MX2007012253A - Uso de ezetimibe para la prevencion y tratamiento de calculos de colesterol en la via biliar. - Google Patents

Abstract

La presente invencion divulga el uso de compuestos de la familia de azetidinona para prevencion o tratamiento de la enfermedad litiasica de la via biliar por calculos de colesterol en mamiferos. La presente invencion esta en el area general de la enfermedad litiasica por calculos de colesterol. Mas especificamente la invencion evidencia que la utilizacion de farmacos que bloquean en forma especifica la absorcion intestinal de colesterol, inhiben la formacion de la enfermedad por calculos de colesterol en la via biliar, disminuyendo la secrecion biliar de colesterol por una parte, e incrementando el flujo biliar y la secrecion hepatica hacia la bilis de compuestos endogenos (i.e. sales biliares, fosfolipidos) que a su vez contribuyen a inhibir la precipitacion del colesterol y la formacion de calculos en la via biliar.

Description

USO DE EZETIMIBE PARA LA PREVENCIÓN Y TRATAMIENTO DE CÁLCULOS DE COLESTEROL EN LA VIA BILIAR MEMORIA DESCRIPTIVA OBJETO DE LA INVENCIÓN La presente invención divulga el uso de compuestos de la familia de azetidmona para prevención o tratamiento de la enfermedad litiasica de la vía biliar por cálculos de colesterol en mamíferos. La presente invención está en el área general de la enfermedad litiásica por cálculos de colesterol. Más específicamente la invención evidencia que la utilización de fármacos que bloquean en forma específica la absorción intestinal de colesterol, inhiben la formación de la enfermedad por cálculos de colesterol en la vía biliar, disminuyendo la secreción biliar de colesterol por una parte, e incrementando el flujo biliar y la secreción hepática hacia la bilis de compuestos endógenos (í.e. sales biliares, fosfolípidos) que a su vez contribuyen a inhibir la precipitación del colesterol y la formación de cálculos en la vía biliar.

ARTE PREVIO La enfermedad litiásica por cálculos de colesterol en la vía biliar, específicamente de la vesícula biliar (colelitiasis) , es una enfermedad de muy elevada prevalencia en la población adulta de los países occidentales desarrollados (10 a 15% de la población mayor a 18 años) , y reviste caracteres epidémicos en la población hispana y nativa americana de la mayor parte de los países del área andina, incluidos Chile, Perú, Bolivia, Ecuador, México entre otros (Carey & Paigen, 2002; Everhart et al., 2002) . En Chile por ejemplo, hemos demostrado que la prevalencia general en hombres es de 17% y en mujeres de 30%, alcanzando prevalencias superiores al 50% de la población mayor de 50 años (Miquel et al., 1998a) . De este modo se ha estimado recientemente que en Estados Unidos, aproximadamente 20 millones de habitantes han padecido o padecen de esta enfermedad (Everhart et al., 1999), y en países como Chile, existen más de 2 millones de personas afectadas de colelitiasis . Este escenario epidemiológico hace que la enfermedad litiásica de la vía biliar sea la patología digestiva de más alto costo social en países como Estados Unidos, con un gasto anual estimado 8 a 10 billones de US$ o 1,3 a 1,5% de los costos totales en salud (Everhart, 1994) por concepto de gastos directos e indirectos. Por otra parte, en países en vías de desarrollo como Chile, la litiasis vesicular constituye la primera causa de hospitalizaciones quirúrgicas superada sólo por las indicaciones obstétricas, con un extremado alto costo social para los servicios de salud del país (Csendes et al., 1993; Medina, Pascual & Medina, 1983) .

La secreción biliar cumple importantes funciones fisiológicas en nuestro organismo, entre otras, eliminar moléculas esteroidales de nuestro organismo secretando colesterol y sales biliares, estas últimas productos catabólicos del colesterol. De hecho, la secreción biliar es la principal vía de eliminación de moléculas esteroidales de nuestro organismo, cumpliendo así un rol central en la homeostasis corporal de colesterol. Los mecanismos patogénicos de la enfermedad litiásica por cálculos de colesterol de la vía biliar, son aún sólo parcialmente conocidos. Se acepta como dogma que el primer defecto metabólico necesario para la formación de cálculos es la generación por parte del hígado, de una bilis muy rica en colesterol, término acuñado como "bilis sobresaturada de colesterol". La generación de una bilis sobresaturada de colesterol es así un defecto de estas funciones fisiológicas del metabolismo hepático de lípidos (Carey, 1993; Miquel et al., 1998b) . Los sujetos que desarrollan cálculos de colesterol presentan como defecto metabólico predominante un incremento selectivo en la secreción de colesterol a la bilis, en relación a las moléculas que pueden solubilizar colesterol en la bilis, es decir, sales biliares y fosfolípidos. Se genera así una solución biliar inestable termodinámicamente donde el colesterol tiende a salir de una fase soluble a una fase insoluble, con precipitación de cristales de colesterol y crecimiento de cálculos de colesterol, principalmente en la vesícula biliar donde se generan condiciones locales que favorecen la estasia y retención de estos cristales de colesterol (Apstein & Carey, 1996) . Se asume que en la generación de esta enfermedad metabólica crónica de origen multifactorial, participan tanto factores genéticos como ambientales. Sin embargo tanto los primeros como los segundos aún no han sido dilucidados (Paigen, 2002) . Debemos destacar que el colesterol biliar es fundamentalmente colesterol preformado derivado de lipoproteinas plasmáticas (y no de neosíntesis hepática) , sin embargo no está clara cual es la participación del colesterol de origen dietético (es decir intestinal) y/o del colesterol derivado de tejidos periféricos al hígado (transporte reverso de colesterol endógeno) en la generación de bilis sobresaturada y finalmente de cálculos de colesterol (Paigen, 2002) .

Una vez que se forman cálculos en la vesícula biliar esto son visibles fácilmente en exámenes de imágenes como una ecografía abdominal. Los cálculos pueden permanecer en la vesícula biliar (o vía biliar común) sin producir síntomas durante toda la vida (cálculos silentes) o bien evolucionar a formas sintomáticas simples (dolor tipo cólico biliar) o bien generar complicaciones clínicas de pronóstico más grave como colecistitis aguda, empiema vesicular, colangitis supurada o pancreatitis aguda, entre otras formas (Johnston & Kaplan, 1993) . A su vez la litiasis vesicular es el principal factor de riesgo para desarrollar cáncer de la vesícula biliar, una neoplasia digestiva de muy mal pronóstico y de elevada prevalencia en poblaciones con elevada prevalencia de litiasis vesicular, como en Chile, Perú, México y población nativa e hispana de Norte América (Nervi, 2001) .

Los principales factores de riesgo que se han descrito asociados a mayor frecuencia de desarrollo de colelitiasis en diferentes poblaciones estudiadas son: sexo femenino, ancestro genético amerindio, colelitiasis en parientes de primer grado, embarazos, obesidad o sobrepeso en mujeres, baja de peso brusco en obesos mórbidos, cirugía bapátrica en obesos mórbidos, diabetes mellitus, puerperio, ayuno prolongado, nutrición parenteral total, hipertpgliceridemia (Amigo et al., 1999; Paigen, 2002; Wudel et al., 2002). Los modelos animales desarrollan colelitiasis sólo en presencia de una dieta rica en colesterol (aproximadamente 100 a 1.000 veces la ingesta humana con dieta occidental) . Recientemente algunos modelos animales manipulados genéticamente han demostrado el rol crítico de la expresión de genes relevantes en la absorción intestinal de colesterol (ACAT-2) como de la destinación de coleterol de origen dietético al hígado en forma de quilomicrones (apolipoprotema E) en la generación de colelitiasis experimental .

