MX2007007228A - Profarmaco de amida de gemcitabina, composiciones y uso del mismo. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a profarmacos novedosos de amida de gemcitabina, composiciones de los mismos y metodos para su uso.

Description

PROFARMACO DE AMIDA DE G EMCITABI N A, COMPOSICIONES Y USO DEL MISMO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un profármaco novedoso de gemcitabina, el cual puede administrarse oralmente, al atravesar el tracto intestinal sustancialmente intacto dentro del torrente sanguíneo portal con menos toxicidad gastrointestinal y mejor biodisponibilidad que con el fármaco precursor, y mantener la eficacia del fármaco precursor a dosis inferiores. El clorohidrato de gemcitabina (clorohidrato de 2',2'-d?fluoro-2'-desoxicitidina) es un agente anti-tumor, con acción a nti viral conocida, que se produce y comercializa actualmente como Gemzar®, una formulación en polvo 11 of 11 izada para el tratamiento de diversos cánceres Gemzar®, un proceso para su elaboración y métodos de uso del mismo se describen en la patente de E U A No 5, 464,826 y patente de E U A No 4, 808, 614 Gemzar® está actualmente aprobado para el tratamiento de cáncer pancreático, cáncer de mama y cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC) y se evalúa para cáncer ovárico Además, Gemzar® se puede usar en el tratamiento de VHC asi como un modulador para la función inmune (ver patente de E U A No 6,555,518) Gemzar® se administra actualmente por infusión intravenosa a una dosis de aproximadamente 1000 a 1250 mg/m2 durante 30 minutos, una vez a la semana por hasta 7 semanas seguido por una semana de descanso desde el tratamiento El uso de gemcitabina oralmente se puede limitar por su pobre biodispon ibihdad oral, la cual es el resultado del metabolismo de primer paso Shipley LA Et al , "Metabolism and disposition of gemcitabme, and oncolytic desoxycytidme analog, in mice, rats, and dogs" Drug Metabolism & Disposition 20(6) 849-55, 1992 Además, cuando se dosifica oralmente, la gemcitabina está implicada en provocar lesiones intestinales adversas limitantes de la dosis, caracterizadas por una pérdida de moderada a marcada del epitelio de la mucosa (enteropatía atrófica) a través de la longitud completa del tracto intestinal en ratones a los que se les da una dosis sencilla oral (cebadura) de gemcitabina de 167, 333, o 500 mg/kg Horton ND et al , "Toxicity of single-dose oral gemcitabine in mice", American Association for Cáncer Research, Poster Presentation, Orlando, FL, Marzo 27-31, 2004 Las dosis comparables por medio de dosificación intravenosa en estudios previos en ratones no resultaron en la muerte o en toxicidad gastrointestinal. Métodos para elaboración de formulaciones de profármacos y de liberación sostenida de gemcitabma son bien conocidos en la técnica. Ejemplos de tales profármacos y formulaciones de liberación sostenida se pueden encontrar en WO 04/0412303 "Gemcitabine Prodrugs, Pharmaceutical Compositions and Uses Thereof", Gallop et al , WO 98/32762 "Gemcitabine Derivatives," Myhren, Finn, et al , WO 02/09768 "Therapeutic polyesters and polyamides," Uhpch, Kathryn E , WO 02/76476 "Prodrugs of anticancer agents based on substituted aromatic acids," Greenwald, Richard B , et al , WO 02/65988 "Term inally-branched polymeric linkers and polymeric conjugates as prodrug,' Choe, Yun Hwang, et al Los derivados de gemcitabina amida se han descrito en el arte como intermediarios útiles en la síntesis de gemcitabina, ver por ejemplo, Bptton, et al , Patente de E U A No 5,420,266 y Gpndey, et al , Patente de E U A No 5,464,826 y también útiles como porciones de profármacos para la administración de gemcitabina, ver por ejemplo, Gallop, et al , WO 04/041203 Continua siendo una necesidad un profarmaco de gemcitabina que permitirá el suministro oral, pasará a través del tracto intestinal intacto sin degradación sustancial y suministro de gemcitabina al área del padecimiento con seguridad y eficacia aceptable Sorprendentemente, se ha descubierto un derivado superior, y novedosos de amida de gemcitabma, el cual atraviesa el enterocito sustancialmente intacto, se h id ro I iza a gemcitabma sin una acumulación importante de desoxidifluoroupdina (dFdU) el metabohto predominante de gemcitabina en el hígado, tiene menos toxicidad que la gemcitabina oral, y mantiene la eficacia apropiada y perfiles de seguridad cuando se administra oralmente BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un compuesto de fórmula I I Otro aspecto de la invención proporciona composiciones farmacéuticas novedosas, que comprenden un compuesto de fórmula I y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. La presente invención también proporciona el uso del compuesto de fórmula I para el tratamiento de neoplasma susceptible en un mamífero que necesita de tal tratamiento. La presente invención proporciona el uso del compuesto de fórmula I para el tratamiento de infecciones virales susceptibles en un mamífero que necesita de tal tratamiento. La presente invención también proporciona el uso de un compuesto de fórmula I para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de neoplasmas susceptibles o infecciones virales. Además, la presente invención también proporciona un método para preparar el compuesto de fórmula I.