MX2007008869A

MX2007008869A - Metodo para proporcionar material celular facilmente disponible derivado de sangre de cordon, y una composicion de la misma.

Info

Publication number: MX2007008869A
Application number: MX2007008869A
Authority: MX
Inventors: Donnie Rudd
Original assignee: Regenetech Inc
Priority date: 2005-01-27
Filing date: 2006-01-26
Publication date: 2007-09-11
Also published as: CN101142310A; EA200701390A1; CA2596083A1; JP2008528034A; IL184700A0; US20060188984A1; KR20070103431A; WO2006081435A2; EP1859024A2; WO2006081435A3

Abstract

La presente invencion esta dirigida a la expansion por TVEMF de celulas madre de sangre de cordon, de mamifero, preferentemente las celulas CD34+/CD38-, a las composiciones que resultan de las celulas expandidas por TVEMF, y a un metodo para tratar la enfermedad o para reparar el tejido con las composiciones. Diversos beneficios y ventajas para las composiciones de la presente invencion se discuten en la presente.

Description

MÉTODO PARA PROPORCIONAR MATERIAL CELULAR FÁCILMENTE DISPONIBLE DERIVADO DE SANGRE DE CORDÓN, Y UNA COMPOSICIÓN DE LA MISMA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a las células madre de sangre de cordón, preparadas en un biorreactor TVEMF, y al proceso para tal preparación, las composiciones de las mismas, y los métodos para tratar un mamífero con las células o las composiciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La regeneración del tejido humano ha sido por mucho tiempo un deseo de la comunidad médica. De este modo, hasta ahora, la reparación del tejido humano ha sido lograda principalmente por trasplantes de tejido principal proveniente de un donador. Comenzando esencialmente con el trasplante de riñon de uno de los gemelos Herrick al otro y el último hecho mundialmente famoso por el Médico Sudafricano Christian Barnard, el transplante de un corazón de Denise Darval a Louis Washkansky el 3 de diciembre de 1967, el trasplante de tejido se volvió un método ampliamente aceptado para prolongar la vida en pacientes terminales. El trasplante de tejido humano, desde su primer uso, encontró grandes problemas, principalmente el rechazo Ref. :184341 del tejido debido al sistema inmune natural del cuerpo. Esto a menudo provocó el uso de trasplante de tejido para tener una prolongación limitada de la vida (Washkansky vivió únicamente 18 días después de la cirugía) . Con el fin de superar el problema del sistema inmune del cuerpo, numerosos fármacos anti-rechazo (por ejemplo, Imuran, Ciclosporina) fueron pronto desarrollados para suprimir el sistema inmune y de este modo prolongar el uso del tejido antes del rechazo. No obstante, el problema del rechazo ha continuado creando la necesidad para una alternativa al trasplante de tejido. Se utilizó también el trasplante de médula ósea, y es todavía el procedimiento de elección para el tratamiento de enfermedades, tales como leucemia, para reparar ciertos tejidos tales como la médula ósea, pero el trasplante de médula ósea también tiene problemas. Éste requiere una compatibilidad de un donador (encontrado menos de 50% de las veces); es doloroso, caro y riesgoso. En consecuencia, una alternativa al trasplante de médula ósea es altamente deseable. El trasplante de células madre de tejidos tales como el trasplante de células madre hepáticas encontrada en la Patente de los Estados Unidos No. 6,129,911 tienen limitaciones similares que hacen su uso difundido muy cuestionable . En años recientes, los investigadores han experimentado con el uso de células madre embrionarias pluripotenciales como una alternativa al trasplante de tejidos. La teoría detrás del uso de las células madre embrionarias ha sido que éstas pueden ser teóricamente utilizadas para regenerar virtualmente cualquier tejido en el cuerpo. El uso de las células madre embrionarias para la regeneración de tejidos, no obstante, ha encontrado también problemas. Entre los más serios de estos problemas están que las células madre embrionarias trasplantadas tienen capacidad de control limitada, algunas veces se desarrollan en tumores, y las células madre embrionarias humanas que son disponibles para la investigación podrían ser rechazadas por un sistema inmune de un paciente (Nature, June 17, 2002: Pearson, "Stem Cell Hopes Double", news@nature.com, publicado en línea: el 21 de Junio del 2002) . Además, el uso difundido de las células madre embrionarias está tan cargado con intereses éticos, morales y políticos que su uso difundido sigue siendo cuestionable . La sangre de cordón ha sido el foco de varias áreas de investigación. La naturaleza pluripotencial de las células madre fue primeramente descubierta a partir de una célula madre adulta encontrada en médula ósea. Verfaille, CM. et al., Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 417, published online 20 June; doi:10.1038/nature00900, (2002) citada por Pearson, H. Stem cell hopes double, news@nature.com, publicada en línea: el 21 Junio del 2002; doi : 10.1038/news020617-ll . Las células madre CD34+ pluripotenciales y las células progenituras linfoides oligopotenciales han sido encontradas en sangre de cordón umbilical y han mostrado que se diferencian en tipos celulares tales como células linfoides asesinas naturales. Pérez S.A. et al., A novel myeloid-like NK cell progenitor in human umbilical cord blood. Blood 101 (9) : 3444-50 (May 1, 2003) . Además, se ha descubierto que las progenituras de células B residen no solamente en la médula ósea, sino también en la sangre de cordón. Sanz E. et al., Human cord blood CD34+Pax-5+ B-cell progenitors: single-cell analyses of their gene expression profiles. Blood 101 (9) : 4324-30 (May 1, 2003) . Boyse et al., Patente de los Estados Unidos No. 6,569,427 Bl, describe la criopreservación y la utilidad de la sangre fetal o neonatal criopreservada, en el tratamiento o prevención de diversas enfermedades y trastornos tales como anemias, malignidades, enfermedades autoinmunes, y diversas disfunciones y deficiencias inmunes. Boyse también describe el uso de la reconstitución hematopoyética en terapia génica con el uso de una secuencia del gen heterólogo. La descripción de Boyse no obstante, detiene la expansión de las células para uso terapéutico. CorCell,'un banco de sangre de cordón, proporciona estadísticas sobre la expansión, criopreservación y trasplante de células madre de sangre de cordón umbilical. "Expansión of Umbilical Cord Blood Stem Cells", Information Sheet Umbilical Cord Blood, CorCell, Inc. (2003). Un proceso de expansión describe la utilización de un biorreactor con una matriz basada en colágeno central. Research Center Julich: Blood Stem Cells from the Bioreactor. Press reléase May 17, 2001. Además, el congelamiento de las células de sangre de cordón antes o después de la expansión ha mostrado que tiene un efecto sobre las capacidades de expansión de las células madre. Lazzari, L. et al., Evaluation of the effect of cryopreservation on ex vivo expansión of hematopoitic progenitors from cord blood. Bone Marrow Trans. 28:693- 698(2001). Se ha encontrado que la sangre de cordón proporciona mejor reconstitución del depósito hematopoyético en comparación a la médula ósea. Frassoni F. et al., Cord blood transplantation provides better reconstitution of hematopoeitic reservoir as compared to bone marrow transplantation. Blood (April 3, 2003). Ver también Unrelated Stem Cell Transplant Performed in Atlanta December 12, 1998-1 year update. Bone Marrow and Cord Blood Stem Cell Transplant, The Sickle Cell Information Center (1999) . La investigación continúa en un esfuerzo para elucidar los mecanismos moleculares involucrados en la expansión de las células madre. Por ejemplo, el artículo de CorCell describe que una molécula de señal llamada Delta-1 ayuda en el desarrollo de las células madre de sangre de cordón. Ohishi K. et al.: Delta-1 enhances marrow and thymus repopulating ability of human CD34+/CD38- cord blood cells. Clin. Invest. 110: 1165-1174 (2002). A todo lo largo de esta solicitud, el término "células de sangre de cordón" significa células sanguíneas derivadas del cordón umbilical y/o la placenta de un feto o infante . Aunque las células de sangre de cordón son definidas como células madre adultas o somáticas, varios factores hacen a las células sanguíneas de cordón y en particular a las células madre de sangre de cordón únicas. Primeramente, la sangre de cordón es primitiva. Las células madre de sangre de cordón son jóvenes; éstas pueden tener más plasticidad que las células más viejas, lo que significa que éstas pueden dar origen a una mayor variedad de células especializadas. Es más probable también que éstas sean células más saludables debido a que éstas han tenido menos oportunidades de ser afectadas por toxinas ambientalmente dañinas que pueden cambiar el .ADN . Además, debido a que éstas son jóvenes, las células madre de sangre de cordón pueden integrarse mejor dentro del paciente recipiente y es menos probable que provoquen la enfermedad de injerto versus hospedero (GvHD por sus siglas en ingles) o rechazo de células. También, debido a que éstas son jóvenes, las células madre de sangre de cordón pueden ser consideradas un poco menos estables que las células madre de sangre periférica de edad adulta, por ejemplo debido a que las células madre de sangre de cordón están todavía relativamente nuevas y han estado en un ambiente muy protegido. Las células madre de sangre de cordón pueden por lo tanto ser más susceptibles al daño, por ejemplo a partir de la criopreservación, que las células de más edad. En segundo lugar, la sangre de cordón es rica en células madre. La sangre de cordón contiene células sanguíneas blancas (incluyendo células mononucleares; para los fines de esta invención, una célula mononuclear es una célula que tiene únicamente un núcleo) y las células sanguíneas rojas. Típicamente, aproximadamente 1 a 2% de las células mononucleares de sangre de cordón son células madre. Esto hace a la sangre de cordón una de las fuentes más ricas de células madre. La sangre de cordón recolectada de una sección de Cesárea es típicamente incluso un poco más rica en células madre que la sangre de cordón recolectada inmediatamente después del parto vaginal. Es también más fácil de aislar las células madre en sangre de cordón, en oposición a otros tejidos. Mientras que las células madre adulto pueden ser encontradas en numerosos tejidos maduros, éstas son encontradas en menos cantidades y son más difíciles de localizar. En tercer lugar, y finalmente, la sangre de cordón es una fuente disponible de células madre. Los trasplantes de células madre de adulto provenientes de tejido corporal tales como médula ósea no son fácilmente disponibles. El banco de sangre de cordón proporciona una fuente de células madre fácilmente disponibles. Una colección de sangre de cordón proveniente de un infante humano típico inmediatamente después del nacimiento producirán típicamente de 50 a 100 ml de sangre de cordón. El cordón umbilical, el cual contiene sangre de cordón, es el cordón que conecta un feto a una placenta materna, proporcionando nutrientes y eliminando desechos. El cordón umbilical es una estructura en forma de cordón de aproximadamente 56 cm (22 pulgadas) de longitud, que se extiende desde la pared abdominal del feto hasta la placenta materna . La función principal del cordón umbilical es llevar nutrientes y oxígeno desde la placenta hacia el feto y regresar productos de desecho hacia la placenta desde el feto. Esencialmente, el cordón umbilical es una estructura en forma de cuerda formada por, e integral con, la membrana del feto en un extremo, con el otro extremo que termina en la placenta. Encerrada dentro del cordón está una jalea mucoide que aloja una vena que lleva sangre oxigenada hacia el feto y dos arterias que llevan sangre no oxigenada lejos del feto. La sangre es llevada desde el feto a lo largo del cordón umbilical y hacia la placenta. En la placenta in vivo, la sangre de cordón es puesta en estrecha proximidad con la sangre de la madre tal que el oxígeno, los nutrientes y los anticuerpos se difunden desde la sangre de la madre hacia la sangre del cordón. Los materiales de desecho provenientes del feto pasan hacia la sangre materna, vía las dos arterias no oxigenadas. La sangre de cordón, la cual ha sido enriquecida con nutrientes, oxigenada y limpiada de desechos, es luego llevada nuevamente hacia el feto por la vena que lleva sangre oxigenada a través del cordón umbilical . Después del nacimiento, el cordón umbilical es pinchado y cortado. El muñón que está adherido al infante después de que el cordón es cortado, eventualmente se seca y se cae, dejando la cicatriz conocida como el ombligo. Debido a que la sangre de cordón es especialmente rica en células madre algunos padres eligen guardarla en bancos de sangre de cordón especiales. Las células madre de sangre de cordón contenidas en ésta pueden ser utilizadas en el caso de una necesidad futura con una alternativa de trasplante a la médula ósea. Los estudios han mostrado que incluso las personas no relacionadas al donador de la sangre de cordón (genéticamente no compatibles) pueden beneficiarse de los trasplantes de la sangre de cordón para combatir la leucemia y otros cánceres, sin promover una reacción inmune rechazando las células de sangre de cordón. Existen dos maneras típicas de recolectar sangre de cordón; la recolección en bolsa de sangre y la recolección por jeringa. La recolección en bolsa de sangre involucra que un proveedor del cuidado de la salud inserte una aguja dentro de la vena umbilical y, con la ayuda de la gravedad, drene la sangre hacia una bolsa. Una vez que la sangre ha dejado de fluir, la bolsa será sellada y etiquetada por el proveedor del cuidado de la salud. Este método es usualmente realizado antes de que la placenta sea extraída. La recolección con jeringa es similar a la recolección con bolsa de sangre, excepto que la sangre de cordón es extraída hacia jeringas que contienen anticoagulantes (una sustancia que previene que la sangre se coagule) . La sangre es almacenada en las jeringas en vez de en bolsas de sangre. Este método puede ser realizado antes o después de que la placenta sea extraída. Se piensa que ésta es una manera más confiable de recolectar sangre que la recolección con bolsa de sangre. Esto también permite que sea recolectada más sangre que lo que es posible con la recolección por bolsa de sangre. No obstante de cuál método se utilice, o si se utiliza otro proceso para recolectar sangre de cordón, el proceso entero de recolección puede tomar tan poco como cinco minutos de realizarse, o incluso menos. Preferentemente, la sangre de cordón es recolectada dentro de 10 a 15 minutos después del nacimiento. Esperar más tiempo que este tiempo puede dar como resultado que sea recolectada menos sangre de cordón y por lo tanto, son recolectadas menos células madre de sangre de cordón. En el caso del banco de sangre de cordón, o el almacenamiento, una vez que la sangre de cordón llega a las instalaciones de almacenamiento, la sangre de cordón es probada para asegurarse de que ésta no lleva enfermedades infecciosas o genéticas, como la hepatitis, HIV/SIDA, leucemia, o un trastorno inmune. Si existen cualesquiera de tales problemas con la sangre de cordón, ésta puede ser ya sea considerada no adecuada para el almacenamiento o, en algunos casos, la sangre puede ser todavía almacenada con los riesgos asociados, anotados. Si la sangre es necesaria en el futuro, los padres pueden evaluar si la necesidad para las células madre de sangre de cordón supera o no los riesgos asociados llevados con la sangre de cordón. La sangre de cordón que será almacenada típicamente pasa a través de una serie de procesos antes de ser colocada en el banco. Primeramente, la sangre de cordón es separada en dos partes; células sanguíneas blancas, células sanguíneas rojas y plasma. Esto es realizado ya sea en una centrífuga (un aparato que hace girar el recipiente de la sangre hasta que la sangre se divide) o mediante sedimentación (el proceso de inyectar sedimento al recipiente de sangre, provocando que la sangre se separe) . En segundo lugar, una vez que la sangre de cordón es dividida con las células sanguíneas rojas (RBC) sobre el fondo, las células sanguíneas blancas (WBC) en la parte intermedia, y el plasma en la parte superior, las células sanguíneas blancas son retiradas para el almacenamiento. La capa intermedia, también conocida como "pelo de ante" contiene las células madre de sangre de cordón, de interés; las otras partes de la sangre no son necesarias. Para algunos bancos, éste será el grado de su procesamiento. No obstante, otros bancos continuarán procesando la capa leucocitica de ante al retirar las células mononucleares (en este caso, un subgrupo de células sanguíneas blancas) de las WBC. Mientras que no todos están de acuerdo con este método, existe menos para almacenar y es necesario menos nitrógeno criogénico para almacenar las células . Es preferible retirar las RBC de la muestra de sangre de cordón. Mientras que las personas pueden tener el mismo tipo de HLA (que es necesario para el trasplante de células madre) , éstas pueden no tener el mismo tipo de sangre. Al eliminar las RBC, pueden ser reducidas al mínimo las reacciones adversas a un trasplante de células madre. Al eliminar las RBC, por lo tanto, la muestra de células madre tiene una mejor oportunidad de ser compatible con más personas. Las RBC pueden también estallar cuando éstas son descongeladas, liberando la hemoglobina libre. Este tipo de hemoglobina puede afectar seriamente los ríñones de las personas que reciben un trasplante. Además, la viabilidad de las células madre es reducida cuando las RBC se rompen. Antes de que las células sean congeladas, éstas pueden ser expandidas (es decir, incrementadas en número, no en tamaño) . Una vez que las RBC son retiradas, las células comenzarán a ser preservadas y congeladas para el almacenamiento a largo plazo. No obstante, esto debe ser realizado lenta y cuidadosamente, con el fin de no dañar las células madre. Antes de que las células sanguíneas sean congeladas, éstas son primeramente mezcladas en una solución para ayudar a prevenir que éstas sean dañadas mientras están congeladas. Esta solución es denominada como criopreservador , solvente de criopreservación o crioprotector. Una vez que las células expandidas están en el criopreservador, éstas son lentamente congeladas para proteger a las células contra el daño. Una vez congelada (en general a una temperatura de aproximadamente -196°C) , las células son transferidas a un congelador de almacenamiento permanente. Mientras están en este congelador, éstas permanecerán congeladas ya sea en nitrógeno líquido o a vapor. Diferentes tipos de congeladores son comúnmente utilizados para preservar las células madre de sangre de cordón. Un tipo es el congelador "BioArchive" . Esta máquina no solamente congela la sangre, sino también la inventaría y maneja hasta 3,626 bolsas de sangre. Ésta tiene un brazo robótico que recuperará la muestra de sangre específica, cuando se requiera. Ésta asegura que las otras muestras no sean perturbadas o expuestas a temperaturas más calientes. Otros tipos actualmente comercialmente disponibles incluyen, pero no están limitados a, Sanyo Modelo MDF-1155 ATN-152C y Modelo MDF-2136 ATN-135C, y Princeton CryoTech TEC 2000. La expansión de las células madre de sangre de cordón puede tomar varios días. En una situación donde es importante tener un suministro inmediato de células madre de sangre de cordón, tal como una situación de vida o muerte en el caso de un daño traumático, especialmente si la investigación necesita ser lograda antes de la reintroducción de las células, varios días no pueden ser disponibles para esperar la expansión de las células madre de sangre de cordón. Es particularmente deseable, por lo tanto, tener tales células madre de sangre de cordón expandidas, disponibles desde el nacimiento en anticipación de una emergencia donde cada minuto en el retraso del tratamiento puede significar la diferencia en la vida o la muerte.

