MX2007013396A - Metodos para sumprimir la carcinogenesis cutanea inducida por luz uv. - Google Patents

Abstract

La administracion de isotiocianato protege contra la carcinogenesis cutanea inducida por luz UV. En particular, la aplicacion topica o administracion dietetica de sulforafano de isotiocianato, despues de la exposicion a la radiacion UV proporciona proteccion efectiva contra la formacion de tumores cutaneos. Tambien se pueden emplear analogos de sulforafano y glucosinolatos. Tambien se pueden emplear analogos de sulforafano y glucosinolatos. Tambien se proporcionan lociones titiles para suprimir la carcinogenesis cutanea inducida por luz UV.

Description

MÉTODOS PARA SUPRIMIR LA CARCINOGENESIS CUTÁNEA INDUCIDA POR LUZ UV CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al uso de compuestos y formulaciones protectoras de la piel contra los daños causados por los rayos UV.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La incidencia del cáncer cutáneo, está aumentando considerablemente y ha alcanzado proporciones epidémicas; el aumento promedio en nuevos diagnósticos de cáncer cutáneo es del 3-8% al año desde 1960, y actualmente los cánceres cutáneos sin melanoma son los tipos más comunes de cáncer en los Estados Unidos, con más de 1 millón de nuevos casos al año (1, 2) . Este aumento considerable de la incidencia se espera continúe y se debe principalmente a la reducción del ozono estratosférico, la exposición aumentada de los seres humanos a radiación solar, y a la mayor esperanza de vida. De acuerdo con los estimados del Instituto Nacional del Cáncer, 40-50% de norteamericanos que vivieron hasta la edad de 65, desarrollaron cáncer cutáneo al menos una vez y es alto el riesgo de desarrollar tumores adicionales (1, 2) . De esta forma, se necesita urgentemente un conocimiento detallados de los factores de riesgo potenciales y el desarrollo de nuevas estrategias para la prevención. Actualmente se acepta ampliamente que la radiación UV es el principal factor responsable de la mayoría de cánceres cutáneos sin melanoma. La radiación UV probablemente es el carcinógeno ambiental más ubicuo y el principal factor que contribuye a los cánceres cutáneos sin melanoma. Al menos, tres diferentes efectos de la exposición a la radiación UV contribuyen al proceso de carcinogénesis en la piel: (i) daño directo del ADN que conduce a la formación de fotoproductos de ADN, por ejemplo, dímeros de ciclobutano-pirimidina y productos de pirimidina-pirimidona (37); (ii) daño oxidativo del ADN relacionado con tensión que resulta de la formación de intermediarios de oxígeno reactivo (ROÍ, por sus siglas en inglés) (39); y (iii) inmunosupresión que produce tolerancia a la inestabilidad genética (40). En muestras de cáncer cutáneo humano (41, 42), se han detectado mutaciones en los proto-oncógenos ( ras, por sus siglas en inglés) así como también en los genes supresores de tumores {p53 y PTCH) . Se cree que las mutaciones puntuales en p53, representan un primer acontecimiento en muchas formas de carcinogénesis incluyendo el desarrollo de tumores cutáneos (1, 38, 41) . Las células con estas mutaciones producen clones que exhiben inestabilidad genética y, después de la expansión clonal, por último progresas a cánceres. La prevención del cáncer cutáneo, se ha demostrado en varios modelos animales implicando una variedad de carcinógenos químicos en ausencia de cualesquiera iniciadores o promotores químicos. La actividad antioxidante directa, la alteración de la apoptosis y las trayectorias de señalización celular se han implicado en los mecanismos de acción inhibidora de los agentes profilácticos. Se ha mostrado desde hace ya aproximadamente 30 años que algunos agentes considerados para ser principalmente antioxidantes, por ejemplo, hidroxitolueno butilado (BHT, por sus siglas en inglés), inhiben significativamente el eritema inducido por radiación UV y el desarrollo de tumores en ratones (5, 6) . El espectro de agentes profilácticos ha aumentado gradualmente para incluir selenio, zinc, así como también, antioxidantes vegetales, por ejemplo, silymarin proveniente de cardo lechero, isoflavonas provenientes de la soya, poliufenoles provenientes de té, y se ha propuesto que su aplicación tópica podría complementar el uso de filtros solares para proteger a la piel contra la radiación UV (51) . El té verde, té negro, y sus componentes, por ejemplo, polifenoles, cafeína, y galacto de (-)-espigalocatequina, previenen efectivamente la carcinogénesis en ratones con alto riesgo tratados con luz-UV, cuando se les administra ya sea tópicamente o en la dieta (24, 25, 52) . El tratamiento con polifenol de té verde, también inhibe el eritema provocado por la radiación-UV y la formación de dímeros de pirimidina del ADN en la piel humana (53) . Curiosamente, el galacto de (-) -espigalocatequina, muy similar a sulforafano, exhibe una plétora de efectos biológicos: la inducción suministrada por el elemento de respuesta antioxidante (ARE, por sus siglas en inglés) de la expresión génica en fase 2, la activación de proteínas cinasas activadas por mitógenos, la estimulación de la actividad de caspasa-3, y la apoptosis (54). Además, el pre-tratamiento de la piel humana con galacto de (-) -espigalocatequina previene el eritema inducido por UV y la inflamación asociada, así como también la generación de peróxido de hidrógeno y óxido nítrico, y restaura la reducción inducida por UV de glutatión (GSH, por sus siglas en inglés) y GSH peroxidasa (50) . Estudios anteriores en modelos de ratón indicaron que una dieta complementada con antioxantes (por ejemplo, una que contenga hidroxitolueno butilado [BHT] ) inhibió significativamente la carcinogénesis cutánea que se indujo ya sea mediante radiación UV (4, 5) o hidrocarburos aromáticos policíclicos-forboléster (6) . BHT y otros antioxidantes fenólicos han mostrado que inducen las enzimas de destoxificación en fase 2 y protegen a los roedores contra los metabolitos mutagénicos de benzo [a] pireno (7). Además, la administración tópica o dietética de BHA, inhibe la inducción dependiente de forboléster de descarboxilasa de ornitina (un primer indicador de la promoción de tumores) en la epidermis de ratones (8) . El equilibrio entre los procesos intracelulares que generan intermediarios reactivos (por ejemplo, electrófilos, oxígeno reactivo y especies de nitrógeno) y la destoxicación en oposición y las reacciones de depuración radical, determina el resultado final de la exposición a carcinógenos (9). La planeación de medios químicos y dietéticos para cambiar el equilibrio hacia la última ruta, es decir, mediante la inducción de enzimas que catalizan las reacciones de destoxicación en fase 2, es una estrategia principal para la protección contra la neoplasia (10). La implementación de este procedimiento es especialmente atractiva por el uso de inductores que están presentes en plantas comestibles debido a que estos inductores ya constituyen la dieta humana y se supone que tienen baja toxicidad. El sulforafano de isotiocianato es uno de estos inductores. El sulforafano se aisló como el principal inductor a partir de bróculi (11), guiado por la capacidad de inducir enzimas en fase 2. La planta intacta contiene un precursor de sulforafano, la glucorafanina de glucosinolato. Con la lesión en las células vegetales, la glucorafanina se pone en contacto con la mirosinasa, de otra manera separada por categorías, una tioglucosidasa, que cataliza su hidrólisis y da por resultado en la formación de sulforafano, como un principal producto de reacción. Estudios posteriores revelaron que la actividad del inductor en los brotes de brócoli de 3 días de edad es 20-50 veces mayor que el de las plantas maduras, y que el >90% de su actividad se puede atribuir a la glucorafanina (12) . Además de ser uno de los más potentes inductores de enzimas en fase 2 que se presentan en la naturaleza conocidos hasta la fecha, el sulforafano, exhibe una actividad anticancerígena adicional. Por ejemplo, el sulforafano estimula apoptosis e inhibe la proliferación (13, 14), es antiinflamatoria (15) e inhibe la histona desacetilasa (16). Además, el sulforafano protege a diversos tipos de células cultivadas contra la toxicidad de diversos oxidantes biológicos, por ejemplo, 4-hidroxinonenal, peroxinitrito, menadiona, hidroperóxido de ter-butilo (17), así como también contra la foto-oxidación generada por all-trans-retinaldehído y luz UVA (18) . Sin embargo, sigue sin poderse determinar, si el sulforafano puede proteger contra carcinogénesis inducida por luz UV. De esta forma, se requieren pruebas y métodos adicionales .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En una modalidad, la administración del sulforafano de isotiocianato, protege contra la carcinogénesis cutánea inducida por luz UV. En otro aspecto, se proporciona un método para suprimir la carcinogénesis cutánea inducida por luz UV, en un paciente que comprende administrar a un paciente que se haya expuesto a luz UV, una cantidad terapéuticamente efectiva de un sulforafano o un análogo de sulforafano. En una modalidad, el sulforafano se administra transdérmica u oralmente. En otra modalidad, el sulforafano se deriva de brotes de bróculi y se administra transdérmica u oralmente. Los análogos de sulforafano, también se pueden emplear para proteger contra la carcinogénesis cutánea inducida por luz UV. Estos análogos de sulforafano, se pueden seleccionar del grupo que consiste de 6-isotiocianato-2-hexanona, exo-2-acetil-6-isotiocianatonorbornano, exo-2-isotiocianato-6-metilsulfonilnorbornana, 6-isotiocianato-2-hexanol, 1-isotiocianato-4-dimetilfosfonilbutano, exo-2- (1' -hidroxietil) -5-isotiocianatonorbornano, exo-2-acetil-5-isotiocianatonorbornano, l-isotiocianato-5-metilsulfonilpentano, cis-3- (metilsulfonil) ciclohexilmetilisotiocianato y trans-3- (metilsulfonil) ciclohexilmetilisotiocianato. Otros isotiocianatos, también se pueden utilizar. De manera similar, también se pueden emplear glucosinolatos orales para proteger contra la carcinogénesis cutánea inducida por luz UV. En otra modalidad, se proporcionan lociones para utilizarse en la supresión de la carcinogénesis cutánea inducida por luz UV, en un paciente que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de sulforafano. También se proporcionan lociones que comprenden isotiocianatos o glucosinolatos . Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Además, los ejemplos demuestran el principio de la invención y no se puede esperar que ilustren específicamente la aplicación de esta invención, para todos los ejemplos donde serán evidentemente útiles para aquellos expertos en la técnica anterior.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1, demuestra gráficamente la inducción de NQOl (B) y la elevación de GSH (0) como una función de la concentración de sulforafano en quratinocitos de murino PE (A) y queratinocitos HaCaT humanos (B) . Las células (20,000 por cavidad) se colocaron en placas de 96 cavidades y se expusieron a una serie de concentraciones de sulforafano. Los niveles de GSH y NQOl se midieron en los lisados celulares después de 24 horas y 48 horas, respectivamente. Cada punto de datos, representa el promedio de las mediciones de 8 diferentes cavidades. La desviación estándar fue del <5%, para todos los puntos de datos . La Figura 2, proporciona una gráfica que muestra la protección producida por sulforafano en queratinocitos de murino PE, contra los intermedios de oxígeno reactivo generados por radiación UVA. Las células (50,000 por cavidad) se colocaron en placas de 24 cavidades, se trataron con sulforafano 5 µm durante 24 horas, se lavaron con DPBS, y luego se expusieron a UVA (10 J/cm2) . Los intermedios de oxígeno reactivo generados mediante la radiación de UV se cuantificaron mediante la solución de ensayo fluorescente de 2' , 7' -diclorodinitrofluoresceína y se midió la intensidad de fluorescencia (expresada como una proporción de células expuestas a no expuestas) . La Figura 3, muestra el curso cronológico de la inducción de quinona reductasa (NQOl, por sus siglas en inglés) en piel humana de voluntarios humanos sanos, mediante una sola aplicación tópica de 100 nmol de sulforafano. La Figura 4, muestra la inducción de NQOl en piel humana de voluntarios humanos sanos, mediante tres aplicaciones tópicas repetidas de 50 nmol de sulforafano a intervalos de 24 horas. Las Figuras 5A-C muestran la inhibición provocada por sulforafano en 5 (A) la producción de NO y iNOS ARNm (B) y proteína (C) , la inducción en células RAW 264.7 estimulada con g-interferón o lipopolisacárido. Las células se trataron con diversas concentraciones de sulforafano y ya sea IFNg (10 ng/ml) o lipopolisacárido (LPS; 3 ng/ml) durante 24 horas. El NO en el medio se midió como nitruro mediante reacción