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MX2007005818A - Vectores recombinantes de la influenza con unidades de transcripcion en tandem. - Google Patents

Vectores recombinantes de la influenza con unidades de transcripcion en tandem.

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MX2007005818A
MX2007005818A MX2007005818A MX2007005818A MX2007005818A MX 2007005818 A MX2007005818 A MX 2007005818A MX 2007005818 A MX2007005818 A MX 2007005818A MX 2007005818 A MX2007005818 A MX 2007005818A MX 2007005818 A MX2007005818 A MX 2007005818A
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MX
Mexico
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transcription
poly
influenza virus
linked
cdna
Prior art date
Application number
MX2007005818A
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English (en)
Inventor
Yoshihiro Kawaoka
Gabriele Neumann
Original Assignee
Wisconsin Alumni Res Found
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

La invencion proporciona una composicion para preparar el virus de la influenza, por ejemplo, en la ausencia de un virus cooperador, utilizando vectores que incluyen casetes de trascripcion en tandem que contienen los promotores Po1I y/o Po1II.

Description

VECTORES RECOMBINANTES DE LA INFLUENZA CON UNIDADES DE TRANSCRIPCIÓN EN TÁNDEM ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las epidemias y pandemias de influenza continúan reclamando vidas humanas e impactan la economía global. En los Estados Unidos únicamente, la influenza provoca un estimado de 50,000 muertes al año (Thompson et al., 2003), mientras que las pandemias globales pueden dar como resultado millones de muertes relacionadas a la influenza. Un ejemplo clásico es la denominada "influenza española" la cual mató un estimado de 40-50 millones de personas en todo el mundo entre 1918-1919 (Potter, 1998). La amenaza impuesta por el virus de la influenza ha sido además elevada con las introducciones recientes de los virus de la influenza aviar en la población humana. Se pensó por mucho tiempo que los virus de la influenza aviar no eran directamente transmisibles a los humanos y provocaban brotes letales. No obstante, esta percepción cambió en 1997, cuando 18 residentes de Hong Kong fueron infectados por un virus de la influenza completamente aviar del subtipo H5N1 , que dio como resultado 6 muertes (Subbarao et al., 1998; Claas et al., 1998). En los últimos pocos años, otros varios casos de transmisión directa de ave a humano fueron reportados (Peiris et al., 2004; Fouchier et al., 2004; Koopsman et al., 2004), incluyendo los brotes Ref.: 182020 continuos del virus de la influenza H5N1 altamente patógena en varios países asiáticos que ha reclamado 41 vidas de 54 individuos infectados en Enero 26 del 2005 (WHO, 2004) . Los números cada vez mayores de infecciones humanas por el virus H4N1, junto con una alta tasa de mortalidad y la posible transmisión de humano a humano, hace esencial el desarrollo de vacunas para estos virus. En los Estados Unidos, dos vacunas para la influenza están autorizadas para el uso humano: una vacuna inactivada y un virus de vacuna atenuada viva. La producción de vacunas del virus de la influenza confía en la reclasificación (Gerdil, 2003) que reclama la co-infección de células con una cepa circulante de tipo silvestre que proporciona los segmentos de hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) y el virus A/PR/8/34 (PR8) (un virus humano atenuado que proporciona propiedades de alto crecimiento en huevos) o bien un virus atenuado vivo que proporciona el fenotipo atenuado. La selección de los reclasificantes deseado "6+2" (por ejemplo, aquellos que contienen los segmentos de los genes de HA y NA de las cepas circulantes de tipo silvestre en el antecedente genético de PR8 o el virus atenuado vivo) consume tiempo y es problemático. Además, la necesidad para la reclasificación y selección, así la incapacidad para algunos virus reclasificantes para desarrollar a títulos altos, han dado como resultado retrasos en la producción de vacunas. Para los virus de la influenza A y B, los sistemas genéticos inversos altamente eficientes están ahora en estudio, lo que permite la generación de estos virus a partir del cADN clonado (Neumann et al., 1999; Hoffmann et al., 2002; Fodor et al., 1999; Hoffmann et al., 2000). En un sistema (Neumann et al., 1999), ocho plásmidos que codifican para ochos segmentos del RNA viral de la influenza bajo el control de las secuencias promotora y terminadora de la RNA-polimerasa I (Poli) son transíectados dentro de células eucarióticas junto con cuatro plásmidos impulsados por la RNA-polimerasa II (PolII) , para la expresión de las tres subunidades de polimerasa virales la nucleoproteína NP; estas cuatro proteínas son requeridas para iniciar la replicación y transcripción viral. Un sistema alternativo ha sido desarrollado (Hoffmann et al., 2000) que confiere ocho plásmidos en los cuales los cADNs virales están flanqueados por un promotor de la RNA-polimerasa I sobre un sitio y un promotor de RNA-polimerasa II sobre el otro sitio, lo cual permite que el vARN y mARN sean derivadas de la misma plantilla. Estos sistemas han permitido que 6+2 re-clasificantes sean manipulados por ingeniería genética sin necesidad para los procedimientos de re-clasificación y selección . Un número limitado de líneas celulares de mamífero están disponibles para la producción de vacunas del virus de la influenza. Estas incluyen las células de riñon caninas Madin-Darby (MDCK) (Brands et al., 1999; Palache et al., 1999; Halperin et al., 2002) y las células de riñon de mono verde Africano (Vero) (Kistner et al., 1998; Kistner et al., 1999a; Kistner et al., 1999b; Bruhl et al., 2000). Estas líneas celulares no pueden ser transfectadas con altas eficiencias, lo cual algunas veces limita su uso en sistemas de genética inversa para la producción de vacuna de virus de la influenza; no obstante, la generación del virus de la influenza en células Vero ha sido demostrada (Fodor et al., 1999; Nicolson et al., 2005). De este modo, lo que se necesita es un método mejorado para preparar el virus de la influenza. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona los vectores aislados (polinucleótidos) que incluyen unidades de transcripción en tándem (casetes de transcripción) incluyendo (i) casetes de transcripción basados en la RNA-polimerasa I (Poli) y/o casetes de transcripción basados en la RNA-polimerasa II (PolíII) y/o (iii) casetes de transcripción basados en la RNA PolI/II sobre uno o más vectores, por ejemplo plásmidos u otros, por ejemplo, vehículos de distribución de ácido nucleico, lineales. En particular, la invención proporciona los plásmidos útiles en la composición para preparar virus de RNA segmentados, de hebra negativa, infecciosos, cuyas composiciones tienen menos de ocho plásmidos que contienen genes vírales para la producción del virus. Por ejemplo, las composiciones de la invención pueden incluir uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete plásmidos que tienen genes de virus de la influenza, cuya composición, una vez introducida a una célula, produce virus de la influenza infecciosos. De este modo, en una modalidad, para proporcionar un sistema de genética inversa que reduzca el número de plásmidos para la generación del virus, hasta ocho casetes de transcripción de la RNA-polimerasa I para la síntesis de los RNAs del virus de la influenza, respectivos, fueron combinados sobre un plásmido, y hasta tres casetes de transcripción para tres subunidades de polimerasa del virus de la influenza sobre un plásmido. Como se describe más adelante en la presente, este procedimiento permitió la generación eficiente y robusta del virus de la influenza A en células Vero. Por ejemplo, la invención incluye un vector tal como un plásmido que incluye los casetes de transcripción en tándem tales como uno o más de los siguientes (i) un promotor de RNA Poli, un cADN para un RNA viral de la influenza (en orientación en sentido negativo o positivo) , un terminador de RNA Poli; (ii) un promotor de RNA PolII, un ADN para la proteína PB2 , PBl, PA y/o NP del virus de la influenza y una señal de poliadenilación (secuencia de terminación de la transcripción de RNA PolII) , y/o (iii) un promotor de RNA PolII, una secuencia de terminación de la transcripción de RNA Poli, un cADN para el RNA viral de la influenza (en orientación del sentido positivo) , un promotor de la RNA-polimerasa PoLI, una secuencia de terminación de la transcripción de RNA Polill. En las líneas celulares que pueden ser transfectadas eficientemente, estos procedimientos produjeron hasta 108 virus por ml del sobrenadante derivado de las células transfectadas. Las combinaciones de casetes y/o vectores de transcripción descritos en la presente son útiles para la generación de virus de la vacuna de la influenza, atenuados, vivos, por ejemplo, empleando los denominados "genes internos" (por ejemplo, PB2 , PBl, PA, NP, M y NS) combinados con los genes HA y NA derivados de los virus actualmente en circulación. Por ejemplo, los virus H5N1 no pueden ser desarrollados en huevos y así pues los casetes de transcripción que contienen esos genes son particularmente útiles para la generación de virus de vacuna H5N1. En una modalidad, la HA en un cásete de transcripción es un tipo A HA. En otra modalidad más, la HA en un c sete de transcripción es una HA tipo B. En otra modalidad más, los genes provenientes del virus de la influenza tipo C son empleados. En una modalidad, el promotor de RNA Poli es un promotor de RNA Poli humano. En una modalidad, el cADN de NA comprende además las secuencias de NB . En una modalidad, la composición incluye además un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de BM2 del virus de la influenza, enlazado a la secuencia de terminación de la transcripción de Poli. En una modalidad, al combinar los ocho casetes de transmisión de RNA Poli para la generación del virus de la influenza en un plásmido, el virus puede ser generado a partir de cinco plásmidos, por ejemplo, uno para la síntesis de los ocho vARNs y cuatro para la síntesis de las proteínas polimerasas y las proteínas NP . En otra modalidad más, al combinar los cuatro casetes de transcripción de RNA PolII para la síntesis de la polimerasa y las proteínas de NP sobre un plásmido, el virus puede ser generado a partir de dos plásmidos, por ejemplo, uno para la síntesis de los ochos vARNs y uno para la síntesis de las proteínas polimerasas y las proteína NP . En una modalidad adicional, al combinar tres casetes de transcripción de RNA PolII para la síntesis de las proteínas polimerasas sobre un plásmido, un cásete de transcripción de RNA PolII para la proteína NP sobre un plásmido, y un plásmido para la síntesis de los ochos vARNs , el virus puede ser generado a partir de tres plásmidos. En una modalidad más, al combinar cuatro casetes de transcripción de RNA poli para la generación de los vARN de HA, NA, M y NS y cuatro casetes de transcripción de RNA PolI/II para la generación de los vARNs y ARNs de PB2 , PBl, PA y NP sobre un plásmido, el virus de la influenza puede ser generado a partir de un plásmido. Cualquier promotor adecuado o secuencia terminadora de la transcripción puede ser empleada para expresar una proteína, por ejemplo, una proteína viral, una proteína de un patógeno no viral, o una proteína terapéutica, o un vARN. De este modo, en una modalidad, la invención proporciona los vectores aislados y purificados, por ejemplo, los plásmidos que expresan o que codifican proteínas del virus de la influenza, o expresan o codifican el vARN de la influenza, el vARN nativo y recombinante. Preferentemente, el promotor es adecuado para la expresión en una célula hospedera, particular, por ejemplo, células hospederas de ave o de mamífero tales como células caninas, felinas, equinas, bovinas, ovinas, o de primate incluyendo células humanas, o preferentemente, para la expresión en más de un hospedero. En una modalidad, uno o más vectores para la producción del vARN comprenden un promotor que incluye, pero no está limitado a, un promotor de RNA Poli, por ejemplo, un promotor de RNA Poli humano, un promotor dé RNA Polll, un promotor de RNA PolIII, un promotor T7 o un promotor T3. Para un vector para el vARN que incluye un promotor de RNA polll, el vector puede incluir opcionalmente secuencias ribozimas (ver PCT/US04/016649 , la descripción de la cual se incorpora por referencia en la presente) . Las secuencias de terminación de la transcripción preferidas para los vectores del vARN incluyen, pero no están limitadas, una secuencia de terminación de la transcripción de RNA Poli, una secuencia de terminación de la transcripción de RNA PolIII, o una ribozima. Cada promotor de RNA Polll en un plásmido o una combinación de plásmidos que van a ser empleados conjuntamente, puede ser el mismo o diferente. Cada promotor de RNA Poli en un plásmido o una combinación de plásmidos que van a ser empleados conjuntamente, puede ser el mismo o diferente. De igual modo, cada secuencia de terminación de la transcripción de RNA Polll en un plásmido o una combinación de plásmidos que van a ser empleados conjuntamente, pueden ser los mismos o diferentes. Además, cada secuencia de terminación de la transcripción de RNA Poli en un plásmido o una combinación de plásmidos que van a ser empleados conjuntamente, pueden ser las mismas o diferentes. El uso de menos de 12 plásmidos, por ejemplo menos de 10 plásmidos, puede producir títulos de 102 TCID50/ml, 103 TCID50/ml, 104 TCID50/ml, 105 TCID50/ml, 106 TCID50/ml, 107 TCID50/ml, 108 TCID50/ml, o más. En una modalidad, los cADNs para uno o más, por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho segmentos virales, cada uno flanqueado por las secuencias de terminación y promotor de RNA Poli, y este cásete de transcripción es luego flanqueado por un promotor de RNA Polll y una señal de poliadenilación de RNA Polll (ejemplificada por el gen de NP en la figura 4) . Este procedimiento produce el vARN (sintetizado por el RNA Poli) y el mARN (sintetizado por el RNA Polll) a partir de la misma plantilla. Los plásmidos adicionales para las síntesis de las proteínas virales ya no son de este modo requeridos, reduciendo el número de casetes de transcripción necesarios para la producción del virus de la influenza. La secuencia promotora de RNA Poli y/o la secuencia de terminación de la transcripción RNA Poli y/la secuencia promotora de RNA Polll y/o la secuencia de terminación de RNA Polll en cada cásete que codifica para el vARN/proteína, puede ser la misma o diferente que cualquier otro cásete. En una modalidad más, la invención incluye la combinación de dos plásmidos, uno para la generación del vARN de HA y vARN de NA, y uno para la generación del vARN de M y vARN de NS , y un plásmido que contiene cuatro casetes de transcripción de RNA PolI/II (para la síntesis de los vARNs y mARNs de PB2 , PBl, PA y de NP) , permitiendo la generación de virus para tres plásmidos, o un plásmido para los vARNs de PB2, PBl, PA, NP, M y NS , un plásmido para el vARN de HA, un plásmido para el vARN de NA, y un plásmido para la síntesis de la polimerasa y las proteínas NP, permitiendo la generación del virus a partir de cuatro plásmidos . En otra modalidad más, la invención incluye un plásmido para la generación de seis