MX2007015292A

MX2007015292A - Anticuerpos monoclonales anti-trkb y sus usos.

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Publication number: MX2007015292A
Application number: MX2007015292A
Authority: MX
Inventors: Xiang-Yang Tan; Seongeun Cho; Davinder Singh Gill; Ming Diana Qian
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2005-06-06
Filing date: 2006-06-05
Publication date: 2008-02-21
Also published as: TW200722437A; KR20080032070A; WO2006133164A2; EP2298813A2; NI200700315A; AU2006255101A1; US20110150893A1; GT200600240A; PA8678401A1; US20070059304A1; BRPI0610938A2; AR053401A1; NZ563941A; IL187710A0; ECSP077978A; EP2298813A3; CA2610771A1; CN101273064A; WO2006133164A3; JP2008545781A

Abstract

La presente invencion proporciona anticuerpos monoclonales para el TrkB humano. En algunas modalidades los anticuerpos de la invencion se unen y activan el TrkB humano. En algunas modalidades de la invencion los anticuerpos son selectivos para el TrkB humano ya que no se unen (ni activan) el TrkA humano o el TrkC humano. En algunas modalidades los anticuerpos monoclonales presentan reactividad cruzada con TrkB murina. Versiones humanizadas o figuradas de los anticuerpos tambien son consideradas. Las composiciones farmaceuticas que comprenden los anticuerpos de la invencion son proporcionadas como metodos para preparar los anticuerpos y metodos de la invencion para utilizar los mismos con propositos de tratamiento, deteccion y purificacion.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-TRKB Y SUS USOS ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los receptores de la tirosina cinasa Trk son receptores transmembrana-únicos de dominio múltiple que desempeñan un papelimportante en un amplio espectro de respuestas neuronales incluyendo la supervivencia , la diferenciación , el crecimiento y la regeneración . Éstos son receptores de alta afinidad para las neurotrof inas , una familia de factores de crecimiento de proteínas , que incluye el factor de crecimiento del tej ido nervioso (NGF, por sus siglas en inglés ) , factor neurotróf ico derivado del cerebro ( BDNF, por sus siglas en inglés ) , neurotrof ina-3 (NT-3 ) y neurotrof ina-4 /5 (NT-4 / 5 ) . Las neurotrof inas comparten características estructurales altamente conservadas, no obstante su secuencia de aminoácidos única permite a cada elemento producir interacciones de gran afinidad con el dominio extracelular de los receptores Trk específicos, particularmente TrkA, B o C. De esta manera, el NGF es un ligando preferido para los TrkA; BDNF y NT-4/5 son los ligandos preferidos para los TrkB; y NT-3 ha demostrado que se une a los TrkC, aún cuando también parece que se une a los TrkA y TrkB con afinidades menores . Entre los receptores Trk, el rol de TrkB ha sido bien caracteri zado en el sistema nervioso central ( SNC , por sus siglas en inglés ) . Los TrkB están ampliamente distribuidos en el cerebro , incluyendo el neocórtex , Ref . : 188216 hipocampo, cuerpo estriado, formación olfatoria y tronco cerebral. Utilizando el BDNF como un ligando consanguíneo y el rol indispensable de TrkB en la supervivencia neuronal, la diferenciación y la neuro-regeneración se han mostrado en un número de modelos neurodegenerativos, incluyendo apoplejía, lesión de la médula espinal, axotomía y ALS (esclerosis lateral amiotrófica) . A través de varios análisis de señalización y sistemas de bloqueo del receptor, las respuestas del BDNF han demostrado depender de la unión y activación de TrkB. Como se ha señalado, los receptores Trk son proteínas transmembrana individuales de dominio múltiple. Estos consisten de un dominio extracelular con capacidad de unión al ligando, una región transmembrana, y un dominio intracelular tirosina cinasa. El dominio extracelular está compuesto de un motivo rico en leucina flanqueado por dos agrupaciones de cisteína y dos dominios tipo inmunoglobulina (Ig). Los receptores Trk han demostrado que interactúan con sus ligandos principalmente a través del segundo dominio tipo Ig, aún cuando, se ha propuesto, la contribución de otras regiones tales como un motivo rico en leucina y el primer dominio Ig en el acoplamiento ligando. Se han resuelto las estructuras cristalinas de los dominios de unión al ligando-receptor de los receptores Trk, así como también, los complejos. La interfaz ligando-receptor parece consistir de dos parches: uno para un motivo de unión conservada compartida entre todas las neurotrofinas y la otra específica para cada neurotrofina. Mediante la unión de las neurotrofinas a los receptores Trk, ocurre la dimerización del receptor y los cambios de conformación subsiguientes, los cuales se cree que conducen a la activación del dominio de la tirosina cinasa intracelular. Existen varias tirosinas conservadas en el dominio intracelular de los receptores Trk. La fosforilación del lazo o bucle auto regulador del dominio cinasa activa la actividad de la cinasa, y la fosforilación de otros residuos promueve la señalización, creando sitios de acoplamiento para las proteínas del adaptador que se acoplan con estos receptores a las cascadas de señalización intracelular, incluyendo el paso de la proteína cinasa (ERK, por sus siglas en inglés) de la señal regulada extracelular/Ras, la vía cinasa Pl3K/Akt y la fosfolipasa C-gamma. Aunque con alguna superposición, estas vías individuales están involucradas en las actividades biológicas discretas: Ras/MAPK regula la diferenciación y proliferación neuronal, las vías de PI3K/Akt controlan las dinámicas de actina y supervivencia y PLC gamma está involucrada en la movilización del calcio. Hasta la fecha, no existen ejemplos exitosos de reactivos que actúen como agonistas de TrkB in vivo potentes y selectivos. Mientras la BDNF, es una proteína recombinante, que ha demostrado incrementar la supervivencia neuronal y la neuro-regeneración en un número de modelos degenerativos del SNC in vi tro e in vivo, los resultados de la terapia de la proteína BDNF en clínicas ha sido negativa, más probablemente porque la BDNF tiene una vida media corta in vivo. Por lo tanto, existe en la técnica, la necesidad de obtener reactivos farmacéuticos que actúen como agonistas de TrkB, in vivo que sean potentes y selectivos. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales para TrkB humano. En ciertas modalidades los anticuerpos de la invención se unen y activan los TrkB. En ciertas modalidades los anticuerpos de la invención son selectivos para TrkB humano, ya que, se unen preferentemente a TrkB sobre los TrkA humanos o TrkC humanos. En algunas modalidades los anticuerpos monoclonales de la invención reaccionan en forma cruzada con los TrkB murinos. La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de estos anticuerpos. La invención proporciona, además, métodos para la preparación de los anticuerpos monoclonales de la invención. En versiones humanizadas o figuradas de los anticuerpos de la invención también quedan comprendidos los hibridomas que producen los anticuerpos de la invención. La invención proporciona, además, métodos para usar estos anticuerpos monoclonales como agonistas de TrkB. En ciertas modalidades los anticuerpos monoclonales son utilizados como agonistas de TrkB humano. De acuerdo con tales modalidades, los anticuerpos monoclonales pueden ser utilizados para tratar condiciones que requieren la activación de TrkB, incluyendo las condiciones neurológicas. La invención proporciona, además, métodos para detectar TrkB en una muestra y los métodos para purificar TrkB a partir de una muestra utilizando los anticuerpos de la invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras ÍA a 1D-2 representan actividades del anticuerpo específico-TrkB en suero inmune de cinco ratones inmunizados (M1-M5) . La unión del suero inmune que resulta de un ensayo ELISA con una proteína recombinante que incluye el dominio extracelular de TrkB humano fusionado con la región Fc de la IgGl humana (rhTrkB-EDC-Fc) se muestran en (figura ÍA) . La unión del suero inmune que resulta de un ensayo ELISA con una proteína recombinante gue incluye el dominio extracelular de TrkB murino (rmTrkB-EDC) se muestran en (fig. IB) . La extensión en la cual el suero inmune puede bloquear la interacción de rhTrkB-EDC-Fc y BDNF en una competencia de ensayo ELISA se muestra en (fig. ÍC) . La unión de suero inmune a la superficie rhTrkB en células HEK-293 se muestra en (figuras ID, 1D-1, 1D-2) .

Las Figuras 2A-2B representan los resultados del control obtenidos con neurotrofinas en una prueba de actividad luciferasa que utiliza células HEK-293 que expresan para la superficie rhTrkB. Estos resultados muestran que el ensayo puede representar selectivamente la activación de TrkB. Las Figuras 3A-3C representan los resultados obtenidos con suero inmune en la misma prueba de actividad luciferasa que en las Figuras 2A-2B. Estos resultados muestran que la incubación de las células hTrkB con secreción inmune incrementó significativamente las señales de luciferasa en una manera dependiente de la dosis. Las Figuras 4A-4B representan los resultados obtenidos con ciertos anticuerpos TrkB en la misma prueba de actividad luciferasa que en las Figuras 2A-2B. Todos los anticuerpos causaron un incremento dependiente de la dosis en la señal con una EC50 en el rango de 10~10 (M) . La ventana de señal máxima fue de ~7 veces sobre la base de referencia para la mayoría de los anticuerpos, la cual fue comparable a la respuesta inducida por la BDNF a 200 ng/ml (6.2 veces sobre la base de referencia) . Las Figuras 5A-5D representan los resultados obtenidos con ciertos anticuerpos TrkB en una prueba de desarrollo de neurita. El ensayo utilizó células SY5Y de neuroblastoma humana, que son conocidas por expresar la diferenciación neuronal. La adición de BDNF y de la mayoría de los anticuerpos promovió el desarrollo de neurita como se demostró a través del incremento en la longitud de la neurita (fig. 5A) y el número de puntos de ramificación (fig. 5B) . Las imágenes representativas de unos pocos grupos de tratamiento se muestran en (fig. 5C) . Los resultados de un análisis de respuesta de dosis completa obtenidos para un subconjunto de estos anticuerpos se muestran en (fig. 5D) . La Figura 6 representa los resultados obtenidos con ciertos anticuerpos TrkB en un ensayo de neuroprotección. El ensayo mide la supervivencia de las células SY5Y diferenciadas seguido de un daño por pérdida de suero. Los resultados muestran que el BDNF y varios anticuerpos de células SY5Y diferenciadas protegidas, demostrando un incremento de dosis dependiente en la viabilidad de la célula . Las Figuras 7A-7C representan algunos de los resultados obtenidos cuando tres anticuerpos anti-TrkB, 18C3, 29D7 y 17D11, los cuales demuestran unirse al TrkB (rmTrkB) murino recombinante, se sometieron a prueba en cultivos de neuronas de granulo cerebelar de rata (CGN) para la actividad contra el receptor TrkB endógeno de ratas. Los resultados se muestran para una prueba de desarrollo de neurita y una prueba de neuroprotección (solamente 29D7). La Figura 8 muestra los resultados obtenidos cuando ciertos anticuerpos anti-TrkB se evaluaron en un análisis Western para la inducción de autofosforilación de TrkB. Todos los anticuerpos se dirigieron a una fosforilación de TrkB contundente, y estos efectos se antagonizaron mediante un tratamiento con el inhibidor cinasa K252a, indicando que estos anticuerpos de unión TrkB causaron la activación de TrkB. Las Figuras 9A, 9A-1, 9A-2 y 9B representan los resultados de una prueba de unión (fig. 9A) TrkA FACS y una prueba de actividad luciferasa (fig. 9B) que se obtuvieron con ciertos anticuerpos anti-TrkB. Estos resultados muestran que los anticuerpos de la invención no se unen o activan las células TrkA humanas . La Figura 10 representa los resultados obtenidos cuando ciertos anticuerpos anti-TrkB se evaluaron en un ensayo de actividad de luciferasa TrkC. Estos resultados muestran que los anticuerpos de la invención no activan las células TrkC humanas . La Figura 11 representa el modelo de la hipoxia-isquemia neonatal (Hl) en roedores que está basada en el procedimiento de Levine. La Figura 12 representa la secuencia aminoácido de TrkB humano, No. de acceso GEN BANK NP_006171 (SEC ID NO:l). La Figura 13 representa la secuencia aminoácido de TrkB murino, No. de acceso GEN BANK Pl5209(SEC ID NO : 2 ) .