El hígado es un órgano central en la regulación de la homeostasis del colesterol corporal. Es el principal órgano involucrado en la síntesis y el catabolismo de las lipoprsteínas plasmáticas y es el único órgano capaz de eliminar cantidades significativas de colesterol (y otras moléculas esteroidales) del organismo, ya sea como colesterol libre (aproximadamente lgr/día, Grundy S.M. 1983) o mediante su conversión o catabolismo a sales biliares (Dietschy, Turley & Spady, 1993) . Defectos en el metabolismo hepático de colesterol generan dos enfermedades altamente prevalentes, aterosclerosis y colelitiasis. Las células hepáticas poseen complejos mecanismos moleculares que regulan finamente la homeostasis de colesterol intracelular . Evidencias experimentales en hombres y animales han permitido estimar que el colesterol destinado a secreción biliar es preferentemente (85-95%) colesterol preformado, es decir, que se genera por la captación de lipoproteínas plasmáticas y sólo un 5-15% es colesterol de neosíntesis hepática (Vlahcevic, 1994). Estudios realizados en pacientes lítiásicos y controles arrojan resultados contradictorios en relación a la actividad de neosíntesis hepática de colesterol y neosíntesis de sales biliares revisión en (Apstein & Carey, 1996; Carey, 1993), sin embargo se acepta que en sujetos litiásicos el colesterol que es destinado en forma anormalmente alta para secreción biliar se origina preferentemente de un pool preformado de origen lipoproteico . El influjo de colesterol lipoprotéico hacia el hígado se puede originar de dos fuentes: a) por el transporte reverso de colesterol desde tejidos periféricos hacia el hígado en HDL y/o LDL (Fielding & Fielding, 1995) y b) el colesterol de origen exógeno (de la dieta) que es transportado desde el intestino hacia el hígado fundamentalmente como remanentes de quilomicrones (rQM) y lipoproteína de muy baja densidad (VLDL) (Wilson & Rudel, 1994) Cabe destacar que el colesterol absorbido a nivel intestinal puede ser a su vez de origen exógeno (proveniente de la dieta) o endógeno (colesterol biliar) . De hecho existen evidencias que permiten afirmar que el colesterol presente en la bilis y secretado al intestino es cuantitativamente más relevante (1000 mg/día) que el colesterol presente en una dieta occidental (200 a 400 mg/día) . A su vez, el colesterol presente en la bilis parece ser absorbido en forma más eficiente que el colesterol dietario. Existen evidencias en humanos que sugieren que el colesterol dietario o de origen intestinal pudiera ser muy relevante en la generación de una bilis litogénica en sujetos genéticamente susceptibles a desarrollar esta enfermedad. La mayor parte del colesterol depositado en los cálculos parece ser de origen dietético (Holzbach, 1984) . A su vez, otras evidencias apoyan el concepto que el colesterol de origen intestinal es destinado preferencialmente a secreción biliar facilitando la formación de bilis litogénica (Cooper, 1991) . Por ejemplo, la ingesta de una dieta rica en colesterol en personas portadoras de cálculos incrementa significativamente el contenido de colesterol en la bilis en las semanas posteriores (Kern, 1994) . Sólo un trabajo reportado ha comparado el efecto del colesterol dietético en mujeres litiásicas y controles, demostrando que sólo las mujeres litiásicas incrementan la secreción biliar de colesterol frente a una sobrecarga exógena de colesterol de origen dietético (Kern, 1994), sugiriendo que el colesterol dietético que puede ser destinado a secreción biliar es un proceso regulado probablemente por genes aún no definidos y estos mecanismos de regulación parecen estar alterados en pacientes que desarrollan colelitiasis.

En contraste con la casi completa absorción intestinal de la mayoría de otros nutrientes, la absorción de colesterol está limitada a un promedio de 40-60% del colesterol ingerido, con una gran variabilidad entre distintas especies (Jolley, Dietschy & Turley, 1999) y entre distintas personas (Gylling & Miettinen, 2002b) . Las diferencias porcentuales entre individuos en su capacidad de absorción de colesterol dietético puede ser tan alta como 4 a 6 veces (rango de 30 a 80%) para una cantidad similar de colesterol en la dieta, lo que contrasta con las variaciones intra- individuos en distintos tiempos bajo una misma dosis de colesterol dietético (< 6%) (Bosner et al., 1993) . Variaciones similares en la capacidad de absorber colesterol de origen dietético se observa en modelos animales, especialmente entre distintas cepas de ratones (Jolley et al., 1999) . En los últimos años esta variabilidad en la capacidad de absorber colesterol de origen dietético ha adquirido gran relevancia, no solo desde un punto de vista del conocimiento de la fisiología del metabolismo del colesterol, sino también en la perspectiva de diseñar alternativas terapéuticas más eficientes en el tratamiento de las dislipidemias y aterosclerosis (Gylling & Miettinen, 2002a) . En los últimos años ha sido posible aclarar al menos parcialmente los mecanismos moleculares que gobiernan y regulan la absorción intestinal de colesterol (Klett & Patel, 2004).

El desarrollo de compuestos que interfieran con la absorción de colesterol ha adquirido gran relevancia en los últimos años, en la perspectiva que la estrategia contribuya al tratamiento de las hipercolesterolemia y enfermedad aterosclerótica. Los compuestos evaluados pueden ser clasificados en tres categorías de acuerdo a su sitio de acción: A) Aquellos que interfieren con la absorción intestinal a nivel intra- lumnial , como resinas tipo colestiramina y saponinas naturales y sintéticas, B) drogas que interfieren con la entrada de colesterol al enterocito, tipo 2-azetidinonas (ezetimibe) y C) drogas que interfieren con la esterificación del colesterol incorporado al enterocito, inhibiendo a la enzima ACAT- 2 específicamente. Sólo las primeras y 2 -azetidinonas están siendo utilizadas actualmente en la práctica clínica para el tratamiento de las dislipídemias y prevención de enfermedades cardiovasculares.

EZETIMIBE (SCH 58235, ((-)- 1 - (4 - fluorophenyl )-( 3R) -[3 - (4-fluorophenyl) - (3S) -hydroxypropyl]- (4S) - (4-hydroxyphenyl) -2 -azetidinone) ) es la primera droga de una clase de fármacos hipocolesterolémicos, los inhibidores específicos de la absorción de colesterol (Klett & Patel, 2004), derivado de la clase estructural de las 2-azetidinonas . Fue aprobado por "US Food and Drug Administration" en octubre de 2002, bajo la marca registrada de Ezetrol®- MSD-Schering-Plough y Zetia®, de Merck/Schering Plough, North ales, Pennsylvania. Ezetimibe (SCH 58235) corresponde a la segunda generación de inhibidores específicos de la absorción intestinal de colesterol, el cual fue generado a partir de modificaciones estructurales y metabolitos de SCH 48461 y SCH 53695 (SCH 53695 es el C-4 fenol de SCH 48461) . Ezetimibe es un metabolito derivado de las formas activas de SCH 48461, con una actividad inhibitoria de la absorción de colesterol 400 veces mayor a su análogo predecesor (SCH 48461) . Este incremento en la actividad inhibitoria de la absorción de colesterol ha sido atribuida a la incorporación de átomos fenólicos en SCH 48461 (Jeu & Cheng, 2003) Ezetimibe ha demostrado inhibir efectivamente la absorción intestinal de colesterol en modelos mamíferos (modelos murmos) en dosis que fluctúan entre 0,1 a 6 mg/kg de peso corporal por día. Ezetimibe está indicada como uso de monoterapia o terapia combinada a inhibidores de la HMG-CaA- reductasa (estatmas) en el tratamiento de las hipercolesterolemias primarias para reducir el colesterol total, colesterol LDL y ApoB . También está indicada como terapia combinada en pacientes con hipercolesterolemia familiar homozigota, y como monoterapia en pacientes con sitosterolemia familiar homozígota (Cheng & Leiter, 2003; Davídson, 2003; Iglesias & Diez, 2003; Lipka, 2003) . La terapia combinada con 2-azetidmonas asociada a inhibidores de la HMG-CaA-reductasa (estatmas) tales como pravastatma, simvastatina, rosuvastatina, lovastatina, fluvastatina, atorvastatina y cerivastatina, se basa en que la inhibición selectiva de la absorción intestinal de colesterol y por ello una reducción en el contenido hepático de colesterol tiene como efecto asociado compensatorio en el ser humano, un incremento en la neosíntesis de colesterol a nivel hepático; por ello, al asociarse con un inhibidor selectivo (estatinas) de la enzima crítica en la cascada neosintética de colesterol, HMG-CaA-reductasa, se potencia el efecto reductor del colesterol plasmático. La terapia combinada con 2-azetidinonas más inhibidores de la HMG-CaA-reductasa en la patología que concierne a esta invención (colelitiasis) no ha sido evaluada y no existen comunicaciones en la literatura científica y médica al respecto. El mecanismo de acción íntimo de ezetimibe como inhibidor selectivo de la absorción de colesterol no se conoce aún con exactitud. Se postula que actúa inhibiendo la entrada de colesterol desde el lumen intestinal al enterocito, actuando a nivel de la membrana plasmática apical del enterocito e interactuando a este nivel con algunas proteínas involucradas en mecanismos de tráfico de colesterol (Klett & Patel, 2004). Ezetimibe se incorpora al enterocito, es glucuronizado a este nivel a su metabolito activo, y entra en el circuito entero-hepático de lípidos (Jeu & Cheng, 2003) . Si bien es captado con alta afinidad por el hígado y secretado activamente hacia la vía biliar alcanzando elevadas concentraciones en la bilis, se desconoce si este compuesto cumple funciones adicionales en el transporte de moléculas esferoidales (e colesterol) a nivel hepático y de la vía biliar Hoy día se acepta umversalmente que la única terapia efectiva para el tratamiento de la colelitiasis es la resección quirúrgica de la vesícula biliar con sus cálculos (colecistectomía) (Gui et al., 1998) Sin embargo se han desarrollado algunas alternativas farmacológicas de tratamiento (no quirúrgicas) que han demostrado eficacia en la disolución de cálculos en subgrupos específicos de pacientes con colelitiasis (Hillebrant et al., 2002; Stiehl et al , 1984) y en algunos grupos específicos de pacientes con alto riesgo a desarrollar colelitiasis (Masón & Renquist, 2002; udel et al., 2002). Las alternativas médicas consisten en la disolución de cálculos vesiculares de colesterol mediante el uso de sales biliares, ácido quenodeoxicólico y ursodeoxicólico (Sugata, 1993) El más utilizado mternacionalmente ha sido el ursodeoxicólico por presentar menores tasas de efectos adversos con igual eficacia. Actúan incrementando el contenido biliar de sales biliares y disminuyendo la secreción hepática de colesterol, lo que genera una bilis no saturada de colesterol, permitiendo la solubilización de cálculos de colesterol. Ha demostrado ser una terapia efectiva en pacientes con cálculos de colesterol pequeños, sin embargo se requieren periodos prolongados de terapia (6 a 12 meses) y su suspensión se asocia a una elevada tasa de recurrencia de los cálculos (50% a 5 años) (Bilhartz, 1988; Stiehl et al., 1984). También se ha explorado la asociación de ácido ursodeoxicólico con estatinas (inhibidores de la neosíntesis de colesterol) para estos fines, sin embrago la eficacia de la terapia no ha sido demostrada (Hillebrant et al., 2002; Miettinen et al. , 1998) . Se ha evaluado la potencial utilidad de otros fármacos hipolipemiantes en el tratamiento de la colelitiasis de colesterol, sin efecto clínico demostrado. Tanto el uso de fibratos, niacina o resinas que disminuyen la absorción intestinal de sales biliares y colesterol (colestiramina, probocol) no han demostrado utilidad terapéutica efectiva en pacientes con enfermedad por cálculos vesiculares de colesterol. Aún más, el uso de terapias hipolipemiantes (que disminuyen el colesterol plasmático) con fibratos en humanos (específicamente clofibratos) incrementa claramente el riesgo a desarrollar colelitiasis (Amigo et al., 1999; Apstein & Carey, 1996). Por otro lado, el uso de inhibidores de la enzima HMG-CoA reductasa (estatinas) han mostrado resultados contradictorios en modelos preclínicos y clínicos. En algunos modelos experimentales y en algunos estudios en humano (pero no en todos) reducen el contenido de colesterol biliar y el índice de litogenicidad, sin embargo no han demostrado ser de utilidad para disolver cálculos de colesterol en estudios clínicos prospectivos (Chapman et al., 1998; Hillebrant et al., 2002; Porsch-Ozcurumez et al., 2001).