vARNs, por ejemplo, los vARNS de PB2 , PBl, PA, NP, M y NS, un plásmido para la generación de dos vARNs, por ejemplo, los vARNs de HA y NA, y cuatro plásmidos cada uno para la producción de la proteína para PB2 , PBl, PA y NP, permitiendo la generación del virus a partir de seis plásmidos. En una modalidad adicional, la invención incluye un plásmido para la generación de seis vARNs, por ejemplo, los vARNs de PB2 , PBl, PA, NP, M y NS , un plásmido para la generación de dos vARNs, por ejemplo, los vARNs de HA y NA, y un plásmido para la producción de la proteína para PB2 , PBl, y PA, y un plásmido para la producción de la proteína para NP, permitiendo la generación del virus a partir de cuatro plásmidos. Otros vectores útiles en las composiciones y/o métodos de la invención incluyen un ADN de interés, por ejemplo, un gen o estructura de lectura abierta (región de codificación) de interés para una proteína terapéutica o profiláctica, flanqueada por secuencias virales y opcionalmente una secuencia promotora Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli y/o una secuencia promotora Polll y un secuencia de terminación de la transcripción Polll. El ADN de interés puede estar en la orientación en sentido positivo o en sentido negativo con relación al promotor. El ADN de interés, ya sea en un vector para la producción de vARN o proteína, puede codificar para un epitopo inmunogénico, tal como un epitopo útil en la terapia o vacunas contra el cáncer o terapia génica. En una modalidad, el ADN de interés es el cADN del virus de la influenza de longitud completa, o una región de codificación del ADN del virus de la influenza, por ejemplo, el ADN de la influenza A (por ejemplo, cualquier gen de la influenza A que incluye cualquiera de los 15 subtipos de HA ó 9 subtipos de NA) , B o C (ver capítulos 45 y 46 de Fields Virology (Fields et al. (eds.), Lippincott-Raven Publ, Filadelfia, PA (1996), que son específicamente incorporadas por referencia en la presente) , aunque se considera que el o los genes provenientes de cualquier fuente, por ejemplo, provenientes de cualquier virus, pueden ser empleados en los vectores o métodos de la invención. Las composiciones de la invención pueden de este modo también incluir un cásete de la transcripción que comprende un promotor ligado a las secuencias del virus de la influenza 5' que comprende las secuencias de no codificación del virus de la influenza 5' ligadas a un ADN heterólogo de interés, por ejemplo, uno que no es encontrado y ligado a las secuencias de la influenza en la naturaleza o en un enlace diferente al que es encontrado en la naturaleza, enlazada a las secuencias del virus de la influenza 3 ' que comprenden las secuencias de no codificación del virus de la influenza 3' enlazadas a una secuencia de terminación de la transcripción. En una modalidad, el ADN de interés está operablemente enlazado a un promotor de la RNA-polimerasa y una secuencia de terminación de la transcripción de la RNA-polimerasa. En una modalidad, el ADN de interés comprende una estructura de lectura abierta que codifica para un polipéptido o péptido inmunogénico de un patógeno, o un polipéptido o péptido terapéutico. En una modalidad, el ADN de interés está operablemente enlazado a la secuencia promotora de Poli y una secuencia de terminación de la transcripción de Poli mientras que en otra modalidad más, el ADN de interés está operablemente enlazado a una secuencia promotora de Polll y a una secuencia de terminación de la transcripción de Polll. En otra modalidad más, el ADN de interés está operablemente enlazado a una secuencia promotora de Poli y a una secuencia de terminación de la transcripción de Poli y a una secuencia promotora de Polll y una secuencia de terminación de la transcripción de Polll. El cásete de transcripción comprende el ADN de interés puede estar sobre el mismo plásmido que al menos otro cásete de la transcripción o puede estar sobre un plásmido diferente que los otros casetes de la transcripción. Cuando se prepara el virus, el ADN de interés puede sustituir una estructura de lectura abierta del virus de la influenza, o una porción del mismo, o puede estar en adición a todas las otras estructuras de lectura abierta del virus de la influenza. La invención también proporciona un método para preparar virus, por ejemplo, el virus de la influenza, o distribuir un gen mediante la introducción de un ADN heterólogo de interés a un vector del virus de la influenza. Por ejemplo, el método incluye poner en contacto una célula con una pluralidad de casetes de transcripción de la invención, por ejemplo, secuencial o simultáneamente, por ejemplo, empleando una composición de la invención, en una cantidad efectiva para producir el virus de la influenza infeccioso. La invención también incluye el aislamiento del virus a partir de una célula puesta en contacto con la composición. De este modo, la invención proporciona además el virus aislado, así como una célula hospedera puesta en contacto con la composición o virus de la invención. En otra modalidad más, la invención incluye poner en contacto la célula con uno o más vectores, ya sea el vARN o vectores de producción de proteína, antes que otros vectores, ya sea el vARN o los vectores de producción de proteína. Los métodos de la invención permiten la fácil manipulación de los virus de hebra negativa tales como los virus de la influenza, por ejemplo, mediante la introducción de mutaciones atenuantes dentro del genoma viral. Además, debido a que los virus de la influenza inducen fuerte inmunidad humoral y celular, la invención mejora en gran medida estos virus como vectores de vacuna, particularmente en vista de la disponibilidad de las variantes naturales del virus, que pueden ser empleadas secuencialmente, permitiendo el uso repetitivo para la terapia génica. Los métodos para producir virus descritos en la presente, que no requieren la infección de virus auxiliares, son útiles en estudios de mutagénesis viral y en la producción de vacunas (por ejemplo, para el SIDA, la influenza, hepatitis B, hepatitis C, rinovirus, filovirus, malaria, herpes, y enfermedades de pie y boca), y vectores de terapia génica (por ejemplo, para el cáncer, el SIDA, adenosina-desaminasa, distrofia muscular, deficiencia de ornitina-transcarbamilasa y tumores del sistema nervioso central) . De este modo, es proporcionado un virus para el uso en terapia médica (por ejemplo, para una vacuna o terapia génica) . La invención también proporciona un método para inmunizar a un individuo contra un patógeno, por ejemplo, una bacteria, un virus, un parásito o un tumor maligno. El método comprende administrarle al individuo una cantidad de al menos un virus aislado de la invención, opcionalmente en combinación con un adyuvante, efectivo para inmunizar al individuo. El virus comprende el vARN que incluye una secuencia para un polipéptido codificado por el patógeno o un polipéptido específico del tumor. También se proporciona un método para aumentar o incrementar la expresión de una proteína endógena en un mamífero, que tiene una indicación o enfermedad caracterizada por una cantidad disminuida o una falta de proteína endógena. El método comprende administrarle al mamífero una cantidad de un virus aislado de la invención, efectiva para aumentar o incrementar la cantidad de la proteína endógena en el mamífero. El virus comprende el vARN para un polipéptido que aumenta o incrementa la cantidad de la proteína endógena. Preferentemente, el mamífero es un humano. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figuras ÍA, IB y 1C . Diagramas esquemáticos de los sistemas genéticos inversos establecidos. En el método de transfección de RNAP (figura ÍA) , proteínas NP y polimerasa purificadas son ensambladas en los RNPs con el uso del vARN sintetizado in vi tro . Las células son transfectadas con RNPs, seguido por la infección por el virus auxiliar. En el método de la RNA-polimerasa I (figura IB), un plásmido que contiene el promotor de la RNA-polimerasa I, un cADN que codifica para el vARN que va a ser rescatado, y el terminador de la RNA-polimerasa I es transfectado dentro de las células. La transcripción intracelular por la RNA-polimerasa I produce el vARN sintético, el cual es empaquetado en partículas virales de progenie después de la infección con el virus auxiliar. En la figura ÍA y figura IB), los virus transfectantes (por ejemplo, aquellos que contienen el RNA derivado del cADN clonado) , son seleccionados a partir de la población viral auxiliar. En el método mostrado en la (figura 1C) , los plásmidos que contienen el promotor de la RNA-polimerasa I, un cADN para cada uno de los ocho segmentos de RNA virales, y el terminador de la RNA polimerasa I son transfectados dentro de las células junto con los plásmidos de expresión de proteínas. Aunque los virus infecciosos pueden ser generados con plásmidos que expresan PA, PBl, PB2 y NP, la expresión de todas las proteínas estructurales remanentes (mostradas en corchetes) incrementan la eficiencia de la producción del virus dependiendo del virus generado. Figura 2. Diagrama esquemático de la generación de las construcciones de RNA-polimerasa I. Los cADNs derivados del virus de la influenza fueron amplificados mediante PCR, digeridos con BsmBl y clonados dentro de los sitios de BsmBl del vector pHH21 (E. Hoffman, Ph . D . thesis, Justus, Liebig-University, Giessen, Alemania) , que contiene el promotor de la RNA-polimerasa I (P) y el terminador de la RNA-polimerasa I de ratón (T) . El nucleótido timidina corriente arriba (5') de la secuencia terminadora (*T) representa el extremo 3' del RNA viral de la influenza. Las secuencias del virus de la influenza son mostradas en letras negritas. Figuras 3A, 3B y 3C. Diagramas esquemáticos de los plásmidos que poseen múltiples genes virales de la influenza. A) pTM-PolI-WSN-todo para la transcripción de los ocho RNAs virales de la influenza a partir de una plantilla. Las unidades de transcripción que comprenden el promotor de la RNA-polimerasa I humano (azul, promotor Pol I) , un cADN que codifica para un segmento viral de la influenza en orientación del sentido negativo (mostrada en colores diferentes) y el terminador de la RNA-polimerasa I de ratón (negro, terminador Poli) fueron combinados sobre un plásmido mediante el uso de sitios de reconocimiento únicos para las endonucleasas de restricción. B) pTM-PolI- SN-PB2-PBl-PA-NP-M-NS y pTM-PolI-WSN-HA para la transcripción de seis y dos RNAs del virus de la influenza a partir de un plásmido. Estos plásmidos y la terminología fueron generados como se describe para pTM-PolI-WSN-todo . C. pC-PolII-WSN-PB2-PBl-PA para la transcripción de los mARNs de PB2 , PBl, y PA, a partir de un plásmido. Las unidades de transcripción que comprenden un promotor de la RNA-polimerasa II (azul oscuro, promotor Polll) , por ejemplo, el promotor de la ß-actina de pollo, la región de codificación para la proteína viral respectiva (mostrada en diferentes colores) , y una secuencia de poliadenilación (oro, PoliA) fueron combinadas sobre un plásmido mediante el uso de los sitios de reconocimiento únicos para las endonucleasas de restricción. Figura 4. Unidad de transcripción de RNA-polimerasa I/II. El gen NP es flanqueado por las secuencias terminadoras de la RNA-polimerasa I (Poll-term) y la secuencia promotora de la RNA-polimerasa I (Poll-Prom) . Esta unidad es luego insertada entre un promotor de RNA polimerasa II, tal como el promotor CMV (CMV Pr) , y una señal de poliadenilación, tal como la señal de poliadenilación de hormona bovina de crecimiento (BGH poliA) . La figura 5. Plásmido que contiene cuatro unidades de transcripción de la RNA polimerasa I/II para la síntesis de los vARNs y mARNs de PB2 , PBl, PA y NP, y cuatro unidades de transcripción de la RNA-polimerasa I para la síntesis de los vARNs de HA, NA, M y NS . PII: promotor de la RNA polimerasa II (casilla sombreada), pA: señal de poliadenilación (casilla abierta); P:promotor de la RNA-polimerasa I (casilla negra grande), T:terminador de la RNA-polimerasa I (casilla negra pequeña) . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Como se utiliza en la presente, los términos "aislado y/o purificado" se refieren a la preparación, aislamiento y/o purificación in vi tro de una molécula de ácido nucleico tal como un plásmido de la invención, o un virus de la invención, de modo que éste no está asociado con las sustancias in vivo, o es sustancialmente purificada a partir de sustancias in vi tro . Una preparación del virus aislado es en general obtenido mediante el cultivo in vi tro y la propagación, y está sustancialmente libre de otros agentes infecciosos. Como se utiliza en la presente, "sustancialmente libre" significa por debajo del nivel de infección para un agente infeccioso particular utilizando métodos de detección estándares para ese agente. Un virus "recombinante" es uno que ha sido manipulado in vi tro, por ejemplo, utilizando técnicas de ADN recombinante, para introducir cambios al genoma viral, o de otro modo artificialmente generado. Como se utiliza en la presente, el término "ácido nucleico recombinante" o "secuencia o segmento de ADN recombinante" se refiere a un ácido nucleico, por ejemplo, al ADN, que ha sido derivado o aislado de una fuente, que puede ser subsecuentemente químicamente alterada in vi tro, de modo que su secuencia no es de origen natural o corresponde a las secuencias de origen natural que no están colocadas como éstas estarían colocadas en el genoma nativo. Un ejemplo del ADN "derivado" de una fuente, podría ser una secuencia de ADN que es identificada como un fragmento útil, y que es luego químicamente sintetizado en forma esencialmente pura. Un ejemplo de tal ADN "aislado" de una fuente sería una secuencia de ADN útil que es extirpado o removido de dicha fuente por medios químicos, por ejemplo, mediante el uso de endonucleasas de restricción, de modo que éste puede ser posteriormente manipulado, por ejemplo, amplificado para el uso en la invención mediante la metodología de ingeniería genética. Una "célula altamente transfectable" como se utiliza en la presente, es una célula donde las eficiencias de transfección con un plásmido simple alcanzan aproximadamente 95%, por ejemplo, como se mide por la expresión de proteína en células transfectadas y/o donde la transfección con más de 5 plásmidos con los genes virales de la influenza para la producción del virus de un virus de la influenza no atenuado, produce un título viral de al menos aproximadamente 106 TCID50/ml por el día 2 después de la transfección, o un virus atenuado produce un título viral de aproximadamente 102 TCID50/ml. Las células altamente transfectables ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, las células 293T. En contraste, una "célula con eficiencia de transfección reducida" como se utiliza en la presente, es una célula en donde las eficiencias de transfección con un plásmido simple son de menos de aproximadamente 50% y/o donde la transfección con más de 5 plásmidos con los genes virales de la influenza para la producción del virus de un virus de la influenza no atenuado, produce un título viral de menos de 3 x 105 TCID50/ml por 2 días después de la transfección. Las células ejemplares con eficiencia de transfección reducida incluyen, pero no están limitadas a las células Vero y células MDCK.