Griess 5 (A) y se detectó la inducción de iNOS mediante transferencia Northern 5 (B) y Western 5 (C) . Las Figuras 6A y 6B, demuestran la inhibición de sulforafano de la carcinogénesis cutánea inducida por radiación UVB en ratones con alto riesgo. La Figura 7, muestra gráficamente la inhibición de la carga tumoral total en ratones con alto riesgo mediante la administración transdérmica de sulforafano. La carga tumoral se expresó como el volumen total de todos los tumores en mm3, divididos entre el número de animales en riesgo. Se muestran los valores promedio ± SE. Existió un efecto de gran importancia y bastante significativo (p<0.0027) de la concentración (tratamiento) con la transformación log del volumen tumoral (ANOVA de la concentración utilizando un tiempo de tratamiento como una variable jerarquizada) . La Figura 8, proporciona una gráfica que muestra el impacto de sulforafano, sobre la multiplicidad de tumores pequeños (<1 cm3, barras blancas) y grandes (>1 cm3, barras negras) . Once semanas después del tratamiento con el protector o vehículo, la incidencia de tumores en el grupo control fue del 100%, y se terminó el experimento. Todos los ratones se sacrificaron el mismo día y se midió el tamaño de los tumores. Bajas dosis, 0.3 µmol de sulforafano, altas dosis de 1.0 µmol de sulforafano se aplicaron diariamente, 5 veces a la semana, a las partes dorsales de los animales. La Figura 9, proporciona una gráfica que muestra la incidencia de tumores (porcentaje de ratones con tumores) en ratones con alto riesgo que recibieron la administración dietética de sulforafano. El grupo control se representa como círculos, el grupo con dosis baja se representa como cuadrados y el grupo con dosis alta se representa como triángulos. La incidencia de tumores se redujo en un 25% y 35% en los animales que recibieron bajas dosis y altas dosis de glucorafanina, respectivamente, en comparación en el grupo control. La Figura 10, proporciona una gráfica que muestra la multiplicidad de tumores (número de tumores por ratón) en ratones con alto riesgo que recibieron la administración dietética de sulforafano. El grupo control se representa como círculos, el grupo de dosis baja se representa como cuadrados y el grupo de dosis alta se representa como triángulos. La multiplicidad del tumor se redujo en un 47% y 72%, respectivamente, en comparación con el grupo control. La Figura 11, proporciona un gráfica que muestra la carga tumoral (volumen tumoral total) por ratón en ratones con alto riesgo que recibieron la administración dietética de sulforafano. El grupo control se representa como círculos, el grupo de dosis baja se representa como cuadrados y el grupo de dosis alta se representa como triángulos. El tratamiento con glucorafanina tanto a dosis baja como a dosis alta dio por resultado en un 70% de inhibición en el volumen tumoral total por ratón en comparación con el grupo control.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La administración de sulforafano de isotiocianato protege contra la carcinogénesis cutánea inducida por luz UV. En particular, la aplicación tópica o aplicación dietética de sulforafano después de la exposición a radiación UV, proporciona protección efectiva contra la formación de tumores cutáneos. Se han detectado actividades quimioprotectoras en ciertos vegetales que son capaces de inducir la actividad de las enzimas que destoxifican carcinógenos (enzimas fase II) . En el bróculi se ha detectado una de estas actividades, lo cual induce a la actividad de quinona reductasa y las actividades de glutatión s-transferasa en células con hepatoma murino y en órganos de ratones. Esta actividad se ha purificado a partir del bróculi y se identificó como sulforafano. Además, se han sintetizado análogos de sulforafano para determinar las relaciones estructura-función. Actualmente se ha descubierto que sulforafano proporciona protección contra la carcinogénesis cutánea inducida por luz UV. En particular, la administración de sulforafano después de la exposición a radiación UV proporciona protección efectiva contra la formación de tumores cutáneos. También se pueden emplear otros isotiocianatos. Los isotiocianatos son compuestos que contienen la entidad isotiocianato (NCS, por sus siglas en inglés) y se identifican fácilmente por alguien con experiencia en la técnica. La descripción y preparación de análogos de isotiocianato se describe en la patente re-otorgada de los Estados Unidos 36,784, y se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. En una modalidad preferida, los análogos de sulforafano utilizados en la presente invención incluyen: 6-isotiocianato-2-hexanona, exo-2-acetil-6-isotiocianatonorbornana, exo-2-isotiocianato-6-metilsulfonilnorbornano, 6-isotiocianato-2-hexanol, 1-isotiocianato-4-dimetilfosfonilbutano, exo-2- (1' -hidroxietil) -5-isotiocianatonorbornano, exo-2-acetil-5-isotiocianatonorbornano, 1-isotiocianato-5-metilsulfonilpentano, cis-3- (metilsulfonil) ciclohexilmetilisotiocianato y trans-3- (metilsulfonil) ciclohexilmetilisotiocianato . En otra modalidad, se pueden utilizar glucosinolatos, precursores para isotiocianatos, para suprimir la carcinogénesis cutánea inducida por luz UV. Los glucosinolatos se pueden reconocer fácilmente y se pueden apreciar por alguien con experiencia en la técnica y se revisan en Fahey et al. Phytochemistry, 56:5-51 (2001), el contenido total del mismo se incorpora en la presente como referencia. Las composiciones que comprenden sulforafano, isotiocianatos, glucosinolatos o análogos de los mismos se pueden administrar en una variedad de vías y comprenden una variedad de portadores o excipientes. Por "portador farmacéuticamente aceptable", se debe entender, aunque no se limita a un sólido no tóxico, semisólido o material de relleno líquido, diluyente, material de encapsulante o formulación auxiliar de cualquier tipo, tal como, liposomas. Una composición farmacéutica de la presente invención, para inyección parenteral puede comprender soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas farmacéuticamente aceptables, así como también, polvo estériles para reconstitución en soluciones inyectables estériles o dispersiones justo antes de utilizarse. Los ejemplos de portadores, diluyentes, solventes o vehículos acuosos y no acuosos incluyen agua, etanol, polioles (tales como, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y lo semejante) , carboximetilcelulosa y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (tales como, aceite de oliva) , y esteres orgánicos inyectables tales como, oleato de etilo. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento tales como, lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones, y mediante el uso de tensoactivos. Las composiciones de la presente invención, también pueden contener adyuvantes tales como, de manera enunciativa, conservadores, agentes humectantes, agentes emulsionantes, y agentes dispersantes. La prevención de la acción de microorganismos, se puede asegurar mediante la inclusión de diversos agentes anti-bacterianos y antimicóticos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, y lo semejante. Puede ser conveniente, incluir agentes isotónicos tales como, azúcares, cloruro sódico, y lo semejante. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede llevar a cabo mediante la inclusión de agentes que retarden la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina. En algunos casos, para prolongar el efecto de los fármacos, es conveniente disminuir la absorción de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede llevar a cabo mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con deficiente solubilidad en agua. La velocidad de absorción del fármaco entonces depende de su velocidad de disolución, lo cual, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de una forma de fármaco administrada parenteralmente se lleva cabo al disolver o suspender el fármaco en un vehículo oleoso . La administración transdérmica de un fármaco con frecuencia es conveniente y cómoda para un paciente. En esta modalidad, el sulforafano, está presente en un portador. El término "portador", se refiere a materiales portadores adecuados para facilitar la administración transdérmica de fármacos, e incluye cualquiera de estos materiales conocidos en la técnica, por ejemplo, cualquier líquido, gel, solvente, diluyente, líquido solubilizante, polímero o lo semejante, que no sea tóxico y que no interactúe significativamente con otros componentes de la composición o la piel de una forma dañina. Las formas de depósito inyectable se realizan mediante la formación de matrices de microencapsulado del fármaco en polímeros biodegradables tales como, poliláctido-poliglicólico. Dependiendo de la proporción del fármaco a polímero y la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación del fármaco. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli (ortoésteres) y poli (anhídridos) . Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan al atrapar el fármaco en liposomas o microemulsiones que sean compatibles con los tejidos corporales. Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro para retensión de bacterias, o mediante la incorporación de agentes esterilizantes en la forma de composiciones sólidas estériles que se puedan disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril justo antes de utilizarse. Las formas de dosificación sólida para administración oral, incluyen de manera enunciativa: cápsulas, tabletas, pildoras, polvo, y granulos. En estas formas de dosificación sólida, los compuestos activos se mezclan con al menos un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable tal como citrato de sodio o fosfato dicálcico y/o a) materiales de relleno, o extendedores tales como, almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y ácido silícico, b) aglutinantes tales como por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y acacia, c) humectantes tales como, glicerol, d) agentes disgregantes tales como, agar-agar, carbonato calcico, almidón de papa o tapioca, ácido alginico, ciertos silicatos, y carbonato de sodio, e) agentes para retardar la solución tales como, parafina, f) aceleradores de absorción tales como, compuestos de amonio cuaternarios, g) agentes humectantes tales como por ejemplo, alcohol acetilico y monoestearato de glicerol, h) absorbentes tales como, caolín y arcilla de bentonita, y i) lubricantes tales como, talco, estearato calcico, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, lauriisulfato de sodio y mezclas de los mismos. En el caso de las cápsulas, tabletas y pildoras, la forma de dosificación también puede comprender agentes amortiguantes . Las composiciones sólidas de un tipo similar, también se pueden emplear como materiales de relleno en cápsulas de gelatina dura y suave rellenas, utilizando excipientes tales como, lactosa o azúcar láctea así como también polietilenglicoles de alto peso molecular y lo semejante . Las formas de dosificación sólida de tabletas, grajeas, cápsulas, pildoras, y granulos, se pueden preparar con recubrimientos y capas tales como, recubrimientos entéricos u otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de la formulación farmacéutica. Los mismos opcionalmente pueden contener agentes opacificantes y también pueden ser de una composición de tal forma que liberen únicamente los ingrediente activos, o de preferencia, en una cierta porción del tracto intestinal, opcionalmente, de una forma retardada. Los ejemplos de composiciones de incorporación que se pueden utilizar incluyen sustancias poliméricas y ceras. Los compuestos activos, también pueden estar en forma microcapsulada, si es lo adecuado, con uno o más de los excipientes mencionados anteriormente. Las formas de dosificación liquida para administración oral incluyen, de manera enunciativa: emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los compuestos activos, las formas de dosificación líquida pueden contener diluyentes inertes utilizados comúnmente en la técnica tales como por ejemplo, agua u otros solventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tales como, alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1, 3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino, y ajonjolí) , glicerol, alcohol tetrahidrofurfurilo, polietilenglicoles y esteres de ácido grasos de sorbitán, y mezclas de los mismos. Junto con los diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como, agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, saborizantes y aromatizantes . Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión como, por ejemplo, alcoholes isostearílicos etoxilados, polioxietilensorbitol y esteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar, y tragacanto, y mezclas de los mismos.

