MX2007007122A - Deteccion y cuantificacion microbial. - Google Patents

Abstract

Se proporciona un método para detectar semi-cuantitativamente o cuantitativamente la presencia de un microbio en una muestra. El método utiliza un tinte de prueba que sufre un cambio de color detectable en la presencia de uno o más microbios. Por ejemplo, en una incorporación, el tinte de prueba es un tinte solvatocrómico (por ejemplo, tinte Reichardt) que responde a las diferencias en polaridad entre los componentes de microbios (por ejemplo, una membrana de célula, citoplasma, etc.) y el ambiente afuera de la célula. Alternativamente, cualesquier otros mecanismos pueden ser completamente o parcialmente responsables por la interacción entre el tinte y el microbio, tal como las reacciones a base de ácido, las reacciones de reducción-oxidación, y otras. Sin importar el color del tinte de prueba puede ser comparado al color del tinte de control, en donde el color del tinte de control corresponde a una concentración de microbios conocida.

Description

DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN MICROBIAL Solicitudes Relacionadas La presente solicitud es una continuación en part de la Solicitud Internacional PCT/US2004/042461 , presentada e 16 de Diciembre del 2004, la cual reclamada la prioridad de l Solicitud de Patente de los Estados Unidos de América Númer 10/737,574, presentada el 16 de Diciembre del 2003.

Antecedentes de la Invención Ésta invención se refiere a procesos y productos para la detección de microbios, bacterias, hongos, moho y virus.

En la vida diaria nosotros estamos expuestos si saberlo a superficies contaminadas con microbios las cuales pueden causar enfermedades. Los estudios han mostrado "puntos calientes" contaminados con bacterias específicos incluyendo los teléfonos públicos, las manijas de puerta, los juguetes en los cuartos de espera de los doctores y en las instalaciones para el cuidado de los niños, las secadoras de aire caliente para secar las manos, las toallas y las esponjas usadas en la cocina, las manos del personal de un hospital durante el cuidado de paciente de rutina y la contaminación cruzada de las superficies de preparación de alimentos y cuchillos en donde son mezclados los vegetales y las carnes sin procesar.

Los surgimientos de contaminación bacterial recientes en varias ubicaciones en los Estados Unidos solamente han resultado en la muerte de niños y ciudadanos mayores y enfermos de otros . La contaminación microbial de alimentos es el problema principal a través del mundo. La Salmonella E. coli y otras bacterias llevadas en los alimentos pueden provocar innumerables enfermedades cada año. Los síntomas agudos incluyen nausea, vomito, dolores abdominales, diarrea, fiebre y jaqueca. Las consecuencias crónicas pueden seguir después del inicio de los síntomas agudos. Como la contaminación cruzada de las superficies puede causar la transferencia de bacterias desde la carne, pescado y pollo a alimentos no cocinados tales como vegetales, la capacidad para detectar fácilmente la presencia de bacterias en las superficies de preparación de alimentos será de un gran beneficio.

En forma similar, la detección de los niveles dañinos de los microbios en el negocio de procesamiento de alimentos es muy importante para mantener la salud de las familias y de los clientes. En la industria del procesamiento de alimentos, la vigilancia de bacterias es crítica. El procesamiento de virtualmente todos los alimentos, desde el empaque de carne a la producción de queso, involucra el vigilar los niveles de microbios a fin de asegurar la seguridad del suministro de alimentos.

Los problemas creados por la contaminación microbial no se limitan a sólo la industria de los alimentos. En décadas recientes se ha visto una elevación dramática de los "súper bichos", un problema cuyo --epicentro existe en la comunidad de hospitales y para el cuidado de la salud. El sobreuso de antibióticos asi como las - inadecuaciones en la limpieza del hospital han dado lugar al S. aureus (MRSA) y Clostridiu difficile resistentes a la meticilina, así como enterococos resistentes a la vancomicina y otros bacilos gram-negativos (Dancer, 2004) . Un reporte de la BBC reciente citó que MRSA reclama alrededor de 5000 vidas por año. El artículo continua declarando que la limpieza "sigue siendo un problema de paciente principal y el MRSA es un problema creciente" . Cuando uno considera que muchos pacientes en los hospitales ya son personas inmuno-comprómetidas y por tanto en gran riesgo de infección, la amenaza puesta por las bacterias en el ambiente de hospital se hace aún más amenazante.

Hay numerosos reportes y estudios dedicados al tópico de la limpieza de hospital y a la prevención de la infección de nosocomios.

En forma similar, los mohos tal como el ergot se han conocido porque crecen en ciertos cereales tal como la cebada y pueden ser potencialmente dañinos por la circunstancia de su producción de alcaloides tóxicos similares al ácido lisérgico. El Aspergillus niger y otros mohos se han conocido porque producen esporas que pueden causar reacciones alérgicas así como grabar las condiciones respiratorias tal como el asma. El Aspergillus niger puede ser particularmente problemático si éste comienza a crecer en una pared húmeda, o en un equipo de acondicionamiento de aire en el hogar o en los edificios comerciales .

Ciertos hongos, tal como Candida albicans, pueden representar otra clase problemática de microorganismos. La Candida albicans se ha asociado con el salpullido de pañal en los infantes, la irritación oral en los niños y en los adultos inmuno-comprómetidos , y las infecciones de hongos vaginales. Los hongos también pueden infectar la región de faringe del cuerpo así como el tracto gastrointestinal.

Los métodos actuales de detección de bacterias involucran el tomar muestras de las superficies de equipo. En un ambiente de procesamiento de alimentos, el equipo puede ser una maquinaria cortadora de carne, en donde en un ambiente de preparación de alimentos tal como un restaurante o en el hogar, la superficie puede ser una mesa, una tabla para cortar, el interior de un refrigerador o una superficie de trabajo. La muestra es entonces incubada durante la noche para crecer un cultivo. El cultivo que creció durante la noche permite a la muestra el crecer sobre una placa de agar a la temperatura y humedad apropiadas de manera que las bacterias crezcan y se multipliquen hasta que éstas forman colonias suficientemente grandes para ser visibles por el ojo desnudo. Después de incub por el tiempo prescrito y permitiendo a las colonias bacterias el crecer, la muestra de placa agar es examina manualmente y las unidades formadoras de colonia (CFU) s estimadas por un técnico experto. Éste método es algo costoso involucra un retraso de tiempo substancial; un retraso de tiem en el cual el producto contaminado puede haber sido enviado o gente puede ser expuesta a los microbios presentes.

Es claro que existe una necesidad de un proceso producto el cual permita una rápida detección de l microorganismos dañinos.

Síntesis de la Invención En respuesta a las dificultades anterior encontradas por aquéllos expertos en el arte, nosotros hem desarrollado una composición indicadora que tiene una fase móv y un colorante sensible a los microbios que sufre un camb detectable visiblemente en la presencia de los microbios. composición puede ser aplicada a superficies para revelar presencia de los microbios. La fase móvil puede ser desinfectante. El colorante proporciona un cambio de color q es visible al ojo sin ayuda en la presencia de microbios. fase móvil puede ser un líquido o un gel y el colorante pue ser un tinte. En algunas incorporaciones, el colorante cambia color a una tasa en proporción a la concentración de microbio En otras incorporaciones, la cantidad de microbios presente proporcional a la cantidad de colorante que sufre un cambio.

Los ejemplos de los tintes adecuados incluyen los tintes de merocianina, 4- [2-N-l, 4-hidrofiridina-4 - ilidina substituido) etilideno] ciclohexa-2 , 5-dien-l-uno, tintes rojos pirazolona, tintes azometina, tintes, indoanilina, tintes diazamerocianina, tintes suiteriónicos como se ejemplifico por el tinte Reichardt, y otros así como las mezclas de los mismos. De una utilidad particular son los tintes que son suiteriónicos, en donde el suiterión está contenido dentro de un sistema de electrón p contiguo que comprende el cromógeno de tinte. Una clase adicional de tintes que parecen ser especialmente útiles para los indicadores de microbios son los tintes de merocianina.

El tinte también puede ser aplicado a una superficie como una solución a base de agua o a base de solvente y dejar secar, dejando el residuo seco de la solución de tinte aplicado. El residuo seco cambiará de color al contacto con los microbios y de ésta manera puede ser usado en el empaque de cajas de tisú facial, sobre aparatos médicos tal como guantes, y otras superficies las cuales pueden ser preparadas con el tinte antes de que el material sea usado, y el cual subsecuentemente indicará la contaminación con microbios. Sorprendentemente, los inventores encontraron que cuando estos tintes son aplicados a una superficie y se dejan secar, ambos el solvente usado para hacer el recubrimiento y el uso de aditivos tal com hidroxipropil-beta-ciclodextrina y los surfactantes tienen u impacto significante sobre la capacidad de detectar los microbios por el recubrimiento.

El hidroxipropil-beta-ciclodextrina es encontrad que es efectivo para mejorar la brillantez del colorante despué de que éste ha sido recubierto sobre una toalla de papel o u material de paño limpiador similar. Aún cuando no se desea e estar unido por una teoría, nosotros creemos que el color de los tintes es mejorado por la edición de un derivado d ciclodextrina mediante el inhibir la cristalización del tinte. Otros químicos pueden ser agregados a un paño limpiador par ayudar a evitar lecturas positivas falsas debido a la presenci del blanqueador, el cual se ha encontrado que interfiere con e tinte .

Los dispositivos de flujo lateral incorporand colorantes indicadores de microbios también son incluidos dentr de las enseñanzas de la invención. Estos dispositivos tienen un membrana que tiene zonas de detección y de control, en donde l zona de detección cambia de color en respuesta a la presencia d las bacterias y la zona de control permanece con el color d tinte original para indicar que el ensayo está funcionand adecuadamente.

También está descrito aquí un método para la detección de microbios sobre superficies mediante el aplicar una solución que contiene un colorante sensible a los microbios a una superficie y observando un cambio visualmente detectable que indica la presencia de microbios.

Otras características y aspectos de la presente invención están discutidos en mayor detalle abajo.

Breve Descripción de los Dibujos Una descripción completa y habilitante de la presente invención, incluyendo el mejor modo de la misma, dirigido a uno con una habilidad ordinaria en el arte se establece más particularmente en el resto de la descripción, la cual hace referencia a las figuras anexas en las cuales: La Figura 1 es un dibujo de cinco formas de célula bacterial básicas.

La Figura 2 es un dibujo de un arreglo de célula bacterial .

La Figura 3 es la estructura de un tinte de merocianina.

Las Figuras 4-5 ilustran un método para sintetizar un tinte de merocianina.

Las Figuras 6 A-D son diagramas de la indicación de la contaminación microbial usada en pollo añejado.

Las Figuras 7 A-G son diagramas de la indicación de lado-por-lado de la limpieza e indicación de contaminación microbial .

Las Figuras 8 A-D son diagramas de la indicación de la contaminación microbial usando diferentes concentraciones de bacterias .

Las Figuras 9 A-E son diagramas de la indicación y cuantificación de contaminación microbial usando bacterias y una concentración de un tinte indicador.

Las Figuras 10 A-C son diagramas de la indicación de contaminación microbial sobre un tablero de computadora.

Las Figuras 11 A-D son diagramas de la indicación de contaminación microbial con y sin surfactante en la solución.

Las Figuras 12 A-F son diagramas de la indicación de la velocidad de indicación de la contaminación microbial dependiendo del solvente.

Las Figuras 13 A-C son diagramas de la indicació de la contaminación microbial en donde el colorante es secad sobre un substrato.

La Figura 14 es una ilustración gráfica de resultado obtenido en el Ejemplo 30 en el cual Delta E es puest en contra de concentraciones conocidas de S. aureus; La Figura 15 es una ilustración gráfica de lo resultados obtenidos en el Ejemplo 30 en el cual Delta E e dibujado en contra de concentraciones conocidas de P aeuruginosa; y La Figura 16 es una ilustración gráfica de lo resultados obtenidos en el Ejemplo 30 en el cual Delta E e dibujado en contra de concentraciones conocidas de E. coli.

La Figura 17 es una vista superior de un incorporación de un dispositivo de ensayo de flujo lateral qu puede ser usado en la presente invención.

El uso repetido de los caracteres de referencia e la presente descripción y en los dibujos se intenta qu represente las mismas o análogas características o elementos d la invención.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención involucra la detección de bacterias y otros microorganismos y el uso del término "microbio" aquí debe ser entendido para incluir bacterias, hongos, tal como levaduras y mohos, y virus.

Hay miles de diferentes clases de bacterias. Algunas difieren sólo ligeramente y se requiere a una persona altamente entrenada para identificarlas. También hay grupos los cuales difieren grandemente en hábitos de crecimiento y apariencia y son fácilmente identificados. Sin importar las diferencias menores, la mayoría de las bacterias pueden ser clasificadas de acuerdo a cinco formas de células básicas ilustradas en la Figura 1. Desde la izquierda a la derecha en la Figura 1 las formas son redondas o cocos, varillas o bacilos, espirales o esperilus, microbio del cólera o vibriones, y filamentos .

Además de sus diferentes formas, su arreglo de células varía de diplococos, estreptococos, y estafilococo (de izquierda a derecha en la Figura 2) . Por ejemplo, los mismos cocos están siempre agrupados en pares (diplococos) . Otros están arreglados en cadenas (estreptococos) . Aún otros están en racimos (estafilococos) . Los diplococos son los conocidos porque provocan la neumonía. Los estreptococos son frecuentemente asociados con una "garganta strip" . Los estafilococos son familiares para muchos debido a su papel en las "infecciones staff" y algunos tipos de envenenamiento con alimentos.

Las bacterias también varían en el tamaño, pero promedian alrededor de 2.54 centímetros por bacteria. En otras palabras, 25,000 bacterias colocadas lado por lado ocuparán sólo una pulgada lineal. Una pulgada cúbica es suficiente para contener nueve trillones de bacterias - de tamaño promedio-alrededor de 3,000 bacterias por cada persona sobre la tierra.

Cuando hay una gran discusión sobre la base teórica de la subdivisión de las bacterias basadas sobre los conceptos biológicos moleculares modernos, para el microbiólogo de trabajo unos medios rápidos de subdivisión están sobre la base de la reacción Gram (un método de manchado para clasificar bacterias) y la morfología.

Las bacterias gram-positivas retienen la mancha violeta cristal en la presencia de alcohol o acetona. Éstas incluyen el género importante: Actinomyces, Bacillus, Bifidobacteriu , Cellulo onas, Clostridium, Corynebacteriumk, Micrococcus, Mycobacterium, Nocardia, Staphylococcus, Streptococcus y Streptomyces . Algunas de las bacterias Gram-positivas notablemente aquéllas del género Corynejacterium, Mycobacterium y Nocardia retienen los tintes aún en la presencia de ácido. Éstos son conocidos como bacterias Ácido-Rápido.

Las bacterias gram-negativas no retienen la mancha de violeta cristal en la presencia de alcohol o acetona. Éstas incluyen el género importante: Acetobacter, Agrobacterium, Alcaligenes, Bordetella, Brucilla, Campylobacter, Caulobacter, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Helicobacterium, Legionella, Nesseria, Nitrobact, Pasteurelia, Pseudomonas, Rhizobium, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Thiobacilus, Veiellonealla, Vibrio, Xanthomonas y Yersinia.

Las membranas de bacteria generalmente se hacen de bicapas de lípido de liposácaridos . Hay diferencias entre las membranas de célula bacterial gram-negativas y gram-positivas , por ejemplo, las paredes de célula. La pared de célula de las bacterias gram-negativa es una estructura más delgada con capas distintas. Hay una capa exterior la cual es más como una membrana citoplásmica en la composición con una estructura trilaminar típica.

El componente principal de la pared de célula gram-negativa es el lipopolisacárido . Adicionalmente está presente un fosfolípido, una proteína, una lipoproteína y una cantidad pequeña de peptidoglican . El lipopolisacárido consiste de una región de núcleo a la cual están sujetadas unidades repetitivas de mitades de polisacárido . Un componente de la pared de celda de la mayoría de las bacterias gram-negativas está asociado con una actividad endotóxica, con la cual están asociados los efectos pirogénicos de las infecciones gram- negativas. Sobre las cadenas laterales son llevadas las bases para el antígeno somático de específico de éstos organismos. La composición química de éstas cadenas laterales ambas con respecto a los componentes así como los arreglos de los diferentes azúcares determina la naturaleza de los determinantes somáticos o antígeno O, los cuales son medios importantes de clasificación de serología de muchas especies gram-negativas . En muchos casos se ha mostrado que la razón para ciertos organismos que pertenezcan a especies muy diferentes, dada la reactividad cruzada serológica fuerte se debe a que tienen mitades de carbohidrato químicamente similares como parte de sus cadenas laterales de lipopolisacárido, con generalmente teniendo alrededor de 30 unidades repetitivas.

