MX2007010687A - Metodo de clasificacion, procedimiento para la purificacion de oligomeros a-beta no difundibles, anticuerpos selectivos contra dichos oligomeros a-beta no difundibles y un procedimiento para la fabricacion de dichos anticuerpos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a oligomeros A((X- 38..43) globulares no difundibles ("globulomeros") o derivados de los mismos, metodos para enriquecer dichos globulomeros o derivados, composiciones que comprenden dichos globulomeros o derivados, anticuerpos y aptameros que tengan caracter especifico para dichos globulomeros o derivados, metodos para preparar dichos anticuerpos y aptameros, usos de dichos globulomeros o derivados, o de dichos anticuerpos o aptameros para propositos de diagnostico, terapeuticos y otros propositos, y metodos correspondientes utilizando dichos globulomeros o derivados, o dichos anticuerpos o aptameros.

Description

MÉTODO DE CLASIFICACIÓN. PROCEDIMIENTO PARA LA PURIFICACIÓN DE OLIGÓMEROS A-BETA NO DIFUNDIBLES.

ANTICUERPOS SELECTIVOS CONTRA DICHOS OLIGÓMEROS A- BETA NO DIFUNDIBLES Y UN PROCEDIMIENTO PARA LA FABRICACIÓN DE DICH OS AN TICUER POS La presente invención se refiere a oligómeros Aß(X-38 43) globulares no difundibles ("globulómeros") o derivados de los mismos, métodos para enriquecer tales globulómeros o derivados, composiciones que comprenden tales globulómeros o derivados, anticuerpos y aptámeros que tienen especificidad para tales globulómeros o derivados, métodos para preparar tales anticuerpos y aptámeros, usos de tales globulómeros o derivados, o de anticuerpos o aptámeros para diagnóstico, terapia y otros propósitos, y métodos correspondientes que utilizan tales globulómeros o derivados, o tales anticuerpos o aptámeros La enfermedad de Alzheimer (AD) es un trastorno neurodegenerativo y que produce demencia por una pérdida progresiva de facultades cognoscitivas y por características neuropatológicas características que comprenden depósitos amiloideos extraceluiares, nudos neurofibplares intracelulares y pérdida neuronal en varias regiones del cerebro (Mattson, M P Pathways towards and away from Alzheimer's disease Nature 430, 631-639 (2004), Hardy, J & Selkoe, D J The amyloíd hypothesis of Alzheimer's disease progress and problems on the road to therapeutics Science 297, 353-356 (2002)) Los constituyentes principales de los depósitos amiloideos son péptidos de amiloide ß Uno de los atributos de patología en la enfermedad de Alzheimer es la formación excesiva de amiloide ß (Aß) 1-42 que agrega y es el constituyente principal de las placas características Aß (1-42) se deriva de la proteína precursora amiloidea (APP), y el procedimiento anormal de APP, que conduce a producción incrementada de Aß(1-42), ha sido un asunto de investigación exhaustiva en el pasado La hipótesis de cascada amiloidea por Hardi y Higgins (Hardy, J A & Higgtns, G A Alzheimer's disease the amyloíd cascade hypothesis Science 256, 184-185 (1992)) postuló que la producción incrementada de Aß(1-42) conduce a su agregación en fibrillas de tamaño cada vez mayor (comenzando con las así llamadas protof ?br¡ I las) y finalmente a depósitos similares a placas, y que los depósitos fibrosos Aß son la razón para los síntomas neuropatológicos en enfermedad de Alzheimer Esta hipótesis fue más favorecida hasta hace poso, aunque la correlación de demencia y carga de placa amiloidea es más bien pobre en pacientes con AD (Katzman, R et al Clínica, pathological, and neurochemical changes in dementia a subgroup with preserved mental status and numerous neocortical plaques Ann Neurol 23, 138-144 (1988), Naslund, J et al Correlation between elevated levéis of amyloíd beta-peptide in the brain and cognitive decline JAMA 283, 1571-1577 (2000)) Es notable que se hayan hecho hallazgos similares en el síndrome de Down, sugiriendo implicación de los mismos mecanismos Los ohgómeros, descritos en primer lugar simplemente como intermediarios del proceso de formación de fibrillas y placas, se han discutido recientemente como especies tóxicas importantes junto con la patología de AD La aparición de Aß oligomépcos solubles en el cerebro de pacientes con AD (Kuo, Y M et al Water-soluble Abeta (N-40, N-42) ohgomers in normal and Alzheimer disease brains J Biol Chem 271, 4077-4081 (1996)) se correlaciona mejor con síntomas de AD que con la carga de placas (Kou, Y M et al Water-soluble Abeta (N-40, N-42) oligomers in normal and Alzheimer disease brains J Biol Chem 271, 4077-4081 (1996), McLean, C A et al Soluble pool of Abeta amyloíd as a determinant of sevepty of neurodegeneration in Alzheimer's disease Ann Neurol 46, 860-866 (1999)) Esto ha conducido a una hipótesis en cascada amiloidea revisada (Hardy, J & Seikoe, D J The amyloíd hypothesis of Alzheimer's disease progress and problems on the road to therapeutics Science 297, 353-356 (2002)) La posibilidad de que ensambles solubles como el globulómero Aß(1-42), en lugar de aglomerados fibrosos solubles, puedan inducir a alteraciones neuronales tempranas en AD ha ganado mucha atención ya que las observaciones iniciales de una correlación consistente entre niveles corticales de Aß solubles prefibrosos y el grado de pérdida neuronal y severidad de deterioro cognoscitivo (McLean, C A et al Soluble pool of Abeta amyloíd as a determinant of sevepty of neurodegeneration m Alzheimer's disease Ann Neurol 46, 860-866 (1999), Lúe, L F et al Soluble amyloíd beta peptide concentration as a predictor of synaptic change in Alzheimer's disease, Am J Pathol 155, 853-862 (1999), Wang, J , Dickson, D W Trojanowksi, J Q & Lee, V M The levéis of soluble versus insoluble brain Abeta distinguish Alzheimer's disease from normal and pathologic aging Exp Neurol 158, 328-337 (1999)) Trabajo reciente mostró la posibilidad para generar formas oligomépcas solubles de Aß m vitro (Lambert, M P et al Diffusible, nonfibpllar hgands depved from Abeta 1-42 are potent central nervous system neurotoxins Proc Nati Acad Sci U S A 95, 6448-6453 (1998), Walsh, D M et al Naturally secreted ohgomers of amyloíd beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo Nature 416, 535-539 (2002)) Algunas de estas formas oligomépcas solubles de Aß demostraron ser perjudiciales a neuronas en la unión específica a espina sináptica (Lacor, P N et al Synaptic targeting by Alzheimer'-related amyloíd ß oligomers, J Neuroscí 24, 10191-10200 (2004)) Esta interacción específica puede ser responsable de la inhibición observada de potenciación a largo plazo hipocámpica (LTP), un paradigma experimental para plasticidad y memoria sináptica (Lambert, M P et al Diffusible, nonfibpllar ligands depved from Abeta 1-42 are potent central nervous system neurotoxins Proc Nati Acad Sci U S A 95, 6448-6453 (1998); Walsh, D M et al Naturally secreted oligomers of amyloíd beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo Nature 416, 535-539 (2002)) Evidencia adicional para un papel clave de formas Aß solubles en patogénesis de AD proviene de que el deterioro cognoscitivo se desarrolla bien antes de la deposición de Aß insoluble en ratones transgénicos para APP humana (Buttini, M et al Modulation of Alzheimer-like synaptic and chohnergic déficits m transgenic mice by human apolipoprotein E depends on isoform, aging, and overexpression of amyloíd beta peptides but not on plaque formation J Neuroscí 22, 10539-10548 (2002), Hsia, A Y et al Plaque-independent disruption of neural circuits in Alzheimer's disease mouse models Proc Nati Acad Sci U S A 96, 3228-3233 (1999), Mucke, L et al High-level neuronal expression of abeta 1-42 in wild-type human amyloíd protein precursor transgenic mice synaptotoxicity without plaque formation J Neuroscí 20, 4050-4058 (2000)) Desde entonces, muchos investigadores han utilizado preparaciones de Aß sintéticas para modelar neurotoxicidad mediada por Aß soluble (revisada en Walsh, D M & Seikoe, D J Deciphepng the molecular basis of memory faillure m Alzheimer's disease Neuron 44, 181-193 (2004)) Sin embargo, la propensión intrínseca de péptidos Aß (especialmente Aß(1-42)) para agregar rápidamente en soluciones acuosas a una variedad de estructuras polimepzadas, incluyendo oligómeros solubles, protof i brillas y fibrillas (Stine, W B Jr , Dahlgren, K N , Krafft, G A & LaDu, M J In vitro charactepzation of conditions for amyloid-beta peptide oligomepzation and fibpllogenesis J Biol Chem 278, 11612-11622 (2003)), hace imposible atribuir los efectos neurotóxícos observados a una forma específica de asociación Aß multimérica. Por lo tanto, varios grupos han tratado recientemente de aislar ensambles Aß (1-42) solubles y probar su actividad neurotóxica. Lambert y co-trabajadores (Lambert, M.P. et al. Diffusible, nonf ¡brillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxíns. Proc. Nati. Acad. Scí U.S.A 95, 6448-6453 (1998)) describe una mezcla de pequeños agregados Aß (1-42) solubles (4-18 kDa en SDS-PAGE), los cuales llamaron "ligandos difundibles derivados de Aß" (ADDLs). Estos son capaces de mostrar que las concentraciones tan bajas como 500 nM de ADDLs provocan muerte neuronal en cultivos celulares y LTP casi completamente bloqueada (Lambert, M.P. et al. Diffusible, nonfibrillar lígands derived from Abeta 1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Nati. Acad. Sci U.S.A 95, 6448-6453 (1998); Wang, H.W. et al. Soluble oligomers of beta amyloid 1-42 inhibit long-term potentiation but no long-term depression in rat dentate gyrus Brain Res 924, 133-140 (2002)). En otro procedimiento no sintético se liberaron oligómeros Aß en el medio por una línea celular que expresa APP humana mutante (Walsh, D.M. et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature 416, 535-539 (2002); Podlisny, M.B. et al. Aggregation of secreted amyloíd beta-protein ¡nto sodium dodecyl sulfate-stable oligomers in cell culture. J Bíol Chem. 270, 9564-9570 (1995)). Las alícuotas de este medio condicionado que contiene oligómeros Aß(1- 42) no caracterizados bloquean LTP in vivo e m vitro a concentraciones nanomolares bajas (Walsh, D M et al Naturally secreted ohgomers of amyloíd beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation m vivo Nature 416, 535-539 (2002), Wang, Q , Walsh, D M , Rowan, M J , Seikoe, D J & Anwyl, R Block of long-term potentiation by naturally secreted and synthetic amyloíd beta-peptide in hippocampal shces is mediated vía activation of the kinases c-Jun N-terminal kinase, cychn-dependent kinase 5, and p38 mitogen-activated protein kinase as well as metabotropic glutamate receptor type 5, J Neuroscí 24, 3370-3378 (2004)) WO 98/33815 y WO 01/10900 (G A Krafft et al ) describe ligandos que producen demencia derivado de amiloide beta1-40 ó 1-42 difundible, particular, llamados ADDLs (Amyloíd Beta (Aß)-Der?ved Djffusible Ugands) como un principio neurotóxico que bloquea selectivamente potenciación a largo plazo (LTP) De acuerdo con WO 98/33815 y WO 01/10900 se ha sugerido que los ADDLs son la especie neurotóxica y que la presencia de ADDLs en el cerebro es el factor causal y por lo tanto el factor de riesgo principal para aparición y progreso de síntomas principales de Enfermedad de Alzheimer (AD) La relevancia de oligómeros Aß para patología de AD se ha enfatizado por su detección en cerebros de pacientes con AD (Gong, Y et al Alzheimer's disease-affected brain presence of oligomepc Aß hgands (ADDLs) suggest a molecular basis for reversible memory loss Proc Nati Acad Sci U S A 100, 10417-10422 (2003)) El término "difundible" como se utiliza en Lambert et al 1998, Walsh et al 2002, Gong et al 2003, WO 98/33815 y WO 01/10900, significa que un aspecto característico de ADDLs (Aß oligomépco (1-42) o Aß(1-42)) es que se difunden rápidamente cuando se inyectan en el hipocampo de las ratas, en contraste a fibrillas oligo o poh-Aß (1-42) o Aß (1-40) las cuales permanecen en la ruta de la inyección (A M Manelli et al , Journal of Molecular Neuroscience, 2004, Vol 23, 235-246) Así mismo, después de la inyección mtraventpcular, se observaron oligómeros "difundibles" que se dispersan dentro del licor y se pernean en el estrato sub-superficial del SNC A pesar de estos reportes, el procedimiento experimental a la patología y función de oligómeros Aß fue aún difícil debido a que la preparación pura y estable, no definida estuvo hasta el momento disponible, lo cual hizo imposible a la estructura patológica subyacente No fue hasta que WO 2004/067561 (Abbott GmbH & Co KG) describiera una especie nueva y altamente estable de ohgómero Aß(1-42) que los efectos neuropatólogicos se pudieron atribuir a una especie de Aß oligomépca distinta, sencilla Debido a que la homogeneidad y estructura espacial globular característica de esta especie Aß oligomépca fue llamada "globulómero Aß(1-42)", los globulómeros Aß(1-42) pueden generarse fácil y reproduciblemente a partir de péptido Aß sintético in vitro La caracterización físico-química revela un ohgómero Aß(1-42) globular altamente soluble en agua de un tamaño de aproximadamente 60 kDa ("globulómero Aß(1-42)") el cual es un antígeno potente en ratones y conejos que producen generación de anticuerpos específicos de globulómero Aß(1-42) que no reaccionan en forma transversal con la proteína precursora amiloidea Sorprendente e inesperadamente, tal ohgómero Aß(1-42) globular soluble ("globulómeros") descrito en WO 2004/067561 (Abbott GmbH & Co KG) se enlaza específicamente a procesos dendríticos de neuronas, pero no a glía en cultivos celulares hipocámpicos El enlace al tejido es muy fuerte y resulta en la remoción inmediata después de inyección i c v en ratas Consecuentemente, no se detectaron globulómeros Aß(1-42) en el fluido cerebroespinal de pacientes con AD dentro de los límites de detección actuales Esto significa, sorprendente e inesperadamente, que globulómeros Aß(1-42) que producen demencia de acuerdo con WO 2004/067561 (Abbott GmbH & Co KG) tienen propiedades no difundibles y que el principio tóxico responsable para aparición y el progreso de enfermedad de Alzheimer se caracteriza por el aspecto "no difundible" en lugar de "difundible" como se postula por WO 98/33815 y publicaciones similares como se discute anteriormente La potencia de deterioro de memoria del globulómero Aß(1-42) no d if u nd i ble se muestra por un bloque completo de potenciación a largo plazo (LTP) en rebanadas hipocámpicas de ratas La neutralización selectiva del globulómero Aß(1-42) se espera por lo tanto que tenga un potencial elevado para tratamiento de AD Se postula ahora que este ohgómero globular no difundióle, particular se genera a lo largo de una nueva trayectoria de agregación independiente de formación de fibrilla Aß y representa una entidad patológica novedosa en enfermedad de Alzheimer Ya que se presenta en el cerebro de pacientes con AD y ratones transgénicos con APP y también se enlaza específicamente a neuronas y bloquea LTP, se cree que este ohgómero Aß globular caracterizado por un nuevo epítope estructural proporcionará una nueva posibilidad sin precedente para producir la neuropatología asociada con ohgómeros Aß y que dirige carencias de pacientes con AD por tratamiento específico Además, se demostró que la invención ahora fue capaz de demostrar que al utilizar anticuerpos anti globulómero Aß como especies de reacción cruzada in vivo de anticuerpo 5598 pohclonal o anticuerpo 8F5 monoclonal no se restringieron a la secuencia Aß(1-42) sino también se pueden extender a otra especie Aß(x-y), por ejemplo Aß(1-40) y Aß (1-38) La invención se relaciona así a un oligómero Aß(X-38 43) globular no difundible ("globulómero") o un derivado del mismo, en donde X se selecciona del grupo que consiste de los números 1 24 Como se utiliza en la presente, la elipsis A B denota el conjunto que comprende todos los números naturales de A a B, incluyendo ambos, por ejemplo, "17 20", de este modo denota el grupo de los números 17, 19, 19 y 20 El guión denota una secuencia contigua de aminoácidos, es decir, "X-Y" comprende la secuencia del aminoácido X al aminoácido Y, incluyendo ambos De este modo, "A B-C D" comprende todas las posibles combinaciones entre miembros de estos dos conjuntos, por ejemplo, "17 20-40 42" comprende todo lo siguiente 17-40, 17-41, 17-42, 18-40, 18-41, 18-42, 19-40, 19-41, 19-42, 20-40, 20-41 y 20-42 A menos que se establezca de otro modo, todos los números se refieren al comienzo del péptido maduro, 1 indicando el aminoácido N-terminal El término "Aß(X-A B)" es un sinónimo para y puede ser utilizado intercambiablemente con el término "Aß(X-A/B)" De acuerdo con una modalidad particular, el oligómero globular no d if u nd ib le o derivado del mismo se selecciona del grupo que consiste de oligomeros Aß(X-40) globulares no difundibles y oligómeros Aß(X -42) globulares no difundibles o derivados de los mismos, en donde X se selecciona del grupo que consiste de los números 8 24, de preferencia del grupo que consiste de los números 12 24, más preferiblemente del grupo que consiste de los números 12 20 y más preferiblemente del grupo que consiste de los números 17 20 De acuerdo con una modalidad particular adicional, el oligómero globular no d if und i ble o derivado del mismo se selecciona del grupo que consiste de oligómeros Aß(X-38) globulares no difundibles, o gómeros Aß(X-39) globulares no difundibles y ohgómeros Aß(X-41) globulares no difundibles o derivados de los mismos De acuerdo con aún una modalidad particular adicional, el oligómero globular no difundible o derivado del mismo se selecciona del grupo que consiste de oligómeros Aß(X-43) globulares no difundióles o derivados de los mismos Derivados del ohgómero Aß(X-38 43) globular no dif und i ble en particular incluyen aldehido reticulado, de preferencia químicamente reticulada y más preferiblemente reticulado, oligómero Aß(X-38 43) globular no difundible reticulado más preferiblemente con glutardialdehído Derivados adicionales del ohgómero Aß(X-38 43) globular no difundible incluyen ohgómeros Aß(X-38 43) globulares no difundibles los cuales se etiquetan al unirse covalentemente a un grupo que facilita la detección, de preferencia un fluoróforo, por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, ficoeptpna, proteína fluorescente de Aequorea victoria, proteína fluorescente de Dictyosoma o cualquier combinación o derivado activo de fluorescencia de la misma, un cromóforo, un quimioluminóforo, por ejemplo, luciferasa, de preferencia luciferasa de Photmus pyralis, luciferasa de Vibrio fischen o cualquier combinación o derivado activo por quimioluminiscencia de la misma, un grupo enzimáticamente activo, por ejemplo, peroxidasa, por ejemplo, peroxidasa de rábano, o cualquier derivado enzimáticamente activo del mismo, un grupo denso de electrón, por ejemplo, un grupo que contiene metal pesado, por ejemplo, un grupo que contiene oro, un hapteno, por ejemplo un hapteno derivado de fenol, una estructura fuertemente antigénica, por ejemplo, una secuencia peptídica prevista para ser antigénica, por ejemplo, prevista para ser antigénica por el algoritmo de Kolaskar y Tongaonkar, un aptámero para otra molécula, un grupo quelante, por ejemplo, hexahistidmilo, una estructura de proteína natural o derivada de la naturaleza que media además interacciones de proteína-proteína específicas, por ejemplo, un miembro del par fos/jun, un grupo magnético, por ejemplo, un grupo ferromagníetico, o un grupo radioactivo, por ejemplo, un grupo que comprende 1H, 1 C, 32P, 25S o 125l o cualquier combinación del mismo Tales grupos de etiquetado y métodos para unirlos a proteínas se conocen en la técnica En otra modalidad particular de la invención, el derivado del ohgómero Aß(X-38 43) globular no difundible es un oligómero Aß(X-38 43) globular no d if und i bl e el cual comprende al menos una subunidad monomérica que se señaliza siendo covalentemente o por interacción de alta afinidad no covalente, de preferencia unida covalentemente a un grupo que facilita la inactivación, secuestración, degradación y/o precipitación, de preferencia señaliza con un grupo que promueve degradación in vivo, más preferiblemente con ubiquitma Se prefiere en particular si este oligómero señalizado se ensambla in vivo Derivados adicionales del ohgómero Aß(X-38 43) globular no d if u nd i ble incluye ohgómeros Aß(X-38 43) globular no difundibles los cuales se reticulan y etiquetan o reticulan y señalizan En una modalidad preferida de la invención, el oligómero o derivado del mismo es soluble Un método para preparar varios oligómeros Aß(1-42) y Aß(X- 42) y derivados de los mismos se describe en WO 2004/067561 Los oligómeros Aß(X-38 43) globulares no difundibles o derivados de los mismos de la invención pueden prepararse en una manera análoga De este modo, la invención se relaciona también a un método para preparar un oligómero Aß(X-38 43) globular n d if u nd i ble o un derivado del mismo-en particular reticulado, etiquetado y/o señalizado -, cuyo método comprende poner en contacto una preparación de una proteína Aß adecuada o derivado de la misma con un detergente, seguida por la reducción de la concentración de detergente y obtener el oligómero Aß(X-38 43) globular no difundible Una descripción detallada de tal método se describe en WO 2004/067561, el contenido del cual se incorpora en la presente para referencia La derivación y/o truncamiento pueden realizarse antes o después de la oligomepzación Por consiguiente, la proteína Aß o derivado de la misma adecuada para utilizarse en tal método incluye derivar opcionalmente el monómero Aß(X-38 43), X de preferencia al seleccionarse a partir del grupo que consiste de los números 1 24, más preferiblemente del grupo que consiste de los números 1 22 y más preferiblemente del grupo que consiste de los números 1 20 Alternativa, y especialmente uti liza b le para métodos de diagnóstico in vitro, los oligómeros Aß(1-42) globulares "no difundióle" ("globulómeros") de la invención pueden extraerse tamóién a partir de células nerviosas humanas o animales, incluyendo, pero sin limitarse a líneas celulares y/o líquidos derivados recomóinantes o no recomómantes que expresan APP o Amylotd ß, en particular cereóro o tejido de la médula espinal y/o líquidos, y luego detectarse directamente en el extracto así oótenido o un extracto procesado por uso de anticuerpos que tienen especificidad contra el oligómero Aß(1-38 43) gloóular "no difundióle" ("gloóulómeros") o derivados de los mismos, como el oligómero Aß(X-38 43) truncado respectivo y/o derivados del mismo En una modalidad particularmente preferida de la invención, el oligómero Aß(X-38 43) globular no difundióle resultante o derivado del mismo se somete entonces a una o más etapas de purificación adicional, por ejemplo, precipitación y re-disolución, por técnicas conocidas en el arte La invención se refiere así a un método para enriquecer un oligómero Aß(X-38 43) globular no difundible o un derivado del mismo en una preparación que comprende el oligómero o un derivado, cuyo método comprende capturar el oligómero o derivado y obtener el oligómero o derivado en forma enriquecida (enriquecimiento "activo" o "positivo") En una modalidad preferida de la invención, el método para enriquecer el oligómero o derivado comprende poner en contacto la preparación con un agente que se enlaza al ohgómero o derivado En una modalidad particularmente preferida de la invención, el agente se inmoviliza En una modalidad particularmente preferida de la invención, el agente es un anticuerpo que tiene especificidad para el oligómero o derivado En una modalidad preferida de la invención, obtener el oligómero o derivado en forma enriquecida comprende desorber el oligómero capturado o derivado, de preferencia en tal forma que al desoróer el oligómero capturado o derivado comprenda poner en contacto el ohgómero capturado o derivado con un regulador de pH con un alto contenido de sal o una solución acídica La invención se refiere tamóién a un método para enriquecer un ohgómero Aß(X-38 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo en una preparación que comprende el ohgómero o derivado, cuyo método comprende remover al menos una sustancia diferente del oligómero o derivado de la preparación (enriquecimiento "pasivo" o "negativo") Se prefiere si la sustancia a diferencia del oligómero o derivado sea monómero Aß o fióplómero Aß, de preferencia amóos, y tamóién si al remover la sustancia comprenda poner en contacto la preparación con un agente que se enlaza específicamente a la sustancia En una modalidad particularmente preferida de la invención, el agente se inmoviliza En una modalidad particularmente preferida de la invención, el agente es un anticuerpo que se enlaza específicamente a la sustancia, de preferencia con alta afinidad Los anticuerpos los cuales pueden utilizarse para remover especies Aß sin gloóulómero incluyen anticuerpos anti Aß(33-42) los cuales son específicos para especies Aß (1-42) C-terminales, tales como anticuerpo pohclonal anti Aß(33-42) de Signet Cat No 9135, y equivalentes monoclonales de los mismos, por ejemplo mAó 12F4 de Signet, Cat No 9141 o mAó ant?-Aß(1 -42), clon BDI780 C-terminal, purificado, I lof 11 izado , Biodiseño Cat No Q67780M En una modalidad más preferida de la invención, remover la sustancia comprende poner en contacto la preparación con un anticuerpo que se enlaza a la sustancia y luego somete la sustancia enlazada al anticuerpo a cromatografía por afinidad para la remoción de complejos de anticuerpo-antígeno, de preferencia a cromatografía por afinidad de proteína A La presente invención se relación así a un oligómero Aß (X-38 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo De acuerdo con una modalidad de la presente invención, un oligómero Aß(X-38 43) gloóular no difundióle purificado o derivado del mismo es aquel el cual es oótenióle por un método para enriquecer un oligómero Aß(X-38 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo, como se define anteriormente En otro aspecto, un oligómero Aß(X-38 43) gloóular no difundióle purificado o derivado del mismo es aquel el cual tiene una pureza de más de 99% en peso, de preferencia de más de 99 9% en peso, de preferencia de más de 99 9% en peso La invención se refiere tamóién a una composición que comprende un oligómero Aß(X-38 43) gloóular no difundióle o lí derivado del mismo, oótenióle por un método de la invención, de preferencia una composición que comprende un o gómero Aß(X-38 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo, en donde la cantidad del oligómero o el derivado es al menos 99% en peso de la composición, de preferencia al menos 99 9% en peso de la composición y más preferiblemente al menos 99 9% en peso de la composición El oligómero Aß(X-38 43) globular no difundible o derivado del mismo de la invención, especialmente en forma purificada, tiene muchas utilidades, algunas de la cuales se describen en lo siguiente En un aspecto, la invención se relaciona al uso de un oligómero Aß(X-38 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo para preparar un anticuerpo que tiene especificidad para el oligómero o derivado Por consiguiente, la invención se relaciona tamóién a un método para preparar un anticuerpo que tiene especificidad para un oligómero Aß(X-38 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo como se define anteriormente, cuyo método comprende -proporcionar un antígeno que comprende el oligómero o un derivado, -exponer un repertorio de anticuerpos o repertorio potencial de anticuerpos al antígeno, -seleccionar a partir del repertorio un anticuerpo el cual se enlaza específicamente al ohgómero o derivado del mismo Se deóe entender aquí que un "repertorio potencial de anticuerpos" se refiere a cualquier biblioteca, colección, ensamble o conjunto de aminoácido o secuencias de ácido nucleico correspondientes o a cualquier generador de tal biblioteca, colección, ensamble o conjunto de secuencias de aminoácido que pueden utilizarse para producir un repertorio de anticuerpos m vivo o m vitro En una modalidad preferida de la invención, el generador es el sistema inmune adaptable de un animal, en particular la parte que produce antígeno del sistema inmune de un mamífero el cual genera diversidad de anticuerpos por un proceso de recombinación bien conocido por aquellos expertos en la técnica En otra modalidad preferida de la invención, el generador es un sistema para la generación de secuencias de ácido nucleico aleatorias las cuales pueden entonces, por inserción en una estructura de anticuerpo adecuada, utilizarse para producir un repertorio de anticuerpos in vitro En una modalidad preferida de la invención, el repertorio de anticuerpos o repertorio potencial de anticuerpos se expone al antígeno in vivo inmunizando un organismo con tal antígeno En otra modalidad preferida de la invención, el repertorio potencial de anticuerpos es una biblioteca de ácidos nucleicos adecuados la cual se expone al anticuerpo por clasificación de afinidad in vitro como se describe en la técnica, por ejemplo, un despliegue de fago y sistema de cribado En otro aspecto, la invención se relaciona también a un anticuerpo que tiene especificidad para un oligómero Aß(X-38 43) globular no difundióle o un derivado del mismo como se define anteriormente. En una modalidad preferida de la invención, el anticuerpo es oótenióle por un método que comprende seleccionar el anticuerpo a partir de un repertorio o un repertorio potencial como se descrióe anteriormente. En una modalidad preferida de la invención, la afinidad del anticuerpo al oligómero o derivado es al menos 2 veces, por ejemplo, al menos 3 veces o al menos 5 veces, de preferencia al menos 10 veces, por ejemplo, al menos 20 veces, al menos 30 veces, o al menos 50 veces, más preferiólemente al menos 100 veces, por ejemplo, al menos 200 veces, al menos 300 veces o al menos 500 veces, e incluso más preferiólemente al menos 1000 veces, por ejemplo, al menos 2000 veces, al menos 3000 veces o al menos 5000 veces, incluso más preferíólemente al menos 10000 veces, por ejemplo al menos 20000 veces, al menos 30000 o al menos 50000 veces, y más preferíólemente al menos 100000 veces mayor que la afinidad de enlace del anticuerpo a un Aß(1-42) monomérico. En una modalidad preferida de la invención, la afinidad del anticuerpo al oligómero o derivado es al menos 2 veces, por ejemplo, al menos 3 veces o al menos 5 veces, de preferencia al menos 10 veces, por ejemplo, al menos 20 veces, al menos 30 veces o al menos 50 veces, más preferiólemente al menos 100 veces, por ejemplo, al menos 200 veces, al menos 300 veces o al menos 500 veces, e incluso más preferiólemente al menos 1000 veces, por ejemplo, al menos 2000 veces, al menos 3000 veces o al menos 5000 veces, incluso más preferiólemente al menos 10000 veces, por ejemplo, al menos 20000 veces, al menos 30000 o al menos 50000 veces, y más preferiólemente al menos 100000 veces mayor que la afinidad de enlace del anticuerpo a un Aß(1-40) monomérico En una manera válida, el anticuerpo de la presente invención se enlaza a uno o más preferiólemente, amóos monómeros con baja afinidad, más preferiblemente con un KD de 1x108 M o afinidad más pequeña, por ejemplo, con un KD de 3x108 M o afinidad más pequeña, con un KD de 1x10'7 M o afinidad más pequeña, por ejemplo, con un KD de 3x107 M o afinidad más pequeña, o con un KD de 1x106 M o afinidad más pequeña, por ejemplo, con un KD de 3x10" 6 M o afinidad más pequeña, o con un KD de 1x105 M o afinidad más pequeña En una modalidad preferida de la invención, la afinidad del anticuerpo al ohgómero o derivado es al menos 2 veces, por ejemplo, al menos 3 veces o al menos 5 veces, de preferencia al menos 10 veces, por ejemplo, al menos 20 veces, al menos 30 veces o al menos 50 veces, más preferiblemente al menos 100 veces, por ejemplo, al menos 200 veces, al menos 300 veces o al menos 500 veces, e incluso más preferiblemente al menos 1000 veces, por ejemplo, al menos 2000 veces, al menos 3000 veces o al menos 5000 veces, incluso mas preferiblemente al menos 10000 veces, por ejemplo, al menos 20000 veces, al menos 30000 veces, o al menos 50000 veces, y más preferiblemente al menos 100000 veces mayor que la afinidad de enlace del anticuerpo a un Aß(1-42) fióplomépco En una modalidad preferida de la invención, la afinidad del anticuerpo al oligómero o derivado es al menos 2 veces, por ejemplo, al menos 3 veces o al menos 5 veces, de preferencia al menos 10 veces, por ejemplos al menos 20 veces, al menos 30 veces o al menos 50 veces, más preferiólemente al menos 100 veces, por ejemplo al menos 200 veces, al menos 300 veces o al menos 500 veces, e incluso más preferiólemente al menos 1000 veces, por ejemplo, al menos 2000 veces, al menos 3000 veces o al menos 5000 veces, incluso más preferiólemente al menos 10000 veces, por ejemplo, al menos 20000 veces, al menos 30000 o al menos 50000 veces, y más preferiólemente al menos 100000 veces mayor que la afinidad de enlace del anticuerpo al Aß(1-40) fióplomépco En una manera válida, el anticuerpo de la presente invención se enlaza a uno o más preferiólemente amóas fibrillas con baja afinidad, más preferiblemente con un KD de 1x10"6 M o afinidad más pequeña, por ejemplo con un KD de 3x10"8 M o afinidad más pequeña, con un KD de 1x107 M o afinidad más pequeña, por ejemplo, con un KD de 3x10'7 M o afinidad más pequeña, o con KD de 1x10'6 M o afinidad más pequeña, por ejemplo, con un KD de 3x10"5 M o afinidad más pequeña, o con un KD de 1x105 M o afinidad más pequeña De acuerdo con una modalidad particularmente preferida, la presente invención se relaciona a anticuerpos específicos de globulómero Éstos incluyen en particular anticuerpos que tienen una afinidad comparativamente más pequeña tanto para formas monoméricas como fibplomépcas de Aß que para el globulómero Aß El término "afinidad mayor" aquí se refiere a un grado de interacción en donde el equilibrio entre el anticuerpo no enlazado y el globulómero no enlazado por un lado el complejo de anticuerpo-globulómero por el otro esta a favor además del complejo de anticuerpo-globulómero Así mismo, el término "afinidad más pequeña" aquí se refiere a un grado de interacción en donde el equilibrio entre el anticuerpo no enlazado y el globulómero no enlazado por un lado y el complejo de anticuerpo-globulómero por el otro está a favor además del anticuerpo no enlazado y el globulómero no enlazado La invención se relaciona al uso del ohgómero Aß(X-38 43) globular no difundible o un derivado del mismo como se define anteriormente para preparar un aptámero que tiene especificidad para el oligómero o derivado La invención se relaciona también a un método para preparar un aptámero que tiene especificidad el oligómero Aß(X-38 43) globular no d if und i ble o un derivado del mismo como se define en la reivindicación, cuyo método comprende al menos las etapas de -proporcionar un objetivo de enlace que comprende el ohgómero o un derivado, -exponer un repertorio de aptámero o repertorio potencial de aptamero al objetivo de enlace, y -seleccionar a partir del repertorio un aptámero el cual se enlaza específicamente al oligómero o derivado del mismo Un "aptámero" en la presente se refiere a cualquier molécula pequeña que es capaz de enlace no covalente específico a su objetivo, de preferencia a un péptido, secuencia de ADN o ARN, más preferiblemente a un péptido, secuencia de ADN o ARN de aproximadamente 3 a 100 monómeros, en particular de aproximadamente 5 a 30 monómeros, más preferiólemente a un péptido de aproximadamente 5 a 30 aminoácidos, los cuales pueden en un extremo o amóos extremos unirse a una molécula más grande, de preferencia una molécula más grande que media las funciones óioquímicas, más preferiólemente una molécula más grande que induce la inactivación y/o degradación, más preferiólemente uóiquitina, o de preferencia una molécula más grande que facilita la destrucción, más preferiólemente una enzima o una proteína fluorescente Se deóe entender aquí que un "repertorio potencial de aptámero" se refiere a cualquier biblioteca, colección, ensamble o conjunto de secuencias de aminoácido o secuencias de ácido nucleico correspondientes o a cualquier generador de tal biblioteca, colección, ensamble o conjunto de secuencias de aminoácido que pueden utilizarse para producir un repertorio de aptámero in vivo o in vitro La invención también se relaciona a un aptámero que tiene especificidad para un oligómero Aß(X-38 43) globular no d if und i ble o un derivado del mismo como se define anteriormente, cuyo aptámero es obtenible por un método como se describe En una modalidad preferida de la invención, el aptámero se etiqueta al unirse covalentemente a un grupo que facilita la detección, de preferencia un fluoróforo, por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, ficoeptpna, proteína fluorescente de Aequorea victoria, proteína fluorescente de Dictyosoma o cualquier combinación o derivado activo de fluorescencia de la misma, un cromóforo, un quimioluminóforo, por ejemplo, luciferasa, de preferencia luciferasa de Photinus pyralis, luciferasa de Vibrio fischen o cualquier combinación o derivado activo por quimioluminiscencia de la misma, un grupo enzimáticamente activo, por ejemplo, peroxidasa, por ejemplo, o cualquier derivado enzimáticamente activo del mismo, un metal pesado, por ejemplo, oro, un hapteno, por ejemplo un hapteno derivado de fenol, una estructura antigénica, por ejemplo, una secuencia peptídica prevista para ser antigénica, otro aptámero, una estructura de proteína natural o derivada de la naturaleza que media además interacciones de proteína-proteína específicas, por ejemplo, un miembro del par fos/jun, un grupo radioactivo, por ejemplo, un grupo que comprende 1H, 14C, 32P, 35S o 125l o cualquier combinación del mismo En otra modalidad preferida de la invención, el aptámero se señaliza siendo covalentemente o por un enlace de afinidad elevada no covalente, de preferencia unido covalentemente a un grupo que facilita la activación, secuestración, degradación y/o precipitación cuando el aptámero se enlaza a su objetivo, de preferencia señaliza con un grupo que promueve la degradación in vivo, más preferiblemente con ubiquitma La invención se relaciona también al uso de un o gómero Aß(X-38 43) globular no d if u nd i ble o un derivado del mismo como se define en la reivindicación para preparar una composición farmacéutica para tratar o evitar enfermedad de Alzheimer En una modalidad preferida de la invención, la composición farmacéutica es una vacuna para inmunización activa Por consiguiente, la invención se relaciona también a un método para tratar o evitar enfermedad de Alzheimer en un sujeto con necesidad del mismo, el cual comprende administrar un oligómero Aß(X-38 43) globular no difundible o un derivado del mismo como se define al sujeto En una modalidad preferida de la invención, administrar un oligómero Aß(X-38 43) globular no difundible o un derivado del mismo es para inmunizar activamente el sujeto contra enfermedad de Alzheimer Se prefiere particularmente si el ohgómero Aß(X-38 43) globular no difundióle o su derivado de la composición no es capaz de penetrar al SNC del paciente en cantidades notables Se prefiere también en particular si la composición farmacéutica que comprende el oligómero Aß(X-38 43) globular no d if u nd i ble o su derivado es capaz de inducir una respuesta inmune fuerte contra globulómeros Aß, de preferencia una respuesta fuerte inmune dirigida contra globulómeros Aß únicamente, más preferiblemente una respuesta inmune basada en anticuerpos no inflamatorios fuertes contra globulómeros Aß únicamente De este modo, en una modalidad más preferida de la invención, la composición farmacéutica comprende un adyuvante inmunológico, de preferencia un adyuvanete y una molécula de señalización, por ejemplo, una atocina, que dirige la respuesta inmune hacia el tipo basado en anticuerpos, no inflamatorios Tales adyuvantes y moléculas de señalización se conocen bien por aquellos expertos en la técnica Se prefiere particularmente si la composición farmacéutica para inmunización activa se administra a través de una ruta seleccionada del grupo que consiste de la ruta intravenosa, la ruta intramuscular y la ruta subcutánea Se prefiere también en particular si la composición se administra por un método seleccionado a partir de inyección infusión por bolo e infusión continua, cada una de las cuales puede realizarse una vez, de forma repetida o en intervalos regulares En una modalidad particular de la invención, se logra la infusión continua a largo plazo al emplear un dispositivo implantable En una modalidad particular adicional de la invención, la composición se aplica como una formulación de depósito de liberación controlada o liberación sostenida implantable Formulaciones y dispositivos adecuados se conocen por aquellos expertos en la técnica Los detalles del método que se utiliza para cualquier ruta dada dependerán de la etapa y severidad de la enfermedad y los parámetros médicos totales del sujeto y se deciden de preferencia de forma individual en el criterio del médico o veterinario tratante En una modalidad especialmente preferida de la invención, la composición farmacéutica para inmunización activa comprende una o más sustancias seleccionadas del grupo que consiste de conservadores farmacéuticamente aceptables, colorantes farmacéuticamente aceptables, coloides protectores farmacéuticamente aceptables, reguladores de pH farmacéuticamente aceptables y reguladores de presión osmótica farmacéuticamente aceptables Tales sustancias se describen en la técnica Los anticuerpos y aptámeros de la invención tienen también muchas aplicaciones potenciales, algunas de las cuales se describen en lo siguiente Éstas son especialmente útiles para propósitos de clasificación, es decir, detección y si se desea, tamótén para determinar la cantidad de oligómero Aß(X-38 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo en una preparación sospechosa o conocida que comprende tales oligómeros o derivados De este modo, los anticuerpos de la invención son capaces de detectar, tanto in vitro como in vivo, un ohgómero Aß(X-38 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo al cual se enlazan Tales anticuerpos pueden por lo tanto utilizarse para detectar tal o gómero o derivado, por ejemplo, en una preparación, por ejemplo, una muestra que se deriva de un sujeto sospechoso o que tiene una amiloidosis, o en un sujeto que tiene una amiloidosis, por ejemplo un individuo humano u otro mamífero Por consiguiente, la invención se relaciona tamóién a un método para detectar un oligómero Aß(X-38 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo en una preparación, cuyo método comprende permitir a un anticuerpo de la invención actuar en un oligómero o derivado de manea que se enlaza al oligómero o derivado del mismo (y por consiguiente forma de preferencia un complejo que comprende el anticuerpo y el oligómero o derivado) Tal ohgómero puede por ejemplo, detectarse in vitro Por ejemplo, el anticuerpo de la invención puede agregarse a una preparación, por ejemplo una muestra derivada de un sujeto o un cultivo celular el cual contiene o se sospecha que contiene el oligómero o derivado, con el fin de detectar tal oligómero o derivado en la preparación Alternativamente, el oligómero o derivado puede detectarse en un individuo in vivo La invención se refiere tamóién al uso de un anticuerpo que tiene especificidad para un oligómero Aß(X-38 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo como se define anteriormente para preparar una composición farmacéutica para tratar o evitar una amiloidosis En una modalidad preferida de la invención, la composición farmacéutica es para inmunización pasiva Por consiguiente, la invención se relaciona tamóién a un método para tratar o evitar una amiloidosis en un sujeto con necesidad del mismo, el cual comprende administrar un anticuerpo que tiene especificidad para un oligómero Aß(X-38 43) gloóular no difundible o un derivado del mismo como se define en la reivindicación al sujeto En una modalidad preferida de la invención, administrar el anticuerpo es para inmunización pasiva El término "amiloidosis" aquí denota un número de trastornos caracterizados por plegado, aglomeración, agregación y/o acumulación anormal de proteínas particulares (amiloides, proteínas fibrosas y sus precursores) en varios tejidos del cuerpo En enfermedad de Alzheimer y síndrome de Down, se afecta el tejido nervioso, y en angiopatía amiloidea cerebral (CAÁ) se afectan los vasos sanguíneos De acuerdo con una modalidad particular de la presente invención, se selecciona una amiloidosts a partir del grupo que consiste de enfermedad de Alzheimer (AD) y la amiloidosis de síndrome de Down Un resultado de utilizar los anticuerpos de la presente invención fue que se diagnostica enfermedad de Alzheimer o se tiene un riesgo incrementado de adquirir enfermedad de Alzheimer no puede fácilmente estar dentro de los límites de detección con base en la determinación del ohgómero Aß(1-42) y/o Aß (1-40) globular soluble no difundible ("globulómeros") en un sujeto Sin embargo, sorprendente e inesperadamente, se encontró que el diagnóstico puede relacionarse a la determinación de la presencia de auto-anticuerpos los cuales se enlazan específicamente a los oligómeros Aß(1-42) globulares solubles no difundibles ("globulómeros") de la invención Sorprendentemente, pero de acuerdo con la hipótesis del gloóulómero se encontró que el epítope de gloóulómero es un antígeno endógeno el cual da lugar a una respuesta inmune endógena. Esta respuesta inmune endógena se caracteriza por al menos tres características independientes: 1. El nivel de auto-anticuerpos anti-Aß se incrementa con la enfermedad de Alzheimer. En particular, es sorprendente que estos auto-anticuerpos se eleven en suero de pacientes con AD. Hasta ahora, varios investigadores han reportado auto-anticuerpos en suero de pacientes con AD. De acuerdo con tres artículos (S. Brettschneíder et al., "Decreased Serum Amyloid 1-42 Autoantióody Levéis ¡n Alzheimer's Disease, Determined óy a Newly Developer Immuno-Precipítatíon Assay with Radiolabeled Amyloid 1-42 Peptíde, Bíol Psychiatry 2005, 57, 813-815, M.E. Weksler, et al., "Patients with Alzheimer disease have lower levéis of serum antiamyloid peptide antibodies than healthy eiderly individuáis" Exp. Gerontology 37, (2002), 943-948 y Y. Du et al., "Reduced levéis of amyloid ß-peptide antibody in Alzheimer disease", Neurology 57, 801-805 (2001)) niveles de anticuerpos anti Aß en general se reportaron para disminuir ligeramente, pero no notablemente en pacientes con enfermedad de Alzheimer. 2. Auto-anticuerpos de gloóulómero anti-Aß se enlazan predominantemente en complejos antígeno. Los auto-anticuerpos aquí se detectan tamóíén sorprendentemente a una cantidad sustancial como parte de complejos de antígeno-anticuerpo como se indica por el pre-tratamiento de sueros con reguladores de pH acídicos como se descpóe en el Ejemplo 7 Ésta es evidencia sólida de que el sistema inmune esta tratando activamente de eliminar el epítope de gloóulómero mal plegado al formar complejos de anticuerpos endógenos 3 Los niveles de auto-anticuerpos de gloóulómero anti-Aß son notaólemente más elevados que los niveles de auto-anticuerpos de monómero anti-Aß Como se descpóe aquí en el ejemplo 7 y en la Figura 24, éstos son aproximadamente 5-10 veces más elevados en comparación a los péptidos Aß del monómero Además de la fracción elevada de complejos de antígeno-anticuerpo éste es otro parámetro que indica que los globulómeros están siendo activamente eliminados por el sistema inmune endógeno La invención se relación así también al uso del oligómero Aß(X-38 43) no difundióle o un derivado del mismo como se define anteriormente para preparar una composición para detectar auto-anticuerpos que tienen especificidad para el oligómero o derivado en un sujeto En una modalidad preferida de la invención, se sospecha que el sujeto tiene cualquier forma de amiloidosis, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, y la detección de auto-anticuerpos es para diagnosticar la presencia o ausencia de cualquier forma de Amiloidosis, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer en el sujeto En una modalidad preferida de la invención, se detectan los anticuerpos utilizando un derivado etiquetado del oligómero gloóular no difundióle o derivado reticulado como se descpóe anteriormente La invención se refiere tamóién al uso de un oligómero Aß(X-38 43) no difundióle o un derivado del mismo como se define anteriormente para detectar auto-anticuerpos que tienen especificidad para el oligómero o derivado en una muestra En una modalidad preferida de la invención, la muestra se deriva de un sujeto que se sospecha tiene una amiloidosis, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, y la detección de auto-anticuerpos es para diagnosticar la presencia o ausencia de la amiloidosis, por ejemplo enfermedad de Alzheimer en el sujeto En una modalidad preferida de la invención, los anticuerpos se detectan utilizando un derivado etiquetado del oligómero globular no difundible o derivado reticulado como se describe anteriormente La invención se refiere también a un método para detectar auto-anticuerpos que tienen especificidad para un oligómero Aß(X-38 43) no difundible o un derivado del mismo en un sujeto, cuyo método comprende administrar al sujeto un oligómero Aß(X-38 43) no difundible o un derivado del mismo como se define anteriormente y detectar un complejo formado por el anticuerpo y el oligómero o derivado, la presencia del complejo que indica la presencia de los auto-anticuerpos En una modalidad preferida de la invención, el método comprende el uso de un derivado etiquetado del oligómero globular no d if u nd i ble o su derivado reticulado como se describe anteriormente En una modalidad preferida de la invención, se sospecha que el sujeto tiene cualquier amiloidosis y la detección de auto-anticuerpos es para diagnosticar la presencia o ausencia de la amiloidosis en el sujeto En una modalidad preferida de la invención, se detectan anticuerpos utilizando un derivado etiquetado del oligómero gloóular no difundióle o derivado reticulado como se describe anteriormente La invención se refiere también a un método para detectar auto-anticuerpos que tienen especificidad para un oligómero Aß(X-38 43) no difundible o un derivado del mismo en una muestra, cuyo método comprende poner en contacto la muestra con un oligómero Aß(X-38 43) no dif u nd i ble o un derivado del mismo como se define anteriormente y detectar un complejo formado por el anticuerpo y el oligómero o derivado, la presencia del complejo que indica la presencia de los auto-anticuerpos En una modalidad preferida de la invención, el método comprende el uso de un derivado etiquetado del oligómero globular no difundible o su derivado reticulado como se describe anteriormente En una modalidad preferida de la invención, la muestra se deriva de un sujeto que se sospecha tiene una amiloidosis y la detección de auto-anticuerpos es para diagnosticar la presencia o ausencia de amiloidosis en el sujeto En una modalidad preferida de la invención, los anticuerpos se detectan utilizando un derivado etiquetado del ohgómero globular no difundible o derivado reticulado como se describe anteriormente Se prefiere en particular si el sujeto sospechoso de tener una amiloidosis es un sujeto que tiene la amiloidosis o que tiene un riesgo incrementado de adquirir la amiloidosis En una modalidad de la presente invención, las muestras son fluidos biológicos los cuales pueden probarse por el método antes mencionado Éstas incluyen plasma, sangre completa, sangre completa seca, suero, fluido cerebroespinal o extractos acuosos u órgano-acuosos de tejidos y células De acuerdo con una modalidad particular de la invención, detectar auto-anticuerpos como se describe anteriormente comprende además un pre-tratamiento de la preparación (muestra) la cual provoca disociación de complejos de auto-anticuerpo/antígeno Un método que comprende tal pre-tratamiento puede por lo tanto utilizarse con el fin de determinar la cantidad total de auto-anticuerpos presentes en la preparación (muestra) mientras un método que no comprende tal pre-tratamiento puede utilizarse con el fin de determinar la cantidad de auto-anticuerpos los cuales pueden unirse aún al antígeno Además, ambos métodos permitirán determinar indirectamente la cantidad de auto-anticuerpos formados en complejo Condiciones adecuadas para inducir disociación de complejos de auto-anticuerpo/antígeno se conocen por la persona experta Por ejemplo, tratar la preparación (muestra) con ácido, por ejemplo, utilizando un regulador de pH de manera que el pH de la preparación resultante (muestra) está en el intervalo de 1 a 5, de preferencia en el intervalo de 2 a 4 y en particular en el intervalo de 2 a 3, puede ser conveniente Los reguladores de pH adecuados incluyen sales en una concentración fisiológica, por ejemplo, NaCI y ácido acético El método para separación de complejos de anticuerpo/antígeno se ha descrito en WO2005/037209, la cual se incorpora en la presente en su totalidad Brevemente, disociar el anticuerpo a partir del antígeno en el complejo de anticuerpo/antígeno comprende las etapas de poner en contacto la muestra que contiene un complejo de anticuerpo/antígeno con un reguladro de pH de disociación, incubar la muestra, y concentrar opcionalmente la muestra El regulador de pH de disociación puede ser un regulador de pH de PBS el cual tiene un pH en el intervalo como se indica anteriormente Por ejemplo, un regulador de pH de PBS que contiene aproximadamente 1 5% de BSA y pH 2 5 de 0 2 M de glicina-acetato, o 140 mM de NaCI y 0 58% de ácido acético es adecuado La incubación por varios minutos, por ejemplo, tal como 10 a 30, por ejemplo, 20 minutos a una temperatura en el intervalo de 20 a 40°C ha demostrado ser adecuada La concentración puede lograrse en una manera conocida per se, por ejemplo, al pasar la muestra sobre un Centpprep YM30 (Amincon Ine ) En una modalidad de la presente invención, el globulómero Aß(X-38 43) o derivado del mismo se recubre en una fase sólida La muestra (por ejemplo, sangre completa, fluido cerebroespinal, suero, etc ) se pone en contacto entonces con la fase sólida Si los auto-anticuerpos se presentan en la muestra, tales anticuerpos se enlazan al globulómero Aß(X-38 43) o derivado del mismo en la fase sólida y se detectan entonces por cualquier método directo o indirecto El método directo comprende detectar simplemente la presencia del complejo mismo y de este modo la presencia de los auto-anticuerpos En el método indirecto, se agrega un conjugado al auto-anticuerpo enlazado El conjugado comprende un segundo anticuerpo, el cual se enlaza a los primeros auto-anticuerpos enlazados, unidos a un compuesto que genera señal o etiqueta El segundo anticuerpo debe enlazarse a un primer auto-anticuerpo enlazado, el compuesto que genera señal genera una señal medible Tal señal indica entonces la presencia de los primeros auto-anticuerpos en la muestra Ejemplos de fases sólidas utilizados en inmunoensayos de diagnóstico son materiales porosos y no porosos, partículas de látex, partículas magnéticas, micropartículas (véase la patente Norteamericana No 5,705,330), perlas, membranas, pozos microtituladores y tubos de plástico La elección del material de fase sólida y el método para etiquetar el antígeno o anticuerpos presentes en el conjugado, si se desea, se determinan con base en las características de rendimiento de formato de ensayo deseadas Como se observó anteriormente, el conjugado (o reactivo indicador) comprenderá un anticuerpo (o quizás anti-anticuerpos, dependiendo del ensayo), unido a un compuesto que genera señal o "etiqueta" Este compuesto que genera señal o etiqueta es por sí mismo detectable o puede hacerse reaccionar con uno o más compuestos adicionales para generar un producto detectable. Ejemplos de compuestos que generan señal se describen anteriormente y en particular ¡ncluyen cromóforos, radioisótopos (por ejemplo, 125 131 32 I, P, ?, 35 i H y C), compuestos quimíoluminiscentes (por ejemplo, acridínio), partículas (visibles o fluorescentes), ácidos nucleicos, agentes que forman complejos, o catalizadores tales como enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina, fosfatasa acídica, peroxidasa de rábano, beta-galactosidasa y ribonucleasa). En el caso del uso de enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano), al adición de un sustrato cromo-, fluro-o lumo-génico resulta en la generación de una señal detectable. Otros sistemas de detección tales como fluorescencia de resolución temporal, fluorescencia de reflexión interna, amplificación (por ejemplo, reacción de cadena de polimerasa) y espectroscopia Raman son también útiles. Se incluyen también equipos dentro del alcance de la presente invención. Más específicamente, la presente invención incluye equipos para determinar la presencia de auto-anticuerpos en un sujeto. En particular, un equipo para determinar la presencia de auto-anticuerpos en una muestra comprende a) un globulómero Aß(X-38 .. 43) o un derivado del mismo, como se define en la presente; y b) un conjugado que comprende un anticuerpo unido a un compuesto que genera señal capaz de generar una señal detectable. El equipo puede contener también un control o calibrador el cual comprende un reactivo el cual se enlaza al antígeno. La presente invención incluye tamóién otro tipo de equipo para detectar auto-anticuerpos en una muestra de prueóa. El equipo puede comprender a) un anti-anticuerpo específico para el auto-anticuerpo de interés, y ó) un gloóulómero Aß(X-38 .. 43) o un derivado del mismo como se define anteriormente. Un control o caliórador que comprende un reactivo el cual se enlaza al gloóulómero Aß(X-38 .. 43) o un derivado del mismo pueden incluirse tamóién. Más específicamente, el equipo puede comprender a) un anti-anticuerpo específico para el auto-anticuerpo y ó) un conjugado que comprende el gloóulómero Aß(X-38 .. 43) o un derivado del mismo, el conjugado se une a un compuesto que genera señal capaz de generar una señal detectaóle. De nuevo, el equipo puede comprender tamóién un control o caliórador que comprende un reactivo el cual se enlaza al antígeno. El equipo puede tamóién comprender un recipiente al como un frasco, una botella o banda, con cada recipiente con una fase sólida pre-determinada y otros recipientes que contienen los respectivos conjugados. Estos equipos pueden también contener frascos o recipientes u otros reactivos necesarios para realizar el ensayo, tales como lavado, procesamiento y reactivos indicadores. En una modalidad preferida de la invención, tales auto-anticuerpos pueden extraerse tamóién a partir de preparaciones de ¡nmunogloóulina comerciales como Octagama® (Octapharma Inc. Viena, Austria) y purificarse además para uso terapéutico.

