MX2007005650A

MX2007005650A - Ligandos que mejoran compuestos endogenos.

Info

Publication number: MX2007005650A
Application number: MX2007005650A
Authority: MX
Inventors: Ian M Tomlinson
Original assignee: Domantis Ltd
Priority date: 2002-12-27
Filing date: 2005-11-10
Publication date: 2007-12-10
Also published as: ZA200703755B

Abstract

La invencion se refiere a ligandos que comprenden una porcion (por ejemplo, un dAb) que tiene un sitio de union con especificidad de union para un compuesto objetivo endogeno pero no inhiben substancialmetne la actividad de dicho compuesto objetivo endogeno. Preferentemente, el ligando no se une al sitio activo de un compuesto objetivo endogeno. La invencion se refiere al uso de tal un ligando para la fabricacion de un medicamento para incrementar la vida media, biodisponibilidad, actividad o cantidad de un compuesto objetivo endogeno al el ligando se une.

Description

LIGANDOS QU E MEJORAN COMPUESTOS ENDÓGENOS Solicitudes relacionadas Esta solicitud es una continuación en parte de la Solicitud de Patente de EE. UU. No. 10/985,847, presentada el 10 de Noviembre de 2004, las enseñanzas totales de la cual se incorporan en la presente para referencia.

Antecedentes de la Invención Animales, incluyendo mamíferos, y humanos producen una variedad de compuestos endógenos que tienen actividades que ayudan a mantener la salud normal y fisiología del animal . Tales compuestos se incluyen en muchos procesos fisiológicos tales como hemostasis, función inmune, metabolismo, regulación de proliferación celular y diferenciación y lo similar. M uchos compuestos endógenos se han aislado y formas sintéticas o recombinantes pueden hacerse y administrarse a pacientes para combatir la enfermedad. Planteamientos terapéuticos actuales con frecuencia incluyen administrar formas exógenas o producidas de manera exógena de compuestos endógenos a pacientes. Tales planteamientos terapéuticos pueden producir efectos indeseables debido a las altas dosis que se administran normalmente, y ciertos agentes terapéuticos, tales como formas recombinantes de proteínas humanas generalmente deben producirse por expresión en células mamíferas que es costosa y produce producciones inferiores que la expresión en sistemas de levadura o bacterianos. Estos problemas podrían superarse por el desarrollo de agentes terapéuticos y métodos que pueden fortalecer y explotar las actividades benéficas de compuestos endógenos para producir efectos terapéuticos. Existe una necesidad de tales agentes terapéuticos y métodos.

Breve Descripción de la Invención La invención se refiere ai uso de un ligando comprendiendo una porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno en donde dicho ligando une dicho compuesto objetivo endógeno y no inhibe substancialmente la actividad de dicho compuesto objetivo endógeno, para la fabricación de un medicamento. Preferentemente, el ligando no se une al sitio activo del compuesto objetivo endógeno. El medicamento puede ser para incrementar la cantidad de un compuesto objetivo endógeno en un sujeto, para incrementar la biodisponibilidad de un compuesto objetivo endógeno en un sujeto, para incrementar la vida media in vivo de un compuesto objetivo endógeno. El medicamento también puede ser para incrementar la actividad (por ejemplo, actividad de unión) de un compuesto objetivo endógeno. El medicamento puede ser para sumi nistro local o sistémico. En algunas modalidades, la cantidad de ligando objetivo endógeno en el sujeto aproximadamente 4 horas después de la administración del medicamento se incrementa por al menos 1 .5 veces, en relación a la cantidad antes de la administración del medicamento. En algunas modalidades, la vida media in vivo del compuesto objetivo endógeno se incrementa por al menos 1 .5 veces después de la administración del medicamento. Generalmente, el ligando inhibe la actividad de dicho compuesto objetivo endógeno por no más de aproximadamente 10%, o tiene una concentración inhibidora 50 (IC50) de al menos 1 micromolar. El ligando puede comprender dos o más copias de dicha porción que tiene un sitio de unión para un objetivo endógeno. Por ejemplo, el ligando puede ser un dímero de una porción que tiene un sitio de unión para un objetivo endógeno, tal como un dímero dAb. La porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno puede ser un aficuerpo, un dominio SpA, un dominio clase A del receptor LDL, un dominio EGF, un avímero, anticuerpo o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un fragmento Fv, un fragmento Fv de cadena única, un fragmento Fv unido de disulfuro, un fragmento Fab, un fragmento Fab' , un fragmento F(ab')2 > un diacuerpo, un dominio variable único de inmunoglobuli na (por ejemplo, un VH humano, y un VL humano, un VHH) . Si se desea, el ligando puede comprender además una porción extendiendo la vida media como se describe en la presente. Por ejemplo, el ligando puede comprender una porción extendiendo la vida media seleccionada del grupo consistiendo de una porción de glicol de polialquileno, albúmina de suero o un fragmento de la misma, receptor de transferrina o una porción de unión a transferrina del mismo, o una porción comprendiendo un sitio de unión para un polipéptido que mejora la vida media in vivo. De manera adecuada una porción comprendiendo un sitio de unión para un polipétido que mejora la vida media in vivo incluye un aficuerpo, un dominio SpA, un dominio de clase A del receptor LDL, un dominio EGF, un avímero, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, tales como un fragmento Fv, un fragmento Fv de cadena única, un fragmento Fv unido de disulfuro, un fragmento Fab, un fragmento Fab' , un fragmento F(ab')2, un diacuerpo, y un dominio variable único de inmunoglobulina (por ejemplo, VH humano, VL humano, VHH) - Los medicamentos y ligandos de la invención son substancialmente no inmunogénicos. En algunas modalidades, el medicamento es una formulación de depósito. En algunas modalidades, el compuesto objetivo endógeno es un agonista soluble (por ejemplo, citoquinas, factores de crecimiento, hormonas), receptor soluble (por ejemplo, receptores de citoquina solubles, tales como TNFR1 soluble, TNFR2 soluble, receptor I L- 1 soluble, receptor I L-4 soluble, receptor I L-13 soluble), antagonista de receptor endógeno (por ejemplo, antagonista de receptor I L-1 (I L-I ra)) o una enzima. En modalidades particulares, el compuesto objetivo endógeno es un receptor de citoquina soluble, tal como TNFR1 soluble . Preferentemente, el ligando une el compuesto objetivo endógeno con alta afinidad, tal como Kd de 1 x 10~7 M o menos. En ciertas modalidades, los medicamentos o ligandos de la invención no incluyen un anticuerpo, fragmento o región del mismo descritos en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. publicada no. 2003/0144484. En ciertas modalidades, los medicamentos o ligandos de la invención no inhiben la unión del anticuerpo A2 o anticuerpo A2 quimérico (cA2) a TNF-alfa de humano. En modalidades particulares, los medicamentos o ligandos de la invención no se unen a un epítopo incluido en aminoácidos 87-108 o un epítopo incluido en ambos aminoácidos 59-80 y 87-108 de TNF humano (factor de necrosis de tumor). Estos aminoácidos son: 59-80: Tyr-Ser-Gln-Val-Leu-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-Cys-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Leu-Thr-His-Thr-lle (SEQ ID NO:26); y 87-108: Tyr-GIn-Thr-Lys-Val-Asn-Leu-Leu-Ser-Ala-lle-Lys-Ser-Pro-Cys-Gln-Arg Glu-Thr-Pro-Glu-Gly (SEQ ID NO:27). La invención también se refiere al uso de compuesto objetivo endógeno para la fabricación de un medicamento para incrementar la actividad de dicho objetivo endógeno, en donde dicho ligando une dicho objetivo endógeno y no inhibe substancialmente la actividad de dicho compuesto objetivo endógeno. Preferentemente, el ligando no se une al sitio activo de dicho compuesto objetivo endógeno. En algunas modalidades, la actividad de unión del ligando objetivo endógeno se i ncrementa, por ejemplo la actividad de unión (por ejemplo, afinidad, avidez) puede incrementarse por un factor de al menos 10. La invención también se refiere a un ligando que une un compuesto objetivo endógeno teniendo actividad adecuada para tratar una enfermedad en un sujeto, en donde dicho ligando no une el sitio activo de dicho compuesto objetivo endógeno o substancialmente inhibe la actividad de dicho compuesto objetivo endógeno, para uso en terapia de una enfermedad apta para tratamiento con dicho compuesto objetivo endógeno. La invención también se refiere a una composición farmacéutica comprendiendo un ligando que une un compuesto objetivo endógeno teniendo actividad adecuada para tratar una enfermedad en un sujeto y un vehículo fisiológicamente aceptable, en donde dicho ligando no une el sitio activo de dicho compuesto objetivo endógeno o substancialmente inhibe la actividad de dicho compuesto objetivo endógeno. La invención también se refiere a un sistema de suministro de fármaco comprendiendo una composición farmacéutica de la invención. En algunas modalidades ese dispositivo de suministro de fármaco es un dispositivo de suministro parenteral , dispositivo de suministro intravenoso, dispositivo de suministro intramuscular, dispositivo de suministro intraperitoneal, dispositivo de suministro transdérmico, dispositivo de suministro pulmonar, dispositivo de suministro intraartepal , dispositivo de suministro intratecal , dispositivo de suministro intraarticular, dispositivo de suministro subcutáneo, dispositivo de suministro intranasal , dispositivo de suministro vaginal, y dispositivo de suministro rectal Por ejemplo, el dispositivo de suministro de fármaco puede ser una jeringa, un dispositivo de suministro transdérmico, una cápsula, una tableta, un nebulizador, un inhalador, un atomizador, un aerosohzador, un vaporizador, un inhalador de polvo seco, un inhalador de dosis medida, un rociador de dosis medida, un vaporizador de dosis medida, un atomizador de dosis medida, un catéter La invención se refiere a un método para incrementar la vida media de un compuesto objetivo endógeno en un sujeto, comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un ligando comprendiendo una porción que tiene un sitio de unión con especificidad de unión para dicho compuesto objetivo endógeno La invención se refiere a un método para incrementar la cantidad de un compuesto objetivo endógeno en un sujeto, comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un ligando comprendiendo una porción que tiene un sitio de unión con especificidad de unión para dicho compuesto objetivo endógeno La invención se refiere a un método para incrementar la biodisponibilidad de un compuesto objetivo endógeno en un sujeto, comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un ligando comprendiendo una porción que tiene un sitio de unión con especificidad de unión para dicho compuesto objetivo endógeno. La invención se refiere a un método para incrementar la actividad (por ejemplo, actividad de unión) de un compuesto objetivo endógeno en un sujeto, comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un ligando comprendiendo una porción que tiene un sitio de unión con especificidad de unión para dicho compuesto objetivo endógeno. La invención se refiere a un método para tratar un sujeto teniendo una enfermedad que es apta para tratamiento con un compuesto objetivo endógeno en un sujeto, comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un ligando comprendiendo una porción que tiene un sitio de unión con especificidad de unión para dicho compuesto objetivo endógeno. La invención también se refiere a nuevos ligandos (por ejemplo, dAbs) descritos en la misma Breve Descripción de los Dibujos Figura 1 es una gráfica de la concentración relativa de TNFR1 soluble detectado por ELISA en el suero con el tiempo (curva de tiempo de concentración) después de una administración intravenosa única de un monómero dAb PEGilado que une TNFR 1 (TAR2m-21 -23/40K PEG ramificado; también referido como PEG anti-TNFR1 dAb). Los puntos de datos en el diagrama se obtienen por ELISA utilizando una dilución 1 :5 de suero. La gráfica muestra claramente que la biodisponibilidad de TNFR1 en la circulación sistémica se incrementa por la administración de un monómero dAb PEGilado que une TNFR1 . Como se muestra por la curva de tiempo de concentración, el nivel de TNFR1 soluble en suero aumentó después de que el monómero dAb PEGilado se administra, alcanza una concentración máxima, y entonces se reduce con el tiempo a niveles básicos a medida que el dAb PEGilado se despeja. Los resultados demuestran que administrar un dAb que une un receptor soluble puede incrementar la biodisponibilidad del receptor e incrementar el nivel o cantidad de receptor soluble en la circulación sistémica, y que el nivel incrementado o cantidad de receptor soluble en la circulación sistémica se despeja y regresa a niveles básicos. Los resultados indican que el nivel de receptor soluble en la circulación sistémica puede controlarse al administrar un monómero dAb PEGilado que une el receptor soluble.