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se usan en la presente, los términos tienen los significados indicados El termino "mamífero" se toma para significar cualquiera de diversos animales vertebrados de sangre caliente de la clase Mammaha, lo mas preferiblemente humanos, caracterizados por cubrir de cabello en la piel y, en las glándulas mamarias femeninas que producen leche para nutrir a los jóvenes El término "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador, solución o aditivo de formulación farmacéuticamente aceptable para mejorar las características de formulación Tales excipientes deben ser compatibles con otros ingredientes de la formulación y no ser perjudiciales a los receptores del mismo, y son bien conocidos por aquellos expertos, ver por ejemplo, Remingtons Pharmaceutical Sciences, 19lh Edition, Mack Publishing Company, 1995 El término 'co-cpstal" significa una asociación física de dos o más moléculas las cuales deben su estabilidad a través de una interacción no covalente Uno o más componentes de este complejo molecular proporcionan una estructura estable en una matriz cristalina En ciertos casos, las moléculas huésped se incorporan en la matriz cristalina como anhidratos o solvatos, ver por ejemplo, "Crystal Engineepng of the Composition of Pharmaceutical Phases Do Pharmaceutical Co-crystals Represent a New Path to Improved Medicmes?" Almarasson, O., et. al , The Royal Society of Chemistry, 1889-1896, 2004 Los co-cpstales preferidos incluyen ácido p-toluensulfónico y ácido bencensulfónico El término 'co-cpstal farmacéuticamente aceptable" significa uno que es compatible con los otros ingredientes de la formulación y no es perjudicial al receptor del mismo El término "neoplasma susceptible" se refiere a un crecimiento anormal de tejido en mamíferos que puede tratarse por la administración oral del compuesto de fórmula I Ya que este profármaco se hidrolizara a gemcitabma, la administración del profármaco se espera que tenga un amplio espectro de actividad contra una amplia variedad de tipos de tumor, tanto sólidos y no sólidos Preferiblemente, neoplasmas susceptibles incluyen linfoma de células T, sarcoma de tejido suave, cáncer pancreático, cáncer de mama, linfoma de Hodgkín, linfoma no de Hodgkín, cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer ovárico y cáncer de vejiga Los compuestos de la invención son útiles en el tratamiento de infecciones virales, particularmente HCV El termino "cantidad terapéuticamente efectiva" significa la cantidad de compuesto/composición que producirá la repuesta biológica o médica deseada de un tejido, sistema o mamífero que se busca por el investigador, medico o personal clínico La gemcitabina contiene tres grupos funcionales que se derivan, los grupos 3' y 5' hidroxilo y el grupo N4-am?no El compuesto de fórmula I se puede preparar al usar grupos protectores adecuados para bloquear las funciones de hidroxilo en 3' y 5' seguido por la acilación del grupo N4-am?no Los grupos protectores típicos son bien conocidos y apreciados en el arte Protectinq Groups m Orqanic Synthesis, 3a edición Theodora Greene, Peter Wuts (Wiley-lnterscience) 1999 La acilación del grupo N4-am?no se puede lograr por la reacción con cloruro o anhídrido de ácido o por la reacción con un ácido carboxíhco en la presencia de un reactivo de acoplamiento, tal como N,N-d?c?clohex?lcarbod??m?da (DCC), N-et?l-N'-(3-d?met?lam?noprop?l)-carbod??m?da (EDC), 1,1-carbon?ld??m?dazol (CDl) u otros reactivos similares bien conocidos en la técnica de la química orgánica Alternativamente, el compuesto de fórmula I se puede preparar sin el uso de grupos protectores En este caso, se formarán mezclas de mono-, di- y tp-aductos y el producto deseado se puede separar de la mezcla Los siguientes ejemplos ilustran además la síntesis de los compuestos de la invención Todos los materiales y reactivos de partida son bien conocidos y apreciados en la técnica y están fácilmente disponibles o se preparan por los métodos aquí descritos. Un proceso para la preparación de gemcitabina (2',2'-d?fluoro-2'-desoxicitidina), por ejemplo, se describe en la patente de E U A No 4,808,614.