Las bacterias gram-positivas son caracterizadas por tener como parte de su estructura de pared de celda peptidoglican así como polisacáridos y/o ácidos teicoicos . Los peptidoglicans los cuales son algunas veces también llamados murein son heteropolímeros de hilos glican, los cuales son entrecruzados a través de péptidos cortos.

Las bases de los murein son cadenas de residuos alternantes de N-acetil glucosamina y iV-ácido acetil murámico las cuales son Seta-l , 4-enlazados . El ácido murámico es una substancia única asociada con las paredes laterales bacteriales. Estas cadenas están entrecruzadas por cadenas de polipéptido corto de ambos L- y D- amino ácidos. Aún cuando en la bacteria gram-negativa el péptido glical es simple en estructura comparativamente uniforme a través de la mayoría de sus géneros en las bacterias gram-positivas hay una variación muy grande e estructura y composición. En general el péptido glican es d capas múltiples. También se han registrado algunas variacione menores en la composición en algunos grupos. Por tanto, en e ycobacterium y Nocardia la mitad N-acetilo del ácido murámic es reemplazada por la forma oxidizada de N-glicolil. L composición de ácido amino de ambos el entrecruzamiento así com los polipéptidos de vástago puede variar extensamente con grupo diferentes. Estas diferencias forman la base para la taxonomí de éstos organismos.

Los mohos y las levaduras son organismos qu pertenecen al reino de los Hongos. Aún cuando muchos mohos hongos son útiles a los humanos, varios son patológicos y puede liberar micotóxinas dañinas las cuales pueden resultar en e envenenamiento o la muerte. Las levaduras también pueden lleva a la infección, la más ampliamente conocida probablemente siend la vaginitis.

La cigomicota es una clase de hongos los cuale incluyen moho de pan negro y otros mohos que exhiben un relación simbiótica con las plantas y animales. Estos mohos so capaces de fundirse y formar "cigosporos" ásperos. La ascomicot es una clase de hongos, la cual incluye levaduras, tizones e polvo, mohos negro y azul verde, y algunas especies las cuale pueden provocar enfermedades tal como la enfermedad del olm Holandés, costa de manzana, y cornezuelo de centeno. El ciclo d vida de estos hongos combina ambas la reproducción sexual asexual y los tejidos reticulados en los hongos ("hyphae") está subdivididos en paredes porosas las cuales permiten el paso d núcleos y citoplasma. La deuteromicota es otra clase de hongo los cuales incluyen una recolección miscelánea de hongos que n entran fácilmente en las clases antes mencionadas de la clase d Basidiomicota (la cual incluye la mayoría de los hongos, hongo de poros, hongos de dejín). Estos deuteromicitos incluyen la especies que crean queso y penicilina, pero también incluye miembros que provocan enfermedad tal como aquéllas que llevan a pie de atleta y la tiña.

El uso de tintes en el área biomédica ha tenido u crecimiento notable en el interés de investigación e importanci técnica en años recientes. Los tintes son usados, por ejemplo en muchas áreas de bioquímica analítica, diagnósticos médicos aún en el tratamiento y prevención de enfermedades. El color de tinte es esencial para ciertas aplicaciones y rango desd reacciones orgánicas simples para detección espectroscópic (Patente de los Estados Unidos de América Número 5,036,000) y l medición de analitos de fluido del cuerpo (Patente Europe Número 0 250 700) a tecnología de formación de imagen de alt definición para detección de tumor (Motohashi, Med. Res. Rev. 11, 239, 1991) . Los tintes también pueden ser usad clínicamente en el tratamiento de enfermedades (Patente de l Estados Unidos de América Número 5,468,469). La terapia fotodinámica (Sedlacek, "El cambio de la investigación para la terapia de tumores", Chimia, 45, 52, 1991) es exitosamente usada en el tratamiento de ciertas clases de cáncer; tal como malignidades de la piel, cabeza, cuello, pulmón y esófago. Otras aplicaciones terapéuticas están asociadas con las propiedades antivirales y bactericidas de los tintes. Los tintes también son el agente clave en áreas importantes de histología, bioetiquetado fluorescente y biosondas fluorescentes. Las técnicas involucradas son altamente sofisticadas y requieren el manchado, lavado, y manchado cruzado (Blue, acción Fotodinámica y enfermedad causada por la luz" Reinhold, Nueva York, 3, 1941) .

Los inventores han encontrado que un rociado indicador de microbios así como un método rápido para la cuantificación de microbios puede hacerse usando colorantes particulares. Las aplicaciones potenciales de ésta tecnología incluyen pero no se limitan a la detección de microbios sobre superficies sólidas tales como mostradores, manijas, áreas médicas, cuartos de baño, rieles de cama, equipo médico, mesas de cirugía, utensilios, cocinas, alimentos, superficies para la preparación de alimentos, equipo para el procesamiento de alimentos, perillas de puerta, teléfonos y tableros de computadora. El recubrimiento de tinte con color, rociado o solución es sensible a los niveles dañinos de bacterias y otros microorganismos y el cambio de color sirve como una herramienta de indicador visual para verificar si fue efectiva la limpiez y/o la descontaminación de la superficie.

Los requerimientos para una tecnología indicador son bastante rigurosos ya que el tinte debe ser sensible a amba las cepas de bacterias gram-positiva y gram-negativa. El tint debe interactuar rápidamente con el microbio y un metabolit microbial . Para una máxima versatilidad, el tinte debe tambié ser sensible a otros microorganismos tal como los hongos y moho Como se mencionó anteriormente, los tintes ha sido usados por algún tiempo como manchas para ambas l identificación de célula y de bacterias. La solución de mancha reacciona o es preferiblemente retenida por la célula o bacteri para ayudar a identificar mediante el mejorar el contraste entr éste y el fondo u otros componentes presentes (Johnson, 1995) Usualmente una mancha tiene que ser aplicada a la superficie entonces el exceso removido mediante ya sea agitación o enjuag a fin de resaltar la presencia de los microbios. Los inventore no tienen conocimiento de cualesquier reportes previos de colorante que cambia el color con la exposición a o con l interacción con los microbios .

El Solvatocromismo puede ser responsable por l cambios de color vistos, sin embargo los inventores no dese estar unidos a una teoría particular. Los tintes solvatocrómic sufren un cambio de color cuando cambia el ambiente molecula tal como una polaridad de solvente y/o una propensión de unión de hidrógeno. Un tinte puede ser azul en color en un ambiente polar tal como el agua, por ejemplo, pero ser amarillo o rojo en un ambiente no polar tal como una solución rica en lípido. Los colores producidos por tales "tintes adecuados" depende de la diferencia de polaridad molecular entre el estado molido y excitado del tinte como se discute más completamente abajo. El tinte Reichardt fue seleccionado como un tinte modelo para la investigación .

Los inventores se preguntan si ciertos tintes solvatocrómicos pueden ser útiles para detectar microbios mediante el responder a las diferencias en la polaridad entre ciertos componentes de célula (tal como la membrana de célula, el citoplasma, etc.) y la polaridad afuera de la célula. Los inventores han encontrado que cuando los microbios se pusieron en contacto con ciertos de éstos tintes recubiertos sobre los substratos tales como las toallas de papel, fue en verdad observado un cambio de color - no sólo hubo un cambio de color sino que en muchos casos el tinte fue decolorado en la región que hizo contacto con las bacterias. Para sorpresa de los inventores, una investigación adicional sugirió que el mecanismo puede no ser atribuido completamente al solvatocromismo . De hecho, los inventores reportan aquí que para su sorpresa, éstos encontraron lo siguiente: i) La cantidad del tinte decolorado por las bacterias u otros microbios puede estar correlacionada a la concentración de microorganismos expuestos al tinte, sugiriendo que el método fue cuantitativo en contra de cualitativo, y ii) un rango de microorganismos puede ser detectado incluyendo bacterias gram-positivas y gram-negativas , levaduras y mohos; y iii) los tintes probados pueden ser usados como un recubrimiento de película seca o como una solución agregada a un líquido que contiene bacterias, o como un sistema detector de rociado, y iv) cuando se usó como un recubrimiento seco sobre, por ejemplo, una toalla de papel o una superficie de esmalte, las propiedades del solvente desde la cual tales tintes fueron aplicados impactaron significativamente el desempeño (tiempo de decoloración, en contraste entre áreas decolorada y no decolorada, y sensibilidad) del tinte de detección; y v) cuando se usaron como un recubrimiento seco sobre, por ejemplo, una toalla de papel, los aditivos incluidos en el recubrimiento con el tinte pueden impactar el desempeño (tiempo de decoloración, contraste en tres áreas decoloradas y no decoloradas y sensibilidad) del tinte detector. Por ejemplo, la hidroxipropil-beta-ciclodextrina mejora los desempeños del tinte detector, y vi) la decoloración inducida por bacterias de estos tintes puede ser revertida usando una base fuerte.

Aún cuando el solvatocromismo puede contribuir a los cambios de color observados, éstas observaciones también pueden ser consistentes con otros mecanismos plausibles. Por ejemplo, estas observaciones también pueden ser consistentes con un ácido - interacción de base de algún tipo, o una reacción de donación de protón de algún tipo que puede contribuir a los cambios de color en el tinte causados por la presencia de bacterias . Los inventores tampoco han descartado completamente la posibilidad de que una reacción de tipo reducción - oxidación también pueda estar contribuyendo a cambios percibidos en el color cuando ciertos tintes son expuestos a un rango de microorganismos. Otros factores también pueden contribuir a los cambios de color observados con ciertos tintes en la presencia de microbios, por ejemplo, puede haber una interacción con una parte de las membranas de célula con ciertos tintes que llevan a cambios de color. Aún otra posibilidad es la de que las mitades de ácido altamente organizadas sobre las paredes de célula bacterial pueden ser capaces de protonotar ciertos tintes indicadores resultando en pérdida de color.

Los inventores han descubierto un fenómen sorprendente pero inesperado y lo han usado para desarrollar u método útil para la detección y cuantificación de una varieda de microorganismos .

Generalmente, en relación a la detección visual cambios de color, "color" es un tipo de sensación que sur cuando la maquinaria del ojo humano detecta la presencia o l ausencia de luz de varias longitudes de onda reflejadas emitidas desde los objetos en el campo visual. La luz que ent en el ojo es sometida a un análisis espectral por tres tipos células de cono retinal que son sensibles a regiones específic del espectro visible. Los estímulos de éstas células a su ve son entonces procesadas por las neuronas retínales, neuronas nervio óptico y la corteza visual de manera que es experimenta una sensación de color. Aún cuando varios mecanismos existe para impartir color (por ejemplo, la absorción, emisió fluorescencia, fosforescencia, refracción, difracción, etc.) e enfoque adecuado está limitado al color absorbente. En otr palabras, ésta invención se refiere a tintes que deben su col a absorber ciertas longitudes de onda de luz.

Debido a la forma en la cual el ojo huma funciona, el color percibido es usualmente el complemento d color asociado con la longitud de onda de luz que está sien absorbida por el objeto. Un objeto que aparece como siendo color rojo cuando se ve en una luz blanca, por ejemplo, fue hecho absorbiendo selectivamente la luz azulada en el rango de una longitud de onda de 490 a 500 nm. En forma similar, un objeto que aparece amarillo a la luz blanca está de hecho absorbiendo la luz azul en el rango de 430 a 480 nm.

La absorción de la luz visible por las moléculas está asociada con las transiciones electrónicas dentro de la molécula y resulta en la generación de un estado excitado. La diferencia de energía entre el estado a tierra de la molécula y el estado excitado relevante determina la longitud de onda de la luz absorbida de acuerdo a la relación de Planck: E=hv En donde E = energía, h = constante de Planck, v es la frecuencia del fotón de luz absorbido y está relacionado a la longitud de onda ? y la velocidad de la luz c por: v=cA Un diagrama de estado puede ser usado para mostrar las transiciones electrónicas gráficamente: Claramente, la energía del fotón absorbido inversamente proporcional a la longitud de onda del fotón. P tanto, los fotones de luz azul (435 -' 480 nm) tienen una energí superior a la de la luz amarilla (580 - 595 nm) . El color de tinte en una solución o sobre un objeto cuando se ve bajo la l blanca, por tanto, es determinado por la transición de energ entre el estado a tierra de la molécula de tinte y el prim estado excitado permitido.

La parte de absorción de luz de un tinte convencionalmente conocida como cromógeno del tinte. cromógeno comprende un cromóforo conectado al sistema conjugad El cromóforo es el grupo principalmente dando lugar al color un tinte, por ejemplo, un grupo azo como en el caso de l tintes azo, un grupo de polietileno, como en el caso caroteno, grupos carbonilo, como en el caso de tint antraquinona . Puede haber muchos otros cromóforos . L auxocromos influencian el color y la intensidad de un tin mediante el actuar sobre el cromógeno conjugado. Los auxocrom pueden o no ser conjugados con el cromógeno. Por ejemplo, grupo amino conjugado con un grupo azo (cromóforo) a través de por ejemplo, un anillo de benceno, formará un cromóge aminoazo. El auxocromo amino conjugado cambia la banda absorción del grupo azo a longitudes de onda más largas aumenta la intensidad de la banda de absorción. Sin embargo, u colocación juiciosa de un grupo de ácido sulfónico en cromógeno azo amino no está conjugada, sin embargo, el efect derretido de electrón provoca un cambio de absorción longitudes de onda más largas.

Un ejemplo de un tinte que tiene un estado tierra más polar que el estado excitado es el tinte merocianina 1 como se mostró abajo. El canónico de la izquierdo separado de carga 1 es un contribuyente principal estado a tierra mientras que el canónico del lado derecho 1' un contribuyente principal al primer estado excitado.

El índigo 2, como se mostró abajo, es un ejemp de un tinte que tiene un estado a tierra que significativamente menos polar que el estado excitado. canónico de extremo izquierdo forma 2 es un contribuyente principal al estado a tierra del tinte, mientras que el canónico 2' de lado derecho es un contribuyente principal al estado excitado . 2 2 Los tintes adecuados para la práctica de las invenciones incluyen aquéllos discutidos arriba como el tinte Reichardt, los tintes merocianina, los tintes suiteriónicos en los cuales las cargas positiva y negativa formales están contenidas dentro de un sistema electrónico - p contiguo, 4- [2-N-substituido-1, 4 -hidropiridina-4 - ilidina) etilideno] ciclohexa-2 , 5-dien-l-uno, tintes pirazolona rojo, tintes azometina, tintes indoanilina, tintes diazamerocianina, y mezclas de los mismos.

Los tintes merocianina caen dentro del donante -una clasificación de cromógeno de aceptador simple de Griffiths como se discutió en "Color y Constitución de Moléculas Orgánicas" Prensa Académica (Londres) 1976, en donde el grupo carbonilo actúa como una mitad aceptadora de electrón. El aceptador de electrón es conjugado a un grupo donante de electrón, por ejemplo, un grupo hidroxilo o uno amino que es capa de donar electrones. Los tintes merocianina son una clase relativamente amplia de tintes que incluyen la estructura 3, en donde un átomo de nitrógeno contenido en un sistema heterocíclico sirve como un donante. En éste caso n puede tomar cualquier valor incluyendo 0. Los tintes merocianina tienen una forma de resonancia (suiteriónicas) separada de carga.

Los tintes de merocianina acíclicos también son conocidos, incluyendo las amidas vinilalogos.

Los tintes de merocianina se han estudiado por su habilidad para fotosensibilizar el haluro de plata a ciertas longitudes de onda de luz para usarse en película fotográfica. Muchas estructuras de tinte de merocianina son conocidas. Las estructuras 4-14 muestran varios ejemplos no limitantes de los tintes de merocianina. Note que para cada uno de éstos tintes, puede sacarse una estructura de resonancia de carga separada. La literatura sugiere que la forma de carga separada ( suiteriónica) contribuye significativamente al estado a tierra del tinte. ? 14 en donde R puede ser metilo, alquilo, arilo fenilo, etc.

