MX2007010934A

MX2007010934A - Metodo de diagnostico in vitro de la enfermedad de alzheimer mediante un anticuerpo monoclonal.

Info

Publication number: MX2007010934A
Application number: MX2007010934A
Authority: MX
Inventors: Enrique Mendez
Original assignee: Consejo Superior Investigacion
Priority date: 2005-03-09
Filing date: 2006-03-09
Publication date: 2007-10-12
Also published as: RU2416619C2; ES2259270A1; BRPI0609168A2; EP1881008A1; CN101137670A; US7932048B2; ES2259270B1; ATE512987T1; CA2601550C; JP2008532984A; US20090023159A1; ES2367837T3; CN101137670B; EP1881008A4; RU2007137125A; EP1881008B1; EP1881008A9; CA2601550A1; WO2006095041A1; JP5117373B2

Abstract

Metodo de diagnostico in vitro de la enfermedad de Alzheimer mediante un anticuerpo monoclonal. Dicho anticuerpo es capaz de unirse al menos a los aminoacidos 12-16 del peptido ??-amiloide detectando especificamente las placas neuriticas, caracteristicas de la enfermedad de Alzheimer, sin detectar placas difusas, que no son definitorias de la enfermedad. Dentro de las placas neuriticas, el anticuerpo monoclonal permite detectar un subgrupo que se diferencia en la composicion de las diferentes isoformas del peptido ??-amiloide depositadas, lo que se asocia con el estadio de progresion de la enfermedad. Ademas, el anticuerpo es capaz de unirse a isoformas del peptido ??-amiloide en fluidos biologicos como la orina. Por ello, el anticuerpo monoclonal de la invencion, las lineas celulares que lo producen y las composiciones que lo contienen son de utilidad en el diagnostico in vitro de la enfermedad de Alzheimer y la determinacion del estadio de progresion de la enfermedad.

Description

MÉTODO DE DIAGNOSTICO IN VITRO DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER MEDIANTE UN ANTICUERPO MONOCLONAL CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al diagnóstico de trastornos neurológicos, especialmente al diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer mediante un anticuerpo capaz de interaccionar con péptidos específicos asociados con dicha enfermedad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurológico que provoca la muerte de las células nerviosas del cerebro. Por lo general, progresa paulatinamente, comenzando después de los 50 años, y sus primeros síntomas pueden atribuirse a la vejez o al olvido común. A medida que avanza la enfermedad, se van deteriorando las capacidades cognitivas, entre ellas, la capacidad para tomar decisiones y llevar a cabo las tareas cotidianas, y pueden surgir modificaciones de la personalidad, así como conductas problemáticas. En sus etapas avanzadas, la EA conduce a la demencia y finalmente a la muerte. La enfermedad es actualmente incurable y constituye una causa importante de mortalidad. En la actualidad, el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer se realiza normalmente a través del cuadro clínico, pues el diagnóstico definitivo sólo puede llevarse a cabo mediante un estudio histológico de muestras cerebrales (autopsia o biopsia), que revele la presencia en el tejido cerebral de sus rasgos característicos. Debido a la peligrosidad de la práctica de biopsias cerebrales en pacientes vivos, este procedimiento se utiliza muy raramente, por lo que se estima que la tasa de errores en el diagnóstico in vivo de esta enfermedad ronda el 20%-30%. Los cerebros de los individuos que padecen enfermedad de Alzheimer muestran dos marcadores patológicos principales: degeneración neurofibrilar (que se identifica por la presencia de ovillos neurofibrilares, neuritas distróficas y hebras del neuropilo) y depósitos de sustancia amiloide (es decir, depósitos del denominado péptido ß-amiloide, abreviado generalmente como Aß), tanto en forma de placas (placas difusas y placas neuríticas, formas estas últimas características de la enfermedad, que se denominan así por aparecer entre y dentro de las neuronas), como en forma de depósitos vasculares (que aparecen en las paredes de los vasos sanguíneos cerebrales). Tanto la degeneración neurofibrilar como la deposición amiloide representan procesos degenerativos asociados también al envejecimiento normal del cerebro. En los sujetos de avanzada edad que no padecen demencia, el péptido Aß se deposita principalmente en forma de placas difusas. Este tipo de depósito es especialmente intenso en algunos sujetos con capacidades cognitivas normales, y para algunos autores representa un proceso de "envejecimiento patológico", que se considera que está a medio camino entre el envejecimiento normal del cerebro y la EA [1]. Un desarrollo particularmente intenso y prematuro de placas difusas años antes de que aparezcan las placas neuríticas tiene lugar también en el síndrome de Down (SD), debido a una trisomía del cromosoma 21 que conduce a una sobreexpresión de la proteína precursora amiloide (ß-APP). Aunque se puede observar un pequeño número de placas neuríticas en cerebros de sujetos con capacidades cognitivas normales, tanto los cerebros afectados por EA como los afectados por SD en edades avanzadas se caracterizan por el desarrollo de una gran cantidad de placas neuríticas maduras [2, 3]. En contraste con las placas difusas, que contienen una forma no fibrilar de Aß (denomina "preamiloide") [4], tanto los depósitos amiloides vasculares como las placas neuríticas contienen péptido Aß en forma fibrilar y reaccionan con tinciones de sustancia amiloide tales como el Rojo Congo y la Tioflavina T.

El declive cognitivo en la EA se correlaciona de forma lineal con la progresión de los cambios neurofibrilares y la pérdida de sinapsis corticales [5]. No se ha observado pérdida local de sinapsis asociada a las placas difusas [6]. En contraste, las placas neuríticas están asociadas con pérdida de densidad sináptica, cambio neurofibrilar y activación de la microglía [7]. Tanto el cambio neuro fibrilar puro como la deposición de Aß siguen en la EA patrones secuenciales de progresión bien establecidos [8, 9]. Sin embargo, aunque el grado de declive cognitivo se correlaciona mejor con una sucesión de etapas basadas en el cambio neurofibrilar [5], el diagnóstico neuropatológico definitivo de la EA se basa todavía en la demostración histológica de una densidad significativamente mayor de placas neuríticas en las regiones neocorticales asociativas, con respecto a lo esperado según el grupo de edad del paciente, dentro de un cuadro clínico de demencia (criterios de consenso del CERAD: Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease) [10]. La formación de placas neuríticas representa el proceso patogénico central en la EA, y la composición molecular de estos depósitos ß-amiloides y las diferencias con las placas difusas en lo que a dicha composición se refiere es, en consecuencia, uno de los principales campos de interés en la investigación actual sobre la EA.

El conocimiento que se posee sobre la composición molecular de los depósitos ß-amiloides en el tejido cerebral de pacientes con enfermedad de Alzheimer ha cambiado radicalmente a lo largo de los últimos años. Varios estudios que empleaban métodos bioquímicos o inmunohistoquímicos con el fin de identificar diferentes formas del péptido Aß han aportado una imagen bastante consistente que permite una interpretación molecular de los hallazgos morfológicos clásicos. Estos estudios son los que han proporcionado las bases de la teoría patogénica unitaria de la enfermedad denomina hipótesis amiloide [1 1], aunque la hipótesis original se ha reformulado recientemente con el fin de incluir el papel emergente de los oligómeros Aß solubles como los principales agentes patógenos [12]. La suposición de un papel patógeno central y primario de los péptidos Aß en la EA está dando lugar en la actualidad a nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a la prevención o eliminación de estos depósitos. La distribución topográfica y secuencia temporal de la deposición de péptidos Aß conocidos en cerebros afectados por EA se ha dilucidado con la ayuda de anticuerpos dirigidos al extremo carboxilo, al extremo amino o a segmentos internos de la molécula Aß, junto con el aislamiento y purificación de isoformas de Aß por medio de métodos bioquímicos. La distribución tisular de péptidos caracterizados por los rasgos de sus extremos carboxilo muestra un patrón bastante regular y bien definido. Mientras que Aßx- 0 es la forma predominante en los depósitos vasculares y es la forma principal que se encuentra en el LCR (líquido cefalorraquídeo), Aß?.42 es la forma principal detectada en los depósitos de tejido cerebral (placas difusas y neuríticas) [13]. En la EA, el síndrome de Down (SD) [13, 14] y el envejecimiento normal [1] Aß?-42 es el único componente de las placas difusas y el componente principal de las placas neuríticas. Estas últimas también pueden contener Aßx- o, predominantemente en la región de su núcleo central. También se ha establecido que Aß?-42 es la forma que se deposita en las fases iniciales. Aunque inicialmente se creía que Aß?-4o y Aß?_42 comenzaban casi en su totalidad en el aminoácido Aspl , está bien establecido inmunohistoquímica y bioquímicamente que una amplia variedad de isoformas heterogéneas del péptido Aß, modificadas y truncadas en el extremo amino, participan en la composición de las placas tanto difusas como neuríticas [15]. Estas isoformas tienden a mostrar también un patrón regular de distribución entre las placas difusas y neuríticas, de forma que finalmente ha comenzado a surgir una imagen completa de la distribución topográfica de los diferentes péptidos Aß. Sin embargo, existen todavía algunas discrepancias entre los estudios, particularmente con respecto a las características del extremo amino de los péptidos que componen las placas difusas, y la cantidad relativa de carga amiloide que representa cada uno de ellos. Estas discrepancias implican particularmente al péptido p3 (Aß?7.42). Mientras que algunos estudios sugieren que Aß? .42 puede ser el principal componente de las placas difusas [16], otros han encontrado una cantidad relativamente mayor de formas más largas (que comienzan en Aspl , o truncadas en el extremo amino u otras isoformas modificadas) a este nivel [15]. Puesto que Aß? .42 se genera mediante la escisión de ß-APP por la a-secretasa (la denominada ruta no amiloidogénica) y muestra propiedades físico-químicas bastante diferentes de las isoformas más largas de Aß (estas últimas generadas mediante la escisión de ß-APP por la ?-secretasa), su presencia selectiva en placas difusas puede tener un significado patogénico crucial en la evolución de las placas.