Existe una necesidad, por lo tanto, para proporcionar un método y proceso de reparación del tejido humano que no está basado en trasplante de órganos, trasplante de médula ósea, células madre embrionarias e incluso proporciona una composición de células madre de sangre de cordón expandidas, que probablemente no promueva una respuesta inmune, para el uso en un asunto de horas en vez de días .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en parte a las células madre de sangre de cordón provenientes de un mamífero, preferentemente humano, en donde las células madre de sangre de cordón son expandidas por TVEMF . La presente invención también se refiere a las células madre de sangre de cordón provenientes de un mamífero, preferentemente humano, en donde las células madre de sangre de cordón están en un número por volumen que es al menos 7 veces mayor que la sangre de cordón de origen natural; y en donde las células madre de sangre de cordón tienen una geometría tridimensional y un soporte de célula a célula y geometría de célula a célula que es esencialmente el mismo que las células madre de sangre de cordón de origen natural . Tales células madre de sangre de cordón son preferentemente elaboradas mediante el proceso de expansión por TVEMF descrito en la presente. La invención también se refiere a las composiciones que comprenden estas células, con otros componentes agregados como se desee, incluyendo portadores farmacéuticamente aceptables, criopreservadores y medios de cultivo de células. La presente invención también se refiere a un proceso para preparar células madre de sangre de cordón y composiciones de las células madre de sangre de cordón, mediante la colocación de una mezcla de sangre de cordón en una cámara de cultivo de un biorreactor de TVEMF; y sometiendo la mezcla de sangre de cordón a un TVEMF y expandiendo por TVEMF las células madre de sangre de cordón, para preparar la composición de células madre de sangre de cordón. Preferentemente, la TVEMF aplicada a las células es de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 6.0 gauss. La presente invención también se refiere a un método para tratar un mamífero con las células madre de sangre de cordón y composiciones de células madre de sangre de cordón de la presente invención. Tal tratamiento puede ser para reparación y regeneración de tejidos, para tratar una enfermedad, o cualesquiera otros usos discutidos a todo lo largo de esta solicitud. También comprendida en la presente está una composición y método para el tratamiento de cualquiera de las enfermedades descritas en la presente, o para la reparación del tejido, o del órgano, que comprende las composiciones de células madre de sangre de cordón de la presente invención. También comprendido en la presente está el uso de una composición de la presente invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cualquiera de las enfermedades discutidas en la presente, o para la reparación o regeneración de tejido como se describe en la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS En las figuras, La Figura 1 ilustra esquemáticamente una modalidad preferida de un circuito o bucle de flujo de portador de cultivo de un biorreactor; La Figura 2 es una vista lateral elevada de una modalidad preferida del biorreactor de TVEMF de la invención; La Figura 3 es una vista lateral en perspectiva de una modalidad preferida del biorreactor de TVEMF de la Figura 2; La Figura 4 es una vista en sección transversal vertical de una modalidad preferida de un biorreactor de TVEMF; La Figura 5 es una vista en sección transversal vertical de un biorreactor de TVEMF; La Figura 6 es una vista lateral en elevación de un dispositivo de fuerza electromagnética que varía con el tiempo, que puede alojar y proporcionar una fuerza electromagnética variante en el tiempo, a un biorreactor; La Figura 7 es una vista frontal del dispositivo mostrado en la Figura 6; y La Figura 8 es una vista frontal del dispositivo mostrado en la Figura 6, que muestra además un biorreactor en éste . La figura 9 muestra una comparación del biorreactor giratorio y el cultivo móvil dinámico del biopotencial de CD34+; el biorreactor realiza el cultivo en cuentas de células CD34+ por 67% DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En los términos más simples, un biorreactor de TVEMF giratorio comprende una cámara de cultivo de células y una fuente de fuerza electromagnética variante en el tiempo. En operación, una mezcla de sangre de cordón es colocada en la cámara de dispositivo de células. La cámara de cultivo de células es rotada sobre un periodo de tiempo durante el cual es generada una fuerza electromagnética variante en la cámara, por la fuente de la fuerza electromagnética que varía con el tiempo. Después de la terminación del tiempo, la mezcla de sangre de cordón expandida es retirada de la cámara. En un sistema de biorreactor de TVEMF más complejo, la fuente de fuerza electromagnética variante con el tiempo puede ser integral al biorreactor de TVEMF, como se ilustra en las Figuras 2-5, pero puede también estar adyacente a un biorreactor como en las Figuras 6-8. Además, un portador fluido, el cual proporciona sustentación a las células, puede ser periódicamente refrescado y removido. Los biorreactores de TVEMF preferidos son descritos en la presente. Con referencia ahora a la Figura 1, se ilustra una modalidad de un circuito de flujo 1 portador de cultivo en un sistema de cultivo de biorreactor completo para desarrollar células de mamífero que tienen una cámara 19 de cultivo de células, preferentemente una cámara de cultivo celular giratoria, un oxigenador 21, un aparato para facilitar el flujo direccional del portador de cultivo, preferentemente mediante el uso de una bomba principal 15, y una tubería de suministro 17 para la entrada selectiva de los requerimientos del portador de cultivo tales como, pero no limitados a nutrientes 3, amortiguadores 5, medio fresco 7, citocinas 9, factores de crecimiento 11, y hormonas 13. En esta modalidad preferida, la bomba principal 15 proporciona portador de fluido fresco al oxigenador 21, donde el portador de fluido es oxigenado y se hace pasar a través de una cámara 19 de cultivo de células. El desecho en el portador de fluido gastado proveniente de la cámara 19 de cultivo de células es retirado y distribuido al desecho 18, y el portador de cultivo de células remanente es devuelto a la tubería 17 en donde éste recibe una carga fresca, como sea necesario, antes del reciclamiento por la bomba 15 a través del oxigenador 21 hacia la cámara 19 de cultivo de células. En el circuito 1 de flujo portador de cultivo, el portador de cultivo se hace circular a través del cultivo de células vivas en la cámara 19, y alrededor del circuito de flujo 1 portador de cultivo, como se muestra en la Figura 1. En este circuito o bucle 1, se realizan ajustes en respuesta a los sensores químicos (no mostrados) que mantienen condiciones constantes dentro de la cámara 19 del reactor de cultivo celular. El control de las presiones de dióxido de carbono y la introducción de ácidos o bases corrige el pH. El oxígeno, el nitrógeno y el dióxido de carbono están disueltos en un sistema de intercambio de gases (no mostrado) con el fin de apoyar la respiración de las células. El circuito cerrado 1 agrega oxígeno y elimina el dióxido de carbono de una capacitancia de gas circulante. Aunque la Figura 1 es una modalidad preferida de un circuito de flujo portador de cultivo que puede ser utilizado en la presente invención, la invención no está destinada a estar limitada así. La entrada de los requerimientos del portador de cultivo tales como, pero no limitados a, oxígeno, nutrientes, amortiguadores, medio fresco, citocinas, factores de crecimiento y hormonas hacia un biorreactor, pueden también ser realizados manualmente, automáticamente, o mediante otro medio de control, como lo puede ser el control y la eliminación de los desechos y el dióxido de carbono. Las Figuras 2 y 3 ilustran una modalidad preferida de un biorreactor de TVEMF 10 con una fuente de fuerza electromagnética variante con el tiempo, integral. La Figura 4 es una sección transversal de un biorreactor de TVEMF 10 giratorio para el uso en la presente invención en una forma preferida. El biorreactor de TVEMF 10 de la Figura 4 es ilustrado con una fuente de fuerza electromagnética variante con el tiempo, integral. La Figura 5 también ilustra una modalidad preferida de un biorreactor de TVEMF con una fuente de fuerza electromagnética que varía con el tiempo, integral. Las Figuras 6-8 muestran un biorreactor giratorio con una fuente de fuerza electromagnética que varía con el tiempo, adyacente. Regresando ahora a la Figura 2, ilustrada en la Figura 2 está una vista lateral elevada de una modalidad preferida de un biorreactor de TVEMF 10 de la presente invención. La Figura 2 comprende un alojamiento 111 del motor, soportado por una base 112. Un motor 113 está acoplado dentro del alojamiento 111 del motor y conectado por un primer alambre 114 y un segundo alambre 115 a una caja de control 116 que tiene un medio de control en ésta mediante el cual la velocidad del motor 113 puede ser controlada en incrementos al hacer girar la perilla de control 117. El alojamiento 111 del motor tiene un motor 113 dentro, colocado de modo que un eje 118 del motor se extiende a través del alojamiento 111 con el eje 118 del motor que está longitudinal de modo que el centro del eje 118 está paralelo al plano de la tierra en el sitio de una cámara longitudinal 119, preferentemente elaborada de un material transparente que incluye, pero no está limitado plástico. En esta modalidad preferida, la cámara longitudinal 119 está conectada al eje 118 de modo que la cámara 119 gira alrededor de su eje longitudinal con el eje longitudinal paralelo al plano de la tierra. La cámara 119 es enrollada con una bobina de alambre 120. El tamaño de la bobina de alambre 120 y el número de veces que está enrollada son tales que cuando una corriente de onda cuadrada preferentemente de 0.1 mA a 1000 mA es suministrada a la bobina de alambre 120, una fuerza electromagnética que varía con el tiempo preferentemente desde 0.05 gauss hasta 6 gauss es generada dentro de la cámara 119. La bobina de alambre 120 está conectada a un primer anillo 121 y un segundo anillo 122 en el extremo del eje 118 por alambres 123 y 124. Estos anillos 121, 122 son luego puestos en contacto por un primer alambre 125 de distribución electromagnética y un segundo alambre 128 de distribución electromagnética, de una manera tal que la cámara 119 puede girar mientras que la corriente es constantemente suministrada a la bobina 120. Un dispositivo 126 generador de fuerza electromagnética, está conectado a los alambres 125, 128. El dispositivo 126 generador de fuerza electromagnética suministra una onda cuadrada a los alambres 125, 128 y la bobina 120, mediante el ajuste de su salida al hacer girar una perilla 127 del dispositivo generador de fuerza electromagnética. La Figura 3 es una vista lateral en perspectiva del biorreactor de TVEMF 10 mostrado en la Figura 2 que puede ser utilizado en la presente invención. Regresando ahora al biorreactor de TVEMF 10 giratorio ilustrado en la Figura 4, con una cámara 230 de cultivo que es preferentemente transparente y adaptada para contener una mezcla de sangre de cordón en ésta, que comprende además un alojamiento externo 220 que incluye un primer 290 y segundo 291 miembro de casquete extremo transversal de forma cilindrica, que tiene una primera superficie extrema 228 y una segunda superficie extrema 229 acomodados para recibir un miembro de vidrio tubular 293 cilindrico interno, y un miembro de vidrio tubular externo 294. Son proporcionados sellos de presión adecuados. Entre los miembros tubulares internos 293 y 294 está un calentador 296 de alambre anular que es utilizado para obtener las temperaturas de incubación apropiadas para el crecimiento celular. El calentador de alambre 296 puede ser también utilizado como un dispositivo de fuerza electromagnética que varía con el tiempo, para suministrar un campo eléctrico que varía con el tiempo a la cámara 230 de cultivo o, como se describe en la Figura 5, una bobina de alambre 144 separada puede ser utilizada para suministrar una fuerza electromagnética variante con el tiempo. El primer miembro 290 de casquete o tapa extrema y el segundo miembro 291 de tapa extrema tienen superficies internas curvadas que se unen a las superficies extremas 228, 229, para promover el flujo más suave de la mezcla dentro de la cámara 230. El primer miembro 290 de tapa extrema, y el segundo miembro 291 de tapa extrema tienen un primer miembro de muñón 292 de transferencia de fluido, central y un segundo miembro de muñón 295 de transferencia de fluido, central, respectivamente, que son giratoriamente recibidos respectivamente sobre un eje de entrada 223 y un eje de salida 225. Cada miembro de muñón de transferencia 294, 295 tiene una pestaña para asentarse en un agujero escariado ahuecado en un miembro de tapa extrema 290, 291 y está acoplado por una primera arandela de aseguramiento y anillo 297, y la segunda arandela de aseguramiento y el anillo 298 contra el movimiento longitudinal con relación a un eje 223, 225. Cada miembro de muñón 294, 295 tiene un hueco anular intermedio que está conectado a los pasajes que se extienden longitudinalmente, circunferencialmente acomodados. Cada hueco anular en un miembro de muñón 292, 295 está acoplado por un primer pasaje 278 radialmente colocado y el segundo pasaje 279 radialmente colocado en un miembro de tapa extrema 290 y 291, respectivamente, al primer acoplamiento de entrada 203 y al segundo acoplamiento de entrada 204. El portador en un pasaje radial 278 ó 279 fluye a través de un primer hueco anular y los pasajes longitudinales en un miembro de muñón 294 ó 295 para permitir el acceso del portador a través de un miembro de muñón 292, 295 a cada extremo del cojinete 292, 295 donde el acceso es circunferencial alrededor de un eje 223, 225. Acoplados a los miembros de tapa extrema 290 y 291 están un primer alojamiento 205 de cojinete, tubular, y un segundo alojamiento 206 de cojinete tubular, que contiene cojinetes de bolas que soportan relativamente el alojamiento externo 220 sobre los ejes de entrada 223 y de salida 225. El primer alojamiento 205 de cojinete tiene un engrane de rueda y cadena 210, acoplado para proporcionar una impulsión giratoria para el alojamiento externo 220 en una dirección rotatoria alrededor de los ejes de entrada 223 y de salida 225 y el eje longitudinal 221. El primer alojamiento 205 de cojinete y el segundo alojamiento de cojinete 206 tienen también provisiones para la captación eléctrica del calentador de alambre 296 y cualquier otro sensor. El montaje 235 de filtro interno incluye los miembros tubulares interno 215 y externo 216 que tienen perforaciones o aberturas a lo largo de sus longitudes y tienen un primero 217 y segundo 218 miembros de tapa extrema del montaje de filtro interno, con perforaciones. El miembro tubular interno 215 está construido en dos piezas con una sección de acoplamiento centralmente localizada, de interaseguramiento y cada pieza acoplada a una tapa extrema 217 ó 218. El miembro tubular externo 216 está montado entre la primera 217 y la segunda tapas extremas de montaje de filtro interno. Los miembros de tapa extrema 217, 218 están respectivamente giratoriamente soportados sobre el eje de entrada 223 y el eje de salida 225. El miembro interno 215 está giratoriamente acoplado al eje de salida 225 por una espiga y un canal de ajuste interactivo 219. Una tela de poliéster 224 con un tejido de diez micrómetros está colocada sobre la superficie externa del miembro externo 216 y acoplada a los anillos tóricos en cualquier extremo. Debido a que el miembro interno 215 está acoplado por una espiga de acoplamiento a una ranura en el eje de impulsión de salida 225, el eje de impulsión de salida 225 puede hacer girar el miembro interno 215. El miembro interno 215 está acoplado en una primera 217 y una segunda 218 tapas extremas que soportan el miembro externo 216. El eje de salida 225 es extendido a través de los cojinetes en un primer alojamiento estacionario 240 y está acoplado a un primer engrane de rueda y cadena 241. Como se ilustra, el eje de salida 225 tiene un orificio tubular 222 que se extiende desde una primera compuerta o vía de paso 289 en el primer alojamiento estacionario 240 localizado entre los sellos hacia el miembro interno 215, de modo que un flujo del portador de fluido puede ser extraído del miembro interno 215 a través del alojamiento estacionario 240. Entre la primera 217 y segunda 218 tapas extremas para el miembro interno 235 y los muñones 292, 295 en el alojamiento externo 220, están un primer cubo 227 y un segundo cubo 226 para los miembros de cuchilla 50a y 50b. El segundo cubo 226 sobre el eje de entrada 223 está acoplado al eje de entrada 223 por una espiga 231, de modo que el segundo cubo 226 gira con el eje de entrada 223. Cada cubo 227, 226 tiene vías de paso que se extienden axialmente para la transmisión del portador a través de un cubo. El eje de entrada 223 se extiende a través de los cojinetes en el segundo alojamiento estacionario 260 para el soporte rotable del eje de entrada 223. Una segunda vía de paso longitudinal 267 se extiende a través del eje de entrada 223 hacia un sitio intermedio de las arandelas de retención y los anillos que están colocados en un segundo hueco anular 232 entre la placa frontal y el alojamiento 260. Una tercera vía de paso radial 272 en el segundo miembro de tapa extrema 291 permite que el portador de fluido en el hueco salga del segundo miembro 291 de tapa extrema. Mientras que no es mostrada, la tercera vía de paso 272 se conecta a través de la tubería y una junta Y a cada uno de los pasajes 278 y 279. Una compuerta de muestreo es mostrada en la Figura 4, donde un primer orificio 237 que se extiende a lo largo de un primer eje se intersecta con una esquina 233 de la cámara 230, y forma una abertura restringida 234. El orificio 237 tiene un agujero escariado y un anillo roscado en un extremo para recibir roscadamente un miembro 236 de válvula cilindrica. Un miembro de válvula 236 tiene una punta complementariamente formada para acoplarse a la abertura 234 y sobresalir ligeramente hacia el interior de la cámara 230. Un anillo tórico 243 sobre el miembro de válvula 236 proporciona un sello. Un segundo orificio 244 a lo largo de un segundo eje intersecta el primer orificio 237 en un sitio entre el anillo tórico 243 y la abertura 234. Un tapón elastomérico o de plástico 245 cierra el segundo orificio 244 y puede ser introducido con una jeringa hipodérmica para retirar una muestra. Para retirar una muestra, un miembro de válvula 236 es retrocedido para acceder a la abertura 234 y el orificio 244. Una jeringa puede ser luego utilizada para extraer una muestra y la abertura 234 puede ser cerrada nuevamente. Ninguna contaminación externa llega al interior del biorreactor de TVEMF 10. En operación, el portador es introducido hacia la segunda compuerta o vía de paso 266 hacia la vía de paso del eje, y allí a la primera vía de paso radialmente colocada 278 y la segunda vía de paso radialmente colocada 279 vía la tercera vía de paso radial 272. Cuando el portador entra a la cámara 230 vía los pasajes longitudinales en los muñones 292, 294, el portador choca sobre una superficie extrema 228, 229 de los cubos 227, 226 y es surtido radialmente, así como axialmente a través de las vías de paso en los cubos 227, 226. El portador que pasa a través de los cubos 227, 226 choca sobre los miembros de tapa extrema 217, 218 y es dispersado radialmente. El flujo del portador del fluido de entrada está de este modo radialmente externo lejos del eje longitudinal 221 y fluye de una manera toroidal desde cada extremo para salir a través de la tela de poliéster 224 y las aberturas en el montaje de filtro 235 para salir por medio de las vías de paso 266 y 289. Mediante el control de la velocidad rotacional y la dirección de rotación del alojamiento externo 220, la cámara 230 y el montaje de filtro interno 235, cualquier tipo deseado de acción portadora puede ser obtenida. De importancia principal, no obstante, es el hecho de que una operación de clinostato puede ser obtenida junto con un suministro continuo de portador de fluido fresco . Si una fuerza electromagnética que varía con el tiempo no es aplicada utilizando el calentador de alambre anular integral 296, éste puede ser aplicado por otra fuente de fuerza electromagnética variante con el tiempo, preferida. Por ejemplo, las Figuras 6-8 ilustran un dispositivo 140 de fuerza electromagnética, variante con el tiempo que proporciona una fuerza electromagnética a un cultivo celular en un biorreactor, que no tiene una fuerza electromagnética que varíe con el tiempo, integral, sino más bien tiene un dispositivo de fuerza electromagnética que varía con el tiempo, adyacente. Específicamente, la Figura 6 es una modalidad preferida de un dispositivo 140 de fuerza electromagnética, que varía con el tiempo. La Figura 6 es una vista lateral en perspectiva, elevada del dispositivo 140, que comprende una base de soporte 145, un soporte 146 de bobina cilindrica soportado sobre la base 145 con una bobina de alambre 147 enrollada alrededor del soporte 146. La Figura 7 es una vista frontal en perspectiva del dispositivo 140 de fuerza electromagnética, variante con el tiempo, ilustrado en la Figura 6. La Figura 8 es una vistan frontal en perspectiva del dispositivo 140 de fuerza electromagnética, variante con el tiempo, que ilustra que en operación, un biorreactor entero 148 es insertado dentro de un soporte 146 de bobina cilindrica que es soportado por una base de soporte 145, y que es enrollado por una bobina de alambre 147. Ya que el dispositivo 140 de fuerza electromagnética variante con el tiempo está adyacente al biorreactor 148, el dispositivo 140 de fuerza electromagnética variante con el tiempo puede ser reutilizado. Además, ya que el dispositivo 140 de fuerza electromagnética variante con el tiempo está adyacente al biorreactor 148, el dispositivo 140 puede ser utilizado para generar una fuerza electromagnética en todos los tipos de biorreactores, preferentemente giratorios. En operación, durante la expansión por TVEMF, un biorreactor de TVEMF 10 de la presente invención contiene una mezcla de sangre de cordón en la cámara de cultivo de células. Durante la expansión de TVEMF, la velocidad de la rotación de la cámara que contiene la mezcla de sangre de cordón puede ser evaluada y ajustada, de modo que la mezcla de sangre de cordón permanece sustancialmente en o aproximadamente en el eje longitudinal. El incremento de la velocidad rotacional es garantizado para prevenir el impacto con las paredes. Por ejemplo, un incremento en la rotación es preferido si las células madre de sangre de cordón en la mezcla de sangre de cordón caen excesivamente hacia adentro y hacia abajo sobre el lado corriente abajo del ciclo de rotación y excesivamente hacia afuera e insuficientemente hacia arriba sobre el lado corriente arriba del ciclo de rotación. Óptimamente, se le aconseja al usuario seleccionar preferentemente una velocidad rotacional que promueva frecuencia e intensidad mínimas de colisión con las paredes, para mantener así la geometría tridimensional de las células madre de sangre de cordón y su soporte de célula a célula y geometría de célula a célula. La velocidad preferida de la presente invención es de 5 a 120 RPM, y más preferentemente de 10 a 30 RPM.