La Figura 14 representa la secuencia aminoácido de TrkB de ratas SEC ID NO : 3 ) . La Figura 15 representa la secuencia aminoácido TrkB de pollos (SEC ID NO: 4). La Figura 16 representa la secuencia aminoácido de TrkA humanos (SEC ID NO: 5) . La Figura 17 representa la secuencia aminoácido de los TrkC humanos (SEC ID NO: 6). La Figura 18 muestra los datos ELISA de unión fago a partir de un conjunto representativo de TrkB positivo scFv clones (Selección de movimiento horizontal de la biblioteca BMV) . Las Figuras 19-19D muestran la especificidad de unión de anticuerpos scFv seleccionados TrkB probados, usando el ensayo FACS. Los datos muestran que los anticuerpos scFv seleccionados de TrkB reaccionan con la membrana asociada de TrkB de una manera específica (histogramas rellenos) sin ninguna reactividad-cruzada para el control de células (histogramas abiertos) . Las Figuras 20A-20B muestran los resultados de la unión ELISA para el anticuerpo 29D7 IgG y su fragmento Fab con TrkB humano (fig. 20A) y ratones (fig. 20B) . Ambos igG y Fab totales de 29D7 mostraron las actividades de unión dependiente de la dosis y TrkB humano y de ratones. Sin embargo, el valor de la ED50 del Fab fue alrededor de 100 veces más bajo que aquel del 27D7 intacto. Ni un control isotipo IgGl, ni su fragmento Fab se unió al TrkB. La Figura 21 muestra la actividad de luciferasa en células HEK-293 medida 16 horas después del tratamiento con 29D7 IgG o 29D7 Fab. Ambos IgG y Fab totales de 29D7 indujeron actividades de luciferasa dependiente de la dosis, indicando la activación de TrkB. Sin embargo, el valor EC50 de la 29D7 Fab fue alrededor de 27 veces más alto que los de 27D7 IgG (0.083 nM y 2,28 nM para 27D7 IgG y 29D7 Fab, respectivamente) . Ni el control isotipo IgGl ni sus fragmentos Fab tuvo efectos en la activación de TrkB. La Figura 22 muestra los resultados a partir de una representación del análisis epítopo de los anticuerpos monoclonales anti-TrkB 17D11, 29D7, 7F5, 11E1 y 19E12. El anticuerpo monoclonal 17D11 reconoció el lazo-3 del segmento IgG-2 de TrkB humano (KNEYGKD, SEC ID NO: 7, los aminoácidos 364 a 370 de la SEC ID NO:l); y lazo-1 del segmento IgG-2 de TrkB humano (KGNPKP, SEC ID NO: 8, aminoácidos 308 a 313 de la SEC ID NO:l). Los anticuerpos monoclonales 29D7, 7F5, 11E1 y 19E12 reconocieron todos el lazo-3 del segmento IgG-1 de TrkB humano (ENLVGED, SEC ID NO: 10, aminoácidos 269 a 275 de la SEC ID NO:l); y pueden reconocer también el lazo-1 del segmento IgG-1 de TrkB humano (AGDPVP, SEC ID NO: 11, aminoácidos 221 a 226 de la SEC ID NO:l). La Figura 23 compara las manchas que fueron obtenidas a partir del cuerpo estriado y el hipocampo para diferentes tratamientos después de la lesión hipóxica-isquémica (Hl) . Las Figuras 24A-24B comparan la pérdida total del tejido cerebral (A) y la pérdida del tejido sub-regional (B) para diferentes tratamientos después de la lesión Hl . Los datos se muestran como promedios y un error estándar del promedio (S.E.M.). Los BDNF y el anticuerpo monoclonal anti-TrkB 29D7 mostraron una protección dependiente de la dosis significativa del cerebro contra el daño Hl. La protección no se localizó en ninguna sub-región específica del cerebro pero se observó una mayor protección en la corteza. La Figura 25 muestra los resultados de una prueba de degradación DEVD-AMC que se usó para determinar las actividades caspasa-3 para diferentes tratamientos después de la lesión Hl. Los resultados para diferentes regiones del cerebro se muestran como la media ± S.E.M. El BDNF y el anticuerpo monoclonal anti-TrkB 29D7 bloquearon la activación caspasa-3 causada por la lesión Hl . La Figura 26 muestra las inmunotinciones de las muestras de proteína tomadas de ratas que recibieron diferentes tratamientos después de la lesión Hl. Las muestras se separaron por SDS-PAGE y se sometieron a inmunotinción con anticuerpos contra ciertos substratos caspasa-3 (PARP y espectrina-a) . Los anticuerpos contra la actina-ß se usaron como controles para verificar la carga equivalente de proteínas. Los resultados mostraron que la degradación de estos substratos caspasa-3 fueron inhibidos por el BDNF y el anticuerpo monoclonal anti-TrkB 29D7 (C = contra a I = ipsi lados de la ligadura de la carótida) . La Figura 27 muestra las inmunotinciones de muestras de proteínas tomadas de ratas normales después de una inyección intracerebroventricular de anticuerpos 29D7 anti-TrkB (o vehículo como control) . Las muestras se tomaron 1, 2, 6, 12 y 24 horas después de la inyección. Las muestras se separaron por SDS-PAGE y se sometieron a inmunotinción con anticuerpos específicos en proteínas que son fosforiladas como un resultado de la activación de TrkB (fosfo-ERKl/2 y fosfo -AKT) . Los anticuerpos contra la actina-ß se usaron como controles para verificar la carga equivalente de proteínas. Los resultados mostraron que el anticuerpo monoclonal 29D7 anti-TrkB indujo la forforilación, dependiente del tiempo de ERK1/2 y AKT (se muestran datos de muestras del hipocampo y corticales que son representativos de los resultados obtenidos de otras cuatro muestras) . La Figura 28 es una cuantificación densitométrica de la fosforilación del ERK mostrada en la Figura 27. La Figura 29 es una cuantificación densitométrica de la fosforilación de AKT mostrada en la Figura 27. La Figura 30 muestra el vehículo y los tejidos cerebrales tratados 29D7 que han sido fijados y el marcado por inmunofluorescencia con un anticuerpo para el marcador neuronal específico NeuN (izquierda) y un anticuerpo anti-fosfo -ERK1/2 (centro) . Las figuras del lado derecho muestran estos dos fusionados. La fosforilación de ERK1/2 es significativamente más fuerte en las muestras tratadas con 29D7. La Figura 31 muestra el desarrollo en el tiempo de la activación de ERK1/2 en los tejidos del hipocampo y corticales seguidos de la inyección intracerebroventricular del anticuerpo monoclonal 29D7 anti-TrkB. Las Figuras 32A-32B muestran la inhibición dependiente de la dosis del desarrollo de la neurita de las neuronas granulares cerebelares primarias causada por (fig. 32A) MAG y (fig. 32B) mielina. Las Figuras 33A-33B muestra la inhibición mediada por la neurita de (fig. 33A) MAG y (fig. 33B) mielina, invertida causada por el anticuerpo monoclonal 29D7 anti-TrkB. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención radica en parte, en el entendimiento que los anticuerpos monoclonales que unen específicamente al dominio extracelular del receptor TrkB podría dimerizar de TrkB y ser suficiente para inducir la activación del receptor y la respuesta biológica similar a aquellas mediadas por el BDNF. Los anticuerpos monoclonales representan en general una clase única de proteínas que tiene diversas utilidades en investigación, diagnóstico médico, y en el tratamiento clínico de enfermedades. Ventajosamente, se piensa que los anticuerpos monoclonales tienen mayor estabilidad farmacocinética que las proteínas recombinantes, tales como la BDNF, permitiendo de esta manera lograr efectos farmacológicos sostenibles que tienen un beneficio significativo en aplicaciones clínicas. Por ejemplo, los actuales usos aprobados clínicamente de las medicaciones de anticuerpos monoclonales incluyen la prevención del rechazo del trasplante de órganos, tratamiento de cánceres (por ejemplo, de mamas, colon, linfoma no-Hodgkins, leucemia) , artritis reumatoide, profilaxis contra la enfermedad del virus sincitial respiratorio, enfermedad de Crohn, intervención coronaria percutánea y el asma. Otras aplicaciones médicas para el tratamiento de una variedad de enfermedades humanas con anticuerpos monoclonales están, actualmente, también en pruebas clínicas. Los efectos biológicos de estos anticuerpos monoclonales son generalmente conducidos por eventos de bloqueo o la neutralización molecular ejercidos por los ligandos endógenos, actuando, de esta manera, principalmente como antagonistas de alta afinidad. En la presente invención, los anticuerpos monoclonales son utilizados como agonistas que simulan los efectos biológicos de las interacciones ligando-receptor. 1 . Anticuerpos monoclonales e hibridomas En un aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos monoclonales que se unen al TrkB humano (SEC ID N0:1). En ciertas modalidades, estos anticuerpos se unen al TrkB humano (SEC ID N0:1) con una ED50 en el rango de alrededor de 10 pM hasta alrededor de 500 nM, por ejemplo, en el rango de alrededor de 10 pM hasta alrededor de 1 nM, alrededor de 10 pM hasta alrededor de 100 pM, o alrededor de 10 pm hasta alrededor de 50 pM. Como se utiliza aquí el término "alrededor de" se define que incluye variaciones de ±15%. En una modalidad los anticuerpos de la invención son también agonistas de TrkB humano. En ciertas modalidades, estos anticuerpos activan el TrkB humano (SEC ID NO:l) con una EC50 en el rango de alrededor de 10 pM hasta alrededor de 500 nM, por ejemplo en el rango de alrededor de 10 pM hasta alrededor de 1 nM, alrededor de 10 pM hasta alrededor de 100 pM, o alrededor de 10 pM hasta alrededor de 50 pM. En una modalidad, los anticuerpos de la invención son selectivos para el TrkB humano (SEC ID NO:l) en el sentido que se unen preferentemente al TrkB (SEC ID NO:l) sobre los TrkA humanos (SEC ID NO: 5) o los TrkC humanos (SEC ID NO: 6) . En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención no se unen a los TrkA humanos o a los TrkC humanos. Como se define aquí, un anticuerpo de la invención "no se une" al TrkA humano (SEC ID NO: 5) o al TrkC humano (SEC ID NO: 6) si este anticuerpo exhibe una unión no detectable con estos receptores en concentraciones sobre alrededor de 1 nM, por ejemplo, sobre alrededor de 10 nM, sobre alrededor de 100 nM o sobre alrededor de 1 µM. En una modalidad, los anticuerpos de la invención son selectivos para el TrkB humano en el sentido que no activan los TrkA humanos (SEC ID NO: 5) o los TrkC humanos (SEC ID NO: 6) . Como se definió aquí, un anticuerpo de la invención "no activa" los TrkA humanos (SEC ID NO: 5) o los TrkC humanos (SEC ID NO: 6) si este causa una activación no detectable con estos receptores en concentraciones sobre alrededor de 1 nM, por ejemplo sobre alrededor de 10 nM, sobre alrededor de 100 nM o sobre alrededor de 1 µM. En una modalidad, los anticuerpos de la invención bloquean la unión entre la BDNF y el TrkB humano (SEC ID NO:l) con IC50 en el rango de alrededor de 100 pM hasta alrededor de 500 nM, por ejemplo, en el rango de alrededor de 100 pM hasta alrededor de 1 nM, o alrededor de 100 pM hasta alrededor de 500 pM. En otras modalidades estos anticuerpos no bloquean la unión entre la BDNF y el TrkB humano (SEC ID NO:l) . Como se definió aquí, un anticuerpo de la invención "no bloquea" la unión entre la BDNF y el TrkB humano (SEC ID N0:1) si este exhibe una actividad de bloqueo no detectable en concentraciones sobre alrededor de 1 nM, por ejemplo, sobre alrededor de 10 nM, sobre alrededor de 100 nM o sobre alrededor de 1 µM. En ciertas modalidades los anticuerpos de la invención pertenecen a un isotipo IgG, por ejemplo, el isotipo IgGl, IgG2a o IgG2b. En otro aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos monoclonales con cualquiera de las propiedades anteriores y que, además, se unen y/o activan el TrkB de ratón (SEC ID N0:2). En ciertas modalidades, estos anticuerpos se unen y/o activan el TrkB de ratón (SEC ID NO: 2) con una ED50 en el rango de alrededor de 10 pM hasta alrededor de 500 nM, por ejemplo, en el rango comprendido entre alrededor de 10 pM hasta alrededor de 1 nM, incluyendo en el rango de alrededor de 10 pM hasta alrededor de 500 pM y el rango de alrededor de 10 pM hasta alrededor de 100 pM. En otro aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos monoclonales con cualquiera de las propiedades anteriores y que, además, se unen a uno o más epítopos específicos de TrkB humano (SEC ID N0:1) y opcionalmente uno o más epítopos específicos de TrkB de ratón (SEC ID NO:2). En ciertas modalidades, estos anticuerpos se unen a uno o ambos epítopos de TrkB humano con la secuencia KNEYGKD (SEC ID NO: 7, aminoácidos 364 a 370 de la SEC ID NO:l) y KGNPKP (SEC ID N0:8, aminoácidos 308 a 313 de la SEC ID N0:1). En una modalidad, estos anticuerpos también se unen a uno o ambos epítopos de TrkB de ratón con la secuencia KNEYGKD (SEC ID NO:7, aminoácidos 364 a 370 de la SEC ID N0:2) y RGNPKP (SEC ID NO:9, aminoácidos 308 a 313 de la SEC ID NO:2). En otras modalidades, la presente invención proporciona anticuerpos que se unen a un epítopo de TrkB humano con la secuencia ENLVGED (SEC ID NO: 10, aminoácidos 269 a 275 de la SEC ID NO:l) y opcionalmente un epítopo de TrkB humano con la secuencia AGDPVP (SEC ID NO: 11, aminoácidos 221 a 226 de la SEC ID NO:l). En una modalidad, estos anticuerpos también se unen a un epítopo de TrkB de ratón con una secuencia ENLVGED (SEC ID NO:10, aminoácidos 269 a 275 de la SEC ID NO:2). En aún otro aspecto, la presente invención proporciona hibridomas que producen cualquiera de estos anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, se proporcionan hibridomas depositados en el ATCC el 18 de Agosto de 2005, a los cuales se les otorgó la designación de depósito de patente ATCC PTA-6948 (17D11) y PTA-6949 (29D7). En aún otro aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos monoclonales que son producidos por los hibridomas que fueron depositados en el ATCC el 18 de Agosto de 2005 y que tienen las designaciones de depósito de patente ATCC PTA-6948 (17D11) y PTA-6949 (29D7), respectivamente. La presente invención también proporciona anticuerpos que bloquean la unión de estos anticuerpos y, por lo tanto, que comparten el mismo epítopo de unión en TrkB humano (SEC ID N0:1) . 2. Preparación de los anticuerpos monoclonales e hibridomas Debe entenderse que los anticuerpos monoclonales de la invención pueden ser preparados por medio de cualquier método conocido. Por ejemplo, estos pueden prepararse, utilizando tecnología sintética, recombinante o hibridoma (por ejemplo, como se describió en An ticuerpos : A Labora tory Manual , Ed. por E. Harlow y D. Lañe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 o An ticuerpos monoclonales : Principies and Practice por J.W. Goding, Academic Press, 1996). En particular, se apreciará que los anticuerpos de la invención pueden ser preparados inmunizando inicialmente a un animal con TrkB humano o un derivado del mismo (por ejemplo, una proteína recombinante que incluye el dominio extracelular de TrkB humano) y luego preparando monoclonales a partir de hibridomas preparados adecuadamente. Según un aspecto, los anticuerpos monoclonales de la presente invención se prepararon por medio de la tecnología hibridoma estándar utilizando al menos dos inmunógenos de proteínas que se derivaron de proteínas TrkB de diferentes especies. Por ejemplo, el inmunógeno puede incluir un primer inmunógeno que se derivó de TrkB humano y un segundo inmunógeno que se derivó de TrkB no-humano. Preferentemente, cada inmunógeno incluye el dominio extracelular de TrkB. En ciertas modalidades los al menos dos inmunógenos se combinan como una mezcla para los propósitos de inmunización. En una modalidad, el primero de estos inmunógenos es una proteína recombinante que incluye el dominio extracelular (ECD) de TrkB humano. El ECD de TrkB humano está comprendido de residuos aminoácidos C32-H430 de todo el largo de la proteína (que se indica como SEC ID NO:l en Figura 12, GenBank No. de acceso NP_006171) . Se hace notar que todas las proteínas y las secuencias de ácido nucleico que están presentes a contar de la fecha de ingreso en la base de datos del GenBank, SwissProt, EMBL o cualquier base de datos disponible públicamente están incorporadas en esta descripción como referencia (incluyendo sin limitación las secuencias de las neurotrofinas, por ejemplo, NGF, BDNF, NT-3, NT-4/5, etcétera). El segundo inmunógeno es una proteína recombinante que incluye el dominio extracelular (ECD) de TrkB murino. El ECD de TrkB murino está conformado de residuos aminoácidos C32-H429 de todo el largo de la proteína (que se indica como SEC ID NO: 2 en la Figura 13, GenBank No. de acceso P15209). Aquellos expertos en la técnica apreciarán que los inmunógenos adecuados que incluyen estos dominios pueden ser preparados utilizando la tecnología recombinante estándar (por ejemplo, ver Protocols in Molecular Biology Ed. por Ausubel y otros, John Wiley & Sons, New York, NY, 1989 y Molecular Cloning: A Labora tory Manual Ed. Por Sambrook y otros, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, 1989, cuyos contenidos se incorporan en esta descripción como referencia) . En ciertas modalidades, los inmunógenos primero y segundo se administran en una proporción (en peso) que es mayor que alrededor de 1. Por ejemplo, la proporción puede ser de alrededor de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más. En una modalidad la proporción es mayor que alrededor de 5. En una modalidad la proporción es alrededor de 10. En una modalidad los inmunógenos primero y segundo son administrados simultáneamente como una mezcla. En una modalidad, uno o ambos inmunógenos incluyen versiones de sus respectivos dominios extracelulares que difieren levemente de los dominios que ocurren naturalmente. Por ejemplo, los aminoácidos en el terminal N- o C- del dominio extracelular pueden estar ausentes. Alternativamente unos pocos aminoácidos dentro de la secuencia que ocurre naturalmente pueden estar mutados. Preferentemente estas mutaciones son sustituciones conservativas. Debe entenderse que estas versiones que no ocurren naturalmente deben incluir una secuencia aminoácido que es al menos un 95%, preferentemente al menos un 96%, más preferentemente al menos un 97%, aún más preferentemente al menos un 98% e incluso más preferentemente al menos un 99% idénticas a los dominios extracelulares que se encuentran en la SEC ID N0:1 o en la SEC ID N0:2. En ciertas modalidades, el primero y/o el segundo inmunógenos no incluyen alguno de los aminoácidos que se encuentran fuera del dominio extracelular de TrkB (por ejemplo, ellos no incluyen