Una composición dietética de acuerdo con la presente invención, es cualquier preparación que se pueda ingerir que contiene sulforafano, isotiocianatos, glucosinolatos o análogos de los mismos. Por ejemplo, el sulforafano, isotiocianatos, glucosinolatos o análogos de los mismos se pueden mezclar con un producto alimenticio. El producto alimenticio se puede deshidratar, cocinar, poner a hervir, liofilizar u hornear. Los panes, tés, sopas, cereales, ensaladas, emparedados, brotes, vegetales, alimento animal, pildoras y tabletas, están entre el basto número de diferentes productos alimenticios contemplados. Alguien con experiencia en la técnica, apreciará que las cantidades efectivas de los agentes de la invención se pueden determinar empíricamente y se pueden emplear en forma pura o, donde existan estas formas, en una forma de sal éster o profármaco farmacéuticamente aceptable. Una cantidad "terapéuticamente efectiva", de las composiciones dé la invención se puede determinar mediante la prevención o disminución de las condiciones adversas o síntomas de enfermedades, lesiones o trastornos que serán tratados. Los agentes se pueden administrar a un sujeto que se expuesto a radiación UV, como las composiciones farmacéuticas en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Se debe entender que, cuando se administra a un paciente humano, la dosis diaria total de los agentes o la composición de la presente invención se decidieron por el médico que está atendiendo dentro del alcance de un juicio médico acertado. El nivel de dosificación efectiva terapéuticamente específica para cualquier paciente en particular dependerá de una variedad de factores: el tipo y grado de la respuesta celular o fisiológica que será alcanzada; la actividad del agente específico o composición empleada; los agentes específicos o la composición empleada; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el tiempo de administración, la vía de administración, y la velocidad de excreción del agente; la duración del tratamiento; los fármacos utilizados en combinación o en coincidencia con el agente específico; y los factores generales bien conocidos en las técnicas médicas. Por ejemplo, queda dentro de la experiencia del técnico, iniciar la dosis de los agentes a niveles inferiores que aquellos requeridos para alcanzar el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente las dosificaciones hasta que se alcance el efecto deseado. Los usos comerciales potenciales de las preparaciones expuestas incluyen, por ejemplo, (i) protector/profiláctico, (ii) cosméticos y (iii) médicos. En una modalidad, se proporcionan lociones protectoras y cremas para aplicación tópica ya sea con base oleosa (sulforafano) o con base acuosa (glucorafanina más un agente hidrolizante) . En otra modalidad, las composiciones que contienen sulforafano se pueden combinar con filtros solares .