Ejemplo 1 1-(2,2-difluoro-2-desoxi-ß-D-r¡bofuranosil)-4-(2-propil-1 oxopentil)aminopirimidin-2-ona Disolver 2' ,2'-d?fluoro-2'-desoxic?t?d?na (10 0 g, 38.0 mmoles) en p i rid i na anhidra (100 ml) y enfriar hasta 0°C mientras se agita bajo nitrógeno Agregar clorotrimetilsilano (24.0 ml, 190.0 mmoles) gota a gota, al mantener una temperatura interna < 5CC. Continuar la agitación a 0°C por 2 horas. En un matraz separado, disolver ácido 2-propilpentanoico (6.0 g, 41.8 mmoles) en acetonitrilo anhidro (100 ml). Agregar 1 ,1-carbonildi?midazol (6.8 g, 41.8 mmoles) en porciones pequeñas durante 30 minutos y agitar durante 2 horas. Agregar esta solución de acetonitrilo gota a gota a la solución de piridina a 0°C y permitir que la reacción llegue a temperatura ambiente. Calentar la reacción a 45°C durante la noche y luego enfriar a 30-35°C y agregar 100 ml de etanol absoluto y calentar a 45°C durante 30 minutos Agregar 50 ml de agua y calentar a 45°C durante 5 horas luego enfriar a temperatura ambiente y concentrar al vacio. La división de residuo crudo entre acetato de etilo y agua. Acidificar a un pH -2 con ácido fosfórico y separar la capa orgánica. Volver a extraer la capa acuosa con acetato de etilo adicional.

Combinar las soluciones orgánicas y lavar con solución saturada de bicarbonato de sodio y solución saturada de cloruro de sodio, secar sobre sulfato de magnesio y concentrar m vacuo. Purificar por cromatografía sobre gel de sílice (120 g) al eluir con un gradiente de 30% a 60% de acetato de etilo en cloruro de metileno Aislar el producto deseado como una espuma blanca pulvepzable (11 2 g, 77% rendimiento) MS (ES), m/z 390 3 = [M + H] + MS (ES) m/z 388 3 = [M-H] + 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 0.83 (t, 6H), 1.15-1.36 (m, 6H), 1.46-1 55 (m, 2H), 260 (dddd, 1H, J = 144, 96, 56, 56 Hz), (ddd, 1H, J= 126, 62, 36 Hz), 3,77-381 (m, 1H), 3,87 (dt, 1H, J =84, 30 Hz), 4.12-422 (m, 1H), 527 (t, 1H, J=56 Hz), 615 (t, 1H, J=74 Hz), 629 (d, 1H, J=64 Hz), 731 (d, 1H, J=72 Hz), 823 (d, 1H, J=80 Hz), 11 03 (s, 1H) Ejemplo 2 co-cpstal de hidrato de ácido p-toluensulfónico de 1-(2,2- difluoro-2-desoxi-ß-D-ribofuranosil)-4-(2-propil-1- oxopentil)aminopirimidin-2-ona (2:1:1) Disolver 0 709 g (1 82 mmoles) del compuesto del Ejemplo 1 en 9 ml de metanol En un matraz separado, preparar una solución acuosa de reserva 0 25 M_de ácido p-toluensulfónico Agregar 3 6 ml (09 mmoles) de la solución acuosa gota a gota. Agregar -5 ml de agua y permitir agitar la mezcla a temperatura ambiente (-30 min) hasta que suceda la precipitación Recolectar el sólido precipitado por filtración al vacio y permitir secar al aire Análisis analítico del co-cristal: Preparar soluciones de concentración conocida de acido p-toluensulfonico, gemcitabina y el compuesto del Ejemplo 1 Analizar una muestra del co-cpstal del acido p-toluensulfónico del Ejemplo 1 para determinar la composición del componente Para una relación 2 1 1 de N-(2-prop?l-pentano?l)]-2',2'-d?fluoro-2'-desox?-c?t?d?na/ac?do p-toluensulfonico/agua, el % determinado de ácido toluensulfónico Teórico, 17 8% de acido p-toluensul fónico Encontrado, 19 1% de acido p-toluensulfonico HPLC Columna Waters Atlantis dC18, 3 0 µm, 46 d i x 150 mm Temp De Columna 50°C Longitud de onda UV 248 nm 1 Fase Móvil A 5/95 acetonitplo/agua + 0 1% TFA B 50/50 acetonitplo/agua + 0 1% TFA 2 Gradiente Tiempo Sol Ivente (min) %A %B 0 100 0 5 0 100 8 0 100 8 01 100 0 11 fin d e la corpdi Ejemplo 3 co-cristal de ácido bencensulfónico de 1-(2,2-difluoro-2-desoxi-ß- D-ribofuranosil)-4-(2-propil-1-oxopentil)am¡nopirimidin-2-ona (1:1) A 5 ml de acetato de etilo, se agregaron 