Sorprendente e inesperadamente, la clasificación de preparaciones diferentes de las preparaciones descritas anteriormente revelaron que tales preparaciones pueden contener sustancias que reaccionan con anticuerpos que tienen especificidad para los oligómeros Aß(X-38 43) gloóulares no difundióles o derivados de la invención Tales sustanciales, las cuales tienen una cierta afinidad de enlace a los anticuerpos, pero las cuales no pueden corresponder a los oligómeros Aß(X-38 43) gloóulares no difundióle o derivados de la invención, se refieren en la presente después como epítopes de oligómero Aß(X-38 43) gloóular ("gloóulómero") o epítopes de estructura de ohgómero Aß(X-38 43) gloóular ("gloóulómero") Deóido a su afinidad de enlace a anticuerpos que tienen especificidad para los oligómeros Aß(X-38 43) gloóulares no difundióle o derivados de la invención, las sustancias que comprenden epítopes de oligómero Aß(X-38 43) pueden detectarse en preparaciones que se sospecha contienen tales epítopes, su cantidad puede determinarse en tales preparaciones y pueden enriquecerse Por consiguiente, la presente invención tamóién se relaciona a un método de clasificación de detección, para determinar la cantidad de y/o para enriquecer epítopes de oligómero Aß(X-38 43)en preparaciones que se sospecha o se saóe comprenden tales epítopes Una vez detectadas y enriquecidas, tales sustancias pueden tener aplicaciones potenciales similares a aquellas descritas anteriormente con respecto a los oligómeros Aß(X-38 43) gloóulares no difundióles o derivados de la invención En los dióujos La Figura 1 muestra una vista esquemática de trayectorias de procesamiento Aß Existen oligómeros Aß(1-42) en dos diferentes formas el oligómero de tipo fióplar ("fióplómero") y el ohgómero de tipo gloóular ("gloóulómero") Este modelo ilustra las dos trayectorias mutuamente exclusivas conduciendo de monómeros a cualesquiera fibrillas o globulómeros La "decisión" para la trayectoria globulomépca en lugar de fibplar se hace por un cambio conformacional en el nivel monómépco, el cual se presume es auxiliado por ácidos grasos La Figura 2 muestra Inmunotrasferencias Western de monómeros y globulómeros después del almacenamiento a diferentes temperaturas con el fin de comparar estabilidad m vitro de A) globulómero Aß (1-42) (vía 1 proteínas marcadoras moleculares estándares, ruta 2 después de 1 día, PBS, TA ruta 3 después de 1 día, PBS, 37°C, ruta 4 después de 4 días, PBS, TA, ruta 5 después de 4 días, PBS, 37°C) y B) monómero Aß(1-42) (ruta 1, proteínas marcadoras moleculares estándares, ruta 2 después 1 día, PBS, -20°C, ruta 3 después de 1 día, PBS, -0°C, ruta 4 después de 1 día, PBS, TA, ruta 5 después de 1 día, PBS, 37°C), La Figura 3 concentraciones de anticuerpo presente de conejos y ratones inmunizados con el globulómero Aß(1-42), globulómero Aß(12-42) y globulómero Aß(20-42), La Figura 4 muestra los resultados de detección de epítopes de gloóulómero Aß(1-42) en cereóros con AD y TG2576 A) datos para 3 muestras de cereóros con AD y 1 muestra de Control Envejecido provisto por Bram-Net, Munich, B) niveles de gloóulómero Aß(1-42), monómero Aß(1-42) y monómero Aß(1-40) en cereóros con AD, C) inmunotinción de placas de cereóro con AD con anticuerpo específico de gloóulómero Aß(1-42) 8C5, D) niveles de gloóulómero Aß(1-42), monómero Aß(1-42) y monómero Aß(1-40) en TG2576 y cereóros de ratones de tipo silvestre control, La Figura 5 muestra los resultados de detección de epítopes de gloóulómero Aß(1-42) en el SNC A) reactividad de muestras de CSF de pacientes 2 AD y 4 MCI con antisuero 5598 (anticuerpo captura) y anticuerpo 6B1 (anticuerpo primario) de gloóulómero anti Aß(1-42) no selectivo monoclonal en ELISA de fase doóle, B) inmunotinción de gloóulómeros Aß(1-42) después de inyección icv de gloóulómero Aß(1-42) en ratas C) inmunotinción de gloóulómero Aß (1-42) después de la inyección de gloóulómero Aß (1-42) en hipocampo de rata, La Figura 6 muestra reactividad de PAó dirigido Aß(33-42) (Signet 9135) con varias preparaciones de Aß con el fin de caracterizar epítope de globulómero Aß(1-42) Tal anticuerpo reacciona solamente con monómero Aß( 1-42), disuelto en regulador de pH de amoniaco, pero no reacciona con el gloóulómero Aß y Aß(1-40) que indica epítope no accesióle o camóiado en el gloóulómero comparado a fióplla propensa a monómero Aß(1-42), disuelto en regulador de pH de amoniaco, La Figura 7 muestra reactividad de anticuerpo 5598 derivado de gloóulómero anti Aß(20-42) en ELISA de fase doóle PAó 5598 purificado con afinidad de gloóulómero anti Aß(1-42) de conejo despliega selectividad para globulómero Aß(1-42) contra otras formas de Aß, La Figura 8 muestra el efecto de pre-tratamiento de preparaciones estándares de globulómero Aß(1-42) y monómero Aß(1-40) con PAb 5598 específico de globulómero anti Aß medido en las siguientes ELISAs -gloóulómero Aß(1-42), ± reducción 5598, ELISA de gloóulómero Aß camóio >10 veces (negro a gris), -monómero Aß(1-40), ± reducción 5598, ELISA de Aß(30-40), sin efecto (verde oscuro a verde claro), -monómero Aß(1-40), ± reducción 5598, ELISA de gloóulómero Aß, camóio 10 veces (azul oscuro a azul claro), indicando que el epítope de gloóulómero Aß es tamóién detectaóle en Aß(1-40), La Figura 9 muestra el cromatograma SDS-PAGE del gloóulómero Aß(20 -42) como se genera de acuerdo al Ejemplo 5, La Figura 10 muestra el cromatograma SDS-PAGE del gloóulómero Aß(12-42) como se genera de acuerdo al Ejemplo 6, La Figura 11 resume datos con respecto a la generación de los gloóulómeros Aß(1-42) A partir del Aß(1-42) sintético un ohgómero estaóle y definido con una estructura gloóular, el globulómero de 38/48 kDa Aß(1-42) puede generarse (a) Como una primera etapa en la generación del péptido gloóulómero Aß(1-42) de kDa 38/48, el péptido Aß(1-42) sintético se disuelve en HFIP, suósecuentemente se evapora y vuelve a suspender en DMSO La incuóación en PBS con 0 2% de SDS resulta en gloóulómeros de 16/20 kDa Aß(1-42) intermedios La dilución adicional en agua y la incuóación resultan en gloóulómeros 38/48 Aß(1-42 kDa maduros los cuales pueden diahzarse o precipitarse en metanol/ácido acético para intercamóio de regulador de pH, (ó) Varias etapas de la generación de gloóulómero de 38/48 kDa Aß(1-42) se visualizan en geles SDS-PAGE de Tris-Glicina al 20% de tinción 4 de Coomasie Rutas (1) gloóulómero de 16/20 kDa Aß(1-42) intermedio, (2) gloóulómero de 16/20 kDa Aß(1-42) intermedio reticulado con glutaraldehído, (3) gloóulómero de 38/48 kDaAß(1-42), (4) gloóulómero de 38/48 kDa Aß(1-42) reticulado con glutardialdehído (5) gloóulómero de 38/48 kDa Aß(1-42) después de la desnaturalización térmica en regulador de pH de muestra SDS a 95°C durante 5 minutos, (6) gloóulómero de 38/48 kDa Aß(1-42) reticulado con glutardialdehído después de la desnaturalización térmica en regulador de pH de muestra SDS a 95°C durante 5 minutos (7) oligómeros Aß preparados de acuerdo con Lamóert, M P et al Difundióle, non-f ibpllary ligands depved from Aóeta-1-42 are potent central nervous system neurotoxins Proc Nati Acad Sci U S A 95, 6448-6453 (1998) Formas Aß se marcan con m = rnonómero, ? = gloóulómero de 16/20 kDa Aß(1-42) intermedio, g = gloóulómero de 38/48 Kda Aß(1 -42) y f=Aß(1-42), f lóplarmente, (c) Estaóilidad temporal del gloóulómero de 38/48 kDa Aß(1-42) comparado al monómero Aß(1-42) por ¡ncuóación en PBS a diferentes temperaturas. Rutas 1 4: gloóulómero de 38/48 kDa Aß(1-42) después de la incuóación durante 1 día a TA y 37°C (1, 2) y 4 días a TA y 37°C (3, 4). Rutas 5 8: preparación de Aß(1 -42)NH4OH después de 1 día a -20°C, 0°C, TA y 37°C; (d) Cromatografía por exclusión de tamaño en columna Superóse 12: gloóulómero Aß(1-42) (panel superior), gloóulómero Aß( 1-42) reticulado con glutardialdehído (panel medio) y preparación de Aß(1 -42)NH4OH con 5 minutos de incuóación a TA después de disolver (panel inferior); (e) Proteólisis limitada del gloóulómero Aß(1-42) y fragmentos truncados resultantes (marcados con t-g) separados por SDS-PAGE y visualizados por tinción de Coomassie. Los fragmentos C-terminales resultantes (analizados por SELDI MS) se indican en corchetes. Rutas: (1) sin gloóulómero Aß(1-42) sin digerir (AA1 42, 4514 Da) (2) Papaína (n.d.), (3) Elastasa (n.d.), (4) Termolisina (AA442, 4200 Da; AA20 42, 2218 Da; AA24, 42, 1756 Da), (5) Quimiotripsína (AA21 42, 2067 Da), (6) Tripsina (AA6 42, 3897 Da; AA17 42, 2578 Da) (7) filtrado de péptido Aß^g soluóle separado después de digestión con Termolisina; (f) gloóulómero Aß(1-42) (panel superior) y gloóulómero Aß(1-42) reticulado con glutardialdehído (panel inferior) se llevaron a proteólisís por termolisina y fragmentos de péptído resultantes analizados por SELDI-MS; La Figura 12: muestra reactividad de anticuerpos específicos de gloóulómero gloóulómero Aß(1-42) que tienen una afinidad y especificidad elevada en técnicas de transferencia en mancha y ELISA: (a) Comparación de anticuerpos Aß con respecto al enlace y afinidad del epítope Aß. Anticuerpo 5598 de conejo policlonal específico de gloóulómero Aß(1-42) y el anticuerpo 8F5 monoclonal de ratón reconoce epítope de inter-suóunidad Aß mientras anticuerpos 6G1 y 6E10 monoclonales de ratón Aß reconocen epítope de ¡ntra-suóunidad Aß. La afinidad de 8F6 y 6G1 se determinó por análisis Scatchard a partir de ELISA; (ó) Especificidad de anticuerpos de gloóulómero anti Aß(1-42) contra diversas formas de Aß se determinó por inmunoensayo de transferencia en mancha. Los anticuerpos 5598 y 8F5 específicos de gloóulómero Aß(1-42) (panel inferior) reconocen predominantemente formas de gloóulómero Aß(1-42) y no la preparación estándar de Aß!. 0 o Aß(1-42) incluyendo Aß(1-42) agregado, en contraste a anticuerpos 6G1 y GE10 no específicos (panel superior); (c) Cuantificación de discriminación de formas Aß en preparaciones estándares por tres diferentes ELISAS de fase doóle; cuantificación del gloóulómero Aß(1-42) con 5598 como anticuerpo de captura y 6G1 como anticuerpo de detección, y de niveles Aß(1-40) o Aß(1-42) con 6E10 como anticuerpo de captura y 9132 (AA30-40 de reconocimiento) y 9135 (AA33-42 de reconocimiento) como anticuerpo de detección, respectivamente; (d) Estándares de formas Aß específicas se contaminan con otras formas Aß. Los valores se calcularon como relación entre el gloóulómero y formas sin gloóulómero en % medido pro ELISAs apropiadas. Previamente descritos oligómeros Aß generados ¡n vitro (* de acuerdo con Lamóert, M.P. et al. Difundióle, nonfiórillar ligands derived from Aóeta 1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Nati. Acad. Sci U.S A 95, 6448-6453 (1998)) y oligómeros Aß óasados en cultivos celulares en medio condicionado (** de acuerdo con Walsh, D.M. et al. Naturally secreted oligomers of amyloid óeta protein potently in ibit hippocampal long-term potentíation in vivo. Nature 416, 535-539 (2002)) se incluyeron en este experimento; La Figura 13: muestra que los globulómeros Aß(1-42) se presentan en los cerebros de pacientes con Alzheimer y ratones transgénicos con APP. (a-f) Tinción de placas amiloídeas con tioflavina S (a, d), anticuerpo 8F5 específico de globulómero Aß(1-42) (b, e), o ambos (c, f) en sección cortical de un paciente con enfermedad de Alzheimer (a-c) y una sección transversal de la corteza de un ratón Tg2576 de 12 meses de edad (d-f). La barra de escala (para a-f): 20 µm. (g-h) Concentración de globulómeros Aß(1-42) o especies Aß monoméricas en la fracción soluble de la corteza de pacientes con enfermedad de Alzheímer (n = 3) (g) o ratones Tg2576 de 12 meses de edad (n = 8) (h). Los cerebros de una persona control que corresponde con la edad (g) o ratones control C57GB16 (n = 4) (h) no tuvieron concentraciones de especie Aß sobre el límite de detección (<d i ) indicado por las líneas horizontales, (i) Concentración de globulómeros Aß(1-42) o especies Aß monoméricas en el fluido cerebroespinal o pacientes con deterioro cognoscitivo ligero (barras grises, n = 4) o pacientes con enfermedad de Alzheimer (óarras negras, n = 2) Ninguno de los gloóulómeros Aß soóre el límite de detección de 10 pg/ml (línea horizontal) se encontró en ningún grupo, La Figura 14 muestra que la generación de gloóulómeros Aß(1-42) puede inducirse por ciertos ácidos grasos Después del procedimiento general del gloóulómero Aß(1-42) la generación de SDS en la etapa de polimerización se intercamóió por varios ácidos grasos en pH neutro Rutas (1) control sin agente de inducción, (2) control positivo con 0 2% de SDS, (3) 0 5% de ácido láupco (12 0), (4) 0 55 de ácido oleico (18 1), (5) ácido hnoleico (18 3), (6) ácido eicosapentanoico (20 5), (7) ácido docosatetranoico (22 4), (8) ácido docosahexanoico (22 6), (9) control positivo con 0 2% de SDS, (10) 1% de ácido araquidónico Rendimientos del gloóulómero Aß(1-42) (g indicado con puntas de flechas) difieren entre varios ácidos grasos La Figura 15 muestra que los gloóulómeros Aß(1-42) se enlazan específicamente a neuronas del hipocampo dependiendo de la edad del cultivo Las neuronas hipocámpicas cultivadas se incuóaron con 200 nM de formas Aß (óasadas en la concentración monomér?ca = 17 nM de gloóulómero Aß(1-42) y se visualizaron por inmunofluorescencia utilizando anticuerpo anti Aß 6E10 (se utilizó Aß no específico 6E10 para permitir comparación cuantitativa del enlace del monómero Aß(1-42) y el gloóulómero Aß( 1-42), (a) Los gloóulómeros Aß(1-42) mostraron un enlace puntualizado en la superficie de las neuronas hipocámpicas en contraste al control sin Aß y el monómero Aß(1-42) después de la incuóación durante 15 minutos (37°C, 5% de C02), (ó) Enlace de gloóulómero Aß(1-42) a cultivos hipocámpicos se proóaron en diferentes días in vitro (DIV) Casi ningún enlace (-1%) del gloóulómero Aß(1-42) se encontró en DIV8, mientras en DIV11 y DIV15 casi todos (-90%) de las neuronas hipocámpicas enlazaron al gloóulómero Aß 1 42 La inserción en DIV15 de muestra, muestra el enlace puntualizado junto y en alguna distancia de la dendrita (puntas de flecha), (c) Se tiñeron dos veces los cultivos hipocámpicos con anti- MAP2 como marcador neuronal y anti-GFAP como marcador para células gliales Las células positivas GFAP no mostraron enlace de gloóulómero Aß(1-2) en contraste a células positivas MAP2 Los parámetros de microscopio para la señal Aß se mantuvieron constantes entre experimentos individuales La óarra de escala 40 µm (?nserc?ón = 10 µm), La Figura 16 (I) muestra que los gloóulómeros Aß(1-42) tienen una penetración de tejido limitada deóido al enlace elevado (a) Tinción de gloóulómeros Aß(1-42) con anticuerpo 8F5 específico (Cy 3, rojo) después de infusión i c v en el cereóro de rata. Se contra-tiñen los núcleos celulares con DAPI (azul) Barra de escala: 100 µm; (ó-c) Tinción de gloóulómeros Aß(1-42) (rojo) 1 día (ó) o 7 días (c) después de infusión intracortical en corteza de ratas. Se contra-tiñen los núcleos celulares con DAPI (azul). Barra de escala (para ó-c); 200 µm; La Figura 16(11): muestra que los gloóulómeros Aß(1-42) tienen una penetración de tejido limitada deóido al enlace elevado: (a) Tinción de gloóulómeros Aß(1-42) con anticuerpo 8F5 específico (Cy 3) después de infusión i.c.v. en el cereóro de la rata. Se contra-tiñen los núcleos celulares con DAPI. Barra de escala: 100 µm; (ó) Tinción de gloóulómeros Aß(1-42) 7 días después de la infusión intracortical en corteza de ratas. Se contra-tiñen los núcleos celulares con DAPI. Barra de escala: 200 µm. (c) Cµrso de tiempo del volumen etiquetado (media ± S.E.M.) después de la inyección de cantidades comparaóles de gloóulómero Aß(1-42) (círculos llenos) en la derecha y del monómero Aß( 1-42) (círculos aóiertos) en la corteza izquierda de las mismas ratas. El anticuerpo 8F5 específico se utilizó para detectar el gloóulómero Aß(1-42), y el anticuerpo 6G1 se utilizó para detectar el monómero Aß(1-429 en 1 (n = 2), 4 (n = 3), y 7 días (n = 2) después de la inyección; La Figura 17: muestra que el gloóulómero Aß(1-42) óloquea completamente la potenciación in vitro a largo plazo; (a) Inducción de LTP reóanadas de cereóro de rata control (cuadrados; n = 9) y tratadas con gloóulómero 52 NM Aß(1-42) (diamantes; n = 6). Se expresó la inclinación de campo EPSP como cambio de porcentaje con relación al valor de línea de base (medía ± S.E.M.); (b) Trazas representativas de rebanadas control (hilera superior) y tratadas con globulómero control Aß(1-42) (hilera inferior) tomadas antes (1), directamente (2) y 90 minutos (3) después de la tetanización; (c) La relación de entrada/salida es similar en el grupo control (cuadros; n = 11 ) y globulómero Aß(1-42) (diamantes; n = 5). La barra horizontal: 2 ms; barra vertical: 1 mV; La Figura 18 muestra un modelo propuesto de un mecanismo de doble trayectoria para multimerización de Aß-péptido. La etapa inicial es la generación de monómero Aß por desdoblamiento de ?-secretasa de APP. Presumiblemente dependiendo de factores intrínsecos o ambientales dos trayectorias independientes de multimerízación de péptído A Aß(1-42) puede ocurrir. La trayectoria de fibrillas descrita adecuadamente (Lomakin, A., Cheng, D.S. Benedek, G.B., Kirschner D.A. und Teplow, D.B., On the nucleatíon and growth of amyloid beta-proteín fibrils: detection of nuclei and quantisatíon of rate constants, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., A93, 1125-1129 (1996)) sigue las cinéticas de polimerización clásicas. Los monómeros Aß(1-42) se polimeriza a través de estructuras de nucleación metastable (fibrílómeros) y asociación adicional de monómeros a protofibrilas y Aß-fibrillas estables de estructura secundaria de hoja ß La trayectoria de globulómero Aß(1-42) se caracteriza por multimepzación a estructuras con distintos números de Aß-peptido Como una primera etapa se forma un globulómero Aß(1-42) intermedio, el cual se auto-asocia además en una estructura de globulómero Aß(1-42) estable con un distinto número de Aß-péptidos (n = 12) El globulómero Aß(1-42) no tiene tendencia para polimerización adicional a fibrillas En el globulómero Aß(1-42) el término C hidrofóbico se extiende al interior de una estructura gloóular evitando así la exposición a la fase acuosa Los términos N más htdrofílicos se exponen a la superficie externa El gloóulómero Aß(1-42)2 se estaóihza por la estructura secundaria de hoja ß La solubilidad elevada y las características definidas y estables del gloóulómero Aß(1-42) pueden atpóuirse a esta estructura gloóular específica, La Figura 19 muestra espectros de dicroismo circular de gloóulómero Aß(1-42) Los espectros se recolectaron para el gloóulómero Aß(1-42) en 7 2 mg/ml con el gloóulómero recientemente intercamóiado con regulador de pH en PBS como se asocia (véase métodos Suplementarios) El voltaje fotomultiphcador (HTS) como una función de longitud de onda se muestra en la inserción Un mínimo fuerte se oóserva en 215 nm, indicativo del contenido de hoja ß elevado Ningún mínimo a 208 nm o 222 nm son aparentes, sugiriendo poco, si lo hay del contenido helicoidal La Figura 20 muestra transferencias de punto de la reactividad de 100 pmoles (hilera A), 10 pmoles (hilera B), y 1 pmoles (hilera C), de gloóulómero Aß(1-42) (columna 1), de monómero Aß(1-42) en 0 15 de Pluronic F58 (columna 2), gloóulómero Aß(20-42) (columna 3), de gloóulómero Aß(1-42) reticulado con glutaraldehído (columna 4), de ADDL preparado de acuerdo con M P Lamóert et al , J Neurochem 79, 595-605 (2001) a 4°C a temperatura amóiente o 37°C (columna 5), gloóulómero Aß(12-42) (columna 6), del monomero Aß(1-40) (columna 7), de Aß(1-42) disuelto en 0 1% de NH4OH (columna 8), de una preparación de fi rilla Aß(1-42) (columna 9), y de APP diluido con PBS de Sigma (columna 10) con A) plasma humana, y B) CSF, La Figura 21, se refiere a una tarea de reconocimiento de objeto novedoso en ratones APP/Lo inmunizados activamente La preferencia para investigar un nuevo objeto sobre un objeto ya conocido se muestra para grupos de ratones inmunizados ya sea con el monómero Aß(1-42) (n = 7), con el globulómero Aß(20-42) (n = 9) o con el globulómero Aß(1-42) (n = 8) o inyectado con vehículo (n = 8) Los datos son media ± S E M Después de la inmunización inicial, los ratones se sobrealimentaron cada tres semanas durantes tres meses La inmunización con globulómeros condujo a un índice de reconocimiento notablemente incrementado, es decir, preferencia para el nuevo objeto durante el ensayo de prueba (P <0 01 en ANOVA seguido por prueba t después del hecho), La Figura 22 muestra un diagrama en barras con índice de reconocimiento en ratones que se trataron con solución salina (control), anticuerpo 8F5 y anticuerpo 6G1 (media ± SEM de datos mostrados para 8 animales por grupo de la cantidad relativa de tiempo gastado con un objeto novedoso comparado a un objeto se introdujeron 3 horas antes; se permitió la exploración durante 10 minutos en cada prueba); La Figura 23: muestra datos de espectrometría de masa SELDI a partir de un extracto de cerebro de AD el cual se inmunoprecipitó por el anticuerpo 8F5. Puede observarse que este anticuerpo no sólo reconoce Aß(1 -42)(m/z = 4514) sino también especies Aß(1-40) (m/z = 4329.9) así como especies Aß(1-38) (m/z = 4131.6); La Figura 24: muestra niveles de auto-anticuerpo derivados de suero/plasma humano dirigido contra una variedad de antígenos beta amiloides: (a) todos los valores de densidad reflectiva se tomaron de la concentración de antígeno 100 pMoles; -valores de fracción libre se tomaron del suero/plasma no tratado -valores de fracción total se tomaron del suero/plasma tratado con ácido -valores de fracción enlazados = valores totales = valores libres; (b) los niveles de auto-anticuerpos de globulómero anti Aß son más elevados que los niveles de auto-anticuerpos de monómero Aß y son más elevados en pacientes con AD comparados a controles saludaóles.