EJEMPLOS Ejemplo 1. Preparación de sulforafano a partir de brotes de bróculi • Semillas de bróculi (Brassica olerácea itálica, cv. DeCicco) , con certificado de que no se han tratado con ningún pesticida u otros tratamientos químicos para semilla, se hicieron germinar y se procesaron como se describe por Fahey et al., (12). En resumen, las semillas se desinfectaron superficialmente con una solución acuosa al 25% de blanqueador Clorox®, que contuvo una traza de detergente Alconox® y se enjuagó minuciosamente con agua. Las semillas, luego se dispersaron en forma de capa, en charolas de plástico perforadas, inclinadas, rociadas con agua de filtro durante 30 segundos aproximadamente 6 veces/hora e iluminadas desde lámparas fluorescentes aéreas. El crecimiento se detuvo después de 3 días al sumergir los brotes directamente en agua hirviendo en una caldera con camisa de vapor, regresando a ebullición, y con agitación durante ~5 minutos. Este tratamiento inactivo la mirosinasa del brote endógeno y extrajo los glucosinolatos. La glucorafanina, el precursor de sulforafano, fue el glucosinolato predominante en el extracto inicial según se determinó mediante HPLC (26) . Luego se agregó mirosinasa al brote Daikon para conversión cuantitativa de los glucosinolatos a isotiocianatos según se define por Fahey et al., 1997 y Shapiro et al., 2001 (12, 27). Esta preparación luego se liofilizó, se disolvió en acetato de etilo, se evaporó a sequedad mediante evaporación giratoria, se disolvió en un pequeño volumen de agua, y se agregó acetona a una concentración final de sulforafano 50 mm en acetona al 80%: agua al 20% (v/v). El contenido total de isotiocianato se determinó (12, 27) mediante la reacción de ciclocondensación (28), se confirmó la ausencia completa de los glucosinolatos mediante HPLC (26) , y la proporción precisa de los isotiocianatos liberados mediante la reacción de mirosinasa se determinó mediante HPLC sobre un gradiente de acetonitrilo, y se hizo coincidir el perfil de glucosinolato del extracto. El sulforafano, constituyó más del 90% del contenido de isotiocianato. Esta preparación se diluyó en acetona al 80% (v/v) para producir la "dosis alta" (1.0 µmol/100 µl) y "dosis baja" (0.3 µmol/100 µl) . El bioanálisis en la prueba Prochaska (29, 30), proporciona un valor CD (concentración requerida para duplicar la actividad de NQOl) consistente con los experimentos anteriores (11) .

Ejemplo 2. Tratamiento de queratinocitos con sulforafano El glutatión es el principal y más abundante tiol sin proteínas celular y constituye una porción decisiva de la defensa celular: reacciona fácilmente con electrófilos potencialmente dañinos y participa en la destoxicación de los intermedios de oxígeno reactivo y sus metabolitos tóxicos mediante la depuración de radicales libres y la reducción de peróxidos. La capacidad para aumentar los niveles celulares de GSH es decisivamente importante para combatir la tensión oxidativa. Para este fin, se examinó la capacidad de la respuesta en fase 2 inducida por sulforafano para proteger contra la tensión oxidativa provocada por UVA en cultivos de queratinocitos. Para este estudio se seleccionó UVA, debido a que se cree que su genotoxicidad se debe principalmente a la generación de intermedios oxígeno reactivo.

