos refuerzos de péptido (25 µg) el día 28 y 31 con ya sea el péptido natural o el análogo I297V. Los ratones se sacrifican 10 dias después del último refuerzo, y los esplenocitos se preparan y valoran para producción de IFN-? por análisis ELISPOT. Varios números de esplenocitos/cavidad se estimulan con lOµg/ml de péptido nativo en placas ELISPOT revestidas con anticuerpo anti-IFN-?. 48 horas después de la incubación, el ensayo se desarrolla y la frecuencia de células T que producen citocina que reconoce el péptido PSMA288-297 se cuenta automáticamente. Los datos se representan en la Figura 23 como frecuencia de células T específicas normalizadas a 0.5 millones de células de respuesta (promedio de triplicados + SD) . Los datos muestran que irrespectivo del número de esplenocitos/cavidad, la frecuencia de células T especificas de epitope nativo fue considerablemente más alta en el grupo de ratones inmunizados con el análogo I297V. EJEMPLO 38 CITOTOXICIDAD EX VIVO CONTRA CÉLULAS DE TUMOR DE HUMANO Ratones transgénicos HHD (n=4) se inmunizan con plásmido que expresa el epitope PSMA288-_97 por inoculación directa en los nodos linf inguinales con 25µg en 25µl de PBS a cada nodo linf el dia 0, 3, 14 y 17. Esto se sigue por dos refuerzos de péptido (misma cantidad) el día 28 y 31, con el análogo I297V. Una semana después del refuerzo, los esplenocitos se estimulan ex vivo con el péptido nativo PSMA288-297 y se prueba durante la noche contra células de tumor de humano marcadas con 51Cr (Lncap, A2+ PSMA+; o 624.38 A2+ PSMA" o control 624.28 células A2" PSMA") en varias proporciones E:T. La inmunidad resultante fue efectiva para mediar la citotoxicidad contra LNCAP (Figura 24). EJEMPLO 39 VALIDACIÓN DE LA ANTIGENICIDAD DE PRAME425-433 Ratones transgénicos HHD (n=4) se inmunizan con péptido PRAME425-433 (25µg en 25µl de PBS, más 12.5µg de pI:C a cada nodo linf) el dia 0, 3, 14 y 17. Una semana después del refuerzo, los esplenocitos se estimulan ex vivo con el péptido nativo PRAME425-433 y prueban contra células de tumor de humano marcadas con 51Cr (PRAME+ A2+ 624.38 células de melanoma; o control negativo 624.38 células, deficiente en expresión A2 ) en varias proporciones E:T. Los resultados, se expresa como %lisis especifica (promedio+SEM) , mostraron que Células T especificas de PRAME fueron capaces de lisar las células de tumor de humano, confirmando el despliegue del epítope PRAME425_433 en MHC clase I de células tumorales en una manera que permite el ataque mediado inmune (Figura 25) . EJEMPLOS 40-48 PRUEBA DE ANÁLOGOS RAME425_433 Los análogos enlistados en las Figuras 26-28 se prueban para varias propiedades como afinidad mejorada y estabilidad de enlace, reactividad cruzada con el epitope nativo, e inmunogenicidad como sigue en los Ejemplos 40-48. Utilizando los procedimientos descritos en el Ejemplo 31, las caracteristicas de enlace a HLA-A*0201 de PRAME425433 y 69 análogos se valoran en comparación entre si. El control positivo para enlace fue melan-A_6-35 A27L. Las afinidades observadas de los análogos se reportan como % enlace (en comparación con el control positivo) y ED50, y la estabilidad de enlace como medio tiempo de disociación. La reactividad cruzada con el epitope nativo fue valorada al utilizar los péptidos de análogo para estimular la secreción de IFN-gamma de una línea de células T específica para el epítope nativo, esencialmente como se describe en el Ejemplo 6. Los datos mostrados en las Figuras 26-28 se generan al estimular con péptido de análogo en aproximadamente 0.3µM. Los resultados se recolectan de tres experimentos separados y se normalizan a la cantidad de IFN-? producida por el péptido nativo en cada uno. En algunos casos, los valores reportados son el promedio de dos determinaciones. Un asterisco "*" indica que la producción de IFN-? no fue distinguible de lo anterior. EJEMPLO 40 REACTIVIDAD CRUZADA Y AVIDEZ FUNCIONAL DE ANÁLOGOS SUBSTITUIDOS EN UNA POSICIÓN ÚNICA (FIGURA 26) Las sustituciones únicas de Val Mel, lie, NIe, Nva y Abu se hacen para Leu en la posición de sujeción primaria P2. Todos estos análogos mostraron % de enlace dentro de 20% del péptido nativo. ED50 para el análogo Met tuvo una afinidad comparable con el péptido nativo mientras las afinidades de los análogos Nva e lie se reducen dentro de aproximadamente 3 veces, pero aún fueron comparables con el epitope PSMA288_287. Todas las sustituciones P2 mantuvieron estabilidad de enlace al menos similar al péptido nativo.