Descripción Detallada de la Invención: Las aóreviaturas como se utilizan en toda la especificación presente, reivindicaciones y figuras AD, enfermedad de Alzheimer, Aß, péptido ß amiloide, APP, proteína precursora amiloidea, BSA, alóúmina de suero de óovino, CD, espectroscopia de dicroismo circular, DIV, días m vitro, DMSO, sulfóxido de dimetilo, GABA, ácido ?-aminoóutípco, HFIP, 1 , 1 , 1 ,3,3,3-hexafluoro-2-propanol, LTP, potenciación a largo plazo, NaH2PO4, Fosfato de sodio, PBS, solución salina regulada en supH con fosfato, SDS, dodecisulfato de sodio, SELDI-MS, espectrometría de masa de ionización de desorción de láser mejorada por superficie, TBS, solución salina regulada en su pH con Tris Se han discutido recientemente oligómeros amiloide ß(1 -42) (Aß(1-42)) como especies tóxicas intermedias y agentes causativos putativos y factores de riesgo en patología de enfermedad de Alzheimer (AD) y condiciones relacionadas como síndrome de Down, y su implicación con ácidos grasos, discutidos posteriormente, sugieren que pueden jugar tamóién un papel en los efectos que provocan demencia de ciertos trastornos metaóóhcos En particular, la invención se relaciona a una especie de oligómero Aß(1-42) altamente estaóle la cual puede prepararse fácilmente in vitro y se presenta en los cereóros de pacientes con AD y ratones transgénicos que soóreproducen Aß(1-42) La caracterización físico-química revela un oligómero gloóular altamente soluóle en agua, puro de tamaño de 60 kDa el cual se llamó "gloóulómero Aß(1-42)" Los datos provistos en la presente indican que el gloóulómero Aß(1-42) es una entidad estructural persistente formada independientemente de la trayectoria de agregación fiórilarmente. Éste es un antígeno potente en ratones y conejos que producen generación de anticuerpos específicos de epítope de gloóulómero Aß(1-42) los cuales no reaccionan en forma transversal notaólemente con la proteína precursora amiloidea, monómeros Aß(1-40) y Aß(1-42) y fibrillas Aß. El globulómero Aß(1-42) se enlaza específicamente a procesos dendríticos de neuronas, pero no a glia en cultivos celulares hipocámpicos y bloquea completamente potenciación a largo plazo en rebanadas hipocá picas de ratas. Los datos provistos en la presente sugieren además que el epítope de globulómero Aß(1-42) representa un principio estructural patogénico presente probaólemente para presentarse al menos en aóundancia óaja en preparaciones de oligómero previamente descritas, y que su formación es un episodio patológico en AD. La neutralización selectiva del epítope de estructura de gloóulómero Aß(1-42) se espera que tenga un potencial elevado para el tratamiento de AD. La capacidad de péptidos Aß para óloquear LTP se ha descrito en la Técnica. Un bloqueo similar de LTP se encontró con el globulómero Aß(1-42) en concentraciones tan bajas como aproximadamente 50 nM. Sin embargo, en contraste a oligómeros solubles previamente descritos, la preparación de acuerdo con la ¡nvención no contuvo una mezcla de oligómeros Aß(1-42) moleculares bajos, sino consistió de una especie homogénea y estable únicamente. Por lo tanto, el hecho de que la concentración efectiva requerida para los globulómeros es más baja por un orden de magnitud que aquel reportado para preparaciones previamente descritas puede indicar que sólo una parte menor de tales preparaciones ejerce actualmente cualquier efecto perjudicial Las preparaciones de oligómero Aß previamente descritas se caracterizaron principalmente por la función, es decir, sus efectos neurotóxicos en una concentración dada Además de estos efectos neurotóxicos, la estabilidad elevada intrínseca y la naturaleza química definida y la disposición estépca del globulómero Aß(1-429 de la presente invención permitió una caracterización hacia la homogeneidad, peso molecular, y carácter globular y topología estructural La generación in vitro de globulomeros Aß(1-42) inicio con un despliegue de Aß(1-42) como puede inducirse por agentes los cuales desintegran los enlaces de hidrógeno y el repliegue subsecuente en una nueva conformación Aunque esta transición conformacional casi se completó, como se analiza por SDS-PAGE, los globulómeros Aß(1-42) mostraron una banda de doóle característica con un peso molecular aparente de 38/48 kDa Sin emóargo, la reticulación con glutaraldehído comómó estas dos óandas en una, indicando que los gloóulómeros Aß(1-42) no existen solamente en una conformación La homogeneidad demostrada tamóién por cromatografía de exclusión de tamaño en la cual los gloóulómeros Aß(1-42) producen uno, aunque pico amplio, el cual se vuelve más definido, es decir, más estrecho, después de la reticulación De este modo, la cromatografía de exclusión de tamaño del gloóulómero Aß(1-42) reticulado óajo condiciones nativas reveló un peso molecular de -60 kDa con varianza mínima, la cual se confirmó tamóién por ultracentrifugación analítica. Cálculos sugieren que el gloóulómero Aß(1-42) consiste de aproximadamente 12 a 14, de preferencia 12 suóunidades de Aß, y datos experimentales adicionales sugieren que pueden formarse a través de un intermediario tetramérico ¡nestaóle.

