MX2007009545A - Anticuerpos para tgfbeta. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con moleculas de anticuerpos, en particular moleculas anticuerpos que se unen al Factor beta de Crecimiento Transformante (TGF??), y los usos de las mismas. Mas particularmente, la invencion se relaciona con moleculas de anticuerpos que se unen y de preferencia neutralizan TGF??1, TGF??2, y TGF??3, denominadas moleculas de anticuerpos "pan-especificas", y los usos de estas moleculas de anticuerpos. Las modalidades preferidas en la presente invencion son moleculas de anticuerpos, ya sea anticuerpos enteros (por ejemplo, IgG, tal como por ejemplo, IgG1 o IgG4) o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, scFv, Fab, dAb).

Description

ANTICUERPOS PARA TGFBETA CAMPO TÉCNICO La presente invención se relaciona con moléculas de anticuerpos, en particular moléculas anticuerpos que se unen al Factor beta de Crecimiento Transformante (TGFß), y los usos de las mismas. Más particularmente, la invención se relaciona con moléculas de anticuerpos que se unen y de preferencia neutralizan TGFßl, TGFß2, y TGFß3, denominadas moléculas de anticuerpos "pan-específicas" , y los usos de estas moléculas de anticuerpos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN TGFß se identificó por primera vez en 1981 (Roberts e t al . , 1981) . En seres humanos existen tres isoformas: TGFßl, TGFß2 y TGFß3 (números de acceso Swiss Prot P01137, P08112 y P10600 respectivamente) las cuales, en su estado biológicamente activo, son homodímeros 25 kDa que comprenden, dos monómeros de 112 aminoácidos unidos por un puente disulfuro inter-cadena . TGFßl difiere del TGFß2 por 27, y del TGFß3 por 22 cambios de aminoácidos principalmente conservadores. Estas diferencias se han mapeado en la estructura 3D del TGFß determinada mediante cristalografía por rayos X (Schlunegger et al . , 1992; Peer et al . , 1996) y se han definido las regiones de unión receptoras (Griffith et al . , 1996; Qian et al . , 1996). Los TGFß humanos son muy similares a los TGFß de ratón: el TGFßl humano tiene únicamente una diferencia de aminoácidos a partir del TGFßl de ratón, el TGFß2 humano tiene únicamente tres diferencias de aminoácidos a partir del TGFß2 de ratón y el TGFß3 humano es idéntico al TGFß3 de ratón. Como resultado, puede ser difícil la producción de anticuerpos para los TGFß humanos en ratones, incluyendo ratones transgénicos. Los TGFß son citocinas multifuncionales que están implicados en la proliferación y diferenciación celular, en el desarrollo embrionario, la formación de la matriz extracelular, el desarrollo óseo, la curación de heridas, hematopoyesis, y las respuestas inmunitarias e inflamatorias (Border et al . , 1995a) . La desregulación del TGFß conduce a procesos patológicos que, en seres humanos, se han implicado en muchas condiciones, por ejemplo, defectos de nacimiento, cáncer, enfermedades inflamatorias crónicas, autoinmunes y fibróticas (Border et al . , 1994; Border et al . , 1995b).

Se han realizado estudios en muchos modelos animales fibróticos (Border et al . , 1995b; Border et al . , 1994), utilizando anticuerpos neutralizantes como antagonistas, por ejemplo, glomerulonefritis (Border et al . , 1990), cicatrización neural (Logan et al . , 1994), cicatrización cutánea (Shah et al . , 1994) y fibrosis pulmonar (Giri et al . , 1993) . Todas las enfermedades representadas por estos modelos representan una necesidad no encontrada por productos terapéuticos novedosos (Bonewald, 1999; Jackson, 1998) . Sin embargo, los anticuerpos utilizados en éstos y otros estudios animales se han mejorado en animales y sus beneficios terapéuticos en seres humanos se pueden limitar debido a su potencial para inducir respuestas inmunogénicas y su rápido aclaramiento farmacocinético (Vaughan et al . , 1998) . Los anticuerpos humanos son más convenientes para el tratamiento de enfermedades provocadas por el TGFß. Se sabe que una variedad de fragmentos de anticuerpo serán capaces de unirse a una proteína blanco específicamente y con buena afinidad. Por ejemplo, se han utilizado ampliamente los fragmentos de anticuerpos que comprenden únicamente los dominios de la variable de cadena pesada (VH) y la variable de cadena ligera (VL) unidos conjuntamente por un enlazante peptídico corto, conocido como Fv de cadena individual (scFv). Se habían generado anteriormente anticuerpos humanos que neutralizan TGFßl (CAT-192) o TGFß2 (CAT-152 o TrabioMR) (EP 0 945 464, EP 0 853 661, Thompson et al . 1999) . Sin embargo, la mayoría de los anticuerpos del TGFß disponibles en la técnica no son humanos. Además, antes de esta invención, los únicos anticuerpos monoclonales pan- específ icos contra el TGFß eran de roedores. Los anticuerpos policlonales que se unen al TGFßl humano y el TGFß2 humano contra epítopes tanto neutralizantes como no neutralizantes se han mejorado en conejos (Danielpour et al. 1989b; Roberts et al . , 1990), pollos (R&D Systems, Minneapolis) y pavos (Danielpour et al . , 1989c) . Los péptidos que representan secuencias parciales del TGFß también se han utilizado como inmunógenos para mejorar los antisueros policlonales neutralizantes en conejos (Border et al . , 1990; Flandes et al . , 1988). Estos anticuerpos policlonales no humanos, son inadecuados para uso terapéutico en humanos . 1D11.16 es un anticuerpo anti-TGFß pan-específico murino que neutraliza TGFßl, TGFß2 y TGFß3 humano y de ratón en una amplia gama de análisis in vitro (Dasch et al . , 1989; Dasch et al . , 1996; R&D System product sheet for MAB1835) y es eficaz en los estudios para prueba de principios en modelos animales de fibrosis (Ling et al . , 2003; Miyaj ima et al . , 2000; Schneider et al . , 1999; Khanna et al . , 1999; Shenkar et al . , 1994). Sin embargo, puesto que 1D11.16 es un anticuerpo monoclonal murino (Dasch et al . , 1989; Dasch et al . , 1996), es inadecuado para uso terapéutico en seres humanos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra la neutralización (% de inhibición) de la producción de fibronectina (10 pM) -inducida por el TGFßl (a) , TGFß2 (b) , o el TGFß3 (c) a partir de células NHLF mediante IgG4 de la línea germinal PET1073G12 (cuadros rellenos) y 1D11.16 (círculos vacíos) . El triángulo relleno representa un IgG4 irrelevante probado a la concentración más alta (100 nM) . Los datos se muestran como ± SEmean promedio de n experimentos realizados por duplicado. Para los valores IC50 véase la Tabla 2. La Figura 2 muestra la neutralización (% de inhibición) de la producción de fibronectina (10 pM) -inducida por el TGFßl (a) , TGFß2 (b) , o el TGFß3 (c) a partir de células NHLF mediante IgG4 de la línea germinal PET1074B9 (cuadros rellenos) y 1D11.16 (círculos vacíos) . El triángulo relleno representa un IgG4 irrelevante probado a la concentración más alta (100 nM) . Los datos se muestran como ± SEmean promedio de n experimentos realizados por duplicado. Para los valores IC50 véase la Tabla 2. La Figura 3 muestra la neutralización (% de inhibición) de la producción de fibronectina (10 pM) -inducida por el TGFßl (a) , TGFß2 (b) , o el TGFß3 (c) a partir de células NHLF mediante IgG4 de la línea germinal PET1287A10 (cuadros rellenos) y 1D11.16 (círculos vacíos) . El triángulo relleno representa un IgG4 irrelevante probado a la concentración más alta (100 nM) . Los datos se muestran como ± SEmean promedio de n experimentos realizados por duplicado. Para los valores IC50 véase la Tabla 2.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En diversos aspectos de la invención se proporciona la materia de las modalidades incluidas más adelante. En la presente descripción se exponen aspectos y modalidades adicionales de la invención. La presente invención proporciona miembros de unión específica para el TGFß, en particular el TGFß humano. En particular se proporcionan los miembros de unión específica que se dirigen al TGFßl, TGFß2 y TGFß3. Las modalidades preferidas dentro de la presente invención son moléculas de anticuerpos, ya sea anticuerpos enteros (por ejemplo, IgG, tal como IgGl o IgG4) o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, scFv, Fab, dAb) . Se proporcionan las regiones de unión con antígenos de anticuerpos y los sitios de unión de antígenos de los anticuerpos, como son los dominios VH y VL de los anticuerpos que contienen estas regiones. Dentro de los dominios VH y VL se proporcionan regiones determinantes de complementariedad, CDRs, que se pueden proporcionar dentro de diferentes regiones de trama, FR's, para formar los dominios VH o VL como pueda ser el caso. Un sitio de unión con antígenos puede consistir de un dominio VH y/o un dominio VL del anticuerpo o las porciones de unión con antígenos de los mismos. En un aspecto, la presente invención proporciona un miembro de unión específica para el TGFß humano, que comprende un sitio de unión con antígenos de un anticuerpo, un conjunto HCDR, un conjunto LCDR, o ambos y/o un dominio VH del anticuerpo humano, un dominio VL o ambos. El conjunto de HCDR1 , HCDR2 y HCDR3 puede tener las secuencias seleccionadas de los siguientes grupos: HCDR1 SEQ ID NO : 3, HCDR2 SEQ ID NO: 4, HCDR3 SEQ ID NO: 5 (denominados en la presente como el "conjunto PET1073G12 de las HCDR"); HCDR1 SEQ ID NO: 13, HCDR2 SEQ ID NO: 14, HCDR3 SEQ ID NO: 15. (denominados en la presente como el "conjunto PET1074B9 de las HCDR"); HCDR1 SEQ ID NO: 23, HCDR2 SEQ ID NO: 24, HCDR3 SEQ ID NO: 25 (denominados en la presente como el "conjunto PET1287A10 de las HCDR") . El conjunto de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 puede tener las secuencias seleccionadas de los siguientes grupos: LCDR1 SEQ ID NO : 8, LCDR2 SEQ ID NO: 9, LCDR3 SEQ ID NO: 10 (denominados en la presente como el "conjunto PET1073G12 de las LCDR"); LCDR1 SEQ ID NO: 18, LCDR2 SEQ ID NO: 19, LCDR3 SEQ ID NO: 20 (denominados en la presente como el "conjunto PET1074B9 de las LCDR" ) ; LCDR1 SEQ ID NO: 28, LCDR2 SEQ ID NO: 29, LCDR3 SEQ ID NO: 30 (denominados en la presente como el "conjunto PET1287A10 de las LCDR") . El conjunto PET1073G12 de las HCDR junto con el conjunto PET1073G12 de las LCDR en la presente se denomina como el conjunto PET1073G12 de las CDR. El conjunto PET1074B9 de las HCDR junto con el conjunto PET1074B9 de las LCDR en la presente se denomina como el conjunto PET1074B9 de las CDR.

El conjunto PET1287A10 de las HCDR junto con el conjunto PET1287A10 de las LCDR en la presente se denomina como el conjunto PET1287A10 de las CDR. También se proporciona por la presente invención un dominio VH que comprende un conjunto de las HCDR como se expone en la presente, al igual que por separado un dominio VL que comprende un conjunto de las LCDR como se expone en la presente. De preferencia, este dominio VH se aparea con el dominio VL, y de mayor preferencia los apareamientos de los dominios VH y VL son iguales como en los clones mostrados en la presente. Además se proporciona por la presente invención un dominio VH que comprende un conjunto de las HCDR, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 en donde el conjunto de las HCDR corresponde al conjunto para PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 con una o dos sustituciones de aminoácidos . Además se proporciona por la presente invención un dominio VL que comprende un conjunto de las LCDR, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 en donde el conjunto de las CDR corresponde al conjunto para PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 con una o dos sustituciones de aminoácidos .

También se proporciona por la presente invención un miembro de unión específica que comprenden un sitio de unión con antígenos de un anticuerpo dentro de este dominio VH y/o VL . Siguiendo la guía de la química computacional para la aplicación de técnicas para análisis de datos multivariables a las relaciones de estructura/ propiedad-actividad (Wold, et al . Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics-Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed.: B. Kowaiski), D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holland, 1984 (ISBN 90-277-1846-6)) las relaciones de propiedad-actividad cuantitativa de anticuerpos se pueden derivar utilizando técnicas matemáticas bien conocidas tales como por ejemplo regresión estadística, reconocimiento y clasificación de patrones (Norman et al . Applied Regression Analysis. Wiley- Interscience ; 3ra. edición (Abril de 1998) ISBN: 0471170828; Abraham Kandel, Eric Backer. Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR; (11 de mayo de 1995), ISBN: 0133418847; Woj tek Krzanowski. Principies of Multivariate Analysis: A User's Perspective (Oxford Statistical Science Series, No 22 (Documento)) . Oxford University Press, (diciembre de 2000), ISBN: 0198507089; lan H. Witten, Eibe Frank. Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations . Morgan Kaufmann; (11 de octubre de 1999), ISBN: 1558605525; David G. T. Denison (Editor), Christopher C. Holmes, Bani K. Mallick, Adrián F. M. Smith. Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics) . John Wiley & Sons; (julio de 2002) , ISBN: 0471490369; Arup K. Ghose, Vellarkad. N. Viswanadhan. Combinatorial Library Design and Evaluation Principies, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery. ISBN: 0-8247-0487-8) . Las propiedades de los anticuerpos se pueden derivar de modelos empíricos y teóricos (por ejemplo, el análisis de residuos con probable contacto o una propiedad fisicoquímica calculada) de la secuencia del anticuerpo, las estructuras funcionales y tridimensionales y estas propiedades se pueden considerar individualmente y en combinación. El análisis de anticuerpos de una estructura atómica conocida ha aclarado las relaciones entre la secuencia y la estructura tridimensional de los sitios de unión con anticuerpos (Chothia C. et al. Journal Molecular Biology (1992) 227, 799-817; Al-Lazikani, et al . Journal Molecular Biology (1997) 273 (4), 927-948). Estas relaciones implican que, a excepción de la tercera región (asa) en los dominios VH, las asas del sitio de unión tienen una de unas cuantas conformaciones de cadena principal: estructuras canónicas. Se ha mostrado que la estructura canónica formada en un asa particular se determinará por su tamaño y la presencia de ciertos residuos en los sitios clave tanto en el asa como en las regiones de trama (Chothia et al . , y Al-Lazikani e t a l . , supra) . Este estudio de la relación secuencia-estructura se puede utilizar para la predicción de aquellos residuos en un anticuerpo de secuencia conocida, aunque de una estructura tridimensional desconocida, que son importantes para mantener la estructura tridimensional de sus asas de la CDR y por lo tanto mantener la especificidad de unión. Estas predicciones se pueden confirmar mediante la comparación de las predicciones del rendimiento a partir de los experimentos de optimización. En un procedimiento estructural, se puede crear un modelo teórico de la molécula del anticuerpo (Chothia, et al . , Science, 223, 755-758 (1986)) utilizando cualquier paquete gratuito o comercial disponible tal como por ejemplo WAM (Whitelegg, N.R.u. and Rees, A.R (2000) Prot. Eng., 12, 815-824). Un paquete de software para visualización y análisis de proteínas tal como por ejemplo, Insight II (Accelerys, Inc.) o Deep View (Guex, N. and Peitsch, M.C. Electrophoresis (1997) 18, 2714-2723) entonces se puede utilizar para evaluar las posibles substituciones en cada posición en la CDR y FR . Esta información entonces se puede utilizar para realizar substituciones probablemente para tener un efecto mínimo o beneficioso sobre la actividad. Las técnicas requeridas para realizar las substituciones dentro de secuencias de aminoácidos de las CDR, los dominios VH o VL del anticuerpo y los miembros de unión específica en general están disponibles en la técnica. Se pueden producir secuencias variables, con las substituciones que se pueden o no predecir para que tengan un efecto mínimo o beneficioso sobre la actividad, y se pueden probar para la capacidad de unirse y/o neutraliar el TGFß y/o para cualquier otra propiedad deseada. Esto se analiza adicionalmente más adelante. Como ya se observó, la presente invención proporciona miembros de unión específica que comprenden un conjunto definido de las CDR, en particular el conjunto de las CDR de PET1073G12, PET1074B9 y PET1287A10, y los conjuntos de las CDR de PET1073G12, PET1074B9 o de PET1287A10 con uno o dos substituciones dentro del conjunto de las CDR. El conjunto relevante de las CDR se proporciona dentro de las regiones de trama del anticuerpo o de otras estructuras de la proteína, por ejemplo, fibronectina o citocromo B. De preferencia se emplean las regiones de trama del anticuerpo. En una modalidad preferida, la cadena pesada utiliza un gen de la familia VH1 humano. En diversas modalidades, la secuencia de aminoácidos en la trama de cadena pesada contiene 1-12, de preferencia 3-12 y de mayor preferencia 3-8 diferencias de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de línea germinal del gen de la familia VH1 humano. En algunas modalidades, la secuencia en la trama de cadena pesada es la secuencia de la línea germinal. En modalidades particularmente preferidas, la región en la trama del anticuerpo para la cadena pesada puede ser DP-10 humana (VH 1-69) o DP-88 humana (VH 1-e) de la familia VH1. De preferencia, las modalidades que utilizan un gen DP-10 humano tienen un aminoácido que no es de la línea germinal en los residuos 27, 78 y 94. En algunas modalidades, el residuo 27 es tirosina, el residuo 78 es treonina y el residuo 94 es serina o leucina. En algunas modalidades, la cadena ligera utiliza un gen humano de la familia V?3 con 1-5, de preferencia 1-4, de mayor preferencia 1-3 diferencias de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal. En algunas modalidades, la secuencia en la trama de cadena ligera es la secuencia del gen humano de la familia V?3 de la línea germinal. En modalidades particularmente preferidas, la región de trama para la cadena ligera puede ser DPK-22 humana (A27) . En algunas de estas modalidades, el residuo 2 es un aminoácido que no es de línea germinal. En algunas modalidades el residuo 2 es una treonina. En una modalidad bastante preferida, se proporciona un dominio VH con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, ésta se denomina el "dominio VH de PET1073G12", o la SEQ ID NO: 12, ésta se denomina el "dominio VH de PET1074B9" , o la SEQ ID NO: 22, ésta se denomina el "dominio VH de PET1287A10" . En una modalidad adicional bastante preferida, se proporciona un dominio VL con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, ésta se denomina el "dominio VL de PET1073G12" , o la SEQ ID NO: 17, ésta se denomina el "dominio VL de PET1074B9", o la SEQ ID NO: 27, ésta se denomina el "dominio VL de PET1287A10" . Una modalidad bastante preferida proporcionada de acuerdo con la presente invención se compone del dominio VH de PET1073G12, la SEQ ID NO: 2, y el dominio VL de PET1073G12, la SEQ ID NO: 7. Otra modalidad bastante preferida proporcionada de acuerdo con la presente invención se compone del dominio VH de PET1074B9, la SEQ ID NO: 12, y el dominio VL de PET1074B9, la SEQ ID NO: 17. Otra modalidad bastante preferida proporcionada de acuerdo con la presente invención se compone del dominio VH de PET1287A10, la SEQ ID NO: 22, y el dominio VL de PET1287A10, la SEQ ID NO: 27. Éstos o cualquier otro sitio de unión con antígenos del anticuerpo proporcionado de acuerdo con la presente invención se puede proporcionar dentro de cualquier formato deseado de la molécula del anticuerpo, por ejemplo, scFv, Fab, IgGl, IgG4, dAb etc., como se analiza adicionalmente a otra parte en la presente. En una modalidad adicional bastante preferida, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo IgG4 que comprende el dominio VH de PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10, de preferencia que también comprende el dominio VL de PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 correspondiente.