Los análogos Met, NIe y Nva produjeron producción de IFN-? dentro de dos veces del péptido nativo y el análogo Val de alguna manera menos. La sustitución única de Lys, Phe, Tyr, Thr, Orn (ornitina), y Hse (homoserina) se hacen para Ser en la posición Pl. Todos estos análogos mostraron $ de enlace dentro del 20% del péptido nativo excepto para el análogo Phe que excedió el rango en el lado alto. ED50 para el análogo Lys se reduce por casi 6 veces, pero los otros cinco análogos tuvieron afinidades dentro de tres veces del péptido nativo. La estabilidad de enlace fue generalmente similar al péptido nativo con el análogo Phe Pl que muestra mayor estabilidad de enlace en este grupo con un medio tiempo de disociación de 17.7 horas en comparación con 12.2 horas para el péptido nativo. Con la excepción del análogo Lys Pl, que produjo 40% del IFN-? del péptido nativo, todos estos análogos se consideran reactivos ya que producen la producción de IFN-? dentro de dos veces del péptido nativo. Las sustituciones únicas de Val, lie, Ala, NIe, Nva, Abu se hacen a la posición de sujeción PO, así como también modificación día terminal carboxi por la adición de un grupo amida. Todos estos análogos mostraron % de enlace dentro de 20% del péptido nativo. Las mediciones ED50 variaron de más de 10 veces menos para la sustitución Ala a un valor comparable para la sustitución NIe; la sustitución Nva y la amida de terminal C también estuvieron dentro de 3 veces de ED50 para el péptido nativo. La estabilidad de enlace también fue generalmente similar con valores extremos del análogo Nva en el extremo alto, tl/2 de 17.2 horas, y la amida de terminal C en el extremo bajo con un tl/2 significativamente reducido de solamente 3 horas. Los análogos Val, lie, Ala y Abu PO mostraron reactividad cruzada menos preferida, pero los otros produjeron producción de IFN-? dentro de dos veces del péptido nativo. Sustituciones únicas en las posiciones principalmente que afectan interacciones TCR también se hacen: NIe, Nva y Abu en P3 y P6, y Ala, Ser y Sar en P8. El análogo Nva P6 produjo IFN-? dentro de dos veces de aquel del péptido nativo, a través del análogo Abu P6 fue cercano al 44%. - EJMPLO 41 REACTIVIDAD CRUZADA Y AVIDEZ FUNCIONAL DE ANÁLOGOS SUBSTITUIDOS EN DOS POSICIONES Los análogos de sustitución doble se crean en Pl y P2, P2 y PO, y Pl y PO utilizando varias combinaciones de las sustituciones únicas de arriba (Figuras 27A y 27B) . Ninguna de las sustituciones dobles P1-P2 examinadas tuvieron cambios radicales a afinidad de enlace o estabilidad, pero ninguna mostró reactividad cruzada significativa en el ensayo de IFN-?. Un patrón similar se observa con los análogos de sustitución doble P2-PO, sin embargo, el análogo L426Nva L433Nle mostró un nivel significativo de reactividad cruzada con el péptido nativo en el ensayo de IFN-? junto con sus características similares de enlace, de alguna manera mejoradas. Finalmente, para las sustituciones dobles Pl-PO, los análogos examinados también se conformaron al patrón general de tener al menos características de enlace similares, pero produciendo IFN-? insignificante en el ensayo de reactividad cruzada. Las excepciones en este grupo fueron el análogo S425F L433Nle, que mostró de alguna manera estabilidad de enlace mejorada y reactividad cruzada significativa, y el análogo S425F L433Nle, que tuvo más de cuatro veces ED50 reducido, un medio tiempo casi doble de disociación, y produjo más de IFN-? que el péptido nativo. EJEMPLO 42 REACTIVIDAD CRUZADA Y AVIDEZ FUNCIONAL DE ANÁLOGOS SUBSTITUIDOS EN TRES POSICIONES Cuatro análogos de sustitución triple se investigan, teniendo Phe o Thr en Pl, Nva o Met en P2, y NIe en PO. El análogo S425T L426M L433Nle tuvo afinidad similar mientras la afinidad se mejora para los otros tres análogos. Ambos análogos con sustituciones Nva P2 desplegaron estabilidad incrementada de enlace y niveles significativos de reactividad cruzada. Ver Figura 28. EJEMPLO 43 INMUNOGENICIDAD DE REACTIVIDAD CRUZADA DEL ANÁLOGO L426NVA L433NLE Dos grupos de ratones transgenicos HHD (n=8) se inmunizan con un plásmido pCTLR2 que expresa PRAME425-433, descrito en el ejemplo 49 abajo, por inoculación directa en los nodos linf inguinales de 25 µg en 25 µl de PBS a cada nodo linf el día 0, 3, 14 y 17. Esto se sigue por dos refuerzos de péptido (2.5µg) el día 28 y 31, de péptido nativo del análogo de epítope PRAME L426Nva L433Nle. Los ratones se sacrifican 10 días después del último refuerzo, y los esplenocitos se preparan y valoran para la producción de IFN-? después de estimulación m vi tro en 0.5xl06 células/cavidad, con lOµg/ml de péptido nativo. 48 horas después de la incubación, el sobrenadante se recolecta y la concentración de IFN-? en respuesta al péptido PRAME425-433 se mide por ELISA. Los datos se presentan en la Figura 29 y muestran una mejora significativa de producción de IFN-? en ratones reforzados con el análogo PRAME425_433 L426NvaL433Nle. EJEMPLO 44 CITOTOXICIDAD JN VIVO INDUCIDA POR EL ANÁLOGO L426NVA L433NLE Dos grupos de ratones transgénicos HHD (n=8) se inmunizan como se describe en el Ejemplo 43 arriba. Para evaluar las respuestas in vivo obtenidas contra el epitope nativo, los esplenocitos se aislan de los ratones HHD control cria e incuban con 20µg/mL o lµg/ml de péptido nativo por 2 horas. Las células se colorean entonces con fluorescencia CFSEhi y CFSEraed (4. OµM o lµM, respectivamente, por 15 minutos) e co-inyectaron intravenosamente en ratones inmunizados con un número igual de esplenocitos de control con fluorescencia CFSE10 (0.4µM). Dieciocho horas después la eliminación especifica de células objetivo se mide al remover los bazos y PBMC de animales con restos y medir la fluorescencia CFSE por citometría de flujo. La eliminación relativa de las poblaciones correspondientes a los esplenocitos cargados de péptido se calcula relativa a la población control (sin cargar) y expresan como %lisis específica. Los resultados en la Figura 30 mostraron inducción conservada de citotoxicidad cuando el análogo reemplazó el péptido natural como un agente de refuerzo. La tendencia indica que el análogo puede mejorar la inducción de inmunidad citotóxica. EJEMPLO 45 CITOTOXICIDAD IN VIVO Y COLORACIÓN DE TETRÁMERO Siete grupos de ratones transgénicos HHD (n=4) se inmunizan con un plásmido, pCTLR2, que expresa PRAME425_433 por inoculación directa en los nodos linf inguinales de 25 µg en 25 µl de PBS a cada nodo linf el dia 0, 3, 14 y 17. Esto se sigue por dos refuerzos de péptido (2.5µg) el dia 28 y 31, de péptido nativo, control negativo (péptido EAAGIGILTV (SEQ ID NO. 100)), o análogos de epítope