Cultivos de células Queratinocitos humanos HaCaT (una donación de G. Tim Bowden, Arizona Cáncer Center, Tucson) se cultivaron en medio Eagle's modificado con Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés) suplementado con FBS al 5%; y los queratinocitos de murino PE (una donación de Stuart H. Yuspa, National Cáncer Institute, Bethesda, MD) se cultivaron en medio esencial mínimo Eagle's (EMEM, por sus siglas en inglés) con FGS al 8%, tratado con resina Chelex (Bio-Rad) para eliminar el Ca2+.

Análisis de quinona reductasa (NQOl) y glutatión Se desarrollaron células (20,000 por cavidad) durante 24 horas en placas de 96 cavidades, luego se expusieron a diluciones en serie de sulforafano ya sea durante 24 horas (para la determinación de glutatión) o 48 horas (para la determinación de NQOl) , y por último se lisaron en digitonina al 0.08%. Una alícuota (25 µl) se utilizó para el análisis de la proteína. La actividad de NQOl se determinó mediante la prueba de Prochaska (29, 30) . Para medir los niveles de glutatión intracelular, 25 µl de lisado celular recibieron 50 µl de ácido metafosfórico enfriado con hielo (50 g/litro) en EDTA 2 mm para precipitar la proteína celular. Después de 10 minutos a 4°C, las placas se sometieron a centrifugación a 1,500 g durante 15 minutos y 50 µl de las fracciones del sobrenadante resultante se transfectaron a una placa paralela. A cada una de estas cavidades, se agregaron 50 µl de tampón de fosfato sodio 200 mm, pH 7.5, que contuvo EDTA 10 mm, y se determinó el glutatión celular total mediante mediciones de variación en un análisis de actualización (31, 32).

Irradiación UV de células y determinación de los intermediarios de oxigeno reactivo Se sembraron células PE (50,000 por cavidad) en placas de 24 cavidades y se desarrollaron durante 48 horas. Las células luego se expusieron a sulforafano 1 µm o 5 µm durante 24 horas. En el día de los experimentos, después de la eliminación del medio, las células se incubaron con diacetato de 2' , 1 ' -diclorodinitrofluoresceina 100 µm en 500 µl de medio recién preparado (Molecular Probes, Eugene, OR) durante 30 minutos. El medio que contenía la solución de ensayo fluorescente luego se retiró, las células se lavaron con DPBS, y se expusieron a radiación UVA (10 J/cm2). Las células control se mantuvieron en la oscuridad. Las células se separaron con tripsina, se suspendieron en 2.0 ml de DPBS, y se determinó la intensidad de fluorescencia en las suspensiones celulares a 520 nm con una excitación de 485 nm en cubetas de 2 ml en un espectrofluorómetro Perkin-Elmer LS50. Cuando los queratinocitos humanos HaCaT o los queratinocitos murinos PE, se expusieron al sulforafano, los niveles intracelulares de NQOl y de glutatión se aumentaron de una forma dependiente de la dosis (Figura ÍA, B) , de acuerdo con las observaciones anteriores (Ye and Zhang, 2001) . La magnitud de la inducción de NQOl fue especialmente impresionante (>10-veces) en células HaCaT, sin ninguna evidencia evidente del tipo citotoxicidad. El tratamiento con sulforafano 5 µm durante 24 horas produjo una reducción sustancial (50%) en los intermediarios de oxígeno reactivo generados por la radiación UV según se cuantificó mediante la solución de ensayo fluorescente de 2' , 1 ' -diclorodinitro-fluoresceina (35) (Figura 2).

Ejemplo 3. Efecto de la aplicación tópica de sulforafano sobre NQOl y GSH en ratones La respuesta fase 2, fue la siguiente evaluada in vivo en ratones sin pelo SKH-1. Los ratones sin pelo SKH-1 hembra (4 semanas de edad) se obtuvieron de Charles River Breeding Labortories (Wilmington, MA) y se aclimataron en la instalación para animales durante 2 semanas antes de iniciar el experimento. Los animales se mantuvieron a un ciclo de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad, humedad al 35%, y tuvieron libre acceso a agua y una dieta de AIN 76A granulado (Harían TekLad, libres de inductores) . Los experimentos con animales estuvieron de acuerdo con los Institutos Nacionales de Lineamientos Sanitarios y se aprobaron por el Comité para el Cuidado y Uso de Animales de la Universidad John Hopkins. Los ratones sin pelo SKH-1 de siete semanas de edad (5 por grupo) se trataron tópicamente en sus partes posteriores ya sea con 100 µl de un extracto de brote de brócoli hidrolizado con mirosinasa estandarizada que contuvo 1 µmol de sulforafano, o un vehículo (100 µl de acetona al 80%: agua al 20%, v/v). Los animales se sacrificaron 24 horas después y se disecaron sus espinas dorsales utilizando un molde rectangular (2.5 x 5 cm) y se congelaron en N2 líquido. Las muestras de piel se pulverizaron en N2 y 100 mg del polvo resultante se homogeneizaron en 1 ml ya sea de sacarosa 0.25 M amortiguada con Tris-HCl 10 mm, pH 7.4, para análisis de la actividad enzimática con NQOl y el contenido de proteínas, o ácido metafosfórico enfriado con hielo (50 g/litro) en EDTA 2 mM para análisis de glutatión. La centrifugación a 14,000 g durante 20 minutos a 4°C, proporcionó fracciones claras del sobrenadante, las alícuotas de la cual se utilizaron para la determinación del contenido proteínico, la actividad enzimática, y los niveles totales de glutatión como se describirá más adelante para los experimentos de cultivos celulares. Los resultados mostraron que la administración tópica de sulforafano produjo aproximadamente una inducción del 50% de NQOl (P<0.001) y aproximadamente una elevación del 15% de los niveles totales de glutatión de los animales tratados en comparación con los controles.

Ejemplo 4. Efecto de la aplicación tópica de sulforafano sobre NQOl y GSH en seres humanos Este estudio que incluyó voluntarios humanos sanos, se realizó de acuerdo con los protocolos aprobados por el Consejo de Análisis Institucional en la Universidad John Hopkins. Se estudió la seguridad de la administración tópica de dosis individuales de extractos de brote de bróculi a la piel de voluntarios humanos sanos. Los extractos se prepararon en acetona al 80%: agua al 20% y se determinó con precisión el contenido de sulforafano mediante un análisis de ciclocondensación, un método utilizado habitualmente en nuestro laboratorio para la cuantificación de isotiocianatos y sus metabolitos de ditiocarbamato. Se dibujó un círculo (1 cm de diámetro) sobre la piel del antebrazo volar de cada participante y el extracto luego se aplicó dentro del círculo utilizando una pipeta con desplazamiento positivo. Dos sujetos participaron para cada una de las 8 dosis en escala que se administraron (0.3; 5.3; 10.7; 21.4; 42.7; 85.4; 170; y 340 nmol de sulforafano) . Cada sujeto sirvió como control propio y recibió un placebo "trasa de vehículo". No se observaron reacciones adversas en ninguna de estas dosis. También se realizaron estudios de eficacia. El punto final, fue la determinación de la actividad enzimática de quinona reductasa (una proteína fase 2 prototípica) en biopsias de perforación de piel de 3 mm de dos voluntarios humanos sanos después de la aplicación de una sola dosis de extracto de brote de bróculi. Nuevamente cada sujeto sirvió como control propio y recibió una "traza de vehículo". En estas muestras se detectaron confiablemente tanto la actividad de quinona reductasa como el contenido proteínico. La actividad específica de la quinona reductasa se aumentó en ~2-veces, 24 horas después de la aplicación de un extracto que contuvo 100 nmol de sulforafano (Figura 2) . De manera notable, la inducción duró más tiempo a medida que la actividad fue superior que la de los sitios tratados con placebo, incluso cuando se realizaron las biopsias 72 horas después de la aplicación. Después se estudió el efecto de tres aplicaciones tópicas repetidas (a intervalos de 24 horas) de extracto de brote de bróculi que contuvo 50 nmol de sulforafano. Esto condujo a elevaciones incuso superiores de la actividad específica de la quinona reductasa (NQOl) en la piel subyacente de dos voluntarios humanos sanos (Figura 4).