Descripción Detallada de la Invención Dentro de esta especificación las modalidades se han descrito en una manera que permite que una especificación clara y concisa sea escrita, pero se propone y se apreciará bien que las modalidades pueden combinarse de manera variada o separada sin apartarse de la invención.

Como se utiliza en la presente, el término "ligando" se refiere a un compuesto que comprende al menos un péptido, polipéptido o porción de proteína que tiene un sitio de unión con especificidad de unión para un compuesto objetivo endógeno deseado. Por ejemplo, la porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno deseado puede ser un dominio variable único de inmunoglobulina (por ejemplo, VH, V , VHH) que tiene especificidad de unión para un compuesto objetivo endógeno deseado (por ejemplo, una proteína de receptor soluble, antagonista de receptor endógeno, citoquina o factor de crecimiento). La porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno también puede comprender una o más regiones de determinación complementarias (CDRs) de un dominio variable único de inmunoglobulina que tiene especificidad de unión para un compuesto objetivo endógeno deseado en un formato adecuado, de manera que la porción tiene especificidad de unión para el compuesto objetivo endógeno. Por ejemplo, las CDRs pueden injertarse en una estructura o microandamio de proteína adecuada, tales como un aficuerpo, un microandamio SpA, un dominio de clase A del receptor LDL, o un dominio EGF. Además, el ligando puede ser monovalente (por ejemplo, un monómero dAb), bivalente (homobivalente, heterobivalente) o multivalente (homomultivalente, heteromultivalente) como se describe en la presente. De esta manera, "ligandos" incluyen polipéptidos que consisten de dAb, incluyen polipéptidos que consisten esencialmente de tal dAb, polipéptidos que comprenden un dAb (o las CDRs de un dAb) en un formato adecuado, tales como un formato de anticuerpo (por ejemplo, formato similar a IgG , scFv, Fab, Fab' , F(ab')2) o una estructura o microandamio de proteína adecuada, tales como un aficuerpo, un microandamio SpA, un dominio de clase A del receptor LDL o un dominio EGF , ligandos específicos duales que comprenden un dAb que une un primer compuesto objetivo endógeno y un segundo dAb que une otro compuesto objetivo endógeno (por ejemplo, albúmina de suero), y ligandos multiespecíficos como se describe en la presente. La porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno también puede ser un dominio de proteína comprendiendo un sitio de unión para un objetivo deseado, por ejemplo, un dominio de proteína se selecciona de un aficuerpo, un dominio SpA, un dominio de clase A del receptor LDL, un dominio EGF, un avímero (ver, por ejemplo, Publicaciones de Solicitud de Patente de EE. UU. Nos. 2005/0053973, 2005/0089932, 2005/0164301 ). Si se desea, un "ligando" puede comprender además una o más porciones adicionales, que pueden ser cada una independientemente un péptido, polipéptido o porción de proteína o una porción no peptídica (por ejemplo, un glicol de polialquileno, un lípido, un carbohidrato). Por ejemplo, el ligando puede comprender además una porción extendiendo la vida media como se describe en la presente (por ejemplo, una porción de glicol de polialquileno, una porción comprendiendo albúmina, un fragmento de albúmina o variante de albúmina, una porción comprendiendo transferrina, un fragmento de transferri na o variante de transferrina, una porción que une albúmina, una porción que une receptor neonatal Fe). Como se utiliza en la presente, el término "compuesto objetivo endógeno" se refiere un compuesto soluble que se produce por un sujeto (por ejemplo, un mamífero, un humano) de interés, compuestos objetivo endógenos incluyen, por ejemplo, agonistas solubles (por ejemplo, citoquinas, factores de crecimiento, hormonas), receptores solubles (por ejemplo, receptores de citoquina solubles, tales como TNFR1 soluble, soluble, TNFR2 soluble, receptor I L-1 soluble, receptor I L-4 soluble, receptor I L-13 soluble), antagonistas de receptor endógeno (por ejemplo, antagonista de receptor I L-1 (I L-1 ra)) , enzimas, y lo similar. Como se utiliza en la presente, el término "sitio activo" se refiere al sitio o dominio de un compuesto objetivo endógeno (por ejemplo, proteína) que interactúa con (por ejemplo, une) un compañero de unión endógeno de un compuesto objetivo endógeno (por ejemplo, sitio o dominio de una proteína receptora que hace contacto con el ligando del receptor, sitio o dominio de una proteína agonista (por ejemplo, una citoquina) que hace contacto con el receptor del agonista, el dominio catalítico de una enzima). Por ejemplo, como se utiliza en la presente, el "sitio activo" de un compuesto endógeno soluble tales como una citoquina, factor de crecimiento u hormona es el sitio en la citoquina, factor de crecimiento u hormona que hace contacto con el receptor endógeno que une la citoquina, factor de crecimiento u hormona. Como se utiliza en la presente, "biodisponibilidad" se refiere al grado al cual un compuesto objetivo endógeno o complejo de ligando-compuesto objetivo endógeno está presente u obtiene acceso a un sitio de acción deseado (por ejemplo, la circulación sistémica, el sistema nervioso central, un sitio de acción local (por ejemplo, un órgano particular, un área particular de tejido (por ejemplo, músculo, piel))). Biodisponibilidad de un compuesto objetivo endógeno puede incrementarse independientemente de cualquier cambio en la vida media in vivo del compuesto objetivo endógeno, o de cualquier cambio en la cantidad del compuesto objetivo endógeno en un sujeto. Por ejemplo, un ligando puede unir un compuesto objetivo endógeno que tiene actividad benéfica en la circulación sistémica pero que se distribuye rápidamente en los tejidos, y disminuye la velocidad de distribución en los tejidos. Tal ligando incrementaría la biodisponibilidad del compuesto objetivo endógeno en la circulación sistémica donde la actividad benéfica del compuesto objetivo endógeno puede tener efecto terapéutico. Como se utiliza en la presente, "actividad de unión" se refiere a la capacidad de los compañeros de unión a unirse entre sí. Por ejemplo, la capacidad de un receptor o receptor sol uble para unir su ligando cognado. La actividad de unión puede expresarse, por ejemplo, como afinidad (Kd; o avidez. Actividad de unión puede incrementarse, por ejemplo, al incrementar la afinidad (por ejemplo, incrementar la velocidad de unión (Kencendida) o disminuir la velocidad de disociación (Kapagada)) o al incrementar avidez. Avidez puede incrementarse, por ejemplo, al incrementar el número de sitios en los cuales un pri mer compañero de unión y un segundo compañero de unión hacen contacto. Como se utiliza en la presente, la frase "substancial mente no inmunogénico" significa anticuerpos de alta afinidad que unen el ligando, ligando-compuesto objetivo endógeno o compuesto objetivo endógeno no se producen con un ligando que se administra a un sujeto. Los anticuerpos de alta afinidad unen el ligando, complejo ligando-compuesto objetivo endógeno o compuesto objetivo endógeno con una afinidad de 500 nM o inferior, o 300 nM o inferior, o 100 nM o inferior, o 10 nM o inferior, o 1 nM o inferior. Los anticuerpos que unen el ligando, complejo ligando-compuesto objetivo endógeno o compuesto objetivo endógeno y la afinidad de tales anticuerpos pueden identificarse utilizando cualquier método adecuado. Varios de tales métodos se conocen bien en la materia. Por ejemplo, una muestra de suero puede obtenerse de un humano a quien un ligando se ha administrado (por ejemplo, aproximadamente 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas después de la administración) y el suero puede probarse por la presencia de anticuerpos que unen ligando, ligando-compuesto objetivo endógeno o compuesto objetivo endógeno utilizando, por ejemplo ELISA u otro ensayo adecuado. La afinidad de anticuerpos puede determinarse utilizando cualquier método adecuado, tal como por diálisis de equilibrio o por resonancia de plasmón de superficie. La frase "dominio variable único de inmunoglobulina" se refiere a una región variable de anticuerpo (VH, VH H , VL) que específicamente une un antígeno o epítopo independientemente de otras regiones V o dominios; sin embargo, como el término se utiliza en la presente, un dominio variable único de ¡nmunoglobulina puede estar presente en un formato (por ejemplo, homo- o hetero-multímero) con otras regiones variables o domi nios variables donde las otras regiones o dominios no se requieren para unión de antígeno por el dominio variable de inmunoglobuli na único (es decir, donde el dominio variable único de inmunoglobulina une el antígeno independientemente de los dominios variables adicionales). "Dominio variable único de inmunoglobulina" comprende no solamente un polipéptido de dominio variable único de anticuerpo aislado, sino que también polipéptidos más grandes que comprenden uno o más monómeros de una secuencia de polipéptidos de dominio variable único de anticuerpo. Un "anticuerpo de dominio" o "dAb" es el mismo que un polipéptido de "dominio variable único de inmunoglobulina" como el término se utiliza en la presente. Un polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina, como se utiliza en la presente se refiere a un polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina de mamífero, preferentemente humano, pero también incluye VH H dAbs de roedor (por ejemplo, como se describe en WO 00/29004, los contenidos de la cual se incorporan en la presente para referencia en su totalidad) o camélido. dAbs de camélido son polipéptidos de dominio variable único de inmunoglobulina que se derivan de especies incluyendo camello, llama, alpaca, camello árabe, y guanaco, y comprenden anticuerpos de cadena pesada naturalmente desprovistos de cadena ligera: : VH H - Moléculas VH H son aproximadamente diez veces más pequeñas que las moléculas IgG, y como polipéptidos únicos, son muy estables, resistiendo condiciones de temperatura y pH extremas. "Complementario" Dos dominios de inmunoglobulina son "complementarios" donde pertenecen a familias de estructuras que forman pares cognados o grupos o se derivan de tales familias y retienen esta característica. Por ejemplo, un dominio VH y un domi nio VL de un anticuerpo son complementarios; dos domi nios VH no son complementarios, y dos dominios VL no son complementarios. Los dominios complementarios pueden encontrarse en otros miembros de la superfamilia de inmunoglobulina, tales como los dominios Va y Vp (o ? y d) del receptor de célula T. Dominios que son artificiales, tales como dominios en base a microandamios de proteína que no unen epítopos al menos que se planeen para hacer eso, no son complementarios. Del mismo modo, dos dominios en base a (por ejemplo) un dominio de inmunoglobulina y un dominio de fibronecti na no son complementarios. "Familia de inmunoglobulina" Esto se refiere a una familia de polipéptidos que retienen la característica de doblez de inmunoglobulina de moléculas de anticuerpo, que contiene dos hojas ß y, usualmente, un enlace de disulfuro conservado. Miembros de la superfamilia de inmunoglobulina se incluyen en muchos aspectos de interacciones celulares y no celulares in vivo, incluyendo papeles de difusión en el sistema inmune (por ejemplo, anticuerpos, moléculas de receptor de célula T y lo similar), la inclusión en adhesión celular (por ejemplo las moléculas ICAM ) y señalización intracelular (por ejemplo, moléculas receptoras, tal como el receptor PDGF). La presente invención es aplicable a todas las moléculas de superfamilia de inmunoglobulina que posee dominios de unión. Preferentemente, la presente invención se refiere a anticuerpos. "Dominio" Un dominio es una estructura de proteína doblada que retiene su estructura terciaria independientemente del resto de la proteína. Generalmente, dominios son responsables de propiedades funcionales discretas de proteínas, y en muchos casos pueden agregarse, removerse o transferirse a otras proteínas sin pérdida de función del resto de la proteína y/o del dominio. Por dominio variable de anticuerpo único se entiende un dominio de polipéptido doblado comprendiendo secuencias características de dominios variables de anticuerpo. Por lo tanto incluye dominios variables de anticuerpo completo y dominios variables modificados, por ejemplo, en los cuales uno o más ciclos se han reemplazado por secuencias que no son características de dominios variable de anticuerpo, o dominios variable de anticuerpo que se han truncado o comprenden extensiones de termi nal N o C, así como también fragmentos doblados de dominios variables que retienen al menos en parte la actividad de unión y especificidad del dominio de longitud completa. "Repertorio" Una recolección de diversas variantes, por ejemplo, variantes de polipéptido que difiere en su secuencia primaria. Una biblioteca utilizada en la presente invención comprenderá un repertorio de polipéptidos comprendiendo al menos 1000 miembros. "Biblioteca" El término biblioteca se refiere a una mezcla de polipéptidos heterogéneos o ácidos nucleicos. La biblioteca se compone de miembros, cada uno de los cuales tiene una secuencia de ácidos nucleicos o polipéptidos única. Para este grado, biblioteca es sinónimo de repertorio. Las diferencias de secuencia entre miembros de la biblioteca son responsables de la diversidad presente en la biblioteca. La biblioteca puede tomar la forma de una mezcla simple de polipéptidos o ácidos nucleicos, o puede estar en la forma de organismos o células, por ejemplo bacterias, virus, células vegetales o animales y lo similar, transformada con una biblioteca de ácidos nucleicos.