La mezcla de sangre de cordón puede ser preferentemente visualmente evaluada a través de la cámara de cultivo preferentemente transparente, y manualmente ajustada. La evaluación y el ajuste de la mezcla de sangre de cordón puede también ser automatizada por un sensor (por ejemplo, un láser) , que monitorea la posición de las células madre de cordón dentro de un biorreactor de TVEMF 10. Una lectura del sensor que indica demasiado movimiento de las células automáticamente provocará que un mecanismo ajuste la velocidad rotacional, en consecuencia. Además, en operación la presente invención contempla que un dispositivo generador de fuerza electromagnética sea encendido y ajustado, de modo que la salida de onda cuadrada genera el campo electromagnético deseado en la cámara que contiene la mezcla de sangre de cordón, preferentemente en un intervalo de 0.05 gauss a 6 gauss . Ya que podrían ser realizados diversos cambios en los biorreactores giratorios sometidos a una fuerza electromagnética variante con el tiempo como son contemplados en la presente invención, sin apartarse del alcance de la invención, se pretende que toda la materia contenida en la descripción anterior sea interpretada como ilustrativa y no como limitante. Se entiende que las siguientes definiciones ayudan en la descripción y entendimiento de los términos definidos en el contexto de la presente invención. No se entiende que las definiciones limiten estos términos a menos de lo que se describe a todo lo largo de esta solicitud. Además, son incluidas varias definiciones con relación a TVMEF -todas las definiciones a este respecto deben ser consideradas como complemento una de la otra, y no deben ser consideradas una contra la otra. Como se utiliza a todo lo largo de esta solicitud, el término "célula madre adulta" se refiere a una célula pluripotencial que está no diferenciada y que puede dar origen a células más diferenciadas. Con respecto a la presente invención, una célula madre adulta es preferentemente CD34+/CD38-. Como se utiliza a todo lo largo de esta solicitud, el término "sangre de cordón" se refiere a la sangre proveniente del cordón umbilical y/o la placenta de un feto o infante. La sangre de cordón es una de las fuentes más ricas de células madre conocidas. El término "cordón" no está destinado de ninguna manera a limitar el término "sangre de cordón" de esta invención a la sangre proveniente del cordón umbilical; como se explica a todo lo largo de la solicitud, la sangre de la placenta de un feto o infante es confluente con la sangre del cordón umbilical. Para los propósitos de la presente invención, no existe razón para distinguir entre la sangre localizada en las diferentes partes del mismo ciclo circulatorio . Como se utiliza a todo lo largo de esta solicitud, el término "célula de sangre de cordón" se refiere a una célula proveniente de sangre de cordón. Las células de sangre de cordón capaces de realizar la replicación pueden sufrir expansión de TVEMF en un biorreactor de TVEMF, y pueden estar presentes en las composiciones de la presente invención. Como se utiliza a todo lo largo de esta solicitud, el término "células madre de sangre de cordón" se refiere a una célula madre adulta proveniente de sangre de cordón. Las células madre de sangre de cordón son células madre adultas, también conocidas como células madre somáticas, y no son células madre embrionarias derivadas directamente de un embrión. Preferentemente, una célula madre de sangre de cordón de la presente invención es una célula CD34+/CD38-. Como se utiliza a todo lo largo de esta solicitud, el término "composición de la célula madre de sangre de cordón" se refiere a las células madre de sangre de cordón de la presente invención, ya sea en un número por volumen al menos 7 veces mayor que la fuente de sangre de cordón de origen natural y que tiene la misma o una similar geometría tridimensional y la geometría de célula a célula y el soporte de célula a célula como las células madre de sangre de cordón de origen natural, o que han sufrido expansión por TVEMF, manteniendo la geometría y el soporte anteriormente mencionados . Con las células madre de sangre de cordón existe un portador de alguna clase, ya sea un portador farmacéuticamente aceptable, plasma, sangre, albúmina, medio de cultivo de células, factor de crecimiento, agente quelante del cobre, hormona, amortiguador, criopreservador, o alguna otra sustancia. La referencia a la sangre de cordón de origen natural es preferentemente para comparar las células madre de sangre de cordón de la presente invención con su fuente de sangre de cordón original. No obstante, si tal comparación es disponible, entonces la sangre de cordón de origen natural puede referirse a las características típicas o promedio de la sangre de cordón, preferentemente de la misma especie de mamífero como la fuente de las células madre de sangre de cordón de esta invención. Como se utiliza a todo lo largo de esta solicitud, el término "mezcla de sangre de cordón" se refiere a una mezcla de las células de sangre de cordón con una sustancia que permite que las células se expandan, tal como un medio para el crecimiento de las células, que será colocado en un biorreactor de TVEMF (por ejemplo en una cámara de cultivo de células) . Las células de sangre de cordón pueden estar presentes en la mezcla de sangre de cordón simplemente al mezclar la sangre de cordón entera con una sustancia tal como un medio de cultivo de células. También, la mezcla de sangre de cordón puede ser elaborada con una preparación celular proveniente de sangre de cordón, como se describe a todo lo largo de esta solicitud, que contiene las células madre de sangre de cordón. Preferentemente, la mezcla de sangre de cordón comprende células madre de sangre de cordón CD34+/CD38- y medio de Dulbecco (DMEM) . Preferentemente, al menos la mitad de la mezcla de sangre de cordón es un medio de cultivo de células tal como DMEM. Como se utiliza a todo lo largo de esta solicitud, el término "TVEMF" se refiere a la "Fuerza Electromagnética Variante con el Tiempo" . Como se utiliza a todo lo largo de esta solicitud, el término "biorreactor de TVEMF" se refiere a un biorreactor giratorio al cual se aplica la TVEMF, como se describe más completamente en la descripción de los dibujos anteriores. La TVEMF aplicada a un biorreactor está preferentemente en el intervalo de 0.05 a 6.0 gauss, preferentemente de 0.005 a 0.5 gauss. Ver por ejemplo las Figuras 2, 3, 4 y 5 en la presente para los ejemplos (no significa que sean limitantes) de un biorreactor de TVEMF. En una modalidad simple, un biorreactor de TVEMF de la presente invención proporciona la rotación de una mezcla de sangre de cordón, mezclada, a un nivel de gauss apropiado (con la TVEMF aplicada) , y permite que las células de sangre de cordón (incluyendo las células madre) en ésta, se expandan. Preferentemente, un biorreactor de TVEMF permite el intercambio del medio de crecimiento (preferentemente con aditivos) y para la oxigenación de la mezcla de sangre de cordón. El biorreactor de TVEMF proporciona un mecanismo para el crecimiento de las células por varios días o más . El biorreactor de TVEMF somete las células en el biorreactor a TVEMF, de modo que la TVEMF se hace pasar a través de las células, sufriendo de este modo expansión por TVEMF. Como se utiliza a todo lo largo de esta solicitud, el término "células de sangre de cordón expandidas por TVEMF" se refiere a las células de sangre de cordón incrementadas en número por volumen (por ejemplo concentración) después de ser colocadas en un biorreactor de TVEMF y sometidas a una TVEMF de aproximadamente 0.05 a 6.0. El incremento en el número de células por volumen es el resultado de la replicación celular en el biorreactor de TVEMF, de modo que el número total de células en el biorreactor se incrementa. El incremento en el número de células por volumen es expresamente no debido a una reducción simple en el volumen de fluido, por ejemplo, produciendo el volumen de la sangre desde 70 ml hasta 10 ml y con esto incrementando el número de células por ml . Como se utiliza a todo lo largo de esta solicitud, el término "células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF" se refiere a las células madre de sangre de cordón incrementadas en número por volumen (por ejemplo concentración) después de ser colocadas en un biorreactor de TVEMF y sometidas a una TVEMF de aproximadamente 0.05 a 6.0 gauss. El incremento en el número de células madre por volumen es el resultado de la replicación celular en el biorreactor de TVEMF, de modo que el número total de células madre en el biorreactor se incrementa. El incremento en el número de células madre por volumen es expresamente no debido a una reducción simple en el volumen del fluido, por ejemplo, la reducción del volumen de la sangre desde 70 ml hasta 10 ml y con esto el incremento de células madre por ml . Como se utiliza a todo lo largo de esta solicitud, el término "expansión por TVEMF" se refiere al paso de las células en un biorreactor de TVEMF que se replican (que se dividen y crecen) en presencia de TVEMF en un biorreactor giratorio de TVEMF. Las células madre de sangre periférica (preferentemente células madre CD34+/CD38-) se replican preferentemente sin sufrir diferenciación posterior. Como se utiliza a todo lo largo de esta solicitud, el término "expansión por TVEMF" se refiere al proceso de incrementar el número de células sanguíneas de cordón en un biorreactor de TVEMF, preferentemente las células madre de sangre de cordón, al someter las células a un TVEMF de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 6.0 gauss.

