MX2007010764A

MX2007010764A - Sintesis de oligonucleotidos.

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Publication number: MX2007010764A
Application number: MX2007010764A
Authority: MX
Inventors: Meinolf Lange; Andreas Schonberger; Olaf Grossel; Andreas Hohlfeld; Fritz Link; Christine Kirchhoff
Original assignee: Girindus Ag
Priority date: 2005-03-04
Filing date: 2006-03-06
Publication date: 2007-11-07
Also published as: CN101133073A; CN101133073B; KR20070110309A; BRPI0609351A2; EP1858909A1; UA96411C2; AU2006221999A1; KR101437824B1; RU2007136716A; CA2599259A1; WO2006094963A1; EP1858909B1; JP5435872B2; JP2008532946A; RU2465280C2

Abstract

Un metodo para preparar un oligonucleotido que comprende los pasos de a) proveer un compuesto que contiene hidroxilo que tiene la formula (ver formula): en donde B es una base heterociclica y i) R2 es H, un grupo 2'-hidroxilo protegido, F, un grupo amino protegido, un grupo O-alquilo, un O-alquilo sustituido, un alquilamino sustituido o una union C4'-O2' metileno R3 es OR'3, NH''3, NR''3R'''3, en donde R'3 es un grupo protector de hidroxilo, un nucleotido protegido o un oligonucleotido protegido, R''3, R'''3 son independientemente grupos protectores de amino, y R5 es OH o ii) R2 es H, un grupo 2'-hidroxilo protegido, F, un grupo amino protegido, un grupo O-alquilo, un O-alquilo sustituido, un alquilamino sustituido o una union C4'-O2' metileno R3 es OH y R5 es OR'5 y R'5 es un grupo protector de hidroxilo, un nucleotido protegido o un oligonucleotido protegido iii) R2 es OH R3 es OR'3, NHR''3, NR''3R'''3, en donde R3 es un grupo protector de hidroxilo, un nucleotido protegido o un oligonucleotido protegido, R''3, R'''3 son independientemente grupos protectores de amino, y R5 es OR'5 y R'5 es un grupo protector de hidroxilo, un nucleotido protegido o un oligonucleotido protegido b) hacer reaccionar dicho compuesto con un agente fosfitilante en presencia de un activador que tiene la formula I (activador I) (ver formula I) en donde R = alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroalquilo, heteroarilo R1, R2 = son H o forman juntos un anillo de entre 5 y 6 miembros X1, X2 = independientemente bien N o CH Y = H o Si(R4)3, con R4= alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, B = acido desprotonado para preparar un compuesto fosfitilado c) hacer reaccionar dicho compuesto fosfitilado sin aislar con un segundo compuesto que tiene la formula (ver formula) en donde R5, R3, R2, B se eligen independientemente, pero tienen la misma definicion anterior en presencia de un activador II diferente del activador I.

Description

Síntesis de oligonucleótidos Campo de la invención La presente invención se relaciona con métodos para preparar oligonucleótidos. Antecedentes de la Invención Los oligonucleótidos son compuestos importantes en la ciencia de la vida que tienen roles importantes en diferentes campos. Ellos se utilizan por ejemplo como sondas en el campo del análisis de expresión génica, como cebadores en PCR o para el secuenciamiento de ADN. Además, también hay varias aplicaciones terapéuticas potenciales que incluyen por ej. oligonucleótidos antisentido. El número creciente de aplicaciones requiere cantidades mayores de oligonucleótidos, por lo tanto, existe una continua necesidad para desarrollar un método de síntesis mejorado. Para una visión general, véase por ejemplo "Antisense - From Technology to Therapy " Blackwell Science (Oxford, 1997). Un tipo destacado de componentes básicos en la síntesis de oligonucleótidos son las fosforam ¡ditas; véase S.L. Beaucage, M. H. Caruthers, Tetrahedron Lettere 1859 (1981) 22. Estas fosforamiditas de nucleósidos, desoxirribonucleótidos y derivados de los mismos se encuentran disponibles en forma comercial. En la síntesis en fase sólida común se usan 3'-O-fosforam ¡ditas pero en otros procedimientos sintéticos también se usan 5'-O y 2'-O-fosforamiditas. Un paso en la preparación de estas fosforamiditas de nucleósidos es la fosfitilación de nucleósidos (protegidos). Luego de la fosfitilación, las amiditas preparadas comúnmente se aislan con el uso de métodos de separación intensiva costosos como por ejemplo cromatografía. Luego del aislamiento, las amiditas sensibles tienen que ser almacenadas bajo condiciones especiales (por ejemplo baja temperatura, libres de agua). Durante el almacenamiento, la calidad de las amiditas puede disminuir por un cierto grado de descomposición e hidrólisis. Ambas reacciones secundarias pueden aparecer y los resultados son detectables. Más frecuentemente, el grupo hidroxilo y los grupos amino y otros grupos funcionales presentes en el nucleósido se protegen antes de la fosfitilación del grupo hidroxilo 3'-, 5'- ó 2'-O remanente. Estas fosforamiditas se unen entonces a grupos hidroxilo de nucleótidos u oligonucleótidos. El uso de la amidita aislada también puede dar como resultado una hidrólisis parcial durante la unión de la amidita. Las fosforamiditas son compuestos caros. Los precios característicos para desoxiamiditas están en el rango de entre € 40.00 por g. Los componentes básicos ARN correspondientes son más aun caros. Resumen de la invención Es un objetivo de la presente invención proveer un método para la preparación de oligonucleótidos que supere al menos algunos de los inconvenientes del arte previo. En una forma de realización, la invención provee un método para la preparación de un oligonucleótido que comprende los pasos de a) proveer un compuesto que contiene hidroxilo que tiene la fórmula: en donde B es una base heterocíclica y i) R2 es H, un grupo 2'-hidroxilo protegido, F, un grupo amino protegido, un grupo O-alquilo, un alquilo O-sustituido, un alquilamino sustituido o una unión metileno C4' - 02' R3 es OR'3, NHR"3, NR"3R'"3, en donde R'3 es un grupo protector de hidroxilo, un nucleótido protegido o un oligonucleótido protegido, R"3, R'"3 son independientemente grupos protectores de amina, y R5 es OH o ii) R2 es H, un grupo 2'-hidroxilo protegido, F, un grupo amino protegido, un grupo O-alquilo, un alquilo O-sustituido, un alquilamino sustituido o una unión metileno C4' - 02' R3 es OH y R5 es OR'5 y R'5 es un grupo protector de hidroxilo, un nucleótido protegido o un oligonucleótido protegido o iii) R2 es OH R3 es OR'3, NHR"3, NR"3R'"3, en donde R'3 es un grupo protector de hidroxilo, un nucleótido protegido o un oligonucleótido protegido, R"3, R'"3 independientemente son grupos protectores de amina, y Rs es OR'5 y R'5 es un grupo protector de hidroxilo, un nucleótido protegido o un oligonucleótido protegido b) hacer reaccionar el mencionado compuesto con un agente de fosfitilación en presencia de un activador que tiene la fórmula I (activador I) en donde R = alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroalquilo, heteroarilo Ri, R2 = H o juntos forman un anillo de entre 5 y 6 miembros Xi , X2 = independientemente N ó CH Y = H ó Si(R4)3, con R4 = alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroalquilo, heteroarilo, B = ácido desprotonado para preparar un compuesto fosfitilado c) hacer reaccionar el mencionado compuesto sin aislar con un segundo compuesto que tiene la fórmula en donde R5, R3, R2, B se seleccionan independientemente, pero tienen la misma definición que más arriba en presencia de un activador II seleccionado del grupo formado por tetrazol, derivados de tetrazol, 4,5-dicianoimidazol, tetrafluoroacetato de piridio y mezclas de los mismos. De acuerdo a la invención, el compuesto fosfitilado se prepara por fosfofitilación del grupo hidroxilo de un nucleósido, un nucleótido o un oligonucleótido con el uso de activadores que tienen la fórmula I que preferentemente son derivados del imidazol. Sin purificación o aislamiento, la fosforamidita sensible preparada se une a grupos hidroxilo de nucleósidos, nucleótidos u oligonucleótidos en presencia de un activador II, diferente del activador I. No se aisla la fosforamidita preparada, ni se separa la amidita del activador I. Preferentemente, la reacción se continúa en el mismo recipiente de reacción. El activador II se usa en presencia del activador I. Los activadores del arte previo para la unión de amidita tienen una alta reactividad para la activación de la función amidita. El uso de dicho activador para la fosfitilación también produce un cierto grado de "sobrereacción" (por ejemplo producto secundario 3'-3'). Para superar este y otros problemas se modula la reactividad del activador. En este caso la reacción se detendrá selectivamente a nivel de la amidita sustancialmente libre de derivados, tales como el producto secundario 3'-3'. Sólo este resultado (generación in-situ de la amidita) permite continuar el método completo empezando con la unión de amidita. El activador II tiene la capacidad de inducir el paso de unión. Luego de la adición del activador II, la amidita comenzará con la unión de amidita.