Preferentemente, cada organismo o célula individual contiene solamente uno o un número limitado de miembros de biblioteca. Ventajosamente, los ácidos nucleicos se incorporan en vectores de expresión, para permitir la expresión de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos. En un aspecto preferido, por lo tanto, una biblioteca puede tomar la forma de una población de organismos huésped, cada organismo conteniendo una o más copias de un vector de expresión conteniendo un miembro único de la biblioteca en forma de ácido nucleico que puede expresarse para producir su miembro de polipéptido correspondiente. De esta manera, la población de organismos huésped tiene el potencial de codificar un gran repertorio de variantes de polipéptido genéticamente diversas. "Anticuerpo" Un anticuerpo (por ejemplo IgG, IgM , IgA, IgD o IgE) o fragmento (tales como un Fab , F(ab')2, Fv, Fv enlazado de disulfuro, scFv, anticuerpo multiespecífico de conformación cerrada, scFv enlazado a disulfuro, diacuerpo) ya sea derivado de cualquier especie que produce de manera natural un anticuerpo, o creado por tecnología de ADN recombinante, ya sea aisló de suero, células B, hibridomas, transfectomas, levadura o bacteria).

"Ligando específico dual" Un ligando comprendiendo un primer dominio variable único de inmunoglobulina y un segundo dominio variable único de inmunoglobulina como se define en la presente, en donde las regiones variables son capaces de unirse a dos antígenos diferentes o dos epítopos en el mismo antígeno que no se unen normalmente por una inmunoglobulina monoespecífica. Por ejemplo, los dos epítopos pueden estar en el mismo hapteno, pero no el mismo epítopo o suficientemente adyacente para unirse por un ligando monoespecífico. Los ligandos específicos duales de acuerdo a la invención se componen de dominios variables que tienen diferentes especificidades, y no contienen pares de dominio variable mutuamente complementarios que tienen la misma especificidad. Ligandos específicos duales y métodos adecuados para preparar ligandos específicos duales se describen en WO 2004/058821 , WO 2004/003019, y WO 03/002609, las enseñanzas completas de cada una de estas solicitudes internacionales publicadas se incorporan en la presente para referencia. "Antígeno" Una molécula que se une por un ligando de acuerdo a la presente invención. Típicamente, antígenos se unen por ligandos de anticuerpo y son capaces de obtener una respuesta de anticuerpo in vivo. Puede ser un polipéptido, proteína, ácido nucleico u otra molécula. Generalmente, los ligandos específicos duales de acuerdo a la invención se seleccionan para especificidad objetivo contra un antígeno particular. En el caso de anticuerpos convencionales y fragmentos de los mismos, el sitio de unión a anticuerpo definido por los ciclos variables (L1 , L2, L3 y H 1 , H2, H3) es capaz de unirse al antígeno.

