MX2007012989A - Metodo para tratar la demencia o la enfermedad de alheimer. - Google Patents

Abstract

Se describen metodos para tratar la enfermedad de Alzheimer (AD) o la demencia, con el uso e un anticuerpo CD20. Tambien se describen articulos de manufactura para su uso en dichos metodos.

Description

MÉTODO PARATRATAR LA DEMENCIA O LA ENFEMEDAD DE ALHEIMER Existe una solicitud provisional que reclama la prioridad según 35 USC §119 a la solicitud provisional No. 60/674,028, presentada el 22 de abril del 2005, cuya descripción se incorpora aquí como referencia.

Campo de la Invención La presente invención se refiere a métodos para tratar la enfermedad de Alzheimer (AD) o demencia en un sujeto humano que usa un anticuerpo CD20, y a un artículo de fabricación con instrucciones para tal uso.

Antecedentes de la Invención La enfermedad de Alzheimer (AD) es un problema mayor en el cuidado actual de la salud y, hasta la pasada década, no se conocían tratamientos benéficos. El trastorno neurodegenerativo más común del cerebro, la AD, suma aproximadamente el 70% de todos los casos de demencia. Esta demencia se manifiesta generalmente como problemas con la memoria, confusión, visual-espacial, cálculos, juicio y posiblemente desilusiones y alucinaciones. En la enfermedad temprana, las manifestaciones del comportamiento de la demencia son a menudo suficientemente sutiles para ser notadas. Durante la etapa media de la enfermedad, mientras los pacientes pueden aún realizar tareas independientemente, a menudo es necesaria asistencia para tareas complicadas. En las últimas etapas, funciones del cuerpo aún comunes, tal como la capacidad de masticar y tragar, el control del intestino y vejiga, y acciones respiratorias se pierden, y el paciente a menudo llega a ser encamado. Típicamente ocurre la muerte alrededor de 5 a 10 años después del inicio de la enfermedad. La AD está comúnmente clasificada como la 4a causa que conduce a la muerte en los Estados Unidos de América. En la AD ocurre una neurodegeneración progresiva en múltiples áreas del cerebro, que incluyen la implicación selectiva de los núcleos básales, hipocampo, amígdalas, corteza entorrinal y finalmente la asociación de alto orden de la corteza de las regiones temporales, frontales y parietales. El daño neuronal y la pérdida consecuente de la densidad sináptica incapacitan varios sistemas neurales, esenciales en el aprendizaje y recuperación de la memoria. La forma más común de la AD se refiere como AD esporádica, y suma aproximadamente el 90% de todos los casos diagnosticados. Esta forma de AD es generalmente nombrada esporádica, debido a que no se ha ligado a las causas genéticas del AD familiar. Los factores de riesgo de herencia pueden aún jugar un papel en esta forma de la enfermedad. Lal y Forster proporcionan una revisión de autoinmunidad y declinación cognitiva asociada con la edad, y discuten la presencia de anticuerpos reactivos del cerebro (BRA) en ratones C57BL/6 (Lal y Forster, NeuroJbiology of Aging, 9: 733-742 (1988)). Toro et al. Rev. Neurol . 29(12) 1104-7 (1999) investigaron los niveles de los anticuerpos contra la cardiolipina y beta-amiloide del suero de pacientes de Alzheimer, quienes llevaron la mutación E280A del gene de presenilin-1 (PS-1) . Se han evaluado por otros los autoanticuerpos en AD, que incluyen Terryberry et al. Neurology of Aging 19(3): 205-216 (1998); Singh et al. Neurosci . Lett 147(1): 25-28 (1992); Davydova et al. Bull Exp. Biol . Med . 134(1): 23.25 (2002). Capeson et al Capsoni et al . Mol . Cell . Neurosci . 21(1): 15-28 (2002); Evseev et al . Bull Exp . Biol . Med . 131 (4) : 305-308 (2001); Appel et al . Ann . N. Y. Acad. Sci . 1 1 -. 183-194 (1994); D'Andrea, M. Brain Res . 982(1) :19-30 (2003); Mruthinti et al . Neurobiol Aging. 25(8) :1023-1032 (2004); ?ath et al . Neuromolecular Med . 3(l):29-39 (2003); Weksler y Goodhardt Exp Gerontol . 37:971-979 (2002); y Furlan et al . Brain 126 (Pt 2):285-291 (2003).

Véase también Keimowitz, R. Arch Neurol . 54(4) :485-8 (1997); Aisen et al . Neurology. 54(3): 588-93 (2000); y Aisen et al . Dementia . 7(4):201-6 (1996), relacionado con la terapia de la AD. Se aprobaron cinco drogas de prescripción por la Administración de Alimentos y Drogas (FDA) de los Estados Unidos de América, para tratar la AD. otro de los medicamentos, aprobados para tratarla AD leve- moderada son los inhibidores de colinoesterasa, galantamina (REMINYL®) , rivastigmine (EXELON®) , donepezil (ARICEPT®) , y tacrina (COGNEX®) . El quinto medicamento aprobado es un antagonista del D-aspartato de N-metilo, denominado memantina (NAMENDA®) , aprobado para la terapia de la AD moderada-severa.

Anticuerpos CD20 y la Terapia con Ellos Los linfocitos son uno de os muchos tipos de leucocitos, producidos en la médula espinal durante el proceso de la hematopoiesis. . Existen dos poblaciones principales de linfocitos: linfocitos B (células B) y linfocitos T (células T) . Los linfocitos de interés particular aquí son las células B. Las células B maduran dentro de la médula espinal y dejan la médula que expresa un anticuerpo que se une a un antígeno en su superficie celular. Cuando una célula B nativa primero encuentra el antígeno, al cual su anticuerpo se une a la membrana, es específico que la célula comience a dividirse rápidamente y su progenie diferencia en las células B y las células de efector, denominadas "células de plasma" . Las células B de memoria tienen una extensión de vida mayor y continúan para expresar el anticuerpo que se une a la membrana con la misma especificidad como la célula padre original . Las células de plasma no producen anticuerpos de unión a la membrana, sino intentan producir el anticuerpo en una forma que pueda ser secretada. Los anticuerpos secretados son moléculas de efector principales de la inmunidad humoral . El antígeno CD20 (también llamado antígeno de diferenciación restringida del linfocito B humano, BP 35) es una proteína de transmembrana hidroóbica con un peso molecular de aproximadamente 35 kD en los linfocitos pre-B y la B maduros Valentine et al . , J. Biol . Chem. 264 (19) : 11282-11287 (1989) y Einfeld et al . , EMBO J. 7(3):711-717 (1988). El antígeno es también expresado en más del 90% de los linfomas no de Hodgkin de células B (NHL) (Anderson et al . Blood 63 (6) :1424-1433 (1984)), pero no se encuentra en las células del tallo hematopoiéticas, células pro-B, células de plasma normales u otros tejidos normales (Tedader et al . J. Immunol . 135 (2) : 973-979 (1985)). CD20 regula uno o más pasos tempranos en el proceso de activación para el inicio del ciclo celular y la diferenciación (Tedader et al . , supra) , y posiblemente funciona como un canal de Ion de calcio. Tedader et al . , J. Cell . Biochem. 14D:195 (1990). Dada la expresión de CD20 en los linfomas de células B, este antígeno puede servir como un candidato para el "objetivo" de tales linfomas. En esencia, tal objetivo puede ser generalizado como sigue: anticuerpos específicos al antígeno de superficie CD20 de las células B se administran a un paciente. Estos anticuerpos de CD20 se unen específicamente al antígeno CD20 de (ostensiblemente) tanto células B normales como malignas; el anticuerpo unido al antígeno de superficie de CD20 puede conducir a la destrucción y evacuación de las células B neoplásticas. Adicionalmente, agentes químicos o etiquetas radioactivas, que tienen el potencial de destruir el tumor, pueden ser conjugados al anticuerpo anti-CD20, de modo que el agente sea "entregado" específicamente a las células B neoplásticas. Independientemente del acercamiento, una meta primaria es destruir el tumor, este acercamiento específico se puede determinar por el anticuerpo anti-CD20 particular, que se utiliza y así, los acercamientos disponibles para el objetivo del antígeno CD20 pueden variar considerablemente. El anticuerpo rituximab (RITUXAN®)es un anticuerpo monoclonal del murino/humano, quimérico, de ingeniería genética, dirigido contra el antígeno CD20. El Rituximab es el anticuerpo llamado "C2B8" en la patente US NO. 5,736,137, expedida el 7 de abril de 1998 (Anderson et al) . el Rituximab es indicado para el tratamiento de pacientes con el linfoma no de Hodgkin de células B, CD20-positivo, de grado bajo o folicular, de recaída o refractario. (intratable) El Rituximab se ha demostrado media la citotoxicidad complemento-dependiente (CDC) y la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) e induce la apoptosis (Reff et al . , Blood 83 (2) :435-445 (1994); Maloney et al . , Blood 88:637a (1996); Manches et al . , Blood 101:949-954 (2003)). La sinergia entre el rituximab t las quimioterapias y toxinas se han observado también experimentalmente. En particular, el rituximab sensibiliza las líneas celulares de linfoma de células B humanas, resistentes a drogas, a los efectos ciitotóxicos de la doxorubicina, CDADP, VP-16, toxina de la difteria y ricina (Demidem et al . , Cáncer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12 (3) : 177-186 (1997)). Los estudios preclínicos in vivo han mostrado que la rituximab evacúa las células B desde la sangre periférica, nodos linfáticos y médula ósea de monos cinomólogos. Reff et al., Blood 83:435-445 (1994). El Rituximab también se ha estudiado en una variedad de trastornos autoinmunes no malignos, en que las células B y los autoanticuerpos parece juegan un papel en la patofisiología de la enfermedad. Edwards et al., Biochem Soc. Trans. 30:824-828 (2002). El Rituximab se ha reportado alivia potencialmente signos u síntomas por ejemplo la artritis reumatoide (RA) (Leandro et al., Ann. Rheum. Dis. 61:883-888 (2002); Edwards et al., Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9): S46 (2002); Stahl et al., Ann. Rheum. Dis., 62 (Suppl. 1): OP004 (2003); Emery et al., Arthritis Rheum. 48(9): S439 (2003)), lupus (Eisenberg, Arthritis. Res. Ther. 5:157-159 (2003); Leandro et al. Arthritis Rheum. 46: 2673-2677 (2002); Gorman et al., Lupus, 13: 312-316 (2004)), púrpura trombocitopénica inmune (D'Arena et al., Leuk.

Lymphoma 44:561-562 (2003); Stasi et al., Blood, 98: 952-957 (2001); Saleh et al., Semin. Oncol., 27 (Supp 12): 99-103 (2000); Zaia et al., Haematolgica, 87: 189-195 (2002); Ratanatharathorn et al., Ann. Int. Med., 133: 275-279 (2000)), aplasia de células rojas puras (Auner et al., Br. J.

Hae atol., 116: 725-728 (2002)); anemia autoimmune (Zaja et al., Haematologica 87:189-195 (2002) (parece errata en Haematologica 87:336 (2002)), enfermedad de aglutinina fría (Layios et al., Leukemia, 15: 187-8 (2001); Berentsen et al., Blood, 103: 2925-2928 (2004); Berentsen et al., Br. J. Hae atol., 115: 79-83 (2001); Bauduer, Br. J. Haematol . , 112: 1083-1090 (2001); Damiani et al., Br. J. Haematol., 114: 229-234 (2001) ) , tipo B síndrome de resistencia severa a la insulina (Coll et al., N. Engl. J. Med., 350: 310-311 (2004), crioglobulinemia mixta (DeVita et al., Arthritis Rheum. 46 Suppl. 9:S206/S469 (2002)), myasthenia gravis (Zaja et al., Neurología, 55: 1062-63 (2000); Wylam et al., J. Pediatr., 143: 674-677 (2003)), Granuklomatosis de Wegener (Specks et al., Arthritis & Rheumatism 44: 2836-2840 (2001)), refractaria pemphigus vulgaris (Dupuy et al., Arch Dermatol., 140:91-96 (2004)), dermatomiositis (Levine, Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9) :S1299 (2002)), Sjogren's syndrome (Somer et al., Arthritis & Rheumatism, 49: 394-398 (2003)), crioglobulinemia mixta tipo II activo (Zaja et al., Blood, 101: 3827-3834 (2003)), pemphigus vulgaris (Dupay et al., Arch. Dermatol., 140: 91-95 (2004)), neuropatía autoimmune (Pestronk et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 74:485-489 (2003)), síndrome opsoclonus-mioclonus paraneoplástico (Pranzatelli et al. Neurology 60 (Suppl. 1) P05.128:A395 (2003)), y esclerosis múltiple recurrente- remisible RRMS).

Cross et al . (extracto) "Preliminary results from a phase II trial of rituximab in MS" (Resultados preliminares de un ensayo de fase II del rituximab en MS) Eighth Annual Meeting of the Americas Committees for Research y Treatment in Múltiple Sclerosis, 20-21 (2003) . Un estudio de la Fase II, ha sido conducido en pacientes con artritis reumatoide (RA) que proporciona datos de seguimiento de 48 semanas en la seguridad y eficacia del rituximab. Emery et al . Arthri tis Rheum 48(9):S439 (2003); Szczepanski et al . Arthri tis Rheum 48(9):S121 (2003); Edwards et al . , "Efficacy of B-cell-targeted therapy with rituximab in patients with rheumatoid arthritis" N Engl . J. Med . 350:2572-82 (2004). Un total de 161 pacientes se trataron aleatoriamente de manera uniforme a cuatro brazos de tratamiento: metotrexato, rituximab solo, rituximab más metotrexato y rituximab más ciclofosfamida (CTX) . El régimen de tratamiento del rituximab fue de un gramo administrado intravenosamente en los días 1 y 15. Las infusiones de rituximab en la mayoría de pacientes con AD fue bien tolerado por la mayoría de estos pacientes, con 36% de los pacientes experimentando al menos un evento adverso durante su primera infusión (comparado con el 30% que recibió placebo) , En general, la mayoría de los eventos adversos se considero leves a moderada en severidad y que bien equilibrada a través de los grupos de tratamiento. Hubo un total de 19 eventos adversos serios a través de los cuatro brazos sobre las 48 semanas, los cuales fueron levemente más frecuentes en el grupo de rituximab/CTX. La incidencia de las infecciones fue bien balanceada en todos los grupos. El régimen medio de infecciones serias en esta población de pacientes con RA fue de 4.66 por 100 pacientes-años, el cual es menor que el régimen de infecciones que requieren la admisión en hospitales en pacientes de RA (9.57 por 100 pacientes-años), reportados en un estudio epidemiológico basado en la comunidad. Doran et al . , Arthri tis Rheum . 46:2287-2293 (2002) . El perfil de seguridad reportado del rituximab en un pequeño número de pacientes con trastornos neurológicos , que incluyen la neuropatía autoinmune (Pestronk et al . , supra) , síndrome de opsoclonus-myoclonus (Pranzatelli et al . , supra) , y RRMS (Cross et al . , supra) , fue similar a aquel reportado en oncología o EA. En un resultado de un ensayo patrocinado por el investigador (IST) del rituximab en combinación con la interferona-3 (IFN-3) o acetato de glatiramer en pacientes con RRMS (Cross et al . , supra) , 1 de 10 pacientes tratados se admitió en el hospital para la observación durante la noche, después de experimentar fiebre moderada y rigores en seguida de la primera infusión de rituximab, mientras los otros 9 pacientes completaron el régimen de cuatro infusiones sin cualquier evento adverso reportado. Las publicaciones de patentes relacionadas con los anticuerpos CD20 y las moléculas ligadas a CD20 incluyen: US Patentes Nos. 5,776,456, 5,736,137, 5,843,439, 6,399,061, y 6,682,734, al igual que US 2002/0197255, US 2003/0021781, US 2003/0082172, US 2003/0095963, US 2003/0147885 (Anderson et al . ) ; US Patente No. 6,455,043, US 2003/0026804, y WO 2000/09160 (Grillo-Lopez, A.); WO 2000/27428 (Grillo-Lopez y White) ; WO 2000/27433 y US 2004/0213784 (Grillo-Lopez y Leonard); WO 2000/44788 (Braslawsky et al . ) ; WO 2001/10462 (Rastetter, W.); WO01/10461 (Rastetter y White); WO 2001/10460 (White y Grillo-Lopez) ; US 2001/0018041, US 2003/0180292, WO 2001/34194 (Hanna y Hariharan); US 2002/0006404 y WO 2002/04021 (Hanna y Hariharan) ; US 2002/0012665 y WO 2001/74388 (Hanna, N.); US 2002/0058029 (Hanna, N.); US 2003/0103971 (Hariharan y Hanna); US 2002/0009444 y WO 2001/80884 (Grillo-Lopez, A.); WO 2001/97858 (White, C); US 2002/0128488 y WO 2002/34790 (Reff, M.); WO 2002/060955 (Braslawsky et al . ) ;VIO 2002/096948 (Braslawsky et al.) ;W0 2002/079255 (Reff y Davies); US Patente No. 6,171,586 y WO 1998/56418 (Lam et al.) ; WO 1998/58964 (Raju, S.); WO 1999/22764 (Raju, S.); WO 1999/51642, US Patente No. 6,194,551, US Patente No. 6,242,195, US Patente No. 6,528,624 y US Patente No. 6,538,124 (Idusogie et al.) ; WO 2000/42072 (Presta, L.); WO 2000/67796 (Curd et al.) ; WO 2001/03734 (Grillo-Lopez et al.) ; US 2002/0004587 y WO 2001/77342 (Miller y Presta); US 2002/0197256 (Grewal, I.); US 2003/0157108 (Presta, L.); WO 04/056312 (Lowman et al.) ; US 2004/0202658 y WO 2004/091657 (Benyunes, K.); WO 2005/000351 (Chan, A.); US 2005/0032130A1 (Beresini et al.) ; US 2005/0053602A1 (Brunetta, P.); US Patente Nos. 6,565,827, 6,090,365, 6,287,537, 6,015,542, 5,843,398, y 5,595,721, (Kaminski et al.) ; US Patente Nos. 5,500,362, 5,677,180, 5,721,108, 6,120,767, y 6,652,852 (Robinson et al.) ; US Pat No. 6,410,391 (Raubitschek et al.); US Patente No. 6,224,866 y WO 00/20864 (Barbera-Guillem, E.); WO 2001/13945 (Barbera-Guillem, E.); US2005/0079174A1 (Barbera-Guillem et al.) ; WO 2000/67795 (Goldenberg); US 2003/0133930 y WO 2000/74718 (Goldenberg y Hansen) ; US 2003/0219433 y WO 2003/68821 (Hansen et al.) ; WO2004/058298 (Goldenberg y Hansen); WO 2000/76542 (Golay et al.) ; WO 2001/72333 (Wolin y Rosenblatt) ; US Patente No. 6,368,596 (Ghetie et al.) ; US Patente No. 6,306,393 y US 2002/0041847 (Goldenberg, D.); US 2003/0026801 (Weiner y Hartmann); WO 2002/102312 (Engleman, E.); US 2003/0068664 (Albitar et al.) ; WO 2003/002607 (Leung, S.); WO 2003/049694, US2002/0009427 , y US 2003/0185796 (Wolin et al.) ; WO 2003/061694 (Sing y Siegall); US 2003/0219818 (Bohen et al.) ; US 2003/0219433 y WO 2003/068821 (Hansen et al.) ; US 2003/0219818 (Bohen et al.) ; US2002/0136719 (Shenoy et al.) ; WO 2004/032828 (Wahl et al.) ; WO 2002/56910 (Hayden-Ledbetter) ; US 2003/0219433 Al (Hansen et al.); WO 2004/035607 (Teeling et al.) ; US 2004/0093621 (Shitara et al.) ; WO 2004/103404 (Watkins et al.) ; WO 2005/000901 (Tedader et al.) ; US 2005/0025764 (Watkins et al.) ; WO2005/016969 y US 2005/0069545 Al (Carr et al.) ; y WO 2005/014618 (Chang et al.) . See also US Patente No. 5,849,898 y EP 330,191 (Seed et al.) ; EP 332,865 A2 (Meyer y Weiss); US Patente No. 4,861,579 (Meyer et al.) ; US 2001/0056066 (Bugelski et al.) ; y WO 1995/03770 (Bhat et al.) . See also US2005/0079184 Al, US2004/0018557 Al, WO2005/016241 A2 , WO2005/009539 A2 , WO2004/105684 A2 WO2004/080387 A2 , WO2004/074434 A2 , WO2004/060911 A2 , WO2004/045512 A2 , WO2004/032828 A2 , y WO2003/043583 A2.

