MX2007014229A - Produccion de enzimas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con un procedimiento para producir una o varias enzimas deseadas en una celula hospedera, que comprende cultivar la celula hospedera capaz de producir una o varias de las enzimas deseadas bajo condiciones que llevan a la produccion de una o varias de las enzimas deseadas utilizando un sustrato para la celula hospedera que comprende material vegetal que contiene almidon licuado y/o sacarificado.

Description

PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un procedimiento para producir enzimas deseadas en una célula hospedadora.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las células hospedadoras microbianas se utilizan actualmente de manera extensa para la elaboración de enzimas por fermentación. Las enzimas, especialmente para uso industrial, por ejemplo enzimas para convertir materiales vegetales que contienen almidón en jarabes y/o productos de fermentación, se necesitan en grandes cantidades aunque únicamente se venden a precios relativamente bajos. Esto vuelve los costos de producción de enzima un factor importante para tener éxito en el mercado. El costo del sustrato puede constituir hasta 40-50 % del costo total de la producción de enzima. Los sustratos están disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar de acuerdo con composiciones publicadas (por ejemplo en catálogos de la American Culture Collection) . Los sustratos de fuente de carbono utilizados más comúnmente para la producción de enzimas son glucosa purificada y azúcares similares. La glucosa purificada y los azúcares similares son costosos. Por lo tanto, existe la REF. : 186837 necesidad de suministrar sustratos disponibles con facilidad y baratos que puedan sustituir a sustratos purificados costosos para la elaboración de enzimas deseadas utilizadas especialmente para aplicaciones industriales.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Un objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento para la elaboración de una o varias enzimas deseadas en una célula hospedadora utilizando un sustrato disponible con facilidad y barato como sustituto de la glucosa purificada o los sustratos similares usados actualmente. De acuerdo con un primer aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la elaboración de una o varias de las enzimas deseadas en una célula hospedadora, que comprende cultivar la célula hospedadora capaz de producir una o varias de las enzimas deseadas bajo condiciones que llevan a la producción de una o varias de las enzimas deseadas utilizando un sustrato para la célula hospedadora que comprende material vegetal que contiene almidón, licuado y/o sacarificado. La invención también se relaciona con el uso de material vegetal que contiene almidón licuado y/o sacarificado para la elaboración de una o varias enzimas deseadas en una célula hospedadora.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra SDS-PAGE de APE- [35-40). La figura 2 muestra hidrólisis de PCS versus carga de enzimas (proteina relativa en caldo/g de celulosa. APE-35 hasta AP3-37 son controles de suministro de glucosa, con celulosa en la alimentación y celulosa en lotes, como se anota . La figura 3 muestra la hidrólisis de PCS versus cargas de enzimas (volumen relativo de caldo/g de celulosa) . Las corridas de APE-35 a APE-37 son controles de alimentación de glucosa, con celulosa en la alimentación y celulosa en el lote, como se indica.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Un objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento para producir una o varias enzimas deseadas en una célula hospedadora utilizando un sustrato disponible fácilmente y barato que pueda sustituir a los sustratos costosos, que incluyen glucosa purificada, que se utilizan actualmente. Los inventores han encontrado sorprendentemente que un material vegetal que contiene almidón licuado y/o sacarificado, tal como macerado de maiz (es decir, maiz licuado), ventajosamente pueda sustituir a la glucosa purificada u otros azúcares similares como sustrato de carbono en procedimientos de elaboración de enzimas. Una de las ventajas de la invención es que las enzimas utilizadas para convertir material vegetal que contiene almidón en jarabes o productos de fermentación deseados se pueden elaborar utilizando sustratos disponibles de antemano en el sitio de producción. En otras palabras, se puede evitar o se por lo menos se puede reducir de manera significativa la necesidad de comprar sustratos costosos como fuente de carbono tal como glucosa purificada de proveedores externos dado que el sustrato para la elaboración de enzimas está disponible en el sitio .