PRAME425-433 que llevan mutaciones en los residuos de sujeción primaria y/o secundaria - S425F, L426Nva L433Nva, S425T L433Nle, y S425T L426Nva L433Nle. Para evaluar la respuesta in vivo contra péptido nativo, los esplenocitos se aislan de ratones HHD control cria e incuban con 0.2µg/ml o 20µg/ml de péptido nativo por 2 horas. Estas células se colorean entonces con fluorescencia CFSE (1 y 25µM, respectivamente, por 15 minutos) y co-inyectan intravenosamente en ratones inmunizados con un número igual de esplenocitos control coloreados con fluorescencia CFSE10 (0.4µM). Dieciocho horas después, la eliminación especifica de células objetivo se mide al remover el bazo de los animales con reto y medir la fluorescencia CFSE en las suspensiones celulares resultantes, por citometría de flujo. La eliminación relativa de las poblaciones correspondientes a los esplenocitos cargados con péptido se calcula relativa a la población control (sin cargar) y expresa como % lisis específica. Además, la frecuencia de células T específicas de PRAME425_433 se evalúa por co-coloración de tetrámero/CD8. El refuerzo con análogos que comprenden mutaciones en los residuos de sujeción primaria o secundaria mostró actividad inmune comparable en comparación con el péptido nativo, en base a la citotoxicidad in vivo y coloración de tetrámero. Los análogos fueron capaces de amplificar la respuesta inmune, como se muestra por comparación con el grupo "EAA", reforzado con un péptido irrelevante. En este aspecto, los análogos que comprenden S425F, L33Nle, L426Nva L433Nle, S425T L433Nle, o S425T L426Nva L433Nle fueron todos capaces de expandir' la inmunidad contra el epítope nativo, como se valora por citotoxicidad in vivo . Sin embargo, solamente los análogos L433Nle, L426Nva L433Nle y S425T L426Nva L433Nle expandieron el subconjunto de células T especifico contra el epitope nativo a un nivel significativamente más alto que en ratones cebados con plásmido y reforzados con el péptido de control negativo (Figura 31) . EJEMPLO 46 PRODUCCIÓN DE CITOCINA EX VIVO Tres grupos de ratones transgénicos HHD (n=4) se inmunizan con un plásmido, pCTLR2, que expresa PRAME425_433 por inoculación directa en los nodos linf inguinales de 25 µg en 25 µl de PBS a cada nodo linf el dia 0, 3, 14 y 17. Esto se sigue por dos refuerzos de péptido (2.5µg) el día 28 y 31, de los análogos de epítope PRAME L426Nva L433Nle y S425T L426Nva L433Nle o péptido Melan A de control negativo (EAAGIGILTV (SEQ ID NO. 100) ) . Los ratones se sacrifican 10 días después del último refuerzo, y los esplenocitos se preparan y valoran para producción de IFN-? por ELISA 48 horas después de la incubación con lOµg/ml de péptido nativo. Los datos se presentan en la Figura 32 como concentración de citocina en pg/ml (promedio de triplicados + SD) . Los datos mostraron producción de citocina ex vivo por esplenocitos de ratones reforzados con ambos análogos, y mayor respuesta a L426Nva L4233Nle que a S425T L426Nva L433Nle. EJEMPLO 47 CITOTOXICIDAD EX VIVO CONTRA LÍNEA DE CÉLULAS DE TUMOR HUMANA DESPUÉS DEL REFUERZO DE PÉPTIDO CON JFVNÁLOGO Ratones transgénicos HHD (n=4) se inmunizan con un plásmido, pCTLR2, que expresa PRAME425_433 por inoculación directa en los nodos linf inguinales de 25 µg en 25 µl de PBS a cada nodo linf el dia 0, 3, 14 y 17. Esto se sigue por dos refuerzos de péptido (2.5µg) el día 28 y 31, con el análogo L426Nva L433Nle. Una semana después del refuerzo, los esplenocitos se estimulan ex vivo con el péptido nativo y prueban contra células de tumor de humano marcadas con 51Cr (PRAME+ 624.38 células de melanoma pretratadas o no con IFN-?; o control negativo 624.38 células, deficientes en expresión HLA-A2 ) en varias proporciones E:T. El análogo L426Nva L433Nle produjo respuestas inmunes que median la citotoxicidad significativa contra células de tumor de humano que expresan A2 (624.38), ligeramente elevada en su pre-tratamiento con IFN?. En contraste, ninguna actividad significativa se mide contra A2-624.28 células control. Ver Figura 33. EJEMPLO 47 INMUNIZACIÓN IN VITRO A PRAME425_433 La inmunización in vi tro se lleva a cabo de acuerdo al esquema general presentado en la Figura 34. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se obtienen de donadores saludables (HLA-A*0201+) por separación Ficoll. PBMCs fresco (2.5xl06), junto con 5 ng/ml PRAME425-.3 o análogo de péptido se colocan en el medio de cultivo de célula T. subsecuentemente 20 IU/ml de interleuquina-2 se agrega a cada cavidad después de 72 y 96 horas y péptido adicional (5 ng/ml) se agrega el día 7. Los cultivos se mantienen por un adicional de 10 días antes de que las células efectoras se recolecten y utilicen en coloración de tetrámero. IVC PBMCs se marcan con tetrámero PRAME425-433 y analizan en FACSCalibur (BD, San José, CA) . Los cuadrantes se fijan en base a los controles negativos, coloreados con tetrámero HBV irrelevante y tetrámero SSX2, y un minimo de 10,000 eventos se capturan. Las células positivas en tetrámero se expresan como un porcentaje de la población de linfocito. Los tetrámeros específicos de PRAME425_433 se mejoran significativamente siguiendo IVS con análogo de péptido en comparación con el péptido nativo. Ver Figura 35. Esto demuestra que el análogo puede ser un inmunógeno preferible.

EJEMPLO 49 PCTLR2 , UN PLÁSMIDO QUE EXPRESA EL EPÍTOPE PRAME425-433 pCTLR2 es una vacuna de plásmido de ADN recombinante que codifica un polipéptido con un epitope CTL especifico de HLA A2 de PRAME, residuos de aminoácido 425-433, SLLQHLIGL (SEQ ID NO. 71), y una región de agrupamiento de epítope de PRAME, aminoácidos 422-509. La secuencia de cADN para el polipéptido en el plásmido está bajo el control de la secuencia promotora/mejoradota de citomegalovirus (CMVp) , que permite la transcripción eficiente del mensajero para el polipéptido en la toma por células que presentan antígeno. La señal de poliadenilación de hormona de crecimiento bovino (BGH polyA) en el extremo 3' de la secuencia de codificación proporciona señal para poliadenilación del mensajero para incrementar su estabilidad asi como también su transubicación fuera del núcleo en el citoplasma. Para facilitar el transporte de plásmido en el núcleo, una secuencia de importación nuclear (NIS) de virus Simian 40 se inserta en la estructura de plásmido. Una copia de motivo inmunoestimulador CpG se forma en el plásmido para respuestas inmunes de refuerzo adicionales. Por último, dos elementos genéticos procarióticos en el plásmido son responsables de la amplificación en E. coli, el gen de resistencia a kanamicina (Kan R) y el origen bacterial de pBM de réplica (Ver Figura 36) .