Virus de RNA en Sentido Negativo Los virus de RNA en sentido negativo son clasificados en siete familias (Rhabdoviridae, Paramyxoviridae , Filoviridae, Bornaviridae, Ortho yxoviridae , Bunyaviridae y Arenaviridae) que incluyen patógenos humanos comunes, tales como el virus sincitial respiratorio, virus de la influenza, virus de sarampión, y virus Ebola, así como virus animales con impacto económico mayor sobre las industrias de las aves de corral y el ganado (por ejemplo, el virus de la enfermedad del Newcastle y el virus de Rinderpest) . Las primeras cuatro familias están caracterizadas por genomas no segmentados, mientras que las últimas tres tienen genomas comprendidos de seis a ocho, tres o dos segmentos de RNA en sentido negativo, respectivamente. La característica común de los virus de RNA en sentido negativo es la polaridad negativa de su genoma de RNA; por ejemplo, el RNA viral (vARN) es complementario del mARN y por lo tanto no es infeccioso por si mismo. Con el fin de iniciar la transcripción y la replicación virales, el vARN tiene que ser transcrito en un vARN en sentido positivo o cRNA, respectivamente, pero el complejo de la polimerasa viral y la nucleoproteína; para los grupos en la influenza A, el complejo de la polimerasa viral está comprendida de las tres proteínas polimerasas PB2 , PBl y PA. Durante la replicación viral, el cRNA simple como una plantilla para la síntesis de nuevas moléculas de vARN. Para todos los virus de RNA de hebra negativa, las regiones de no codificación en los extremos 5' y 3' del vARN y del cRNA son críticas para la transcripción y replicación del genoma viral. De manera contraria a los transcriptos de mARN celulares o virales, el cRNA y el vARN no son ni encasquetados en el extremo 5 ' ni poliadenilados en el extremo 3 ' . Las funciones básicas de muchas proteínas virales han sido elucidadas bioquímicamente y/o en el contexto de la infección viral. No obstante, los sistemas genéticos inversos han incrementado dramáticamente nuestro conocimiento de los virus de RNA segmentados y no segmentados, de hebra negativa con respecto a su replicación viral y patogenicidad, así como al desarrollo de vacunas virales atenuadas vivas. La genética inversa, como el término se utiliza en la virología molecular, es definido como la generación de virus que posee un genoma derivado de los cADNs clonados (para una revisión, ver Neuman et al., 2002) . Virus de la influenza Los virus de la influenza A poseen un genoma de ocho RNAs virales en sentido negativo, de una sola hebra (vARNs) que codifican para un total de diez a once proteínas. El ciclo de vida del virus de la influenza comienza con el enlace de la hemaglutinina (HA) a los receptores que contienen ácido siálico en la superficie de la célula hospedera seguido por la endocitosis mediada por el receptor. El bajo pH en los endosomas tardíos dispara un cambio conformacional en la HA con lo cual se expone el extremo N de la subunidad HA2 (el denominado péptido de fusión) . El péptido de fusión inicia la fusión de la membrana viral y endosomal, y los complejos de proteína de matriz (Ml) y RNP son liberados hacia el citoplasma. Los RNPs consisten de la nucleoproteína (NP) , la cual encapsida el vARN, y el complejo de la polimerasa viral, que es formado por las proteína PA, PBl, y PB2. Los RNPs son transportados hacia el núcleo, donde tiene lugar la transcripción y la replicación. El complejo de la RNA-polimerasa cataliza tres reacciones diferentes. La síntesis del RNA con un casquete 5' y la estructura poliA en el extremo 3', de un RNA complementario de longitud completa (cRNA) y del vARN genómico utilizando el cADN como una plantilla. Los vARNs recién sintetizados, NP y las proteínas polimerasas son luego ensamblados dentro de las RNPs, exportadas desde el núcleo y transportadas hacia la membrana plasmática, donde ocurre la gemación de las partículas virales de progenie. La proteína neuraminidasa (NA) juega un papel crucial posteriormente en la infección por la eliminación del ácido siálico a partir de los sialiloligosacáridos, librando de este modo los viriones recién ensamblados de la superficie celular y previniendo la auto agregación de las partículas virales. Aunque el ensamblaje del virus involucra interacciones proteína-proteína-vARN, la naturaleza de estas interacciones es ampliamente desconocida. Aunque los virus de la influenza B y C son estructural y funcionalmente similares al virus de la influenza A, existen algunas diferencias. Por ejemplo, el segmento M del virus de la influenza B codifica para dos proteínas, Ml y BM2 , a través de un esquema de terminación-reinicio de cistrones en tándem, y el segmento de NA codifica para las proteínas NA y NB a partir de un mARN bicistrónico . El virus de la influenza C, el cual tiene 7 segmentos de vARN, confían los transcritos empalmados para producir proteína Ml , el producto del mARN no empalmado es proteolíticamente escindido para producir la proteína CM2. Además, el virus de la influenza C codifica para un HA-esterasa en vez de para las proteínas HA y NA individuales. Togotovirus Los togotovirus (THOV) representan un nuevo género en la familia de los Orthomyxoviridae. Estos son transmitidos por las garrapatas y han sido encontrados en animales domésticos, incluyendo camellos, cabras y ganado bovino. En consecuencia, los THOV pueden replicarse en garrapatas y células de vertebrados. El genoma del THOV comprende seis segmentos del RNA de una sola hebra, en sentido negativo. Las proteínas codificadas por los tres segmentos más grandes muestran homología significativa para las proteínas polimerasas PB2 , PBl, y PA del virus de la influenza. El segmento 5 codifica para una proteína relacionada al virus de la influenza NP . La glucoproteína THOV la cual es codificada por el segmento 4, no es homologa a la HA o NA del virus de la influenza, pero muestra similitud secuencial a la glucoproteína del baculovirus. Se piensa que el segmento más pequeño codifica para una proteína de matriz y no se asemeja a ninguna de las proteínas del virus de la influenza. Como el virus de la influenza, los extremos 3 ' y 5 ' del vARN son requeridos para la actividad del promotor y esta actividad está localizada en los 14 y 15 nucleótidos terminales de los extremos 3' y 5' del vARN, respectivamente . La síntesis del mARN del THOV es aprestada por las estructuras de casquete derivadas de la célula hospedera. No obstante, en contraste el virus de la influenza, únicamente las estructuras de casquete (sin nucleótidos adicionales) son escindidas de los mARNs celulares (Albo et al., 1996; Leahy et al., 1997; Weber et al., 1996). Los ensayos de escisión in vi tro revelaron que los extremos 5' y 3' del vARN son requeridos para la actividad endonucleasa (Leahy et al., 1998), pero la adición de un promotor de cRNA modelo no estimula la actividad de la endonucleasa (Leahy et al., 1998) , como ha sido mostrado para el virus de la influenza (Hagen et al., 1994). Una estructura de "gancho" ha sido propuesta para el THOV (Leahy et al., 1997; Weber et al., 1997), que es similar a la estructura de tapón de corcho propuesta para el virus de la influenza. Esta estructura de "gancho", no obstante, es únicamente encontrada el promotor vARN del THOV. Las secuencias promotoras de cRNA no permiten la formación de pares de bases entre las posiciones 2 y 9, y entre 3 y 8 en el extremo 5' del cRNA. Las alteraciones en las posiciones 3 y 8 para permitir el apareamiento de bases entre estos nucleótidos, estimula la actividad endonucleasa, que es una evidencia de apoyo fuerte de la estructura propuesta de "gancho" (Leahy et al., 1998). Además, esta estructura puede ser crucial para la regulación del ciclo de vida del THOV; el promotor del vARN, que forma la estructura de "gancho", puede estimular la actividad de endonucleasa de PB2 , con lo cual se permite la transcripción. El promotor del cRNA, en contraste, puede no formar la estructura de "gancho" y puede por lo tanto ser capaz de estimular la actividad de endonucleasa, dando como resultado de este modo la replicación. Bunyaviridae La familia Bunyaviridae incluye diversos virus que provocan las fibras hemorrágicas o encefálicas en humanos (por ejemplo, la fibra del valley Rift, Hantaan, La Crosse, y la fiebre hemorrágica de Crimen-Congo) . Los viriones esféricos y envueltos contienen tres segmentos de RNA en sentido negativo, de una sola hebra (revisado en Elliott, 1997). El segmento más grande (L) codifica para la proteína RNA-polimerasa viral (proteína L) , mientras que el segmento M codifica para las dos glucoproteínas virales Gl y G2 , y una proteína no estructural (NSm) . El segmento más pequeño (S) codifica para la proteína de nucleocápside (N) y una segunda proteína no estructural (NSs) . La replicación del virus y la transcripción del mismo tienen lugar en el citoplasma, y los viriones recién ensamblados sobresalen a través de las membranas del aparato de Golgi . Bridgen y Elliott (1996) han establecido un sistema de genética inversa para generar el virus Bunyamwera infeccioso completamente a partir de los cADNs clonados. Estos siguieron una primera estrategia descrita por Schnell et al. (1994) para el virus de la rabia: la transcripción intracelular de un cADN que codifica para el RNA antigenómico en sentido positivo (pero no para el RNA genómico en sentido negativo) en células que expresan la polimerasa viral y la nucleoproteína . Bridgen y Elliott (1996) infectaron las células HeLaT4+ con el virus de la vaccinia que expresa la polimerasa T7 , y transfectaron estas células con los plásmidos que expresan las proteínas codificadas con los segmentos S, M y L. Luego transfectaron estas células con tres plásmidos que codifican para los cADNs antigenómicos de longitud completa flanqueados por el promotor de la polimerasa T7 y la ribosima del virus de la hepatitis delta. Para incrementar el número de partículas del buniavirus con relación al número de partículas virales de las vaccinia, los autores utilizaron células de mosquito en las cuales el Bunyamwera se replica pero no el virus de la vaccinia. Este protocolo puede ser utilizado no solamente para manipular por ingeniería genética Bunyaviridae, sino también para generar virus reclasificantes que no pueden ser fácilmente obtenidos mediante la co-infección de células con diferentes cepas de Bunya viridae . Para estudiar los elementos promotores del bunyavirus y las proteínas vírales que son requeridas para la transcripción y la replicación, Dunn et al. (1995) clonaron el gen CAT en la orientación en sentido negativo entre las regiones no traducidas 5 ' y 3 ' del segmento de RNA de S de Bunyamwera. Las células fueron transfectadas con construcciones que expresan las proteínas codificadas por el segmento L y S y fueron luego transfectadas con el RNA transcrito in vi tro, el cual dio como resultado la actividad de CAT. El segmento S de bunyavirus codifica para dos proteínas, N y NSs, en estructuras de lectura traslapadas. Para determinar si estas dos proteínas son requeridas para la transcripción y replicación, las construcciones que expresan únicamente N ó S fueron probadas para la actividad de CAT.
La expresión de la proteína N, junto con la proteína L, dio como resultado actividad de CAT, mientras que ninguna actividad de CAT fue detectada con la construcción de expresión NSs. De este modo, las proteínas L y N son suficientes para la transcripción y replicación de un RNA similar al bunyavirus. Como con el virus de la influenza, las secuencias terminales de los RNAs de bunyavirus son complementarias y altamente conservadas. Se ha asumido por lo tanto que estos elementos secuenciales definen el promotor bunyaviral son cruciales para la actividad del promotor. La supresión de cinco nucleótidos en el extremo 3' del RNA viral reduce drásticamente la expresión de CAT (Dunn et al., 1995) . En contraste, la adición de dos nucleótidos en el extremo 5' o de 11 ó 35 nucleótidos en el extremo 3' no elimina la expresión de CAT (Dunn et al., 1995) . Por lo tanto, el complejo de polimerasa del virus de la influenza, la proteína polimerasa del bunyavirus puede aparentemente comenzar la transcripción y/o replicación internamente. Vectores Recombinantes del Virus de la Influenza de la Invención El uso de los vectores descritos en la presente reduce significativamente el número de plásmidos requeridos para la generación del virus segmentado tales como el virus de la influenza. Incrementa la eficiencia del rescate del virus de la influenza en líneas celulares que pueden ser transfectadas con altas deficiencias, permitiendo la generación de virus que son severamente atenuados y/o permite la generación del virus de la influenza en líneas celulares que no pueden ser transfectadas con altas eficiencias, incluyendo las líneas celulares para la producción de vacunas humanas (por ejemplo células Vero) . En consecuencia, el uso de los vectores de la invención reduce el número de variables para la generación de virus, dando como resultado generación más consistente del virus de la influenza, y disminuyendo la carga de proporcionar documentación adecuada de la historia del plásmido, la pureza y la toxicidad del mismo. Estas ventajas permiten la generación rápida del virus de vacuna, especialmente para pandemias. Además, la invención descrita en la presente no está limitada al virus de la influenza pero puede ser aplicada a cualquier otro virus de RNA antisentido, por ejemplo, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Reoviridae, Arenaviridae o Bunyaviridae . La invención proporciona al menos uno de los siguientes vectores aislados y/o purificados o una composición que incluye uno o más vectores y/ dos o más casetes de transcripción: un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PA del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN del PBl del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PBl del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN del PB2 del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PB2 del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN del HA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN del HA del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NP del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NP del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NA del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de M del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de M del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NS del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NS del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para la PA del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción de Polll, un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para la PBl del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción de Polll, un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para la PB2 del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción de Polll, un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para la NP del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción de Polll, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada uno operablemente enlazado a un segmento de ADN para la PA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PA del virus de la influenza, de longitud completa, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada uno operablemente enlazados a un segmento de ADN para PBl del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PBl del virus de la influenza, de longitud completa, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada uno operablemente enlazados a un segmento de ADN para PB2 del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PB2 del virus de la influenza, de longitud completa, y/o un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada uno operablemente enlazados a un segmento de ADN para NP del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NP del virus de la influenza, de longitud completa. Un vector de la invención puede incluir dos o más casetes de transcripción seleccionados de un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PA del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transmisión Poli, un cásete de la transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PBl del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PBl del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de la transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PB2 del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PB2 del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de la transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de la HA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de la HA del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de la transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NP del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NP del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de la transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de la NA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de la NA del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de la transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de M del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de M del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de la v transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NS del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NS del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de la transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación de ADN para la PA del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, un cásete de la transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación de ADN para PBl del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, un cásete de la transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación de ADN para PB2 del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, y/o un cásete de la transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación de ADN para NP del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Polll. En una modalidad, un vector de la invención incluye dos o más casetes de transcripción seleccionados de un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación de ADN para la PA del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación de ADN para PBl del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación de ADN para PB2 del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, y un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación de ADN para NP del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Polll. En otra modalidad más, un vector de la invención incluye al menos dos casetes de transcripción seleccionados de un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de HA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de HA del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NA del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de M del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de M del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, y/o un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NS del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NS del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli. La invención incluye además, un vector con al menos dos casetes de transcripción seleccionados de un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada una operablemente enlazadas a un segmento ADN para la PA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PA del virus de la influenza, de longitud completa, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada una operablemente enlazadas a un segmento ADN para PBl del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PBl del virus de la influenza, de longitud completa, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada una operablemente enlazadas a un segmento ADN para PB2 del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PB2 del virus de la influenza, de longitud completa, y/o un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada una operablemente enlazadas a un segmento ADN para NP del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NP del virus de la influenza, de longitud completa. Se proporciona además un vector que incluye dos o más casetes de transcripción seleccionados de un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PA de virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PA del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PBl de virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PBl del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PB2 de virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PB2 del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de HEF de virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de HEF del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NP de virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NP del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de M de virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de M del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de transcripción Poli, y/o un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NS de virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NS del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de transcripción Poli. También se proporciona un vector que incluye dos o más casetes de transcripción seleccionados de un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de M de virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de M del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NS de virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NS del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de transcripción Poli, y un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de HEF de virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de HEF del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de transcripción Poli. En una modalidad, la invención proporciona un vector aislado y/o purificado que incluye uno o más casetes de transcripción que incluyen un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PA de virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PA del virus de' la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PBl de virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PBl del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PB2 de virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PB2 del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de HEF de virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de HEF del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NP de virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NP del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de M de virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de M del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NS de virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NS del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para la PA de virus de la influenza, enlazada a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para la PBl de virus de la influenza, enlazada a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para la PB2 de virus de la influenza, enlazada a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para la NP de virus de la influenza, enlazada a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada una operablemente enlazada a un segmento de ADN para la PA del virus de la influenza, un cADN de PA del virus de la influenza, de longitud completa, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada una operablemente enlazadas a un segmento de ADN para la PBl del virus de la influenza, un cADN de PBl del virus de la influenza, de longitud completa, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada una operablemente enlazadas a un segmento de ADN para la PB2 del virus de la influenza, por ejemplo un cADN de PB2 del virus de la influenza, de longitud completa, y/o un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada una operablemente enlazadas a un segmento de ADN para la NP del virus de la influenza, por ejemplo un cADN de NP del virus de la influenza, de longitud completa. Composiciones Ejemplares de la Invención La invención proporciona una composición que comprende al menos un plásmido que incluye dos o más casetes de transcripción para la producción del vARN seleccionado de un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PA del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PBl del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PBl del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PB2 del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PB2 del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de HA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de HA del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NP del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NP del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NA del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de M del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de M del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, y/o un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NS del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NS del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli; y al menos un plásmido que incluye uno o más casetes de transcripción para la producción del mARN, seleccionado de un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para la PA del virus de la influenza, enlazada a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para PBl del virus de la influenza, enlazada a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para PB2 del virus de la influenza, enlazada a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, y/o un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para NP del virus de la influenza, enlazada a una secuencia de terminación de la transcripción Polll. En una modalidad, cada promotor Poli es el mismo. En cada modalidad, el promotor Polll es el mismo. En una modalidad, cada secuencia terminadora de la transcripción Poli es la misma. En una modalidad, cada secuencia terminadora de la transcripción Polll es la misma. En una modalidad, al menos un plásmido para la producción del vARN incluye los casetes de transcripción para la PA del virus de la influenza, la PBl del virus de la influenza, la PB2 del virus de la influenza, la HA del virus de la influenza, la NP del virus de la influenza, la NA del virus de la influenza, la M del virus de la influenza, y los segmentos de NS del virus de la influenza. En una modalidad, al menos un plásmido para la producción del mARN incluye dos o más casetes de transcripción para la PA del virus de la influenza, la PBl del virus de la influenza, la PB2 del virus de la influenza o la NP del virus de la influenza, por ejemplo, al menos un plásmido para la producción del mARN incluyen los casetes para la PA del virus de la influenza, la PBl del virus de la influenza, la PB2 del virus de la influenza, y la NP del virus de la influenza. En una modalidad, al menos un plásmido para la producción del mARN incluye tres de los casetes, en donde la composición comprende además un plásmido para la producción de mARN con el promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para un gen del virus de la influenza ligado a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, en donde la región de codificación del ADN en el tercer plásmido es para un gen del virus de la influenza que no está sobre el plásmido que incluye los tres casetes, por ejemplo, al menos un plásmido para la producción del mARN incluyen los casetes para la PA del virus de la influenza, la PBl del virus de la influenza, la PB2 del virus de la influenza y el tercer plásmido incluye un cásete para el NP del virus de la influenza. En otra modalidad más, al menos un plásmido para la producción de vARN incluye los casetes de transcripción para la PA del virus de la influenza, la PBl del virus de la influenza, la PB2 del virus de la influenza, el NP del virus de la influenza, la M del virus de la influenza, y la NS del virus de la influenza. También se incluye un plásmido para la producción del vARN que incluye un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de la HA del virus de la influenza, por ejemplo un cADN de la HA del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli y un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de la NA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de la NA del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, por ejemplo, al menos un plásmido para la producción del mARN incluye los casetes para la PA del virus de la influenza, la PBl del virus de la influenza, la PB2 del virus de la influenza, y la NP del virus de la influenza. En otra modalidad más, al menos un plásmido para la producción del mARN incluye tres de los casetes, en donde la composición comprende además un tercer plásmido para la producción del mARN con un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para un gen del virus de la influenza enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, en donde la región de codificación del ADN en el tercer plásmido es para un gen del virus de la influenza que no está sobre el plásmido que incluye los tres casetes, por ejemplo, al menos un plásmido para la producción del mARN incluye los casetes para la PA del virus de la influenza, la PBl del virus de la influenza, la PB2 del virus de la influenza, y el tercer plásmido incluye un cásete para la NP del virus de la influenza. En una modalidad, una composición de la invención comprende un plásmido que incluye un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de la PA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de la PA