"Epítopo" Una unidad de estructura convencionalmente unida por un par VH/V de inmunoglobulina. Epítopos definen el sitio de unión mínimo para un anticuerpo, y de esta manera representan el objetivo de especificidad de un anticuerpo. En el caso de un anticuerpo de dominio único, un epítopo representa la unidad de estructura unida por un dominio variable en aislamiento. "Estructura universal" Una secuencia de estructura de anticuerpo única correspondiente a las regiones de un anticuerpo conservado en secuencia como se define por Kabat ("Sequences of Proteins of I mmunological Interest", US Department of Health and Human Services) o correspondiente a la estructura o repertorio de inmunoglobulina de la línea germinal de humano como se define por Chothia and Lesk, ( 1987) J. Mol . Biol . 196: 910-917. La invención proporciona el uso de una estructura única, o un conjunto de tales estructuras, que se ha encontrado que permiten la derivación de virtualmente cualquier especificidad de unión a través de variación en las regiones hipervariables solas. "Vida media" El tiempo tomado para la concentración del suero del ligando para reducirse por 50%, in vivo, por ejemplo debido a la degradación del ligando y/o despeje o secuestración del ligando por mecanismos naturales. Los ligandos e la invención se estabilizan in vivo y su vida media se incrementa al unirse a moléculas que resisten la degradación y/o despeje o secuestración. Típicamente, tales moléculas son proteínas que ocurren de manera natural que tienen por ellas mismas una vida media larga in vivo. La vida media de un ligando se incrementa si su actividad funcional persiste, in vivo, por un periodo más largo que un ligando similar que no es específico para la molécula incrementando la vida media. De esta manera, un ligando específico para HSA y una molécula objetivo se compara con el mismo ligando en donde la especificidad para HSA no está presente, que no une HSA pero une otra molécula. Por ejemplo, puede ser un segundo epítopo en la molécula objetivo. Típicamente, la vida media se incrementa por 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o más. I ncrementos en el rango de 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, 20x, 30x, 40x, 50x o más de la vida media son posibles. Alternativamente, o además, los incrementos en el rango de hasta 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 150x de la vida media son posibles. "Substancialmente idéntica (o "substancialmente homologa") Una primer secuencia de nucleótidos o aminoácidos que contiene un número suficiente de nucleótidos o residuos de aminoácidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, con una cadena lateral similar, por ejemplo, substituciones de aminoácido conservadas) a una segunda secuencia de nucleótidos o aminoácidos de manera que las secuencias de nucleótidos o aminoácidos, primera y segunda, tienen actividades similares. En el caso de anticuerpo, el segundo anticuerpo tiene la misma especificidad de unión y tiene al menos 50% de la afinidad de la misma. Como se refiere en la presente, el término "aproximadamente" se interpreta preferentemente por significar más o menos 20%, más preferentemente más o menos 10%, aún más preferentemente más o menos 5%, aún más preferentemente más o menos 2%, más preferentemente más o menos 1 %. Como se utiliza en la presente, los términos "baj a severidad", "severidad media", "alta severidad", o "condiciones de muy alta severidad" describen condiciones para hibridización de ácido nucleico y enjuague. Gupia para realizar reacciones de hibridización pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 -6.3.6, que se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. Los métodos acuosos y no acuosos se describen en esa referencia y cualquiera puede utilizarse. Las condiciones de hibridización específicas referidas en la presente son como sigue: ( 1 ) condiciones de hibridización de baja severidad en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido por dos enjuagues en 0.2X SSC, 0.1 % SDS al menos a 50°C (la temperatura de los enjuagues puede incrementarse a 55°C para condiciones de baja severidad; (2) condiciones de hibridización de severidad media en 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguido por uno o más enjuagues en 0.2X SSC, 0.1 % SDS a 60°C; (3) condiciones de hibridización de alta severidad en 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguido por uno o más enjuagues 0.2X SSC, 0.1 % SDS a 65°C; y preferentemente (4) condiciones de hibridización de muy alta severidad son 0.5M fosfato de sodio, 7% SDS a 65°C, seguido por uno o más enjuagues a 0.2X SSC, 1 % S DS a 65°C. Condiciones de muy alta severidad (4) son las condiciones preferidas y las que deben utilizarse al menos que se especifique de otra manera. Como se refiere en la presente, el término "compite" significa que la unión de un primer epítopo a su dominio de unión de epítopo cognado se inhibe cuando un segundo epítopo se une a su dominio de unión de epítopo cognado. Por ejemplo, la unión puede inhibirse estéricamente, por ejemplo por bloqueo físico de un dominio de unión o por alteración de la estructura o ambiente de un dominio de unión de manera que su afinidad o avidez para un epítopo se reduce. Secuencias similares u homologas (por ejemplo, al menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia) a las secuencias descritas en la presente también son parte de la invención. En algunas modalidades, la identidad de secuencia al nivel de aminoácido puede ser aproximadamente 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más alta. Al nivel de ácido nucleico, la identidad de secuencia puede ser aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más alta. Alternativamente, la identidad substancial existe cuando los segmentos de ácido nucleico se hibridizarán bajo condiciones de hibridización selectivas (por ejemplo, condiciones de hibridización de muy baja severidad) , al complemento del filamento. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células completas, en un lisato de célula, o en una forma parcialmente purificada o substancialmente pura.