Publicaciones relacionadas con la terapia con rituximab incluyen: "Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to rituximab" ("Respuesta de la recidiva crónica ITP de 10 Años de duración al rituximab") Abstract # 3360 Blood 10 (1) (part 1-2): p. 88B (1998); Perotta et al . , "Rituxan in the treatment of chronic idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) " ("Eituxab en el tratamiento de púrpura trombocitopénica idiopática (ITP)") , Blood, 94: 49 (abstract) (1999); Matthews, R. , "Medical Heretics" (Herética Médica") New Scientist (7 April, 2001); Leandro et al . , "Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy y dose response" ("Evacuado de linfocitos en la artritis reumatoide; evidencia temprana para la seguridad, eficacia y respuesta de dosis ") ( Arthri tis y i-heu a ism 44(9): S370 (2001); Leandro et al . , "An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus" ("Un esrudio abierto de evacuación de linfocitos B en lupus eritematoso sistémico!) , Arthritis y Rheumatism, 46:2673-2677 (2002) , en que, durante un período de 2 semanas, cada paciente recibió dos infusiones de 500 mg de rituximab, dos infusiones de 750 mg de ciclofosfamida y altas dosis de corticoesteroides orales y donde dos de los pacientes tratados recayeron en 7 y 8 meses, respectivamente y han sido retratados, aunque con diferentes protocolos; Weide et al . , "Successful long-term treatment of systemic lupus erythematosus with rituximab maintenance therapy" ("Tratamientos exitosos por períodos largos de lupus eritematoso sistémico con terapia de mantenimiento de rituximab!) Lupus, 12: 779-782 (2003), en que un paciente se trató con rituximab (375 mg(m2 x 4, repetido en intervalos semanales) y otras aplicaciones de rituximab se entregaron cada 5-6 meses y luego recibieron una terapia de mantenimiento con rituxima b de 375 mg/m2 cada tres meses y un segundo paciente con SLE refractario (intratable) se trató exitosamente con rituximab y recibió terapia de mantenimiento cada tres meses, con ambos pacientes respondiendo bien a la terapia del rituximab. Edwards y Cambridge, "Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes" ("Mejora sostenida en artritis reumatoide siguiendo un protocolo diseñado para evacuar los linfocitos B") Rheumatology 40:205-211 (2001); Cambridge et al . , "B lymphocyte depletion in patients with rheumatoid arthritis: serial studies of immunological parameters" ("Evacuado de linfocitos B en pacientes con artritis reumatoide, estudios en serie de parámetros inmunológicos") ( "Arthri tis Rheum. , 46 (Suppl. 9): S1350 (2002); Edwards et al . , "Efficacy y safety of rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: ("Eficacia y seguridad del rituximab, un anticuerpo monoclonal quimérico de células B" ) Un ensayo controlado de placebo aleatorio en pacientes con artriitis reumatoide. S197 (2002); Pavelka et al . , Ann . Rheum. 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Compendio de la Invención En un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar la enfermedad de Alzheimer en un sujeto, el método comprende administrar un anticuerpo de CD20 sin protección al sujeto, en una cantidad efectiva para tratar la enfermedad de Alzheimer. En un segundo aspecto, la invención se refiere a un método para tratar la demencia en un sujeto, este método comprende administrar un anticuerpo CD20 sin protección al sujeto, en una cantidad efectiva para tratar la demencia. La invención además se refiere a un artículo de fabricación que comprende: (a) un contenedor, que comprende un anticuerpo de CD20 sin protección; y (b) un inserto de paquete, con instrucciones para tratar la enfermedad de Alzheimer o la demencia en un sujeto.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura ÍA es un alineamiento de secuencias que compra las secuencias de aminoácidos del dominio ligero variable (VL) de cada cual del murino 2H7 (SEQ ID NO:l ) la variante humanizada 2h/ VI6 (SEQ ID NO: 2) y el subgrupo de cadena ligera kappa humano (SEQ ID NO: 3. Las CDRs de VL de 27 y hu2H7 vl6 son como sigue: CDRl (SEQ ID N0:4), CDR2 (SEQ ID NO: 5) Y CDR3 (SEQ ID NO: 6).

La Figura IB es un alineamiento de secuencias que compara las secuencias de aminoácidos del dominio pesado variable (VH) de cada uno del murino 2H7 (SEQ ID NO.7), variante humanizada 2H7 vl6 (SEQ ID NO: 8) y la secuencia de consenso del subgrupo III de cadena pesada (SEC ID NO: 9) . Las CDRs de VH de 2H7 y hu2H7 v 26 son como sigue: CDRl (SEQ ID NO; 10), (CDR2 (SEQ ID No. 11) y CDR3 (SEQ ID NO: 12). En las Figuras ÍA y IB, las CDRl, CDR3 y CDR3 en cada cadenaa se encierran con corchetes, flanqueaass por las regiones de armazón FR1-FR4, como se indica. 2H7 se refiere al anticuerpo 2H7 del murino. Los esteriscos entredós hileras de secuencias indican laas posiciones que son diferentes entre las dos secuencias. La numeración de residuos es de acuerdo con Kabat et al. Sequences of Immunological Interest (Secuencias de Interés Inmunológico) 5a Ed. Public Health Service; National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1951) , con las inserciones mostraas como a, b, c, d y e. La Figura 2 muestra un alineamiento de las cadenas ligeras 2H7 vl6 y 2H7 v522 (SEQ ID NOS. 113 y 17, respectivamente) . Con la numeración del residuo de dominio variable de Kabat y numeración de residuo de dominio constante Eu.

La Figura 3 muestra un alineamiento de las cadenas pesadas 2H7 vl6 y 2H7 v511 SEQ ID Nos. 14 y 16, respectivamente con la numeración del residuo de dominio variable de Kabat y la numeración de residuo de dominio constante de Eu.

Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas 1. Definiciones "Demencia" se refiere a un deterioro mental general, caracterizada por la desorientación, memoria, juicio e intelecto perjudicados y efecto lábil de esmero. La demencia aquí incluye la demencia vascular, demencia vascular isquémica (IVD) , demencia frontotemporal (FTD) , demencia del cuerpo de Lewy, demencia de Alzheimer, etc. La forma más común de demencia entre las personas ancianas es la enfermedad de Alzheimer (AD) . La "enfermedad de Alzheimer (AD) " se refiere al deterioro mental progresivo, manifestado por la pérdida de memoria, confusión y desorientación, que comienza generalmente más tarde en la vida, y que resulta comúnmente en muerte en 5-10 años. La enfermedad de Alzheimer puede ser diagnosticada por neurólogos y clínicos expertos. En una modalidad, el sujeto con AD cumplirá con los criterios del National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Strike/Alzheimer' 3 Disease and Relatied Disorders Association (NINCDS/ADRDA) para la presencia de la ad probable . Las expresiones de AD "benigna-moderada" o "etapa temprana" , se usan aquí como sinónimos para referirse a la AD que no ha avanzado y en que los signos o síntomas de la enfermedad no son severos. Los sujetos con A benigna o moderada o en la etapa temprana se pueden identificar por un neurólogo o clínico experto. En una modalidad, el sujeto con AD benigna-moderada se identifica usando el Examen de Estado Mini-Mental (MMSE) . Aquí, AD "moderada-severa" o de "etapa tardía" se refiere a la AD que ha avanzado y los signos o síntomas de enfermedad son pronunciados. Tales sujetos pueden ser identificados por un neurólogo o clínico experto. Los sujetos con esta forma de AD pueden ya no responder a la terapia con inhibidores de la colinoesterasa y pueden tener un nivel de la acetilcolina marcadamente reducido. En una modalidad, el sujeto con AD moderada-severa se identifica usando el Examen de Estado Mini-Mental (MMSE) . El "Examen de Estado Mini-Mental (MMSE)" es la prueba usada más comúnmente para pacientes con problemas de memoria o cuando un diagnóstico de demencia se ha considerado. Los sujetos con una clasificación de 12 a 26 puntos pueden ser considerados como teniendo una demencia benigna-moderad o AD. Los sujetos con una clasificación menor de 12 puntos, pueden ser considerados tienen una demencia o AD severa. El MMSE comprende una serie de cuestiones y pruebas, cada una de las cuales clasifica puntos de respuestas correctas. Si cada respuesta es correcta, una clasificación máxima de 30 puntos es posible. Las personas con la enfermedad de Alzheimer clasifican generalmente 26 puntos o menos. Copas de la prueba completa están disponibles de Psychological Assessment Resourses (PARA) sitio web: http : //www . parinc . com. La "AD Familiar" es una forma hereditaria de AD, causada por un defecto genético. La "AD Esporádica" es la forma más común de AD, que se cree es causada por una combinación de factores ambientales y genéticos, por ejemplo el genotipo Apo E4 , así el 90% de todos los pacientes de AD diagnosticados tienen la forma esporádica de la enfermedad. Por "medicamentos "estándar de cuidado" se intentan uno o más medicamentos usados más comúnmente para tratar la AD o demencia, por ejemplo, los medicamentos estándar de cuidado para la AD pueden ser un inhibidor de la colinoesterasa y/o antagonista de la NMDA. Un "síntoma de AD o demencia es cualquier fenómeno mórbido o que se aparta del normal en estructura, función o sensación, experimentados por el sujeto y que indican la AD o demencia. Un "sujeto" aquí es un sujeto humano. Para los propósitos de la presente, el sujeto se refiere a un sujeto con AD o demencia. Generalmente, el sujeto es elegible para el tratamiento de la AD o demencia. Para los fines de la presente, tal sujeto elegible es no quien experimenta, ha experimentado o es probable experimente, uno o más signos o síntoma de la AD o demencia. El diagnóstico de AD o demencia puede incluir un diagnóstico de demencia mixta (MIX) , donde los signos y síntomas de la AD coexisten con aquellos de la demencia vascular isquémica (IVD) . En una modalidad, el sujeto no sufre de una enfermedad autoinmune, además de la AD. Uno que sufre de, o con riesgo de sufrir la AD o demencia, puede, opcionalmente, ser identificado como uno quien se ha clasificado por niveles elevados de células B CD20-positivas en el suero, fluido cerebroespinal (CSF) y/o plaquetas seniles. Alternativa o adicionalmente, el sujeto puede ser clasificado por usar un ensayo para detectar autoanticuerpos, evaluados cualitativamente, y, en forma preferible, cuantitativamente. Tales anticuerpos pueden ser detectados en el suero del sujeto, fluido cerebroespinal (CSF) y/o placas seniles, por ejemplo, por el ensayo ELISA. Un "autoanticuerpo" es un anticuerpo llevado por un sujeto y dirigido contra un antígeno propio del sujeto. Autoanticuerpos ejemplares, asociados con la AD o demencia, incluyen, pero no se limitan a, los anticuerpos reactivos del cerebro (BRAs) y anticuerpos a: beta-amiloide, cardiolipina, tubulina, proteína del ácido fibrilar glial, proteína de neurofilamento (NFL) , gangliosida, proteína del citoesqueleto, proteína básica de mielina (MBP) , serotonina, dopamina, presenilina, receptor de beta-péptido amiloide (Abeta) para productos terminales de la glicación avanzada (RAGE), factor de crecimiento de nervios (NGF) y similares. Por nivel de autoanticuerpo "atípico" se entiende un nivel de tal autoanticuerpo que excede el nivel normal . Tal nivel de autoanticuerpo normal o típico puede ser el nivel encontrado en una muestra biológica de un sujeto normal, o sujeto quien no sufre de la AD o demencia. La muestra biológica puede ser el suero, Anticuerpos reactivos del cerebro" o "BRAs" son cualquier población que ocurre espontáneamente anticuerpos humanos, presentes en el suero, fluido cerebroespinal (CSF) y/o tejido del cerebro de un sujeto, el cual puede reaccionar con el cerebro humano y/o con tejidos del Sistema Nervioso Central (CNS) Humano, con mayor especificidad con la que ellos reaccionan con otros tejidos humanos normales. "Tratamiento" de un sujeto aquí se refiere a tanto el tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Aquellos que necesitan tal tratamiento incluyen los que ya tienen 1 AD o demencia, al igual que aquellos en que la AD o demencia se va a prevenir. Así, el sujeto puede haber sido diagnosticado como teniendo la AD o demencia o puede estar predispuesto o es susceptible a la AD o demencia. El término de "tratamiento", según se usa aquí, incluye el tratamiento preventivo (por ejemplo, profiláctico) paliativo y curativo. La expresión de "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad del anticuerpo (u otra droga) que sea efectiva para prevenir, mejorar o tratar la demencia o la AD.. Tal cantidad efectiva generalmente resulta en una mejora en los signos o síntomas de la demencia o enfermedad de Alzheimer, tal como: mantener la función cognitiva (por ejemplo, memoria, lenguaje, pensamiento crítico, lectura y/o experiencia de escritura) , disminuye el progreso de la enfermedad, retarda su inicio o previene la enfermedad, junto con el manejo de problemas del comportamiento asociados con la enfermedad, trata la depresión y/o apatía: trata comportamientos, tal como la agresión y/o ansiedad, disminuye la pérdida de experiencia diaria de la vida, tal como comer, vestir e ir al baño, reduce los niveles de autoanticuerpos y reduce los números de células B CD20-positivas (por ejemplo en el suero) . El SNC y/o las placas seniles) . Un "inhibidor de colinoesterasa" es un agente o composición que bloquea o interfiere con la interrupción de la acetilcolina y/o butirilcolina . Ejemplos de inhibidores de la colinoesterasa incluyen la galantamina (REMINYL®) , rivastigmina (EXELON®) , donepezil (ARICEPT®) , tacrina (COGNEX®) y HUPRINE X™. Por "antagonista de D-aspartato de N-metilo" se intenta aquí un agente o composición que bloquea o interfiere con NMDA y/o regula el glutamato en exceso o la activación del glutamato. antagonistas de NMD ejemplares incluyen la memantina (NAMENDA®) y neramexano . El término de agente inmunosupresivo" , según se usa aquí para la terapia adjunta a sustancias que actúan para suprimir o enmascarar el sistema inmune del sujeto que se trata. Incluirá sustancias que suprimen la producción de citocina, regulan disminuyendo o suprimiendo la expresión de auto-antígeno, o enmascarando los antígenos MHC. Ejemplos de tales agentes incluyen las 2-amino-6-aril-5-pirimidinas sustituidas (véase la Patente US 4,665,077) Drogas anti-inflamatorias no esteroidales NSAIDs) ; ganciclovir, tacrolimus, gluocorticoides, tal como cortisol o aldosterona; agentes anti-inflamatorios, tal como un inhibidor de la ciclooxigenasa, un inhibidor de la 5-lipoxigenasa o un antagonista receptor de leucotrieno; antagonistas de la purina, tal como una azotioprina o micofenolato mofetil (MMF) , agentes de alquilación, tal como la ciclofosfamida; bromocriptina; danazol; dapsona; glutaraldehído (el cual enmascara los antígenos de MHC, como se describe en la Patente US No. 4,120,649), anticuerpos anti-idiotípicos para los antígenos MHC y fragmentos de MHC; ciclosporina; 6-,mercaptopurina, esteroides, tal como corticosteroides o glucocorticosteroides o análogos glucocorticoides, por ejemplo, predinsona, metilprednisolona, que incluye SOLU-MENDRO® . succinato de metilpredinsolona y dexametasona; inhibidores de reductasa de dihidrofolato, tal como el metotrexato (oral o subcutáneo) ; agentes anti -malaria, tal como la cloroquina e hidroxicloroquina; sulfasalazina, leflunmida , citocina o anticuerpos del receptor de la citocina, o antagonistas que incluyen los alfa, beta o gamma-anticuerpos de anti-interferona, alfa-anticuerpos del factor de necrosis anti-tumor (TNF) (infliximab (REMICADE®) o adaltimumab) , anti-alfa-inmunoadhesna tanercept) , alfa-anticuerpos anti-TNF, anticuerpos de anti-leucina-2- (IL-2) y anticuerpos del receptor de anti-IL y anticuerpos del receptor de anti-interleucina-6 (IL-6) y antagonistas; anticuerpos de anti-LFA-1, que incluyen los anticuerpos anti-CDllla y anti CD-18; anticuerpos anti-L3T4, globulina anti-linfocitos heterologa; anticuerpos pan-T, preferiblemente anti-CD3 o anti-CD4/CD4A, péptidos solubles que contienen un dominio de liga de LFA-3 (WO 90/08187, publicada el 7/260) , etreptocinasa, factor beta del crecimiento de transformación (TGF-beta) , estreptodomasa; ARN o ADN del huésped; FK506 RS-62443, cloranbucul; doxispergualina; rapamicin; receptor de células T (Cohén et a, Patente US No. 5,114,721); fragmentos del receptor de células T (Offner et al., Science, 251:430-432 (1991); WO 90/11294; Laneway, Natue, 341:482 (1989); y WO 91/01133) . Antagonistas de BAFF tal como anticuerpos de BAFF o BR3 o inmunoadhesivas y antagonistas de zTNF4 (para una revisión, véase Mackay y Mackay. Trens Immunol . , 2 : 113 -5 (2002) Y véase también la definición abajo) , agentes biológicos que interfieren con las señales de ayuda de células t, tal como el receptor anti-CD40 o la ligadura CD40 (CD154) , que incluye los anticuerpos de bloqueo a CD40-ligadura de D40 (por ejemplo, Durie et al., Science 261_ 1329-30 (1993): Mohán et al., J. Immunol . 154: 2470-80 (1995)) y CTLA4-Ig (Finck et al., Science 265: 1225-7 (1995); y anticuerpos del receptor de células T (EP 340,209) tal como T10B9. El término e "agente citotóxico, según se usa aquí, se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o causa la destrucción de células. El término intenta incluir los isótopos radioactivos (por e „ -j; , Vti • 12 , P r,32 e _ isótopos radioactivos de Le), agentes quimioterapéuticos, y toxinas tal como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fungal, de plantas o animales, o sus fragmentos. Un "agente quimioterpéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes de alquilación, tal como tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN®) ; sulfonatos de alquilo, tal como busulfan, improsulfan y piposuilfan, aziridinas, tal como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa, etileniminas y metilamelaminas, que incluyen la altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolmelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona) delt-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®) , beta-lapachona (apachol, colchincinas, ácido betulínico; una camptotecina (que incluye la topotecan análoga sintética HYCAMTIN®) -11 (innotecan, CAMPTOSAR®) , acetilcamptotecina, scoplectina y 9-aminocamptotecina) , calistatina, -1065 (que incluye sus análogos sintéticos de su adozelesina, carelesina y bizelesina, podofilotoxina, ácido podofilinico, tenipósido, criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y vitiptoficina 8) , dolastatina, duocamicina (que incluye los análogos sintéticos, KW-2189 y CB2-TM1) , eleuterobina, pancratistatina, una sarcodicttina. spongistatina, mostazas de nitrógeno. tal como clorambucil, clornafazina, clorfosfamia, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, mecloretamina-óxido-clorhidrato, melfalan, novembichina, fenesterina, prednmustina, trofosfamida, mostaza de uracilo, nitrosoureas tal como caarmustina, clorozotoxcina, fotemusina, lomustina, nimustina y ranimnustina, antibióticos, tal como antibióticos de enemicina (por ejemplo calciehamicina, especialmente calicheamicina gamma 1) y calicheamicina omega 1 (véase, por ejemplo, Agnew. hem. 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Ed.Engl. 33; 183-186 (1994)); dinemicina, que incluye dinamicina A; una esperamicina; al igual que cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos antibióticos de enedicina de cromaproteína relacionados) aclasinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carxinofilina, cromamicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxofubicina (que incluye la ADRIAMICINA®) , morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina, inyección de doxorubicina HCl liposoma (DOXIL®) y deoxidoxorubicina) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicin, mitomicinas tal como mitomicina C, ácido micofenólico nogalamicina, olivomicinas, peplomicin, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicin, streptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tal como metotrexato, gemcitabina (GEMZAR®) , tegafur (UFTORAL®) , capecitabina (XELODA®) , una epotilona, y 5-fluorouracil (5-FU) ; análoghos del ácido fólico denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de la purina tal como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de la pirimidina tal como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, cytarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; anti-adrenales tal como such as aminoglutetimide, mitotane, trilostane; rellenador del ácido fólico tal como ácido frolinico aceglatona; aldofosfamide glicoside; ácido aminolevulínico eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; elliptinio acetato; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tal como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenameto; pirarubicina; losoxantrona; 2-etylhydrazida; procarbazina; complejo de poisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxano; rhizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquone; 2 , 2 2 " -trichlorotrietilamina; tricotecenos (especialmente T-2 toxina, verracurina A, roridina A y anguidina) ; uretano; vindesina (ELDISINA®, FILDESIN®) ; dacarbazina; manomustina; mitobronitol ; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosido ("Ara-C"); tiotepa; taxoides, por ejemplo., paclitaxel (TAXOL®), formulación de nanopartículas de ingeniería de paclitaxel (ABRAXANE™) , y doxetaxel (TAXOTERE®) ; cloranbucilo; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos del platino tal como cisplatino y carboplatino; vinblastina (VELBAN®) ; platino; etopósido (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®) ; oxaliplatino; leucovovina; vinorelbina (NAVELBINA®) ; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometlilornitina (DMFO) ; retinoides tal como ácido retínoico acid; sales aceptables farmacéuticamente, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriors, al igual que combinaciones de dos o más de ellos tal como CHOP, una abreviatura para la terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, y prednisolona, y FOLFOX, una abreviatura para un régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovovina. También se incluyen en esta definición los agentes anti-hormonales que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de hormonas que pueden promover el crecimiento del cáncer, y son a menudo en la forma de un tratamiento sistémico o de todo el cuerpo. Ellos pueden ser las propias hormonas. Ejemplos incluyen los anti-estrógenos y moduladores de receptores del estrógeno selectivos (SERMx) , que incluyen, por ejemplo, el tamoxifen (que incluye el tamoxifen NOLVADEX®) , raloxifen (EVISTA®) , droloxifeno, 4-droxytamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno (FARESTON®) ; anti-progesterónos; receptor del estrógeno, reguladores de disminución, receptor de estrógeno (ERDs) ; antagonistas tal como fulvestrant (FASLODEX®) ; agentes que funcionan para suprimir o detener los ovarios, por ejemplo los agonistas de la hormona que libera la hormona leutinizante (LHRH) tal como acetato de leuprolide (LUPRON® y ELIGARD®) , acetato de goserelina, acetato de buserelina y tripterelina; anti-andrógenos tal como flutamida, nilutamida y bicalutamida; e inhibidores de aromatasa, que inhiben la enzima aromatasa, la cual regula la producción de estrógeno en las glándulas adrenales, tal como, por ejemplo, 4 (5) -imidazoles, acetato de aminoglutetimida, megestrol (MEGASE®) , exemestano (AROMASIN®) , formestania, fadrozol, vorozol (RIVISOR®) , letrozol (FEMARA®) , y anastrozol (ARIMIDEX®) . Además, tal definición de agentes quimioterapéuticos incluye los bisfosfonatos, tal como el clodronato (por ejemplo BONEFOS® o OSTAC®) , etidronato (DIDROCAL®) , NE-58095, ácido zoledrónico /zoledronato (ZOMETA®) , alendronato (FOSAMAX®) , pamidronato (AREDIA®) , tiludronato (SKELID®) , o risedronato (ACTONEL®) ; al igual que troxacitabina (un análogo de una citosina de nucleósido de 1, 3 -dioxolano) oligonucleótides antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes de trayectorias de señalamiento implicadas en la proliferación de células aberrantes, tal como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, y el receptor del crecimiento epidermal; vacunas tal como TERATOPE® y vacunas de terpia de genes, por ejemplo, la vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® v vacuna VAXID® ; inhibidor de la topoisomerase 1 (por ejemplo, LURTOTECAN®) ; rmRH (por ejemplo ABARELIX®) ; ditiosilato de lapatinib (un inhibidor de molécula pequeña de tirosina-cinasa doble EGFR, también conocido como GW572016) ; ylas sales, ácidos o derivados aceptables farmacéuticamente de cualquiera de los anteriores. El término de "citocina" es un término genérico de proteínas liberadas por una población celular que actúa en otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de estas citocinas son las linfocinas, monocinas, interieucinas (lis), tal como IL-1, IL-la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15, que incluyen la PROLEUKIN® rIL-2 e IL-4 humano y mutantes del IL-4 humano, tal como, por ejemplo, un mutante que contiene una mutación en la región de IL-4, que está implicada en la ligadura a IL-2R-gamma, por ejemplo, Arg 21 se cambia a un residuo de Glu; un factor de necrosis de tumor, tal como TNF-a or TNF-jS; y otros factores de polipéptidos que incluyen LIF y la ligadura del equipo (KL) . Según se usa aquí, el término de citocina incluye las proteínas de fuente natural o de un cultivo celular recombinante y equivalentes activos biológicamente de las citocinas de secuencia nativas, que incluyen las entidades de molécula pequeña, producidas sintéticamente y los derivados y sus sales aceptables farmacéuticamente. El término de "hormona" se refiere a hormonas de polipéptidos que son generalmente secretadas por órganos glandulares con conductos. Se incluyen entre las hormonas, por ejemplo, las hormonas del crecimiento, tal como la hormona del crecimiento humana, la hormona del crecimiento humana de N-metionilo, y la hormona del crecimiento de bivinos; hormona paratiroide, tiroxina, insulina proinsulina, relaxina, estadiol, terapia de reemplazao de hormonas; andrógenos, tal como calusterona, propionato de dromostanlona epitiostanol , mepitiostalon o testolactona; prorelaxina, hormonas de glicopropteínas, tal como la hormona que estimula el folículo (FSH) , hormona que estimula la tiroides (TSH= y hormona luteinizante (LD) ; prolactina, placental, lactógeno, pépytido asociado con la gonadotropia del ratón, hormona que libera la gonadotropia, inhibina, activina, sustancia que inhibe el muleriano y trombopoietina. Según se usa aquí, el término de hormona incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivos de células recombinantes y equivalentes actvos biológicamente de la hormona de secuencia natva, que incluyen las entidades de moléculas pequeñas, producidas sintéticamente, y los derivados y sus sales aceptables farmacéuticamente . El término de "factor de crecimieto" e refiere a proteínas que promueven el crecimiento e incluyen, por ejemplo, el factor del crecimiento hepático, factor del crecimiento de fibroblastos, factor del crecimiento endotelial, factor del crecimiento de nervios, tal como el factor del crecimiento derivado de las plaquetas NGF-ß; factor del crecimiento de transformación (TGFs) tal como TGF-a y TGF-ß, factor-I y factor II del crecimiento de tipo insulina y factrores osteoinductivos de eritropoietina (EPO) , interferonas, tal como la interferona a, ß y ?, y factores que estimulan colonias (CSFs) , tal como CSF de macrofagos (M-CSF) ; CSF de granulositos-macrofagos (GM-CSF) y CSF degranulositos (G-CSF) . Según se usa aquí, el término de factor de crecimiento incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivos de células recombinantes y equivalentes activos biológicamente del factor de crecimiento de secuencia nativa., que incluyen las entidades de moléculas pequeñaas producidas sintéticamente, y los derivados y sus sales aceptables farmacéuticamente.

El término de "integrina" se refiere a una proteína receptora que permite a las células tanto ligarse a para responder a la matriz extracelular y se implica enuna variedad de funciones celulares, tal como sanar heridas, diferenciación celular, regreso de células de tumor y apoptosis. Ellas son parte de una gran familia de receptores de adhesión celular que están implicadas en la matriz extracelular y las interacciones de célula a célula. Las integrinas funcionales consisten de dos subunidades de glicoproteína transmembrana, nombradas alfa y beta, que se enlazan no covalentamente . Las subunidades alfa todas comparten la homología entre sí, como lo hacen las subunidades beta. Los receptores siempre contienen una cadena alfa y una cadena beta. Ejemplos incluyen Alfa6betal, Alfa3betal, Alfa7betal, LFA-1, etc. Según se usa aquí, el término de "integrina" incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivos celulares recombinantes y equivalentes activos biológicamente de la integrina de secuencia nativa, que incluyen las entidades de molécula pequeña producidas sintéticamente y los derivados y sus sales aceptables farmacéuticamente . Para los fines de la presente, el "factor alfa de necrosis de tumor" (TNF-alfa) ) " se refiere a la molécula TNF- alfa que comprende la ecuencia de aminoácidos descrita en Pennica et al., Nature 312-721 (1984) o Aggarwal et al, JBC, 260-2345 (1986) . Un "inhibidor de TNF-a es un agente que inhibe, en alguna extensión, una función biológica del TNF-a, generalmente a través de la liga al TNF-a y neutralizando su actividad. Ejemplos de inhibidores del TNF considerados aquí específicamente son el etanercept (ENBREL®) , infliximab (REMICADE') y adalmumab (HUMIRA™) Ejemplos de "drogas anti -reumáticas que modifican la enfermedad" o "DMARDS" incluyen la hydroxycloroquina, sulfasalazina, metotrexato, leflunomida, etanercept, infliximab, azatioprina, D-penicillamina, sales de oro de a D-penicilamina (oral, sales de oro (intramuscular), minociclina, ciclosporina que incluye la including ciclosporina A y la ciclosporina tópica, s tafylococcal proteína A (Goodyear and Silverman, J". Exp. Med. , 197, (9), pll25-39 (2003)), que incluye las sales y sus derivados, etc. Ejemplos de "drogas anti-inflamatorias no esteroidales" o "NSAIDs" incluyen la aspirina, ácido acetilsalicilico, ibuprofen, naproxen, indometacin, sulindac, tolmetin, inhibidores de COX-2 tal como celecoxib (CELEBREX®; 4- (5- (4 -metilfenil) -3- (trifluorometil) -1H-pyrazol-1-il) benzenesulfonamida y valdecoxib (BEXTRA®) , y meloxicam (MOBIC®) , que incluyen las sales y sus derivados, etc . Ejemplos de "antagonistas o anticuerpos de la integrina" incluyen aquí el anticuerpo de LFA-1, tal como efalizumab (RAPTIVA") disponible comercialmente de Genentech, o un anticuerpo de alfa 4 integrina tal como natalizumab (ANTEGREN ) disponible de Biogen, o derivados de la fenilalanina aiazaacíclica (WO 2003/89410) , derivados de fenilalanina (WO 2003/70709, WO 2002/28830, WO 2002/16329 y WO 2003/53926) , derivados del ácido fenylpropiónico (WO 2003/10135) , derivados de enamina (WO 2001/79173) , derivados del ácido propanóico (WO 2000/37444) , derivados del ácido alcanóico, (WO 2000/32575) , derivados de fenilo sustituidos (Patentes US Nos. 6,677,339 y 6,348,463), derivados de amina aromática (Pat. US No. 6,369,229), polipéptido del dominio de la disintegrina ADAM (US2002/0042368) , anticuerpos a la integrina alfa-beta3 (EP 633945) , derivados de aminoácidos bicíclicos con puente aza (WO 2002/02556) , etc. El "Corticoesteroide" se refiere a cualquiera de las varias sustancias sintéticas o que ocurren naturalmente, con la estructura química general de esteroides, que semejan o aumentan los efectos de los corticoesteroides que ocurren naturalmente. Ejemplos de corticoesteroides sintéticos incluyen la prednisona, prednisolona (que incluye la metilprednisolona, tal como SOLU-MEDROL metilprednisolona sodio-succinatp) , dexametasona or dexametasona triamcinolona, hidrocortisona, y betametasona. Los corticoesteroides preferidos aquí son la prednisona, metylprednisolona, hidrocortisona, o dexametasona. Una "célula B" es un linfocito que madura dentro de la médula ósea e incluye una célula nativa, célula B de memoria o una célula B de efector (células de plasma) . La célula B aquí puede ser una célula normal o no maligna. Un "marcador de la superficie e la célula B" o "antígeno de superficie de la célula B" es un antígeno expreado en la superficie de una c+elula B que puede ser objetivo con un antagonista o anticuerpo que se liga al mismo. Ejemplos de marcadores de la superficie de la célula B incluyen los marcadores de la superficie de leucocitos :CD10 , CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 y CD86 (para las descripciones, véase The Leukocyte Antigen Facts Book, 2nd Edition. 1997, ed. Barclay et al . Academic Press, Harcourt Brace & Co., New York) . Otros marcadores de la superficie de las células B incluyen : RP105, FcRH2 , CR2 de célula B, CCR6 , P2X5, HLA-DOB, CXCR5, FCER2, BR3 , Btig, NAG14, SLGC16270, FcRHl , IRTA2 , ATWD578, FcRH3, IRTA1, FcRH6 , BCMA, y 239287. El marcador de la superficie de la célula B de interés particular es expresado preferiblemente en las células B comparado con otros tejidos no de células B, de un sujeto y puede ser expresado en tanto las células B del precursor como las células B maduras. El "antígeno CD20" o "CD20" es una fosfoproteína no glicosilada de alrededor de 35 kDa, encontrada en la superficie de más del 90% de las células B de la sangre periférica o de órganos linfoides. El CD20 está presente en tanto las células B normales como en las células B malignas, pero no se expresa en las células de estirpe. Otros nombres del CD20 en la literatura incluyen "antígeno restringido de linfocitos B" y Bp35" . El antígeno CD20 se describe en, por ejemplo Clark et al . , Proc . Nati . Acad . Sci . (USA) 82:1766 (1985), for example. Un antagonista marcador de la superficie de la célula B" es una molécula que, en la liga al marcador de la superficie de la célula B, en lass células B, destruye o evacúa laas células B en un sujeto y/o interfiere con una o máss funciones de las células B, por ejemplo, reduciendo o previniendo una respuesta humoral buscada por la célula B. El antagonista es capaz preferiblemente de evacuar las células B (es decir, reducir los niveles de células B circulantes) en un sujeto tratado con ellasa. Tal evacuación puede ser logradaa por medio de varios mecanismos, tal como la citotoxicidad mediada por células, dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o la inhibición de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de la proliferación de las células B y/o la inducción de la muerte de las células B (por ejemplo por la apoptosis) . Antagonistas incluidos dentro del ámbito de la presente invención incluyen los anticuerpos, péptidos de secuencia sintética o nativa, inmunoadhesinas, y antagonistas de molécula pequeña que se ligan al marcador de la superficie de las células B, tal como CD20, conjugados, opcionalmente, con o fundidos a un gente citotóxico. El antagonista preferido comprende un anticuerpo. Un "antagonista de anticuerpo de CD20" aquí es un anticuerpo que, en la liga a CD20 en las células B, destruye o evacúa las células B en un sujeto yo interfiere con una o más funciones de las células B, por ejemplo reduciendo o previniendo una respuesta humoral buscada por la célula B. El antagonista del anticuerpo preferiblemente es capaz de evacuar las células B (es decir, reducir la circulación de los niveles de las células B) en un sujeto tratado con el mismo, al evacuación puede ser lograda por varios mecanismos, tal como la citotoxicidad mediada por células dependientes del anticuerpo (ADCC y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) , la inhibición de la proliferación de las células B y/o la inducción de la muerte de las células B (por ejemplo, por apoptosis) . El término de "anticuerpo" se usa aquí en el sentido más amplio y cubre específicamente los anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos por ejemplo anticuerpos biespecíficos) formados de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos en tanto ellos exhiban la actividad biológica deseada. Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferiblemente su región de liga del antígeno. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Dab, FabX F(ab')2 y fragmentos de Fv, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpos.