Gowing et al. [17] fueron los primeros en aislar el péptido Aß?7-42 como la forma predominante recuperada de cerebros afectados por EA ricos en placas difusas. Este depósito no se encontró, ni en depósitos amiloides vasculares, ni en placas neuríticas. El anticuerpo monoclonal comercial 6E10, que reconoce Aß?_? , no produjo la inmunotinción de placas difusas, ni neocorticales, ni cerebelosas, en una serie de cerebros afectados por EA y SD [18]. Sin embargo, el cuerpo estriado, donde las placas difusas son particularmente abundantes en ausencia de placas neuríticas, mostró algunas placas positivas para el anticuerpo 6E10. Utilizando determinaciones por HPLC e inmunohistoquímica, Lalowski et al. [19] demostraron que Aß? -42 representa un 70% del contenido amiloide total en placas difusas del cerebelo, mientras que Aß?-42 representa un 12% y otras formas truncadas de Aß?. 2 un 5% o menos. En cerebros de personas de edad avanzada y afectados por SD, Saido et al. [20] encontraron una tinción mayor de placas difusas con un anticuerpo específico anti-Aß N3 (piroGlu) que con un anticuerpo anti-Aß N(l). Iwatsubo et al. [15] estudiaron placas difusas en una serie de cerebros de personas de edad avanzada, afectados por EA y afectados por SD con un panel de anticuerpos dirigidos a reconocer formas de Aß truncadas y modificadas en el extremo amino. Este estudio es único por el hecho de que el tejido cerebral empleado para el estudio inmunohistoquímico se fijó o en etanol al 70%, o en formaldehído al 4%, de forma que se podía ensayar el efecto sobre la aparición de artefactos de la fijación rutinaria con formaldehído. En todas las muestras de tejido fijadas en etanol al 70%, las placas difusas se tiñeron intensamente por la presencia de Aß NI (L-Asp), Aß NI (L-isoAsp), Aß NI (D-Asp), Aß N3 (piroGlu), y Aß X-42. Se obtuvo una inmunotinción débil con Aß Nl l (piroGlu) y Aß N17. Sin embargo, en el material fijado en formaldehído algunas placas difusas se tiñeron con Aß NI (L-Asp), y no se obtuvo ninguna tinción con Aß NI (L-isoAsp) o Aß NI (D-Asp), mientras que el patrón de tinción para el extremo carboxilo permaneció sin cambios. Aunque los autores demostraron que la modificación del extremo amino puede alterar los resultados de la inmunotinción en tejidos fijados en formaldehído, obtuvieron una reactividad débil para el Aß NI 7 incluso en material fijado en etanol. Utilizando un anticuerpo monoclonal específico para p3 (Aß?7- 2) [16], encontraron deposición de este péptido limitada en gran medida a las placas difusas, las neuritas distróficas y las coronas de placas neuríticas en las regiones de las amígdalas, el hipocampo y el parahipocampo. Los autores sugieren un papel específico de p3 en la deposición inicial de sustancia amiloide y en el origen de las placas neuríticas. Tekirian et al. [21] , en una serie de cerebros afectados por EA y de control, demostraron la presencia en las placas difusas de Aß N3 (pE) > Aß Nl (D) > Aß N17 (L) > Aß Nl (rD). En cuanto a la variabilidad en el extremo carboxilo, Parvathy et al. [22], en un estudio que empleaba anticuerpos dirigidos contra Aß?- o, Aß?_42 o Aßx_43, encontraron un subgrupo de placas neuríticas reactivas sólo frente al anticuerpo Aß C40 y un subgrupo mayor de placas reactivas tanto frente a Aß C40 como frente a Aß C42. Los estudios previos han establecido así que las placas difusas muestran un perfil de Aß altamente específico en el extremo carboxilo y un perfil bastante específico en el extremo amino, este último sometido a alguna heterogeneidad entre los pacientes y entre diferentes regiones del cerebro. La presencia de Aß] -42 parece estar limitada en gran medida a las placas difusas, aunque hay una gran variación entre los estudios con respecto a los contenidos relativos de este péptido más corto en las mismas. En los estudios realizados por Kida et al. [18], no se obtuvo ninguna tinción para péptidos Aß que incluían la secuencia 12-16 en placas difusas de regiones corticales y subcorticales. Tomándolos en conjunto, los resultados del Estado de la Técnica (ET) sugieren que, como propuso Lamer [23], las formas del péptido Aß específicas según el extremo amino pueden jugar un papel esencial en la evolución de las placas difusas para convertirse en placas neuríticas. Por ello, los anticuerpos capaces de detectar específicamente formas con el extremo amino truncado y, con ello, diferenciar claramente entre las placas difusas y las placas neuríticas son de gran utilidad como herramientas en el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer. De entre ellos, serían de especial utilidad aquellos capaces de diferenciar subgrupos de placas neuríticas según la proporción de las distintas formas de péptido amiloide que se diferencian en el aminoácido en el que acaba el extremo carboxilo, en especial si fueran capaces de permitir definir subconjuntos de placas que constituyeran un marcador específico de la enfermedad. El anticuerpo monoclonal de la invención, dirigido contra la secuencia constituida por los aminoácidos 12-16 del péptido ß-amiloide y con una mayor afinidad por la forma Aß42 que por Aß40, cumple ambas características.

Otro aspecto en el que los anticuerpos capaces de detectar formas del péptido ß-amiloide serían de especial utilidad sería en el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer mediante el análisis de la concentración de distintas formas de este péptido en fluidos biológicos, un aspecto en el que se están trabajando tanto para facilitar el diagnóstico a partir de parámetros bioquímicos como, incluso, con vistas a identificar casos preclínicos o en especial riesgo de desarrollar la enfermedad y permitir el seguimiento de los pacientes incluidos en estudios clínicos. Con esta finalidad, muchos estudios se están centrando en el líquido cefalorraquídeo (LCR), con el fin de detectar si existen variaciones en las concentraciones de formas solubles del péptido ß-amiloide presentes en este fluido que permitan diferenciar a los pacientes de los controles sanos. Sin embargo, es poco probable que el análisis del LCR, que lleva implícito el uso de una técnica invasiva, la punción lumbar, pueda aplicarse al diagnóstico y seguimiento de rutina de los pacientes con enfermedad de Alzheimer en la práctica clínica. Por ello, otras líneas de investigación se han centrado en el estudio de variaciones en la concentración en sangre y orina de marcadores biológicos (entre los cuales se encuentran formas solubles del péptido ß-amiloide) que puedan correlacionarse con la aparición y la evolución de la enfermedad, aunque hay pocos estudios publicados hasta el momento. De acuerdo con ellos, los niveles e Aß?_ 2 y Aß?- 0 en plasma parecen estar aumentados en el caso de existencia de síndrome de Down y también se incrementan en individuos normales con la edad. Los niveles plasmáticos de Aß?. 2, pero no de Aß?-4o, están aumentados en pacientes con enfermedad de Alzheimer, y descienden a lo largo de la evolución de la enfermedad [28,29], aunque la medida de la concentración de estas especies en plasma no permite su aplicación actual al diagnóstico. También se ha detectado la presencia de formas solubles del péptido ß-amiloide en orina [30], aunque no se ha realizado hasta el momento un estudio comparativo entre pacientes y controles. Aunque el orden de magnitud de las concentraciones de péptido ß-amiloide que se están detectando en plasma y orina están dificultando la definición de los perfiles correspondientes a los individuos sanos y a los pacientes que se encuentran en distintos estadios de la enfermedad y la posible asociación de las formas solubles del péptido ß-amiloide con otras proteínas presentes en dichos fluidos biológicos es otra dificultad a superar, es este un campo en el que se está trabajando activamente, por lo que los anticuerpos monoclonales que puedan interaccionar con formas del péptido ß-amiloide presentes en fluidos biológicos para posibilitar su detección pueden significar una herramienta de gran utilidad en el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer. El anticuerpo de la invención, que es capaz de interaccionar con formas solubles del péptido ß-amiloide y de detectar su presencia en fluidos biológicos como la orina, es uno de los anticuerpos que puede ser de utilidad en la ejecución de estas técnicas diagnósticas. Además, el hecho de estar dirigido específicamente contra la zona cercana al extremo amino del péptido ß-amiloide es una característica de interés en la diferenciación de las formas del péptido ß-amiloide que conservan el extremo amino de aquellas formas en las que dicho extremo está truncado. Se han descrito otros anticuerpos monoclonales dirigidos específicamente contra la zona cercana al extremo amino del péptido ß-amiloide, así como su utilización en métodos diagnósticos relacionados con la EA. Así, por ejemplo, en la patente norteamericana US- 4.666.829 se describe la obtención de un anticuerpo monoclonal generado frente a una porción del péptido amiloide más cercana al extremo amino. En concreto, se preparó un péptido sintético consistente en los diez primeros residuos de dicho péptido (Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr), representando por SEQ ID NO: l . El epítopo reconocido por este anticuerpo estará incluido en estos aminoácidos 1 a 10, mientras que el anticuerpo reivindicado en la presente invención reconoce al menos el epítopo que comprende los aminoácidos del 12 al 16. Además de diferir en la secuencia específica que reconoce este anticuerpo monoclonal con respecto al de la presente invención, también es diferente el diseño del método diagnóstico propuesto, pues lo que se determina es exclusivamente la unión de los anticuerpos utilizados a lo que en esa patente se considera el péptido característico de la enfermedad de Alzheimer, el constituido por los aminoácidos 1 a 28 del péptido amiloide, no considerándose la unión a otras formas del péptido de diferentes longitudes y/o con variaciones en los extremos amino y carboxilo. Además, no se aporta ninguna prueba experimental que demuestre su capacidad para detectar formas del péptido amiloide presentes en fluidos biológicos. Por otra parte, en la solicitud de patente PCT WO 90/12871 se describe la preparación del anticuerpo monoclonal denominado SV17-6E10. La generación de este anticuerpo se produce por inmunización con la secuencia peptídica Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Gln-Val-His-His-Gln-Lys-Leu, representada por SEQ ID NO:2, que podría considerarse equivalente a la de los aminoácidos 1 a 17 del péptido amiloide. Otro anticuerpo monoclonal dirigido contra la zona en la que se incluyen los aminoácidos 1 a 17 es el ya mencionado anticuerpo monoclonal comercial 6E10 que, según figura en la descripción de la hoja técnica correspondiente al producto, http://www.alexis co .com/rnonoclonal:antibodies-SIG-9320/opfa.1.1.SIG-9320.386.4.1 .html, específicamente, dentro de los aminoácidos 1 a 17 del péptido ß-amiloide, reconoce el epítopo comprendido entre los aminoácidos 3 a 8. Este epítopo corresponde a una zona diferente y más cercana al extremo amino que la del anticuerpo monoclonal EM5 de la invención. Aunque es capaz de producir una tinción diferencial de las placas neuríticas y los depósitos vasculares, sin teñir las placas difusas, este anticuerpo no parece presentar diferencias de afinidad entre los péptidos Aß42 y Aß40. Por tanto, el anticuerpo monoclonal de la invención, al que se ha denominado EM5, constituye una herramienta novedosa, porque reconoce al menos un epítopo no reconocido por ninguno de los anticuefos descritos en el estado de la técnica conocido, en la secuencia del péptido ß-amiloide. El anticuefo de la invención, por consiguiente, es útil para su aplicación en el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer. Detecta específicamente placas neuríticas sin detectar placas difusas, que no están asociadas a la enfermedad de forma específica. Dentro de las placas neuríticas, el anticuefo monoclonal de la invención permite detectar un subgrupo de placas neuríticas que se diferencia en la composición molecular de las mismas con respecto a los depósitos de péptido ß-amiloide. Además, el anticuefo monoclonal de la invención es capaz de unirse a formas del péptido ß-amiloide presentes en solución, permitiendo la posterior detección y cuantificación de dichos péptidos, incluso si la solución es un fluido biológico como la orina.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un anticuefo monoclonal que reconoce en el péptido ß-amiloide el epítopo correspondiente a la secuencia: Val-His-His-Gln-Lys (SEQ ID NO:3) y es capaz de unirse a isoformas del péptido ß-amiloide que contengan dicha secuencia, independientemente de que el péptido se encuentre en forma soluble, agregada o desnaturalizada por SDS, aunque mostrando una afinidad mayor por la isoforma Aß 42 que por la isoforma Aß 40. La invención se refiere también a fragmentos del citado anticuefo capaces también de unirse a isoformas del péptido ß-amiloide que contengan dicha SEQ ID NO:3. La invención se refiere también a una línea celular de hibridoma capaz de producir el anticuefo monoclonal anteriormente descrito y a un método de producir dicho anticuefo mediante la obtención de una línea celular de hibridoma y el cultivo de dicha línea celular en condiciones que permitan la producción del anticuefo monoclonal. Adicionalmente, la invención se refiere a una composición que comprenda el anticuefo de la invención o al menos un fragmento del mismo capaz de unirse a SEQ ID NO:3. Una posible realización de una composición de la invención es aquella en la que el anticuefo o el fragmento del mismo están acoplados a una sustancia capaz de permitir su detección, sustancia que puede ser un segundo anticuefo capaz de unirse al anticuefo de la invención o al fragmento del mismo y que lleva acoplada una sustancia capaz de permitir su detección, como puede ser una enzima capaz de catalizar la transformación de una determinada sustancia en otra que puede ser detectada, por ejemplo un cromógeno. Otra posible realización de una composición de la invención es aquella en la que el anticuefo o un fragmento del mismo están acoplados a alguna sustancia o partícula que facilita la extracción de isoformas del péptido ß-amiloide presentes en una solución, como puede ser una partícula magnética que permitirá la separación de la solución de los complejos antígeno-anticuefo o antígeno-fragmento de anticuefo formados si se aplica un campo magnético, siendo así posible concentrar las isoformas del péptido ß-amiloide presentes en dicha solución y facilitar su posterior detección, identificación y/o cuantificación. La invención se refiere también al uso del anticuefo monoclonal de la invención o al menos un fragmento del mismo capaz de unirse a SEQ ID NO:3 para detectar isoformas del péptido ß-amiloide que contengan SEQ ID NO:3. Las isoformas del péptido ß-amiloide a detectar pueden encontrarse en una muestra de tejido cerebral tomada de un individuo, en una solución como puede ser una muestra de un fluido biológico o una solución derivada del mismo o, incluso, pueden encontrarse en algún otro tipo de muestra, no biológica, en la que se desea igualmente detectar la posible presencia de isoformas del péptido ß-amiloide. Por último, la invención se refiere a un método de diagnóstico in vitro de la enfermedad de Alzheimer basado en la detección de isoformas de péptido ß-amiloide mediante el uso del anticuefo de la invención, o de al menos un fragmento del mismo capaz de unirse a SEQ ID NO:3. En una realización preferida de la invención, la detección de isoformas del péptido ß-amiloide se produce en una muestra de tejido cerebral tomada de un individuo. En ese caso, las composiciones de la invención en las que el anticuefo o el fragmento del mismo están acoplados a una sustancia capaz de permitir su detección, sustancia que puede ser un segundo anticuefo capaz de unirse al anticuefo de la invención o a un fragmento del mismo y que lleva acoplada otra sustancia capaz de permitir su detección, pueden ser de especial utilidad. En otra realización preferida del método diagnóstico de la invención, la detección de isoformas del péptido ß-amiloide se produce en una solución, preferiblemente una muestra de un fluido biológico como puede ser el líquido cefalorraquídeo, la orina o la sangre o, incluso, una solución derivada de algún fluido biológico, como puede ser el plasma. En esta segunda realización de la invención, se prefiere el uso de composiciones de la invención en las que el anticuefo o el fragmento del mismo están acoplados a alguna sustancia o partícula que facilite la extracción de isoformas del péptido ß-amiloide presentes en solución, como puede ser una partícula magnética que permitirá la separación de la solución de los complejos antígeno-anticuefo o antígeno-fragmento de anticuefo formados, si se aplica un campo magnético, siendo así posible concentrar las isoformas del péptido ß-amiloide presentes en la solución y facilitar su posterior detección, identificación y/o cuantificación. De esta forma, el método de diagnostico de la invención comprende las etapas de: a) añadir a la muestra de fluido biológico o la solución derivada del mismo una composición que comprende el anticuefo de la invención o al menos un fragmento del mismo capaz de unirse a SEQ ID NO:3 acoplados a una partícula magnética; b) dejar transcurrir tiempo suficiente para que se formen complejos antígeno-anticuefo o antígeno fragmento de anticuefo, entre al menos una isoforma del péptido ß-amiloide y el anticuefo o fragmento de anticuefo, comprendidos en la composición; c) aplicar un campo magnético para extraer los complejos antígeno-anticuefo o antígeno-fragmento de anticuefo de la solución; d) retirar la solución; e) separar el anticuefo o fragmento de anticuefo de las moléculas de péptido ß-amiloide, f) identificar y cuantificar las isoformas del péptido ß-amiloide extraídas de la muestra de fluido biológico o solución derivada del mismo. Se prefiere que la solución de la que se extraen las isoformas del péptido ß-amiloide sea una muestra de sangre u orina, por ser más sencilla su obtención que en el caso de las muestras de líquido cefalorraquídeo, o bien una muestra de plasma derivado de una muestra de sangre. Entre sangre o plasma y orina, se prefiere especialmente que la muestra de fluido biológico sea una muestra de orina, por no requerir de métodos invasivos para su obtención. Ello obliga, sin embargo, a utilizar algún método muy sensible para la identificación y cuantificación de las isoformas del péptido ß-amiloide, que puede ser la espectrometría de masas MALDI-TOF. Los anticuefos policlonales EM2 y EM3, desarrollados también por el grupo de los inventores, pueden utilizarse también como herramienta complementaria en el método de diagnóstico de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Fig. 1 muestra las curvas de unión de los anticuefos EM5 (parte superior) y 6E10 (parte inferior) a péptidos Aß inmovilizados. Se muestran los resultados correspondientes a distintas concentraciones (abscisas; en concentración nM) de los anticuefos tanto frente al péptido Aß 40 (símbolos rellenos) como frente al péptido Aß 42 (símbolos vacíos), en ambos casos agregado (?) o sin agregar (D). Cada punto representa la media de experimentos realizados por triplicado. En ordenadas se representa la densidad óptica (D.O) a 450 nm.