Secuencia de Producto de Traducción de Inmunógeno La secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado (150 residuos de aminoácido en longitud) se da abajo malqsllqhliglsnlthvlypvplesyedihgtlhlerlaylharlrellcelgrspsmv wlsanpcphcgdrtfydpepilepefmpnkrsllqhliglgdaaysllqhligli spekee ?ryiasllqhliglkrpsikrsllqhligl (SEQ ID NO. 196) . Los primeros 89 residuos de aminoácido son una región de agrupamiento de epítopes que representa PRAME 422-509. Dentro de esta región de agrupamiento de epítope, un número de epítopes CTL específicos de HLA A2 se han encontrado utilizando una variedad de algoritmos de predicción de epítope. Los residuos de aminoácido 90-150 son una secuencia de liberación de epítope (Synchrotope™) con cuatro copias de PRAME 425-433 epítope CTL (negritas) incorporadas. El flanqueo del epitope CTL PRAME definido son secuencias de aminoácido cortas que se ha mostrado que juegan un papel importante en el procesamiento del epítope CTL PRAME. Además, la secuencia de aminoácidos ispekeeqyia (SEQ ID NO. 197) (correspondiente a aminoácido PRAME 276-286, en cursivas) se forma en la región de cadena de perlas para facilitar la detección de expresión de polipéptido codificado. Utilizando una variedad de ensayos inmunológicos, incluyendo tetrámero, ELISPOT, ELISA y citotoxicidad, las respuestas de CTL fuertes especificas para epítope PRAME4_5-433 se han detectado de ratones transgenicos HLA-A2 inmunizados con el plasmido pCTLR2, sugiriendo potencia inmunogénica para pCTLR2. Estos datos indicaron que el plásmido se toma por células que presentan antígeno, el polipéptido codificado sintetizado y procesado proteolíticamente para producir el péptido de epítope de nonámero, y el péptido de epitope de nonámero HLA-A2 enlazado para presentación. Construcción de Plásmido La ligación paso a paso de conjuntos de oligonucleotidos complementarios resultó en la generación de cADN que codifica residuos de aminoácido en la secuencia de liberación de epitope "Cadena de perlas" (aminoácidos 90- 150) . Este núcleo de cADN lleva extremos cohesivos ' apropiados para enzimas de restricción que pueden utilizarse para ligación adicional con cADN que codifica la región de agrupamiento de epítope PRAME (aminoácido 1-89) , que se amplifica al realizar PCR en cADN que codifica PRAME como templado. La inserción completa se liga entonces en estructura de vector entre los sitios Aft II y Eco R I . La secuencia de codificación completa se verifica por secuenciación de ADN. EJEMPLO 50 GENERACIÓN DE RESPUESTAS DE CÉLULA T ESPECÍFICAS DE ANTÍGENO Los ratones HHD transgénicos de HLA-A2.1, H-2 clase I negativa se alojan bajo condiciones libres de patógeno y utilizan para evaluación de la inmunogenicidad de epitopes de linfocito de célula T (CTL) citotóxicos asociados a tumor de humano restringido a HLA-A2.1. Los ratones hembra de 8-12 semanas de edad se utilizan para inmunización intralinfática y para aislamiento de esplenocitos para estudios de citotoxicidad in vivo . Los ratones se inmunizan a través de inyección del nodo linf inguinal bilateral. Los ratones se anestesian por inhalación de isofluorano y las cirugías se conducen bajo condiciones especificas. Después de la preparación de cirugía, una incisión de 0.5 cm en longitud se hace en el doblez inguinal y el nodo linf inguinal se expone. Un volumen máximo de 25 µl (25µg) de vacuna de ADN de plásmido o péptido se inyecta directamente en el nodo linf utilizando una jeringa de insulina de 0.5 mL. La herida se cierra con suturas de piel de 6-0 nylon estériles. EJEMPLO 51 CITOTOXICIDAD EX VIVO CONTRA CÉLULAS DE TUMOR DE HUMANO Ratones transgénicos HHD (n=4/grupo) se inmunizan con el plásmido pSEM (descrito de manera más completa en la Solicitud de Patente de E.U. No. 10/292,413 (Pub. No. 20030228634 Al), que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad) que expresa epítope melan-A26-35 A27L por inoculación directa en los nodos linf inguinales con 25µg en 25µl de PBS/cada nodo linf el dia 0, 3, 14 y 17.

Esto se sigue por dos refuerzos de péptido adicionales (misma cantidad) el dia 28 y 31, con los análogos A27L, A27Nva o A27L V35Nva. Una semana después del refuerzo, los esplenocitos se estimulan ex vivo con el péptido melan-A26-_s nativo y prueba contra células de tumor de humano marcadas con 51Cr (624.38 células) en varias proporciones E:T. La inmunidad resultante después del refuerzo con los análogos A27L o A27Nva fue comparable y más efectiva que el péptido nativo EAAGIGILTV (SEQ ID NO. 100) (Figura 37) . Debido a que el plásmido de cebado expresa el análogo A27L, el experimento tuvo una desviación potencial en factor de ese péptido. De esta manera, la citotoxicidad substancial obtenida con el análogo A27Nva puede ser un subestimado de potencia si el cebado hace uso de esa misma secuencia. EJEMPLO 52 jftNÁLISIS DE TETRÁMERO La enumeración de células T específicas de antígeno CD8+ requiere reconocimiento cognado del receptor de célula T (TCR) por un MHC clase I/complejo de péptido. Esto puede hacerse utilizando tetrámeros MHC clase I que se componen de un complejo de cuatro moléculas HLA MHC Clase I cada una enlazada al péptido especifico y conjugado con una proteína fluorescente. De esta manera, los ensayos de tetrámero permiten la cuantificación de la población de célula T total especifica para un péptido dado compuesto en una molécula MHC particular. Además, debido a que el enlace no depende de las trayectorias funcionales, esta población incluye todas las células T CD8+ especificas sin considerar el estado funcional. La respuesta CTL en animales inmunizados se mide al co-colorear las células mononucleares aisladas de sangre periférica después de la centrifugación de densidad (Lymholyte Mammal, Cedarlane Labs) con HLA-A*0201 MARTI (ELAGIGILTV (SEQ ID NO. 100) ) -tetrámero MHC PE (Becjman Coulter, T01008) o un reactivo de tetrámero especifico de Tirosinasa369-377 (YMDGTMSQV (SEQ ID NO. 94)) (HLA-A*0201 Tirosinasa-PE, Beckman Coulter) y FITC anti-ratón de rata conjugado CD8a (Ly-2) anticuerpo monoclonal (BD Biosciences). Los datos se recolectan utilizando un citómetro de flujo BD FACS Calibur y analizan utilizando software cellquest al entrar a la población de linfocito y calcular el por ciento de células de tetrámero* dentro de la población CD8+ CTL. EJEMPLO 53 COLORACIÓN DE TETRÁMERO (CEBADO DE PLÁSMIDO, REFUERZO DE PÉPTIDO - NATIVO CONTRA ANÁLOGO) Dos grupos de ratones transgénicos HHD (n=8) se inmunizan con plásmido que expresa Tirosinasa 369-377 por inoculación directa en los