los aminoácidos que se encuentran en los dominios de la transmembrana y/o intracelular de TrkB) . En ciertas modalidades, los inmunógenos pueden incluir uno o más terminales aminoácidos que están ausentes de las proteínas TrkB que ocurren naturalmente. En particular, el aminoácido terminal puede ser incorporado para incrementar la expresión de la proteína recombinante, como una consecuencia del vector usado para la expresión, etcétera. Además, los segmentos aminoácidos que están ausentes de la proteína alérgeno pueden ser incorporados al terminal amino y/o carboxilo de la proteína recombinante, por ejemplo, marcadores para purificación, rótulos para detección, marcadores para incrementar la solubilidad del alérgeno recombinante, marcadores que incrementan la estabilidad de los inmunógenos, fusión con una proteína no relacionada o un proteína portadora adyuvante, etcétera. Un sitio de degradación proteolítica puede ser inducido en la bifurcación de los segmentos aminoácidos y la proteína recombinante terminal para permitir la remoción de los segmentos agregados después que la proteína recombinante ha sido purificada, absorbida, etcétera. Las modificaciones terminales utilizadas en la tecnología recombinante se describen en Current Protocols in Molecular Biology Ed. de Ausubel y otros, John Wiley & Sons, New York, NY, 1989 y Molecular Cloning: A Labora tory Manual Ed. de Sambrook y otros, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, 1989. En una modalidad, los inmunógenos primero y segundo tienen la misma composición que los dos inmunógenos que se describieron en los Ejemplos y que fueron obtenidos a partir de R&D systems, Inc. (Cat. No. 397-TR/CF y 1494-TB/CF, respectivamente) . En ciertas modalidades, el primer inmunógeno es como se describió anteriormente pero el segundo inmunógeno incluye el dominio extracelular (ECD) de TrkB de especies no-humanas diferentes de la murino (por ejemplo, rata, pollo, conejo, etcétera). El ECD de TrkB de rata está comprendido de residuos aminoácidos C32-H429 de todo el largo de la proteína (que se indica como la SEC ID NO: 3 en la Figura 14, GenBank No. de acceso NP_036863) . El ECD de TrkB de pollo está comprendido de residuos aminoácidos C32-T428 de todo el largo de la proteína (que se indica como la SEC ID NO: 4 en la Figura 15, GenBank No. de acceso CAA54468) . Una vez que se han preparado los inmunógenos adecuados, los inmunógenos son inyectados dentro de una amplia variedad de animales (por ejemplo, ratones, lauchas, conejos, etcétera) . En una modalidad los inmunógenos son inyectados en ratones como se describió en los Ejemplos. Por ejemplo, los inmunógenos son inyectados subcutáneamente e intraperitonealmente con un adyuvante Freund completo. En ciertas modalidades, cada animal es inyectado subcutáneamente en sitios diferentes múltiples. En esta etapa, las proteínas recombinantes pueden servir como inmunógenos sin modificación adicional. Alternativamente, una respuesta inmune superior puede desarrollarse si las proteínas recombinantes están unidas a una proteína portadora adyuvante, tal como, albúmina de suero bovino o hemocianina de la lapa californiana (KLH) . Los inmunógenos son inyectados dentro del hospedante animal, preferentemente de acuerdo con un calendario predeterminado incorporando uno o más reforzadores de inmunización y los animales son sangrados periódicamente. Por ejemplo, en ciertas modalidades, uno o más reforzadores de inmunización son administrados de manera intravenosa. La unión entre el suero inmune y el primer (y opcionalmente el segundo) inmunógeno es entonces evaluada opcionalmente para confirmar que un título adecuado de anticuerpos se ha elevado. Los anticuerpos monoclonales que son específicos para uno o más inmunógenos pueden ser preparados mediante cualquier un método estándar. Por ejemplo, se puede usar la técnica de Kohier y Milstein, Eur . J. Immunol . 6:511, 1976 y mejoras a la misma. Brevemente, estos métodos generalmente incluyen la preparación de líneas de células inmortales capaces de producir anticuerpos que tienen la especificidad deseada. Tales líneas celulares pueden ser producidas, por ejemplo, a partir de las células del bazo de uno o más animales inmunizados como se describió anteriormente. Las células del bazo son luego inmortalizados, por ejemplo, por fusión con un compañero de la célula mieloma, preferentemente una que es genéticamente idéntica con el animal inmunizado. En ciertas modalidades los animales con un suero adecuado son reforzados una o más veces con el primer y/o el segundo inmunógeno antes que las células del bazo se remuevan. Una variedad de técnicas de fusión pueden ser empleadas. Por ejemplo, las células del bazo y las células mieloma pueden ser combinadas con un detergente no iónico por unos cuantos minutos y luego colocada en placas a baja densidad en un medio selectivo que sustente el crecimiento de las células híbridas, pero no las células mieloma. Una cierta solución técnica utiliza una selección HAT (hipoxantina, aminopterina timidina) . Después de un tiempo suficiente, usualmente alrededor de 1 a 2 semanas, se observan las colonias de híbridos. Las colonias únicas son seleccionadas y sus sobrenadantes de cultivo ensayados para la actividad de unión contra el primer (y opcionalmente el segundo) inmunógeno, como se describió anteriormente. Los anticuerpos monoclonales pueden ser aislados de sobrenadantes de colonias de crecimiento de hibridomas. Además, se pueden emplear varias técnicas para mejorar el rendimiento, tal como una inyección de la línea celular hibridoma dentro de la cavidad peritoneal de un huésped vertebrado adecuado, tal como un murino. Los anticuerpos monoclonales pueden ser luego cosechados del líquido ascítico o la sangre. Los contaminantes pueden ser removidos de los anticuerpos mediante técnicas convencionales, tal como cromatografía, filtración en gel, precipitación y extracción. Los isotipos del anticuerpo pueden ser determinados, utilizando métodos estándar. Como se discutió en los Ejemplos y se muestra en la Tabla 1, hemos preparado anticuerpos murino específicos pertenecientes de los isotipos IgGl, IgG2a e IgG2b utilizando estos métodos. 3. Caracterización de la unión del anticuerpo En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención se caracterizan por sus actividades de unión al TrkB humano (por ejemplo, utilizando el ensayo ELISA y/o FACS como se describió en los Ejemplos) . En ciertas modalidades la unión a las proteínas TrkB humano que son expresadas en una superficie de una célula también puede ser evaluada (por ejemplo, usando células HEK293 como se describió en los Ejemplos). Preferentemente, los anticuerpos de la invención son también probados para su actividad de unión de especies cruzadas (por ejemplo, con el segundo inmunógeno) . Esto permite que los anticuerpos monoclonales que se unen al TrkB de ambas especies sean identificados. Estos anticuerpos son de interés, dado que pueden ser probados en modelos animales sabiendo que ellos también pueden ser aplicados en pruebas clínicas en humanos. En ciertas modalidades puede ser ventajoso caracterizar adicionalmente las propiedades de unión de cualquier anticuerpo monoclonal dado. En particular, se puede utilizar una prueba de competencia (por ejemplo, un ensayo ELISA) para determinar si los anticuerpos bloquean la interacción de TrkB y la BDNF. También se puede evaluar si ellos se unen a los anticuerpos TrkB non-humanos y/o los TrkA o TrkC humanos. La representación de los epítopos de unión de anticuerpo relativo en TrkB (humanos u otros) también puede ser conducida, por ejemplo, examinando la actividad de cada anticuerpo individual en el bloqueo de la unión de otros anticuerpos al TrkB. Por ejemplo, la observación de que dos anticuerpos bloquean la unión entre ellos sugiere que estos anticuerpos pueden unirse al mismo epítopo o a los epítopos superpuestos en el TrkB. 4. Caracterización de la función del anticuerpo En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención se caracterizan por su habilidad funcional para activar el TrkB humano. Se puede utilizar cualquier prueba agonista. Los Ejemplos describen una luciferasa de ejemplo, que ha demostrado selectivamente la activación de TrkB. La autofosforilación de TrkB (por ejemplo, como se midieron mediante Western blot) puede ser también utilizada como una medida de la activación de TrkB. Alternativamente o adicionalmente, la actividad agonista de TrkB humano de los anticuerpos de la invención puede ser evaluada en una prueba que implica TrkB endógenos (por ejemplo, en células SY5Y de neuroblastoma humano). Como se describió en los Ejemplos, tales ensayos de pruebas para detectar la habilidad de cada anticuerpo para promover el crecimiento de neurita para incrementar la supervivencia de células diferenciadas seguido del daño o lesión (por ejemplo, lesión por pérdida de suero) . En ciertas modalidades se miden los efectos dependientes de la dosis de los anticuerpos de la invención en el crecimiento de la neurita y/o la viabilidad de las células. En ciertas modalidades los anticuerpos monoclonales purificados son también caracterizados por su habilidad funcional para activar los TrkB no-humanos (por ejemplo, de murino, rata, pollo, conejo, etcétera) . Los Ejemplos describen una prueba en la cual los anticuerpos se probaron en cultivos de neuronas de granulos cerebelares de ratas (CGN) para la actividad contra el receptor endógeno TrkB de ratas. Así como en las células humanas se puede realizar una prueba de desarrollo de neurita y una prueba de neuroprotección. Otras pruebas útiles son conocidas en la técnica y serán reconocidas por aquellos expertos en la técnica . En aún otra modalidad y como se describió en los Ejemplos, los anticuerpos monoclonales purificados son caracterizados, además, por su habilidad funcional para activar los TrkA y/o TrkC humanos. 5. An ti cuerpos humani zados o figurados Cuando se utiliza un anticuerpo de la invención para propósitos terapéuticos puede ser ventajoso utilizar una versión del anticuerpo de interés para reducir cualquiera reacción inmunogénica potencial. En general, los anticuerpos humanizados o figurados minimizan las respuestas inmunológicas no deseadas que limitan la duración y la efectividad de las aplicaciones terapéuticas de los anticuerpos non-humanos en receptores humanos. Un número de métodos para preparar anticuerpos humanizados que comprenden una porción de unión a antígeno derivada de un anticuerpo no-humano han sido descritos en la técnica. En particular, los anticuerpos con regiones de roedor variable y sus regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) asociadas fusionadas a dominios humanos constantes se han descrito (por ejemplo, ver Winter y otros, Na ture 349:293, 1991; Lobuglio y otros, Proc. Na t . Acad. Scí . USA 86:4220, 1989; Shaw y otros, J. Immunol . 138:4534, 1987; y Brown y otros, Cáncer Res . 47:3577, 1987). Los CDR de roedores injertados en una región de marco de soporte humano (FR, por sus siglas en inglés) antes de la fusión con un dominio constante de anticuerpo humano apropiado (por ejemplo, ver Riechmann y otros, Na ture 332:323, 1988; Verhoeyen y otros, Science 239:1534, 1988; y Jones y otros Na ture 321:522, 1986) y CDR de roedores soportados por FR de roedores figurados recombinantemente también han sido descritos (por ejemplo, ver la publicación de patente EP No. 519.596). Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Tales anticuerpos pueden ser producidos utilizando ratas que son incapaces de expresar cadenas de genes ligeras y pesadas de inmunoglobulina endógenas, pero que pueden expresar cadenas de genes humanas ligeras y pesadas (por ejemplo, ver Lonberg y Huszar Int. Rev. Immunol . 13:65-93, 1995 y las Patentes U.S. Nos. 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661.016). Las versiones figuradas de los anticuerpos de la invención pueden ser también utilizadas en los métodos de la presente invención. El procedimiento figurado implica reemplazar selectivamente los residuos FR, por ejemplo, de un murino con una región variable de cadena ligera o pesada, con residuos FR humanos con el objeto de proporcionar un anticuerpo que comprende una porción de unión del antígeno que retiene sustancialmente toda la estructura de veces de la proteína FR nativa. Las técnicas de "figurado" se basan en el entendimiento de que las características de unión del antígeno de una porción de unión de un antígeno son determinadas principalmente por la estructura y la disposición relativa de los conjuntos de cadenas CDR pesadas y ligeras en la superficie de asociación del antígeno (por ejemplo, ver Davies y otros, Ann . Rev. Biochem . 59:439, 1990). De esta manera, la especificación de la asociación del antígeno puede ser preservada en un anticuerpo humanizado solamente en donde las estructuras CDR, su interacción entre ellas y su interacción con el resto de los dominios de región variables son cuidadosamente mantenidas. Mediante la utilización de técnicas de figurado, los residuos FR exteriores (por ejemplo, accesible a solventes) que son rápidamente encontrados en el sistema inmune son selectivamente reemplazados con residuos humanos para proporcionar una molécula híbrida que comprende tanto una superficie inmunogénica "figurada" débil, o sustancialmente no-inmunogénica . 6. Anticuerpos de cadena única Los anticuerpos de cadena única pueden ser preparados también a partir de los anticuerpos de la invención. Por ejemplo, un anticuerpo (scFv) de cadena única puede ser diseñado como se describió, por ejemplo, en Colcher y otros, Ann . N Y Acad. Sci . 880:263-80, 1999; y Reiter, Clin . Cáncer Res . 2:245-52, 1996. Los métodos específicos están descritos en los Ejemplos. El anticuerpo de cadena única puede ser dimerizado o multimerizado para generar anticuerpos multivalentes que tienen especificidades para diferentes epítopos de TrkB humano. 7. Composi ciones farmacéuticas Los anticuerpos monoclonales de la invención pueden ser administrados cuidadosamente con el objeto de activar el TrkB, de acuerdo con la presente invención. Sin embargo, más comúnmente, estos son administrados en el contexto de una composición farmacéutica, que contiene una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más anticuerpos junto con uno o más de otros ingredientes conocidos por aquellos expertos en la técnica para la formulación de composiciones farmacéuticas . Como se utiliza aquí, los términos "cantidad farmacéuticamente efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva" significa la cantidad de cada ingrediente activo de la composición farmacéutica o método que es suficiente para mostrar un beneficio significativo al paciente, es decir, el tratamiento, la prevención o mejora de una condición que requiere la activación de TrkB. Cuando se aplica a un individuo un ingrediente activo que se administra sólo, el término se refiere a ese ingrediente solamente. Cuando se aplica a una combinación de ingredientes activos, el término se refiere a cantidades combinadas de ingredientes activos que resultan en un efecto terapéutico, ya sea, que se administren en combinación, en forma serial o simultáneamente. En ciertas modalidades de la invención, los anticuerpos de la invención son administrados con una dosis semanal en el rango de alrededor de 0.1 hasta alrededor de 1.000 mg/kg en peso corporal, o alrededor de 1 hasta alrededor de 500 mg/kg en peso corporal, en ciertas modalidades alrededor de 10 hasta alrededor de 300 mg/kg en peso corporal. Las dosis pueden ser administradas como un régimen único o como un régimen continuo dividido en dos o más dosis en el curso de un día o semana. La entrega puede ser como un bolo o en ciertas modalidades como una infusión gradual (por ejemplo, por inyección encima de 30 mins) . En ciertas modalidades, una o más dosis superiores (por ejemplo, 2, 3 o 4 veces superiores) pueden ser administradas inicialmente seguidas de una o más dosis de mantención inferiores. La(s) dosis más alta puede ser administrada al comienzo del tratamiento solamente o al principio de cada ciclo de tratamiento. Estos niveles de dosis y otros niveles de dosis indicados aquí son para la administración intravenosa o intraperitoneal. La persona experta será fácilmente capaz de determinar los niveles de dosis requeridas para una vía diferente de administración. Se apreciará que, en general, la dosis precisa utilizada será como se determine por la prescripción médica y dependerá no solamente del peso del sujeto y la vía de administración, sino que también de la edad del sujeto y la severidad de los síntomas . Los ingredientes adicionales útiles en la preparación de las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención incluyen, por ejemplo, portadores (por ejemplo, en forma sólida o líquida) , agentes saborizantes, lubricantes, solubilizantes, agentes de suspensión, rellenos, deslizantes, ayudantes de compresión o tableteado, aglomerantes, agentes desintegradores de tabletas, materiales de encapsulado, emulsionantes, reguladores de pH, conservadores, edulcorantes, agentes espesantes, agentes colorantes, reguladores de la viscosidad, estabilizantes u osmorreguladores o combinaciones de los mismos. Las composiciones farmacéuticas líquidas contienen preferentemente uno o más anticuerpos monoclonales de la invención y uno o más portadores líquidos para formar soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, elixires, o composiciones presurizadas. Los portadores líquidos farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, agua, solventes orgánicos, aceites o grasas farmacéuticamente aceptables, o combinaciones de los mismos. El portador líquido puede contener otros aditivos farmacéuticamente adecuados tales como solubilizantes, emulsionantes, reguladores de pH, 1, edulcorantes, agentes saborizantes, agentes de suspensión, agentes espesantes, colorantes, reguladores de la viscosidad, estabilizantes u osmorreguladores, o combinaciones de los mismos. Si la formulación líquida está propuesta para uso pediátrico, es generalmente deseable evitar la