La Fig. 2 muestra el resultado de los análisis por inmunotransferencia de los anticuefos EM2, EM3 y EM5 frente a péptidos sintéticos Aß 1-40 y Aß 1-42. La Fig. 3 muestra en su parte superior, un diagrama de barras referente a la reactividad de EM5 frente a series de péptidos Aß sintéticos mediante ELISA, con los valores de absorbancia (D.O. a 450 nm) correspondientes a 20 µg/ml de anticuefo. En la parte inferior se indica la localización del epítopo reconocido por EM5 según los resultados obtenidos en este ELISA. 1-28R = Aß?-28 de roedor. Entre paréntesis, diferentes mutaciones. La Fig. 4 muestra la localización del epítopo del péptido Aß reconocido por el anticuefo monoclonal EM5 según se determinó mediante análisis de Espectrometría de Masas del péptido ß-amiloide inmunoprecipitado digerido con diferentes enzimas proteolíticas indicadas en la Tabla de la descripción (péptidos 1-5). La secuencia 6 corresponde al péptido ß-amiloide sin digerir. La Fig. 5 muestra fotografías de inmunotinciones de tejido cerebral afectado por la enfermedad de Alzheimer, utilizando EM2, EM3, EM5 y combinaciones de EM5 con cada uno de los anteriores. Las estructuras teñidas se señalan como V (vasos), DP (placas difusas) y NP (placas neuríticas). Las fotografías corresponden a: - (A) y (B): Secciones seriadas consecutivas de la misma zona del córtex occipital inmunoteñidas con EM5 (A) y EM 3 (B) como anticuefo primario, utilizando azul de nitro-tetrazolio (NBT) como cromógeno.

- (C): Micrografía con alto grado de magnificación de una técnica de inmunotinción doble utilizando EM3 (cromógeno: NBT) y EM5 (cromógeno: DAB) como anticuefos primarios. - (D) y (E): Secciones seriadas consecutivas de la misma área del córtex occipital inmunoteñidas o con EM5 (D) o con EM2 (E). - (F): Microfotografía con alto grado de magnificación de una técnica de inmunotinción doble empleando EM2 (cromógeno: azul de nitro-tetrazolio, NBT) y EM5 (cromógeno: diaminobencidina, DAB). La Fig. 6 muestra gráficos obtenidos en el análisis por espectrometría de masas MALDI-TOF de formas del péptido ß-amiloide de distinta longitud. En cada caso, en el eje de ordenadas se representa el porcentaje de intensidad (% Int.) correspondiente a cada uno de los picos de diferente masa (Mas.), deducida a partir de la relación masa/carga (m/z). El gráfico superior, indicado con la letra A y con el indicativo "Ctrl." a la derecha, se obtuvo de una solución que contenía los péptidos que comprenden los aminoácidos 12 a 29 (Pep. Aß. 12-29), 1 a 40 (Pep. Aß. 1-40) y 1 -42 (Pep. Aß 1-42) del péptido ß-amiloide. El gráfico inferior, indicado con la letra B y con el indicativo "EM5+PM" a la derecha, se obtuvo tras la concentración de los péptidos a partir de la solución que los contenía mediante el uso del anticuefo EM5 unido covalentemente a partículas magnéticas y separación de los complejos formados mediante el uso de un campo magnético. El dibujo de la zona inferior derecha representa la zona de unión del anticuefo a cada uno de los péptidos considerados.