Procedimiento para Elaboración de Enzimas La producción de enzimas en células hospedadoras de origen micótico tales como hongos filamentosos o de origen bacteriano es bien conocido en la técnica. El procedimiento de la invención es un procedimiento bien conocido excepto que el sustrato utilizado es material vegetal que contiene almidón licuado y/o sacarificado. Una célula hospedadora capaz de producir una o varias de las enzimas deseadas se hace crecer bajo condiciones de cultivo precisas a una velocidad de crecimiento particular. Cuando se introduce el cultivo de célula hospedadora en el medio de fermentación, el cultivo inoculado pasará a través de diversas etapas. Inicialmente no se produce crecimiento. Este periodo se denomina como la fase de retraso (lag) y se puede considerar un periodo de adaptación. Durante la siguiente fase, denominada como la "fase exponencial", se incrementa gradualmente la velocidad de crecimiento de la célula hospedadora. Después de un periodo de crecimiento máximo la velocidad cesa y el cultivo entra a la fase estacionaria. Después de un periodo de tiempo adicional el cultivo entra hacia la fase de muerte y el número de células viables disminuye. La mayor parte de las enzimas son producidas en la fase exponencial. No obstante, las enzimas también se pueden producir en la fase estacionaria o justo antes de la esporulación . En otras palabras, de acuerdo con la invención, la célula hospedadora se cultiva en un medio adecuado y bajo condiciones que permiten que una o varias de las enzimas se expresen y preferiblemente se secreten y opcionalmente se recuperen. El cultivo se lleva a cabo en un medio de fermentación que comprende: (a) uno o varios sustratos. De acuerdo con la presente invención, el sustrato de carbono es material vegetal que contiene almidón licuado y/o sacarificado. Los procedimientos de elaboración de enzimas son bien conocidos en la técnica. Las enzimas pueden ser extracelulares o intracelulares. En el contexto de la presente invención, una o varias de las enzimas consideradas preferiblemente, y de manera más principal son enzimas extracelulares secretadas al medio de fermentación por la célula hospedadora. Una o varias de las enzimas se pueden recuperar utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, en el caso de una o varias enzimas extracelulares, la recuperación del medio de fermentación se puede realizar por procedimientos convencionales que incluyen pero que no se limitan a centrifugación, filtración, extracción, secado por aspersión, evaporación o precipitación. Los procedimientos para recuperación de enzimas intracelulares también se conocen bien en la técnica. Por lo menos en el contexto de la presente invención, el término "cultivo" o "fermentación" significa cualquier procedimiento que produzca una o varias de las enzimas que se desean utilizando cultivo masivo de una o más células hospedadoras. La presente invención es útil para la elaboración de enzimas a escala industrial, por ejemplo que tienen un medio de cultivo de por lo menos 50 litros, de manera preferible por lo menos 100 litros, de manera más preferible por lo menos 500 litros, incluso de manera más preferible por lo menos 1000 litros, en particular por lo menos 5000 litros. El procedimiento de la invención se puede llevar a cabo como un lote, una alimentación-lote o una alimentación-lote repetida o bien un procedimiento continuo. El procedimiento de la invención se puede llevar a cabo aeróbica o anaeróbicamente . Algunas de las enzimas deseadas se producen por cultivo sumergido y algunas por cultivo en superficie. El cultivo sumergido es el más común para las enzimas deseadas producidas de acuerdo con la invención. De esta manera, de acuerdo con un primer aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la elaboración de una o varias enzimas deseadas en una célula hospedadora, que comprende cultivar a la célula hospedadora capaz de producir una o varias de las enzimas que se desean bajo condiciones que lleven a la producción de una o varias de las enzimas deseadas utilizando un sustrato para la célula hospedadora que comprende material vegetal que contiene almidón licuado y/o sacarificado.