inclusión de alcohol. Los ejemplos de portadores líquidos adecuados para la administración oral o parenteral incluyen agua (preferentemente conteniendo aditivos tales como derivados de la celulosa, como son la carboximetilcelulosa) , alcoholes o sus derivados (incluyendo alcoholes monohídricos o alcoholes polihidricos tales como glicoles) o aceites (por ejemplo, aceite de coco fraccionado o aceite de maní) . Para la administración parenteral el portador también puede ser un éster oleoso tal como etil oleato y miristato de isopropilo. Los portadores líquidos para composiciones presurizadas pueden ser hidrocarburos halogenados u otros propelentes farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones farmacéuticas sólidas preferentemente contienen uno o más portadores sólidos, y opcionalmente uno o más aditivos tales como agentes saborizantes, lubricantes, solubilizantes, agentes de suspensión, rellenos, agentes deslizantes, ayudantes de compresión, aglomerantes o agentes desintegradores de tabletas o un material de encapsulado. Los agentes sólidos adecuados incluyen, por ejemplo, fosfato de calcio, estearato de magnesio, lactosa, dextrina, almidón, gelatina, celulosa, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, polivinilpirrolidina, ceras de bajo punto de fusión o resinas de intercambio iónico, o combinaciones de los mismos. En composiciones farmacéuticas en polvo, el portador es preferentemente un sólido finamente dividido que está adicionado con un ingrediente activo finamente dividido. En tabletas, el ingrediente (s) activo está generalmente mezclado con un portador que tiene las propiedades de compresión necesarias en proporciones adecuadas, y opcionalmente, otros aditivos, y compactados en la forma y tamaño deseados. En algunas modalidades de la invención, las composiciones farmacéuticas están provistas en una forma de dosis unitaria, tal como tabletas o cápsulas. En tal forma, la composición es subdividida en dosis unitarias que contienen las cantidades adecuadas del ingrediente (s) activo. Las formas de dosis unitarias pueden ser composiciones envasadas, por ejemplo, polvos envasados, frascos, ampollas, jeringas pre-llenadas o almohadillas que contienen líquidos. La forma de dosis unitaria puede ser, por ejemplo, una cápsula o la tableta misma, o puede ser un número apropiado de tales composiciones en forma envasada. De esta manera, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica en una forma de dosis unitaria para activar los TrkB, donde la composición contiene una dosis unitaria terapéuticamente efectiva de al menos un anticuerpo monoclonal de la invención. Como será reconocido por un experto en la técnica, la cierta dosis unitaria terapéuticamente efectiva dependerá del método de administración . La presente invención también proporciona un envase terapéutico adecuado para dispensar los anticuerpos monoclonales de la invención a un individuo que está siendo tratado por una condición que requiere una activación de TrkB. En algunas modalidades, el envase terapéutico contiene uno o más dosis unitarias de al menos un anticuerpo monoclonal, un contenedor de contiene una o más dosificaciones unitarias, y marcados dirigidos al uso del paquete o envase para el tratamiento. En ciertas modalidades, la dosis unitaria tiene la forma de una tableta o cápsula. En algunos casos, cada dosis unitaria es una cantidad terapéuticamente efectiva. 8. Otros agentes farmacéuticos De acuerdo con la presente invención, los anticuerpos monoclonales de la invención pueden ser administrados solos para modular la actividad de TrkB. Alternativamente, los anticuerpos pueden ser administrados en combinación con (ya sea simultáneamente o secuencialmente) uno o más de otros agentes farmacéuticos útiles en el tratamiento, prevención y mejoramiento de una o más de otras condiciones (incluyendo síntomas, trastornos, o enfermedades) que requieren la actividad de TrkB. Por ejemplo, otros agentes farmacéuticos que pueden modular la actividad de TrkB pueden ser utilizados en combinación con los anticuerpos monoclonales de la invención, incluyendo otra actividad de TrkB. Ver las patentes U.S. 5,770,577; 6,077,829; 6,723,701 y 6,800,607 (cada una de las cuales se incorporan como referencia, en su totalidad, en esta descripción) que describen derivados de BDNF y composiciones que pueden ser útiles de acuerdo con la práctica de la presente invención. Adicional o alternativamente, los anticuerpos monoclonales pueden ser utilizados en conjunto con otros agentes farmacéuticos que son útiles en el tratamiento, prevención o mejoramiento de las enfermedades y los trastornos neurológicos. En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales son combinados con agentes que son útiles en el tratamiento combinado con agentes útiles en el tratamiento, prevención o mejoramiento de enfermedades o trastornos causados por el daño al sistema nervioso central (por ejemplo, por heridas, cirugía, isquemia, infecciones, enfermedades metabólicas, desnutrición, tumor maligno, fármacos tóxicas, etcétera) . Debe entenderse que cualquier agente adecuado conocido en la técnica puede usarse, incluyendo aquellos listados en el Physicians' Desk Reference, 55th Edición, 2001, publicado por Medical Economics Company, Inc. en Monvale, NJ, cuyas porciones relevantes son incorporadas en esta descripción como referencia. 9. Usos terapéuticos En un aspecto, los anticuerpos de la invención son útiles para el tratamiento de condiciones (incluyendo síntomas, trastornos, o enfermedades) que requieren la activación de TrkB. Tales métodos incluyen la administración al individuo de una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más anticuerpos de la invención. En ciertas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar las condiciones neurológicas. Por ejemplo, y sin limitación, los anticuerpos de la invención pueden ser utilizados para tratar individuos con un sistema nervioso dañado por heridas, cirugía, isquemia, infección, enfermedad metabólica, desnutrición, tumor maligno, fármacos tóxicos, etcétera. Ejemplos específicos incluyen, apoplejía, lesión de la médula espinal, daño cerebral traumático, degeneración retinal y axotomía. Los anticuerpos de la invención puede ser también utilizados para tratar trastornos tales como el desorden de déficit atencional con hiperactividad (ADHD) , depresión y deterioro mental asociado con la edad (es decir, proporcionando un incremento cognitivo) . Los anticuerpos de la invención también pueden ser utilizados para tratar condiciones cognitivas o neurodegenerativas incluyendo la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, corea de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (ALS) y las condiciones relacionadas con estas. Los beneficios de la activación de TrkB en el tratamiento de las enfermedades no-neurológicas, tales como, el cáncer y la diabetes también se han descrito y los anticuerpos de la invención pueden, por lo tanto, encontrar utilidad en tales contextos (por ejemplo, las patentes U. S. Nos. 5.877.016 y 6.800.607 describen los beneficios de la activación de TrkB para el tratamiento del cáncer y la diabetes, respectivamente) . Los métodos de esta invención son útiles para el tratamiento de las condiciones descritas aquí, en adultos y niños. También pueden ser utilizados para aplicaciones veterinarias, particularmente incluyendo aplicaciones caninas y felinas. Si se desea, los métodos descritos también pueden ser utilizados con animales agropecuarios, tales como la crianza de ovinos, bovinos, porcinos y equinos.

Los métodos de la invención incluyen la entrega de los anticuerpos monoclonales de la invención vía cualquier ruta apropiada de administración incluyendo, por ejemplo, parenteral, intravenoso, tópica, nasal, oral (incluyendo bucal o sublingual), rectal u otros modos. En general, los anticuerpos pueden ser formulados para una entrega inmediata, retardada, modificada, sostenida, por impulsos, o controlada. En ciertas modalidades, los anticuerpos están formulados para la entrega por inyección. En tales modalidades, la administración puede ser, por ejemplo, intracavernoso, intravenoso, intra-arterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intrasternal, intracraneal, intramuscular o subcutánea, o por la vía de infusión o por técnicas de inyección sin aguja. Para tal administración parenteral, los anticuerpos de la invención pueden ser preparados y mantenidos en formulaciones que pueden ser liofilizadas convencionales y reconstituidas antes de la administración con una solución salina farmacéuticamente aceptable, tal como una solución salina al 0.9%. El pH de la formulación inyectable puede ser ajustado, como se conoce en la técnica, con un ácido farmacéuticamente aceptable, tal como el ácido metansulfónico. Otros vehículos aceptables y solventes que pueden ser utilizados incluyen una solución de Ringer USP. Además, los aceites fijados, estériles, utilizados convencionalmente como un solvente o medio de suspensión. Para este propósito cualquier aceite fijo blando puede ser utilizado incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como el ácido oleico son útiles en la preparación de inyectables. Las formulaciones inyectables pueden ser esterilizadas, por ejemplo, por filtración a través de un filtro retenedor de bacterias, o mediante la incorporación de agentes esterilizadores en la forma de composiciones sólidas estériles las cuales pueden ser disueltas o dispersadas en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso. Con el objeto de prolongar el efecto del anticuerpo de la invención, puede ser deseable reducir su absorción de una inyección intramuscular o subcutánea. La absorción retardada de tal anticuerpo administrado puede ser lograda mediante la disolución o suspensión del agente en un vehículo oleoso. Las formas de depósito inyectable son realizadas, formando matrices micro encapsuladas del anticuerpo en polímeros biodegradables tales como poliláctico-poliglicólico . Dependiendo del la proporción de anticuerpo con respecto del polímero y la naturaleza del polímero particular utilizado, se puede controlar la velocidad de la liberación del anticuerpo. Ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli (ortoéteres) y poli (anhídridos). Los depósitos de formulaciones inyectables son también preparados por entrampado de los anticuerpos en liposomas o micro emulsiones las cuales son compatibles con los tejidos del cuerpo. Para la aplicación en forma tópica a la piel, los anticuerpos pueden ser formulados como un ungüento adecuado que contiene el ingrediente activo suspendido o disuelto, por ejemplo, en una mezcla con uno o más de los siguientes: aceite mineral, petrolato líquido, petrolato blanco, propilenglicol, compuesto polioxietileno polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Alternativamente, estos pueden ser formulados como una crema o loción adecuada, suspendida o disuelta, por ejemplo, en una mezcla de uno o más de los siguientes: aceite mineral, monoestearato de sorbitán, un polietilenglicol, una parafina líquida, polisorbato 60, ceras cetil esteres, alcohol cetearilo, 2-octildodecanol, alcohol bencilo y agua. Los anticuerpos de la invención también pueden ser administrados intranasalmente o por inhalación y son convencionalmente entregados en la forma de un inhalador de polvo seco o en la forma de presentación en un contenedor presurizado aerosol, bomba, pulverizado, atomizador o nebulizador, con o sin el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, a hidrofluoroalcano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la dosis unitaria puede ser determinada mediante la provisión de una válvula para entregar una cantidad medida. El contenedor presurizado, la bomba, el pulverizador, atomizador o nebulizador pueden contener una solución o suspensión del anticuerpo, por ejemplo, utilizando una mezcla de etanol y el propelente como un solvente, que puede contener adicionalmente un lubricante, por ejemplo, triolato de sorbitán. Las cápsulas y cartuchos (fabricados, por ejemplo, a partir de gelatina) para su uso en un inhalador o insuflador pueden ser formuladas para contener una mezcla en polvo de los anticuerpos de la invención y una base en polvo adecuada tal como una lactosa o almidón. Para los métodos de la invención que utilizan la administración oral, donde tal administración puede ser realizada utilizando formulaciones sólidas o líquidas, por ejemplo, en la forma de tabletas, cápsulas, multiparticulados, geles, películas, óvulos, elixires, soluciones o suspensiones. En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales son administrados como tabletas o cápsulas. Tales preparaciones pueden ser formulaciones mezcladas masticables o líquidas o materiales alimentarios o líquidos si se desea, por ejemplo, para facilitar la administración a los niños, a individuos cuya habilidad para tragarse las tabletas está comprometida, o a animales. Las composiciones adecuadas para la administración rectal son preferentemente supositorios, los cuales pueden ser preparados mezclando los anticuerpos de la invención con excipientes adecuados no irritantes o portadores tales como mantequilla de cacao, polietilenglicol o una cera supositorio las cuales son sólidas a temperatura ambiente pero líquidas a la temperatura corporal y que, por lo tanto, se derriten en la bóveda rectal y liberan los anticuerpos. Los catéteres rectales y los enemas de retención también pueden ser utilizados como se conoce en la técnica. Los portadores de incremento de la viscosidad tales como la hidroxipropilcelulosa son también ciertos portadores de la invención para la administración rectal dado que estos facilitan la retención de la composición farmacéutica dentro del recto. Generalmente, el volumen de portador que se agrega a la composición farmacéutica se selecciona con el objeto de maximizar la retención de la composición. En particular, el volumen no debe ser tan grande como para perjudicar la retención de la composición administrada en la bóveda rectal. 10. Usos en diagnóstico En otro aspecto, los anticuerpos de la invención pueden ser utilizados para la detección de TrkB en una muestra (por ejemplo, con el objeto de diagnosticar un desorden caracterizado por la sobre o sub expresión de TrkB) . De acuerdo con tales métodos un anticuerpo de la invención se combina con una muestra bajo condiciones para permitir una unión específica. La unión específica se detecta entonces indicando la presencia de TrkB en la muestra. La muestra puede ser derivada de un fluido corporal (por ejemplo, de fluido cerebroespinal, sangre, suero, orina, etcétera) o un extracto de célula o tejido (por ejemplo, una muestra de biopsia) . La detección de la unión puede facilitarse acoplando (es decir, unión física) el anticuerpo a una sustancia detectable (es decir, anticuerpo marcado) . Ejemplos de substancias detectables incluyen enzimas varias, grupos protéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, y materiales radioactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen la peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; ejemplos de grupos prostéticos complejos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, y aecuorina; y ejemplos de un material radioactivo adecuado incluyen los isótopos 125I, 131I, 35S o 3H. Una variedad de protocolos para medir la unión del anticuerpo, incluyendo ELISA y FACS, son conocidos en la técnica y proporcionan una base para diagnosticar niveles alterados o anormales de la expresión de TrkB. El ensayo ELISA y FACS son descritos más adelante en los Ejemplos. Los valores normales o estándar de la expresión de TrkB se establecen por la combinación de muestras tomadas de individuos normales con un anticuerpo de la invención bajo condiciones adecuadas para la formación del complejo. La cantidad de formación de complejo estándar puede ser cuantificada por medio de varios métodos dependiendo de la naturaleza de la sustancia detectable. Preferentemente la cantidad de formación de complejo estándar se cuantifica por medios fotométricos . Los niveles de expresión de TrkB en muestras de individuos enfermos son luego comparados con valores estándar. La desviación entre valores estándar y de enfermos establece el parámetro para el diagnóstico de enfermedades . En ciertas modalidades, los métodos de la invención pueden ser utilizados para diagnosticar condiciones neurológicas que se caracterizan por sobre- o sub-expresión de TrkB. Por ejemplo, y sin limitación, los métodos de la invención puede ser utilizados para identificar los sistemas nerviosos que se han dañado por heridas, cirugía, isquemia, infección, enfermedades metabólicas, desnutrición, tumor maligno, fármacos tóxicos, etcétera. Ejemplos específicos incluyen apoplejía, lesión de la médula espinal, daño cerebral traumático, degeneración retinal y axotomía. Los métodos de la invención también pueden ser utilizados para diagnosticar trastornos tales como desorden de déficit atencional con hiperactividad (ADHD) , depresión y deterioro mental asociada a la edad (es decir, proporcionando un incremento cognitivo) . Los métodos de la invención pueden ser también utilizados para diagnosticar condiciones congénitas o neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, corea de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (ALS) y condiciones relacionadas con las mismas . 11 . Usos en purificación La invención también proporciona un método para utilizar un anticuerpo para la purificación de TrkB a partir de una muestra que comprende combinar un anticuerpo de la invención con una muestra bajo condiciones para permitir la unión específica, produciendo de esa manera un complejo receptor de anticuerpo-TrkB, separando el complejo receptor del anticuerpo-TrkB del remanente de la muestra y luego separando el anticuerpo del receptor TrkB, obteniendo, por lo tanto, un receptor TrkB purificado. Será apreciado que los anticuerpos de la invención pueden ser utilizados para aislar TrkB por cualquier técnica estándar, tal como, la afinidad cromatográfica o inmunoprecipitación.