Se proporcionan por la presente invención otro IgG4 u otras moléculas del anticuerpo que comprenden el dominio VH de PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10, y/o el dominio VL de PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10, al igual que otras moléculas de anticuerpo que comprenden el conjunto PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 de las HCDR dentro de un dominio VH del anticuerpo, y/o el conjunto PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 de las LCDR dentro de un dominio del anticuerpo VL . Es conveniente precisar aquí que "y/o" cuando se utiliza en la presente se debe tomar como una exposición específica de cada una de las dos características o componentes especificados o sin el otro. Por ejemplo "A y/o B" se debe tomar como la exposición específica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, justo como si cada uno se precisara individualmente en la presente. Como se observa, en ciertas modalidades de la presente invención se proporciona un miembro de unión específica que une las tres isoformas del TGFß humano y que comprende el dominio VH y/o VL de PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 o las porciones de unión con antígenos de aquellos dominios.

En algunas modalidades, un dominio VH se aparea con un dominio VL para proporcionar un sitio de unión con antígenos. En una modalidad preferida, el dominio VH de PET1073G12 (SEQ ID NO: 2) se aparea con el dominio VL de PET1073G12 (SEQ ID NO: 7) para formar un sitio de unión con antígenos que comprenda ambos de los dominios VH y VL de PET1073G12. En una modalidad preferida, el dominio VH de PET1074B9 (SEQ ID NO: 12) se aparea con el dominio VL de PET1074B9 (SEQ ID NO: 17) , para formar un sitio de unión con antígenos que comprenda ambos de los dominios VH y VL de PET1074B9. En una modalidad preferida, el dominio VH de PET1287A10 (SEQ ID NO: 22) se aparea con el dominio VL de PET1287A10 (SEQ ID NO: 27), para formar un sitio de unión con antígenos del anticuerpo que comprenda ambos dominios VH y VL de PET1287A10. En otras modalidades el VH de PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 se aparea con un dominio VL con excepción del VL de PET1073G12, PET1074B9 O PET1287A10 correspondiente. Queda bien establecida en la técnica la promiscuidad de cadena ligera. De manera similar, se puede proporcionar cualquier conjunto de las HCDR expuesto en la presente en un dominio VH que se utilice como un miembro de unión específica solo o en combinación con un dominio VL . Un dominio VH se puede proporcionar con un conjunto de las HCDR como se expone en la presente, y si este dominio VH se aparea con un dominio VL, entonces el dominio VL se puede proporcionar con un conjunto de las LCDR expuestos en la presente. Un apareamiento de un conjunto de las HCDR y un conjunto de las LCDR puede ser como se expone en la presente para los anticuerpos PET1073G12, PET1074B9 y PET1287A10. Las regiones en la trama de los dominios VH y/o VL pueden ser las estructuras de la línea germinal. Las regiones en las tramas del dominio de cadena pesada se pueden seleccionar de la familia VH-1, y una trama VH-1 preferida es la trama DP-10 o DP-88. Las regiones en la trama de la cadena ligera se pueden seleccionar de la familia V?3 , y una trama preferida es DPK-22. Una o más de las CDR se puede tomar de un dominio VH o VL del cual se expone la secuencia en la presente y se incorpora en una trama adecuada. Ésta se analiza adicionalmente en la presente. Lo mismo se aplica para otras CDR y los conjuntos de las CDR de los anticuerpos como se obtuvo utilizando los métodos descritos en la presente. Un dominio VH del anticuerpo, un dominio VL del anticuerpo, un conjunto de las HCDR, un conjunto de las LCDR, un conjunto de las CDR, uno o más de las HCDR por ejemplo, una HCDR3 , y/o uno o más de las LCR por ejemplo, una LCDR3 , se pueden emplear en cualquier aspecto y modalidad de la presente invención como se expone en la presente para otras moléculas, por ejemplo los métodos de mutación y selección de los sitios de unión con antígenos con potencia mejorada. Las variantes de los dominios VH y VL y las CDR de la presente invención, incluyendo aquellos para los cuales las secuencias de aminoácidos se precisan en la presente, y que se pueden emplear en los miembros de unión específica para el TGFß se pueden obtener por medio de los métodos para alteración o mutación y selección de secuencias. También se proporcionan por la presente invención estos métodos . Las variantes de la secuencia de aminoácidos de dominio variable de cualquiera de los dominios VH y VL cuyas secuencias se exponen específicamente en la presente se pueden emplear de acuerdo con la presente invención, como se analiza. Las variantes particulares pueden incluir unas o más alteraciones de la secuencia de aminoácidos (adición, supresión, substitución y/o inserción de un residuo de aminoácidos), pueden ser menos de aproximadamente 20 alteraciones, menos de aproximadamente 15 alteraciones, menos de aproximadamente 10 alteraciones o menos de aproximadamente 5, 4, 3, 2 ó 1 alteraciones. Las alteraciones se pueden realizar en una o más regiones en la trama y/o uno o más de las CDR. De acuerdo con aspectos adicionales de la presente invención se proporciona un miembro de unión específica humano, humanizado, quimérico o sintético que compite o compite en cruce para la unión al antígeno con cualquier miembro de unión específica que tanto une al antígeno como comprende una región de unión con antígenos del anticuerpo específico, el dominio VH y/o VL expuestos en la presente, el conjunto de las CDR o HCDR3 expuesto en la presente, o una variante de cualquiera de éstos. La competición entre los miembros de unión se puede analizar fácilmente in vi tro , por ejemplo al utilizar ELISA y/o al marcar una molécula reportera específica con un miembro de unión que se puede detectar en presencia de otros miembros de unión sin marcar, para permitir la identificación de los miembros de unión específica que se unen al mismo epítope o un epítope de traslape. La competición de cruce entre los miembros de unión se puede analizar fácilmente al ejecutar un análisis inverso, por ejemplo, al invertir los miembros de unión marcados y sin marcar para identificar los pares que bloquean la unión en ambas direcciones. De esta forma, un aspecto adicional de la presente invención proporciona un miembro de unión específica que comprende un sitio de unión con antígenos de un anticuerpo que compite o compite en cruce con una molécula de anticuerpo PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10, en particular scFv e IgG4 de PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10, para unirse al TGFß. En diversas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado, quimérico o sintético. En aspectos adicionales, la presente invención proporciona un miembro de unión específica que comprende un sitio de unión con antígenos de un anticuerpo humano, humanizado, quimérico o sintético que compite o compite en cruce con un sitio de unión con antígenos de la presente invención para unirse al TGFß, en donde el sitio de unión con antígenos del anticuerpo humano, humanizado, quimérico o sintético se compone de un dominio VH y un dominio VL, y en donde los dominios VH y VL comprenden un conjunto de las CDR como se expone en la presente.

Dada la información expuesta en la presente, están disponibles en la técnica diversos métodos para obtener anticuerpos humanos, humanizados, quiméricos o sintéticos contra el TGFß y que pueden competir o competir en cruce con una molécula de anticuerpo de PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10, una molécula de anticuerpo con un conjunto PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 de las CDR, una molécula de anticuerpo con un conjunto PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 de las HCDR, o una molécula de anticuerpo con un conjunto PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 de las LCDR, para unirse al TGFß. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para obtener uno o más miembros de unión específica capaces de unirse a TGFßl, TGF2ß y TGF3ß, el método incluye poner en contacto una biblioteca de miembros de unión específica de acuerdo con la invención y los TGFß, y seleccionar uno o más miembros de unión específica de la biblioteca capaces de unirse a todos los TGFß. La biblioteca se puede exhibir sobre la superficie de las partículas del bacteriófago, cada partícula contiene ácido nucleico que codifica para el dominio de la variable VH del anticuerpo exhibido sobre su superficie, y opcionalmente también un dominio VL exhibido si está presente. Después de la selección de los miembros de unión específica capaces de unirse al antígeno y exhibidos sobre las partículas del bacteriófago, el ácido nucleico se puede extraer de una partícula del bacteriófago que exhiba un miembro de unión específica seleccionado. Este ácido nucleico se puede utilizar en la producción posterior de un miembro de unión específica o un dominio de la variable VH del anticuerpo (y opcionalmente un dominio de la variable VL del anticuerpo) mediante la expresión de un ácido nucleico con la secuencia del ácido nucleico extraído de una partícula del bacteriófago que exhibe un miembro de unión específica seleccionado. Un dominio VH del anticuerpo con la secuencia de aminoácidos de un dominio VH del anticuerpo de un miembro de unión específica seleccionado se puede proporcionar en forma aislada, al igual que un miembro de unión específica puede comprender este dominio VH . La capacidad de unirse a las tres isoformas del TGFß se puede probar adicionalmente, también la capacidad para competir o competir en cruce con PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 (por ejemplo, en el formato scFv y/o el formato IgG, por ejemplo, IgG4) para unirse a las tres isoformas humanas del TGFß. Como se analizará adicionalmente más adelante, se puede probar la capacidad para neutralizar el TGFß. Un miembro de unión específica de acuerdo con la presente invención puede unirse al TGFßl, TGFß2 y/o TGFß3 con la afinidad de una molécula de anticuerpo PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10, por ejemplo, scFv, o de preferencia IgG4 , o con una afinidad que sea mayor a la de las moléculas anteriores. Un miembro de unión específica de acuerdo con la presente invención puede neutralizar el TGFßl, TGFß2 y/o TGFß3 con la potencia de una molécula del anticuerpo PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10, por ejemplo, scFv, o de preferencia IgG4 de PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10, o con una potencia que es mayor que una de las moléculas anteriores. Un miembro de unión específica de acuerdo con la presente invención puede neutralizar el TGFß que se presenta en la naturaleza con la potencia de una molécula del anticuerpo PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10, por ejemplo, scFv, o de preferencia IgG4 , o con una potencia que es mayor a la de una de las moléculas anteriores. Bajo condiciones adecuadas se puede comparar la afinidad de unión y la potencia de neutralización de diferentes miembros de unión específica . Una modalidad preferida de la presente invención comprende de preferencia anticuerpos humanos, humanizados, quiméricos o sintéticos que neutralizan el TGFß que se presenta en la naturaleza con una potencia que es igual o mayor a la potencia de un sitio de unión con antígenos del TGFß formado por el dominio VH de PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 y el dominio VL de PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 correspondiente. Además de las secuencias de anticuerpos, un miembro de unión específica de acuerdo con la presente invención puede comprender otros aminoácidos, por ejemplo, la formación de un péptido o polipéptido, tal como por ejemplo un dominio plegado, o para impartir a la molécula otra característica funcional además de la capacidad para unirse al antígeno. Los miembros de unión específica de la invención pueden portar una marca detectable, o se pueden conjugar con una toxina o una entidad o enzima blanco (por ejemplo, vía un enlace de peptidilo o enlazante) .

En aspectos adicionales, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica para un miembro de unión específica, un dominio VH y/o un dominio VL o CDR de de acuerdo con la presente invención, y los métodos para preparar un miembro de unión específica, un dominio VH y/o un dominio VL o CDR de la invención, los métodos comprenden expresar el ácido nucleico bajo condiciones para llevar a cabo la producción del miembro de unión específica, el dominio VH y/o el dominio VL, o CDR y recuperarla. Los miembros de unión específica de acuerdo con la invención se pueden utilizar en un método para tratamiento o diagnóstico del cuerpo humano o animal, este método de tratamiento (que puede incluir tratamiento profiláctico) de una enfermedad o trastorno en un paciente humano, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un miembro de unión específica de la invención. Las condiciones que se pueden tratar de acuerdo con la presente invención incluyen cualesquiera en las cuales el TGFß desempeñe una función, en especial el tratamiento de una enfermedad fibrótica, la modulación de la curación de heridas y el tratamiento del cáncer.

Más particularmente, los miembros de unión específica de la invención son útiles para inhibir la actividad de cualquiera o la totalidad de las tres isoformas del TGFß humano in vi tro o in vi vo . Estas actividades incluyen de manera enunciativa la señalización suministrada por el TGFß, la deposición de la matriz extracelular (ECM) , la inhibición de la proliferación celular epitelial y endotelial, estimulando la proliferación de músculo liso, la inducción de la expresión de colágeno tipo III, la inducción del TGF-ß, fibronectina, la expresión de VEGF e IL-11, la unión del Péptido Asociado con Latencia, inmunosupresión inducida por tumores, promoción de la angiogénesis, miof ibroblastos activantes, promoción de metástasis e inhibición de la actividad de las células NK. Los miembros de unión específica de la invención también son útiles para tratar enfermedades y condiciones que resultan directa o indirectamente de la actividad del TGFß. Debido a que los miembros de unión específica de la invención son pan-específicos, es decir, se unen e inhiben la actividad de la totalidad de las tres isoformas del TGFß, son particularmente ventajosos para tratar las condiciones y enfermedades que implican dos o más isoformas del TGFß (tales como por ejemplo infecciones y tumores) y condiciones severas donde es conveniente inhibir múltiples blancos. Los miembros de unión específica son útiles para tratar enfermedades y condiciones que incluyen de manera enunciativa, enfermedades fibróticas (tales como por ejemplo glomerulonefritis, cicatrización neural, cicatrización cutánea, fibrosis pulmonar, fibrosis inducida por radiación, fibrosis hepática, mielof ibrosis ) , quemaduras, enfermedades inmuno provocadas, enfermedades inflamatorias (incluyendo artritis reumatoide), rechazo a trasplantes, cáncer, contracción de Dupuytren, y úlceras gástricas . También son útiles para tratar, prevenir y reducir el riesgo de que se presenten insuficiencias renales incluyendo de manera enunciativa: nefropatía diabética (tipo I y tipo II) , nefropatía por radiación, nefropatía obstructiva, esclerosis sistémica difusa, fibrosis pulmonar, rechazo a aloinjertos, enfermedad renal hereditaria (por ejemplo, enfermedad renal policística, riñon esponjoso medular, riñon en herradura), glomerulonefritis, nef roesclerosis , nefrocalcinosis , lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren, enfermedad de Berger, hipertensión sistémica o glomerular, nefropatía túbulointersticial , acidosis tubular renal, tuberculosis renal e infarto renal. En particular, son útiles cuando se combinan con los antagonistas del sistema de renina-angiotensina-aldosterona incluyendo de manera enunciativa: inhibidores de renina, inhibidores de la enzima convertidota de angiotensina (ACE) , antagonistas del receptor Ang II (también conocidos como "bloqueadores del receptor Ang II), y antagonistas de aldosterona. Los métodos para utilizar los miembros de unión específica de la presente invención en combinación con de estos antagonistas se muestran en el PCT/US04/13677 , el contenido del cual se incorpora en la presente como referencia. Los miembros de unión específica de la invención también son útiles para tratar las enfermedades y condiciones asociadas con la deposición de ECM, las enfermedades y condiciones incluyen esclerosis sistémica, adhesiones postoperatorias, cicatrización queloidea e hipertrófica, vitreo-ret inopatía proliferativa, cirugía para drenado de glaucoma, lesión córnea, catarata, enfermedad de Peyronie, síndrome de distrés respiratorio en adultos, cirrosis del hígado, cicatrización por infarto de miocardio posterior, restenosis por angioplastía posterior, cicatrización posterior a una hemorragia subaracnoidea, esclerosis múltiple, fibrosis después de laminectomía , fibrosis después de reparaciones de tendón y otras, cicatrización debida a la eliminación de tatuajes, cirrosis biliar (incluyendo colangitis esclerosante), pericarditis, pleuresía, traqueotomía, lesión del CNS penetrante, síndrome miálgico eosinof ílico, restenosis vascular, enfermedad veno-oclusiva, pancreatitis y artropatía psoriática. Los miembros de unión específica de la invención además son útiles en condiciones donde es beneficiosa la promoción de la re-epitelialización. Estas condiciones incluyen de manera enunciativa enfermedades de la piel, tales como por ejemplo úlceras venosas, úlceras isquémicas (úlceras por presión), úlceras diabéticas, sitios de injerto, sitios donadores de injertos, abrasiones y quemaduras, enfermedades del epitelio bronquial, tales como por ejemplo asma, ARDS, enfermedades del epitelio intestinal, tales como por ejemplo mucositis asociada con tratamiento citotóxico, úlceras esofágicas (enfermedad de reflejos) , úlceras estomacales, lesiones del intestino delgado y del intestino grueso (enfermedad inflamatoria del intestino) . Los usos todavía adicionales de los miembros de unión específica de la invención son en condiciones en las cuales es adecuada la proliferación celular endotelial, por ejemplo, para estabilizar las placas ateroscleróticas, al estimular la curación de anastomosis vasculares, o en condiciones en las cuales es adecuada la inhibición de la proliferación de células del músculo liso, por ejemplo en una enfermedad arterial, restenosis y asma . Los miembros de unión específica de la invención también son útiles para intensificar la respuesta inmunitaria a infecciones provocadas por macrófagos tales como por ejemplo aquellas provocadas por Leishmania spp., Trypanosorna Cruzi, tuberculosis por Mycobacterium y lepra por Mycobacterium, así como también el Toxoplasma gondii por protozoarios, el hongo capsulatum Histoplasma, Candida albicans, Candida parapsilosis , y Cryptococcus neoformans, y Rickettsia, por ejemplo, R. prowazekii, R. coronii, y R. tsutsugamushi . También son útiles para reducir la inmunosupresión provocada por ejemplo por tumores, SIDA o enfermedades granulomatosas.