Los cálculos de "homología" o "identidad de secuencia" o "similitud" entre dos secuencias (los términos se utilizan de manera intercambiable en la presente) se realizan como sigue. Las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptimos (por ejemplo, espacios pueden introducirse en una o ambas de una primer y una segunda secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos para alineación óptima y secuencias no homologas pueden descartarse para propósitos de comparación) . En una modalidad preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada para propósitos de comparación es al menos 30%, preferentemente al menos 40%, más preferentemente al menos 50%, aún más preferentemente al menos 60%, y aún más preferentemente al menos 70%, 80%, 90%, 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Los nucleótidos o residuos de aminoácido en posiciones de nucleótido o posiciones de ami noácido correspondientes se comparan entonces. Cuando una posición en la primer secuencia se ocupa por el mismo nucleótido o residuo de aminoácido como la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se utiliza en la presente "homología" de ácido nucleico o aminoácido es equivalente a "identidad" de ácido nucleico o aminoácido). El por ciento de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, tomando en cuenta el número de espacios, y la longitud de cada espacio, que necesitan introduci rse para alineación óptima de las dos secuencias. Las alineaciones de la secuencia de nucleótidos y aminoácidos y homología, similitud o identidad, como se define en la presente se preparan preferentemente y determinan utilizando las secuencias de algoritmo BLAST 2, utilizando parámetros de falla (Tatusova, T. A. et al., FEMS Microbiol Lett, 174: 187-188 ( 1999)). Alternativamente, ventajosamente, el algoritmo BLAST (versión 2.0) se emplea para alineación de secuencia, con parámetros establecidos a valores de falla. El algoritmo BLAST se describe en detalle en el sitio web ("www") del Centro Nacional para I nformación de Biotecnología (".ncbi") de los I nstitutos Nacionales de Salud ("nih") del Gobierno de EE. UU. (".gov") , en el directorio "/Blast/", en el archivo "blast_help. html". Los parámetros de búsqueda se definen como sigue, y se establecen ventajosamente a los parámetros de falla definidos. BLAST (Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica) es el algoritmo de búsqueda heurístico empleado por los programas blastp, blastn, blastx, tblastn, y tblastx; estos programas adscriben significado a sus descubrimientos utilizando los métodos estadísticos de Karlin and Altschul, 1990, Proc. Nati . Acad. Sci . USA 87(6):2264-8 (ver el archivo "blast_help. html" , como se describe arriba) con unas pocas mejoras. Los programas BLAST se adecúan para búsqueda de similitud de secuencia, por ejemplo, para identificar homólogos con una secuencia de consulta. Los programas generalmente no son útiles para búsqueda de motivo-estilo. Para una discusión de los campos básicos en búsqueda de similitud de bases de datos de secuencias, ver Altschul et al. ( 1994). Los cinco programas BLAST disponibles en el sitio web del Centro Nacional para I nformación de Biotecnología eralizan las siguientes tareas: "blastp" compara una secuencia de consulta de aminoácidos contra una base de datos de secuencias de proteínas; "blastn" compara una secuencia de consulta de nucleótidos contra una base de datos de secuencias de nucleótidos; "blastx" compara los productos de traslación conceptual de seis estructuras de una secuencia de consulta de nucleótidos (ambos filamentos) contra una base de datos de secuencias de proteínas; "tblastn" compara una secuencia de consulta de proteínas contra una base de datos de secuencias de nucleótidos dinámicamente trasladada en todas las seis estructuras de lectura (ambos filamentos) . "tblastx" compara las traslaciones de seis estructuras de una secuencia de consulta de nucleótidos contra las traslaciones de seis estructuras de una base de datos de secuencias de nucleótidos. BLAST utiliza los siguientes parámetros de búsqueda: HISTOGRAMA Despliega un histograma de puntuaciones para cada búsqueda; falla es sí. (Ver parámetro H en el Manual BLAST). DESCRI PCIONES Restringe el número de descripciones cortas de secuencias de acoplamiento reportadas para el número especificado; l ímite de falla es 100 descripciones. (Ver parámetro V en la página del manual). Ver también ESPERA y CORTE. ALI NEACIONES Restringe las secuencias de las bases de datos al número especificado para el cual los pares de segmento de alta puntuación (HSPs) se reportan; el límite de falla es 50. Si más secuencias de bases de datos que este pasan para satisfacer el umbral de significado estadístico para reportar (ver ESPERA y CORTE abajo), solamente los acoplamientos que adscriben el mayor significado estadístico se reportan. (Ver parámetro B en el Manual BLAST). ESPERA El umbral de significado estadístico para reportar acoplamientos contra secuencias de bases de datos; el valor de falla es 10, de manera que 10 acoplamientos se esperan encontrar meramente por suerte, de acuerdo al modelo estocástico de Karlin and Altschul ( 1990). Si el significado estadístico adscrito a un acoplamiento es mayor que el umbral de ESPERA, el acoplamiento no se reportará. Los umbrales de ESPERA bajos son más severos, conduciendo a pocos acoplamientos por suerte reportándose. Los valores de fracción son aceptables. (Ver parámetro E en el Manual BLAST). CORTE puntuación de Corte para reportar pares de segmento de alta puntuación. El valor de falla se calcula del valor ESPE RA (ver arriba). HSPs se reporta para una secuencia de base de datos solamente si el significado estadístico adscrito a ellos es al menos tan alto como sería adscrito a HSP solo teniendo una puntuación igual al valor de CORTE. Los valores de CORTE altos son más severos, conduciendo a pocos acoplamientos por suerte reportándose. (Ver parámetro S en el Manual BLAST) . Típicamente, los umbrales de significado pueden manejarse de manera más intuitiva utilizando ESPERA. MATRIZ Especificar una matriz de puntuación alterna para BLASTP, BLASTX, TBLASTN y TBLASTX. La matriz de falla es BLOSUM62 (Henikoff & Henikoff, 1992, Proc. Nati . Acad. Sci . USA 89(22): 10915-9). Las elecciones alternativas válidas incluyen: PAM40, PAM 120, PAM250 e I DENTI DAD. Ninguna matriz de puntuación alterna está disponible para BLASTN; especificar la MATRIZ directiva en solicitudes BLASTN regresa una respuesta de error. FI LAM ENTO Restringir una búsqueda TBLASTN a solo el filamento superior o inferior de las secuencias de bases de datos; o restringir una búsqueda BLASTN, BLASTX o TBLASTX a solo las estructuras de lectura en el filamento superior o inferior de la secuencia de consulta. FI LTRO Ocultar segmentos de la secuencia de consulta que tienen baja complejidad de composición, como se determina por el programa SEG de Wootton & Federhen ( 1993) Computers and Chemistry 17: 149-163, o segmentos consistiendo de repeticiones internas de corta periodicidad, como se determina por el programa XNU de Claverie & States, 1993, Computers and Chemistry 17: 191 -201 , o, para BLASTN, por el programa DUST de Tatusov and Lipman (ver el sitio web de NCBI). La filtración puede eliminar reportes estadísticamente significativos pero biológicamente no interesantes de la salida blast (por ejemplo, golpes contra regiones comunes acidas, básicas o ricas en prolina), conduciendo a las regiones más biológicamente interesantes de la secuencia de consulta disponible para acoplamiento específico contra secuencias de bases de datos. Secuencia de baja complejidad encontrada por un programa de filtro se sustituye utilizando la letra "N" en secuencia de nucleótidos (por ejemplo, "N" repetida 13 veces) y la letra "X" en secuencias de proteínas (por ejemplo, "X" repetida 9 veces) . La filtración solamente se aplica a la secuencia de consulta (o sus productos de traslación), ninguna secuencia de bases de datos. La filtración de falla es DUST para BLASTN, SEG para otros programas. No es inusual que todos se oculten por SEG, XNU, o ambos, cuando se aplican a secuencias en SWISS-PROT, de manera que la filtración no debe esperarse que siempre produzca un efecto. Además, en algunos casos, las secuencias se ocultan en su totalidad, indicando que el significado estadístico de cualquier acoplamiento reportado contra la secuencia de consulta sin filtrar debe esperarse. Causas NCBI-gi identificadores NCBI gi se muestran en la salida, además del acceso y/o número de lugar. Más preferentemente, las comparaciones de secuencias se conducen utilizando el algoritmo de búsqueda BLAST simple proporcionado en el sitio web NCBI descrito arriba, en el directorio "/BLAST". Al menos que se defina de otra manera, todos los térmi nos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por alguien de experiencia ordinaria en la materia (por ejemplo, en cultivo celular genéticas moleculares, química de ácido nucleico, técnicas de hibridización y bioquímica). Las técnicas estándar se utilizan para métodos moleculares, genéticos y bioquímicos (ver generalmente, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. ( 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. y Ausubel et al, Short Protocols in Molecular Biology ( 1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc. que se incorpora en la presente para referencia) y métodos químicos. La invención se refiere a ligandos que comprenden una porción de unión que tiene especificidad de unión para un compuesto objetivo endógeno deseado, a tales ligandos para uso en terapia y al uso de tales ligandos para la fabricación de un medicamento y a métodos terapéuticos que comprenden administrar tales ligandos. Se ha descubierto que los agentes que unen compuestos objetivo endógenos solubles pero no alteran substancialmente la actividad de tales compuestos, tales como anticuerpos y fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, fragmento Fab, fragmento Fab' , fragmento F(ab')2, fragmento Fv (por ejemplo, scFv, Fv unido a disulfuro), dAb, diacuerpo), pueden utilizarse para alterar ciertas propiedades del compuesto objetivo endógeno, y así hacer el compuesto objetivo endógeno más efectivo para tratar, suprimir o mitigar una enfermedad, o para propósitos de diagnóstico. De acuerdo con lo anterior, la invención se refiere a ligandos, como se describe en la presente, que unen un compuesto objetivo endógeno soluble pero no inhibe substancialmente la actividad del compuesto objetivo endógeno (por ejemplo, no unen el sitio activo del compuesto objetivo endógeno), pero que son útiles para alterar ciertas propiedades de los compuestos objetivo endógenos. Por ejemplo, un ligando que comprende una porción de unión que tiene especificidad de unión para un compuesto objetivo endógeno deseado puede unir el compuesto objetivo endógeno, incrementando así el tamaño hidrodinámio del compuesto objetivo endógeno e incrementando la vida media en suero del compuesto objetivo endógeno. Benéficamente, el compuesto objetivo endógeno retiene su actividad biológica cuando se une por el ligando (por ejemplo, es activo en un complejo consistiendo de ligando y compuesto objetivo endógeno), y puede producir efectos benéficos para propósitos terapéuticos y/o de diagnóstico. El ligando, como se describe en la presente, puede incrementar la vida media en suero de un compuesto objetivo endógeno al , por ejemplo, reducir la vel ocidad de despeje del compuesto objetivo endógeno. En tal situación, la cantidad de compuesto objetivo endógeno en un sujeto (por ejemplo, en la circulación sistémica) puede aumentar a una cantidad que es mayor que la cantidad normal mente presente en un sujeto, y la canti dad i ncrementada de ligando objetivo endógeno puede producir efectos terapéuticos benéficos que no se producen por cantidades inferiores o normales de compuesto objetivo endógeno. Un ligando que comprende una porción de unión que tiene especificidad de unión para un compuesto objetivo endógeno deseado puede unir el compuesto objetivo endógeno e incrementar la biodisponibilidad del compuesto objetivo endógeno independiente de cualquier cambio en la vida media in vivo del compuesto objetivo endógeno, o de cualquier cambio en l a cantidad del compuesto objetivo endógeno en un sujeto. Por ejemplo, un ligando puede unir un compuesto objetivo endógeno que tiene actividad benéfica en la ci rculación sistémica pero se distri buye rápidamente en los tejidos o despeja (por ej emplo, un esferoide u hormona de péptido) , y dismi nuye la velocidad de distri bución o despeje. Tal ligando puede incrementar la biodi sponi bilidad del compuesto objetivo endógeno en l a circulación sistémica donde la actividad del compuesto obj etivo endógeno puede tener un efecto benéfico (por ejem plo, terapéutico) . Un ligando que comprende una porción de unión que tiene especificidad de unión para un compuesto objetivo endógeno deseado puede unir el compuesto objetivo endógeno e i ncrementar la actividad (por ejemplo, actividad de unión) del compuesto objetivo endógeno. Por ejemplo, un ligando puede unir un compuesto objetivo endógeno tales como un agonista endógeno (por ejemplo, una citoquina) o un receptor de citoquina soluble y mejorar la actividad de unión del compuesto objetivo endógeno al incrementar la afinidad y/o avidez del compuesto objetivo endógeno para su compañero de unión endógeno. Por ejemplo, un ligando que comprende dos o más porciones que tienen sitios de unión con especificidad de unión para una citoquina deseada puede unir dos o más moléculas de citoquina individuales produciendo así un dímero de citoquina, trímero, oligómero o multímero. Tal un dímero, trímero, oligómero o multímero tendrá una actividad de unión mejorada hacia, por