Preferentemente, el incremento en el número de células sanguíneas de cordón, preferentemente las células madre de sangre de cordón, es al menos 7 veces el número por volumen (por ejemplo concentración) de la fuente de sangre de cordón original . La expansión de las células madre de sangre de cordón en un biorreactor de TVEMF de acuerdo a la presente invención proporciona las células madre de sangre de cordón que mantienen, o tienen esencialmente la misma geometría tridimensional y el mismo soporte de célula a célula y la geometría de célula a célula como las células madre de sangre de cordón antes de la expansión por TVEMF. Otros aspectos de la expansión por TVEMF pueden también proporcionar las características excepcionales de las células madre de sangre de cordón de la presente invención. Aunque no se pretende estar comprometido por teoría, la expansión por TVEMF no solamente proporciona altas concentraciones de células madre de sangre de cordón que mantienen su geometría tridimensional y el soporte de célula a célula. Sin estar comprometido por teoría, TVEMF puede afectar algunas propiedades de las células madre durante la expansión por TVEMF, por ejemplo la suprarregulación de los genes que promueven el crecimiento, o la subregulación de los genes que previenen el crecimiento. En general, la expansión por TVEMF da como resultado la promoción del crecimiento pero no la diferenciación general. Como se utiliza a todo lo largo de esta solicitud, el término "célula expandida por TVEMF" se refiere a una célula que ha sido sometida al proceso de expansión por TVEMF . Como se utiliza a todo lo largo de esta solicitud, el término "sustancia tóxica" o términos relacionados, puede referirse a las sustancias que son tóxicas para una célula, preferentemente una célula madre de sangre de cordón; o a un paciente. En particular, el término sustancia tóxica se refiere a las células muertas, macrófagos, así como a sustancias que pueden ser únicas o no usuales en la sangre de cordón (por ejemplo, células falsiformes, sangre materna u orina materna u otro tejido o desecho) . Otras sustancias tóxicas son discutidas a todo lo largo de esta solicitud. La eliminación de estas sustancias de la sangre es bien conocida en la técnica. Otras declaraciones referentes a los términos anteriormente definidos u otros términos utilizados a todo lo largo de esta solicitud no se entiende que estén limitados por las definiciones anteriores, y pueden contribuir a las definiciones. La información relacionada a diversos aspectos de esta invención es proporcionada a todo lo largo de esta solicitud, y no se entiende que esté limitada únicamente a la sección en la cual está contenido, sino que significa que contribuye a un entendimiento de la invención como un todo. La presente invención está relacionada a la provisión de una fuente rápidamente disponible de células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF para reparar, reabastecer y regenerar tejido en humanos. Esta invención puede ser más completamente descrita por las modalidades preferidas como se definen más adelante en la presente, pero no está destinada a estar limitada a éstas.

Método Operativo - Preparación de una composición de células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF, y uso de la composición En una modalidad preferida de esta invención, se describe un método para preparar las células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF, que pueden ayudar al cuerpo en la reparación, reemplazo y regeneración de tejido o ser útiles en investigación. La sangre de cordón es recolectada de un mamífero, preferentemente un mamífero primate, y más preferentemente un humano, por ejemplo como se describe a todo lo largo de esta solicitud, y preferentemente de acuerdo al método de jeringa. La sangre de cordón puede ser también recolectada in útero, por ejemplo en situaciones crue amenazan la vida o en situaciones extremas donde es aparente un defecto (por ejemplo un defecto en el oído) durante el tercer semestre del embarazo, de modo que las células madre de sangre de cordón pueden ser expandidas y fácilmente disponibles si son necesarias al nacimiento o poco después del nacimiento del infante. La sangre de cordón in útero podría únicamente ser removida en una cantidad que no amenazará al infante nonato. La recolección de sangre de cordón de acuerdo a esta invención no se entiende que sea limitante, pero puede también incluir por ejemplo otros medios de recolectar directamente sangre de cordón de mamífero, o recolectar indirectamente sangre por ejemplo mediante la adquisición de la sangre a partir de una fuente comercial o de otro tipo, incluyendo el caso de la sangre criopreservada proveniente de un "banco de sangre" . Preferentemente, las células de sangre rojas son eliminadas de la sangre de cordón y las células restantes que incluyen las células madre de sangre de cordón son colocadas con un medio apropiado en un biorreactor de TVEMF (ver "mezcla de sangre de cordón" ) tal como aquel descrito en la presente. En una modalidad más preferida de esta invención, únicamente la "la capa leucocitica" (que incluye células madre de sangre de cordón, como se discute a todo lo largo de esta solicitud) descrita anteriormente es colocada en el biorreactor de TVEMF. Otras modalidades incluyen el retiro de otras células no madre y los componentes de la sangre de cordón, para preparar diferentes preparaciones de sangre de cordón. Tal preparación de sangre de cordón puede incluso tener, únicamente como un componente de sangre de cordón remanente, células madre de sangre periférica CD34+/CD38-. La eliminación de los tipos de células no madre de las células de sangre de cordón puede ser lograda a través de técnicas de separación negativa, tales como, pero no limitadas a, sedimentación y centrifugación. Muchos métodos de separación negativos son bien conocidos en la técnica. No obstante, pueden ser también utilizadas técnicas de selección positiva, y son preferidas en esta invención. Los métodos para retirar diversos componentes de la sangre y seleccionar positivamente para CD34+/CD38- son conocidos en la técnica, y pueden ser utilizados siempre y cuando éstos no lisen o de otro modo dañen irreversiblemente las células madre de sangre de cordón deseadas. Por ejemplo, puede ser utilizado un método de afinidad selectivo para CD34+/CD38-. Preferentemente, una "la capa leucocitica" como se describe anteriormente es preparada a partir de sangre de cordón, y las células CD34+/CD38- en ésta, separadas de la la capa leucocitica para la expansión por TVEMF. La sangre de cordón recolectada, o las partes celulares deseadas como se discute anteriormente, deben ser colocadas dentro de un biorreactor de TVEMF para que ocurra la expansión por TVEMF. Como se discute anteriormente, el término "mezcla de sangre de cordón" comprende una mezcla de sangre de cordón (o parte celular deseada, por ejemplo sangre de cordón sin células sanguíneas rojas, o preferentemente las células madre de sangre de cordón CD34+/CD38- aislada de sangre de cordón) con una sustancia que permite que las células se expandan, tal como un medio para el crecimiento de las células, que será colocado en un biorreactor de TVEMF. Los medios de cultivo de células, los medios que permiten que las células se desarrollen y se expandan, son bien conocidos en la técnica. Preferentemente, la sustancia que permite que las células se expandan es el medio de cultivo de células, más preferentemente el medio de Dulbecco. Los componentes de los medios celulares deben, por supuesto, no matar o dañar a las células. Otros componentes pueden ser también agregados a la mezcla de sangre de cordón antes de o durante la expansión con TVEMF. Por ejemplo, la sangre de cordón puede ser colocada en el biorreactor con el medio de Dulbecco y adicionalmente suplementada con 5% (o alguna otra cantidad deseada, por ejemplo en el intervalo de aproximadamente 1% a aproximadamente 10%) de albúmina sérica humana. Otros aditivos para la mezcla de sangre de cordón, incluyendo, pero no limitados a factor de crecimiento, agente quelante de cobre, citocina, hormonas y otras sustancias que pueden aumentar la expansión por TVEMF, pueden también ser agregadas a la sangre de cordón fuera o dentro del biorreactor, antes de ser colocadas en el biorreactor. Preferentemente, el volumen completo de la colección de sangre de cordón proveniente de un individuo (preferentemente sangre de cordón de humano en una cantidad de aproximadamente 10 ml a aproximadamente 100 ml, más preferentemente 50 ml a aproximadamente 100 ml de sangre de cordón) es mezclada con aproximadamente 25 ml hasta aproximadamente 100 ml de medio de Dulbecco (DMEM) y suplementado con 5% de albúmina sérica humana de modo que el volumen total de la mezcla de sangre de cordón es de aproximadamente 75 a aproximadamente 200 ml, cuando se coloca en el biorreactor. Como una regla general, entre más sangre de cordón pueda ser recolectada, es mejor; si una recolección de un individuo da como resultado más de 100 ml , el uso de toda esa sangre de cordón valiosa es preferido. Donde está disponible un volumen más grande, por ejemplo mediante la combinación de la sangre de cordón, puede ser preferida más de una dosis. El uso de un biorreactor de TVEMF por perfusión es particularmente útil cuando las recolecciones de sangre de cordón son combinadas y expandidas por TVEMF conjuntamente. El término "colocado dentro de un biorreactor de TVEMF" no se pretende que sea limitante -la mezcla de sangre de cordón puede ser realizada completamente fuera del biorreactor y luego la mezcla es colocada dentro del biorreactor. También, la mezcla de sangre de cordón puede ser completamente mezclada dentro del biorreactor. Por ejemplo, la sangre de cordón puede ser colocada en el biorreactor con el medio de Dulbecco y suplementado con 5% de albúmina sérica bovina, ya en el biorreactor, agregado simultáneamente al biorreactor, o agregado después de la sangre de cordón al biorreactor. Una mezcla de sangre de cordón preferida de la presente invención comprende lo siguiente: células madre CD34+/CD38- aisladas de la la capa leucocitica de una muestra de sangre de cordón recolectada de un infante en la sección C; y el medio de Dulbecco el cual, con las células CD34+/CD38-, es de un volumen total de aproximadamente 200 ml . Aún más preferentemente, el G-CSF (Factor de Estimulación de Colonias de Granulocitos) estimulan la expansión por TVEMF de las células madre de sangre de cordón. Aún más preferentemente, la cantidad de G-CSF presente en la mezcla de sangre de cordón antes de la expansión por TVEMF es de aproximadamente 25 a aproximadamente 200 ng/ml de mezcla, más preferentemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 150 ng/ml, y aún más preferentemente de aproximadamente 100 ng/ml . El recipiente del biorreactor de TVEMF (que contiene la mezcla de sangre de cordón que incluye las células madre de sangre de cordón) es rotado a una velocidad que proporciona la suspensión de las células madre de sangre de cordón para mantener su geometría tridimensional y su soporte de célula a célula y geometría de célula a célula. Preferentemente, la velocidad rotacional es de 5 a 120 rpm; más preferentemente, de 10 a 30 rpm. Durante el tiempo en que las células están en el biorreactor de TVEMF, éstas son preferentemente alimentadas con nutrientes y medio fresco (DEMEM y 5% de albúmina sérica humana) , expuestas a hormonas, citocinas, y/o factores de crecimiento (preferentemente G-CSF) ; y los materiales tóxicos son eliminados. Los materiales tóxicos eliminados de las células de sangre de cordón en un biorreactor de TVEMF incluyen el material granular tóxico de las células que mueren y el material tóxico de los granulocitos y los macrófagos. La expansión por TVEMF de las células es controlada de modo que las células se expanden preferentemente (se incrementan en número por volumen, o concentración) al menos siete veces en una cantidad suficiente de tiempo. Preferentemente, las células madre de sangre de cordón (con otras células, si están presentes) sufren expansión por TVEMF por al menos 4 días, preferentemente aproximadamente 7 a aproximadamente 14 días, más preferentemente aproximadamente 7 a aproximadamente 10 días, aún más preferentemente aproximadamente 7 días. La expansión por TVEMF puede continuar en un biorreactor de TVEMF por hasta 160 días. Mientras que la expansión por TVEMF puede ocurrir incluso por más de 160 días, tal expansión prolongada no es una modalidad preferida de la presente invención Preferentemente, la expansión por TVEMF es llevada a cabo en un biorreactor de TVEMF a una temperatura de aproximadamente 26°C hasta aproximadamente 41°C, y más preferentemente a una temperatura de aproximadamente 37°C. Un método de monitorizar la expansión completa de las células que sufren expansión por TVEMF, es mediante inspección visual. Las células madre de sangre periférica son típicamente de color rojo oscuro. Preferentemente, el medio utilizado para formar la mezcla de sangre de cordón es de color claro. Una vez que el biorreactor comienza a rotar y es aplicada la TVEMF, las células se agrupan preferentemente en el centro del recipiente del biorreactor, con el medio que rodea el cúmulo coloreado de células. La oxigenación y otras adiciones nutritivas a menudo no opacan la habilidad para visualizar el grupo de célula a través de una ventana de visualización (típicamente de plástico claro) construida dentro del biorreactor. La formación del cúmulo es importante para ayudar a las células madre a mantener su geometría tridimensional y su soporte de célula a célula y geometría de célula a célula; si el grupo parece dispersarse y las células comienzan a hacer contacto con la pared del recipiente del biorreactor, la velocidad rotacional es incrementada (manual o automáticamente) de modo que el cúmulo centralizado de células puede formarse nuevamente. Una medición del diámetro visualizable del cúmulo de células, tomado poco después de la formación, puede ser comparado con los últimos diámetros del cúmulo, para indicar el incremento en número aproximado en las células en el biorreactor de TVEMF. La medición del incremento en el número de células durante la expansión por TVEMF puede también ser tomada en un número de formas, como es conocido en la técnica. Un sensor automático podría ser también incluido en el biorreactor de TVEMF para monitorizar y medir el incremento en el tamaño del cúmulo . El proceso de expansión por TVEMF puede ser cuidadosamente monitorizado, por ejemplo por un experto de laboratorio quien verificará la formación del cúmulo celular para asegurar que las células permanezcan agrupadas dentro del biorreactor e incrementará la rotación del biorreactor cuando el cúmulo de células comience a dispersarse. Un sistema automático para monitorizar el cúmulo de células y la viscosidad de la mezcla de sangre de cordón dentro del biorreactor, puede también monitorizar los cúmulos celulares. Un cambio en la viscosidad del cúmulo celular puede volverse aparente a aproximadamente 2 días después del comienzo del proceso de expansión por TVEMF, y la velocidad rotacional del biorreactor de TVEMF puede ser incrementada alrededor de ese tiempo. La velocidad del biorreactor de TVEMF puede variar a todo lo largo de la expansión por TVEMF. Preferentemente, la velocidad rotacional es ajustada a tiempo de modo que las células que sufren expansión por TVEMF no hacen contacto con los lados del recipiente del biorreactor de TVEMF. También, el experto en laboratorio puede, por ejemplo una vez al día, o una vez cada dos días, insertar manualmente (por ejemplo con una jeringa) medio fresco y preferentemente otros aditivos deseados tales como nutrientes y factores de crecimiento, como se discute anteriormente, dentro del biorreactor, y extraer el medio viejo que contiene desechos celulares y toxinas. También, el medio fresco y otros aditivos pueden ser automáticamente bombeados dentro del biorreactor de TVEMF durante la expansión por TVEMF y los desechos automáticamente eliminados. Las células madre de sangre periférica pueden incrementar al menos siete veces su número original aproximadamente 7 a aproximadamente 14 días después de ser colocadas en el biorreactor de TVEMF y expandidas por TVEMF. Preferentemente, la expansión por TVEMF dura aproximadamente 7 a 10 dias, y más preferentemente aproximadamente 7 días. La medición del número de células madre no necesita ser tomada durante la expansión por TVEMF por lo tanto. Como se indicó anteriormente y a todo lo largo de esta solicitud, las células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF de la presente invención tienen esencialmente la misma geometría tridimensional y el soporte de célula a célula y la geometría de célula a célula como las células madre de sangre de cordón no expandidas por TVEMF, de origen natural.