Sustrato El sustrato utilizado en un procedimiento de la invención puede ser cualquier material vegetal que contenga almidón licuado y/o sacarificado. Se prefiere el material que contenga almidón que se selecciona del grupo que consiste de: tubérculos, raices y granos completos; y cualquier combinación de los mismos; en una modalidad, el material que contiene almidón se obtiene de cereales. El material que contiene almidón puede seleccionarse, por ejemplo, de los grupos que consisten de maiz, trigo, cebada, mandioca, sorgo, centeno, sorgo, agropiro y papa o cualquier combinación de los mismos. En una modalidad preferida el material vegetal licuado y/o sacarificado es macerado de maiz. En general, el macerado de maiz comprende 10-50% en peso de TS, preferiblemente 25-40% en peso de TS (sólidos totales). Aproximadamente 70% en peso de los TS de macerado de maiz es almidón. En una modalidad, el material vegetal que contiene almidón licuado y/o sacarificado es introducido, por lo menos parcialmente, en uno o varios tanques de fermentación antes del inicio del procedimiento de elaboración de enzima (es decir, el sustrato se suministra al tanque) y se utiliza como fuente de carbono durante el periodo de incubación inicial. Preferiblemente, el material vegetal que contiene almidón licuado y/o sacarificado se agrega, por lo menos parcialmente como alimentación de sustrato durante el periodo de tiempo del procedimiento de producción de enzima significativamente de la misma manera que la glucosa purificada agregada habitualmente en un procedimiento bien conocido en la técnica. En general, la gran mayoria del sustrato se agrega como alimentación de sustrato. La dosificación óptima de la alimentación del sustrato depende de una o varias de las enzimas producidas, la célula hospedadora y/o las condiciones de procedimiento seleccionadas. Por ejemplo, cuando se produce celulasa utilizando una cepa de Trichoderma tal como Trichoderma reesei como célula hospedadora la concentración de sustrato de fuente de carbono se mantiene baja, es decir, por debajo de 1 g de sustrato de fuente de carbono/1 tal como 1 g de glucosa/1. Un procedimiento de la invención puede durar por el mismo periodo de tiempo que un procedimiento correspondiente utilizando, por ejemplo, glucosa purificada. Las fermentaciones con Trichoderma en general duran entre 5 y 9 dias. En una modalidad, el material vegetal que contiene almidón licuado y/o sacarificado se filtra (es decir, macerado de maiz filtrado (FCM) por ejemplo como se describe en la sección de "preparación de FCM" en la sección de "materiales y métodos" posteriormente. El sustrato filtrado de manera cruda permite el bombeo fácil del sustrato a las lineas de alimentación. No obstante, debe entenderse que el filtrado del material vegetal que contiene almidón licuado y/o sacarificado no es obligatorio. No obstante, si la concentración del sustrato licuado y/o sacarificado, por ejemplo FCM está demasiado diluido, por ejemplo en menos de 200 g de sustrato/1, puede no ser adecuado para alimentación como sustrato. Por lo tanto, el sustrato/alimentación de sustrato de acuerdo con la invención se puede concentrar y/o se puede combinar con uno u otros sustratos con el fin de incrementar la concentración de sustrato hasta una concentración adecuada. Se prefiere que la concentración de alimentación de sustrato está por encima de 200 g de sustrato/1, preferiblemente por encima de 400 g de sustrato/1, de manera preferible por encima - lu ¬ de 500 g de sustrato/1, y de manera más preferible a aproximadamente 600 g de sustrato/1, por ejemplo, entre 300 y 800 g de sustrato/1, preferiblemente entre 400 y 700 g de sustrato/1, por ejemplo en aproximadamente 600 g de sustrato/1, . El material vegetal que contiene almidón licuado y/o sacarificado puede ser el único sustrato o la fuente de sustrato de carbono agregada durante el periodo de tiempo de elaboración de una o varias de las enzimas que se desean o puede constituir un porcentaje significativo del mismo, tal como por lo menos 10% en peso, preferiblemente por lo menos 30% en peso, de manera más preferible por lo menos 50% en peso, de manera más preferible por lo menos 70% en peso, incluso de manera más preferible por lo menos 90% en peso o de manera mucho más preferible por lo menos 95% en peso de todos los sustratos o sustratos de fuente de carbono. Otras fuentes de carbono o sustratos tales como glucosa (purificada) o sustrato similares pueden constituir la parte remanente del sustrato que comprende al sustrato licuado y/o sacarificado. Se pueden agregar fuentes de nitrógeno, inductores y otros estimuladores de crecimiento para mejorar la fermentación y producción de enzima. Las fuentes de nitrógeno incluyen amoniaco (NH4C1) y péptidos. Se puede utilizar proteasa, por ejemplo para digerir proteina para producir nitrógeno amino libre (FAN). Tales aminoácidos libres pueden funcionar como nutrientes para la célula hospedadora, por lo que incrementan el crecimiento y la producción de enzimas. Los estimuladores de fermentación preferidos para crecimiento incluyen vitaminas y minerales. Los ejemplos de vitaminas incluyen multivitamina, biotina, pantotenato, ácido nicotinico, meso-inositol, tiamina, piridoxina, ácido para-aminobenzoico, ácido fólico, rivoflavina y vitaminas A, B, C, D y E. Los ejemplos de minerales incluyen minerales y sales minerales que pueden suministrar nutrientes que comprenden P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn y Cu. Ya sea que se agrega un inductor y dependiendo del inductor que se agregue, depende también de la célula hospedadora y una o varias de las enzimas deseadas que se van a producir. Por ejemplo, cuando se producen celulasas, la celulosa con frecuencia se utiliza como un inductor. De acuerdo con la invención el material vegetal que contiene almidón licuado y/o sacarificado (es decir, el sustrato) se puede agregar al medio de cultivo ya sea antes de la inoculación o después de la inoculación del cultivo de célula hospedadora en una cantidad que corresponde a la cantidad de glucosa purificada o un sustrato de fuente de carbono similar usado normalmente (sustituido/reemplazado de acuerdo con la invención) . Esto significa que el material vegetal licuado y/o sacarificado se puede agregar en una cantidad que es igual a la de la glucosa utilizada normalmente. En otras palabras, la relación del material vegetal que contiene almidón licuado y/o sacarificado respecto a la glucosa (es decir kg de material vegetal licuado y/o sacarificado por kg de glucosa u otro sustrato de fuente de carbono similar) es de aproximadamente 2:1 a 3:1. No obstante, como se menciona en lo anterior, el material vegetal licuado y/o sacarificado también se puede concentrar o combinar con otros sustratos con el fin de obtener una concentración adecuada como se menciona en lo anterior. Como se menciona en lo anterior, el material vegetal que contiene almidón licuado y/o sacarificado se utiliza de la misma manera que el uso normal de la glucosa purificada como sustrato en los procedimientos de elaboración de enzimas bien conocidos. La concentración del sustrato durante un procedimiento de la invención corresponde a una concentración de glucosa bien conocida en los procedimientos en la técnica pero depende en cierta medida de una o varias de las enzimas que se desean. Una persona experta en la técnica puede determinar con facilidad que cantidad de sustrato agregar durante un procedimiento de la invención. Se puede encontrar una guia adicional, por ejemplo en Biochemical Engineering Fundamentáis por James E Bailey and David F. Ollis, Segunda Edición, McGraw-Hill Book Company 1986. De acuerdo con la invención, el "material vegetal que contiene almidón licuado" significa un material vegetal que se ha sometido a hidrólisis por amilasa, tal como una -amilasa o con tratamiento ácido por un periodo de tiempo adecuado. En una modalidad preferida, el material vegetal tiene un tamaño de particula reducido, por ejemplo por medio de molido en seco o en húmedo, antes de la hidrólisis para incrementar la accesibilidad a la superficie del material vegetal . El material vegetal que contiene almidón o el material vegetal licuado también se puede sacarificar. El término "sacarificado" significa que el material vegetal, por ejemplo maltodextrina (tal como un material vegetal que contiene almidón licuado) o el material vegetal que contiene almidón no cocinado se convierte a azúcares de peso molecular bajo por ejemplo DP?_3, tal como glucosa y maltosa (es decir, una fuente de carbohidratos) que pueden ser metabolizados por la célula hospedadora en cuestión. Una ventaja de la invención es que el material vegetal licuado y/o sacarificado puede estar disponible en el sitio de producción de enzima. El procedimiento de la invención es adecuado especialmente para la producción de enzimas en lugares en donde el material que contiene almidón se convierte de antemano en un sustrato adecuado. En otras palabras, el procedimiento de la invención es especialmente adecuado en lugares en donde, por ejemplo, se produce una corriente de procedimiento que contiene glucosa o almidón para uso en la producción de jarabe o en un procedimiento de fermentación. No obstante, el material vegetal licuado y/o sacarificado también se puede producir con el propósito de ser utilizado como un sustrato para la producción de enzima de acuerdo con la invención. El procedimiento de la invención es especialmente ventajoso en casos en donde el material vegetal licuado y/o sacarificado es un producto intermedio en, por ejemplo, procedimientos de elaboración de almidón a jarabe o de almidón a producto de fermentación. Esto vuelve al sustrato en especial fácilmente disponible y barato para la producción de enzimas en el lugar.