550 mg del compuesto del Ejemplo 1 La mezcla se calienta hasta aproximadamente 55°C Una equivalencia uno molar del ácido bencensulfónico suministrado como solución de reserva se agrega Se agregan -10 ml adicionales de acetato de etilo con sonicación, como sea necesario, para fragmentar el precipitado La suspensión se permite enfriar a temperatura ambiente y aislar por filtración al vacío El solido aislado se deja secar al aire PF 171 °C El compuesto de formula I y los solvatos del mismo están disponibles oralmente y se administran normalmente oralmente, y así se prefiere la administración oral Las composiciones farmacéuticas se preparan en una forma bien conocida en la técnica farmacéutica. El portador o excipiente puede ser un material sólido, semi-sólido o líquido que puede servir como un vehículo o medio para el ingrediente activo. Los portadores o excipientes adecuados son bien conocidos en la técnica. La composición farmacéutica se puede adaptar para uso oral, inhalación, parenteral, o tópico, y se puede administrar al paciente en la forma de tabletas, cápsulas, aerosoles, inhaladores, supositorios, soluciones, suspensiones o los similares. Los compuestos de la presente invención se pueden administrar oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o cápsulas o comprimido en tabletas. Para el propósito de la administración terapéutica oral, los compuestos se pueden incorporar con excipientes y usarse en la forma de tabletas, trociscos, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas, gomas de mascar y los similares. Estas preparaciones contienen preferiblemente al menos 1% del compuesto de la presente invención, el ingrediente activo, pero puede variar dependiendo de la forma en particular y puede estar convenientemente entre 1% hasta alrededor de 90% del peso de la unidad. La cantidad del compuesto presente en las composiciones es tal que se obtendrá una dosis apropiada. Las composiciones y preparaciones preferidas de la presente invención se pueden administrar por métodos bien conocidos por el técnico experimentado. Las tabletas, pildoras, cápsulas, trociscos, y los similares pueden también contener uno o más de los siguientes adyuvantes, aglutinantes tales como povidona, hidroxipropilcelulosa, celulosa microcpstalina, o gelatina; excipientes o diluyentes tales como almidón, lactosa, celulosa microcpstalina o fosfato de dicalcio, agentes desintegrantes tales como croscarmelosa, crospovidona, g I ico lato de almidón de sodio, almidón de maíz y los similares, lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido estérico, talco o aceite vegetal hidrogenado, agentes mejoradores de flujo tales como dióxido de silicio coloidal, agentes humectantes tales como laurel sulfato de sodio y pohsorbato 80, y agentes edulcorantes tales como, sacarosa, aspartame o sacarina se pueden adicionar o un agente sabopzante tales como hierbabuena, salicilato de metilo o sabopzante de naranja Cuando la forma de dosis unitaria es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un portador liquido tales como po I leti le ng I icol o aceite graso Otras formas de dosis unitaria pueden contender diversos otros materiales que modifican la forma física de la unidad de dosis, por ejemplo, como recubrimientos Preferiblemente la forma de dosis es de recubrimiento entérico Así, las tabletas o pildoras se pueden recubrir con azúcar, hidroxipropilmetilcelulosa, polimetacplatos u otros agentes de recubrimiento Los jarabes pueden contener, además de los compuestos actuales, sacarosa como agente edulcorante y ciertos conservadores, pigmentos y colorantes y sabores Los materiales usados en