Un anticuerpo intacto es aquí uno que comprende dos regiones de liga del antígeno y una región de Fc . Preferiblemente, el anticuerpo intacto tiene una región Fc funcional . Ejemplos de anticuerpos CD20 incluyen los "C2B8" , que son ahora llamados "rituximab" ("RITUXAN®") (Patente US No. 5,736,137); el anticuerpo del murino 2B8 etiquetado con itrio [90] , designado "Y2B8" o "ibritumomab Tiuxetan" (ZEVALIN®) , disponible comercialmente de IDEC Pharmaceuticals, Inc. (Patente US No. 5,736,137; 2B8 depositado con ATCC bajo número de acceso No. HB11388 el 22 de junio de 1993 (; murine IgG2a "Bl" llamado "Tositumomab," optionalmente etiquetado con 1311 para generar el "1311 -Bl" o "iodina 1131 tositumomab" anticuerpo (BEXXAR™) disponible comercialmente de Corixa (véase también la Patente No. 5,595,721); el anticuerpo monoclonal del murino "1F5" (Press et al . Blood 69 (2) : 584-591 (1987) y sus variantes, que incluyen el "armazón parchado" o humanizado 1F5 (WO 2003/002607, Leung, S.; ATCC depósito HB-96450) ; anticuerpo de murino 2H7 y quimérico 2H7 en (Patente US No. 5,677,180); 2H7 humanizado (WO 2004/056312, Lowman et al . , y como se indica abajo) 2F1 (HuMax-CD20) , un anticuerpo completamente humano, de alta afinidad, objetivo en la molécula CD20 en la membrana celular de las células B (Genmab, Dinamarca; véase, por ejemplo, Glennie y van de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003) y Cragg et al . , Blood 101: 1045-1052 (2003); WO 2004/035607; US2004/0167319) ; los anticuerpos monoclonales indicados en WO 2004/035607 y US2004/0167319 (Teeling et al . ) ; los anticuerpos que tienen cadenas de azúcar enlazadas al N-glicósido complejo, unido a la región Fc descrita en US 2004/0093621 (Shitara et al . ) ; anticuerpos monoclonales y fragmentos de unión al antígeno que se unen a CD20 (WO 2005/000901, Tedader et al . ) tal como HB20-3, HB20-4, HB20-25, y MB20-11; moléculas de unión de CD20 tal como la serie AME de anticuerpos, por ejemplo anticuerpos AME 33, como se indican en WO 2004/103404 y US2005/0025764 (Watkins et al . , Eli Lilly/Applied Molecular Evolution, AME) ; moléculas de unión de CD20 tal como aquellas descritas en US 2005/0025764 (Watkins et al . ) ; anticuerpo A20 o sus variantes, tal como el anticuerpo A20 quimérico o humanizado (cA20, hA20, respectivamente (US 2003/0219433, Immunomedics) ; anticuerpos de liga a CD20 que incluyen Leul6, 1H4 o 2B8, evacuados de epítope, conjugados opcionalmente con IL-2, como US 2005/0069545A1 y WO 2005/16969 (Carr et al . ) ; anticuerpo biespecífico que se liga a CD22 y CD20, por ejemplo; hLL2xhA20 (WO2005/14618 , Chang et al . ) ; anticuerpos monoclonales L27, G28-2, 93-1B3, B-Cl o NU-B2 disponibles de International Leukocyte Typing Workshop (Valentina et al . , In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed. , p. 440, Oxford University Press (1987)); 1H4 (Haisma et al . Blood 92:184 (1998) ) . Los anticuerpos CD20 preferidos aquí son quiméricos, humanizados o humanos, más preferiblemente rituximab, humanizado, o anticuerpos 2H7, 2F2 (Hu-Max-CD20) anticuerpo CD20 humano (Genmab) , y anticuerpo A20 humanizado (Immunomedics) . Los términos de "rituximab" o "RIITUXAN®" aquí se refieren al anticuerpo monoclonal del murino/humano quimérico de ingeniería genética, dirigido contra el antígeno CD20 y designado "CDB8" en la Patente US No. 5,736,137, que incluye sus fragmentos, los cuales retienen la habilidad de ligarse a CD20. Solamente para los propósitos presentes y a no ser que se indique de otra manera, un anticuerpo "2H7 humanizado" es una variante del anticuerpo H7 humanizado, en que este anticuerpo es reactivo en reducir la circulación de las células B in vivo. En una modalidad, el anticuerpo 2H7 humanizado comprende, uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las siguientes secuencias de la CDR: Seuencia Ll de CDR RASSSVSYXH donde Y es M ó (SEQ ID NO. 21), por ejemplo SEQ ID NO : 4 (Fig. ÍA) , Secuencia L2 de CDR de SEQ ID NO: 5 (Fig. ÍA) , Secuencia L3 de CDR de QQWXFNPPT en que Y es S ó A (SEQ ID NO. 22), por ejemplo SEQ ID NO:6 (Fig. ÍA) , Secuencia Hl de CDR de SEQ ID NO: 10 (Fig. IB), Secuencia H2 de CDR de AIYPGNGXTSYNQKFKG en que X es D ó A (SEQ ID NO. 23), por ejemplo SEQ ID NO: 11 (Fig. IB), y Seuencia H3 de CDR de WYYSXXYWYFDV en que X en la posición 6 es N, A, Y, W ó D y X como posición 7 es S ó R (SEQ ID NO. 24), por ejemplo SEQ ID NO:12 (Fig. IB). Las secuenciaas de la CDR anteriores están presentes generalmente dentro de las secuencias de armazón ligero y armazón pesado humanos, tal como sustancialmente los residuos del F de consenso humano del subgrupo I (V 61) kappa de cadena ligera humano y sustancialmente los residuos FR de consenso humano del subgrupo III (VLiii) de cadena pesada humano. Véase también WO 2004/056312 (Lowman et al . ) . La región pesada variable puede ser unida a una región constante de cadena de IgG, en que la región puede ser, por ejemplo, IgGl ó IgG3,que incluyen la secuencia nativa y regiones constantes variantes.

En una modalidad preferida, este anticuerpo comprende la secuencia de dominio pesado variable de SEQ ID N0:8 (vl6, como se muestra en la Figura 18), que comprende también, opcionalmente, la secuencia de dominio ligero variable de SEQ ID NO: 2 (vl6, como se muestra en la Fig. ÍA) , la cual comprende, opcionalmente, uno o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones 56, 100 y/o 100a, por ejemplo D56A, N100A o N100Y, y/o SlOOaR en el dominio pesdo variable y una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones 32 y/o 92, por ejemplo M32L y/o S92A en el dominio ligero variable. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo intacto que comprende las secuencias de aminoácidos de cadenas ligeras de SEQ ID NOs. 13 ó 15, y secuencias de aminoácidos de cadenas pesadas de SEQ ID NO. 14, 16, 17 o 20. Un anticuerpo 27 humanizado preferido es ocrelizumab (Genentech) . Este anticuerpo aquí además comprende al menos un sustitución de aminoácido en la región Fc, que mejora la actividad de ADCC, tal como uno en que las sustituciones de aminoáidos están en las posiciones 298, 333, y 334, preferiblemente S298A, E333A, y K334A, usando la numeración Eu de residuos de cadenas pesadas. Véaase también la Patente US No. 6,737,056B1, de Presta.

Todos estos anticuerpos pueden comprender al menos una sustitución en la región Fc, que mejora la liga FcRn o la vida media del suero, por ejemplo una sustitución den la posición 434 de la cadena pesada, tal como N434W. Vése también la Patente US No. 6,737,056B1, de Presta. Cualquiera de estos anticuerpos puede además comprender cuando menos una sustitución de aminoácido en la región de Fc, que aumenta la actividad de CDC, por ejemplo, que comprende al menos una sustitución n la posición 326, preferiblemente K326A o K326W. Véase también la Patente US No. 6,528,624B1 (Idusogie et al . ) . Algunas variantes de 2H7 humanizadas preferidas son aquellas que comprenden el dominio ligero variable de SEQ ID NO: 2 y el dominio pesado variable de SEQ ID NO: 8, que incluye aquellos con o sin sustituciones en la región Fc (si está presente) y aquellos que comprenden un dominio pesado variable con alteración N100A; o D56A y N100A; o D56A, N100Y, y SlOOaR; en SEQ ID NO: 8 y un dominio ligero variable con alteración M32L; o S92A; o M32L y S92A; en SEQ ID NO: 2. M34 en la cadena pesada variable de 2H7.vl6 se ha identificado como una fuente potencial y es otro candidato potencial para la sustitución.

En un resumen de algunas de las varias modalidades preferidas de la invención, la región variable de las variantes basada en 2H7.vl6 comprende las secuencias de aminoácidos de vl6, en las posiciones de sustituciones de aminoácidos que se indican en la siguiente Tabla 1. no ser que se indique de otra manera, las variantes 2H7 tendrán la misma cadena ligera como aquella de vl6.

Tabla 1 Variantes de Anticuerpos 2H7 Humanizados, Ejemplares Un anticuerpo 2H7 humanizado preferido comprende la secuencia de dominio ligero variable 2H7.V16: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 2); y la secuencia de dominio pesado variable 2H7.V16 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYN QKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAWYCARVWYSNSYWYFDWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 8) . Donde el anticuerpo 2H7.V16 humanizado es un anticuerpo intacto, puede comprender la secuencia de aminoácidos ligera: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 13); y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO. 14 o EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYN QKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 17). Otro anticuerpo 2H7 humanizado preferido comprende la secuencia de dominio ligero variable 2H7.v511: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 18) y la secuencia de dominio pesado variable 2H7.v511: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYN QKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO. 19) .

Donde el anticuerpo 2H7.v511 humanizado es un anticuerpo intacto, puede comprender la secuencia de aminoácidos de cadena ligera: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 15) y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO. 16 O: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYN QKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATY RWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO. 20) . Los anticuerpos "inhibidores del crecimiento" son aquellos que previenen o reducen la proliferación de una célula que expresa un antígeno al cual se liga el anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo puede prevenir o reducir la proliferación de las células B in Vitro y Jo in vivo .

Los anticuerpos que "inducen la apoptosis" son aquellos que inducen la muerte celular programada, por ejemplo de una célula B, según se determina por ensayos estándar de apoptosis, tal como la liga de la anexina V, fragmentación del ADN, y encogimiento celular, dilatación del retículo endoplásmico, fragmentación celular y/o formación de vesículas de membrana (llamadas cuerpos de apoptosis) . Los "anticuerpos nativos" son usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de alrededor de 150,000 Daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se enlaza a una cadena pesada por un enlace de disulfuro covalente, mientras el número de enlaces de disulfuro varíen entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes de disulfuro ente cadenas, espaciados regularmente.

Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V) , seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada; y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Los residuos de aminoácido particulares se cree forman una interfaz entre los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada. El término de "variable" se refiere al hecho que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos y se usan en la liga y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente a través de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamadas regiones hipervariables, tanto en los dominios variables de la cadena ligera como en la cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan regiones de armazón (FRs) . Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro FRs, que adoptan grandemente una configuración de hoja ß, conectada por tres regiones hipervariables, que forman lazos que se conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de la hoja ß. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en proximidad estrecha por los FRs y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión del antígeno de anticuerpos (véase Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la liga de un anticuerpo a un antígeno, sino exhiben varias funciones de efectores, tal como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . La digestión de la papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de liga de antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab" , cada uno con un sitio de liga al antígeno sencillo, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su habilidad en cristalizar fácilmente. El tratamiento de pepsina suministra un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de unión del antígeno y es aún capaz de entrelazar el antígeno. "Fv" en el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un reconocimiento de antígeno completo y el sitio de unión del antígeno. Esta región consiste de un dímero de una cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, en una asociación no covalente firme. Es en esta configuración donde las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúa para definir un sitio de liga del antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de liga del antígeno al anticuerpo. Sin embargo, aún un dominio variable sencillo (o la mitad de un Fv comprende solamente tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la habilidad de reconocer y ligar el antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de liga completo. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos cuantos residuos en el término carboxi del dominio CH1 de cadena pesada, una o más cisteínas de la región de bisagra del anticuerpo. Fab' -SH es la designación para Fab' , en que los residuos de cisteína de los dominios constantes llevan al menos un grupo de tiol libre. Los fragmentos del anticuerpo F(ab')2 originalmente se producen como parejas de fragmentos de Fab' que tienen cisteínas de bisagra entre ellos. Otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos son también conocidos. Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos (inmunoglobulinas ( de cualquier especie de vertebrado, pueden ser asignadas a uno de dos tipos distintos claramente, llamados kappa (K) y lambda (?) basados en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus "cadenas pesadas" (si están presentes) , los anticuerpos pueden ser asignados a diferentes clases. Existen cinco clases mayores de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas pueden además dividirse en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de cadenas pesadas que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se llaman, a, d, ? y µ, respectivamente. Las estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. A no ser que se indique de otra manera, aquí la numeración de los residuos en una cadena pesada de la inmunglobulina es aquella del índice EU como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) , incorporadas expresamente aquí como referencia. El "índice EU como en Kabat" se refiere a la numeración de residuos del antiuerpo EU de la IgGl humana. El término de "región Fc" se usa aquí para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, que incluye las regiones de secuencia nativa Fc y regiones de Fc variantes. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de la inmunoglobulina varíe, la región de Fc de cadena pesada de la IgG humana se define usualmente para extender desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226 o de Pro230 a su terminal de carboxilo. La lisina de la terminal C (residuo 447, de acuerdo con el sistema de numeración EU) de la región Fc puede ser removida, por ejemplo, durante la producción o purificación del anticuerpo o por la ingeniería recombinante del ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo. Por lo tanto, una composición de anticuerpos intactos puede comprende poblaciones de anticuerpos con todos los residuos K447 removidos, poblaciones de anticuerpos sin residuos K447 removidos, y poblaciones de anticuerpos que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo K447. Una "región Fc funcional" posee una "función de efector" de una secuencia nativa de la región Fc . "funciones de efector" ejemplares incluyen la liga Clq: citotoxicidad dependiente del complemento, citotoxicidad mediada por células dependientes el anticuerpo (AADCC) ; fagocitosis, regulación descendente de los receptores de superficie celular (por ejemplo, el receptor de la célula B; BCR), etc. Tales funciones de efector generalmente requieren que la región Fc sea combinada con un dominio de liga (por ejemplo un dominio variable de anticuerpo) y puede ser evaluado usando varios ensayos como se describen aquí, por ejemplo. Una "región Fc de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc encontrada en la naturaleza.. Las regiones de Fc humanas de secuencia nativa incluyen una región Fc de la IgGl humana de secuencia nativa (alotipos no de A y de A) , la región Fc de la gG2 humana d de la secuencia nativa; la región Fc de la IgH3 humana de la secuencia nativa; y la región Fc de la IgG de la secuencia nativa, al igual que las variantes que ocurren naturalmente de cualquiera de las anteriores . Una "región Fc variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de aquella de la región Fc de secuencia nativa en virtud de al menos una modificación de aminoácido, preferiblemente una o más sustituciones de aminoácidos. Preferiblemente, la región Fc variante tiene al menos una sustitución de aminoácido comparada a una región Fc de secuencia nativa o la región Fc de un polipéptido a fin, por ejemplo de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos, y preferiblemente de alrededor de uno a alrededor de cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fc de secuencia nativa o en la región Fc del polipéptido afín. La región Fc variante aquí tendrá preferiblemente al menos un 80% de homología con una región Fc de secuencia nativa y/o con una región Fc de un polipéptido afín, y más preferiblemente al menos alrededor del 90% de homología con el mismo, más preferiblemente al menos alrededor del 95% de homología con éste. La "citotoxicidad mediada por células dependiente del anticuerpo" y "ADCC" se refiere a una reacción mediada por célula en la cual las células citotóxicas no específicas que expresan los receptores de Fc (FcRs) (por ejemplo células destructivas Naturales (NK) , neutrófilos y macrófagos) reconocen la unión al anticuerpo en una célula objetivo y en seguida causan la lisis de esta célula objetivo. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan FcyRIII solamente, en tanto los monocitos expresan FcyRI , FcyRII y FcyRIII. La expresión FcR en las células hematopoiéticas ese resumen en la Tabla 3, en la página 464 de Ravetch y Kinet , Annu. Rev. Immunol . 9:457-492 (1991). Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, como el ensayo de aDCC in vitro, tal como se describe en la Patente US No. 5,500,362 o 5,821,337 puede ser realizado. Las células de efector para tales ensayos incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PBMC( y las células destructivas naturales (NK) . Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede ser evaluada in vivo, por ejemplo en un modelo de animal, tal como se describe en Clynes et al . PNAS (USA) 95:652-656 (1998) . Las "Células de Efector Humanas" son los leucocitos que expresan uno o más FcRs y realizan funciones de efector. Preferiblemente, las células expresan al menos FcyRIII y llevan a cabo la función de efector. Ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) , las células destructoras naturales (NK) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos; con las células PBMCs y NK siendo preferidas. Los términos de "receptor Fc" o "FcR" se usan para describir un receptor que se liga a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Asimismo, un FcR preferido es uno que se une a un anticuerpo de la IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRiii, que comprenden las variantes alélicas y formas empalmadas alternativamente de estos receptores. Los receptores de FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor de activación" y FcyRIIB (un "receptor de inhibición") que tienen secuencias de aminoácidos similares, que difieren primariamente en sus dominios de citoplasma. El receptor de activación FcyRIIA contiene una clase de activación basada en la tirosina del inmunorreceptor (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor e inhibición FcyRIIB contiene una clase de inhibición basada en la tirosina del inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplásmico. (Véase Daéron, Annu. Rev. Immunol . 15:203-234 (1997)). Los FcRs se revisan en Ravetch y Kinet, Annu . Rev. Immunol 9:457-492 (1991); Capel et al . , Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al . , J. Lab . Clin . Med . 126:330-341 (1995). Otros FcRs, incluyen aquellos que se van a identificar en el futuro, son abarcados por el término "FcR" aquí . El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, el cual es responsable de la transferencia de las IgGs maternas al feto y la homostasis de la inmunoglobulina (Guyer et al., J. Immunol 117:587 (1976) y Kim et al . , J. Immunol . 24:249 (1994)). La "Citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la habilidad de una molécula a la lisis de un objetivo en la presencia del complemento. La trayectoria de la activación del complemento es iniciada por la liga del primer componente del sistema de complemento (Clq) a una molécula (por ejemplo un anticuerpo) que forma complejo con un antígeno nativo. Para evaluar la activación del complemento, un ensayo CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al . , J. Immunol . Methods 202:163 (1996), puede ser realizado. Fragmentos de anticuerpo de "Fv de cadena sencilla" o "scFv" comprenden los dominios VH y V del anticuerpo, en que esos dominios están presentes en una cadena de polipéptido sencilla. Preferiblemente, el polipéptido Fv además comprende un enlazador de polipéptido entre los dominios VH y VL, que habilitan la scFv para formar la estructura deseada para la liga al antígeno. Para una revisión de la scFv véase Plückthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) . El término de "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de unión del antígeno, estos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH-VL) . Usando un enlazador que es demasiado corto para permitir la formación de pareja entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a formar pareja con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión de antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al . , Proc . Nati . Acad. Sci . USA, 90:6444-6448 (1993). El término de "anticuerpo monoclonal" , según se usa aquí, se refiere a un anticuerpo de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que ocmprenden la población son idénticos y/o se ligan al mismo epítope, excepto por posibles variantes que pueden surgir durante la producción del anticuerpo monoclonal, tales variantes generalmente están presentes en cantidades menores. Este anticuerpo monoclonal incluye típicamente un anticuerpo que comprende una secuencia de polipéptidos que se liga a un objetivo, en que la secuencia de polipéptidos que se liga al objetivo se obtiene por un proceso que incluye la selección de una sola secuencia de polipéptidos que se liga al objetivo, de una pluralidad de secuencias de polipéptidos. Por ejemplo, el proceso de selección puede ser la selección de una clona única de una pluralidad de clonas, tal como un conjunto de clonas de hibridoma, clonas de fagos o clonas del ADN recombinante. Se debe entender que la secuencia de liga objetivo seleccionada puede ser además alterada, por ejemplo, para mejorar la afinidad para el objetivo, para humanizar la secuencia de liga el objetivo, para mejorar su producción en el cultivo celular, para reducir su inmunogenicidad in vivo para crear un anticuerpo multiespecífico, etc. y que un anticuerpo que comprende la secuencia de unión objetivo alterada es también un anticuerpo monoclonal de esta invención. En contraste a las preparaciones del anticuerpo policlonal, el cual incluye típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes /epítopes) , cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal dirigida contra un solo determinante en un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpos monoclonales son ventajosas debido a que ellas están típicamente sin contaminar por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como siendo obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no se debe interpretar como requiriendo producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar, de acuerdo con la presente invención, pueden ser obtenidos por una variedad de técnicas, que incluyen, por ejemplo, el método de hibridoma (por ejemplo Kohler et al . , Nature, 256:495 (1975); Harlow et al . , Antibodies : A Laboratory Manual , (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al . , in : Monoclonal Antibodies y T- Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos del ADN recombinantes (véase, por ejemplo, la patente US No. 4,816,567), teologías de exhibición de fagos (véase, por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338 (2) :299-310 (2004); Lee et al., J.Mol. Biol.340 (5) : 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101 (34) : 12467-12472 (2004); y Lee et al. J. Immunol. Methods 284 (1-2) : 119-132 (2004), y tecnologías para producir anticuerpos humanos o de tipo humano en animales que tienen partes o todo el sitio de la inmunoglobulina o genes que codifican las secuencias de la inmunoglobulina (vése, ,por ejemplo, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); Patentes U.S. Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,591,669 (todas de GenPharm) ; 5,545,807; WO 1997/17852; Patentes U.S. Nos. 5,545,807 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; y 5,661,016 Marks et al., Bio J echnology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); ?euberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol . , 13: 65-93 (1995). Los anticuerpos monoclonales incluyen aquí específicamente los anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase de anticuerpo particular o subclase, mientras el resto de las cadenas es idéntico con u homólogo a las secuencias correspondientes n los anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase de anticuerpos o subclase, al igual que fragmentos de estos anticuerpos, en tanto ellos exhiban la actividad biológica deseada (Patente US 4,816,567; Morrison et al . , Proc . Nati . Acad . Sci . USA, 81:6851-6855 (1984) ) . Anticuerpos quiméricos de interés incluyen aquí los anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de liga al antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo el Mono del Viejo Mundo, tal como el baboon, rhesus o cinomólugus) y las secuencias de región constante humanas (Patente US No. 5,693,780). Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo del murino) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte de los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en que los residuos de una región hipervariable del receptor son reemplazados por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) , tal como el ratón, rata, conejo o primate no humano, que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de armazón (FR) de la inmunoglobulina humana son reemplazados por los residuos no humanos correspondientes. Asimismo, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donado. Estas modificaciones se hacen para refinar más el desempeño del anticuerpo. En general,, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos, de al menos uno y típicamente dos, los dominios variables, en que todos o sustancialmente todos los lasos hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los FRs son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana, excepto para las sustituciones de FR, como se notó anteriormente. El anticuerpo humanizado, opcionalmente, también comprenderá al menos una porción de una región constante de la inmunoglobulina, típicamente aquella de la inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al . , Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al . , Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op . Struct . Biol . 2:593-596 (1992) . El término de "región hipervariable" , cuando se usa aquí, se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables para la liga al antígeno. Esta región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una "región de determinación complementaria" o "CDR" (por ejemplo los residuos 24-34 (Ll, 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada: Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos de un "laso hipervariable" (por ejemplo los residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada. Chothia y Lesk J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987) ) . Residuos de "Armazón" o "FR" son aquellos residuos de dominios variables además de los residuos de la región hipervariable como se definen aquí.

Un "anticuerpo no protegido", para los fines de la presente, es un anticuerpo que no es conjugado a la parte citotóxica o radio-etiqueta. Un anticuerpo "aislado" es aquel que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural . Los componentes de contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirán con los usos en diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En modalidades preferidas, el anticuerpo será purificado (1) hasta más del 95% en peso del anticuerpo, como se determina por el método de Lowry y más preferiblemente, más del 99% en peso (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la N-terminal o la secuencia de aminoácidos interna, por el uso de un secuenciado de copa rotatoria, o (3) a homogeneidad por el ensayo SDS-PAGE bajo condiciones de reducción o no reducción, usando el azul de Coomassie o preferiblemente, el tinte de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in si tu dentro de las células recombinantes, puesto que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, ordinariamente, el anticuerpo aislado será preparado por al menos una etapa de purificación.

Un anticuerpo madurado de afinidad es aquel con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables del mismo, que resulta en una mejora en la afinidad del anticuerpo para el antígeno, comparado con un anticuerpo afín que no posee estas alteraciones. Anticuerpos madurados de afinidad preferidos tendrán afinidades nanomolares o aún picomolares para el antígeno objetivo. Los anticuerpos madurados de afinidad se producen por procedimientos conocidos en el arte.. Marks et al . Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración de afinidad por el entremezclar los dominios VH y VL. La mutagénesis aleatoria de la CDR y/o los residuos del armazón se describen por Barbas et al . Proc Nat . Acad. Sci , USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al . Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al . J. Immunol . 155:1994-2004 (1995); Jackson et al . , J. Immunol . 154 (7) :3310-9 (1995); y Hawkins et al , J. Mol . Biol . 226:889-896 (1992) . La "exposición del anticuerpo" se refiere al contacto con o exposición al anticuerpo presente en una o más dosis administradas en un período de tiempo de alrededor de 1-20 días. Las dosis pueden ser dadas en un momento o en intervalos de tiempo fijos o irregulares en este período de exposición. Las exposiciones de anticuerpo iniciales y últimas (por ejemplo segunda o tercera) se separaron en tiempo entre sí, como se describe en detalle aquí. Un inserto de paquete" se usa para referir a las instrucciones incluidas acostumbradamente en los paquetes comerciales de productos terapéuticos que contienen información acerca de las indicaciones, uso, administración de dosis, contraindicaciones, otros productos terapéuticos que se van a combinar con el producto empacado y/o advertencias respecto al uso de estos productos terapéuticos, etc.

II. Tratamiento de Sa AD o la Demencia La presente invención proporciona un método para tratar la AD o la demencia en un sujeto que sufra de las mismas, este método comprende administrar una cantidad efectiva de un antagonista (preferiblemente un anticuerpo) que se liga a una superficie de la célula B (preferiblemente un anticuerpo CD20) al sujeto. La AD o demencia que se va a tratar aquí incluye lasa formas benigna, moderada, severa, benigna-moderada, moderada-severa, esporádica, familiar, inicio temprano e inicio tardío de esta AD o demencia. De acuerdo con un protocolo ejemplar de dosificación, el método comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo CD20 sin proteger al sujeto con AD o demencia para proporcionar una exposición de anticuerpo inicial de aproximadamente 0.5 a 4 gramos (preferiblemente de alrededor de 1.5 a 2.5 gramos), seguido por una segunda exposición del anticuerpo de alrededor de 0.5 a 4 gramos (preferiblemente de alrededor de 1.5 a 2.5 gramos) la segunda exposición del anticuerpo no siendo provista hasta alrededor de 16 a 60 semanas de la exposición inicial del anticuerpo. Para los fines de la invención, la segunda exposición del anticuerpo es la siguiente vez que el sujeto se trata con el anticuerpo CD20, después de la exposición del anticuerpo inicial, no existe intervención del tratamiento o exposición del anticuerpo CD20 entre las exposiciones inicial y segunda. El intervalo entre las exposiciones de anticuerpo inicial y segunda o subsiguiente puede ser medido de cualquiera de la primera o segunda dosis de la exposición inicial del anticuerpo, pero preferiblemente desde la primera dosis de la exposición inicial del anticuerpo. En las modalidades preferidas presentes, las exposiciones del anticuerpo son aproximadamente de 24 semanas o de 6 meses de separación o aproximadamente de 48 semanas o 12 meses de separación.

En una modalidad, la segunda exposición al anticuerpo no es provista hasta alrededor de 20 a 30 semanas desde la exposición inicial, de alrededor de 0.5 a 4 gramos (preferiblemente alrededor de 1.6 a 2.5 gramos) desde la exposición inicial y luego preferiblemente ninguna exposición más del anticuerpo es provista hasta al menos aproximadamente 70-75 semanas desde la exposición inicial. En una modalidad alternativa, la segunda exposición del anticuerpo no es provista hasta aproximadamente 46 a 60 semanas desde la exposición inicial y las exposiciones de anticuerpos subsiguientes, si las hay, son pro vistas hasta alrededor de 46 a 60 semanas desde la exposición del anticuerpo previa. Cualquiera de una o más exposiciones del anticuerpo aquí, pueden ser provistas al sujeto como una dosis sencilla de este anticuerpo, o como dos dosis separadas del anticuerpo (es decir, que constituyen una primera y una segunda dosis) . El número particular de dosis (una o dos) empleadas para cada exposición del anticuerpo es dependiente, por ejemplo, del tipo de AD tratada, el tipo de anticuerpo empleado, si y que tipo de segundo medicamento es empleado y el método y frecuencia de administración. Donde se administran dos dosis separadas, la segunda dosis se administra preferiblemente en aproximadamente 3 a 17 días, más preferiblemente de aproximadamente 6 a 16 días, y aún más preferiblemente en 13 a 16 días desde el momento en que la primera dosis se administró, cuando se administran dos dosis separadas, la primera y segunda dosis del anticuerpo es preferiblemente de alrededor de 0.5 a 1.5 gramos, más preferiblemente de alrededor de 0.75 a 1.3 gramos. En una modalidad, el sujeto es provisto con al menos unas tres o al menos cuatro exposiciones del anticuerpo, por ejemplo, de alrededor de 3 a 60 exposiciones y más particularmente de alrededor de 3 a 40 exposiciones, aún más particularmente de alrededor de 3 a 20 exposiciones. Preferiblemente, estas exposiciones se administran en intervalos de aproximadamente 24 semanas cada cual o de seis meses, o de 48 semanas o 12 meses. En una modalidad, cada exposición de anticuerpo es provista como una sola dosis del anticuerpo. En una modalidad alternativa, cada exposición del anticuerpo es provista como dos dosis separadas de este anticuerpo. Sin embargo, no necesita ser provista cada exposición del anticuerpo como una sola dosis o como dos dosis separadas. En una modalidad preferida, el método comprende administrar una o más dosis en el intervalo de aproximadamente 200 mg a 2000 mg, preferiblemente de alrededor de 500 mg a 1500 mg y más preferiblemente de alrededor de 750 a 1200 mg. Por ejemplo, una a cuatro dosis o solamente una o dos dosis pueden ser administradas. De acuerdo con esta modalidad, el anticuerpo puede ser administrado dentro de un período de alrededor de un mes, preferiblemente dentro de un período de alrededor de 2 a 3 semanas y más preferiblemente dentro de un período de alrededor de dos semanas. Cuando más de una dosis se administra, la última dosis (por ejemplo, la segunda o tercera dosis) es administrada preferiblemente de alrededor de 1 a 20 días, más preferiblemente de alrededor de 6 a 16 días y aún más preferiblemente de alrededor de 14 a 16 días, desde el momento de administrar la dosis previa, Las dosis separadas son administradas preferiblemente dentro de un período total entre alrededor de 1 día y 4 semanas, más preferiblemente entre alrededor de 1 y 20 días (por ejemplo, dentro de un período de 6 a 18 días) . Cada dosis separada del anticuerpo es preferiblemente de alrededor de 200 mg hasta 2000 mg, preferiblemente de alrededor de 500 mg a 1500 mg y más preferiblemente de alrededor de 70 a 1200 mg .

El sujeto puede volverse a tratar con el antagonista o anticuerpo, como siendo dado en más de una exposición o un conjunto de dosis, tal como al menos alrededor de dos exposiciones del antagonista o anticuerpo, por ejemplo, de alrededor de 2 a 60 exposiciones y, más particularmente, alrededor de 2 a 40 exposiciones, aún más particularmente, alrededor de 2 a 20 exposiciones. Tales exposiciones adicionales pueden ser administradas intermitentemente, por ejemplo para los intervalos de tiempo antes mencionados. El antagonista preferido es un anticuerpo. En los métodos señalados aquí, el anticuerpo CD20 es un anticuerpo sin protección. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo intacto, sin protección. El anticuerpo CD20 preferido aquí es un anticuerpo CD20 humanizado o humano, quimérico, más preferiblemente un anticuerpo 2OCD humano, humanizado 2H7 2F2 (HuMax-CD20) , rituximb enmab) anticuerpo humanizado A20 (Immunomedics) . Aún más preferido, es el rituximab o 2H7 humanizado. En una modalidad, el sujeto nunca se ha tratado con drogas, tal como agentes inmunosupresivos, para tratar la D o demencia y/o nunca se ha tratado previamente con un anticuerpo a un marcador superficial de la célula B (por ejemplo nunca se ha tratado previamente con un anticuerpo CD20) . Preferiblemente, el sujeto no tiene una célula B maligna. EN una modalidad, el sujeto no sufre de una enfermedad autoinmune, además de la AD o la demencia. El anticuerpo se administra por cualquier medio adecuado, que incluye la administración parenteral, tópica, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar, intranasal o intralesional . Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal y subcutánea. La administración intratecal es también considerada (véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente US. 2002/0009444, Grillo-Lopez, A, relacionada con la entrega intratecal de un anticuerpo CD20) como es la infusión intersticial y las inyecciones esterotácticas bilaterales. Preferiblemente, la dosificación se da intravenosamente, subcutáneamente o intratecalmente, más preferidas es por infusión intravenosa. En una modalidad, el anticuerpo CD20 es la única droga administrada al sujeto para tratar la AD o la demencia. Sin embargo, generalmente el anticuerpo CD20 será combinado con uno o más segundos medicamentos. Por ejemplo, uno puede administrar, opcionalmente, un segundo medicamento, tal como: un inhibidor de la colinesterasa, que incluye, pero no se limita a: galantamina (REMINYL®), rivastigmina (EXELON®) que incluye el parche trasdermal de donepezil (ARICEPT®) , tacrina (COGNEX®), y HUPRINE X™; antagonistas de D-aspartato de N-metilo (NMDA) (por ejemplo, memantina (NAMENDA®) o neramexano) ; virus de adeno-associados que entregan el NGF (por ejemplo CERE-110) ; beta-bloqueadores; antipsicóticos, precursor de la acetilcolina, agonista nicotínico o muscarínico (por ejemplo el parche de XANOMELINE™) ; anticuerpo snti-beta-amiloide; anticuerpo anti-NGF, tal como RA624,; vacunas, por ejemplo la vacuna amiloide humana; agente que bloquea la actividad de enzimas, secretasas beta o gamma, implicadas en la formación del amiloide; terapia anti -amiloide; serotonina; norepinefrina; somatostatina; agente que interfiere con la conversión del APP a beta-amiloide o la formación de placas seniles y etiquetas neurofibrilarias; enzima de desdoblamiento de la proetína precursoraa del amiloide sitio beta; antagonista beta-secretasa (BACE) ; antagonista BASE1, antagonist BASE2 , antagonista de gamma-secretase, presenilin-1 (PSEN-1) antagonista; presenilin-2 (PSEN-2) antagonista; APO-E4 antagonista; antidepresivo; anticonvulsivo; inhibidor de la retoma de serotonina; sertralina (ZOLOFT™) ; trazodona (DESYREL™) ; divalproex (DEPAKOTE™) ; gabapentina (NEURONIN™) ; risperidona (RISPERDAL®) ; olanzapina (ZYPREXA™) ; quetiapina (SEROQUEL™) ; tioridazina (MELLARIL™) ; droga que disminuye el colesterol o estatina (por ejemplo. HMG-CoA reductasa o simvastatina) ; agente inmunomodulador; antioxidantes, tal como la vitamina E (alfa-tocoferol) , aceite de pescado o ácido alfa-lipóico; nicotina, extracto de ginkgo selegilina; ergoloide- mesilatos; estrógeno; agente anti-inflamatorios que incluyen las drogas anti-inflamatorias no esteroidales, inhibidor de cox-2, rofecoxib (VIOXX®) , naproxen (ALEVE®), celecoxib (CELEBRIX®) , o naproxen; ginkgo biloba; PPl -1019; huperzine A; vitamina folato (ácido fólico), B6, B12, vitamina C, vitamina E; selenio (PREADVISE™) ; GABA(B) receptor antagonista, yal como SGS742; NC-758 (ALZHEMED™) ; C-1073 (MIFEPRISTONE™) ; FK962 ; curcumin; ONO-2506PO; rasagilina-mesilato; valproato; SR57746A (XALIPRODEN™) ; NS 2330; MPC-7869; una an interferona, tal como interferona-alfa, cadena ligera beta amiloide proteolytica fragmento de anticuerpo; agente cytotóxico (véase definitión anterior) ; agente quimiotherapéutico (antes definido) agente inmunosupresivo (antes definido) , inhibidor de TNF-alfa; DMARD; antagonista de la integrina o anticuerpo; corticosteroide; purina derivado de hipoxantina (por ejemplo e . g. AIT-082) etc.