El problema de la técnica consiste en que en la actualidad no hay formas eficaces de prevención primaria de colelitiasis en la población general o en grupos específicos de alto riesgo (mujeres, tercer trimestre de embarazo y puerperio, mujeres con sobrepeso u obesas, ba a de peso programado en obesos mórbidos, gastroplastía y by pass intestinal en obesos mórbidos, ayuno prolongado, terapia nutpcional enteral prolongada) , como tampoco terapias médicas eficaces (í.e. disolución de cálculos vesiculares ya formados) Es sabido que los compuestos 2 -azetidinonas y sus respectivas familias se usan en el tratamiento de colesterol plasmático elevado y que están protegidos por diversas patentes, por ejemplo los documentos US 5,631,365, WO 2004 010948, WO 2004 081002, WO 2004 000803, WO 2004 000804, WO 2004 000805, divulgan el uso del ezetimibe para tratar un desorden del colesterol, como hipercolesterolemia, la arteriosclerosis o tumores inducido por colesterol. Si bien la litiasis biliar de colesterol es una enfermedad del metabolismo del colesterol, no existe una clara correlación entre niveles plasmáticos de colesterol total o colesterol LDL o aterosclerosis con la presencia de colelitiasis o con mayor riesgo a desarrollar colelitiasis. Por ello, las distintas terapias desarrolladas para el tratamiento de la hipercolesterolemia o dislipidemias , principal factor de riesgo de enfermedad cardiovascular aterosclerótica, no han demostrado ser efectivas en el tratamiento y/o prevención de la colelitiasis de colesterol. Sólo la hipertrigliceridemia y niveles plasmáticos bajos de colesterol HDL se han asociado en algunos estudios a mayor riesgo de colelitiasis , sin que se haya demostrado una relación causal entre estas variables serológicas y el desarrollo de colelitiasis (revisión actual en (Paigen, 2002) ) .

Por lo anterior, la presente invención viene a solucionar un problema de la técnica, ya que no es obvio derivar que las técnicas actualmente desarrolladas para el tratamiento de las dislipidemias plasmáticas y/o aterosclerosis tengan utilidad en el tratamiento de la colelitiasis .

En los documentos WO2004001002 y US20030153541 se menciona un compuesto 2 -azetidmona en combinación con otros compuestos y su uso para el tratamiento de cálculos de colesterol o coleolitiasis . Específicamente reivindican una composición farmacéutica que comprende un modelador de un receptor LXR y un agente de regulación de lípidos, como por ejemplo ezetimibe. El receptor nuclear huérfano LXR actúa como un regulador de la transcripción de genes involucrados en el metabolismo y tráfico de colesterol. En particular al unirse a ligandos endógenos (oxiesteroles) o ligandos sintéticos, por una parte inhiben la síntesis de colesterol en las células (especialmente en el hígado) y por otra estimulan el catabolismo del colesterol a sales biliares y la salida de colesterol hacia la bilis en el hígado de roedores (Yu et al., 2003) . Se ha demostrado en modelos experimentales animales (roedores) que la activación de este receptor nuclear LXR disminuye los niveles plasmáticos de colesterol, especialmente bajo dietas experimentales ricas en colesterol y que incrementan el contenido de colesterol en la bilis de los ratones, por estímulo de genes específicos denominados ABCG5 y ABCG8. Esto no ha sido demostrado aún en el hombre ya que no existen aún fármacos disponibles y aprobados para el uso en humanos. Por las evidencias disponibles en animales experimentales, el uso de fármacos que estimulan LXR, podrían incluso incrementar el riesgo a formar cálculos de colesterol en la vía biliar, ya que el estímulo de LXR incrementa el contenido de colesterol en la bilis (Yu et al., 2003) . No hay evidencias en la literatura que el uso de ligandos sintéticos (es decir, farmacológicos) de LXR, solos o en combinación con ezetimibe, inhiban la formación de cálculos de colesterol en la vía biliar.

El documento WO 2005 00217 divulga una composición que comprende un agente contra la obesidad y un anti-dislipidémico, entre ellos un inhibidor de la absorción de colesterol como ezetimibe. La composición está indicada para su uso para desordenes relacionados como dislipidemia. El documento WO2004078716 describe derivados de piperazmas y su uso como agonistas del receptor de melanocortma (MC-R) , indicado para tratar la obesidad. Asimismo, el documento WO2004030637 reivindica moduladores del receptor- 5 metabotrópico de glutamato (mGluR5) útiles en tratar desordenes asociados con la obesidad. En la memoria descriptiva se mencionan "Agentes contra la obesidad adecuado para usarlas en combinaciones con un modulador de mGluR5, incluyen sin limitarse entre otros a agentes que bajan el colesterol tales como inhibidores de la absorción de colesterol como 2-azet?dmonas tal como ezetipube." El documento WO2004031175 divulga compuestos con acción antagonista a receptores NPY, especialmente receptores NPY Y5 Los compuestos son agentes útiles para el tratamiento de distintas enfermedades relacionados con NPY, entre ellos por ejemplo, el mal de la vesícula biliar. Asimismo, se puede tratar la obesidad y problemas médicos asociados, como por ejemplo cálculos en la vesícula Como ejemplos de otros ingredientes activos que se pueden administrar en combinación con las composiciones de la invención, se menciona ezetimibe.