Como activador II se pueden usar todos los activadores (diferentes del activador I) que sean capaces de activar la amidita preparada para reaccionar con el compuesto que contiene hidroxilo del paso c); es decir tetrazol y derivados de tetrazol Los derivados de tetrazol preferidos son bencilmercaptotetrazol y etiltiotetrazol (ETT) Los compuestos adecuados se seleccionan del grupo formado por heterociclos que contienen nitrógeno que tienen hidrógeno acídico, piridina, sales de pipdina y mezclas de los mismos en forma no protonada Los heterociclos que contienen nitrógeno tienen una unión N°-H, es decir N no es protonado Estos compuestos se pueden usar como sales por combinación con ácidos, tales como los ácidos H+B" en donde B" tiene el mismo significado como se lo define en las reivindicaciones Piridina es un activador II adecuado adicional, preferentemente trifluoracetato de piridinio. Los compuestos preferidos se seleccionan del grupo formado por tetrazol, derivados del tetrazol, 4,5-D?c?ano?m?dazol, tpfluoroacetato de pipdinio y mezclas de los mismos Luego de la unión, generalmente se usa oxidación (formación de PO) o sulfupzación (formación de PS) Para la formación de PO se prefiere el método del peróxido Esta reacción se puede llevar a cabo sin ningún paso de extracción (oxidación de iodo requiere unos pocos pasos de extracción) En el caso de la sulfurización, es posible usar cada reactivo conocido para sulfurización (es decir PADS, S-Tetra, beaucage). Un reactivo preferido para la formación de PS es el azufre La diferencia de costos de producción está a favor del uso de azufre En una forma de realización, la reacción se puede realizar en presencia de acetona El agente de fosfitilación se puede usar en una relación más o menos equimolar en comparación a los grupos hidroxilo del compuesto que contiene hidroxilo. En otra forma de realización, se puede usar en exceso, por ejemplo entre 3 y 5 mol/mol de grupos hidroxilo en el compuesto que contiene hidroxilo.