Preferiblemente, el segundo medicamento es un inhibidor de la colinoesterasaa (tal como galantamina (REMINYL®) , rivastigmina (EXELON®) que incluye el parche dermal de la rivastigmina y donepezil (ARICEPT®) ) , especialmente cuando la AD o demencia es benigna-moderada; o un D-aspartato de N-metilo (NMDA) antagonista (por ejemplo, memantina (NAMENDA®) , especialmente cuando la AD o demencia es moderada-severa . Aparte de la aadministración de anti-cueroos al sujeto la presente solicitud considera la administración de anticuerpos por la terapia de genes. Tal administración de ácido nucleico que codifican el anticuerpo se aompaña por la administrción de expresión de una "cantidad efectiva" de un anticuerpo, véase, por ejemplo WO96/07321 publicada el 13 de marzo de 1996 relacionada al uso de la terapia de genes para generar anticuerpos intracelulares. Existen dos acercamientos mayores para otorgar el ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) dentro de las células del sujeto in vivo y ex vivo . Para la entrega in vivo, el ácido nucleico se inyecta directamente dentro de un sujeto, usualmente en el sitio dondese requiere este anticuerpo. Para el tratamiento ex wo las células del sujeto se emueven, se introduce el ácido nucleico dentro de estas células aisladas y las células modificada se administran al sujeto, oo directamente o, por ejemplo, encapsuladas dentro de membranas porosaas que se implantan dentro del sujeto (véase por ejemplo, las Patentes U.S. Nos. 4,892,538 y 5,283,187). Hay una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en las células viables. Las técnicas pueden variar dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere dentro de las células cultivads in vi tro o in vivo dentro de las células del huésped intentado. Técnicas adecuadas para la transferencia del ácido nucleico en las células de mamíferor in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión de células, DEAE-dextrano, método de precipitación de fosfato de caalcio, etc. Un vector usado comúnmente para la entrega ex vivo del gene es un retrovirus. Las técnicas de transferencia del ácido nucleico in vivo actualmente preferidas incluyen la transfección (introducción) con vectores virales (tal como adenovirus. El virus de Herpes simplex I o virus adeno-asociadado) y los sistemas a baae de lípidos (lípidos úties para la transferencia mediada por lípidos del gene son DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo). En algunas situaciones, es conveniente proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que va a las células objetivo, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie celular o la célula objetivo, una ligadura para un receptor en la célula objetivo, etc. Cuando se emplen liposomas, proteínasa que se unen a la proteína de la membrana de superficie celular asociadas con endocitosis, pueden ser usadas para el objetivo y/o facilita laadmisión, por ejemplo, proteínas o sus fragmentos de cápsidapara un tipo de célula particular, anticuerpos para proteínas que se sometan a internalización en el ciclo y proteínas que se dirijan a la localización intracelular objetivo y aumenten la vida media intracelular. La técnica de la endocitosis mediada por el receptor se describe, por ejemplo, por Wu et al . , J. Biol . Chem . 262:4429-4432 (1987); y Wagner et al . , Proc . Nati . Acad . Sci . USA 87:3410-3414 (1990). Para una revisión del mareaje de genes, conocido actualmente, y los protocolos de la terapia de genes, véase Anderson et al . , Science 256:808-813 (1992). Véase también WO 93/25673 y las referencias ahí citadas.

PRODUCCIÓN OF ANTICUERPOS Los métodos y artículos de fabricación de la presente invención usan preferiblemente o incorporan un anticuerpo que liga a un marcador de la superficie de la célula B, especialmente uno que se liga al CD20. Por lo tanto, métodos para generar estos anticuerpos serán descritos aquí . El marcador de la superficie de la célula B que se va a usar para la producción de o clasificación para anticuerpos, puede ser, por ejemplo, una forma soluble del marcador o una porción del mismo, que contenga la expresión del marcador en su superficie celular y pueda ser usado para generar o clasificar los anticuerpos. Otras formas del marcador de la superficie de la célula B, útil para generar anticuerpos, serán evidentes a los expertos en la materia. Una descripción sigue como las técnicas ejemplares para la producción de los anticuerpos usados, de acuerdo con la presente invención. (i) Anticuerpos policlonales Los anticuerpos policlonales son llevados preferiblemente en animales por múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un auxiliar. Pueden ser útiles para conjugar el antígeno relevante a una proteína que es inmunogénica en las especies que se van a inmunizar, por ejemplo la hemocianina de lapa de tipo bocallave, albúmina de suero, tiroglobulina del bovino, o inhibidor de la tripsina de soya, que usan un agente bifuncional o de derivación, por ejemplo, el éster de sulfosucinimida de maleimidobenzoilo (conjugación a través de residuos de cisteína) , N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina) , glutaraaldehído, anhídrido succínico, S0C12, o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos de alquilo diferentes . Los animales son inmunizados contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados, por combinar por ejemplo 100 µg o 5 µg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes del auxiliar completo de Freund e inyectar la solución intradermalmente en múltiples sitios. Un mes más tarde, los animales son impulsados con 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido o conjugado en el auxiliar completo de Freund por la inyección subcutánea en sitios múltiples. Siete a 14 días después, lo animales se sangraron y el suero se ensayó para el título del anticuerpo. Los animales se impulsaron hasta la uniformidad del título. Preferiblemente, el animal se impulsó con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una proteína diferente y/o a través de un reactivo de entrelazamiento diferente. Los conjugados pueden también ser obtenidos en cultivos de células recombinantes como fusiones de proteína. Igualmente, agentes de agregado, tal como el alumbre, son usados adecuadamente para aumentar la respuesta inmune. (ii) Anticuerpos monoclonales Se obtuvieron los anticuerpos monoclonales de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítope, excepto para variantes posibles que surgen durante la producción del anticuerpo monoclonal, tales variantes generalmente están presentes en cantidades menores. Así, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como no siendo una mezcla de anticuerpos discretos o policlonales. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden ser obtenidos usando el método de hibridoma, primero descrito por Kohler et al . , Nature, 256:495 (1975), o pueden ser obtenidos por los métodos de ADN recombinante (patente US No. 4,816,567) . En el método de hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, se inmuniza como se describió aquí antes, para averiguar los linfocitos que produce o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vivo. Estos linfocitos se funden con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como el polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies y Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Las células de hibridoma, . así preparadas, se siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado, que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma parentales no fundidas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima de transferasa de fosforilo de guanina hipoxantina (HGPRT o HPRT) el medio de cultivo para los hibrodomas incluirá típicamente la hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) , estas sustancias previenen el crecimiento de las células deficientes en HGPRT. Células de mieloma preferidas son aquellas que funden eficientemente, soportan la producción de alto nivel estables del anticuerpo por células que producen anticuerpos seleccionada, . y son sensibles a un medio, tal como el medio HAT. Entre ellas, las líneas de células de mieloma preferidas son líneas del mieloma del murino, tal como aquellas derivadas de tumores del ratón MOPC-21 y MPC-11, disponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y SP-2 o células X63-Ag8-653 disponibles de American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Las líneas celulares de mieloma humanas y heteromieloma del ratón-humano se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol . , 133:3001 (1984); Brodeur et al . , Monoclonal Antibody Production Techniques y Applications, pp . 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). El medio de cultivo en el cual crecen las células de hibridoma, se ensayaron para la producción de anticuerpos monoclonales, dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determinó por la inmunoprecipitación o por un ensayo de liga in vitro, tal como el radioinumino-ensayo (RÍA) o el ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA) . La afinidad de liga del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, ser determinado por el análisis de Sctchard de Munson et al . , Anal . Biochem . , 107:220 (1980). Después que se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, lasa clonas pueden ser subclonadas por procedimientos de dilución limitante y crecidas por métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies y Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo los medios D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden crecer in vivo como tumores de ascites en un animal . Los anticuerpos monoclonales secretados por las subclonas son separados adecuadamente del medio de cultivo, fluido de ascites o suero por procedimientos de purificación convencionales de la inmunoglobulina, tal como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, diálisis de electroforesis de gel, o cromatografía de afinidad. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales es fácilmente aislado y forma secuencias usando procedimientos convencionales (por ejemplo usando sondas de oligonucleótidos que sean capaces de ligarse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos del murino) . Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede ser colocado dentro de los vectores de expresión, los cuales son luego transfectdos (introducidos) en las células huésped, tal como las células de E. coli, células COS del simio, células del ovario del Hámster chino (CHO) , o células de mieloma, que no producen de otra manera la proteína de la inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Artículos de revisión en la expresión recombinante en bacterias del ADN que codifican el anticuerpo incluyen Skerra et al . , Curr. Opinión in Immunol . , 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol . Revs . , 130:151-188 (1992) . N otra modalidad, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, pueden ser aislados de las colecciones de fagos de anticuerpos, generadas usando las técnicas descritas en McCafferty et al . , Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al . , Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al . , J. Mol . Biol . , 222:581-597 (1991) describe el aislamiento de los anticuerpos del murino y humano, respectivamente, usando colecciones de fagos. Publicaciones subsiguientes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) por mezcla de cadenas (Marks et al . , Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), al igual que la infección combinatoria y la recombinación ín vivo como una estrategia para construir colecciones de fagos muy grandes. (Waterhouse et al . , Nuc . Acids . Res . , 21:2265-2266 (1993)). Así, estas técnicas son alternativas viables para las técnicas de hibridoma de anticuerpos monoclonales tradicionales, para el aislamiento de los anticuerpos monoclonales. El ADN puede también ser modificado, por ejemplo, por sustituir la secuencia de codificación para dominios constantes de cadenas pesadas y ligeras humanas en lugar de las secuencias del murino homologas (Patente US No. 4,816,567; Morrison, et al . , Proc . Nati Acad . Sci . USA, 81:6851 (1984)), o por la unión covalente a la secuencia de codificación de la inmunoglobulina, toda o parte de la secuencia de codificación para el polipéptido no de la inmunoglobulina . Típicamente, tales polipéptidos no de la inmunoglobulina son sustituidos por los dominios constantes de un anticuerpo o ellos son sustituidos por los dominios variables de un sitio de combinación del antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio que combina el antígeno que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio que combina con el antígeno que tiene especificidad para un diferente antígeno. (iii) Anticuerpos humanizados Métodos para humanizar los anticuerpos no humanos se han descrito en el arte. Preferiblemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos dentro del mismo desde una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos son a menudo referios como residuos "importantes", que se toman típicamente de un dominio variable "importante" . La humanización puede ser realizada esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al . , Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al . , Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al . , Science, 239:1534-1536 (1988)), por sustituir las secuencias de la región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por lo tanto, tales "anticuerpos humanizados" son anticuerpos quiméricos (U.S. Patente No. 4,816,567) en que sustancialmente menor de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos, en que algunos residuos de la región hipervariable y posiblemente algunos residuos de FR son sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

La selección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, se usará en obtener los anticuerpos humanizados, es muy importante en reducir la antigenicidad. De acuerdo con el llamado método de "mejor ajuste", la secuencia de un dominio variable de un anticuerpo de roedor se clasifica contra toda la colección de secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana que está más cercana a aquella del roedor es luego aceptada como la región de armazón humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al . , J. Immunol . , 151:2296 (1993); Chothia et al . , J. Mol . Biol . , 196:901 (1987)). Otro método usa una región de armazón particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o pesada. El mismo armazón puede ser usado para varios diferentes anticuerpos humanizados (Cárter et al . , Proc . Nati . Acad . Sci . USA, 89:4285 (1992); Presta et al . , J. I munol . , 151:2623 (1993) ) . Es igualmente importante que los anticuerpos sean humanizados con retención de alta afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr esta meta, de acuerdo con un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan por un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos humanizados conceptuales que usan modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están disponibles comúnmente y son familiares por los expertos en el arte. Programas de computadora están disponibles e ilustran y exhiben estructuras conformocionales tridimensionales probables de secuencias de la inmunoglobulina candidatos seleccionadas. La inspección de estas exhibiciones permiten el análisis del papel posible de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de la inmunoglobulina candidato, es decir, el análisis de residuos que tienen influencia en la habilidad de la inmunoglobulina candidato para unir su antígeno. En esta manera, los residuos FR pueden ser seleccionados y combinados desde el receptor e importar secuencias así que la característica del anticuerpo deseada, tal como la afinidad aumentada para los antígenos objetivo se logre. En general, los residuos de la región hipervariable están directa y más sustancialmente involucrados en la influencia la liga del antígeno. (iv) Anticuerpos humanos Como una alternativa a la humanización, se pueden generar los anticuerpos humanos. Por ejemplo, es ahora posible producir animales transgénicos (por ejemplo ratones) que sean capaces, en la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos, en la ausencia de la producción de la inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homoziga del gene de la región de unión (JH) de cadena pesada del anticuerpo, en el ratón mutante de línea del germen y quimérica resulta en la inhibición completa de la producción del anticuerpo endógeno. La transferencia del arreglo del gene de la inmunoglobulina de la línea de germen humana en tales ratones mutantes de la línea del germen resultará en la producción de anticuerpos humanos en el reto del antígeno. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al . , Proc . Nati . Acad . Sci . USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al . , Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al . , Year in Immuno . , 7:33 (1993); y Patentes US Nos. 5,591,669, 5,589,369 y 5,545,807. Alternativamente, la tecnología de exhibición de fagos (McCafferty et al . , Nature 348:552-553 (1990)) puede ser usada para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro de los repertorios del gene del dominio variable (V) de la inmunoglobulina de donadores no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes del dominio V de anticuerpo son clonados en el marco en un gene de recubrimiento mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o siguientes, y exhibido como fragmentos de anticuerpo funcionales en la superficie de la partícula del fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copa del ADN de cordón sencillo del genoma de fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también resultan en la selección del gene que codifica el anticuerpo que exhibe esas propiedades. Así, el fago semeja algunas de las propiedades de la célula B. La exhibición del fago puede ser realizada en una variedad de formatos, para su revisión véase, por ejemplo Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J. , Current Opinión in Structural Biology 3:564-571 (1993). Varias fuentes de segmentos del gene V pueden ser usadas para la exhibición del fago. Clackson et al . , Nature, 352:624-628 (1991) aislaron un arreglo diverso de anticuerpos anti-oxalona de una pequeña colección combinatoria aleatoria de genes V derivados del bazo de ratones inmunizados. Un repertorio de genes V de donadores humanos no inmunizados puede ser construido y los anticuerpos a un arreglo diverso de antígenos (que incluyen los auto-antigenos) pueden ser aislados siguiendo esencialmente las técnicas descritas por Marks et al . , J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991), o Griffith et al . , EMBO J. 12:725-734 (1993). Véanse también, las Patentes US Nos. 5,565,332 y 5,573,905. Los anticuerpos humanos pueden también ser generados por las células B activadas in vi tro (véanse las Patentes US Nos. 5,567,610 y 5,229,275). (v) Fragmentos de anticuerpos Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivan por la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al . , Journal of Biochemical y Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al . , Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden ahora ser producidos directamente por las células huésped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden ser aislados de las colecciones de fagos de anticuerpos, discutidas antes. Alternativamente, los fragmentos Fab' -SH pueden ser recuperados directamenre de E. coli y acoplados químicamente para formar fragmentos de F(ab')2 (Cárter et al . , Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro acercamiento, los fragmentos F(ab')2 pueden ser aislados directamente del cultivo celular de huéspedes recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes a los practicantes expertos. En otras modalidades, el anticuerpo de selección es un fragmento Fv de cadena sencilla. Véase WO 93/16185; Patente US No. 5,571,894; y Patente US No. 5,587,458. El fragmento del anticuerpo puede también ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la Patente US No. 5,641,870 por ejemplo. Estos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos. (vi) Anticuerpos biespecíficos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de liga para al menos dos epítopes diferentes. Anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden ligarse a dos diferentes epítopes del marcador superficial de la célula B y además ligarse a un segundo marcador superficial de célula B diferente. Alternativamente, un brazo que se liga a un marcador superficial de una superficie de anti-célula B puede ser combinado con un brazo que se une a una molécula de inicio en un leucocito, tal como una molécula del receptor de célula T (por ejemplo CD2 o CD3) , o receptores de Fc para la IgG (FcyR) , tal como Fc?RI (CD64) , Fc?RII (CD32) y Fc?RIII (CD16) para así enfocar mecanismos de defensa celulares a la célula B. Anticuerpos biespecificos pueden también ser usados para localizar agentes citotóxicos a la célula B. Estos anticuerpos poseen un brazo de liga al marcador de la superficie de la célula B y un brazo que se liga al agente citotóxico (por ejemplo la saporina, anti-interferona-a, vinca-alcaloide, cadena de ricina A, metotrexato o hapten isótopo radioactivo. Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo los anticuerpos biespecíficos F(ab')2. Métodos para marcar los anticuerpos biespecíficos se conocen en el arte. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basan en la coexpresión de dos parejas de cadena pesada - cadena ligera de la inmunoglobulina, donde estas dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et al, Nature 305:537-539 (1983)). Debido a la clasificación aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina, estos hibrodomas cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferentes moléculas de anticuerpos, de las cuales solamente una tiene la estructura biesspecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, la cual se hace usualmente por las etapas de cromagtografía de afinidad, es más bien embarazosa y son bajos los rendimientos del producto. Procedimientos similares se describen en WO 93/08829, y en Traunecker et al . , EMBO J. , 10:3655-3659 (1991) . De acuerdo con un acercamiento diferente, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas ( sitios de combinación del antígeno-anticuerpo) se funden a las secuencias de dominio constante de la inmunoglobulina. a fusión preferiblemente es con un dominio constante de la cadena pesad de la inmunoglobulina que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3 de bisagra. Se prefiere tener la primera región constante /CH1) de cadena pesada que contiene el sitio necesario para la liga de la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y son co-transfectados en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona mayor flexibilidad en ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptidos en las modalidades, cuando relaciones desiguales de las tres cadenas del polipéptido usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o todas las cadenas de polipéptidos en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptidos en relaciones iguales resulta en altos rendimientos o cuando las relaciones no son de significancia particular. En una modalidad preferida de este acercamiento, los anticuerpos biespecíficos se componen de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida, con una primera especificidad de unión en un brazo, y una pareja de cadenas, pesada y ligera, de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se ha encontrado que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, como la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula específica proporciona una manera fácil de separación. Este acercamiento se describe en WO 94/04690. Para otros detalles de la generación de anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh et al . , Methods in Enzymology, 121:210 (1986). De acuerdo con otro acercamiento, descrito en la patente US No. 5,731,168, la interfaz entre una pareja de moléculas de anticuerpo puede ser tratada con ingeniería para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo celular recombinante. La interfaz preferida comprende al menos parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeñas forman la interfaz de la primera molécula de anticuerpo y son reemplazadas con cadenas laterales mayores (por ejemplo la tirosina o triptófano) . Las "cavidades compensadoras de tamaño idéntico o similar a las cadenas laterales grandes son creadas en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo, por reemplazar cadenas laterales de aminoácidos grandes con unas más pequeñas (por ejemplo la alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados, tal como los homodímeros. Anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos entrelazados o "heteroconjugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede ser acoplado a la avidina, el otro a la biotina. Tales anticuerpos, por ejemplo, se han propuesto a células del sistema inmunes objetivo a células indeseadas (Patente US o» 4,676,980) y para el tratamiento de la infección de HIV (WO 91/00350, WO 92/200373 y EP 03089) . Los anticuerpos heteroconjugados pueden ser obtenidos usando cualquier método de entrelazamiento conveniente. Agentes de entrelazamiento adecuados son bien conocidos en el arte, y se describen en la patente US No. 4675,980, junto con un número de técnicas de entrelazamiento . Técnicas para generar anticuerpos biespecíficos de los fragmentos de anticuerpo se han descrito también en la literatura. Por ejemplo, anticuerpos biespecíficos pueden ser preparados usando el enlace químico. Brennan et al . , Science, 229: 81 (1985) describe un procedimiento en que los anticuerpos intactos son desdoblados proteolíticamente para generar fragmentos de F(ab')2 Estos fragmentos se reducen en la presencia de un arsenito de sodio de agente que forma complejo de ditiol, para estabilizar los ditioles vecinales y prevenir la formación del disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados son luego convertidos a derivados de tionitrobenzoato TNB) Uno de los derivados de Fab' -TNB es luego reconvertido al Fab' -tiol por la reducción con la mercaptoetilamina y es mezclado con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab' -TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas .

Varias técnicas para obtener y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente desde el cultivo celular recombinante también se han descrito. Por ejemplo, anticuerpos biespecíficos se han producido usando cremalleras de leucina. Kostelny et al . , J. Immunol . , 148 (5) : 1547-1553 (1992) . Los péptidos de cremallera de leucina de los Fc y protepinas Jun, se enlazan a las porciones de Fab' de dos diferentes anticuerpos por la fusión de gene. Los homodímeros de anticuerpo se reducen en la región de bisagra para formar monómeros y luego se re-oxidan para formar heterodimeros de anticuerpo. Este método puede también ser utilizado para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al . , Proc . Nati . Acad . Sci . USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismoo alternativo para obtener los fragmentos de anticuerpo biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de caen aligera (VL) por un enlazador que es demasiado corto para permitir la formación de parejas entre los dos dominios en la misma cadena. Por lo tanto, los dominios VH y VL de un fragmento son forzados a formar parejas con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando así dos sitios de unión de antígeno. Otra estrategia para obtener fragmentos de anticuerpos biespecíficos por el uso de dímeros de cadena simple Fv (sFv) se ha reportado también. Véase Gruber et al . , J. Immunol . , 152:5368 (1994). Los anticuerpos con más de dos valencias se consideran. Por ejemplo, anticuerpos itriespecíficos pueden ser preparados. Tutt et al . J. Immunol . 147: 60 (1991).

IV- OTRAS MODIFICACIONES DEL ANTICUERPO Se consideran las modificaciones de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo. Por ejemplo, puede ser conveniente mejorar la afinidad de unión y/o otras propiedades biológicas del anticuerpo. Variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan por introducir cambios de nucleótidos apropiados en el ácido nucleico de anticuerpo o por la síntesis de péptidos. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, supresiones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de los residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Cualquier combinación se supresión, inserción y sustitución se hace para llegar a la construcción final, con la condición que esta construcción final posea las características deseadas.

Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos post-translacionales del anticuerpo, tal como cambiar el número o posición de los sitios de glicosilación. Un método útil para identificar ciertos residuos o regiones del anticuerpo que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis, se llama la "mutagénesis de exploración de la alanina" como se describe por Cunningham y Wells, Science 244 : 1081 -1085 (1989) . Aquí, un residuo o grupo de residuos objetivo se identifican (por ejemplo residuos cargados, tal como arg, asp, his, lys, y glu) y reemplazados por un aminoácido neutral o cargado negativamente (más preferiblemente la alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Esas ubicaciones de aminoácidos que demuestran la sensibilidad funcional a las sustituciones luego se refinan por introducir otras variantes en, o por, los sitios de sustitución. Así, mientras el sitio para la introducción de una variación de la secuencia de aminoácidos está predeterminada, la naturaleza de la mutación de por si no necesita ser predeterminada. Por ejemplo, para analizar el desempeño de una mutación en un sitio dado, la exploración de ala o mutagéneis aleatoria se conduce en un codón objetivo o región y las variantes del anticuerpo expresadas se clasifican para la actividad deseada.

Las inserciones de la secuencia de aminoácidos incluye las fusiones terminales de amino y/o carboxilo, que varían en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, al igual que las inserciones intra secuencia de residuos de aminoácidos sencillos o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionina N-terminal o el anticuerpo fundido a un polipéptido citotóxico Otras variantes de inserciones de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión de la terminal N o C del anticuerpo de una enzima, o un polipéptido que aumenta la vida media del suero del anticuerpo. Otro tipo de variante de es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula del anticuerpo reemplazado por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagéneis de sustitución de los anticuerpos incluyen lasa regiones hipervariables, pero las alteraciones FR son también consideradas. Sustituciones conservativas se muestran en la Tabla 2, bajo el encabezado de "sustituciones preferidas" . Tales sustituciones resultan en un cambio en la actividad biológica, luego más cambios sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 2 o como se describen además abajo con referencias a las clases de aminoácidos, pueden ser introducidos y los productos clasificados .

Tabla 2 Residuo Sustituciones Ejemplares Sustituciones Original Preferidas Ala (A) Val; Leu; He Val Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gln Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg He (I) Leu; Val; Met; Ala; Leu Phe; Norleucina Leu (L) Norl< sucina; He; Val; He Met; Ala; Phe Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; He Leu Phe (F) Trp; Leu; Val; He; Ala; Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se acompañan por la selección de suustituciones que difieren significantemennte en su efecto en mantener (a) la estructura el esqueleto de polipépptido en el área de sustitución, por ejemplo como una hoja o conformación helicoidal, (b) la carga de la hidrofoboeidad de la molécula en el sitio objetivo o (c) el volumen de la cadena lateral. Los amkinoácidos se pueden agrupar, de acuerdo con similaridades en las propiedades de sus cadenas laterales (en A L. Lehninger, en Biochemistry, Segunda Ed pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) no-polar: Ala (A), Val (V), Leu (L) , He (I), Pro (P) , Phe (F) , Trp (W) , Met (M) (2) Polar sin cargar: Gly (G) , Ser (S) , Thr (T) , Cys (C) , Tyr (Y) , Asn (N) , Gln (Q) (3) acida: Asp (D) , Glu (E) (4) básica: Lys (K) , Arg (R) , His (H) Alternativamente, los residuos que ocurren naturalmente se pueden divbidir en grupos basados en las propiedades de caena laterales comunes : (1) hidrofóbicas: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrofílicasa neutrales: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) acidas: Asp, Glu; (4) básicas: His, Lys, Arg; (5) residuos que tienen influencia en la orientación de cadena: Gly, Pro; (6) aromáticas Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservativas conducirán a intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase . ualquier residuo de cisteína no involucrado en mantener la confofrmación popia del anticuerpo, también puee ser sustituido, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir el entrelazamiento aberrante. A la inversa, los enlaces de cisteína pueden ser agregados al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fv. Un tipo particularmente preferido de variante sustitucional implica sustituir uno o más residuos de la región bipervariable de un anticuerpo afín. Generalmente, las variantes resultantes, seleccionadas para un desarrollo ulterior, tendrán propiedades biológicas mejoradas relativas al anticuerpo padre, desde el cual se generan, Una manera conveniente de generar estas variantes sustitucionales es la maduración de afinidad uasndo la exhibición de fagos. En breve, varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo 6 a 7 sitios) son mutados para generar todas las posibles sustituciones de amino en cada sitio. Las variantes de anticuerpos, así generadas, se exhiben en una manera monovalente de partículas de fagos filamentsos, como fuiones al producto de gene III de M13 empacado dentro de cada partícula. Las variantes exhbidas de fagos son luego clasificadas por su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) como se describe aquí, con el fin de identificar los sitios e la región hipervariable candidato para la modificación, la mutagénesis de exploración de la alanina puede ser realizada para identificar los residuos de la región hipervariable que contribuyen significantemente a la liga del antígeno. Alternativamente, o adicionamente, puede ser ben'+efico anaalizar una estructura de cristal del complejo de antigeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Estos residuos de contacto y los residuos vecinos son candidatos de la sustitución, de acuerdo con las técnicas aquí elaboradas. Una vez que se generan estas variantes, el panel de variantes se somete a la clasificación, como se decribe aquí, y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes pueden ser seleccionados para el desarrollo ulterior. Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo alter el patrón de glicosilación orignal del anticuerpo. Tal alteración incluye suprimir uno o más partes de carbohidratos encontrados en el anticuerpo y/o agregar uno o más sitios de glicsilación qu no estén presentes en el anticuerpo. La glicosilación de polipéptidos es típicamente o enlazada a N o enlazada a O. Enlazado a N se refiere a adjuntar la parte de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptidos de asparagina-X-serina y de asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto la prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la parte de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido, crea un sitio potencial de glicosilación. La glicosilación enlazada a 0, se refiere a la unión de una de las azúcares de N-acetilgalactosamina, galactsa o xilosa, a un ácido de hidroxiamino, más comúnmente la serina o treonina. aunque la 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina pueden también ser usadas . La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se logra convenientemente por alterar la secuencia de aminoácido que contiene uno o más secuencias de tripolipéptidos, descritas anteriormente (para los sitios de glicosilación N-enlazados) . La alteración puede también ser hecha por la adición de o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina de la secuencia del anticuerpo original (para los sitios de glicosilación enlazados) . Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, el carbohidrato adjunto ahí puede ser alterado. Por ejemplo, los anticuerpos con una estructura de carbohidrato madura, que carece de fructosa unida a una región Fc del anticuerpo, se describen en la Solicitud de Patente No US 2003/0157108 Al, Presta, L. Véase también US 2004/0093621 Al (Kyowa Hakko Kogyo Co . , Ltd) con relación a una composición de anticuerpo.

Los anticuerpos con una bisección de N-acetilglucosamina (GlcNAc) en el carbohidrato unido a una región Fc del anticuerpo se mencionan en WO03/011878, Jean-Mairet et al . and US Patent No. 6,602,684, Umana et al . Anticuerpos con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido adjunta a una región Fc del anticuerpo se reportan en WO97/30087, Patel et al . See, also, W098/58964 (Raju, S.) y W099/22764 (Raju, S.) con relación al anticuerpos con carbohidratos alterados unidos a su región Fc . Las moléculas del ácido nucleico que codifican las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan por una variedad de métodos conocidos en el arte. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos que ocurren naturalmente) o la preparación por oligonucleótidos mediada (o de sitio dirigido) por mutagénesis. La mutagénesis de la PCR y la mutagénesis de cásete de una variante preparada antes o una versión no variante del anticuerpo. Puede ser conveniente modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función del efector, por ejemplo, para así aumentar la citotoxicidad mediada por célula dependiente del antígeno (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto se puede lograr por introducir una o más sustituciones de aminoácidos en la región Fc de un anticuerpo. Alternativa o adicionalmente, los residuos de la cisteína pueden ser introducidos en la región Fc, permitiendo así la formación de enlace de disulfuro intercadena en esta región. El anticuerpo homodimérico, así generado, puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o destrucción celular mediada por complemento y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Véase Carón et al . , J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol . 148:2918-2922 (1992). Anticuerpos homodiméricos con una actividad anti-tumor aumentada pueden también ser preparados usando entrelazadores heterobufuncionales, como se describen en Wolff et al Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, un anticuerpo puede ser formado por ingenie 'ría que tiene regiones Fc dobles y puede tener así lisis de complemento aumentada y capacidades de ADCC. Véase Stevenson et al . Anti cancer Drug Design 3:219-230 (1989) . La WOOO/42072 (Presta, L.) describe anticuerpos con función ADCC mejorada en la presencia de células de efector humanas, donde los anticuerpos comprenden sustituciones de aminoácidos en su región Fc . Preferiblemente, el anticuerpo con ADCC mejorada comprende sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc . Preferiblemente, la región de Fc alterada es una región IgGl Fc humana, que comprende o consiste de sustituciones en una, dos o tres de estas posiciones. Los anticuerpos con la unión Clq alterada y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) se describen en W099/51642, US Patent No. 6,194,551B1, US Patent No. 6,242, 195B1, US Patent No. 6,528,624B1 y US Patent No. 6,538,124 (Idusogie et al . ) . Los antiuerpos comprenden una sustitución de aminoácido en una o más posiciones de aminoácidos 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 and/or 334 de su región Fc . Para aumentar la vida media del suero del anticuerpo, uno puede incorporar un epítope de unión de receptor silvestre en el anticuerpo (especialmente un fragmeto de anticuerpo) como se describe en la Patente US 5,739,277, por ejemplo. Según se usa aquí, el término de "epítope de unión de receptor silvestre" se refiere a un epítope de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo IgGi, IgG2/ IgG3, o IgG4) que es responsable del aumento de la vida media del suero in vivo de la molécula IgG. Anticuerpos con sustituciones en su región Fc y vidas medias del suero aumentadas se describen en WO00/42072 (Presta, L.). Los anticuerpos de ingeniería con tres o más (preferiblemente cuatro) sitios de unión de antígeno funcionales, son también considerados (Solicitud US No. US2002/0004587 Al, Miller et al . ) . v. FORMULACIONES FARMACÉUTICAS Las formulciones terapéuticas de los anticuerpos usados, de acuerdo con la presente invención, se preparan para el almacenamiento por mezclar un anticuerpo que tiene el grado deseaado de pureza conportadores aceptables farmacéuticamente opcionales, excipientes o etabilizadores (Remington ' s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol , A. Ed. (1980) ) , en la forma de formulaciones liofilizads o soluciones acuosas. Portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos a los receptores a las dosis y concentraciones empleaass, e incluyen reguladores, tal como el fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos, antioxidantes, que incluyen el ácido aascórbico y la metionina; preservativos (tal como el octadecildi etilbencilo del cloruro de amonio; cloruro de benzaalconio, cloruro de bencetonio, fenol, alcohol butíico o bencílio; parabens de alquilo, tal como el paraben de metilo o de propilo; catecol; resorcinol; ciciohexanol; 3-pentanol y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menor de aproximadamente 10 residuos) , proteínas, tal como la albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como la polivinilpirrolidona; aminoácidos, tal como la glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros crbohidratos, que incluyen la glucosa, mañosa o destrinas; agentes de quelación, tal como EDTA, azúcares, tal como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra-iones que foran sales, tal como el sodio, complejos de metal (por ejemplo, los ocmplejos de Zn-protepina) ; y/o agentes tensoactivos no iónicos, tal como RWEEN™, pluronics™ o polietlen-glicol (EG) . Formulaciones de anticuerpos anti-CD20 ejemplares se describen en WO/98/56418. Esta publicación describe una formulación líquida de múltiples dosis que comprende 40 mg/ml de rituximab, 25 mM de acetato, 150 mM de trehalosa, 0.9% de alcohol bencílico, 0.02% e polisorbato 20 a un pH de 5.0 , que tiene una vida en anaqul m'nima de dos años de almacenamiento a 2-8BC. Otra formulación anti-CD20 de interés comprende 10 mg/ml de rituximab en cloruro de sodio 9.0 mg/ml, 7.35 mg/ml de dihidrato de citrato de sodio, 0.7 mg/ml de poiorbato 80 y agua estéril para inyección, pH de 6.5. Formulaciones liofilizadas, adaptads para la administraión subcutánea se describen en la Patente US No. 6,267,958 (Andya et al). Estas formulaciones liofilizadas pueden ser reconstituidas con un diluyente adecuado a una alta concentración de proteína y la formulación recnstituida puede ser administrada subcutáneamente al mamífero que se va a tratar aquí . Las formas cristaliads del anticuerpo o el anticuerpo pueden también ser considerados. Véase, por ejemplo, US 2002/0136719A1 (Shenoy et al . ) . La presente formulación puede también contdner más de un compuesto activo, según sea anecesario, para la indicación particular que se trata, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se efecten adversamente entre sí. Por ejemplo, puede ser conveniente proporcionar además un segundo medicamento, como los discutidos en la Sección de Tratamiento II anterior. El tipo y las cantidades efectivas de tales otros agentes dependen, por ejemplo, de la cantidad del anticuerpo presente en la formulación, el tipo de AD o demencia que se trata, y los parámetros clínicos de los sujetos. estos se usan generalmente en las mismas dosis y con rutas de administración usados anteriormente o alrededor del 1 al 99% de las dosis empleadas hasta ahora. Los ingredientes activos pueden también ser atrapados en micocápsulas preparadasa, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli (metilmetacrilato) , respectivamente, en sistemas de entrega de drogas coloidaes (por ejemplo, liposomas, microesferas e albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) en en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington ' s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol , A. Ed. (1980). Preparaciones de liberación sostenida se pueden preparar. Ejemplos adecuados de estas preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, estasa matrices están en la forma de artículos configurados, por ejemplo películas o microápsulas . Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen los poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) o poli (alcohol vinílico)), poliláctidos (U.S. Pat. No. 3,773,919), copolímeros del ácido L-glutámico y ?-etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros degradables del ácido láctico - ácido glicólico, tal como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuests del copolímero de ácido láctico-ácido glicóico y acetato de leuprolide) y poli-D- (-) -3-ácido hidroxibutírico. Aunque la barrera del cerebro a la sangre en la AD y demencia puede ser interrumpida o alterad en su permeabilidad o transporte, agentes o métodos que aumentan la permeabilidad y/o agentes terapéuticos del transporte, pueden ser formulados con el anticuerpo. Por ejemplo, los vectores lipofílicos, tal como la procarbazina, pueden ser usados para permeabilizar la barrera del cerebro a la sangre y/o llevar agentes terapéuticos al cerebro, inmunoliposomas, liposomas dirigidos al anticuerpo y complejos lipofílicos biomoleculares pueden también ser usados como portadores a través de la barera al cerebro de la sangre. Estos preferiblemente incluyen los ácidos grsos, tal como la serie de omega-3 o derivados de lípidos en esta serie. Adicionalmente, moléculas lipofílicas, que incluyen, pero no se limitan a: otros ácidos grasos, lisofosfolípidos, fosfolípidos de diacilo, gliceroles de diacilo, coleterol, esteroides, que incluyen aquellos que llevan grupos de hidrocarburos insaturdos de 18-46 átomos de carbono. Se pueden usar adicionalmente biopolímeros . Estos incluyen, pero no se limitan a: poli (alfa) -aminoácidos, albumen o agentes del suero humano, que se nen y enlazan al albumen humano, aminodextrano y caseína. Preferiblemente, estos portadores tienen una biocompatibilidad y farmacocinética apropiadas para su uso como un sistema de entrega, véase, por ejemplo la Patente US No. 5,716,614. Otro ejemplo de un agente el cual puede aumentar la permeabilidad de la barera al cerebro de la sangre es un anticuerpo receptor de la transferina. Este receptor de la transferina es detectable en las células endoteliales capilares del cerebro. Algunos ejemplos de tales anticuerpos incluyen: B3/25, OKT-9, OX-26, Tf6/14, L5.1 , 5E-9, T58/30, y RI7 217, véase la US Patent No. 5,182,107. Adicionalmete, la barrera al cerebro de la sangre puede ser interrumpida osmóticamente. Las fdormulaciones que se van a usar para la administrción in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente por filtración a travéas de membranas de filtración estériles.