del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PBl del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PBl del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PB2 del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PB2 del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de la HA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de la HA del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de la NP del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de la NP del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de la NA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de la NA del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de M del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de M del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, y un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NS del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NS del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli. En una modalidad, la HA en un cásete de transcripción es una HA tipo A. En una modalidad, la HA en el cásete de transcripción es una HA tipo B. En una modalidad, el promotor de la RNA-polimerasa I es un promotor de la RNA-polimerasa, humana. En una modalidad, el segmento NA en un cásete de transcripción es un segmento NA del tipo B, por ejemplo, uno para las proteínas NA y NB del virus de la influenza B. En una modalidad, la composición incluye además un cásete de transcripción que comprende el promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de M del virus de la influenza, por ejemplo, uno para ambos de Ml y BM2 , enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli. También se proporciona una composición que comprende un plásmido que incluye dos o más casetes de transcripción seleccionados de un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para la PA del virus de la influenza, enlazada a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para PBl del virus de la influenza, enlazada a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para PB2 del virus de la influenza, enlazada a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, y/o un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para NP del virus de la influenza, enlazada a una secuencia de terminación de la transcripción Polll. En otra modalidad, la invención proporciona una composición que comprende un plásmido que incluye uno o más casetes de transcripción seleccionados de un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de la HA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de la HA del virus de la influenza, de longitud completa, enlazados a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de la NA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de la NA del virus de la influenza, de longitud completa, enlazados a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de M del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de M del virus de la influenza, de longitud completa, enlazados a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, y un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NS del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NS del virus de la influenza, de longitud completa, enlazados a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, y uno o más casetes de transcripción seleccionados de un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli, y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada uno operablemente enlazados a un cADN para la PA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de la PA del virus de la influenza, de longitud completa, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli, y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada uno operablemente enlazados a un cADN para PBl del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PBl del virus de la influenza, de longitud completa, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli, y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada uno operablemente enlazados a un cADN para PB2 del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PB2 del virus de la influenza, de longitud completa, y un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli, y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada uno operablemente enlazados a un cADN para NP del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NP del virus de la influenza, de longitud completa. En una modalidad, la HA en un cásete de transcripción es una HA del tipo A. En otra modalidad más, la HA en un cásete de transcripción es una HA del tipo B. En una modalidad, el promotor Poli del RNA es un promotor Poli de RNA humano. En una modalidad, el cADN de NA en un cásete de transcripción es un cADN de NA del tipo B, por ejemplo, uno que tiene NA y NB. En una modalidad, la composición incluye además un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de M del virus de la influenza, por ejemplo, uno que tiene Ml y BM2 , enlazados a una secuencia de terminación de la transcripción Poli. Se proporciona además una composición que comprende un plásmido que incluye un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de transmisión de la transcripción Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada uno operablemente enlazados a un cADN para la PA del virus de la influenza, por ejemplo, una PA del virus de la influenza, de longitud completa, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de transmisión de la transcripción Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada uno operablemente enlazados a un cADN para PBl del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PBl del virus de la influenza, de longitud completa, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada uno operablemente enlazados a un cADN para PB2 del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PB2 del virus de la influenza, de longitud completa, y un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada uno operablemente enlazados a un cADN para NP del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NP del virus de la influenza, de longitud completa . También se incluye una composición que comprende al menos un plásmido para la producción del vARN que incluye dos o más casetes de transcripción seleccionados de un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN del PA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN del PA del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN del PBl del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN del PBl del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PB2 del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PB2 del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de HEF del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de HEF del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NP del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NP del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de M del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de M del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, y/o un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NS del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NS del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli; y al menos un plásmido para la producción del mARN que incluye uno o más casetes de transcripción seleccionados de un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para la PA del virus de la influenza, enlazada a una secuencia de terminación de la transcripción de Polll, un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para PBl del virus de la influenza, enlazada a una secuencia de terminación de la transcripción de Polll, un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para PB2 del virus de la influenza, enlazada a una secuencia de terminación de la transcripción de Polll, y/o un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para NP del virus de la influenza, enlazada a una secuencia de terminación de la transcripción de Polll. En una modalidad, al menos un plásmido para la producción del vARN incluye los casetes de transcripción para la PA del virus de la influenza, la PBl del virus de la influenza, la PB2 del virus de la influenza, la HA del virus de la influenza, la NP del virus de la influenza, la NA del virus de la influenza, la M del virus de la influenza, y los segmentos de NS del virus de la influenza. En una modalidad, al menos un plásmido para la producción del mARN incluye dos o más casetes de transcripción para la PA del virus de la influenza, la PBl del virus de la influenza, la PB2 del virus de la influenza o la NP del virus de la influenza, por ejemplo, al menos un plásmido para la producción del mARN incluyen los casetes para la PA del virus de la influenza, la PBl del virus de la influenza, la PB2 del virus de la influenza, y la NP del virus de la influenza. En una modalidad, al menos un plásmido para la producción del mARN incluye tres de los casetes, en donde la composición comprende además un plásmido para la producción de mARN con el promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para un gen del virus de la influenza ligado a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, en donde la región de codificación del ADN en el tercer plásmido es para un gen del virus de la influenza que no está sobre el plásmido que incluye los tres casetes, por ejemplo, al menos un plásmido para la producción del mARN incluyen los casetes para la PA del virus de la influenza, la PBl del virus de la influenza, la PB2 del virus de la influenza y el tercer plásmido incluye un cásete para el NP del virus de la influenza. En otra modalidad más, al menos un plásmido para la producción de vARN incluye los casetes de transcripción para la PA del virus de la influenza, la PBl del virus de la influenza, la PB2 del virus de la influenza, el NP del virus de la influenza, la M del virus de la influenza, y la NS del virus de la influenza. Por ejemplo, la composición incluye un plásmido para la producción de vARN que incluye un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de HEF del virus de la influenza, por ejemplo un cADN de HEF del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli. También se proporciona una composición que comprende un plásmido que incluye dos o más casetes de la transcripción seleccionados de un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PA del virus de la influenza, por ejemplo, el cADN de PA del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a la secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PBl del virus de la influenza, por ejemplo, el cADN de PBl del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a la secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PB2 del virus de la influenza, por ejemplo, el cADN de PB2 del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a la secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de HEF del virus de la influenza, por ejemplo, el cADN de HEF del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a la secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NP del virus de la influenza, por ejemplo, el cADN de NP del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a la secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de M del virus de la influenza, por ejemplo, el cADN de M del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a la secuencia de terminación de la transcripción Poli, y/o un cásete de transcripción que comprende un promotor operablemente enlazado a un cADN de NS del virus de la influenza, por ejemplo, el cADN de NS del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a la secuencia de terminación de la transcripción Poli. En una modalidad, cada cásete de transcripción para la producción del vARN está sobre un plásmido. En una modalidad, cada cásete de transcripción para la producción del mARN está sobre un plásmido. En una modalidad, cada cásete de transcripción está sobre un plásmido. En una modalidad, el promotor Poli del RNA es un promotor Poli del RNA humano. La invención también incluye una composición que comprende un plásmido que incluye uno o más casetes de transcripción seleccionados de un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli ligado a un cADN de HEF del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de HEF del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción Poli que comprende un promotor operablemente enlazado cADN de M del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de M del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, y un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NS del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NS del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli; y uno o más casetes de transcripción seleccionados de un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli, y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada uno operablemente enlazado a un cADN para la PA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de la PA del virus de la influenza, de longitud completa, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli, y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada uno operablemente enlazado a un cADN para PBl del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PBl del virus de la influenza, de longitud completa, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli, y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada uno operablemente enlazado a un cADN para PB2 del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PB2 del virus de la influenza, de longitud completa, y un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli, y un promotor Polll y/o una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada uno operablemente enlazado a un cADN para NP del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NP del virus de la influenza, de longitud completa. En una modalidad, cada cásete de transcripción para la producción del vARN está sobre un plásmido. En una modalidad, cada cásete de transcripción para la producción del mARN está sobre un plásmido. En una modalidad, cada cásete de transcripción está sobre un plásmido. En una modalidad, el promotor Poli del RNA es un promotor Poli del RNA humano . En una modalidad, la composición cuando se pone en contacto con una célula que es opcionalmente una célula 293T o una célula Vero produce cantidades detectables del virus de la influenza, por ejemplo, un título de al menos 102 hasta al menos 103 TCID50/ml. Métodos Ejemplares La invención también proporciona un método para preparar el virus de la influenza. El método incluye poner en contacto una célula con un plásmido que incluye dos o más casetes de transcripción seleccionados de un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PA del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transmisión Poli, un cásete de la transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PBl del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PBl del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un c sete de la transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PB2 del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PB2 del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de la transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de la HA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de la HA del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de la transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NP del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NP del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de la transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de la NA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de la NA del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de la transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de M del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de M del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un c sete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NS del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NS del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli; y un plásmido que incluye uno o más casetes de transcripción seleccionados de un cásete de transcripción, un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación de ADN para la PA del virus de la influenza, un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación de ADN para PBl del virus de la influenza, un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación de ADN para PB2 del virus de la influenza, y/o un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación de ADN para NP del virus de la influenza. En una modalidad, un método para preparar el virus de la influenza, incluye poner en contacto una célula con un plásmido que incluye un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de HA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de HA del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NA del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de M del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de M del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NS del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NS del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, y opcionalmente incluye uno o más casetes de transcripción seleccionados de un c sete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada una operablemente enlazadas a un cADN para la PA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PA del virus de la influenza, de longitud completa, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada una operablemente enlazadas a un cADN para PBl del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PBl del virus de la influenza, de longitud completa, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada una operablemente enlazadas a un cADN para PB2 del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PB2 del virus de la influenza, de longitud completa, y/o un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada una operablemente enlazadas a un cADN para NP del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NP del virus de la influenza, de longitud completa. En otra modalidad más, la invención proporciona un método para preparar el virus de la influenza, que incluye dos o más casetes de la transcripción seleccionados de un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PA del virus de la influenza, por ejemplo, el cADN de PA del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a la secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PBl del virus de la influenza, por ejemplo, el cADN de PBl del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a la secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PB2 del virus de la influenza, por ejemplo, el cADN de PB2 del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a la secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de HEF del virus de la influenza, por ejemplo, el cADN de HEF del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a la secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NP del virus de la influenza, por ejemplo, el cADN de NP del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a la secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de M del virus de la influenza, por ejemplo, el cADN de M del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a la secuencia de terminación de la transcripción Poli, y/o un cásete de transcripción que comprende un promotor operablemente enlazado a un cADN de NS del virus de la influenza, por ejemplo, el cADN de NS del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a la secuencia de terminación de la transcripción Poli; y un plásmido que incluye uno o más casetes de la transcripción seleccionados de un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para la PA del virus de la influenza, un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para PBl del virus de la influenza, un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para PB2 del virus de la influenza, y/o un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para NP del virus de la influenza. Se proporciona además un método para preparar el virus de la influenza. El método incluye poner en contacto una célula con un plásmido que incluye un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de HEF del virus de la influenza, por ejemplo un cADN de HEF del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de M del virus de la influenza, por ejemplo un cADN de M del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NS del virus de la influenza, por ejemplo un cADN de NS del virus de la influenza, de longitud completa, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, y opcionalmente incluye uno o más casetes de transcripción seleccionados de un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada uno operablemente enlazados a un cADN para la PA del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de la PA del virus de la influenza, de longitud completa, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada uno operablemente enlazados a un cADN para PBl del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PBl del virus de la influenza, de longitud completa, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada una operablemente enlazadas a un cADN para PB2 del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de PB2 del virus de la influenza, de longitud completa, y/o un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transcripción Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll, cada uno operablemente enlazados a un cADN para NP del virus de la influenza, por ejemplo, un cADN de NP del virus de la influenza, de longitud completa.
En una modalidad, el método de la invención incluye poner en contacto una célula con un vector que comprende un cásete de transcripción que comprende un promotor ligado a las secuencias del virus de la influenza 5', que comprende las secuencias de no codificación del virus de la influenza 5' y opcionalmente porciones adyacentes de la secuencia de codificación (ver PCT /US03 / 04233 , que se incorpora por referencia en la presente) , enlazadas a un ADN de interés enlazado a la secuencia del virus de la influenza 3' que comprende la secuencia de no codificación del virus de la influenza 3' , y opcionalmente porciones adyacentes de la secuencia de codificación, enlazada a una secuencia de terminación de la transcripción (ver PCT/USO 3 / 04233 ) . En una modalidad, el ADN de interés está en la misma orientación. En otra modalidad más, el ADN de interés está en orientación en sentido negativo. El ADN de interés puede incluir una estructura de lectura abierta que codifica para un polipéptido inmunogénico o un péptido de un patógeno o un polipéptido o péptido terapéutico. El ADN de interés puede ser operablemente enlazado a un promotor Poli y a una secuencia de terminación de la transcripción Poli y/o el ADN de interés está operablemente enlazado a un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll.
Líneas Celulares y Virus de la Influenza que pueden ser Utilizados en la Presente Invención De acuerdo a la presente invención, cualquier célula que apoye la replicación eficiente del virus de la influenza puede ser empleada en la invención, incluyendo células mutantes que expresan niveles reducidos o disminuidos de uno o más ácidos siálicos que son receptores para el virus de la influenza. Los virus obtenidos mediante los métodos son elaborados en un virus reclasificante . Preferentemente, las células son certificadas por WHO, o líneas celulares continuas, certificables. Los requerimientos para certificar las líneas celulares incluyen la caracterización con respecto al menos a una de la genealogía, las características de crecimiento, los marcadores inmunológicos, la susceptibilidad del virus, la tumorigenicidad y las condiciones de almacenamiento, así como mediante la prueba en animales, huevo y cultivos celulares. Tal caracterización es utilizada para confirmar que las células están libres de agentes adventicios detectables. En algunos países, puede ser también requerida la cariología. Además, la tumorigenicidad es preferentemente probada en células que están al mismo nivel de pase que aquellas utilizadas para la producción de la vacuna. El virus de la vacuna es preferentemente purificada mediante un proceso que ha mostrado que da resultados consistentes (ver por ejemplo, World Health Organization, 1982) . Se prefiere establecer una caracterización completa de las líneas celulares para ser utilizadas, de modo que las pruebas apropiadas para la pureza del producto final pueden ser incluidas. Los datos que pueden ser utilizados para la caracterización de una célula que va a ser utilizada en la presente invención incluyen (a) la información sobre su origen, la derivación y la historia de los pases; (b) la información sorbe su crecimiento y las características morfológicas; (c) los resultados de las pruebas de agentes adventicios; (d) las características distintivas, tales como los patrones bioquímicos, inmunológicos y citogenéticos que permiten que las células sean claramente reconocidas entre otras líneas celulares; y (e) los resultados de las pruebas para la tumorigenicidad. Preferentemente, el nivel de pasaje, o la duplicación de la población de la célula hospedera utilizada es tan baja como sea posible. Se prefiere que el virus producido en la célula sea altamente purificada antes de la formulación en terapia en vacuna o génica. En general, los procedimientos de purificación darán como resultado la eliminación extensa del ADN celular, otros componentes celulares y agentes adventicios. Los procedimientos que degradan o desnaturalizan intensamente el ADN pueden ser también utilizados. Ver por ejemplo, Mizrahi, 1990.
Vacunas Una vacuna de la invención puede comprender proteínas inmunogénicas que incluyen glucoproteínas de cualquier patógeno, por ejemplo, una proteína inmunogénica proveniente de una o más bacterias, virus, levaduras u hongos. De este modo, en una modalidad, los virus de la influenza de la invención pueden ser vectores de vacuna para el virus de la influenza u otros patógenos virales que incluyen, pero no están limitados a, lentivirus tales como el HIV, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus del herpes tales como CMV o HSV o el virus de la enfermedad de pie y boca. Una vacuna de virión completo es concentrada mediante ultrafiltración y luego purificada mediante centrifugación zonal o mediante cromatografía. Ésta es inactivada antes de o después de la purificación utilizando formalina o beta-propiolactona, por ejemplo. Una vacuna subunitaria comprende glucoproteínas purificadas. Tal vacuna puede ser preparada como sigue: utilizando suspensiones virales fragmentadas por tratamiento con detergente, los antígenos superficiales son purificados, mediante ultracentrifugación por ejemplo. Las vacunas subunitarias contienen de este modo, principalmente la proteína HA y también NA. El detergente utilizado puede ser detergente catiónico, por ejemplo, tal como bromuro de hexadeciltrimetilamonio (Bachmeyer, 1975), un detergente aniónico tal como desoxicolato de amonio (Laver y Webster, 1976; Webster et al., 1977); o un detergente no iónico tal como aquel comercializado bajo el nombre TRITÓN X100. La hemaglutinina puede ser también aislada después del tratamiento de los viriones con una proteasa tal como bromelina, luego purificada mediante un método tal como aquel descrito por Grand y Skehel (1972). Una vacuna dividida comprende viriones que han sido sometidos a tratamiento con agentes que disuelven los lípidos. Una vacuna dividida puede ser preparada como sigue: una suspensión acuosa del virus purificado obtenido como se describe anteriormente, inactivado o no, es tratada, bajo agitación, por solventes de lípidos tales como éter etílico o cloroformo, asociados con detergentes. La disolución de los lípidos de la envoltura viral da como resultado la fragmentación de partículas virales. La fase acuosa es recuperada conteniendo la vacuna dividida, principalmente constituida de hemaglutinina y neuraminidasa con su ambiente lipídico original removido, y el núcleo o sus productos de degradación. Luego, las partículas infecciosas residuales son inactivadas si esto todavía no ha sido realizado. Vacunas Inactivadas. Las vacunas del virus de la influenza, inactivadas, de la invención son proporcionadas por la activación de los virus replicados de la invención utilizando métodos conocidos tales como, pero no limitados a, tratamiento con formalina o ß-propiolactona . Los tipos de vacunas inactivadas que pueden ser utilizadas en la invención pueden incluir vacunas del virus completo (WV) o vacunas de subviriones (SV) (divididas) . La vacuna WV contiene el virus inactivado, intacto, mientras que la vacuna SV contiene el virus purificado desintegrado con detergentes que solubilizan la envoltura viral que contiene lípido, seguido por inactivación química del virus residual . Además, las vacunas que pueden ser utilizadas incluyen aquellas que contienen las proteínas superficiales HA y NA aisladas, las cuales son referidas como vacunas de antígenos superficial o subunitarias. En general, las respuestas a las vacunas de SV y de antígeno superficial (por ejemplo, HA o NA purificadas) son similares. Una vacuna WV inactivada experimental que contiene un antígeno NA inmunológicamente relacionado al virus epidémico y una HA no relacionada parece ser menos efectiva que las vacunas convencionales (Ogra et al., 1977). Las vacunas inactivadas que contienen antígenos de la superficie relevante son preferidas . Vacunas de Virus Atenuados Vivos . Las vacunas de virus de la influenza, atenuado, vivo, pueden ser también utilizadas para prevenir o tratar la infección por el virus de la influenza, de acuerdo a los pasos del método conocidos.