El sobrepeso (índice de masa corporal, IMC, >25 kg/mt2) y la obesidad (IMC >28) son factores de riesgo establecidos para el desarrollo de colelitiasis principalmente en mujeres, siendo esta evidencia menos clara en hombres. El sobrepeso y la obesidad incrementan el riesgo de colelitiasis 2 a 3 veces en mujeres no así en hombres. Por otra parte, la reducción brusca de peso (>1,5 kg/semana) en obesos mórbidos (IMC >35) , ya sea mediante tratamiento dietético hipocalórico (aproximadamente 1.000 kcal/día) o mediante cirugía bariátrica, incrementan a su vez el riesgo a desarrollar colelitiasis, y se ha descrito que entre un 20 a 40% de estos sujetos pueden desarrollar colelitiasis en las semanas o meses posteriores. No está clara la razón por la cual sólo algunos sujetos con sobrepeso u obesidad desarrollan colelitiasis (20 a 30% según las series) , y se ha postulado que otros factores ambientales y/o genéticos determinan esta susceptibilidad (revisión actual en (Paigen, 2002) y referencias allí señaladas . Sin embargo se debe destacar que la mayor parte de la población que desarrolla colelitiasis no sufre de sobrepeso ni obesidad y por lo tanto esta asociación está lejos de ser universal. Es probable que el tratamiento de la obesidad per se con las técnicas actuales pueda incluso incrementar el riesgo a desarrollar colelitiasis en esos sujetos, pero por otra parte la prevención de esta condición metabólica pudiera disminuir al menos en parte la frecuencia de la enfermedad en la poblaciones de alto riesgo (genéticamente susceptibles) .

Por lo anterior, la invención actual viene a solucionar un problema de la técnica ya que no es obvio derivar que las técnicas actualmente desarrolladas para el tratamiento de la obesidad mórbida y/o el sobrepeso tengan utilidad en el tratamiento y/o prevención de la colelitiasis .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIGURA 1 muestra la inhibición de la formación de cristales de colesterol y cálculos de colesterol en ratones C57BL/6 que reciben dieta litogénica por 14 días.

La FIGURA 2 (A) muestra el perfil lipoproteico de plasma de ratones C57/BL6 en Dieta Chow a los 14 días con y sin Ezetimibe (VLDL, lipoproteínas de muy baja densidad; LDL, lipoproteínas de baja densidad; IDL, lipoproteínas de densidad intermedia; HDL, lipoproteínas de alta densidad) .

La FIGURA 2 (B) muestra el perfil lipoproteico de plasma de ratones C57/BL6 en dieta litogenica a los 14 días con y sin Ezetimibe (VLDL, lipoproteínas de muy baja densidad; LDL, lipoproteínas de baja densidad; IDL, lipoproteínas de densidad intermedia; HDL, lipoproteínas de alta densidad) .

La FIGURA 3 (A) muestra el flujo biliar en ratones C57BL/6 que recibieron dieta chow o litogénica con o sin Ezetimibe. La FIGURA 3 (B) muestra la concentración biliar de colesterol para los ratones con la dieta arriba indicada; FIGURA 3 (C) la secreción biliar de colesterol; FIGURA 3 (D) la concentración de ácidos biliares en la bilis, FIGURA 3 (E) la secreción biliar de ácidos biliares; FIGURA 3 (F) la concentración de fosfolípidos en la bilis y la FIGURA 3 (G) la secreción biliar de fosfolipidos para la misma dieta indicada. (*, p significativo <0,05 respecto a su grupo control; &, p<0,05 respecto al grupo con dieta litogénica sin ezetimibe) .

La FIGURA 4 muestra la secreción biliar de glutatión en ratones C57/BL6 en dieta litogénica con y sin Ezetimibe. (*, p<0,05 respecto a grupo dieta litogénica más agua).

La FIGURA 5 muestra como el Ezetimibe inhibe la formación de cristales de colesterol y cálculos de colesterol en ratones C57BL/6 que reciben dieta litogénica por 30 días.

La FIGURA 6 muestra los niveles de expresión proteica hepática (iVestern Blots) de transportadores críticos de sales biliares, Bsep (FIGURA 6 A) y Ntcp (FIGURA 6 B) en los ratones con dieta control y litogénica, con o sin Ezetimibe. Se demuestra que Bsep no cambia significativamente con Ezetimibe en ambas dietas. Ntcp disminuye su nivel de expresión bajo dieta litogénica, pero esta disminución es significativamente más atenuada con Ezetimibe (*, p<0,05 en relación a dieta chow control; &, p<0,05 en relación a dieta litogénica más agua).

La FIGURA 7 muestra los niveles de expression de RNA mensajero de MDR2 , MRP y G-GCS en hígados de ratones bajo dieta litogénica sin o con Ezetimibe. La cuantificación de las bandas radioactivas específicas del análisis de los Northen blots mostradas como unidades relativas a 18S. El análisis cuantitaivo de los Northern muestran que solo el transportador de fosfolípidos MDR2 , muestra una disminución discreta pero significativa.

La FIGURA 8 : muestra que el RNA extraído estaba íntegro en las diferentes muestras a analizar, en ratones con dieta litogénica con y sin Ezetimibe.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención demuestra que el uso de inhibidores específicos de la absorción intestinal de colesterol del tipo 2-AZETIDINONAS, específicamente EZETIMIBE (SCH 58235), inhibe completamente la formación de colelitiasis en un modelo murino de la enfermedad bajo dieta litogénica. Esta invención en un modelo preclínico de la enfermedad litiásica por cálculos de colesterol permite predecir que el bloqueo selectivo de la absorción intestinal de colesterol constituye una alternativa terapéutica eficaz en la prevención primaria y/o en el tratamiento de la colelitiasis en humanos. A su vez, como se argumentó en la sección del arte previo, es posible predecir que en humanos la combinación de ezetimibe (SCH 58235) más inhibidores de la neosíntesis hepática de colesterol (inhibidores de HMG-CoA reductasa) , pudieran ser más eficaces que ezetimibe (SCH 58235) sólo para prevenir y/o tratar la litiasis vesicular.

EJEMPLO DE APLICACIÓN MATERIALES Y MÉTODOS Modelos Experimentales Animales de la Enfermedad. La colelitiasis espontánea es excepcional en animales de experimentación o silvestres, probablemente porque estos animales estudiados secretan bajas concentraciones de colesterol a la bilis, con bilis no saturadas de colesterol. Bajo dietas experimentales ricas en colesterol, o ricas en colesterol más triglicéridos y sales biliares (acido cólico) diferentes modelos animales (conejos, hámster, perro de la pradera, ardillas y ratones) desarrollan colelitiasis de colesterol similar a la enfermedad en humanos. El modelo mejor caracterizado es el del ratón experimental donde el desarrollo de colelitiasis es dependiente de una dieta denominada "litogénica" (1,25% colesterol, 0,5% ácido cólico, 15% grasa) . Bajo estas condiciones la mayor parte de las diferentes cepas de ratones disponibles desarrollan colelitiasis de colesterol en porcentajes variables y tiempos variables (Paigen, 2002) . Se ha establecido la existencia de cepas más susceptibles o más resistentes a desarrollar colelitiasis, lo cual estaría genéticamente determinado. Las cepas de ratones C57L y C57BL/6 son particularmente susceptibles a desarrollar colelitiasis (80 a 100% en 2 a 4 semanas de dieta litogénica) (Paigen, 2002) (Bouchard et al., datos no publicados pero comunicados en www.jax.org/pub-cgi/phenome). Los estudios en estos modelos animales han sido determinantes en los últimos años para comprender mejor la patogenia de esta enfermedad y para el descubrimiento de genes potencialmente relevantes en generar susceptibilidad a la enfermedad (Paigen, 2002) . La sepa de ratón C57BL/6 fue la utilizada en este trabajo preclínico de innovación.

Se utilizaron ratones susceptibles al desarrollo de colelitiasis C57BL/6J obtenidos originalmente de Jackson Corp (Bar Harbor, ME, USA) y las colonias desarrolladas en nuestro laboratorio de Gastroenterología, Facultad de Medicina, P. Universidad Católica de Chile. A los grupos experiemtales se les administró una dieta control chow pobre en colesterol (<0,02% colesterol, Prolab RMH3000, PMI Feeds Inc., St. Louis, MO) o dieta litogénica (1,25% colesterol, 0,5% ácido cólico, 15 % grasa, TD90221, Harían Teklad, Madison, Wl) (Amigo et al., 2000). A su vez a estos ratones se les administró ezetimibe (Zetia®, Merck/Schering Plough) o placebo. En el protocolo N°l las tabletas Zetia® fueron pulverizadas en un mortero de porcelana y disuelto en agua para ser administrado a los ratones en una dosis única diaria (08hrs) de 5mg/kg peso vía gavage en volumen final de 200µl; a los grupos controles se les administró el mismo volumen de agua vía gavage sin droga. En el protocolo Nc2, las tabletas Zetia® fueron pulverizadas de la misma forma, disueltas en 200cc de etanol 100% (Merck) y agregadas a dieta litogénica previamente molida y secada por 48hrs a temperatura ambiente. Los ratones C57BL/6J recibieron esta dieta litogénica+Zetia® en dosis estimada de 5 a 6mg/kg/día por 30 días (ratones consumen 4 a 5gr de dieta por día) . El grupo control recibió la misma dieta litogénica molida, agregando sólo etanol puro (200cc) y secada por 48hrs. Los ratones durante el estudio mantienen una temperatura ambiental controlada, con ciclo luz día/noche de 09-21hrs y 21-09hrs, respectivamente y acceso libre a agua y alimento. Cuatro grupos de ratones machos (5 a 10 por grupo) de 8 a 10 semanas de edad, fueron puestos en las siguientes dietas experimentales: Protocolo N°l: Grupo 1-A: Dieta chow control más agua en gavage (n=10) Grupo 1-B: Dieta chow control más ezetimibe 5mg/kg peso día en gavage (n=10) Grupo 2 -A: Dieta litogénica más agua en gavage (n=10) Grupo 2-B: Dieta litogénica más ezetimibe en gavage (n=10) . Protocolo N°2: Grupo 1: dieta litogénica por 30 días (n=5) . Grupo 2: dieta litogénica más Ezetimibe, 5-6mg/kg/día por 30 días (n=5) .