EJEMPLOS La presente invención se ilustra y se sustenta a continuación por los siguientes ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos no deben, de ninguna manera, ser considerados como una limitación del ámbito de protección de la invención. Por el contrario, cualquier experto en la técnica rápidamente entenderá que existen otras modalidades, modificaciones, y equivalentes de la presente invención sin apartarse del espíritu de la presente invención y/o del campo de aplicación de las cláusulas anexas. EJEMPLO 1 Este ejemplo describe la preparación, la caracterización y el ensayo in vi tro de una pluralidad de anticuerpos TrkB. Materiales y métodos Inmunógenos Los anticuerpos TrkB anti-murino se prepararon utilizando una mezcla de dos proteínas inmunógenos: una primera proteína recombinante que incluye el dominio extracelular (ECD) de TrkB humano (rhTrkB-ECD) (R&D systems, Inc., Cat. No. 397-TR/CF) y una segunda proteína recombinante que incluye el dominio extracelular de TrkB murino (rmTrkB-ECD) (R&D system, Inc., Cat. No. 1494-TB/CF). El dominio extracelular de TrkB humano está conformado de residuos de aminoácidos C32-H430 de todo el largo de la proteína (que se señala como SEC ID NO:l en la Figura 12, GenBank No. de acceso NP_006171) . La rhTrkB-ECD se expresó en la línea celular de mieloma murino NSO. La masa molecular calculada de rhTrkB-ECD monomérico es 44 kDa; sin embargo, cuando se glicosiló migró como una banda ancha de 80-100 kDa en SDS-PAGE bajo condiciones reducidas. El dominio extracelular de TrkB murino está comprendido con residuos aminoácidos C32-H429 de todo el largo de la proteína (el cual se indica como SEC ID NO: 2 en la Figura 13, GenBank No. de acceso P15209) . En el mhTrkB-ECD utilizado para este Ejemplo, la secuencia es flanqueada por un péptido de señal CD33 humana N-terminal que es degradada durante la expresión y un C-terminal His Tag. El rhTrkB-ECD también se expresó en la línea celular de mieloma murino NSO. La masa molecular calculada del mhTrkB-ECD monomérico es 45.9 kDa; sin embargo, cuando se glicosiló migró como una banda ancha de 75-100 kDa en SDS-PAGE bajo condiciones de reducción. Programas de inmuniza ción Se inmunizaron cinco ratones hembras BALB/c de 8-semanas de edad con 10 µg de rhTrkB-ECD que se premezcló con un adyuvante completo de Freund (CFA) . La mezcla se separó en porciones que se inyectaron subcutáneamente e intraperitonealmente 4 veces bisemanal (es decir, en la semana 0, 2, 4, y 6) . Los ratones también se inmunizaron a la semana 7 por inyección subcutánea e intraperitoneal con 1 µg de rmTrkB-ECD que se pre-mezcló con un adyuvante completo de Freund (CFA) . La sangre de ratones se recolectó en la semana 5 y 7 y se evaluó la respuesta del anticuerpo. Generación de anti cuerpos monoclonales (mAbs) de TrkB anti -murino Tres de los cinco ratones se reforzaran adicionalmente, intravenosamente, con 10 µg de rhTrkB y 1 µg de rmTrkB 3 días antes de la fusión de la célula (lo que ocurrió en la semana 12) . Los esplenocitos del bazo de estos tres ratones se fusionaron con células de mieloma murino P3X63Ag8.653 (ATCC, Cat. No. CRL-1580) en una proporción de 4:1 utilizando 50% de polietilenglicol (MW 1500) (Roche Diagnostics Corp., Cat. No. 783641). Después de la fusión, las células se sembraron y se cultivaron en placas de 96 cavidades a lxlO5 células /cavidad en un medio de selección (RPMI1640 conteniendo 20% de FBS y 5% Oxígeno) (IGEN International, Inc., Cat. No. 210001), 2 mM L-glutamina, 100 U/ml penicilina, 100 µg/ml estreptomicina, IxHEPES y lxHAT (hipoxantina-aminopterina-timidina) (Sigma, Cat. No. H0262). Los sobrenadantes de hibridoma se monitorearon para la unión con el rhTrkB mediante ELISA y tinción en células estables HEK293 que expresan rhTrkB mediante análisis FACS (ver más adelante) . El sobrenadante de hibridoma seleccionado como positivo se probó posteriormente para actividades agonistas 5 en rhTrkB, utilizando una prueba luciferasa (ver más adelante) . Los hibridomas seleccionados se sub-clonaron cuatro veces mediante diluciones en serie y una vez mediante clasificación FACS (ver más adelante) . El medio convencional se cosechó de un cultivo de hibridoma estable. Se utilizó Prosep-A (Montage Antibody Purification Spin columns, Millipore, Cat. No. P36486) para purificar IgG a partir del medio condicional de hibridoma. La clase Ig de cada mAb se determinó con un kit de isotipificación de mAb murino (IsoStrip, Boehringer Mannheim Corp., Cat. No. 1493027). Pruebas ELISA Para medir la presencia de los anticuerpos TrkB-específicos, se recubrieron placas de 96 cavidades (Maxisorp, Nunc) con 1 µg/ml de rhTrkB-EDC-Fc (R&D system, Cat. No. 688-TK) o de rmTrkB-Fc (R&D system) y se incubaron durante toda la noche a 4°C. Después del lavado de las placas y de bloquear los cavidades con PBS (10 mM fosfato de sodio, 150 mM NaCl, pH 7.2) conteniendo 1% de BSA y 0.05% de Tween-20, se agregaron 100 µl de suero inmune diluido o sobrenadantes de hibridoma y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavaron las placas, y se detectaron los anticuerpos anti-TrkB unidos, utilizando peroxidasa conjugada de (H+L) de IgG murino anti-cabra (PIERCE, Cat. No. 31434) seguido de la incubación con el substrato TMB (BioFX Laboratories, Cat. No. TMBW 1000-01) . Los valores de absorbancia se determinaron a 450 nm en un espectrofotómetro. Para determinar la concentración de mAb en el sobrenadante de hibridoma, se recubrieron placas de 96 cavidades con 1 µg/ml de (Fcy) IgG murino anti-cabra (PIERCE, Cat. No. 31123) en PBS y se incubaron durante toda la noche a 4°C. Después de lavar y bloquear las cavidades con PBS con un contenido de 1% de BSA y 0.05% de Tween-20, se agregaron 100 µl de sobrenadantes de hibridoma diluidos durante 1 hora a temperatura ambiente. El isotipo concordante con IgG murino se utilizó como un estándar para la cuantificación de las concentraciones IgG anti-TrkB. Se lavaron las placas y se agregó IgG-Fc de murino anti-cabra marcado HRP y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado de las cavidades, se agregó el substrato TMB. La absorbancia se determinó a 450 nm. Caracterización de los epí topos de unión al anticuerpo rela tivo utilizando unión de competencia Para determinar cómo la unión de la proteína IgG anti-TrkB a la proteína TrkB afecta la interacción de la BDNF con el TrkB, se recubrieron placas de 96 cavidades con 0.3 µg/ml de BDNF (R&D system, Cat. No. 248-BD/CF) en PBS y se incubaron durante toda la noche a 4°C. Después del lavado y el bloqueado de los cavidades con PBS con un contenido de 1% BSA de 0.05% de Tween-20, se agregaron 100 µl de sobrenadantes de hibridoma (o suero inmune diluido) mezclado con un rhTrkB-EDC-Fc a la placa y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar la placa, la IgG, (Fo?) humana anti-cabra conjugada con peroxidasa (PIERCE, Cat. No. 31416) se agregó y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las cavidades se lavaron y se agregó el substrato TMB. La absorbancia se determinó a 450 nm. Para trazar los epítopos relativos de unión al anticuerpo de rhTrkB, se recubrieron placas de 96 cavidades con 1 µg/ml de cada mAb TrkB-específico individual en PBS y se incubaron durante toda la noche a 4°C. Después de lavar y bloquear los cavidades con PBS con un contenido de 1% de BSA y 0.05% de Tween-20, se agregaron 100 µl de mezcla de cada mAb TrkB pre-incubados individuales (20 µg/ml) y rhTrkB-EDC-Fc (0.1 µg/ml) a los cavidades y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó y se incubó durante 1 hr con IgG, (FCY) humana anti-cabra conjugada con peroxidasa. Después de lavar la placa, se agregó el substrato TMB. La absorbancia se determinó a 450 nm. Ensayo de Luciferasa Se generó una línea estable de células HEK-293 que expresan rhTrkB mediante la transfección de células HEK-293 con pcDNA-hTrkB (largo total, ver GenBank No. de acceso NM_006180). Las células transfectadas se seleccionaron en la presencia de higromicina durante 2 semanas con diluciones limitadas. Siguiendo la evaluación inicial, un único clon de células se escogió para el estudio. Para el ensayo luciferasa, las células se colocaron el placas a 1.5xl04 células/cavidad en 100 µl de un medio de crecimiento en placas de 96 cavidades. Al día siguiente, las células se trataron con una concentración final de 10 µl de lOx de BDNF o anticuerpos de prueba. La actividad de Luciferasa se midió 16 horas después del tratamiento, utilizando el kit de ensayo Promega Steady-Glo de acuerdo con el protocolo del fabricante. En breve, el medio se reemplazó con 100 µl de PBS y se agregó 100 µl de reactante Steady-Glo. Después de sellar las placas con TopSeal, las placas se agitaron en un placa agitadora de titulación a una velocidad de ~5 durante 5 minutos y luego se midió la luminiscencia utilizando un instrumento TopCount NXT v2,13 (Packard). Análisis FACS Las células HEK-293 que expresan rhTrkB se desprendieron de las placas con PBS con un contenido de 5 mM EDTA y se transfirieron dentro de tubos Falcon de 5 ml (Becton Dickinson, Cat. No. 352063) con 2xl05 células por tubo. Las células se lavaron una vez con PBS y se centrifugaron a 800 rpm a 4°C durante 3 minutos, y se incubaron durante 30 minutos a 4°C con 100 µl de sobrenadante de cultivo de hibridoma, suero de anticuerpos purificado o inmune diluido en PBS con 1% FBS. Las células se lavaron 3 veces con 1 ml PBS con un contenido de 1% de FBS e incubadas durante 30 minutos a 4°C en la oscuridad con PE marcado con un fragmento IgG, F(ab')2 murino anti-cabra (DAKO Corporation, Cat. No. R0480) en una PBS con un contenido de 1% FBS. Las células se lavaron nuevamente tres veces y se re-suspendieron en 250 µl de PBS con un contenido de 1% de FBS. Se utilizó yoduro de Popidio para la detección de las células, que fueron excluidas del análisis. Se contó la fluorescencia de 5.000 células/tubo con un citofluorómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson) . Ensayo de autofosforila ción de TrkB Las células HEK-293 que expresan rhTrkB se colocaron en placas de 24 cavidades a 2xl05 células/cavidad en un medio de crecimiento DMEM. Al día siguiente, las células se incubaron en DMEM libre de suero durante 90 minutos, luego se estimularon con BDNF o anticuerpos de prueba a diferentes concentraciones durante 30 minutos a 37°C. Después de lavar una vez con PBS, las células se usaron en un regulador de pH de muestra de Laemmli (Bio-Rad) precalentado a 95°C. Los lisatos se condujeron a través de una columna QIAshredder (Qiagen) y se resolvieron 20 µl de muestras en 4-12% de Bis-Tris gel (Invitrogen). Seguido de la transferencia a membranas nitrocelulosa, las bandas TrkB fosforiladas se detectaron, utilizando un anticuerpo específico Trk-fosfo PY490 (1:100, Cell Signaling, Cat. No. 9141) seguido por la incubación anticuerpos secundarios anti-conejo HRP-conjugados (Sondas moleculares) . Las señales se desarrollaron utilizando el kit ECL plus (Amersham) . Ensayo de desarrollo de Neuri ta Las células SH-SY5Y de neuroblastoma humano se desarrollaron en DMEM: F12 (1 : 1) suplementadas con 2 mM de glutamina-L, 15 % de FBS y pen/estrep. Para el ensayo de desarrollo de neurita, las células se colocaron en placas en placas de 96 cavidades de cultivo de tejidos a una densidad de 4xl03 células/cavidades y se incubaron con 10 µM ácido todo-trans retinoico (RA) para inducir la diferenciación neuronal. Al tercer día, el medio se reemplazó con un medio de crecimiento fresco con o sin BDNF o anticuerpos de prueba, como se indica en los resultados. Después de tres días adicionales al cultivo, las células se fijaron por IC-Fix durante 30 minutos a temperatura ambiente y procesadas luego para inmunotinción de beta-Tubulina III. Primero, las células se permeabilizaron por incubación breve en 0.2% de Tritón en una solución de regulador de pH fosfato (TPBS) . Cuando las muestras se incubaron en 1.5% de suero de cabra normal (NGS) en una TPBS durante 30 minutos para bloquear una unión no-específica, seguido por la incubación con mAb Tubulina III anti-beta (Tujl, 1:1000, Covance) en 1.5% NGS/TPBS. Las señales Tuj 1 se detectaron utilizando un anticuerpo murino anti-cabra Alexa 488 (1:500, Sondas moleculares) y el desarrollo de neurita se analizó utilizando Cellomics Arrayscan. Para la medición de los efectos promotores de neurita en las neuronas primarias, se prepararon cultivos (CGN) de neurona granular cerebelar de rata o murino. Brevemente, se diseccionó el cerebelo de animales después del día 7 del nacimiento y se cortaron en pequeños pedazos. El tejido se trató con papaína (Worthington Bioquímico Corp.) durante 30 minutos a 37°C y se dispersaron por trituración gentil. Luego se centrifugó a 300 g durante 5 minutos, las células disociadas se reconstituyeron en un medio Neurobasal con un contenido de suplemento B27, 0.5 mM de l-glutamina, y 25 mM de cloruro de potasio y se colocaron en placas de 96 cavidades Biocoat pre recubiertas con poli-d-lisina (BD bioscience) a una densidad de 1.2xl04 células /cavidades. Las células se trataron con BDNF o anticuerpos de prueba durante 24 horas, fijadas con IC-Fix durante 30 minutos a temperatura ambiente y procesada por immunotinción Tujl como se describió anteriormente . Ensayo de supervivencia celular Las células SH-SY5Y se colocaron en placas de 96 cavidades a lxlO4 células /cavidades y se incubaron con RA (10 µM) para inducir la diferenciación neuronal. Después de 3 días, el medio de cultivo se conmutó a un medio de crecimiento son suero (medio libre de suero) y las células se trataron con BDNF, anticuerpos de prueba o vehículos. Seguido de dos días adicionales de cultivo, la viabilidad de las células se midió mediante ensayo MTT, utilizando el kit (Promega) de ensayo de proliferación no radiactivo CellTiter 96 de acuerdo con el protocolo del fabricante. Ensayo de Neuroprotección Los cultivos CGN de rata o murino se prepararon a partir de cachorros de 7 días de edad como se describió anteriormente y se colocaron el placas Biocoat de 96 cavidades pre-recubiertas con poli-d-lisina (BD bioscience) a una densidad de 7.3xl04 células/cavidades. 24 horas después de la preparación de cultivos en placas, las células se sometieron a daño por privación de suero y potasio (KSD) , que se conoce por resultar en una muerte significativa de las neuronas granulares cerebelares. Los cultivos gemelos se co-trataron con BDNF o anticuerpos de prueba. Después de 24 horas de incubación, la viabilidad de la célula se midió utilizando un Kit (Promega) de ensayo de proliferación de la célula no-radioactivo CellTiter 96. Resultados Evaluación de la respuesta del an ticuerpo de ra tones inmuni zados TrkB Para evaluar las respuestas inmunes específicas al TrkB, los cinco ratones inmunizados (M1-M5) se desangraron una semana luego de tres y cuatro inmunizaciones. Los títulos de los anticuerpos anti-TrkB altos en el suero se determinaron mediante ELISA y análisis FACS tanto en el tercero y en el cuarto sangrado. Las Figuras ÍA, IB, ÍC, ID, 1D-1, 1D-2 representan los resultados a partir de los sangrados después de la cuarta inmunización. Los cinco ratones generaron títulos altos, reconociendo tanto los rhTrkB-ECD y rmTrkB-ECD en ELISA (Figura 1A y IB). La ubicación de los epítopos de unión al anticuerpo en el hTrkB relativo al sitio de unión de BDNF también se evaluó. Los resultados de la competencia ELISA mostraron que los sangrados inmunes pueden bloquear las interacciones del rhTrkB-EDC-Fc y el BDNF en el orden de M2 = M5 > M3 > M4 = Ml (Figura ÍC) . De manera interesante, las eficacias de los anticuerpos en el bloqueo de la interacción correlativa rhTrkB-BDNF con el título de unión con el anticuerpo (comparar Figuras ÍA y ÍC) . Todos los sangrados inmunes demostraron también que se unen a la superficie de células expresadas rhTrkB en células HEK-293 como se demostró mediante el análisis FACS (Figura ID). Seguido de la observación de un título alto de unión específica de suero inmune al hTrkB, estos sangrados inmunes se evaluaron en un ensayo informador de luciferasa para probar sus actividades antagonistas. La actividad luciferasa en células HEK-293 que expresan el rhTrkB ha demostrado representar selectivamente la activación de TrkB (Figuras 2A-2B) . La incubación de estas células con sangrados inmunes incrementan significativamente las señales luciferaza de una manera dependiente de la dosis (Figuras 3A-3C) . Nuevamente, la eficacia de las actividades agonísticas estaba en el orden de M2 = M5 > M3 > M4 = Ml . Los tres ratones con el título más alto de anticuerpos y actividades agonistas contundentes (M2, M3 y M5) se escogieron de la generación de hibridoma subsiguiente. Producción de anticuerpos monoclonales Como se describió anteriormente, los tres ratones seleccionados (M2, M3 y M5) se reforzaron intravenosamente con 10 µg de rhTrkB-ECD y 1 µg de rmTrkB-ECD tres días antes de la fusión. A partir de la primera serie de monitoreo del hibridoma, se tomaron noventa y cuatro clones que se unen fuertemente a los rhTrkB-EDC-Fc en un ensayo ELISA. Veinte de estos clones reaccionaron cruzadamente con rmTrkB-ECD en un ensayo ELISA. Los análisis FACS confirmaron que cincuenta y cuatro clones se unieron al rhTrkB expresado en una superficie de células HEK-293. La actividad agonista de TrkB de cada clon se probó utilizando un ensayo luciferasa y diecisiete clones de hibridomas con las actividades más altas se seleccionaron para su caracterización adicional. La estabilización subsiguiente de estos clones, tres series de sub-clonación con dilución serial, y una serie de sub-clonación con selección FACS, los anticuerpos monoclonales de cada medio de cultivo condicional se recolectaron y se purificaron utilizando (kit de Purificación del Anticuerpo Montage) ProSep-A. El isotipo IgGs de cada anticuerpo se determinó mediante un kit de prueba de Isotipificación de Murino (Tabla 1) . Las concentraciones del anticuerpo se determinaron mediante IgG murino cuantificación ELISA y los diecisiete clones produjeron buenos niveles de Ig en los sobrenadantes de los cultivos. TABLA 1 Isotipo IgG Concentración Ig mAb Murino (µg/ml) 2E8 IgG2b, k 14 4C7 IgG2b, k 8 5D8 IgG2b, k 28 5E11 IgG2b, k 55 6D5 IgG2b, k 26 6E2 IgG2b, k 18 6E6 IgG2b, k 14 7E1 IgG2b, k 26 7F5 IgG2b, k 16 11E1 IgGl, k 20 16E11 IgG2b, k 5 17D11 IgGl, k 22 18C3 IgGl, k 18 19E12 IgG2a, k 10 29D7 IgGl, k 52 Caracterización de anticuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales purificados se caracterizaron por sus actividades de unión a los hTrkB mediante ELISA. La mayoría de los anticuerpos se unieron al rhTrkB con afinidades de unión alta (ED50 = 10_11(M)), excepto para el clon 29D7, para el cual la ED50 decreció desde 10_11(M) a 10~10(M) después de la purificación (dato no mostrado). Dos clones 12F4 y 18C8 perdieron su actividad de unión después de la purificación y fueron, por lo tanto, cancelados de la elección desde la lista prioritaria (y de esta manera no fueron incluidos en la Tabla 1). Utilizando el análisis FACS, todas las quince uniones de mAbs restantes también demostraron unirse específicamente a los hTrkB expresados en la superficie de las células HEK293. Los anticuerpos se probaron también para sus actividades de unión de especies cruzadas a rmTrkB mediante ELISA. Mientras se encontró que la mayoria de los anticuerpos se unían débilmente a los rmTrkB, los clones 17D11, 18C3 y 29D7 demostraron unirse a los rmTrkB con una ED50 = 10"10"-11 (M) (Tabla 2). Se utilizó un ensayo de competencia ELISA para determinar si los anticuerpos bloquean la interacción de rhTrkB y BDNF. El clon 29D7 no mostró actividad de bloqueo, mientras los clones 17D11, 18C3 y 19E12 bloquearon parcialmente la interacción de rhTrkB-BDNF. Todos los clones restantes bloquearon la interacción rhTrkB-BDNF con un IC50 = 3-5 x 10"10 (M) (Tabla 2) .