En otra forma de realización preferida, un alcohol polimérico se agrega después del paso b) de la reivindicación 1. Entre los alcoholes poliméricos adecuados se incluye polivinilalcohol (PVA), disponible en forma comercial como PVA 145000 por Merck, Darmstadt. Se prefiere PVA macroporoso con un tamaño de partícula >120 µm (80%). También son adecuadas las membranas con grupos hidroxilo u otros compuestos con capacidad para formar enoles. El activador I se puede usar en forma estequiométrica, en forma de catalizador (entre 3 y 50 % en mol, preferentemente entre 10 y 30 % en mol) o en exceso. En una forma de realización preferida, el activador I tiene una fórmula seleccionada del grupo formado por en donde Y es H ó Si(R )3, con R = alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroalquilo, heteroarilo, B = ácido desprotonado R es metilo, fenilo o bencilo. La preparación de estos activadores se describe por ejemplo en Hayakawa y col., J. Am. Chem. Soc. 123 (2001 ) 8165-8176. En una forma de realización el activador se usa en combinación con un aditivo. Los aditivos se pueden seleccionar de la forma no protonada de los compuestos que tienen la fórmula I y otras bases heterocíclicas, por ejemplo piridina. Las relaciones adecuadas entre el activador y el aditivo son entre 1 :1 y 1 : 10. En una forma de realización preferida, el activador se puede preparar siguiendo un procedimiento "in situ". En este caso el activador no se aislará, lo que genera mejores resultados de reacción. Se omite la hidrólisis o descomposición de la molécula objetivo. Para una fosfitilación de alto rendimiento en posiciones 3' y/o 5' de oligonucleótidos (di, tri, tetra, penta, hexa, hepta y octámeros), se prefiere la preparación in-situ del activador y la combinación con un aditivo. Como se describe más arriba, la fosfitilación es especialmente útil en la síntesis de oligonucleótidos y componentes básicos fosforamiditas. Por lo tanto, en una forma de realización preferida, el compuesto que contiene hidroxilo comprende un grupo azúcar por ejemplo un nucleósido o un derivado oligomérico del mismo. Dichos nucleósidos son por ejemplo adenosina, citosina, guanosina y uracilo, desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina, desoxicitosina y derivados de los mismos, que en forma opcional comprenden grupos protectores. Generalmente, ellos se protegerán en forma adecuada en su funcionalidad heterocíclica y en sus grupos que contienen hidroxilo excepto del que debe ser fosfitilado. Generalmente, se usan dimetoxitritilo, monometoxitritilo o t-butildimetil-sililo (TBDMS) como grupos protectores para el grupo 5OH, que permite la fosfitilación del grupo 3'-OH. Otros grupos posibles son esteres fosfato e H-fosfonatos, véase por ejemplo Posición 5'-0 Posición 3'-0 Posición 3'-0 Para el éster fosfato y fosfodiéster, R se puede seleccionar entre alquilo, arilo, alquilarilo. Se prefiere fenilo. Otros grupos protectores de hidroxilo para 5', 3' y 2' son bien conocidos en el arte, por ejemplo TBDMS. En general, el agente de fosfitilación puede ser igual que en las reacciones de fosfitilación que usan 1-H-tetrazol. En una forma de realización preferida, tiene la fórmula, en donde Z representa un grupo saliente por ejemplo -CH2CH2CN, -CH2CH=CHCH2CN, para-CH2C6H4CH2CN, -(CH2)2.5N(H)COCF3, CH2CH2Si(C6H5)2CH3, ó -CH2CH2N(CH3)COCF3 y Ri y R2 son independientemente grupos amino secundarios N(R3)2, en donde R3 es un alquilo que tiene entre 1 y alrededor de 6 carbonos; o R3 es un anillo heterocicloalquilo o heterocicloalquenilo que contiene entre 4 y 7 átomos, y que tiene hasta 3 heteroátomos que seleccionados entre nitrógeno, azufre, y oxígeno. Un agente del fosfitilación típico es 2-cianoetil-N,N,N',N'-tetraisopropilfosfordiamidita. Otros reactivos de fosfitilación preferidos son los derivados del oxazafosfolidina como se describe en N. Ok y col., J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 8307 a 8317 que se incorpora como referencia. Este agente de fosfitilación permite la síntesis de oligonucléotidos en donde el enlace internucleotídico se puede convertir en fosfortioatos en una forma estéreo selectiva. Dichas uniones fosfotioato internucleotídicas sintetizadas en forma diastereoselectiva tienen un impacto promisorio en el uso de fosfortioatos como drogas antisentido o drogas inmunoestimulantes. La Figura 1 muestra un esquema de reacción de acuerdo a la invención.

Ejemplos adecuados de ácidos desprotonados B" son trifluoroacetato, triflato, dicloroacetato, mesilo, tosilo, o-clorofenolato. Se prefieren ácidos con un pKa por debajo de 4,5. Preferentemente, ellos tienen una nucleofilicidad baja. En una forma de realización, la reacción se lleva a cabo en presencia de un tamiz molecular para secar el medio de reacción. En general, el agua se debe quitar o se debe fijar mediante un medio de secado durante la reacción.