La atenuación es preferentemente lograda en un paso simple mediante transferencia de genes atenuados a partir de un virus donador atenuado a un virus aislado o reclasificado, replicado, de acuerdo a métodos conocidos (ver por ejemplo, Murphy, 1993) . Ya que la resistencia al virus de la influenza A es mediada por el desarrollo de una respuesta inmune a las glucoproteínas HA y NA, los genes que codifican para estos antígenos superficiales deben venir de las cepas de tipo silvestre circulantes. Los genes atenuados son derivados del progenitor atenuado. En este procedimiento, los genes que confieren atenuación preferentemente no codifican para las glucoproteínas HA y NA. De otro modo, estos genes podrían no ser transferidos a los reclasificantes que poseen los antígenos superficiales del aislado viral clínico. Muchos virus donadores han sido evaluados para su habilidad de atenuar reproduciblemente los virus de la influenza. Como un ejemplo no limitante, el virus donador adaptado en frío (ca) , A/Ann Arbor (AA) 6/60 (H2N2) puede ser utilizado para la producción de vacunas atenuadas (ver por ejemplo, Edwards, 1994; Murphy, 1993). La progenie reclasificanrte es luego seleccionada a 252C (restrictiva para la replicación del virus virulento) , en presencia de un antisuero de H2N2 , el cual inhibe la replicación de los virus que poseen los antígenos superficiales del virus donador ca atenuado A/AA/6/60 (H2N2). Una serie grande de reclasificantes HlNl y H3N2 han sido evaluados en humanos y son encontrados satisfactoriamente: (a) infecciosos, (b) atenuados para niños seronegativos y adultos inmunológicamente aprestados, (c) inmunogénicos y (d) genéticamente estables. La inmunogenicidad de los reclasificantes ca está en paralelo a su nivel de replicación. De este modo, la adquisición de los seis genes transferibles del virus donador ca por nuevos virus de tipo silvestre ha atenuado reproduciblemente estos virus para el uso en la vacunación de adultos y niños receptibles . Otras mutaciones de atenuación pueden ser introducidas dentro de los genes del virus de la influenza mediante mutagénesis dirigida al sitio, para rescatar los virus infecciosos que poseen estos genes mutantes. Las mutaciones de atenuación pueden ser introducidas dentro de las regiones de no codificación del genoma, así como dentro de las regiones de codificación. Tales mutaciones de atenuación pueden también ser introducidas, por ejemplo, dentro del gen de la polimerasa PB2 (Subbarao et al., 1993) o del gen NS . De este modo, los nuevos virus donadores pueden también ser generados poseyendo mutaciones de atenuación introducidas por mutagénesis dirigida al sitio, y tales nuevos virus donadores pueden ser utilizados en la producción de candidatos de vacuna HlNl y H3N2 reclasificantes, atenuados, de una manera análoga a aquella descrita anteriormente para el virus donador ca A/AA/6/60. Se prefiere que tales virus atenuados mantengan los genes provenientes del virus que codifican los determinantes antígenos sustancialmente similares a aquellos de los aislados clínicos originales. Esto es debido a que el propósito de la vacuna atenuada es proporcionada sustancialmente de la misma antigenicidad que el aislado clínico original del virus, mientras que al mismo tiempo carezca de la infectividad al grado en que la vacuna provoque cambio mínimo de la inducción de una condición patogénica seria en el mamífero vacunado. El virus puede ser de este modo atenuado o inactivado, formulado y administrado de acuerdo a métodos conocidos, como una vacuna para inducir una respuesta inmune en un animal, por ejemplo, un mamífero. Los métodos son bien conocidos en la técnica para determinar si tales vacunas atenuadas o inactivadas han mantenido antigenicidad similar a aquella del aislado clínico o la cepa de alto crecimiento derivada de ésta. Tales métodos conocidos incluyen el uso de antisueros o anticuerpos para eliminar los virus que expresan los determinantes antigénicos del virus donador; la selección química (por ejemplo, amantadina o rimantidina) ; actividad de inhibición de HA y NA; y selección de ADN (tal como la hibridación de sonda o PCR) para confirmar que los genes donadores que codifican para los determinantes antigénicos (por ejemplo, los genes HA o NA) no están presentes en los virus atenuados. Ver por ejemplo, Robertson et al., 1988; Kilbourne, 1969; Aymard-Henry et al., 1985; Robertson et al., 1992. Composiciones Farmacéuticas Las composiciones farmacéuticas de la presente invención, adecuadas para la inoculación o para la administración parenteral u oral, comprenden virus de la influenza atenuados o inactivados, que comprenden opcionalmente además soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas, estériles. Las composiciones pueden comprender además agentes auxiliares o excipientes, como son conocidos en la técnica. Ver por ejemplo, Berkow et al., 1987; Avery's Drug Treatment, 1987; Osol, 1980. La composición de la invención es en general presentada en la forma de dosis individuales (dosis unitarias) . Las vacunas convencionales contienen aproximadamente 0.1 a 200 µg, preferentemente 10 a 15 µg, de hemaglutinina provenientes de cada una de las cepas que entran en su composición. La vacuna que forma el constituyente principal de la composición de vacuna de la invención puede comprender un virus del tipo A, B ó C, o cualquier combinación de los mismos, por ejemplo, al menos dos de los tres tipos, al menos dos de los diferentes subtipos, al menos dos del mismo tipo, al menos dos del mismo subtipo, o uno o varios aislados o reclasificantes diferentes. El virus de la influenza humana tipo A incluye los subtipos H1N1, H2N2 y H3N2. Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones, y/o emulsiones acuosas o no acuosas, estériles, las cuales pueden contener agentes o excipientes auxiliares conocidos en la materia. Los ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y esteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los portadores o revestimientos oclusores pueden ser utilizados para incrementar la permeabilidad de la piel y aumentar la absorción del antígeno. Las formas de dosis líquida para la administración oral pueden comprender en general una solución liposomal que contiene la forma de dosis líquida. Las formas adecuadas para suspender liposomas incluyen emulsiones, suspensiones, soluciones, jarabes, y elíxires que contienen diluyentes inertes comúnmente utilizados en la técnica tales como agua purificada. Además de los diluyentes inertes, tales composiciones pueden también incluir adyuvantes, agentes humectantes, agentes emulsificantes y suspensores o endulzantes, saborizantes o agentes perfumantes. Ver por ejemplo, Berkow et al., 1992; Avery's 1987; y Osol, 1980.
Cuando una composición de la presente invención es utilizada para la administración a un individuo, ésta puede comprender además tales amortiguadores, adyuvantes u otras sustancias que son deseables para el mejoramiento de la eficacia de la composición. Para las vacunas, los adyuvantes, las sustancias que pueden aumentar una respuesta inmune específica, pueden ser utilizadas. Normalmente, el adyuvante y la composición son mezclados antes de la presentación al sistema inmune, o presentados separadamente pero dentro del mismo sitio del organismo que es inmunizado. Los ejemplos de materiales adecuados para el uso en composición de vacuna son proporcionados en Osol (1980) . La heterogeneidad en una vacuna puede ser proporcionada al mezclar los virus de la influenza replicados para al menos dos cepas del virus de la influenza, tales como 2-50 cepas o cualquier intervalo o valor entre éstos. Las cepas del virus de la influenza A o B que tienen una composición antigénica moderna son preferidas. De acuerdo a la presente invención, las vacunas pueden ser proporcionadas para variaciones en una cepa simple de un virus de la influenza, utilizando técnicas conocidas en la materia. Una composición farmacéutica de acuerdo a la presente invención puede comprender además adicionalmente al menos un compuesto inmunoterapéutico, por ejemplo, para terapia génica, inmunosupresores, agentes anti-inflamatorios o aumentadores de la respuesta inmune, y para vacunas, los quimioterapéuticos que incluyen, pero no están limitados a, gamma-globulina, amantadina, guanidina, hidroxibencimidazol , interfón-a, interferón-ß, interferón-?, factor alfa de necrosis tumoral, tiosemicarbazonas , metisazona, rifampina, ribavirina, un análogo de pirimidina, un análogo de purina, foscarnet, ácido fosfonoacético, aciclovir, didesoxinucleósidos, un inhibidor de proteasa o ganciclovir. La composición puede también comprender cantidades variables pero pequeñas del formaldehído libre de endotoxinas, y conservadores, que han sido encontrados como seguros y no contribuyentes a efectos indeseables en el organismo al cual es administrada la composición. Propósitos Farmacéuticos La administración de la composición (o los antisueros que promueve) pueden ser ya sea para un propósito "profiláctico" o "terapéutico" . Cuando se proporcionan profilácticamente, las composiciones de la invención que son vacunas, son proporcionadas antes de que cualquier síntoma de una infección por patógeno se vuelva manifiesto. La administración profiláctica de la composición sirve para prevenir o atenuar cualquier infección subsecuente. Cuando se proporciona profilácticamente, las composiciones de terapia génica de la invención, son proporcionadas antes de que se manifieste cualquier síntoma de una enfermedad. La administración profiláctica de la composición sirve para prevenir o atenuar uno o más síntomas asociados con la enfermedad. Cuando se proporciona terapéuticamente, una vacuna viral atenuada o activada es proporcionada después de la detección de un síntoma de la infección efectiva. La administración terapéutica del o de los compuestos sirve para atenuar cualquier infección efectiva. Ver por ejemplo, Berkow et al., 1992; y Avery, 1987. Cuando se proporciona terapéuticamente, una composición de terapia génica proporcionada después de la detección de un síntoma o indicación de la enfermedad. La administración terapéutica de o de los compuestos sirve para atenuar un síntoma o indicación de esa enfermedad. De este modo, una composición de vacuna atenuada o inactivada de la presente invención puede ser de este modo ya sea antes del inicio de la infección (para prevenir así o atenuar una infección anticipada) o después del inicio de una infección efectiva. Similarmente, para la terapia génica, la composición puede ser proporcionada antes de que se manifieste cualquier síntoma de un trastorno o enfermedad, o después de que se tenga uno o más síntomas. Se dice que una composición es "farmacológicamente aceptable" si su administración puede ser tolerada por un paciente recipiente. Se dice que tal antígeno es administrado en una "cantidad terapéuticamente efectiva" si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa. Una composición de la presente invención es fisiológicamente significativa si su presencia da como resultado un cambio detectable en la fisiológica de un paciente o recipiente, por ejemplo, aumenta al menos una respuesta inmune humoral o celular, primaria o secundaria, contra al menos una cepa de un virus de la influenza, infeccioso. La "protección" proporcionada no necesita ser absoluta, por ejemplo, la infección por la influenza no necesita ser totalmente prevenida o erradicada, si existe un mejoramiento estadísticamente significativo en comparación con una población control o un grupo de pacientes. La protección puede ser limitada para mitigar la severidad o la rapidez del inicio de los síntomas de la infección por el virus de la influenza. Administración Farmacéutica Una composición de la presente invención puede conferir resistencia a uno o más patógenos, por ejemplo, una o más cepas del virus de la influenza, ya sea mediante inmunización pasiva o bien inmunización activa. En la inmunización activa, una composición de vacuna viva inactivada o atenuada es administrada profilácticamente a un hospedero, (por ejemplo, un mamífero), y la respuesta inmune del hospedero a la administración protege contra la infección y/o la enfermedad. Para la inmunización pasiva, los antisueros producidos pueden ser recuperados y administrados a un recipiente sospechoso de generar una infección provocada por al menos una cepa del virus de la influenza. Una composición de terapia génica de la presente invención puede producir niveles profilácticos o terapéuticos del producto génico deseado mediante inmunización activa. En una modalidad, la vacuna es proporcionada a una hembra mamífera (en o cerca de la preñez o el parto) , bajo condiciones de tiempo y cantidad suficientes para provocar la producción de una respuesta inmune que sirva para proteger a la hembra y al feto o al neonato (vía la incorporación pasiva de los anticuerpos a través de la placenta o en la leche materna) . La presente invención incluye de este modo los métodos para prevenir o atenuar un trastorno o enfermedad, por ejemplo, una infección por al menos una cepa del patógeno. Como se utiliza en la presente, se dice que una vacuna previene o atenúa una enfermedad si su administración da como resultado ya sea la atenuación total o parcial (por ejemplo, supresión) de un síntoma o condición de la enfermedad, o da como resultado la inmunidad total o parcial del individuo hacia la enfermedad. Como se utiliza en la presente, una composición de terapia génica se dice que previene o atenúa una enfermedad si su administración da como resultado ya sea la atenuación total o parcial (por ejemplo, la supresión) de un síntoma o la condición de la enfermedad, o da como resultado la inmunidad total o parcial del individuo hacia la enfermedad. Al menos un virus de la influenza, inactivado o atenuado, o composición del mismo, de la presente invención puede ser administrado mediante cualquier medio que logre los propósitos pretendidos, utilizando una composición farmacéutica como se describió previamente. Por ejemplo, la administración de tal composición puede ser mediante diversas rutas parenterales tales como la ruta subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, oral o transdérmica. La administración parenteral puede ser mediante inyección de bolo o mediante perfusión gradual sobre el tiempo. Un modo preferido de utilizar la composición farmacéutica de la presente invención es mediante aplicación intramuscular o subcutánea. Ver por ejemplo, Berkow et al., 1992, y Avery, 1987. Un régimen típico para prevenir, suprimir o tratar una patología relacionada al virus de la influenza, comprende la administración de una cantidad efectiva de una composición de vacuna como se describe en la presente, administrado como un tratamiento simple, o repetida como dosis aumentadoras o reforzadoras, en un periodo hasta e incluyendo entre una semana y aproximadamente 24 meses, o cualquier intervalo o valor entre éstos. De acuerdo a la presente invención, una "cantidad efectiva" de una composición es una que es suficiente para lograr un efecto biológico deseado. Se entiende que la dosis efectiva será dependiente de la edad, el sexo, la salud y el peso del recipiente, el tipo de tratamiento concurrente, si lo hay, la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado. Los intervalos de dosis efectivos proporcionados más adelante no están destinados a limitar la invención y representan intervalos de dosis preferidos. No obstante, la dosis más preferida será diseñada para el sujeto individual, como es entendido y determinable por una persona de experiencia ordinaria en la técnica. Ver por ejemplo, Berkow et al., 1992; Avery's 1987; y Ebadi , 1985. La dosis de una vacuna de virus atenuado para un mamífero (por ejemplo, humano) o un organismo adulto aviar puede ser de aproximadamente de 103-107 unidades formadoras de placa (PFU)/kg, o cualquier intervalo o valor entre éstos. La dosis de la vacuna inactivada puede estar en el intervalo de aproximadamente 0.1 a 200, por ejemplo, 50 µg de proteína hemaglutinina. No obstante, la dosis debe ser una cantidad segura y efectiva como es determinada por los métodos convencionales, utilizando vacunas existentes como un punto inicial.