Los miembros de unión específica de la invención además son útiles en el tratamiento de enfermedades hiperproliterativas , tales como por ejemplo cánceres incluyendo de manera enunciativa cánceres de mama, prostático, ovárico, estomacal, renal, pancreático, colorrectal, cutáneo, pulmonar, cervical y de vejiga, glioma, mesotelioma, así como también diversas leucemias y sarcomas, tales como por ejemplo sarcoma de Kaposi, y en particular son útiles para tratar o prevenir reapariciones o metástasis de estos tumores. En particular, los miembros de unión específica antagonista de la invención son útiles para inhibir las metástasis provocadas por ciclosporina . Por supuesto se apreciará que en el contexto de la terapia del cáncer, "tratamiento" incluye cualquier intervención médica que dé por resultado en el retraso del crecimiento de tumores o la reducción en la metástasis de tumores, así como también la remisión parcial del cáncer para prolongar la esperanza de vida de un paciente. Un aspecto adicional de la presente invención proporciona ácido nucleico, en general aislado, que codifica para un dominio de la variable VH del anticuerpo y/o el dominio de la variable VL expuestos en la presente. Otro aspecto de la presente invención proporciona ácido nucleico, en general aislado, que codifica para una secuencia de HCDR o LCDR expuesta en la presente, especialmente un HCDR seleccionado de las SEQ ID NOS: 3, 4, 5, 13, 14, 15, 23, 24 y 25 o un CDR de VL seleccionado de las SEQ ID NOS: 8, 9, 10, 18, 19, 20, 28, 29, 30, de mayor preferencia HCDR3 de PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 (SEQ ID NO: 5, 15 o 25, respectivamente) . Los ácidos nucleicos que codifican para el conjunto PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 de las CDR, los ácidos nucleicos que codifican para el conjunto PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 de las HCDR y los ácidos nucleicos que codifican para el conjunto PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 de las LCDR también se proporcionan por la presente invención, al igual que los ácidos nucleicos que codifican para las CDR, las HCDR, las LCDR individuales, y los conjuntos de las CDR, las HCDR, las LCDR de PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10. Un aspecto adicional proporciona una célula hospedera transformada con el ácido nucleico de la invención .

Todavía un aspecto adicional proporciona un método para la producción de un dominio de la variable VH del anticuerpo, el método incluye provocar la expresión del ácido nucleico codificante. Este método puede comprender cultivar las células hospederas bajo las condiciones para la producción del dominio de la variable VH del anticuerpo o provocar que el dominio VH del anticuerpo se exprese in vi vo . Como aspectos adicionales de la presente invención se proporcionan métodos análogos para la producción de los dominios variables VL y los miembros de unión específica que comprenden un dominio VH y/o VL . Un método de producción puede comprender un paso de aislamiento y/o purificación del producto. Un método de producción puede comprender formular el producto en una composición incluyendo al menos un componente adicional, tal como por ejemplo, un excipiente farmacéuticamente aceptable. Éstos y otros aspectos de la invención se describirán con mayor detalle más adelante.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION TERMINOLOGÍA Miembro de unión específica Esto describe un miembro de un par de las moléculas que tienen especificidad de unión entre sí. Los miembros de un par de unión específica se pueden derivar naturalmente o se producen total o parcialmente de manera sintética. Un miembro del par de moléculas tiene un área sobre su superficie, o una cavidad, que se une específicamente a un área sobre la superficie, o una cavidad en el otro miembro del par de moléculas. De esta forma, los miembros del par tienen la propiedad de unirse específicamente entre sí. La presente invención se relaciona con miembros de unión específica que se unen a un antígeno de blanco.

Específico Esto se puede utilizar para hacer referencia a la situación en la cual un miembro de unión específica no mostrará ninguna unión significativa a moléculas distintas de sus compañeras de unión específica de un animal determinado. Por ejemplo, un miembro de unión específica para el TGFß humano no tendrá unión significativa con otras moléculas humanas que no son del TGF-ß sin embargo puede tener reacción cruzada con el TGF-ß de otras especies. Un miembro de unión específica para unión con antígenos comprende un sitio de unión con antígenos. Por ejemplo, un miembro de unión específica puede ser una molécula de anticuerpo. Un sitio de unión con antígenos también se puede proporcionar por medio del arreglo de las CDR en estructuras proteínicas que no son de anticuerpos tales como por ejemplo fibronectina o citocromo B, etc. Koide et al . , (1998) Journal of Molecular Biology, 284:1141-1151; Nygren et al. (1997) Current Opinión in Structural Biology, Vol. 7:463-469) . Las estructuras para los sitios de unión novedosos sometidos a ingeniería en proteínas se han repasado en detalle por Nygren et al . , supra. Las estructuras proteínicas para los imitadores de anticuerpos se exponen en la WO 00/4784 que describe proteínas (imitadores de anticuerpos) que incluyen un dominio tipo III de fibronectina que tiene al menos un asa seleccionada al azar. Una estructura adecuada en la cual injertar uno o más de las CDR, por ejemplo, un conjunto de las HCDR, se puede proporcionar mediante cualquier miembro del dominio de la superfamilia del gen de inmunoglobulina. La estructura puede ser una proteína humana o no humana.

Una ventaja de una estructura proteínica que no es de anticuerpo es que puede proporcionar un sitio de unión con antígenos en una región de trama conservada que sea más pequeña y/o más fácil de producir que al menos algunas moléculas de anticuerpos. El tamaño pequeño de un miembro de unión específica puede conferir propiedades fisiológicas útiles tales como por ejemplo una capacidad para incorporarse en células, penetrar profundamente en tejidos o alcanzar blancos dentro de otras estructuras, o unirse dentro de las cavidades proteínicas del antígeno blanco. El uso de los sitios de unión con antígenos en estructuras proteínicas que no son de anticuerpos se repasa en Wess, 2004. Las proteínas típicas son las que tienen una estructura estable y una o más asas variables, en las cuales la secuencia de aminoácidos del asa o asas se muta específica o aleatoriamente para crear un sitio de unión con antígenos que tiene especificidad para unirse al antígeno blanco. Estas proteínas incluyen los dominios de unión IgG de la proteína A proveniente de S . aureus , transferrina, tetranectina , fibronectina (por ejemplo el 10o. dominio tipo III de fibronectin) y lipocalinas. Otros procedimientos incluyen "Microcuerpos" sintéticos (Selecore GmbH), que se basan en ciclótidos -pequeñas proteínas que tienen enlaces disulfuro intra-moleculares . Además de las secuencias de anticuerpos y/o un sitio de unión con antígenos, un miembro de unión específica de acuerdo con la presente invención puede comprender otros aminoácidos, por ejemplo, para formar un péptido o un polipéptido, tal como un dominio plegado, o para impartir a la molécula otra característica funcional además de la capacidad de unirse al antígeno. Los miembros de unión específica de la invención pueden portar una marca detectable, o se pueden conjugar con una toxina o una entidad o una enzima blanco (por ejemplo, vía un enlace o enlazante de peptidilo) . Por ejemplo, un miembro de unión específica puede comprender un sitio catalítico (por ejemplo, en un dominio enzimático) así como también un sitio de unión con antígenos, en donde el sitio de unión con antígenos se une al antígeno y de esta forma dirige el sitio catalítico al antígeno. El sitio catalítico puede inhibir la función biológica del antígeno, por ejemplo, mediante escisión. Aunque, como se observa, las CDR se pueden portar por estructuras tales como por ejemplo fibronectina o citocromo B (Haan y Maggos, 2004 BioCentury, 12 (5): A1-A6; Koide et al . , supra; Nygren et al . , supra ) , la estructura para portar una CDR o un conjunto de las CDR de la invención en general será de una secuencia de cadena pesada o ligera del anticuerpo o una porción substancial de la misma en la cual la CDR o conjunto de las CDR se ubica en una posición que corresponde a la CDR o al conjunto de las CDR de los dominios variables del anticuerpo VH y VL que se presenta en la naturaleza codificados por genes de inmunoglobulina redispuestos . Las estructuras y ubicaciones de los dominios variables de inmunoglobulina se pueden determinar al hacer referencia a Kabat, et al . , 1987, y las actualizaciones del mismo, actualmente disponibles en la Internet (http://immuno.bme.nwu.edu o encontrar en "Kabat" utilizando cualquier motor de búsqueda) .

Molécula del anticuerpo Esto describe una inmunoglobulina ya sea natural o producido parcial o totalmente de manera sintética. El término también cubre cualquier polipéptido o proteína que comprenda un dominio de unión con antígenos de un anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo que comprenden un dominio de unión con antígenos son moléculas tales como por ejemplo Fab, scFv, Fv, dAb, Fd y diacuerpos. En el genome de una célula de línea germinal humana, la información genética para las cadenas polipeptídicas del anticuerpo está contenida en múltiples segmentos del gen dentro de los locus dispersos a lo largo de diversos cromosomas. Las cadenas pesadas humanas (VH) se codifican en el cromosoma 14, las cadenas ligeras kappa (VK) en el cromosoma 2 y las cadenas ligeras lambda (V?) en el cromosoma 22. Durante el desarrollo de los Linfocitos B (células productoras de anticuerpos) , los segmentos génicos en estos locus se ensamblan mediante la recombinación que conduce a la formación de los genes de cadena completa pesada o ligera del anticuerpo (Tonegawa S. Nature, 302, 575-81, 1983). Las regiones constantes del anticuerpo (VH, V6 y V?) son bastante idénticas a lo largo de la población humana aunque existe una diversidad considerable dentro de los dominios variables. Esta diversidad permite el desarrollo de muchos miles de millones de diferentes anticuerpos cada uno con especificidad para un diferente antígeno blanco. La diversidad dentro de las regiones variables de anticuerpos se genera de diversas maneras. En primer lugar, a nivel genético existe una diversidad considerable dentro de las secuencias génicas variables de la línea germinal del anticuerpo. Se han descrito aproximadamente 50 líneas germinales VH diferentes (Tomlinson I.M. et al, J. Mol. Biol., 227, 776-798, 1992), 35 líneas germinales VK diferentes (Tomlinson I.M. et al EMBO J, 14, 4628-38, 1995) y 30 líneas germinales V? diferentes (Williams S.C. & Winter G. Eur. J. Immunol, 23, 1456-61, 1993 ; Kawasaki K, et al Genome Res, 7, 250-61, 1997) . Los anticuerpos se generan a partir de diferentes combinaciones de estas secuencias génicas de líneas germinales. La diversidad adicional luego es presenta en los dominios variables del anticuerpo mediante los procesos tales como por ejemplo recombinación y hipermutación somáticas (Tonegawa S. Nature, 302, 575-81, 1983) . Aunque existe una diversidad considerable dentro de secuencias génicas de línea germinal variable del anticuerpo, es posible para el grupo que las secuencias en las familias se basen en la homología de secuencia. Las 50 diferentes secuencias génicas VH se pueden agrupar en 7 familias, las 35 secuencias VK en 6 familias y las 30 familias V? en 10 familias. Los grupos varían de tamaño a partir de un miembro (VH6 y V? ) hasta 21 miembros (VH3) y los miembros de cada grupo comparten un alto grado de homología de secuencia. Los anticuerpos se pueden alinear con las bases de datos de las secuencias de la línea germinal VH y VL para determinar su coincidencia de línea germinal más cercana y para identificar cualesquiera cambios de aminoácidos presentados por hipermutación somática. La investigación ha mostrado que el sistema inmunitario humano utiliza algunas líneas germinales (por ejemplo, VH3 DP47) de preferencia con otras (por ejemplo, VH2) durante una respuesta inmunitaria (Knappik A. et al J. Mol. Biol, 296, 57-86, 2000) . Sin embargo, las poblaciones de anticuerpos aislados mediante la exhibición de fagos utilizan típicamente una amplia gama de genes de línea germinal, incluso cuando se aislan contra un solo antígeno (Edwards B. et al J. Mol Biol, 334, 103-118, 2003) . Es posible extraer anticuerpos monoclonal y otros y utilizar técnicas de la tecnología de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que conserven la especificidad del anticuerpo original. Estas técnicas pueden implicar la unión del ADN que codifica para una región variable de inmunoglobulina con una región constante, o introduciendo las regiones determinantes de complementariedad (CDR) , de un anticuerpo en la región constante más las regiones en la trama, de una inmunoglobulina diferente. Véase, por ejemplo, la EP-A-184187, GB 2188638A o EP-A-239400, y una gran cantidad de literatura posterior. Un hibridoma u otra célula que produce un anticuerpo se puede someter a mutación genética o a otros cambios, que puedan o no alterar la especificidad de unión de los anticuerpos producidos. A medida que los anticuerpos se puedan modificar en varias formas, el término "molécula del anticuerpo" se debe interpretar que cubre cualquier miembro de unión específica o sustancia que tenga un sitio de unión con antígenos de un anticuerpo con la especificidad requerida. De esta forma, este término cubre los fragmentos y derivados de anticuerpos, incluyendo cualquier polipéptido que comprenda un dominio de unión con antígenos, ya sea natural o total o parcialmente sintético. Por lo tanto se incluyen las moléculas quiméricas que comprenden un dominio de unión con antígenos de un anticuerpo, o equivalente, fusionado a otro polipéptido. La reproducción y expresión de anticuerpos quiméricos se describen en la EP-A-0120694 y EP-A- 0125023 , y una gran cantidad de literatura posterior. Técnicas adicionales disponibles en el campo de la ingeniería de anticuerpos han permitido aislar anticuerpos humanos y humanizados. Por ejemplo, los hibridomas humanos se pueden producir como se describe por Kontermann et al . (Kontermann R y Dubel Stefan; Arztijbody Engineering , Springer-Verlag New York, LLC; 2001, ISBN: 3540413545) . La exhibición de fagos, otra técnica establecida para la generación de los miembros de unión específica se ha descrito en detalle en muchas publicaciones tales como por ejemplo Kontermann et al . , supra, y la WO 92/01047 (analizado adicionalmente más adelante) . Los ratones transgénicos en los cuales los genes del anticuerpo de ratón se inactivan y se reemplazan funcionalmente con genes de anticuerpos humanos mientras que dejan intactos otros componentes del sistema inmunitario del ratón, se pueden utilizar para aislar anticuerpos humanos para antígenos humanos (Méndez et al . , 1997) . Los anticuerpos humanos, ya sea monoclonales o policlonales, también se pueden producir en otros animales transgénicos tales como por ejemplo cabras, vacas, ovejas, conejos, etc.

Las moléculas de anticuerpos sintéticos se pueden crear mediante expresión a partir de genes generados por medio de oligonucleótidos sintetizados y ensamblados dentro de vectores de expresión adecuados, por ejemplo como se describe por Knappik et al . , supra o Krebs et al . , Journal of Immunol ogi cal Me thods 254 2001 67-84. Se ha mostrado que los fragmentos de un anticuerpo entero pueden realizar la función de la unión con antígenos. Los ejemplos de fragmentos de unión son (i) el fragmento Fab que consiste de los dominios VL, CL, VH y CHI; (ii) el fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CHI ; (iii) el fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un solo anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (Ward, E.S. et al . , Na t ure 341, 544-546 (1989), McCafferty et al . (1990) Na t ure , 348, 552-554) que consiste en un dominio VH; (v) las regiones de la CDR aislada; (vi) los fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados (vii) las moléculas Fv de cadena individual (scFv) , en donde se enlazan un dominio VH y un dominio VL mediante un enlazante peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión con antígenos (Bird et al., Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al., Proc . Na t i . Acad . Sci USA 85, 5879-5883; 1998 viii) dímeros Fv de cadena individual biespecíficos (PCT/US92/ 09665 ) y (ix) "diacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecíf icos construidos por la fusión de genes (WO/13804); F. Holliger et al . , Proc . Na ti . Acad . Sci . USA 90 6444-6448, 1993) . Las moléculas de Fv, scFv o diacuerpo se pueden estabilizar mediante la incorporación de puentes disulfuro que enlazan los dominios VH y VL (Y. Reiter et al., Na t ure Bi o t ech , 14, 1239-1245, 1996) . También se pueden producir minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio CH3 (S. Hu et al . , Cáncer Res . , 56, 3055-3061, 1996). Un dAb (anticuerpo dominio) es un pequeño fragmento de unión con antígenos monomérico de un anticuerpo, a saber la región variable de una cadena pesada o ligera del anticuerpo (Holt et al . , 2003) .