Cirugía y toma de muestras : Los grupos fueron mantenidos por 14 día (protocolo N°l) o 30 días (protocolo N°2) en las diferentes modalidades experimentales. Durante los 3 días previos al término de los protocolos se recolectó deposiciones de 24 hrs de los diferentes grupos (pool) para determinación de excreción fecal de esteróles neutros (colesterol) y esteróles ácidos (sales biliares) . Al término de las dietas por el tiempo señalado en cada protocolo los ratones fueron anestesiados (entre las 08 a lOhrs) mediante una inyección de pentobarbital intraperitoneal en dosis de 4 , 5mg por lOOgr de peso corporal (Amigo et al., 2000) y sometidos a cirugía. La cirugía estandarizada consiste en una laparotomía amplia y visualización de órganos abdominales, incluido el hígado, vía biliar y vesícula biliar. Se procede a realizar primero una resección de la vesícula biliar (colecistectomía) , con conducto cístico previamente ligado (Amigo et al., 2002, Amigo et al., 2000; Amigo et al., 2003b) La vesícula biliar se extrae, explora visualmente para determinar la presencia de cálculos; luego se extrae la bilis vesicular para análisis de presencia de cristales de colesterol en la muestra fresca bajo microscopio óptico con luz polarizada (20x) y se guardan alícuotas a -20°C para análisis químicos posteriores. Luego la vía biliar común es canulada (fístula biliar) con una cánula de polietileno P-10 para recolectar bilis por 15 minutos, determinar flujo biliar por gavimetría (lg de b?l?s=lml; se expresa el flujo como µl/mm/gramo de hígado de ratón) y para posterior análisis químicos de lípidos biliares y glutatión biliar, como se especifica más abajo. Posteriormente se extrae el hígado el cual es pesado y luego congelado en nitrógeno líquido y mantenido a -80°C para posteriores análisis. Se punciona la vena cava inferior con una jeringa de tuberculma hepapnizada, se extrae 500 a 800µl de sangre, se separa plasma por centrifugación a 1 500 rpm y se guarda a -80 °C para posterior análisis. Los protocolos en animales han sido aprobados por el comité de ética de nuestra Institución y los animales tratados de acuerdo a normas internacionales de cuidado de animales de experimentación.

Determinación de litiasis vesicular y cristales de colesterol en bilis vesicular: La presencia o ausencia de cálculos de colesterol en la vesícula biliar de ratones se determina por visualización óptica simple, dado que la vesícula biliar es translúcida y permite ver fácilmente la presencia de estructuras particuladas en su interior (cálculos o sedimento particulado) . Para determinar la presencia de cristales monohidrato de colesterol típicos, lOµl de bilis vesicular fresca se colocan en un portaobjeto y se analiza bajo microscopía óptica bajo luz polarizada con magnificación lOx a 20x. Los cristales de colesterol se observan típicamente como cristales birefringentes con apariencia de vidrios rotos (Amigo et al., 2000; Miquel et al., 1998b; Moschetta, Bookout & Mangelsdorf , 2004) .

Absorción intestinal de colesterol y sales biliares: La capacidad de ezetimibe de inhibir la absorción de colesterol y sales biliares fue determinado indirectamente mediante la cuantificación de esferoides neutros (Colesterol) y ácidos (ácidos biliares) en las deposiciones, respectivamente, presentes en las deposiciones recolectadas entre el día 12, 13 y 14 de experimentación (3 días) . Para determinar la escreción fecal de colesterol (o esteróles neutros) , las fecas son secadas a 50°C por 3 días y posteriormente pesadas obteniéndose un promedio de deposiciones por días (en gramos) . Las deposiciones son homogenizadas en mortero y se toman 100 mg de peso seco, a los cuales se agrega 5 ml de NaOH 2N/Metanol 1:1. La muestra es vortexeada y posteriormente saponificada incubándose a 60°C por 1 hora. Las muestras son enfriadas y se agregan 5 ml de éter de petróleo, se agitan vigorosamente obteniéndose la separación de las fases hidrofóbica e hidrofilica. Luego son centrifugadas a 1.000 rpm por 10 minutos y la fase hidrofóbica (superior) es recuperada, se agrega 5 ml de éter de petróleo a la fase hidrofílica y se realiza otra extracción y este procedimiento se repite una vez mas. Las fases hidrofobicas obtenidas son secadas bajo nitrógeno gaseoso y los lípidos contenidos son resuspendidos en 1 ml de cloroformo. De esta mezcla se toman 50 µl en duplicado, se secan a temperatura ambiente y se cuantifica el colesterol total de acuerdo al método enzimático antes señalado. Los valores obtenidos se expresan como umoles colesterol/día/100 gramos de ratón (Miettinen T et al.

Quantitative isolation and gas-liquid chromatography analysis of total dietary and fecal neutral steroids. J.Lipid.Res. 1965. Vol 6. Pag 412-24.). Para determinar la escreción fecal de ácidos biliares se recolectaron las heces de los ratones por 3 días (día 12 a 14) , posteriormente esta se seca a 50°C por una semana y se pesa. Las heces son homogenizadas en mortero y se pesa 1 gramo al cual se agrega Acido Cólico (1C) 200.000 cpm para determinar el grado de recuperación. Las muestras luego son mezcladas con Borohidruro de sodio, NaOH y HCl disueltos en etanol e incubadas a 120°C por 8 horas en un sistema de reflujo. Las muestra de heces hidrolizadas son resuspendidas en NaOH/etanol y secadas bajo N2 gaseoso. El pellet obtenido es resuspendido en etanol y pasados a través de columnas de Sep-Pak por las cuales se eliminan todos los contaminantes que no sean sales biliares. Posteriormente, las sales biliares son eluidas con una mezcla Metanol/H20 85:15 y luego secadas bajo N2 gaseoso. Las muestras luego se resuspenden en metanol y se toman alícuotas en duplicado, las cuales son secadas a temperatura ambiente y luego se mide sales biliares usando Hidroxiesteroide Deshidrogenasa tal cual se miden en bilis. Se corrige el valor obtenido por la recuperación de ácido cólico 14C (Mendez-Sanchez N et al.. Ursodeoxycholate acid and cholesterol induce enterohepatic cycling of billirubm ín rodents . Gastroenterology 1998, Vol 115: pag 722-32) .