También es posible combinar el activador I de la presente invención con el agente de fosfitilación y agregar más tarde el componente hidroxilo. También es posible combinar el activador I con el compuesto que contiene hidroxilo y agregar el agente de fosfitilación después de esto. En el caso de usar un aditivo, el activador se mezcla con el componente hidroxilo antes de que se agregue el agente de fosfitilación. Para la generación "in situ" del activador, el ácido seleccionado se agrega preferentemente después del agregado del aditivo bajo temperatura de reacción controlada. El agente de fosfitilación se puede agregar antes de la adición del ácido seleccionado o luego de esto. En relación al agregado de ácido y de agente de fosfitilación, el componente nucleosídico se puede agregar al final o al inicio. En una forma de realización preferida, la base correspondiente del activador, el compuesto que contiene hidroxilo, y el agente de fosfitilación se combinan y el ácido se agrega para iniciar la reacción. El compuesto fosfitilado (fosforamidita) se acopla luego a un grupo hidroxilo de un nucleósido, un nucleótido o un oligonucleótido en presencia de activador II. Después de reaccionar un compuesto como se describe con anterioridad, se oxidan los triésteres preparados. La oxidación se puede usar para preparar uniones fosfato o tiofosfato estables, por ejemplo. Como se usan en la presente, los oligonucleótidos también cubren oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, miméticos de nucleótido y parecidos en la forma de ARN y ADN. En general, estos compuestos comprenden una estructura principal de subunidades monoméricas enlazadas donde cada subunidad monomérica unida se encuentra unida en forma directa o indirecta a un grupo base heterocíclica. Las uniones que unen las subunidades monoméricas, las subunidades monoméricas y los grupos base heterocíclica pueden ser variables en estructura lo que origina una pluralidad de motivos para los compuestos resultantes. La invención es especialmente útil en la síntesis de oligonucleótídos que tienen la fórmula Xn, en donde cada X se selecciona entre A, dA, C, dC, G, dG, U, dT y n = entre 2 y 30, preferentemente entre 2 y 12, más preferentemente entre 2 y 8 o entre 2 y 6 y derivados de los mismos que comprenden grupos protectores. Modificaciones conocidas en el arte son la modificación de bases heterocíclicas, el azúcar o las uniones que unen las subunidades monoméricas. Se describen variaciones de uniones ¡ntemucleotídicas por ejemplo en WO 2004/011474, comenzando al final de la página 11 , que se incorpora como referencia. Derivados típicos son los fosfortioatos, fosforoditioatos, fosfonatos de metilo y alquilo y derivados fosfonoacetato. Otras modificaciones típicas son la porción azúcar. La ribosa se sustituye por un azúcar diferente o una o más de las posiciones se sustituyen con otros grupos tales como F, O-alquilo, S-alquilo, N-alquilo. Las realizaciones preferidas son 2 '-metilo y 2 '-metoxietoxi. Todas estas modificaciones son conocidas en el arte. Con respecto a la porción base heterocíclica, hay un número de otras bases sintéticas que se usan en el arte, por ejemplo 5-metil-citosina, 5-hidrox¡- metil-citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados 6- ó 2-alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo. Tales modificaciones también se describen en WO 2004/011474 comenzando desde página 21. Cuando se usan en síntesis, estas bases normalmente tienen grupos protectores, por ejemplo N-6-benciladenina, N-4-bencilcitosina o N-2-isobutiril guanina. En general, todos los grupos reactivos que no tienen como intención reaccionar en otra reacción tienen que ser protegidos, sobre todo los grupos hidroxilo del azúcar. En realizaciones relacionadas a la síntesis de oligonucleótidos es útil realizar la reacción ?n presencia de aldehidos o cetonas que se pueden usar tanto como un medio de reacción como un co-solvente para otros solventes. Los compuestos adecuados son aquellos que pueden formar enoles. Los compuestos típicos tienen la fórmula R-|R2C = O, en donde Ri y R2 son independientemente H o consisten entre 1 y 20 átomos de carbono que pueden formar estructuras cíclicas exclusivamente o Ri y R2 forman juntos sistemas cíclicos en donde Ri y R2 no son ambos H. Una cetona muy preferida es acetona. La presencia de acetona extingue la actividad de cualquier cantidad de aminas, como diisopropilamina (DIPA), que se libera durante el proceso de fosfitilación. Esto se puede utilizar para la fosfitilación de oligonucleótidos más cortos y más largos con resultados similares (sin descomposición). Otras compuestos de cetona que tienen la fórmula Rx-C(=O)-Ry en donde Rx y Ry son independientemente alquilo C1-C6 o forman juntos un cicloalquilo también se pueden usar con tal de que ellos puedan formar enolatos en presencia de, por ejemplo aminas que tengan un grupo CH2 en la posición a.

La invención se explica en forma adicional por los siguientes ejemplos no limitantes. Eiemplo 1 Síntesis de triéster fosfato de 5'-0-DMTr-T-T-3'-0-Lev cianoetilo a través de preparación in situ de 5'-0-DMTr-T-3'-0-fosforamidita mediante el uso de trifluoroacetato de metil imidazolio (MIT) Se disuelven 5,0 g de 5'-O-DMTr-T-3'-OH (9,2 mmol, 1 ,0 eq.) y 2,34 g de MIT (11 ,9 mmol, 1 ,3 eq.) en 100 ml de diclorometano y se agrega 3 g de tamiz molecular de 3Á y se agita la mezcla durante 10 mín. Se agrega 3,8 ml de 2-cianoetil N,N,N',N'-tetraisopropilfosfordiamidita (11 ,9 mmol, 1 ,3 eq.). La formación de la 5'-O-DMTr-T-3'-O-fosforamidita se completa luego de 2 h. Se agregan 3,28 g de 5'-OH-T-3'-O-Lev (9,64 mmol, 1 ,05 eq.) y 51 ml de solución de tetrazol (0,45 M, 22,95 mmol, 2,5 eq) y se agita durante una noche. El triéster de fosfita resultante se oxida mediante agregado de 4,57 g de l2, 140 ml de THF, 35 ml de piridina y 4 ml de H2O. La reacción se completa luego de 10 min. La mezcla de reacción se evapora, se disuelve en 300 ml de diclorometano, se extrae con 200 ml de solución saturada de tiosulfato de sodio y luego se extrae con 200 ml de solución saturada de carbonato ácido de sodio. Las fases acuosas combinadas se extraen con 30 ml de diclorometano, las fases orgánicas combinadas se secan sobre sulfato de magnesio y se evapora el solvente. Rendimiento 9,0 g (espuma incolora): 98%; Pureza (determinado por HPLC): 84%.