Cromogenos Suiteriónicos Ciertos tintes pueden ser preparados los cuales son permanentemente de una forma suiteriónica . Es decir, estos tintes tienen cargas permanentes asociadas con el sistema de electrón-p y una estructura de resonancia neutral para el cromógeno no puede ser sacada. Tales tintes incluyen el tinte Reichardt 15, el cual se conforma a la estructura general 16. 15 15 Otros distintos al tinte de Reichardt, aún otros ejemplos de tintes de N-fenolato betaína piridinio solvatocromático negativamente se establecen abajo en las estructuras 16-21: 20 16 en donde, R es hidrógeno, -C(CH3)3, -CF3, o C6F: 19 20 22 Las estructuras no limitantes adicionales 24 - 32 pueden incluir las siguientes las cuales se conforman a l estructura general 23 : en donde X puede ser oxígeno, carbón, nitrógeno, 23 29 32 La cantidad de tinte debe ser suficiente para permitir un cambio en el color con el contacto con los microbios en donde el cambio es detectable para el ojo sin ayuda y dependerá de la sensibilidad del tinte. La cantidad de tinte encontrada que es suficiente generalmente de entre 0.001 y 20 porciento por peso, en algunas incorporaciones de entre 0.01 y 10 porciento por peso, en algunas incorporaciones de entre 0.05 y 5, y en algunas incorporaciones de entre 0.1 y 3 porciento por peso sobre una base seca. El cambio de color ocurre muy rápidamente en una manera que depende de la concentración y el tipo de microorganismos.

La composición incluye un colorante sensible a los microbios como se describió anteriormente y una fase móvil. El término "fase móvil" incluye líquidos y gases que pueden ser usados como portadores para el colorante. El acetonitrilo, tetrahidrofurán; xilenos; formaldehídos (por ejemplo, dimetilformamida) , y los alcoholes (por ejemplo, metanol, etanol, n-propanol, e isopropanol) se han encontrado que son portadores adecuados aún cuando puede ser usado cualquier portador efectivo. La fase móvil puede además también ser una composición desinfectante o bactericida.

El tinte colorante puede estar en la forma de un líquido que puede ser rociado o limpiado sobre una superficie para indicar la presencia de microbios. El líquido que contiene el tinte puede ser aplicado a las superficies y el líquido aplicado dejar que se seque, formando el residuo seco del tinte que puede en un momento posterior ser expuesto a la contaminación por los microbios. Con la exposición a los microbios, el residuo secado cambiará de color, indicando la presencia de los microbios. El cambio de color puede ocurrir rápidamente de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, el cromógeno puede comenzar a cambiar de color en menos de alrededor de 30 minutos, en algunas incorporaciones, menos de alrededor de 5 minutos, en algunas incorporaciones menos de alrededor de 1 minuto, en algunas incorporaciones menos de alrededor de 30 segundos, y en algunas incorporaciones, menos de alrededor de 10 segundos.

Tal método de indicación usando el residuo secado de una solución de tinte aplicado puede ser útil para emplearse en superficies sólidas tal como, por ejemplo, empaques tal como cajas de tisú facial, etiquetas con pegamento, papel, tisúes, parafernalia médica como guantes quirúrgicos, trajes quirúrgicos y cubiertas quirúrgicas, máscaras para la cara, cubiertas para la cabeza tales como gorras abombadas, gorras quirúrgicas y caperuzas, guantes para examen y quirúrgicos, artículos para los pies tal como cubiertas para zapatos, cubiertas para botas y pantuflas, vendajes para heridas, apositos, envolturas de esterilización, paños limpiadores, prendas como batas de laboratorio, cubretodos, delantales y sacos, ropa para paciente, sábanas para camilla y cuna, envolturas para la preparación de alimentos, esponjas para platos, trapos, manijas de puerta, teléfonos, teclados de computadora, ratones de computadora, plumas, lápices, cuadernos de notas, manijas de retrete, vendajes para heridas, vendas y juguetes (por ejemplo en los cuartos de espera de los doctores, instalaciones para el cuidado de los niños) .

Los substratos sobre los cuales el tinte solvatocrómico puede ser recubierto puede por tanto incluir paños limpiadores, así como otros artículos que pueden ser expuestos a las bacterias como aquéllos mencionados anteriormente . Los tintes solvatocrómicos también pueden ser incorporados en las lociones o cremas usadas para verificar la contaminación de las manos respecto de los microbios. El tinte puede ser incorporado en esponjas o toallas para platos para advertir de la contaminación.

Los substratos adecuados para usarse como pañ limpiador para recubrir con colorantes incluyen cualquiera d los tradicionalmente usados para paños limpiadores incluyend películas, telas tejidas y no tejidas, substratos celulósico como tisúes, toallas de papel y materiales coform, materiale colocados por aire, tejidos cardados y unidos y otros. Lo ejemplos no exclusivos de los substratos pueden ser encontrado en las Patentes de los Estados Unidos de América Número 4,775,582 y 4,853,281, 4,833,003, y 4,511,488, todas cedidas Kimberly-Clark Corporation.

Una tela no tejida puede hacerse de acuerdo a lo procesos como la unión con hilado, soplado con fusión colocación por aire, unión y cardado, y otros. Las telas n tejidas pueden hacerse de resinas termoplásticas incluyendo pero no limitándose a poliésteres, nylons, y poliolefinas . La olefinas incluyen etileno, propileno, butilenos, isopreno otros, así como combinaciones de las mismas.

Las "fibras unidas con hilado" son fibras d diámetro pequeño las cuales son formadas mediante el extrudir e material termoplástico derretido como filamentos desde un pluralidad de vasos capilares finos usualmente circulares de u órgano de hilado con el diámetro de los filamentos extrudido entonces siendo rápidamente reducido como se indica por ejemplo en las Patentes de los Estados Unidos de América Número 4,340,563 otorgada a Appel y otros, 3,692,618 otorgada Dorschner y otros, 3,802,817 otorgada a Matsuki y otros, 3,338,992 y 3,341,394 otorgada a Kinney, 3,502,763 otorgada a Hartman, y 3,542,615 otorgada a Dobo y otros. Las fibras unidas con hilado no son generalmente pegajosas cuando éstas son depositadas sobre una superficie recolectora. Las fibras unidas con hilado son generalmente continuas y tienen diámetros promedio (desde una muestra de por lo menos 10) más grande de 7 mieras, más deseablemente, de entre alrededor de 10 y 20 mieras.

Las "fibras sopladas con fusión" significa fibras formadas mediante el extrudir un material termoplástico derretido a través de una pluralidad de vasos capilares de matriz finos, usualmente circulares, como hilos derretidos o filamentos adentro de corrientes de gas (por ejemplo de aire) , usualmente calientes a alta velocidad y convergentes las cuales atenúan los filamentos del material termoplástico derretido para reducir su diámetro puede ser a un diámetro de microfibra. Después, las fibras sopladas con fusión son llevadas por la corriente de gas a alta velocidad y son depositadas sobre la superficie recolectora para formar un tejido de fibras sopladas con fusión dispersadas al azar. Tal proceso está descrito, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos de América Número 3,849,241 otorgada a Butin y otros. Las fibras sopladas con fusión son microfibras las cuales pueden ser continuas o discontinuas, son generalmente más pequeñas de 10 mieras en diámetro promedio, y son generalmente pegajosas cuando se depositan sobre una superficie recolectora.

Como se usó aquí, el término "coform" significa u proceso en el cual por lo menos una cabeza de matriz soplada co fusión está arreglada cerca de un conducto a través del cual so agregados otros materiales al tejido mientras que éste se est formando. Tales otros materiales pueden ser pulpa, partícula súper absorbentes, fibras de polímeros naturales (por ejemplo fibras de rayón o de algodón u otros materiales celulósicos) y/ fibras de polímeros sintéticos (por ejemplo, polipropileno poliéster) , por ejemplo, en donde las fibras pueden ser d longitud corta. Los procesos coform son mostrados en la Patentes de los Estados Unidos de América Números 4,818,46 otorgada a Lau y 4,100,324 otorgada a Anderson y otros. Lo tejidos producidos por el proceso coform son generalment mencionados como materiales coform.

Un tejido cardado y unido se hace de fibras corta las cuales son enviadas a través de una unidad de peinado o d cardado, la cual rompe y separa y alinea las fibras cortas en l dirección de la máquina para formar una tela no tejida fibros orientada generalmente en la dirección de la máquina. Una ve que el tejido es formado, es entonces unido por uno o más d varios métodos tales como la unión de polvo, la unión co patrón, la unión a través de aire y la unión ultrasónica.

En el proceso de colocación por aire, los manojo de fibras pequeñas teniendo las longitudes típicas variando desde alrededor de 3 a alrededor de 52 milímetros (mm) son separadas y llevadas en un suministro de aire y después son depositadas sobre una rejilla formadora, usualmente con la ayuda de un suministro de vacío. Las fibras depositadas al azar son unidas unas a otras. Los ejemplos de las enseñanzas de colocación por aire incluyen el proceso DanWeb como se describe en la Patente de los Estados Unidos de América Número 4,640,810 otorgada a Laureen y otros y cedida a Sean Web de North America Inc . , el proceso Kroyer descrito en la Patente de los Estados Unidos de América Número 4,494,278 otorgada a Kroyer y otros y la Patente de los Estados Unidos de América Número 5,527,171 otorgada a Soerensen y cedida a Niro Separation a/s, el método de la Patente de los Estados Unidos de América Número 4,375,448 otorgada a Appel y otros cedida a Kimberly-Clark Corporation, u otros métodos similares.

Los inventores han descubierto que los blanqueadores usados para limpiar superficies como, por ejemplo, la solución de hipoclorito de sodio, cloro, y bisulfito de sodio pueden impactar posiblemente en forma negativa los tintes solvatocrómicos y provocar un cambio de color aún cuando no esté presente la bacteria. Otro aspecto de la invención, por tanto, incluye un colorante detector de blanqueador en un paño limpiador junto con los tintes solvatocrómicos. El indicador puede ser, por ejemplo, 2 , 2 ' , 5 , 5 ' -tetrametilo bencidina, el cual es normalmente incoloro y se vuelve rojo cuando se expone al hipoclorito de sodio o al cloro. El indicador también puede ser una combinación de almidón y yodo la cual se convierte en negr en la presencia de cloro o de hipoclorito. Aún otro indicador, la fucsina, puede ser útil para la detécción de sulfitos, tal como metabisulfito de sodio. La fucsina es de color de rosa cambia a incoloro cuando se expone a los sulfitos. En ést manera, las áreas del paño limpiador las cuales pueden se designadas como sensibles a las bacterias y a otras áreas com sensibles a los blanqueadores y preservativos de manera que las superficies que contienen un blanqueador activo da combinaciones de cambio de color que permiten al usuario el distinguir la contaminación bacterial del blanqueador. El indicador de blanqueador puede ser impreso en un patrón par escribir la palabra "BLANQUEADOR" , escondida en el pañ limpiador de manera que si el paño limpiador fuera pasado través del blanqueador, la palabra BLANQUEADOR se haría visible, junto con cualquier otro cambio de color que el blanqueado pudiera provocar al tinte solvatocrómico . La cantidad de indicador de blanqueador sólo requiere ser una cantida suficiente para provocar un cambio de color que pueda se detectado por el ojo sin ayuda y está en el mismo rango que el tinte solvatocrómico.

Los inventores también creen que es posible e incluir los parches pequeños de a) un tinte solvatocrómico qu detecta bacterias, b) un material detector de cloro hipoclorita, tal como tetrametil bencidina, c) un detector d agente oxidizante tal como una mezcla de ioduro de potasio almidón, d) un indicador de bisulfito tal como fucsina, e) un reagente detector de nitrito, como ejemplos, sobre una tira indicadora. En ésta manera, una variedad de indicadores de calidad pueden dar un estado o calidad de, por ejemplo, los alimentos.

En otro aspecto de la invención, un recubrimiento sobre el substrato puede ser usado para inhibir que los tintes de detección se cristalicen, obteniendo por tanto un recubrimiento que tiene una sensibilidad mayor a los microbios. En forma ideal, un recubrimiento que tiene las moléculas de tinte únicas sobre la superficie tendrá una mayor sensibilidad a los microbios . Cada molécula de tinte estará libre para interactuar con la membrana microbial . En contraste, los cristales pequeños de tinte tendrán primero que disolverse y después penetrar en la membrana. Aún cuando no se desea el estar unido por una teoría, nosotros creemos que la hidroxipropil-beta-ciclodextrina, hidroxietil-beta-ciclodextrina, gama-ciclodextrina, hidroxipropilo-gama-ciclodextrina, hidroxietilo-gama-ciclodextrina (de aquí en adelante colectivamente "ciclodextrina"), todos disponibles de Cerestar International de Hammond, Indiana, Estados Unidos de América, perjudican la cristalización del tinte, permitiendo que ocurra un color de tinte más vivido sobre el substrato. La cantidad de ciclodextrina se ha encontrado que es efectiva de entre 0.001 y 2 porciento por peso, deseablemente de entre 0.01 y 1 porciento por peso y aún más deseablemente de entre 0.025 y 0.5 porciento por peso.

Ciertos surfactantes se han encontrado que ayudan a detectar los microbios. Los surfactantes particularmente deseados son los surfactantes no iónicos, tal como los alquilfenoles etoxilatados , los alcoholes grasos etoxilatados y propoxilatados , los copolímeros de bloque de óxido de propileno-óxido de etileno, los ésteres etoxilatados de ácidos grasos (C8 -C18) , los productos de condensación de óxido etileno con aminas o amidas de cadena larga, los productos de condensación de óxido etileno con alcoholes, dioles acetilénicos , y mezclas de los mismos. Varios ejemplos específicos de los surfactantes no iónicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, metil gluceth-10, PEG-20 metil glucosa diestearato, PEG-20 metil glucosa sesquiestearato, pareth-20 Cn.i5, ceteth-8, ceteth-12, dodoxinol-12 , laureth-15, aceite de ricino PEG-20, polisorbato 20, esteareth-20 , polioxietileno-10 cetil éter, polioxietileno-10 estearil éter, polioxietileno-20 cetil éter, polioxietileno-10 oleilo éter, polioxietileno-20 oleilo éter, un nonilfenol etoxilatado, octilfenol etoxilatado, dodecilfenol etoxilatado, o alcohol graso etoxilatado (C6 - C22) , incluyendo 3 a 20 mitades de óxido de etileno, polioxietileno-20 isohexadecil éter, polioxietileno-23 glicerol laurato, polioxi-etileno-20 gliceril estearato, PPG-10 metil glucosa éter, PPG-20 metil glucosa éter, polioxietileno-20 monoésteres de sorbitan, aceite de ricino polioxietileno- 80 , tridecil éter polioxietileno- 15 , polioxi- etileno-6 tridecil éter, laureth-2, laureth-3( laureth-4, aceit de ricino PEG-3, dioleato de PEG 600, dioleato de PEG 400, mezclas de los mismos. Los surfactantes no iónico comercialmente disponibles pueden incluir el rango de SURFYNOL de surfactantes diol acetilénicos disponibles de Air Product and Chemicals de Allentown, Pennsylvania y el rango T EEN® d surfactantes de polioxietileno disponibles de Fischer Scientifi de Pittsburg, Pennsylvania.

Un aglutinante también puede ser empleado par facilitar la inmovilización del colorante sobre un substrato. Por ejemplo, los polímeros orgánicos solubles en agua pueden se empleados como aglutinantes. Una clase adecuada de polímero orgánicos solubles en agua incluye los polisacáridos derivado de los mismos. Los polisacáridos son polímeros que contiene unidades de carbohidrato repetitivas, las cuales pueden se catiónicas, aniónicas, no iónicas y/o amfotéricas . En un incorporación particular, el polisacárido es un éter celulósic no iónico, catiónico, aniónico y/o amfotérico. Los étere celulósicos no iónicos adecuados pueden incluir, pero no s limitan a éteres de celulosa de alquilo, tal como metil celulos y etil celulosa; hidroxialquil celulosa éteres, tal com hidroxietil celulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropi hidroxibutil celulosa, hidroxietil hidroxipropil celulosa, hidroxietil hidroxibutil celulosa e hidroxietil hidroxipropi hidroxibutil celulosa; alquilo hidroxialquil celulosa éteres, tal como metilo hidroxietil celulosa, metilo hidroxipropi celulosa, etilo hidroxietil celulosa, ' etilo hidroxipropil celulosa, metilo etil hidroxietil celulosa y metilo etilo hidroxipropilo celulosa; y otros.