Ejemplo 5. Efecto del sulforafano sobre la sintasa de óxido nitrico inducible Recientemente se encontró una medición de correlación lineal sobre 6 órdenes de magnitud de potencia entre la inhibición de respuestas inflamatorias, (activación de iNOS y COX-2 mediante ?-interferón) y la inducción de enzimas fase 2, entre una serie de triterpenoides sintéticos (20) . Macrófagos 264.7 RAW (5 x 105 células/cavidad) se colocaron en placas de 96 cavidades y se incubaron con sulforafano, y ya sea 10 ng/ml IFN-? o 3 ng/ml de LPS durante 24 horas. Se midió el NO como nitruro mediante la reacción Griess (33) . Cuando se incubaron las células RAW 264.7 con ?-interferón o el lipopolisacárido junto diversas concentraciones de sulforafano durante 24 horas, hubo una inhibición dependiente de la dosis de la formación de NO con un IC5o de 0.3 µm para ambas citosinas (Figura 5A) . De acuerdo con este resultado, los análisis de transferencia Northern, y Western, revelaron que la síntesis del ARNm de iNOS y la proteína también se inhibieron (Figura 5B, C) . Los macrófagos RAW 264.7 (2 x 106 células/cavidad) se incubaron con sulforafano y ya sea 10 ng/ml de IFN-? o 3 ng/ml de LPS durante la noche. Para las transferencias Northern, el ARN total se aisló con reactivo Trizol (Invitrogen) y se preparó para la transferencia como se describió anteriormente (33) . Las soluciones de ensayo para iNOS y GAPDH se radiomarcaron con [?-32P]dCTP con cebadores aleatorios. Para las trasnferencias Western, los lisados celulares totales se sometieron a SDS/PAGE, se transfirieron a una membrana, y se analizaron con iNOS y anticuerpos ß-actina (Santa Cruz Biotechnology) . Estos hallazgos indican que la exposición a sulforafano, suprime la inducción de iNOS mediante ya sea ?-interferón o lipopolisacárido y atenúa las respuestas inflamatorias que desempeñan una función en el proceso de la carcinogénesis.

Ejemplo 6. Efecto de la aplicación tópica de sulforafano sobre la carcinogénesis inducida por luz UV La exposición de ratones sin pelo SKH-1 a dosis relativamente bajas de radiación UVB (30 mJ/cm2) dos veces a la semana durante 20 semanas, dio por resultado en "ratones con alto riesgo" que posteriormente desarrollaron tumores cutáneos en ausencia de un tratamiento con UV adicional (24, 25). Este modelo animal es altamente relevante para seres humanos que hayan tenido una exposición importante a luz solar como niños, aunque hayan limitado su exposición como adultos. Además, esto permite la evaluación de agentes quimioprotectores potenciales después de terminar el programa de irradiación, excluyendo así la posibilidad de un "efecto filtrante de luz" mediante las preparaciones protectoras de extractos de brotes que pueden estar ligeramente coloreados. De esta forma, los ratones con alto riesgo pretratados con UVB se trataron tópicamente una vez al día, 5 días a la semana durante 11 semanas con 100 µl de extractos de brote de brócoli hidrolizados con mirosinasa estandarizada que contuvo ya sea 0.3 µmol (dosis baja) o 1 µmol (dosis alta) de sulforafano. El grupo control recibió tratamiento con vehículo. Semanalmente se determinaron los pesos corporales y la formación de tumores mayores a 1 mm de diámetro. La radiación UVB, se proporcionó mediante un banco de lámparas UV (FS72T12-UVB-HO, National Biological Corporation, Twinsburg, OH) que emitieron UVB (280-320 nm, 65% de energía total) y UVA (320-375 nm, 35% de energía total) . La dosis de radiación de UVB, se cuantificó con un Dosímetro para Integración Control UVB Daavlin Flex y se calibró adicionalmente con un radiómetro IL-1400 (International Light, Newburyport, MA) . Los animales se irradiaron durante 20 semanas los martes y viernes con una exposición a radiación de 30 mJ/cm2/sesión. Una semana después, los ratones se dividieron en tres grupos: 29 animales en cada grupo de tratamiento y 33 animales en el grupo control. Los ratones en los dos grupos de tratamiento, recibieron aplicaciones tópicas de ya sea 100 µl de extractos de brotes de bróculi que contuvieron 1 µmol de sulforafano (dosis alta), o 0.3 µmol de sulforafano (dosis baja), aquellos en el grupo control recibieron 100 µl del vehículo. El tratamiento se repitió 5 días a la semana durante 11 semanas en cuyo tiempo todos los animales en el grupo control tuvieron al menos un tumor y se termino el experimento. Semanalmente se registraron los tumores (definidos como lesiones de >1 mm de diámetro) y el peso corporal. Los volúmenes de tumor se determinaron al medir el peso, longitud y anchura de cada masa que fue mayor a 1 mm de diámetro. El promedio de estas mediciones se utilizó como el diámetro y se calculó el volumen (v = 4pr3/3) . Todos los ratones se sacrificaron en el mismo día y se determinó el tamaño y multiplicidad de tumores. Se disecaron las pieles dorsales utilizando un molde rectangular (2.5 x 5 cm) para incluir las áreas totales tratadas de los ratones. Las pieles se engraparon en cartón, se fotografiaron, y se fijaron en formalina amortiguada con fosfato al 10% enfriada con hielo a 4°C durante 24 horas. No hubo diferencia en el peso corporal promedio ni ganancia de peso entre los grupos. Los pesos corporales (mediana ± SD) al inicio del experimento fueron: 22.3 ± 1.9 g para el grupo control, 22.2 ± 1.9 g para el grupo tratado con dosis bajas, y 23.0 ± 1.9 g para el grupo tratado con dosis altas. Al finalizar el experimento (31 semanas después), los pesos corporales respectivos fueron: 32.1 ± 9.7 g, 31.9 ± 8.8 g, y 32.1 ± 6.9 g. Se observaron las primeras lesiones mayores a 1 mm 2 semanas después de terminar la irradiación lo cual fue 1 semana después de que se inició el tratamiento tópico con el protector. En este punto de tiempo, 3, 6, y 4 ratones del control, los ratones tratados con dosis bajas y los tratados con dosis altas, respectivamente desarrollaron su primer tumor. Los animales tratados con altas dosis, se protegieron sustancialmente contra los efectos carcinogénicos de la radiación UV. De esta forma, después de 11 semanas de tratamiento cuando se terminó el experimento, 100% de los animales en el grupo control habían desarrollado tumores, mientras que el 48% de los ratones tratados diariamente con el extracto de brote que contuvo 1 µmol de sulforafano no tuvieron tumores (Figura 6A) . Notablemente, tres animales (dos del control y uno del grupo tratado con dosis baja) se sacrificaron 1 semana antes de terminar el experimento debido a que tuvieron tumores que alcanzaron 2 cm de diámetro. El análisis de supervivencia Kaplan-Meier seguido tanto por una prueba de grado logarítmico estratificado, como por una prueba Wilcoxon para la igualdad de funciones de supervivencia, mostró que hubo una diferencia ligeramente significativa (P<0.0001) entre los tratamientos. El tratamiento con 1.0 µmol fue diferente tanto del tratamiento con 0.3 µmol como el control, a un nivel de confianza del 95%, para cada uno de los tres períodos de observación (semanas 9, 10, y 11) . No hubo diferencia significativa entre el tratamiento con 0.3 µmol y el control en ningún punto de tiempo. La Figura 6B, muestra el efecto total del tratamiento sobre el número de tumores que fue ligeramente significativo (P<0.001). Las comparaciones ANOVA del nivel de dosis con 1.0 µmol con el control indicó un efecto total bastante significativo (P<0.001), aunque hubo diferencias solamente significativas después de la semana 9: p<0.0794, p<0.0464 y p<0.0087, para las observaciones hechas en las semanas 9, 10, y 11, respectivamente. Se muestran los valores promedio ± SE. Además de la reducción en la incidencia y multiplicidad de tumores, hubo un retrazo significativo en la aparición de tumores. Mientras que el 50% de los animales control en riesgo tuvo tumores a las 6.5 semanas después de terminar la radiación, tomó 10.5 semanas para un 50% de los animales tratados con dosis altas en riesgo de desarrollar tumores. Es de observarse, la capacidad de un agente protector para retardar el proceso carcinogénico que se tornó en un concepto apreciado cada vez mayor en la quimio-prevención. De manera similar, la multiplicidad de tumores se redujo en un 58%: el número promedio de tumores por ratón fue de 2.4 para el grupo tratado y 5.7 para el control.