Eiemplo 2 Síntesis de triéster fosfato de 5'-0-DMTr-dCBz-T-3'-0-Lev cianoetilo a través de preparación en situ de 5'-0-DMTr-dCBz-3'-0-fosforam?d?ta mediante el uso de tnfluoroacetato de metil imidazolio (MIT) Se disuelven 108 mg de MIT (0,56 mmol, 1 ,5 eq ) y 224 mg de 5'-O- DMTr-dCBz-3'-OH (0,37 mmol, 1 ,0 eq ) en 9 ml de diclorometano y se agrega 300 mg de tamiz molecular de 3Á Se agrega 140 µl de 2-c?anoet?l N,N,N',N'-tetraisopropilfosfordiamidita (0,44 mmol, 1 ,2 eq ) a la solución agitada La formación de la 5'-O-DMTr-dCBz-3'-O-fosforam?d?ta se completa luego de 30 min La mezcla se filtra y se agregan 125 mg de 5'-OH-T-3'-O-Lev (0,37 mmol, 1 ,0 eq ) y 2 ml de solución de tetrazol (0,45 M, 0,9 mmol, 2,4 eq) y se agita durante una noche El triéster de fosfita resultante se oxida mediante agregado de 10 ml de solución oxidante (254 mg de l2, 7,8 ml de THF, 1 ,9 ml de pipdina y 222 µl de H2O) La reacción se completa luego de 30 min Rendimiento (determinado por HPLC) 66% Eiemplo 3 Síntesis de triéster fosforotioato de 5'-0-DMTr-dCBz-dG'Bu-3'-0-Lev cianoetilo a través de preparación en situ de 5'-0-DMTr-dCBz-3'-0-fosforam?d?ta mediante el uso de tpfluoroacetato de metll imidazolio (MIT) Se disuelven 2,57 g de 5'-O-DMTr-dCBz-3'-OH (6,0 mmol, 1 ,0 eq ) y 1 ,76 g de MIT (9,0 mmol, 1 ,5 eq ) en 6 ml de acetona y 6 ml de acetonitplo y se agrega 3,0 g de tamiz molecular de 3Á Se agrega 2,46 ml de 2-c?anoet?l N,N,N',N'-tetra?soprop?lfosford?am?d?ta (7,74 mmol, 1 ,3 eq ) a la solución agitada La formación de la 5'-O-DMTr-dCBz-3'-O-fosforam?d?ta se completa luego de 30 min Esta solución se filtra y se agrega sobre una solución de 2,48 g de 5'-OH-GiBu-3'-O-Lev (5,7 mmol, 0,95 eq.) y 2,3 g de bencilmercaptotetrazol (12,0 mmol, 2,0 eq) en 20 ml de diclorometano y 20 ml de acetonitrilo y se agita durante 30 min. La solución que contiene el triéster de fosfita resultante se filtra y se sulfura mediante agregado de 14 g de tetrationato unido a polímero (25,2 mmol, 4,2 eq.). La reacción se completa luego de 16 h. Rendimiento (determinado por HPLC): 84%. Eiemplo 4 Síntesis de triéster fosforotioato de 5'-0-DMTr-dCBz-dCBz-3'-0-Lev cianoetilo a través de preparación en situ de 5'-0-DMTr-dCBz-3'-0-fosforamidita mediante el uso de trifluoroacetato de metil imidazolio (MIT) Se disuelven 10 g de 5'-O-DMTr-dCBz-3'-OH (15,8 mmol, 1 ,0 eq.) y 7,75 g de MIT (39,5 mmol, 2,5 eq.) en 30 ml de diclorometano y 30 ml de acetonitrilo, se agrega 10 g de tamiz molecular de 3A y se agita la mezcla durante 30 min. Se disuelven 9,0 ml de 2-cianoetil N,N,N',N'-tetraisopropilfosfordiamidita (28,4 mmol, 1 ,8 eq.) en 15 ml de diclorometano y 15 ml de acetonitrilo. La solución de 5'-O-DMTr-dCBz-3'-OH y MIT se agrega en forma de goteo a la solución agitada de la 2-Cianoetil N,N,N',N'-tetraisopropilfosfordiamidita. La formación de la 5'-O-DMTr-dCBz-3'-O-fosforamidita se completa luego de 30 min. Esta solución se filtra y se agrega sobre una solución de 5,43 g de 5'-OH-CBz-3'-O-Lev (12,6 mmol, 0,8 eq.) y 7,6 g de bencilmercaptotetrazol (39,5 mmol, 2,5 eq) en 90 ml de dímetilformamida y 450 ml de acetonitrilo y se agita durante 10 min. La solución que contiene el triéster de fosfita resultante se filtra y se sulfura mediante agregado de 50 g de tetrationato unido a polímero (90 mmol, 5,7 eq.). La reacción se completa luego de 16 h. Rendimiento (determinado por HPLC): 80%.