De acuerdo con aún otro aspecto de la presente invención, se ha descubierto que el tinte también puede proporcionar información en relación a la cantidad de microbios a la cual éste es expuesto. Por ejemplo, el tinte Reichardt muestra un solvatocromismo negativo fuerte. Esto es, la reducción de tinte puede sufrir cualquier cambio de color desde azul a incoloro en la presencia de uno o más microbios. Los cambios a los cuales el tinte cambia de color pueden ser determinados ya sea visualmente o usando instrumentos para proporcionar una correlación semi-cuantitativa y/o cuantitativa para la concentración de microbios. Por ejemplo, el color de un tinte de prueba reaccionado puede ser comparado (por ejemplo, visualmente o con la ayuda de un instrumento) con el color del control de tinte, el cual está formado de un compuesto que es el mismo o similar al tinte de prueba con respecto a su respuesta a los microbios. Los tintes de control múltiples pueden en forma similar ser empleados los cuales corresponden a diferentes concentraciones de microbios. Por ejemplo, cinco tintes pueden ser utilizados los cuales son reaccionados con las concentraciones de microbio de 103, 104, 105, 106, y 107 de unidades formadoras de colonia ("CFU") por milímetro, respectivamente. Con la comparación, uno o más tintes de control pueden ser seleccionados teniendo un color que es el mismo o esencialmente similar al tinte de prueba reaccionado con la muestra de prueba. La concentración del microbio (o rango de concentraciones) adentro de la muestra de prueba es entonces determinado del tinte de control seleccionado o tinte (s) y la concentración o concentración (es) de microbios conocidas correspondientes. Los resultados cuantitativos (por ejemplo, una concentración especifica) o semi-cuantitativos (por ejemplo, un rango de concentraciones) pueden por tanto ser obtenidos usando ésta técnica.

Si se desea, la intensidad de color de un tinte puede ser medida para determinar mejor la cantidad actual de uno o más microbios presentes en la muestra de prueba. En una incorporación, la intensidad de color es medida con un lector óptico. La configuración y estructura actuales del lector óptico pueden generalmente variar como es entendido fácilmente por aquéllos expertos en el arte. Típicamente, el lector óptico contiene una fuente de iluminación que es capaz de emitir radiación electromagnética y un detector que es capaz de registrar una señal (por ejemplo, transmitida o luz reflejada) . La fuente de iluminación puede ser cualquier dispositivo conocido en el arte que es capaz de proporcionar radiación electromagnética, tal como la luz en el rango visible o casi visible (por ejemplo, la luz ultravioleta o infrarroja) . Por ejemplo, las fuentes de iluminación adecuadas que pueden ser usadas en la presente invención incluyen, pero no se limitan a los diodos emisores de luz (LED) , a las lámparas de flash, a las lámparas fluorescentes de cátodo frío, a las lámparas electroluminiscentes , y similares. La iluminación puede ser multiplexada y/o colimada. En algunos casos, la iluminación puede ser pulsada para reducir cualquier interferencia de fondo. Además, la iluminación puede ser continua o puede combinar una onda continua (CW) y una iluminación pulsada en donde múltiples rayos de iluminación son multiplexados (por ejemplo, un rayo pulsado es multiplexado con un rayo de onda continua) , permitiendo la discriminación de señal entre una señal inducida por la fuente de onda continua y una señal inducida por una fuente pulsada. Por ejemplo, en algunas incorporaciones, los diodos emisores de luz (por ejemplo, diodos rojos de aluminio galio arsénido, diodos verdes de galio fosfido, diodos verdes de galio arsénido fosfido, o diodos violeta/azul/ultravioleta (UV) de indio galio nitrido son usados como la fuente de iluminación pulsada. Un ejemplo comercialmente disponible de un diodo de excitación UV LED adecuado para usarse en la presente invención es el modelo NSHU550E (de Nichia Corporation) , el cual emite 750 a 1000 microwatts de fuerza óptica a una corriente hacia delante de 10 miliamperios (3.5-3.9 voltios) adentro de un rayo con un ancho completo a una mitad máxima de 10 grados, una longitud de onda pico de 370-375 nanómetros, y un ancho medio espectral de 12 nanómetros .

En algunos casos, la fuente de iluminación puede proporcionar una iluminación difusa al tinte. Por ejemplo, un arreglo de fuentes de luz de puntos múltiples (por ejemplo, Diodos Emisores de Luz) puede simplemente ser empleados para proporcionar una iluminación relativamente difusa. Otra fuente de iluminación particularmente deseada que es capaz de proporcionar una iluminación difusa en una manera relativamente no costosa es un dispositivo electroluminiscente (EL) . Un dispositivo electroluminiscente es generalmente una estructura de capacitor que utiliza un material luminiscente (por ejemplo, partículas de fósforo) colocada en forma de emparedado entre electrodos, por lo menos uno de los cuales es transparente para permitir que la luz escape. La aplicación de un voltaje a través de los electrodos genera un cambio de campo eléctrico dentro del material luminiscente que hace que éste emita luz.

El detector puede generalmente ser cualquier dispositivo conocido en el arte que es capaz de percibir una señal. Por ejemplo, el detector puede ser un detector formador de imágenes electrónico que está configurado para una discriminación espacial. Algunos ejemplos de tales sensores de formaciones de imágenes electrónicos incluyen los dispositivos acoplados de carga lineales de alta velocidad (CCD) , los dispositivos de inyección de carga (CID) , los dispositivos semiconductores-óxido-de metal-complementarios (CMOS), y otros. Tales detectores de imágenes, por ejemplo, son generalmente arreglos de dos dimensiones de sensores de luz electrónicos, aún cuando los detectores de formaciones de imagen lineales (por ejemplo, los detectores CDD lineales) que incluyen una línea única de píxeles detectores o sensores de luz, tal como, por ejemplo, aquéllos usados para escanear imágenes, también puede ser usados. Cada arreglo incluye un juego de posiciones única conocidas que puede ser mencionado como "direcciones" . Cad dirección en un detector de imagen es ocupada por un sensor qu cubre un área (por ejemplo, un área típicamente conformada com una caja o un rectángulo) . Ésta área es generalmente mencionad como un "píxel" o área de píxel. Un píxel detector, por ejemplo puede ser un sensor CCD, CID, o un CMOS, o cualesquier otro dispositivos o sensores que detectan o miden la luz. El tamañ de los píxeles detectores puede variar ampliamente, y puede e algunos casos tener un diámetro o longitud tan baja como de 0. micrómetros .

En otras incorporaciones, el detector puede ser u sensor de luz que carece de capacidades de discriminació espacial. Por ejemplo, los ejemplos de tales sensores de lu pueden incluir dispositivos fotomúltiplicadores , fotodiodos, ta como fotodiodos de avalancha o fotodiodos de silicio y otros Los fotodiodos de silicio son algunas veces ventajosos en e sentido de que éstos son baratos, sensibles, capaces de un operación a alta velocidad (tiempo de elevación corto / ancho d banda alto) , y son fácilmente integrados en la mayoría de lo otros circuitos monolíticos y tecnología de semi-conductor Además, los fotodiodos de silicio son físicamente pequeños, l cual les permite el ser incorporados fácilmente en varios tipo de sistemas de detección. Si los fotodiodos de silicio so usados, entonces el rango de longitud de onda de la seña emitida puede estar dentro del rango de sensibilidad el cual de 400 a 1100 nanómetros .

Los lectores ópticos pueden generalmente emple cualquier técnica de detección, incluyendo, por ejemplo, luminiscencia (por ejemplo, la fluorescencia, la fosforescenci etc.), la absorbencia (por ejemplo, fluorescente o fluorescente), la difracción, etc. En una incorporaci particular de la presente invención, el lector óptico mide intensidad de color como una función de la absorbencia. En u incorporación, las lecturas de absorbencia son medidas usando lector de microplacas de Dynex Technologies de Chantill Virginia (Modelo # MRX) . En otra incorporación, las lecturas absorbencia son medidas usando una prueba convencional conoci como "CIELAB" , la cual está discutida en la obra Guía Bolsillo para Impresión Digital de F. Cost, Delmar Publisher Albany, Nueva York. ISBN 0-8273-7592-1 páginas 144 y 145. És método define tres variables L* , a*, y b* las cual corresponden a tres características de un color percibido c base en la teoría oponente de percepción de color. Las tr variables tienen el siguiente significado: L* = Lightness (o luminosidad) , variando de des 0 a 100, en donde 0 = oscuro y 100 = luz; a* = Eje rojo/verde, variando aproximadamente de desde -100 a 100; valores positivos son rojizos y los valores negativos son verdosos; y b* = Eje amarillo/azul, variando aproximadamente de desde -100 a 100; los valores positivos son amarillentos y los valores negativos son azulados.

Debido a que el espacio de color CIELAB es algo visualmente uniforme, un número único puede ser calculado el cual representa la diferencia entre dos colores como se percibió por el ojo humano. Ésta diferencia es llamada ?? y se calcula mediante el tomar la raíz cuadrada de la suma de los cuadrados de tres diferencias (AL*, Aa* , y Ab*) entre los dos colores. En el espacio de color CIELAB, cada unidad ?? es de aproximadamente igual a una diferencia entre "justo notable" entre los dos colores . El CIELAB es por tanto una buena medida para un sistema de especificación de color independiente del dispositivo objetivo que puede usarse como un espacio de color de referencia para el propósito del manejo de color y la expresión de cambios de color. Usando ésta prueba, las intensidades de color (L*, a*, y b*) pueden por tanto ser medidas usando, por ejemplo, un espectrofotómetro sostenido en la mano de Minolta Company Limited de Osaka, Japón (Modelo # CM2600d) . Éste instrumento utiliza la geometría D/8 conformándose a CIE No. 15, ISO 7724/1, ASTME1164 y JIS Z8722-1982 (iluminación difusa/sistema de visión de 8 grados) . La luz D65 reflejada por la superficie de espécimen a un ángulo de 8 grados al normal de la superficie es recibida por el sistema óptico de medición de espécimen. Aún otro lector óptico adecuado es el espectrofotómetro de reflectancia descrito en la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de América Número 2003/0119202 otorgada a Kaylor, y otros, la cual se incorpora aquí en su totalidad por referencia para todos los propósitos. En forma similar, los sistemas de detección de modo-transmisión también pueden ser usados en la presente invención.

Sin importar la manera en la cual la intensidad de color es medida, el resultado puede ser comparado en algunas incorporaciones con una curva de detección predeterminada. La curva de detección es generada mediante el dibujar la intensidad del tinte a varias concentraciones de microbios. En ésta manera, el color es un tinte de prueba reaccionado que puede ser medido y fácilmente correlacionado a una concentración de microbios usando la curva de detección para proporcionar resultados cuantitativos o semi-cuantitativos a un usuario. Aún cuando la curva de detección puede ser desarrollada para un rango amplio de microbios, también se contempla que la curva de detección puede ser desarrollada para un tipo único de microbios. Por tanto, la intensidad de color puede ser correlacionada a la curva de detección para el microbio de interés en una solicitud particular. Por ejemplo, un tinte puede ser seleccionado el cual exhibe una reacción particular para E.coli. Al sufrir un cambio de color, la intensidad del color puede entonces ser correlacionada con la curva de detección predeterminada para E. coli. Además, las curvas de detección múltiples también pueden ser desarrolladas para múltiples tipos de microbios.

Los métodos de correlación, tal como se describió anteriormente, pueden ser llevados a cabo automáticamente y/o manualmente. Por ejemplo, un microprocesador puede opcionalmente ser empleado para seleccionar automáticamente la técnica de correlación deseada y para convertir la medición de un detector a un resultado que indica cuantitativamente o semi-cuantitativamente la concentración de microbios. El microprocesador puede incluir una capacidad de memoria para permitir al usuario el volver a llamar los varios últimos resultados. Aquéllos expertos en el arte apreciarán que cualesquier dispositivos de memoria legibles por computadora adecuados tal como RAM, ROM, EPROM, EEPROM, las tarjetas de memoria instantánea, los discos de video digitales, los cartuchos Bernoulli, y otros, también pueden ser usados. Si se desea, los resultados pueden ser llevados a un usuario usando un exhibidor de cristal líquido (LCD) o LED.

Las técnicas de correlación antes descritas pueden ser implementadas en una variedad de formas de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, un substrato puede ser utilizado el cual contiene una zona de detección que proporciona cualquier número de regiones de detección distintas (por ejemplo, líneas, puntos, etc.) de manera que un usuario puede determinar mejor la concentración de uno o más microbios dentro de la muestra de prueba. Cada región puede contener el mismo tinte de prueba, o puede contener diferentes tintes para reaccionar con diferentes tipos de microbios. Algunos tintes, por ejemplo, son más sensibles a las bacterias gram positivas y algunos son más sensibles a las bacterias gram negativas. En ésta forma, más de un tipo de microbios puede ser detectado. La concentración de tinte de prueba también puede ser controlada selectivamente para proporcionar el nivel deseado de sensibilidad de detección. Por ejemplo, las concentraciones más altas pueden proporcionar un nivel más alto de sensibilidad de detección cuando son sospechados niveles de microbios bajos. Si se desea, el substrato también puede contener una zona de control que es aplicada con el tinte de control que es el mismo o similar al tinte de prueba. La zona de control no cambia de color generalmente durante la prueba de manera que ésta puede ser usada para una comparación cualitativa y/o semi-cuantitativa . En forma similar a la zona de detección, la zona de control también puede proporcionar cualquier número de regiones distintas. Por ejemplo, la zona de control puede contener regiones que corresponden a diferentes concentraciones de microbios , tal como se describió anteriormente . Además , las regiones pueden contener tintes que tienen un nivel de sensibilidad diferente para diferentes tipos de microbios.

El substrato puede ser formado de cualquiera d una variedad de materiales capaces de ser aplicados con u tinte. Por ejemplo, el substrato puede ser formado de un película, un papel, una tela no tejida, una tela de punto, un tela tejida, espuma, etc. En una incorporación particular, e substrato es un material de suministro de cara emplead generalmente en la fabricación de etiquetas, tal como de papel, de poliéster, de polietileno, de polipropileno, de polibutileno, de poliamidas, etc. Un adhesivo, tal como un adhesivo sensible la presión, un adhesivo activado por calor, un adhesiv derretido caliente, etc., puede ser empleado en uno o más superficies del material de suministro para ayudar a adherirlo un artículo deseado. Los ejemplos adecuados de adhesivos sensibles a la presión incluyen, por ejemplo, los adhesivos d base acrílica y los adhesivos elastoméricos . En un incorporación, el adhesivo sensible a la presión está basad sobre los copolímeros de ásteres de ácido acrílico (por ejemplo, 2-etil hexil acrilato) con los co-monómeros polares (po ejemplo, ácido acrílico) . El adhesivo puede tener un grosor e el rango de desde alrededor de 0.1 a alrededor de 2 milésimas d pulgada (2.5 a 50 mieras). Un forro de liberación también puede ser empleado el cual hace contacto con un adhesivo antes del uso. El forro de liberación puede contener cualquiera de un variedad de materiales conocidos por aquéllos expertos en e arte, tal como un substrato de película o papel recubierto d silicona. Durante el uso, el substrato tratado y el adhesivo so pelados del forro de liberación. Después, el adhesivo e colocado a un lado de una ubicación deseada para exponer el substrato tratado al ambiente.