nodos linf inguinales con 25 µg en 25 µl en PBS/cada nodo linf el dia 0, 3, 14 y 17. Esto se sigue por dos refuerzos adicionales (cantidad similar) el dia 28 y 31, de péptido natural o el análogo 377Nva. Diez días después, la respuesta inmune se monitorea utilizando un reactivo de tetrámero específico de Tirosinasa369-377 (HLA-A*0201 Tirosinasa-PE, Beckman Coulter) . Los ratones individuales sangran a través de la vena seno retro-orbital y PBMC se aislan utilizando centrifugación de densidad (Lympholyte Mammal, Cedarlane Labs) a 2000rpm por 25 minutos. PMBC se co-colorea con un anticuerpo especifico de ratón a CD8 (BD Bioscience) y el reactivo de tetrámero de Tirosinasa y porcentajes específicos se determinan por citometría de flujo utilizando un citómetro de flujo de calibre FACS (BD Biosciences). Los porcentajes de células CD8+ específicos de Tirosinasa muestran que el reemplazo del péptido nativo con el análogo conservó la expansión del subconjunto especifico de Tirosinasa. La tendencia indica que el análogo puede mejorar la expansión de las células T especificas de Tirosinasa (Figura 38). EJEMPLO 54 CITOTOXICIDAD IN VIVO Y COLORACIÓN DE TETRÁMERO (COMPARACIÓN DE CABEZA A CABEZA ENTRE PÉPTIDO NATIVO Y UN PANEL DE CANDIDATOS ANÁLOGOS) Cuatro grupos de ratones transgénicos HHD (n=6) se inmunizan con plásmido (pSEM) que expresa epítopes Tirosinasa369-377 y Melan-A_6_35 A27L por inoculación directa en los nodos linf inguinales de 25 µg de plásmido en 25µl de PBS por nodo linf el dia 0, 3, 14 y 17. Esto se sigue por dos refuerzos de péptido (cantidad similar) los dias 28 y 31, de Melan-A26_35 A27L en el nodo linf inguinal izquierdo y análogos de Tirosinasa369-377, llevando sustituciones en los residuos de sujeción primaria y/o secundaria en el nodo linf derecho. Como controles, los ratones inmunizados con plásmido solamente o ratones puros se utilizan. Para evaluar la respuesta in vivo contra epitopes naturales de Tirosinasa y Melan A, los esplenocitos se aislan de ratones HHD control cria e incuban por separado con 20 µg/ml de péptido natural (Melan-A25-35 o Tirosinasa369-.377) por 2 horas en medio libre de suero HL-1 (Cambrex) en una concentración de 20xl05 células/mL. Estas células se colorean entonces con CFSE (kit indicador de célula Vybrant CFDA SE, Molecuar Probes) (1 y 2.5µM respectivamente, por 15 minutos) e intravenosamente se co-inyectan en ratones HHD control puro o inmunizados con un número igual de esplenocitos revestidos no péptido de control coloreados con fluorescencia CFSE10 (0.4µM). Dieciocho horas después la eliminación específica de células objetivo se mide al remover el bazo de animales con reto y medir fluorescencia CFSE en las suspensiones celulares resultantes por citometría de flujo. La eliminación relativa de las poblaciones correspondiente a esplenocitos cargados con péptido se calcula relativa a la población control (sin cargar) y expresa como % lisis específica. Además, la frecuencia de células T específicas de Tirosinasa369-377 y Melan-A26-.5, se evalúa por co-coloración de tetrámero/CD8 (tetrámeros HLA-A*0201, Beckman Coulter) . El análogo de tirosinasa V377Nva fue capaz de expandir la población de células T específicas de tirosinasa y amplificar la inmunidad citotóxica, similarmente al péptido nativo y mayor que el análogo de Tirosinasa M370V V377Nva (Figura 39) . EJEMPLO 55 CITOTOXICIDAD EX VIVO CONTRA CÉLULAS DE TUMOR DE HUMANO Ratones transgénicos HHD (n=4/grupo) se inmunizan (de acuerdo al procedimiento general en la Figura 40) con plásmido (pSEM) que expresa epítope Tirosinasa 69-377 por inoculación directa en los nodos linf inguinales de 25 µg de plásmido en 25µl de PBS por nodo linf el dia 0, 3, 14 y 17. Esto se sigue por dos refuerzos de péptido (misma cantidad) el dia 28 y 31, con el péptido nativo o análogos llevando sustituciones en residuos de sujeción primaria P2 y PO (370 y 377). Una semana después del refuerzo, los esplenocitos se estimulan ex vivo con el péptido de Tirosinasa369-_7 y ensayan contra células de tumor de humano marcadas con 51Cr (624.38 células) en varias proporciones E:T. Tanto el péptido nativo como el análogo M370V V377Nva generaron citotoxicidad robusta contra 624.38 células (Figura 41). Mientras hubo alguna dilución de actividad citolítica con el péptido nativo, no hubo ninguna con el análogo, reforzando asi la indicación de mayor inmunogenicidad obtenida de los resultados de tetrámero en el Ejemplo 52. Junto con el ejemplo precedente, esta observación ilustra la utilidad de complementar ensayos más exigentes (citotoxicidad in vivo y coloración de tetrámero) con ensayos más sensibles (citotoxicidad ex vivo después de estimulación ín vitro) para resaltar análogos potencialmente útiles . EJEMPLO 56 CARACTERIZACIÓN DE ESTABILIDAD Y ENLACE (MEDIA VIDA) DE PÉPTIDOS NATIVOS Y ANÁLOGOS POR SISTEMA ITOPIA Debido a que el enlace y la estabilidad de los péptidos enlazados a los complejos MHC 1 son esenciales para obtener una buena respuesta inmune, los epítopes nativos y análogos de los mismos se prueban por su enlace y estabilidad (T_/2) a moléculas MHC Clase I restringidas a A0201 utilizando Sistema de descubrimiento de Epitope iTopia (también tratado en el Ejemplo 31) . El enlace y fórrate (T_/2) se determina para seis epítopes activos y sus análogos que se diseñan para mejorar la respuesta inmune. Los péptidos nativos y análogos son como sigue: NY-ESO-l_57-_65, NY-ESO-l?57-i65 (Ll58Nva, C165V)), Melan-A26-35, Melan-A26-35 (A27Nva) , SSX-24?-49, SSX-24?-49 (A42V), Prame425-433, Prame425-433 (L426Nva, L433Nle) , Tirosinasa369-377, Tirosinasa369-377 (V377Nva) , PSMA288_297 (I297V) . La Tabla 10 (abajo) muestra los valores promedio de enlace de péptido y estabilidad o vida media de seis análogos y sus péptidos nativos. Los análogos de SSX-241-49 y NY-ESO-I157-165 mostraron un incremento marginal en el porcentaje de enlace de los péptidos en comparación con los péptidos nativos. Melan A26_35 (A27Nva) mostró incremento substancial en la estabilidad (vida media) en comparación con el péptido nativo. El incremento significativo en la estabilidad se observa para otros análogos Psma288-297 (I297V), NY-ESO-l?57-?65 (L158Nva, C165V), Prame25-4 3 (L426Nva, L433Nle) y SSX-241_47 (A42V) . No se observan diferencias significativas en la vida media del análogo Tirosinasa69-377 (V377Nva) en comparación con el péptido nativo. Las diferencias observadas en la vida media de los análogos puede deberse a la diferencia en el mecanismo de enlace de cada análogo a las moléculas MHC1.