Enzimas deseadas Una o varias de las enzimas producidas de acuerdo con el procedimiento de la invención puede ser cualquier enzima. Las enzimas preferidas son hidrolasas (clase EC 3, de acuerdo con la nomenclatura de enzimas) , que incluyen especialmente celulasas, hemicelulasas, amilasas, glucoamilasas u otras hidrolasas, especialmente utilizadas para convertir materiales vegetales en jarabes y sustratos de fermentación, por ejemplo convertidos por una levadura en etanol. La enzima puede ser homologa o heteróloga a la célula hospedadora. El término "enzima homologa" significa una enzima codificada por un gen que se deriva de la célula hospedadora en la cual se produce. El término "enzima heteróloga" significa una enzima codificada por un gen el cual es extraño a la célula hospedadora en la cual se produce. En una modalidad, la enzima deseada es una enzima de monocomponente. En otra modalidad, la enzima deseada es una preparación de enzima o un complejo de enzima que consiste de dos o más enzimas derivadas de una célula hospedadora de tipo silvestre o un mutante del mismo. Un ejemplo de un complejo de enzima es el complejo de celulasa bien conocido que comprende endoglucanasa, exo-celobiohidrolasa y ß-glucosidasa . Un ejemplo de una preparación de enzimas es el complejo de celulasa mencionado antes en donde uno o más genes que codifican para enzimas, por ejemplo uno o más genes para endoglucanasa se han suprimido de la célula hospedadora natural. Un complejo de celulasa o una preparación se puede elaborar por una célula hospedadora natural o un mutante de la misma. En una modalidad, una o varias de las enzimas se producen de manera recombinante en una célula hospedadora recombinante adecuada diferente de la célula donadora de la cual se deriva el gen que codifica para la enzima. Una o varias de las enzimas deseadas pueden ser extracelulares o intracelulares. Se prefieren las enzimas extracelulares. Una enzima deseada también puede ser una variante de una enzima natural.

Celulasa y Hemicelulasa Una célulasa y/o hemicelulasa puede ser la enzima deseada producida de acuerdo con la invención. Las hemicelulasas contempladas incluyen xilanasas, arabinofuranosidasas, acetilxilanoesterasas, glucuronidasas, endo-galactanasa, manasas, endo- o exo-arabinasas y exo-galactanasas . Las celulasas contempladas incluyen aquellas de origen bacteriano o micótico. Se incluyen las variantes modificadas químicamente o sometidas a ingeniería proteinica. Las celulasas adecuadas incluyen celulasas de los géneros Bacillus , Pseudomonas , Humi cola , Fusari um , Thielavia , Acremoni um y Trichoderma , por ejemplo, celulasas micóticas producidas por Humí cola insolens , Myceliophtora , thermophila , Thielavia terrestris , Fusarium oxysporum y Trichoderma reesei . En una modalidad preferida, la enzima deseada es el complejo de celulasa el cual se produce de manera homogénea por Tri choderma reesei . En otra modalidad preferida, la enzima deseada es una preparación de celulasa producida de manera heteróloga en Trichoderma reesei, en donde se producen una o más hidrolasas extrañas a Trichoderma reesei . En otra modalidad, la enzima deseada es el complejo de celulasa el cual se produce de manera homologa en Humi cola insolens .