Eiemplo 5 Síntesis de triéster fosforotioato de 5'-0-DMTr-dABz-dGiBu-3'-0-Lev cianoetilo a través de preparación en situ de 5'-0-DMTr-dABz-3'-0-fosforamidita mediante el uso de trifluoroacetato de metil imidazolio (MIT) Se disuelven 5,0 g de 5'-O-DMTr-dABz-3'-OH (5,8 mmol, 1 ,0 eq.) y 1 ,8 g de MIT (9,2 mmol, 1 ,6 eq.) en 50 ml de acetona y 50 ml de acetonitrilo, se agrega 2,5 g de tamiz molecular de 3Á y se agita la mezcla durante 15 min. Se agregan 3,0 ml de 2-cianoetil N,N,N',N'-tetraisopropílfosfordiamidita (9,5 mmol, 1 ,6 eq.) a la solución agitada. La formación de la 5'-O-DMTr-dABz-3'-O-fosforamidita se completa luego de 1 h. Esta solución se filtra y se agrega sobre una solución de 2,22 g de 5'-OH-GiB?-3'-O-Lev (5,1 mmol, 0,94 eq.) y 2,9 g de bencilmercaptotetrazol (15,1 mmol, 2,6 eq) en 25 ml de diclorometano y 25 ml de acetonitrilo y se agita durante 40 min. La solución que contiene el triéster de fosfita resultante se filtra y se sulfura mediante agregado de 2 g de tetrationato unido a polímero (3,6 mmol, 3,9 eq.). La reacción se completa luego de 16 h. Rendimiento (determinado por HPLC): 71 %. Eiemplo 6 Síntesis de triéster fosforotioato de 5'-0-DMTr-T-dG'Bu-3'-0-Lev cianoetilo a través de preparación en situ de 5'-0-DMTr-T-3'-0-fosforamidita mediante el uso de trifluoroacetato de metil imidazolio (MIT) Se disuelven 5,0 g de 5'-O-DMTr-T-3'-OH (9,2 mmol, 1 ,0 eq.) y 2,7 g de MIT (13,5 mmol, 1 ,5 eq.) en 50 ml de acetona y 50 ml de acetonitrilo, se agrega 2,5 g de tamiz molecular de 3Á y se agita la mezcla durante 15 min. Se agregan 3,0 ml de 2-cianoetil N,N,N',N'-tetraisopropilfosfordiamidita (9,5 mmol, 1 ,03 eq.) a la solución agitada. La formación de la 5'-O-DMTr-T-3'-O- fosforamidita se completa luego de 1 h Esta solución se filtra y se agrega sobre una solución de 4,44 g de 5'-OH-GlB?-3'-O-Lev (10,2 mmol, 1 ,1 eq ) y 5,3 g de bencilmercaptotetrazol (27,6 mmol, 1 ,6 eq) en 50 ml de diclorometano y 50 ml de acetonitnlo y se agita durante 2 h La solución que contiene el triéster de fosfita resultante se filtra y se sulfura mediante agregado de 30 g de tetrationato unido a polímero (54 mmol, 5,9 eq ) La reacción se completa luego de 16 h Rendimiento (determinado por HPLC) 90% Eiemplo 7 Síntesis de triéster fosforotioato de 5'-0-DMTr-T-dCBz-dCBz-dCBz-3'-0-Lev cianoetilo a través de preparación en situ de 5'-0-DMTr-T-P(S)-dCBz-3'-0-fosforamidita mediante el uso de tnfluoroacetato de metll imidazolio (MIT) Se disuelven 100 mg de 5'-O-DMTr-T-P(S)-dCBz-3'-OH (0,10 mmol, 1 ,0 eq ) y 24,4 mg de MIT (0,11 mmol, 1 ,1 eq ) en 10 ml de diclorometano, se agrega 200 mg de tamiz molecular de 4Á Se agrega 32 µl de 2-c?anoet?l N,N,N',N'-tetra?soprop?lfosf?rd?am?drta (0,10 mmol, 1 ,0 eq ) a la solución agitada La formación de la 5'-O-DMTr-T-P(S)-dCBz-3'-O-fosforam?d?ta se completa luego de 24 h Se agregan 82 mg de 5'-OH-dCBz-3'-P(S)-dCBz-3'-O-Lev (0,09 mmol, 0,9 eq ) y 366 µl de solución de tetrazol (0,45 M, 0,16 mmol, 1 ,6 eq) y se agita durante 45 h El triéster de fosfita resultante se sulfura mediante agregado de 400 mg de tetrationato unido a polímero en 72 h Rendimiento (determinado por HPLC) 58% Eiemplo 8 Síntesis de triéster fosforotioato de 5'-0-DMTr-dCBz-dGlBu-dCBz-dCBz-3'-0-Lev cianoetilo a través de preparación en situ de 5'-0-DMTr-dCBz-P(S)-dGlBu-3'-0-fosforamidita mediante el uso de tnfluoroacetato de mer// imidazolio (MIT) Se disuelven 100 mg de 5'-O-DMTr-dCBz-P(S)-dGlB?-3'-OH (0,09 mmol, 1 ,0 eq ) y 17,8 mg de MIT (0,09 mmol, 1 ,0 eq ) en 10 ml de diclorometano, se agrega 200 mg de tamiz molecular de 4Á Se agrega 28 µl de 2-c?anoet?l N,N,N',N'-tetra?soprop?lfosford?am?d?ta (0,09 mmol, 1 ,0 eq ) a la solución agitada La formación de la 5'-O-DMTr-dCBz-P(S)-dGlBu-3'-O-fosforam?d?ta se completa luego de 3 h Se agregan 40 mg de 5'-OH-dCBz-3'-P(S)-dCBz-3'-O-Lev (0,04 mmol, 0,5 eq ) y 0,9 ml de solución de etiltiotetrazol (0,25 M, 0,23 mmol, 2,5 eq ) y se agita durante 2 h El triéster de fosfita resultante se sulfura mediante agregado de 200 mg de tetrationato unido a polímero en 72 h Rendimiento 30 mg (14,1 µmol, cristales blancos) 16 %, Pureza (determinado por HPLC) 67% Eiemplo 9 Síntesis de triéster fosforotioato de 5'-0-DMTr-dCBz-dCBz-dABz-T-3'-0-Lev cianoetilo a través de preparación en situ de 5'-0-DMTr-dCBz-P(S)-dCBz-3'-0-fosforamidita mediante el uso de trifluoroacetato de bencilimidazolio (BIT) Se disuelven 100 mg de 5'-O-DMTr-dCBz-P(S)-dCBz-3'-OH (0,09 mmol, 1 ,0 eq ) y 46 mg de BIT ^0, 17 mmol, 1 ,9 eq ) en 5 ml de acetona y 5 ml de acetonitplo, se agrega 500 mg de tamiz molecular de 3A Se agrega 58 µl de 2-cianoetil N,N,N',N'-tetra?soprop?lfosford?am?d?ta (0,14 mmol, 1 ,5 eq ) a la solución agitada La formación de la 5'-O-DMTr-dCBz-P(S)-dCBz-3'-O-fosforamidita se completa luego de 1 h Se agregan 41 ,3 mg de 5'-OH-dABz-3'-P(S)-T-3'-O-Lev (0,05 mmol, 0,55 eq ) y 43,7 mg de bencilmercaptotetrazol (0,23 mmol, 2,5 eq ) y se agita durante 1 ,5 h El triéster de fosfita resultante se sulfura mediante agregado de 500 mg de tetrationato unido a polímero en 72 h Rendimiento (determinado por HPLC) 70% Eiemplo 10 Síntesis de triéster fosfato de 5'-0-DMTr-dGlBu-dG,Bu-dG'Bu-T-dG,Bu-dG,B?