la preparación de estas diversas composiciones deben ser farmacéuticamente puros y no tóxicos en las cantidades usadas Los compuestos de fórmula I son generalmente efectivos sobre un intervalo amplio de dosis Por ejemplo, las dosificaciones por día, en dosis sencillas o divididas, caen normalmente dentro del intervalo de alrededor de 15 mg/dia a alrededor de 200 mg/día, más preferiblemente alrededor de 85 mg/día En algunos casos, niveles de dosificación debajo del limite inferior del intervalo anterior pueden ser más que adecuados, mientras que en otros casos, dosis todavía mayores se pueden emplear sin provocar ningún efecto colateral dañino, y por lo tanto el intervalo anterior de dosificación no se pretende que limite de ninguna manera el alcance de la invención Se entenderá que la cantidad del compuesto realmente administrado se determinará por un médico, a la luz de las circunstancias relevantes, incluyendo, la condición a tratarse, la vía elegida de administración, el compuesto o compuestos actuales administrados, la edad, peso, y respuesta del paciente individual, y la severidad de los síntomas del paciente Ensayo de estabilidad química del pH La estabilidad química del pH se evalúa al usar una técnica semi-automática de HPLC Muestras del compuesto de fórmula I se preparan a 100 mcg/ml en cinco soluciones amortiguadoras que representan el intervalo de pH a través del tracto gastrointestinal (pH1-pH8) Las muestras se cargan sobre el automuestreador de HPLC incubado a 40°C Las muestras se inyectaron repetidamente sobre HPLC en intervalos horarios por hasta 24 horas con una columna HPLC que separa un compuesto de formula I de gemcitabina El área pico del compuesto de formula I se observa por detección UV con el tiempo y se compara a las áreas pico iniciales para determinar la estabilidad Menos del 25% del compuesto del Ejemplo 1 degradado a gemcitabina a un intervalo de pH de 1 a 8 después de cuatro horas Ensayos de Farmacocinética Farmacocinetica en Ratón Los perfiles farmacocmeticos de gemcitabina y un compuesto de fórmula I, se evalúan en ratones machos CD-1 después de la administración oral a dosis seleccionadas para contener aproximadamente 10 mg/kg de gemcitabma Los animales designados (n = 3/punto de tiempo/compuesto) se sacrifican a 008, 025, 0 5, 1, 2, y 6 horas después de la dosificación, y se recolectan muestras de sangre sistémica dentro de tubos tratados con EDTA que contienen tetra id rou rid i n a (concentración final de 0 5mM en la sangre) para inhibir el metabolismo adicional de la gemcitabina 3 animales adicionales se sacrifican a 0 08 horas para recolección de la sangre portal hepática Se aisla el plasma por centrifugación y se congela previo al análisis Las concentraciones de plasma de gemcitabina y de profármacos se determina por el análisis LC/MS/MS Parámetros farmacocineticos se calculan al usar el software WinNonlin (Pharsight Corp , Mountain View, CA) Parámetros farmacocineticos de cada profármaco se comparan con aquellos determinados a partir de la administración de clorhidrato de gemcitabina oral en un diseño de estudio similar El compuesto del Ejemplo 1 se hid rol izó ampliamente in vivo para liberar gemcitabina cuando se administra oralmente a ratones CD-1 La exposición del plasma a gemcitabina se incrementó en los ratones CD-1 cuando el compuesto del Ejemplo 1 se administró, en comparación con la administración directa oral del clorhidrato de gemcitabina La absorción del profármaco intacto se verifica por las concentraciones relativamente altas del compuesto del Ejemplo 1 en el plasma portal hepático a 0 08 horas después de la dosificación oral.