Los dAb del VH se presentan naturalmente en camélidos (por ejemplo, camello, llama) y se pueden producir al inmunizar un camélido con un antígeno blanco, al aislar los linfocitos B antígeno-específ icos y al clonar directamente los genes del dAb a partir de linfocitos B individuales. Los dAb también se pueden producir en cultivo celular. Su tamaño pequeño, buena solubilidad y estabilidad de temperatura los hace particular y fisiológicamente útiles y adecuados para la selección y la maduración de afinidad. Un miembro de unión específica de la presente invención se puede un dAb que comprende un dominio VH o VL substancialmente como se precisa en la presente, o un dominio VH o VL que comprende un conjunto las CDR substancialmente como se precisa en la presente. Cuando se utilizarán anticuerpos biespecíficos, éstos pueden ser anticuerpos biespecíficos convencionales, que se pueden producir en una variedad de formas (Holliger, P. y Winter G. Current Opinión Biotechnol. 4, 446-449 (1993)), por ejemplo, preparados químicamente o a partir de hibridomas híbridos, o pueden ser cualquiera de los fragmentos de anticuerpo biespecíficos mencionados anteriormente. Los ejemplos de anticuerpos biespecíficos incluyen aquellos de la tecnología BiTEMR en la cual los dominios de unión de dos anticuerpos con diferente especificidad se pueden utilizar y enlazarse directamente vía péptidos flexibles cortos. Esto combina dos anticuerpos en una sola cadena polipeptídica corta. Los diacuerpos y scFv se pueden construir sin una región Fc , utilizando sólo dominios variables, al reducir potencialmente los efectos de la reacción anti-idiotípica . Los diacuerpos biespecíficos, según se oponen a los anticuerpos enteros biespecíficos, también pueden ser particularmente útiles debido a que se pueden construir y expresar fácilmente en E . col i . Los diacuerpos (y muchos otros polipéptidos tales como por ejemplo fragmentos de anticuerpo) de especificidades de unión adecuadas se pueden seleccionar fácilmente utilizando la exhibición de fagos (WO94/13804) a partir de las bibliotecas. Si una ramificación del diacuerpo se mantendrá constante, por ejemplo, con una especificidad dirigida contra el TGFß, luego se puede producir una biblioteca donde se varía la otra ramificación y un anticuerpo de especificidad adecuada seleccionada.

Los anticuerpos enteros biespecíficos se pueden producir mediante ingeniería de botones en orificios (C. E. B. Ridgeway et al., Pro t ein Eng . , 9, 616-621, 1996) .

Sitio de unión con antígenos Esto describe la porción de un miembro de unión específica, tal como por ejemplo, una molécula de anticuerpo, que esté en contacto y sea complementara con una porción o la totalidad de los otros miembros en el par de unión, es decir, el antígeno. En una molécula de anticuerpo, el sitio de unión con antígenos se puede denominar como el sitio de unión con antígenos del anticuerpo, y comprende la porción del anticuerpo que se une específicamente y es complementaria a la totalidad o porción del antígeno blanco. Cuando un antígeno es grande, un anticuerpo sólo se puede unir a una porción particular del antígeno, esa porción se denomina un epítope .

Dominio de unión con antígenos Un dominio de unión con antígenos es una porción de un miembro de unión específica que comprende un sitio de unión con antígenos y que se une al antígeno blanco. En algunas modalidades, se puede proporcionar un dominio de unión con antígenos mediante uno o más dominios variables de anticuerpos (por ejemplo, un denominado fragmento del anticuerpo Fd que consiste de un dominio VH) o las porciones de unión con antígenos de los mismos. En algunas modalidades, un dominio de unión con antígenos comprende una región variable de cadena ligera del anticuerpo (VL) y una región variable de cadena pesada del anticuerpo (VH) . Los miembros de unión específica se pueden glucosilar, ya sea naturalmente o mediante los sistemas de diversas células eucariotas (por ejemplo, células CHO o NSO (ECACC 85110503), o las mismas pueden estar sin glucosilar (por ejemplo si se producen mediante expresión en una célula procariota) . La glucosilación también se puede alterar intencionalmente, por ejemplo al inhibir la fucosilación, para aumentar la actividad ADCC del anticuerpo resultante. Por consiguiente, cualquiera de los miembros de unión específica de la invención se puede expresar para reducir al mínimo o eliminar la fucosilación . En algunas modalidades, la CDR o el dominio VH o VL de la invención será idéntico o bastante similar a las regiones específicas de las cuales la secuencia se precisa en la presente. Se contempla que de 1 a 5 , de preferencia de l a 4 ó l ó 2, o 3 ó 4, sustituciones de aminoácidos se pueden producir en la CDR y/o los dominios VH o VL . Los dominios VH o VL y las CDR y los conjuntos de CDR que son bastante similares a aquellos para los cuales las secuencias se proporcionan en la presente se abarcan por los aspectos de la presente invención, como son aquellos con secuencias que son prácticamente como se precisa en la presente. La estructura para portar una CDR o un conjunto las CDR de la invención en general será de una secuencia de cadena pesada o ligera del anticuerpo o una porción substancial de la misma, en la cual la CDR o conjunto de las CDR se ubica en una ubicación que corresponde a la CDR o conjunto de las CDR de los dominios variables del anticuerpo VH y VL que se presentan naturalmente codificados por los genes de inmunoglobulina redispuestos . Las estructuras y ubicaciones de los dominios variables de inmunoglobulina se pueden determinar mediante una referencia a Kabat, E.A. et al . , Sequences of Proteins of Immunologi cal In teres t . 4a. Edición. US Department of Health and Human Services. 1987, y actualizaciones del mismo, actualmente disponible en la Internet (http://inmuno.bme.nwu.edu o buscar "Rabat" utilizando cualquier motor de búsqueda) . Las CDR se definen de acuerdo con Kabat et al . Las CDR también se pueden portar por otras estructuras tales como por ejemplo fibronectina o citocromo B.

De preferencia, una secuencia de aminoácidos CDR prácticamente como se precisa en la presente se porta como una CDR en un dominio variable humano o una porción substancial del mismo. Las secuencias HCDR3 prácticamente como se precisa en la presente representan modalidades preferidas de la presente invención y se prefiere que cada una de éstas se porte como una HCDR3 en un dominio variable humano de cadena pesada o una porción substancial del mismo. Los dominios variables empleados en la invención se pueden obtener o derivar de cualquier línea germinal o dominio variable humano redispuesto, o puede ser un dominio variable sintético con base en secuencias consensúales o reales de dominios variables humanos conocidos. Una secuencia CDR de la invención (por ejemplo, CDR3 ) se puede introducir en un repertorio de dominios variables que carecen de una CDR (por ejemplo, CDR3 ) , utilizando tecnología de ADN recombinante. En la presente ya se han identificado las tramas de línea germinal preferidas. Por ejemplo, Marks et al . , (Bio/Technology , 1992, 10^ 779-783) describen los métodos para producir repertorios de dominios variables de anticuerpos en los cuales se utilizan cebadores consensúales dirigidos o adyacentes al extremo 5' del área de dominio variable conjuntamente con cebadores consensúales con la tercera región de trama de genes VH humanos para proporcionar un repertorio de los dominios variables VK que carecen de una CDR2. Marks e t al . , describen adicionalmente la forma en que este repertorio se puede combinar con una CDR2 de un anticuerpo particular. Utilizando técnicas análogas, las secuencias derivadas de CDR3 de la presente invención se pueden mezclar con los repertorios de los dominios VH o VL que carecen de una CDR3 , y los dominios VH o VL completos mezclados, combinados con un dominio VL o VH cognado para proporcionar los miembros de unión específica de la invención. El repertorio entonces se puede exhibir en un sistema hospedero adecuado tal como el sistema para exhibición de fagos de la WO92/01047 o cualquiera de una gran cantidad de literatura posterior, incluyendo Kay, B. K. , Winter, J., y McCafferty, J. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual , San Diego: Academic Press, de tal forma que se puedan seleccionar los miembros de unión específica adecuados. Un repertorio puede consistir de 104 miembros individuales, por ejemplo de 106 a 108 ó 1010 miembros. Otros sistemas hospederos adecuados incluyen la exhibición de levadura, la exhibición de bacterias, la exhibición de T7, la exhibición de ribosomas, la exhibición covalente, etc. Las técnicas de mezclado análogo o combinatorias también se exponen por Stemmer (Nature, 1994, 370:389-391), que describe la técnica con relación a un gen de ß-lactamasa aunque observa que el procedimiento se puede utilizar para la generación de anticuerpos. Una alternativa adicional es generar regiones VH o VL novedosas que porten las secuencias CDR-derivadas de la invención utilizando mutagénesis aleatoria de uno o más genes VH y/o VL seleccionados para generar mutaciones dentro del dominio variable total. Esta técnica se describe por Gram et al. (1992, Proc . Na t i . Acad . Sci . , USA, 89 : 3576-3580) , quienes utilizaron PCR propensa a errores. En modalidades preferidas, se realizan una o dos sustituciones de aminoácidos dentro de un conjunto de las HCDR y/o las LCDR. Otro método que se puede utilizar es dirigir la mutagénesis a las regiones de la CDR de los genes VH o VL . Estas técnicas se exponen por Barbas et al . , (1994, Proc . Na ti . Acad . Sci . , USA, 91 : 3809-3813) y Schier et al . (1996, J . Mol . Bi ol . 263 : 551-567) .

Todas las técnicas descritas anteriormente se conocen como tales en este campo y en sí mismas no forman parte de la presente invención. Dada la exposición proporcionada en la presente, el experto podrá utilizar estas técnicas para proporcionar los miembros de unión específica de la invención utilizando metodología rutinaria en la técnica. Un aspecto adicional de la invención proporciona un método para obtener un sitio de unión con antígenos de un anticuerpo específico para el antígeno del TGFß, el método comprende proporcionar mediante adición, supresión, substitución o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un dominio VH precisado en la presente un dominio VH que es una variante de la secuencia de aminoácidos del dominio VH, al combinar opcionalmente el dominio VH proporcionado de esta forma con uno o más dominios VL, y al probar el dominio VH o la combinación o combinaciones VH/VL para identificar un miembro de unión específica o un dominio de unión con antígenos específico para el TGFß y opcionalmente con una o más propiedades preferidas, de preferencia la capacidad para neutralizar la actividad del TGFß. El dominio VL puede tener una secuencia de aminoácidos que sea prácticamente como se precisa en la presente.

Se puede emplear un método análogo en el cual una o más variantes de la secuencia de un dominio VL expuesto en la presente se combinan con uno o más dominios VH . En una modalidad preferida, el dominio VH de PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 se puede someter a mutación para proporcionar una o más variantes de la secuencia de aminoácidos del dominio VH que se puedan combinar con uno o más dominios VL . Un aspecto adicional de la invención proporciona un método para preparar un miembro de unión específica, específico para las tres isoformas del TGFß humano, el método comprende: (a) proporcionar un repertorio de partida de ácidos nucleicos que codifican para un dominio VH que incluye ya sea una CDR3 que se reemplazará o carecerá de una región codificante CDR3 ,- (b) combinar el repertorio con un ácido nucleico donador que codifica para una secuencia de aminoácidos prácticamente como se precisa en la presente para un HCDR3 de tal forma que el ácido nucleico donador se inserte en la región CDR3 en el repertorio, para proporcionar un repertorio del producto de los ácidos nucleico que codifican ara un dominio VH ; (c) expresar los ácidos nucleicos del repertorio de productos; (d) seleccionar un miembro de unión específica, específico para al menos una isoforma del TGFß; y (e) recuperar el miembro de unión específica o el ácido nucleico que lo codifica. El método puede comprender además los pasos de llevar a cabo análisis de unión y análisis de neutralización con cada una de las tres isoformas del TGFß para identificar los miembros de unión específica que se unen y neutralizan las tres isoformas . Nuevamente, se puede emplear un método análogo en el cual un LCDR3 de la invención se combina con un repertorio de ácidos nucleicos que codifican para un dominio VL que incluyen ya sea una CDR3 que se reemplazará o carecerá de una región codificante CDR3. De manera similar, una o más, o las tres CDR se pueden injertar en un repertorio de dominios VH o VL que luego se seleccionan para un miembro de unión específica o los miembros de unión específica, específicos para todas las isoformas del TGFß humano.

El dominio VH puede tener una secuencia de línea germinal, y en modalidades preferidas es DP-10 o DP-88. Una secuencia del dominio VL puede tener una secuencia de línea germinal, y en modalidades preferidas es DPK-22 En una modalidad preferida, se pueden emplear una o más de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10, o el conjunto PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 de las HCDR, y/o una o más de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de PET1073G12, PET1074B9 O PET1287A10, o el conjunto PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 de las LCDR. Una porción substancial de un dominio variable de inmunoglobulina comprenderá al menos las tres regiones de la CDR, junto con sus regiones de trama intercalantes. De preferencia, la porción también incluirá al menos aproximadamente el 50% de cualquiera o ambas de las primeras y cuartas regiones de trama, el 50% que será el C-terminal 50% de la primera región de trama y el N-terminal 50% de la cuarta región de trama. Los residuos adicionales en el extremo N-terminal o C-terminal de la porción substancial del dominio variable pueden ser aquellos que no están asociados normalmente con las regiones de dominio variable que se presentan naturalmente.

Por ejemplo, la construcción de miembros de unión específica de la presente invención hecha mediante técnicas de ADN recombinante puede dar por resultado en la introducción de los residuos N o C-terminales codificados por los enlazantes introducidos para facilitar la clonación u otros pasos de manipulación. Otros pasos de manipulación incluyen la introducción de enlazantes para unir los dominios variables de la invención para las secuencias proteínicas adicionales que incluyen cadenas pesadas de inmunoglobulina, otros dominios variables (por ejemplo en la producción de diacuerpos) o marcas proteínicas como se analizará con mayor detalle a otra parte en la presente . Aunque en un aspecto preferido de la invención se prefieren miembros de unión específica que comprenden un par de dominios VH y VL, los dominios de unión individual con base en las secuencias del dominio ya sea VH o VL forman aspectos adicionales de la invención. Se sabe que los dominios de inmunoglobulina individual, en especial los dominios VH , son capaces de unirse a los antígenos blanco de una manera específica. En el caso de cualquiera de los dominios de unión específica, estos dominios se pueden utilizar para seleccionar los dominios complementarios capaces de formar un miembro de unión específica de dos dominios capaz de unirse a las tres isoformas del TGFß humano . Esto se puede alcanzar mediante los métodos de selección para exhibición de fagos utilizando el denominado procedimiento combinatorio dual jerárquico como se expone en la WO92/01047, en la cual se utiliza una colonia individual que contiene un clon de la cadena ya sea H o L. para infectar una biblioteca completa de clones que codifican para la otra cadena (L o H) y el miembro de unión específica de dos cadenas resultante se selecciona de acuerdo con las técnicas para exhibición de fagos tales como por ejemplo aquellos expuestos en esa referencia. Esta técnica también se expone en Marks et al . , ibi d . Los miembros de unión específica de la presente invención pueden comprender adicionalmente regiones constantes del anticuerpo o porciones del mismo. Por ejemplo, un dominio VL se puede unir en su extremo C-terminal a los dominios constantes de cadena ligera del anticuerpo incluyendo las cadenas humanas C? o C?, de preferencia las cadenas C? - De manera similar, un miembro de unión específica con base en un dominio VH se puede unir en su extremo C- terminal a la totalidad o una porción (por ejemplo, un dominio CH1) de una cadena pesada de inmunoglobulina derivada de cualquier isotipo del anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgA, IgE e IgM y cualesquiera subclases del isotipo, en particular IgGl e IgG4. Para algunas aplicaciones se prefiere IgG4 debido a que éste no se une al complemento y no crea funciones efectoras. Cuando se desea una función efectora, se prefiere IgGl . La función efectora también se puede aumentar al manipular el estado de glucosilación del anticuerpo, tal como por ejemplo al disminuir el contenido de fucosa, mediante métodos que se conocen en la técnica. La cadena pesada puede o no tener un residuo de lisina C-terminal. Para utilizarse en las modalidades de la presente invención también se prefiere cualquier variante de la región sintética u otra constante que tenga estas propiedades y estabilice las regiones variables . También dentro de la invención, se encuentran las preparaciones heterogéneas de los miembros de unión específica o los fragmentos de unión con antígenos de los mismos expuestos en la presente. Por ejemplo, estas preparaciones pueden ser mezclas de anticuerpos con cadenas pesadas de longitud total y cadenas pesadas que carecen de la lisina C-terminal, con diversos grados de glucosilación, con aminoácidos derivados, tales como por ejemplo ciclización de un ácido glutámico N-terminal para formar un residuo de ácido piroglutámico y/o con las formas desamidadas de la cadena pesada y/o ligera. Los miembros de unión específica de la invención se pueden marcar con una marca perceptible o funcional. Las marcas detectables incluyen radiomarcas tales como por ejemplo 131I o 99TC, que se puede unir a los anticuerpos de la invención utilizando la química convencional conocida en la técnica de la formación de imágenes de anticuerpos. Las marcas también incluyen marcas de la enzima tales como por ejemplo peroxidasa de rábano picante. Las marcas además incluyen entidades químicas tales como por ejemplo biotina que se pueden detectar vía la unión a una entidad perceptible cognada específica, por ejemplo, avidina marcada. Los miembros de unión específica de la presente invención se diseñan para ser utilizados en métodos para diagnóstico o tratamiento en sujetos humanos o animales, de preferencia seres humanos. En algunas modalidades, los miembros de unión específica de la invención inhiben la unión del TGFßl, 2 y/o 3 a un receptor del TGFß de superficie celular o complejo de receptores, incluyendo de manera enunciativa un complejo que comprende el tipo I o tipo II de la cinasa de serina/treonina y proteoglicano beta-glicano (receptor tipo III del TGFß) . Por consiguiente, la invención comprende un método para inhibir la unión de TGFß a un receptor TGFß de superficie celular o complejo de receptores que comprende el paso de poner el contacto el TGFß con un miembro de unión específica de la invención y detectar la inhibición de la unión al receptor o complejo de receptores. En diversas modalidades, la inhibición de la unión del TGFß a sus receptores se puede indicar por la fosforilación reducida del tipo I del receptor TGFß, la activación reducida del tipo I del receptor TGFß, la fosforilación reducida y/o la activación de las proteínas R-SMAD, en particular SMAD2 y SMAD3 , la translocación reducida de las proteínas SMAD al núcleo, la unión reducida de la proteína SMAD al ADN y/o la modulación de la expresión de un gen cuya expresión en la célula o tipo celular se sabe que se suministra por la señalización de TGFß. En los ejemplos se muestran análisis adicionales.