TABLA 2 Actividad de Actividad de unión bloqueo rmTrkB 293-hTrkB rhTrkB [ED50 [Valor hTrkB-BDNF mAb [ED50 (nM)] (nM) 1 promedio] [IC50 (nM)] 2E8 0.020 W* 251.88 0.30 4C7 0.017 W* 241.26 0.30 5D8 0.019 W* 247.43 0.30 5E11 0.016 W* 263.27 0.40 6D5 0.021 W* 258.74 0.58 6E2 0.016 W* 235.47 0.28 6E6 0.019 W* 246.15 0.40 7E1 0.016 W* 237.89 0.27 7F5 0.016 W* 240.03 0.30 11E1 0.020 NB** 117.83 0.30 16E11 0.020 W* 224.55 0.28 Bloqueo 17D11 0.020 0.300 134.52 parcial Bloqueo 18C3 0.020 0.300 132.03 parcial Bloqueo 19E12 0.031 W* 194.41 parcial 29D7 0.120 0.013 95.59 Sin bloqu W* : unión débil NB**: sin unión La representación de los epítopos de unión relativa de los anticuerpos en rhTrkB se condujo mediante el examen de la actividad de cada anticuerpo individual en el bloqueo de la unión de otros anticuerpos al rhTrkB. Por ejemplo, la observación que dos anticuerpos bloquearon la unión de uno con el otro con el rhTrkB sugiere que estos anticuerpos pueden unirse al mismo epítopo o epítopos superpuestos en el rhTrkB (Tabla 3 ) . En la Tabla 3 , los anticuerpos pre-unidos se representan en cada fila, mientras los anticuerpos en competencia (es decir, recubiertos) se presentan en cada columna. Los resultados muestran que los clones 11E1, 19E12 y 29D7 pueden reconocer epitopos únicos . Los clones 17D11 y 18C3 parecen competir por el mismo sitio de unión. Todos los clones restantes compitieron unos con otros y pueden compartir el mismo epítopo de unión . TABLA 3 +: Bloqueo completo. +/- : Bloqueo parcial. -: sin bloqueo. c mAb*: Una mezcla de IgGl, IgG2a e IgG2b de murino.

Actividades Luciferasa Los anticuerpos TrkB-específicos purificados se examinaron, utilizando un ensayo luciferasa para demostrar actividades agonistas. Todos los anticuerpos causaron incrementos dependientes de la dosis en la señal con EC50 en el rango de 10~10 (M) (Figura 4). La ventana de señal máxima fue ~7 veces sobre la base de referencia para la mayoria de los anticuerpos, la cual fue comparable con la respuesta inducida por la BDNF a 200 ng/ml (6,2 veces sobre la base de referencia) . Actividades funcionales de los mAbs Para probar si los anticuerpos de unión de TrkB tienen actividades agonistas mediadas por la activación del receptor TrkB endógeno, los efectos promotores de neurita se evaluaron seguidos de tratamientos con estos anticuerpos. Basados en las características de unión específicas de especies de los anticuerpos, se utilizaron primero células SY5Y de neuroblastoma humano, las cuales se conocen por expresar el TrkB sobre diferenciación neuronal. Consistentemente con los informes previos, se observó que la adición de BDNF promovió el desarrollo de neurita como se demostró por el incremento del largo de la neurita y el número de puntos de ramificación (las Figuras 5A y 5B) . De manera importante, la mayoría de los anticuerpos incrementaron también significativamente el desarrollo de neurita con eficacias comparables o incluso superiores al BDNF (Figuras 5A y 5B) . Ejemplos de imágenes representativas de unos pocos grupos de tratamiento se muestran en la Figura 5C. Siete anticuerpos TrkB con actividades superiores (6E2, 7F5, 11E1, 16E11, 17D11, 19E12 y 29D7) se seleccionaron para un análisis de respuesta de dosis completa. Estos indujeron un incremento dependiente de la dosis en el crecimiento de neurita con una EC50 de alrededor de 10~10 (M) (Figura 5D, el dato no se obtuvo para 6E2). Esos anticuerpos fueron probados también para su habilidad de incrementar la supervivencia de células SY5Y diferenciadas seguido de un daño por pérdida de suero. Los resultados mostraron que la BDNF y varios anticuerpos de células SY5Y diferenciadas protegidas, demostraron un incremento dependiente de la dosis en la viabilidad de las células (Figura 6). Dos anticuerpos de TrkB, 17D11, 18C3 y 29D7, que demostraron unirse al rmTrkB, fueron también probados en cultivos de neuronas de granulo cerebelar de ratas (CGN) para su actividad contra el receptor endógeno TrkB de rata. En ambos el ensayo de desarrollo de neurita y el ensayo de neuroprotección, solamente el 29D7 mostró una actividad comparable a aquellas de la BDNF, mientras el 17D11 y 18C3 fueron inactivos (Figuras 7A-7C y el dato no se muestra) . Se puede sugerir que el 17D11 y 18C3 reconocen un epítopo en TrkB de murino que contiene diferentes aminoácidos en TrkB de ratas. Análisis de la fosforilación de TrkB Siete anticuerpos de TrkB (6E2, 7F5, 11E1, 16E11, 17D11, 19E12 y 29D7) seleccionados sobre la base de todas las actividades descritas anteriormente se evaluaron en un análisis Western para la inducción de la autofosforilación de TrkB. Todos los anticuerpos inducen una fosforilación robusta de TrkB, y estos efectos se antagonizaron mediante el tratamiento con el inhibidor K252a de cinasa, indicando que estos anticuerpos de unión de TrkB causaron la activación de TrkB (Figura 8) . Dos anticuerpos de TrkB, 17D11, 18C3 y 29D7, que mostraron unirse al rmTrkB, fueron probados también en cultivos de neuronas granulares cerebelares (CGN) para la actividad en contra del receptor endógeno TrkB de rata. En ambos ensayos de desarrollo de neurita y de neuroprotección, solamente el 29D7 mostró actividades comparables a aquellas de BDNF, mientras el 17D11 y 18C3 fueron inactivos (Figura 7 con datos no mostrados) . Se puede sugerir que el 17D11 y el 18C3 reconocieron un epítopo en TrkB de murino que contiene diferentes aminoácidos en TrkB de ratas. Análisis de fosforilación de TrkB Siete anticuerpos de TrkB (6E2, 7F5, 11E1, 16E11, 17D11, 19E12 y 29D7) seleccionados sobre la base de todas las actividades descritas anteriormente se evaluaron en un análisis Western para la inducción de la autofosforilación de TrkB. Todos los anticuerpos conducen a una fosforilación TrkB robusta, y estos efectos fueron antagonizados mediante el tratamiento con un inhibidor cinasa K252a, indicando que estos anticuerpos de unión TrkB causaron la activación del TrkB (Figura 8) . Depósi tos ATCC Los hibridomas que produjeron los anticuerpos TrkB 17D11 y 29D7 se depositaron en el ATCC el 18 de Agosto de 2005 y se les concedió la designación de depósito de patente ATCC PTA-6948 y PTA-6949, respectivamente. EJEMPLO 2 Este ejemplo describe a continuación la caracterización y la prueba in vi tro de una pluralidad de anticuerpos TrkB. En particular, este ejemplo describe experimentos que se realizaron para evaluar la especificidad de TrkB vs . TrkA y TrkC de algunos de los anticuerpos del Ejemplo 1. Materiales y métodos Análisis FACS Las células HEK-293 que expresan TrkA humano se separaron de las placas con una PBS con un contenido de 5 mM EDTA y fueron trasferidas dentro de tubos Falcon de 5 ml (Becton Dickinson, Cat. No. 352063) con 2xl05 células por tubo. Las células se lavaron una vez con una PBS mediante centrifugación a 4°C durante 3 minutos, y se incubaron durante 30 minutos a 4°C con 100 µl de sobrenadante de cultivos de hibridoma o suero inmune diluido en una PBS con un 1% de FBS. Las células se lavaron 3 veces con 1 ml de PBS con un contenido de 1% de FBS y se incubaron durante 30 minutos a 4 °C en la oscuridad con un fragmento F(ab')2 de IgG murino anti-cabra marcado con PE (DAKO Corporation, Cat. No. R0480) en PBS con un contenido de 1% de FBS. Las células se lavaron tres veces, nuevamente, y se re . -suspendieron en 250 µl de PBS con un contenido de 1% de FBS. Se utilizó yoduro de propidio para la detección de las células muertas, las cuales se excluyeron del análisis. La fluorescencia de 5.000 células /tubo se contó mediante citofluorómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson) . Ensayo de Luciferasa Se prepararon las líneas estables de células HEK-293 que expresan TrkA humana (o TrkC humana) . Las células transfectadas se seleccionaron en la presencia de higromicina durante 2 semanas con diluciones limitadas. Luego de la evaluación inicial, se escogió un clon único de células para el estudio. Para el ensayo luciferasa, las células se colocaron en placas a 1.5xl04 células/cavidades en 100 µl de medio de crecimiento en placas de 96 cavidades. Al día siguiente, las células se trataron con 10 µl de lOx de concentración final de NGF (o NT-3) o anticuerpos de prueba. Las actividades Luciferasa se midieron 16 horas después de los tratamientos utilizando el kit de ensayo Promega Steady-Glo de acuerdo con el protocolo del fabricante. En resumen, el medio se reemplazó con 100 µl de PBS y se agregó 100 µl de reactante Steady-Glo. Después del sellado de las placas con TopSeal, las placas se agitaron en una placa agitadora de titulación a una velocidad ~5 por 5 minutos y luego la luminiscencia se midió utilizando un instrumento TopCount NXT v2.13 (Packard) . Resultados Análisis FACS de los an ticuerpos monoclonales Un medio condicionado puro para cada uno de los anticuerpos monoclonales específicos de TrkB de la Tabla 1 se caracterizaron por sus actividades de unión a los TrkA humanos por FACS. Todos los anticuerpos probados fallaron en su unión a los TrkA humanos. Específicamente, los anticuerpos se probaron en concentraciones comprendidas en el rango desde alrededor de 5 hasta alrededor de 60 µg/ml (ver concentraciones específicas para cada anticuerpo en la Tabla 1, estos corresponden a concentraciones en el rango de alrededor de 30 hasta alrededor de 500 nM) y cada anticuerpo falló en mostrar cualquier actividad de unión detectable. El dato FACS se muestra en la Figura 9A.