Aunque no hubo diferencia en la incidencia y multiplicidad de tumores entre los grupos tratados con dosis bajas y los tratados con vehículos (Figura 6A, B) , la carga tumoral total (expresada como, el volumen en mm3) por ratón, fue prácticamente menor en el grupo tratado con dosis bajas en un 86-, 68-, y 56% de tratamiento en las semanas 9, 10, y 11, respectivamente (Figura 7). La eficacia aparentemente cada vez menor con respecto al tratamiento con el tiempo parece presentarse debido que los grandes tumores (>1 cm3) , crecieron rápidamente durante las últimas 2 semanas del experimento. La carga tumoral total en el grupo tratado con altas dosis se redujo incluso de manera más importante en un 91-, 85-, y 46% en el tratamiento en las semanas 9, 10, y 11, respectivamente. De manera interesante, algunos de los ratones de este grupo de tratamiento tuvieron tumores en la cabeza, donde no se aplicó el extracto, aunque no hubo tumores en su parte dorsal, donde se aplicó el extracto protector. Aunque la caracterización histológica de los tumores individuales no se había completado, este modelo animal dio por resultado consistentemente en la formación de tumores no malignos, pequeños en aproximadamente el 80% (principalmente queratoacantomas y unos cuantos papilomas) y tumores malignos mayores de aproximadamente el 20% (carcinoma de célula escamosa) (24, 25) . Se clasificaron todos los tumores de acuerdo con sus volúmenes en dos categorías: "pequeños" (<1 cm3) (Figura 8, barras blancas) y "grandes" (>1 cm3) (Figura 8, barras negras) . El tratamiento con el extracto de brote no cambió la multiplicidad de tumores grandes a través de los grupos experimentales, hubo 17 tumores grandes entre la totalidad de 33 animales en el grupo control, 19 entre la totalidad de 29 animales en el grupo tratado con dosis baja, y 16 entre la totalidad de 29 animales en el grupo tratado con dosis alta. En contraste, el extracto de brotes de bróculi, produjo una inhibición dependiente de la dosis en el número de tumores pequeños: 170, 123, y 54 en el control, los grupos tratados con dosis baja, y los tratados con dosis alta, respectivamente. Es posible que los sin afectar originados de las células que tuvieron mutaciones acumuladas se provocaron mediante fotoproductos de ADN inducidos por radiación directa de UV, mientras que los extractos inhibieron principalmente los procesos carcinogénicos que resultan del daño del ADN inducido por tensión oxidativa. Se reportaron fenómenos similares, ya que la genisteina de isoflavona de soya inhibió la generación de productos de peroxidación lipídica, H202, y 8-hidroxi-2' -desoxiguanosina en piel de ratón, aunque no hubo ningún efecto sobre los dímeros de pirimidina formados en respuesta a la radiación UV (36) .

Análisis estadistico La incidencia tumoral se evaluó utilizando el análisis de supervivencia Kaplan-Meier, seguido por una prueba de grado logarítmico estratificado y una prueba Wilcoxon, para la igualdad de las funciones de sobreviviente. La multiplicidad tumoral se avaluó mediante ANOVA y se revisaron comparaciones en todos los tratamientos y sobre los tratamientos por pares, individuales (prueba t) . El volumen tumoral se evaluó mediante ANOVA con el tiempo de tratamiento como una variable jerarquizada. Estos cálculos se realizaron utilizando Stata 7.0 (Collage Station, TX) . Se calcularon otras estadísticas utilizando Excel.

Ejemplo 7: Preparación de polvo de extracto de brotes de bróculi liofilizados Se utilizaron semillas de bróculi ( Brassica olerácea i tálica , cv. DeCicco) para hacer crecer los brotes como se describió en el Ejemplo 1. El crecimiento se detuvo después de 3 días al sumergir los brotes en agua diluyendo y se dejaron hervir durante ~30 minutos. Este tratamiento, inactivo la mirosinasa endógeno del brote y se extrajeron los glucosinolatos. Glucorafanina, el precursor de sulforafano, fue el glucosinolato predominante en el extracto según se determinó mediante HPLC (26) . Esta preparación luego se liofilizó para proporcionar un polvo rico en glucosinolato que contuvo ~8.8% de glucorafanina en peso. El polvo se mezcló con dieta para ratones (AIN 76A pulverizado) para proporcionar el equivalente de 10 µmol (dosis baja) o 50 µmol (dosis alta) de glucorafanina por 3 gramos de dieta.