Por consiguiente, aspectos adicionales de la invención proporcionan métodos de tratamiento que comprenden la administración de un miembro de unión específica como se proporciona, las composiciones farmacéuticas que comprenden este miembro de unión específica, y el uso de este miembro de unión específica en la preparación de un medicamento para administración, por ejemplo en un método para elaborar un medicamento o composición farmacéutica que comprende formular el miembro de unión específica con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los miembros de unión específica de la invención se pueden administrar mediante inyección (por ejemplo, subcutánea, intravenosamente, intracavidad . (por ejemplo, después de la resección de tumores), intralesional , intraperitoneal o intramuscularmente), mediante inhalación, o tópicamente (por ejemplo intraocular, intranasal, rectal, en heridas, sobre la piel), u oralmente. La vía de administración se puede determinar por las características fisicoquímicas del producto, por las consideraciones especiales para la enfermedad, por la dosis o intervalo de dosis o por el requerimiento para optimizar la eficacia o para reducir al mínimo los efectos secundarios.

Se prevé que el tratamiento anti-TGFß no se restringirá a la administración por los profesionales del cuidado de la salud. Por lo tanto, puede ser adecuada la inyección subcutánea, utilizando en especial un dispositivo sin aguja. De acuerdo con la presente invención, las composiciones proporcionadas se pueden administrar a individuos que necesitan de las mismas. La administración de preferencia será en "una cantidad terapéuticamente eficaz" , ésta será suficiente para mostrar un beneficio para un paciente. Este beneficio puede ser al menos la mejora de un síntoma de una enfermedad o trastorno particular. La cantidad real administrada, y la velocidad y tiempo de administración, dependerán de la naturaleza y gravedad de la enfermedad que será tratada. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, las decisiones de dosificación, etc, se pueden determinar con base en estudios preclínicos y clínicos, el diseño de los cuales está de conformidad con el nivel de experiencia en la técnica. La dosis exacta dependerá de varios factores, incluyendo si el anticuerpo es para diagnóstico o para tratamiento, el tamaño y localización del área que se tratará, la naturaleza exacta del anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo entero, fragmento o diacuerpo) , y la naturaleza de cualquier marca detectable u otra molécula unida al anticuerpo. Una dosis típica de anticuerpos estará en la variación de lOOµg a lmg para aplicaciones sistémicas, y lµg a lmg para aplicaciones tópicas. Típicamente, el anticuerpo será un anticuerpo entero, de preferencia el isotipo IgG4. Ésta es una dosis para un tratamiento individual de un paciente adulto, que se puede ajustar proporcionalmente para niños y lactantes, y también se ajusta para otros formatos de anticuerpo en proporción al peso molecular y la actividad. Los tratamientos se pueden repetir diariamente, dos veces a la semana, semanalmente, mensualmente u otros intervalos, a discreción del médico. En modalidades preferidas de la presente invención, el tratamiento es periódico, . y el período entre administraciones es de aproximadamente dos semanas o más, de preferencia aproximadamente tres semanas o más, de preferencia aproximadamente cuatro semanas o más, o aproximadamente una vez al mes. Los miembros de unión específica de la presente invención se administrarán usualmente en la forma de una composición farmacéutica, que puede comprender al menos un componente además del miembro de unión específica. De esta forma, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención, y para utilizarse de acuerdo con la presente invención, pueden comprender, además del ingrediente activo, un excipiente, portador, tampón, estabilizador farmacéuticamente aceptable u otros materiales bien conocidos para aquellos con experiencia en la técnica. Estos materiales deben ser no tóxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. Estos materiales podrían incluir, por ejemplo, cualesquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes anti-bacterianos y antimicóticos, agentes isotónicos y para retardar la absorción, y lo semejante que sean fisiológicamente compatibles. Algunos ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables son agua, solución salina, solución salina amotiguada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y lo semejante, así como también las combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como por ejemplo manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. Los ejemplos adicionales de sustancias f rmacéuticamente aceptables son agentes humectantes o pequeñas cantidades de sustancias auxiliares tales como por ejemplo agentes humectantes o emulsionantes, conservadores o tampones, que aumentan la vida en anaquel o la eficacia del anticuerpo. La naturaleza exacta del portador u otro material dependerá de la vía de administración, que puede ser oral, tópica, mediante inhalación o mediante inyección, por ejemplo, intravenosa. En una modalidad preferida, el anticuerpo se administra mediante infusión o inyección intravenosa. En otra modalidad preferida, el anticuerpo se administra mediante inyección intramuscular o subcutánea. Las composiciones farmacéuticas para administración oral pueden estar en forma de tableta, cápsula, polvo o líquido por ejemplo, con un diluyente inerte o un portador comestible asimilable. Una tableta puede comprender un portador sólido tal como por ejemplo, gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas en general comprenden un portador líquido tal como por ejemplo, agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Se puede incluir solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos o glicoles tales como por ejemplo etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. El miembro de unión específica (y otros ingredientes, si se desea) también se pueden incluir en una cápsula de gelatina con revestimiento duro o suave, se puede comprimir en tabletas, o incorporar directamente en la dieta del sujecto. Para administración terapéutica oral, el ingrediente activo se puede incorporar con los excipientes y se puede utilizar en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas, y lo semejante. Para administrar un compuesto de la invención mediante otra administración distinta a la parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto, o co-administrar el compuesto con un material para prevenir su inactivación . Para inyección intravenosa, o inyección en el sitio de aflicción, el ingrediente activo estará en forma de solución acuosa parenteralmente aceptable que esté libre de pirógenos y tenga pK, isotonicidad y estabilidad adecuados. Aquellos expertos en la técnica serán capaces de preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como por ejemplo inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de Ringer lactada, conservadores, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos se pueden incluir, según se requiera. Una composición se puede administrar sola o en combinación con otros tratamientos, ya sea simultánea o secuencialmente dependiendo de la condición que se tratará. Los miembros de unión específica de la presente invención se pueden formular en formas líquida, semisólida o sólida tal como por ejemplo soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables y para infusión) , dispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo pretendido de administración, la aplicación terapéutica, las características fisicoquímicas de la molécula y la vía de suministro. Las formulaciones pueden incluir excipientes, o combinaciones de excipientes, por ejemplo: azúcares, aminoácidos y surfactantes. Las formulaciones líquidas pueden incluir una amplia gama de concentraciones de anticuerpos y pH . Las formulaciones sólidas se pueden producir mediante liofilización, atomización, o secado mediante tecnología de fluidos supercrítica, por ejemplo. Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de preparación y almacenaje. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura ordenada, adecuada para una alta concentración del fármaco. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar al incorporar el miembro de unión específica en la cantidad requerida en un solvente adecuado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido por esterilización filtrada. En general, las dispersiones se preparan al incorporar el compuesto activo en un vehículo estéril que contenga un medio de dispersión básica y los otros ingredientes requeridos a partir de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y liofilización que proporciona un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución filtrada estéril previamente del mismo. La fluidez adecuada de una solución se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como por ejemplo, lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de surfactantes. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede llevar a cabo al incluir en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. En ciertas modalidades, el compuesto activo de las composiciones de anticuerpo se puede preparar con un portador que protegerá el anticuerpo contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos, y sistemas para suministro microcapsulado . Se pueden utilizar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como por ejemplo, acetato etilenvinílico , polianhídridos , ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres , y ácido poliláctico. Muchos de los métodos para la preparación de estas formulaciones están patentados o se conocen en general por aquellos expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sus tained and Control l ed Reléase Drug Del ivery Sys tems (J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978).

La presente invención proporciona un método que comprenden provocar o permitir la unión de un miembro de unión específica como se proporciona en la presente para el TGFß. Como se observa, esta unión se puede se llevar a cabo in vi vo , por ejemplo, después de la administración de un miembro de unión específica, o del ácido nucleico que codifica para un miembro de unión específica, a un paciente o se puede llevar a cabo in vi tro , por ejemplo en ELISA, transferencia Western, inmunocitoquímica, inmunoprecipitación, cromatografía de afinidad, o análisis con base celular, o ex vi vo con base en métodos terapéuticos (por ejemplo, los métodos en los cuales las células o fluidos corporales se ponen en contacto ex vi vo con un miembro de unión específica de acuerdo con la invención y luego se administra a un paciente. Se puede determinar la cantidad de unión del miembro de unión específica al TGPß . La cuantificación se puede relacionar con la cantidad del antígeno en una muestra de prueba, que puede ser de interés diagnóstico. Como un aspecto de la presente invención también se proporciona un equipo que comprenden un miembro de unión específica o una molécula de anticuerpo de acuerdo con cualquier aspecto o modalidad de la presente invención. En un equipo de la invención, el miembro de unión específica o molécula de anticuerpo se puede marcar para permitir su reactividad en una muestra que será determinada, por ejemplo, como se describirá adicionalmente más adelante. Los componentes de un equipo en general son estériles y en viales sellados u otros recipientes. Los equipos se pueden emplear en análisis para diagnóstico u otros métodos para los cuales son útiles las moléculas de anticuerpo. Un equipo puede contener las instrucciones para el uso de los componentes en un método, por ejemplo, un método de acuerdo con la presente invención. Dentro de un equipo de la invención se pueden incluir materiales auxiliares para ayudar o permitir la realización de este método. Las reactividades de los anticuerpos en una muestra se pueden determinar mediante cualquier medio adecuado. El radioinmunoanálisis (RÍA) es una posibilidad. El antígeno marcado radiactivo se mezcla con el antígeno sin marcar (la muestra de prueba) y se deja unir al anticuerpo. El antígeno unido se separa físicamente del antígeno disgregado y la cantidad del antígeno radiactivo unido al anticuerpo determinado. Entre más antígeno haya en la muestra de prueba, menor será la cantidad del antígeno radiactivo que se unirá al anticuerpo. Un ensayo de unión competitiva también se puede utilizar con el antígeno que no es radiactivo, utilizando un antígeno o un análogo enlazado a una molécula reportera. La molécula reportera puede ser un fluorocromo, fósforo o tinte láser con características de absorción o emisión aislada espectralmente . Los fluorocromos adecuados incluyen fluoresceína, rodamina, ficoeritrina y Texas Red. Los tintes cromogénicos adecuados incluyen diaminobencidina . Otros reporteros incluyen partículas macromoleculares coloidales o material en macropartículas tal como por ejemplo, perlas de látex que son agentes coloreados, magnéticos o paramagnéticos, y biológica o químicamente activos que pueden provocar directa o indirectamente señales perceptibles que se observarán visualmente, se detectarán electrónicamente o de otra manera se registrarán. Estas moléculas pueden ser enzimas que catalizan las reacciones que desarrollan o cambian los colores o provocan cambios en las propiedades eléctricas, por ejemplo. Las mismas se pueden excitar molecularmente, de tal forma que las transiciones electrónicas entre los estados de energía den por resultado en absorciones o emisiones espectrales características. Las mismas pueden incluir entidades químicas utilizadas junto con biosensores. Se pueden emplear sistemas para detección de biotina/avidina o biotina/estreptavidina y fosfatasa alcalina. Las señales generadas por conjugados individuales de anticuerpo-reportero se pueden utilizar para derivar datos absolutos o relativos cuantif icables de la unión de anticuerpos relevantes en las muestras (normales y de prueba) . La presente invención también proporciona el uso de un miembro de unión específica como anteriormente para medir los niveles del antígeno en un análisis de competición, es decir un método para medir el nivel del antígeno en una muestra al emplear un miembro de unión específica como se proporciona por la presente invención en un análisis de competición. Esto puede cuando no se requiera la separación física del antígeno unido o disgregado. El enlazamiento de una molécula reportera al miembro de unión específica de modo que se presente un cambio físico u óptico en la unión es una posibilidad. La molécula reportera puede generar directa o indirectamente señales perceptibles, y de preferencia mensurables. El enlace de las moléculas reporteras puede ser directa o indirecta, covalentemente, por ejemplo, vía un péptido unido o no covalentemente. El enlace vía un enlace peptídico puede ser el resultado de la expresión recombinante de una fusión génica que codifica para un anticuerpo y una molécula reportera . La presente invención también proporciona la medición de los niveles de unión con antígenos directamente, al emplear un miembro de unión específica de acuerdo con la invención por ejemplo en un sistema del biosensor. El modo para determinar la unión no es una característica de la presente invención y aquellos expertos en la técnica pueden elegir un modo adecuado de acuerdo con su preferencia y conocimiento generales . Como se observa, en diversos aspectos y modalidades, la presente invención se extiende a un miembro de unión específica humano, humanizado, quimérico o sintético que compite para unir al TGFß (TGFßl, 2 y/o 3) con cualquier miembro de unión específica definido en la presente, por ejemplo, el IgG4 de PET1037GR, PET1074B9 O PET1287A10. La competición o competición cruzada entre los miembros de unión se puede probar fácilmente in vi tro , por ejemplo al marcar una molécula reportera específica con un miembro de unión que se pueda detectar en presencia de otros miembros de unión sin marcar, para permitir la identificación de los miembros de unión específica que se unen al mismo epítope o un epítope traslapante. La competición se puede determinar por ejemplo utilizando ELISA en el cual el TGFß se inmoviliza y a la placa se agrega un primer miembro de unión marcado (el miembro de unión de referencia) junto con uno o más de otros miembros de unión sin marcar. La presencia de un miembro de unión sin marcar que compite con el miembro de unión marcado se observa por una disminución en la señal emitida por el miembro de unión marcado. En la prueba para competición, se puede emplear un fragmento peptídico del antígeno, especialmente un péptido que incluye un epítope de interés. Se puede utilizar un péptido que tenga la secuencia de epítopes más uno o más aminoácidos en cualquier extremo. Este péptido puede ser el que "consiste esencialmente" de la secuencia específica. Los miembros de unión específica de acuerdo con la presente invención pueden tales que su unión al antígeno se inhibe por un péptido o incluye la secuencia determinada. En la prueba para esto, se puede utilizar un péptido con cualquier secuencia más uno o más aminoácidos. Los miembros de unión específica que se unen a un péptido específico se pueden aislar por ejemplo a partir de una biblioteca para exhibición de fagos mediante el filtrado con los péptidos. La presente invención proporciona además un ácido nucleico aislado que codifica para un miembro de unión específica de la presente invención. El ácido nucleico puede incluir ADN y/o ARN. En un aspecto preferido, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica para una CDR o un conjunto las CDR o el sitio de unión con antígenos del anticuerpo o el dominio VH o el dominio VL o la molécula del anticuerpo, por ejemplo, scFv o IgG4 , de la invención como se definió anteriormente. La presente invención también proporciona construcciones en la forma de plásmidos, vectores, casetes de transcripción o expresión que comprenden al menos un polinucleótido como anteriormente. La presente invención también proporciona una célula hospedera recombinante que comprende una o más construcciones como anteriormente. Un ácido nucleico que codifica para cualquier CDR o conjunto de las CDR o el dominio VH o el dominio VL o el sitio de unión con antígenos o la molécula de anticuerpo, por ejemplo, scFv o IgG4 como se proporciona, por sí mismos forman un aspecto de la presente invención, al igual que un método para elaboración de un producto codificado, el método comprende la expresión a partir del ácido nucleico codificante por consiguiente. La expresión se puede alcanzar convenientemente al cultivar bajo condiciones adecuadas las células hospederas recombinantes que contienen el ácido nucleico. Después de la producción mediante la expresión de un dominio VH o VL, o el miembro de unión específica se puede aislar y/o purificar utilizando cualquier técnica adecuada, luego se utiliza según sea adecuado. Los miembros de unión específica, los dominios VH y/o VL, y las moléculas de ácido nucleico codificante y los vectores de acuerdo con la presente invención se pueden proporcionar aislados y/o purificados, por ejemplo, a partir de su entorno natural, en forma prácticamente pura u homogénea, o, en el caso del ácido nucleico, libres o prácticamente libres del ácido nucleico o el origen de los genes distinto de la secuencia que codifica para un polipéptido con la función requerida. El ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede comprender ADN o ARN y puede ser total o parcialmente sintético. La referencia a una secuencia nucleotídica como se precisa en la presente abarca una molécula de ADN con la secuencia específica, y abarca una molécula de ARN con la secuencia específica en la cual U se sustituye por T, a menos que el contexto los requiera de otra manera. Son bien conocidos los sistemas para clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de diferentes células hospederas. Las células hospedera adecuadas incluyen bacterias, células mamíferas, células vegetales, células de insectos, hongos, levadura y plantas y animales transgénicos. Las líneas celulares mamíferas disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células renales de hámster bebé, células de melanoma de ratón NSO, células de mieloma de rata YB2/0, células embrionarias humanas de riñon, células embrionarias humanas de retina y muchas otras. Un hospedero bacteriano preferido común es E . col i .