-3'-0-Lev cianoetilo a través de preparación en situ de 5'-0-DMTr-dGlBu-P(0)-dGiBu-3'-0-fosforamidita mediante el uso de trifluoroacetato de metil imidazolio (MIT) Se disuelven 200 mg de 5'-O-DMTr-dGlB?-P(O)-dGlBu-3'-OH (0,18 mmol, 1 ,0 eq.) y 56 mg de MIT (0,27 mmol, 1 ,5 eq.) en 5 ml de acetona y se agrega 300 mg de tamiz molecular. Se agrega 128 µl de 2-cianoetil N,N,N',N'-tetraisopropilfosfordiamidita (BisPhos) (0,4 mmol, 2,2 eq.) a la solución agitada. La formación de la 5'-O-DMTr-dGlB?-3'-P(O)-dGlBu-3'-O-fosforamidita se completa luego de 15 min. Se agregan 156 mg de 5'-OH-dGlBu-T-dGlBu-dGlBu-3'-O-Lev (0,09 mmol, 1 ,0 eq ) y 87 mg de bencilmercaptotetrazol (0,46 mmol, 5,0 eq) y se agita durante 20 min. El triéster de fosfita resultante se oxida mediante agregado de 3,7 ml de solución oxidante (94 mg de l2, 2,9 ml de THF, 0,7 ml de piridina y 82 µl de H2O) La reacción se completa luego de 30 min. Rendimiento (determinado por HPLC): 51 %. Eiemplo 11 Síntesis de triéster fosfato de 5'-0-DMTr-dGlBu-T-3'-0-Lev cianoetilo Se disuelven 200 g (312 mmol) de DMTr-dGlBu-3'-OH y 80 g (408 mmol) de MIT en 400 mL diclorometano y 400 mL acetona. Se agregan 200 g de tamiz molecular y 89 mL (1 ,25 mol) de NMI (N-methyl-imidazol). Se agregan, a 15°C, 109 mL (344 mmol) de BisPhos a la solución agitada. La formación de la 5'-O-DMTr-dGlB?-3'-O-fosforamidita se completa luego de 10 min y la solución se deja agitar durante otros 30 min. Se disuelven 88,4 g (260 mmol) de 5'-OH-T-3'-O-Lev y 83,4 g (624 mmol) de ETT con 600 mL acetona y 600 ml de diclorometano. Se agregan 100 g de tamiz molecular y 86 mL (1 ,08 mol) de NMI A esta solución agitada se agregan 800 mL de la solución de fosforamidita La reacción se completa luego de 10 mm y se agregan 46 mL de solución de peróxido de butanona (Curox M400) a la mezcla enfriada (baño de hielo) La reacción se completa luego de 5 min Conversión (determinado por HPLC) 100% Eiemplo 12 Síntesis de triéster fosforotioato de 5'-0-DMTr-dGlBu-T-3'-0-Lev c?anoet?lo Se disuelven 1 ,0 g (1 ,56 mmol) de DMTr-dGlBu-3'-OH y 368 mg (1 ,88 mmol) de MIT en 3 mL diclorcmetano y 3 mL acetona Se agregan 1 g de tamiz molecular y 154 µL (1 ,25 mol) NMI Se agregan, a 15°C, 594 µL (1 ,87 mmol) de BisPhos a la solución agitada La formación de la 5'-O-DMTr-dGlBu-3'-O-fosforamidita se completa luego de 10 min y la solución se deja agitar durante otros 30 min Se disuelven 438 mg (1 ,29 mmol) de 5'-OH-T-3'-O-Lev y 396 mg (3,07 mmol) de ETT con 5 mL acetona y 5 ml de diclorometano Se agregan 1 g de tamiz molecular y 248 mL (3,61 mol) de NMI A esta solución agitada se agregan 5,5 mL de la solución de fosforamidita La reacción se completa luego de 10 min y A) se agregan 25 mg (7,8 mmol) de azufre (Ss) y 2,5 mg de Na2Sx9H2O La reacción se completa luego de 10 min Conversión (determinado por HPLC) 100% B) se agregan 25 mg (7,8 mmol) de azufre (Ss) La reacción se completa luego de 3 h Conversión 99% Eiemplo 13 Síntesis de triéster fosforotioato de 5'-0-DMTr-T-dCBz-dGlBu-T-T-dG'Bu-3'-0-L?v cianoetilo Se disuelven 5,0 g (4,9 mmol) de DMTr-T-dCBz-3'-OH y 2,4 g (12,3 mmol) de MIT en 10 mL diclorometano y 10 mL acetona. Se agregan 8 g de tamiz molecular y 980 µL (12,3 mol) de NMI. Se agregan, a 15°C, 3,13 mL (9,85 mmol) de BisPhos a la solución agitada. La formación de la 5'-O-DMTr- T-dCBz -3'-O-fosforamidita se completa luego de 10 min y la solución se deja agitar durante otros 30 min. Se agregaron 100 mL de heptano, se decantó y se agregaron 10 mL de diclorometano y 10 mL de acetona al residuo resultante. Se disuelven 4,44 g (2,79 mmol) de 5'-OH- dGlBu-T-T-dGiBu-3'-O-Lev y 1 ,05 g (8,06 mmol) de ETT con 15 mL acetona y 15 ml de diclorometano. Se agregan 5 g de tamiz molecular y 640 µL (8,06 mol) de NMI. A esta solución agitada se agregan 20 mL de la solución de fosforamidita. La reacción se completa luego de 10 min y se agregan 930 mg (3,09 mmol) de PADS. La reacción se completa luego de 10 min. Conversión (determinado por HPLC) 92%. Eiemplo 14 Síntesis de triéster fosfato de 5'-0-DMTr-dCBz-dABz- dCBz-dABz-dCBz-dABz- dCBz-dABz-3'-0-Lev cianoetilo Se disuelven 860 mg (0,45 mmol) de 5'-O-DMTr-dCBz-dABz- dCBz-dABz-3'-OH y 133 mg de (0,67 mmol) MIT en 3 mL de diclorometano y 3 mL de acetona. Se agregan 800 mg de tamiz molecular y 55 µL (69 moles) de NMI. Se agregan 214 µL (0,65 mmol) de BisPhos a la solución agitada. La formación de la 5'-O-DMTr-dCBz-dABz- dCBz-dABz-3'-3'-O-fosforamidita se completa luego de 10 min y la solución se deja agitar durante otros 20 min. Se agregaron 30 mL de heptano, se decantó y se agregaron 5 mL de diclorometano y 5 mL de acetona al residuo resultante. Se disuelven 545 mg (0,3 mmol) de 5'-OH-dGlBu-T-T-dGiBu-3'-O-Lev y 1 17 mg (0,9 mmol) de ETT con 3 mL de acetona, 3 ml de diclorometano y 0,3 mL de DMF. Se agregan 1 g de tamiz molecular y 70 µL (0,9 mmol) de NMI. A esta solución agitada se agregan 8 mL de la solución de fosforamidita. La reacción se completa luego de 30 min y se agregan 70 µL de solución de peróxido de butanona (Curox M400) a la mezcla. La reacción se completa luego de 10 min. Conversión (determinado por HPLC): 80%.