Amilasa Una amilasa puede ser la enzima deseada producida de acuerdo con la invención. Las amilasas contempladas incluyen a-amilasas, ß-amilasas y amilasas maltogénicas. Una a-amilasa se puede derivar del género Ba cillus, tal como derivada de una cepa de B . licheniformis , B . amyloliquefaciens, B . sul tilis y B. stearothermophilus . Otras a-amilasas incluyen a-amilasa derivada de la cepa del género Ba cillus NC1B 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 o DSM 9375, la totalidad de los cuales se describen con detalle en WO 95/26397 o la a-amilasa descrita por Tsukamoto et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988), pp. 25-31. Otras a-amilasas incluyen a-amilasas derivadas de hongos filamentosos, preferiblemente una cepa de Aspergillus tal como Aspergillus oryzae y Aspergillus niger. En una modalidad preferida, la enzima deseada es una a-amilasa derivada de Aspergillus oryzae tal como una que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 10 en WO 96/23874 la cual se incorpora en la presente como referencia) . La enzima deseada también puede ser una a-amilasa derivada de A . niger, especialmente una descrita como "AMYA_ASPNG" en la base de datos Swiss-prot/TeEMBL bajo el acceso primario número P56271.

La enzima deseada también puede ser una ß-amilasa tal como un cualquiera de las ß-amilasas vegetales o de microorganismos descritas en W. M. Fogarty and C.T. Kelly, Progress in Industrial Microbiology, vol. 15, pp. 112-115, 1979 (la cual se incorpora en la presente como referencia) . La enzima deseada también puede ser una amilasa maltogénica. Una "amilasa maltogénica" (glucano 1,4-a-maltohidrolasa, E.C. 3.2.1.133) es susceptible de hidrolizar amilosa y amilopectina a maltosa en la configuración a. Una amilasa maltogénica contemplada específicamente es aquella derivada de Bacill us stearothermopilus cepa NCIB 11837. Las a-amilasas maltogénicas se describen en las patentes de E.U.A. números 4,598,048, 4,604,355 y 6,612,628, las cuales se incorporan en la presente como referencia.

Glucoamilasa Una glucoamilasa puede ser la enzima deseada producida de acuerdo con la invención. Una glucoamilasa se puede derivar de cualquier fuente adecuada, por ejemplo derivada de un microorganismo o una planta. Las glucoamilasas preferidas son de origen micótico o bacteriano, por ejemplo seleccionadas del grupo que consiste de glucoamilasas de Aspergill us, en particular las glucoamilasas Gl o G2 de A. niger (Boel et al., 1984, EMBO J. 3:5, p. 1097-1102); la glucoamilasa de A . awamori (WO 84/02921) , la glucoamilasa de A . oryzae (Agrie. Biol. Chem., 1991, 55:4, p. 941-949). Otras glucoamilasas incluyen la glucoamilasa de Athelia rolfsii (indicada previamente como Corti cum rolfsii ) (véase la patente de E.U.A. número 4,727,026 y (Nagasaka, Y. et al., (1988) Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases from Corticum rolfsii , Appl Microbiol Biotechnol 50:323-330). Las glucoamilasas de Talaromyces, en particular derivadas de Talaromyces emersonii (WO 99/28448), Talarymices leycet tanus (patente de los E.U.A. número Re 32,153), Talarymi ces dupon ti , Talarymices thermophilus (patente de los E.U.A. número 4,587,215). Las glucoamilasas bacterianas contempladas incluyen glucoamilasas del género Clostridium, en particular CJ thermoamylolyticum (EP 135,138) y C. thermohydrosulfuricum (WO 86/01831) .

Célula hospedadora capaz de producir enzimas La célula hospedadora puede ser de cualquier género. Como se menciona en lo anterior la enzima deseada puede ser homologa o heteróloga a la célula hospedadora capaz de producir una o varias de las enzimas deseadas. Como se utiliza en la presente, el término "célula hospedadora recombinante" significa una célula hospedadora la cual alberga uno o varios genes que codifican para una o varias de las enzimas deseadas y que es capaz de expresar dicho gen para producir una o varias de las enzimas deseadas.