Varios experimentos dirigieron el carácter gloóular y topología estructural del gloóulómero Aß(1-42). Para el gloóulómero Aß(1-42) maduro una estructura gloóular fundida la cual se condensa además hasta la reticulación a una estructura casi perfectamente gloóular se determinó. En primer lugar, la cromatografía de exclusión de tamaño del gloóulómero de Aß(1-42) con un perfil de elusión amplio, especialmente de la forma reticulada, sugiere un carácter gloóular. Además, el volumen hidrodinámico puede calcularse a partir de estos datos y relacionarse al número total de aminoácidos que resultan en una medida para el grado de pliegue (Tcherkasskaya, O. & Uversky, V.N. Denatured collapsed states in protein holding: example of apomyogloóin. Proteíns 44, 244-254 (2001); Uversky, V.N. Natívely unfolded proteins: a point where óiology waits for physics. Protein Sci 11, 739-756 (2002)). En segundo lugar, la digestión del gloóulómero Aß(1-42) con una variedad de proteasas no específicas desdoóló aproximadamente 20 aminoácidos a partir del sitio N-terminal, mientras se retiene la estructura oligomépca de un núcleo C-terminal resistente a proteasa Este resultado tamóién indicó una topología estructural uniforme con cada una de las 12 suóunidades de Aß sencillas que forman el gloóulómero Aß(1-42) que apunta en la misma dirección En tercer lugar, la espectrometría de masa confirmó el carácter gloóular uniforme y la topología estructural, deóido a que la reticulación ocurrió solamente entre grupos amino de los términos N y Lys-16, mientras se reserva Lys-28 En cuarto lugar, y finalmente, anticuerpos selectivos para Aß(33-42) y Aß(33-40) los cuales se utilizan en ELISA convencional para determinación de concentración de Aß(1-42) y Aß( 1-40) no reaccionan con gloóulómeros Aß(1-42), demostrando una vez más que el término C no es accesióle La espectrometría de CD sugiere que una fracción sustancial del gloóulómero Aß(1-42), presumiólemente el término C, se presenta en la estructura ß (véase la Figura 11), una característica común de proteínas amiloides en su forma polimepzada patológica (Rochet, J C & Lansóury, P T Jr Amyloíd f lópllogenesis, themes and vapations Curr Opin Struct Biol 10, 60-68 (2000)) En el modelo resultante del gloóulómero Aß(1-42), el término C hidrofóóico (Aß(24-42)), forma el núcleo interior, mientras el término N hidrofíhco (Aß(1-19-23)) se exponen a la superficie externa, por lo que hace al gloóulómero Aß(1-42) altamente soluóle en agua (véase Figura 18) En resumen, el gloóulómero Aß(1-42) de la invención es una especie homogénea, definida y estaóle con efectos neuropatológicos comparaóles en LTP como se descpóe previamente para oligómeros Aß soluóles (Lamóert, M P et al Diffusióle, nonfiópllar hgands depved from Aóeta 1-42 are potent central nervous system neurotoxins Proc Nati Acad Sci U S A 95, 6448-6453 (1998), Walsh, D M et al Naturally secreted ohgomers of amyloíd óeta protein potently inhióit hippocampal long-term potentiation in vivo Nature 416, 535-539 (2002), Wang, H W et al Soluble ohgomers of óeta amyloíd 1 2 inhióit long-term potentiation óut not long-term depresión m rat dentate gyrus Brain Res 924, 133-140 (2002), Wang, Q , Walsh, D M , Rowan, M J , Seikoe, D J & Anwyl, R Block of long-term potentiation óy naturally secreted and synthetic amyloíd óeta-peptide m hippocampal shces is mediated vía activation of the kinases c-Jun N-terminal kinase, cychn-dependent kinase 5, y p38 mitogen-activated protein kinase as well as metaóotropic glutamate receptor type 5 J Neuroscí 24, 3370-3378 (2004)), caracterizado por no ser difundióle Para el entendimiento del concepto de ligandos difundióles y no difundióles es importante entender que existen dos trayectorias generalmente independientes para procesamiento de monómeros derivados de APP Aß(1-42) formados m situ a) la trayectoria de fibrilla, b) la trayectoria de globulómero De estos, la trayectoria de fi rilla se ha caracterizado apropiadamente por más de veinte años como lo es la trayectoria cuantitativamente dominante para el procesamiento Aß in vitro e m vivo Se aceptó bien que Aß(1-40) y especialmente Aß(1-42) o derivados relacionados, tales como Aß(1-38) Aß(1-39), Aß(1-41) o Aß(1-43), se polimepcen fácilmente a partir de una unidad monomérica y desarrollen continuamente mediante oligómeros (asociaciones de dos a veinticuatro monómeros) y protof i brillas (asociaciones de más de veinticuatro monómeros) finalmente en fibrillas solubles las cuales se depositan in vitro o in vivo en tejido cerebral o paredes de los vasos sanguíneos Esta formación de fibrillas es tan predominante que investigadores anteriores atribuyeron efectos que provocan demencia de Aß a ésta Es importante entender que un subconjunto de oligómeros los cuales se sugiere llamar "fibplómeros" (véase Figura 1), diferente de los globulómeros, ocurren aquí como intermediarios La invención describe aquí una nueva trayectoria para estabilización de Aß meta-estable formado in situ el cual comprende alterar su conformación estructural en el nivel del monomero a una estructura tridimensional alternativa, la cual resulta subsecuentemente en un diferente tipo de asociación la cual se llama "globulomepzación" Característicamente, debido a la estructura espacial cambiada de Aß(1-42) (Figura 1) el procesamiento conduce a una estructura de núcleo de oligómero de tipo globular terminal ("globulómeros") la cual es completamente diferente de la estructura de núcleo de oligómero de tipo fibplar no terminal ("fibplómeros") "Terminal" aquí significa que los distintos fibplómeros, globulómeros no se ensamblan además a fibrillas Ya que el globulómero Aß(1-42) es estable y no un intermediario de agregados moleculares más elevados, se propone que su formación refleja una trayectoria alternativa para la formación de agregados fibrilares. Asumiendo que los oligómeros solubles son tóxicos a neuronas o de otra manera son perjudiciales para función neuronal, puede ser que aquellos junto con la trayectoria de las fibrillas se inactívan "naturalmente" por polimerización adicional a fibrillas maduras (Caughey, B. & Lansbury, P.T. Protofíbrils, pores, fibrils, and neurodegeneration: separating the responsable protein aggregates from the innocent bystanders. Annu. Rev Neurosci 26, 267-298 (2003)), la cual puede incluso representar un intento natural para remover Aß por secuestración. En contraste, el globulómero Aß(1-42) es el punto final de una trayectoria alternativa como un multímero Aß(1-42) neurotóxico con estabilidad a largo plazo bajo condiciones fisiológicas (véase Figura 18). Para la relevancia del globulómero Aß(1-42) se requiere que existe en los cerebros de pacientes con AD. Por lo tanto, los anticuerpos monoclonales selectivos se han originado y los epítopes del globulómero Aß(1-42) se han detectado junto con Aß fibrilar en depósitos de placas cerebrales de ambos pacientes con AD y ratones transgénícos para APP humana. Paralelos a estos hallazgos, los ADDLs se han detectado también en el cereóro de pacientes con AD (Lacor, P.N. et al. Synaptic targeting óy Alzheimer's related amyloid óeta oligomers. J Neurosci 24, 10191-10200 (2004); Gong, Y. et al. Alzheimer's disease-affected órain: presence of oligomeric A óeta ligands (ADDLs) suggests a molecular oasis for reversióle memory loss. Proc. Nati. Acad. Sci U.S.A 100, 10417-10422 (2003)). Se apreciará que, de acuerdo con la definición dada anteriormente, los ADDLs son esencialmente diferentes de gloóulómeros en que se descrióieron para ser difundióles; sin emóargo, como se discute anteriormente, al menos una parte de su efecto puede realmente deóerse a una cantidad hasta ahora no detectada de sustancia presente en la preparación de ADDL que reacciona en forma transversal con anticuerpos específicos de gloóulómero. Los ADDLs pueden por lo tanto comprender una cantidad óaja de epítopes de gloóulómero Aß(1-42). Al utilizar anticuerpos específicos de gloóulómero Aß(1-42) la cantidad de los epítopes puede determinarse para ser aproximadamente 5%. Tal cantidad puede determinar algún grado para los efectos neurotóxicos oóservados de tal preparación. Dado que los gloóulómeros Aß(1-42) ocurren naturalmente en cereóros de AD, queda poco claro cómo el gloóulómero Aß(1-42), hasta ahora demostrado in vitro solamente, puede formarse in vivo. Esta interrogante se ha dirigido al reemplazar SDS, el cual se utiliza en el proceso de preparación del gloóulómero Aß(1-42) original, con ácidos grasos de origen natural. La presencia de varios ácidos grasos tamóién resultó en agregación al gloóulómero Aß(1-42). El mismo efecto, solo o en comóinación con ácidos grasos, se espera tamóién que ocurra con detergentes aniónicos (por ejemplo, SDS) o agentes polianiónicos (por ejemplo, la glicosaminoglican hepapna) Estos agentes químicamente diferentes comparten la capacidad para inducir agregación u ohgomerización de proteína amiloide proporcionando una superficie de carga amónica para inducción y estaóihzación de camóios conformacionales y para nucleación, sugiriendo que las superficies amónicas, en forma de micelas o vesículas, son efectivamente capaces de inducir formación de globulómero Aß(1-42) Las membranas amónicas o plataformas lípidas pueden efectuar esta función in vivo Esto sugiere que la demencia inducida por ciertos trastornos metabólicos, en particular por trastornos de metaóohsmo de lípidos, puede implicar tamóién formación de gloóulómero, y que la presente invención puede por lo tanto ser útil en el diagnóstico y tratamiento de esta condición tamóién El modo y sitio de acción de gloóulómeros Aß(1-42) in vivo no se conoce actualmente Aunque soluóle por medio de su capa hidrofílica no son detectaóles en el fluido cereóroespinal, sino más óien se enlazan rápido y estrechamente al tejido, en particular cuando se comparan a monómeros Aß(1-42) Este enlace de gloóulómeros Aß(1-42) parece ser de relevancia fisiológica ya que se orienta específicamente a neuronas hipocámpicas en cultivos primarios, sugiriendo un modo específico de enlace Varias oóservaciones excluyen la posibilidad de que la interacción de los globulómeros Aß(1-42) hidrofílicos con neuronas hipocámpicas sea inespecífica y pueda basarse en un fenómeno similar a la inserción conocida del péptido Aß en bicapas de lípido (McLaupn, J & Chakrabartty, A Membrana disruption by Alzheimer beta-amylotd peptides mediated through specific binding to either phosphohpids or ganghosides Implications for neurotoxicity J Biol Chem 271, 26482-26489 (1996), Verdier, Y , Sarandi, M & Penke, B Amyloíd beta-peptide interactions with neuronal and ghal cell plasma membrane, binding sites and implications for Alzheimer's disease J Pept Sci 10, 229-248 (2004)) Más importantemente, Aß(1-42) monomérico (conocido por ser inocuo e incluso implica tener efectos anti-demencia) mostró enlace no detectable a estructuras neuronales (Plant, L D et al The Production of amyloíd beta peptide is a cptical requirement for the viabihty of central neurons J Neuroscí 23, 5531-5535) Luego, el enlace de globulómero Aß(1-42) fue fuertemente dependiente de la etapa del cultivo celular y se restringió a células neuronales solamente, dejando una glia no etiquetada El patrón de enlace puntualizado de globulómeros Aß(1-42) junto a dendritas se asemeja a aquel de ADDLs, los cuales han demostrado que se enlazan a neuronas y se co-locahzan con marcadores post-sinápticos como PSD-95 (Lacor, P N et al Synaptic targeting by Alzheimer's-related amyloíd beta oligomers J Neuroscí 24, 10191-10200 (2004)) De este modo, parece que el globulómero Aß(1-42) unido se localiza específicamente en procesos post-sinápticos, y su enlace puede restringirse a espinas dendríticas Se especula que ahí se enlace a su receptor no caracterizado, interfiriendo con el procesamiento de información electroquímica, pero no con la bioquímica doméstica esencial de la célula. Esto explicaría el bloque específico de LTP, mientras que deja la neurofisiología básica así como potenciación a corto plazo no alterada. La supresión de LTP (pero no de fisiología de membrana básica) también indica que el globulómero Aß(1-42) puede interferir específicamente con el aprendizaje y la memoria ¡n vivo, sugiriendo que el globulómero Aß(1-42) es causal para la pérdida de memoria observada en pacientes con AD. En la presente invención, "neurotoxicidad" se entiende que denota cualquier pérdida notable de función neuronal y/o sínáptica sin tener en cuenta sus influencias en la viabilidad de la célula respectiva. Aunque se encontraron que los globulómeros Aß(1-42) son estables bajo condiciones fisiológicas in vitro, la degradación bajo condiciones in vivo es probable El experimento con proteasas no específicas demostró que el término N hidrofílico el cual se proyecta a partir de la estructura globular puede desdoblarse, dejando un globulómero Aß(1-42) truncado. La existencia de una variedad de especies Aß truncadas N-terminal en AD se ha reportado recientemente (Sergeant, N. et al. Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccinatíon approach. J Neurochem 85, 1581-1591 (2003)) sugiriendo que el truncamiento N-terminal es ciertamente un posible evento fisiológico en el cerebro. El bloqueo de LTP parece ser una característica patofisiológica común de globulómero Aß(1-42) y describe previamente preparaciones de ohgómeros Aß (Lambert, M P et al Difundióle, nonf ibp llar hgands depved from Aóeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins Proc Nati Acad Sci U S A 95, 6448-6453 (1998), Walsh, D M et al Naturally secreted ohgomers of amyloíd óeta protein potently inhióit hippocampal long-term potentiation m vivo Nature 416, 535-539 (2002), Wang, H W et al Soluóle oligomers of óeta amyloíd 1-42 inhióit long-term potentiation óut no long-term depression in rat dentate gyrus Brain Res 924, 133-140 (2002), Wang, Q , Walsh, D M , Rowan, M J , Seikoe D J & Anwyl, R Block of long-term potentiation óy naturally secreted and synthetic amyloíd óeta-peptide in hippocampal shces is mediated vía activation of the kinases c-Jun N-terminal kinase, cychn-dependen kinase 5, y p38 mitogen-activated protein kinase as well as metaóotropic glutamate receptor type 5 J Neuroscí 24, 3370-3378 (2004)) Puede ser tamóién que varios tipos de oligómeros soluóles ocurran con anticipación en AD, orientándose hacia la misma función neuronal Específicamente, otros oligómeros Aß(1-42) funcionalmente caracterizados (Walsh, D M et al Naturally secreted oligomers of amyloíd óeta protein potently inhióit hippocampal long-term potentiation m vivo Nature 416, 535-539 (2002), Wang, Q , Walsh, D M , Rowan, M J , Seikoe, D J & Anwyl, R Block of long-term potentiation óy naturally secreted and synthetic amyloíd óeta-peptide in hippocampal shces is mediated vía activation of the kinases c-Jun N-terminal kinase, cychn-dependent kinase 5, y p38 mitogen- activated protein kinase as well as metaóotropic glutamate receptor type 5 J Neuroscí 24, 3370-3378 (2004)) producidos por una línea celular que expresa APP humana mutante son más óien del tipo de pre-f i brilla No se encontró epítope de globulómero Aß(1-42) entre los ohgómeros Aß liberados por una línea celular similar No obstante, los ohgomeros Aß(1-42) obtenidos de esta línea celular (Walsh, D M et al Naturally secreted ohgomers of amyloíd óeta protein potently inhióit hippocampal long-term potentiation in vivo Nature 416, 525-539 (2002), Wang, Q , Walsh, D M , Rowan, M J , Seikoe, D J & Anwyl, R Block of long-term potentiation óy naturally secreted and synthetic amyloíd óeta-peptide in hippocampal shces is mediated vía activation of the kinases c-Jun N-terminal kinase, cychn-dependent kinase 5, y p38 mitogen-activated proteina kinase as well as metaóotropic glutamate receptor type 5 J neuroscí 24, 3370-3378 (2004)) efectivamente óloquean LTP, por lo que se indica que diferentes especies de gloóulomero Aß(1-42) soluóles son neurotóxicas (Lamóert, M P et al Diffusible, nonfibpllar hgands depved from Abeta-1-42 are potent central nervous system neurotoxins Proc Nati Acad Sci U S A 95, 6448-6453 (1998), Walsh, D M et al Naturally secreted oligomers of amyloíd óeta protein potently inhióit hippocampal long-term potentiation in vivo Natura 416, 535-539 (2002), Wang, H W et al Soluble ohgomers of beta amyloíd 1-42 inhibit long-term potentiation but not long-term depression in rat dentate gyrus Bram Res 924, 133-140 (2002), Wang, Q , Walsh D M Rowan, M J Seikoe, D J & Anwyl, R Block of long-term potentiation óy naturally secreted and synthetic amyloíd óeta-peptide in hippocampal slices is mediated vía activation of the kinases c-Jun N-terminal kinase, cychn-dependent kinase 5, y p38 mitogen-activated protein kinase as well as metabotropic glutamate receptor type 5 J Neuroscí 24, 3370-3378 (2004)) Pero es también probable que las contaminaciones residuales de los epítopes del globulómero Aß(1-42) sean una pequeña, pero crítica fracción de los ADDLs como los culpables de la naturaleza patológica de la mezcla de ohgómeros Aß(1-42) solubles que comprenden los ADDLs Independientemente de esto, trabajar con los gloóulómeros Aß(1-42) tiene la gran ventaja de tener una poólación homogénea definida de multímeros Aß(1-42) Esto es obvio cuando se originan anticuerpos para propósitos científicos o terapéuticos La presente invención se relaciona también a anticuerpos monoclonales y pohclonales con diferente especificidad contra varios epítopes de globulómero El primer anticuerpo 6G1 de ratón monoclonal demostró que se enlaza a un epítope Aß lineal ubicado N-terminal promiscuo típico compartido por todos los tipos estructurales de especies Aß(1-X) De este modo, se encontró que 6G1 es muy potente, pero que tiene un perfil de inmunotipo similar a 6E10 En contraste, dos diferentes anticuerpos, el anticuerpo 8F5 monoclonal de ratón y el anticuerpo PAb 5598 de conejo pol iclona I de afinidad purificada, fueron selectivos para globulómeros Aß(1- 42) comparados a monómeros Aß de fibrillas Sin embargo, estos reaccionan en forma transversal con el oligómeros Aß(1-42) truncado, por lo tanto se trazan más allá del aminoácido 20 Ya que estos anticuerpos acceden al gloóulómero después de ser nativos, pero no después de desnaturalizar la transferencia Western de SDS (datos no mostrados), es proóaóle que amóos anticuerpos reconozcan un epítope no lineal estructural, entre suóunidades en la región del aminoácido 20 y 30 Tales epítopes estructurales se han discutido recientemente para ser compartidos por diversas proteínas emiloides con secuencias primarias vapaóles, produciendo por lo tanto su función neurotóxica por una estructura común compartida (Kayed, R et al Common structure of soluóle amyloíd oligomers implies common mechanism of pathogenesis Science 300, 486-489 (2003), Glaóe, C G Conformation-dependent antióodies target diseases of protein misfolding Trends Biochem Sci 29, 542-547 (2004)) Estos anticuerpos proporcionan las herramientas para óuscar gloóulómeros Aß(1-42) en los cereóros de pacientes con AD y ratones transgénicos con APP humana Inicialmente, haóía preocupación acerca de la selectividad óaja contra preparaciones de monómero Aß(1-42) Después, se encontró que la falta de gloóulómeros Aß(1-42) en la presencia de monómeros Aß aóundantes en amóas muestras de CSF de pacientes con AD y en medio condicionado de células que soóre-expresan APP, evidenció selectividad mucho más elevada para gloóulómeros Aß(1-42) que la determinada inicialmente Ciertamente, las preparaciones estándares in vitro de monómeros Aß(1-42) contuvieron contaminaciones de epítopes de gloóulómero Aß(1-42) y los anticuerpos selectivos del gloóulómero Aß(1-42) no fueron capaces de determinar el grado de contaminación. De este modo, los epítopes de gloóulómero Aß(1-42) demostraron que son el componente principal en preparaciones de gloóulómero de 38/48 kDa artificial, pero un componente menor en otra preparación de oligómero Aß previamente descrita (Lamóert, M.P. et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta 1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Nati. Acad. Sci U.S.A 95, 6448-6453 (1998)). Anticuerpos incrementados contra globulómeros Aß(1-42) no sólo permiten la detección de esta especie en varias preparaciones in vitro e in vivo, sino también proporcionan un medio para inactivar selectivamente una especie de oligómero definida. Además, de la posibilidad de estudiar el papel de una proteína neurotóxica específica en la génesis de la AD, se espera que tal anticuerpo específico que reconoce un epítope estructural sea superior para tratamiento terapéutico debido a que cualquier efecto secundario asociado con una reacción de anticuerpo a otro común, pero pueden evitarse especies Aß(1-42) menos tóxicas. En este sentido, es interesante observar que los globulómeros Aß(1-42) acumularon una respuesta inmune excelente que resulta en concentraciones elevadas de anticuerpo, proporcionando la posibilidad para inmunización activa y pasiva contra globulómeros Aß(1-42). De este modo, los globulómeros Aß(1-42) así como anticuerpos específicos incrementados contra éstos, incluyendo derivados de los últimos tales como anticuerpos recombinantes, humanizados y/o quiméricos, se espera que sean útiles en el diagnóstico así como el tratamiento de, y/o la fabricación de sustancias útiles en el diagnóstico y/o el tratamiento de enfermedad de Alzheimer y otras condiciones que implican globulómeros Aß Es concebible que estas condiciones puedan incluir síndrome de Down y demencia provocado por trastornos metabólicos tales como ciertas formas de hiperhpidemia El término "Aß(X-Y)" se refiere aquí a la secuencia de aminoácido a partir de la posición X de aminoácido a la posición Y de aminoácido de la proteína ß amiloidea humana incluyendo tanto X como Y, en particular a la secuencia de aminoácido a partir de la posición X de aminoácido a la posición Y de aminoácido de la secuencia de aminoácidos DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IAT (que corresponde a posiciones 1 a 43 de aminoácido) o cualquiera de sus vanantes de origen natural, en particular aquellas con al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste de A2T, H6R, D7N, A21G ("Flamenco"), E22G ("Ártico"), E22Q ("Holandés"), E22K ("Italiano") , D23N ("lowa"), A42T y A42V en donde los números son relativos al inicio del péptido Aß, incluyendo tanto la posición X como la posición Y o una secuencia con hasta tres sustituciones de aminoácidos adicionales ninguna de las cuales pueden evitar la formación de globulómero, de preferencia sin sustituciones de aminoácidos adicionales en la porción a partir del aminoácido 12 o X, cualquier número es mayor, al aminoácido 42 o Y, cualquier número es menor, más preferiblemente sin sustituciones de aminoácidos adicionales en la porción desde el aminoácido 20 o X, cualquier número es mayor, al aminoácido 42 o Y, cualquier número es menor, y más preferiblemente sin sustituciones de aminoácidos adicionales en la porción a partir del aminoácido 20 o X, cualquier número es mayor al aminoácido 40 o Y, cualquier número es menor, una sub-estación de aminoácido "adicional" en la presente siendo cualquier desviación a partir de la secuencia canónica que no se encuentra en la naturaleza Más específicamente, el término "Aß(1-42)" se refiere aquí a la secuencia de aminoácidos a partir de la posición 1 del aminoácido a la posición 42 del aminoácido de la proteína ß amiloide humana incluyendo tanto 1 como 42, en particular a la secuencia de aminoácidos DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA o cualquiera de sus vanantes de origen natural, en particular aquellas con al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste de A2T, H6R, D7N, A21G ("Flamenco"), E22G ("Ártico"), E22Q ("Holandés"), E22K ("Italiano") , D23N ("lowa"), A42T y A42V en donde los números son relativos al inicio del péptido Aß, incluyendo tanto 1 como 42 o una secuencia con hasta tres sustituciones de aminoácidos adicionales ninguna de las cuales puede evitar formación de globulómero, de preferencia sin sustituciones de aminoácidos adicionales en la porción del aminoácido 20 al aminoácido 42 Así mismo, el término "Aß(1-40)" aquí se refiere a la secuencia de aminoácidos de la posición 1 de aminoácido a la posición 40 de aminoácido de la proteína ß amiloide humana incluyendo tanto 1 como 40, en particular a la secuencia de aminoácidos DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV o cualquiera de sus vanantes de origen natural, en particular aquellas con al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste de A2T, H6R, D7N, A21G ("Flamenco"), E22G ("Ártico"), E22Q ("Holandés"), E22K ("Italiano") y D23N ("lowa") en donde los números son relativos al inicio del péptido Aß, incluyendo tanto 1 como 40 o una secuencia con hasta tres sustituciones de aminoácidos adicionales ninguna de la cuales puede evitar formación de globulómero, de preferencia sin sustituciones de aminoácidos adicionales en la porción del aminoácido 20 al aminoácido 40 Más específicamente, el término "Aß(12-42)" se refiere aquí a la secuencia de aminoácidos de la posición 12 del aminoácido a la posición 42 del aminoácido de la proteína ß amiloide humana incluyendo tanto 12 como 42, en particular a la secuencia de aminoácidos VHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA o cualquiera de sus vanantes de origen natural, en particular aquellos con al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste de A21G ("Flamenco"), E22G ("Ártico"), E22Q ("Holandés"), E22K ("Italiano") , D23N ("lowa"), A42T y A42V en donde los números son relativos al inicio del péptido Aß, incluyendo tanto 12 como 42 o una secuencia de hasta tres sustituciones de aminoácidos adicionales ninguna de las cuales puede evitar la formación de globulómero, de preferencia sin sustituciones de aminoácidos adicionales en la porción a partir del aminoácido 20 al aminoácido 42. Más específicamente, el término "Aß(20-42)" se refiere aquí a la secuencia de aminoácido a partir de la posición 20 de aminoácido a la posición 42 de aminoácido de la proteína ß amíloide humana incluyendo tanto 20 como 42, en particular a la secuencia de aminoácidos F AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA o cualquiera de sus variantes de origen natural, en particular aquellas con al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste de A21G ("Flamenco"), E22G ("Ártico"), E22Q ("Holandés"), E22K ("Italiano") , D23N ("lowa"), A42T y A42V en donde los números son relativos al inicio del péptido Aß incluyendo tanto 20 como 42 o una secuencia con hasta tres sustituciones de aminoácidos adicionales ninguna de las cuales pueden evitar formación de globulómero, de preferencia sin ningunas sustituciones de aminoácidos adicionales. El término "globulómero Aß(X-Y)" (oligómero (Aß(X-Y) globular) se refiere aquí a una asociación no covalente, globular, soluble de péptidos Aß(X-Y) como se define anteriormente, poseyendo homogeneidad y distintas características físicas. De acuerdo con un aspecto, los globulómeros Aß(X-Y) son ensambles olígoméricos no fibrilares, estables de péptídos Aß(X-Y) los cuales son obtenibles por incubación con detergentes aniónicos. En contraste al monómero y las fibrillas, estos globulómeros se caracterizan por números de ensamble definidos de subunidades (por ejemplo, formas de ensamble anterior, n= 4-6, "oligómeros A", y formas de ensambles posteriores, n = 12-14, "oligómeros B" como se describe en WO2004/067561 ) Los globulómeros tienen una estructura de tipo globular tridimensional ("glóbulo fundido" véase Barghorn et al , 2005, J Neurochem, 95, 834-847) Éstos pueden caracterizarse además por una o mas de las siguientes características - capacidad de desdoblamiento de los aminoácidos X-23 N-terminal con proteasas promiscuas (tales como termolisina o endoproteinasa GluC) produciendo formas truncadas de globulómeros, - sin accesibilidad de aminoácidos 24-Y C-terminales con proteasas promiscuas y anticuerpos, - formas truncadas de estos globulómeros mantienen la estructura de núcleo tridimensional de tales globulómeros con una mejor accesibilidad del epítope núcleo Aß(20-Y) en su conformación de globulómero De acuerdo con la invención y en particular para el propósito de evaluar las afinidades de enlace de los anticuerpos de la presente invención, el término "globulómero Aß(X-Y)" aquí se refiere a un producto el cual es obtenible por un proceso como se describe en WO 2004/067561, el cual se incorpora en la presente para referencia Tal proceso comprende desplegar un péptido natural, recombinante o sintético (Aß(X-Y) o un derivado del mismo, exponer al menos un péptido Aß(X-Y) al menos parcialmente desplegado o derivado del mismo a un detergente, reduciendo la acción del detergente y continuando la incubación Para el propósito para desplegar el péptido, pueden permitirse actuar en la proteína agentes de ruptura de enlace de hidrógeno tales como, por ejemplo, hexafluoroisopropanol (HFIP) Los periodos de acción de unos minutos, por ejemplo, aproximadamente 10 a 60 minutos, son suficientes cuando la temperatura de acción es de aproximadamente 20 a 50°C y en particular aproximadamente 35 a 40°C La disolución subsecuente del residuo se evaporó a sequedad, de preferencia en forma concentrada, en solventes orgánicos adecuados miscibles con reguladores de pH acuosos, tales como por ejemplo, sulfóxido de dimetilo (DMSO), resulta en una suspensión de un péptido al menos parcialmente desplegado o derivado del mismo, el cual puede utilizarse de forma subsecuente Si se requiere, la suspensión madre puede almacenarse a temperatura baja, por ejemplo, a aproximadamente -20°C, durante un periodo temporal. Alternativamente, el péptido o el derivado del mismo puede alojarse en una solución preferiblemente acuosa, ligeramente acídica, por ejemplo, en una solución de HCl acuosa de aproximadamente 10 mM Después de un periodo de incubación de usualmente unos minutos, se remueven los componentes insolubles por centrifugación Unos minutos a 10000 g es conveniente Estas etapas del método se llevan a cabo de preferencia a temperatura amóiente, es decir, una temperatura en el intervalo de 20 a 30°C El 71 soórenadante oótenido después de la centrifugación contiene el péptido Aß(X-Y) o el derivado del mismo y puede almacenarse a óaja temperatura, por ejemplo, en aproximadamente -20°C, durante un periodo temporal La siguiente exposición a un detergente se relaciona a la oligomepzación del péptido o el derivado del mismo para dar un tipo intermedio de ohgómeros (en WO 2004/067561 se refiere como ohgómeros A) Para este propósito, se permite que un detergente actúe en un péptido al menos parcialmente desplegado o derivado del mismo hasta que se ha producido suficiente oligómero intermedio Se da preferencia a utilizar detergentes iónicos, en particular detergentes amónicos De acuerdo con una modalidad particular, un detergente de la fórmula (I) R-X, se utiliza, en el cual el radical R es alquilo no ramificado o ramificado que tiene de 6 a 20 y de preferencia 10 a 14 átomos de caróono o alquenilo no ramificado o ramificado que tiene de 6 a 20 y de preferencia 10 a 14 átomos de caróono, el radical X es un grupo acídico o sal del mismo, con X que se selecciona de preferencia de entre -COO-M + , -SO3 M + , y especialmente -OSO3"M+ y M+ es un catión de hidrógeno o un catión inorgánico u orgánico de preferencia seleccionado de cationes de metal álcali y de metal alcalinotérreo y cationes de amonio. Ventajosos son los detergentes de la fórmula (I), en la cual R es alquilo no ramificado de los cuales los radicales alquil o- 1 deóen mencionarse en particular. Se da preferencia particular a dodecilsulfato de sodio (SDS). El ácido láurico ,y el ácido oleico pueden utilizarse tamóién ventajosamente. La sal de sodio del detergente de lauroilsarcosina (tamóién conocido como sarkosyl NL-30 o Gardol®) es tamóién particularmente ventajoso. El periodo de acción del detergente en particular depende de sí-ya sea de hasta que punto-el péptído o el derivado sometido a oligomerización se ha desplegado. Si, de acuerdo con la etapa de despliegue, el péptído o derivado del mismo se ha tratado de antemano con un agente de ruptura de enlace de hidrógeno, es decir, en particular con hexafluoroisopropanol, los periodos de acción en el intervalo de unas horas, ventajosamente de aproximadamente 1 a 20 y en particular de aproximadamente 2 a 10 horas, son suficientes cuando la temperatura de acción es aproximadamente 20 a 50°C y en particular aproximadamente 35 a 40°C. Si un péptido menos desplegado o esencialmente no desplegado o derivado del mismo es el punto de partida, periodos más correspondientemente más prolongados de acción son convenientes. Sí el péptido o el derivado del mismo se han pre-tratado por ejemplo, de acuerdo con al procedimiento indicado anteriormente como una alternativa al tratamiento de HFIP o péptido o derivado del mismo se somete 10 directamente a oligomepzación, periodos de acción en el intervalo de aproximadamente 5 a 30 horas y en particular de aproximadamente 10 a 20 horas son suficientes cuando la temperatura de acción es aproximadamente 20 a 50°C y en particular aproximadamente 35 a 40°C Después de la incuóación, componentes insoluoles se remueven ventajosamente por centrifugación Unos minutos a 10000 g es conveniente La concentración de detergente que se elige depende del detergente utilizado Si SDS se utiliza, una concentración en el intervalo de 0 01 a 1% en peso, de preferencia de 0 05 a 05% en peso, por ejemplo, de aproximadamente 02% en peso, resulta conveniente Si el ácido laúrico o el ácido oleico se utilizan, algunas concentraciones más elevadas son convenientes, por ejemplo en un intervalo de 0 05 a 2% en peso, de preferencia de 0 1 a 0 5% en peso, por ejemplo, de aproximadamente 0 5% en peso La acción del detergente deóe tener lugar en una concentración salina aproximadamente en el rango fisiológico De este modo, las concentraciones particulares de NaCI en el intervalo de 50 a 500 mM, de preferencia de 100 a 200 mM y en particular a aproximadamente 140 mM son convenientes La reducción suósecuente de la acción del detergente y la continuación de mcuóación se relaciona a una oligomepzación adicional para dar el gloóulómero Aß(X-Y) de la invención (en WO 2004/067561 referido como oligómeros B) Ya que la composición oótenida a partir de la etapa precedente contiene regularmente II detergente y una concentración salina en el rango fisiológico, es conveniente entonces reducir la acción del detergente y, de preferencia tamóién la concentración salina Esto puede llevarse a caóo al reducir la concentración del detergente y la sal, por ejemplo, diluyendo, convenientemente con agua o un regulador de pH una concentración salina inferior, por ejemplo, Tps-HCI, pH 7 3 Los factores de dilución en el intervalo de aproximadamente 2 a 10, ventajosamente en el intervalo de aproximadamente 3 a 8 y en particular de aproximadamente 4, han resultado ser adecuados La reducción en la acción del detergente puede lograrse tamóién al agregar sustancias las cuales pueden neutralizar la acción del detergente Ejemplos de éstas incluyen sustancias capaces de formar complejos con los detergentes, sustancias similares capaces de estaóilizar células en el curso de la purificación y medidas de extracción, por ejemplo, copolímeros en óloque EO/PO particulares, en particular copolímero en óloque óajo la marca Pluronic® F 68 Los fenoles alcoxilados y en particular, etoxilados tales como los t-octilfenoles etoxilados de la sene Tritón® X, en particular Tritón® X100, 3-(3-colam?doprop?ld?met?lamon?o)-1-propansulfonato (CHAPS®) o esteres grasos de soróitan alcoxilados y en particular etoxilados tales como aquellos de la sene Tween®, en particular Tween® 20, en intervalos de concentración alrededor o soóre la concentración micelar crítica particular, pueden utilizarse igualmente Suósecuentemente, la solución se incuóa hasta que suficiente globulómero Aß(X-Y) de la invención se ha producido Periodos de acción en el rango de vanas horas, de preferencia en el intervalo de aproximadamente 10 a 30 horas y en particular en el intervalo de aproximadamente 15 a 25 horas, son suficientes cuando la temperatura de acción es aproximadamente 20 a 50°C y en particular aproximadamente 35 a 40°C La solución puede entonces concentrarse y posibles residuos pueden removerse por centrifugación Aquí también, unos minutos a 10000 g resultan convenientes El sobrenadante obtenido después de la centrifugación contiene un globulómero Aß(X-Y) de la invención Un globulómero Aß(X-Y) de la invención puede recuperarse finalmente en una manera conocida per se, por ejemplo, por u Itraf i Itración , diálisis, precipitación o centrifugación Se prefiere además si la separación electroforética de los globulómeros Aß(X-Y) bajo condiciones de desnaturalización, por ejemplo, por SDS-PAGE, produce una banda doble (por ejemplo, con un peso molecular aparente de 38/48 kDa para Aß(1-42)), y especialmente se prefiere si en el tratamiento de glutardialdehído de los globulómeros antes de la separación estas dos bandas se incorporan en una Se prefiere también si la cromatografía de exclusión de tamaño de los globulómeros resulta en un pico sencillo (por ejemplo, que corresponde a un peso molecular de aproximadamente 60 kDa para Aß(1-42)) A partir del péptido Aß(1-42) péptido Aß(12-42) y el péptido Aß(20-42) los procesos son en particular adecuados para obtener 13 globulómeros Aß(1-42), globulómeros Aß(12-42) y globulómeros Aß(20-42) En una modalidad particular de la invención, los globulómeros Aß(X-Y) en donde X se selecciona del grupo que consiste de los números 2 24 e Y es como se define anteriormente, son aquellos los cuales son obtenibles al truncar globulómeros Aß(1-Y) en formas más cortas en donde X se selecciona del grupo que consiste de los números 2 24, con X siendo de preferencia 20 o 12 e Y es como se define anteriormente, lo cual puede lograrse por tratamiento con proteasas apropiadas Por ejemplo, un globulómero Aß(20-42) puede obtenerse al someter un globulómero Aß(1-42) a proteóhsis con termohsina, y un globulómero Aß(12-42) puede obtenerse al someter un globulómero Aß(1-42) a proteólisis con endoproteínasa GluC Cuando el grado deseado de proteólisis se alcanza, la proteasa se inactiva en una manera generalmente conocida Los globulómeros resultantes pueden entonces aislarse siguiendo los procedimientos ya descritos en la presente, y si se requiere, procesarse además por etapas de desarrollo y purificación adicionales Una descripción detallada de los procesos se describe en WO 2004/067561, la cual se incorpora en la presente para referencia El término "monómero Aß(X-Y)" se refiere aquí a la forma aislada del péptido Aß(X-Y), de preferencia una forma del péptido Aß(X-Y) el cual no se emplea en interacciones esencialmente no covalentes con otros péptidos Aß Prácticamente, el monómero Aß(X-Y) se proporciona usualmente en la forma de una solución acuosa En una modalidad particularmente preferida de la invención, la solución de monómero acuoso contiene 0.05% a 0.2%, más preferiblemente alrededor de 0.1% de NH4OH. En otra modalidad particularmente preferida de la invención, la solución de monómero acuoso contiene 0.05% a 0.2%, más preferiblemente alrededor de 0.1% de NaOH. Cuando se utiliza (por ejemplo, para determinar las afinidades de enlace de los anticuerpos de la presente invención), puede ser conveniente diluir tal solución en una manera apropiada. Además, es usualmente conveniente utilizar tal solución en un lapso de 2 horas, en particular en un lapso de 1 hora, y especialmente en un lapso de 30 minutos después de su preparación. El término "fibrilla" se refiere a una estructura molecular que comprende ensambles de péptidos Aß(X-Y) individuales, no covalentemente asociados, los cuales muestran una estructura fibrilar en el microscopio electrónico, el cual enlaza rojo Congo y luego exhibe doble refracción bajo luz polarizada y cuyo patrón de difracción de rayos X es una estructura ß cruzada. En otro aspecto de la invención, una fibrilla es una estructura molecular obtenible por un proceso que comprende la agregación polimérica auto-inducida de un péptido Aß adecuado en la ausencia de detergentes, por ejemplo, en 0.1 M de HCl, conduciendo a la formación de agregados de más de 24, de preferencia más de 100 unidades. Este proceso se conoce bien en la técnica. Convenientemente, se utilizan fibrillas Aß(X-Y) en la forma de una solución acuosa. En una modalidad particularmente preferida de la invención, la solución de fibrillas acuosa se hace al disolver el péptido Aß en 0.1% de NH4OH, diluyendo 1:4 con 20 mM de NaH2PO4, 140 mM de NaCI, pH 7.4, seguido al reajustar el pH a 7.4, incubando la solución a 37°C durante 20 horas, seguido por centrifugación a 10000 g durante 10 minutos y la resuspensión en 20 mM de NaH2PO4, 140 mM de NaCI, pH 7.4. La presente invención se relaciona además con la siguiente enseñanza: Los resultados obtenidos para los oligómeros Aß(1-42) globulares solubles son también válidos y aplicables para los oligómeros Aß(1-40) globulares solubles así como los respectivos oligómeros Aß(X-38), Aß(X-39), Aß(X-40), Aß(X-41), Aß(X-42) o Aß(X-43) truncados, de preferencia Aß(X-42) o Aß(X-40), y/o los oligómeros reticulados respectivos. De este modo, de acuerdo con la presente invención, el término "oligómero Aß(1-42) globular soluble ("globulómero")" se entiende que comprende por ejemplo, también "oligómeros Aß(1-40) globulares soluóles" así como "olígómeros Aß(X-42) gloóulares soluóles" y "oligómeros Aß(X-40) gloóulares soluóles" y/o un derivado reticulado del mismo con "x que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 2 .. 24, de preferencia 8 .. 24, más preferiblemente 12 .. 24, más preferiblemente 12 .. 20" y más preferiblemente 17 .. 20" en donde el significado de la elipsis es como se descríóe anteriormente (es decir, 1 .. 24 representa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 y 24, etc.).

Además, se encontró que los resultados de acuerdo con la presente invención con respecto al ohgómero Aß(1-42) gloóular soluóle en agua, no difundióle ("gloóulómero") son válidos y aphcaóles tamóién con respecto a los ohgómeros Aß(X-42) y/o Aß(X-40) respectivos, con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiólemente 12 20 y más preferiólemente 17 20 así como un derivado reticulado del mismo En el curso para investigar además el método de clasificación anterior, tamóién se investigaron preparaciones químicas como se descpóe en la literatura Sorprendentemente, en la presente invención se encontró que los ohgómeros de acuerdo con WO 98/33815 (y puólicaciones similares) no son una sustancia ide ntif icable homogénea o mezcla homogénea de sustancias identificables Inesperadamente, se encontró que los oligómeros de acuerdo con WO 98/33815 (y publicaciones similares) comprenden de hecho una mezcla de aproximadamente 5% de epítopes de ohgómero Aß(1-42) globular solubles no difundibles ("epítopes de globulómeros") y de aproximadamente 95% de monómero propenso a fibrillas incluyendo oligómeros dif und ibles como precursores de protof i brillas ("fibplómeros") en la trayectoria a fibrillas Además, sorprendentemente, se ha encontrado también que las otras preparaciones de ohgómero Aß(1-42) conocidas, también comprenden una cantidad de aproximadamente 5% de epítopes de 17 ohgómero Aß(1-42) globular solubles no difundibles ("epítopes de globulómero") Los cálculos sugieren que el globulómero Aß(1-42) consiste de 12 o aproximadamente 12 subunidades de Aß, pero es también probable y sugiere que existen ensambles que tienen el mismo cambio característico en su estructura de epítope pero con un número bajo de cadenas de Aß (por ejemplo, con sólo 4 subunidades) Normalmente, éste es el caso con "ohgómeros A" como se describe en WO 2004/067561 (Abbott GmbH & Co KG) (véase la Figura 18) De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para diagnosticar in vitro o in vivo cualitativa (= positiva o negativamente) o cuantitativamente en un paciente humano o animal para la presencia o ausencia de enfermedad de Alzheimer (AD) o el nesgo del paciente de adquirir AD, caracterizado por la etapa de determinar en una o más muestras representativas tomadas del paciente la presencia (= diagnóstico positivo) o ausencia (= diagnóstico negativo) o la cantidad cuantitativa de auto-anticuerpos que tienen especificidad contra el oligómero Aß(X-38/43) globular no difundióle, de preferencia Aß(X-42) y/o Aß(X-40) y/o un derivado reticulado del mismo con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiólemente 12 20 y más preferiólemente 17 20 De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, el método como se descpóe anteriormente se caracteriza en que la muestra se selecciona del grupo que consiste de una célula, un ensarnóle celular, una muestra de tejido corporal (célula), una muestra de líquido corporal y una muestra de tejido (célula)/l íquido corporal, cada muestra es de un cuerpo animal de preferencia un ser cuerpo humano, animal no humano o animal transgenico no humano De acuerdo con otra modalidad preferida de la invención, el método como se descpóe anteriormente, se caracteriza en que el anticuerpo mono o pol i clona I es selectivo para un epítope específico de tipo de estructura de gloóulómero uóicado entre las posiciones de aminoácido o de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 del oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) gloóular soluóle no difundióle ("gloóulómero") y/o un derivado reticulado del mismo, con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiólemente 12 20 y mas preferiólemente 17 20 La palaóra "aproximadamente" cuando se utiliza anteriormente o en otra parte en la presente especificación y reivindicaciones se utiliza para significar el hecho de que la posición exacta puede variar dentro de los límites experimentales y de faópcación normales de 0 a 1, 2 ó 3 posiciones de aminoácidos El término "posiciones de aminoácidos de aproximadamente 20 a aproximadamente 30" se entenderá en la presente invención y donde sea que se utilice en la presente especificación que incluye sin limitarse a la misma al menos los términos "posiciones de aminoácidos de aproximadamente 20 a aproximadamente 30", "posiciones de aminoácidos de aproximadamente 21 a aproximadamente 30", "posiciones de aminoácidos de aproximadamente 22 a aproximadamente 30", "posiciones de aminoácidos de aproximadamente 23 a aproximadamente 30", y "posiciones de aminoácidos de aproximadamente 24 a aproximadamente 30". El término "aproximadamente 30" debe independientemente del significado del término "aproximadamente 20" entenderse que incluye sin limitarse al mismo al menos los números seleccionados del grupo que consiste de 26 34. El término "aproximadamente 20" debe independientemente del significado del término "aproximadamente 30" entenderse que incluye sin limitarse al mismo al menos los números seleccionados del grupo que consiste de 16 .. 24. De acuerdo con una modalidad preferida, el método como se describe anteriormente se caracteriza en que la muestra se selecciona del grupo que consiste de una célula, un ensamble celular, una muestra de tejido corporal (célula), una muestra de líquido corporal y una muestra de tejido (célu la)/l íquido corporal, cada muestra es de un cuerpo animal, de preferencia un cuerpo humano, animal no humano o animal transgénico no humano. De acuerdo con la modalidad preferida, el método como se describe anteriormente se caracteriza en que el anticuerpo mono o policlonal es selectivo para un epítope específico de tipo de estructura de globulómero ubicado entre las posiciones de aminoácido o de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 del ohgómero Aß(X-38/43) globular no difundióle, de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómero") y/o un derivado reticulado del mismo, con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiblemente 12 20 y más preferiblemente 17 20 De acuerdo con una modalidad preferida, el método como se describe anteriormente se caracteriza en que el oligómero Aß(X-38/43) globular no difundióle, de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómero") es soluóle De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un proceso de enriquecimiento, caracterizado porque comprende la etapa de capturar selectiva y reversiólemente el ohgómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómeros") con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiólemente 12 20, y más preferiólemente 17 20 y/o el derivado reticulado del mismo a partir de la preparación al utilizar una o más etapas del proceso de purificación de péptido conocidas per se De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un proceso para determinar la cantidad de al menos un ohgómero Aß(X-38/43) globular no difundióle, de preferencia un ohgómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómero") y/o un derivado reticulado del mismo, con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiólemente 12 20 y más preferiólemente 17 20 y/o un derivado reticulado del mismo en una preparación articular o natural, caracterizado por la etapa de poner en contacto la preparación o una parte representativa del mismo, con un anticuerpo mono o pohclonal que tiene especificidad contra al menos un ohgómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia un ohgómero Aß(X- 42) y/o Aß(X-40), y/o un derivado reticulado del mismo y determinar luego la cantidad de los productos de enlace de anticuerpo-gloóulómero resultantes De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el proceso es un inmunoensayo anti-Aß de transferencia en mancha y ELISA como se descpóe posteriormente en WO 2004/067561 De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el proceso como se descpóe anteriormente se caracteriza en que el anticuerpo mono o pohclonal es específico para un epítope específico de tipo de estructura de gloóulómero uóicado en o entre las posiciones de aminoácido de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 del oligómero Aß(X-38/43) gloóular soluóle no difundióle, de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómero") y/o un derivado reticulado del mismo De acuerdo con una modalidad preferida adicional de la presente invención, el proceso como se descpóe anteriormente se caracteriza por enriquecer la cantidad del ohgómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia oligómeros Aß(X-42) y/o Aß(X-40), con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24 más preferiólemente 12 20 y más preferiólemente 17 20 y/o un derivado reticulado del mismo como el contenido en la preparación al utilizar una o más etapas del proceso de purificación del péptido conocidas per se De acuerdo con una modalidad preferida adicional de la presente invención, el proceso de enriquecimiento como se descpóe anteriormente se caracteriza por un enriquecimiento de la cantidad del ohgómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia ohgómeros Aß(X-42) y/o Aß(X- 40), con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiólemente 12 20 y más preferiólemente 17 20 y/o un derivado reticulado del mismo de igual o mayor de 50% en peso, de preferencia de igual a o mayor de 60% en peso, más preferiólemente de igual a o mayor de 70% en peso, más preferiólemente de igual a o mayor de 80% en peso, más preferiblemente de igual a, o mayor de 90% en peso, más preferiólemente de igual a o mayor de 95% en peso, más preferiólemente de igual a o mayor de 99% en peso, más preferiólemente de igual a o mayor de 99 9% en peso, más preferiólemente de igual a o mayor de 99 99% en peso De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el proceso de enriquecimiento como se descpóe anteriormente se caracteriza porque comprende la etapa de capturar selectiva y reversiólemente el ohgómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómeros") con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiólemente 12 20 y más preferiólemente 17 20 y/o el derivado reticulado del mismo a partir de la preparación utilizando una o más etapas del proceso de purificación de péptido conocidas per se De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el proceso de enriquecimiento como se descpóe anteriormente se caracteriza porque comprende la etapa de remover reversióle o irreversiólemente aquellas sustancias que son diferentes del oligómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómeros") y/o el derivado reticulado del mismo a partir de la preparación utilizando una o más etapas del proceso de purificación de péptido conocidas per se De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el proceso de enriquecimiento como se descpóe anteriormente se caracteriza en que la etapa para determinar la cantidad del oligómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómeros") y/o el derivado reticulado del mismo se realiza solamente después de haóer realizado una o más etapas de enriquecimiento De acuerdo con una modalidad preferida adicional de la presente invención, el proceso de determinación y/o enriquecimiento como se descrióe anteriormente se caracteriza en que el oligómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómeros") se retícula al utilizar una o más etapas de reticulación conocidas per se las cuales pueden realizarse ya sea antes, durante y/o después de las etapas de enriquecimiento y/o determinación La reticulación puede realizarse, por ejemplo, por tratamiento con glutardialdehído Se descrióen métodos de reticulación adecuados en WO 2004/067561 La etapa de reticulación puede realizarse antes, durante y/o después del procedimiento de enriquecimiento De acuerdo con una modalidad preferida adicional de la presente invención, el proceso de determinación y/o enriquecimiento como se descrióe anteriormente se caracteriza en que el ohgómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia el ohgómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómero") es soluóle De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un ohgómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle purificado, esencialmente purificado o altamente purificado, de preferencia un ohgómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómero") con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiólemente 12 20 y más preferiblemente 17 20 y/o un derivado reticulado del mismo, como se describe anteriormente, obtenido u obtenible por un método como se describe anteriormente De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un oligómero Aß(X-38/43) globular no d if und i ble purificado o esencialmente purificado o altamente purificado, de preferencia un oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("globulómero"), con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiblemente 12 24, más preferiblemente 12 20 y más preferiblemente 17 20 y/o un derivado reticulado del mismo, como se describe anteriormente, obtenido u obtenible por un método como se describe anteriormente De acuerdo con una modalidad preferida adicional de la presente invención, el oligómero Aß(X-38/43) globular no difundible purificado o esencialmente purificado o altamente purificado, de preferencia un oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("globulómero") como se describe antepormente se caracteriza en que el ohgómero Aß(X-38/43) globular no difundióle, de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómero") es soluóle De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición que comprende un ohgómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle purificado o esencialmente purificado o altamente purificado, de preferencia un oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómero"), con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiólemente 12 .. 20 y más preferiólemente 17 .. 20- y/o un derivado reticulado del mismo como se descpóe anteriormente, obtenido u obtenible por un método como se describe anteriormente.