Determinación de colesterol plasmático, lípidos biliares y glutatión biliar: El contenido de colesterol en plasma y colesterol, sales biliares y fosfolípidos en la bilis vesicular y hepática fueron determinadas mediante técnicas enzimáticas. Para determinar la concentración de colesterol biliar se toman 5 µl de bilis hepática o 1 µl de bilis vesicular al cual se agregan 500 µl de buffer conteniendo Tris-HCl pH 7,6, Fenol , Clorofenol, Tritón X-100, colato de sodio, ammoantipirina y las enzimas Colesterol Esterasa, Colesterol Oxidasa y Peroxidasa. Esta mezcla de reacción se incuba por 10 minutos a 37°C y posteriormente se cuantifica la absorbancia a 500 nm. Los valores obtenidos se interpolan a una curva estándar preparada a distintas concentraciones de Colesterol. El colesterol plasmático se cuantifica de la misma forma a partir de 5 ul de plasma (Abell, L.L. et al . A simple method for estimation of total cholesterol ín serum. Clin. Chem. 1974, Vol 20. Pag 470). La concentración de sales biliares se se determina a partir de 2 ul de bilis hepática o 1 µl de bilis vesicular al cual se agrega 1 ml de buffer Fosfato de Potasio pH 8,0 conteniendo Hidrato de Hidracina, NAD y la enzima hidroxiesteroide deshidrogenasa. Esta mezcla de reacción se incuba a 30°C por 30 minutos y posteriormente se cuantifica la absorbancia en rango UV a 340 nm. Los valores obtenidos se interpolan a una curva estándar preparada a distintas concentraciones de Taurocolato (Talalay P.. Enzymatic análisis of steroid hormones. Methods Biochem Anal. 1960, Vol 8. pag 119-43) . La concentración de fosfatidilcolina (fosfolípidos) en la bilis se determina a partir de 5 µl de bilis hepática o 1 µl de bilis vesicular al cual se agrega 1 ml de buffer conteniendo Tris-HCl pH 7.6, Fenol, Aminoantipirina, Tritón X-100, CaCl2 y las enzimas Fosfolipasa D, Colina Oxidasa y Peroxidasa. La mezcla de reacción se incuba a 37°C por 10 minutos y posteriormente se cuantifica la absorbancia a 500 nm. Los valores obtenidos se interpolan a una curva estándar preparada a distintas concentraciones de Fosf tidilcolina (Gurantz T et al. Enzymatic measurement of choline-containing phospholipids in bile. J. Lipid.Res. 1981, Vol 22. Pag 373-6) . Determinación de Débito de lípidos biliares: En cada caso antes señalado el valor de concentración obtenido en mM es expresado en términos del débito, lo cual indica la cantidad de cada lipido secretado hacia la bilis por unidad de tiempo en relación al peso del hígado o del ratón. El cálculo del débito se realiza multiplicando el valor de concentración de cada lípido por el flujo biliar. El glutatión biliar fue cuantificado a partir de bilis obtenida por canulación de la vía biliar por un período de 5 minutos utilizando tubos que contienen 5 µl de ácido sulfosalícilico . De estas muestras de bilis se tomaron alícuotas en duplicado y se diluyeron 1/60 en ácido sulfosalícilico. La reacción enzimática para medir glutatión se realizó agregando buffer fosfato de sodio conteniendo EDTA, DNTB , NADPH y la enzima GSH reductasa. Esta mezcla fue incubada a 37°C y se realizó una curva de cinética enzimática utilizando como estándar GSH a distintas concentraciones, las muestras fueron medidas a 412 nm. La actividad enzimática obtenida fue transformada a concentración de glutatión presente en la bilis. Una vez obtenido los valores de concentración de glutatión biliar, se obtuvo el ébito de glutatión, tal como se describió anteriormente para lípidos biliares (Anderson M. Determination of glutathione disufide in biological samples. Methods of Enzymology 1985, Vol 113. pag 548-55).

Determinación de índice de Saturación de Colesterol en muestras de bilis vesicular: El índice de saturación de colesterol en bilis vesicular se obtuvo utilizando las concentraciones de cada lípido biliar (colesterol, sales biliares y fosfatid lcolma) . A partir de estas concentraciones de determina la cantidad de lípidos totales, la relación Fosfolipidos/ (sales biliares-fosfolipidos) y el % molar de colesterol. Utilizando estos datos y una tabla específica para calcular el índice de saturación se determinó el índice de saturación de colesterol como ha sido descrito previamente (Carey MC.. Critical tables for calculating the colesterol saturation of native bile. J.Lipid.Res 1978, Vol 19: pag 945).

Perfil lipoprotéico plasmático: Para caracterizar el perfil de lipoproteínas plasmáticas, se juntan 40 µl de suero de 5 ratones por grupo (pool de 200 µl para cada grupo experimental) , y las muestras son eluidas en una columna de sepharosa 6B (sistema Fast Presure Liquid Chromatography, FPLC, de Pharmacia) donde las lipoproteínas son separadas de acuerdo a su tamaño en las diferentes fracciones que se recolectan del eluido (37 fracciones de 300µl cada una) . En cada fracción se cuantifica el contenido de colesterol, lo que permite conocer como se distribuyen las lipoproteínas más grandes (VLDL, IDL/LDL) y las más pequeñas (HDL) . Para ello, a cada fracción obtenida se agregan 200 µl de mezcla de reacción para medir colesterol total (sin diluir con H20) . La reacción enzimática se realiza exactamente co o se describió para colesterol biliar. El valor obtenido en cada fracción se expresa como µg de colesterol por fracción.

Determinación de colesterol hepático: El contenido de colesterol hepático se cuantifica a partir de un segmento de tejido hepático (50 mg) el cual es homogenizado en una mezcla de cloroformo/metanol 2:1. El homogenizado obtenido es incubado a 50°C por 30 minutos y posteriormente se agrega H20 destilada para separar las fases; la mezcla es vortexeada e incubada a 4°C por 2 horas. Posteriormente la mezcla se centrífuga a 1.000 rpm por 20 minutos y la fase inferior (hidrofóbica-cloroformo) es extraída y secada bajo nitrógeno gaseoso. Los lípidos contenidos en la pared del tubo son resuspendidos en cloroformo conteniendo Tritón X-100 0,5% v/v. De esta mezcla se toman cuatro alícuotas y se secan a temperatura ambiente. A la mitad de los tubos se mide el contenido de colesterol total por método enzimático antes señalado (ver colesterol biliar) y la otra mitad se mide colesterol libre en un buffer conteniendo Tris-HCl pH 7,6, Tritón X-100 0,2%, fenol, aminoantipirina y las enzimas colesterol oxidasa y peroxidasa. Las muestras se incuban y se cuantifican de la misma forma que se mide colesterol total. El contenido de colesterol ester de cada muestra se calcula como la diferencia entre el colesterol total y colesterol libre : Colesterol Total -Colesterol Libre= Colesterol Ester. Los valores obtenidos en cada caso son expresados como mg de colesterol/gramo de hígado (Folch J et al.. A simple method for isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 1957, Vol 226; Pag 497-509.

Determinación de la expresión hepática de transportadores específicos de sales biliares (Ntcp, Bsep) , fosfolípidos (MDR2) y de aniones orgánicos o glutatión (MRP2) y de síntesis de glutatión, la glutamil-cistein-sintetaza (GGCS) : Western Blots. Se evaluó los niveles de expresión proteica de los transportadores de sales biliares Ntcp (polo sinusoidal) y Bsep (polo canalicular) en membrana total o membrana plasmática de hígado de ratones mediante Western blotting de membranas totales de hígado de ratones tratados con las diferentes dietas. Las membranas totales fueron obtenidas a partir de segmentos de hígado que fueron homogenizados en buffer Tris-HCl pH 7,5, MgCl2 y sacarosa. Estos homogenizados fueron centrifugados a l.OOOg para separar núcleos y el sobrenadante conteniendo las membranas fueron centrifugados a lOO.OOOg, el pellet obtenido que corresponde a membranas totales fue resuspendido en el buffer antes mencionado y se cuantificó proteínas por el método de Bradford. Iguales alícuotas de proteínas (50µg) fueron separadas en SDS-PAGE por tamaño y luego transferidas a nitrocelulosa . Posteriormente se agregó buffer TBS-T (Tris-HCl pH 7,5, NaCl y Tween 20) con leche 5% v/v conteniendo anticuerpos para las distintas proteínas evaluadas (Bsep, Ntcp) . La señal de cada proteína fue revelada agregándose reactivo de quimoluminiscencia (ECL) el cual reacciona con peroxidasa presente en el anticuerpo secundario (anti IgG de conejo o ratón) usada para detectar el anticuerpo usado contra cada antígeno antes señalado. Como control interno de carga se utilizó beta-actina, dado que es una proteina de expresión constitutiva que no cambia sus niveles de expresión con las dietas y fármacos usados .

Northen Blots.

A) Procedimiento de extracción de RNA total: 80 mg de tejido hepático congelado a -70°C se homogeniza con 800 1 solución D, siguiendo el método descrito por Chomczynski y Sacchi (Smgle-Step Meted of Isolation RNA by Acid Guanidmium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extracction. Piotr Chomcynski and Nicoletta Sacchi . Analytical Biochemistry 162, 156-159, 1987) . B) Estimación de la concentración y pureza del RNA total extraído: Se realiza por espectrometría, donde la absorbancia a 260 nm igual a 1, corresponde a una concentración de 40 g/ml, se calcula por medio de la siguiente fórmula: Concentración RNA ( 1/ml) = OD 2er, x fd x 40. La pureza se determina estimando la razón OD26 /OD280 la cual debe ser mayor de 1,6 donde a OD280 se miden las proteínas y otros posibles contaminantes. Las muestras extraídas se guardan a -20°C.