En la técnica está bien establecida la expresión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos en células procariotas tales como por ejemplo E . col i . Para una revisión, véase por ejemplo Plückthun, A. Bi o/Technol ogy 9_ 545-551 (1991) . La expresión en células eucariotas en cultivo también está disponible para aquellos expertos en la técnica como una opción para la producción de un miembro de unión específica por ejemplo Chadd HE y Chamow SM (2001) 110 Curren t Opini ón in Bi o t echnol ogy 12_: 188-194, Andersen DC y Krummen L (2002) Curren t Opini ón in Bi o t echnol ogy 1_3_: 117, Larrick JW y Thomas DW (2001) Current Opinión in Biotechnol ogy 12:411-418. Se pueden seleccionar o construir vectores adecuados que contengan secuencias reguladoras adecuadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias adaptadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias reforzadoras, genes marcadores y otras secuencias según sea adecuado. Los vectores pueden ser plásmidos virales, por ejemplo, fagos, o fagémidos, o adenoviral, AAV, lentiviral, etc. según sea adecuado. Para detalles adicionales véase, por ejemplo, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a. edición, Sambrook y Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo en la preparación de las construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en las células y expresión génica, y análisis de proteínas, se describen en detalle en Current Protocols in Molecular Biology, Segunda edición, Ausubel et al . eds., John Wiley & Sons, 1986, Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al . eds., John Wiley & Sons, 4a. edición 1999. Las exposiciones de Sambrook et al. y Ausubel et al. (ambas) se incorporan en la presente como referencia. De esta forma, un aspecto adicional de la presente invención proporciona una célula hospedera que contiene ácido nucleico como se expone en la presente. Esta célula hospedera puede estar in vi tro y puede estar en cultivo. Esta célula hospedera puede estar in vi vo . La presencia in vi vo de la célula hospedera puede permitir la expresión intracelular de los miembros de unión específica de la presente invención como "intracuerpos" o anticuerpos intracelulares. Los intracuerpos se pueden utilizar para terapia génica (Marasco WA (1997) Gene Therapy, 4_(1) : 11) .

Todavía un aspecto adicional proporciona un método que comprende introducir este ácido nucleico en una célula hospedera. La introducción puede emplear cualquier técnica disponible. Para células eucariotas, las técnicas adecuadas pueden incluir transfección con fosfato de calcio, DEAE-Dextran, electroporación, transfección suministrada por liposomas y transducción utilizando retrovirus u otro virus, por ejemplo, vaccinia o, para células de insectos, baculovirus. La introducción de ácido nucleico en la célula hospedera, en particular una célula eucariota puede utilizar un sistema con base viral o de plásmido. El sistema de plásmido se puede mantener episomalmente o se puede incorporar en la célula hospedera o en un cromosoma artificial (Csonka E et al . (2000) Journal of Cel l Sci ence , 113: 3207-3216; Vanderbyl S et al. (2002) Mol ecular Therapy, 5_ (5:10) . La incorporación puede ser mediante la integración ya sea aleatoria o dirigida de una o más copias en locus individuales o múltiples. Para células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro de calcio, electroporación y transfección utilizando bacteriófagos .

La introducción se puede seguir al provocar o permitir la expresión del ácido nucleico, por ejemplo al cultivar células hospederas bajo condiciones para la expresión del gen. En una modalidad, el ácido nucleico de la invención se integra en el genoma (por ejemplo, el cromosoma) de la célula hospedera. La integración se puede estimular mediante la inclusión de secuencias que estimula la recombinación con el genoma, de acuerdo con técnicas estándar. La presente invención también proporciona un método que comprende utilizar una construcción como se declaró anteriormente en un sistema expresión para expresar un miembro de unión específica o un polipéptido como anteriormente. Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden administrar a un paciente que necesita de los mismos vía terapia génica. La terapia puede ser ya sea in vi vo o ex vi vo . En una modalidad preferida, las moléculas de ácido nucleico que codifican tanto para una cadena pesada como para una cadena ligera se administran a un paciente. En una modalidad más preferida, las moléculas de ácido nucleico se administran de tal forma que se integren establemente en los cromosomas de los linfocitos B debido a que estas células se especializan para producir anticuerpos. En una modalidad preferida, los linfocitos B precursores se transfectan o infectan ex vi vo y se re- trasplantan en un paciente que necesita de los mismos. En otra modalidad, los linfocitos B precursores u otras células se infectan in vi vo utilizando un virus conocido para infectar el tipo celular de interés. Los vectores típicos utilizados para la terapia génica incluyen liposomas, plásmidos y vectores virales. Los vectores virales de ejemplo son retrovirus, adenovirus y adenovirus asociados. Después la infección ya sea in vi vo o ex vi vo , los niveles de la expresión del anticuerpo se pueden supervisar al extraer una muestra del paciente tratado y al utilizar cualquier inmunoanálisis conocido en la técnica o analizada en la presente. Se conocen en la técnica los métodos para utilizar un anticuerpo anti-TGFß en terapia génica. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos 5,824,655 (Border) , que es incorporada en la presente como referencia en su totalidad. En una modalidad preferida, el método para terapia génica comprende los pasos de administrar una molécula de ácido nucleico aislado que codifica para la cadena pesada o una porción de unión con antígenos de la misma de un anticuerpo anti-TGFß y que expresa la molécula de ácido nucleico. En otra modalidad, el método para terapia génica comprende los pasos de administrar una molécula de ácido nucleico aislado que codifica para la cadena ligera o una porción de unión con antígenos de la misma de un anticuerpo anti-TGFß y que expresa la molécula de ácido nucleico. En un método más preferido, el método para terapia génica comprende los pasos de administrar una molécula de ácido nucleico aislado que codifica para la cadena pesada o una porción de unión con antígenos de la misma y una molécula de ácido nucleico aislado que codifica para la cadena ligera o la porción de unión con antígenos de la misma de un anticuerpo anti-TGFß de la invención y que expresa las moléculas de ácido nucleico. La corrección de dosis a través de especies en general requiere únicamente un ajuste para el peso corporal, si el agente activo es un anticuerpo que actúa en o cerca del sistema vascular. Las dosis eficaces de los anticuerpos de la invención han sido 0.5-5mg/kg en rata y ratón en un entorno grave. Por lo tanto, para una dosificación a largo plazo, se considera probablemente administrar en el período 0.3-10mg/kg (esperado para estar en la región de 21 días en seres humanos) . Las dosis de preferencia son suficientes para eficacia, aunque bastante bajas para facilitar una administración óptima. Por ejemplo una dosis menor a 50mg facilita la administración subcutánea. Se prefiere una administración intravenosa en ensayos clínicos tempranos y se puede utilizar como la vía de suministro para enfermedades severas si la dosis es alta y el intervalo de dosificación es largo. La inyección subcutánea en general es más conveniente que el suministro intravenoso, debido a que permite una autoadministración. Sin embargo, la inyección subcutánea tiene el potencial de aumentar cualquier respuesta inmunitaria al producto. La administración local para una enfermedad localizada puede reducir al mínimo la cantidad de producto requerida y aumentar al máximo la concentración en el sitio de acción. Mediante una administración local, se puede conferir una ventaja de seguridad significativa (ventana terapéutica) , evitando cualesquiera efectos secundarios potenciales que se puedan desarrollar a partir de una administración sistémica crónica. Los aspectos y modalidades adicionales de la presente invención serán evidentes para aquellos expertos en la técnica teniendo en cuenta la presente exposición., incluyendo la siguiente ejemplificación experimental . Todos los documentos a los que se hace referencia en cualquier lugar de esta especificación se incorporan como referencia.

EJEMPLO 1 Generación de los ScFv de Anti-TGFß Bibliotecas del anticuerpo sin tratamiento previo de ScFv Para las selecciones se utilizó una biblioteca de anticuerpos humanos Fv de cadena individual larga (scFv) derivada de linfocitos de bazo proveniente de 20 donantes y clonada en un vector de fagémidos (Hutchings et al . , 2001) .

Bibliotecas para selección guiada a ScFv Se construyó una biblioteca de VL 1D11.16 VH-humano y se utilizó para seleccionar anticuerpos quiméricos de ratón-humano con las propiedades de unión deseadas. Las cadenas ligeras humanas de estos anticuerpos quiméricos entonces se clonaron en bibliotecas aceptoras de VH-VL humano y VH (IDI1 CDR3)-VL humano. Estas bibliotecas se seleccionaron para anticuerpos humanos con las características de unión deseadas.

Selección de bibliotecas de fagos ScFv El TGFßl y el TGFß2 humanos recombinantes se suministraron por Genzyme Corp. (Framingham, MA) y el TGFß3 se adquirió de R&D Systems. Los ScFv que reconocieron el TGFß se aislaron de las bibliotecas para selección guiadas por scFv después de una serie de ciclos de selección repetidos en el TGFß humano recombinante esencialmente como se describe en Vaughan et al . (1996) . En resumen, después de la incubación con la biblioteca, el antígeno inmovilizado, que se había preacoplado a las perlas paramagnéticas, y los fagos unido se recuperaron mediante separación magnética mientras que los fagos disgregados se eliminaron mediante lavado. Los fagos unidos luego se rescataron como se describe por Vaughan et al . (1996) y el proceso de selección se repitió. Las selecciones se realizaron utilizando TGFßl, TGFß2 o TGFß3 acoplados a la amina de Dynabeads M-270 (Dynal) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Alternativamente, las selecciones utilizaron TGFßl o TGFß2 biotinilados preparados utilizando el reactivo específico de amina primaria hexanoato de succinimidilo- 6 - (biotinannido) siguiendo las instrucciones del fabricante (EZ link NHS LC Biotin, Pierce) . Los rendimientos a partir de las selecciones se probaron como preparaciones periplásmicas en selecciones de alto rendimiento con base en análisis de competición que midieron la capacidad de los scFvs presentes en la preparación periplásmica para competir con el 1D11.16 o las quimeras II-Fc del receptor soluble del TGFß humano recombinante (sRII, R&D systems) para la unión al TGFß. Las muestras que compitieron con el 1D11.16 o el sRII en las selecciones de alto rendimiento se sometieron a secuenciación de ADN como se describe en Vaughan et al . (1996) y Osbourn et al . (1996). Los clones se expresaron y purificaron como scFvs o IgGs y se valoraron por su capacidad para neutralizar los TGFß en el MLEC y/o los análisis NHLF como se describe en los ejemplos 4 y 5 respectivamente. Las preparaciones scFv purificadas se prepararon como se describe en el Ejemplo 3 de la WO 01/66754. Las concentraciones proteínicas de las preparaciones de scFv purificado se determinaron utilizando el método BCA (Pierce) . Las preparaciones de IgG purificado se prepararon como se describirá más adelante en el ej emplo 3.

EJEMPLO 2 Optimización de los scFvs anti-TGFß Los ScFvs que se unen y neutralizan el TGFß se generaron como se describe en el Ejemplo 1. Las potencias de neutralización de estos anticuerpos se aumentaron en TGFßl y/o TGFß2 y/o TGFß3 utilizando mutagénesis de ADN y/o técnicas combinatorias. Los anticuerpos con potencias significativamente mejoradas en TGFßl y/o TGFß2 y/o TGFß3 se generaron al seleccionar y explorar las bibliotecas de anticuerpos fagos esencialmente como se describe en el Ejemplo 1. Los scFvs generados se compararon con 1D11.16 en el análisis para proliferación de MLEC. Se encontró que las líneas germinales particulares estarán bastante representadas entre la población de alta potencia, los scFvs para neutralización del TGFß. Éstos fueron DP-10/1-69 y DP-88/l-e (ambos miembros de la familia de la línea germinal VH1) para la cadena pesada, y DPK22/A27 (familia V?3) para la cadena ligera. Estas líneas germinales parecen proporcionar una trama estructural particularmente adecuada para alta potencia, los anticuerpos pan-neutralizantes del TGFß. Esto no fue previsible, debido a que el segmento génico de 1D11.16 VH está cercano al DP-7 de línea germinal humana y el segmento génico 1D11.16 VL está más cercano al L16 de línea germinal humana. Los scFvs de PET1073G12, PET1074B9 y PET1287A10 mostraron potencias que alcanzan o exceden las de 1D11.16 en las tres isoformas del TGFß en el análisis de proliferación de MLEC. Las secuencias de aminoácido derivados de los segmentos génicos VH y VL de PET1073G12, PET1074B9 y PET1287A10 se alinearon a las secuencias humanas conocidas de línea germinal en la base de datos VBASE (Tomlinson et al . , 1997) y la línea germinal humana más cercana identificada mediante similitud de secuencias. El gen humano más cercano de la línea germinal para el segmento génico VH de PET1073G12 y PET1074B9 se identificó como DP-10/1-69 (familia de la línea germinal VH1) y el gen humano más cercano de la línea germinal para el segmento génico VH de PET1287A10 se identificó como DP-88/l-e (familia de la línea germinal VH1) . El gen humano más cercano de la línea germinal para el segmento génico VL de PET1073G12, PET1074B9 y PET1287A10 se identificó como DPK22/A27 (familia de la línea germinal V?3 ) . La mutagénesis sitio dirigida se utilizó para cambiar los residuos de trama que difirieron de la línea germinal con el residuo de la línea germinal, con la condición de que estos cambios no produzcan una pérdida de potencia en el análisis de proliferación de MLEC más de tres veces en el anticuerpo resultante sobre cualquier isoforma del TGFß. Si se observó esta pérdida de potencia, el aminoácido en la trama que no es de línea germinal se mantuvo en el anticuerpo final. En el PET107 G12 de línea germinal y el PET1074B9 de línea germinal todos los residuos de trama son de línea germinal a excepción de dos residuos en VH y un residuo en VL . Las secuencias de aminoácidos para el PET1073G12 de línea germinal se describen en la SEQ ID NO: 2 para VH y la SEQ ID NO: 7 para VL . Las secuencias de aminoácidos para el PET1074B9 de línea germinal se describen en la SEQ ID NO: 12 para VH y la SEQ ID NO: 17 para VL . En el PET1287A10 de línea germinal todos los residuos de trama VH y VL son de línea germinal. Las secuencias de aminoácidos para el PET1287A10 de línea germinal se describen en la SEQ ID NO: 22 para VH y la SEQ ID NO: 27 para VL .

EJEMPLO 3 Producción de los IgG4 Los PET1073G12, PET1074B9 y PET1287A10 de los scFvs de línea germinal se convirtieron del formato scFv al formato IgG4 al sub-clonar sus dominios VH y VL en los vectores que expresan cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo entero respectivamente. El segmento génico VH se amplificó a partir del scFv de pCantabd que expresa el vector y se clonó en el vector pEU8.1(+) que contiene los dominios constantes de cadena pesada ?4 humanos y los elementos reguladores para expresar la cadena pesada total en células mamíferas. De manera similar, el segmento génico VL se amplificó a partir del vector que expresa scFv de pCantabd y se clonó en el vector pEU3.1 ( - ) que contenía los dominios constantes de cadena ligera K humana y los elementos reguladores para expresar la cadena ligera total en células mamíferas. Los vectores pEU3.1 ( - ) y pEU8.1(+) se basaron en los vectores descritos por Persic et al . (1987) y se modificaron para introducir la secuencia oriP para aumentar los rendimientos del anticuerpo producido (Shen. et al . , 1995; Langle-Rouault et al . , 1998) . Después de la clonación, los dominios VH y VL de los tres anticuerpos se secuenciaron para confirmar que no se habían introducido mutaciones durante el procedimiento de clonación. Los vectores para la expresión de la cadena pesada y ligera de PET1073G12, PET1074B9 y PET1287A10 se transfectaron en células EBNA-293 (Invitrogen) . Después de la expresión génica y la secreción en el sobrenadante celular, los IgG4 de PET1073G12, PET1074B9 y PET1287A10 se purificaron mediante cromatografía de afinidad con la proteína A (Amersham) . Las preparaciones purificadas del anticuerpo se filtraron estériles y se almacenaron a 4°C en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) antes de la evaluación. La concentración de IgG se determinó espectrofotométricamente utilizando un coeficiente de extinción basado en la secuencia de aminoácidos del IgG como se describe en Mach et al . (1992) . Los IgG purificados se analizaron mediante SEC-HPLC utilizando una columna Biosep- SEC- S2000 (Phenomenex) para verificar la agregación o degradación de la proteína. Los anticuerpos enteros de IgG4 humanos reformateados se compararon con el anticuerpo 1D11.16 en los análisis basados en células MLEC y NHLF como se describe en los Ejemplos 4 y 5 respectivamente .