Ejemplo 8: Efecto de la administración dietética de sulforafano sobre la carcinogénesis inducida por luz UV En este estudio, los ratones con alto riesgo pretratados con UVB se alimentaron durante 13 semanas con una dieta en la cual se incorporó un polvo de extracto de brotes de brócoli liofilizado, preparado de acuerdo con el Ejemplo 6 (equivalente a 10 µmol/días [dosis baja] y 50 µmol/día [dosis alta] de glucorafanina, el precursor de glucosinolato de sulforafano que se encontró en la planta intacta, aproximadamente 10% de lo cual se convirtió a sulforafano con la ingestión por parte de los ratones). La dieta del grupo control, no contuvo ningún polvo de extracto de brotes de bróculi liofilizados. Los pesos corporales y la formación de tumores mayores a 1 mm de diámetro se determinaron semanalmente. La radiación UVB, se proporcionó mediante un banco de lámparas UV (FS72T12-UVB-HO, National Biological Corporation, Twinsburg, OH) que emitieron UVB (280-320 nm, 65% de energía total) y UVA (320-375 nm, 35% de energía total) . La dosis de radiación de UVB, se cuantificó con un Dosímetro de Integración Control UVB Davlin Flex, y se calibró adicionalmente con un radiómetro IL-1400 (international Light, Newburyport, MA) . Los animales se irradiaron durante 20 semanas los martes y viernes con una exposición a radiación de 30 mJ/cm2/sesión. Una semana después, los ratones se dividieron en tres grupos: 30 animales en cada grupo de tratamiento y 30 animales en el grupo control. Los ratones en los dos grupos de tratamiento recibieron una dieta en la cual se incorporó un polvo de extracto de brotes de bróculi liofilizado. La dieta del grupo de tratamiento con dosis baja incluyó un polvo de extracto de brotes de bróculi liofilizados equivalente a 10 µmol/día de glucorafanina, mientras que la dieta del grupo de tratamiento con dosis alta incluyó un polvo de extracto de brotes de bróculi liofilizado equivalente a 50 µmol/día de glucorafanina. La dieta del grupo control no contuvo ningún polvo de extracto de brotes de bróculi liofilizados. Los ratones se alimentaron con esta dieta durante 13 semanas. Después de las 13 semanas, el 93% de los ratones control tuvieron tumores y se terminó el experimento. Los volúmenes tumorales se determinaron al medir la altura, longitud, y anchura de cada masa que fue mayor a 1 mm de diámetro. El promedio de las tres mediciones se utilizó como el diámetro y se calculó el volumen (v = 4 pr3/3) . Todos los ratones se sacrificaron el mismo día y se determinó el tamaño y multiplicidad de los tumores. Se disecaron pieles dorsales, utilizando un molde rectangular (2.5 x 5 cm) para incluir las áreas totales tratadas de los ratones. Las pieles se engraparon a cartón, se fotografiaron y se fijaron en formalina amortiguada con fosfato al 10% enfriada con hielo a 4°C durante 24 horas. La incidencia tumoral (porcentaje de animales con tumores) se redujo en un 25% y un 35%, en los animales que recibieron la dosis baja y la dosis alta de glucorafanina, respectivamente, en comparación con el grupo control de ratones. (Figura 9). Incluso fue mayor el efecto del tratamiento sobre la multiplicidad tumoral (número de tumores por ratón) que se redujo en un 47% y un 72% en los animales que recibieron la dosis baja y la dosis alta de glucorafanina, respectivamente, en comparación con el grupo control de ratones. De esta forma, mientras que los animales en el grupo control tuvieron el promedio de 4.3 tumores por ratón, el número de tumores por ratón fue de 2.3 para la dosis baja y 1.2 para la dosie alta de glucorafanina. (Figura 10) . La carga tumoral también se afectó de manera importante: tanto la dosis baja como la dosis alta de los tratamientos con glucorafanina dieron por resultado en una inhibición del 70% en el volumen tumoral total por ratón. (Figura 11) . Los niveles plasmáticos de sulforafano y sus metabolitos fueron muy similares: 2.2 µm y 2.5 µm para la dosis baja y la dosis alta de los tratamientos con glucorafanina, respectivamente, lo que indica que la glucorafanina se convirtió a sulforafano y que el tratamiento dietético crónico había resultado en niveles en estado estable de sulforafano y sus metabolitos en la sangre de los animales. Estos niveles son adecuados para esperar efectos biológicos. Los niveles de las enzimas fase 2 se indujeron (de 2 a 2.5 veces para la quinona reductasa 1 y 1.2 a 2.2 veces para las glutatión S-transferasas) en casi todos los órganos que se examinaron, a saber antrocardiaco, estómago, vejiga, hígado, y retina.

Análisis estadistico La incidencia tumoral se evaluó utilizando el análisis de supervivencia Kaplan-Meier seguido tanto por una prueba de rango y logarítmico estratificado como una prueba Wilcoxon, para la igualdad de las funciones de supervivencia. La multiplicidad tumoral se evaluó mediante ANOVA y se realizaron comparaciones en todos los tratamientos y sobre los tratamientos en pares, individuales (prueba t) . El volumen tumoral se evaluó mediante ANOVA con un tiempo de tratamiento como una variable jerarquizada. Estos cálculos se realizaron utilizando Stata 7.0 (Collage Station, TX) . Se calcularon otras estadísticas utilizando Excel. En conclusión, la administración tópica o dietética de extractos de brotes de bróculi, como una fuente de sulforafano en la dieta protege contra la formación de tumores cutáneos en un modelo de ratón que es altamente relevante para la exposición de los seres humanos a luz UV. Esta invención se realizó con apoyo del gobierno de conformidad con CA06973 y CA93780 concedido por Instituto Nacional del Cáncer. El gobierno tiene ciertos derechos a la invención. Abreviaturas: COX-2, ciclo-oxigenasa 2; GSH, glutatión; ?-IFN, interferón ?; iNOS, sintasa de óxido nítrico inducible; LPS, lipopolisacárido; NQOl, oxidoreductasa aceptora de NAD (P) H-quinona, también designada como quinona reductasa.

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Claims (8)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES : 1. Un método para suprimir la carcinogénesis cutánea inducida por luz UV en un paciente que comprende administrar a un paciente que se haya expuesto a luz UV una cantidad terapéuticamente efectiva de un sulforafano o un análogo de sulforafano.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sulforafano se administra trasndérmicamente .
3. 3. El método de conformidad de la reivindicación 1, caracterizado porque el sulforafano se deriva de brotes de bróculi.
4. 4. El método de conformidad de la reivindicación 1, caracterizado porque el análogo de sulforafano se selecciona del grupo que consiste de 6-isotiocianato-2-hexanona, exo-2-acetil-6-isotiocianatonorbonano, exo-2-isotiocianato-6-metilsulfonilnorbornano, 6-isotiocianato-2-hexanol, 1-isotiocianato-4-dimetilfosfonilbutano, exo-2- (1' -hidroxietil) -5-isotiocianatonorbornano, exo-2-acetil-5-isotiocianatonorbornano, l-isotiocianato-5-metilsulfonilpentano, cis-3- (metilsulfonil) ciclohexilmetilisotiocianato y trans-3-(metilsulfonil) ciclohexilmetilisotiocianato.
5. 5. Un método para suprimir la carcinogénesis cutánea inducida por luz UV en un paciente, caracterizado porque comprende administrar a un paciente que se haya expuesto a luz UV una cantidad terapéuticamente efectiva de un isotiocianato.
6. 6. Un método para suprimir la carcinogénesis cutánea inducida por luz UV en un paciente, caracterizado porque comprende administrar a un paciente que se haya expuesto a luz UV una cantidad terapéuticamente efectiva de un glucosinolato.
7. 7. Una loción para utilizarse en la supresión de la carcinogénesis cutánea inducida por luz UV en un paciente, caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de isotiocianato.
8. 8. Una loción para utilizarse en la supresión de la carcinogénesis cutánea inducida por luz UV en un paciente, caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de glucosinolato.