El gen o los genes que codifican para una o varias de las enzimas deseadas se pueden transformar, transfectar, transducir o similares en una célula hospedadora recombinante utilizando técnicas bien conocidas en el arte. Cuando una o varias de las enzimas deseadas son enzimas heterólogas, la célula hospedadora recombinante capaz de producir una o varias de las enzimas deseadas preferiblemente son de origen micótico o bacteriano. La selección de la célula hospedadora recombinante también en gran medida dependerá de uno o varios de los genes que codifican para una o varias de las enzimas deseadas y la fuente de dicha enzima. El término "célula hospedadora natural", como se utiliza en la presente se refiere a una célula hospedadora que alberga de manera natural uno o varios genes que codifican para una o varias de las enzimas deseadas y que es capaz de expresar uno o varios de dichos genes. Cuando una o varias de las enzimas deseadas son preparaciones de enzimas homologas o complejo de la célula hospedadora natural o un mutante de la misma capaz de producir una o varias de las enzimas deseadas, preferiblemente pueden ser de origen micótico o bacteriano. Un "mutante de la misma" puede ser una célula hospedadora natural en la cual se han suprimido uno o más genes, por ejemplo con el fin de enriquecer la preparación de enzima deseada en cierto componente. Una célula hospedadora natural mutante también puede ser una célula hospedadora natural transformada con uno o más genes adicionales que codifican para las enzimas adicionales con el fin de introducir una o más actividades de enzima adicionales en el complejo de enzima deseado o la preparación producida de manera natural por la célula hospedadora de tipo natural. La enzima adicional puede tener la misma actividad (por ejemplo actividad de celulasa) o simplemente ser otra molécula de enzima, por ejemplo con propiedades diferentes. La célula hospedadora natural mutante también puede tener genes codificantes para enzima homólogos adicionales transformados, transfectados, transducidos o similares integrados preferiblemente en el genoma, con el fin de incrementar la expresión de dicho gen para producir más enzima. En una modalidad preferida, la célula hospedadora recombinante o natural es de origen de hongo filamentoso. Los ejemplos de células hospedadoras incluyen aquellas que se seleccionan del mismo que comprende células de Acremoni um , Aspergillus , Aureobasidium, Bjerkandera , Ceriporiopsis , Coprinus , Coriolus , Cryptococcus , Filobasidum , Fusarium , Humicola , Mgnaporthe , Mucor, Myceliophtora , Neocallimastix, Neurospora , Paecilomyces , Penicillium, Phanerochaete, Phlebia , Piromyces , Pleurotus , Schízophyll um , Talaromyces , Thermoascus , Thielavia , Tolypocladi um , Trametes o Tri choderma . En una modalidad más preferida, la célula hospedadora de hongo filamentoso se selecciona del grupo que comprende una cepa de Aspergill us awamori , Aspergillus fumiga tus , Aspergillus foetidus , Aspergillus japonicus , Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae . En otra modalidad preferida, la célula hospedadora de hongo filamentoso es de una cepa de Fusarium bactridioides , Fusarium cerealis , Fusarium crookwellense , Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi , Fusarium oxysporum, Fusarium reticula tum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides , Fusarium sulphurem , Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides o Fusarium venenatum . En otra modalidad preferida, la célula hospedadora de hongo filamentoso se selecciona del grupo que consiste de una cepa de Bjerkandera adusta , Ceriporiopsis aneirina , Ceriporiopsis aneririna , Ceriporiopsis caregiea , Ceriporiopsis gilvescens , Ceriporiopsis pannocinta , Ceriporiopsis rivulosa , Ceriporiopsis subrufa o Ceriporiopsis subvermispora , Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa , Mucor miehie, Myceliophthora thermophila , Neurospora crassa , Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radia ta , Pleudotus eringii , Thielavia terrestris , Trametes villosa , Trama tes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viridel .

En otra modalidad preferida, la célula hospedadora recombinante o natural es de origen bacteriano. Los ejemplos de células hospedadoras incluyen aquellos que se seleccionan del grupo que comprende de bacterias grampositivas tales como una cepa de Bacillus, por ejemplo Bacillus alkalophil us , Bacillus amyloliquefaciens , Bacillus brevis , Bacillus circulans , Bacillus coagulans , Bacillus lautus , Bacillus lentus, Bacillus licheniformis , Bacillus mega terium, Bacillus stearothermophilus , Bacillus subtilis o Bacillus thuringiensis; o de una cepa de Streptomyces, por ejemplo Streptomyces lividans o Streptomyces murinus; o de una bacteria gramnegativa, por ejemplo E . coli o del género Pseudo/nonas.

Uso En un segundo aspecto, la invención se relaciona con el uso de material vegetal que contiene almidón licuado y/o sacarificado para la elaboración de una enzima deseada en una célula hospedadora. La invención descrita y reclamada en la presente no se limita en alcance por las modalidades especificas que se describen en la presente, dado que estas modalidades se diseñaron como ilustraciones de varios aspectos de la invención. Cualquiera de las modalidades equivalentes se considera que están dentro del alcance de la invención. En realidad se volverán evidentes para aquellos expertos en la técnica diversas modificaciones de la invención además de las mostradas y descritas en la presente, a partir de la descripción que sigue. Tales modificaciones también se pretende que se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. En caso de contradicción, la presente descripción incluyendo las definiciones será la que preserve. Las diferentes referencias que se mencionan en la presente, sus descripciones se incorporan como referencia en su totalidad.