ejemplo, una célula que expresa el receptor para la citoquina debido a avidez más alta. De manera similar, la actividad de unión de receptores solubles (por ejemplo, TNFR1 soluble) puede incrementarse por un ligando que comprende dos o más sitios de unión para TNFR 1 soluble. Tal un ligando puede, por ejemplo, unir dos cadenas de TNFR1 solubles formando un dímero de TNFR1 soluble que unirá TNF trimérico con avidez más alta que una cadena de TNFR1 única. Los ligandos descritos en la presente pueden administrarse sistémicamente, por ejemplo, para unir ligandos objetivo endógenos en la circulación sistémica y producir efectos benéficos en la circulación sistémica. Adicionalmente, los ligandos pueden administrarse localmente (por ejemplo, por inyección subcutánea, inyección intramuscular, inyección intrarticular, inyección intradérmica, inhalación, y lo similar) y mejorar así la biodisponibilidad local de un compuesto objetivo endógeno o para incrementar la cantidad de compuesto objetivo endógeno al sitio donde el ligando se administra localmente. Por ejemplo, una formulación de depósito de un ligando puede administrarse localmente por inyección subcutánea, y el ligando administrado puede reclutar ligando objetivo endógeno al sitio del depósito y unir el ligando objetivo endógeno para mejorar biodisponibilidad local o para producir una cantidad localmente alta de ligando objetivo endógeno. Tal planteamiento es ventajoso, por ejemplo, para promover la curación de la herida, o para inhibir reacciones inflamatorias locales (por ejemplo, en la piel , en el pulmón, en una articulación) . La invención proporciona varias ventajas sobre agentes terapéuticos convencionales y planteamientos. Por ejemplo, los ligandos descritos en la presente son generalmente polipéptidos pequeños que pueden producirse de manera económica y en grandes cantidades utilizando sistemas de expresión de levadura o bacteriales, en lugar de sistemas de expresión de mamífero más costosos que producen producciones inferiores. Además, los ligandos descritos en la presente se administran para aprovechar y explotar las actividades benéficas de los compuestos (por ejemplo, proteínas) que son endógenos al paciente, y generalmente el ligando se compone de dominios de proteína (por ejemplo, dAb) que son del mismo origen como el paciente (por ejemplo, origen humano) y por lo tanto son substancialmente no inmunogénicos . Ventajosamente, esto reduce significativamente o elimina el riesgo de que el paciente producirá anticuerpos neutralizantes de alta afinidad contra el ligando, complejo ligando-compuesto objetivo endógeno o compuesto objetivo endógeno. Esto es una ventaja distinta sobre planteamientos terapéuticos que comprenden administrar compuestos exógenos, o aún proteínas endógenas recombinantemente producidas, que inducen frecuentemente la producción de anticuerpos de alta afinidad en el paciente que pueden restringir o eliminar la eficacia del agente terapéutico. Ligandos que Unen un Compuesto Objetivo Endógeno La invención se refiere a ligandos que comprenden una porción (por ejemplo, dAb) que tiene un sitio de unión con especificidad de unión para un compuesto objetivo endógeno pero no inhibe substancialmente la actividad de dicho compuesto objetivo endógeno. Preferentemente, el ligando no se une al sitio activo de un compuesto objetivo endógeno. Los ligandos descritos en la presente no inhi ben substancialmente la actividad de los compuestos objetivo endógenos a los cuales se unen, y el compuesto objetivo endógeno permanece activo cuando se une por el ligando. Por ejemplo, un receptor soluble se une por un ligando de la invención, y el receptor soluble en el complejo receptor-ligando resultante puede unir el ligando endógeno del receptor soluble. En otro ejemplo, una enzima se une por un ligando de la invención, y la enzima en el complejo enzima-ligando resultante puede unir substrato y catalizar la reacción enzimática. Generalmente, el ligando inhibe la actividad del compuesto objetivo endógeno al cual se une por no más de aproximadamente 10%, no más de aproximadamente 9%, no más de aproximadamente 8%, no más de aproximadamente 7%, no más de aproximadamente 6%, no más de aproximadamente 5%, no más de aproximadamente 4%, no más de aproximadamente 3%, no más de aproximadamente 2%, no más de aproximadamente 1 %, o no tiene substancialmente efecto inhibidor en la actividad del compuesto objetivo endógeno. En algunos ejemplos, un ligando que no inhibe substancialmente la actividad de un compuesto objetivo endógeno al cual se une, inhibe esa actividad de dicho compuesto objetivo endógeno con una concentración inhibidora alta 50 (I C50) , tal como una IC50 de al menos 1 nanomolar, al menos 10 nanomolares, al menos 100 nanomolares, al menos 1 micromolar, o al menos 10 micromolares. La habilidad de un ligando para inhibir la actividad del compuesto objetivo endógeno puede valorarse utilizando cualquier ensayo in vitro o in vivo. M uchos ensayos adecuados se conocen bien en la materia y utilizan de manera rutinaria para valorar la actividad i nhibidora de los compuestos. Por ejemplo, la habilidad de ligandos que comprenden una porción que tiene un sitio de unión para TNFR1 para inhibir la actividad o TNFR1 puede valorarse utilizando modelos de choque de endotoxina in vivo o necrosis de piel inducida por TNF (ver, Sheehan et al. , J . Exp. Med. , 181 :607-61 1 ( 1995)), y/o el ensayo de unión del receptor in vitro, ensayo de citotoxicidad L929, ensayo I L-8 HeLa, o ensayo de liberación I L-8 M RC-5 descrito en la presente. Otros ensayos adecuados para valorar si un ligando inhibe la actividad de un compuesto objetivo endógeno deseado, tales como aquellos descritos en la presente, se conocen bien en la materia. Los ligandos per se generalmente no tienen actividad terapéutica substancial pero se utilizan para aprovechar y explotar la actividad de compuestos objetivo endógenos para propósitos de diagnóstico y terapéuticos. En algunas modalidades, los ligandos no tienen actividad substancial en un ensayo in vitro adecuado para la actividad de un compuesto objetivo endógeno. Por ejemplo, un ligando que une un compuesto objetivo endógeno e incrementa la vida media del compuesto objetivo endógeno generalmente no alterará la actividad de un compuesto objetivo endógeno en el ensayo en comparación con la actividad del compuesto objetivo endógeno en el mismo ensayo pero sin ligando. Ligandos (por ejemplo, dAbs) que une un compuesto objetivo endógeno deseado, tales como una proteína receptora, un agonista soluble (por ejemplo, una citoquina), o una enzima, pero no unen el sitio activo del compuesto objetivo endógeno pueden identificarse utilizando cualquier método adecuado. Por ejemplo, ligandos individuales, o porciones que tienen un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno o colecciones de tales porciones (por ejemplo, una biblioteca o repertorio) pueden seleccionarse en un ensayo de competición adecuado en el cual la unión de un compañero de unión endógeno (por ejemplo, ligando natural, substrato, cofactor) al compuesto objetivo endógeno se valora en la presencia del ligando o porción (o colección de ligandos o porciones) seleccionándose. Ninguna reducción substancial (por ejemplo, inhibición) en unión del compañero de unión endógeno al compuesto objetivo endógeno en relación a un control adecuado indica que el ligando o porción seleccionándose no une el sitio activo del compuesto objetivo endógeno. M uchos ensayos adecuados para seleccionar ligandos y porciones que comprenden un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno, tales como enzimas, receptores (por ejemplo, receptores de citoquina, receptores de factor de crecimiento) , y agonistas solubles (por ejemplo, citoquinas, quimoquinas, factores de creci miento, hormonas) se conocen bien en la materia. Adicionalmente, los ensayos de competición se utilizan de manera rutinaria para seleccionar colecciones de compuestos que contienen 106 a 109 o más miembros. De esta manera, tal actividad de selección está dentro de la experiencia ordinaria en la materia y no se considera problemática o indebida por aquellos en la materia. Por ejemplo, los dominios variables descritos en WO 03002609, WO 2004101790, WO 2005035572, WO 2004061026, WO 2004003019, WO 2004058821 , WO 9404678, WO 9749805, WO 9923221 , WO 9937681 , WO 0024884, WO 0043507, WO 0065067, WO 0140310, WO 03035694, WO 03053531 , WO 03054015, WO 0305527, WO 2004015425, WO 2004041862, WO 2004041863, WO 2004041865, WO 2004062551 , WO 2005044858 y EP1 134231 pueden seleccionarse por la habilidad para unir un compuesto objetivo endógeno deseado sin unión al sitio activo en un ensayo de competición adecuado. La descripción de los dominios variables, sus secuencias y métodos de producción y selección en los documentos anteriores se incorporan de manera explícita para referencia en la presente para proporcionar la dirección experta con ejemplos de porciones que tienen un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno para uso en la invención. Los ligandos pueden incrementar la vida media de los objetivos a los cuales se unen, incrementar la cantidad de objetivos endógenos a los cuales se unen en un sujeto (por ejemplo, la cantidad sistémica, la cantidad en un sitio o ubicación deseada), y/o incrementar la biodisponibilidad de los objetivos endógenos a los cuales se unen. Un ligando puede incrementar la vida media de un compuesto objetivo endógeno al cual se une al , por ejemplo, unir el compuesto objetivo endógeno e incrementar así el tamaño hidrodinámico del compuesto objetivo endógeno, al unir y estabilizar el compuesto objetivo endógeno, o al unir y disminuir la velocidad de despeje o metabolismo del compuesto objetivo endógeno. Generalmente, el ligando incrementará la vida media del compuesto objetivo endógeno al cual se une por un factor de al menos aproximadamente 1.5, al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 6, al menos aproximadamente 7, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 9, o al menos aproximadamente 10, en relación a la vida media del compuesto objetivo endógeno en la ausencia de ligando. Por ejemplo, un compuesto objetivo endógeno puede tener una vida media de aproximadamente 1 hora, y después de la administración de un ligando que comprende una porción con un sitio de unión que une dicho compuesto objetivo endógeno, la vida media del compuesto objetivo endógeno puede incrementarse a aproximadamente 1.5 horas, a aproximadamente 10 horas, o más tiempo. El nivel o cantidad de compuesto objetivo endógeno puede aumentar después de la administración de un ligando, como se describe en la presente, debido al efecto que incrementa la vida media de los ligandos. Por ejemplo, el nivel o cantidad de ligando objetivo endógeno (por ejemplo, en suero) 1 hora, o 2 horas, o 3 horas, o 4 horas, o 5 horas, o 6 horas, o 7 horas, o 8 horas, o 9 horas, o 10 horas, u 1 1 horas, o 12 horas, o 1 día después de la administración de un ligando de la invención puede incrementarse por un factor de al menos aproximadamente 1 .5, al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 500, al menos aproximadamente 1 ,000, al menos aproximadamente 5,000, al menos aproximadamente 10,000, al menos aproximadamente 50, 000, o al menos aproximadamente 100,000. El incremento de los niveles o cantidades de un compuesto objetivo endógeno pueden detectarse fácilmente utilizando cualquier método adecuado. Por ejemplo, una muestra adecuada (por ejemplo, suero) puede obtenerse antes de la administración del ligando y en uno o más puntos de tiempo después de la administración, y el nivel o cantidad de compuesto objetivo endógeno en las muestras puede determinarse utilizando cualquier método adecuado. La muestra puede ser, por ejemplo, una muestra de sangre, suero, fl uido cerebroespinal, fluido sinovial, lavado broncoalveolar, enema o una biopsia. En algunas modalidades, la cantidad o nivel de ligando en tal una muestra se incrementa, en relación a la cantidad o nivel antes de que el ligando se administre. Los ligandos pueden incrementar la biodisponibilidad de un compuesto objetivo endógeno. La biodisponibilidad puede incrementarse sistémicamente, o en un sitio de acción deseado (por ejemplo, en un sitio donde el ligando se admi nistra localmente). Por ejemplo, un ligando puede unir un compuesto objetivo endógeno que tiene actividad benéfica en la circulación sistémica pero se distribuye rápidamente en los tejidos o se despeja (por ejemplo, un esteroide u hormona de péptido), y disminuye la velocidad de distribución o despeje. Tal ligando puede incrementar biodisponibilidad del compuesto objetivo endógeno en la circulación sistémica donde la actividad del compuesto objetivo endógeno puede tener un efecto benéfico (por ejemplo, terapéutico). Un ligando puede incrementar la biodisponibilidad de un compuesto objetivo endógeno en un sitio deseado al reclutar el compuesto objetivo endógeno a ese sitio. Por ejemplo, un ligando comprendiendo un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno deseado puede administrarse localmente a un paciente (por ejemplo, como una formulación de depósito). El ligando localmente administrado puede unir el compuesto objetivo endógeno deseado, y reclutar compuesto objetivo endógeno adicional al sitio. De esta manera, un nivel o cantidad incrementada de compuesto objetivo endógeno puede estar presente en el sitio para producir efectos benéficos. Por ejemplo, en una modalidad, el ligando comprende una porción con un sitio de unión para isoforma de TGF beta 3. Tal un ligando puede administrarse localmente para unir isoforma de TGF beta 3 y reclutar la isoforma de TGF beta 3 al sitio de administración local, y de esta manera promover la curación de la herida.