C) Electroforesis y visualización del RNA: La integridad del RNA extraído se comprueba por la clara visualización de los RNA pbosomales 28 S y 18 S en un gel denaturante de agarosa/formaldehído al 1% en tampón MOPS IX. Se carga 10 g de RNA total, se seca las muestras ba o flujo de N2 gas o en vacío utilizando un "speed vacum" por 10 min. Se agrega 10 1 de tampón de carga RNA incubado por 10 min a 65°C. La electroforesis se realiza a 100 volts por aproximadamente 4 horas. Ver figura 8.

D) Northern Blot e hibridización con sondas marcadas radiactivamente: El gel con las muestras de RNA total se lavó con H:,0 DEPC por 10 min para eliminar el formaldehído, luego se incubó por 20 min con 50 mM NaOH para realizar la hidrólisis parcial del RNA para la posterior elusión del gel. El resto de NaOH se eliminó lavando por 10 min con H20 DEPC. Luego se transfirió las muestras de RNA en membrana de Nylon (Hybond-N, Amersham Pharmacia) , bajo un sistema de transferencia por capilaridad, con tampón SSC 10X usando como puente papel Whatman 3MM por toda la noche. Finalizada la transferencia se fijó los RNA a la membrana a 80 °C por 2 horas.

E) Marcación de sonda por "síntesis de novo" : Para la marcación de sondas específicas para MDR2 , MRP2 y Gama-glutamil-cistein-sintetaza (G-GCS) , se utilizó por el sistema del Ki t Promega " Prime -a -gene Labelling System" , (cat.# 01100) . Este sistema está basado en el método desarrollado por Feinberg y vogelstein (Anal. Biochem, 1983, 132: 6-13; 137: 266-267). Desde una sonda del gen a estudiar, se realizó una reacción de PCR utilizando en la mezcla de nucleótidos un precursor marcado con P32 (dCTP- -P32) , con la enzima DNA polimerasa (Klenow fragment) . Este sistema genera fragmentos de 250-300pb con alta especif cidad Luego el producto amplificado se precipitó agregando 50 1 de DNA de Espermio de Salmón 2 g/ 1, 34 1 de Acetato de Amonio ION (1/3 vol) y 340 1 de Etanol absoluto (2,5 vol), se incubó por 1 hora a -20 °C, se centrifugó a 13 500 rpm por 20 min a 4°C, y se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo y el pellet se secó por 5 mm y se resuspendió en 100 1 de tampón TE pH 8. Se determinó la radioactividad asociada tanto al pellet resuspendido como en el sobrenadante, y se estimó el porcentaje de incorporación de radioactividad de la sonda, el cual fue superior al 60%, a través de la siguiente fórmula: % Incorporación: (cpm sonda/cpm totales, sonda más sobrenadante) x 100 F) Hibridización de la membrana con sonda marcada: La membrana se prehibpdó con solución de hibridización (25 ml de tampón fosfato 1M, 100 1 EDTA 0,5 M pH 8, 3,5 g SDS 0,25 g BSA grado RÍA y H20 DEPC hasta 50 ml), por 2 horas a 65°C en frascos de hibridización Luego de este tiempo se denaturó la sonda marcada incubando por 5 min a 100 °C y vaciando inmediatamente al frasco de hibridización para hibpdar la membrana con la sonda. Se incubó toda la noche a 65 °C. Finalizada la hibridización se lavó la membrana con 0,2x SSC/0,1 SDS por 15 min a 65°C varias veces hasta que las cuentas por Geiger fueron estables. Luego se envolvió la membrana en papel film plástico y se expuso en cassette con placas mtensificadoras a -70°C utilizando un film de autoradiografía (Kodak Biomax MS) . Finalmente se reveló el film y analizaron los datos en un equipo Molecular Imager System GS-525. BIO-RAD.

Análisis estadístico: Los resultados son presentados como promedios ± desviación estándar. Las significancias estadísticas entre los grupos tratados con ezetimibe y controles fue determinado mediante test de Student t no-pareado. Un valor p < 0,05 fue considerado significativo.

RESULTADOS PROTOCOLO N°l Litiasis vesicular De los ratones que recibieron dieta litogénica y agua por gavage por 14 días, el 100% desarrolló cálculos vesiculares y todos presentaban cristales de colesterol monohidrato en la bilis vesicular. En contraste, ninguno de los ratones que recibió dieta litogénica más ezetimibe en gavage por 14 días, desarrolló cálculos vesiculares como tampoco se observaron cristales de colesterol en la bilis vesicular (Figura 1). Como era predecible, ningún ratón ba o dieta control pobre en colesterol, ya sea con agua o ezetimibe, desarrolló colelitiasis o cristales de colesterol en la bilis. Este es el resultado más trascendente que sustenta la presente invención, la inhibición absoluta de la generación de colelitiasis en el modelo experimental preclínico, mediante la utilización de un bloqueador potente y selectivo de la absorción intestinal de colesterol de la familia de las 2-azetidmonas , el ezetimibe.

Peso corporal y hepático No hubo diferencias significativas en el peso de los animales, peso del hígado e índice hígado/peso corporal entre los ratones ba o dieta control con y sin ezetimibe. Ba o dieta litogénica se observa un incremento significativo en el peso del hígado, incremento que no difiere significativamente entre los ratones sin ezetimibe en comparación a los que recibieron ezetimibe (tabla 1) .

Colesterol y lipoproteinas plasmáticas La concentración plasmática de colesterol total fue similar entre el grupo de ratones con dieta control con y sin ezetimibe. La concentración de colesterol plasmático incrementa bajo la dieta litogénica por 14 días en forma similar en ambos grupos con y sin ezetimibe (tabla 1) . Esto contrasta con diferencias significativas observadas por otros investigadores entre ratones con dietas ricas en colesterol con y sin ezetimibe, pero a mayores tiempos de exposición a los tratamientos (mayores a dos meses) , lo que explica nuestros resultados. Se estudió el perfil de lipoproteínas plasmáticas en los diferentes grupos experimentales, no observando diferencias significativas entre los grupos que recibieron ezetimibe en comparación con los controles (figura 2) .

TABLA 1: *, p<0,05 en comparación con el grupo control respectivo; &, p<0,05 en comparación con grupo dieta litogénica sin ezetimibe .

Excreción fecal de colesterol y contenido hepático de colesterol Para certificar el efecto inhibitorio de ezetimibe sobre la absorción de colesterol bajo la dieta control y litogénica utilizada, se cuantificó el contenido hepático de colesterol y la excreción fecal de colesterol (esteroides neutros) . La excreción fecal de esteróles neutros en 24 horas, entre el día 13 y 14 de experimentación fue de 5,36 µmol por día por lOOg ratón en el grupo bajo dieta control sin ezetimibe, y de 19,98 µmol por día por lOOg ratón bajo dieta control más ezetimibe (incremento de 370%), lo que es concordante con estudios previos bajo dieta similar pobre en colesterol. Bajo la dieta litogénica, la excreción fecal de esteróles neutros (colesterol) incrementa significativamente en ambos grupos (8 veces) , siendo un 55% mayor en los ratones que recibieron dieta litogénica más ezetimibe en comparación con la dieta litogénica sin ezetimibe (tabla 2) .

TABLA 2 Por otro lado, el contenido hepático de colesterol en los ratones bajo dieta control fue similar entre los que recibieron agua o ezetimibe, siendo discretamente inferior (20%) en estos últimos. El contenido de colesterol total hepático incrementa significativamente en los ratones que reciben dieta litogénica (360%), sin embargo este incremento es significativamente menor en los ratones que recibieron dieta litogénica más ezetimibe (38%) (Tabla 1) . El incremento de colesterol hepático corresponde a un incremento tanto de colesterol ester como de colesterol libre, siendo más relevante el incremento de colesterol esterificado en los ratones sin ezetimibe. Esto confirma que el contenido de colesterol de origen dietético que se acumula en el hígado bajo dieta litogénica es reducido drásticamente por ezetimibe. Ezetimibe no afecta significativamente la excreción fecal de sales biliares (tabla 2) , tanto bajo la dieta control como bajo la dieta litogénica. Esto es concordante con estudios previos, que demuestran la selectividad de ezetimibe para inhibir la absorción intestinal de colesterol.

Contenido lipídico e índice de saturación de colesterol en la bilis vesicular Bajo la dieta control, ezetimibe no produjo cambios significativos en el contenido de colesterol, sales biliares o lecitina en la bilis vesicular de ratones; el índice de saturación de colesterol fue también similar entre ambos grupos (Tabla 3) .