La dosis de la HA inmunorreactiva en cada dosis de la vacuna del virus replicado, puede ser estandarizado para contener una cantidad adecuada, por ejemplo, 1-50 µg o cualquier intervalo o valor entre éstos, o la cantidad recomendada por el servicio de salud pública de los Estados Unidos (PHS), que es usualmente de 15 µg, por componente para niños mayores de 3 años de edad, y 7.5 µg por componente para niños menores de 3 años de edad. La cantidad de NA puede también ser estandarizada, no obstante, esta glucoproteína puede ser lábil durante el procesamiento, purificación y almacenamiento. Cada dosis de 0.5 ml de la vacuna contiene preferentemente aproximadamente 1-50 mil millones de partículas virales, y preferentemente 10 mil millones de partículas . La invención será además descrita al seguir los siguientes ejemplos no limitantes. Ejemplo 1 El genoma del virus de la influenza A ó B es una hebra negativa simple de ocho segmentos (C tiene únicamente 7 segmentos) . Dos de los genes que son críticos para la infección viral, así como para las estrategias para desarrollar las vacunas para la influenza, son los genes para la hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) . La entrada a una célula hospedera es facilitada por el enlace de los picos de HA a las mucoproteínas que contienen grupos ácido N-acetil- neuramínico (ácido siálico) terminales. Las vacunas de la influenza clásicas son usualmente elaboradas mediante fusión de los genes de HA y NA, junto con otros seis genes provenientes de una cepa maestra "inocua". Este proceso consume mucho tiempo y está a menudo propenso a títulos bajos durante el desarrollo de la vacuna. Una metodología que permite generar el virus sintético de la influenza mediante genética inversa ha sido empleado para preparar virus, por ejemplo, el virus recombinante que contiene los genes de HA y NA provenientes de cepas patógenas, y seis genes provenientes de una cepa maestra son ensamblados. En particular, estos genes clonados, junto con las proteínas necesarias para la replicación y transcripción (polimerasa PB2 , PBl, PA y NP) , codificadas en plásmidos adicionales, son transfectadas dentro de líneas celulares. Los virus atenuados vivos son luego cosechados para la producción de vacunas. Materiales y Métodos Células . Células de riñon embrionario humano 293T y células de riñon de mono verde Africano (Vero) fueron mantenidas en DMEM suplementado con 10% de FCS. Para todos los experimentos, se utilizaron las células Vero CCL-81, las cuales han sido previamente utilizadas para producir una vacuna inactivada de la encefalitis Japonesa, y han sido seleccionadas para la falta de tumorogenicidad y agentes infeccioso adventicios (Sugawara et al., 2002). Las células de riñon caninos, Madin-Darby (MDCK) fueron mantenidas en MEM que contenía 5% de NCS. Todas las células fueron mantenidas a 372C en 5% de C02. Construcción de plásmidos . Para combinar los casetes de transcripción de la RNA-polimerasa 1 a la síntesis de los segmentos de RNA viral de la influenza, los casetes de transcripción que comprenden el promotor de la RNA-polimerasa 1 humana, un cADN de la influenza en orientación en sentido negativo, y el terminador de la RNA-polimerasa I de ratón (Neumann et al., 2002) fueron amplificados mediante PCR con oligunucleótidos que contenían secuencias de reconocimiento para las endonucleasas de restricción que no estaban presentes en el genoma viral. Como plantillas, se emplearon pP?lI-WSN-PB2, -PBl, -PA, -HA, -NP, -NA, -M, -NS (todas descritas en Neumann et al., 2002), las cuales contenían el cADN viral respectivo del virus A/WSN/33 (H1N1) colocado entre el promotor de la RNA-polimerasa I y las secuencias terminadoras. Los productos del PCR fueron clonados dentro de vectores estándares que contenían los sitios de restricción respectivos y fueron secuenciados para confirmar que éstos carecían de mutaciones no deseadas. La funcionalidad de los plásmidos resultantes fue confirmada mediante genética inversa. Un vector pTMl modificado (Moss et al., 1990) con sitios de restricción flanqueantes únicos, se utilizó para combinar gradualmente los casetes de transcripción de la RNA-polimerasa I individuales (este vector es descrito con más detalle más adelante) . En cada paso de clonación, la funcionalidad de los plásmidos resultantes, que contenían 2-7 unidades de transcripción del RNA-polimerasa I, fue confirmada mediante genética inversa. El plásmido final, pPolI-WSN-All (figura 3A) contenía ocho casetes de transcripción de la RNA-polimerasa I para la síntesis de los ocho RNAs virales de la influenza A/WSN/33. Este plásmido fue establemente mantenido en células E. coli JM109 a temperatura ambiente, los cultivos bacterianos fueron desarrollados en el medio Terrific Broth por aproximadamente 30 horas. Utilizando la misma estrategia, fueron generados dos plásmidos (pTM-PolI-WSN-HA-NA y pTM-PolI-WSN-PB2-PBl-PA- NP-M-MS, respectivamente) (figura 3B) que contenían los casetes de transcripción de la RNA polimerasa I para los segmentos HA y NA, y los seis segmentos virales restantes (por ejemplo, PB2 , PBl, PA, NP, M y NS), respectivamente. Los plásmidos pCAWSPB2 , pCAWSPBl y pCAWSPA incluyeron el promotor de la a-actina de pollo, la secuencia de codificación A/WSN/33 de la proteína PB2 , PBl, ó PA, y una señal de poliadenilación. Estas unidades de transcripción de RNA-polimerasa II estuvieron flanqueadas por secuencias de reconocimiento para endonucleasas de restricción únicas, ya sea mediante PCR mediante inserción de ligadores de ADN cortos. Los casetes de transcripción amplificados por PCR fueron secuenciados en su totalidad, antes de que los tres casetes de transcripción de la RNA-polimerasa II fueron combinados mediante el uso de sitios de restricción únicos. La funcionalidad del plásmido resultante (pC-PolII-WSN-PB2-PBl-PA, Figura 3C) fue verificada por genética inversa. Generación de virus a partir de plásmidos. Las células 293T (1 x 106) o las células Vero CCL-81 (5 x 105) fueron transfectadas mediante el uso de Trans IT-LT-1 (Mirus, Madison, Wl) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. En resumen, el reactivo de transfección (2 µl de Trans IT-LT1 por µg de ADN por la transfección de las células 293T, 4 µl de Trans IT-LT1 por µg de ADN por la transfección de las células Vero) , fue diluido en 100 µl de Opti-MEM (GIBCO BRL) , incubado por 5 minutos a temperatura ambiente, y agregados a los ADNs premezclados. Para todos los experimentos de transfección, 0.1 µg de cada uno de los plásmidos de "unidad simple" para la síntesis de los RNAs virales (por ejemplo, pP?lI-WSN-PB2, -PBl, -PA, -HA, NP, -M, -NS; descrito en Neumann et al., (1999), 1 µg de los plásmidos que contienen más de una unidad de transcripción de RNA-polimerasa I (por ejemplo, pTM-PolI-WSN-All , pTM-PolI-WSN-HA-NA, o pTM-PolI-WSN-PB2-PB1-PA-NP-M-NS) , y 1 µg de cada uno de los plásmidos de expresión de proteína, fueron utilizados. A los tiempos indicados después de la transfección, se determinó la dosis infecciosa del cultivo tisular al 50% (TCID50) en células MDCK. Resultados Plásmidos que contienen múltiples casetes de transcripción de la RNA-polimerasa I ó II. Para permitir la generación del virus de la influenza a partir de menos de 8-12 plásmidos (Neumann et al., 1999; Hoffmann et al., 2000; Fodor et al., 1999), los casetes de transcripción de la RNA-polimerasa I para la síntesis del RNA viral (vARN) o los casetes de transcripción de la RNA-polimerasa II para la síntesis del mARN, fueron combinados sobre un plásmido. Como un modelo, el virus A/WSN/33 (WSN) , para el cual están bien establecidos los parámetros y eficiencias de la generación viral, fue utilizado. En resumen, los casetes de transcripción de la RNA-polimerasa I que comprenden el promotor de la RNA-polimerasa I humano, un cADN viral de la influenza en orientación de sentido negativo, y el terminador de la RNA-polimerasa I de ratón, fueron amplificados mediante PCR, clonados y secuenciados, y luego unidos gradualmente mediante el uso de sitios de restricción únicos. Como una cadena principal del vector, un vector pTMl modificado (Moss et al., 1990) fue utilizado el cual soportó establemente un cADN viral de Ebola de 20 kb (Neumann et al., 2000) y es por lo tanto adecuado para la inserción de fragmentos de ADN grandes. La generación de pTM-PolI-WSN-All (Figura 3A; aproximadamente 22.5 kb de longitud), que contiene ocho unidades de transcripción de la RNA polimerasa I individuales, no presentó obstáculos mayores; sin embargo, el crecimiento de las bacterias E. coli JM109 a temperatura ambiente fue requerido para prevenir la recombinación de este plásmido . Para la generación anual de vacunas de virus de la influenza, únicamente dos segmentos de RNA virales, por ejemplo, aquellos que codifican para las glucoproteínas superficiales hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) necesitan ser reemplazados. Por esta razón, fue generado un plásmido en el cual las unidades de transcripción para los segmentos de HA y NA fueron combinadas (pTM-PolI-WSN-HA-NA) (Figura 3B) , mientras que un segundo plásmido combinó las unidades de transcripción que codifican para las proteínas internas (pTM-PolI-WSN-PB2-PBl-PA-NP-M-NS) (Figura 3B) . Estos dos plásmidos fueron estables durante la amplificación en bacterias de E. coli JM109 a 37aC. Para reducir adicionalmente el número de plásmidos requeridos para las generaciones de virus, las tres unidades de transcripción de la RNA-polimerasa II para las proteínas PB2, PBl y PA de WSN, fueron combinados sobre una columna vertebral o cadena principal del vector, utilizando la misma estrategia que permitió la unión de las unidades de transcripción de RNA-polimerasa I para la síntesis de vARN. El plásmido resultante fue estable en bacterias de E. coli JM109 a 372C; esto fue designado pC-PolI-WSN-PB2-PBl-PA (figura 3C) . Hay que hacer notar que un plásmido que combina la unidad de transcripción de RNA-polimerasa II para las proteínas polimerasas y NP fue incapaz de ser recuperado. Generación de virus en células 293T a partir de plásmidos que contienen múltiples casetes de transcripción.
Para probar la funcionalidad de los plásmidos que contienen múltiples casetes de transcripción, las células 293T fueron transfectadas con pTM-PolI-WSN-All (para la transcripción de los ochos vARNs ) (tabla 1, columnas 2 y 3), o pTM-PolI-WSN-HA-NA y pTM-PolI-WSN-PB2-PBl-PA-NP-M-NS (para la transcripción de dos y seis vARNs) (tabla 1, columnas 7 y 8) . Las células fueron co-transfectadas con cuatro plásmidos para la expresión de NP y las subunidades polimerasas a partir de plásmidos separados (tabla 1, columnas 2 y 7) o con dos plásmidos que expresan NP, ó PB2 , PBl, y PA, respectivamente (tabla 1, columnas 3 y 8) . Los virus fueron exitosamente generados a partir de estos plásmidos, demostrando que las unidades de transcripción de la RNA-polimerasa I o RNA-polimerasa II pueden ser combinadas, reduciendo de este modo el número de plásmidos requeridos para la generación artificial del virus de la influenza. A las 48 horas después de la transfección, la eficiencia de generación del virus estuvo en el intervalo de 2 x 107 a 2.7 x 108 TCID50/ml (tabla 1, columnas 2, 3, 7, 8: media = 1.1 x 108 TCÍDso/ml). Estas eficiencias fueron ligeramente mayores (p = 0.17) que aquellas obtenidas para los experimentos control en los cuales las células fueron transfectadas con 8 plásmidos separados para la transcripción de los vARNs de la influenza, y cuatro o dos plásmidos para la síntesis de NP y las tres subunidades de polimerasa (tabla 1, columna 9 y 10, produciendo 6.3 x 106 a 1.3 x 108 TCIDso/ml; media = 5.5 x 107 TCID50/ml) . Se llevó a cabo un número de experimentos control que incluían pseudo-transfecciones (tabla 1, columna 14) , células transfectadas con los plásmidos de expresión de proteína únicamente (tabla 1, columnas 11 y 12), con 8 plásmidos para la síntesis de vARN únicamente (tabla 1, columna 13), o con los plásmidos para la síntesis de dos o seis vARNs, respectivamente (tabla 1, columna 4 ó 5, respectivamente) . Ninguno de estos controles produjo virus. No obstante, los títulos virales apreciables fueron consistentemente detectados en células transfectadas con pTM-PolI-WSN-All (tabla 1, columna 1) o con una combinación de pTM-PolI-WSN-HA-NA y pTM-PolI-PB2-PB1-PA-NP-M-NS (tabla 1, columna 6) . Estos plásmidos fueron diseñados para la transcripción de los RNAs virales en sentido negativo, y la síntesis de NP y las tres proteínas polimerasas no fue esperada. De este modo, la generación de virus con estos plásmidos solos no fue esperada tampoco (para posible explicaciones ver más adelante) .
Tabla 1: Eficiencia de generación de virus en células 293T. oo Las células 293T fueron transfectadas con los plásmidos indicados. 48 horas más tarde, los títulos virales en el sobrenadante fueron determinados mediante ensayo de placa en células MDCK. Se muestran los resultados de tres experimentos independientes. Plásmido "8 Unidades": pTM- Pol I -WSN-All; Plásmido "6 Unidades": pTM- Pol I -WSN-PB2 -PBl- PA-NP-M-SN; Plásmido "2 Unidades": pTM- Poli -WSN-HA-NA ; Plásmido 8 x 1 Unidades: combinación de Poli -WSN- PB2 , -PBl, -PA, -HA, -NP, -NA, -M, -NS ; p.t.: post-trans fección . Generación de Virus en células B a partir de plásmidos que contienen múltiples casetes de transcripción . En seguida, se probó la eficiencia de la generación de virus en células Vero, que son difíciles de transfectar a altas eficiencias. A las 48 horas después de la transfección, la generación de virus a partir de 12 plásmidos fue despreciable en dos experimentos y baja en un experimento (tabla 2, columna 9) , mientras que a las 72 horas después de la transfección, el virus fue detectado en los tres experimentos. El uso únicamente de uno o dos plásmidos para las síntesis de los RNA virales incrementó la eficiencia de generación de virus a las 72 horas después de la transfección, especialmente en combinación con pC-PolI I-WSN- PB2 - PBl - PA , produciendo hasta 2.5 x 106 TCID50/ml (tabla 2, columna 9 vs . 3: p 0.0017; columna 9 vs . 9: p 0.0063) . Consistentemente, la expresión de las tres proteínas polimerasas a partir del plásmido pC- Pol II-WSN- PB2 -PBl-PA dio como resultado generación de virus más eficiente en comparación a la provisión de estas proteínas a partir de plásmidos separados (tabla 2, compárense columnas 2 y 3 ( p = 0.0054) , columnas 7 y 8 (p = 0.028) y columnas 9 y 10 (p = 0.2)) . El virus fue detectado a partir del plásmido pTM-Pol I-WSN-All únicamente (tabla 2, columna 1) , o de los plásmidos pTM-P?lI-WSN-PB2-PBl-PA-NP-M-NS y pTM- Pol I -WSN-HA-NA (tabla 2, columna 6) ; no obstante, la generación del virus no fue observada consistentemente y los títulos de virus resultantes fueron bajos. Esto fue probablemente debido a la menor eficiencia de transfección de las células Vero. Tomadas conjuntamente, estos resultados muestran que los plásmidos que contienen múltiples unidades de transcripción de RNA-polimerasa I ó II pueden ser altamente eficientes en la generación de virus en células Vero.