De acuerdo con una modalidad preferida adicional de la presente invención, la composición como se describe anteriormente se caracteriza en que el oligómero Aß(X-38/43) globular no difundible, de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("globulómero") es soluble. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso de un oligómero Aß(X-38/43) globular no difundible purificado o esencialmente purificado o altamente purificado, de preferencia un oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómeros"), con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 .. 24, de preferencia 8 .. 24, más preferiólemente 12 .. 24, más preferíólemente 12 .. 20 y más preferiólemente 17 .. 20 y/o un derivado retículado del mismo como se oótiene o es oótenióle por un método como se descrióe anteriormente se utiliza como una vacuna para la inmunización activa contra Enfermedad de Alzheimer (AD) de un paciente con necesidad del mismo. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso de un oligómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle purificado o esencialmente purificado o altamente purificado, de preferencia un oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómeros"), con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 .. 24, de preferencia 8 .. 24, más preferiólemente 12 .. 24, más preferiólemente 12 .. 20 y más preferiólemente 17 .. 20 y/o un derivado reticulado del mismo como se oótiene o es oótenióle por un método como se descrióe anteriormente para la preparación de un aptámero específico contra Enfermedad de Alzheimer (AD) de un paciente con necesidad del mismo. Métodos para la preparación de aptámeros específicos adecuados contra el olígómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle purificado o esencialmente purificado o altamente purificado identificado anteriormente, de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómeros") se conocen por la persona experta en la técnica. Véase por ejemplo, la Solicitud de Patente Alemana puólicada No. DE 199 16417 A1. El término inmunización "activa" o "pasiva" significará en términos del tratamiento de la enfermedad del paciente que la aparición o desarrollo o progreso de enfermedad de Alzheimer (AD) se evita o prolonga o la patogénesis de AD relacionada al grado de pérdida neuronal y severidad de deterioro cognoscitivo se detiene o retarda. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso de un olígómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle purificado o esencialmente purificado o altamente purificado, de preferencia un oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómero"), con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 .. 24, de preferencia 8 .. 24, más preferiólemente 12 .. 24, más preferiólemente 12 .. 20 y más preferiólemente 17 .. 20 y/o un derivado reticulado del mismo como se oótiene o es oótenible por un método como se describe anteriormente para la preparación de un medicamento para la inmunización pasiva contra la Enfermedad de Alzheimer (AD) de un paciente con necesidad del mismo. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso de un oligómero Aß(X-38/43) globular no difundible purificado o esencialmente purificado o altamente purificado, de preferencia un oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("globulómeros"), con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 .. 24, de preferencia 8 .. 24, más preferiblemente 12 .. 24, más preferiblemente 12 .. 20 y más preferiblemente 17 .. 20 y/o un derivado retículado del mismo como se obtiene o es obtenible por un método como se describe anteriormente para la preparación de un anticuerpo monoclonal o policlonal, nativo o recombínante, humano o animal o quimérico que tiene especificidad contra el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) globular no difundióle ("gloóulómeros") y/o el derivado reticulado del mismo, que es útil para la inmunización pasiva contra enfermedad de Alzheimer en un paciente con necesidad del mismo De acuerdo con una modalidad preferida adicional de la presente invención, cualquiera de los usos como se descrióe anteriormente, se descrióe en que el ohgómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia el ohgómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómero") es soluóle De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para la preparación de un anticuerpo monoclonal o policlonal, nativo o nativo o recomóinante, humano, humanizado, animal o quimérico que tiene especificidad contra el oligómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia los ohgómeros Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómeros"), con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiblemente 12 24, más preferiblemente 12 20 y más preferiblemente 17 20 y/o un derivado reticulado del mismo caracterizado por la etapa de aportar un organismo que tiene un sistema inmune en contacto con un ohgómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) globular no difundible purificado o esencialmente purificado o altamente purificado ("globulómeros") y/o un derivado reticulado del mismo como se obtiene o es obtenible por un método como se describe anteriormente y aislar el anticuerpo que tiene especificidad contra el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) globular no difundióle ("globulómeros") y/o un derivado reticulado del mismo o una célula que produce un anticuerpo que tiene especificidad contra el ohgómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) globular no difundible ("globulómeros") y/o un derivado reticulado del mismo a partir del organismo y determinar opcionalmente la secuencia química y/o estructura del anticuerpo obtenido De acuerdo con una modalidad preferida adicional de la presente invención, el método como se describe anteriormente, se caracteriza en que el ohgómero Aß(X-38/43) globular no difundible, de preferencia el ohgómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("globulómero") es soluble De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un anticuerpo monoclonal o pohclonal, nativo o recombinante, humanizado, humano, animal o quimérico, que tiene especificidad contra el oligómero Aß(X-38/43) globular no difundióle, de preferencia el ohgómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómeros"), con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiólemente 12 20 y más preferiólemente 17 20 y/o un derivado reticulado del mismo como se oótiene o es oótenióle de acuerdo al método descrito anteriormente para inmunización activa o pasiva contra enfermedad de Alzheimer (AD) en un paciente con necesidad del mismo De acuerdo con una modalidad preferida adicional de la presente invención, el anticuerpo monoclonal o po cl onal, nativo o recomóinante, humanizado, humano, animal o quimérico, como se descrióe anteriormente, se caracteriza en que el oligómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia el ohgómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómero") es soluóle. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal, nativo o recomóínante, humano, humanizado, animal o quimérico, que tiene especificidad contra el oligómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia oligómeros Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómeros"), con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 .. 24, de preferencia 8 .. 24, más preferiólemente 12 .. 24, más preferiólemente 12 .. 20 y más preferíólemente 17 .. 20 y/o un derivado reticulado del mismo como se oótíene o es oótenióle de acuerdo al método descrito anteriormente para inmunización activa o pasiva contra enfermedad de Alzheimer (AD) en un paciente con necesidad del mismo. De acuerdo a un aspecto preferido adicional de la presente invención, la composición antes mencionada, caracterizada en que el oligómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómero") es soluóle. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente ¡nvención, se proporciona un método para diagnosticar positiva o negativamente a un paciente que tiene Enfermedad de Alzheimer (AD) o que tiene un riesgo incrementado de adquirir Enfermedad de Alzheimer, caracterizado por la etapa de determinar en una o más muestras representativas tomadas del paciente la presencia (diagnóstico positivo) o ausencia (diagnóstico negativo) de auto-anticuerpos contra el oligómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia oligómeros Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómeros"), con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiólemente 12 20 y más preferiólemente 17 .. 20 y/o un derivado retículado del mismo. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el método como se descrióe anteriormente se caracteriza en que la muestra se selecciona del grupo que consiste de una célula, un ensamóle celular, una muestra de tejido corporal (célula), una muestra de líquido corporal y una muestra de tejido/líquido corporal, cada muestra es de un cuerpo humano, animal o animal transgénico. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el método como se descrióe anteriormente, se caracteriza en que el oligómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómero") es soluóle. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso de anticuerpo humanizado, humano, animal o quimérico contra un oligómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle y de preferencia oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómeros"), con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 .. 24, de preferencia 8 .. 24, más preferiólemente 12 24, más preferiólemente 12 20 y más preferiólemente 17 .. 20 y/o un derivado reticulado del mismo como un marcador de diagnóstico para determinar la enfermedad de Alzheimer (AD) o un riesgo incrementado de adquirir enfermedad de Alzheimer en un paciente con necesidad del mismo. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el uso de anticuerpos humanizados, humanos, de animal o quiméricos contra un oligómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómeros") se caracteriza en que el oligómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómero") es soluóle. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso de uno o más fármacos que disminuyen el nivel de ácido graso en el cereóro de un paciente para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedad de Alzheimer o enfermedades relacionadas como síndrome de Down en un paciente con necesidad del mismo. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un oligómero Aß(X-Y) gloóular no difundióle, con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiólemente 12 20 y más preferiólemente 17 .. 20 e Y que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 38, 39, 41 y 43, y/o un derivado reticulado del mismo útil como un marcador de diagnóstico para determinar la enfermedad de Alzheimer (AD) o un riesgo incrementado de adquirir enfermedad de Alzheimer en un paciente con necesidad del mismo. Con respecto a la presente ¡nvención, incluyendo la especificación, reivindicaciones y figuras, el término "oligómero Aß(1-42)" se entiende que incluye oligómeros Aß(X-42), oligómeros Aß(X-40) y/o los derivados reticulados de los mismos, con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 .. 24, de preferencia 8 .. 24, más preferiólemente 12 .. 24, más preferiólemente 12 .. 20 y más preferiólemente 17 .. 20. En particular en toda la especificación presente, cualesquiera reivindicaciones y cualesquiera figuras, las siguientes definiciones son aplicaóles: De acuerdo con la presente invención, el término "soluóle" se define con respecto a los gloóulómeros Aß(1-Y) como teniendo una soluóílídad acuosa alta o notaóle (carácter hidrofílico) de hasta 14 mg/ml o más" y con respecto a los gloóulómeros Aß(X-Y) truncados como teniendo solubilidad baja, moderada o elevada en soluciones de regulador de pH fisiológica acuosa en la presencia de proteínas (por ejemplo, HAS) o detergentes (por ejemplo, pluriol, Pluronic F68) con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 .. 24, de preferencia 8 .. 24, más preferiblemente 12 24, más preferiblemente 12 20 y más preferiblemente 17 .. 20 e Y que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 38 .. 43.

De acuerdo con la presente invención, el término "oligómero Aß(X-38/43)" se define como que comprende al menos un ohgómero Aß seleccionado del grupo que consiste de un "oligómero Aß(X-38)", "oligómero Aß(X-39)", "oligómero Aß(X-40)", "ohgómero Aß(X-41)", "oligómero Aß(X-42), y "ohgómero Aß(X-43)", y/o un derivado reticulado del mismo, con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiblemente 12 24, más preferiblemente 12 20 y más preferiblemente 17 20 De acuerdo con la presente invención, el término "ohgómero Aß(X-38)" se define como que comprende al menos un ohgómero Aß(X-38) y/o un derivado reticulado del mismo, con X que se selecciona del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiblemente 12 24, más preferiólemente 12 20 y más preferiólemente 17 20 De acuerdo con la presente invención, el término "oligómero Aß(X-39)" se define como que comprende al menos un oligómero Aß(X-39) y/o un derivado reticulado del mismo, con X que se selecciona del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiólemente 12 20 y más preferiólemente 17 20 De acuerdo con la presente invención, el término "oligómero Aß(X-40)" se define como que comprende al menos un oligómero Aß(X-40) y/o un derivado reticulado del mismo, con X que se selecciona del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiólemente 12 20 y más preferiólemente 17 20 De acuerdo con la presente invención, el término "oligómero Aß(X-41)" se define como que comprende al menos un oligómero Aß(X-41) y/o un derivado reticulado del mismo, con X que se selecciona del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiblemente 12 24, más preferiólemente 12 20 y más preferiólemente 17 20 De acuerdo con la presente invención, el término "oligómero Aß(X-42)" se define como que comprende al menos un oligómero Aß(X-42) y/o un derivado reticulado del mismo, con X que se selecciona del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiblemente 12 20 y más preferiblemente 17 20 De acuerdo con la presente invención, el término "ohgómero Aß(X-43)" se define como que comprende al menos un ohgómero Aß(X-43) y/o un derivado reticulado del mismo, con X que se selecciona del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiólemente 12 20 y más preferiólemente 17 20 De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para diagnosticar in vitro o m vivo cualitativa (= positiva o negativamente) o cuantitativamente en un sujeto no humano o animal para la presencia o ausencia de enfermedad de Alzheimer (AD) o el nesgo de adquirir AD, caracterizado por la etapa de determinar en una o más muestras representativas tomadas del sujeto la presencia (= diagnóstico positivo) o ausencia (= diagnóstico negativo) o la cantidad cuantitativa de auto-anticuerpos que tienen especificidad contra al menos un epítope de la estructura del ohgómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia al menos un epitope de estructura del oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) y/o un derivado reticulado del mismo con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiólemente 12 20 y más preferiólemente 17 20 De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, el método como se descrióe anteriormente se caracteriza en que la muestra se selecciona del grupo que consiste de una célula, un ensamóle celular, una muestra de tejido corporal (célula), una muestra de líquido corporal y una muestra de tejido (célula)/) íquido corporal, cada muestra es de un cuerpo animal de preferencia un ser cuerpo humano, no humano o animal transgénico no humano De acuerdo con otra modalidad preferida de la invención, el método como se descrióe anteriormente, se caracteriza en que el anticuerpo mono o policlonal es selectivo para al menos un epítope específico de tipo de estructura de gloóulómero uóicado entre las posiciones de aminoácidos o de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 del oligómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia el Aß(X-42) y/o Aß(X-40) gloóular no difundióle ("gloóulómero") y/o un derivado reticulado del mismo, con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiblemente 12 24, más preferiblemente 12 20 y más preferiblemente 17 20 De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el método como se describe anteriormente, se caracteriza en que el ohgómero Aß(X-38/43) globular no difundióle, de preferencia el ohgómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómero") es soluóle De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un proceso para determinar la cantidad de al menos un oligómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia un ohgómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómero") y/o su derivado reticulado del mismo, con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiólemente 12 20 y más prefepólemepte 17 20 y/o un derivado reticulado del mismo en una preparación artificial o natural, caracterizado por la etapa de poner en contacto la preparación, o una parte representativa de la misma, con un anticuerpo mono o po I icio na I específico que tiene especificidad contra al menos un epítope de estructura del oligómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia al menos un epítope de estructura del oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) y/o un derivado reticulado del mismo y luego determinar la cantidad de los productos de enlace anticuerpo-gloóulómero resultantes En particular, se proporciona el proceso de acuerdo al último aspecto, caracterizado en que el anticuerpo mono o policlonal es específico para un epítope específico de tipo de estructura de gloóulómero uóicado en o entre las posiciones de aminoácido o desde aproximadamente 20 a aproximadamente 30 del ohgómero Aß(X- 38/43) gloóular no difundióle, de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) gloóular no difundióle ("gloóulómero") y/o un derivado reticulado del mismo De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el proceso como se descrióe anteriormente se caracteriza al enriquecer la cantidad del ohgómero Aß(X- 38/43) globular no difundióle, de preferencia el ohgómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) gloóular no difundióle con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiólemente 12 20 y más preferiólemente 17 20 y/o un derivado reticulado del mismo como el contenido en la preparación al utilizar una o más etapas del proceso de purificación del péptido conocidas per se De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el proceso de enriquecimiento como se descrióe anteriormente se caracteriza por un enriquecimiento de la cantidad del ohgómero Aß(X- 38/43) gloóular no difundióle, de preferencia el ohgómero A(3(X-42) y/o Aß(X-40) gloóular no difundióle con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiólemente 12 20 y más preferiólemente 17 20 y/o un derivado reticulado del mismo de igual a o mayor de 50% en peso, de preferencia de igual a o mayor de 60% en peso, más preferiólemente de igual a o mayor de 70% en peso, más preferiólemente de igual a o mayor de 80% en peso, más preferiólemente de igual a o mayor de 90% en peso, más preferiólemente de igual a o mayor de 95% en peso, más preferiólemente de igual a o mayor de 99% en peso, más preferiólemente de igual a o mayor de 99 9% en peso, más preferiólemente de igual a o mayor de 99 99% en peso De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el proceso de enriquecimiento como se descrióe anteriormente se caracteriza porque comprende la etapa de capturar selectiva y reversiólemente el oligómero Aß(X- 38/43) gloóular no difundióle, de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) ("gloóulómero")con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más prefepblemente 12 20 y más preferiólemente 17 20 y/o un derivado reticulado del mismo a partir de la preparación al utilizar una o más etapas del proceso de purificación de péptido conocidas per se De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el proceso de enriquecimiento como se describe anteriormente se caracteriza porque comprende la etapa de remover reversible o irreversiblemente aquellas sustancias que son diferentes del ohgómero Aß(X- 38/43) globular no d if u nd i ble , de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) globular no difundible ("globulómeros") y/o el derivado reticulado del mismo a partir de la preparación al utilizar una o más etapas de proceso de purificación de péptido conocidas per se De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el proceso de enriquecimiento como se describe anteriormente se caracteriza en que la etapa para determinar la cantidad del ohgómero Aß(X- 38/43) globular no difundióle, de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) gloóular no difundióle ("gloóulómeros") y/o el derivado reticulado del mismo se realiza solamente después de haber realizado una o más etapas de enriquecimiento De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el proceso de determinación y/o enriquecimiento como se describe anteriormente se caracteriza en que el ohgómero Aß(X-38/43) globular no difundióle, oótenido, de preferencia el ohgómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) gloóular no difundióle ("gloóulómeros") se retícula al utilizar una o más etapas de reticulación conocidas per se las cuales pueden realizarse ya sea antes, durante y/o después de las etapas de enriquecimiento y/o de determinación De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el proceso de determinación y/o enriquecimiento como se descrióe anteriormente se caracteriza en que el oligómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) gloóular no difundióle ("gloóulómero") es soluóle. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente ¡nvención, se proporciona un oligómero Aß(X- 38/43) gloóular no difundióle, purificado o esencialmente purificado o altamente purificado, de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) gloóular no difundióle ("gloóulómero") con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 .. 24, de preferencia 8 .. 24, más preferiólemente 12 .. 24, más preferiólemente 12 .. 20 y más preferiólemente 17 .. 20 y/o un derivado reticulado del mismo, de acuerdo a como se descrióe anteriormente, oótenido u oótenióle por un método como se descrióe anteriormente. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el oligómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, purificado o esencialmente purificado o altamente purificado de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) gloóular no difundióle ("gloóulómero") como se descrióe anteriormente se caracteriza en que el oligómero Aß(X- 38/43) gloóular no difundióle, de preferencia el olígómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) globular no dífundible ("globulómero") es soluóle. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición que comprende un oligómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle purificado o esencialmente purificado o altamente purificado, de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) gloóular no difundióle ("globulómero"), con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiólemente 12 20 y más preferiólemente 17 20 y/o un derivado reticulado del mismo de acuerdo a como se descrióe anteriormente, oótenido u oótenióle por un método como se descrióe anteriormente De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, la composición como se descrióe anteriormente se caracteriza en que el ohgómero Aß(X- 38/43) gloóular no difundióle, de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) globular no difundióle ("gloóulómero"), es soluóle De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso de un oligómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, purificado o esencialmente purificado o altamente purificado, de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) gloóular no difundióle ("gloóulómeros"), con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiólemente 12 20 y más preferiólemente 17 20 y/o un derivado reticulado del mismo como se oótiene o es oótenióle por un método como se descrióe anteriormente para uso como una vacuna para la inmunización activa contra Enfermedad de Alzheimer (AD) de un paciente con necesidad de la misma De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso de un oligómero Aß(X-38/43) globular no difundióle, purificado, esencialmente purificado o altamente purificado, de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) gloóular no difundióle ("globulómeros"), con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiblemente 12 24, más preferiblemente 12 20 y más preferiblemente 17 20 y/o un derivado reticulado del mismo como se obtiene o es obtenible por un método como se describe anteriormente para la preparación de un aptámero específico contra Enfermedad de Alzheimer (AD) de un paciente con necesidad del mismo De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso de un oligómero Aß(X-38/43) globular no difundióle, purificado o esencialmente purificado o altamente purificado, de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) gloóular no difundióle ("gloóulómero"), con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiólemente 12 20 y más preferiblemente 17 20 y/o un derivado reticulado del mismo como se oótiene o es oótenióle por un método como se descrióe anteriormente para la preparación de un medicamento para la inmunización pasiva contra Enfermedad de Alzheimer (AD) de un paciente con necesidad del mismo De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso de un ohgómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, purificado o esencialmente purificado o altamente purificado, de preferencia el ohgómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) globular no difundible ("globulómeros"), con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiblemente 12 24, más preferiblemente 12 20 y más preferiblemente 17 20 y/o un derivado reticulado del mismo como se obtiene o es obtenible por un método como se describe anteriormente para la preparación de un anticuerpo monoclonal o pol iclona I , nativo o humano recombinante o animal o quimérico que tiene especificidad contra al menos un epítope de estructura de oligómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia el epitope de estructura del ohgómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) gloóular no difundióle ("gloóulómeros") y/o el derivado reticulado del mismo De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el uso como se descrióe anteriormente se caracteriza en que el oligómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) gloóular no difundióle ("gloóulómero"), es soluóle De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para la preparación de un anticuerpo monoclonal o policlonal, nativo o humano recomóinante, humanizado, animal o quimérico que tiene especificidad contra al menos un epítope de estructura del ohgómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia al menos un epítope de estructura del ohgómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) gloóular no difundióle ("gloóulómeros"), con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiólemente 12 20 y más preferiólemente 17 20 y/o un derivado reticulado del mismo caracterizado por las etapas de (i) poner en contacto un organismo que tiene un sistema inmune con un ohgómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia el oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) gloóular no difundióle ("gloóulómeros") y/o un derivado reticulado del mismo como se oótiene o es oótenióle por un método descrito anteriormente e (n) aislar el anticuerpo que tiene especificidad contra al menos un epítope de estructura del oligómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia contra al menos un epítope de estructura del oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) gloóular no difundióle ("gloóulómeros") y/o un derivado reticulado del mismo a partir del organismo e (ni) determinar opcionalmente la secuencia y/o estructura química del anticuerpo oótenido, o alternativamente, caracterizado por la etapa de aislar el anticuerpo que tiene especificidad contra al menos un epítope de estructura del oligómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia contra al menos un epítope de estructura del ohgómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) gloóular no difundióle ("gloóulomeros") y/o un derivado reticulado del mismo a partir de una célula o línea celular que produce un anticuerpo que tiene especificidad contra al menos un epítope de estructura de olígómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia contra el menos un epítope de estructura del oligómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) gloóular no difundióle ("gloóulómeros") y/o un derivado reticulado del mismo. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el método como se descrióe anteriormente se caracteriza en que el oligómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia el olígómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) gloóular no difundióle ("gloóulómero"), es soluóle. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente ¡nvención, se proporciona un anticuerpo monoclonal o policlonal, nativo o recomóinante, humanizado, humano, animal o quimérico que tiene especificidad contra al menos un epítope de estructura del oligómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia al menos un epítope de estructura del olígómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) gloóular no difundióle ("gloóulómeros"), con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 .. 24, de preferencia 8 .. 24, más preferíólemente 12 .. 24, más preferiólemente 12 .. 20 y más preferiólemente 17 .. 20 y/o un derivado reticulado del mismo como se oótiene o es oótenióle de acuerdo al método como se descrióe anteriormente para inmunización activa o pasiva contra enfermedad de Alzheimer (AD) en un paciente con necesidad del mismo. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el anticuerpo monoclonal o policlonal, nativo o recomóinante, humanizado, humano, animal o quimérico como se describe anteriormente, se caracteriza en que el oligómero Aß(X-38/43) globular no difundióle, de preferencia el ohgómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) gloóular no difundióle ("gloóulómero"), es soluóle De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, una composición que comprende un anticuerpo monoclonal o po I icio nal , nativo o recomóinante, humano, humanizado, animal o quimérico que tiene especificidad contra al menos un epítope de estructura del oligómero Aß(X-38/43) gloóular no difundióle, de preferencia al menos un epítope de estructura del ohgómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) gloóular no difundióle ("gloóulómeros"), con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiólemente 12 20 y más preferiólemente 17 20 y/o un derivado reticulado del mismo como se oótiene o es oótemble como se describe anteriormente para inmunización activa o pasiva contra enfermedad de Alzheimer (AD) en un paciente con necesidad de la misma De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, la composición como se describe anteriormente se caracteriza en que el oligómero Aß(X-38/43) globular no difundible, de preferencia el ohgómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) globular no difundible ("globulómero"), es soluble De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para diagnosticar positiva o negativamente un sujeto humano o animal no humano que tiene Enfermedad de Alzheimer (AD) o que tiene un nesgo incrementado para adquirir Enfermedad de Alzheimer, caracterizado por la etapa de determinar en una o más muestras representativas tomadas del paciente la presencia (diagnóstico positivo) o ausencia (diagnóstico negativo) de auto-anticuerpos que tienen especificidad contra al menos un epítope de estructura del ohgómero Aß(X-38/43) globular no difundible, de preferencia al menos un epítope de estructura del ohgómero Aß(X-42) y/o Aß(X-40) globular no difundible ("globulómeros"), con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiólemente 12 20 y más preferiólemente 17 20 y/o un derivado reticulado del mismo De acuerdo a una modalidad preferida de la presente invención, el método como se descrióe anteriormente se caracteriza porque la muestra se selecciona del grupo que consiste de una célula, un ensamóle celular, una muestra de tejido (célula) corporal, una muestra de líquido corporal y una muestra de tejido (célu I a)/l íq uido corporal, cada muestra se deriva de un cuerpo humano, no humano o animal transgénico De acuerdo a una modalidad preferida de la presente invención, el método como se descrióe anteriormente, se caracteriza porque el oltgómero Aß(X - 38/43) gloóular no difundióle, de preferencia el oligómero Aß(X - 42) y/o Aß(X - 40) gloóular no difundióle ("gloóulómero") es soluóle De acuerdo a un aspecto de la presente invención, se proporciona un uso de un anticuerpo humanizado, humano, animal o quimérico que tiene especificidad contra al menos un epítope de estructura de ohgómero Aß(X - 38/43) gloóular no difundióle, de preferencia al menos un epítope de estructura de oligómero Aß(X -42) y/o Aß(X - 40) gloóular no difundióle ("gloóulómeros"), con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 24, de preferencia 8 24, más preferiólemente 12 24, más preferiólemente 12 20 y más preferiólemente 17 20 y/o un derivado reticulado del mismo como un marcador de diagnóstico para determinar enfermedad de Alzheimer (AD) o un nesgo incrementado de adquirir enfermedad de Alzheimer en un paciente con necesidad del mismo De acuerdo a una modalidad preferida de la presente invención, el uso de un anticuerpo humanizado, humano, animal o quimérico que tiene especificidad contra al menos un epítope de estructura de oligómero Aß(X - 38/43) gloóular no difundióle, de preferencia al menos un epítope de estructura de ohgómero Aß(X -42) y/o Aß(X - 40) gloóular no difundióle ("gloóulómeros") como se descrióe anteriormente se caracteriza porque el oligómero Aß(X -38/43) gloóular no difundióle, de preferencia el oligómero Aß(X - 42) y/o Aß(X - 40) gloóular no difundióle, es soluóle De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso de uno o más fármacos que disminuyen el nivel de ácido graso en el cereóro de un paciente para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedad de Alzheimer o enfermedades relacionadas como Síndrome de Down en un paciente con necesidad de los mismos. De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un oligómero Aßx.y gloóular no difundióle, con X que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 1 .. 24, de preferencia 8 .. 24, más preferiólemente 12 .. 24, más preferiólemente 12 .. 20 y más preferiólemente 17 .. 20 e Y que se selecciona independientemente de su caso del grupo que consiste de los números 38 .. 43 y/o un derivado reticulado del mismo útil como un marcador de diagnóstico para determinar enfermedad de Alzheimer (AD) o un riesgo incrementado de adquirir enfermedad de Alzheímer en un paciente con necesidad del mismo. Junto con los usos de diagnóstico, la presente invención incluye un método para diagnosticar la enfermedad de Alzheímer en un paciente que se sospecha tiene esta enfermedad. Este método comprende las etapas de: a) aislar una muestra óiológica a partir del paciente; ó) poner en contacto la muestra óiológica con uno de los anticuerpos descritos anteriormente, durante un periodo y óajo condiciones suficientes para la formación de complejos de gloóulómero/anticuerpo; y c) detectar la presencia de los complejos de gloóulómero/anticuerpo en la muestra, la presencia de los complejos indican un diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en tal paciente. Un método adicional de la presente invención incluye un método para diagnosticar enfermedad de Alzheimer en un paciente que se sospecha tiene esta enfermedad que comprende las etapas de: a) aislar una muestra óiológica a partir del paciente; ó) poner en contacto la muestra óiológíca con un gloóulómero durante un periodo y óajo condiciones suficientes para la formación de complejos, de anticuerpo/gloóulómero; c) agregar un conjugado a los complejos de anticuerpo/gloóulómero resultantes durante un tiempo y óajo condiciones suficientes para permitir al conjugado enlazarse al anticuerpo enlazado, en donde el conjugado comprende un anticuerpo unido a una señal que genera un compuesto capaz de generar una señal detectaóle; y d) detectar la presencia de anticuerpos los cuales pueden presentarse en la muestra óiológica detectando una señal generada por el compuesto que genera señales, la señal indica un diagnóstico de enfermedad de Alzheimer en el paciente. La presente invención incluye un método adicional para diagnosticar enfermedad de Alzheimer en un paciente que se sospecha tiene enfermedad de Alzheimer que comprende las etapas de: a) aislar una muestra óiológica a partir del paciente; ó) poner en contacto la muestra óiológica con el gloóulómero descrito anteriormente durante un periodo y óajo condiciones suficientes para la formación de complejos de anticuerpo/gloóulómero purificado; y c) detectar la presencia de los complejos de anticuerpo/gloóulómero purificado en la muestra, la presencia de los complejos indican un diagnóstico de enfermedad de Alzheimer en el paciente.

Además, la presente invención incluye otro método para diagnostica enfermedad de Alzheimer en un paciente que se sospecha tiene enfermedad de Alzheimer que comprende las etapas de: a) aislar una muestra óiológica a partir del paciente; poner en contacto la muestra óiológíca con un anticuerpo específico para anticuerpos en la muestra durante un periodo y óajo condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de anti-anticuerpo/antícuerpo; ó) agregar un conjugado a los complejos de anti-antícuerpo/anticuerpo resultantes durante un periodo y óajo condiciones suficientes para permitir al conjugado enlazarse al anticuerpo enlazado, en donde el conjugado comprende un gloóulómero unido a un compuesto que genera señales capaz de generar una señal detectaóle; y c) detectar una señal generada por el compuesto que genera señales, la señal indica un diagnóstico de enfermedad de Alzheimer en el paciente. Adicionalmente, la presente invención incluye un método para identificar compuestos para el tratamiento o prevención de enfermedad de Alzheimer. Este método comprende las etapas de: a) exponer uno o más compuestos de interés al gloóulómero purificado descrito anteriormente durante un periodo y óajo condiciones suficientes para que uno o más compuestos se enlacen a o neutralicen el gloóulómero purificado; y ó) identificar aquellos compuestos los cuales se enlazan a o neutralizan el gloóulómero purificado; los compuestos identificados se utilizan en el tratamiento o prevención de la enfermedad de Alzheimer.