Otra modalidad más de la presente invención se refiere a una composición de células madre de sangre de cordón de mamífero, ex vivo, que funciona para ayudar a un sistema o tejido corporal a reparar, reabastecer y regenerar tejido, por ejemplo, los tejidos descritos a todo lo largo de esta solicitud. La composición comprende células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF, preferentemente en una cantidad de al menos siete veces el número por volumen de células madre de sangre de cordón por volumen como en la sangre de cordón de la cual se origina. Por ejemplo, preferentemente, si un número X de células madre de sangre de cordón fue colocado en un cierto volumen dentro de un biorreactor de TVEMF, entonces después de la expansión por TVEMF, el número de células madre de sangre de cordón a partir de ese mismo volumen de células madre de sangre de cordón colocadas dentro del biorreactor de TVEMF, será de al menos 7X. Mientras que esta expansión de al menos siete veces no es necesaria para que esta invención funcione, esta expansión es particularmente preferida para fines terapéuticos. Por ejemplo, las células expandidas por TVEMF pueden estar únicamente en cantidad de 2 veces el número de células madre de sangre de cordón en la sangre de cordón de origen natural, si se desea. Preferentemente, las células expandidas por TVEMF están en un intervalo de aproximadamente 4 veces a aproximadamente 25 veces el número por volumen de células madre de sangre de cordón en la sangre de cordón de origen natural . La presente invención está también dirigida a una composición que comprende las células madre de sangre de cordón provenientes de un mamífero, en donde las células madre de sangre de cordón están presentes en un número por volumen que es al menos 7 veces mayor que la sangre de cordón de origen natural proveniente del mamífero; y en donde las células madre de sangre de cordón tienen una geometría tridimensional y un soporte de célula a célula y geometría de célula a célula que es esencialmente el mismo que las células madre de la sangre de cordón de origen natural . Una composición de la presente invención puede incluir un portador farmacéuticamente aceptable; plasma, sangre, albúmina, medido de cultivo de células, factor de crecimiento, agente quelante de cobre, hormona, amortiguador o criopreservador. "Portador farmacéuticamente aceptable" significa un agente que permitirá la introducción de las células madre dentro de un mamífero, preferentemente un humano. Tal portador puede incluir sustancias mencionadas en la presente, incluyendo en particular cualesquiera sustancias que puedan ser utilizadas para la transfusión de sangre, por ejemplo, sangre, plasma, albúmina, preferentemente proveniente del mamífero al cual será introducida la composición. El término "introducción" de una composición a un mamífero se entiende que se refiere a la "administración" de una composición a un animal. "Portador aceptable" se refiere en general a cualquier sustancia en la que las células madre de sangre de cordón de la presente invención puedan sobrevivir, por ejemplo que sea no tóxica para las células, ya sea después de la expansión por TVEMF, antes de o después de la criopreservación, antes de la introducción (administración) dentro de un mamífero. Tales portadores son bien conocidos en la técnica, y pueden incluir una amplia variedad de sustancias, incluyendo sustancias descritas para tal propósito a todo lo largo de esta solicitud. Por ejemplo, el plasma, la sangre, la albúmina, el medio de cultivo de células, el amortiguador y el criopreservador son todos portadores aceptables de esta invención. El portador deseado puede depender en parte del uso deseado. Otros métodos de expansión conocidos en la técnica (ninguno de los cuales utiliza TVEMF) no proporcionan una expansión de las células madre de sangre de cordón en esta cantidad de al menos 7 veces aquella de la sangre de cordón de origen natural mientras que todavía mantienen la geometría tridimensional y el soporte de célula a célula de las células madre de sangre de cordón. Las células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF tienen esencialmente la misma, o mantienen la geometría tridimensional y el soporte de célula a célula y la geometría de célula a célula como la sangre de cordón de la cual se originaron. La composición comprende las células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF, preferentemente en una suspensión de medio de Dulbecco o en una solución lista para la criopreservación. La composición está preferentemente libre de material granular tóxico, por ejemplo, las células que mueren y el material tóxico o contenido de los granulocitos y macrófagos. La composición puede ser una composición criopreservada que comprende las células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF al disminuir la temperatura de la composición a una temperatura de -120°C hasta -196°C y manteniendo la composición criopreservada en ese intervalo de temperatura hasta que sea necesaria para un uso terapéutico u otro uso. Como se discutió más adelante, preferentemente, tanto material tóxico como sea posible es removido de la composición antes de la criopreservación. Otra modalidad más de la presente invención se refiere a un método para regenerar tejido y/o para tratar enfermedades tales como enfermedades autoinmunes (como se discute anteriormente) con una composición de las células madre de sangre de cordón de TVEMF, que han sufrido ya sea criopreservación o poco después de que se completa la expansión por TVEMF. Las células pueden ser introducidas dentro del cuerpo de un mamífero, preferentemente un humano, por ejemplo inyectadas intravenosamente o directamente dentro del tejido que va a ser requerido, permitiendo que el sistema natural del cuerpo repare y regenere el tejido. Preferentemente, la composición introducida dentro del cuerpo del mamífero está libre de material tóxico y otros materiales que pueden provocar una reacción adversa a las células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF, administradas. El método (y composición) pueden ser utilizados potencialmente para reparar un órgano vital y otro tejido de un mamífero, preferentemente un humano, con tal uso potencial que incluye pero no está limitado a tejido hepático, tejido cardiaco, tejido hematopoyético, vasos sanguíneos, tejido de la piel, tejido muscular, tejido intestinal, tejido pancreático, células del sistema nervioso central, hueso, tejido cartilaginoso, tejido conectivo, tejido pulmonar, tejido del bazo, tejido cerebral y otros tejidos corporales. Las células son fácilmente disponibles para el tratamiento o investigación donde tal tratamiento o investigación requiere las células sanguíneas individuales, especialmente si una enfermedad ha ocurrido y las células libres de la enfermedad son necesarias .

Método Operativo - Criopreservación Como se mencionó anteriormente, la sangre de cordón es recolectada por ejemplo durante el nacimiento (aún más preferentemente en una sección Cesárea) de un mamífero bebé, preferentemente un infante humano. Las células sanguíneas rojas son preferentemente eliminadas de la sangre de cordón. Las células madre de sangre de cordón (con otras células y el medio como se desee) son colocadas en un biorreactor de TVEMF, sometidas a una fuerza electromagnética de tiempo variante y expandidas. Después de la expansión, las células pueden ser criogénicamente preservadas. Los detalles adicionales relacionados a la criopreservación de la composición de células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF, son proporcionados en la presente y en particular más adelante. Después de la expansión por TVEMF, las células expandidas por TVEMF, incluyen las células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF, son preferentemente transferidas dentro al menos un recipiente de criopreservación que contiene al menos un agente crioprotector. Las células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF son preferentemente primeramente lavadas con una solución (por ejemplo una solución amortiguadora o la solución criopreservadora deseada) para retirar el medio y otros componentes presentes durante la expansión por TVEMF, y luego colocadas en una solución que permite la criopreservación de las células. Las células son transferidas a un recipiente criogénico apropiado y el recipiente es descendido en temperatura en general desde -120°C hasta 196°C, preferentemente aproximadamente -130°C hasta aproximadamente -150°C, y mantenidas a esa temperatura.

Cuando sea necesario, la temperatura de las células (por ejemplo la temperatura del recipiente criogénico) es elevada a una temperatura compatible con la introducción dentro del cuerpo humano (en general desde alrededor de la temperatura ambiente hasta alrededor de la temperatura corporal) , y las células expandidas por TVEMF son introducidas dentro del cuerpo de un mamífero, preferentemente un humano, por ejemplo como se discute anteriormente. El congelamiento de las células es ordinariamente destructivo. Al enfriarse, el agua dentro de las células se congela. El daño ocurre entonces por efectos osmóticos sobre la membrana celular, la deshidratación celular, la concentración de solutos, y la formación de cristales de hielo. Conforme se forma el hielo fuera de la célula, el agua disponible es retirada de la solución y retirada de la célula, provocando deshidratación osmótica y concentración elevada de solutos que tarde o temprano destruyen a la célula. (Para una discusión ver Mazur, P., 1977, Cryobiology 14: 251-272) . Diferentes materiales tienen diferentes puntos de congelamiento. Preferentemente, una composición de células madre de sangre de cordón lista para la criopreservación, contiene tan pocas sustancias contaminantes como sea posible, para reducir al mínimo el daño a la pared celular por la cristalización y el proceso de congelamiento.

Estos efectos dañinos pueden ser evitados mediante (a) el uso de un agente crioprotector, (b) el control de la velocidad de congelamiento, y (c) el almacenamiento a una temperatura suficientemente baja para reducir al mínimo las reacciones de degradación. La inclusión de los agentes de criopreservación es preferida en la presente invención. Los agentes crioprotectores que pueden ser utilizados incluyen pero no están limitados a una cantidad suficiente de sulfóxido de dimetilo (DMSO) (Lovelock, J. E. and Bishop, M. W. H., 1959, Nature 183: 1394-1395; Ashwood-Smith, M. J., 1961, Nature 190: 1204-1205), glicerol, polivinilpirrolidina (Rinfret, A. P., 1960, Ann. N. Y. Acad. Sci. 85: 576), polietilenglicol (Sloviter, H. A. y Ravdin, R. G., 1962, Nature 196: 548), albúmina, dextrano, sucrosa, etilenglicol, i-eritritol, D-ribitol, D-mannitol (Rowe, A. W. , et al., 1962, Fed. Proc. 21: 157), D-sorbitol, i-inositol, D-lactosa, cloruro de colina (Bender, M. A., et al . , 1960, J. Appl. Physiol. 15: 520) , soluciones de aminoácidos-glucosa o aminoácidos (Phan The Tran and Bender, M. A., 1960, Exp. Cell Res. 20: 651), metanol, acetamida, monoacetato de glicerol (Lovelock, J. E., 1954, Biochem. J. 56: 265), y sales inorgánicas (Phan The Tran and Bender, M. A., 1960, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 104: 388; Phan The Tran and Bender, M. A., 1961, en Radiobiology, Proceedings of the Third Australian Conference on Radiobiology, Ilbery, P. L. T., ed. , Butterworth, London, p. 59) . En una modalidad preferida, se utiliza DMSO. DMSO, es un líquido no tóxico para las células en baja concentración. Siendo una molécula pequeña, DMSO permea libremente la célula y protege los organismos intracelulares al combinarse con el agua para modificar su capacidad de congelamiento y prevenir el daño por la formación de hielo. La adición de plasma (por ejemplo, a una concentración de 20 a 25%) puede aumentar el efecto protector del DMSO. Después de la adición del DMSO, las células deben ser mantenidas a 0°C hasta el congelamiento, ya que las concentraciones de DMSO de aproximadamente 1% son tóxicas a temperaturas por arriba de 4°C. Los agentes crioprotectores preferidos seleccionados son, en combinación con las células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF, solución de sulfóxido de dimetilo del 20 al 40% en una solución de aminoácidos-glucosa al 60-80%, o una solución de hidroxietil almidón al 15-25%, o 4 a 6% de glicerol, 3 a 5% de glucosa, 6 a 10% de dextrano TÍO, o 15 a 25% de polietilenglicol o 75 a 85% de solución de aminoácidos-glucosa. Mientras otras sustancias, diferentes de las células de sangre de cordón y un agente crioprotector, pueden estar presentes en la presente invención, preferentemente la criopreservación de una composición de células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF de la presente invención, ocurre con tan pocas de otras sustancias, como sea posible, por ejemplo por razones tales como aquellas discutidas con respecto al mecanismo de congelamiento anterior. Preferentemente, la composición de las células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF de la presente invención es enfriada a una temperatura en el intervalo de aproximadamente -120°C a aproximadamente -196°C, preferentemente aproximadamente -130°C hasta aproximadamente -196°C, y aún más preferentemente aproximadamente -130°C a aproximadamente -150°C. Una velocidad de enfriamiento lenta, controlada, es crítica. Diferentes agentes crioprotectores (Rapatz, G. , et al., 1968, Cryobiology 5(1): 18-25) y diferentes tipos celulares tienen diferentes velocidades de enfriamiento óptimas (ver por ejemplo Rowe, A. W. y Rinfret, A. P., 1962, Blood 20: 636; Rowe, A. W. , 1966, Cryobiology 3(1): 12-18; Lewis, J. P., et al., 1967, Transfusión 7(1): 17-32; y Mazur, P., 1970, Science 168: 939-949 para los efectos de la velocidad de enfriamiento sobre la supervivencia de las células periféricas (y sobre su potencial de trasplante) ) . El calor de la fase de fusión donde el agua se vuelve hielo debe ser mínimo. El procedimiento de enfriamiento puede ser llevado a cabo mediante el uso de, por ejemplo, un dispositivo de congelamiento programable o un procedimiento de baño de metanol . Los aparatos de congelamiento programables permiten la determinación de las velocidades de enfriamiento óptimas y facilitan el enfriamiento estándar reproducible. Los congeladores de velocidad controlada programables tales como Cryomed o Planar permiten la afinación del régimen de congelamiento a la curva de velocidad de enfriamiento deseada. Otros congeladores aceptables pueden ser, por ejemplo, Sanyo Modelo MDF-1155ATN-152C y Modelo MDF-2136ATN-135C, Princeton CryoTech TEC 2000. Por ejemplo, para células de sangre de cordón o células CD34+/CD38- en 10% de DMSO y 20% de plasma, la velocidad óptima es 1 a 3°C/minuto desde 0°C hasta -200°C. En una modalidad preferida, esta velocidad de enfriamiento puede ser utilizada para las células de la invención. El recipiente criogénico que mantiene las células debe ser estable a temperaturas criogénicas, y permiten la rápida transferencia de calor para el control efectivo del congelamiento y descongelamiento. Los frascos de plástico sellados (por ejemplo Nunc, Wheaton cryules) o ampolletas de vidrio pueden ser utilizadas para múltiples cantidades pequeñas (1-2 mililitros), mientras que volúmenes más grandes (100 a 200 ml) pueden ser congelados en bolsas de poliolefina (por ejemplo, Delmed) mantenidas entre placas metálicas para transferir mejor el calor durante el enfriamiento. (Las bolsas de células de médula ósea han sido exitosamente congeladas al colocarlas en congeladores a -80°C lo cual, fortuitamente, da una velocidad de enfriamiento de aproximadamente 3°C/minuto). En una modalidad alternativa, el método de baño con metanol de enfriamiento puede ser utilizado. El método de baño de metanol es muy adecuado para la criopreservación rutinaria de múltiples artículos pequeños en una escala grande. El método no requiere el control manual de la velocidad de congelamiento ni un registrador para monitorizar la velocidad. En un aspecto preferido, las células tratadas con DMSO son preenfriadas sobre hielo y transferidas a una charola que contiene metanol enfriado que es colocado, a su vez, en un refrigerador mecánico (por ejemplo, Harris o Reveo) a -130°C. Las mediciones de termopar del baño de metanol y las muestras indican la velocidad de enfriamiento deseada de 1 a 3°C/minuto. Después de al menos dos horas, los especímenes han alcanzado una temperatura de -80°C y pueden ser colocados directamente dentro de nitrógeno líquido (-196°C) para el almacenamiento permanente. Después de un congelamiento completo, las células madre expandidas por TVEMF pueden ser rápidamente transferidas a un recipiente de almacenamiento criogénico de largo plazo. En una modalidad preferida, las muestras pueden ser criogénicamente almacenadas en nitrógeno líquido (-196°C) o su vapor (-165°C) . La temperatura de almacenamiento debe estar por debajo de -120°C, preferentemente por debajo de -130°C. Tal almacenamiento es facilitado en gran medida por la disponibilidad de los refrigeradores de nitrógeno líquido altamente eficientes, los cuales se asemejan a los recipientes Termos grandes con un super aislamiento interno y vacío extremadamente bajo, tal que la fuga de calor y las pérdidas de nitrógeno son mantenidas a un mínimo absoluto. El aparato preferido y el procedimiento para la criopreservación de las células es aquel fabricado por Ther ogenesis Corp., Rancho Cordovo, CA, utilizando su procedimiento para disminuir la temperatura de las células por debajo de -130°C. Las células son mantenidas en una bolsa de plasma Thermogenesis durante el congelamiento y almacenamiento. Después de que la temperatura de la composición de células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF es reducida por debajo de -120°C, preferentemente por debajo de -130°C, éstas pueden ser mantenidas en un aparato tal como un congelador Thermogenesis. Su temperatura es mantenida a una temperatura de aproximadamente 120°C hasta -196°C, preferentemente -130°C hasta -150°C. La temperatura de una composición de células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF de la presente invención, no debe ser de aproximadamente -120°C por un periodo de tiempo prolongado.