TABLA 10 LOS VALORES PROMEDIO DE POR CIENTO DE ENLACE Y LA ESTABILIDAD (VIDA MEDIA) DE PÉPTIDOS NATIVOS Y SUS ANÁLOGOS Los diversos métodos y técnicas descritas arriba proporcionan un número de maneras para llevar a cabo la invención. Por supuesto, debe entenderse que no necesariamente todos los objetivos o ventajas descritas pueden lograrse de acuerdo con cualquier modalidad particular descrita en la presente. De esta manera, por ejemplo, aquellos expertos en la materia reconocerán que los métodos pueden realizarse en una manera que logra u optimiza una ventaja o grupo de ventajas como se enseñan en la presente sin lograr necesariamente otros objetivos o ventajas como puede enseñarse o sugerirse en la presente. Una variedad de alternativas ventajosas y desventajosas se mencionan en la presente. Debe entenderse que algunas modalidades preferidas específicamente incluyen una, otras, o varias características ventajosas, mientras otras específicamente excluyen una, otra o varias características desventajosas, mientras otras específicamente mitigan una característica desventajosa presente por inclusión de una, otra, o varias características ventajosas . Además, el experto reconocerá la aplicación de varias características de diferentes modalidades. De manera similar, los diversos elementos, caracteristicas y etapas tratadas arriba, asi como otras equivalentes conocidas para cada tal elemento, característica o etapa, pueden mezclarse y acoplarse por un experto en la materia para realizar métodos de acuerdo con los principios descritos en la presente. Entre los diversos elementos, caracteristicas, y pasos algunos se incluirán específicamente y otros se excluirán específicamente en diversas modalidades. Aunque la invención se ha descrito en el contexto de ciertas modalidades y ejemplos, se entenderá por aquellos expertos en la materia que la invención se extiende más allá de las modalidades específicamente descritas a otras modalidades alternativas y/o usos y modificaciones y equivalentes de los mismos. Muchas variaciones y elementos alternativos de la invención se han descrito. Aún variaciones adicionales y elementos alternos serán aparentes para un experto en la materia. Entre estas variaciones, sin limitación, están el número específico de antígenos en un panel de selección u objetivo por un producto terapéutico, el tipo de antígeno, el tipo de cáncer, y el (los) antígenos (s) particular (es) especificado (s) . Varias modalidades de la invención pueden incluir específicamente o excluir cualquiera de estas variaciones o elementos. En algunas modalidades, los números que expresan cantidades de ingredientes, propiedades tales como peso molecular, condiciones de reacción, y así sucesivamente, utilizados para describir y reivindicar ciertas modalidades de la invención deben entenderse como modificándose en algunos casos por el término "aproximadamente" . De acuerdo con lo anterior, en algunas modalidades, los parámetros numéricos se establecen en la descripción escrita y reivindicaciones anexas son aproximaciones de que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas pensadas a obtenerse por una modalidad particular. En algunas modalidades, los parámetros numéricos deben construirse en vista del número de dígitos significativos reportados y al aplicar técnicas de redondeo ordinarias. Sin importar que los rangos numéricos y parámetros que establecen el alcance amplio de algunas modalidades de la invención son aproximaciones, los valores numéricos establecidos en los ejemplos específicos se reportan de manera tan precisa como práctica. Los valores numéricos presentados en algunas modalidades de la invención pueden contener ciertos errores que resultan necesariamente de la desviación estándar encontrada en sus mediciones de prueba respectivas. En algunas modalidades, los términos "un" y "una" y "el/la" y referencias similares utilizadas en el contexto de describir una modalidad particular de la invención (especialmente en el contexto de ciertas de las siguientes reivindicaciones) pueden construirse para cubrir tanto el singular como el plural. La citación de rangos de valores en la presente meramente propone servir como un método corto para referirse individualmente a cada valor separado que cae dentro del rango. Al menos que se indique de otra manera en la presente, cada valor individual se incorpora en las especificaciones como si se citarán individualmente en la presente. Todos los métodos descritos en la presente pueden realizarse en cualquier orden adecuado al menos indicado de otra manera en lá presente o de otra manera claramente contradictoria por contexto. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o lenguaje ejemplificativo (e.g., "tal como") proporcionado con respecto a ciertas modalidades en la presente se propone meramente ilustrar mejor la invención y no posee una limitación en el alcance de la invención de otra manera reivindicada. Ningún lenguaje en la especificación debe construirse como indicando cualquier elemento no reivindicado esencial para la práctica de la invención. Los agrupamientos de elementos alternativos o modalidades de la invención descritas en la presente no deben construirse como limitaciones. Cada número de grupo puede referirse y reivindicarse individualmente o en cualquier combinación con otros miembros del grupo u otros elementos encontrados en la presente. Se anticipa que uno o más miembros de un grupo pueden incluirse en, o eliminarse de, un grupo de razones de conveniencia y/o patentabilidad. Cuando cualquier tal inclusión o eliminación ocurre, la especificación en la presente parece contener el grupo como se modifica, cumpliendo de esta manera la descripción escrita de todos los grupos Markush utilizados en las reivindicaciones anexas. Las modalidades preferidas de la invención se describen en la presente, incluyendo el mejor modo conocido para los inventores para llevar a cabo la invención. Las variaciones en aquellas modalidades preferidas serán aparentes a aquellos de experiencia ordinaria en la materia en la lectura de la descripción anterior. Se contempla que los expertos puedan emplear tales variaciones según sea apropiado, y la invención puede practicarse de otra manera que la descrita específicamente en la presente. De acuerdo con lo anterior, muchas modalidades de esta invención incluyen todas las modificaciones y equivalentes de la materia sujeto citada en las reivindicaciones anexas a la misma según se permite por la ley aplicable. Además, cualquier combinación de los elementos arriba descritos en todas las variaciones posibles de los mismos se comprende por la invención al menos que se indique de otra manera en la presente o se contradice claramente de otra manera por contexto . Además, numerosas referencias se han hecho a patentes y publicaciones impresas a través de esta especificación. Cada una de las referencias arriba citadas y publicaciones impresas se incorporan individualmente en la presente para referencia en su totalidad. En conclusión, debe entenderse que las modalidades de la invención descritas en la presente son ilustrativas de los principios de la presente invención. Otras modificaciones que pueden emplearse pueden estar dentro del alcance de la invención. De esta manera, a manera de ejemplo, pero no limitación, la configuración alternativa de la presente invención puede utilizarse de acuerdo con las enseñanzas en la presente. De acuerdo con lo anterior, la presente invención no se limita a lo que se muestra y describe de manera precisa.