Ensayo de Farmacocinética en Monos Los perfiles farmacocinéticos de gemcitabina y un compuesto de fórmula I, se evalúan en monos cynomolgus después de administración oral e intravenosa en un diseño cruzado Los compuestos se administran a dosis seleccionadas para contener aproximadamente 10 mg/kg de gemcitabina Las muestras de sangre se recolectan en tubos tratados con EDTA que contienen tetrahidroupdina (concentración final 0 5mM en la sangre) a intervalos designados por hasta 48 horas Se trataron previamente los animales con ranitidina (intravenosa, 5 mg/kg) en los periodos de dosificación oral Plasma se aisló por centrifugación y se congeló previo al análisis Las concentraciones de plasma de gemcitabina y un compuesto de fórmula I se determinan por un análisis LC/MS/MS. Parámetros farmacocinéticos se determinan al usar el software WinNonlin (Pharsight Corp., Mountain View, CA). El compuesto del Ejemplo 1 se hidrolizó ampliamente in vivo para liberar gemcitabina cuando se administra intravenosamente a monos cynomolgus. La exposición oral a gemcitabina se incrementó en monos cynomolgus aproximadamente 5 veces cuando un compuesto del Ejemplo 1 se administró, en comparación con la administración oral directa de clorhidrato de gemcitabina.

Ensayos de Hidrólisis Ensayo de Homogeneizado de Intestino Delgado Para determinar la estabilidad de un compuesto de fórmula I a la hidrólisis enzimática en el intestino, los homogeneízados crudos de células epiteliales del intestino delgado se preparan a partir de secciones del intestino delgado superior en ratones CD-1, perros sabuesos, monos cynomolgus, y humanos. Los homogeneizados de ratón y de perro se preparan a partir de tejido recientemente recolectado, mientras que los homogeneizados de mono y humano se preparan a partir de tejidos previamente congelados. Las células se raspan suavemente de los segmentos intestinales, se acumulan y se homogeneizan en solución amortiguadora 50 mM de acetato al usar Polytron (PT-10-85). Las concentraciones de proteína se determinan por técnicas espectrofotométricas estándar. Los homogeneizados preparados se almacenan a -70CC antes de usar. -lí Las relaciones h id rol ít icas de un compuesto de la fórmula I en homogeneizados intestinales pequeños (SIH) se determina al incubar un compuesto de fórmula I (100 uM) con SIH (2 5 - 5 mg/ml de proteína total) en acetato a un pH de 7 5 por hasta 6 horas. Las concentraciones de gemcitabina liberadas por medio de hidrólisis se determinan por análisis de LC/MS después de que la reacción se apaga con acetonitplo Las relaciones de hidrólisis se calculan a 30 minutos en experimentos de selección y a partir de la pendiente de la porción lineal de las curvas de hidrólisis vs tiempo en estudios de caracterización de un compuesto de fórmula I El compuesto del Ejemplo 1 mostró una tasa lenta de hidrólisis en el ensayo de homogeneizado del intestino delgado La hidrólisis fue más lenta en homogeneizados de mono y de humano, con menos del 3% del total del compuesto convertido a gemcitabina en una incubación por 6 horas Ensayo de Hidrólisis en S9 de Hígado La hidrólisis de un compuesto de fórmula I por enzimas del hígado se determina por un ensayo de hidrólisis del hígado. Los homogeneizados del hígado se preparan a partir de ratón CD-1, perro sabueso, mono cynomolgus, e hígados humanos Los tejidos de hígado se cortan en pedazos pequeños usando tijeras, luego se homogeneizan en solución amortiguadora de acetato 50 mM usando Polytron (PT-10-85) por 1 min Las fracciones post-mitocondria (S9) se preparan a partir de cada una por ultracentpfugación a 9,000 x g a 4°C por 10 min. Las fracciones de hígado S9 de ratón, perro y mono se preparan a partir de tejidos recientemente recolectados, mientras que las de S9 de hígado humano se preparan a partir de tejido previamente congelado. Después de la centrifugación, se recolecta el sobrenadante y se determinan las concentraciones de proteínas por técnicas espectrofotométricas estándar. Las fracciones preparadas de S9 se almacenan a -70°C antes de usar. Las relaciones hidrolíticas de un compuesto de fórmula I en S9 de hígado se determina al incubar el compuesto (10 uM) con S9 (2 mg/ml de proteína total) en solución salina amortiguada con fosfato a pH 8.0 por hasta 6 horas. Las concentraciones de gemcitabina liberada por medio de hidrólisis se determinan por un análisis de LC/MS después de que se apaga la reacción con acetonitrilo. Las relaciones de hidrólisis se calculan a 30 minutos en experimentos de selección y a partir de la pendiente de la porción lineal de las curvas de hidrólisis vs. tiempo en estudios de caracterización de un compuesto de fórmula I. El compuesto del Ejemplo 1 se hidrolizó en S9 del hígado de todas las especies descritas. La hidrólisis fue más rápida en homogeneizados de monos y humanos, con aproximadamente 35% del compuesto total convertido a gemcitabina en una incubación durante 6 horas.