EJEMPLO 4 Potencia de neutralización de los anticuerpos Anti-TGFß en el análisis de proliferación MLEC dependiente del TGFß La potencia de neutralización de las preparaciones del anticuerpo purificado contra la bioactividad del TGFß humano se determinó utilizando el análisis de proliferación de células epiteliales pulmonares de visón (MLEC) . El análisis de proliferación de MLEC se basa en un análisis descrito por Danielpour et al . (1989a) . Este análisis funciona sobre el principio de que cuando TGFßl, TGFß2 o TGFß3 se agrega a células epiteliales pulmonares de visón, esto provoca una inhibición de la proliferación celular inducida por suero. Los anticuerpos se probaron para la neutralización del TGFßl, TGFß2 o TGFß3 dando por resultado en la restauración de la proliferación celular. La proliferación se midió mediante la absorción de [3H] - timidina . La potencia del anticuerpo se definió como la concentración del anticuerpo que neutralizó una concentración individual del TGFßl, TGFß2 o TGFß3 a un nivel del 50% (IC50) en nM.

Protocolo de análisis para proliferación de MLEC Colocación en placas de MLEC La línea MLEC se obtuvo de la American Type Culture Collection (Cat. # CCL-64) . Las células se desarrollaron en medio esencial mínimo (MEM, Gibco) que contuvo FBS al 10% (Gibco) , penicilina/estreptomicina al 1% (Gibco) y solución de aminoácidos no esencial MEM al 1% (Gibco) . Las células confluentes provenientes de matraces T-175 se disociaron del matraz, se sometieron a centrifugación, se lavaron, y se volvieron a suspender en medios para análisis MLEC que se preparó a partir de MEM que contuvo FBS al 1%, penicilina/estreptomicina al 1% y solución de aminoácidos no esencial MEM al 1%. Una alícuota de células luego se marcó con azul de tripano, contado sobre un hemocitómetro y la solución madre de células se diluyó a 1.75 x 105 células por ml utilizando medios para análisis. Se agregaron lOOµl de esta suspensión a cada cavidad de una placa de 96 cavidades de fondo plano para cultivo de tejidos y se incubaron durante 3 a 5 horas .

Preparación de las soluciones del TGFß/anticuerpos Las soluciones de trabajo del TGFßl, TGFß2 o TGFß3 en 6 ng/ml (6 veces la concentración para análisis final) y los anticuerpos (incluyendo los controles tales como por ejemplo 1D11.16) a 3 veces la concentración de análisis máxima final se prepararon en los medios para análisis de MLEC. La concentración final del TGFß en el análisis (1 ng/ml o 40 pM) correspondió a la concentración que indujo aproximadamente el 80% de inhibición de la proliferación celular en comparación con el control sin el TGFß (es decir el valor EC8o) • Ajuste de la placa de dilución Las muestras de prueba y los anticuerpos control se valoraron en pasos de dilución de tres veces en medios para análisis de MLEC y se incubaron en presencia y ausencia del TGFßl, TGFß2 o TGFß3. Todos los controles relevantes se incluyeron en cada experimento: prueba del 1D11.16 y/o el anticuerpo de referencia como sea adecuado para el desempeño de las valoraciones del TGFßl, TGFß2 o TGFß3. Las placas completas se dejaron en una incubadora humedecida para cultivo de tejidos durante 1 hora ± 15 minutos.

Adición de las soluciones del TGFß/anticuerpo a las células colocadas en placas Después de los tiempos de incubación adecuados, lOOµl de cada cavidad de las placas de dilución se transfirieron al MLEC colocado en placas y las placas se regresaron a la incubadora durante 44 ± 2 horas .

Adición de [3H] -timidina 25µl de lOµCi/ml [3H] -timidina (diluidos en PBS) se agregaron a cada una de las cavidades ( 0.25µCi/cavidad) . Las placas luego se regresaron a la incubadora durante 4 horas ± 30 minutos.

Recolección de células lOOµl de tripsina-EDTA (0.25%, Gibco) se agregaron a cada cavidad, las placas se incubaron durante 10 minutos en la incubadora y las células se recolectaron utilizando un recolector de células para 96 cavidades Tomtec o Packard 96.

Acumulación y análisis de datos Los datos provenientes de las células recolectadas se leyeron utilizando un lector de placas beta (TopCount, Packard) . Los datos se analizaron para obtener los valores IC50 y de desviación estándar. Los valores IC50 se obtuvieron utilizando el software Prism 2.0 (GraphPad) .

Resultados Los IgG4 de línea germinal de PET1073G12, PET1074B9 y FET1287A10 purificados se probaron junto con 1D11.16 en el análisis de proliferación MLEC. Los IgG4 se produjeron como se describe en el ejemplo 3. En la Tabla 1 se muestran la media aritmética IC50S ± la desviación estándar (donde IC50 es la concentración del anticuerpo requerida para neutralizar 40 pM TGFßl, TGFß2 o TGFß3 en un 50%) . Los datos de la media IC50 para los IgG4 de PET1073G12 y PET1287A10 muestran que estos anticuerpos tienen potencias similares o se acercan a aquellas de 1D11.16 en TGFßl, TGFß2 y TGFß3. Los datos de la media IC50 sugieren que el IgG4 de PET1074B9 son considerablemente más potentes en el TGFßl (aunque en el análisis de MLEC no se obtuvo una curva de respuesta de dosis total) . Como un medio para comparación, 1D11.16 mostró una neutralización del 12% sobre el TGFßl a una concentración de 91 pM y el PET1074B9 mostró una neutralización del 78% a una concentración similar de 92 pM . Además, PET1074B9 también se probó junto con 1D11.16 en un análisis de fibroblastos pulmonares humanos normales (NHLF) ,- un análisis para la producción de fibronectina (Ejemplo 5) . Los resultados obtenidos en el análisis NHLF confirman aquellos obtenidos en el análisis MLEC: PET1074B9 tiene potencias similares a aquellas de 1D11.16 en el TGFß2 y TGFß3, y PET1074B9 es más potentes que 1D11.16 en el TGFßl.

EJEMPLO 5 Neutralización de la potencia de los anticuerpos anti-TGFß en el análisis celular NHLF dependiente del TGFß3 La potencia de neutralización de las preparaciones de anticuerpo purificados contra la bioactividad del TGFß humano se valoró utilizando el análisis para producción de fibronectina con Fibroblastos Pulmonares Humanos Normales (NHLF) . Este análisis mide la capacidad de los anticuerpos para neutralizar la producción de la glucoproteína de matriz extracelular (ECM), fibronectina. Los TGFß son estimuladores potentes para la producción de fibronectina en fibroblastos cultivados (Ignotz y Massaoue, 1986) que ejercen sus efectos vía la activación de la trayectoria de la cinasa N-terminal de c-Jun (Hocevar et al . , 1999).

Protocolo para el análisis de células NHLF Las células NHLF se obtuvieron de CloneticsMR y se mantuvieron en medios-2 para crecimiento completo de fibroblastos (FGM-2) en una atmósfera humedecida que contuvo C02 al 5% a 37°C. A una confluencia de 90-100%, los fibroblastos se colocaron en placas (1.5 x 105/cavidad, formato de 24 cavidades) en medio FGM-2 de 1.5 ml y se dejaron aglutinarse durante 24 horas a 37°C. Las células se lavaron con medios básicos de fibroblastos sin suero (FBM) y el suero subalimentado durante la noche en 1.5 ml de FBM suplementado con insulina humana (lOOµg/ml), gentamicina/fungizona (50µg/ml) y ácido ascórbico (50µg/ml) se incubó durante 24 horas a 37°C. Todos los experimentos se realizaron sobre células entre subcultivos de tres a seises.

Preparación de las soluciones del TGFß y de anticuerpos En medio para análisis se prepararon soluciones de trabajo de TGFßl, TGFß2 o TGFß3 en 25 ng/ml (1 nM) y anticuerpos (incluyendo controles tales como por ejemplo, 1D11.16) . La concentración final del TGFß en el análisis (250 pg/ml o 10 pM) correspondió a la concentración que indujo aproximadamente un 80% de estimulacinón de la producción de fibronectina en comparación con el control sin TGFß (es decir el valor EC8o) • Ajuste de las placas para dilución Las muestras de prueba y los anticuerpos control se diluyeron en serie en pasos de dilución de diez veces en medio para análisis y se preincubaron en presencia y ausencia del TGFßl, TGFß2 o TGFß3 32 durante 30 minutos. Las células NHLF se incubaron en medio para análisis 2ml/cavidad durante 48 horas a 37°C. Después de 48 horas, para análisis de fibronectina mediante ELISA se extrajo una alícuota de 0.5 ml del sobrenadante en medio de cultivo.

ELISA de fibronectina humana Las muestras del sobrenadante NHLF frescas o congeladas (-20°C) se analizaron utilizando un equipo ELISA para el antígeno de fibronectina humana de TechnocloneMR que comprende un anticuerpo monoclonal para captura de anti- fibronectina humana (clon 6FN) y un anticuerpo secundario de anti- fibronectina monoclonal conjugado con HRP. La metodología fue como sigue: Placas de 96 cavidades Nunc- InmunoMR MaxisorpMR se recubrieron ( lµg/cavidad) con un anticuerpo para captura de anti-fibronectina en tampón de recubrimiento (Na2C03 12 mM, NaHCO3 35 mM , 0.01% (p/v) timerosal en agua destilada, pH 9.6) durante 16 horas a 4°C. El anticuerpo para captura se retiró y cada cavidad se bloqueó con lOOµl de tampón de dilución (1% (p/v) BSA en PBS) durante 1 hora a 37°C. Después de lavar tres veces con tampón de lavado ( 250µg/cavidad de 0.5% (v/v) de Tween 20 en PBS) , a la placa se agregaron estándares y muestras de fibronectina con plasma humano y se incubaron durante 1 hora a 37°C. La placa luego se lavó tres veces y se incubó con un anticuerpo secundario HRP de anti - fibronectina ( 10 Oµg/cavidad en tampón de dilución) durante 30 minutos a 37°C. La placa se lavó tres veces con tampón de lavado y a la placa se agregaron lOOµg/cavidad de substrato de tetrametilbencidina (TMB) . Después de la incubación de la placa a temperatura ambiente durante 20 minutos, la reacción se detuvo con lOOµg/cavidad ácido sulfúrico 2 M. Luego se midió la absorbencia en 450 nM utilizando un lector de placas DynexMRX .

Análisis de datos Los datos se presentan como un porcentaje de la respuesta control para la isoforma TGFß bajo prueba (100%) . Los valores pIC50 de la media geométrica y los límites de confianza al 95% se estimaron utilizando un ajuste de la curva logística de cuatro parámetros (Prism 2, GraphPad Software, San Diego, USA) . Cuando fracató un ajuste de cuatro parámetros, se realizó un ajuste de tres o dos parámetros al mantener constantes los valores superiores y/o inferiores de la curva.

Resultados Los IgG4 de línea germinal de PET1073G12, PET1074B9 y PET1287A10 purificados se probaron junto con 1D11.16 en el análisis para producción de fibronectina NHLF. Los IgG4 se produjeron como se describe en el Ejemplo 3. Se muestran en la Tabla 2 los IC50 de media aritmética ± la desviación estándar (donde IC50 es la concentración del anticuerpo requerida para neutralizar TGFßl, TGFß2 o TGFß3 10 pM al 50%) .

EJEMPLO 6 Potencia en el análisis para inducción de IL-11 Se valoró la potencia de neutralización de las preparaciones de anticuerpos purificados contra la bioactividad del TGFß humano utilizando un análisis para inducción de IL-11 de células A549 (células de carcinoma epitelial pulmonar humano) . Se mantuvieron células A549 (ATCC, Parte #: CCL-185) en medio para crecimiento/análisis (435 ml DMEM, suero fetal de bovino 50mL (FBS), 5 L de penicilina/estreptomicina, 5 ml de medio Eagle Modificado con aminoácidos no esenciales, 5 ml de 100X de L-glutamina; todos de Gibco/Invitrogen) . A una confluencia de aproximadamente el 90%, se colocaron en placas las células en lOOµl de medio para crecimiento/análisis y se dejó que las células se aglutinaran durante 24 horas a 37°C, C02 al 5%.

Preparación de soluciones del TGFß y de anticuerpos Se prepararon soluciones de trabajo del TGFßl (1.8 ng/ml), TGFß2 (4.2 ng/ml) o TGF03 (4.2 ng/ml) y anticuerpos (incluyendo controles) en medios para crecimiento/análisis .

Ajuste de las placas para dilución Las muestras de prueba y los anticuerpos control se diluyeron en serie en pasos de dilución de 5 veces (TGBß2 o TGFFß3) o 10 veces (TGBßl) en medio para crecimiento/análisis y se preincubaron en presencia y ausencia del TGFßl, TGFß2 o TGFß3 a 37°C durante 75 minutos. Las células A549 se incubaron en 200µl/cavidad de medio para análisis durante 18-24 horas a 37°C. Después de 18-24 horas, para análisis de IL-11 mediante ELISA se extrajo una alícuota de 100 µl del sobrenadante en medio de cultivo.

EJEMPLO 7 Para determinar la eficacia biológica de un anticuerpo monoclonal del TGF-ß humano pan-neutralizante para tratar una enfermedad renal crónica y otras indicaciones clínicas caracterizadas por fibrosis patógena, se estudió el efecto del anticuerpo en un modelo para obstrucción ureteral unilateral (UUO) de rata. Ratas Sprague Dawley adultas (Taconic Farms, Germantown, NY) que pesaron 250-280 gramos (aproximadamente 6 semanas) se alojaron en un entorno con aire, temperatura, y luz controlados. Las ratas que experimentaron UUO recibieron una pequeña incisión abdominal en la línea media ventral para exponer el riñon izquierdo y el uréter superior. Se ligó el uréter al nivel del polo inferior del riñon con el hilo de sutura de seda y una segunda vez a aproximadamente 0.2 centímetros debajo de la primera. Las ratas con operación simulada recibieron el mismo protocolo quirúrgico aunque sin ligadura ureteral. Las ratas obstruidas se trataron con PBS, un anticuerpo monoclonal pan-neutralizante murino (ID11), un anticuerpo control que coincide con isotipos (13C4) o un anticuerpo monoclonal TGF-ß pan-neutralizante humano de la invención como sigue. Se administraron los anticuerpos a las ratas intraperitonealmente iniciando el día de la ligadura ureteral durante un curso de 3 semanas. Se administraron 13C4 e ID11 en 5 mg/kg (3 veces a la semana) y el anticuerpo pan-neutralizante humano se administró a las ratas a 5 mg/kg (cada 5 días) . Al final de 3 semanas, las ratas se sacrificaron, los ríñones se sometieron a perfusión con PBS durante 3 minutos y se recolectados los ríñones sometidos a perfusión para el análisis de ARNm, la determinación de contenido de colágeno y examen histológico. Para valorar el grado de fibrosis en tejido, se determinó el contenido total de colágeno en tejido mediante análisis bioquímico de hidroxiprolina en extractos hidrolisados de acuerdo con Kivirikko et al . Este análisis se basa en la observación de que prácticamente toda la hidroxiprolina en tejidos animales se encontró en colágeno. También se realizó un análisis de colágeno Sircol para el contenido total de colágeno. El análisis de colágeno Sircol midió la cantidad total de colágenos solubles en ácido/pepsina con base en la unión específica del tinte rojo Sirius con la cadena lateral del colágeno en tejidos. Las ratas UUO tratadas con el anticuerpo monoclonal pan-neutralizante humano mostraron un 43.4% de reducción en el contenido de hidroxiprolina ( 1.98±0.26µg/mg de tejido seco) en comparación con el grupo tratado con PBS (3.5±0.3µg/mg de tejido seco, p<0.05) . La disminución en fibrosis renal se apoyó adicionalmente mediante la reducción en el colágeno total solubilizado en los ríñones afectados, según se determina por un análisis basado en tinte rojo de Sirius (simulado: 18.5±2.6, PBS: 69.3±3.8, y el anticuerpo monoclonal pan-neutralizante humano: 35.6±5.2µg/100mg de tejido, p<0.05 contra PBS). También se valoró la capacidad de un anticuerpo monoclonal anti-TGF-ß pan-neutralizante humano para reducir la fibrosis de tejidos mediante examen inmunohistoquímico. En animales control, la obstrucción ureteral durante tres semanas provocó la interrupción extensa de la arquitectura tubular renal con distensión marcada, atrofia celular y necrosis/apoptosis , inflamación de tejidos y epansión túbulointersticial con fibrosis evidente. Hubo poca evidencia de daño glomerular. Las ratas tratadas con ID11 o el anticuerpo monoclonal pan-neutralizante humano, por otro lado, la conservación mostrada de la arquitectura renal como se juzga por dilatación y desorganización tubular atenuada, infiltrados inflamatorios reducidos (celularidad) y expansión túbulointersticial disminuidas y fibrosis. También se midió el efecto de tratamiento con un anticuerpo monoclonal anti-TGF-ß pan-neutralizante humano en la expresión génica regulada por el TGF-ß. El ARNm TGF-ßl se redujo significativamente en animales UUO tratados con el anticuerpo monoclonal pan-neutralizante humano en comparación con animales tratados ya sea con PBS o el anticuerpo control 13C4. También se observó una disminución significativa de los niveles de ARNm para el colágeno tipo III en ríñones obstruidos tratados con los anticuerpos anti- TGF-ß humanos y murinos en comparación con aquellos tratados con PBS o 13C4 lo que indicaba una disminución en la síntesis de colágeno. Se confirmó adicionalmente la eficacia de un anticuerpo monoclonal anti-TGF-ß pan-neutralizante humano para reducir la síntesis del TGF-ß auto-inducida al medir la proteína TGF-ßl total renal. En comparación con los animales con operación simulada, los ríñones obstruidos exhibieron un aumento marcado en el TGF-ßl total en tejido. Las ratas obstruidas dosificadas con un anticuerpo monoclonal pan-neutralizante humano, sin embargo, mostraron una reducción del 75% de los niveles TGF-ßl en tejido, significativamente debajo de los niveles registrados para ambos grupos control. Por comparación, el anticuerpo ID11 murino redujo los niveles del TGF-ßl en tejido en un 45%, en comparación con los grupos control. Los resultados descritos anteriormente demuestran que la neutralización del TGF-ß con un anticuerpo monoclonal anti-TGF-ß pan-neutralizante humano interrumpió eficazmente el asa de regulación autocrina del TGF-ß concomitante con la prevención de la producción del TGF-ßl y la expresión del ARNm en colágeno III.