Actividades de Luciferasa Un subconjunto de anticuerpos específicos TrkB purificados de la Tabla 2 fueron también examinados utilizando un ensayo luciferasa de TrkA o TrkC para evaluar las actividades agonistas. Ninguno de los anticuerpos probados activó el TrkA o TrkC. Específicamente, los anticuerpos se probaron en concentraciones de hasta alrededor de 3 µg/ml (alrededor de 20 nM) y en cada caso los anticuerpos fallaron en provocar un incremento detectable sobre el base (ver Figura 9B para el TrkA y Figura 10 para el TrkC) . Al contrario, el NGF indujo un incremento de ~6 veces sobre la base de referencia para el TrkA a 300 ng/ml (Figura 9A) y NT-3 inducidos a ~ 6 veces de incremento de señal sobre la base de referencia para el TrkC a 300 ng/ml (Figura 10) . EJEMPLO 3 Este ejemplo describe la prueba in vivo de una pluralidad de anticuerpos TrkB en un modelo de isquemia-hipoxia neonatal (Hl) en roedores. Materiales y métodos Procedimien tos quirúrgicos y animales El modelo de isquemia-hipoxia neonatal (Hl) en roedores se basó en el procedimiento de Levine que se indica en la Figura 11 (por ejemplo, ver Levine, Am . J. Pa thol . 36:1-17, 1960; Rice y otros, Ann . Neurol . , 9:131-141, 1981 y Gidday y otros, Neurosci . Lett . 168:221-224, 1994 cada uno de los cuales se incorpora aquí como referencia) . En resumen, los cachorros en P7 se anestesiaron con 2.5% de haloetano y la arteria carótida común izquierda estuvo permanentemente ligada. Después que las incisiones se suturaron y los cachorros se retornaron a su jaula para su recuperación y alimentación. Dos horas después, los cachorros se ubicaron en contenedores individuales, a través de los cuales se hizo circular un 8% de oxígeno humedecido. Después de 2.5 horas de un periodo de isquémica hipóxica, los cachorros se retornaron a su jaula. Para el tratamiento, los animales recibieron una inyección intracerebroventricular de 5 µl de 0.1 o 0.3 nmoles ya sea de BDNF, 29D7 anticuerpo monoclonal anti-TrkB, control IgGl o un vehículo justo antes del ataque hipóxico. Evaluación de la pérdida de tejido cerebral En P14, las secciones cerebrales se prepararon a partir de algunos de los ratones para determinar el daño causado por la lesión Hl. Las secciones coronales del cuerpo estriado, la corteza y el hipocampo se tiñeron con cresil violeta y el área porcentual perdida en el hemisferio lesionado se comparó con el área intacta. La Figura 23 compara las tinciones que se obtuvieron del cuerpo estriado e hipocampo para diferentes tratamientos. Las Figuras 24A y 24B comparan la pérdida total del tejido cerebral y la pérdida de tejido sub-regional, respectivamente, para diferentes tratamientos. Los datos se muestran como promedios y el error estándar del promedio (S.E.M.). El BDNF y el anticuerpo monoclonal anti-TrkB 29D7 mostraron una protección significativa del daño Hl del cerebro dependiente de la dosis. La protección no fue localizada en ninguna sub-región específica del cerebro pero la protección mayor se observó generalmente en la corteza. Análisis bioquímico 24 horas después del daño Hl, las secciones del cerebro se prepararon a partir de un subconjunto de ratones para el análisis bioquímico. Los tejidos cerebrales corticales y del hipocampo se diseccionaron, se lisaron y se sometieron a varios de los ensayos bioquímicos. Un ensayo de degradación DEVD-AMC se utilizó para determinar actividades caspasa-3 (por ejemplo, ver Nagase y otros, Immunol Lett . 84:23, 2002 incorporados en esta descripción como referencia) . Los resultados para diferentes regiones del cerebro se muestran en la Figura 25 para ratones a los cuales se les administró 0.1 nmoles de diferentes reactivos de prueba (promedio ± S.E.M.). El BDNF y el anticuerpo monoclonal anti-TrkB 29D7 bloqueó la activación caspasa-3 causada por el daño Hl. Las muestras de proteínas (30 µg/cavidades) de ratones tratados con 0.3 nmoles de diferentes reactivos de prueba se separaron mediante SDS-PAGE y se sometieron a inmunotinción con anticuerpos contra ciertos substratos caspasa-3 (PARP y espectrina-a) . Los anticuerpos contra la actina-ß se utilizaron como controles para verificar la carga equitativa de proteínas. Los resultados mostrados en la Figura 26 demostraron la inhibición de la degradación de estos substratos caspasa-3 mediante el BDNF y el anticuerpo monoclonal anti-TrkB 29D7 (C = contra y I = ipsi lados de la ligación de la carótida) . Experimentos de seguimiento Los siguientes son experimentos de seguimiento proféticos que pueden ser realizados en los ratones de este estudio. El funcionamiento de los ratones en pruebas de memoria y aprendizaje espacial puede ser evaluado (por ejemplo, sin limitación a partir de las pruebas descritas en Almli y otros, Exp . Neurology 166:99-114, 2000 incorporados en esta descripción como referencia). Por ejemplo, los ratones pueden ser probados entre P20-P30. Opcionalmente, el funcionamiento puede ser evaluado en varios días durante ese periodo o incluso en épocas posteriores. Los protocolos de tratamiento que producen resultados positivos (medidos por la reducción de la pérdida de tejido cerebral, y un mejoramiento de la memoria y, por otra parte, del aprendizaje espacial) pueden ser repetidos durante y sobre un rango de dosis mayores. Alternativamente o adicionalmente, los protocolos de tratamiento pueden ser repetidos con diferentes modos de administración (por ejemplo, administración intraperitoneal, administración intravenosa, etcétera) ; con diferentes puntos de partida (por ejemplo, antes de la ligadura, inmediatamente después de la hipoxia, con un retardo variable después de la hipoxia, etcétera) ; y/o con una duración o una frecuencia diferente (por ejemplo, un tratamiento diario durante 2 semanas después del daño, etcétera) . EJEMPLO 4 Este ejemplo describe la preparación y el ensayo de anticuerpos Fv (scFv) humanos de cadena única contra TrkB humano. Se seleccionó una biblioteca fago de exhibición del anticuerpo humano (CS, BMV y DP-47; Tecnología de Anticuerpo de Cambridge) que contiene fragmentos Fv de cadena única para la unión de TrkB utilizando los métodos siguientes. Materiales y métodos Selección de anticuerpos mediante movimiento horizontal 10 µg de hTrkB-EDC-Fc se recubrieron en una placa Nunc Maxisorp en 100 µl y se dejaron durante toda la noche a 4°C. Se pre-bloqueó una biblioteca fago (50 µl de una alícuota fago agregada a 50 µl de 6% de leche descremada en 2xPBS) y seleccionadas negativamente contra PSGL-Fc (Wyeth, Lot. No. 00H25M004) durante 1 hora a temperatura ambiente para reducir el reactivo fago contra Fc . Los fagos cancelados de la elección fueron transferidos a la placa recubierta de proteína objetivo (hTrkB-EDC-Fc) e incubada a temperatura ambiente durante 2 horas. Los cavidades se lavaron 10 veces con PBS/0.1% de Tween 20 y 5 veces con PBS. Los fagos unidos se extrajeron con solventes con 50 µl/cavidades de 100 mM de TEA recientemente preparado (140 µl de TEA en 10 ml de agua ultra pura) . Los fagos extraídos con solventes se neutralizaron utilizando 25 µl de 1 M Tris-HCl pH 7.5 estéril. Los fagos se infectaron dentro de 10 ml de un mid-log (OD a 600 nm = 0.5) de células TG1 E . coli . Las células transformadas se dispersaron en una placa agar de bioensayo 2xTYAG y se incubaron durante toda la noche a 30°C. Selección de la fase soluble (selección Biotina) Los anticuerpos fago se seleccionaron utilizando biotinilado hTrkB-EDC-Fc de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente con las excepciones siguientes. El fago pre-bloqueado se deseleccionó primero contra 100 nM de biotinilado PSGL-Fc seguido de una selección positiva en 100 nM de biotinilado hTrkB-EDC-Fc. Los fagos específicos TrkB humano se capturaron utilizando glóbulos estreptadivina magnéticos bloqueados (Dynalos glóbulos M-280 estreptavidina, Cat. No. 112.06). Los glóbulos se lavaron 10 veces con PBS/0.1% de Tween 20 y 3 veces con PBS. Los fagos unidos se eluyeron con 200 µl de 100 mM de TEA recientemente preparado (140 µl de TEA en 10 ml de agua ultra pura) y se neutralizaron utilizando 100 µl de estéril 1 M Tris-HCl pH 7.5 al fago eluido para neutralizar el TEA. Los fagos se infectaron en E . coli y propagados como se describió en la etapa anterior. Resca te de fagos Los E . coli infectados con fagos se desecharon de las placas agar de bioensayo y se mezclaron con 10 ml 2xTYAG por placa de bioensayo (2xTY con 100 µg/ml Amp y 2% glucosa) . Se inocularon 20 ml 2xTYAG con 100 µl de suspensión de células y se desarrollo a 37°C (300 rpm) a un OD a 600 nm = 0.3-0.5. Los E. coli se superinfectaron con 3.3 µl de fagos auxiliares MK13K07 y se incubaron a 37°C 150 rpm) durante 1 hora. Las células superinfectadas se re-suspendieron en 20 ml 2xTYAK medio (2xTY/100 µg/ml Amp/50 µg/ml canamicina) y se desarrollaron durante la noche a 25°C a 280 rpm. Los E. coli se centrifugaron a 3500 rpm durante 15 minutos y el sobrenadante que contiene el fago se utilizó para la próxima serie de selección. Preparación del an ticuerpo fago mediante ELISA Colonias únicas de E . coli infectadas se colocaron dentro de cavidades de microtitulación (Costat Cellwell) con un contenido de 150 ml de 2xTYAG medio (2% glucosa) por cavidad. Los clones fueron dejados desarrollarse a 37°C (100-120 rpm) durante 5-6 horas (OD a 600 nm = 0.5). Un stock de fagos auxiliares M13K07 (1013 pfu/ml) se diluyeron en 1:1000 con un medio 2xTYAG y se agregaron 20 µl a cada cavidad. Los cavidades se incubaron a 37°C (100 rpm) durante 1 hr. Las placas se centrifugaron a 3200 rpm durante 10 minutos, se removió el sobrenadante y las células se re-suspendieron en 150 µl de un medio 2xTYAK. Los cultivos se desarrollaron durante la noche a 25°C (120 rpm). Al día siguiente, las placas se centrifugaron a 3200 rpm durante 15 minutos y se transfirió el sobrenadante a una placa recién preparada para el ensayo ELISA para fagos. ELISA fago Las placas ELISA se recubrieron con 50 µl por cavidad de 1 µg/ml de hTrkB-EDC-Fc (BSA como un control) en PBS a 4°C durante la noche. Los cavidades se enjuagaron 3 veces con una PBS y se bloquearon con 300 µl por cavidad de PBS/3% de leche descremada a temperatura ambiente durante 1 hora. Los fagos se bloquearon con un volumen igual de PBS/6% de leche descremada y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. 50 µl de fagos bloqueados se agregaron a los cavidades ELISA y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron 3 veces con una PBS/0.1% de Tween seguido de 3 veces con una PBS. Se agregaron 50 µl de un anticuerpo anti-M13 HRP-Ratón en PBS/3% de leche descremada (1:5000, Amersham Pharmacia biotech, Cat. No. 27-9421-01) a cada cavidad y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron como antes y 50 µl de substrato TMB se agregó a cada cavidad y se desarrollaron durante 2-5 minutos. La reacción se detuvo agregando 50 µl de 0.5 M de ácido sulfúrico y la absorbancia se determinó a 450 nm. Preparación Fv de cadena-única mediante FACS Las colonias únicas se tomaron y se desarrollaron en placas microtituladoras de cavidad profundo con un contenido de 0.9 ml 2xTYAG medio a 37°C durante 5-6 horas. La expresión scFv se indujo agregando IPTG a una concentración final de 0.02 mM en un medio 2xTY y se desarrollaron a 30°C durante la noche. Los E . coli se cosecharon después de su desarrollo durante la noche y se sometieron a un shock osmótico con 150 µl de un regulador de pH TES diluido 1:5 en agua e incubado en hielo durante 30 minutos. Las células se centrifugaron y el sobrenadante se transfirió a una placa recién preparada para un ensayo FACS. 293 células transfectadas establemente con TrkB se tiñeron con scFv preparado como se describió. Las células se incubaron en hielo durante 30 minutos y luego lavadas con un regulador de pH PBS. Una cadena única Fv se detectó utilizando una solución con un contenido de anticuerpo anti myc 9E10 diluido 1:1.000 seguido por la adición de un anticuerpo IgG-Fc antiratón conjugado PE diluido 1:500. Las células teñidas se analizaron en un citómetro de flujo Bectin-Dickinson.

Resultados ELISA fago La Tabla 4 muestra los resultados de los ensayos ELISA fago de las diferentes selecciones de bibliotecas fago (selecciones solubles y movimiento horizontal). La Figura 18 muestra los datos ELISA de unión de fagos de un conjunto representativo de clones TrkB positivos (selección movimiento horizontal de biblioteca BMV) . La mayoría de los clones TrkB seleccionados mostraron una reacción fuerte y específica contra TrkB-EDC-Fc y no al control de la proteína PSGL-Fc. TABLA 4 ELISA fago Secuencia Antígeno (selección) Biblioteca (% positivos; (% diversidad) CS 78 53 TrkB-EDC-Fc (movimiento BMV 58 23 horizontal! DP-47 45 39 CS 100 Biotinilado TrkB-EDC-Fc BMV 50 (soluble) DP-47 10 50 Después de dos series de selecciones movimiento horizontal, un 78% de clones tomados en forma aleatoria de la biblioteca CS fueron positivos para la unión de TrkB-EDC-Fc pero no para la unión PSGL-Fc. De manera similar, 3% de los clones fueron positivos después de dos series de las selecciones solubles. Los miembros para las librerías BMV y DP-47 fueron un 58% y un 45% de clones positivos de una selección movimiento horizontal y un 6% y un 10% de selección soluble. Utilizando una secuenciación ADN, se confirmó que un 53% de los clones CS movimiento horizontal eran únicas, mientras un 100% de los clones de selección soluble CS eran únicos. Los números las bibliotecas BMV y DP-47 fueron un 23% y un 39% únicas de selecciones movimiento horizontal y un 50% y un 50% Y selecciones solubles. Análisis FACS La Figura 19 muestra la especificidad de unión de los anticuerpos scFv seleccionados de TrkB probados, utilizando el ensayo FACS. Los datos muestran que los anticuerpos scFv seleccionados de TrkB reaccionan con la membrana asociada de TrkB de una manera específica (histogramas llenados con azul) sin ninguna reactividad-cruzada a las células control (histogramas verdes abiertos). EJEMPLO 5 Este Ejemplo compara las actividades de unión del anticuerpo 29D7 TrkB y un fragmento Fab 29D7 contra TrkB de ratón y humano. Los TrkB (rhTrkB-EDC-Fc) de ratón y los (rmTrkB-EDC) humanos se recubrieron en placas ELISA como se describió en el Ejemplo 1 anterior. Las Figuras 20A y 20B muestran los resultados de unión ELISA para TrkB humano y ratón, respectivamente. Ambos anticuerpos IgG 29D7 y su fragmento Fab tienen actividades de unión dependiente de la dosis al TrkB humano y de ratón. Sin embargo, el valor de ED50 del Fab fue alrededor de 100 veces más bajo que aquel del intacto 27D7. Ni el control isotipo IgGl ni su fragmento Fab se unieron al TrkB. EJEMPLO 6 Este ejemplo compara las actividades agonistas del anticuerpo TrkB 29D7 y el fragmento Fab del Ejemplo 5 contra el TrkB humano. Las actividades agonistas se examinaron utilizando un ensayo luciferasa y células HEK-293 que expresan la superficie rhTrkB como se describió en el Ejemplo 1. Las células HEK-293 se trataron con IgG 29D7 o Fab 29D7 en las concentraciones indicadas y acumulando actividades luciferasa se midieron 16 horas después del tratamiento. Como se mostró en la Figura 21, ambos totales IgG y Fab de 29D7 indujeron actividades de luciferasa dependiente de la dosis, indicando actividad de TrkB. Sin embargo, el valor de EC5o de Fab 29D7 fue alrededor de 27 veces más alto que aquel IgG 27D7 (0.083 nM y 2.28 nM para IgG 27D7 y Fab 29D7, respectivamente). Ni el control isotipo IgGl ni su fragmento Fab tienen efectos en la activación de TrkB. EJEMPLO 7 Este ejemplo describe el análisis del mapeo epítopo de ciertos anticuerpos monoclonales TrkB de la invención. El mapeo se realizó contra péptidos lineales, con lazos únicos y con lazos dobles que fueron deducidos de secuencias dentro del dominio extracelular de TrkB humano. Como se muestra en la Figura 22, el anticuerpo monoclonal 17D11 reconoce el lazo-3 del segmento IgG-2 de los TrkB humano (KNEYGKD, SEC ID NO: 7, aminoácidos 364 a 370 de la SEC ID N0:1); y lazo-1 del segmento IgG-2 del TrkB humano (KGNPKP, SEC ID NO: 8, aminoácidos 308 a 313 de la SEC ID N0:1). La secuencia del ratón para el primer epítopo (KNEYGKD, SEC ID NO: 7, aminoácidos 364 a 370 de la SEC ID NO:2) es idéntico a la secuencia humana. La secuencia del ratón para el último epítopo (RGNPKP, SEC ID NO: 9, aminoácidos 308 a 313 de la SEC ID NO: 2) difiere en un aminoácido . Como se muestra en la Figura 22, los anticuerpos monoclonales 29D7, 7F5, 11E1 y 19E12 reconocen todos el lazo-3 del segmento IgG-1 del TrkB humano (ENLVGED, SEC ID NO: 10, aminoácidos 269 a 275 de la SEC ID NO:l); y también pueden reconocer el lazo-1 del segmento IgG-1 del TrkB humano (AGDPVP, SEC ID NO: 11, aminoácidos 221 a 226 de la SEC ID NO:l). La secuencia del ratón para el primer epítopo (ENLVGED, SEC ID NO: 10, aminoácidos 269 a 275 de la SEC ID NO: 2) es idéntica a la secuencia humana. La secuencia del ratón para el último epítopo (GGDPLP, SEC ID NO: 12, aminoácidos 221 a 226 de la SEC ID NO: 2) difiere en dos aminoácidos. EJEMPLO 8 Este ejemplo describe in vivo los experimentos de activación TrkB que se realizaron con los anticuerpos 29D7 anti-TrkB. En resumen los cachorros en P7 recibieron una inyección intracerebroventricular de 5 µl de 0.3 nmoles de, ya sea, de anticuerpo monoclonal anti-TrkB 29D7 o de un vehículo. Los tejidos cerebrales se diseccionaron 1, 2, 6, 12 y 24 horas después de la inyección. Los tejidos se Usaron y se separaron en iguales cantidades de muestras de proteínas (30 µg/cavidad) mediante SDS-PAGE y se sometieron a inmunotinción con anticuerpos específicos a proteínas que están fosforiladas como un resultados de la activación de TrkB (fosfo -ERK1/2 y fosfo -AKT) . Los anticuerpos contra la actina-ß se usaron como controles para verificar la carga equivalente de proteínas. Los resultados de la Figura 27 muestran que el anticuerpo monoclonal 29D7 anti-TrkB indujeron una fosforilación dependiente del tiempo de ERK1/2 y AKT (los datos de las muestras corticales y del hipocampo son conocidos y son representativos de los resultados obtenidos de otras cuatro muestras).