Ligandos similares que comprenden una porción con un sitio de unión para un objetivo de superficie celular deseado pueden prepararse utilizando los métodos descritos en la presente y se utilizan, por ejemplo, para reclutar un tipo celular deseado a un sitio deseado (por ejemplo, un sitio de lesión, sitio de inflamación) . Generalmente, el ligando incrementará la biodisponibilidad (por ejemplo, en la circulación sistémica, en un sitio deseado de acción) del compuesto objetivo endógeno al cual se une por un factor de al menos aproximadamente 1 .5, al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 6, al menos aproximadamente 7, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 9, o al menos aproximadamente 10, en relación a la biodisponibilidad del compuesto objetivo endógeno en la ausencia de ligando. Por ejemplo, cuando el ligando incrementa la biodisponibilidad en la circulación sistémica, una curva de tiempo de concentración para el ligando endógeno iniciando en el tiempo de administración del ligando puede prepararse, y compararse con los niveles sistémicos normales del ligando objetivo endógeno para determinar el grado de incremento en biodisponibilidad sistémica. Los ligandos pueden incrementar la actividad (por ejemplo, actividad de unión) de los objetivos endógenos a los cuales se unen. Por ejemplo, un ligando puede unir un compuesto objetivo endógeno tal como un agonista endógeno (por ejemplo, una citoqui na) o un receptor de citoquina soluble y mejorar la actividad de unión del compuesto objetivo endógeno al incrementar la afinidad y/o avidez del compuesto objetivo endógeno para su compañero de unión endógeno. Ligandos que comprenden dos o más porciones que tienen sitios de unión con especificidad de unión para un compuesto objetivo endógeno deseado pueden unir dos o más moléculas de compuesto objetivo endógeno individuales produciendo así un dímero, trímero, oligómero o multímero de compuesto objetivo endógeno. Tal un dímero, trímero, oligómero o multímero tendrán actividad de unión mejorada hacia, por ejemplo, una célula que expresa el compañero de unión natural para el compuesto objetivo endógeno debido a avidez más alta. Generalmente, tal un ligando puede mejorar la actividad de unión del compuesto objetivo endógeno. Por ejemplo, la intensidad de unión (por ejemplo, afinidad o avidez) de un dímero, trímero, oligómero o multímero de compuesto objetivo endógeno para su compañero de unión puede ser al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 1000 o al menos aproximadamente 10,000 veces más fuerte que la intensidad de unión del compuesto objetivo endógeno como un monómero (es decir, no en un complejo con un ligando de la invención) . En un ejemplo, el ligando comprende dos o más porciones que tienen sitios de unión con especificidad de unión para un agonista endógeno deseado (por ejemplo, una citoquina, un factor de crecimiento) y une dos o más moléculas agonistas endógenas produciendo así un dímero, trímero, oligómero o multímero de agonista endógeno. Tal un dímero, trímero, oligómero o multímero tendrá actividad de unión mejorada hacia, por ejemplo, una célula que expresa el receptor para el agonista endógeno debido a avidez más alta, y puede tener eficacia terapéutica mejorada. De manera similar, la actividad de unión de un receptor soluble (por ejemplo, TNFR1 soluble) puede incrementarse por un ligando que comprende dos o más sitios de unión para el receptor sol uble. Tal un ligando puede, por ejemplo, unir dos cadenas de receptor soluble formando un dímero de receptor soluble que unirá el ligando endógeno del receptor con avidez más alta que una cadena de receptor única. En una modalidad específica, el ligando comprende dos o más porciones (dAbs) que tienen especificidad de unión para TNFR 1 soluble pero no une el sitio activo (el sitio activo de TNFR1 soluble se contiene dentro de Dominios 2 y 3). Tal un ligando puede unir dos o más cadenas de TNFR1 soluble para formar un dímero, trímero, oligómero o multímero de TNFR1 soluble, que tiene actividad de unión mejorada hacia su ligando trimérico, TNF, debido a avidez incrementada. También debe apreciarse que la vida media de tal dímero, trímero, oligómero o multímero de TNFR1 soluble, que tiene un tamaño hidrodinámico más grande que una cadena de TNFR1 soluble único, también puede extenderse en relación a un TNFR1 único. Como un resultad, tal un ligando puede mejorar la actividad de unión a TNF de TNFR1 soluble y mejorar su eficacia terapéutica. Por ejemplo, tal un ligando puede mejorar la eficacia de TNFR1 soluble por un factor de al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 1 ,000 o al menos aproximadamente 10, 000. En un ejemplo de esta modalidad, un ligando que es un dímero de un dAb que une Dominio 1 de TNFR1 de ratón se utiliza para demostrar que ligandos que inducen dimerización de TNFR1 soluble mejoran la eficacia de TNFR 1 soluble. Por ejemplo, tal un ligando puede agregarse a un ensayo conteniendo células M RC5 de humano, TNF de humano y TNFR1 de ratón soluble. TNFR1 de ratón soluble competirá con TNFR1 de humano en las células M RC5 para unión a TNF de humano. El ligando que es un dímero de un dAb que une Dominio 1 de TNFR1 de ratón une dos cadenas de TNFR1 de ratón soluble para formar un dímero de TNFR1 de ratón que será más efectivo para inhibir los efectos de TNF en el ensayo. Por ejemplo, la IC 50 para TNFR1 de ratón puede reducirse del rango nanomolar al rango picomolar (aproximadamente 10 o aproximadamente 100 o aproximadamente 1000 veces de reducción) por la adición del ligando que induce la dimerización de TNFR1 soluble. Administración de ligandos que induce dimerización (o tpmerización u oligomerización) de cadenas de receptor soluble a pacientes puede causar el agrupamiento y activación de formas de transmembrana de ciertos receptores que se expresan en la superficie celular. Generalmente, cualquier efecto no deseado de tal activación (por ejemplo, activación de células inmunes) será mínimo en comparación con la función de unión mejorada y eficacia del receptor soluble dimerizado. Sin embargo, si se desea, la interacción de un ligando de dimerización, trimerización u oligomerización con la forma de transmembrana de un receptor puede reducirse además al formar el ligando para incrementar su tamaño hidrodinámico como se describe en la presente. Por ejemplo, el ligando puede formatearse para incluir una porción PEG u otra porción extendiendo la vida media, tal como una porción que tiene un sitio de unión para un polipéptido que mejora la vida media in vivo (por ejemplo, un dAb que une albúmina de suero). Como se muestra en la presente utilizando dAbs que unen TNFR1 , PEGilación de dAbs redujo dramáticamente la habilidad de dAb para inhibir la actividad de TNFR1 en una ensayo a base de célula, pero no tuvo casi efecto en la habilidad de dAbs para unir TNFR1 en un ensayo de unión al receptor que aproxima las condiciones para unión a TNFR1 soluble in vivo. Estos resultados indican que dAbs de PEGilación y ligandos que comprenden dos o más dAbs mejora la selectividad de dAbs para receptor soluble sobre la forma de transmembrana del receptor. Algunos compuestos objetivo endógenos naturalmente se unen j untos para formar dímeros, trímeros o multímeros activos. De esta manera, la porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno puede ser el compuesto objetivo endógeno por si mismos de un fragmento o porción del compuesto objetivo endógeno. En algunas modalidades, tales como cuando la porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno es el compuesto objetivo endógeno, el ligando puede tener la actividad del compuesto objetivo endógeno. De acuerdo con lo anterior, la administración de tal un ligando puede, como se describe en la presente, incrementar la vida media, incrementar la biodisponibilidad, incrementar la cantidad y/o incrementar la actividad del compuesto objetivo endógeno, y también proporcionará actividad adicional del compuesto objetivo endógeno debido a la presencia de una forma biológicamente activa del compuesto objetivo endógeno en el ligando. En otras modalidades, el ligando puede comprender una porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno que es una porción del compuesto objetivo endógeno. Por ejemplo, la porción del compuesto objetivo endógeno puede ser una porción que se une al compuesto objetivo endógeno in vivo, pero no tiene la actividad (por ejemplo, actividad de unión de ligando, actividad de unión de receptor, actividad catalítica) del compuesto objetivo endógeno. Ejemplos de compuestos objetivo endógenos que forman naturalmente dímeros, trímeros o multímeros incluyen, por ejemplo, factores de crecimiento (por ejemplo, PDGF que forma homodímeros y heterodímeros de cadenas A y B), citoquinas (por ejemplo, citoquinas de la superfamilia TNF (por ejemplo, RANK-L) que forma trímeros), y receptores (por ejemplo, receptor de la superfamilia de receptor TNF que forma trímeros) . Porciones adecuados de tales compuestos objetivo endógenos pueden prepararse fácilmente en base al conocimiento de la estructura de los dominios