MATERIALES Y MÉTODOS Materiales Trichoderma reeseí SMA135-04 se describe en el ejemplo 8 de la publicación de patente de E.U.A. número 2005/0233423 PREPARACIÓN DE METALES EN TRAZAS PREPARACIÓN DE MATRAZ DE SIEMBRA INOCULACIÓN DEL MATRAZ DE SIEMBRA ADICIONES POSTESTERILIZACION (Agente de Control de Espuma) Ejemplo 1 Utilidad del macerado de maíz licuado y sacarificado para producción de enzimas de celulasa Se calientan granos de maíz molidos de manera gruesa en agua y se tratan con a-amilasa ( TERMAMYLMRSC de Novozymes) para licuar la mezcla espesa la cual contiene aproximadamente 34% de peso seco de sólidos. Esta mezcla se sacarifica por la adición de glucoamilasa (SPIRIZYMEMR FUEL de Novozymes) y se incuba a 65°C durante 48 horas. Esta mezcla se centrifuga a aproximadamente 4500 x g durante 10 minutos para separar los sólidos insolubles, se filtra a través de Miracloth (Calbiochem) y el sobrenadante del macerado de maíz filtrado resultante (FCM) se somete a análisis para determinar el contenido de azúcar por análisis de CLAP utilizando una columna Aminex HPX87H (BioRad) que eluye con ácido sulfúrico 5 mM con detección por un detector de índice de refracción (Agilent) . Se utilizan soluciones estándar de glucosa, celobiosa, xilosa y etanol para calibración de la cuantificación de azúcares y etanol detectado. La concentración típica de glucosa en el jarabe de sobrenadante de macerado de maíz de azúcar es de aproximadamente 300 g/litro. Las fermentaciones se realizan en recipientes con chaqueta de vidrio Applikon 2 1 los cuales tienen un volumen de trabajo de 1.8 1. Se mide la temperatura por termopares electrónicos y se controla utilizando un baño de agua circulante. El oxígeno disuelto y el pH se miden utilizando sondas de sensor adquiridas de Broadley James Corporation. Un controlador ADI 1030 permite un control de retroalimentación proporcional para ajustar el pH utilizando bombas de suministro de ácido y base que se basan en el punto establecido de pH y una banda inactiva. Se utilizan los controladores del agitador ADI 1012 para activar un motor Applikon P310 para agitar el caldo a velocidades que varían de 1100 a 1300 rpm. Se utilizan impulsores de flujo radial Rushton sin deflectores. Se airea el caldo utilizando un flujo de aire estéril a un caudal de aproximadamente 1 vvm; el aire entra por medio de un purgador que se localiza en el fondo del tanque, debajo del impulsor. Las fermentaciones se llevan a cabo utilizando Tri choderma reesei cepa SMA-135-04. Se han preparado concentrados de congelado de glicerol y se utilizan como inoculo para los matraces de siembra. Los matraces de siembra se someten a crecimiento como se muestra en la tabla siguiente. Algunos inóculos se reducen en volumen como se muestra. La fermentación de Trichoderma reesei cepa SMA-135-04 dura aproximadamente 165 horas, momento en el cual se cosecha el tanque. Se utiliza una alimentación de glucosa con celulosa en la alimentación para inducir producción de celulasa. Se utiliza el tensioactivo PluronicMR (BASF) para reducir el espumado según se necesite. Los ejemplos con alimentados de glucosa (APE-35, -36, 37) se comparan con los alimentados de filtrado de macerado de maíz (APE-38, -39, -40) .

MEDIO DE FERMENTACIÓN COMPOSICIÓN DE ALIMENTACIÓN CONDICIONES DE OPERACIÓN Las alícuotas de los caldos de fermentación final se diluyen 5 veces en agua DDI . Después 1 volumen de muestra diluida se mezcla con 2 volúmenes de amortiguador de muestra SDS (BioRad) mezclado con ß-mercaptoetanol 5% y que se somete a ebullición durante 5 minutos. Se cargan 15 µl de cada muestra en gel Tris-HCl 8-16% (BioRad) , se somete a electroforesis y se tiñe con azul de Coomassie BioSafe (figura 1) . APE35-40 muestra una banda clara a ~18 kD, también muestra una banda a <10 kD. Como se observa en el gel, la proteína expresada en APE-38, -39 y -40 son mayores que las fermentaciones que contienen glucosa. Se miden las actividades de los caldos de enzima para determinar su capacidad para hidrolizar maíz creado en el horno pretratado con ácido diluido (PCS) y producir azúcares detectables por un análisis químico de sus extremos reductores. Se proporciona PCS por el National Renewable Energy Laboratory (NREL, Golden CO) con un contenido de glucano de 53.2% (datos de NREL). Se suspende 1 kg de PCS en -20 litros de agua doble desionizada en una cubeta y, después de que sedimenta PCS, se decanta el agua. Esto se repite hasta que el agua de lavado se encuentra a un pH superior a 4.0, momento en el cual los azúcares reductores son menores de 0.06 g/1. La suspensión sedimentada se tamiza a través de cribas de malla 100 para asegurar capacidad de pipeteo. Se determina el porcentaje de contenido en peso seco de PCS lavado mediante secado de la muestra en un horno a 105°C durante más de 24 horas (hasta peso constante) y se compara con el peso húmedo. La hidrólisis por PCS se realiza en placas de 96 pozos profundos (Axygen Scientific) sellados por un sellador de placa (ALPS-300, ABgene) . La concentración de PCS es de 10 g/1, con acetato 50 mM, pH 5.0. La hidrólisis por PCS se realiza a 50°C con un volumen de reacción total de 1.0 ml, sin agitación adicional. Cada reacción se realiza por triplicado. Los azúcares reductores liberados se analizan mediante un reactivo de hidrazida y ácido p-hidroxibenzoico (PHBAH) como se describe en lo siguiente. Con detalle, se pipetean 0.8 ml de PCS (12.5 g/1) dentro de cada pozo de las placas de 96 pozos profundos, a esto se le agregan 0.10 ml de amortiguador de acetato de sodio (0.5 M, pH 5.0) y después se agregan 0.10 ml de solución de enzima diluida para iniciar la reacción y proporcionar el volumen de reacción final de 1.0 ml y una concentración de PCS de 10 g/1. La mezcla de reacción se mezcla al invertir la placa de pozo profundo al inicio de la hidrólisis y antes de tomar cualquier muestra de punto de tiempo. Después del mezclado, la placa de pozo profundo se centrifuga (Sorvall RT7 con un rotor RTH-250) a 3000 rpm durante 2 minutos antes de que se extraigan 20 µl de hidrolizado (sobrenadante) y se agreguen a 180 µl de NaOH 0.4% en una microplaca de 96 pozos. Esta solución detenida se diluye adicionalmente en el intervalo apropiado de azúcares reductores si es necesario.