La Fig. 7 muestra un gráfico obtenido mediante el análisis por espectrometría de masas MALDI-TOF de una muestra de orina de un individuo sano a la que se le habían añadido cantidades adicionales de los péptidos que comprenden los aminoácidos 12 a 28 (pico marcado como Pep. 12-28), 1 a 40 (pico marcado como Pep. 1-40) y 1-42 (pico marcado Pep. 1-42) del péptido ß-amiloide, tras lo cual la muestra se trató con el anticuefo EM5 unido covalentemente a partículas magnéticas y se separaron los complejos formados mediante el uso de un campo magnético. En el eje de ordenadas se representa el porcentaje de intensidad (% Int.) correspondiente a cada uno de los picos de diferente masa (Ms.), deducida a partir de la relación masa/carga (m/z). Se indican los picos correspondientes a cada uno de las formas del péptido ß-amiloide añadidas a la muestra de orina.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se ha comentado anteriormente, la invención se refiere a un anticuefo monoclonal, EM5, que reconoce en el péptido ß-amiloide el epítopo correspondiente a la secuencia: Val-His-His-Gln-Lys (SEQ ID NO:3) Esta secuencia se corresponde con la de los residuos 12-16 del péptido ß-amiloide humano. En consecuencia, sería esperable que el citado anticuefo fuera capaz de unirse a isoformas del péptido ß-amiloide que contuvieran dicha secuencia, no reconociendo aquellas que carecieran de ella como, por ejemplo, el denominado péptido p3 (Aß?7-42) y otras formas con el extremo amino truncado (Aß?7-?). En la caracterización del anticuefo monoclonal que se describe detalladamente en los ejemplos posteriores se demuestra que EM5 se une a cualquier péptido que contenga los residuos 12 a 16 de la secuencia del Aß humano, aún presentando modificaciones fuera de esta región, y no reconoce péptidos que estén desprovistos de dicha región. Si la región se modifica, como es el caso del péptido Aß?-28(roedor), que presenta un cambio de aminoácido en la posición 13, además de en las posiciones 5 y 10, el péptido deja de ser reconocido por EM5. Además, los estudios muestran que el anticuefo es capaz de unirse a isoformas del péptido Aß que contienen los residuos 12 a 16 independientemente de si las mismas se encuentran en forma soluble, agregada o desnaturalizada (en SDS). En particular, las pruebas descritas en los Ejemplos que se describen posteriormente demuestran que el anticuefo de la invención es capaz de unirse tanto a isoformas del péptido ß-amiloide que se encuentran agregadas, formando parte del placas presentes en muestras de tejido cerebral, como a isoformas del péptido ß-amiloide que se encuentren en solución, incluso si la solución es una muestra de fluido biológico como puede ser la orina. Por ello, otro de los aspectos de la invención se refiere a una composición que contenga el anticuefo de la invención, o al menos un fragmento del mismo capaz de unirse a SEQ ID NO:3, acoplados a alguna sustancia que permita su detección y/o su concentración, y a su uso en el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer. Cuando el anticuefo de la invención o un fragmento del mismo estén acoplados a alguna sustancia que permita su detección, la detección de la presencia de las isoformas del péptido ß-amiloide que se hayan unido al anticuefo o un fragmento del mismo y/o la cuantificación de las mismas podrá hacerse mediante la detección y/o cuantificación del anticuefo o de su fragmento unidos a isoformas del péptido ß-amiloide que contengan la secuencia específica reconocida por el anticuefo de la invención. En una realización preferida de la invención, la sustancia a la que se acopla el anticuefo, o un fragmento del mismo capaz de unirse a SEQ ID NO:3, es un segundo anticuefo capaz de unirse al anticuefo monoclonal de la invención, estando el segundo anticuefo unido a una enzima capaz de catalizar la transformación de una determinada sustancia en otra que posea unas características que hagan fácil la detección de su presencia. En la realización que más se prefiere de la invención, el segundo anticuefo unido a una enzima es parte del sistema Envision, de Laboratorios Dako, siendo la sustancia cuya transformación es catalizada por la enzima un cromógeno y siendo la enzima que cataliza la reacción o bien fosfatasa alcalina (utilizándose entonces como cromógeno azul de nitro-tetrazolio) o peroxidasa de rábano (utilizándose entonces como cromógeno diaminobencidina). Otra posibilidad es que el anticuefo de la invención o un fragmento del mismo estén unidos a alguna sustancia o partícula que facilite la concentración de las isoformas del péptido ß-amiloide que se hayan unido a dicho anticuefo o a su fragmento. Esta realización se prefiere cuando la composición de la invención vaya a utilizarse para la detección y/o cuantificación de isoformas del péptido ß-amiloide que se encuentren en solución, especialmente en una solución en la que su concentración sea baja, como puede ser la sangre o el plasma, la orina o el líquido cefalorraquídeo. La sustancia o partícula será tal que permita la separación fácil del complejo antígeno-anticuefo de dicha disolución, por ejemplo, por inmunoprecipitación. Un ejemplo preferido de dichas partículas son las partículas magnéticas que, al estar acopladas al anticuefo de la invención o a un fragmento del mismo capaz de unirse a isoformas del péptido ß-amiloide que contengan la secuencia específica reconocida por el anticuefo de la invención, permitirán la extracción de la solución de las isoformas del péptido ß-amiloide unidas al anticuefo o a un fragmento del mismo si se aplica un campo magnético adecuado. Posteriormente, las isoformas del péptido ß-amiloide pueden separarse del anticuefo o del fragmento del mismo para proceder a su detección, identificación y/o cuantificación. Un método adecuado para ello puede ser la espectrometría de masas, en especial la conocida como MALDI-TOF (iniciales de la expresión inglesa Matrix Assisted Láser Desorption Ionization Time-of-ßight, es decir, la espectrometría de masas de desorción/ionización por láser, asistida por una matriz, realizada en tiempo de vuelo). Como se ha mencionado, el anticuefo de la invención o un fragmento del mismo capaz de unirse a isoformas del péptido ß-amiloide que contengan la secuencia específica reconocida por el anticuefo de la invención, así como las composiciones que contengan al menos uno de ellos, pueden utilizarse para el diagnóstico in vitro de la enfermedad de Alzheimer. Los métodos de diagnóstico in vitro de la enfermedad de Alzheimer que hagan uso del anticuefo de la invención o de un fragmento del mismo capaz de unirse a isoformas del péptido ß-amiloide que contengan la secuencia específica reconocida por el anticuefo de la invención, así como los que hagan uso de composiciones que incluyan dicho anticuefo o dicho fragmento, están incluidos dentro del alcance de la invención. Dicho diagnóstico puede realizarse sobre tejido cerebral, en el que se pone de manifiesto selectivamente la presencia de depósitos en los que predominen isoformas del péptido amiloide que contengan la secuencia reconocida por el anticuefo monoclonal de la invención (placas neuríticas y depósitos vasculares, depósitos característicos del desarrollo de la enfermedad de Alzheimer) revelando la existencia de unión a dichos depósitos del anticuefo monoclonal de la invención, o de un fragmento del mismo capaz de unirse a la secuencia específica reconocida por dicho anticuefo, a diferencia de lo que sucedería con los depósitos en los que las isoformas predominantes fueran aquellas que carecen de la secuencia reconocida por el anticuefo monoclonal de la invención (placas difusas), las isoformas Aß?7.?, que no presentarían unión del anticuefo monoclonal o de fragmentos del mismo. La unión del anticuefo a placas neuríticas y depósitos vasculares se pone de manifiesto mediante una composición como puede ser una de las que comprenden, además del anticuefo de la invención o un fragmento del mismo, un segundo anticuefo capaz de unirse al anticuefo monoclonal de la invención, estando el segundo anticuefo unido a una enzima capaz de catalizar la transformación de una determinada sustancia en otra que posea unas características que hagan fácil la detección de su presencia, como puede ser un cromógeno. En la realización del método diagnóstico de la invención sobre tejido cerebral que más se prefiere, el método de diagnóstico se complementa mediante la utilización adicional de los anticuefos policlonales EM2 y EM3, que reconocen o Aß?.42 (EM3) o Aß?. 0 (EM2), ambos anticuefos también desarrollados previamente por el grupo de los autores de la invención [24]. Otra realización del método diagnóstico de la invención se lleva a cabo en un fluido biológico que se sepa que contiene isoformas del péptido ß-amiloide, como puede ser el líquido cefalorraquídeo, la orina o la sangre o, en este último caso, el plasma derivado de la misma. Dado que la obtención de líquido cefalorraquídeo implica la realización de una punción, se prefiere la utilización de plasma o de orina, especialmente de esta última, que no lleva implícita la utilización de técnicas invasivas para su obtención. Se prefiere entonces que el método diagnóstico de la invención haga uso de composiciones que comprendan el anticuefo de la invención o un fragmento del mismo unidos a alguna sustancia o partícula que facilite la concentración de las isoformas del péptido ß-amiloide que se unan a dicho anticuefo o a un fragmento del mismo. Tal como se ha comentado, se prefiere que las partículas que faciliten la concentración de las isoformas del péptido ß-amiloide sean partículas magnéticas acopladas al anticuefo o a un fragmento del mismo, de manera que, al someter la solución que contenga los complejos formados con las isoformas del péptido ß-amiloide a la acción de un campo magnético, puedan extraerse éstos de la solución, que se puede desechar con facilidad mediante algún método como la aspiración. En el caso de utilizarse un anticuefo completo, se prefiere especialmente que el acoplamiento del anticuefo a la partícula magnética se produzca mediante un enlace covalente, para aumentar su estabilidad, pero que el establecimiento de dicho enlace covalente se produzca de manera que se evite en lo posible la zona de unión al antígeno, para no disminuir la capacidad de unión del anticuefo, por lo que se prefieren los métodos en los que unión se produzca preferentemente en la zona rica en histidinas del fragmento Fe del anticuefo o en las cadenas glicosídicas de dicha zona. En esta línea, se prefiere particularmente el método de unión de los anticuefos a partículas magnéticas descrito por Fuentes et al. [26]. Una vez separados los complejos de unión de las isoformas del péptido ß-amiloide de la solución, se prefiere la separación de dichas isoformas de los anticuefos o de los fragmentos de los mismos previamente a la detección y/o cuantificación de las isoformas de péptido ß-amiloide extraídas, para lo cual pueden utilizarse acetonitrilo y ácido trifluoroacético. Dado que la concentración de isoformas de péptido ß-amiloide en orina no suele ser elevada, se prefiere que la detección y/o cuantificación se produzca mediante algún método muy sensible como puede ser la espectrometría de masas MALDI-TOF. Otro de los aspectos de la invención es una línea celular de hibridoma capaz de producir el anticuefo monoclonal de la invención. En una realización preferida de la invención, dicha línea celular se obtiene mediante la fusión con la línea de mieloma de ratón P3/X63-Ag.653 de células de bazo de ratones BALB/c inmunizados con péptido Aßi. 4o acoplado a KLH (hemocianina de lapa californiana). Por último, un aspecto más de la invención es un método de producción y purificación del anticuefo monoclonal de la invención a partir de células de hibridoma. En la realización preferida de la invención, el método consiste en la producción de una línea celular de hibridoma como la anteriormente descrita y su crecimiento como fluido ascítico en ratones BALB/c previamente tratados con Pristane. El anticuefo monoclonal se purifica de ese fluido ascítico mediante cromatografía de afinidad en una columna de proteína A-Sefarosa (Pharmacia). En una realización particularmente preferida de la invención, las células de hibridoma utilizadas para ello son las de la línea denominada "EM5 clone A", cuyo depósito se ha solicitado el día 1 de Marzo de 2006 en la European Collection of Cell Cultures (Colección Europea de Cultivos Celulares, ECACC), CAMR, Portón Down, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido, habiendo recibido el número de acceso 06030101.

La invención y sus realizaciones preferidas se describen ahora con más detalle mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplos.- Ejemplo 1.- Producción de anticuerpos La producción de los anticuefos policlonales EM2 y EM5 empleados en este estudio se llevó a cabo tal como se ha publicado previamente [24]. Para la producción del anticuefo monoclonal EM5 se llevaron a cabo los siguientes pasos: Obtención de hibridomas Se inyectaron de forma subcutánea a ratones BALB/c 40 µg de péptido Aß?_ o acoplado a KLH (hemocianina de lapa californiana) y disuelto en tampón fosfato salino (PBS) y emulsionado con un volumen igual de coadyuvante de Freund completo. Los ratones recibieron tres inyecciones repetitivas cada dos semanas en coadyuvante de Freund incompleto. Tres días antes de la fusión, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de 25 µg de Aß?_ 0 -KLH en PBS. El día de la fusión, se fusionó células de bazo de los animales inmunizados con la línea de mieloma de ratón P3/X63-Ag.653 utilizando polietilenglicol 1400 (Sigma), siguiendo procedimientos establecidos [25]. Las células fusionadas se distribuyeron en placas estériles de 96 pocilios a una densidad de 105 células por pocilio y se seleccionaron en medios que contenían hipoxantina, timidina y aminopterina. Los hibridomas productores de anticuefos se identificaron mediante el ELISA descrito más adelante.

Cribado de hibridomas. Se recubrieron durante toda la noche a 4°C placas de microtitulación de poliestireno (Maxisorb, Nunc) con Aß?_ 0, a 5 µg/ml en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6 (tampón de recubrimiento). Las placas se lavaron con Tween 20 al 0,05% en PBS (PBS-T) y se bloquearon los sitios de unión no específicos con albúmina de suero bovino (BSA) al 2% en PBS-T (solución de bloqueo) durante 1 hora a 37 °C. Después de lavar, se incubó las placas durante 1 hora con sobrenadante de cultivo de tejidos diluido dos veces en solución de bloqueo. Las placas se lavaron de nuevo y se incubaron con IgG de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano (Sigma) una hora a 37 °C. Después de lavar, se añadió la solución con el sustrato (o-fenilendiamina al 0,05% y peróxido de hidrógeno al 0,015% en tampón citrato 100 mM, pH 5,0). La reacción se paró 10 minutos más tarde con ácido sulfúrico 2,5 M y se determinó la absorbancia a 492 nm en un lector de microplacas. Se seleccionaron los hibridomas cuyos sobrenadantes produjeron un valor de absorbancia al menos dos veces superior al obtenido con el sobrenadante de hibridomas no relacionados (anticuefos anti-gliadinas). Los hibridomas que producían anticuefos específicos se clonaron repetidamente mediante dilución limitante, y los isotipos de los anticuefos monoclonales se determinaron en sobrenadante de cultivo de células concentrado mediante inmunoprecipitación en gel utilizando un antisuero específico (Sigma). Los hibridomas seleccionados se hicieron crecer como fluido ascítico en ratones BALB/c previamente tratados con Pristane.