Una composición de células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF, criopreservadas de acuerdo a la presente invención, puede ser congelada por un periodo de tiempo indefinido, para ser descongeladas cuando sea necesario. Por ejemplo, una composición puede ser congelada por hasta 18 años. Periodos de tiempo aún más prolongados pueden funcionar, quizás incluso por tanto tiempo como el tiempo de vida de un donador infante. Cuando sea necesario, las bolsas con las células en la presente pueden ser colocadas en un sistema de descongelamiento tal como un Descongelador de Plasma Thermogenesis u otro aparato en la serie de descongeladores Thermoline. La temperatura de la composición criopreservada es elevada hasta la temperatura ambiente. En otro método preferido de descongelamiento las células mezcladas con un agente crioprotector, las bolsas que tienen una composición criopreservada de células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF de la presente invención, almacenadas en nitrógeno líquido, pueden ser colocadas en la fase gaseosa del nitrógeno líquido por 15 minutos, expuestas a temperatura ambiente por 5 minutos, y finalmente descongeladas en un baño de agua a 37 °C tan rápidamente como sea posible. Las bolsas descongeladas son inmediatamente diluidas con un volumen igual de una solución que contiene 2.5% (peso/volumen) de albúmina sérica humana y 5% (peso/volumen) de Dextrano 40 (Solplex 40; Sifra, Verona Italia) en solución salina isotónica y subsecuentemente centrifugadas a 400 g por diez minutos. El sobrenadante es retirado y las células sedimentadas son resuspendidas en solución fresca de albúmin /Dextrano . Ver Rubinstein, P. et al., Processing and cryopreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution. Proc. Natl . Acad. Sci . 92: 10119-1012 (1995) for Removal of Hypertonic Cryoprotectant; a variation on this preferred method of thawing cells can be found in Lazzari, L. et al., Evaluation of the effect of cryopreservation on ex vivo expansión of hematopoietic progenitors from cord blood. Bone Marrow Trans . 28: 693-698 (2001) . Después de que las células son llevadas hasta la temperatura ambiente, éstas son disponibles para la investigación o para la terapia de regeneración. La composición de células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF, descongelada, puede ser introducida directamente dentro de un mamífero, preferentemente un humano, o utilizada en su forma descongelada en la investigación deseada. Pueden ser agregados diversos aditivos a las composiciones descongeladas (o a una composición no criopreservada de células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF) antes de la introducción dentro del cuerpo de un mamífero, preferentemente inmediatamente antes de tal introducción.

Tales aditivos incluyen pero no están limitados a un factor de crecimiento, un agente quelante de cobre, una citocina, una hormona, un amortiguador o diluyente adecuados. Preferentemente, se agrega G-CSF. Aún más preferentemente, para humanos, se agrega GCSF en una cantidad de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 microgramos/kg de peso corporal, y aún más preferentemente en una cantidad de aproximadamente 30 microgramos/kg de peso corporal. También, antes de la introducción, la composición de células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF puede ser mezclada con el propio plasma, sangre o albúmina del mamífero o de un donador adecuado u otros materiales que pueden acompañar a las transfusiones sanguíneas. Las células madre de sangre de cordón descongeladas pueden ser utilizadas por ejemplo para probar si existe una reacción adversa a un producto farmacéutico que se desea utilizar para el tratamiento, o éstos pueden ser utilizados para el tratamiento. Mientras que la Administración de Fármacos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) no ha aprobado el uso de las células madre de sangre de cordón expandidas para la regeneración de tejido en los Estados Unidos, tal aprobación parece ser inminente. Ya que la colección de sangre de cordón puede únicamente ser lograda dentro de un periodo de tiempo breve desde el nacimiento, si éstas van a ser recolectadas para el uso futuro, deben ser recolectadas y expandidas, y almacenadas para la investigación posterior y para posibles usos posteriores. La inyección directa de una cantidad suficiente de células madre de sangre de cordón expandidas debe ser capaz de ser utilizada para regenerar órganos vitales tales como el corazón, el hígado, el páncreas, la piel, el músculo, el intestino, el bazo, el cerebro, etc. Una composición de células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF de la presente invención debe ser introducida dentro de un mamífero, preferentemente un humano, en una cantidad suficiente para lograr la reparación o regeneración de los tejidos, o para tratar una enfermedad o condición deseada. Preferentemente, al menos 20 ml de una composición de células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF que tienen 107 a 109 células madre por ml , es utilizada para cualquier tratamiento, preferentemente todas a la vez, en particular donde un daño traumático ha ocurrido y es necesaria la reparación inmediata del tejido. Esta cantidad es particularmente preferida en un humano de 75 a 85 kg de peso. La cantidad de las células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF en una composición que es introducida en el mamífero fuente, está inherentemente relacionada al número de células presentes en el material de sangre de cordón fuente (por ejemplo, la cantidad de las células madre presentes en la sangre de cordón de un infante) . Un intervalo preferido de las células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF, introducidas dentro de un paciente puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 10 ml hasta aproximadamente 50 ml de una composición de células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF que tienen 107 a 109 células madre por ml, o potencialmente aún más. Mientras que se entiende que una alta concentración de cualquier sustancia, administrada a un mamífero, puede ser tóxica o incluso letal, es improbable que la introducción de todas las células madre de sangre de cordón del mamífero, por ejemplo después de la expansión por TVEMF al menos por 7 veces, provocará una sobredosis en las células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF. Donde se utiliza la sangre de cordón de varios donadores, el número de células madre de sangre de cordón introducidas dentro de un mamífero puede ser más alto. También, las dosis de las células expandidas por TVEMF que pueden ser introducidas al paciente, no está limitada por la cantidad de la sangre de cordón proporcionada a partir de la colección de un individuo; múltiples administraciones, por ejemplo una vez al día o dos veces al día, o dos veces a la semana, u otros marcos de tiempo de administración, pueden ser más fácilmente utilizados. También, donde un tejido va a ser tratado, el tipo de tejido puede garantizar el uso de tantas células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF como sean disponibles. Por ejemplo, el hígado es más fácil de tratar. Se debe entender que, mientras que la modalidad descrita anteriormente se refiere en general a la criopreservación de células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF, la expansión por TVEMF puede ocurrir después del descongelamiento de las células madre de sangre de cordón ya criopreservadas, no expandidas, o no expandidas por TVEMF. Muchos bancos de sangre de cordón, por ejemplo, tienen composiciones criopreservadas que comprenden células madre de sangre de cordón en almacenamiento congelado, en el caso en que tal cosa sea necesaria en algún punto de tiempo. Tales composiciones pueden ser descongeladas de acuerdo a métodos convencionales y luego expandidas por TVEMF como se describe en la presente, incluyendo variaciones en el proceso de TVEMF como se describe en la presente. Después de esto, tales células madre de sangre periférica expandidas por TVEMF son consideradas como composiciones de la presente invención, como se describe anteriormente. La expansión por TVEMF antes de la criopreservación es preferida, por ejemplo como cuando ocurre un daño traumático, las células madre de sangre de cordón de un paciente han sido ya expandidas y no requieren días extra preciosos para prepararse. También, mientras que no es preferido, se debe notar que las células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF de la presente invención pueden ser criopreservadas, y luego descongeladas, y luego si no se utilizan, criopreservadas nuevamente. También, se debe entender que las células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF de la presente solicitud pueden ser introducidas dentro de un mamífero, preferentemente el mamífero fuente (el mamífero que es la fuente de la sangre de médula) después de la expansión con TVEMF, con o sin criopreservación. Las células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF descongeladas pueden ser utilizadas para la investigación para posibles curas para las siguientes enfermedades : I. Enfermedades que resultan de una insuficiencia o disfunción de la producción y maduración de las células sanguíneas normales, trastornos hiperproliferativos de células madre, anemia aplásica, pancitopenia, trombocitopenia, aplasia de células rojas, síndrome de Blackfan-Dia ond debido a fármacos, radiación, o infección, idiopático; II. Malignidades hematopoyéticas, leucemia linfoblástica aguda (linfocítica), leucemia linfocítica crónica, leucemia mielogénica aguda, leucemia mielogénica crónica, mieloesclerosis maligna aguda, mieloma múltiple, policitemia vera, mielometaplasia agnogénica, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma de Hodking, linfoma no Hodgkin; III. Inmunosupresión en pacientes con tumores sólidos malignos, melanoma maligno, carcinoma del estómago, carcinoma de ovario, carcinoma de mama, carcinoma pulmonar de células pequeñas, retinoblastoma, carcinoma testicular, glioblastoma, rabdo iosarcoma, neuroblastoma, sarcoma de Swing, linfoma; IV. Enfermedades autoinmunes, artritis reumatoide, diabetes tipo I, hepatitis crónica, esclerosis múltiple, y lupus eritematoso sistémico; V. Trastornos genéticos (congénitos) , anemias, anemia aplástica familiar, síndrome de Fanconi, síndrome de Bloom, aplasia de células rojas puras (PRCA), disqueratosis congénita, síndrome de Blackfan-Diamond, síndromes I-IV diseritropoyéticos congénitos, síndrome de Chwachmann-Diamond, deficiencias de la dihidrofolato-reductasa, deficiencia en la formamino-transferasa, síndrome de Lesch-Nyhan, esclerosis congénita, eliptocitosis congénita, estomatocitosis congénita, enfermedad congénita de Rh nulo, hemoglobinuria nocturna paroxismal, G6PD (glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa) , deficiencia de variantes de 1, 2 , 3-piruvato-cinasa, sensibilidad congénita de la eritropoyetina, deficiencia, enfermedad y rasgo de células falciformes, talasemia alfa, beta, gamma met-hemoglobinemia, trastornos congénitos de la inmunidad, enfermedad de inmunodeficiencia combinada severa, (SCID), síndrome de linfocitos desnudos, inmunodeficiencia combinada de respuesta a ionóforos, inmunodeficiencia combinada con una anormalidad de encasquetamiento, deficiencia de nucleósido-fosforilasa, deficiencia de actina de granulocitos, agranulocitosis infantil, enfermedad de Gaucher, deficiencia de la adenosina-desaminasa, síndrome de Kostmann, disgénesis reticular, síndromes de disfunción leucocítica congénita; y VI. Otros que incluyen osteoporosis, mieloesclerosis , anemias hemolíticas adquiridas, inmunodeficiencias adquiridas, trastornos infecciosos que provocan inmunodeficiencias primarias o secundarias, infecciones bacterianas (por ejemplo, Brucelosis, Listerosis, tuberculosis, lepra), infecciones parasíticas (por ejemplo, malaria, Leishmaniasis), infecciones por hongos, trastornos que involucran desproporciones en los grupos de células linfoides y funciones inmunes deterioradas debidas a trastornos de envejecimiento de los fagotitos, agranulocitosis de Kostmann, enfermedad granulomatosa crónica, síndrome de Chediak-Higachi , deficiencia de actina de neutrófilos, deficiencia de GP-180 de la membrana de neutrófilos, enfermedades de almacenamiento metabólico, mucopolisacaridosis, mucolipidosis, trastornos misceláneos que involucran mecanismos inmunes, síndrome de Wiskott-Aldrich, deficiencia de alfa-1-antitripsina. Durante el proceso completo de expansión, preservación y descongelamiento, las células madre de sangre de cordón de la presente invención mantienen su geometría tridimensional y su soporte de célula a célula y geometría de célula a célula. Mientras que las modalidades preferidas han sido descritas en la presente, aquellos expertos en la técnica entenderán que la presente invención incluye diversos cambios y modificaciones. El alcance de la invención está destinado a ser limitado a las modalidades anteriormente descritas.