Además, la presente invención incluye un método para diseñar una molécula pequeña útil para el tratamiento o prevención de enfermedad de Alzheimer en un paciente. Este método comprende las etapas de: a) analizar la estructura tridimensional de una proteína tal como el gloóulómero purificado descrito anteriormente, la composición de proteína óeta-amiloide aislada descrita anteriormente, o un ensamble de las composiciones de proteína óeta-amiloide aislada; ó) aislar uno o más epítopes de la superficie de la proteína seleccionada de la etapa a); y c) diseñar una molécula pequeña la cual se enlazará al epítope o epítopes identificados de la etapa ó) la molécula pequeña se utiliza en el tratamiento o prevención de la enfermedad de Alzheimer. La presente invención tamóién incluye un método para identificar un anticuerpo monoclonal que se utiliza en el tratamiento o prevención de enfermedad de Alzheimer. Este método comprende las etapas de: a) exponer el gloóulómero purificado descrito anteriormente a una óiólíoteca de anticuerpos monoclonales durante un periodo y óajo condiciones suficientes para enlazarse a uno o más de los anticuerpos monoclonales al gloóulómero y la formación de complejos de gloóulómero/anticuerpo; ó) identificar la presencia de los complejos de gloóulómero/anticuerpo; y c) determinar la identidad de uno o más anticuerpos dentro de los complejos, uno o más anticuerpos se utilizan en el tratamiento o la prevención de enfermedad de Alzheímer. Adicionalmente, deóe oóservarse que los gloóulómeros de la presente invención (así como anticuerpos dirigidos a los mismos), pueden utilizarse en una variedad de ensayos de diagnóstico En una modalidad de la presente invención, el gloóulómero, o una porción del mismo, se recuóre en una fase sólida (o se presenta en una fase líquida) La prueóa o muestra óiológica (por ejemplo, sangre completa, fluido cereóroespinal, suero, etc ) se pone en contacto entonces con la fase sólida Si los anticuerpos se presentan en la muestra, tales anticuerpos se enlazan al antígeno en la fase sólida y luego se detectan por cualquier método directo o indirecto El método directo comprende simplemente detectar la presencia del complejo mismo y de este modo la presencia de los anticuerpos En el método indirecto, un conjugado se agrega al anticuerpo enlazado El conjugado comprende un segundo anticuerpo, el cual se enlaza al primer anticuerpo enlazado, unido a un compuesto que genera señales o etiqueta Deóe el segundo anticuerpo unirse a un primer anticuerpo enlazado, el compuesto que genera señales genera una señal medióle Tal señal indica entonces la presencia del primer anticuerpo en la muestra de prueóa Ejemplos de fases sólidas utilizados en inmunoensayos de diagnóstico son materiales porosos y no porosos, partículas de látex, partículas magnéticas, micropartículas (véase por ejemplo, Patente de E U A No 5,705,330), perlas, memóranas, pozos microtituladores y tuóos de plástico La elección del material de fase sólida y el método para etiquetar el antígeno o anticuerpo presente en el conjugado, si se desea, se determinan con óase en las características de rendimiento de formato de ensayo deseado Como se oóservó anteriormente, el conjugado (o reactivo indicador) comprenderá un anticuerpo (o quizas un anti-anticuerpo, dependiendo del ensayo), unido a un compuesto que genera señales o etiqueta Este compuesto que genera señales o "etiqueta" es por sí mismo detectaóle o puede hacerse reaccionar con uno o más compuestos adicionales que generan un producto detectable Ejemplos de compuestos que general señales incluyen cromógenos, radioisótopos (por ejemplo, 1251, 1311, 32P, 3H, 35S y 14C), compuestos quimioluminiscentes (por ejemplo, acpdinio), partículas (visibles o fluorescentes), ácidos nucleicos, agentes que forman complejos, o catalizadores tales como enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina, fosfatasa acídica, peroxidasa de rábano, beta-galactosidasa y ribonucleasa) En el caso del uso de enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano), la adición de un sustrato cromo, fluro o lumogénico resulta en la generación de una señal detectable Otros sistemas de detección tales como fluorescencia de resolución de tiempo, fluorescencia de reflexión interna, amplificación (por ejemplo, reacción de cadena de polimerasa) y espectroscopia Raman son también útiles Ejemplos de fluidos biológicos los cuales pueden probarse por los inmunoensayos anteriores incluyen plasma, sangre completa, sangre completa seca, suero, fluido cerebroespinal o extractos acuosos o de órgano acuosos de tejidos y células En otra modalidad de la presente invención, la muestra de prueba puede exponerse a una fase sólida (o fase líquida) recubierta con anticuerpos específicos de la presente invención (por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanos o humanizados, anticuerpos pohclonales, etc ) Los globulómeros como se describen anteriormente, y si se presentan en la muestra, se enlazan a la fase sólida y pueden entonces detectarse por un método directo o indirecto como se describe anteriormente Más específicamente, el método indirecto implica la adición de un conjugado que comprende un segundo anticuerpo (el cual se enlaza al antígeno enlazado) unido a una etiqueta o un compuesto que genera señales Cuando el segundo anticuerpo se enlaza al antígeno enlazado, una señal detectable se genera entonces indicando la presencia de una proteína de Alzheimer tal como un globulómero o una porción del mismo, en la muestra de prueba La presente invención abarca también un tercer método para detectar la presencia de anticuerpos en una muestra de prueba Este método comprende las etapas de (a) poner en contacto la muestra de prueba sospechosa de contener los anticuerpos con anti-anticuerpo específico para el antígeno (por ejemplo, globulómero o porción del mismo), durante un periodo y condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de anti-anticuerpo/antígeno, (b) agregar antígeno a los complejos de anti-anticuerpo/antígeno resultantes durante un tiempo y condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de anti-anticuerpo/antígeno, el antígeno comprendiendo un globulómero o porción del mismo, como se define auqí; y (c) agregar un conjugado a los complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo/antígeno resultantes, el conjugado comprende una composición que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal unido a un compuesto que genera señales capaces de detectar una señal detectable, el anticuerpo monoclonal o policlonal se dirige contra el antígeno; y (d) detectar la presencia de los anticuerpos los cuales pueden presentarse en la muestra de prueba al detectar la señal generada por el compuesto que genera señales. Puede utilizarse un control o calibrador el cual comprende el anticuerpo al anti-anticuerpo. La mezcla de antígeno puede comprender además P30, si desea. Se incluyen también equipos dentro del alcance de la presente invención. Más específicamente, la presente invención incluye equipos para determinar la presencia de anticuerpos en un paciente. En particular, un equipo para determinar la presencia de anticuerpos en una muestra de prueba comprende a) un antígeno como se define en la presente (por ejemplo, globulómero o porción del mismo; y b) un conjugado que comprende un anticuerpo unido a un compuesto que genera señales capaces de generar una señal detectable. El equipo puede contener también un control o calibrador el cual comprende un reactivo el cual se enlaza al antígeno. La presente invención también incluye otro tipo de equipo para detectar anticuerpos en al una muestra de prueóa. El equipo puede comprender a) un anti-anticuerpo específico para el anticuerpo de interés, y ó) un antígeno o porción del mismo como se define anteriormente. Un control o caliórador que comprende un reactivo el cual se enlaza al antígeno puede incluirse tamóién. Más específicamente, el equipo puede comprender a) un anti-anticuerpo específico para el anticuerpo y ó) un conjugado que comprende el antígeno, el conjugado se une a un compuesto que genera señales capaces de generar una señal detectaóle. Nuevamente, el equipo puede tamóién comprender un control o caliórador que comprende un reactivo el cual se enlaza al antígeno. El equipo puede tamóién comprende un recipiente tal como un frasco, óotella o óanda, con cada recipiente con una fase sólida predeterminada, y otros recipientes que contienen los conjugados respectivos. Estos equipos pueden contener tamóién frascos o recipientes de otros reactivos necesarios para realizar el ensayo, tal como lavado, procesamiento y reactivos indicadores. La invención se ¡lustrará ahora además por los ejemplos suósecuentes, los cuales no van a interpretarse como limitantes en ningún aspecto.

Ejemplos Eiemplo 1 : Preparación de monómeros propensos a fibrillas Se disolvió 1 mg del polvo sólido Aß(1-42), químicamente sintetizado por Bachem (Bachem, Weil am Rhein, Germany), No. de Cat. H-1368, en 0.5 ml de 0.1% de NH4OH en agua (recientemente preparada) y se agitó durante 30 segundos a temperatura amóiente para oótener una solución transparente con una concentración de 2 mg/ml. Se diluyó la preparación Aß(1-42) resultante con 1.5 ml de 20 mM de NaH2PO , 140 mM de NaCI, pH 7.4 a una concentración de proteína final de 0.5 mg/ml. El pH de esta preparación de monómero propensa a fibrilla Aß(1-42) se ajustó con 5% de ácido clorhídrico a pH 7.4, y luego la preparación se colocó en baño de hielo para uso inmediato. Todas las etapas se realizaron rápidamente para evitar el inicio de la polimerización de Aß(1-42) durante la preparación. Se encontró que la máxima estabilidad de los monómeros es 1 hora a 4°C o 15 minutos a temperatura ambiente. Alternativamente, podrían congelarse muestras inmediatamente a -80°C y se almacenó a -80°C durante un máximo de 1-2 semanas. Incluso en esta temperatura extremadamente baja, el proceso de polimerización de Aß protof i brilla y fibrilla inició, haciendo inusable la preparación si se almacena por más de dos semanas.

Eiemplo 2: Estabilidad de globulómeros Aß(1-42) y monómeros propensos a fibrillas Se preparó una solución de globulómeros Aß(1-42) como se describe en el Ejemplo 5a de WO2004/067561. Brevemente, el péptido sintético Aß(1-42) (No. de Cat. H-1368, Bachem, Switzerland) se suspendió en 1 ,1 ,1 ,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) a - 6 mg/ml y se incubó para solubílización completa bajo agitación a 37°C durante 1.5 horas. El HFIP se removió por evaporación en un SpeedVac y el Aß(1-42) se volvió a suspender en una concentración de 5 mM de sulfóxido de dimetilo (DMSO) y 20 segundos se sometió a sonicacíón. El Aß (1-42) pretratado con HFIP se diluyó en solución regulada en su pH con fosfato (PBS) (20 mM de NaH2PO4, se agregó 140 mM de NaCI, pH 7.4) a 400 µM y 1/10 de volumen de 2% de SDS (en H2O) (concentración final de 0.2% de dodecilsulfato de sodio (SDS)). Una incuóación durante 6 horas a 37°C resultó en el gloóulómero Aß(1-42) de 16/20 kDa intermedio. Se generó el gloóulómero Aß(1-42) de 38/48 kDa por una dilución adicional con tres volúmenes de H2O y la incuóación durante 18 horas a 37°C. Después de la centrifugación a 3,000 x g durante 20 minutos, la muestra se concentró por ultrafiltración (separación de 30 kDa), se dializó con 5 mM de NaH2PO4, 35 mM de NaCI, pH 7.4, se centrifugó a 10,000 xg durante 10 minutos y el soórenadante que contiene el gloóulómero Aß(1-42) de 38/48 kDa se retira. Para el gloóulómero Aß(1-42) de 38/48 kDa inducido por ácido graso, el SDS se reemplazó por la adición de 1/10 volúmenes de 0.5% de ácido graso. Para reticular el gloóulómero Aß(1-42) de 38/48 kDa, se trató antes de la concentración y diálisis con 1 mM de glutardialdehído durante 2 horas a TA seguido por tratamiento con etanolamina (5 mM) durante 30 minutos a temperatura amóiente (TA). La proteólisís limitada del gloóulómero Aß(1-42) de 38/48 kDa se realizó utilizando 1/50 (mg/mg) de la proteasa respectiva y la ¡ncuóación durante 20 horas a TA, produjo la forma truncada correspondiente. Se evaluó la concentración como sigue: En la óase de su peso molecular expepmentalmente determinado, el gloóulómero Aß(1-42) se aproximó para consistir de -12 monómeros Las concentraciones indicadas estaólecidas son por lo tanto aproximaciones tamóién Por ejemplo, una concentración de gloóulómero Aß(1-42) indicada de 42 nM sería equivalente a 500 nM de concentración de gloóulómero Aß(1-42) óasada en el monómero La muestra a 0 5 mg/ml en 20 mM de NaH2PO4, 140 mM de NaCI, pH 74, se incuóó a temperatura amóiente y 37°C durante 1 día y 4 días, respectivamente Una alícuota de 10 µl de las muestras se analizó por SDS-PAGE Se disolvió Aß(1-42) (Bachem, síntesis de péptido) en 2 mg/ml en 0 1% de NH OH y se diluyó en 1 4 en agua (0 5 mg/ml) como se descrióe en el Ejemplo 1 Se incuóó la preparación propensa a fibrillas Aß(1-42) durante 24 horas en cada una de las siguientes temperaturas -20°C, 0°C, temperatura ambiente (que corresponde aproximadamente 20-22°C) y 37°C Una alícuota de 10 µl de cada una de las muestras se analizó por SDS-PAGE Se muestran los resultados en la Figura 2 Se encontró que los globulómeros Aß(1-42) son estables durante al menos 4 días en PBS tanto a temperatura ambiente como a 37°C, mientras que los monómeros Aß(1-42) exhióen polimerización marcada a agregados mega-Dalton incluso después de 1 día a 0°C, la polimerización extensiva 1 día a temperatura amóiente y la polimerización virtualmente completa después de 1 día a 37°C en PBS Eiemplo 3 : Demostración de los epítopes del globulómero Aß(1-42) in vivo utilizando los anticuerpos específicos de la invención. Fue posible detectar epítopes del globulómero Aß(1-42) en placas amiloideas en los cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer (véase la Figura 13a-c) y de ratones Tg2576 transgénicos APP (véase la Figura 13d-f). La mayoría de la inmunofluorescencia se asocia con placas positivas de tioflavina S (véase Figura 13a, d) en donde los epítopes del gloóulómero Aß(1-42) formaron un óorde denso alrededor de las placas (véase Figura 13 c, f). La cuantíficación de la cantidad relativa de los epítopes del gloóulómero Aß(1-42) fue posióle para la fracción soluóle de PBS de extractos de cereóro. Tanto en pacientes con enfermedad de Alzheimer (véase la Figura 13g) como ratones Tg2576 (véase la Figura 13h), sólo pequeñas cantidades de Aß total se extinguieron para ser la estructura de epítope del gloóulómero Aß(1-42). Se detectaron epítopes del gloóulómero Aß(1-42) no sólo en placas, sino tamóién en los cereóros de ratones Tg2576 de 2.5 meses de edad los cuales tienen todavía una concentración de Aß(1-42) total óaja. Esto está óien antes del desarrollo de placas amiloideas e incrementa fuertemente los niveles de Aß(1-42) totales empezando en una edad de 11 meses (véase la Figura 13i), indicando que la formación de epítope del gloóulómero es frecuente incluso en concentraciones de Aß(1-42) comparativamente óajas. Sorprendentemente, no se detectaron epítopes del gloóulómero Aß(1-42) en el fluido cereóroespinal de pacientes con deterioro cognoscitivo moderado (véase la Figura 13j óarras grises) o con enfermedad de Alzheimer (véase la Figura 13j, óarras negras). Sin emóargo, este hallazgo negativo puede deóerse a concentraciones de epítopes del gloóulómero Aß(1-42) deóajo del límite de detección, ya que es una característica distintiva de gloóulómeros que se enlazan a estructuras neurales rápida y fácilmente y se espera así que sean cuantitativamente claros a partir del fluido cereóroespinal por consiguiente. Se hizo la detección utilizando los siguientes materiales y métodos. 3.1 Extracción y detección de epítopes del globulómero Aß en tejido cerebral humano con AD post mortem. 3.1. A. Lista de Reactivos: - Regulador de pH de extracción: 5 mM de NaH2PO ; 35 mM de NaCI; pH 7.4. - Taóletas de Cóctel Inhióidor de Proteasa Completa; Roche Diagnostics GMBH No. de Cat.: 697498; almacenadas a 4°C. - Extracción-regulador de pH + cóctel inhióidor completo: Se disuelve 1 taóleta de cóctel inhióidor completo en 1 ml de agua. Se agrega una solución del cóctel inhibidor completo 1/100 a la Regulador de pH de extracción. 3.1.B. Procedimiento para extracción de una etapa a partir de cerebro con AD humano Se proporcionaron muestras de tejido cereóral con AD humano y control equilióradas con la edad post mortem congeladas a -80°C por Brain-Net, Munich. Se agregaron el regulador de pH de extracción y el cóctel de inhióidor completo a 1 g de material de tejido cereóral congelado en un tuóo falcon de 50 ml. La muestra de homogeneizó en hielo por un homogeneizador UltraTurax durante 2 minutos y la muestra homogenizada se llenó en un tuóo de ultracentrifugación y se centrifugó a 8°C a 150O00 g durante 1 hora. El soórenadante se recolectó cuidadosamente y se almacenó en un tuóo Falcon de 15 ml a -18°C para prueóa ELISA adicional como se descrióe posteriormente. 3.1.C. ELISA de doble plano: como se descrióe en 3.2.B. 3.2. Extracción y detección de epítopes del globulómero Aß en tejido cerebral de ratones TG 2576 transgénicos de Aß que sobreproducen Aß 3.2. A. Procedimiento de extracción (reactivos requeridos como se describe en 3.1.A): Varios ratones Tg2576 hembras de 3 meses los cuales portan y sobreexpresan el gen APP humano con la mutación doble Swedich (K670N; M671L) de enfermedad de Alzheimer familiar se adquirieron de Taconics (USA) y se mantuvieron en nuestra instalación para el cuidado de animales hasta una edad de 12 meses. 100 mg de corteza congelada a partir de ratones TG2576 que sobreexpresan APP (Taconics Inc.) o 3 ratones de tipo silvestre C57 de 3 meses se enjuagaron con 2.5 ml de PBST + 0.5% de BSA-regulador de pH-cóctel inhibidor completo (10 mg/0.25 ml de peso húmedo). Las muestras se pre-homogenizaron en un crisol de vidrio y se sometió a sonicación en un baño con hielo a 0°C durante 5 minutos de 1-2 segundos con un interruptor celular ultrasónico, 2 ml de alícuotas de muestras se incubaron en un tubo de ultracentrifugación durante 16 horas a 37°C durante la noche y se centrifugaron a 8°C durante 1 hora a 100O00 g. El sobrenadante se removió cuidadosamente y se almacenó a -20°C para análisis ELISA. 3.2.B. Elisa de Doble Plano: 3.2.B.1. Lista de Reactivos: 1. F96 Cert. Maxisorp Inmunoplaca NUNC Cat. No. 439454 2. Anticuerpo de captura afinidad purificada 5598 de conejo anti-Aß pAb (procedimiento purificado Labj. : 1286/155); solución en PBS; conc.: 0.24 mg/ml; almacenada a -20°C 3. Reguldor de pH de recubrimiento 100 mM de carbonato de ácido de sodio; pH 9.6 4. Reactivo de Bloque para Elisa; Roche Díagnostics GmbH No. Cat.: 1112589 5. Reguldor de pH de PBST 20 mM de NaH2PO4; 140 mM de NaCI; 0.05% de Tween 20; pH 7.4 6. fracción V de albúmina de bovino, libre de proteasa; Serva Cat. No.: 11926.03; almacenada a 4°C. 7. PBST + 0.5% de regulador de pH de BSA; 20 mM de NaH2PO4; 140 mM de NaCI; 0.05% de Tween 20; pH 7.4 + 0.5% de BSA 8. Solución madre estándar de oligómero Aß(1 . 42); solución en 5 mM de NaH2PO4; 35 mM de NaCI; pH 7.4; conc.: 10.77 mg/ml; almacenada a -20°C 9. clon 6B1 mAb de ratón anti-Aß; Fa. Jackson ImmunoRearch Cat. No.: 715-035-150; 10. Conjugado anti-ratón-POD; Fa. Jackson ImmunoResearch Cat. No.: 715-035-150; 11. Desarrollo: TMB: Roche Diagnostics GmBH Cat. No.: 92817060; 42 mM en DMSO 3% de H2O2 en agua 100 mM de acetato de sodio, pH 4.9 12. Solución Tope 3.2.B.2. Preparación de reactivos: 1. Anticuerpo de captura: Se obtuvo el anticuerpo 5598 globulómero anti Aß(20-42) policlonal de conejo al inmunizar conejos de acuerdo al procedimiento descrito en el Ejemplo 25 de 5598 se inmunopuríficó a partir de este antisuero de conejo por cromatografía de afinidad en globulómero Aß(1-42) inmovilizado con Sefarosa. - Preparación de Sefarosa del globulómero Aß(1-42): Preparación del globulómero Aß(1-42): se disolvieron 9 mg de Aß(1-42) Fa. Bachem en 1.5 ml de HFIP (1 , 1 , 1 ,3,3,3-hexafluoro-2-fluoropropanol) y se incubaron durante 1.5 horas a 37°C. La solución se evaporó en un SpeedVac y se suspendió en 396 µl de DMSO (5 mM de solución madre Aß). La muestra se sometió a sonicacíón durante 20 segundos en un baño de agua sónico, se agitó durante 10 minutos y se almacenó durante la noche a -20°C. La muestra se diluyó con 4554 µl de PBS (20 mM de NaH PO4; 140 mM de NaCI; pH 7.4) y se agregaron 495 µl de 2% de solución de SDS acuosa (0.2% de contenido de SDS). La mezcla se incubó durante 7 horas a 37°C, se diluyó con 16335 µl de H2O y se incubó además durante 16 horas a 37°C. Después de que la solución de globulómero de Aß(1-42) se centrifugó durante 20 minutos a 3000 g. El sobrenadante de globulómero Aß(1-42) final se desechó el cual se utilizó para inmovilización. Preparación de Sefarosa activada con NHS: 2.0 g de Sefarosa Fast Flor activada con NHS, Amersham Biosciences, Cat. No.: 17-0906-01 se lavaron subscuentemente con 2 x 25 ml de 30% de isopropanol en 1 mM de HCl (enfriado en hielo); 2 x 25 ml de 1 mM de Hcl (enfriado en hielo); y finalmente 2 x 25 ml de 50 mM de NaHCO3 pH 7.5 (enfriado en hielo). Inmoviilzación: se mezclaron 10 ml de solución de globulómero Aß(1-42) con 2.0 g de Sefarosa activada con NHS y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se centrifugó a 4000 g y el sobrenadante se desechó. Bloqueo: La resina se incubó después de agregar 10 ml de 50 mM de NaHCO3: 250 mM de etanolamina; 0.05% de SDS, pH 7.5 durante 1 hora a TA. El material de Sefarosa se recolectó por filtración y se lavó 4 x con 25 ml de 5 mM de NaH2PO4; 35 mM de NaCI; 0.05% de SDS; pH 7.4. Reticulación: El material de Sefarosa se volvió a suspender con 10 ml de NaH2PO4; 35 mM de NaCI; 0.05% de SDS; pH 7.4 y se mezcló con 1 ml de 40 mM de solución de glutaraldehído en agua (recién preparada). Después de la incubación (2 horas, a temperatura ambiente) y centrifugación (10 minutos, 4000 g) el sobrenadante se desechó y la Sefarosa se trató con 10 ml de 5 mM de NaH2PO4; 35 mM de NaCI; 250 mM de etanolamina; 0.05% de SDS; pH 7.4 durante 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla se centrifugó a 4000 g, durante 10 minutos y el sobrenadante se desechó. Se repitió la reacción de bloqueo de etanolamina y finalmente el material de Sefarosa se recolectó por filtración y se lavó 4 x con 25 ml de 5 mM de NaH2PO4; 35 mM de NaCI; 0.05% de SDS; pH 7.4. Se agregó el material de Sefarosa de globulómero Aß(1-42) final con 4.0 ml de 5 mM de NaH2PO4; 35 mM de NaCI; 0.055 de SDS; O 02% de NaN3, pH 74 y se almacenó a 4°C en un refrigerador (05 de Sefarosa /ml) para cromatografía de afinidad adicional - Cromatografía de afinidad Se recolecto el material de Sefarosa de globulómero Aß(1-42) se recolectó por filtración y se lavó 4 veces con 10 ml de regulador de pH TBS (25 mM de Tris, 150 mM de NaCI, pH 7 5) Se diluyó suero de 5598 de conejo (1 1) con regulador de pH de TBS 40 ml de esta muestra se agregó a 0 8 g de Sefarosa de globulómero Aß(1-42) y se incubó a 8°C durante la noche Sefarosa Aß(1-42) se llenó entonces en una columna y se lavó con 25 ml de regulador de pH TBS La elusión se hizo con 0 58% de ácido acético en 140 mM de NaCI y se recolectó la fracción activa con UV eluida La fracción eluida (solución madre Pab 5598 inmunopupficada) se ajustó inmediatamente a pH 7 5 al agregar 2 mM de regulador de pH Tris, pH 7 5, y se almacenó a -80°C - Preparación de solución de anticuerpo La solución madre 5598 PAó se descongeló y se diluyó 1 240 en regulador de pH de recuópmiento 2 Reactivo de óloqueo Se disuelve el reactivo de óloqueo en 100 ml de agua para preparar la solución madre de óloqueo y se almacena en alícuotas de 10 ml a -20°C Se diluye 3 ml de solución madre de óloqueo con 27 ml de agua para óloquear cada placa 3. dilución estándar del gloóulómero Aß(1-42): A- Agregar 1 µl de la solución madre estándar del gloóulómero Aß(1 42) de 1076 µl de PBST + 0.5% de BSA = 10 µg/ml B- Agregar 5 µl de 10 µg/ml de solución estándar de gloóulómero Aß(1-42) a 4995 µl de PBST + 0.5% de BSA = 10 ng/ml Curva Estándar: No. Solución Madre PBST + 0.5% BSA Conc. final 1 2 ml B 0 ml 10000 pg/ml 2 0.633 ml (D 1.367 ml 3160 pg/ml 3 0.633 ml (2) 1.367 ml 1000 pg/ml 4 0.633 ml (3) 1.367 ml 316 pg/ml 5 0.633 ml (4) 1.367 ml 100 pg/ml 6 0.633 ml (5) 1.367 ml 3.16 pg/ml 7 0.633 ml (6) 1.367 ml 10 pg/ml 8 0 ml 2 ml 0.0 pg/ml Muestras: No. Solución Madre PBST + 0.5% BSA factor de dilución 1 1 ml S 0 ml directamente 2 0.2 ml(1) 0.8 ml 1:5 4. Anticuerpo 6B1 Primario: Se oótuvo el anticuerpo 6B1 monoclonal de ratón por procedimientos estándares mediante inmunización con el gloóulómero Aß(1-42). El anticuerpo se purificó a partir del hióridoma utilizando procedimientos estándares. El clon 6B1 anti-ß mAó concentrado se diluyó en PBST + 0.5% de BSA-regulador de pH. El factor de dilución fue 1/6000 = 0.2 µg/ml. El anticuerpo se utilizó inmediatamente. 5. Reactivo de Etiqueta: Reconstituir el liofilizado conjugado anti-ratón-POD en 0.5 ml de agua. Agregar 500 µl a -20°C para uso adicional. Diluir el reactivo de etiqueta concentrado en regulador de pH de PBST. El factor de dilución es 1/5000. Usar inmediatamente. 6. Solución de TMB: Mezclar 20 ml de 100 mM de acetato de sodio pH 4.9 con 200 µl de la solución de TMB y 29.5 µl de solución peróxido al 3%. Usar inmediatamente. 3.2.B.3. Sistema de Placa de Muestra (Observe que todos los estándares y muestras se operan por duplicado) U1-U8 = Muestras desconocidas 3.2.B.4. Procedimiento 1 Aplicar 100 µl de solución 5598 de conejo anti-Aß pAb de conejo por pozo e incubar durante la noche a 4°C 2 Desechar la solución de anticuerpo y lavar los pozos con 250 µl de regulador de pH de PBST durante tres periodos 3 Agregar 300 µl de solución en bloque por pozo e incubar 2 horas a temperatura ambiente 4 Desechar la solución en bloque y lavar los pozos con 250 µl de regulador de pH de PBST durante tres periodos 5 Después de la preparación de estándares y muestras, aplicar 100 µl por pozo de estándares y muestras a la placa Incubar 2 horas a temperatura ambiente y durante la noche a 4°C 6 Desechar la solución estándar/de muestra y lavar los pozos con 250 µl de regulador de pH de PBST durante tres periodos 7 Agregar 200 µl de solución de anticuerpo primario por pozo e incubar 1 5 horas a temperatura ambiente 8 Desechar la solución de anticuerpo y lavar los pozos con 250 µ de regulador de pH de PBST durante tres periodos 9 Agregar 200 µl de solución de etiqueta por pozo e incubar 1 hora a temperatura ambiente 10 Desechar la solución de etiqueta y lavar los pozos con 250 µl de regulador de pH de PBST durante tres periodos 11 Agregar 100 µl de solución de TMB a cada pozo e incubaron a temperatura ambiente (5-15 minutos) 12 Observar el desarrollo de color y aplicar 50 µl de la solución de detención por pozo 13 Leer a 450 nm 14 Calcular los resultados a partir de la curva estándar 15 Evaluación Si las extinciones a partir de muestras desconocidas no están en el intervalo de hneapdad de la curva de calibración, repetir Elisa con dilución de muestra apropiada A partir de estos datos, se puede concluir que los epítopes del globulómero Aß(1-42) existen m vivo en una etapa muy temprana de enfermedad de Alzheimer, precediendo todas las manifestaciones clínicas Por lo tanto se debe asumir que pueden valuarse en detección temprana en evaluación de nesgo de AD y condiciones relacionadas Ejemplo 4: Generación y caracterización de oligómeros Aß(1-42) globulares La etapa inicial en el procedimiento de la generación del ohgómero Aß(1-42) sintético con HFIP con el fin de remover m-homogeneidades estructuras pre-existentes (Stine, W B , Jr , Dahgren, K N , Krafft, G A & LaDu, M J In vitro charactepzation of conditions for amyloid-beta peptide ohgomepzation and fibpllogenesis, J Biol Chem 278, 11612-11622 (2003)) Después de la resuspensión en incubación de DMSO en 0 25 de SDS se genera primero una forma de Aß ohgomépco intermedio con 16/20 kDa (masa aparente de las dos bandas en SDS-PAGE) En la dilución e incubación adicional este intermediario se auto-asocia a la forma Aß oligomépco de 38/48 kDa final, la cual se encontró que es de estructura globular y por lo tanto se refiere como ohgómero Aß(1-42) globular de 38/48 kDa o brevemente globulómero Aß(1-42) en lo siguiente (véase Figura 11b) La separación de los monómeros propensos a fibrillas residuales a partir de la fracción del globulómero puede lograrse por eliminación mediante cromatografía de afinidad utilizando anticuerpos específicos para monómero Aß(1-42) propenso a fibrillas enlazado a Proteína A inmovilizada, o mediante eliminación directa de anticuerpos (inmunoprecipitación o inmunosorción) de monómero Aß(1-42) propenso a fibrillas Estos métodos se describen en más detalle posteriormente La reticulación del glutardialdehído tanto del globulómero Aß(1-42) de 18/20 kDa intermedio como de 38/48 kDa final combinó las dos bandas en SDS-PAGE en una, indicando una estructura de globulómero Aß(1-42) uniforme Las interacciones de péptido Aß(1-42) que forman la estructura del globulómero Aß(1-42) son exclusivamente no covalentes La desnaturalización térmica revirtió el globulómero Aß(1-42), pero no el globulómero Aß(1-42) reticulado a Aß(1-42) No obstante, el globulómero Aß(1-42) no covalentemente unido exhibe estabilidad a largo plazo a temperatura fisiológica (37°C) La estructura de globulómero Aß(1-42) se mantiene por hasta 4 días m vitro sin desensamble obvio o polimerización adicional a fibrillas En contraste, una preparación monomérica estándar del péptido Aß(1-42) (Bachem, Switzerland) se disuelve en 0 1% de NH4OH (Aß(1-42)NH4OH prep ) muestra un grado elevado de agregación después de casi 1 día de incubación (véase la Figura 11c) Se analizaron las formas Aß con respecto a su distribución de peso molecular utilizando una columna Superóse 12 HR10/30 (Amersham Biosciences, Germany) y PBS (pH 74) como regulador de pH de funcionamiento La columna se calibró con un conjunto de proteínas estándares La masa de péptido Aß se determinó por SELDI-MS utilizando un trozo de proteína H4 (Ciphergen biosystems, USA) y ácido alfa-c?ano-4-h?drox?-c?nám?co en 50% de aceton?tr?lo/0 5% de ácido tpfluoroacético como matriz Bajo condiciones nativas (PBS, pH 7 4) la cromatografía de exclusión de tamaño del globulómero Aß(1-42) demostró un pico sencillo, aunque amplio a - 100 kDa (véase la Figura 11d) Similar a SDS-PAGE el globulómero Aß(1-42) reticulado demostró un peso molecular aparente reducido con un pico angosto a 60 kDa, sugiriendo que los globulómeros Aß(1-42) existen sólo en una forma en estado globular la cual condensa hasta la reticulación de glutardialdehído En contraste, la preparación de Aß(1-42) NH4OH fue ligeramente inestable y propensa a fibphzación Casi aproximadamente 5 minutos después de la resuspensión la agregación prominente fue detectaóle (pico mayor 11 kDa, pico menor 74 kDa) y después de 1 hora de incuóación la agregación pronunciada de fibrillas evitó Aß de entrar a la columna de cromatografía (datos no mostrados) La proteóhsis con proteasas promiscuas truncan el globulómero Aß(1-42) a partir del término N hacia delante hacia el amino ácido -20, dejando la parte C-terminal y la estructura globular intacta (véase la Figura 11e) Un análisis SELDI-MS de los productos de desdoblamiento de termolisina mostró que la reticulación del globulómero Aß(1-42) condujo a una pérdida del producto de desdoblamiento de Aß(20-42), mientras Aß(20-42) se mantuvo (véase Figura 11f) Por lo tanto, la reticulación afectó solamente el término N y Lys-16, pero no Lys-28, lo cual debe por lo tanto ocultarse en el interior del globulómero Aß(1-42) En lo siguiente, métodos adecuados para aclarar la solución del globulómero Aß(1-42) de monómero propensos a fibrillas residuales se describen Todo esto requiere los siguientes reactivos además de aquellos listados - Proteína A Sefarosa 4 Fast Flow Amersham Biosciences Cat No 17-0974-01 - Regulador de pH de PBS 20 mM de NaH2PO4 140 mM de NaCI, 0 05% de Pluronic F68, pH 74 4.1. Purificación de globulómeros Aß(1-42) al reducir las contaminaciones de monómeros propensos a fibrillas Aß(1-42) en preparaciones del globulómero Aß(1-42) mediante cromatografía de afinidad de anticuerpo específica de Aß(1-42) propensa a fibrillas enlazadas a Proteína A 4.1. A. Lista de reactivos: - Anticuerpo de captura ant?-Aß(1 -42) de conejo pAb, solución IgG biotmilado en PBS con 50% de ghcerol, conc 0 5 mg/ml, Signet Ca No 9135, almacenar a -80°C - solución madre estándar de ohgómero Aß(1-42), solución en 5 mM de NaH2PO4, 35 mM de NaCI, pH 7 4, conc 10 77 mg/ml, almacenado a -20°C 4.1.B. Preparación de reactivos: 1 Dilución de anticuerpos de captura Diluir el ant?-Aß(1 -42) concentrado pAb 1 5 en PBS a 0 1 mg/ml 2 La inmovilización de anticuerpos de captura en Proteína A- Sefarosa: Equilibrar 20 µl de Proteína A-Sefarosa con 200 µl de regulador de pH de PBS seguido por centrifugación durante 5 minutos a 30090 g y desechar el sobrenadante. Repetir el procedimiento 5 veces. Agregar 100 µl del anti-Aß(1 -42) pAb diluido 1:5 en PBS al granulo de Proteína A-Sefarosa y agitar durante 1 hora a temperatura ambiente. Centrifugar durante 5 minutos a 3000 g. Desechar el sobrenadante y lavar la Proteína A-Sefarosa tres veces con 200 µl de PBS seguido por centrifugación durante 5 minutos a 3000 g cada vez. Desechar sobrenadantes. 3. Dilución estándar de oligómero Ai.42. Agregar 50 µl de solución de solución madre estándar de oligómero Aß(1-42) a 450 µl de PBS = 1.08 mg/ml. 4.1.C. Procedimiento: Se agregan 500 µl de la dilución estándar de oligómero Aß(1- 42) a la resina anti-Aß(1 -42) pAb inmovilizada con Proteína A-Sefarosa de 20 µl. Se agita la muestra durante 2 horas a temperatura ambiente y 16 horas además a 4°C seguida por centrifugación durante 5 minutos a 3000 g. Los contaminantes propensos a fibrillas Aß (fíórilómeros) reaccionan con la matriz de afinidad y el soórenadante contiene el gloóulómero Aß purificado en una pureza >> 95% de epítope de gloóulómero. La pureza de esta muestra se mejora además al repetir el procedimiento dos veces lo cual produce pureza >99% de epítope de gloóulómero en los soórenadantes. 4.2. Purificación de los gloóulómeros Aß al reducir contaminantes de monómero propenso a fibrillas Aß(1-42) en preparaciones sin purificar Aß(1-42) mediante eliminación directa de Aß(1-42) propenso a fibrillas. 4.2. A. Lista de reactivos: - Inmuno Placa NUNC F96 Cert. Maxisorp Cat. No. 439454 - Anticuerpo de captura anti-Aß(1 -42) de conejo pAb; solución de IgG biotinilada en PBS con 50% de glicerol; conc.: 0.5 mg/ml; Signet Cat. No. 9135; almacenado a -80°C - Regulador de pH de recubrimiento: 100 mM de carbonato ácido de sodio; pH 9.6 - Reactivo de bloqueo para Elisa; Roche Diagnostícs GmbH Cat. No. 1112598 - Regulador de pH de PBST: 20 mM de NaH2PO4; 140 mM de NaCI; 0.05% de Tween 20; pH 7.4 - Solución madre Estándar de oligómero Aß(1-42); solución en 5 mM de NaH2PO4; 35 mM de NaCI; pH 7.4; Conc.: 10.77 mg/ml; almacenado a -20°C. 4.2. B Preparación de reactivos: 1. Anticuerpo de captura: Diluir el anti-Aß(1 -42)= pAb concentrado 1:100 en regulador de pH de recuórimíento. 2. Reactivo de óloqueo: Disolver el reactivo de óloqueo en 100 ml de agua para preparar la solución madre de óloqueo y almacenar alícuotas de 10 ml a -20°C. Diluir 3 ml de solución madre de óloqueo con 27 ml de agua para óloquear a cada placa. 3. Dilución estándar de gloóulómero Aß(1-42): Agregar 1 µl de la solución madre estándar del gloóulómero Aß(1-42) a 1076 µl de PBST = 10 µg/ml de la solución estándar del gloóulómero Aß(1-42). 4.2.C. Procedimiento: Aplicar 100 µl de solución Signet 9135 de clon antí-Aß(1 -42) mAó por pozo e ¡ncuóar durante la noche a 4°C. Desechar la solución de anticuerpo y lavar los pozos con 250 µl de regulador de pH de PBST tres veces. Agregar 300 µl de solución de óloque por pozo e incuóar 2 horas a temperatura ambiente. Desechar la solución de bloque y lavar los pozos con 250 µl de regulador de pH de PBST tres veces. Después de la preparación de la solución estándar, aplicar 100 µl a cada pozo de la solución estándar del globulómero Aß(1-42) a la placa. Incubar durante 2 horas a temperatura amóiente y durante la noche a 4°C. Recolectar la solución estándar del gloóulómero Aß(1-42) en un tuóo Falcon de 15 ml el cual ahora tiene una pureza de >95%. La pureza de epítope gloóular puede mejorarse además al repetir el procedimiento de ¡nmunoafinidad anterior en la placa microtituladora dos veces. Después de este procedimiento, la solución del gloóulómero Aß(1-42) es >>99% pura con respecto a las estructuras de tipo propenso a fibrillas de Aß (monómero y fibplómeros) 4.3. Enriquecimiento de epítopes del globulómero aß al reducir contaminaciones de monómero propenso a Aß fibrillas en preparaciones de ADDL de Aß(1-42) mediante cromatografía de afinidad de anticuerpo específica de Aß(1-42) propensa a fibrillas enlazada a Proteína A 4.3. A. Lista de reactivos: - Anticuerpo de captura ant?-Aß(1 -42) conejo pAb, solución de IgG biotin i lada en PBS con 50% de glicerol, conc 0 5 mg/ml, Signet Cat No 9135, almacenar a -80°C - solución madre estándar de ADDL Aß(1-42), solución en medio F12, conc O 12 mg/ml, almacenado a -80°C 4.3.B. Preparación de reactivos: 1 Equilibro de Proteína A-Sefarosa Equilibrar 20 µl de Proteína A-Sefarosa con 200 µl de regulador de pH de PBS seguido por 200 µl de 0 58% de ácido acético y lavar además con 200 µl de regulador de pH de PBS en una columna Colocar la Proteína A-Sefarosa equiliórada en un tuóo y agregar el regulador de pH de PBS del mismo volumen a la matriz 2 Dilución estándar de ADDL Aß(1-42) Agregar 42 µl de solución madre estándar de ADDL Aß(1-42) a 58 µl de PBS = 005 mg/ml 4.3.C. Procedimiento: 20 µl de anti-Aß(1 -42) de conejo pAó; se agrega la solución de IgG óiotinilada a 100 µl de solución de ADDL Aß(1-42). Agitar la muestra durante 2 horas a temperatura amóiente. Agregar 10 µl de suspensión de Proteína A-Sefarosa equiliórada en regulador de pH de PBS a la muestra y agitar durante 1 hora a temperatura amóiente seguida por centrifugación durante 5 minutos a 3000 g. Los contaminantes propensos a Aß fibrillas (fibrilómeros) reaccionan con la matriz de afinidad y el sobrenadante muestra una pureza de >>55% de epítope de globulómero. La pureza de esta muestra se mejora además al repetir el procedimiento dos veces el cual produjo pureza de >95% de epítope de globulómero en los sobrenadantes. 4.4. Enriquecimiento de epítopes de globulómero Aß al reducir contaminaciones de Aß propenso a fibrillas en preparaciones de ADDL mediante cromatografía de afinidad de anticuerpo específica a Aß(1-42) propensa a fibrillas enlazadas a Proteína A. 4.4. A. Lista de reactivos: - Anticuerpo de captura: clon BDI780 c-terminal anti-Aß(1-42) mAb; purificado, liofilizado; Bíodíseño Cat. No. Q67780M; almacenar a -20°C - solución madre estándar de ADDL's Aß(1-42); solución en medio F12; conc.: 0.12 mg/ml; almacenado a -80°C 4.4. B. Preparación de reactivos: 1. Equilibro de Proteína A-Sefarosa: Equilibrar 20 µl de Proteína A-Sefarosa con 200 µl de regulador de pH de PBS seguido pro 200 µl de 0.58% de ácido acético y lavar además con 200 µl de regulador de pH de PBST en una columna: Colocar la Proteína A-Sefarosa equilibrada en un tubo y agregar el regulador de pH de PBS del mismo volumen a la matriz. 2. Reconstitución del anticuerpo de captura: Reconstituir 100 µg del anticuerpo con 1 ml de agua a 0.1 mg/ml. 3. Dilución estándar de ADDL anti-Aß(1 -42): Agregar 42 µl de solución madre estándar de ADDL's Aß(1-42) a 58 µl de PBS = 0.05 mg/ml. 4.4.C. Procedimiento: 100 µl de anti-Aß(1 -42) de conejo pAb: se agrega la solución de IgG biotinilada a 100 µl de solución de ADDL Aß(1-42). Agitar la muestra durante 2 horas a temperatura ambiente. Agregar 10 µl de suspensión de Proteína A-Sefarosa equilíórada en regulador de pH de PBS a la muestra y agitar durante 1 hora a temperatura amóiente seguida por centrifugación durante 5 minutos a 3000 g. Los contaminantes propensos a fióríllas Aß (fíórilómeros) reaccionan con la matriz de afinidad y el soórenadante muestra una pureza de >>50% de epítope de gloóulómero. La pureza de esta muestra se mejora además al repetir el procedimiento dos veces, lo cual produce pureza de > 90% de epítope de gloóulómero en los sobrenadantes. 4.5. Enriquecimiento de epítopes del globulómero Aß al reducir contaminaciones de fibrílómeros Aß en preparación de Aß(1-42) de NH4OH mediante cromatografía de afinidad de anticuerpo específica de Aß(1-42) propensa a fibrillas enlazadas a Proteína A. 4.5. A. Lista de Reactivos: - Anticuerpo de captura anti-Aß(1 -42) de conejo pAb: solución de IgG biotínilada en PBS con 50% de glicerol; conc.: 0.5 mg ml; Signet Cat. No. 9135; almacenar a -80°C - solución madre estándar de NH4OH Aß(1-42); solución en 0.1% de NH4OH; conc.: 2 mg/ml; almacenar a -80°C 4.5.B. Preparación de Reactivos: 1. Equilibrio de Proteína A-Sefarosa: Equilibrar 20 µl de Proteína A-Sefarosa con 200 µl de regulador de pH de PBS seguido por 200 µl de 0.58% de ácido acético y lavar además con 200 µl de PBS- regulador de pH en una columna. Colocar la Proteína A-Sefarosa equilibrada en un tubo y agregar el regulador de pH de PBS del mismo volumen a la matriz. 2. Dilución Estándar de Aß(1-42) de NH4OH: Agregar 2.5 µl de solución madre estándar de ADDLs Aß(1- 42) a 97.5 µl de PBS = 0.05 mg/ml. 4.5.C. Procedimiento: Como se describe bajo 4.3.C, Eiemplo 5: Generación del globulómero Aß(1-42) a partir del péptido Aß(20-42) a) Preparación de la solución madre del globulómero Se disolvieron 0 5 mg de proteína ß-amiloide (20- 42) (hofihzada, Anaspec Ine , Nr 408/452-5055/33908) en 25 µl de 1 , 1 , 1 ,3,3,3-hexafluoro-2-propanol y se incubaron durante 1 hora, 37°C en un tubo Eppendorff seguido pro 10 minutos de centrifugación a 10','" g El sobrenadante se removió produciendo una solución madre de Aß(20-42) de 20 mg/ml (9 mM) la cual pudo almacenarse a -80°C b) Preparación del globulómero Aß(20-42) estable final Se mezclaron 4 µl de solución madre Aß(20-42) a partir del Ejemplo 5a) con 196 µl de 2 mM de fosfato de sodio, 14 mM de NaCI, pH 74 y 20 µl de 1% de solución de dodecilsulfato de sodio (SDS) seguida por 20 h de incubación a 6°C y finalmente centrifugación durante 10 minutos a 10O00 g El sobrenadante se recolectó como aproximadamente 180 µM de la preparación del globulómero Aß(20-42) y pudo almacenarse a -20°C La muestra se analizó por SDS-PAGE subsecuente (Figura 9) y el producto mostró hasta 32 kDa La purificación adicional puede lograrse por el método de purificación descrito en el Ejemplo 4 Eiemplo 6: Generación del globulómero Aß(12-42) a partir del péptido Aß(12-42). a) Preparación de la solución madre del globulómero Iniciar con 0.5 mg de proteína ß-amiloíde (12-42) (liofilizada, Anaspec Inc., Nr.: 408/452-5055/33907A), el procedimiento como se describe en el Ejemplo 5a) produjo una solución madre Aß(12-42) de 20 mg/ml (6.2 mM) la cual pudo almacenarse a -80°C. b) Preparación del globulómero Aß(12-42) estable final se procesaron 4 µl de la solución madre Aß(12-42) a partir del Ejemplo 6a) como se describe en el Ejemplo 5b) para producir aproximadamente 120 µM de la preparación del globulómero Aß(12-42) la cual pudo entonces almacenarse a -20°C. La muestra se analizó por SDS-PAGE subsecuente (Figura 10) y el producto mostró hasta aproximadamente 12 kDa en casi todo el rendimiento cuantitativo. El gloóulómero Aß(12-42) Ultrapure podría oótenerse por purificación adicional con el método descrito en el Ejemplo 4.