Purificación de anticuerpos monoclonales.

El anticuefo monoclonal EM5 se purificó del fluido ascítico mediante cromatografía de afinidad en una columna de proteína A-Sefarosa (Pharmacia). Los anticuefos purificados se dializaron profusamente en PBS y se almacenaron a - 85 °C hasta el momento de su uso.

Ejemplo 2.- Cálculo de la constante aparente de disociación: afinidad por los péptidos Aß)- 0 y Aß?-42 Se estudió mediante ELISA la afinidad de los anticuefo monoclonales EM5 y 6E10 utilizando los péptidos inmovilizados recién disueltos Aß?-40 y Aß?-42, péptidos que habían sido sintetizados en la instalación WM Keck de la Universidad de Yale utilizando la metodología del N-t-butiloxicarbonilo. Se revistieron placas de microtitulación de poliestireno (Immulon 2, Dynex Technology Inc., Chantilly, VA) durante 16 horas a 4 °C con 0,5 µg de péptido Aß?- o o Aß?_42 recién disuelto o agregado en tampón carbonato/bicarbonato pH 9,6. Después de bloquear con Superblock (Pierce Chemical Co.) se añadieron a los pocilios recubiertos con Aß concentraciones crecientes de EM5 purificado (0-0,5 nM en TBS-T, 100 microlitros por pocilio) y se incubaron durante 3 horas a 37 °C. El EM5 unido se detectó con el fragmento F(ab')2 de IgG de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano (1 :3000, Amersham). La reacción se desarrolló durante 15 minutos con 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) (BioRad, Hercules, CA.), se paró con ácido sulfúrico 2 M y se cuantifícó en un lector de microplacas (Cambridge Technology, Watertown, MA) a 450 nm. La afinidad del anticuefo comercialmente disponibles 6E10 (Senetek, PLC) se estudió siguiendo un protocolo similar utilizando preparaciones de anticuefos IgG purificados. El análisis de regresión no lineal, la estimación de las constantes aparentes de disociación y la comparación de los datos de unión de proteínas para averiguar la significación estadística mediante el cálculo de las ratios F se evaluaron empleando el software Prism de GraphPad (GraphPad, San Diego, CA). La Figura 1 muestra las curvas de saturación correspondientes a la unión en el ELISA de los anticuefos monoclonales EM5 y 6E10 a péptidos Aß recién disueltos y agregados. En todos los casos, se observó una elevada afinidad con constantes aparentes de disociación en el rango picomolar. Ninguno de estos anticuefos mostró una afinidad diferencial por las formas de Aß recién preparadas o agregadas. De forma interesante, mientras que 6E10 mostró una afinidad equivalente por Aß?-4o y Aß?.42, EM5 mostró una afinidad mayor por Aß 42 que por Aß 40 (p<0,01) (13,7 pM y 15,5 pM por Aß 42 recién preparado y agregado, respectivamente; y 37,5 pM y 37,0 pM por Aß 40 recién preparado y agregado, respectivamente).

Ejemplo 3.- Análisis por inmunotransferencia Se estudió y comparó el reconocimiento específico de Aß?.4o y Aß?-42 por parte de EM5 con los anticuefos policlonales EM2 y EM3 mediante análisis por inmunotransferencia. Para ello, se sometieron péptidos Aß (0,5 µg/calle) a electroforesis PAGE en acrilamida al 16%, tris-tricina-SDS. Los péptidos se transfirieron electroforéticamente durante 1 hora a 400 mA y 4°C a membranas de poli(fluoruro de vinilideno) (Immobilon-P, Millipore) utilizando ácido 3-ciclohexilamino-l- propanosulfónico, pH 1 1 , que contenía metanol al 10%. Las membranas se bloquearon durante 16 h a 4 °C con TBS-T que contenía leche descremada en polvo al 5% y se incubaron luego durante 1 hora a temperatura ambiente con 2 µg/ml de las IgG EM2, EM3 o EM5. Como segundo anticuefo se empleó una IgG de cabra anti-conejo (EM2 y EM3) o anti-ratón (EM5) acoplada a peroxidasa de rábano (Amersham) y diluida 1 :2.000. Las inmunotransferencias se visualizaron mediante quimioluminiscencia (Amersham) siguiendo las especificaciones del fabricante. Los resultados se muestran en la Figura 2. En ella puede apreciarse que, en los experimentos de inmunotransferencia, EM5 mostró inmunorreactividad frente a los péptidos tanto Aß?- o como Aß?-42 (corroborando los resultados obtenidos por ELISA), mientras que los anticuefos EM2 y EM3 fueron capaces de reconocer sólo los péptidos Aß?_ o ? Aß?- 2, respectivamente, como se ha descrito anteriormente [24]. Estos resultados apoyan la idea de que el anticuefo monoclonal EM5 se une a un epítopo lineal específico común a ambos péptidos, que se conserva en las muestras tratadas con SDS. En conjunto, nuestros resultados indican que EM5 es capaz de reconocer péptidos Aß en las formas soluble, agregada y desnaturalizada (en SDS), con una unión ligeramente preferencial con Aß 42, probablemente como resultado del incremento de la hidrofobicidad del péptido.

Ejemplo 4.- Localización del epítopo Con el fin de localizar con precisión el epítopo exacto reconocido por el anticuefo EM5, se analizó la unión del anticuefo a una serie de péptidos Aß sintéticos. De ellos, los péptidos AßM 6, Aß?.28 y Aß25-35 se adquirieron a Sigma (San Luis, MO); los péptidos Aß?_ 42, Aß,.42(E22Q), Aß,.40, Aß,.40(E22G), Aß,-40(E22Q), Aß1.28(roedor), Aß,.28(E22Q), Aß17. 4o, Aß?6-42 y Aß25-35 se sintetizaron en la instalación WM Keck de la Universidad de Yale utilizando la metodología del N-t-butiloxicarbonilo; Aß2i-28, Aß2?.28(E22Q), Aß3 -4? y Aß37. o se sintetizaron en la Unidad de Síntesis de Péptidos (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid) utilizando la metodología normal del Fmoc. El diseño de los péptidos Aß37.4 y Aß37-49 incluía una cola en el extremo amino con un residuo de cisteína para el acoplamiento que tenía la secuencia CSGGSGGG (SEQ ID NO:4). Todos los péptidos se purificaron mediante cromatografía líquida de alta eficacia en el modo de fase inversa y su pureza se evaluó mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. a) ELISA de captura de anticuerpos Para realizar el ensayo, se recubrieron placas de microtitulación de poliestireno de fondo plano (Immulon 2, Dynex Technology Inc., Chantilly, VA) durante 16 horas a 4 °C con 1 µg/pocillo del correspondiente péptido Aß en tampón carbonato-bicarbonato 0,1 M, pH 9,6. Después de bloquear con NaCl 150 mM, Tris 20 mM, Tween-20 al 0,05%, pH 7,4 (TBST) que contenía BSA al 2%, se incubaron diluciones seriadas del anticuefo EM5 (de 20 a 0,02 mg/ml de la fracción de las IgG) durante 1 hora a 37°C. Se aplicó entonces una IgG anti-ratón acoplada a peroxidasa (Sigma, San Luis, MO) y diluida 1 :2000 durante 30 minutos a 37°C. La reacción se desarrolló con TMB (BioRad, CA), se paró con ácido sulfúrico 2M y se cuantificó a 450 nm. La unión inespecífica se determinó omitiendo los primeros anticuefos. Los resultado se muestran en la Figura 3, en cuya parte superior aparece un diagrama de barras correspondiente a los valores de absorbancia obtenidos correspondientes a la incubación de 20 µg/ml del anticuefo con cada uno de los péptidos. EM5 demostró unirse a cualquier péptido que contuviera los residuos 12 a 16 de la secuencia del Aß humano y no logró reconocer péptidos desprovistos de esta región. Es más, variantes mutantes con modificaciones fuera de esta región (Aß?-42(E22Q), Aßi. 40(A21G), Aß?- 0(E22G), Aß?-40(E22Q)) mostraron una unión similar al compararlas con el péptido de tipo silvestre, mientras que el péptido Aß?.28(roedor), que muestra tres cambios de aminoácidos en las posiciones 5, 10 y 13, no fue reconocido por EM5. b) Análisis por espectrometría de masas del péptido ß-amiloide digerido e inmunoprecipitado Para confirmar los resultados, se realizó un estudio complementario en el que un juego de péptidos derivados de Aß?.42, generados por digestión con tripsina o a-quimotripsina, se pusieron en contacto con partículas magnéticas recubiertas con anticuefo EM5. Para ello se siguieron los siguientes pasos: Para digerir el péptido, a una alícuota de 10 µl de péptido ß-amiloide en bicarbonato amónico 50 mM que contenía 1 µg de péptido se le añadieron 0,5 µl de tripsina o a-quimotripsina que contenían 0,025 µg de la enzima. La incubación se llevó a cabo durante 2 horas a 37 °C. En la Tabla I se muestran esquemáticamente las digestiones llevadas a cabo. Para realizar la inmovilización del anticuefo monoclonal EM5 sobre partículas magnéticas, se incubó una alícuota de 5 µl (1 ,1 mg/ml) de EM5 con 50 µl de Dynabeads M450 recubiertas con IgG de cabra anti-ratón a temperatura ambiente durante 2 horas. El complejo se lavó 4 veces con PBS con mezcla bidireccional (en un rotor). Para efectuar la inmunoprecipitación, se incubó una alícuota de 10 µl del péptido ß-amiloide digerido con tripsina (o a-quimotripsina) con 50 µl de EM5 inmovilizado sobre partículas magnéticas en un rotor durante 1 hora a 37 °C. El complejo magnético-inmunoprecipitado se lavó 4 veces con PBS en el mismo rotor y se aspiraron y descartaron los sobrenadantes. Para llevar a cabo el análisis de espectrometría de masas del péptido ß-amiloide inmunoprecipitado digerido los péptidos inmunoprecipitados contenidos en los complejos magnéticos se liberaron con 20 µl de acetonitrilo al 50 %/ ácido trifluoroacético al 0,3 %. Se mezclaron 5 µl de esta solución con 5 µl de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico saturado en ácido trifluoroacético al 0,1 % / acetonitrilo (2:1). Un volumen de 0,5 µl de esta solución se depositó después en una sonda de acero inoxidable en forma de punta y se dejó que se secara a temperatura ambiente. Las muestras se midieron en un espectrómetro de masas para MALDI-TOF Reflex II de Bruker equipado con una fuente de iones con óptica de visualización y un láser de N2 (337 nm). Los espectros de masas se recogieron en el modo positivo lineal a un voltaje de aceleración de 28,5 kV y 1,5 kV en el detector lineal, acumulando 200 espectros de disparos únicos de láser por debajo del umbral de irradiancia. Sólo se consideraron las señales de masas bien resueltas, de elevada intensidad, surgidas de 3-5 puntos de incidencia seleccionados. Todos los espectros MALDI se calibraron externamente utilizando una mezcla de péptidos normalizada [angiotensina II (1047,2), fragmento 18-39 de la hormona adrenocorticotrópica (2466,7) e insulina (5734,6); Sigma]. Las características de los péptidos analizados, así como los datos obtenidos, se resumen en la Tabla I siguiente: Tabla I.- Datos de espectrometría de masas MALDI-TOF obtenidos para fragmentos obtenidos por digestión del péptido ß-amiloide Las secuencias de cada uno de estos péptidos (1-5) y del péptido sin digerir (6) se muestran en la Figura 4, en la que se ha sombreado la zona que parece corresponder al epítopo reconocido por el anticuefo EM5 según los resultados de espectroscopia de masas MALDI-TOF del material inmunoprecipitado. Como puede apreciarse en dicha Figura 4, el análisis por espectroscopia de masas MALDI-TOF del material inmunoprecipitado demuestra que EM5 fue capaz de extraer de la mezcla de digestión cada fragmento de péptido que contenía los residuos 11-16 (regiones sombreadas). No se recuperaron de la solución fragmentos de péptido fuera de esta región. Estos resultados confirman los datos obtenidos mediante ELISA y análisis por inmunotransferencia. En conclusión, la reactividad diferencial del anticuefo frente a una serie de péptidos Aß indica que EM5 reconoce los residuos 1 1-16 de los péptidos Aß. De entre ellos, la participación de los residuos 12-16 es fundamental, como lo demuestra el hecho de que la mutación del residuo 12 en el péptido Aß?_28 de roedor (1-28 R) impida su reconocimiento por parte del anticuefo; por su parte, la implicación del residuo 1 1 (E) en la conformación del epítopo no puede descartarse aunque los datos obtenidos no la confirman por completo.