Claims

Reivindicaciones 1. Un método para preparar un oligonucleótido que comprende los pasos de a) proveer un compuesto que contiene hidroxilo que tiene la fórmula en donde B es una base heterocíc ca y 0 R2 es H, un grupo 2'-h?drox?lo protegido, F, un grupo amino protegido, un grupo O-alqu?lo, un O-alqu?lo sustituido, un alquilamino sustituido o una unión C4'-O2' metlleno R3 es OR'3, NHR 3, NR 3R 3, en donde R 3 es un grupo protector de hidroxilo, un nucleótido protegido o un ohgonucleótido protegido, R 3, R 3 son independientemente grupos protectores de amino, y R5 es OH
R2 es H, un grupo 2'-h?drox?lo protegido, F, un grupo amino protegido, un grupo O-alqu?lo, un O-alqu?lo sustituido, un alquilamino sustituido o una unión C4'-O2' metlleno R3 es OH y R5 es OR'5 y R'5 es un grupo protector de hidroxilo, un nucleótido protegido o un o gonucleótido protegido iii) R2 es OH R3 es OR'3, NHR 3, NR' 3R' "3, en donde R 3 es un grupo protector de hidroxilo, un nucleótido protegido o un oligonucleótido protegido, R 3, R 3 son independientemente grupos protectores de amino, y R5 es OR'5 y R'5 es un grupo protector de hidroxilo, un nucleótido protegido o un oligonucleótido protegido b) hacer reaccionar dicho compuesto con un agente fosfitilante en presencia de un activador que tiene la fórmula I (activador I) en donde R = alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroalquilo, heteroarilo R1, R2 = son H o forman un juntos un anillo de entre 5 y 6 miembros
X1, X2 = independientemente bien N o CH Y = H o Si(R4)3, con R4= alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroalquilo, heteroarilo B" = ácido desprotonado para preparar un compuesto fosfitilado c) hacer reaccionar dicho compuesto fosfitilado sin aislar con un segundo compuesto que tiene la fórmula en donde R5, R3, R2, B se eligen independientemente, pero tienen la misma definición anterior en presencia de un activador II diferente del activador I. 2. El método de la reivindicación 1 , en donde el activador de fórmula I tiene una fórmula que se elige del grupo que consiste en en donde Y se define como en la reivindicación 1 R es metilo, fenilo o bencilo. 3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde el agente fosfitilante tiene la fórmula en donde Z representa un grupo saliente y Ri y R2 son independientemente grupo amino secundarios .
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el agente fosfitilante es 2-cianoetil-N,N,N',N'-tetraisopropilfosfordiamidita.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el ácido desprotonado deriva del grupo que consiste en ácido trifluoroacético, ácido dicloroacético, ácido metano sulfónico, ácido trifluorometano sulfónico, o- clorofenolato.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la reacción es en presencia de acetona.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el agente fosfitilante se usa en una cantidad entre 1 ,0 y 1 ,2 mol/mol de grupos hidroxilos en el compuesto que contiene hidroxilo.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el agente fosfitilante se usa en una cantidad entre 3 y 5 mol/mol de grupos hidroxilos en el compuesto que contiene hidroxilo.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde se agrega un alcohol polimérico luego del paso b) de la reivindicación 1.
10. El método de cualquie a de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el alcohol polimérico es alcohol polivinílico.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el ácido desprotonado deriva del grupo que consiste en ácido trifluoroacético, ácido dicloroacético, ácido metano sulfónico, ácido trifluorometano sulfónico (triflato), o-clorofenolato y mezclas de los mismos.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , en donde la reacción es en presencia de acetona.
13. El método de la reivindicación 11 en donde al menos 95% (p/p) del medio de reacción es acetona.
14. El uso de cetonas que tienen la fórmula Rx-C(=O)-Ry, en donde Rx y Ry son independientemente alquilo C-i-Cß o forman un cicloalquilo juntos como medio de reacción o co-solvente en la síntesis de oligonucleótidos.
15. El uso de la reivindicación 14, en donde la cetona es acetona, butanona, pentanona, hexanona, ciclohexanona, o una mezcla de las mismas Resumen Un método para preparar un oligonucleótido que comprende los pasos de a) proveer un compuesto que contiene hidroxilo que tiene la fórmula: en donde B es una base heterocíclica y ¡) R2 es H, un grupo 2'-hidroxilo protegido, F, un grupo amino protegido, un grupo O-alquilo, un O-alquilo sustituido, un alquilamino sustituido o una unión C4'-O2' metileno R3 es OR'3, NHR 3, NR 3R 3, en donde R 3 es un grupo protector de hidroxib, un nucleótido protegido o un oligonucleótido protegido, R "3, R " 3 son independientemente grupos protectores de amino, y R5 es OH R2 es H, un grupo 2'-hidroxilo protegido, F, un grupo amino protegido, un grupo O-alquilo, un O-alquilo sustituido, un alquilamino sustituido o una unión C4'-O2' metileno R3 es OH y R5 es OR'5 y R'5 es un grupo protector de hidroxilo, un nucleótido protegido o un oligonucleótido protegido iii) R2 es OH R3 es OR'3, NHR 3, NR 3R 3, en donde R 3 es un grupo protector de hidroxilo, un nucleótido protegido o un oligonucleótido protegido, R 3, R 3 son independientemente grupos protectores de amino, y Rs es OR'5 y R'5 es un grupo protector de hidroxilo, un nucleótido protegido o u?\ oligonucleótido protegido b) hacer reaccionar dicho compuesto con un agente fosfitilante en presencia de un activador que tiene la fórmula I (activador I) en donde R = alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroalquilo, heteroarilo R1, R2 = son H o forman juntos un anillo de entre 5 y 6 miembros X-?, X2 = independientemente bien N o CH Y = H o Si(R )3, con R4= alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroalquilo, heteroarilo B = ácido desprotonado para preparar un compuesto fosfitilado c) hacer reaccionar dicho compuesto fosfitilado sin aislar con un segundo compuesto que tiene la fórmula en donde R5, R3, R2, B se eligen independientemente, pero tienen la misma definición anterior en presencia de un activador II diferente del activador I.