Se determinó adicionalmente el efecto de un anticuerpo monoclonal anti-TGF-ß pan-neutralizante humano en la expresión de actinia de músculo liso (a-SMA) como un indicador indirecto de la inhibición del TGF-ß. La expresión de actinia de músculo liso es un indicador de miofibroblastos activados, que se asocian con fibrosis de tejidos y producen tejido conjuntivo fibroso. El TGF-ß es un inductor importante de la activación y transformación fenotípica de fibroblastos estromales y de células epiteliales residentes para células miofibroblásticas . Se detectó una proteína -SMA mediante análisis de transferencia Western estándar. En comparación con animales operados simuladamente, las ratas con ríñones obstruidos mostraron una sobre-regulación dramática en la proteína a-SMA según se mide por transferencia Western de homogenados de tejido (datos no mostrados) . Las ratas obstruidas se dosificaron con un anticuerpo monoclonal anti -TGF-ß pan-neutralizante humano, mostraron reducción significativa (75% en comparación con los controles de PBS) en la expresión de OÍ-SMA mensurable.

Estos resultados demuestran la eficacia de un anticuerpo monoclonal anti-TGF-ß pan-neutralizante humano en la reducción de la deposición de colágeno en los ríñones fibróticos, indicando claramente que el anticuerpo es un potente inhibidor de la producción y deposición renal de colágeno en este modelo de lesión renal severa y de fibrosis túbulointersticial. Debido a que el proceso de fibrosis de tejidos en órganos tales como por ejemplo en pulmón, hígado o riñon posee mecanismos o trayectorias comunes, el experto apreciará que el anticuerpo es útil en el tratamiento de enfermedades renales crónicas así como también otras indicaciones clínicas caracterizadas por fibrosis patógena. Enseguida se muestra una descripción de ciertas reivindicaciones preferidas de la invención:

Claims (63)

1. REIVINDICACIONES 1. Un miembro de unión específica aislado que se une y neutraliza los TGFßl, TGFß2 y TGFß3, humanos, que comprenden un dominio de unión con antígenos de un anticuerpo, en donde el dominio de unión con antígenos comprende un conjunto de las CDR, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 , y en donde el dominio de unión con antígenos utiliza un gen de la familia VH1 humano y en donde la HCDR3 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 25.
2. 2. El miembro de unión específica según la reivindicación 1, en donde el gen de la familia VH1 humano es un gen VHl-2 humano.
3. 3. El miembro de unión específica según la reivindicación 2, donde el gen VH1-2 humano es un gen DP-10 o un gen DP-88.
4. 4. El miembro de unión específica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el dominio de unión con antígenos comprende además un conjunto de las CDR LCDR1, LCDR2 y LCDR3 , y en donde el dominio de unión con antígenos utiliza un gen de la familia V?3 humano y en donde la LCDR3 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 30.
5. 5. El miembro de unión específica según la reivindicación 4 en donde la HCDR3 y la LCDR3 se seleccionan del grupo que consiste de: (a) SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 10, respectivamente; (b) SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 20, respectivamente; y (c) SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 30, respectivamente .
6. 6. El miembro de unión específica según la reivindicación 4, en donde el gen de la familia V?3 humano es un gen V6 DPK22 humano.
7. 7. El miembro de unión específica según la reivindicación 1, en donde HCDR1, HCDR2 y HCDR3 del dominio VH están dentro de una trama de cadena pesada de la línea germinal.
8. 8. El miembro de unión específica según la reivindicación 1, en donde HCDR1, HCDR2 y HCDR3 del dominio VH están dentro de una trama que comprende hasta 12 mutaciones de la secuencia de aminoácidos de la línea germinal.
9. 9. El miembro de unión específica según la reivindicación 4, en donde LCDR1, LCDR2 y LCDR3 del dominio V están dentro de una trama de cadena pesada de la línea germinal.
10. 10. El miembro de unión específica según la reivindicación 4, en donde LCDR1, LCDR2 y LCDR3 del dominio VK están dentro de una trama que comprende hasta 5 mutaciones de la secuencia de aminoácidos de la línea germinal VK .
11. 11. Un miembro de unión específica aislado que se une y neutraliza los TGFßl, TGFß2 y TGFß3 humanos que comprende un dominio de unión con antígenos de un anticuerpo, en donde el dominio de unión con antígenos utiliza un gen VH DP-10 humano o un gen VH DP-88 humano y comprende una secuencia de aminoácidos FR4 que comprende la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO: 31.
12. 12. El miembro de unión específica según la reivindicación 11, en donde el dominio de unión con antígenos utiliza un gen VH DP-10 humano o un gen VH DP-88 humano, y comprende un conjunto las CDR HCDR1, HCDR2 y HCDR3 , en donde la HCDR3 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste.de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO : .25 , y comprende además una secuencia de aminoácidos FR4 que comprende la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO: 31.
13. 13. El miembro de unión específica según la reivindicación 11, en donde el dominio de unión con antígenos utiliza además un gen de la familia V?3 humano y un gen J?5 humano.
14. 14. El miembro de unión específica según la reivindicación 13, en donde el dominio de unión con antígenos que utiliza un gen de la familia V?3 humano y un gen J?5 humano comprende un conjunto de CDR LCDR1, LCDR2 y LCDR3 , y en donde la LCDR3 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 30.
15. 15. Un miembro de unión específica aislado que se une y neutraliza los TGFßl, TGFß2 y TGFß3, humanos que comprende un dominio de unión con antígenos de un anticuerpo, en donde el dominio de unión con antígenos comprende: (a) la HCDR1 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, la HCDR2 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, la HCDR3 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5; (b) la HCDR1 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13, la HCDR2 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14, la HCDR3 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15; o (c) la HCDR1 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23, la HCDR2 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24, la HCDR3 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25.
16. 16. El miembro de unión específica aislado según la reivindicación 15, en donde el dominio de unión con antígenos comprende además un dominio VL del anticuerpo.
17. 17. El miembro de unión específica aislado según la reivindicación 15, en donde el dominio de unión con antígenos que comprende las LCDR se selecciona del grupo que consiste de: (a) la LCDR1 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, la LCDR2 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9, la LCDR3 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10; (b) la LCDR1 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18, la LCDR2 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19, la LCDR3 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20; y (c) la LCDR1 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28, la LCDR2 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29, la LCDR3 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 30.
18. 18. El miembro de unión específica aislado según la reivindicación 15 en donde las HCDR1, HCDR2 y HCDR3 del dominio VH están dentro de una trama de cadena pesada de la línea germinal.
19. 19. El miembro de unión específica aislado según la reivindicación 18, en donde la trama de cadena pesada de la línea germinal es una trama de la familia VH1 humano.
20. 20. El miembro de unión específica aislado según la reivindicación 15, en donde las HCDR1, HCDR2 y HCDR3 del dominio VH están dentro del VHl DP-10 o DP-88 humano de la trama de cadena pesada de la línea germinal.
21. 21. El miembro de unión específica aislado según la reivindicación 17, en donde las LCDR1 , LCDR2 y LCDR3 del dominio VL están dentro de una trama de la cadena ligera de la línea germinal.
22. 22. El miembro de unión específica aislado según la reivindicación 21, en donde la trama de cadena ligera de la línea germinal es una trama de la familia V?3 humano.
23. 23. El miembro de unión específica aislado según la reivindicación 21, en donde el dominio de unión con antígenos utiliza además un gen J?5 humano.
24. 24. El miembro de unión específica aislado según la reivindicación 22, en donde el gen de la familia V?3 humano es un gen DPK22 V? .
25. 25. Un miembro de unión específica aislado que comprenden el dominio VH de PET1073G12 (SEQ ID NO: 2) con hasta 5 mutaciones, o una porción de unión con antígenos del mismo.
26. 26. Un miembro de unión específica aislado que comprenden el dominio VH de PET1074B9 (SEQ ID NO: 12) con hasta 5 mutaciones, o una porción de unión con antígenos del mismo.
27. 27. Un miembro de unión específica aislado que comprende el dominio VH de PET1287A10 (SEQ ID NO: 22) con hasta 5 mutaciones, o una porción de unión con antígenos del mismo.
28. 28. El miembro de unión específica aislado según la reivindicación 10, que comprende además el dominio VL de PET1073G12 (SEQ ID NO: 7) con hasta 5 mutaciones, o una porción de unión con antígenos del mismo .
29. 29. El miembro de unión específica aislado según la reivindicación 25 que comprende además el dominio VL de PET1074B9 (SEQ ID NO: 17) con hasta 5 mutaciones, o una porción de unión con antígenos del mismo .
30. 30. El miembro de unión específica aislado según la reivindicación 26 que comprende además el dominio VL de PET1287A10 (SEQ ID NO: 27) con hasta 5 mutaciones, o una porción de unión con antígenos del mismo .
31. 31. Un anticuerpo que comprende el dominio de PET 1073G12 VH (SEQ ID NO: 2) y el dominio VL PET 1073G12 (SEQ ID NO: 7) .
32. 32. Un anticuerpo que comprende el dominio VH de PET 1074B9 (SEQ ID NO: 12) y el dominio VL de PET 1074B9 (SEQ ID NO: 17) .
33. 33. Un anticuerpo que comprende el dominio VH de PET 1287A10 (SEQ ID NO: 22) y el dominio VL de PET 1287A10 (SEQ ID NO: 27) .
34. 34. El miembro de unión específica aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-30 que comprende una molécula del anticuerpo scFv.
35. 35. El miembro de unión específica aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-30, que comprende una región constante del anticuerpo.
36. 36. El miembro de unión específica aislado según la reivindicación 35 en donde la región constante es de un IgG .
37. 37. Una composición que comprende un miembro de unión específica según cualquiera de las reivindicaciones 1-30.
38. 38. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para un miembro de unión específica según cualquiera de las reivindicaciones 1-30.
39. 39. Una célula hospedera transformada con el ácido nucleico según la reivindicación 38.
40. 40. Un método para producir un miembro de unión específica que comprende cultivar una célula hospedera según la reivindicación 39 bajo condiciones para la producción del miembro de unión específica y aislar y/o purificar el miembro de unión específica.
41. 41. El método según la reivindicación 40 que comprende además formular el miembro de unión específica o el dominio variable VH o VL del anticuerpo en una composición que incluye al menos un componente activo adicional.
42. 42. Un método para producir un miembro de unión específica que se une específicamente a los TGFßl, TGFß2 y TGFß3 humanos, el método comprende: (a) proporcionar un ácido nucleico de partida que codifica para un dominio VH o un repertorio de partida de ácidos nucleicos cada uno que codifica para un dominio VH, en donde los dominios VH o VH comprenden DP-10 o DP-88 de VHl humano de la trama de línea germinal y cualquiera comprende un HCDR1, HCDR2 y/o HCDR3 que se reemplazará o carecerá de una HCDR1, HCDR2 y/o HCDR3 que codifica para una región; (b) combinar el ácido nucleico de partida o el repertorio de partida con el ácido nucleico donador o ácidos nucleicos donadores, en donde el ácido nucleico donador codifica para una HCDR potencial o los ácidos nucleicos donadores que codifican para las HCDR potenciales, de tal forma que el ácido nucleico donador o los ácidos nucleicos donadores se insertan en la región HCDR1 , HCDR2 y/o HCDR3 en el ácido nucleico de partida o el repertorio de partida, de tal forma que proporcionen un repertorio de productos de los ácidos nucleicos que codifican para los dominios VH; (c) expresar los ácidos nucleicos del repertorio de productos para producir los dominios VH del producto; (d) combinar opcionalmente los dominios VH del producto con uno o más dominios VL ; (e) seleccionar un miembro de unión específica para los TGFßl, TGFß2 y TGFß3 humanos, el miembro de unión específica comprende un dominio VH del producto y opcionalmente un dominio VL ; y (f) recuperar el miembro de unión específica o el ácido nucleico que lo codifica.
43. 43. El método según la reivindicación 42, en donde el ácido nucleico donador o ácidos nucleicos donadores que codifican o se producen por la mutación de la secuencia de aminoácidos de: (a) la HCDR1 de la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 13 O la SEQ ID NO: 23; (b) la HCDR2 de la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 24; y/o (c) la HCDR3 de la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 15 o la SEQ ID NO: 25.
44. 44. El método según la reivindicación 42 ó 43, que comprende además fusionar el miembro de unión específica recuperado con una región constante del anticuerpo .
45. 45. El método según la reivindicación 42, en donde el miembro de unión específica es una molécula del anticuerpo scFv.
46. 46. El método según la reivindicación 42, en donde el miembro de unión específica es una molécula del anticuerpo Fab.
47. 47. El método según la reivindicación 42 en donde el miembro de unión específica es un anticuerpo entero .
48. 48. Un método para tratar una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste de una enfermedad fibrótica, cáncer, o una enfermedad inmuno provocada al administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz de una composición según la reivindicación 37.
49. 49. Uso de un miembro de unión específica según cualquiera de las reivindicaciones 1-30 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste de enfermedad fibrótica, cáncer, o enfermedad inmuno provocada.
50. 50. Un método para inhibir la señalización de TGFßl, TGFß2 o TGFß3 que comprende el paso de poner en contacto el TGFßl, TGFß2 y TGFß3 in vi vo con un miembro de unión específica según cualquiera de las reivindicaciones 1-30.
51. 51. Un método para inhibir la producción de fibronectina suministrada por el TGFßl, 2 o 3 que comprende el paso de poner en contacto TGFßl, TGFß2 y TGFß3 con un miembro de unión específica según cualquiera de las reivindicaciones 1-30.
52. 52. Un método para inhibir la producción de VEGF del TGFßl, 2 ó 3 que comprende el paso de poner en contacto el TGFßl, TGFß2 y TGFß3 con un miembro de unión específica según cualquiera de las reivindicaciones 1-30.
53. 53. Un método para modular la proliferación celular seleccionado del grupo que consiste de: (a) reducir la inhibición suministrada por el TGFßl, 2 ó 3 de la proliferación celular epitelial ,- (b) reducir la inhibición suministrada por el TGFßl, 2 ó 3 de la proliferación celular endotelial; y (c) inhibir la proliferación de células de músculo liso suministrada por el TGFßl, 2 ó 3, que comprende el paso de poner en contacto las células que expresan TGFßl, TGFß2 o TGFß3 con un miembro de unión específica según cualquiera de las reivindicaciones 1-30.
54. 54. Un método para inhibir la actividad del TGFßl, 2 ó 3 inducida por ciclosporina que comprende el paso de poner el contacto el TGFßl, TGFß2 o TGFß3 con un miembro de unión específica según cualquiera de las reivindicaciones 1-30.
55. 55. Un método para aumentar la actividad de las células NK que comprende el paso de poner en contacto las células que expresan el TGFßl, TGFß2 o TGFß3 con un miembro de unión específica según cualquiera de las reivindicaciones 1-30.
56. 56. Un método para inhibir la inmunosupresión suministrada por el TGFßl, 2 ó 3 que comprende el paso de poner en contacto las células que expresan el TGFßl, TGFß2 o TGFß3 con un miembro de unión específica según cualquiera de las reivindicaciones 1-30.
57. 57. Un método para inhibir el crecimiento de un tumor que expresa el TGFßl, 2 ó 3 que comprende el paso de poner en contacto las células que expresan el TGFßl, TGFß2 o TGFß3 con un miembro de unión específica según cualquiera de las reivindicaciones 1-30.
58. 58. Un miembro de unión específica aislado que se une específicamente y neutraliza a los TGFßl, TGFß2 y TGFß3 que comprende una secuencia de trama de cadena pesada de la línea germinal de la familia del gen VHl humano.
59. 59. El miembro de unión específica aislado según la reivindicación 58, en donde la secuencia de trama de cadena pesada de la línea germinal es de la familia del gen DP-10 VHl humano.
60. 60. El miembro de unión específica aislado según la reivindicación 59, en donde la secuencia de trama de cadena pesada de la línea germinal es de la familia del gen DP-88 VHl humano.
61. 61. Un miembro de unión específica aislado que se une y neutraliza específicamente el TGFßl, TGFß2 y TGFß3 que comprenden una secuencia de cadena ligera de la línea germinal de la familia del gen V?3 humano .
62. 62. El miembro de unión específica aislado según la reivindicación 61, en donde la región de trama para la cadena ligera es de DPK-22.
63. 63. El miembro de unión específica aislado según la reivindicación 35 en donde la región constante es de un IgGl .