Ejemplo 5.- Inmunohistoquímica: reactividad tisular de los anticuerpos Para demostrar la validez del anticuefo EM5 para poner de manifiesto depósitos característicos de la enfermedad de Alzheimer (placas neuríticas y depósitos vasculares) frente a las placas difusas, se realizaron inmunotinciones de secciones de tejido cerebral afectado por la enfermedad de Alzheimer utilizando los anticuefos EM2 (un anticuefo policlonal dirigido al extremo carboxilo del péptido Aß 40), EM3 (un anticuefo policlonal dirigido al extremo carboxilo del péptido Aß 42) y EM5 (un anticuefo monoclonal con especificidad demostrada por los residuos 12-16 del péptido Aß). Tanto EM2 como EM3 se han utilizado ya en un estudio anterior [24], Procesamiento de tejido cerebral y áreas seleccionadas para inmunohistoquímica. El tejido cerebral fue proporcionado por el Banco de Tejidos para Investigaciones Neurológicas, Madrid. Se incluyeron en el estudio seis sujetos, 3 varones y 3 hembras, con EA definida. Las edades oscilaban entre 68 y 75 años. En todos los casos se hizo un diagnóstico de EA según las directrices clínico-patológicas del CERAD (Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease: Consorcio para el Establecimiento de un Registro de la Enfermedad de Alzheimer) [10]. Ninguno de los pacientes presentó otros hallazgos neuropatológicos relevantes, por ejemplo enfermedad de Parkinson o cambios vasculares significativos. Todos los cerebros se procesaron para su estudio histológico siguiendo los protocolos de corte, fijación e inclusión del Brain Bank. Los períodos post-mortem oscilaron entre 10 y 18 horas. Inmediatamente después de la autopsia se fijó una mitad del cerebro (obtenida por medio de una sección medio-sagital de los hemisferios cerebrales, cerebelo y tronco encefálico) en formaldehído tamponado con fosfato al 4%. Después de 3-4 semanas de fijación, se obtuvieron bloques de tejido de todas las áreas corticales y subcorticales implicadas de modo significativo en la EA, y se incluyeron en paraf?na después de una deshidratación progresiva en etanol y aclarado del tejido con xilol. En todos los casos se obtuvieron de los bloques de parafina originales para su estudio inmunohistoquímico secciones de tejido de 5 µm que correspondían al córtex parieto-occipital lateral, córtex temporal lateral (estas dos últimas áreas según lo recomendado por las directrices del CERAD [10]), hipocampo, caudado - putamen (a nivel de la cabeza del núcleo caudado), y córtex del hemisferio cerebeloso. Como control de tinción amiloide inespecífica, se llevó a cabo una tinción con metenamina - plata modificada en secciones consecutivas a las procesadas para la inmunohistoquímica amiloide.

Anticuerpos y protocolos de inmunotinci?n Los anticuefos primarios empleados fueron EM2, EM3, y EM5. Tanto EM2 como EM3 se han utilizado en un estudio anterior [24]. Las secciones se incubaron con anticuefos primarios a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los anticuefos policlonales se revelaron con el sistema Envision (Laboratorios Dako) con fosfatasa alcalina (FA) utilizando azul de nitro-tetrazolio (NBT) como cromógeno, y el EM5 se reveló o con el sistema anterior o con el sistema Envision (Dako Laboratories) con peroxidasa de rábano (HRP) utilizando diaminobencidina (DAB) como cromógeno. En el caso de las técnicas de colocalización los anticuefos policlonales se revelaron siempre con el sistema Envision con FA (utilizando NBT como cromógeno), mientras que el EM5 se reveló con el sistema Envision con HRP (utilizando DAB como cromógeno).

Inmunotinci?n doble y simple. Se utilizaron técnicas de inmunotinción doble utilizando EM5 como primer anticuefo primario y EM2 o EM3 como segundo anticuefo primario, como trabajo preliminar con el fin de establecer el grado de colocalización de cada par de anticuefos, junto con la dilución óptima de trabajo de cada uno de ellos. Durante esta fase del estudio, que se restringió a secciones de tejido del córtex parieto-occipital de dos de los casos, se estableció que el uso de EM5 como primer anticuefo primario descartaba un efecto enmascarador de los otros dos anticuefos, cuando se empleaban como primer anticuefo durante la técnica de inmunotinción doble. En secciones seriadas de ambos bloques de parafina seleccionados se colocalizaron diluciones crecientes (1 :50, 1 : 100, 1 :500, 1 : 1000 y 1 :2000) de EM5 con diluciones decrecientes (1 :2000, 1 : 1000, 1 :500, 1 : 100 y 1 :50) de EM2 o de EM3. Como se encontró así que el anticuefo EM2 se colocalizaba en alto grado con EM5, el resto del estudio se dirigió a mostrar el patrón diferencial de reactividad mostrado por EM5 y EM3. Con este propósito, la posterior inmunotinción doble en secciones de todas las áreas seleccionadas en todos los casos se limitó al uso de EM5 (a una dilución 1 : 1000) como primer anticuefo primario y EM3 (a una dilución 1 : 1000) como segundo anticuefo primario. De forma adicional, con el fin de visualizar con más precisión el patrón de reactividad mostrado por cada anticuefo en el mismo tejido, se llevó a cabo una inmunotinción simple en secciones seriadas de cada bloque utilizando EM5, EM2 o EM3 como anticuefo primario. Como el objetivo principal de esta parte del estudio es comparar cualitativamente diferentes patrones de inmunorreactividad, más que diferencias cuantitativas entre anticuefos, los resultados de las tinciones no se cuantificaron.

Resultados Los resultados de uno de los casos pueden apreciarse en la Figura 5, presentados con la distribución que se mencionó anteriormente, es decir: - (A) y (B): Secciones seriadas consecutivas de la misma zona del córtex occipital inmunoteñidas con EM5 (A) y EM 3 (B) como anticuefo primario, utilizando NBT como cromógeno. Se han marcado los vasos (V) para facilitar la localización de las placas. Mientras que EM3 (B) pone de manifiesto tanto placas difusas (DP) como neuríticas (NP), así como depósitos en los vasos sanguíneos (V), EM5 (A) tiñe con más intensidad tanto vasos sanguíneos como algunas placas neuríticas, aunque no placas difusas. - (C) Micrografía con alto grado de magnificación de una técnica de inmunotinción doble utilizando EM3 (utilizando NBT -color azul- como cromógeno) y EM5 (utilizando DAB -color marrón- como cromógeno) como anticuefos primarios. Se observa una doble inmunotinción de las placas neuríticas y la pared de los vasos. - (D) y (E): Secciones seriadas consecutivas de la misma área del córtex occipital inmunoteñidas o con EM5 (D) o con EM2 (E). De nuevo, se han marcado los vasos (V) para ayudar en la identificación de las placas. Se observa que tanto los vasos como las placas neuríticas reaccionan con ambos anticuefos. Se tiñen menos placas neuríticas con EM2 que con EM5, y ninguna placa difusa reacciona con ninguno de ellos. - (F) Microfotografía con alto grado de magnificación de una técnica de inmunotinción doble empleando EM2 (utilizando NBT -color azul- como cromógeno) y EM5 (utilizando DAB -color marrón- como cromógeno) como anticuefos primarios en la misma sección de tejido del córtex occipital. Se observa una precisa colocalización de la reactividad de ambos anticuefos en la pared del vaso y las placas neuríticas. Todos los casos salvo uno mostraron depósitos amiloides vasculares prominentes leptomeníngeos e intracorticales que reaccionaban con todos los anticuefos ensayados. En todos los casos positivos la inmunorreactividad de los depósitos amiloides vasculares fue más marcada (más extensa e intensa) tanto con EM2 (Fig. (5E)) como con EM5 (Fig. (5A) y (5D)) que con EM3 (Fig. (5B)). EM2 y EM5 se colocalizan exquisitamente a este nivel (Fig. (5F)). Como se esperaba, las áreas neocorticales y el hipocampo mostraron una alta densidad de placas difusas y neuríticas, mientras que el córtex del cerebelo y el cuefo estriado mostraron sólo depósitos amiloides difusos. Las secciones incubadas con el anticuefo EM3 mostraron reactividad con placas tanto difusas como neuríticas (Fig. (5B)). Cuando se compararon con secciones sucesivas teñidas con el método de metenamina - plata modificado, se demostró que EM3 teñía todas las placas presentes en cada sección. Adicionalmente, el anticuefo EM3 teñía algunos cuefos neuronales. Tanto EM2 como EM5 tiñeron placas neuríticas inmaduras (sin núcleo) y maduras (con núcleo), de nuevo con un alto grado de colocalización (Fig. (5F)). EM2 no reaccionó con ninguna placa difusa ni en la región cortical ni en la subcortical (Fig. (3E)). La inmunotinción doble con EM5 y EM3 revela la colocalización de ambos anticuefos en algunas placas neuríticas, pero no en placas difusas (Fig. (5C)), aunque se encontró algo de colocalización a este nivel cuando se incubó EM5 a una dilución muy baja (1 :50). Sólo en un caso que mostraba abundantes placas difusas positivas para EM3 en secciones del cuefo estriado sí que tiñó EM5 algunas de ellas muy ligeramente a la dilución de trabajo (1 :500). Este mismo caso no mostró ninguna reactividad de las placas difusas como EM5 en el córtex del cerebelo. En todos los demás casos las secciones del cuefo estriado y del cerebelo mostraron una cantidad variable de placas difusas, ninguna de ellas reactiva frente al anticuefo EM5. Ni EM2 ni EM5 parecieron teñir todas las placas neuríticas presentes (véanse las Fig. (5A, D)). Sin embargo, como se había observado en el caso de la inmunorreactividad de los depósitos amiloides vasculares, las placas neuríticas reactivas frente a EM2 o EM5 se tiñeron más intensamente que con EM3. Salvo por la negatividad de los vasos frente a todos los anticuefos en un único caso y la ligera positividad de algunas placas difusas del cuefo estriado en ese mismo cerebro, se puede considerar que todos los casos muestran patrones de tinción similares para cada anticuefo ensayado.