Los azúcares reductores liberados se analizan por medio del reactivo de hidrazida de ácido para-hidroxibenzoico (PHBAH, Sigma, 4-hidroxibenzhidrazida) : 50 µl de reactivo PHBAH (1.5%), se mezcla con una muestra de 100 µl en una placa Thermowell de 96 pozos de fondo en V (Costar 6511) , se incuba en un bloque de calentamiento de placa a 95° durante 10 min y después se agregan a cada pozo 50 µl de agua DDI, se mezclan y se transfieren 100 µl a otra placa de 96 pozos de fondo plano (Costar 9017) y se lee la absorbancia a 410 nm. Se calcula el azúcar reductor utilizando una curva de calibración de glucosa bajo las mismas condiciones. Se calcula el porcentaje de conversión de celulosa a azúcares reductores como: porcentaje de conversión = azúcares reductores (mg/ml) / (celulosa agregada (mg/ml) x 1.11) El factor de 1.11 corrige la ganancia en peso de la celulosa hidrolizante a glucosa. APE-39 produce los segundos niveles más altos de proteína (figura 3), produce también la mezcla de celulasa más eficaz de las fermentaciones utilizando macerado de maíz (figura 2). Todas las fermentaciones muestran producción de actividad de celulasa. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (22)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un procedimiento para producir una o varias de las enzimas deseadas en una célula hospedadora, caracterizado porque comprende cultivar dicha célula hospedadora capaz de producir una o varias de las enzimas deseadas bajo condiciones que lleven a la producción de una o varias de las enzimas deseadas utilizando un sustrato para la célula hospedadora que comprende un material vegetal que contiene almidón licuado y/o sacarificado .
2. 2. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula hospedadora es una célula hospedadora recombinante o una célula hospedadora natural o un mutante de la misma.
3. 3. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la célula hospedadora es de origen bacteriano o micótico.
4. 4. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la enzima es una hidrolasa (clase EC 3, de acuerdo con la nomenclatura de enzimas), preferiblemente una celulasa, hemicelulasa, amilasa o glucoamilasa.
5. 5. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la enzima deseada es un complejo/preparación de células producido por una célula hospedadora natural o un mutante de la misma, preferiblemente una célula hospedadora natural o un mutante de la misma del género Tri choderma , preferiblemente una cepa de Trichoderma reesei .
6. 6. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 4 , caracterizado porque la enzima deseada es una preparación de celulasa producida por una célula hospedadora de recombinación, preferiblemente una célula hospedadora de recombinación del género Trichoderma , especialmente una cepa de Tri choderma reesei .
7. 7. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la enzima deseada es un complejo/preparación de celulasa producido por una cepa del género Humi cola , preferiblemente una cepa de Humicola insolens .
8. 8. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la enzima deseada se produce en un tanque de por lo menos 50 litros.
9. 9. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el material vegetal que contiene almidón licuado y/o sacarificado constituye por lo menos 50% (p/p) del sustrato agregado sobre el intervalo de tiempo de la fermentación.
10. 10. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el material vegetal que contiene almidón licuado y/o sacarificado se filtra antes del uso.
11. 11. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, Caracterizado porque el sustrato se agrega por lo menos parcialmente como una alimentación de sustrato durante el intervalo de tiempo del procedimiento de producción de la enzima deseada.
12. 12. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, Caracterizado porque el material vegetal que contiene almidón licuado y/o sacarificado se concentra a una concentración superior a 200 g de sustrato/1 antes del uso.
13. 13. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la concentración de alimentación del sustrato es superior a 200 g de sustrato/1, preferiblemente de aproximadamente 600 g de sustrato/1.
14. 14. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la concentración de sustrato durante la fermentación se mantiene por debajo de 1 g de sustrato/1.
15. 15. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el material vegetal que contiene almidón licuado y/o sacarificado se deriva de tubérculos, raíces o granos completos; o cualquier combinación de los mismos.
16. 16. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el material que contiene almidón se deriva de maíz, mandioca, trigo, cebada, centeno, sorgo, agropiro, y papas; o cualquier combinación de los mismos.
17. 17. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque el material vegetal que contiene almidón licuado y/o sacarificado es una corriente lateral o compartida de la elaboración del producto de fermentación tal como producción de etanol.
18. 18. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque el sustrato se prepara a partir de un material vegetal que contiene almidón que ha sido licuado utilizando una a-amilasa o se ha sometido a tratamiento ácido.
19. 19. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque el sustrato se prepara a partir de un material vegetal que contiene almidón o un material vegetal que contiene almidón licuado que ha sido sacarificado utilizando una glucoamilasa.
20. 20. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque la enzima deseada se recupera después de fermentación.
21. 21. El uso de un material vegetal que contiene almidón licuado y/o sacarificado como un sustrato para producir enzimas en una célula hospedadora.
22. 22. El uso de conformidad con la reivindicación 21, en donde la enzima es una hidrolasa, preferiblemente una carbohidrasa, especialmente una celulasa, hemicelulasa, amilasa o glucoamilasa.