Tabla 2: Eficiencia de generación de virus en células Vero Las células Vero fueron transfectadas con los plásmidos indicados. A las 48 horas ó 72 horas después de la transfección, los títulos virales en el sobrenadante fueron determinados mediante ensayo de placa en células MDCK. Se muestran los resultados de tres experimentos independientes. Plásmido "8 Unidades": pTM-PolI-WSN-All ; Plásmido "6 Unidades": pTM-PolI-WSN-PB2-PBl-PA-NP-M-SN; Plásmido "2 Unidades": pTM-PolI-WSN-HA-NA; Plásmido 8 x 1 Unidades: combinación de PolI-WSN-PB2 , -PBl, -PA, -HA, -NP, -NA, -M, -NS; p.t.: post-transfección . Discusión La generación de virus de vacuna puede ser lograda ahora mediante genética inversa. De hecho, éste es el único procedimiento eficiente para la producción de cepas de vacunas para virus de la influenza aviar altamente patógena. Estos virus son letales para humanos y huevos embrionarios (Shorgtridge et al., 1998); por lo tanto, la atenuación, por ejemplo, mediante la alteración de su secuencia del sitio de escisión por HA (Horimoto et al., 1994; Subbarao et al, 2003), es crítica para asegurar el crecimiento a títulos altos en huevos embrionarios, al tiempo que protege al personal de producción de vacunas contra la exposición a virus aerosolizados . Para el uso en humanos, la producción de cepas de vacuna requerirá líneas celulares que estén certificadas para la falta de tumorigenicidad y agentes infecciosos adventicios. Una línea celular de este tipo es una línea de células Vero, la cual es actualmente utilizada para la producción de vacunas contra la rabia y la polio (Montagnon et al., 1999). El uso de un procedimiento de "12 plásmidos", Fodor et al. (1999) reportó la generación de 10- 20 unidades formadoras de placa a partir de 107 células Vero en el 42 día después de la transfección. Wood y Robertson (2004) generaron una cepa de vacuna de referencia H5N1 en células Vero mediante genética inversa, pero no reportaron la eficiencia de rescate, mientras que los virus basados en A/PR/8/34 (H1N1) o A/PR/8/34 fueron generadas en células Vero con una eficiencia de < 103 pfu/ml (Ozaki et al., 2004). Al combinar las unidades de transcripción de la RNA-polimerasa I y/o II y lograr de este modo el rescate viral a partir de menos plásmidos, fuimos capaces de producir aproximadamente 105-106 TCID50/ml a partir de 5 x 105 células Vero en el día 3 después de la transfección. Con esto, se logró una generación de virus más eficiente en células Vero con estos sistemas, en comparación con el procedimiento de "12 plásmidos" (tabla 2, compárense columna 3 u 8 con la columna 9) . Este sistema de genética inversa robusta y altamente eficiente, podría ser por lo tanto, un activo para la preparación rápida de cepas de vacuna en situaciones pandémicas . La generación virus de la influenza confía en la expresión de las proteínas polimerasa y NP . La combinación de las subunidades de polimerasa son un plásmido aumento la eficiencia de la generación del virus. Este hallazgo puede ser explicado por la reducción en el número de plásmidos utilizados para el rescate del virus, o en la combinación de las tres unidades de transcripción puede reflejar más estrechamente las proporciones equimolares de las subunidades de polimerasa encontradas en células infectadas. La combinación de las unidades promotoras y terminadoras idénticas sobre un plásmido se piensa que provoca la recombinación. No obstante, en la presente se demostró que ocho secuencias promotoras y terminadoras de RNA-polimerasa I o tres de RNA-polimerasa II, pueden ser combinadas sobre un vector de cadena principal. Hoffmann et al. (2000) demostraron que una combinación de los promotores de RNA-polimerasa I y II permite la síntesis de vARN y mARN a partir de una plantilla. Se puede diseñar por lo tanto un plásmido que contiene cuatro unidades de transcripción de RNA-polimerasa I/II para la síntesis de los vARN y mARNs de PB2 , PBl, PA y NP y cuatro unidades de transcripción de RNA-polimerasa I para la síntesis de los vARN de NA, HA, M y NS . Tal construcción debería permitir la generación eficiente del virus de la influenza a partir de un plásmido. Además, el éxito descrito en la presente en la combinación de unidades de transcripción sobre un plásmido, puede proporcionar el incentivo para que otros apliquen esta estrategia a otros sistemas de genética inversa que confían en la co-transfección de células con varios plásmidos, o para diseñar los vectores para la expresión simultánea de varias proteínas a partir de un plásmido. Sorprendentemente, la generación de virus fue observada a partir de un plásmido simple pTM-PolI-WSN-All . La expresión de las proteínas virales de la influenza a partir de este plásmido sugieren la síntesis de proteína a partir de un promotor de la RNA-polimerasa II (críptico) presente en el vector, o en la región promotora o terminadora de la RNA polimerasa I . Para determinar si la secuencia promotora de la RNA-polimerasa I alberga un promotor en la dirección opuesta que pudiera impulsar potencialmente la expresión de la proteína a partir de un cásete de transcripción corriente arriba (5'), se clonó un promotor de la RNA-polimerasa I invertida enfrente de un gen reportero, no obstante, no fueron detectados niveles apreciables de la expresión del gen reportero a partir de este plásmido (datos no mostrados) . La generación del virus de la influenza confía en la expresión de cuatro diferentes proteínas (PB2, PBl, PA y NP) y podría requerir por lo tanto varios eventos de lectura. Alternativamente, la expresión de la proteína puede haber resultado de otro mecanismo, tal como la iniciación interna de la traducción. Un vector pTMl modificado (Moss et al., 1990) fue utilizado, el cual contiene el origen de replicación fl del ADN de una sola hebra, el gen de resistencia a la ampicilina, un sitio de clonación múltiple, y el terminador transcripcional de la RNA-polimerasa T7. El promotor de la RNA-polimerasa T7 fuerte y partes de la región no traducida del EMCV y las secuencias de timidina-cinasa que están presentes en el vector de clonación de pTMl original, han sido eliminados de esta versión modificada. La síntesis de las proteínas polimerasa y NP a partir de este vector, fue por lo tanto no esperada. No obstante, la generación del virus de la influenza a partir de plásmidos diseñados para producir únicamente RNAs de hebra negativa, es intrigante y merece estudio adicional. En resumen, aquí, se describe un sistema mejorado para la generación del virus de la influenza que permite la producción fácil y reproducible de virus de vacuna en células Vero. La aplicación de este sistema puede ser especialmente ventajoso en situaciones de brotes de virus de influenza aviar altamente patógenos. Ejemplo 2 Para mejorar la producción de virus recombinante, un procedimiento es clonar los cADNs que codifican para los 8 genes virales en un plásmido. De este modo, en vez de generar ocho RNAs virales a partir de ocho plásmidos, la unidad de transcripción para la síntesis de los RNAs virales puede ser combinada sobre un plásmido; por lo tanto, todos los ochos RNAs virales son elaborados a partir de únicamente un plásmido, permitiendo el rescate del virus a partir de menos plásmidos. De igual modo, las unidades de transcripción para la síntesis de proteínas virales pueden ser combinadas sobre menos plásmidos . Si los 8 genes virales son similarmente colocados en un plásmido, el número de plásmidos requeridos para la síntesis del virus de la influenza es de 5 (1 plásmido para todos los genes virales y 4 plásmidos para los genes que codifican para PB2 , PBl, PA y NP) . Alternativamente, se pueden combinar los genes PB2 , PBl, PA y NP en 1 plásmido, cada gen flanqueado por un promotor de la RNA-polimerasa II y una señal de poliadenilación. Además, todos los genes virales en PB2 , PBl, PA y NP pueden ser combinados en 1 plásmido. Otras combinaciones pueden incluir 1 plásmido con seis genes virales, cada uno con un promotor Pol I, 1 plásmido con 3 genes virales, cada uno con promotor Pol II, y 1 plásmido con 2 genes virales (HA y NA) cada uno con un promotor Pol I. Un gen viral es flanqueado por las secuencias promotoras y terminadora de la RNA-polimerasa I para formar una unidad de transcripción (o cásete) , y en algunas modalidades, ese cásete de transcripción es luego flanqueado por una señal promotora y de terminación de la RNA-polimerasa II (señal de poliadenilación) (figura 4). Este procedimiento produce RNA de hebra negativa genómico sintetizado por la RNA-polimerasa I y el mARN sintetizado por la RNA-polimerasa II a partir del mismo gen. De este modo, la presente invención reduce el número de plásmidos para la transfección de 12 a 5 o menos, por ejemplo, 4, 3, 2, ó 1, incrementa la eficiencia de rescate del virus a partir de las líneas celulares, permitiendo la generación de varios virus atenuados, permite el uso de líneas celulares con baja eficiencia de transfección (por ejemplo, células Vero), permite la generación consistente del virus de la influenza para la producción de vacunas y/o reduce los problemas regulatorios de la FDA respecto a la historia de los plásmidos, la pureza y la toxicidad de los mismos. Referencias Albo et al., J. Virol. 70:9013 (1996). Avery's Drug Treatment: Principies and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics. 3rd edition, ADIS Press, Ltd., Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1987). Aymard-Henry et al, Virology: A Practical Approach, Oxford IRL Press, Oxford, 119-150(1985). Bachmeyer. Intervirology . 5:260 (1975). Berkow et al., eds., The Merck Manual , 16th edition, Merck & Co . , Rahway, NJ (1992).
Brands et al., Dev. Biol. Stand. 98:93 (1999). Bridgen et al.. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A, 93:15400 (1996) . Bruhl et al, Vaccine. 19:1149 (2000). Claas et al., Lancet, 351:472 (1998). Dunn et al., Virology. 211:133 (1995). Edwards, J. Infect. Dis. 169: 68 (1994) . Elliott, Mol. Med.. 3:572 (1997). Enami et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 87:3802 (1990) Fodor et al., J. Virol. 73:9679 (1999) Fouchier et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 101:1356 (2004) . Gerdil, Vaccine. 21:1776 (2003). Grand y Skehel, Nature. New Biology. 238:145 (1972) Hagen et al., J. Virol.. 68:1509 (1994). Halperin et al., Vaccine. 20:1240 (2002). Hoffman et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 97:6108 (2000) Hoffman et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 99:11411 (2002) . Honda et al., J. Biochem. (Tokyo), 104:1021 (1988). Horimoto et al., J. Virol. 68:3120 (1994). Kilbourne, Bull. M2 World Health Org. 41: 653 (1969) Kistner et al.. Dev. Biol. Stand. 98:101 (1999). Kistner et al., Vaccine. 16:960 (1998). Kistner et al., Wein. Klin. Wochenschr.. 111:207 Ü999) Koopmans et al., Lancet, 363:587 (2004) Laver y Webster, Virology. 69:511 (1976). Lawson et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 92:4477 (1995) . Leahy et al, J. Virol.. 71:8347 (1997). Leahy et al., J. Virol., 71:8352 (1997). Leahy et al., J. Virol.. 72:2305 (1998). Mizrahi, (ed. ) , Viral Vaccines. Wiley-Liss, New York, 39-67 (1990) . Montagnon et al., Dev. Biol. Stand., 98:137 (1999). Moss et al., Nature, 348:91 (1990). Murphy, Infect. Dis. Clin. Pract. 2: 174 (1993). Muster et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 88: 5177 (1991) . Neumann et al., Adv. Virus Res. 53:265 (1999). Neumann et al., J. Gen. Virol.. 83:2635 (2002). Neumann et al., J. Virol .. 76:406 (2002). Neumann et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 96:9345 (1999) . Nicolson et al., Vaccine, 23:2943 (2005).
Ogra et al., J. Infect. Dis. , 134: 499 (1977). Osol (ed. ) , Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Co . , Easton, PA 1324-1341 (1980). Ozaki et al., J. Virol. 78:1851 (2004). Palache et al., Dev. Biol. Stand. 98:115 (1999). Peiris et al., Lancet. 363:617 (2004). Potter in Textbook of Influenza, eds . Nicholson, K.G., Webster, R.G. y Hey, A.J.; Malden : Blackwell Scientific Publication, pp . 3-18 (1998) . Robertson et al., Biologicals. 20:213 (1992). Robertson et al . , Giornale di Igiene e Medicina Preventiva, 29:4 (1988). Schnell et al., EMBO J.. 13:4195 (1994). Shortridge et al., Virology. 252:331 (1998). Subbarao et al, J. Virol. 67:7223 (1993). Subbarao et al., Science. 279:393 (1998). Subbarao et al., Virology. 305:192 (2003). Sugawara et al., Biologicals. 30:303 (2002). Thompson et al, Jama. 289:179 (2003). Weber et al., Arch. Virol.. 142:1029 (1997). Weber et al., J.Virol. , 70:8361 (1996). Weber et al., Arch. Virol. 142:1029 (1997). World Health Organization TSR No. 673 (1982) . WHO, Cumulative Number of Confirmed Human Cases of Avian Influenza A (H5N1) since 28 Enero 2004.
Wood y Robertson. Nat. Rev. Microbiol.. 2:842 (2004) . Yasuda et al. J. Virol. 68:8141 (1994). Todas las publicaciones, patentes y soluciones de patentes son incorporadas por referencia en la presente. Mientras que en la especificación anterior esta invención ha sido descrita en relación a ciertas modalidades preferidas de la misma, y muchos detalles han sido descritos para fines de ilustración, será aparente para aquellos expertos en la técnica que la invención es susceptible a modalidades adicionales, y que algunos de los detalles descritos en la presente pueden ser variados considerablemente sin apartarse de los principios básicos de la invención. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (49)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una composición, caracterizada porque comprende : a) al menos un plásmido que incluye dos o más casetes de transcripción para la producción de vARN seleccionados de un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PA del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN del PBl del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN del PB2 del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un c sete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN del HA del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NP del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NA del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de M del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, y/o un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NS del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli; y b) al menos un plásmido que incluye uno o más casetes de transcripción para la producción de mARN, seleccionados de un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para la PA del virus de la influenza, enlazada a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para PBl del virus de la influenza, enlazada a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para PB2 del virus de la influenza, enlazada a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, y/o un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para NP del virus de la influenza, enlazada a una secuencia de terminación de la transcripción Polll., en donde la composición incluye ocho casetes de transcripción para el vARN y en donde la transfección de una célula con la composición produce títulos de al menos 1 x 102 TCID50/ml.
  2. 2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es para la producción del virus de la influenza de menos de ocho plásmidos.
  3. 3. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque un plásmido tiene ocho casetes de transcripción para la producción del vARN.
  4. 4. La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque un plásmido tiene un cásete de transcripción para la producción de mARN y otro plásmido tiene tres casetes de transcripción para la producción de mARN.
  5. 5. La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque tiene cuatro plásmidos para la producción de mARN.
  6. 6. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque un plásmido tiene seis casetes de transcripción para la producción de vARN y otro plásmido tiene dos casetes de transcripción para la producción de vARN.
  7. 7. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque un plásmido tiene un cásete de transcripción para la producción de mARN y otro plásmido tiene tres casetes de transcripción para la producción de mARN.
  8. 8. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque tiene cuatro plásmidos para la producción de mARN.
  9. 9. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque un plásmido tiene un cásete de transcripción para la producción de mARN y otro plásmido tiene tres casetes de transcripción para la producción de mARN.
  10. 10. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque tiene cuatro plásmidos para la producción de mARN.
  11. 11. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque comprende un cásete de transcripción que comprende un promotor ligado a las secuencias del virus de la influenza 5', que comprende las secuencias de no codificación del virus de la influenza 5', enlazadas a un ADN de interés enlazado a las secuencias del virus de la influenza 3' que comprende las secuencias de no codificación del virus de la influenza 3', enlazadas a una secuencia de terminación de la transcripción.
  12. 12. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el cásete de transcripción que comprende el ADN de interés está sobre un plásmido diferente al de los casetes de transcripción para la producción de vARN.
  13. 13. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el cásete de transcripción que comprende el ADN de interés está sobre un plásmido diferente al de los casetes de transcripción para la producción de mARN.
  14. 14. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el cásete de transcripción que comprende el ADN de interés está sobre un plásmido que tiene uno de los casetes de transcripción para la producción de vARN.
  15. 15. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el cásete de transcripción que comprende el ADN de interés está sobre un plásmido que tiene uno de los casetes de transcripción para la producción de mARN.
  16. 16. Una composición, caracterizada porque comprende : al menos un plásmido que incluye dos o más casetes de transcripción para la producción de vARN seleccionados de un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PA del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de 'la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN del PBl del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN del PB2 del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN del HA del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NP del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NA del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de M del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, y/o un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NS del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli en donde la composición incluye al menos seis casetes de transcripción para vARN, en donde la composición incluye ocho casetes de transcripción para vARN y en donde la transfección de una célula con la composición produce títulos de al menos 1 x 102 TCID50/ml.
  17. 17. La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque es para la producción del virus de la influenza de menos de ocho plásmidos.
  18. 18. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 17, caracterizada porque un plásmido tiene ocho casetes de transcripción para la producción del vARN.
  19. 19. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 17, caracterizada porque un plásmido tiene seis casetes de transcripción para la producción de vARN y otro plásmido tiene dos casetes de transcripción para la producción de vARN.
  20. 20. La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque comprende un plásmido que tiene un cásete de transcripción para la producción de mARN y otro plásmido que tiene tres casetes de transcripción para la producción de mARN.
  21. 21. La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque comprende además cuatro plásmidos para la producción de mARN.
  22. 22. La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque comprende además un plásmido que tiene un cásete de transcripción para la producción del mARN y otro plásmido que tiene tres casetes de transcripción para la producción del mARN.
  23. 23. La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque comprende además cuatro plásmidos para la producción de mARN.
  24. 24. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, caracterizada porque comprende además un cásete de transcripción que comprende un promotor ligado a las secuencias del virus de la influenza 5', que comprende las secuencias de no codificación del virus de la influenza 5 ' , enlazadas a un ADN de interés enlazado a las secuencias del virus de la influenza 3' que comprenden las secuencias de no codificación del virus de la influenza 3 ' , enlazadas a una secuencia de terminación de la transcripción.
  25. 25. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el cásete de transcripción que comprende el ADN de interés está sobre un plásmido diferente al de los casetes de transcripción para la producción de vARN.
  26. 26. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el cásete de transcripción que comprende el ADN de interés está sobre un plásmido que tiene uno de los casetes de transcripción para la producción de vARN.
  27. 27. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, caracterizada porque la HA es una HA del tipo A.
  28. 28. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, caracterizada porque la HA es una HA del tipo B.
  29. 29. Un método para preparar el virus de la influenza, caracterizado porque comprende: poner en contacto una célula con la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 en una cantidad efectiva para producir el virus de la influenza infeccioso.