TABLA 3 Como es sabido, la dieta litogénica per se produce un incremento significativo en el contenido de colesterol en la bilis vesicular (4 a 5 veces) , sin cambios significativos en sales biliares o lecitma; por ello, el índice de saturación de colesterol incrementa a su vez en forma significativa (2 a 3 veces) . La administración de Ezetimibe bajo dieta litogénica disminuye notoriamente el contenido de colesterol en la bilis vesicular (50 a 60%), con una correspondiente reducción en el índice de saturación de colesterol (50%) . De hecho, el índice de saturación de colesterol y el contenido de colesterol en la bilis vesicular de los ratones bajo dieta litogénica más ezetimibe, fue similar a la de los ratones bajo dieta control con o sin ezetimibe (figura 3) . Estos resultados son similares a los obtenidos por otros investigadores utilizando modelos mupnos con dietas pobres y ricas en colesterol con y sin ezetimibe (pero sin ácido cólico y grasas) (Repa, Dietschy & Turley, 2002) .

Flujo biliar y secreción hepática de lípidos y glutatión Se determinó a su vez el flujo biliar y la secreción hepática de lípidos biliares en los cuatro grupos experimentales, lo que constituye observaciones originales adicionales y que forma parte de nuestra invención. Ba o dieta control pobre en colesterol, ezetimibe produce un discreto incremento no significativo en el flujo biliar (30 a 40%) (Figura 4) . Como es sabido, la dieta litogénica per se incrementa significativamente el flujo biliar (200 a 300%) , como también incrementa la secreción de lípidos biliares, sales biliares, lecitina y colesterol (figura 3). Sorprendentemente, la administración de ezetimibe bajo dieta litogénica indujo un incremento aún mayor del flujo biliar, el cual fue significativamente mayor al grupo con dieta litogénica sin ezetimibe (50 a 60% mayor) . Observamos que este incremento mayor en el flujo biliar, se asoció a un incremento en la secreción de sales biliares y de fosfolípidos (dependiente de la secreción de sales biliares) , pero no se asoció a una mayor secreción de colesterol biliar en comparación con el grupo que no recibió ezetimibe (figura 3) . Dado que el flujo biliar es dependiente principalmente de la secreción hepática de sales biliares pero también de la secreción hepática de otros solutos como glutatión, se cuantificó la secreción biliar de glutatión en los ratones bajo dieta litogénica sm y con ezetimibe. Se observó un incremento significativo en la secreción de glutatión (200%) en los ratones que recibieron ezetimibe en comparación con los que recibieron sólo la dieta litogénica (figura 4) . Esto sugiere que ezetimibe bajo dieta l togénica incrementa el flujo biliar por mecanismos dependientes e independientes (glutatión) de sales biliares, lo que puede ser relevante como mecanismos adicionales que favorecen la inhibición de la formación de colelitiasis en este modelo preclínico.

Expresión hepática de proteínas o sus RNA-mensajeros involucradas en el transporte de colesterol, sales biliares y xenobióticos glucuronizados . Con el objetivo de determinar si las diferencias observadas en el flujo biliar y secreción de lípidos biliares y glutatión entre el grupo de ratones tratados sólo con dieta litogénica o dieta litogénica más Ezetimibe por 14 días (protocolo n°l), se explica por cambios en la expresión hepática de transportadores específicos para estos solutos (fosfolípidos, sales biliares y aniones orgánicos), se determinó sus niveles de expresión hepática ya sea mediante western blottmg y/o northen blottmg. No hubo diferencias significativas entre ambos grupos en los niveles de expresión hepática de SR-BI, Ntcp, Bsep, MRP2 , como tampoco de GGCS . Sólo se observó una discreta pero significativa menor expresión del gen (RNA) transportador de fosfolípidos (MDR2) en los ratones bajo dieta litogénica más Ezetimibe, lo que no se correlacionó con los niveles de expresión de la proteína (mdr2, datos no mostrados) , ni con una mayor secreción biliar de fosfolípidos bajo dieta litogénica más Ezetimibe . Por lo tanto, se planteó que el incremento observado en el flujo biliar y en la secreción biliar de sales biliares, fosfolípidos y glutatión que observamos en los ratones ba o dieta litogénica más Ezetimibe en comparación con dieta litogénica sin Ezetimibe, no se debe a cambios inducidos en transportadores específicos, sino que probablemente se explica por un efecto sustractivo de Ezetimibe sobre el contenido de colesterol en el hígado. Se postula que los hígados con menor contenido hepático de colesterol (depletados de colesterol), presentan una mayor capacidad de transporte de solutos como sales biliares, lecitma y glutatión que los hígados sobrecargados de colesterol. Esta observación es innovadora y permite plantear que ezetimibe puede tener un efecto hepatoprotector frente a daño por xenobióticos endógenos (colestasis, ácidos grasos) o exógenoe (por ejemplo algunos aniones orgánicos) RESULTADOS PROTOCOLO N°2 Dado que el uso de Ezetimibe evitó la formación de cálculos vesiculares en el protocolo por dos semanas (14 días) , quisimos determinar si su efecto se mantenía por períodos más prolongados de dieta. Para ello proporcionamos esta vez Ezetimibe directamente en la dieta litogénica (no por gavage) por el doble del tiempo: 30 días. Nuevamente el uso de Ezetimibe evitó por completo la formación de cálculos vesiculares de colesterol (Figura 5) . Como era de esperar, el 100% de los ratones bajo dieta litogénica desarrolló colelitiasis; en contraste, ningún animal (0%) bajo la misma dieta litogénica pero más Ezetimibe desarrolló cálculos vesiculares, como tampoco cristales de colesterol en la bilis vesicular. Este último resultado demuestra en forma categórica el potente y prolongado efecto protector de Ezetimibe sobre la formación de colelitiasis en el modelo murino.

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Claims (7)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Uso de compuestos de la familia 2-azetidinonas 5 CARACTERIZADO porque sirve para preparar un medicamento que sirve para la prevención o tratamiento de la enfermedad litiásica de la vía biliar por cálculos de colesterol, es decir, colelitiasis, en sujetos que poseen la enfermedad o que están en riesgo de desarrollar dicha 10 condición, además para incrementar en dichos sujetos el flujo y secreción biliar de compuestos que inhiben la formación de cálculos de colesterol.

2.- Uso de compuestos de la familia 2-azetidinonas de 15 acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque el medicamento se usa en una dosis terapéuticamente efectiva de compuestos de la familia de 2-azetidinonas que inhiben selectivamente la absorción intestinal de colesterol 20

3. - Uso de compuestos de la familia azetitinonas de acuerdo a la reivindicación 2, CARACTERIZADO porque el medicamento se usa en una dosis terapéuticamente efectiva entre 0,1 a 6 mg/kg de peso corporal por día.

4.- Uso de compuestos de la familia 2-azet?dmonas de acuerdo a la reivindicación 1, 2 o 3, CARACTERIZADO porque el compuesto seleccionado para preparar un medicamento que sirve para la prevención o tratamiento de la enfermedad litiásica son compuestos del grupo consistente esencialmente de EZETIMIBE (SCH 58235) , o alguno de sus metabolitos activos glucurónidos o sus análogos fenólicos .

5.- Uso de compuestos de la familia 2-azet?d?nonas de acuerdo a cualquiera de las reivindicación anteriores, CARACTERIZADO porque el compuesto seleccionado para preparar un medicamento que sirve para la prevención o tratamiento de la enfermedad litiásica son compuestos de la familia 2-azet?dmonas o sus análogos derivados asociado al menos con un agente regulador del metabolismo lipídico del grupo consistente en inhibidores de la enzima HMG-CoA reductasa.

6.- Uso de compuestos de la familia 2-azet?d?nonas de acuerdo a la reivindicación 5, CARACTERIZADO porque el compuesto seleccionado para preparar un medicamento que sirve para la prevención o tratamiento de la enfermedad litiásica de la vía biliar son compuestos de la familia 2-azetidmonas o sus análogos derivados asociados al menos I con un agente regulador del metabolismo lipídico del grupo consistente en inhibidores de la enzima HMG-CoA reductasa tales como pravastatina, simvastatma, rosuvastatma, lovastatma, fluvastatma, atorvastatma y cerivastatma y 5 sus presentaciones farmacéuticas aceptadas.

7.- Uso de compuestos de la familia 2-azet?dmonas de acuerdo a la reivindicación 6, CARACTERIZADO porque sirve para la preparación de una composición farmacológica para 10 la prevención o tratamiento de la enfermedad litiasica que contiene un compuesto de la familia de 2-azet?dmonas en una dosis terapéuticamente efectiva entre 0,1 a 6 mg/kg de peso corporal por día y un segundo compuesto correspondiente a un agente regulador del metabolismo 15 lipídico del grupo consistente en inhibidores de la enzima HMG-CoA reductasa, presente en dosis de 10 mg hasta 80 mg por día por dosis