Ensavos de Toxicología Selección de Ratones durante 4 Días Para evaluar la toxicidad producida por el compuesto de fórmula I administrado oralmente cuando se administra diariamente a ratones hembra CD-a durante 4 días, los perfiles de toxicidad gastrointestinal de un compuesto de fórmula I se comparan con los resultados históricos para la toxicidad gastrointestinal cuando la gemcitabina se administra oralmente a 8 mg/kg en un estudio de ratón de 4 días Ratones hembra CD-1 de 5-8 semanas de edad se dosificaron con un compuesto de fórmula I por cebadura oral. Se escoge un nivel de dosis para aproximarse al equivalente molar de 8-mg/kg gemcitabina Un volumen de dosis de 10 ml/kg se usa y las dosis se administran una vez al día en 4 días consecutivos La necropsia se efectúa aproximadamente 5-8 horas después de la 4a dosis Se evaluaron los signos clínicos, química clínica, patología gruesa, e histopatología limitada (íleo, yeyuno e hígado) Hubo una reducción importante en la severidad de los cambios atrofíeos intestinales o la enteropatía observada después de dosificar a los ratones con una dosis equivalente del compuesto del Ejemplo 1 contra HCl de gemcitabina Estudio de 14 Días en Ratones Un Estudio de 14 Días en Ratones se efectuó para evaluar si un compuesto de fórmula I produce efectos adversos en ratones después de 14 días de dosificación con cebadura oral y para determinar las concentraciones en plasma de un compuesto de fórmula I y sus metabolitos HCl de gemcitabina y desoxidifluoroupdina después de 1 o 14 dosis Ratones hembra y macho CD-1 de 9-12 semanas de edad se dosifican con un compuesto de fórmula I rug por cebadura oral Se selecciona un intervalo de dosis en un esfuerzo por determinar una dosis máxima tolerada y una toxicidad limitada por la dosis Un volumen de dosis de 10 ml/kg se usa y las dosis se administran una vez diariamente Los signos clínicos, peso corporal, consumo de alimento, hematología, química clínica, concentraciones en plasma del compuesto de formula I y metabolitos de HCl de gemcitabina y desoxidifluoroupdina, y patología (incluyendo patología gruesa, pesos de los órganos, e histopatologia) se evaluaron En una base equivalente molar, el compuesto del Ejemplo 1 se asocia con menos enteropatía que el HCl de gemcitabina aunque resulta en aproximadamente dos veces la exposición sistémica a HCl de gemcitabina Estudio de 7 Días en Perros Para evaluar el perfil de la toxicidad de un compuesto de fórmula I cuando se administra a perros sabuesos durante 7 días, y para determinar las concentraciones en plasma de un compuesto de fórmula I y los metabolitos HCl de gemcitabina y desoxidifluoroupdina después de 1 o 7 dosis, se llevó a cabo un estudio de 7 días en perros Perros sabuesos machos y hembra de 6-48 meses de edad se dosifican oralmente por medio de la cápsula con un compuesto de fórmula I Se selecciona un rango de dosis en un esfuerzo por determinar una dosis máxima tolerada y toxicidad limitada por la dosis Un volumen de dosis de 1 ml/kg se usa, y las dosis se administran una vez al día. Los signos clínicos, peso corporal, consumo de alimento, temperatura corporal, hematología (incluyendo coagulación), química clínica, análisis de orina, concentraciones en plasma del compuesto del Ejemplo I y sus metabolitos HCl de gemcitabina y desoxidifluoroupdina, y patología (incluyendo patología gruesa, pesos de órganos, e histopatología) se evaluaron La hematotoxicidad y las otras toxicidades, incluyendo la toxicidad del Gl, son consistentes con lo que se ha descrito previamente para la gemcitabina parenteral Por lo tanto, ninguna de estas toxicidades es particular para la vía de dosificación oral Ensayo In Vivo Se hacen crecer células de