  30. 30. Un método para preparar el virus de la influenza, caracterizado porque comprende poner en contacto una célula con un plásmido que incluye dos o más casetes de transcripción para la producción del vARN seleccionados de un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PA del virus de la influenza enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un c sete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PBl del virus de la influenza enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PB2 del virus de la influenza enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de HA del virus de la influenza enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NP del virus de la influenza enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NA del virus de la influenza enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de M del virus de la influenza enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, y/o un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NS del virus de la influenza enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, y un plásmido que incluye uno o más casetes de transcripción para la producción del mARN seleccionados de un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para la PA del virus de la influenza, enlazada a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para la PBl del virus de la influenza, enlazada a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para la PB2 del virus de la influenza, enlazada a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, y/o un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para la NP del virus de la influenza, enlazada a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, en donde la célula es puesta en contacto con ocho casetes de transcripción para vARN, y en donde la célula produce títulos de al menos 1 x 102 TCID5o/ml.
  31. 31. Un método para preparar el virus de la influenza, caracterizado porque comprende poner en contacto una célula con un plásmido que incluye los casetes de transcripción para la producción de vARN que incluye un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PA del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PBl del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PB2 del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de HA del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NP del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NA del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de M del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, y un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NS del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, en donde la célula es puesta en contacto con ocho casetes de transcripción para vARN y en donde la célula produce títulos de al menos 1 x 102 TCID50/ml.
  32. 32. Un método para preparar el virus de la influenza, caracterizado porque comprende poner en contacto una célula con dos plásmidos, en donde los dos plásmidos conjuntamente comprenden un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PA del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PBl del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PB2 del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de HA del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NP del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NA del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de M del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NS del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, en donde la célula es puesta en contacto con ocho casetes de transcripción para vARN y en donde la célula produce títulos de al menos 1 x 102 TCID50/ml.
  33. 33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, caracterizado porque la célula es una célula altamente transfectable .
  34. 34. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, caracterizado porque la célula es una célula Vero.
  35. 35. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 34, caracterizado porque la HA es una HA del tipo A.
  36. 36. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 34, caracterizado porque la HA es una HA del tipo B.
  37. 37. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 36, caracterizado porque comprende además el aislamiento del virus.
  38. 38. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 37, caracterizado porque comprende además un cásete de transcripción que incluye un promotor enlazado a las secuencias del virus de la influenza 5', que comprenden las secuencias de no codificación del virus de la influenza 5', enlazadas a un ADN de interés enlazado a las secuencias del virus de la influenza 3', que comprenden las secuencias de no codificación del virus de la influenza 3', enlazadas a una secuencia de terminación de la transcripción.
  39. 39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el ADN de interés está en la orientación en sentido positivo.
  40. 40. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el ADN de interés está en la orientación en sentido negativo.
  41. 41. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el ADN de interés incluye una estructura de lectura abierta que codifica para un polipéptido o péptido inmunogénico de un patógeno o un polipéptido o péptido terapéutico.
  42. 42. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 36 y 38 a 41, caracterizado porque comprende además el aislamiento del virus.
  43. 43. Una célula caracterizada porque es puesta en contacto con la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28.
  44. 44. Un plásmido para la producción del virus de la influenza, caracterizado porque comprende: un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PA del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PBl del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PB2 del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de HA del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NP del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NA del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de M del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, y un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NS del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, en donde la transfección de una célula con el plásmido produce títulos de al menos 1 x 102 TCID50/ml.
  45. 45. Un plásmido para la producción de vARN, caracterizado porque comprende: un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PA del virus de la influenza, enlazado a una 5 secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de PBl del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli 10 operablemente enlazado a un cADN de PB2 del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NP del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de i5 terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de M del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli 0 operablemente enlazado a un cADN de NS del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, en donde la transfección de una célula con el plásmido y los casetes de transcripción para la producción de vARN de HA y NA produce títulos de al menos 1 x 5 102 TCID50/ml.
  46. 46. Un plásmido para la producción de vARN, caracterizado porque comprende: un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de HA del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, y un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NA del virus de la influenza, enlazado a la secuencia de terminación de la transcripción Poli, en donde la transfección de una célula con el plásmido y los casetes de transcripción para la producción de vARN de PA, PBl, PB2 , NP, M y NS produce títulos de al menos 1 x 102 TCID50/ml.
  47. 47. Un plásmido para la producción de mARN, caracterizado porque comprende un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para la PA del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para la PBl del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, un cásete de transcripción que comprende un promotor Polll operablemente enlazado a una región de codificación del ADN para la PB2 del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Polll, en donde el plásmido no codifica para NP .
  48. 48. Un plásmido para la producción del virus de la influenza, caracterizado porque comprende un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de HA del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NA del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de M del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli operablemente enlazado a un cADN de NS del virus de la influenza, enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción Poli, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transfección Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll cada uno operablemente enlazado a un segmento de ADN para la PA del virus de la influenza, un c sete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transfección Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll cada uno operablemente enlazado a un segmento de ADN para la PBl del virus de la influenza, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transfección Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll cada uno operablemente enlazado a un segmento de ADN para la PB2 del virus de la influenza, un cásete de transcripción que comprende un promotor Poli y una secuencia de terminación de la transfección Poli y un promotor Polll y una secuencia de terminación de la transcripción Polll cada uno operablemente enlazado a un segmento de ADN para la NP del virus de la influenza.
  49. 49. Un método para preparar el virus de la influenza, caracterizado porque comprende: poner en contacto una célula con el plásmido de conformidad con la reivindicación 44 ó 48, en una cantidad efectiva para producir virus infecciosos de la influenza.
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Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5215561B2 (ja) * 2003-05-28 2013-06-19 ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション ワクチン及び遺伝子治療のための高力価組換えインフルエンザ・ウイルス
JP2008520248A (ja) 2004-11-19 2008-06-19 ウィスコンシン・アラムナイ・リサーチ・ファウンデイション タンデム転写ユニットを有する組換えインフルエンザベクター
WO2007126810A2 (en) 2006-03-31 2007-11-08 Warf - Wisconsin Alumni Research Foundation High titer recombinant influenza viruses for vaccines
EP2150616A4 (en) 2007-05-10 2011-07-27 Univ Arizona REGULATED ANTIGEN SYNTHESIS AND / OR REGULATED ATTENUATION FOR IMPROVING VACCINATE IMMUNOGENICITY AND / OR SAFETY
WO2008141226A2 (en) * 2007-05-10 2008-11-20 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacteria comprising vectors for expression of nucleic acid sequences encoding antigens
WO2008156778A2 (en) 2007-06-18 2008-12-24 Tokiko Watanabe Influenza m2 protein mutant viruses as live influenza attenuated vaccines
EP2045323A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-08 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Linear expression constructs for production of influenza virus particles
US8465755B2 (en) * 2007-10-05 2013-06-18 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacterium capable of eliciting an immune response against enteric pathogens
CA2713178A1 (en) * 2008-02-09 2009-08-13 Sanofi Pasteur Biologics Co. Influenza b vaccines
WO2010045620A1 (en) 2008-10-17 2010-04-22 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacterium capable of eliciting an immune response against streptococcus pneumoniae
US9163219B2 (en) * 2009-04-14 2015-10-20 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Single expression vector for generation of a virus with a segmented genome
CA2762044A1 (en) * 2009-05-18 2010-11-25 Panacea Biotec Ltd Universal influenza vaccine based on recombinant modified vaccinia ankara virus (mva)
WO2010135563A1 (en) 2009-05-22 2010-11-25 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacterium and methods of antigen and nucleic acid delivery
US9045742B2 (en) * 2009-05-29 2015-06-02 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant Edwardsiella bacterium
JP5845180B2 (ja) * 2009-07-30 2016-01-20 モウント シナイ スクール オフ メディシネ インフルエンザウイルス及びそれらの使用
AU2010277310B2 (en) * 2009-07-31 2015-01-15 Seqirus UK Limited Reverse genetics systems
WO2011056591A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Warf - Wisconsin Alumni Research Foundation High titer recombinant influenza viruses with enhanced replication in vero cells
GB0919117D0 (en) * 2009-10-30 2009-12-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Process
US9062297B2 (en) 2010-01-13 2015-06-23 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Yersinia pestis vaccine
EP2526185A4 (en) 2010-01-22 2013-07-24 Univ Arizona BACTERIUM WITH REGULATED RFAH NUCLEIC ACID
US10130697B2 (en) 2010-03-23 2018-11-20 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Vaccines comprising mutant attenuated influenza viruses
WO2011150421A2 (en) 2010-05-28 2011-12-01 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacterium to decrease tumor growth
KR101323582B1 (ko) * 2011-03-17 2013-10-30 충북대학교 산학협력단 Ｖｅｒｏ 세포 유래의 ｐｏｌⅠ 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터
JP2014527799A (ja) * 2011-08-26 2014-10-23 ダブリュエーアールエフ−ウィスコンシン アラムナイ リサーチ ファウンデーション 変異型ｐｂ２遺伝子セグメントを有する弱毒化生ワクチンとしてのインフルエンザウイルス
US9303264B2 (en) 2012-05-18 2016-04-05 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Photosynthetic microorganisms expressing thermostable lipase
US9580718B2 (en) 2013-06-17 2017-02-28 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Attenuated live bacteria with increased acid resistance and methods of use thereof
WO2015009743A1 (en) 2013-07-15 2015-01-22 Wisconsin Alumni Research Foundation High titer recombinant influenza viruses with enhanced replication in mdck or vero cells or eggs
US10053671B2 (en) 2014-06-20 2018-08-21 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses
US10633422B2 (en) 2015-06-01 2020-04-28 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza virus replication by inhibiting microRNA lec7C binding to influenza viral cRNA and mRNA
US9890363B2 (en) 2015-07-06 2018-02-13 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza virus replication for vaccine development
JP2018530314A (ja) 2015-08-28 2018-10-18 ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション ウイルス様粒子からの感染性インフルエンザウイルスの生成
WO2017143236A1 (en) 2016-02-19 2017-08-24 Yoshihiro Kawaoka Improved influenza b virus replication for vaccine development
WO2017218624A1 (en) 2016-06-15 2017-12-21 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus hemagglutinin proteins and uses thereof
US11254733B2 (en) 2017-04-07 2022-02-22 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anti-influenza B virus neuraminidase antibodies and uses thereof
US11197926B2 (en) 2017-10-25 2021-12-14 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Recombinant influenza viruses with stabilized HA for replication in eggs
EP3810634A4 (en) 2018-06-21 2022-07-27 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Mosaic influenza virus hemagglutinin polypeptides and uses thereof
JP7783047B2 (ja) 2018-08-07 2025-12-09 ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション 組換えの生物学的に封じ込められたフィロウイルスワクチン
JP7655849B2 (ja) 2018-08-20 2025-04-02 ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション ヘマグルチニン（ｈａ）タンパク質内の非ドミナントエピトープに対する免疫応答を誘起するためのベクター
JP2022527235A (ja) 2019-01-23 2022-06-01 義裕 河岡 インフルエンザウイルスにおける付加的遺伝子に遺伝的安定性を付与する突然変異
EP3921413A1 (en) 2019-02-08 2021-12-15 Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) Humanized cell line
CN109957550B (zh) * 2019-03-13 2020-10-20 浙江森卫生物医药发展有限公司 流感病毒的拯救方法及其组合物
US11390649B2 (en) 2019-05-01 2022-07-19 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza virus replication for vaccine development
US11807872B2 (en) 2019-08-27 2023-11-07 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Recombinant influenza viruses with stabilized HA for replication in eggs
US20210221854A1 (en) * 2020-01-17 2021-07-22 Regents Of The University Of Minnesota Systems, methods, and cell lines for generating influenza virus or influenza virus proteins
JP2023511444A (ja) 2020-01-24 2023-03-17 ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション 安定化されたｎａを有する組換えインフルエンザウイルス
WO2021195410A1 (en) 2020-03-25 2021-09-30 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Recombinant multivalent influenza viruses

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4071618A (en) 1974-09-03 1978-01-31 Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University Process for preparing virus disease live vaccines
JPS57136528A (en) 1981-02-09 1982-08-23 Hayashibara Biochem Lab Inc Preparation of viral vaccine
NZ219515A (en) 1987-02-10 1989-09-27 Wellcome Found Fusion proteins comprising influenza virus ha and a nonnatural antigenic epitope
US5854037A (en) 1989-08-28 1998-12-29 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US5786199A (en) 1989-08-28 1998-07-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US5840520A (en) 1989-08-28 1998-11-24 Aviron Recombinant negative strand RNA virus expression systems
US5166057A (en) 1989-08-28 1992-11-24 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand rna virus expression-systems
US6001634A (en) 1989-08-28 1999-12-14 Palese; Peter Recombinant negative strand RNA viruses
US5919676A (en) 1993-06-24 1999-07-06 Advec, Inc. Adenoviral vector system comprising Cre-loxP recombination
PT702085E (pt) 1994-07-18 2004-04-30 Karl Klaus Conzelmann Virus de arn de cadeia negativa nao segmentada infeccioso recombinante
US5716821A (en) 1994-09-30 1998-02-10 Uab Research Foundation Prevention and treatment of respiratory tract disease
WO1996010400A1 (en) 1994-09-30 1996-04-11 The Uab Research Foundation Gene therapy vectors and vaccines based on non-segmented negatives stranded rna viruses
EP0704533A1 (en) 1994-09-30 1996-04-03 Bayer Ag An attenuated vaccination virus, a method to make the virus and a pharmaceutical compositions comprising the virus
US5994526A (en) 1996-06-21 1999-11-30 Plant Genetic Systems Gene expression in plants
EP2112220A3 (en) 1996-07-15 2010-01-06 The Government of the United States of America, as represented by The Department of Health and Human Services Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences
US6271011B1 (en) 1996-10-15 2001-08-07 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Pasteurella neuraminidase coding sequences and diagnostic methods
WO1998048834A1 (en) 1997-04-30 1998-11-05 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant influenza viruses expressing tumor-associated antigens as antitumor agents
BR9809456B1 (pt) 1997-05-23 2011-06-28 molécula isolada de polinucleotìdeo, composição de célula ou isenta de célula, partìcula de piv infeciosa, atenuada e imunogênica, e, composição imunogênica.
ES2255181T3 (es) 1997-08-05 2006-06-16 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw. Antigeno inmunoprotector contra la gripe y su uso en vacunacion.
US6146642A (en) 1998-09-14 2000-11-14 Mount Sinai School Of Medicine, Of The City University Of New York Recombinant new castle disease virus RNA expression systems and vaccines
EP1117807B1 (en) * 1998-10-07 2010-07-21 Sanofi Pasteur Limited Protective recombinant haemophilus influenzae high molecular weight proteins
EP1035209A1 (en) 1999-03-06 2000-09-13 ARTEMIS Pharmaceuticals GmbH Stable recombinant influenza viruses free of helper viruses
US8715940B2 (en) 1999-04-06 2014-05-06 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of making recombinant influenza virus
EP2345716B1 (en) 1999-04-06 2015-01-14 Wisconsin Alumni Research Foundation Recombinant influenza viruses for vaccines and gene therapy
US6686168B1 (en) 1999-11-04 2004-02-03 Zymogenetics, Inc. Cell surface display of proteins by recombinant host cells
AU5533601A (en) 2000-04-14 2001-10-30 Wisconsin Alumni Res Found Viruses comprising mutation ion channel protein
DE60137345D1 (de) 2000-04-28 2009-02-26 St Jude Childrens Res Hospital Dna-transfektionssystem zur erzeugung von infektiösen negativsträngigen rna virus
US6358733B1 (en) * 2000-05-19 2002-03-19 Apolife, Inc. Expression of heterologous multi-domain proteins in yeast
US20040241139A1 (en) 2000-07-20 2004-12-02 Gerd Hobom Recombinant influenza viruses with bicistronic vRNAs coding for two genes in tandem arrangement
EP1201760A1 (en) 2000-10-30 2002-05-02 ARTEMIS Pharmaceuticals GmbH Influenza virus vector for human dendritic cells
HUE050222T2 (hu) 2002-02-13 2020-11-30 Wisconsin Alumni Res Found Szignál influenzavírus-vektorok pakolására
CN103540613A (zh) 2002-04-26 2014-01-29 米迪缪尼有限公司 制备流感病毒的多质粒系统
CA2522081C (en) 2003-04-23 2013-01-29 Wisconsin Alumni Research Foundation Recombinant influenza viruses holding a mutation in a transmembrane protein gene
JP5215561B2 (ja) 2003-05-28 2013-06-19 ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション ワクチン及び遺伝子治療のための高力価組換えインフルエンザ・ウイルス
JP2006525815A (ja) 2003-05-28 2006-11-16 ウィスコンシン・アラムナイ・リサーチ・ファウンデイション Ｐｏｌｉｉプロモーターおよびリボザイムを有する組換えインフルエンザベクター
JP2008520248A (ja) 2004-11-19 2008-06-19 ウィスコンシン・アラムナイ・リサーチ・ファウンデイション タンデム転写ユニットを有する組換えインフルエンザベクター

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