Eiemplo 7: Detección de auto-anticuerpo anti-globulómero en fluidos corporales humanos por transferencia de mancha o CSF Tratamiento de muestras de plasma o suero: a) Los títulos de la fracción lióre de auto-anticuerpos se midieron directamente a partir de suero o plasma. ó) Los títulos de los auto-anticuerpos totales se midieron por pre-tratamiento de muestras de plasma/suero como sigue: 100 µl de plasma/suero se mezclaron con 10 ml de 140 mM de NaCI + 0.58% de ácido acético y se ¡ncuóaron durante 20 minutos seguido por concentración con un Centriprep YM30 (Amjicon Inc.) a 1 ml. Luego, se evaluaron las muestras de plasma/suero para auto-anticuerpos anti-Aß. Para este fin, se hicieron series de dilución de las formas de Aß(1-42) individuales que varían de 100 pmoles/µl a 0.01 pmoles/µl en PBS suplementado con 0.2 mg/ml de BSA. 1 µl de cada muestra se tiñó soóre una memórana de nitrocelulosa. Para detección, se utilizaron muestras de plasma de ratón correspondientes (diluidas 1:400). La ¡nmunotínción se hizo utilizando IgG anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina y el reactivo de tinción NBT/BCIP.

Estándares Aß para transferencia de mancha: 1. Gloóulómero Aß(1-42) La preparación de los oligómeros Aß(1-42) (llamados gloóulómero Aß(1-42) en lo siguiente) se descríóe en WO2004/067561. 2. Monómero de Aß(1-42) Se disolvieron 3 mg de Aß(1-42) humano, (Bachem Inc.: Cat.

No. H-1368) en 0.5 ml de HFIP (suspensión de 6 mg/ml) en un tuóo Eppendorff de 1.7 ml y se agitó (termo mezclador Eppendorff, 1400 rpm) durante 1.5 horas a 37°C hasta que se oótuvo una solución transparente. La muestra se secó en un concentrador SpeedVac (1.5 horas) y se volvió a suspender en 13 2 µl de DMSO, agitado durante 10 segundos, seguido por sonificación (20 segundos) y agitación (por ejemplo, en el Thermo mezclador Eppendorff, 1400 rpm) durante 10 minutos, 6 ml de 20 mM de NaH2PO4, 140 mM de NaCI, 0 1% de Pluronic F68, pH 7 4 se agregaron y se agitaron durante 1 hora a temperatura amóiente La muestra se centrifugó durante 20 minutos a 3000 g El soórenadante se desechó y el precipitado se convirtió a solución en 0 6 ml de 20 mM de NaH2PO4 140 mM de NaCI, 1% de Pluronic F68, pH 74 34 ml de H2O se agregó y se agitó durante 1 hora a temperatura amóiente seguido por 20 minutos de centrifugación a 3000 g Ocho alícuotas de cada 0 5 ml del soórenadante se almacenaron a -20°C para uso adicional 3 Gloóulómero Aß(12-42) La preparación de los oligómeros Aß(1-42) (llamada gloóulómero Aß(1-42) en lo siguiente) se descrióe en WO2004/067561 4 Monómero Aß(12-42) Se preparó una solución de 5 mg/ml (Anaspec Ine ) en 0 1% de NaOH y se almacenó a -20°C 5 Gloóulómero Aß(17-42) Preparación del gloóulómero Aß(17-42) truncado, a partir de los oligómeros Aß(1-42), por desdoólamiento con tripsina 0 1 ml del gloóulómero Aß(1-42) (conc 12 5 mg/ml, preparación del gloóulómero Aß(1-42) se descrióe en WO 2004/067561), se mezclan con 24 ml de regulador de pH (20 mM de NaH2PO4, 140 mM de NaCI pH 7.4) y 125 µl de una solución de Tripsina 0.2 mg/ml (Roche Inc.) en 20 mM de NaH2PO4, 140 mM de NaCI pH 7.4. La mezcla de reacción se agita a TA durante 20 horas. Luego se agregan 25 µl de una solución de diísopropilfluorofosfato 100 mM en agua y la mezcla se ajusta además a un contenido de SDS de 0.03% con 80 µl de una solución de SDS de resistencia. La mezcla de reacción se concentra en aproximadamente 0.25 ml mediante un tuóo Centriprep de 10 kDa. El concentrado se mezcla con 0.625 ml de regulador de pH (20 mM de NaH2PO4, 140 mM de NaCI, pH 7.4) y se nuevo se concentra a 0.25 ml. 6. Monómero Aß(17-42) Se preparó una solución de 5 mg/ml (Anaspec Inc.) en 0.1% de NaOH y se almacenó a -20°C. 7. gloóulómero Aß(20-42) La preparación de los oligómeros Aß(20-42) (llamados gloóulómero Aß(20-42) en lo siguiente) se descrióe en WO2004/067561. 8. Monómero Aß(20-42) Se preparó una solución de 5 mg/ml (Anaspec Inc.) en 0.1% de NaOH y se almacenó a -20°C. 9. Monómero Aß(1- 40) Se suspendieron 1 mg de Aß(1-40) humano (Bachem Inc., cat.

No. H-1194) en 0.25 ml de HFIP (suspensión de 4 mg/ml) en un tuóo Eppendorff. El tuóo se agitó (por ejemplo, en Thermo mezclador Eppendorff, 1400 rpm) durante 1.5 horas a 37°C para conseguir una solución transparente y más adelante secar en un concentrador speed vac (1.5 h). La muestra se volvió a disolver en 46 µl de DMSO (solución de 21.7 mg/ml = 5 mM), se agitó durante 10 segundos y se sometió a sonicación suósecuentemente durante 20 segundos. Después de 10 minutos de agitación (por ejemplo, en Thermo mezclador Eppendorff, 1400 rpm) la muestra se almacena a -20°C para uso adicional. 10. Fibrillas Aß(1-42) Se disolvieron 1 mg de Aß(1-42) humano (Bachem Inc. Catálogo Nr.: H1-368) en 500 µl de NH4OH al 0.1% acuoso (tubo de Eppendorff) y la muestra se agitó durante 1 minuto a temperatura ambiente. Se neutralizó 100 µl de esta solución de Aß(1-42) recién preparada con 300 µl de 20 mM de NaH2PO4; 140 mM de NaCI, pH 7.4. El pH se ajustó a pH 7.4 con 1% de HCl. La muestra se incubó durante 24 horas a 37° y se centrifugó (10 minutos a 10O00 g). El sobrenadante se desechó y el granulo de fibrillas se volvió a suspender con 400 µl de 20 mM de NaH2PO4; 140 mM de NaCI, pH 7.4 al formar un vórtice durante 1 minuto. Transferencia de manchas de materiales: Aß-estándares Dilución serial de antígenos Aß en 20 mM de NaH2PO4, 140 mM de NaCI, pH 7.4 + 0.2 mg/ml de BSA 1) 100 pmoles/µl 2) 10 pmoles/µl 3) 1 pmoles/µl 4) O 1 pmoles/µl 5) 0 01 pmoles/µl Nitrocelulosa Medio de Transferencia de Mancha Trans, Membrana de Nitrocelulosa Pura (045 µm) = , Fa BIO-RAD AP-Anti-Ratón AQ330 (Fa Chemicon) Reactivo de Detección Tabletas de NBT/BCIP (Roche) Albúmina de Suero de Bovino (BSA) A-7888 (SIGMA) Reactivo de Bloqueo 5% de leche baja en grasa en TBS Soluciones de regulador de pH TBS 25 mM de Tps/HCI- regulador de pH, pH 7 5 + 150 mM de NaCI TTBS 25 mM de Tps/HCI- regulador de pH, pH 7 5 + 150 mM de NaCI + 0 05% de Tween 20 PBS + 0 2 mg/ml de BSA 20 mM de regulador de pH de NaH2PO4 pH 7 + 140 mM de NaCI + 0 2 mg/ml de BSA Solución I de Anticuerpo: Muestras de plasma de ratón a partir de un estudio de inmunización activa con el globulómero Aß(20-42) (1:400 diluido en 20 ml de 1% de leche baja en grasa en TBS) Solución II de Anticuerpo: Dilución 1 :5000 AP Anti-Ratón en 1% de leche baja en grasa en TBS Procedimiento de Transferencia de mancha 1) 1 µl de los diferentes estándares Aß (en sus 5 diluciones seriales) se mancharon sobre la membrana de nitrocelulosa en una distancia de aproximadamente 1 cm entre sí. 2) Se les permitió a las manchas Aß estándares secar en la membrana de nitrocelulosa en aire durante al menos 10 minutos a temperatura ambiente (TA) (= transferencia de mancha) 3) Bloqueo: La solución de bloqueo se desecha y la transferencia de mancha se incuba bajo agitación con 20 ml de TTBS durante 10 minutos a TA. 4) Lavado: La solución de bloqueo se desecha y la transferencia de mancha se incuba bajo agitación con 20 ml de TTBS durante 10 minutos a TA. 5) Solución I de Anticuerpo: El regulador de pH de lavado se desecha y la transferencia de mancha se incuba con solución I de anticuerpo durante la noche a TA. 6) Lavado: La solución I de anticuerpo se desecha y la transferencia de mancha se incuba bajo agitación con 20 ml de TTBS durante 10 minutos a TA. La solución de lavado se desecha y la transferencia de mancha se ¡ncuba bajo agitación con 20 ml de TTBS durante 10 minutos a TA. La solución de lavado se desecha y la transferencia de mancha se ¡ncuba bajo agitación con 20 ml de TBS durante 10 minutos a TA. 7) Solución II de Anticuerpo: El regulador de pH de lavado se desecha y la transferencia de mancha se incuba con solución II de anticuerpo durante 1 hora a TA. 8) Lavado: La solución II de anticuerpo se desecha y la transferencia de mancha se incuba bajo agitación con 20 ml de TTBS durante 10 minutos a TA. La solución de lavado se desecha y la transferencia de mancha se incuba bajo agitación con 20 ml de TTBS durante 10 minutos a TA. La solución de lavado se desecha y la transferencia de mancha se incuba bajo agitación con 20 ml de TBS durante 10 minutos a TA. 9) Desarrollo: La solución de lavado se desecha. Se disuelve 1 tableta de NTB/BCIP en 20 ml de H2O y la transferencia de mancha se ¡ncuba durante 5 minutos con esta solución. El desarrollo se detiene por lavado intensivo con H2O. 10) Análisis de densitómetro: Se hizo la evaluación cuantitativa utilizando un análisis de densitómetro (densitómetro BioRad y paquete de software Quantity one (BioRad) de la intensidad; para la evaluación en la Figura 24 se tomaron los valores de densidad refractiva 100 pMoles como lectura.

Los resultados se muestran en la Figura 24 a y b. Se concluye que el plasma de un paciente humano con enfermedad de Alzheimer contiene auto-anticuerpos los cuales son reactivos a globulómero Aß(12-42) y el globulómero Aß(20-42), y que el CSF de un paciente humano con enfermedad de Alzheimer contiene auto-anticuerpos los cuales son reactivos al globulómero Aß(12-42) y el globulómero Aß(20-42). Estos resultados demuestran la factibilidad para probar la existencia de globulómeros, los cuales por sí mismos son difíciles de detectar debido a su alta afinidad a sus objetivos, en fluidos corporales al evaluar la existencia de anticuerpos contra gloóulómeros. Éstos además corroóoran el estado de los gloóulómeros como entidades pato-fisiológicas.

Eiemplo 8: Inmunización Activa Descripción: La inmunización activa de ratones transgénicos de APP que portan y soóreexpresan el APP humana con la mutación London (APP/Lo; Moechars et al., 1999) óajo control de un promotor Thyl revierte un déficit de memoria en la tarea de reconocimiento del oójeto novedoso. En ratones APP/Lo inmunizados con el gloóulómero Aß(1-42) o gloóulómero Aß(1-42), pero no en ratones inmunizados con el monómero Aß(1-42) se encuentran un índice de investigación incrementado para un nuevo oójeto comparado a un oójeto conocido el cual se encontró primero 3 horas antes (Figura 21). La curiosidad de los ratones medida como tiempo de investigación durante el primer encuentro no cambió entre los grupos. Por lo tanto, la inmunización activa con el globulómero Aß(1-42) y el globulómero Aß(20-42) mejoró selectivamente la memoria a corto plazo para los objetos. Métodos: - Inmunización activa de ratones transgénicos de APP: Ratones hembra APP [V717I] C57]BI x FVB (n = 36; de 6 semanas) se utilizaron para este estudio (Moechars et al., 1999). Todos los ratones se alojaron y reprodujeron en las instalaciones de alojamiento de animales de la Universidad Católica Leuven, Campus Gasthulsber. De acuerdo con la ley ética de Bélgica en alojamiento, reproducción y manejo de animales de laboratorio. Se les determinó el genotipo medíante reacción de cadena de polimerasa (PCR) a la edad de 3 semanas y se verificaron por duplicado por una segunda PCR en el inicio del estudio. Todos los ratones se aleatorizaron en ciego, se acoplaron por edad y se asignaron de forma aleatoria a un tratamiento. Los animales se volvieron a enjaular por grupo de tratamiento un día antes del inicio del estudio con el fin de permitirles familiarizarse al contexto de la nueva jaula. Estos tuvieron libre acceso a agua pre-filtrada y estéril (lámpara de UV) y comida para ratón estándar (Muracon-G, Trouw Nutrition, Gent). El alimento se almacenó bajo condiciones secas y frías en un cuarto de almacenamiento bien ventilado. La cantidad de agua y alimento se verificó diariamente, se suministró cuando fue necesario y se renovó de forma estándar dos veces a la semana. Los ratones se alojaron bajo un ritmo día-noche invertido: 14 horas luz/10 horas de oscuridad, la luz inició a las 7 p.m, en jaulas metálicas estándares de tipo RVS T2 (área de 540 cm2) equipadas con pisos sólidos y capa de lechos de paja. Se trataron a los ratones intraperitonealmente con una de las siguientes soluciones (200 µl por inyección; n = 7-9 por grupo): solución salina reguladada en su pH con fosfato (PBS; pH 7.4), 100 µg de Aß(1-42) (Bachem, H1368) en 0.25% de NH4OH, 100 µg del globulómero Aß(1-42) o 30 µg del globulómero Aß(1-42). La primera inyección contuvo 50% (v/v) de Adyuvantes de Freund's completos (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA, ref no. 263810) mientras las inyecciones contuvieron 50% (v/v) de Adyuvante de Freund incompleto (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA, ref. no. 263910). La administración de compuestos se realizó cada 3 semanas durante 3 meses (en la semana 0/3/6/9/12). - Tarea de reconocimiento de objetos novedosos en ratones inmunizados: Después de la última inyección todos los ratones experimentaron una tarea de reconocimiento de objetos novedosos. El protocolo utilizado sigue el método como se describe por Dewachter I. Et al., Journal of Neuroscience, 2002, 22(9):3445-3453. Los ratones se familiarizaron durante una hora a una caja de campo abierto Plexiglás (52 x 52 x 40 cm) con paredes verticales negras y un piso translúcido, iluminado débilmente por una lámpara colocada debajo de la caja. Al día siguiente se colocaron los animales en la misma caja y se sometieron a una prueba de adquisición de 10 minutos. Durante esta prueba se colocaron ratones individualmente en el campo abierto en la presencia del objeto A (balón azul o cubo rojo, tamaño similar de ± 4 cm) y la duración (tiempoAA) y la frecuencia (FreqAA) que explora el objeto A (en el hocico de los animales se dirigió hacia el objeto a una distancia de < 1 cm y los ratones olfatearon activamente en la dirección del objeto) se registró por un sistema computarizado (Ethovisíon, Noldus Information Technology, Wageningen, the Netherlands). Durante una prueba de retención de 10 minutos (segunda prueba) realizada 3 horas después, un objeto novedoso (objeto B, cubo rojo o balón azul) se colocó junto con el objeto familiar (objeto A) en el campo abierto. (FreqA y FreqB y TiempoA y TiempoB, respectivamente). El índice de reconocimiento (Rl), definido como la relación de la duración en la cual el objeto novedoso se exploró durante la duración en la cual ambos objetos se exploraron [Tiempo B/(Tiempo A + Tiempo B) X 100] se utilizó para medir la memoria no espacial. La duración y objeto A de frecuencia se exploró durante la prueba de adquisición (tiempoAA y FreqAA) se utilizó para medir la curiosidad. - Resultados: Durante el proceso de inmunización activa, la ganancia de peso corporal entre los grupos diferencíalmente tratados de ratones fue la misma, indicando efectos no secundarios del procedimiento de inmunización. Durante et primer encuentro del objeto todos los grupos mostraron la misma curiosidad, es decir, diferencias no estadísticamente notables en TiempoAA y FreqAA Durante el segundo encuentro, los ratones inmunizados con el globulómero Aß(1-42) y el globulómero Aß(20-42), pero no aquellos con el monómero Aß(1-42) o vehículo investigó el sujeto desconocido notablemente más largo, es decir, Rl más de 50% (= nivel de oportunidad a causa de no memoria; P < 0.01: prueba t de Student). Además, el Rl de ratones inmunizados con el globulómero Aß(1-42) y el globulómero Aß(20-42) fue notablemente más elevado que el Rl de ratones tratados con el monómero Aß(1-42) o vehículo (P < 0.07; ANOVA seguido por la prueba t Holm-Sidak post-hoc).

Eiemplo 9: Inmunización pasiva Descripción: La inmunización pasiva de ratones transgénicos de APP que portan y sobreexpresan la APP humana con la mutación London (APP/Lo; Moechars et al., 19999) bajo control de un promotor Thyl invirtió un déficit de memoria en la tarea de reconocimiento del objeto novedoso. En ratones APP/Lo inmunizados con los anticuerpos 6G1 y 8F5 monoclonales de ratón comparados a ratones tratados con PBSI, se encuentra un índice de investigación incrementado para un nuevo objeto comparado a un objeto conocido el cual encontraron primero 3 horas antes (Figura 22) La curiosidad de los ratones medidos como tiempo de investigación del objeto durante el primer encuentro no cambió entre los grupos Por lo tanto, la inmunización pasiva con los anticuerpos 6G1 y 8F5 monoclonales de ratón mejoran selectivamente la memoria a corto plazo para los objetos Métodos Los ratones y condiciones de alojamiento fueron idénticos al protocolo utilizado en el Ejemplo 8 Los ratones se inyectaron intrapeptonealmente con 250 µg de los anticuerpos 6B1 y 8F5 monoclonales en 250 µl de solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS) o con PBS sola (n = 8 para todos los grupos) los cuales se aumentaron contra el gloóulómero Aß una vez a la semana durante dos semanas (2 inyecciones en total) Un día después de la última inyección, se realizó una tarea de reconocimiento del oójeto como se descrióe en el Ejemplo 8 Resultados Durante el primer encuentro del oójeto, todos los grupos mostraron la misma curiosidad, es decir, sin diferencias estadísticamente notaóles en FreqAA Durante el segundo encuentro, los ratones inmunizados con los anticuerpos 6G1 y 8F5 monoclonales, pero no aquellos inyectados con PBS solamente investigaron el sujeto no conocido notaólemente más largo, es decir, Rl más de 50% (= nivel de oportunidad deóido a que no hay ninguna memoria; P al menos < 0.05; prueóa t de Student).

Eiemplo 10: Inducción de la formación del globulómero Aß(1 - 42) por ácidos grasos Se proóó una variedad de ácidos grasos por si fueron capaces de reemplazar SDS como el inductor de la formación del gloóulómero Aß(1 - 42). Se muestran resultados en la Figura 14. Como puede verse, el ácido láurico, ácido oleico y ácido araquidóníco tamóién inducen la característica del gloóulómero Aß(1 - 42) de 38/48 kDa, mientras que el ácido eícosapentanoico crea un oligómero parcialmente camóiado, y el ácido linoleico, ácido docosahexanoico y ácido docosatetranoico no pudieron generar la característica de doóle óanda Aß de 38/48 dentro del límite de detección. Estos datos sugieren que la formación de gloóulómero in vivo se promueve no sólo por los factores aún no caracterizados, que conducen a desdoólamiento erróneo de APP y así la soóreproducción de Aß, sino tamóién por una influencia catalítica directa de lípidos, presumiólemente al proporcionar superficies amónicas, en forma de micelas o vesículas, las cuales inducen camóios conformacionales en Aß y/o sirven como andamios en donde la formación del gloóulómero puede ocurrir. Esto es de interés particular ya que puede indicar un papel de los gloóul?meros en los efectos que producen demencia de ciertos disturóios de metaóolismo de lípídos así como efectos potencialmente óenéficos de fármacos que influencian metaóolismo cereóral de lípidos o composición en AD y condiciones relacionadas.