Por tanto, en contraste con el patrón de tinción más bien uniforme observado en las placas difusas, el panel de anticuefos detectó heterogeneidad dentro de las placas neuríticas, lo que resulta relevante para indicar etapas concretas en el proceso de evolución de las placas difusas para convertirse en placas neuríticas. El anticuefo EM5 tiñó intensamente todas las estructuras (placas neuríticas y paredes de los vasos) teñidas por EM2 y teñidas de forma variable por EM3. Un subconjunto de placas neuríticas demostró tener un patrón de tinción idéntico al amiloide vascular, con una elevada colocalización de reactividad frente a EM2 y EM5. La invención muestra que EM5 debería reaccionar con todas las estructuras que contienen o Aß <n- o o Aß <p-42. De hecho, los resultados de los ELISA aquí presentados muestran que el anticuefo EM5 reconoce formas tanto de reciente disolución como agregadas del péptido Aß. Sin embargo, en secciones de tejidos encontramos una variabilidad mayor en la tinción entre las placas neuríticas con EM5 que con los anticuefos policlonales, junto con una elevada colocalización de intensa reactividad frente a EM5 con EM2 (Aß C40). Una tinción relativamente más intensa en estas placas positivas puede revela un subgrupo de placas neuríticas o bien con un contenido particularmente elevado de péptidos Aß largos, o selectivamente alto de Aß C40, o incluso una accesibilidad particular del epítopo reconocido por EM5 en estructuras (vasos o placas) que muestran codeposición de Aß <n-4o y Aß <n. 2. El anticuefo de la invención parece detectar el mismo subconjunto de placas neuríticas Aß C40 (+) detectado anteriormente por Parvathy et al. [22]. Este subconjunto de placas neuríticas con contenidos particularmente altos de péptidos Aß largos pueden ser hitos relevantes en la progresión de las lesiones amiloides en la EA que el anticuefo monoclonal de la invención permite poner de manifiesto. Por ello, el uso de EM5 puede permitir definir subconj untos de placas que constituyan un marcador específico del estadio de progresión de la enfermedad.

Ejemplo 6.- Capacidad de los anticuerpos para reaccionar con formas del péptñdo ß-amiloide en orina Para demostrar la validez del anticuefo EM5 para poner de manifiesto la presencia de formas del péptido ß-amiloide en fluidos biológicos, se realizó una prueba de detección de los mismos en muestras de orina de pacientes sanos, a las que se había añadido con posterioridad a su obtención una mezcla de péptidos sintéticos que correspondían a formas de distinta longitud del péptido ß-amiloide. Para ello, se añadió a las muestras de orina el anticuefo monoclonal, unido a partículas magnéticas y se procedió a la detección de los péptidos unidos mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Los detalles del procedimiento seguido se indican a continuación.

Unión del anticuerpo a partículas magnéticas Las partículas magnéticas acopladas al anticuefo EM5 se prepararon siguiendo el método descrito por Fuentes et al. [26], basado en la oxidación suave de los restos glicosídicos de las inmunoglobulinas para generar grupos aldehido, que se hacen reaccionar con partículas magnéticas en cuya superficie se han generado grupos amino mediante modificación con etilendiamina. Brevemente, se indujo la oxidación del anticuefo EM5 mediante la incubación con peryodato sódico 10 mM durante 2 horas, tras las cuales se dializó el anticuefo oxidado en agua destilada a 4°C. La modificación de las partículas magnéticas EM/100-30 (Merck Co, Francia), que poseen grupos carboxílicos en su superficie, se produjo mediante su incubación, a una concentración de 10 mg/ml, con etilendiamina 1 M pH 4J5, durante 90 minutos, tras los cuales se añadió EDCl (l-etil-3-(3'-dimetilaminopropil)carbodiimida hidrocloruro)sólido hasta una concentración final de 10 mM y se dejó que tuviera lugar la reacción durante 90 minutos, antes de lavar profusamente con agua destilada. La inmovilización del anticuefo sobre las partículas magnéticas se llevó a cabo tras añadir 10 mg del anticuefo EM5 oxidado, disuelto en tampón fosfato sódico 150 mM de pH 7,5, a 2 ml de partículas magnéticas (10 mg/ml) con grupos amino en su superficie a 4°C e incubando toda la noche. Las bases de Schiff formadas y los grupos aldehido sin reaccionar se redujeron mediante la adición de borohidruro sódico hasta alcanzar una concentración de 1 mg/ml, a pH 8,5 y 4°C. La preparación se lavó profusamente con agua destilada. La cantidad de anticuefo inmovilizado se determinó cuantificando la diferencia en concentración de proteínas en el sobrenadante antes y después de la inmovilización, utilizando el método de Bradford [27].

Detección de péptido ß-amiloide en solución Antes de comprobar su validez para unirse a isoformas de péptido ß-amiloide presentes en muestras de fluidos biológicos como puede ser la orina, se comprobó la capacidad del anticuefo de la invención para unirse a formas del péptido ß-amiloide en solución y si los anticuefos acoplados a partículas magnéticas permitían la extracción de formas del péptido ß-amiloide de soluciones en las que se encontraran para proceder a su posterior identificación y/o cuantificación. Para ello, péptidos sintéticos que correspondían a las formas del péptido ß-amiloide Aß?2-29, Aß?-40 y Aß?- 2, disueltos en agua destilada, se mezclaron en agua destilada para dar lugar a una mezcla con unas concentraciones finales de 0,44 µg/µl de Aß?2-29 y Aß?.42 y 0,1 1 µg/µl de Aß?-40. 4 µl de esta mezcla de péptidos se añadieron a 981 µl de agua. A continuación, se provocó la separación de las formas del péptido ß-amiloide presentes en solución en agua mediante el uso del anticuefo de la invención, utilizándolo acoplado a partículas magnéticas. El análisis por espectrometría de masas de las mezclas de péptidos separadas de la solución se muestra en la Fig. 6, en la que la parte A corresponde al análisis de la solución sin tratamiento previo con anticuefos (Ctrl.) y la parte B corresponde al uso del anticuefo unido a partículas magnéticas (EM5+PM). Como se ve, el anticuefo es capaz de unirse a formas del péptido ß-amiloide en solución y de formar complejos con ellas de forma que pueden separarse de dicha solución.

Preparación de la muestra de orina En distintos días, se recogieron muestras de 10 ml de orina de un individuo sano y se centrifugaron a 3500 fm a temperatura ambiente durante 5 minutos. La orina se neutralizó a pH 7,0 con NaOH 1M en tampón PBS. Péptidos sintéticos que correspondían a las formas del péptido ß-amiloide Aß?2-28, Aß?.40 y Aß?- 2, se mezclaron en agua destilada para dar lugar a una mezcla con unas concentraciones finales de 0,44 µg/µl de Aß|2-28 y Aß?- 2 y 0,11 µg/µl de Aß|.40. 4 µl de esta mezcla de péptidos se añadieron a 981 µl de orina. La concentración final de formas del péptido ß-amiloide en orina era 1 ,76 µg/ml en el caso de Aß?2-i8 y de Aß?.42 y 0,44 µg/ml en el caso de Aß]- 0.

Inmunoprecipitaci?n 15 µl de partículas magnéticas recubiertas con el anticuefo monoclonal EM5 (diluido 1 :4 en tampón PBS) se incubaron durante 1 hora a 37°C con 981 µl de la muestra de orina antes descrita, que contenía los tres péptidos ß-amiloides (Aß?2-i8, Aß?-40 y Aß?-42). Después de la incubación, se colocó el tubo en un separador imantado de partículas magnéticas y se extrajo cuidadosamente la orina utilizando una pipeta. Las partículas magnéticas con los péptidos unidos a ellas, retenidas por la acción del campo magnético del separador, se lavaron 3 veces con H2O. Los péptidos unidos a ellas se separaron de las partículas magnéticas con 12 µl de una solución de una matriz de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico en 30% (v/v) de acetonitrilo acuoso que contenía un 0,1% (v/v) de ácido trifluoroacético (TFA) y se analizaron mediante espectrometría de masas MALDI-TOF.

Detección de los péptidos inmunoprecipitados por espectrometría de masas 1,5 µl de la mezcla de la muestra resultante de la inmunoprecipitación en la matriz de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico se colocó en una sonda de acero inoxidable con capacidad para 100 muestras y se dejaron secar a temperatura ambiente durante 5 minutos.

Las muestras se midieron en una estación de trabajo para espectrometría de masas MALDI-TOF Voyager DE-PRO de PE Biosystems utilizando la configuración por defecto del aparato. Los espectros de masa de recogieron en el modo reflector positivo a un voltaje de aceleración de 20 kV y un voltaje del colector del 75%, 0,002% de filamento guía y 150 nanosegundos de tiempo de retraso, acumulando 200 espectros de disparos individuales de láser por debajo de la irradiación umbral. Sólo se consideraron las señales de masas bien resultas, de elevada intensidad, de 3-5 puntos de incidencia seleccionados. El equipo se calibró externamente empleando la mezcla de calibración 2, proporcionada por Applied Biosystems (Tres Cantos, Madrid, España), compuesta por angiotensina (1297 Da), ACTH 1-17 (2094 Da), ACTH 18-39 (2466 Da), ACTH 7-38 (3660 Da) e insulina bovina (2867 Da). La Fig. 7 muestra la gráfica obtenida con una de las muestras, representativa de las demás. Se observan picos correspondientes a los péptidos añadidos a la muestra de orina, lo que demuestra la capacidad del anticuefo de la invención para unirse a ellos en muestras de orina. Al haberse realizado el análisis con una muestra de un fluido biológico, se observan también otros picos, correspondientes a otras moléculas presentes de forma natural en la muestra y que se han unido también al anticuefo acoplado a partículas magnéticas.

Depósito del hibridoma El hibridoma que produce el anticuefo EM5 se depositó en la European Collection of Cell Cultures (Colección Europea de Cultivos Celulares, ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido. La fecha de depósito y el número de acceso se muestran a continuación: Denominación del hibridoma Fecha de depósito N° de acceso EM5 clone A 01.03.2006 06030101 Tal como se comentó anteriormente, estas células de hibridoma de obtuvieron mediante la fusión de dos tipos de células: a) linfocitos de bazo de ratones BALB/c, obtenidos tras la inmunización de los ratones utilizando como inmunógeno la forma del péptido ß-amiloide denominada Aß?.4?, que comprende los aminoácidos 1 a 40 de dicho péptido, acoplada a KLH, la hemocianina de lapa californiana; b) células de la línea de mieloma de ratón P3/X63-Ag653, que actuaban como parte inmortal de la fusión. Se obtuvieron varios clones, de los cuales se seleccionó el clon denominado "EM5 clone A", que produce el anticuefo monoclonal denominado "EM5", un anticuefo tipo IgGl capaz de reconocer específicamente el antígeno utilizado para la inmunización, el péptido según se comprobó mediante ensayos tipo ELISA de captura de anticuefos. Este clon se creció en medio de cultivo RPMI 1640 con 10% de suero fetal bovino, 10% de DMSO, glutamina 2 mM y piruvato sódico 1 mM, a 37°C y en una atmósfera con 5% de CO2, condiciones en las que el 95% de las células crecían en suspensión y el 5% restante adherido al recipiente de cultivo. Las células se clonaron dos veces mediante diluciones limitantes, tras lo cual se tomaron alícuotas de 4 x 106 células, que se introdujeron en viales. Una vez realizados controles de ausencia de bacterias, ausencia de micoplasmas y ausencia de hongos, se enviaron varios de estos viales a la European Collection of Cell Cultures (ECACC), solicitando la admisión de su depósito.