La Figura 28 es una cuantificación densitométrica de la fosforilación de ERK mostrada en la Figura 27. La Figura 29 es una cuantificación densitométrica de la fosforilación AKT mostrada en la Figura 27. La Figura 30 muestra un vehículo y los tejidos cerebrales tratados con 29D7 que se han fijado y marcado inmunofluorescentemente con un anticuerpo para el marcador específico neuronal NeuN (izquierdo) y un anticuerpo ERK1/2 anti-fosfo (centro) . Las figuras del lado derecho muestran estos dos fusionados. La fosforilación ERK1/2 es significativamente más fuerte en las muestras tratadas 29D7. La Figura 31 muestra el curso del tiempo de la activación ERK1/2 en los tejidos del hipocampo y corticales seguido de una inyección intracerebroventricular de anticuerpo monoclonal 29D7 anti-TrkB. EJEMPLO 9 Este ejemplo describe un ensayo de inhibición de la neurita inducido por MAG/mielina que fue realizado con un anticuerpo 29D7 anti-TrkB. En resumen, se agregaron alícuotas de 50 µl de MAG (1-5) de rata recombinante o mielina de rata purificada en placas de 96 cavidades de cultivo de tejido inferior plano y secado durante la noche con aire a temperatura ambiente. Las cantidades totales de MAG (1-5) o mielina fue de 0.25-0.5 µg por cavidad, salvo indicación diferente. Al día siguiente, las placas recubiertas con mielina o MAG se trataron con 50 µl de poli-D-lisina (17 µg/ml) durante 1.5 horas, seguido por la incubación en un medio con un contenido de un 10% de FBS durante 1 hora a 37°C. Después de la aspiración del medio, las células CGN de ratas se colocaron en placas a una densidad de 8.000 células/cavidades en un medio de crecimiento neurobasal-B27 con un contenido de 200 mM L-Glutamina, 2 M KCl, y 100 U/ml de penicilina y estreptomicina. Cuando se indicó, se agregaron reactivos de tratamiento al momento de revestir las células. Las neuronas se desarrollaron en un incubador a 37°C equilibrado con 5% C0 . Aproximadamente 20 horas después del revestimiento, las células se fijaron con un 4% de paraformaldehído y se procedió con la tinción Tujl. Las células se permeabilizaron con 0.2% de Tritón X/PBS (TPBS) durante 5 minutos a temperatura ambiente seguido por una incubación con 1.5% de suero de cabra normal en TPBS (S-TPBS) durante 30 minutos para bloquear una unión no-específica. Se agregó a las células una alícuota de anticuerpo monoclonal Clase III Tubulina-b de anti-Neuronal (Tujl, 1:1000; Covance # MMS-435P) . Después de 1 hora a temperatura ambiente, los anticuerpos no unidos se lavaron tres veces con PBS y se agregó una alícuota de anticuerpo IgG de ratón anti-cabra Alexa Flúor 488 (1:500, Sonda Molecular # A-11001) para visualizar las señales. Hoechst 33342 (Sonda Molecular # H-3570, 2 µg/ml) se incluyó para marcar el núcleo. Después del lavado, las placas se sellaron y se analizaron para su desarrollo de neurita utilizando un barrido de tipo Cellomics. Generalmente alrededor de 300 células de 9 campos se analizaron por cavidad y cada tratamiento se condujo en cuadruplicado. La MAG y la mielina inhiben el desarrollo de neurita en los cultivos de neuronas granulares cerebelares primarias. Las concentraciones incrementadas de MAG (1-5) de rata recombinante o mielina de rata purificada se recubrieron en placas de 96 cavidades de cultivo de tejidos y la extensión de neurita de las neuronas primarias se midieron a las 20 horas como se describió anteriormente. Como se muestra en la Figura 32, (A) MAG y (B) mielina resultaron en una inhibición del desarrollo de neurita dependiente de la dosis. Las neuronas CGN se recubrieron, ya sea, en placas recubiertas de MAG o mielina con el control o con el rango de concentraciones del anticuerpo 29D7 TrkB. La extensión de la neurita se midió 20 horas después del tratamiento. Como se muestra en la Figura 33, la 29D7 conlleva a un cambio total de la inhibición mediada por la neurita (A) MAG- y la (B) mielina. OTRAS MODALIDADES Otras modalidades de la invención serán aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la consideración de la especificación o la práctica de la invención aquí descrita. Se pretende que esta descripción y los ejemplos sean considerados solamente a modo de ejemplo, con el campo de aplicación verdadero estando indicado en las reivindicaciones siguientes. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : l.- Un anticuerpo monoclonal caracterizado porque se une al TrkB humano.
2.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la unión con el TrkB humano tiene un valor ED50 comprendido entre aproximadamente 10 pM y aproximadamente 500 nM.
3.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la unión con el TrkB humano tiene un valor ED50 comprendido entre aproximadamente 10 pM y aproximadamente 1 nM.
4. - El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la unión con el TrkB humano tiene un valor ED50 comprendido entre aproximadamente 10 pM y aproximadamente 100 pM.
5.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la unión con el TrkB humano tiene un valor ED50 comprendido entre aproximadamente 10 pM y aproximadamente 50 pM.
6.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal activa el TrkB humano con un valor EC5o comprendido entre aproximadamente 10 pM y aproximadamente 500 nM.
7.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal activa el TrkB humano con un valor EC50 comprendido entre aproximadamente 10 pM y aproximadamente 1 nM.
8. - El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal activa el TrkB humano con un valor EC50 comprendido entre aproximadamente 10 pM y aproximadamente 100 pM.
9.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal activa el TrkB humano con un valor EC50 comprendido entre aproximadamente 10 pM y aproximadamente 50 pM.
10.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal no se une y/o no activa al receptor humano TrkA.
11.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal no demuestra una unión perceptible con el TrkA humano y/o no causa ninguna activación perceptible del TrkA humano en concentraciones de anticuerpo superiores a alrededor de 1 nM.
12.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal no demuestra una unión perceptible con el TrkA humano y/o no causa ninguna activación perceptible del TrkA humano en concentraciones de anticuerpo superiores a alrededor de 10 nM.
13.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal no demuestra una unión perceptible con el TrkA humano y/o no causa ninguna activación perceptible del TrkA humano en concentraciones de anticuerpo superiores a alrededor de 100 nM.
14.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal no demuestra una unión perceptible con el TrkA humano y/o no causa ninguna activación perceptible del TrkA humano en concentraciones de anticuerpo superiores a alrededor de 1 µM.
15.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal no se une y/o no activa el TrkC humano.
16.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal no demuestra una unión perceptible con el TrkC humano y/o no causa ninguna activación perceptible del TrkC humano en concentraciones de anticuerpo superiores a alrededor de 1 nM.
17.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal no demuestra una unión perceptible con el TrkC humano y/o no causa ninguna activación perceptible del TrkC humano en concentraciones de anticuerpo superiores a alrededor de 10 nM.
18.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal no demuestra una unión perceptible con el TrkC humano y/o no causa ninguna activación perceptible del TrkC humano en concentraciones de anticuerpo superiores a alrededor de 100 nM.
19.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal no demuestra ninguna activación perceptible del TrkC humano en concentraciones de anticuerpo superiores a alrededor de 1 µM.
20.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal no se une y no activa el TrkC humano.
21.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal bloquea la unión entre el BDNF y el TrkB humano.
22.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal bloquea la unión entre el BDNF y el TrkB humano con un valor IC50 comprendido entre aproximadamente 100 pM y aproximadamente 500 nM.
23.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal bloquea la unión entre el BDNF y el TrkB humano con un valor IC50 comprendido entre aproximadamente 100 pM y aproximadamente 1 nM.
24.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal bloquea la unión entre BDNF y el TrkB humano con un valor IC50 comprendido entre aproximadamente 100 pM y aproximadamente 500 pM.
25.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal no bloquea la unión entre el BDNF y el TrkB humano.
26.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal no demuestra una actividad perceptible de bloqueo en concentraciones de anticuerpo superiores a aproximadamente 1 nM.
27.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal no demuestra una actividad perceptible de bloqueo en concentraciones de anticuerpo superiores a aproximadamente 10 nM.
28.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal no demuestra una actividad perceptible de bloqueo en concentraciones de anticuerpo superiores a aproximadamente 100 nM.
29.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal no demuestra una actividad perceptible de bloqueo en concentraciones de anticuerpo superiores a aproximadamente 1 µM.
30.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal tiene un isotipo IgGl.
31.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal tiene un isotipo IgG2a.
32.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal tiene un isotipo IgG2b.
33.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicación 1 a 32, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal se une y/o activa la TrkB murina.
34.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la unión con TrkB murina tiene un valor ED50 comprendido entre aproximadamente 10 pM y aproximadamente 500 nM.
35.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la unión con TrkB murina tiene un valor ED5o comprendido entre aproximadamente 10 pM y aproximadamente 1 nM.
36.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la unión con TrkB murina tiene un valor ED50 comprendido entre aproximadamente 10 pM y aproximadamente 500 pM.
37.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la unión con TrkB murina tiene un valor ED50 comprendido entre aproximadamente 10 pM y aproximadamente 100 pM.
38.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal se une a uno o ambos de los epítopos de TrkB humano con las secuencias KNEYGKD (SEC. ID. No. 7) y KGNPKP (SEC. ID. No. 8) .
39.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal además se une a uno o ambos de los epítopos de TrkB de ratón con las secuencias KNEYGKD (SEC. ID. No. 7) y RGNPKP (SEC. ID. No. 9) .
40.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal une a un epítopo de TrkB humano con la secuencia ENLVGED (SEC. ID. No. 10) y opcionalmente un epítopo de TrkB humano con la secuencia AGDPVP (SEC. ID. No.11).
41.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal además se une un epítopo de TrkB de ratón con la secuencia ENLVGED (SEC. ID. No. 10) .
42.- El anticuerpo monoclonal caracterizado porque se produce a partir del hibridoma depositado en el ATCC el 18 de agosto de 2005 y que se le concedió la designación de depósito de patente ATCC PTA-6948 o de una célula madre del mismo .
43.- El anticuerpo monoclonal caracterizado porque se produce a partir del hibridoma depositado en el ATCC el 18 de agosto de 2005 y que se le concedió la designación de depósito de patente ATCC PTA-6949 o de una célula madre del mismo.
44.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal se une al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 42.
45.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal se une al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 43.
46.- Un hibridoma caracterizado porque produce un anticuerpo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41.
47.- Un hibridoma caracterizado porque se depositó en el ATCC el 18 de agosto de 2005 y que se le concedió la designación de depósito de patente ATCC PTA-6948 o una célula madre del mismo.
48.- Un hibridoma caracterizado porque se depositó en el ATCC el 18 de agosto de 2005 y que se le concedió la designación de depósito de patente ATCC PTA-6949 o una célula madre del mismo.
49.- Un método caracterizado porque comprende: inmunizar a un animal con, al menos, dos inmunógenos proteicos que fueron derivados a partir de proteínas TrkB de diferentes especies; y - fusionar células esplénicas del animal inmunizado con células de mieloma para producir un hibridoma.
50.- El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque, al menos, dos inmunógenos proteicos incluyen un primer inmunógeno que fue derivado del TrkB humano y un segundo inmunógeno que fue derivado de un TrkB no-humano.
51.- El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el primer inmunógeno incluye el dominio extracelular del TrkB humano y el segundo inmunógeno incluye el dominio extracelular de un TrkB no-humano.
52. - El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el segundo inmunógeno incluye el dominio extracelular de un TrkB no-humano seleccionado del grupo que consiste de TrkB murina, TrkB de rata y TrkB de pollo.
53. - El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el segundo inmunógeno incluye el dominio extracelular de TrkB murina .
54 . - El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el primer inmunógeno y el segundo inmunógeno son administrados en la etapa de inmunización en cantidades (en peso) que tienen una proporción que es mayor que aproximadamente 1.
55. - El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque la proporción es mayor que aproximadamente 5.
56 . - El método de conformidad con la reivindicación 55 , caracterizado porque la proporción es aproximadamente 10 .
57 . - El método de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado porque el primer y segundo inmunógeno no incluyen cualquiera de los aminoácidos que se encuentran fuera del dominio extracelular del TrkB .
58 . - Un hibridoma , caracterizado porque fue elaborado de conformidad con el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49 a 57 .
59 . - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49 a 57 , caracteri zado porque además coraprende : - generar un anticuerpo monoclonal a partir del hibridoma .
60. - Un anticuerpo monoclonal caracterizado porque fue elaborado de acuerdo al método de conformidad con la reivindicación 59.
61. - Uso de un anticuerpo monoclonal, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41, para la manufactura de un medicamento útil para activar el TrkB humano en un individuo.
62. - El uso de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque el individuo sufre de una afección neurológica que requiere la activación del TrkB.
63. - El uso de conformidad con la reivindicación 61, en donde el sistema nervioso de dicho individuo ha sido lesionado por una herida, una cirugía, isquemia, una infección, una enfermedad metabólica, desnutrición, un tumor maligno o una droga tóxica.
64. - El uso de conformidad con la reivindicación 61, en donde el individuo ha sufrido un ataque de apoplejía, un daño a la médula espinal o una axotomía .
65 . - El uso de conformidad con la reivindicación 61 , en donde el individuo sufre una afección congénita o neurodegenerativa .
66 . - El uso de conformidad con la reivindicación 65 , en donde la condición está seleccionada a partir del grupo que consiste de la enfermedad de Al zheimer , enfermedad de Parkinson , enfermedad de Huntington o corea y esclerosis amiotróf ica lateral (ALS ) .
67 . - El uso de conformidad con la reivindicación 61 , en donde el anticuerpo monoclonal es administrando al individuo de forma parenteral .
68 . - El uso de conformidad con la reivindicación 61 , en donde el anticuerpo monoclonal es administrado al individuo de forma intravenosa o intraperitoneal .
69 . - Un método caracteri zado porque comprende : - combinar un anticuerpo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones l a 41 con una muestra que incluye una cantidad de TrkB humano bajo condiciones que permiten una unión específica entre el anticuerpo monoclonal y el TrkB humano; y - detectar la unión específica, de ese modo, indicando la presencia del TrkB humano en la muestra.
70. - Un método caracterizado porque comprende: - combinar un anticuerpo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41 con una muestra que incluye una cantidad de TrkB humano bajo condiciones que permiten una unión específica entre el anticuerpo monoclonal y el TrkB humano, de ese modo, produciendo un complejo de anticuerpo TrkB; - separar el complejo de anticuerpo TrkB humano del resto de la muestra; y - separar el anticuerpo del TrkB humano para , de ese modo , obtener un TrkB humano purificado .