Expansión de Datos en un Sistema Giratorio Fue conducido un experimento para comparar los niveles de expresión de los genes como fueron evaluados por la abundancia de los transcritos de mARN en dos muestras de células madre de sangre de cordón, movilizadas, cultivadas en dos diferentes métodos: (A) caja de Petri agitada (cultivo móvil dinámico) (B) Biorreactor giratorio de Regenetech. Los cultivos fueron reestablecidos, realimentados, cosechados y de otro modo manipulados de una manera idéntica. El cultivo A sirve como la línea base sobre la cual determinar el incremento o disminución de los niveles de trascrito en el cultivo B. Existen tales diferencias en la composición de la membrana entre los 2 cultivos, siempre y cuando estén relacionados los receptores de la superficie celular. Además, varios de los otros genes que son alterados en el cultivo de biorreactor giratorio (principalmente los 'disminuidos') tienen un papel en la inmunidad innata y adaptativa. También, algunos transcritos de los genes involucrados en los contactos célula a célula y en las estructuras citoesqueléticas son significativamente cambiados . Algunos de los genes alterados están involucrados en la proliferación celular. Enseguida se encuentra un resumen de las funciones más relevantes de un subgrupo de datos de arreglo. Incluidos en este resumen están únicamente aquellos genes que muestran al menos 200% (1 vez) de diferencia en los niveles de expresión entre las muestras, ya sea disminuidos (I) o incrementados (II) . Los datos son además agrupados con base en la localización y/o función celulares.

I) Genes "Disminuidos" El intervalo de cambio es de 4 a 1 vez A. PROTEÍNAS MEMBRANALES . Receptores - IL2RD : aka CD25, expresado en células T reguladoras y macrófagos, y células T y B activadas; involucrado en las interacciones de la citocina-receptor de citocina y un papel en la proliferación celular IL17DR: receptor para IL17, y citocina esencial que actúa como un modulador de la respuesta inmune EVI27 : precursor truncado del homólogo del receptor de IL17 TGFDR3 : (aka beta-glucano) tiene también una forma soluble; involucrado en la diferenciación celular, progresión del ciclo celular, migración, adhesión, producción de ECM FCGRla : (aka CD64, receptor humano de Fc-D) expresado en macrófagos/monolitos, neutrófilos; involucrado en la fagocitosis, la respuesta inmune y la transducción de la señal celular MRC1: (ac CD206; receptor de mañosa; familia de lectina) expresado en macrófagos/monolitos (donde la expresión se incrementa durante el cultivo) , y células dendríticas; involucrado en la inmunidad innata y adaptativa CCRl : (receptor de quimiocina, aka CD191, receptor de MIPl, receptor de RANTES); proteína de paso múltiple expresada en varias células hematopoyéticas que transduce una señal en respuesta a varias miocinas, mediante el incremento del nivel intracelular de iones calcio; responsable de afectar la proliferación de las células madre; un papel en la adhesión celular, inflamación y respuesta inmune CRL4 : precursor putativo del receptor de citocina, con un papel en la transducción de señales y la proliferación FER1L3 : (mioferlina) proteína de paso simple en las membranas nucleares y plasmáticas; involucrada en la regeneración y reparación membranal; expresada en músculo cardiaco y esquelético EMPl: (aka TMP) proteína de pasos múltiples de la familia de claudinas, involucrada en la formación de uniones fuertes, y del contacto de célula a célula THBD: ( trombomodulina aka CD141) ; receptor de células endoteliales de paso simple, con lectina y dominios similares a EGF; complejos con trombina para activar la cascada de la coagulación (factor Va y Villa) 2. Transportadores - ABCAl : proteína de pasos múltiples involucrada en el tráfico del colesterol (eflujo) ; expresada en macrófagos y queratinocitos ABCGl: transportador de pasos múltiples involucrado en la homeostasis de lípido de macrófagos; expresado en compartimientos intracelulares de macrófagos principalmente; encontrado en la membrana del retículo endoplásmico y el aparato de Golgi ; 3. Glucoproteínas/Superficie Celular - Versican (aka CSPG2 , sulfato de condroitina proteoglicano 2); involucrado en el mantenimiento de la integridad de ECM, y tiene un papel en la proliferación celular, la migración y la adhesión célula-célula (también interactúa con tenascinR) - CDlc : expresado en células T activadas; involucrado en el montaje de la respuesta inmune CD14 : marcador de la superficie celular expresado en monocitos/macrófagos AREG: (amfiregulina) involucrada en la señalización de célula a célula y en la proliferación; glucoproteína moduladora del crecimiento. Inhibe el crecimiento de varias células de carcinoma humano en cultivos, y estimula la proliferación de los fibroblastos humanos y otras ciertas células tumorales - Z39lg: una inmunoglobulina que abarca la membrana, con un papel en el monta e de la respuesta inmune; expresada en monocitos y células dendríticas HML2 : (aka CLEC10A, CD301) lectina de paso simple expresado en macrófagos; probable papel en la regulación de las respuestas inmunes adaptativa e innata. Se enlaza de una manera dependiente al calcio a la galactosa terminal y a las unidades de N- acetilgalactosamina, enlazadas a la serina o treonina CLECSF5 : lectina mieloide de paso simple; involucrado en la activación proinflamatoria de células mieloides vía la señalización mediada por TYROBP de una manera dependiente del calcio B. CITOSOLICO/TRANSDUCCIÓN DE SEÑAL - SKGl : expresado en granulocitos; tiene un papel en la respuesta a la tensión oxidativa y en la comunicación celular; parte de la vía de proteasoma-ubiquitina C. SECRETADA - SCYA3 (aka CCL3 , MIPl) : secretada por macrófagos/ onocitos; monocina soluble con propiedades inflamatorias y quimiocinéticas, involucrada en la mediación de la respuesta inflamatoria; un factor principal supresor del HIV producido por las células T CD8+ CRO3 : (aka CKCL3 , MPI2); secretada por monocitos PB; quimiocina con la actividad quimiotáctica para neutrófilos y un papel en la inflamación y en la inmunidad - Galectina 3 : una proteína soluble secretada por macrófagos/monocitos; puede enlazarse a ECM para activar las células o restringir la movilidad; involucrada en otros procesos que incluyen la inflamación, transformación neoplásica e inmunidad innata y adquirida mediante el enlace de IgE; también tiene una forma nuclear; inhibida por MMP9 D. FACTORES NUCLEARES/DE TRANSCRIPCIÓN KRML: LOC51713 : KLF4 : tres miembros génicos de la familia Kreisler/Krox de los factores de transcripción nuclear involucrados en la morfogénesis ósea y del oído interno, la diferenciación de las células epiteliales y/o el desarrollo del esqueleto y el riñon EGRl : (aka KROX24) expresada en linfocitos y órganos linfoides; involucrada en la diferenciación de macrófagos, y en las vías de inflamación/apoptosis; activa genes en diferenciación E . ENZ MAS - HMOX1 : (oxigenasa de hemo) microsomal (ER) ; altamente expresada en bazo; involucrada en la conversión del grupo hemo; ubicuamente expresada después de la inducción por varias tensiones, proteínas antiinflamatorias potentes siempre que tenga lugar el daño por oxidación BPHL : hidrolasa de serina mitocondrial que cataliza la activación hidrolítica de los profármacos de éster de aminoácido de análogos de nucleósido; puede jugar un papel en el proceso de destoxificación II) Genes "Inere entados" Éstos son suprarregulados (intervalo de 2 a 1 vez) A. PROTEÍNAS MEMBRANALES - Proteoglicano 3 : expresado en eosinófilos y granulocitos, altamente expresado en médula ósea; involucrado en la respuesta inmune, activación de neutrófilos y liberación de IL8 e histamina CYP1B1: citocromos P450 son un grupo de monooxigenasas de hemo-tiolato involucradas en una vía de transporte de electrones dependiente de NADPH. Ésta oxida una variedad de compuestos estructuralmente no relacionados, incluyendo esteroides, ácidos grasos, y xenobióticos IL9R: receptor de interleucina de paso simple, involucrado en la proliferación celular y en la señalización, expresado en células hematopoyéticas HBA1: (CD31) se enlaza al grupo hemo y al hierro involucrado en el transporte de oxígeno, específico para células sanguíneas rojas - RHAG: (aka CD241) expresado en eritrocitos, transportador de amonio de la proteína de pasos múltiples de la proteína del grupo sanguíneo Rh; se enlaza a la anquirina, un componente del citoesqueleto de las células sanguíneas rojas B. PROTEÍNAS CITOESQUELETICAS SPTAl: ANKl : ambas proteínas están localizadas en la cara citoplásmica de la membrana plasmática de los eritrocitos (RBC) y actúan para anclar las proteínas transmembranales al citoesqueleto; junto con la actina y otras proteínas forman la superestructura del citoesqueleto de las RBC y son responsables del mantenimiento de su forma; NCALD : neurocalcina; citosólica; involucrada en el transporte mediado por vesículas; se enlaza a la actina, a la tubulina y a la clatrina; puede enlazarse a Ca2+; expresado en tejido neuronales y en los testículos C. ENZIMAS (citosolicas) - LSS : metabolismo del colesterol-biosíntesis de esteroides PDE4B: involucrada en la respuesta anti-inflamatoria, alta en el sistema nervioso central; metabolismo de la purina - SPUVE: una proteasa de serina secretada (función desconocida) ELA2 : proteasa de serina expresada en leucocitos/neutrófilos, involucrada en la hidrólisis de proteínas incluyendo la elastina; sirve para modificar la función de las células NK, los monocitos y granulocitos ; inhibe la quimiotaxis en la respuesta anti-inf lamatoria, alta en BM HGD : oxigenasa de enlace al hierro involucrada en el metabolismo de la tirosina y en el catabolismo de la fenilalanina ADAMDEC1 : expresada en macrófagos ; una proteasa sérica secretada, que se enlaza al zinc , involucra en la respuesta inmune ; suprarregulada durante la diferenciación de monocito primario a macrófago y/o células dendríticas HMGCS1 : sintasa de la co-enzíma A soluble involucrada en la biosíntesis del colesterol COVA1 : hidroquinona-oxidasa (X-enlazada) asociada a la membrana extracelular y transplasmática (factor secretado) tiene cobre como un cofactor, tiene varias propiedades asociadas con los priones; naturalmente está glucos i lada; involucrada en el mantenimiento del ritmo ultradiano, regulación del crecimiento celular, transporte de electrones PFKB4 : enzima glucolítica FACTORES NUCLEARES/DE TRANSCRIPCIÓN Pirina: factor de transcripción nuclear que se enlaza al hierro; replicación y transactivación del ADN (X-enlazada) ; interactúa con la cascada de la señalización de SMAD E. OTROS S100A8, A9 : secretada, proteínas de enlace al calcio (isoformas A8 , A9 expresadas en células epiteliales) expresadas por monocitos/macrófagos y granulocitos como parte de la respuesta inflamatoria; inhibidor de las cinasas de proteína. También expresadas en células epiteliales constitutivamente o inducidas durante la dermatosis. Puede interactuar con componentes de los filamentos intermediarios en monocitos y células epiteliales; altamente expresada en médula ósea.