Refiriéndonos a la Figura 17, otra incorporación de la presente invención está ilustrada en la cual el substrato es un dispositivo de flujo lateral 20. Más específicamente, el dispositivo 20 contiene una membrana porosa 23 que actúa como un medio fluidíco y es opcionalmente sostenida por un material rígido (no mostrado) . En general, la membrana porosa 23 puede hacerse de cualquiera de una variedad de materiales a través de los cuales la muestra de prueba es capaz de pasar. Por ejemplo, los materiales usados para formar la membrana porosa 23 pueden incluir, pero no se limitan a materiales naturales, sintéticos o que ocurren naturalmente que son modificados sintéticamente tal como los polisacáridos (por ejemplo, materiales de celulosa tal como papel y derivados de celulosa, tal como acetato de celulosa y nitrocelulosa) ; poliéter sulfona; polietileno; nylon; fluoruro de polivinilideno (PVDF) ; poliéster; polipropileno; sílice; materiales inorgánicos tal como alúmina desactivada, tierra de atómacea, MgS04 , u otro material finamente dividido inorgánico dispersado uniformemente en una matriz de polímero poroso, con polímeros tales como el cloruro de vinilo, el copolímero de propileno-cloruro de vinilo, y el copolímero de acetato de vinilo-cloruro de vinilo; trapo, ambos ocurriendo lateralmente (por ejemplo, de algodón) y sintético (por ejemplo, de nylon o rayón) ; geles porosos, tales como gel de sílice, agarosa, dextrán, y gelatina; películas poliméricas, tal como poliacrilamida; y otros. En una incorporación particular, la membrana porosa 23 es formada de materiales de sulfona poliéter y/o de nitrocelulosa . Deberá entenderse que el término "nitrocelulosa" se refiere a ásteres de ácido nítrico de celulosa, los cuales pueden ser sólo nitrocelulosa o un éster mezclado de ácido nítrico y otros ácidos, tal como los ácidos alifático carboxílicos teniendo de desde 1 a 7 átomos de carbono. El dispositivo 20 también puede contener una almohadilla absorbente 28. La almohadilla absorbente 28 generalmente recibe el fluido que ha emigrado a través de la membrana porosa completa 23. Como se conoce en el arte, la almohadilla absorbente 28 puede ayudar a promover la acción capilar y el flujo de fluido a través de la membrana 23.

Para iniciar la detección de los microbios dentro de una muestra de prueba, un usuario puede directamente aplicar la muestra de prueba a una parte de la membrana porosa 23 a través de la cual ésta puede entonces viajar. Alternativamente, la muestra de prueba puede primero ser aplicada a una almohadilla de muestreo (no mostrada) y/o una almohadilla conjugada (no mostrada) que están en comunicación de fluido con la membrana porosa 23. Tales materiales adecuados que pueden ser usados para formar la almohadilla de muestreo y la almohadilla conjugada incluyen, pero no se limitan a nitrocelulosa, celulosa, almohadillas de polietileno porosas, y papel de filtro de fibra de vidrio. Sin importar de dónde es aplicada, la muestra de prueba emigra a una zona de detección 31 definida por la membrana porosa 23 que es capaz de señalar la presencia de un microbio. En particular, como se mostró en la Figura 17, la zona de detección 31 incluye un tinte de prueba que exhibe un cambio de color detectable con el contacto de uno o más microbios . El dispositivo de ensayo 20 también incluye una zona de control 32 que es aplicada con un tinte de control y opcionalmente se coloca hacia abajo desde la zona de detección 31. La zona de control 20 no cambia generalmente de color durante la prueba de manera que ésta puede ser usada para una comparación semi-cuantitativa y/o cuantitativa.

La prueba y los tintes de control son algunas veces aplicados en una manera de forma que éstos no se difundan esencialmente a través de la matriz de la membrana porosa 23. Esto permite a un usuario el detectar fácilmente el color de los tintes después del tiempo de reacción deseado. Por ejemplo, los tintes pueden formar una unión iónica y/o covalente con los grupos funcionales presentes en la superficie de la membrana porosa 23 de manera que éstos permanecen inmovilizados sobre la misma. En una incorporación, un tinte cargado positivamente puede formar una unión iónica con grupos de carboxilo cargados negativamente presentes en la superficie de algunas membranas porosas (por ejemplo, nitrocelulosa) . Alternativamente, ciertos componentes pueden ser agregados a una solución de tinte que inhibe esencialmente la difusión del tinte adentro de la matriz de la membrana porosa 23. En otros casos, la inmovilización puede no ser requerida, y el tinte puede en vez difundirse adentro de la matriz de la membrana porosa 23 para la reacción con la muestra de prueba.

Los siguientes ejemplos ayudan a ilustrar varias incorporaciones de la invención.

MATERIALES DE EJEMPLO Todos los reactivos y solventes son obtenidos de Aldrich Chemical Company Inc. (de Milwaukee, isconsin) a menos que se note de otra manera y en donde fueron usados sin purificación. Los microorganismos usados en el estudio fueron: 1. Gram negativo (viable) Escherichia coli (ATCC #8739) . Psuedomonas aeruginosa (ATCC #9027) Sal onella choleraesuis Gardnerella vaginalis 2. Gram positive (viable) Staphylococcus aureus (ATCC #6538) S. Xylosis Lactobacillus acidophilus 3 Gram positive (muerto) Staphylococcus Aureus (ATCC #6538) S. Xylosis 4. Hongo (viable) Candida Albicans 5. Moho (viable) Aspergillus Niger 6. Virus - Virus de polio tipo 1 Virus Simple de Herpes (HSV-1) Rinovirus Sarampión Vacuna - Influenza A Todos los virus fueron obtenidos de Gibraltar Laboratories, Inc. de Fairfield, Nueva Jersey. El tinte Reichardt (2 , 6 -difenilo-4 - (2 , 4 , 6-trifenilpiridinio) -fenolato) y l-docosilo-4 - (4 -hidroxiestirilo) -bromuro de piridinio fueron comprados de Aldrich Chemical Company de Milwaukee, Wisconsin. Las otras merocianinas usadas en éste estudio fueron sintetizadas en-casa y están descritas en detalle abajo.

SÍNTESIS DE TINTES MEROCIANIÑA El l-Decosilo-4- (4 -hidroxiestirilo) -bromuro de piridinio estuvo comercialmente disponible de Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, Wisconsin) y se usó directamente.

Los ejemplos adicionales de los tintes de merocianina fueron sintetizados en el laboratorio en una reacción de dos pasos.

El tinte preparado sintéticamente usó el método de prueba como se mostró en la Figura 3.

El ioduro de metilo fue agregado lentamente a una solución agitada de d-picolina en 50 mililitros de isopropanol en un baño de hielo como se mostró en la Figura 4. Después de que se completó la adición, la reacción fue calentada a reflujo y el reflujo continuo por dos horas. La solución fue entonces enfriada en un baño de hielo y el precipitado se filtró, y se lavó con alcohol enfriado sobre un embudo Buchner. El polvo fue entonces secado en la cubierta-humos por 2 horas. El rendimiento del producto crudo fue de 18.6 gramos. El producto crudo no fue purificado además y se usó directamente para el siguiente paso.

La N-metilo-8-Picolona (9.4 gramos, 0.04 mol), y la vainilla (6.1 gramos, 0.04 mol) fueron todos disueltos en 50 mililitros de etanol con agitación como se muestra en la Figura 5. A ésta solución fueron agregados la piperidina (3.4 gramos, 0.04 mol) y la mezcla reflujada por 16 horas. La mezcla de reacción fue entonces enfriada en un baño de hielo y el producto se filtró usando un embudo Buchner y se lavó con etanol enfriado .

El tinte de crudo de la estructura 13 mencionado arriba, en donde R=metilo, fue entonces agitado en 250 mililitros de una solución de hidróxido de potasio de 0.2 Molar por 60 minutos para formar el suiterión y después se filtró usando un embudo Buchner. El tinte fue entonces cristalizado de la cantidad mínima de una mezcla de 1:1 de agua/metanol . El rendimiento fue de 9.4 gramos (98%).

Los otros tintes fueron sinterizados en una manera similar empezando desde el ioduro de alquilo respectivo. La siguiente Tabla 1 muestra los compuestos y los rendimientos obtenidos para la estructura de tinte 13 para tres grupos R diferentes.

Tabla 1. Derivados de alquilo sintetizados y rendimientos obtenidos GRUPO DE ALQUILO RENDIMIENTO (%) R=METILO 98 R=HEXILO 92 R=DODECILO 87 Ejemplo 1: Tinte Reichardt en Solvente de Acetonitrilo aplicado a una superficie previamente contaminada: A fin de investigar el uso de éstos tintes como un rocío, una solución del tinte Reichardt (160 miligramos en 10 mL de acetonitrilo) fue hecha. Una botella de rociado con un propulsor de aerosol fue utilizada para crear un mecanismo de rociado .

Una pierna de pollo cruda fue añejada a la temperatura ambiente por varios días para asegurar niveles altos de bacterias. Como se mostró en la Figura 6, la pierna de pollo fue colocada sobre la superficie de una placa de cerámica por varios segundos (6A) , y después se removió, después de lo cual la superficie fue secada para remover cualquier indicio de jugo de pollo (6B) . Después, fue rociada la solución de tinte Reichardt sobre la superficie usando una botella de rociado (6C) . La prueba fue repetida con una pieza adicional de pollo para asegurar la repetición y el que se diera un resultado similar .

Después de rociar la solución de tinte indicadora sobre la superficie, el área completa que se había puesto en contacto con el pollo fue decolorada (esto es, el color de rociado de indicador cambio de azul a muy pálido o incoloro) creando una delineación del pollo (6D) . El tinte fue rápidamente decolorado en el punto exacto que corresponde en donde el pollo había sido colocado en la superficie.

Ejemplo 2: Tinte Reichardt en Isopropanol aplicado a una superficie contaminada: El isopropanol fue investigado como un portador el cual puede tener beneficios adicionales debido a la capacidad de desinfección. El tinte Reichardt fue disuelto en isopropanol (160 mg de tinte en 10 mL de isopropanol) . Las perillas de puerta de plástico fueron utilizadas como una superficie "del mundo real" sobre la cual probar la contaminación bacterial. El jugo del pollo añejado fue usado para marcar la superficie de una de las perillas. La otra perilla de puerta se dejó no contaminada como un control. Ambas perillas fueron limpiadas. La solución de isopropanol del tinte fue rociada sobre ambas superficies. El área contaminada de la perilla fue fácilmente observada por su decoloración del tinte Reichardt de azul a incoloro .

Ejemplo 3: Tinte Reichardt en Prueba de Rociado de Indicador de Isopropanol para Positivos Falsos sobre superficies contaminadas : El indicador de tinte Reichardt se ha mostrado por tener una alta sensibilidad a los microbios de pollo. A fin de probar el indicador respecto de positivos falsos, otros componentes del fluido de pollo tal como lípidos y proteín fueron usados. El caldo de pollo fue utilizado por su naturale no bacterial y su probabilidad alta de contener interferenci potenciales .

El Caldo de Pollo Swanson® (Campbell Soup Compan de Nueva Jersey, comercialmente disponible en los supermercado de una lata recientemente abierta fue transmitido con pipe sobre una superficie de cerámica y se limpió en seco con u toalla de papel SCOTT®. El jugo del pollo añejado fue tambi suministrado con pipeta sobre las superficies de cerámica en lugar diferente y se limpió y se secó como un control positi conocido. El indicador de tinte Reichardt (160 miligramos en mi de isopropanol) fue rociado sobre la superficie de cerámica fue claro que sólo el lado conteniendo el jugo de pollo añeja (y por tanto las bacterias) fue decolorado. De éste experimen puede concluirse, que en el caso del pollo, es en verdad bacteria la que activa la respuesta de decoloración y no alg componente o componentes secundarios tal como la grasa o l proteínas de pollo.

Ejemplo 4: Rociado de Indicador de Tinte Reichar como un Auxiliar de Limpieza sobre una superficie contaminada: El uso de un tinte Reichardt en un rocío isopropanol como un auxiliar de limpieza también fue probad Como se mostró en la Figura 7, el jugo de pollo añejado f aplicado longitudinalmente a ambas mitades de una superficie de cerámica de forma cuadrada (7A) . Sobre una mitad, el lado A, no se llevó a cabo una limpieza distinta a limpiar rigurosamente la superficie con una toalla de papel SCOTT® . Sobre la otra mitad, el lado B, fue aplicado el antiséptico para manos Kimberly-Clark Professional Moisturizing Instant Hand Antiseptic (60% de solución de etanol, de Roswell Georgia) -a la toalla y se usó para limpiar la superficie (7B) . El rocío de tinte Reichardt fue entonces aplicado para determinar si la limpieza tuvo una diferencia (7C) . Fue claro que aún cuando el limpiador ayudó, varias áreas fueron "no tocadas" (7B) . Después, las mitades de fondo de ambas áreas de tiras fueron limpiadas vigorosamente de nuevo con el Antiséptico Profesional K-C, ésta vez usando las claves de rociado para guiarse en donde la limpieza fue más necesaria (7E) . Cuando el área fue rociada de nuevo (7F) no tuvo lugar ninguna decoloración, verificando la limpieza de la superficie (7G) .

Ejemplo 5: Decoloración de Materiales de Papel recubiertos de Tinta Reichardt: Éste experimento probó la capacidad de un recubrimiento de superficie del tinte Reichardt para responder a la contaminación bacterial. Como se mostró en la Figura 8, una hoja de papel fue también recubierta con cepillo con una solución de tinte Reichardt (80 mg / 10 mL de acetonitrilo) (8A) .

A éste papel fueron agregadas las partes alícuotas de 100 µ?. de 107, 106, 105, y 104 de CFU/mL E. coli o soluciones S. aureus (8B) . El agua fue usada como un control negativo. El color de tinte fue rápidamente descargado cuando se contaminaron por ambos tipos de bacterias (8C) , pero más rápidamente para el S. aureus (8D) . Se determinó posteriormente que aún cuando ambas soluciones de bacterias estuvieron en verdad a concentraciones de 107 CFU/mL, la concentración actual de la solución de S. aureus fue de 7 X 107 CFU/mL, en comparación a 1 X 107 de CFU/mL de la solución de E. coli. El agua causó una decoloración ligera del tinte después de varios minutos, en contraste a la rápida decoloración (< 1 minuto) observada para las soluciones de bacterias .

Una hoja de etiquetas auto-adhesivas de papel (de Avery-Dennison) también fue recubierta con cepillo con dos concentraciones diferentes de la solución de tinte Reichardt (160 mg / 10 mL de acetonitrilo, 80 mg / 10 mL de acetonitrilo) . Las etiquetas fueron aplicadas a la tapa y mecanismo de pestillo de una caja de Paños Limpiadores húmedos Huggies®. Un guante de mano fue usado para transferir 107 de CFU/mL de S. aureus a la superficie de las etiquetas. Aún cuando ambas concentraciones fueron rápidamente decoloradas, la descarga de color fue más fácilmente visible sobre la superficie la cual tuvo la concentración más baja de tinte, indicando que hubo una concentración de recubrimiento óptima que proporciona la detección y un contraste visual fuerte. La etiqueta puede proporcionar unos medios para una detección fácil y rápida de la contaminación bacterial para una variedad de aplicaciones.

Ejemplo 6: Cuantificación de concentración bacterial usando el tinte Reichardt: Un nuevo potencial para el indicador bacterial a base de tinte Reichardt fue realizado a través de la prueba del tinte líquido con bacterias sobre un substrato más bien que un tinte unido con substrato poniéndose en contacto con la bacteria líquida (Ejemplo 5) . Éste experimento se enfocó en determinar cómo responde la solución de tinte a concentraciones conocidas de bacterias que residen sobre una superficie. 100 µ? de 108 CFU/ml bacteria gram-positiva fueron colocados sobre una toalla SCOTT® (Figura 9A) . A éste punto fue agregado una gota de el tinte Reichardt disuelto en acetonitrilo (160 mg en 10 mi de acetonitrilo) (9B) .

Para comparación, un punto de tinte fue secado sobre la toalla y se agregó la misma cantidad de bacterias. Con la adición al punto de las bacterias, el tinte de Reichardt fue inmediatamente decolorado. La reacción de las bacterias colocadas sobre la toalla celulósica conteniendo el tinte, por contraste, tiene varios minutos para decolorar. Las gotas adicionales del tinte fueron agregadas al punto de las bacterias (9C) , y la decoloración continuo hasta la cuarta gota, en cuyo punto el color morado persistió (9D) . Los intentos para restaurar el color de tinte sobre la toalla SCOTT® recubierta de tinte mediante el agregar acetonitrilo usando una pipeta no fueron exitosos (9E) .

Ejemplo 7: Prueba de Volumen Volumétrico de Indicador Bacterial usando el tinte Reichardt: El descubrimiento de una rápida decoloración de la solución de tinte mediante una bacteria unida al substrato, así como el hecho de que la reacción alcanzó un punto de extremo, impulsó la exploración en la capacidad del tinte para dar una información cuantitativa acerca de las bacterias CFU/ml. El propósito de éste experimento fue el de analizar el volumen de varias concentraciones de bacterias unidas a un substrato con tinte y determinar si la cantidad de tinte requerida para estabilizar el color varío del todo con el CFU/ml bacterial.