ARTÍCULOS DE MANUFACTURA En otra modalidad de la invención, se proporciona un artículo de manufactura que contiene materiales úitiles para el tratamiento de la AD o demencia, descritos anteriormente. Preferiblemente este artículo de manufactura comprende (a) un contenedor que comprende una composición que incluye un antagonista del antígeno de la superficie de la célula B, un portador o diluyente aceptable dentro del contenedor; y (b) un inserto del paquete con instrucciones para administrar la composición a un sujeto con AD o demencia. El artículo de manufactura comprende un contenedor y una etiqueta o inserto de paquete dentro o asociado con el contenedor. Contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, írseos, jeringas, etc. Los contenedores pueden ser formados de una variedad de materiales, tal como vidrio o plástico. El contenedor retiene o contiene una composición que es efectiva para tratar la AD o demencia y puede tener una puerta de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tenga un obturador perforable por una aguja de inyección hipodérica) . Al menos un agente activo en la composición e el anticuerpo. La etqiuet o inserto de paquete indica que la composición se usa para tratar la AD o demencia en un sujeto que la sufre, con una guía específica respecto a la dosificaciónen cantidades e intervalos del anticuerpo y cualquier otra droga provista. El artículo de manufactur puede además comprender un segundo contenedor que comprende un regulador diluyente, aceptable farmacéuticamente, tal como agua bacteriostática paa la inyección (BWF) , solución salina regulada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. El artículo de manufctura puede además incluir otros materiales convenientes desde el punto de vista comercial y del usuario, que incluyen otros reguladores, diluentes, filtros, agujas y jeringas, opcionalmente, el artículo de manufactura prsente además comprende un segundo contenedor, dentro del cual se retiene un agente, además del anticuerpo, para el tratamiento y además comprende instrucciones para el tratamiento de un mamífero con tal agente, ejemplares de tales segundos medicamentos se discutieron en la Seccicón II de Tratamiento anterior, de la composición a un sujeto con la AD o demencia. Otros detalles de la invención se ilustran por los siguientes ejemplos no limitativos. Las descripciones de todas las citas en la especificación se incorporan expresamente aquí como referencia.

EJEMPLO 1 TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER BENIGNA-MODERADA Se trató un sujeto con la enfermedad de Alzheimer (AD) benigna-moderada con un anticuerpo CD20 en este ejemplo. Sujetos de 50 a 80 años de cada, hombre sy mujeres, con la enfermedad de Alzheimer, como se determinó por los criterios de NINCS/ADRDA (McKhann et al. "Clinical diagnosis of Alzheimer's disease: report of the NINCDS-ADRDA Work Group bajo los auspicios del Department of Health and Human Services Task Forcé on Alzheimer's Disease." Neurology 34 , 939-944 (1984)) serán tratados aquí. Tales sujetostienen la AD benigna- , oderada como se determinó usando el examen Mini-Mental State Exam (MMSE), por ejemplo, la clasifiación de este MMSE puede estar en el intervalo de 16 a 24. Lo sujetos están preferiblemente bajoo medicamentos estándar del cuidado de la salud (es decir, los inhibidores de la acetilcolinoesterasa) para la AD durante 3 meses antes de la terapia con el anticuerpo CD20. Asimismo, los sujetos tendrán una agudeza visual y de auditorio adecuada para permitir la prueba neuropssicológica . El rituximab, disponible comercialmente de Genentech, se formuló para la administración iv como un producto estéril en 9.0 mg/ml de cloruro de sodio, 0.7 mg/ml de polisorbato 80, 7.35 mg/ml de deshidrato de citrato de sodio y agua estéril para la inyección (pH de 6.5) . Alternativamente, una formulación que comprende 2H7 vl6 humanizado intacto o 2H7 v511 humanizado intacto se administró. El primer curso del tratamiento consistía de una dosis de 1 g intravenosa (iv) del anticuerpo CD20 administrado en los días 1 y 15. Los sujetos recibieron la acetaminofen (1 g) y difenhidramina HCl (50 mg) oral, 30-60 minutos antes del inicio de cada infusión. Los cursos subsiguientes de tratamiento serán administrados partiendo en la semana 24 (día 169) , semana 48 (día 337) y semana 72 (día 505) . La segunda infusión de los cursos subsiguienets de tratamiento siendo de 1 y 14 días después de la primera infusión. La administración del anticuerpo CD20 , como se describe aquí, resultará en una función cognitiva mantenida, que disminuye la progresión de la enfermedad, maneja problemas del comportamiento asociados con la enfermedad, disminuye la pérdida de experiencia de vida diaria, reduce los niveles de autoanticuerpo o BRA y/o reduce la circulación de células B positvas de CD20. Por ejemplo, la administración del anticuerpo CD20 puede resultar en la clasificación MMSE que permanece la misma o disminuye por < 4 puntos (en la AD benigna-moderada sin tratar, la declinación esperada en las clasificaciones de MMSE es de 2-4 puntos por año) . Tal resultado mejorado será superior a aquel logrado con las medicaciones estándar para el cuidado de la salud solas.

TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER MODERA A-SEVERA Este ejemplo describe la terapia de la AD moderada-severa usando un anticuerpo CD20. Sujetos, hombres y mujeres, mayores de 50 años de edad, con la AD moderada-severa se trataron en este ejemplo. Estos sujetos tienen una AD moderada-severa con una clasificación mayor o igual a 4 en el dominio de agitación/agresión de NPI . Los sujetos han sido tratados con una dosis estable de memantina durante al menos 3 meses. Rituximab, disponible comercialmente de Genentech, se formularon para la administración iv como un producto estéril en 9.0 mg/ml de cloruro de sodio, 0.7 mg/ml de polisorbato 80, 7.35 mg/ml de deshidrato de citrato de sodio y agua estéril para la inyección (pH de 6.) . Alternativamente, una formulación que comprende 2H7 vl6 humanizado intacto o 2H7 v511 humanizado intacto se administró .

El primer curso de tratamiento consistía de una dosis de 1 g intravenoso (iv) del anticuerpo CD20 administrado en cada día 1 y 15, Los sujetos recibieron el acetoaminofen (lg) y difenhidramina HCl (50 mg) oralmente 30-60 minutos antes de iniciar cada infusión. Los cursos subsiguientes de tratamiento se administrarán comenzando la semana 24 (día 169) , semana 48 (día 337) y semana 72 (día 505) . La segunda infusión de los cursos subsiguientes de tratamiento serán 1 y 14 días después de la primera infusión. Se puede evaluar la función día a día usando un inventario de actividades de vida diaria (ADL) que comprende una batería completa de cuestiones de ADL usadas para medir las capacidades funcionales del sujeto. Cada párrafo ADL es clasificado del nivel más alto de desempeño independiente para la pérdida completa. El clínico realiza el inventario por entrevista con el familiar al cuidado de la salud con respecto el comportamiento del sujeto El desempeño cognitivo puede ser evaluado usando un instrumento de múltiples términos validado para la evaluación de la función cognitiva en pacientes con demencia moderada-severa . Por ejemplo, el instrumento puede examinar los aspectos seleccionados del desempeño cognitivo, que incluyen los elementos de atención, orientación , lenguaje, memoria, habilidad visuoespacial, construcción, práctica e interacción social. Por ejemplo, la Batería de Daño Severo (SIB) puede ser usada, con un intervalo de clasificación de 0 a 100, con la clasificación menor indicando un daño cognitivo mayor. La administración del anticuerpo CD20, como se describe aquí, resultará en una función cognitiva mantenida, que disminuye la progresión de la enfermedad, manejan los problemas de comportamiento asociados con la enfermedad, disminuyen la pérdida de experiencia de vida diaria, reduce los niveles de autoanticuerpo o BRA y/o reduce la circulación de células B positivas CD20. La administración del anticuerpo CD20 resultará en una clasificación ADL superior a aquella lograda con placebo o, cuando el anticuerpo de CD20 se combina con la memantina., superior a aquel logrado con la memantina sola.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Un método para tratar la enfermedad de Alzheimer en un sujeto, este método comprende administrar un anticuerpo CD20 sin protección al sujeto, en una cantidad efectiva para tratar esta enfermedad de Alzheimer. El método de la reivindicación 1, en que el sujeto no sufre de células B malignas. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en que el sujeto no tiene una enfermedad autoinmune, además de la enfermedad de Alzheimer. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que: el sujeto tiene una enfermedad de Alzheimer benigna-moderada. El método de la reivindicación 4, que además comprende administrar un inhibidor de la colinoestersa al sujeto. El método de la reivindicación 5, en que el inhibidor de la colinoesterasa se selecciona del grupo que consiste de la galantamina, rivastigmina y donepezil . El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en que el sujeto tiene una enfermedad de Alzheimer moderada-severa. El método de la reivindicación 7, que además comprende administrar un antagonista del D-aspartato de N-metilo (NMDA) al sujeto. El método de la reivindicación 8, en que el antagonista NMDA es la memantina. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el sujeto tiene un nivel atípico de autoanticuerpo. El método de la reivindicación 10, en que el autoanticuerpo es un anticuerpo a la beta-amiloide, cardiolipina, tubulina, proteína del ácido fibrilar glial, proteína de neurofilamento (NFL) , gangliosida, proteína del citoesqueleto, proteína báica de mielina (MBP) , serotonina, dopamina, factor del crecimiento de nervios (NGF) , prsenilina, beta-péptido amiloide (Abeta) , receptor para productos finales de glicación avanzada (TAGE) o anticuerpo reactivo del cerebro (BRA) . El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que además comprende administrar un segundo medicamento al sujeto, en una cantidad efectiva para tratar la enfermedad de Alzheimer, en que el anticuerpo de CD20 es un primer medicamento. El método de la reivindicación 12, en que el segundo medicamento se selecciona del grupo que consiste de: inhibidor de la colinoesterasa, galantamina, rivastigmina, parche transdermal de rivastigmina, donepezil, tacrina, antagonista del D-aspartato N-metilo, (NMDA) memantina, neramexano, entrega del virus adeno-asociado de NGF, CERE-110, bloqueador beta, antipsicótico, precursor de la acetilcolina, agonista nicotínico o musarínico, anticueroo anti-beta-amiloide, anticuerpo anti-NGF, TA624, vacuna, vacuna amiloide humana, agaente que bloquea la actividad de la beta- o gamma-secretasas implicadas en la formación de amiloide, terapia anti-amiloide, serotonina, norepinefrina, somatostatia, agente que interfiere con la conversión de APP a la amiloide-beta o la formación de placas seniles y laberintos neurofibrilarios, proteína precursora del amiloide en el sitio beta, antagonista de la enzima de desdoblamiento, antagonista de la beta-secretasa (BACE) , antagonista de BASE 1, antagonista e BASE 2, antagonista e gamma-secretasa, antagonista de la prsenilina-1 (PEN-1) , antagonista de la presenilina-2 (PSEN-2) antagonista de AP0-E4, antidepresivo, anticonvulsivo, inhibidor de la recaptación de la serotonina, sertralina, trazodona, divalprolex, gabapentina, risperidona. olanzapina, quetianina, tioridazina, droga que disminuye el colesterol o statina. reductasaa de HMBG-CoA, simbastatna, agente inmunomodulador, antooxidante, vitamina E, aceite de pescado, ácido alfa-lipóico, caroteno, nicotina, extracto de ginkgo, selegilina, mesilato de ergoloid, estrógeno, agente anti-inflamatorio, droga antiinflamatoria o esferoidal (NSAI) , aspirina, buprofen, inhibidor de cox-2, rofecosib, naproxen, celecoxib, naproxen, ginkgo biloba, PPI-1019, hupersina A, vitamina, folato, B6 B12, citamina C; bvitamina E, selenio, antagonista del receptor de GABA(B), SGS742, -758,C-1073, FK962, curcumina, ONO-2506PO, mesilato de asaglilina, va,lproato, SR57746A, NS 2330, MPC- 7869, intererona, interferona alfa, fragmento de anticuerpo de cadena ligera beta-amiloide proteolítico, agente citotóxico agente quimioterapéutico, agente inmunosupresor, inhibidor TNF-alfa, droga anti -reumática que modifica la enfermedad (DMARD) , antagonista o anticuerpo de la integrina corticoesteroide y derivado de la purina- hipoxantina- 14. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el sujeto nunca ha sido tratado previamente con un anticuerpo CD20. 15. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, humano o humanizado. 16. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el anticuerpo comprende el rituximab. 17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en que el anticuerpo comprende el 2H7 humanizado. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en que el anticuerpo comprende el 2F2 (huMax-CD20) . El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el anticuerpo se administra intravenosamente, subcutáneamente o intratecalmente . El método de la reivindicación 19, en que el anticuerpo se administra intravenosamente. El método de la reivindicación 20, que comprende administrar el anticuerpo como una dosis en el intervalo de próximamente 200 mg a 2000 mg, a una frecuencia de alrededor de una a cuatro dosis dentro de un período de alrededor de un mes. El método de la reivindicación 21, en que la dosis está en el intervalo de aproximadamente 500 mg a 1500 mg . El método de la reivindicación 22, en que la dosis está en el intervalo de aproximadamente 750 a 1200 mg. 24. El método de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en que el anticuerpo se administra en una o dos dosis . 25. El método de la reivindicación 24, en que una o dos dosis se administran dentro de un período de aproximadamente 2 a 3 semanas . 26. El método de la reivindicación 1, en que el anticuerpo CD20 es el único medicamento administrado al sujeto para tratar la enfermedad de Alzheimer. 27. El método de la reivindicación 1, que consiste esencialmente de administrar el anticuerpo CD20 y un segundo medicamento, seleccionado del grupo que consiste del inhibidor de la colinoesterasa y el antagonista del D-aspartato de N. -metilo (NMDA), al sujeto para tratar la AD. 28. Un método para tratar la demencia en un sujeto, que comprende administrar un anticuerpo CD20 sin protección al sujeto, en una cantidad efectiva para tratar la demencia. 29. Un artículo de manufactura que comprende: (a) un contenedor, el cual compendie dentro del mismo el anticuerpo CD20 sin proteger; y (b) un inserto del paquete, con instrucciones para tratar la enfermedad de Alzheimer o demencia en un sujeto. 30. El artículo de manufactura de la reivindicación 29, que además comprende otro contenedor, que incluye un segundo medicamento, donde el anticuerpo CD20 es un primer medicamento y asimismo comprende instrucciones en el inserto del paquete para trata el sujeto con este segundo medicamento. 31. El artículo de la reivindicación 30, en que el segundo medicamento es un inhibidor de la colinoesterasa o un antagonista del D-aspartato de N- metilo (NMDA) .