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un péptido aislado que consiste esencialmente de una secuencia en la cual: PO es X, XX, o XXX, en donde X especifica cualquier aminoácido o no aminoácido; y Pl es S, K, F, Y, T, Orn, o Hse; y P2 es L, V, M, I, Nva, NIe, o Abu; y P3 es L, Nva, NIe o Abu; y P4 es Q; y P5 es H; y P6 es L, Nva, NIe, o Abu; y P7 es I; y P8 es G, A, S, o Sar; y PO en P9 es L, V, I, A, Nle, Nva, Abu, o L-NH2; y PO+1 es X, XX, o XXX, en donde X especifica cualquier aminoácido o no aminoácido; y en donde la secuencia no es SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 71) . 2. El péptido aislado de la reivindicación 1 que consiste esencialmente de la secuencia: {K, F, Y, T, Orn, o Hse}LLQHLIGL (SEQ ID NO: 72); o S{V, M, I, Nva, NIe, o AbuJLQHLIGL (SEQ ID NO: 73); o SL{Nva, NIe o AbuJQHLIGL (SEQ ID NO: 74); o SLLQH{Nva, NIe o Abu}IGL (SEQ ID NO: 75); o SLLQHLI{A, S, o Sar}L (SEQ ID NO: 76); o SLLQHLIG f V , I , A, NIe , Nva , Abu , o L-NH2 } ( SEQ I D NO : 77 ) ; o {F, Y, T, Orn, o Hse} {Nva, Nle, M, o I}LQHLIGL (SEQ ID NO: 78) ; o S{Nva, NIe, o M} LQHLIG{Nva, NIe, o V} (SEQ ID NO: 79); o {K, F, Y, T, Orn, o Hse}LLQHLIGV (SEQ ID NO: 80); o {F o T}LLQHLIG(Nle} (SEQ ID NO: 81); o {F o T} {Nva o M}LQHLIG{Nle} (SEQ ID NO: 82) . 3. El péptido aislado de la reivindicación 2 que consiste esencialmente de la secuencia: {F, Y, T, Orn, o Hse.LLQHLIGL (SEQ ID NO: 83); o S{Nva, NIe, o MJLQHLIGL (SEQ ID NO: 84); o SLLQHLIG{Nle, Nva, o L-NH2} (SEQ ID NO: 85); o SLLQH{Nva o Abu} IGL (SEQ ID NO: 86); o S {Nva}LQHLIG{Nle} (SEQ ID NO: 87); o {F o T} {L o Nva}LQHLIG{Nle} (SEQ ID NO: 88) . 4. El péptido aislado de la reivindicación 3 que consiste esencialmente de la secuencia: S{L o Nva}LQHLIG{Nle} (SEQ ID NO: 89); o T{Nva}LQHLIG{Nle} (SEQ ID NO: 90) . 5. El péptido aislado de la reivindicación 4 que consiste esencialmente de la secuencia: S {Nva} LQHLIG{Nle } (SEQ IDNO: 87) . 6. El péptido aislado de la reivindicación 1, en donde el péptido tiene afinidad para una hendidura de enlace de péptido de MHC clase I. 7. El péptido aislado de la reivindicación 6, en donde MHC clase I es HLA-A2. 8. Un péptido aislado que comprende de 1 a 3 sustituciones en la secuencia SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 71) que tiene una afinidad para una hendidura de enlace de MHC clase I que es similar o mayor que la afinidad de SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 71) para dicha hendidura de enlace de MHC clase I. 9. El péptido aislado de la reivindicación 8, en donde el tiempo medio de disociación es similar o mayor que el tiempo medio de disociación de SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 71) de dicha hendidura de enlace de MHC clase I . 10. El péptido aislado de la reivindicación 8, que se reconoce por células T con especificidad para el péptido SLLQHLIGL (SEQ ID NO:71). 11. Un MHC clase I/complejo de péptido, en donde el péptido tiene la secuencia del péptido de la reivindicación 1. 12. El MHC clase I/complejo de péptido de la reivindicación 11, que es reactivo cruzado con TCR que reconoce un MHC clase I/complejo de PRAME425-33. 13. El MHC clase I/complejo de péptido de la reivindicación 12, en donde el MHC clase I/complejo es un complejo de HLA-A2/PRAME425_433. 14. Un polipéptido que comprende las secuencias de péptidos de la reivindicación 1 incorporadas dentro de una secuencia de liberación. 15. Una composición inmunogénica que comprende el péptido de la reivindicación 1. 16. Una composición inmunogénica que comprende el polipéptido de la reivindicación 14. 17. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la reivindicación 14. 18. Un medio de ácido nucleico para expresar el péptido de la reivindicación 1. 19. Una composición inmunogénica que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 17 o 18. 20. Un método para inducir, mantener, o amplificar una respuesta CTL que comprende la administración intranodal de la composición de la reivindicación 15. 21. Un método para producir una respuesta de célula T restringida a MHC clase I que comprende la administración intranodal de la composición de la reivindicación 15, y un agente de inmunopotenciación . 22. Un método para inducir, mantener, o producir una respuesta CTL que comprende la administración intranodal de la composición de la reivindicación 19. 23. Un péptido aislado que consiste esencialmente de una secuencia en la cual: PO es X,. XX, o XXX, en donde X especifica cualquier aminoácido o no aminoácido; y Pl es G, A, S, Abu, o Sar; y P2 es L, M, I, Q, V, Nva, NIe, o Abu; y P3 es P o ; y P4 es S; y P5 es I; y P6 es P; y P7 es V; y P8 es H; y P9 es P, A, L, S, o T; y PO en PÍO es I, L, V, Nva, o NIe; y PO+1 es X, XX, o XXX, en donde X especifica cualquier aminoácido o no aminoácido; y en donde la secuencia no es GLPSIPVHPI (SEQ ID NO. 42) . 24. Un péptido aislado que consiste esencialmente de la secuencia: {S, Sar, o Abu}LPSIPVHPI (SEQ ID NO. 43); o G{M o Nle}PSIPVHPI (SEQ ID NO. 44); o G{L, I, Nva, o Nle} SIPVHPI (SEQ ID NO. 45); o GLWSIPVHP {Nva o V} (SEQ ID NO. 46); o GLPSIPVH{A o S}I (SEQ ID NO. 47); o GLPSIPVHP{V, L, Nva, o NIe} (SEQ ID NO. 48); o G{Nle}PSIPVHP {Nva, o NIe} (SEQ ID NO. 49); o G{Nva}PSIPVHP{Nva} (SEQ ID NO. 50); o G{V, Nva, o Nle}PSIPVHPV (SEQ ID NO. 51); o {Sar o Abu}LPSIPVHP {V o Nva} (SEQ ID NO. 52); o A{V, I, Nva, o Nle}WSIPVHPI (SEQ ID NO. 53); o AVPSIPVHP{V o Nva} (SEQ ID NO. 54); o A{Nva}PSIPVHPV (SEQ ID NO. 55); o AL SIPVHP{V o Nva} (SEQ ID NO. 56); o GV SIPVHP{V o Nva} (SEQ ID NO. 57); o G{Nva} WSIPVHPV (SEQ ID NO. 58) . 25. Un péptido aislado que consiste esencialmente de la secuencia: {Abu}LPSIPVHPI (SEQ ID NO. 59); o G{V, Nva, o Abu}PSIPVHPI (SEQ ID NO. 60); o GLPSIPVHP{V o Nva} (SEQ ID NO. 61); o GLWSIPVHP{I o Nva} (SEQ ID NO. 62); o G{Nle}PSIPVHP{Nva} (SEQ ID NO. 63); o G{Nle o Nva}PSIPVHPV (SEQ ID NO. 64); o {A o Abu}LPSIPVHP{V o Nva} (SEQ ID NO. 65); o G{Nva} PSIPVHP {I o V} (SEQ ID NO. 66); o A{Nva o Nle} SIPVHPI (SEQ ID NO. 67); o A{V o Nva}PSIPVHPV (SEQ ID NO. 68). 