Sobre una toalla de papel SCOTT® fueron colocados 100 µ? cada uno de suspensiones bacteriales S. aureus y diluidas en serie. Las gotas (10 µ?) del tinte Reichardt en solución de acetonitrilo (40 mg/10 mi) fueron puestas con pipeta sobre cada punto en donde las bacterias fueron colocadas . La solución de tinte fue al principio coloreada pero fue casi instantáneamente (< 1 segundo) decolorada y se colocaron gotas adicionales sobre el mismo punto hasta que el tinte ya no estuvo decolorado y el color morado/azul ya no se desvaneció. Ésto fue repetido sobre cada punto que corresponde a en dónde fueron colocadas diferentes concentraciones de bacterias.

Los resultados nos muestran una buena correlación al nivel de contaminación bacterial sobre una superficie o substrato.

Ejemplo 8: Análisis volumétrico de bacterias en orina añejada de mujer: Para ilustrar el uso práctico de éste nuevo método, una muestra de orina añejada de mujer estancada (100 µ?) fue colocada sobre una toalla celulósica para dar varias manchas cada una teniendo 100 µ? volúmenes de la orina. Dos soluciones del tinte fueron usadas para el estudio de análisis volumétrico; 40 mg de tinte/10 mi de acetonitrilo y 160 mg de tinte/10 mi de acetonitrilo. Las soluciones de tinte fueron entonces colocadas sobre los puntos con orina en 10 µ? de partes alícuotas y se continuo hasta que el color de tinte azul/morado permaneció (esto es, el tinte fue agregado a la orina hasta que el color persistió) . La Tabla 2 presenta el volumen de cada solución de tinte requerido para que permanezca estable el color de tinte (esto es, ya no haya decoloración) . La orina añejada de mujer es conocida por tener una contaminación bacterial alta y éste estudio preliminar muestra un nivel alto de contaminación e ésta muestra particular.

Tabla 2: Cuantificación Bacterial de la Orina Estancada de Muje Es interesante el notar que tomó cuatro veces má diluir (para dilución de cuatro veces) de solución de tinte qu la solución de tinte más concentrada (cuatro veces superior) . Esto puede permitir el confeccionar el sistema indicador par los niveles de CFU variables vistos en diferentes industria (alimentos en contra del cuidado de la salud, etc.) mediante e usar concentraciones de tinte máximas para minimizar la cantida requerida para la saturación. Por ejemplo, las partes de poll pueden producir cualquiera de desde 102-109 de niveles d bacterias dependiendo del tiempo y condiciones d almacenamiento. Los preparados de alimentos y los manej adores, sin embargo, pueden sólo estar preocupados acerca de los nivele de bacterias 107 y superiores por la preocupación d enfermedades . Los hospitales por otro lado están tratand pacientes típicamente quienes ya están con el sistema inhum comprometido en alguna manera, ya sea debido a una enfermedad, cirugía. El personal del hospital puede por tanto esta preocupado acerca de niveles mucho más bajos de bacterias que l mayoría de otras industrias y pueden potencialmente beneficiars de una concentración de tinte indicadora confeccionada para sus niveles específicos a fin de reducir el riesgo de infección par pacientes susceptibles.

Ejemplo 9: Prueba de indicador de bacterias co una variedad de microorganismos incluyendo bacterias, moho, hongos : En la misma manera como se describió previamente, una toalla celulósica fue usada como un substrato sobre el cua fueron puestos con pipeta las bacterias y otros microorganismos. Fueron puestos con pipeta 107 de CFU/ml de S. aureus, C. albicans (hongo) , G. vaginalis, E. coli, P. aeruginosa, y L. acidophilus sobre la toalla (100 µ? cada una) . Además, 105 de A. niger (un moho común) también fue puesto con pipeta sobre l toalla. La solución de tinte Reichardt (160 miligramos en 10 m de acetonitrilo) fue entonces agregada en partes alícuotas de 1 µ? a cada punto y los números de gotas necesarias par establecer un color persistente fueron contados.

La cantidad de tinta requerida para mantener u color morado persistente para cada organismo se proporcionó e la Tabla 3. La reacción más fuerte fue observada con L. acidophilus, seguida por S. aureus, G. vaginalis, E. coli, P. aeruginosa, C. albicans, y finalmente ?. niger. Aún cuand parece haber una reacción fuerte para el S. aureus gram-positivo como para el G. vaginalis gram-negativo, las cantidades requeridas para alcanzar una reacción de estado estable fueron diferentes para varios tipos de bacterias y patógenos.

Tabla 3: Análisis Volumétrico de Varios Microorganismos con Tinte Reichardt Ejemplo 10: Prueba de Indicador de Tinte Reichardt con Componentes de Pared-Celda Bacterial: Una vista interior a cómo ésta tecnología de indicador trabaja fue obtenida mediante el utilizar moléculas comúnmente encontradas en las paredes de celda de las bacterias. Aún cuando hay alguna comunidad en los compuestos que comprenden las superficies de bacterias gram-positivas y gram-negativas , su arreglo y composición química difiere una de otra. Las bacterias gram-negativas tienen una membrana recubierta con lipopolisacárido (LPS) . El lipopolisacárido presta una carga negativa neta a la superficie de la bacteria gram-negativa y contribuye a su patogénesis. La bacteria gram-positiva está recubierta con una capa de tipo de hoja péptidoglican, o mureína gruesa. Las hojas fueron formadas de moléculas de N-acetilglucosamina y N-ácido acetilmurámico alternantes. Los ácidos teicoicos también son encontrados en las bacterias gram-positivas y pueden ser vinculados al ácido N-acetil murámico. Aún cuando las bacterias gram-negativas también tienen péptidoglican, la capa sobre la bacteria gram-positiva es mucho más gruesa. Además, la capa péptidoglican de bacterias gram-negativas está localizada debajo de la capa LPS, haciendo menos accesible desde la superficie.

Sobre una toalla de papel SCOTT® fueron colocadas las soluciones de lipopolisacárido detoxificado derivado de E. coli (Componente Lípido A removido) , ácido lipoteicóico derivado de Steptococcus faecalis, lipopolisacárido derivado de E. coli, y ácido murámico. Con la excepción de LPS puro, todas las soluciones fueron preparadas en 5% (peso/peso) , 1% (peso/peso) , y concentraciones de 0.2% (peso/peso). El LPS puro fue preparado en 0.1% (peso/peso), 0.02% (peso/peso), y 0.004% (peso/peso) por razones de seguridad. El tinte Reichardt (160 mg en 10 mL de acetonitrilo) fue agregada en 10 µ? de partes alícuotas a cada punto y la cantidad de tinta requerida para producir un color persistente fue registrada. El experimento inverso también se llevó a cabo en donde los compuestos de pared de celda fueron colocados sobre un punto de tinte sobre la toalla de papel.

El ácido murámico produjo la reacción más fuerte, resultando en una decoloración casi instantánea del tinte en ambas colocaciones experimentales . El otro de los compuestos causó una decoloración eventual del tinte, pero no pareció reaccionar tan fuertemente como el ácido murámico. Debido a que el ácido murámico se encuentra en concentraciones mayores en las bacterias gram-positivas , éstos resultados demuestran el potencial del tinte para no sólo dar datos CFU/mL, siendo también el potencial de distinguir entre bacterias gram-positivas y gram-negativas basadas sobre la resistencia y velocidad de la reacción.

Ejemplo 11: Prueba de Componentes relacionados con Pollo: El indicador de tinte Reichardt se ha mostrado porque tiene alta sensibilidad a los microbios que crecen sobre la carne de pollo sin procesar que se ha almacenado a la temperatura ambiente. Con consideración al potencial de positivos falsos, sin embargo, se hizo necesario el probar la respuesta del indicador a otros componentes del fluido de pollo, tal como los lípidos y proteínas. El caldo de pollo enlatado fue utilizado como un control que puede contener productos derivados de pollo tales como lípidos, proteínas, etc., para verificar las interferencias potenciales de éstos materiales que ocurren naturalmente .

El Caldo de Pollo Swanson® recientemente abierto fue puesto con pipeta sobre una superficie de placa caliente y se secó y limpió con una toalla SCOTT®. El jugo del pollo sin procesar que se había almacenado a la temperatura ambiente por varios días también fue transmitido con pipeta sobre la placa caliente y se secó y limpio como un control positivo. El indicador de tinte Reichardt (160 miligramos en 10 mi de isopropanol) fue rociado sobre la superficie y fue claro que sólo el lado conteniendo el jugo de pollo añejado (y por tanto con bacteria) fue decolorado. De éste experimento puede ser concluido que en el caso del pollo, en verdad es la presencia de los microbios la que activa la respuesta de decoloración y no algún otro componente tal como las grasas o proteínas de pollo.

Ejemplo 12: Efecto de la Base Fuerte sobre la Decoloración de Tinte Reichardt: Los resultados preliminares en relación a la interacción del tinte Reichardt con componentes de pared de célula tal como el ácido murámico, así como el trabajo dirigido a identificar los positivos falsos potenciales sugirieron qu una reacción con ácidos puede contribuir a la decoloración de tinte Reichardt. Esto llevó a una especulación de que un reacción de base-ácido puede jugar en parte en el cambio d color observado. Un experimento para probar el efecto de un base fuerte sobre el tinte Reichardt decolorado fue planeado.

Varias gotas del tinte Reichardt (160 miligramo en 10 mi de acetonitrilo) fueron puestos con pipeta sobre un toalla SCOTT® y se dejaron secar. Dos compuestos conocido porque causan cambios de color (ácido acético y el amortiguado Aldrich pH 2.0) fueron cada uno puestos sobre dos de los punto los cuales llevaron a una rápida decoloración del tinte. Un gota de 1 N de NaOH fue entonces transmitido con pipeta sobr uno de cada uno de los puntos, provocando una rápid decoloración. El color azul/morado del tinte Reichardt regres después de que el 1 N de NaOH fue agregado.

Un segundo experimento se llevó a cabo usando e rociado indicador para corroborar éstos resultados. El jugo d pollo sin procesar añejado fue transmitido con pipeta sobre l superficie de placa caliente en un patrón fácilment reconocible. La superficie fue secada con papel secante y s roció con un rociado de indicador de tinte Reichardt (16 miligramos en 10 mi de acetonitrilo) , provocando la decoloració del tinte en la forma exacta del patrón del jugo de pollo. Un gota de 1 N de NaOH fue entonces colocada sobre el área que fu previamente decolorada, llevando a la re-coloración de ese punto pequeño. Esto fue repetido con otra área.

Para probar la posibilidad- de que 1 N de NaOH estaba simplemente actuando sobre la bacteria y no sobre el tinte, el jugo de pollo añejado y un molar de NaOH fueron mezclados en proporciones iguales y se dejaron permanecer por 30 segundos . Ésta mezcla entonces fue usada para crear otro patrón idéntico (aún cuando más pequeños) . La solución provocó una decoloración rápida del tinte Reichardt, sin embargo, el color regresó con la adición de 1 N de NaOH.

Ejemplo 13: Prueba de Etiquetas Adhesivas recubiertas de Tinte Reichardt con Fluido Vaginal Infectado-Vaginosis Bacterial (BV) y Normal: Considerando la prevalencia alta de las infecciones vaginales de origen bacterial, se llevó a cabo un experimento para determinada respuesta de las etiquetas adhesivas recubiertas de tinte Reichardt a muestras de fluido vaginal saludable (pH bajo, sin infección bacterial) , un pH positivo/Vaginosis Bacterial negativa (BV) (sin infección bacterial, pero superior al pH normal) , y muestras de fluido vaginal de pH positivo / BV positivo (superior que el pH normal y la infección bacterial conocida) . Una hoja de etiquetas adhesivas fue recubierta con cepillo con dos concentraciones diferentes de solución de tinte Reichardt (160 mg / 10 mL de acetonitrilo, 80 mg / 10 mL de acetonitrilo, 40 mg / 10 mL de acetonitrilo, 20 mg / 10 mL de acetonitrilo) . Una etiqueta adhesiva de cada concentración fue probada con muestras de fluido vaginal normal, positivo BV / positivo pH, y negativo BV / positivo pH.

El fluido vaginal normal dio la decoloración más aguda del tinte, presumiblemente debido a la combinación de lactobacilos y pH bajo. La muestra de BV / pH positivo exhibió la decoloración siguiente más aguda, debido a la presencia de números grandes de bacterias BV. La muestra BV negativa / pH positiva sólo decoloro débilmente el tinte, quizás debido a la cantidad menor de lactobacilos que en la muestra normal. Los tres estados de decoloración fueron fácilmente distinguibles, sugiriendo que puede haber un diagnóstico potencial para ésta tecnología dentro del campo de la salud vaginal.

Ejemplo 14: Prueba de Superficie Común con un Rocío de Indicador de Tinte Reichardt: Fue muy conocido que las bacterias pueden sobrevivir sobre superficies secas por horas, sino es que por días. La capacidad de identificar las bacterias y otros microbios sobre superficies comunes y alertar a los consumidores o trabajadores de la contaminación ayudaría a la limpieza y desinfección y ayudaría a minimizar el esparcimiento de infección.

Como se mostró en la Figura 10, un tablero de computadora viejo fue usado como una superficie de "el mundo real" para probar el rociado de indicador microbial (10A) . El tinte Reichardt fue disuelto en isopropanol (160 miligramos en 10 mL de isopropanol) y se sujetó a un dispositivo de rociado a base de aerosol. El teclado fue entonces rociado con la solución indicadora (10B) .

Rociando el tablero con la solución de indicador de tinte Reichardt causó una decoloración rápida del tinte en ciertas áreas (10C) . Es interesante que sólo ciertas áreas o teclas mostraron contaminación, permitiendo la identificación específica de las teclas que estaban altamente ensuciadas, tal como la almohadilla de números. Como los teclados son usados muy frecuentemente, pero son raramente limpiados, ésta superficie en verdad proporcionó una vista de los niveles microbiales en las superficies de mundo real.

Ejemplo 15: El Uso de un Surfactante para Mejorar la Sensibilidad del Indicador Bacterial: Una solución del tinte Reichardt (80 mg / 10 mL de acetonitrilo) y TWEEN® 80 (200 µL) de surfactante de polioxietileno (de Fischer Scientific, de Pittsburg, Pennsylvania) fue preparado. Ésta solución fue entonces usada para recubrir una superficie de cerámica (Figura 119 y se dejó el secar al aire. Una segunda solución del tinte Reichardt (80 mg / 10 mL de acetonitrilo) sin surfactante se dejó sobre la superficie y se permitió secar al aire también (11A) . Después del secado, una gota de jugo añejado de pollo conocido por tener una alta cuenta bacterial fue colocada sobre cada área recubierta (11B) . El área conteniendo el surfactante TWEEN® 80 (11C) decoloró a una tasa mucho más rápida (>20-30 segundos) cuando se comparó al área que no contuvo el surfactante TWEEN® (11D) . Además, la adición del surfactante TWEEN® permitió una remoción fácil del tinte desde la superficie. La adición de una cantidad pequeña de agua permitió una remoción completa de la superficie mientras que la adición de agua a ése punto que no contuvo el surfactante no mejoró la facilidad de remoción desde la superficie.

Ejemplo 16: Importancia de Elección del Solvente: El comportamiento de los recubrimientos de tinte Reichardt hechos usando varios solventes fue evaluado.

Las soluciones de tinte Reichardt en acetonitrilo, isopropanol, y xilenos fueron preparadas y las soluciones fueron usadas para recubrir las toallas de rollos para cocina SCOTT® y se dejaron secar al aire (Figura 12A y 12D) . Las toallas tratadas tuvieron 100 µ? de partes alícuotas de S. aureus colocadas sobre éstas (12B,E) y el recubrimiento se observó respecto de un cambio de color. Sólo el recubrimiento a base de solución de acetonitrilo tuvo una rápida decoloración cuando la suspensión bacterial fue colocada (12C) . El tinte Reichardt fue observado por no tener un color parejo cuando se disolvió en acetonitrilo. No fue observado un cambio de color visible con los otros dos recubrimientos de solvente (12F) .

Los inventores han encontrado que la concentración del tinte Reichardt puede ajustarse de manera que el isopropanol pueda ser utilizado como un solvente para el tinte. Aun cuando el color del tinte es menos intenso que cuando se ve con acetonitrilo, la decoloración en respuesta a la contaminación microbial es observada fácilmente y rápidamente.