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Claims

REIVINDICACIONES 1. Un anticuefo monoclonal, caracterizado porque reconoce, en péptido ß-amiloide (Aß), por lo menos el epítopo correspondiente a la secuencia: Val-His-His-Gln-Lys (SEQ ID NO: 3) y es apto de enlazarse a isoformas del péptido ß-amiloide humano que contiene tal secuencia. 2. El anticuefo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque su afinidad de enlace a Aß?_42 es mayor que su afinidad de enlace a Aß?-4o, ambas medidas mediante ELISA. 3. El anticuefo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque es apto de enlazarse a depósitos de péptido ß-amiloide humano en tejido cerebral de individuos afectados por enfermedad de Alzheimer. 4. El anticuefo monoclonal de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque es apto de enlazarse selectivamente a placas neuríticas y depósitos amiloides vasculares. 5. El anticuefo monoclonal de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque es apto de mostrar una mayor afinidad de enlace por un subconjunto de placas neuríticas con una composición similar a aquella de los depósitos amiloides vasculares. 6. El anticuefo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es producido mediante la línea de célula de hibridoma ECACC 06030101. 7. Una línea celular de hibridoma, caracterizada porque es apta de producir el anticuefo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5. 8. La línea celular de hibridoma de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque es obtenida mediante fusión con la línea de mieloma de ratón P3/X63-Ag.653 de células de bazo de ratones BALB/c inmunizados con por lo menos un péptido que contiene la secuencia Val-His-His-His-Gln-Lys (SEQ ID NO: 3). 9. La línea celular de hibridoma de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque es obtenida mediante fusión con la línea de mieloma de ratón P3/X63-Ag.653 de células de bazo de ratones BALB/c inmunizados con el péptido Aß?-4o. 10. La línea celular de hibridoma de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque es obtenida mediante fusión con la línea de mieloma de ratón P3/X63-Ag.653 de células de bazo de ratones BALB/c inmunizados con el péptido acoplado a KLH. 1 1. La línea celular de hibridoma de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque comprende una muestra sustancialmente pura de ECACC 06030101. 12. El anticuefo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se usa en la diagnosis in vitro de enfermedad de Alzheimer a partir de una muestra de tejido cerebral tomado de un individuo que sufre de tal enfermedad. 13. El anticuefo monoclonal de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la etapa de avance de la enfermedad está correlacionada con la presencia en la muestra de un subconjunto de placas neuríticas reveladas debido a su enlace al anticuefo monoclonal. 14. Una composición, caracterizada porque comprende el anticuefo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, acoplado a una sustancia que permite que el anticuefo o fragmento del mismo sea detectado. 15. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la sustancia a la cual el anticuefo monoclonal es acoplado es un segundo anticuefo apto de enlazarse al primer anticuefo, este segundo anticuefo es enlazado a una enzima apta de catalizar la conversión de una sustancia particular a otra que puede ser detectada. 16. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la sustancia cuya conversión es catalizada mediante la enzima es un cromógeno. 17. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 y 16, caracterizada porque el segundo anticuefo es enlazado a fosfatasa alcalina y el cromógeno usado es nitroazul tetrazolio. 18. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 y 16, caracterizada porque el segundo anticuefo es enlazado a peroxidasa de rábano y el cromógeno usado es diaminobencidina. 19. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, caracterizada porque comprende por lo menos otro anticuefo específico para por lo menos una región de secuencia diferente del péptido ß-amiloide. 20. La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque comprende el anticuefo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 acoplado a una sustancia que puede ser detectada u otro anticuefo u otros anticuefos específicos para una o más diferentes regiones de secuencia diferentes del péptido ß-amiloide, acoplado a diferentes sustancias que pueden también ser detectadas. 21. La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque el segundo anticuefo dirigido a una región de secuencia diferente del péptido ß-amiloide es el anticuefo EM2. 22. La composición de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el anticuefo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 es acoplado a un segundo anticuefo enlazado a peroxidasa de rábano, el cromógeno de diaminobencidina (DAB) es usado como sustancia para conversión que puede ser detectada, mientras que el anticuefo EM2 es acoplado a un segundo anticuefo enlazado a fosfatasa alcalina, el cromógeno nitro azul de tetrazolio es usado como sustancia para conversión que puede ser detectada. 23. La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque el segundo anticuefo dirigido a una región de secuencia diferente del péptido ß-amiloide es el anticuefo EM3. 24. La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el anticuefo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 es acoplado a un segundo anticuefo enlazado a peróxidasa de rábano, el cromógeno diaminobencidina (DAB) es usado como sustancia para conversión que puede ser detectada, mientras que el anticuefo EM3 es acoplado a un segundo anticuefo enlazado a fosfatasa alcalina, el cromógeno nitroazul de tetrazolio es usado como sustancia para conversión que puede ser detectada. 25. El uso de la composición de conformidad con cualquira de las reivindicaciones 14 a 24, en la diagnosis en enfermedad de Alzheimer a partir de una muestra de tejido cerebral tomada de un individuo que tiene tal enfermedad. 26. Un método para la diagnosis in vitro de enfermedad de Alzheimer a partir de una muestra de tejido cerebral tomada de un individuo que sufre de la enfermedad, caracterizado porque comprende la detección de la presencia en la muestra de placas neuríticas y depósitos amiloides vasculares, por medio del enlace del anticuefo monoclonal de conformidad con cualquier de las reivindicaciones 1 a 6 a por lo menos una isoforma del péptido ß-amiloide que contiene por lo menos la secuencia Val-His-His-His-Gln-Lys (SEQ ID NO: 3) y que está presente en las placas neuríticas y/o los depósitos amiloides vasculares. 27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el anticuefo monoclonal está contenido en una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18. 28. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la presencia de placas neuríticas, detectada por medio del anticuefo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 está correlacionada con la etapa de avance de la enfermedad. 29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, caracterizado porque la presencia de la isoforma Aß?-40 del péptido ß-amiloide en las placas neuríticas, detectada por medio del anticuefo monoclonal, es confirmada por medio del enlace de un anticuefo específico para el carboxi-terminal de la isoforma Aßi^o del péptido ß-amiloide. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el anticuefo específico para el carboxi-terminal de la isoforma Aß?-4o del péptido ß-amiloide es EM2. 31. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30, caracterizado porque la presencia de placas neuríticas adicionales y/o placas difusas es detectada por medio del enlace de un anticuefo específico para el carboxi-terminal de la isoforma Aß?_ 2 del péptido ß-amiloide. 32. El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado porque el anticuefo específico para el carboxi-terminal de la isoforma Aß?-42 del péptido ß-amiloide es EM3. 33. El anticuefo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque es apto de enlazarse a formas solubles del péptido ß-amiloide humano en muestras de fluidos biológicos o soluciones derivadas de los mismos. 34. El anticuefo monoclonal de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque es apto de enlazarse a formas solubles del péptido ß-mieloide humano en muestras de fluido cerebroespinal, sangre, plasma u orina. 35. El anticuefo monoclonal de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque es apto de enlazarse a formas solubles del péptido ß-mieloide humano en muestras de orina. 36. Una composición caracterizada porque comprende un anticuefo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, caracterizada porque el anticuefo es acoplado a una sustancia o partícula que facilita la extracción de complejos de fragmento de antígeno - anticuefo de la solución en la cual se presenta. 37. La composición de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque la sustancia o partícula que facilita la extracción de complejos de antígeno -anticuefo de la solución en la cual se presentan es una partícula magnética. 38. La composición de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque el enlace entre el anticuefo y la partícula magnética es un enlace covalente. 39. El uso del anticuefo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, en la diagnosis in vitro de enfermedad de Alzheimer de una muestra de un fluido biológico o de una solución derivada del mismo. 40. El uso de conformidad con la reivindicación 39, en donde el anticuefo monoclonal está contenido en una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38. 41. El uso de conformidad con la reivindicación 40, en donde el anticuefo monoclonal está contenido en una composición de conformidad con la reivindicación 38. 42. El uso de conformidad con la reivindicación 41, en donde la composición de conformidad con la reivindicación 38 es agregada a la muestra de fluido biológico o a la solución derivada del mismo, con el fin de formar antígeno - anticuefo con las formas del péptido ß-amiloide presentes en la muestra de fluido biológico o la solución derivada del mismo. 43. El uso de conformidad con la reivindicación 42, en donde la extracción de complejos de antígeno - anticuefo formados del fluido biológico o la solución en la cual se presentan es efectuada mediante el uso de un campo magnético. 44. El uso de conformidad con la reivindicación 43, en donde las formas del péptido ß-amiloide extraídas de un fluido biológico o una solución derivada del mismo en forma de complejos de antígeno - anticuefo son separadas del anticuefo subsecuentemente a su extracción del fluido biológico o la solución en la cual se presentan y antes de emprender su identificación y/o cuantificación. 45. El uso de conformidad con la reivindicación 44, en donde las formas de ß-amiloide son identificadas y/o cuantificadas por medio de espectrometría de masas MALDI-TOF. 46. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 45, en donde la muestra de fluido biológico es una muestra de orina. 47. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 46, en donde la etapa de avance de la enfermedad de Alzheimer está copelacionada con la concentración de la isoforma Aß|.42 en la muestra. 48. Un método para la diagnosis en vitro de enfermedad de Alzheimer a partir de una muestra de un fluido biológico o de una solución derivada del mismo, que comprende la detección de la muestra de por lo menos una isoforma del péptido ß-amiloide que contiene por lo menos la secuencia la secuencia Val-His-His-His-Gln-Lys (SEQ ID NO: 3) por medio de su enlace a un anticuefo monoclonal de conformidad con las reivindicaciones 33 a 35, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) adición de una composición de conformidad con la reivindicación 37 o 38 a la muestra de fluido biológico o la solución derivada del mismo; (b) esperar un tiempo suficiente para que se formen complejos de antígeno -anticuefo entre por lo menos una isoforma del péptido ß-amiloide y el anticuefo contenido en la composición; (c) aplicaciónb de un campo magnético para extraer los complejos de antígeno - anticuefo de la solución; (d) remoción de la solución; (e) separación del anticuefo de las moléculas del péptido ß-amiloide; (f) identificación y cuantificación de las isoformas del péptido ß-amiloide extraído de la muestra de fluido biológico o solución derivada del mismo. 49. El método para la diagnosis in vitro de enfermedad de Alzheimer de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la muestra de fluido biológico es una muestra de orina. 50. El método para la diagnosis in vitro de enfermedad de Alzheimer de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque la composición que es agregada en la etapa (a) comprende un anticuefo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, enlazado covalentemente a las partículas magnéticas copespondientes mediante modificación de uno o más residuos presentes en la región Fe del anticuefo. 51. El método para la diagnosis in vitro de enfermedad de Alzheimer de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la identificación y cuantificación de las isoformas del péptido ß-amiloide extraídas de la muestra de orina se llevan a cabo mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. 52. El método para la diagnosis in vitro de enfermedad de Alzheimer de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque la etapa (e) de separación del anticuefo o fragmento del anticuefo de las moléculas del péptido ß-amiloide se lleva a cabo en ácido a-ciano-hidroxi-cinámico en acetonitrilo acuoso que contiene ácido trifluoroacético.