26. El péptido aislado de la reivindicación 25 que consiste esencialmente de la secuencia: {Abu}LPSIPVHPI (SEQ ID NO. 59); o GLPSIPVHP{V o Nva} (SEQ ID NO. 61); o GL SIPVHPI (SEQ ID NO. 69); o G{Nle}PSIPVHP {Nva} (SEQ ID NO. 63). 27. El péptido aislado de la reivindicación 26 que consiste esencialmente de la secuencia: GLPSIPVHPV (SEQ ID NO. 70) . 28. El péptido aislado de la reivindicación 23, en donde el péptido tiene afinidad para una hendidura de enlace de péptido de MHC clase I. 29. El péptido aislado de la reivindicación 28, en donde MHC clase I es HLA-A2. 30. Un MHC clase I/complejo de péptido en donde el péptido tiene la secuencia del péptido de la reivindicación 23. 31. El MHC clase I/complejo de péptido de la reivindicación 30, que es reactivo cruzado con TCR que reconoce un MHC clase I/complejo de PSMA288-297. 32. El MHC clase I/complejo de péptido de la reivindicación 31, en donde MHC clase I/complejo es un complejo de HLA-A2/PSMA288_297. 33. Un polipéptido que comprende las secuencias de péptidos de la reivindicación 23 incorporadas dentro de una secuencia de liberación. 34. Una composición inmunogénica que comprende el péptido de la reivindicación 23. 35. Una composición inmunogénica que comprende el polipéptido de la reivindicación 33. 36. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la reivindicación 33. 37. Un medio de ácido nucleico para expresar el péptido de la reivindicación 23. 38. Una composición inmunogénica que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 36 o 37. 39. Un método para inducir, mantener, o amplificar una respuesta CTL que comprende la administración intranodal de la composición de la reivindicación 34. 40. Un método para producir una respuesta de célula T restringida a MHC clase I que comprende la administración intranodal de la composición de la reivindicación 33 y un agente de inmunopotenciación. 41. Un método para inducir, mantener, o producir una respuesta CTL que comprende la administración intranodal de la composición de la reivindicación 38. 42. Un péptido aislado que comprende de 1 a 3 sustituciones en la secuencia GLPSIPVHPI (SEQ ID NO. 42) que tiene una afinidad para una hendidura de enlace de MHC clase I que es similar o mayor que la afinidad de GLPSIPVHPI (SEQ ID NO. 42) para dicha hendidura de enlace de MHC clase I. 43. El péptido aislado de la reivindicación 42, en donde el tiempo medio de disociación es similar o mayor que el tiempo medio de disociación de GLPSIPVHPI (SEQ ID NO. 42) de dicha hendidura de enlace de MHC clase I . 44. El péptido aislado de la reivindicación 42, que se reconoce por células T con especificidad para el péptido GLPSIPVHPI (SEQ ID NO. 42) . 45. Un análogo de péptido aislado de un péptido inmunogénico expresado por un plásmido pSEM que consiste esencialmente de la secuencia: E{A, L, Nva, Nle }AGIGILT { V, Nva, NIe} (SEQ ID NO: 91); o Y{M, V, Nva, NIe } DGTMSQ{ V, Nva, NIe} (SEQ ID NO: 92); y en donde la secuencia no es E{A, L}AGIGILTV (SEQ ID NO: 93) o YMDGTMSQV (SEQ ID NO: 94) . 46. El análogo de péptido aislado de la reivindicación 45, en donde dicho análogo de péptido se selecciona del grupo que consiste de ELAGIGILTNva (SEQ ID NO: 95), ENvaAGIGILTV (SEQ ID NO: 96), YVDGTMSQNva (SEQ ID NO: 97), YVDGTMSQV (SEQ ID NO: 98) y YMDGTMSQNva (SEQ ID NO: 99). 47. El análogo de péptido aislado de la reivindicación 46, que consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos ENvaAGIGILTV (SEQ ID NO: 96) . 48. El análogo de péptido aislado de la reivindicación 46, que consiste esencialmente de la secuencia YMDGTMSQNva (SEQ ID NO: 99) . 49. El análogo de péptido aislado de la reivindicación 45, en donde el péptido tiene afinidad para una hendidura de enlace de péptido de MHC clase I . 50. El análogo de péptido aislado de la reivindicación 49, en donde MHC clase I es HLA-A2. 51. Un análogo de péptido aislado que comprende de 1 a 3 sustituciones en la secuencia EAAGIGILTV (SEQ ID NO: 100) que tiene una afinidad para una hendidura de enlace de MHC clase I que es similar o mayor que la afinidad de EAAGIGILTV (SEQ ID NO: 100) para dicha hendidura de enlace de MHC clase I. 52. El péptido aislado de la reivindicación 51, en donde el tiempo medio de disociación es similar o mayor que el tiempo medio de disociación de EAAGIGILTV (SEQ ID NO: 100) de dicha hendidura de enlace de MHC clase I . 53. El péptido aislado de la reivindicación 51, que se reconoce por células T con especificidad para el péptido EAAGIGILTV (SEQ ID NO: 100) . 54. Un análogo de péptido aislado que comprende de 1 a 3 sustituciones en la secuencia YMDGTMSQV (SEQ ID NO: 94) que tiene una afinidad para una hendidura de enlace de MHC clase I que es similar o mayor que la afinidad de YMDGTMSQV (SEQ ID NO: 94) para dicha hendidura de enlace de MHC clase I . 55. El péptido aislado de la reivindicación 54, en donde el tiempo medio de disociación es similar o mayor que el tiempo medio de disociación de YMDGTMSQV (SEQ ID NO: 94) de dicha hendidura de enlace de MHC clase I . 56. El péptido aislado de la reivindicación 54, que se reconoce por células T con especificidad para el péptido YMDGTMSQV (SEQ ID NO: 94). 57. Un MHC clase I/complejo de péptido, en donde el péptido tiene la secuencia del péptido de la reivindicación 1. 58. El MHC clase I/complejo de péptido de la reivindicación 57, que es reactivo cruzado con TCR que reconoce un MHC clase I/complejo de Melan-A26-35 • 59. El MHC clase I/complejo de péptido de la reivindicación 58, en donde MHC clase I/complejo es un complejo de HLA-A2/Melan-A26-35 • 60. El MHC clase I/complejo de péptido de la reivindicación 57, que es reactivo cruzado con TCR que reconoce un MHC clase I/complejo de Tirosinasa369-377. 61. El MHC clase I/complejo de péptido de la reivindicación 60, en donde el MHC clase I/complejo es un complejo de HLA-A2/Tirosinasa369-377. 62. Un polipéptido que comprende las secuencias de péptidos de la reivindicación 45 incorporadas dentro de una secuencia de liberación. 63. Una composición inmunogénica que comprende cualquiera de los péptidos de la reivindicación 45. 64. Una composición inmunogénica que comprende el polipéptido de la reivindicación 62. 65. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la reivindicación 62. 66. Una composición inmunogénica que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 65. 67. Un método para inducir, mantener, o amplificar una respuesta CTL que comprende la administración intranodal de la composición de la reivindicación 63. 68. Un método para producir una respuesta de célula T restringida a MHC clase I que comprende la administración intranodal de la composición de la reivindicación 63 y un agente de inmunopotenciación. 69. Un método para inducir, mantener, o producir una respuesta CTL que comprende la administración intranodal de la composición de la reivindicación 66.