Ejemplo 17: Tinte de N-docosil-merocianina recubiertos sobre tela de algodón: La película transparente cubriendo la mitad de un pollo fresco sobre una charola de poliestireno (del supermercado) fue almacenado a la temperatura ambiente por tres semanas. Los jugos amarillo pálido que se recolectaron sobre la charola de poliestireno fueron recolectados usando una pipeta y se usaron para pruebas . 47 mg de l-docosil-4- (4-hydroxiestirilo) -bromuro de piridinio (de Aldrich Chemical) fueron mezclados con 10 g de dimetilformamida . Una cantidad pequeña de sólidos permanecieron después de la agitación y se dejaron asentar. El fluido súper nadante naranja fue puesto en gotas sobre la tela de algodón tejida de peso base (29.2 cm x 20.3 cm 6.-888 gramos) para hacer círculos de color naranj a-amarillo . Una gota de 1N de solución de hidróxido de sodio fue agregada al punto de naranj a-amarillo sobre la tela de algodón, cambiando el color de naranja-amarillo a un naranja rosado.

El jugo de pollo añejado fue puesto en puntos sobre los puntos amarillo-naranj a de la tela de algodón, produciendo un cambio de color a un amarillo muy pálido. El cambio de color fue rápido sobre el algodón. En forma similar, el jugo de pollo añejando fue puesto sobre las áreas rosado-naranja sobre el algodón (tinte + solución NaOH) provocando un cambio de color similar de rosado-naranj a a amarillo muy pálido.

Ejemplo 18: N-metilmerocianina recubierto sobre toalla de papel de cocina y orina añejada: La orina humana de mujer fue recolectada y almacenada en un frasco de vidrio a la temperatura ambiente por 8 días. El tinte de N-metil merocianina de la siguiente estructura fue sintetizado como se describió arriba. 0.5 g fueron disueltos en 20 mi de agua deionizada y se recubriero sobre una toalla de papel de rollo de cocina SCOTT® mediante e sumergir la toalla adentro de la solución, dejando que el exces escurriera, y entonces permitiendo a la toalla recubierta e secado a las condiciones ambiente. La toalla de papel fu manchada de un color naranja profundo por el tinte. orina añejada fue dejada caer sobre la toall de color naranja para dar un cambio de color inmediato d naranja profundo a amarillo pálido. Como un control, la orin añejada fue filtrada a través de un filtro de 0.2 mieras par remover bacterias y otros microbios. Después de la filtración, la orina añejada no causó un cambio de color cuando se puso e gotas sobre la toalla sugiriendo que los microbios fueron lo responsables por provocar el cambio de color contra otro componentes en la orina añejada.

Ejemplo 19: N-metilmerocianina recubierta sobr toalla de cocina y orina añejada: La orina humana de mujer fue recolectada almacenada por 24 horas a 37° C. La orina de mujer estancada s espero que tuviera una carga bacterial de aproximadamente lxlO CFU / mi después del almacenamiento bajo éstas condiciones. El tinte de N-metil merocianina de la siguiente estructura 33 fue sintetizado como se describió anteriormente. 0.5 gramos fueron disueltos en 20 mi de agua deionizada y se recubrieron sobre una toalla de papel de rollo de cocina SCOTT® mediante el permitir a la toalla recubierta el secar a las condiciones ambiente. La toalla de papel fue manchada con un color naranja profundo por el tinte.

La orina añejada fue puesta sobre la toalla de color naranja para dar un cambio de color inmediato de naranja profundo a amarillo pálido. Como un control, la orina añejada fue filtrada a través de un filtro de 0.2 mieras para remover las bacterias y otros microbios. Después de la filtración, la orina añejada no provocó un cambio de color cuando se puso sobre la toalla sugiriendo que los microbios fueron responsables por provocar un cambio de color en contra de otros componentes en la orina añejada.

Ejemplo 20: Tinte de N-metilo merocianina recubierto sobre toallas de papel de cocina y movimientos intestinales de una mascota de pajarito: Las heces fecales de periquito australiano fueron recolectadas de periquito enjaulado, y se agitaron en aproximadamente 10 mi del agua de la llave doméstica de la ciudad de Atlanta. El tinte de N-metilo merocianina de la estructura 33 mencionada arriba fue sintetizado como se describió anteriormente. 0.5 gramos fueron disueltos en 20 mi de agua deionizada y se recubrieron sobre la toalla de papel de cocina en rollo SCOTT® mediante el sumergir la toalla en la solución, dejando al exceso escurrir fuera, y después permitiendo a la toalla recubierta el secar a las condiciones ambientales. La toalla de papel fue manchada de un color naranja profundo por el tinte (Figura 13A) .

Las gotas de heces fecales de periquito en suspensión en el agua de la llave fueron puestas en puntos sobre la toalla recubierta (13B) y produjeron un cambio de color inmediato de naranja profundo a amarillo pálido en donde la suspensión fue agregada (13C) . Como un control, el agua de la llave doméstica de la ciudad de Atlanta fue puesta en gotas sobre un área diferente de la toalla y mientras que el color fue diluido algo por el agua, el área permaneció naranja.

Ejemplo 21 (Profético) : Tintes indicadores usados en un recubrimiento: 1 gramo de hidroxipropil metil celulosa, 0.5 gramos de N-metilo merocianina de la estructura 33 fueron entonces disueltos en una mezcla de 10 gramos de agua y 10 gramos de alcohol de isopropilo con buena agitación. Ésta solución puede ser recubierta sobre película de poliéster y se deja secar a la temperatura ambiente para producir una película flexible recubierta capaz de detectar la presencia de los microbios .

Ejemplo 22 (Profético) : Tintes indicadores en un recubrimiento : 1 gramo de etilcelulosa, 0.25 gramos de N-metilo merocianina de la estructura 33 pueden ser disueltos en 20 gramos de tetrahidrofuran. Ésta solución puede ser recubierta sobre la película de poliéster y dejarse secar a la temperatura ambiente para producir una película flexible recubierta capaz de detectar la presencia de microbios.

Ejemplo 23: Dispositivo de flujo lateral: La membrana HF75 de nitrocelulosa de Millipore (de Millipore Corporation de Bilerica, Massachussets , Estados Unidos de América) fue laminada sobre una tarjeta de soporte de plástico (de Millipore Corporation) teniendo una longitud de aproximadamente de 30 centímetros. Sobre ambas la zona de detección y la' zona de control, se había desvestido una solución de 5 porciento por peso del tinte Reichardt en isopropanol. La membrana fue secada en un horno de laboratorio por 1 hora a una temperatura de 37.5° Centígrados. Después de que la tarjeta de membrana fue tomada del horno, una almohadilla de transmisión celulósica (Cat# CFSP203000 de Millipore Corporation) fue sujetada a un extremo de la membrana más cercana a la zona de control. El otro extremo de la tarjeta, usado para sujetar la almohadilla de muestra se cortó) . La tarjeta fue entonces rebanada en tiras de 4 milímetros para formar medias etiquetas.

Una vez que las medias etiquetas fueron preparadas, una solución de bacterias fue aplicada al extremo de la membrana de detección. La acción capilar jaló la solución y a las bacterias adentro de la zona de detección y un cambio de color fue notado en la zona de detección. El color de la línea de control permaneció igual a través de la prueba.

Ejemplo 24: Mejora de Ciclodextrina : Una toalla de papel SCOTT® de papel fue primero recubierta con hidroxipropilo-beta-ciclodextrina (de Cerestar Internacional, de Hammong, Indiana, Estados Unidos de América) en solución en agua (1 gramo en 20 mi) mediante el sumergido y el secado al aire a la temperatura ambiente. Cuando la toalla de papel recubierta se secó fue tratada con una solución de secado Reichardt en isopropanol (1 porciento por peso) y se permitió el secar al aire. La toalla secada fue de color morada/azul. Aquí la ciclodextrina perjudica la cristalización del tinte permitiendo que ocurra un color más vivido del tinte sobre la toalla de papel . Ésta toalla recubierta fue usada en una prueba con bacterias gram-negativas {E. coli) y se encontró a su vez incolora en menos de 5 segundos cuando una parte alícuota de 100 microlitros de medios conteniendo 10,000 CFU/ml fue aplicada a la toalla. Ésta decoloración se encontró que ocurre en la concentración de bacterias de 500 CFU/ml, aún cuando esto tomó tanto como 15 segundos. Por tanto mediante el detener al tinte de la cristalización, el tinte se cree que está presente sobre el substrato como moléculas singulares y por tanto la sensibilidad del tinte a los niveles de bacterias aumenta. Los inventores creen que mediante un uso cuidadoso de un recubrimiento (por ejemplo, cilodextrina) sobre la toalla ocurrirá un recubrimiento mono-molecular de tinte sobre la superficie del substrato y ocurrirá una sensibilidad máxima.

Ejemplo 25: Prueba de muestra seca: Una prueba usando la toalla de papel recubierta de tinte Reichardt con una muestra de bacteria "seca" , no en solución se llevó a cabo. Una muestra seca de una colonia de bacterias E. coli levantada de un plato petri agar conteniendo una serie de cultivos en crecimiento fue usada. Ésta muestra seca fue entonces frotada sobre una toalla de papel SCOTT® recubierta de tinte prehumedecida. El área en donde la colonia fue colocada y frotada se hizo incolora adentro de 1-5 segundos. Esto es similar a cómo una toalla de paño limpiador húmedo puede ser usada y se realizó bien.

Ejemplo 26: Prueba de Indicador de Blanqueador: Una mezcla del Tinte Reichardt y 3, 3', 5, 5'-tetrametilbencidina (TMB) fue recubierta sobre una toalla de papel SCOTT® y se dejó secar al aire. Una solución de blanqueador diluida fue aplicada a la toalla de papel la cual resultó en la decolorización del tinte y el TMB volviéndose de color naranja/amarillo. Esto mostró que un indicador de blanqueado puede ser construido en un paño limpiador indicando bacterias . En la prueba final, una toalla de papel SCOTT® teniendo un recubrimiento de tinte Reichardt y químicas TMB fue expuesta a la suspensión de bacterias E. coli con gotas. El área de toalla que se puso en contacto con la bacteria decoloró a un punto blanco en menos de 10 segundos. No fue observado el que se desarrollara un color naranja/amarillo .

Ejemplo 27: Un espectro de absorción UV-Vis de tintes de merocianina y suiteriónico : El tinte Reichardt fue usado sin una purificación adicional. Los tintes de N-n-hexilo y N-n-dodecil merocianina fueron sintetizados como se describió. Los solventes usados fueron obtenidos de Aldrich Chemical y fueron de la clase HPLC. Un Espectrofotómetro visible Shimadzu UV-1601 UV- Visible (de Shimadzu Corporation) fue usado para medir la absorción pico de longitud de onda más larga de los tintes en el rango de 400 a 800 nm, se disolvió en tres solventes diferentes, contenidos en tubos de cuarzo. La siguiente tabla contiene los resultados de la prueba con los solventes sobre el lado izcruierdo y los tintes a través de la parte superior.

Hexil Dodecil Tinte Merocianina Merocianina Reichardt Acetona 617.5 nm 617 nm 674 nm (Verde) (Verde) (Azulado Verde) Metanol 514 nm 522 nm 509 nm (Rojo) (Naranj a) (Naranja) Acetonitrilo 582 nm (Azul- 600 nm (Azul) 623 (Azul) Verdoso) Los tintes de merocianina también mostraron absorción cerca de 400 nm, en adición a la absorción de longitud de onda más larga, la cual alteró el color percibido. Claramente, con base en las mediciones espectroscópicas , estos tintes mostraron cantidades grandes (> 10 nm) en una absorción pico de longitud de onda máxima entre éstos tintes de detección de microbios cuando se disolvieron en diferentes solventes.

Ejemplo 28: Detección de Virus La capacidad de un cromógeno para detectar la presencia de un virus de acuerdo con la presente invención fue demostrada. El virus de polio tipo 1, el Virus Herpes Simple (HSV-1) , el Rinovirus, la rubéola, vacuna, y la influenza A fueron preparadas e inoculadas en células de riñon de mono embriónico MA-104 propagadas y alimentadas con el Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) , complementado con suero de chivo fetal a una concentración de 5% e incubado a 37° Centígrados + Io Centígrado en presencia de 5% de C02 por 6 días. La preparación viral fue detectada por observación de microscopio de las hojas de célula infectadas para la desintegración celular (efecto citopático, CPE) , tal como redondeado, rajadura, lisis, piqnósis, etc., como se observó en por lo menos 50% de la hoja de célula. La citotoxicidad fue medida como la extensión de la desintegración celular como se produjo por el agente solo sin el virus. El virus fue graduado usando diluciones de serie de 10 veces en DMEM, 4 duplicados de cultivos MA 104 por dilución, cada duplicado inoculado con 0.1 mililitros de dilución de virus. La extensión de la duplicación viral fue calculada como la dosis-50% infecciosa de cultivo de tisú (TCID 50) como se determinó por el método de Reed y Muench.

Las etiquetas adhesivas recubiertas de tinte Reichardt (160 miligramos / 10 mililitros de acetonitrila, 80 miligramos / 10 mililitros de acetonitrilo, 40 miligramos / 10 mililitros de acetonitrilo, y 20 miligramos / 10 mililitros de acetonitrilo) fueron usadas como la superficie de prueba. 50 microlitros de virus no diluido (TCID50 10"8 virus de Polio/mL; TCID50 10"7 HSV-l/mL; TCID50 10~7 Rinovirus/mL; TCID50 10"6 virus de viruela/mL; TCID50 10"6 vacuna/mL y TCID50 10~7 influenza/mL) en un medio fue goteado sobre cada etiqueta adhesiva y se dejo permanecer por tres minutos antes de remover la gota con un hisopo de algodón. Para el Rinovirus y el virus de Polio, los cuales fueron diluidos en ambos medios y agua salada, las partes alícuotas de medios solos, medio de cultivo de célula libre de virus y el agua salada de cultivo de célula libre de virus fueron utilizados como muestras de control y también se dejaron permanecer por tres minutos antes de frotar con hisopo. Para los virus restantes (los cuales fueron usados sin diluir en su medio de cultivo original) sólo fue utilizado un medio de control.

Para el virus de Polio, el control de agua salada pareció interferir con el tinte, mientras que los medios no causaron cambio de color. Las diluciones de virus de Polio en un medio fueron por tanto usadas para el resto del experimento. El virus fue diluido en serie en un medio y los incrementos de diez veces y las partes alícuotas de 50 microlitros fueron aplicadas a cada etiqueta. Después de permanecer por 3 minutos, las gotas fueron frotadas con un hisopo fuera de la etiqueta. Para el Rinovirus, el medio de control se encontró que interfería, mientras que el control de agua salada no llevó al cambio de color del tinte. Por tanto, las diluciones en serie de diez veces del virus diluidas en agua salada fueron aplicadas a las etiquetas en partes alícuotas de 50 microlitros y se frotaron con un hisopo después de 3 minutos. Para el virus de Polio y el Rinovirus, las etiquetas adhesivas cambiaron color abajo a 10-6 (por ejemplo, la sexta en la serie de diluciones de diez veces) , indicando que las etiquetas recubiertas de tinte poseyeron sensibilidad hacia la detección de estos virus (decoloración ligeramente fuerte para el virus de Polio) . Para el HSV-1, influenza A, viruelas, y vacuna, sólo las gotas de 50 microlitros de virus (no diluido) fueron colocadas sobre las etiquetas adhesivas. La decoloración subsecuente observada fue comparada con aquélla observada para el medio de control libre de virus y también a un control positivo de Sal onella (108 CFU/mL) . Aún cuando la decoloración no fue tan fuerte como aquélla observada para la bacteria Salmonella, la exposición al virus HSV-1 no diluido llevó a una decoloración más fuerte de la etiqueta que aquélla observada para el virus de Polio Rinovurs . La decoloración en respuesta a la influenza A, l vacuna, y los virus de viruela fueron menores que aquéllo observados para otros virus .

Dos soluciones de tinte Reichardt (80 miligramos 10 mililitros de acetonitrilo con o sin 400 microlitros d surfactante TWEEN 80) también fueron preparados. Una gota d 100-microlitos de ya sea virus de Polio o Rinovirus (ambo diluidos en un medio) fueron puestos con pipeta sobre una toall de papel SCOTT® doblada y las gotas de tinte Reichardt fuero agregadas a cada uno de los puntos conteniendo el virus . E color fue rápidamente descargado de ambas soluciones conteniend surfactante y sin surfactante. El tinte fue eventualment agregado hasta que el color persistió (aproximadamente 9 gotas) . Los mismos controles de medio y agua salada mencionado previamente también fueron probados . Aún cuando los medio exhibieron alguna habilidad para decolorar el tinte, el agu salada presentó el mismo comportamiento de graduació previamente observado con el agua.