Eiemplo 11 : Enlace in vivo de globulómeros Aß(1 - 42) Se realizaron inyecciones intracraniales en ratas para proóar la viaóilidad de administración in vivo del gloóulómero Aß(1 - 42). Para estudios electrofisiológicos e histopatológicos, se oótuvíeron ratas Sprague-Dawley macho de Janvier (France) de una edad de aproximadamente 8 semanas. Todos los animales se mantuvieron óajo condiciones estándares (ciclo de 12 horas días/noche, 22°C, 50% de humedad) con acceso More a alimentos y agua corriente y se les permitió recuperarse durante al menos una semana después de la llegada en nuestra colonia animal. Se anestesiaron ratas (260 - 430 g) con pentoóaróital (60 mg/kg i.p.; Narcoren) y se fijaron en un aparato estereotáxico de acuerdo a Paxinos y Watson36. Para aplicación intravenosa, 18 ratas recióieron una microínyección estereotáxica de 0.8 nmoles del gloóulómero Aß(1 - 42) en el ventrículo derecho utilizando las siguientes coordenadas (en mm a Bregman); caudal 1.0, lateral 1.5 y ventral 3.9. Un volumen total de 4.3 µl se infundo por una jeringa Hamilton de 10 µl unida a una microóomóa motorizada (WPI, Germany) durante 5 minutos con la cánula que se deja en el lugar durante 2 minutos adicionales. Para inyección intracortical, 8 ratas recióieron microinyecciones estereotáxicas del gloóulómero Aß(1 - 42) (0.15 nmoles en 1 µl) utilizando las siguientes coordenadas (en mm a Bregma); caudal 2.0, lateral 2.0 y ventral 2.0. La infusión se aplicó mediante una jeringa Hamilton de 10 µl durante 5 minutos con la cánula que se deja en el lugar durante 5 minutos adicionales. Se les permitió a los animales recuperarse y se sacrificaron suósecuentemente 1, 4 y 7 días después de estudiar la penetración del gloóulómero Aß(1 - 42) a partir de los sitios del ventrículo/inyección en el tejido circundante por inmunohistoquímíca y análisis de transferencia de mancha óioquímica. Por lo tanto, las ratas se anestesiaron profundamente con Narcoren. Con el fin de analizar si los gloóulómeros Aß(1 - 42) se despejaron del fluido cereóroespinal (CSF), en algunas de las ratas varios µl de CSF se retiró después de exponer la memórana atlanto-occípital y punzando la cisterna magna con una jeringa de 1 ml y una cánula de 0.3 mm. Luego, las ratas se perfundieron transcardiacamente con 10 mM de PBS (pH 7.2) durante 5 minutos, seguido por 5% de paraformaldehído (PFA) en PBS. Los cereóros se removieron, post-fijaron durante la noche en 4% de PFA en PBS conteniendo 30% de sacarosa y se transfirieron en 30% de sacarosa en PBS para crioprotección. Para la tinción del gloóulómero Aß(1 - 42), se cortaron secciones de 40 µm en un micrótomo de congelamiento y se incuóaron mediante flotación More en 5% de suero de óurro (Serotec) en TBST durante 20 minutos. Luego, las secciones se transfirieron en anticuerpo 8F5 primario monoclonal, el cual es específico para los gloóulómeros Aß(1 - 42), en una dilución de 1:1000 en TBST durante 24 horas. Un anticuerpo anti-ratón de óurro etiquetado con Cy3 (Jackson Laóoratories) se utilizó para etiquetado por fluorescencia durante 1 hora. Entre las etapas y el final, las secciones se lavaron completamente en TBST tres veces durante 5 minutos, después de lo cual se montaron en un portaoójetos de vidrio, se secaron al aire y se montaron soóre una cuóierta de vidrio (Vector Laboratories) para visualizar el núcleo de la célula. Todas las incuóacíones se realizaron a temperatura amóiente. Algunas secciones se tiñeron tamóién con 0.05% de tioflavina S (Sigma, Germany) en 50% de etanol durante 10 minutos, seguido por dos enjuagues de 100% de etanol durante 5 minutos antes del encrustamiento en Vectashield. El análisis del etiquetado se realizó óajo un microscopio de fluorescencia confocal (Zeiss LSM 510 Meta, Germany). Las inyecciones en el tercer ventrículo conducen el enlace rápido y persistente de los gloóulómeros Aß a células de las paredes del ventrículo (véase la Figura 18(ll)a) mientras desaparecen completamente a partir del fluido cereóroespinal (CSF; datos no mostrados). Los gloóulómeros Aß(1 - 42) inyectados no se enmascararon por otras proteínas en CSF ya que la aplicación de diferentes concentraciones en CSF de rata in vitro conduce a una recuperación dependiente de dosis. Los gloóulómeros Aß enlazados permanecieron en el epéndimo sin difusión detectaóle en tejido cereóral suóyacente y sin toxicidad celular oóvia ya que la densidad celular a lo largo de la pared del ventrículo parece no cambiar. La poóre penetración del tejido se mostró tamóién por inyección intracereórales en las cuales la tinción de los gloóulómeros Aß se restringió cerca del sitio de inyección y no disminuyó durante varios días (véase la Figura 16(11) b-c) . El análisis óioquímico confirmó que la vasta mayoría del gloóulómero Aß(1 - 42) inyectado está aún presente en el hipocampo durante al menos 7 días (datos no mostrados). En contraste, los monómeros Aß(1 - 42) tiñeron un área más grande y el etiquetado disminuyó después de 7 días (véase Figura 16(ll)c) sugiriendo mejor penetración de tejido que el gloóulómero Aß(1 - 42).

Eiemplo 12: Enlace específico de globulómeros Aß(1 - 42) en neuronas hipocámpicas Se proóó la relevancia fisiológica de los gloóulómeros Aß(1 -42) al estudiar su interacción con neuronas hipocámpicas primarias.

Las células hipocámpícas de cereóro de ratas (QBM Cell Science, Canadá) se cultivaron en placas de 24 pozos en tiras recuóiertas con poli-L-lisina (BD Biosciences, Germany), en medio Neuroóasal con suplemento B27 (Invitrogen, Germany) a 37°C, 5% de CO2. Para algunos cultivos inhióidores de mítosis (35 µg/µl de uridína, 15 µg/ml de 5-fluoro-2'-desoxiurídina) se agregaron a DIV6 para evitar un soórecrecimiento con glia. A menos que se estaólezca de otro modo se utilizaron células hipocámpícas en DVI-13-14.

Cuando se agregaron formas Aß, 750 µl de medio caliente a 37°C reciente que contiene las formas Aß se intercamóiaron de 1 ml total.

La incuóación tomó lugar durante 15 minutos a 37°C, 5% de CO2, la solución madre del monómero Aß (0.5 mg/ml) estuvo en HFIP y el gloóulómero Aß(1 - 42) en 35 mM de NaCI, 5 mM de NaH2PO4, pH 7.4. Se enjuagaron las células tres veces con 1 ml de medio y se fijaron con 3.7% de formaldehído regulado en su pH (Accustain, Sigma, Germany). Los sitios de enlace no específicos se óloquearon por incuóación con 10% de suero de caóra normal en PBS (pH 7.4) durante 90 minutos a temperatura amóiente a la cual se agregó 0.1% de Tritón X-100 en el caso de contra-tinción intracelular. Anticuerpos primeros (anti Aß 6E10 (Signet Laóoratories, USA), 1:2000; anti GFAP (Dako Cytomation, Germany), 1:2500; anti-MAP2 (Chemicon, International, Germany), 1:1000) y anticuerpos secundarios dAlexa 488, 1:500; Alexa 635, 1:500; Molecular Proóes, Germany) se incuóaron suósecuentemente durante 2 horas a temperatura amóiente en 10% de suero de caóra normal en PBS (pH 7.4). Después que cada una de las células de incuóación de anticuerpo se lavaron tres veces con PBS y finalmente se montaron en reactivo antídecoloro ProLong (Molecular Proóes, Germany). Los gloóulómeros Aß(1 - 42) exhióieron un enlace fuerte a neuronas hipocámpicas en una concentración de 17 nM (equivalente a 200 nM de concentración monomérica) en contraste a controles sin Aß(1 - 42) o con 200 nM del Aß(1- 42) monomérico (véase la Figura 15a). La estructura monomérica del Aß(1- 42) se aseguró por solución madre de HFIP. Un efecto posiólemente negativo del HFIP en la capacidad de neuronas hipocámpicas para enlazarse a Aß(1 -42) se eliminó por incubación de un HFIP de volumen equivalente junto con los globulómeros Aß(1 - 42) sin diferencia a los globulómeros Aß(1 - 42) solos. Las neuronas hipocámpicas se enlazaron al globulómero Aß(1 - 42) tan bajo como 2 nM (datos no mostrados). El enlace del globulómero Aß(1 - 42) a neuritas se enfatizó altamente, sugiriendo un enlace específico a termínales sinápticas o espinas dendríticas (véase la Figura 15b, inserción). Se observó una dependencia fuerte del enlace del globulómero Aß(1 -42) en la edad de neuronas cultivadas. En DIV8 casi ningún enlace hipocámpico (-1%) se encontró, mientras en DIV11 y DIV15 el enlace del globulómero Aß(1 - 42) se pronunció (-90%) (véase la Figura 15b). La especificad elevada del enlace del globulómero Aß(1 - 42) se verificó además por enlace confinado a neuronas mientras la glia en esta preparación hipocámpica no se enlazó al globulómero Aß(1 -42) (véase la Figura 15c). Además, una variedad de líneas celulares neuronales fueron negativas para el enlace del globulómero Aß(1 -42) (datos no mostrados).

Eiemplo 13: Inhibición completa de potenciación a largo plazo por globulómeros Aß(1 - 42) Con el fin de determinar el efecto de los globulómeros Aß(1 -42) en función sináptica la invención registró potenciales extraceluiares a partir de la región CA1 de las rebanadas de cerebro perfundidas con o sin los globulómeros Aß(1 - 42).

Se prepararon rebanadas a partir de ratas Sprague-Dawley macho (7-8 semanas de edad) Los hemisferios aislados se ajustaron y luego se cortaron utilizando un vibratomo Las rebanadas (400 µM) se transfirieron directamente a una cámara de registro de interfaz y se perfundieron continuamente a 33°C con CSF artificial oxigenado (aCSF 118 mM de NaCI, 1 24 mM de KH2PO4, 10 mM de glucosa, 2 mM de MgSO4, 2 5 mM de CaCI2, 5 mM de KCl, 25 6 mM de NaHCO3) en una velocidad de flujo de 1 8 ml/mm Se dejó equilibrar a rebanadas recién preparadas durante al menos una hora antes del registro Potenciales de campo se obtuvieron del radiatum del estrato de CA1 utilizando microelectrodos de vidrio (0 8-1 2 MO) llenados con aCSF Se estimuló el Schaffer colateral por un electrodo de tungsteno bipolar (0 5MO, Science Products GmbH, Germany) Los pulsos bifásicos de voltaje constante (0 1 ms/fase, rango 1-5 V) se aplicaron una vez por minuto a 100 Hz (1 seg/tren con intervalo de 10 segundo mtertren) utilizando la misma intensidad y la longitud de pulso En el grupo Aß, 42 nM del globulómero Aß(1 - 42) se inundó durante el experimento completo, iniciando 80-120 minutos antes de la tetanización La relación de entrada/salida se determinó antes del registro de línea base (64-94 minutos después de lavar el globulómero Aß(1 - 42)) Las señales se dig ita I izaron por un Power CED 1401 y se analizaron durante el software Signal 2 14 (Cambridge Electronic Design Ltd , Cambridge) Para datos de comparación estadísticos se analizaron por mediciones ANOVA repetidas de doble vía utilizando SAS Las EPSPs de campo obtenidas de la capa dendrítíca CA1 de rebanadas tratadas con globulómero Aß(1 - 42) parecieron normales en tamaño y forma (véase la Figura 17b), indicando que la transmisión sináptíca excitatoria no se afectó. Las EPSPs de campo no relevaron carencia de inhibición sináptíca (es decir, puntos de población múltiple), sugiriendo que la transmisión de GABA-érgica estuvo intacta. También, la comparación de la relación de entrada/salida promedio de rebanadas tratadas con el gloóulómero Aß(1 - 42) contra no tratadas (véase la Figura 17c) indicó que el funcionamiento sináptico óásico no se deterioró por los gloóulómeros Aß(1 - 42) . Sin emóargo, cuando se examina LTP inducida por estimulación de frecuencia elevada, reóanadas (42 nM) tratadas con el gloóulómero Aß(1 - 42) revelaron un óloque completo (véase la Figura 17a). La potenciación decayó al nivel de línea óase en el lapso de 30 minutos después del estímulo tetánico. Aunque la potenciación a corto plazo pudo inducirse fácilmente en el grupo del gloóulómero Aß(1 - 42), la potenciación se deterioró notaólemente tan pronto como 5 minutos después de la tetanización (p<0.05). En contraste, las reóanadas control revelaron LTP estaóle durante al menos una hora, con al menos 30% de potenciación en todo el tiempo de registro. En algunos experimento la concentración del gloóulómero Aß(1 - 42) en el flujo de la cámara de registro se determinó, y 50-70% del gloóulómero Aß(1 - 42) pudo detectarse, indicando que una cantidad sustancial (aunque no toda) de los gloóulómeros Aß(1 - 42) haóía alcanzado las reóanadas durante los experimentos. De este modo, menos de 42 nM de los gloóulómeros Aß(1 - 42) fueron suficientes para inhióir específicamente LTP, mientras se deja la transmisión sináptica óásica no afectada.

Eiemplo 14: Anticuerpos a Aß(1 - 42) Se generó el anticuerpo 5598 policlonal del gloóulómero Aß(20 - 42) a partir de conejos inmunizados y afinidad purificada contra el gloóulómero Aß(1 - 42) inmovilizado. Los métodos utilizados se documentan óien en la técnica. Brevemente, el péptido sintético de Aß(1 - 42) (Cat. No. H-1368, Bachme, Switzerland) se suspendió en 111 ,333-hexafluoro-2-propanol (HFIP) a ~6 mg/ml y se ¡ncuóó para soluóilízación completa óajo agitación a 37°C durante 1.5 horas. El HFIP se removió por evaporación en un SpeedVac y el Aß(1 - 42) se volvió a suspender en una concentración de 5 mM en sulfóxido de dimetilo (DMSO) y se sometió a sonicación 20 segundos. El Aß(1 -42) pre-tratado con HFIP se diluyó en una solución regulada en su pH con fosfato (PBS) (20 mM de NaH2PO4, 140 mM de NaCI, pH 7.4) a 400 µM y 1/10 volumen de 2% de SDS (en H20) agregado (concentración final de 0.2% de dodecilsulfato de sodio (SDS)). Una incuóación durante 6 horas a 37°C resultó en el gloóulómero Aß(1 -42) de 16/20 kDa intermedio. El gloóulómero Aß(1 - 42) de 38/48 kDa se generó por una dilución adicional con tres volúmenes de H2O y la incuóaci?n durante 18 horas a 37°C. Después de la centrifugación a 3,0000 xg durante 20 minutos, la muestra se concentró por ultrafiltración (corte de 30 kDa), se diatizó contra 5 mM de NaH2PO4, 35 mM de NaCI, pH 7.4, se centrifugó a 10,000 xg durante 10 minutos y el soórenadante que contiene el gloóulómero Aß(1 - 42) de 38/48 KDa se retiró. Para el gloóulómero Aß(1 - 42) de 38/48 kDa inducido por ácido graso, el SDS se reemplazó por la adición de 1/10 volumen de 0.5% de ácido graso. Para reticulación el gloóulómero Aß(1 - 42) de 38/48 kDa se trató antes de la concentración y la diálisis con 1 mM de glutardialdehído durante 2 horas a TA seguido por tratamiento con etanolamina (5 mM) durante 30 minutos a temperatura amóiente (TA). La proteólisis límite del gloóulómero Aß(1 - 42) de 38/48 kDa se realizó utilizando 1/50 (mg/mg) de la proteasa respectiva y la incuóación durante 20 horas a TA. La inmunización de ratones resultó en títulos elevados (1:10,000-100,000) produciendo anticuerpos monoclonales específicos del gloóulómero Aß(1 - 42) (8F5) y no específicos (6G1) potentes. En contraste al 6G1 no específico y al anticuerpo 6E10 de referencia, el anticuerpo específico 8F5 detectó gloóulómeros Aß(1 -42) sólo por transferencia PAGE-Western, pero no por análisis de transferencia SDS-PAGE Western (datos no mostrados) indicando enlace a más epítope de ¡nter-suóunidad disociaóle de detergente más compleja en la estructura del gloóulómero Aß(1 - 42) núcleo (véase la Figura 12a). El análisis de transferencia de mancha contra varias preparaciones estándares Aß(1 - 42) y Aß(1 - 40) mostró diferencias notaóles en el reconocimiento del gloóulómero Aß(1 - 42) contra formas Aß sin gloóulómero (preparación del monómero Aß(1 - 40/42) estándar, Aß(1 - 42) agregado)) para 8F5 y 5598 específico pero no para los anticuerpos no específicos de isoforma 6G1 y 6E10 (véase la Figura 12ó) La especificidad del gloóulómero de 8F5 y 5598 pero no de 6G1 y 6E10 se confirmó al cuantificar el gloóulómero Aß(1 - 42), el monómero Aß(1- 42), el enlace de Aß(1 -40) y SAPPa en ELISAs de doóle plano (véase la Figura 12c) Sin emóargo, se sume que la selectividad de anticuerpos se desestimó deóido a menores contaminaciones cruzadas de nuestras preparaciones estándares sintéticas con los epítopes del gloóulómero Aß(1 - 42) ya que nuestros anticuerpos específicos no detectaron epítopes del gloóulómero Aß(1 - 42) en un nivel tan óajo como <0 5% comparado al monómero Aß en muestras de CSF (véanse los datos en la Figura 13) El grado de contaminaciones cruzadas en preparaciones Aß sintéticas se calculó a partir de relaciones de valor de ELISA (véase la Figura 12d) En la preparación de NH4OH de Aß(1 - 42) y oligómeros Aß preparados de acuerdo a Lamóert et al (Lamóert, M P et al Diffusible, non-f ibpllar Mgands depved from Aóeta 1-42 are potent central nervous system neurotoxins Proc Nati Acad Sci U S A 95, 6448-6453 (1998)) -5% de los epítopes del gloóulómero Aß(1 - 42) y 95% de los epítopes del monómero Aß(1 - 42) se midieron, mientras la preparación del gloóulómero Aß(1 - 42) de la invención fue de 95% de pureza con sólo 5% de señal de contaminación cruzada para Aß(1 - 42) monomérica En medio condicionado (CM) de células CHO que expresan APP con mutación V717F (de acuerdo a Walsh et al (Walsh, D M et al Naturally secreted oligomers of amyloíd óeta protein potently inhióit hippocampal long-term potentiation in vivo Nature 416, 535 - 539 (2002)) el nivel de epítope del gloóulómero Aß(1 - 42) estuvo deóajo del límite de detección Ejemplo 15: Niveles de amiloide ß(1 - 38), (1 - 40) y (1 - 42) endógeno en extractos de tejido cerebral de AD después de inmunoprecipitación con anti-Aß mAb 8F5 selectivo de globulómero Se suspendieron 154 mg de cereóro con AD humano (muestra de Brain-net, Munich) a 0°C con 1 39 ml de regulador de pH de extracción La muestra de homogenizó en un crisol de vidrio por 20 golpes con la mano del mortero Se centrifugó el tejido homogenizado a 100O00 g durante 1 hora El soórenadante se tomó como el extracto de cerebro de AD Material Regulador de pH básico 50 mM de Tris, 150 mM de NaCI, 2 mM de EDTA, 001% de Tergitol NP-40, 0 1% de SDS pH 7 6 (ajustado con 10 M de HCl) Regulador de pH de extracción = 100 ml de regulador de pH + 1 tableta de cóctel inhibidor de proteasa completo (Fa Roche Nr 1697498) en solución en 1 ml de H2O + 200 µl de 250 mM de PMSF (en solución en Metanol), preparado directamente antes de su uso. Inmovilización de anti-Aß mAbs a Sepharose 4B activada con CNBr: m 8F5: Se agregaron 0.4 g de Sepharose 4B activada con CNBr (Amersham Ine No.: 17-0430-01) a 10 ml de 1m de HCl acuoso y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. La Sepharose 4B activada con NCBr se lavó tres veces con 10 ml de 1 mM de HCl y finalmente dos veces con 10 ml de 100 mM de NaHCO3; 500 mM de NaCI; pH 8.3. Para cada uno de los anticuerpos inmovilizados se agregaron 100 µl de Sepharose 4B activada con CNBr a 950 µl de 0.5 mg/ml de solución de anti-Aß mAb 8F5 en 100 mM de NaHCO3; 500 mM de NaCI; pH 8.3. Después de 2 horas de agitación a temperatura ambiente las muestras se centrifugaron durante 5 minutos a 10O00 g. Luego, 500 µg de 100 mM de etanolamina; 100 mM de NaHCO3; 500 mM de NaCI; pH 8.3, se agregó el regulador de pH a las perlas y las muestras se agitaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Se centrifugó la muestra de Sepharose 8F5 mAb anti-Aß durante 5 minutos a 10O00 g y se lavó 5 veces con 500 µl de 20 mM de NaH2PO ; 140 mM de NaCI; pH 7.4. Antes del congelamiento se estabilizaron muestras almacenadas agregando azida de sodio a 0.02% de la concentración final. Inmunoprecipitación: mAb 8F5-Sepharose: Se diluyeron 150 µl del extracto de cerebro con AD humano con 150 µl de 20 mM de NaH2PO4; 140 mM de NaCI; 0.05% de Tween 20; pH 7.4. Estas muestras se agregaron a 2 µl de Matriz mAó 8F5-Sepharose anti-Aß y se agitaron durante 1.5 horas a temperatura amóiente. Las muestras se centrifugaron durante 5 minutos a 10O00 g. Los soórenadantes se desecharon y la mAó 8F5-Sepharose anti-Aß se lavó dos veces con 50 µl de PBS, se agitaron durante 1 minuto y se centrifugaron (5 minutos a 10O00 g). Los soórenadantes se desecharon y las perlas de Sepharose se suspendieron en 50 µl de 2 mM de NaH2PO4; 14 mM de NaCI; pH 7.4; seguidos por 1 minuto de agitación a temperatura amóiente y 5 minutos de centrifugación a 10O00 g. En una siguiente etapa las perlas mAó-Sepharose anti-Aß se trataron con 10 µl de 50% de CH3CN; 0.2% de TFA en agua. Después de 10 minutos de agitación a temperatura amóiente las muestras se centrifugaron durante 5 minutos a 10O00 g. Los soórenadantes se recolectaron.

Determinación de Aß(1-xx) con Seldi-MS: Se cuórieron con manchas 2 µl dei eluato-IP de Sepharose 8F6 mAó anti-Aß en un sitio de una configuración de Disposición de Pedazo de Proteína H4 A-H Fa. Ciphergen número de parte C553-0028. El pedazo se secó al aire. Después de 2 µl de 3.33 mg/ml de CHCA en 50% de CH3CN; 0.5% de TFA en agua se cuórieron con manchas en el sitio. El pedazo se secó de nuevo por aire y se analizó en un espectrómetro de masa SELDI Ciphergen, Inc. Condiciones: Intensidad: 200 Sensióilídad: 6 Intervalo de masa: 800-10O00 Da Calióración: Mezcla Estándar de Péptido Todo en 1 de 7 Fa. Ciphergen parte número C100-0005.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1 Un oligómero Aß(X - 38 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo, en donde X se selecciona del grupo que consiste de los números 1 24 2 El oligómero o derivado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el oligómero es un oligomero Aß(X - 40) gloóular no difundióle 3 El oligómero o derivado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el oligómero es un oligómero Aß(X - 42) gloóular no difundióle 4 El oligómero o derivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde X se selecciona del grupo que consiste de los números 8 24 5 El oligómero o derivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde X se selecciona del grupo que consiste de los números 12 24 6 El oligómero o derivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde X se selecciona del grupo que consiste de los números 12 20 7 El oligómero o derivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el cual es soluóle 8 El oligómero o derivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el derivado es un oligómero que se etiqueta covalentemente con un grupo que facilita la detección 9 El oligómero o derivado de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el grupo que facilita la detección se selecciona a partir del grupo que consiste de fluoróforos, cromóforos, quimioluminóforos, grupos enzimáticamente activos, grupos densos de electrón, haptenos, estructuras fuertemente antigénicas, aptámeros, grupos quelantes, mediadores de interacción de proteína-proteína específicos, grupos magnéticos y grupos radioactivos 10 El oligómero o derivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el derivado es un oligómero que se sostiene con un grupo que facilita la degradación in vivo 11 El oligómero o derivado de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el grupo que facilita la degradación m vivo es ubiqu itina 12 El oligómero o derivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, el cual se purifica 13 Un método para enriquecer el oligómero Aß(X - 38 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo en una preparación que comprende el oligómero o derivado, dicho método comprende capturar el oligómero o derivado y oótener el oligómero o derivado en forma enriquecida 14 El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde capturar el oligómero o derivado comprende poner en contacto la preparación con un agente que se enlaza al oligómero o derivado 15 El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el agente se inmoviliza 16. El método de acuerdo con la reivindicación 14 ó 15, en donde el agente es un anticuerpo que tiene especificidad para el oligómero o derivado. 17. El método de cualquiera de acuerdo con las reivindicaciones 13 a 16, en donde oótener el oligómero o derivado en forma enriquecida comprende resoróer el oligómero o derivado capturado. 18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde resoróer el oligómero o derivado capturado comprende poner el contacto el oligómero o derivado capturado con un regulador de pH con un alto contenido de sal o una solución acídica. 19. El método de cualquiera de acuerdo con las reivindicaciones 13 a 18, en donde el método comprende además determinar la cantidad del oligómero Aß(X - 38 .. 43) gloóular no difundióle o derivado en la preparación. 20. Un método para enriquecer el oligómero Aß(X - 38 .. 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo en una preparación que comprende el oligómero o derivado, dicho método comprende remover al menos una sustancia diferente del oligómero o derivado de la preparación. 21. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde la sustancia a diferencia del olígómero o derivado es un monómero de Aß o un fiórilómero de Aß. 22. El método de acuerdo con la reivindicación 21 ó 22, en donde remover la sustancia comprende poner en contacto la preparación con una gente que se enlaza específicamente a la sustancia. 23. El método de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el agente se inmoviliza. 24. El método de acuerdo con la reivindicación 22 ó 23, en donde el agente es un anticuerpo que se enlaza específicamente a la sustancia. 25. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, en donde remover la sustancia comprende poner en contacto la preparación con un anticuerpo que se enlaza a la sustancia y luego someter la sustancia enlazada al anticuerpo a cromatografía de afinidad de la proteína A. 26. El método, en donde el método comprende además determinar la cantidad del oligómero Aß(X - 38 .. 43) gloóular no difundióle o derivado del mismo en la preparación. 27. La composición que comprende el oligómero Aß(X - 38 .. 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo, que se oótiene a través del método como se define en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 26. 28. La composición que comprende el oligómero Aß(X - 38 .. 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la cantidad del oligómero o el derivado es al menos 99% en peso de la composición. 29. La composición de acuerdo con la reivindicación 28, en donde la cantidad del oligómero o derivado es al menos 99.9% en peso de la composición. 30. La composición de acuerdo con la reivindicación 28, en donde la cantidad del oligómero o derivado es al menos 99.99% en peso de la composición. 31. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30, en donde la composición es una vacuna. 32. El uso del oligómero Aß(X - 38 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para preparar un anticuerpo que tiene especificidad para el oligómero o derivado. 33. Un método para preparar un anticuerpo que tiene especificidad para el oligómero Aß(X - 38 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, dicho método comprende proporcionar un antígeno que comprende el olígómero o derivado; exponer un repertorio de anticuerpo o repertorio de anticuerpo potencial al antígeno; y seleccionar del repertorio un anticuerpo el cual se enlaza específicamente al oligómero o derivado del mismo. 34. El método de acuerdo con la reivindicación 33, en donde el repertorio se expone al antígeno in vivo al inmunizar un organismo con el antígeno. 35. Un anticuerpo que tiene especificidad para el oligómero Aß(X - 38 .. 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12. 36. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 35, en donde el anticuerpo es oótenióle a través de un método de la reivindicación 33 ó 34 37 El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 35 ó 36, en donde la afinidad del anticuerpo al oligómero o derivado es al menos 10 veces mayor que a un Aß(1 - 42) monomérico 38 El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, en donde la afinidad del anticuerpo al oligómero o derivado es al menos 10 veces mayor que a un Aß(1 -40) monomérico 39 El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 38, en donde la afinidad del anticuerpo al oligómero o derivado es al menos 10 veces mayor que a un Aß(1 -42) fióplomépco 40 El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 39, en donde la afinidad del anticuerpo al oligómero o derivado es al menos 10 veces mayor que al Aß(1 - 40) fióplomépco 41 El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 40, en donde la afinidad del anticuerpo al oligómero o derivado del mismo es al menos 10 veces mayor que a un Aß(1 - 42) protofióplomépco 42 El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 41, en donde la afinidad del anticuerpo al oligómero o derivado es al menos 10 veces mayor que a un Aß(1 -40) protofióplomépco 43. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 42, en donde el anticuerpo se enlaza a un epítope uóicado entre las posiciones de aminoácido de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 del oligómero o derivado. 44. El uso de un oligómero Aß(X - 38 .. 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para preparar un aptámero que tiene especificidad para el oligómero o derivado. 45. Un método para preparar un aptámero que tiene especificidad para el oligómero Aß(X - 38 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, dicho método comprende proporcionar un oójetivo de enlace que comprende el oligómero o derivado; exponer un repertorio de aptámero o repertorio de aptámero potencial al oójetivo de enlace; y seleccionar a partir del repertorio un aptámero el cual se enlaza específicamente al oligómero o derivado del mismo. 46. Un aptámero que tiene especificidad para el oligómero Aß(X - 38 .. 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, dicho aptámero es oótenióle a través de un método de la reivindicación 45. 47. El aptámero de acuerdo con la reivindicación 46, en donde el aptámero se etiqueta y/o señala. 48. El uso de un oligómero Aß(X - 38 .. 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para preparar una composición farmacéutica para tratar o evitar una amiloidosis. 49. El uso de acuerdo con la reivindicación 48, en donde la composición farmacéutica es una vacuna para inmunización activa. 50. El uso de acuerdo con la reivindicación 48 ó 49, en donde el olígómero no es capaz de entrar al SNC. 51. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 50, en donde la composición es capaz de inducir una respuesta no inflamatoria mediada por un anticuerpo resistente contra gloóulómeros. 52. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 51, en donde la composición farmacéutica se administra a través de una ruta seleccionada de la intravenosa, intramuscular y suócutánea. 53. Un método para tratar o evitar una amiloídosis en un sujeto con necesidad del mismo, el cual comprende administrar el oligómero Aß(X - 38 .. 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 al sujeto. 54. El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde administrar el olígómero Aß(X - 38 .. 43) gloóular no difundióle o derivado del mismo es para inmunización activa. 55. El uso de un anticuerpo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 35 a 43 para preparar una composición farmacéutica para tratar o evitar una amiloidosis. 56 El uso de acuerdo con la reivindicación 55, en donde la composición farmacéutica es para inmunización pasiva 57 Un método para tratar una amiloidosis en un sujeto con necesidad del mismo, el cual comprende administrar un anticuerpo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 35 a 43 al sujeto 58 El método de acuerdo con la reivindicación 57, en donde la administración del anticuerpo es para inmunización activa 59 El uso de un anticuerpo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 35 a 43 para detectar el oligómero o derivado en una preparación 60 El uso de un anticuerpo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 35 a 43 para determinar la cantidad del oligómero o derivado en una preparación 61 El método para detectar el oligómero Aß(X - 38 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo en una preparación, el cual comprende poner en contacto la preparación con un anticuerpo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 35 a 43 y detectar un complejo formado por el anticuerpo con el oligómero o derivado, la presencia del complejo que indica la presencia del oligómero o derivado 62 El método de acuerdo con la reivindicación 61, en donde el método comprende además determinar la cantidad de oligómero o derivado presente en la preparación 63 El uso del oligómero Aß(X - 38 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para preparar una composición para detectar auto-anticuerpos que tienen especificidad para el oligómero o derivado en un sujeto 64 El uso de acuerdo con la reivindicación 63, en donde se sospecha que el sujeto tiene una amiloidosis y la detección de auto-anticuerpos es para diagnosticar enfermedad de Alzheimer en el sujeto 65 El uso del oligómero Aß(X - 38 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para detectar auto-anticuerpos que tienen especificidad para el oligómero o derivado en una muestra 66 El uso de acuerdo con la reivindicación 65, en donde la muestra se deriva de un sujeto que se sospecha tiene una amiloidosis y la detección de auto-anticuerpos es para diagnosticar la amiloidosis en el sujeto 67 El método para detectar auto-anticuerpos que tienen especificidad para el oligómero Aß(X - 38 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo en un sujeto, dicho método comprende administrar al sujeto el oligómero Aß(X - 38 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y detectar un complejo formado por el anticuerpo y el oligómero o derivado, la presencia del complejo que indica la presencia de los auto-anticuerpos 68 El método de acuerdo con la reivindicación 67, en donde se sospecha que el sujeto tiene una amiloidosís y la detección de los auto-anticuerpos es para diagnosticar la amilodisis en el sujeto. 69. Un método para detectar auto-anticuerpos que tienen especificidad para el oligómero Aß(X - 38 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo en una muestra, dicho método comprende poner en contacto la muestra con un oligómero Aß(X - 38 .. 43) gloóular no difundióle o un derivado del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y detectar un complejo formado por el anticuerpo y el oligómero o derivado, la presencia del complejo que indica la presencia de los auto-anticuerpos. 70. El método de acuerdo con la reivindicación 69, en donde la muestra se deriva de un sujeto que se sospecha tiene una amiloidosis y la detección de los auto-anticuerpos es para diagnosticar la amiloídosis en el sujeto. 71. El método de acuerdo con la reivindicación 69 ó 70, en donde el sujeto sospechoso de tener una amiloidosis es un sujeto que tiene la amiloídosis o que tiene un riesgo incrementado de adquirir la amiloidosis. 72. El método o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 71, en donde la amiloidosis se selecciona del grupo que consiste de enfermedad de Alzheimer y la amiloidosis del síndrome de Down.