Datos Brutos Affymetrix GCOS PUNTO INTENSIDAD CAMBIO NOMBRE DEL GEN DETALLES PROPORCIO NAL 22081 27 1 1203 P Q Z 1 (PRG3)=proteogl?cano 3 gb NM.0060932/DB_XREP=gl 10092602/GEN=PRG3 FCA= s 251 386/LL=10394 DEF=proleogl¡cano 3 de homo sapiens (PRG3), mARN/PROD=proteogl?cano 3/F qb NM_0060932 qb AF1322092 1_at ÍM 6 3489 Pp EST FL=qb NM_0060932 qb AF1322092 22479 gb AB037797 1/DB_XREF=gl 7243132/GEN=KIAA1376(FEA =mARN/CWr=137 TID=Hs 246B40TIER=STACK/Stk=33/ug =hS 24684/11=57561 /def=mARN de homo sapiens para la protelna KIAA1376, cds Parclales./PROD=pro.elna KIAA1376 7_at 750 5 2706 i 18 (CYP1B1)=c?tocromo P450, gb NM.0001042 DB.XREF=gl 13325059/GEN=CYP1B1/FE 20243 subfamilia I A=FLmARN/CNT=212 TID=Hs 154654 omER=FL+Snack ST K=32/UG=Hs 154654 LL=1545 DEF=c?tocromo P450 de homo sapiens, subfamilia I (Inducible por dioxma), polipéptido 1 (glaucoma 3, infantil primarla) (CYP1B1), mARN/PROD=c?tocomno P450 7_s_at (HGD)=homogenl?salo 1,2 subfamilia I (inducible por dioxina), polipéptidos 1 20522 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dioxina), polipéplido 1 (glaucoma 3, Infantil pnmapo) 6_S_at (inducible por dioxina), /FL=gb U03688 1 gb NM J001042 20613 872 267 1 7 polipépfido 1 gb NM_014479 1/DB_XREF=gl 7657318/GEN=M12219/FEA (M12219)=des?ntegpna =FLmARN/CNT=21 pD=Hs 1452960TIER=FL+SnacWSTK= proteasa 14/UG=Hs 145296 L 27299/DEF=des?ntegnna proteasa de homo sapiens (M12219), mARN PROD=des?ntegnna proteasa/FL=gb NM.014479 1 4_St gb D63807 1/DB_XREF=gl 1019365 FEA=FLmARN CNT=3/T 21101 357 132 3 LSS=lanosterol sintasa ID=Hs 93199 1/TIER=FL/STK=O?JG=Hs93199/LL=4097 UG_ GEN=LSS/DEF=mARN humano para la lanosterol smtasa, cds Completos PROD=lanosterol sintasa 9_s_at /FL=qb D63807 1 21277 1263 3488 P P Q 1 5 EST gb AU150943DB_XREF=gl 11012454DB_XREF=AU150943 /CLON=NT2RP2003984/FEA=mARN/CNT=97TID=Hs 66762 0H"IER=Snack STK=30/UG=Hs 66762/UG_TlTULO=mARN de homo sapiens, cADN (DKFZp564a026 (del clon DKFZp564A026) l_at (S100A9)=S100 pratelna de gb 20353 261 6929 P P Q 1 4 enlace al calcio NM_0029652/DB_XREF=gl 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mARN/PROD=proteasa, sepna, 23FL=gb BC0012781 gb AF1936111 gb AF0152671 gbAL1369141 8_at gb M_0071731 20303 3447 8093 P P 0 12 EST gb NM.0147511/DB.XREF=gl 7662113GEN=KIAA0429/FE A=FLmARN/CNT=119TID=Hs 77694 (WIERíFL+SpackSTK =50/UG=Hs 77694LL=978aOEF=producto del gen KIAA0429 de homo sapiens (KIAA0429), mARNPROD=KIAA0429 7_s_at producto del gen/FL=gb NM_014751 1 gb AB007689 1 20472 263 6 645 0 P P 0 1 2 EST gb AV729634/DB_XREF=gl 10839055 DB_XREF=AV729634 /CLON=HTEAFB10/FEA=FLmARN/CNT=79TID=Hs 448960 mER=Snack,STK=21/UG=Hs 44895 LL=9829/UG_GEN=DN AJC6 UG.TlTUL0=ADN1 (Hsp40) homólogo, subfamilia B, miembro 6 FL=gb AB007942 1 gb NM-014787 1 0_s_at gb NM.003126 1/DB_XREF=gl 4507188/GEN=SPTA1/FEA= 20693 628 220 1 1 2 (SPTA2)=espectnna, alfa, FünARN/CNT=24 TID=Hs 19850/TIER=FL STK=1/UG=Hs 1 eptrocitica 1 985íLL=5708/DEF=espectnna de homo sapiens, alfa, entrocitica 1 (eliptocitosis 2) (SPTA1), mARN/PROD=espectpna, alfa, entrocitica 1 (eliptocitosis 2) FL=gb M61677 1 gb NM J03126 1 |7_at gb L20966 1/DB_XREF=gl 21130 47 1 141 2 P P 0 1 2 PDE45=fosfod?esterasa 4 D=Hs 188 1??ER=FL,STK=0/UG=Hs 188/L 51427G_GEN isoforma B =PDE48 DEF=fosfod?esterasa mARN, cds completos/PROD=fosfod?esterasa FL=gb L20966 1 2_s_at gb AI041522/DB_XREF=gi 3280716 DB_XREF=ov62a06 xl/ 22803 103 1 2859 P P 0 1 2 RBM6=ARN que se enlaza CLON=IMAGEN 1643794/FEA=EST/CNT=26/TID=Hs 17399 a la porción de la proteína 6 3 1 TIER=Snack/STK=22/UG=Hs 173993/LL=10180 UG_GE N=RBM6/UG_TlTULO=ARN que se enlaza a la protelna 6 0_st 22849 82 9 2549 P P 0 1 2 PFKFB4=6-fosfofructo-2- gb AL038787/DB_XREF=gl 5407926 DB_XREF=DKFZp566N 1546_s1/CLON=DKFZp566N1546/FEA=EST/CNT=29TIDrH S 198278 1 TIER=Stack/STK=26/UG=Hs 198278/LL=5210?J G 3EN=PFKF84/UG_TlTULO=6- cmasafr uctosa-26- fosfofructo-2-c?nasafructosa 2,6-b?fosfatasa 4 23014 1582 3756 P P 0 1 2 bifosfatasa 4 gb AI378647/DB_XREF=gl 4188500/DB_XREF=bc57a04 xS/ EST CLON=IMAGEN 2068686/FEA=EST/CNT=22/TID=Hs 42502 0/TIER= Snack 7_St /STK=11/UG=Hs 42502 UG_T(TULO-ESTs 23250 532 164 5 P P 0 1 2 EST gb AL389942 1/DB_XREF=gl 9367848/FEA=mARN/CNT=6/T ID=Hs 1577520TIER=ConsEnd STK=3?JG=Hs 157752?JG_ TlTULO=EUROIMAGE 2005635 de cADN del inserto de longitud completa del mARN de homo sap?ens/DEF= EUROIMAGE 2005635 de cADN del inserto de longitud completa del mARN de homo sapiens 4_at 15543 97 3 1637 1 2 EST gb BC0367961/DB.XREF=gl 22478071 TID=Hs299414 1/C NT=6/FEA=FLmARN/TIER=FL.STK=2/UG_GEN=LOC13630 6/UG=Hs 99414/DEF=homo sapiens, similar a la protelna relacionada al SV2, clon MGC 45715 IMAGEN 5590416, mARN cds completos/PROD=s?m?lar a la protelna relacionada al 20224 6467 18149 1 1 LSS=lanosterol smtasa SV2/FL=gb BC036796 1 gb AW084510/DB_XREF=gl 6039662/DB.XREF=wz24g11 x 1/CLON=IMAGEN 25590434/FEA=FLmARN/CNT=153 riD= Hs 93199 0mER=Snack/STK=51/UG=Hs 93199/LL=4047/U G.GEN=LSS/UG.TlTULOIanosterol s?ntasa 5_at (2,3-ox?doescualeno-lanosterol-c?clasa)/FL=gb NMJ02340 1 20425 7285 15482 1 1 EST gb U22526 1 gb NM.024090 1/DB_XREF=gl 13129087/GEN=MGC5487/F EA=FLmARN/CNT=63/TID=Hs 211556 Q/TIER=FL+Snack/ST K=16/UG=Hs 211556/LL=79071/DEF=protelna hipotética MGC5487 de homo sapiens (MGC5487), mARN, 6_St /PROD=protelna hipotética MGC5487/FL=gb NM J24090 1 20464 661 1845 1 1 (COVA1)=carc?noma de gb NM.006375 1/DB_XREF=gl 5453550/GEN=COVA1/FEA= ovario citosolico FLmARN/CNT=74/TID=Hs 1551850TIER=FL+Snack/STK=3 6/UG=Hs 155185/LL=10495 DEF=antlgeno 1 del carcinoma de ovapo citosolico de homo sapiens (COVA1), mARN 3_s_at antigeno 1 /PROD=antlgeno 1 de carcinoma de ovapo 20614 2428 528 6 1 1 (RHAG)=glucoproteina c?t0S?l?CO/FL=gb NM_006375 1 gb AF207881 1 asociada al grupo gb NM_00324 1/DB_XREF=gl 4506522/GEN=RHAG FEA=FL sanguíneo Rhesus mARN/CNT=31/TID=Hs 1695360 TIER=FL/STK=0/UG=Hs 1 69536/LL=6006/DEF=glucoprotelna asociada al gnjpo sanguíneo Rhesus de homo sapiens (RHAG), mARN,/PROD=glucoprotelna asociada al grupo sanguíneo Rhesus/FL=gb AF031548 1 gb AF187847 1 5_at glucoprotelna gb AF178841 1 gb AF179684 1 gb AF179682 1 20746 1823 3708 1 1 (PIR)=pmna gb NMJJ00324 1 gb NMJ03662 1/DB_XREF=gl 4505822/GEN=PIR/FEA=FL mARN/CNT=4/TID=Hs 279663 O/TIER=FL/STK=0/UG=Hs 27 9663/LL=8544/DEF=p?pna de homo sapiens (PIR), mARN/PROD=p?nna/FL=gb NM-003662 1 9_s_at gb NM_0204801/DB_XREF=gl 10947047/GEN=ANK1 FEA=F 20835 603 1424 P P 0 1 1 (ANK1), vanante 7 del LmARN/CNT=1/TID=Hs 1838056/TIER- transcpto=ank?r?na 1, FL.STK=0/UG=Hs 183805/LL=286/DEF=ank?pna 1 de homo sapiens, eptroatico (ANK1), vanante 7 del tránsente, mARN./PROD=ank?nna 1, t isoforma 7 isoforma 7/FL=gb NM_0204801 20945 171 4 426 P P 0 1 1 (HBA1)=alfa-uno-glob?na gb AF105974 1/DB_XREF=gl 4038449/GEN=HBA1/FEA=FL mARN/CNT=496 D=Hs 272572 Q/TIER=FL/STK=1/UG=Hs 272572 LL=3040/DEF=alfa-uno-glob?na de homo sapiens (HBA1) mARN, cds completos/PROD=alfa-uno-glob?na t /FL=gb NM_0005172 gb AF105974 1 gb AF097635 1 21086 3105 664 7 P P 0 1 1 EST gb BC001305 1 DB_XREF=gl 12654918/FEA/FLmARN/CNT =2 TID=Hs 211556 1/TIER=FUSTK=0/UG=Hs 211556/LL=79 071/UG_GEN=MGC5487/DEF=homo sapiens, clon MGC 5487, mARN, cds completos/PROD=desconoc?do (proteína paraMGC 5487)/FL=gb BC001305 1 8_s_at gb TS0399/DB_XREF=gl 652259/DB_XREF=yb30b11 S1/CL 21441 331 1 723 1 P P 0 1 1 HBA1 hemoglobina, alfa 1 ON=IMAGEN 72669/FEA=EST/CNT=5/TID=Hs 251577 1/TIE 4_x_a R=Snack/STK=8/UG=Hs 251577 t /LL=3039/UG_GEN=HBA1/UG_TlTULO=hemoglob?na, alfa 1 21595 142 1 329 9 P P 0 1 1 IL94=receptor de gb L39064/DB_XREF=gl 632992/FEA=ADN/CNT=12/TID=Hs mterleucina 9 1702 1?JG_TlTULO=receptor de interleucina 9/DEF=gen del precursor del receptor de interleucina 9 de homo sapiens (IL9R), cds completos Descripción: La tabla lista la comparación de las muestras de BDlB con B017, con B017 como una línea base. La columna 6 lista una cifra del cambio proporcional. Los datos fueron analizados utilizando el software Affrimetrix GC05. Las columnas B y C son la intensidad de la señal de la muestra 0017 y 0013, y las columnas D y E son la detección de las muestras B017 y B013. B017 es el cultivo móvil dinámico, y B013 es el biorreactor giratorio Amánsente, P=presente, I=incremento, D=decremento EST: marcador de secuencia expresado, correspondiente al gen de UK fx Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Las células madre de sangre de cordón, genéticamente modificadas; caracterizadas porque son provenientes de un mamífero; en donde las células madre de sangre de cordón tienen genes que son supra y subregulados para soportar la expansión sin diferenciación y suspensión en un cultivo t idimensional de un biorreactor TVEMF que comprende una bobina y una cámara de cultivo que gira alrededor de su eje central longitudinal.

2. Una composición, caracterizada porque comprende las células madre de sangre de cordón de conformidad con la reivindicación 1, y un portador aceptable.

3. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el portador aceptable es al menos uno del grupo que consiste de plasma, sangre, albúmina, medio de cultivo de células, factor de crecimiento, agente quelante del cobre, hormona, amortiguador y criopreservador .

4. La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el factor de crecimiento es G-CSF.

5. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque está a una temperatura suficiente para preservar criogénicamente las células madre de sangre de cordón.

6. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el criopreservador está presente en una cantidad suficiente para la criopreservación de las células, y en donde la composición está a una temperatura de aproximadamente -120°C hasta aproximadamente -196°C.

7. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la temperatura es de aproximadamente -130°C hasta aproximadamente -150°C.

8. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.

9. La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque comprende un criopreservador seleccionado del grupo que consiste de solución del 20 al 40% de sulfóxido de dimetilo en una solución del 60 al 80% de aminoácido-glucosa; solución del 15 al 25% de hidroxietilalmidón; 4 a 6% de glicerol, 3 a 5% de glucosa y 6 a 10% de dextrano TÍO; 15 a 25% de polietilenglicol; y 75 a 85% de solución de aminoácido- glucosa .

10. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la composición está libre de material tóxico.

11. Las células madre de sangre de cordón provenientes de un mamífero, caracterizadas porque son expandidas por TVEMF en un biorreactor giratorio de TVEMF que comprende una bobina .

12. Las células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF de conformidad con la reivindicación 11, caracterizadas porque el número de células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF por volumen es al menos 2 veces mayor que el número de células madre por volumen en el biorreactor de TVEMF giratorio antes de la expansión por TVEMF.

13. Las células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF de conformidad con la reivindicación 12, caracterizadas porque el número de células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF por volumen es al menos 7 veces mayor que el número de células madre por volumen en el biorreactor de TVEMF giratorio que comprende una bobina antes de la expansión por TVEMF.

14. Una composición, caracterizada porque comprende las células madre de sangre de cordón de conformidad con la reivindicación 13, y un portador aceptable.

15. Una composición que comprende las células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF con la reivindicación 13, caracterizada la composición porque comprende además al menos uno del grupo que consiste de plasma, sangre, albúmina, medio de cultivo de células, factor de crecimiento, agente quelante de cobre, hormona, amortiguador y criopreservador.

16. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el factor de crecimiento es G-CSF.

17. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque comprende un criopreservador seleccionado del grupo que consiste de solución del 20 al 40% de sulfóxido de dimetilo en una solución del 60 al 80% de aminoácido-glucosa; solución del 15 al 25% de hidroxietilalmidón; 4 a 6% de glicerol, 3 a 5% de glucosa y 6 a 10% de dextrano TÍO; 15 a 25% de polietilenglicol; y 75 a 85% de solución de aminoácido-glucosa.

18. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque está a una temperatura suficiente para preservar criogénicamente las células madre de sangre de cordón.

19. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el criopreservador está presente y en donde la composición está a una temperatura de aproximadamente -120°C hasta aproximadamente -196°C.

20. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la temperatura es de aproximadamente -130°C hasta aproximadamente -150°C.

21. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque está libre de material tóxico.

22. Un proceso para preparar una composición de células madre de sangre de cordón, caracterizado porque comprende los pasos de: a. colocar una mezcla de sangre de cordón que contiene células madre de sangre de cordón en una cámara de cultivo de un biorreactor de TVEMF que comprende una bobina; b. hacer girar la cámara de cultivo alrededor de su eje central longitudinal, de modo que las células madre de sangre de cordón son suspendidas en un ambiente tridimensional, y c . se somete la mezcla de sangre de cordón a una TVEMF y se expanden por TVEMF las células madre de sangre de cordón para preparar la composición de células madre de sangre de cordón.

23. El proceso de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la TVEMF es de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 6.0 gauss.

24. El proceso de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la expansión por TVEMF continúa hasta que el número por volumen de las células madre de sangre de cordón expandidas por TVEMF es mayor de 7 veces el número por volumen de las células madre de sangre de cordón colocadas en el biorreactor de TVEMF.

25. El proceso de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque comprende además la recolección de sangre de cordón criopreservada, descongelada, proveniente de una instalación de almacenamiento de sangre de cordón, antes de agregar la sangre de cordón a la mezcla de sangre de cordón.

26. El proceso de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque comprende además un paso de eliminar el material tóxico de la mezcla de sangre de cordón antes de la expansión por TVEMF.

27. El proceso de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque las células madre de sangre de cordón de la mezcla de sangre de cordón son separadas de los otros componentes de la sangre de cordón antes del paso a.

28. El proceso de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque las células madre de sangre de cordón de la mezcla de sangre de cordón son un componente de una capa leucocitica separadas de los componentes de la sangre de cordón antes del paso a.

29. El proceso de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque comprende además los pasos de transferir las células expandidas por TVEMF a la composición de células madre de sangre de cordón en un recipiente criogénico que tiene una temperatura, y disminuyendo la temperatura del recipiente criogénico a una temperatura desde -120°C hasta -196°C a una velocidad controlada .

30. El proceso de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque comprende además un paso de eliminar el material tóxico de la composición de células madre de sangre de cordón antes de disminuir la temperatura hasta una temperatura desde -120°C hasta -196°C, por una velocidad controlada.

31. El proceso de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque comprende además, después el paso de disminución de la temperatura, un paso de mantenimiento de la temperatura del recipiente criogénico a una temperatura de -120°C hasta -196°C, por un periodo de tiempo .

32. El proceso de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el periodo de tiempo es al menos 1 año.

33. El proceso de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque comprende además, después de la disminución y el mantenimiento de la temperatura, un paso de incrementar la temperatura del recipiente criogénico a una velocidad controlada hasta una temperatura adecuada para la introducción de la composición de células madre de sangre de cordón a un mamífero.

34. El proceso de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el material tóxico ha sido eliminado de la composición de células madre de sangre de cordón con temperatura incrementada.

35. El proceso de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque comprende además el paso de agregar un criopreservador a las células expandidas por TVEMF de la composición de células madre de sangre de cordón.

36. Una composición, caracterizada porque comprende células madre de sangre de cordón y un portador aceptable preparado mediante el proceso de conformidad con la reivindicación 22.

37. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque es para el tratamiento de tejido de mamífero.

38. La composición de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque el tejido de mamífero es un tejido humano.

39. La composición de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque el tejido es al menos uno seleccionado del grupo que consiste de tejido hepático, tejido cardiaco, tejido hematopoyético, vasos sanguíneos, tejido de la piel, tejido muscular, tejido intestinal, tejido pancreático, células del sistema nervioso central, hueso, tejido cartilaginoso, tejido conectivo, tejido pulmonar, tejido del bazo y tejido cerebral.

40. La composición de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque las células madre de sangre de cordón están en una cantidad terapéuticamente efectiva .

41. La composición de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque la cantidad terapéuticamente efectiva es al menos 20 ml y 107 a 109 células madre/ml.

42. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque es para el tratamiento de una enfermedad de mamífero.

43. El uso de las células madre de sangre de cordón de conformidad con la reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad de mamífero.

44. El uso de la composición de células madre de sangre de cordón de conformidad con la reivindicación 22, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un tejido de mamífero.

45. Las células madre de sangre de cordón genéticamente modificadas de conformidad con la reivindicación 1, caracterizadas porque son para utilizarse en el tratamiento de una enfermedad de mamífero.

46. Las células madre de sangre de cordón genéticamente modificadas de conformidad con la reivindicación 22, caracterizadas porque son para utilizarse en el tratamiento de una enfermedad de mamífero.