Ejemplo 29: Semi-Cuantificación de Contaminació Bacterial : La capacidad del tinte Reichardt para proporciona una información semi-cuantitativa en relación a la concentració de bacterias fue demostrada. Un substrato a base de pape (Neenah Bond™) (disponible de Neenah Paper, Inc. de Alpharetta Georgia) fue tratada inicialmente con una solución de tint Reichardt (80 miligramos / 10 mililitros de acetonitrilo mediante el sumergir el papel en el recubrimiento o cepilland el recubrimiento sobre el papel, y después colgando el pape para secar. Siete (7) gotas de concentraciones conocidas de aureus (101, 102, 103, 104, 105, 106, y 107 CFU por mililitro fueron puestas sobre la parte superior de cada hoja. Después d aproximadamente 2 minutos, las gotas fueron removidas y secada con papel secante revelando un cambio de color obvio en la concentraciones de S. aureus de 105 CFU/mL y arriba. La diferencias de color a concentraciones más bajas fueron meno distintas, particularmente para la hoja recubierta con cepillo.

Un estudio ciego fue entonces llevado a cabo. Par propósitos de prueba, una primera gota conteniendo 10 microlitros a una concentración de 106 CFU/mL fue colocada sobr una parte de una hoja recubierta con embebido conteniendo e tinte Reichardt. Una segunda gota conteniendo 100 microlitros una concentración de 105 CFU/mL fue colocada sobre una parte d una hoja recubierta con cepillo conteniendo el tinte Reichardt Finalmente, una tercera gota conteniendo S. aureus a un concentración de 104 CFU/mL fue colocada sobre parte de una hoj recubierta-sumergida conteniendo el tinte Reichardt. La concentraciones de estas tres gotas fueron desconocidas para d de los participantes del experimento. Después de aproximadament 2 minutos, las gotas fueron removidas y secadas. Usando l regiones de control, las concentraciones de cada muestra fueron cada una estimada visualmente por estas dos personas. Ambas personas estimaron correctamente la concentración de la primera muestra como siendo de 106 CFU/mL. Estas personas también adivinaron correctamente la concentración de 105 CFU/mL para la segunda muestra. Las personas, sin embargo, estimaron incorrectamente la tercera muestra como siendo de 103 CFU/mL. Se cree que ésta inexactitud se debió, por lo menos en parte a la diferencia relativamente baja en color de las regiones de control a concentraciones menores de 105 CFU/mL los presentes inventores creen, sin embargo, que la concentración del cromógeno y la uniformidad del recubrimiento puede ser seleccionada fácilmente para lograr resultados exactos a tales concentraciones bajas. En cualquier caso, debido a que las regiones de control proporcionan una diferencia de color más distinta a concentraciones superiores (por ejemplo, 105 CFU/mL o arriba) , se cree que los resultados exactos serán logrados a concentraciones altas más clínicamente relevantes.

Ejemplo 30: Cuantificación de Contaminación Bacterial : La capacidad del tinte Reichardt para proporcionar información cuantitativa en relación a la concentración de bacterias fue demostrada. Un substrato a base de papel (Neenah Bond™) (disponible de Neenah Paper, Inc. de Alpharetta, Georgia) y una etiqueta (disponible de Avery-Dennison) fueron inicialmente recubiertos con la solución de tinte Reichardt (80 miligramos / 10 mililitros de acetonitrilo) y se colgaron a secar. Las partes alícuotas (100 microlitros) de concentraciones conocidas de S. aureus, P. aeruginosa, y E. coli fueron usadas para crear las curvas de control para cada tipo de bacterias . Más específicamente, el indicador usado para crear las curvas de control para cada tipo de bacterias. Más específicamente, las tiras de indicador recubiertas con el tinte Reichardt fueron expuestas con cantidades en disminución de las partes alícuotas de bacterias. Fue usado un espectrofotómetro sostenido en la mano para después de la aplicación de cada parte alícuota determinar el valor "Delta E" (calculado usando los valores L* , A*, y B*) para cada concentración de CFU/mL. Los resultados están establecidos en la Tabla 4 (para papel) y en la Tabla 5 (para etiqueta) .

Tabla 4: Resultados para Substratos de Papel en Bitácora Delta E Delta E Delta E CFU/ml (S. aureus) (E. coli) (P. aeruginosa) 8 9.3642 7 11.73368 4.3483 4.9569 6 3.876455 3.2574 1.3193 5 2.447325 2.3320 1.7151 4 2.074175 3.0123 2.2358 3 1.866789 3.8228 1.7900 Tabla 5: Resultados para Substratos de Etiquetas De lo anterior, fueron generadas las curvas de detección estándar como se mostró en las Figuras 5-7 para S. aureus, P. aeruginosa, y E. coli, respectivamente. Como se mostró, cada tipo de bacteria cambió el color del substrat tratado con tinte en una forma ligeramente diferente, creando una curva estándar única. Después, las gotas de concentraciones de bacterias no conocidas fueron colocadas sobre las etiquetas el espectrofotómetro fue usado para medir la "Delta E" del color resultante. Los valores numéricos obtenidos para cada muestra desconocida se establecen abajo en las Tablas 6-7.

Tabla 6: Resultados para Substratos de Papel S. aureus E. coli P. aeruginosa log Delta E log CFU/ml log Delta E log CFU/ml log Delta E log CFU/ml CFU/ml ml (estimado) CFU/ml (estimado) CFU/ (estimado) (actual) (actual) (actual) 5 3.16136 5 3 1.3605 5 3 1.0267 5 Tabla 7 : Resultados para Substratos de Etiqueta Como puede verse de los datos numéricos, las concentraciones no conocidas fueron predecidas mediante el determinar a cuál valor Delta E conocido el valor Delta E del no conocido fue el más cercano. Aún cuando unos pocos de los resultados no fueron completamente exactos, los presentes inventores creen que mejorando la uniformidad del recubrimiento se mejorará además la exactitud de la detección.

Ejemplos Comparativos (no ejemplos de la invención) : El pollo añejado fue usado como una fuente de bacterias para ejemplos comparativos. La película transparente cubrió la mitad de un pollo fresco sobre una charola de poliestireno (del supermercado) y se almacenó a la temperatura ambiente por tres semanas. Los jugos amarillo pálido que se recolectaron en la charola de poliestireno fueron recolectados usando una pipeta y se usaron para las pruebas .

Ejemplo Comparativo 1: El jugo de pollo añejado fue puesto con gotas sobre una toalla de papel SCOTT®. La estructura de solución 34 Cl Ácido Verde 41 (de Aldrich Chemical) (0.008 mol / 1) (un ejemplo de un tinte hidroxiantraquinona) abajo fue puesto en gotas sobre el jugo de pollo añejado. No fueron observados cambios de color. Como un control, 100 miligramos de tinte Reichardt fueron suspendidos en 10 mililitros de acetonitrilo . Ésta suspensión fue puesta en gotas sobre el jugo de pollo añejado y se decoloro inmediatamente. 34 Ejemplo Comparativo 2: El jugo de pollo añejado fue goteado sobre una toalla de papel SCOTT®. La estructura de solución Cl Ácido Verde 25 (0.008 mol / I), 35 abajo, un ejemplo de tinte antraquinona, fue puesto en gotas sobre el jugo de pollo añejado. No fueron observados cambios de color. Como un control, 100 miligramos de tinte Reichardt fueron suspendidos en 10 mililitros d acetonitrilo . Ésta suspensión fue puesta con gotas sobre el jug de pollo añejado y se decoloro inmediatamente.

Ejemplo Comparativo 3 El jugo de pollo añejado fue puesto con gota sobre una toalla de papel SCOTT®. 50 miligramos de la estructur de Cl Ácido Rojo 37 (de Aldrich Chemical) , 36 abajo y un ejempl de un tinte aminoazo, fueron disueltos en 10 mililitros de agu deionizada. Ésta solución de tinte fue puesta con gotas sobre e jugo de pollo añejado sobre la toalla de papel. No fuero observados cambios de color. Como un control, 100 mg del tint Reichardt fueron suspendidos en 10 mi de acetonitrilo. Ést suspensión fue puesta en gotas sobre el jugo de pollo añejado se decoloró inmediatamente.

Ejemplo Comparativo 4 El jugo de pollo añejado fue puesto con gotas sobre una toalla de papel SCOTT®. 50 miligramos de Ácido Amarillo Cl 23 (también conocido como el colorante alimenticio tartracina) (de Aldrich Chemical) , estructura 37 abajo, y ejemplo de un tinte fenilpirazolona, fue disuelto en 10 mililitros de agua deionizada. Ésta solución de tinte fue puesta con gotas sobre el jugo de pollo añejado sobre la toalla de papel. No fueron observados cambios de color. Como un control, 100 miligramos de tinte Reichardt fueron suspendidos en 10 mililitros de acetonitrilo . Ésta suspensión fue puesta en gotas sobre el jugo de pollo añejado y se decoloró inmediatamente.

Ejemplo Comparativo 5: El jugo de pollo añejado fue puesto con gotas sobre una toalla de papel SCOTT®. El Ácido Rojo Cl 52 (sulforodamina B) , estructura 38 abajo, un ejemplo de un tinte xantano, la solución en agua fue puesta en gotas sobre el jugo de pollo añejado sobre la toalla de papel. No fueron observados cambios de color. Como un control, 100 miligramos del tinte Reichardt fueron suspendidos en 10 mililitros de acetonitrilo . Ésta suspensión fue puesta con gotas sobre el jugo de pollo añejado y se decoloró inmediatamente. 15 38 Ejemplo Comparativo 6: El jugo de pollo añejado fue puesto con gotas sobre una toalla de papel SCOTT®. 30 miligramos de Ácido Azul Cl 74 (también conocido como índigo Carmine) , estructura 39 abajo, (de Aldrich Chemical) , como un ejemplo de un tinte indigóide, fue disuelto en 10 mi de agua deionizada. Ésta solución de tinte fue puesta en gotas sobre el jugo de pollo añejado sobre la toalla de papel. No fueron observados cambios de color. Como un control, 100 miligramos de tinte Reichardt fueron suspendidos en 10 mililitros de acetonitrilo . Ésta suspensión fue puesta en gotas sobre el jugo de pollo añejado y se decoloró inmediatamente .

Como se apreciará por aquéllos expertos en el arte, los cambios y variaciones de la invención están considerados como que están dentro de la capacidad de aquéllos con una habilidad en el arte. Los ejemplos de tales cambios están contenidos en las patentes identificadas anteriormente, cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad en la extensión en que es consistente con ésta descripción. Tales cambios y variaciones se intentan por los inventores para que estén dentro del alcance de la invención. También deberá entenderse que el alcance de la presente invención no debe ser interpretado como limitado a las incorporaciones específicas descritas aquí, sino sólo de acuerdo con las reivindicaciones anexas cuando se leen a la luz de la descripción anterior.

Claims (22)

RE IVI ND I CAC I ONE S

1. Un método para detectar semi-cuantitativamente o cuantitativamente la presencia de un microbio en una muestra, el método comprende: poner en contacto un tinte de prueba con l muestra de manera que el tinte de prueba sufra un cambio de color detectado; y después, comparar el color del tinte de prueba co el color de un tinte de control, en donde el color del tinte de control corresponde a una concentración de microbios conocida.

2. El método tal y como se reivindica en l cláusula 1, caracterizado porque el tinte de prueba, el tinte de control o ambos son tintes solvatocrómicos .

3. El método tal y como se reivindica en l cláusula 1, caracterizado porque el tinte de prueba, el tinte de control o ambos son un tinte de merocianina.

4. El método tal y como se reivindica en l cláusula 3, caracterizado porque el tinte de merocianina tiene la siguiente estructura:

5. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el tinte de prueba, el tinte de control o ambos son un tinte suiteriónico .

6. El método tal y como se reivindica en la cláusula 5, caracterizado porque el tinte suiteriónico es un tinte de -fenolato betaina.

7. El método tal y como se reivindica en la cláusula 5, caracterizado porque el tinte suiteriónico es un tinte Reichardt.

8. El método tal y como se reivindica en la cláusula 5, caracterizado porque el tinte suiteriónico tiene la siguiente estructura: en donde, n es 0 o más; y x es oxígeno, carbón, nitrógeno, o sulfuro.

9. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el color del tinte de prueba es comparado al color de una pluralidad de tintes de control, en donde los tintes de control cada uno tienen un color que corresponde a diferentes concentraciones de microbios conocidas.

10. Un método para detectar semi-cuantitativamente o cuantitativamente la presencia de un microbio en una muestra, el método comprende: poner en contacto un tinte de prueba solvatocrómico con la muestra de manera que el tinte de prueba sufra un cambio de color detectable; y después, comparar el color del tinte de prueba con el color de una pluralidad de tintes de control solvatocrómico, en donde los tintes de control cada uno tienen un color que corresponde a diferentes concentraciones de microbios conocidas.

11. El método tal y como se reivindica en la cláusula 10, caracterizado porque el tinte de prueba y los tintes de control son tintes de merocianina, tintes de N-fenolato betaína, combinaciones de los mismos.

12. El método tal y como se reivindica en la cláusula 10, caracterizado porque el tinte de prueba y los tintes de control son un tinte Reichardt.

13. El método tal y como se reivindica en cualquiera de las cláusulas precedentes, caracterizado además porque comprende medir la intensidad de color del tinte de prueba, el tinte o tintes de control, o las combinaciones de los mismos.

14. El método tal y como se reivindica en la cláusula 13, caracterizado porque la intensidad de color del tinte de prueba es proporcional a la concentración del microbio adentro de la muestra de prueba.

15. El método tal y como se reivindica en la cláusula 13, caracterizado además porque comprende generar una curva de detección mediante el dibujar la intensidad de color del tinte de control o tintes para una pluralidad de concentraciones de microbios conocidas.

16. El método tal y como se reivindica en la cláusula 15, caracterizado además porque comprende correlacionar la intensidad de color del tinte de prueba a una concentración de microbios sobre la curva de detección.

17. El método tal y como se reivindica en cualquiera de las cláusulas precedentes, caracterizado porque un substrato define una zona de detección que contiene el tinte de prueba y una zona de control que contiene el tinte o tintes de control . i

18. El método tal y como se reivindica en cualquiera de las cláusulas precedentes, caracterizado porque el cambio de color ocurre en menos de alrededor de 5 minutos, y preferiblemente en menos de 1 minuto.

19. Un substrato para detectar semi-cuantitativamente o cuantitativamente la presencia de un microbio en una muestra, el substrato define una zona de detección y una zona de control, en donde el tinte de prueba está contenido dentro de la zona de detección que es capaz de sufrir un cambio de color detectable en la presencia del microbio, y en donde la pluralidad de tintes de control están contenidos dentro de la zona de control, el color de cada tinte de control corresponde a una concentración de microbios conocida diferente .

20. El substrato tal y como se reivindica en la cláusula 19, caracterizado porque el tinte de prueba, los tintes de control, o las combinaciones de los mismos son tintes solvatocrómicos .

21. El substrato tal y como se reivindica en la cláusula 19, caracterizado porque el tinte de prueba, los tintes de control, o las combinaciones de los mismos son un tinte merocianina, un tinte N-fenolato betaína, o combinaciones de los mismos .

22. El substrato tal y como se reivindica en la cláusula 19, caracterizado porque el tinte de prueba, los tintes de control, o las combinaciones de los mismos son tintes Reichardt. RE S UMEN Se proporciona un método' para detectar semi-cuantitativamente o cuantitativamente la presencia de un microbio en una muestra. El método utiliza un tinte de prueba que sufre un cambio de color detectable en la presencia de uno o más microbios. Por ejemplo, en una incorporación, el tinte de prueba es un tinte solvatocrómico (por ejemplo, tinte Reichardt) que responde a las diferencias en polaridad entre los componentes de microbios (por ejemplo, una membrana de célula, citoplasma, etc.) y el ambiente afuera de la célula. Alternativamente, cualesquier otros mecanismos pueden ser completamente o parcialmente responsables por la interacción entre el tinte y el microbio, tal como las reacciones a base de ácido, las reacciones de reducción-oxidación, y otras. Sin importar el color del tinte de prueba puede ser comparado al color del tinte de control, en donde el color del tinte de control corresponde a una concentración de microbios conocida.