tumor de colon HCT-116 in vitro bajo condiciones de cultivo de tejidos estándar, se cosecharon, lavaron, y 5 x 106 células (suspensión 1'1 en Matpgel, Collaborative Biomedical Products, Inc) se inyectan subcutáneamente en el flanco posterior de ratones hembra sin pelo (Charles River, CD1 nu/nu, 24- 27 g, irradiados con 450 Rads dentro de las 24 h del implante) Los tumores se dejaron crecer hasta -100 mm3 antes del inicio de la terapia El control de vehículo, un compuesto de fórmula I o HCl de gemcitabina a varios niveles de dosis se administran a los ratones por cebadura oral (10 ml/kg volumen) en los tiempos indicados en los experimentos individuales Los compuestos se administran ya sea diariamente durante catorce días, cada tercer día para un total de siete dosis, o cada tercer día para un total de cuatro dosis Para el programa de dosificación de cada día, un compuesto de formula I se formula en solución amortiguadora de fosfato de sodio 100 mM, pH 6.0, y se formula en 1% de carboximetilcelulosa de sodio, 0.5% de laupl sulfato de sodio, 0 05% de antiespumante 150 y 0 085% de povidona cada tercer día y cada tercer día de los programas de dosificación El HCl de gemcitabina se prepara en solución salina fisiológica para administración oral El tamaño del tumor se determina por mediciones con calibrador y el volumen del tumor (mm3) se estima a partir de la formula / x w2 x 0 536, donde / es el mayor y w es el mas pequeño de los diámetros perpendiculares Todos los datos (mediciones del tumor y pesos de los animales) se capturaron dos veces por semana comenzando con el inicio de la terapia y analizado al usar un sistema de medición de tumor basado en computadora La eficacia antitumor observada con el compuesto del Ejemplo 1 fue comparable con aquella obtenida con una dosis equivalente de HCl de gemcitabina Sin embargo, el tratamiento con el compuesto del Ejemplo 1 resultó en una toxicidad global menor comparada con los animales que recibieron una cantidad equivalente de HCl de gemcitabina.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1 El compuesto de la fórmula 2 El compuesto que es co-cpstal de aci lo p-toluensulfonico de 1-(2,2-d?fluoro-2-desox?-ß-D-r?bofuranos?l)-4-(2-prop?l-1-oxopent?l)am?nop?r?m?d?n-2-ona 3 El compuesto de acuerdo con la reivindicación 2, el cual es co-cpstal de hidrato del acido p-toluensulfonico de 1 -( 2 , 2-d if I uoro-2-desox?-ß-D-r?bofuranos?l)-4-(2-prop?l-1-oxopent?l)am?nop?pm?d?n-2-ona (2 1 1) 4 La composición que comprende un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 a 3 y un excipiente farmacéuticamente aceptable 5 La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la composición esta recubierta de forma entérica 6 Un método de tratamiento de neoplasmas susceptibles en un mamífero, que comprende administrar al mamífero que necesita del mismo, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 a 3. 7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el neoplasma susceptible se selecciona del grupo que consiste de linfoma de células T, sarcoma de tejido suave, cáncer pancreático, cáncer de mama, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer ovárico y cáncer de vejiga. 8. El uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 a 3 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de neoplasmas susceptibles. 9. Un compuesto seleccionado a partir de la reivindicación 1, 2, ó 3 para su uso como un farmacéutico. 10. El uso de un compuesto seleccionado de la reivindicación 1, 2, ó 3 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de linfoma de células T, sarcoma de tejido suave, cáncer pancreático, cáncer de mama, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer ovárico o cáncer de vejiga.