formadores de dímero, trímero o multímero de los compuestos objetivo endógenos, o al preparar fragmentos de péptido o polipéptido del compuesto objetivo endógeno y analizar los péptidos o polipéptidos para la habilidad para unir el compuesto objetivo endógeno (por ejemplo, utilizando resonancia de plasmón de superficie o cualquier otro método adecuado). Ilustrativos de las porciones de compuestos objetivo endógenos que unen el compuesto objetivo endógeno correspondiente in vivo son los así llamados dominios de ensamble de pre-ligando (PLAD) de miembros de la superfamilia del receptor TNF. (Ver, por ejemplo, WO 01 /58953; Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. No. 2003/0108992 Al ; Deng et al, Nature Medici ne, doi : 10.1038/nml304 (2005)). Dominios PLAD de un receptor particular se unen entre sí in vivo. Por ejemplo, el dominio PLAD de TNFR1 se unirá a otro dominio PLAD de TNFR 1 in vivo. La superfamilia de receptor TNF es un grupo de proteínas reconocido en la materia que incluye TNFR1 (p55, CD120a, p60, miembro de la superfamilia de receptor TNF 1 A, TNFRSF 1 A), TNFR2 (p75, p80, CD120b, miembro de la superfamilia de receptor TNF 1B, TNFRSF1B), CD (TNFRSF3, LTßR, TNFR2-RP, TNFR-RP, TNFCR, TNF-R-lll), OX40 (TNFRSF4, ACT35, TXGPIL), CD40 (TNFRSF5, p50, Bp50), Fas (CD95, TNFRSF6, APO-I, APTI), DcR3 (TNFRSF6B), CD27 (TNFRSF7, Tp55, S152), CD30 (TNFRSF8, Ki-1, D1S166E), CD137 (TNFRSF9, 4-1BB, ILA), TRAILR-1 (TNFRSF10A, DR4, Ap?2), TRAIL-R2 (TNFRSF10B, DR5, KILLER, TRICK2A, TRICKB), TRAILR3 (TNFRSF10C, DcRI , LIT, TRID), TRAILR4 (TNFRSF10D, DcR2, TRUNDD), RANK (TNFRSF11A), OPG (TNFRSF11B, OCIF, TRI), DR3 (TNFRSF12, TRAMP, WSL-1, LARD, WSL-LR, DDR3, TR3, APO-3), DR3L (TNFRSF12L), TACI (TNFRSF13B), BAFFR (TNFRSF13C), HVEM (TNFRSF14, ATAR, TR2, LIGHTR, HVEA), NGFR (TNFRSF16), BCMA (TNFRSF17, BCM), AITR (TNFRSF18, GITR), TNFRSF19, FLJ14993 (TNFRSF19L, RELT), DR6 (TNFRSF21), SOBa (TNFRSF22, Tnfrh2, 2810028K06Rik), mSOB (THFRSF23, Tnfrhl). Varios dominios PLAD se conocen en la materia y otros dominios PLAD y variantes de dominios PLAD pueden aislarse fácilmente y prepararse utilizando cualquier método adecuado, tales como los métodos descritos en WO 01/58953; Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. No. 2003/0108992 A1; Deng et al, Nature Medicine, doi: 10.1038/nml304 (2005). Muchos métodos adecuados para preparar polipéptidos, fragmentos de proteína, y variantes de péptido, así como también ensayos de unión adecuados, tal como el ensayo de unión de receptor TNFR1 descrito en la presente se conocen bien y son convencionales en la materia. Dominios PLAD ejemplificativos se presentan en la Tabla 1 . Tabla 1 En algunas modalidades, el ligando comprende una porción que tiene un sitio de unión con especificidad de unión para un compuesto objetivo endógeno que es PLAD, tal como PLAD de TNFR1 , TNFR2, FAS, LT ßR, CD40, CD30, CD27, HVEM, OX40, DR4 u otro miembro de la superfamilia de receptor TNF, o una variante de un Dominio PLAD. La variante de un dominio PLAD puede, por ejemplo, ser un dominio PLAD de TNFR1 , TNFR2, FAS , LT ßR, CD40, CD30, CD27, HVEM , OX40, o DR4, en donde uno o más aminoácidos se han eliminado, insertado o substituido, pero que retiene la habilidad de unirse a PLAD de TNFR1 , TNFR2, FAS, LT ßR, CD40, CD30, CD27, HVEM, OX40, o DR4 correspondiente. la secuencia de aminoácidos de un dominio PLAD variante puede comprender una región de al menos aproximadamente 10 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 15 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 20 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 25 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 30 ami noácidos contiguos, al menos aproximadamente 35 aminoácidos contiguos, o al menos aproximadamente 40 aminoácidos contiguos que son los mismos que los aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de PLAD correspondiente (por ejemplo, PLAD de TNFR1 , TNFR2, FAS, LT ßR, CD40, CD30, CD27, HVEM , OX40, DR4). Además, o alternativamente, la secuencia de aminoácidos de un dominio PLAD variante puede ser al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91 %, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de PLAD correspondiente (por ejemplo, PLAD de TNFR1 , TNFR2, FAS, LT ßR, CD40, CD30, CD27, HVEM , OX40, o DR4). Ligandos que comprenden una porción de unión que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno que es PLAD o variante de PLAD, pueden formatearse como se describe en la presente. Por ejemplo el ligando puede ser un dímero, trímero o multímero de PLAD o variante de PLAD, o una proteína de fusión comprendiendo PLAD o variante de PLAD y una porción extendiendo la vida media (por ejemplo, una porción que tiene un sitio de unión para albúmina de suero o receptor Fe neonatal). Ligandos que comprenden dos o más PLAD o variantes de PLAD (por ejemplo, dímeros, trímeros, multímeros de PLAD) pueden unir dos o más cadenas de receptor soluble para formar dímeros de receptor soluble, trímeros o multímeros que, como se describe en la presente, pueden tener función de unión mejorada en comparación con los monómeros de receptor soluble. En algunas circunstancias, tal un ligando puede unir receptor soluble y también unir la forma de transmembrana del receptor expresado en la superficie celular. Si se desea, la selectividad para receptor soluble de unión puede mejorarse al formatear el ligando para ten un tamaño hidrodinámico más grande, por ejemplo utilizando una porción PEG, u otra porción extendiendo la vida media como se describe en la presente. En modalidades particulares, el ligando comprende PLAD (por ejemplo, PLAD de TNFR1, TNFR2, FAS, LT ßR, CD40, CD30, CD27, HVEM, OX40, o DR4) o variante de PLAD y una porción extendiendo la vida media, tal como una porción PEG o un dAb que une albúmina de suero o receptor Fe neonatal. Preferentemente, un ligando que induce dimerización (o trimerización u oligomerización) de cadenas de receptor soluble no agoniza substancialmente la superficie celular o formas de transmembrana del receptor en un ensayo de célula estándar (es decir, cuando presente a una concentración de 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 µM, 10 µM, 100 µM, 1000 µM o 5,000 µM, resulta en no más de aproximadamente 5% de la actividad mediada por el receptor inducida por ligando natural del receptor en el ensayo). Se prefiere que la porción que tiene un sitio de unión con especificidad de unión para un compuesto objetivo endógeno una el compuesto objetivo endógeno con alta afinidad, tal como Kd de 300 nM a 5 pM (es decir, 3 x 10~7 a 5 x 10"12M), preferentemente 50 nM a 20 pM, más preferentemente 5 nM a 200 pM y más preferentemente 1 nM a 100 pM, por ejemplo 1 x 10~7 M o menos, preferentemente 1 x 10"8 M o menos, más preferentemente 1 x 10"9 M o menos, ventajosamente 1 x 10~10 M o menos y más preferentemente 1 x 10"11 M o menos; y/o una constante de velocidad Kapagada de 5 x 10~1 s"1 a 1 x 10~7 s"\ preferentemente 1 x 10"2 s"1 a 1 x 10"6 s' más preferentemente 5 x 103 s" a 1 x 10"5 s" 1, por ejemplo 5 x 10"1 s"1 o menos, preferentemente 1 x 10'2 s"1 o menos, ventajosamente 1 x 10"3 s"1 o menos, más preferentemente 1 x 10~4 s"1 o menos, aún más preferentemente 1 x 10"5 s"1 o menos, y más preferentemente 1 x 10"6 s"1 o menos como se determina por resonancia de plasmón de superficie. Una porción que tiene un sitio de unión con especificidad de unión para un compuesto objetivo endógeno y une el compuesto objetivo endógeno con alta afinidad puede formatearse en cualquier formato de ligando adecuado como se describe en la presente. Además de las características de los ligandos descritos en la presente, se prefiere que el ligando una el compuesto objetivo endógeno con alta afinidad, tal como Kd de 300 nM a 5 pM (es decir, 3 x 10"7 a 5 x 10"1 M), preferentemente 50 nM a 20 pM, más preferentemente 5 nM a 200 pM y más preferentemente 1 nM a 100 pM, por ejemplo 1 x 10"7 M o menos, preferentemente 1 x 10"8 M o menos, más preferentemente 1 x 10"9 M o menos, ventajosamente 1 x 10"10 M o menos y más preferentemente 1 x 10~11 M o menos; y/o una constante de velocidad Kapagada de 5 x 10"1 s"1 a 1 x 10"7 s" 1, preferentemente 1 x 10"2 s"1 a 1 x 10"6 s"1, más preferentemente 5 x 103 s"1 a 1 x 10"5 s"1, por ejemplo 5 X 10"1 s"1 o menos, preferentemente 1 x 10"2 s"1 o menos, ventajosamente 1 x 10"3 s"1 o menos, más preferentemente 1 x 10"4 s"1 o menos, aún más preferentemente 1 x 10"5 s"1 o menos, y más preferentemente 1 x 10"6 s" 1 o menos como se determina por resonancia de plasmón de superficie. En ciertas modalidades, el ligando comprende un dAb que une un compuesto objetivo endógeno. El compuesto objetivo endógeno puede ser, por ejemplo, un receptor soluble (por ejemplo, receptor de citoquina soluble, receptor del factor de creci miento soluble, receptor de hormona soluble), un antagonista de receptor endógeno (por ejemplo, I L-1 ra), una enzima, un agonista endógeno (por ejemplo, una citoquina, un factor de crecimiento, una hormona). En algunas modalidades, el ligando es un dímero, trímero, oligómero o multímero de dAb. Los ligandos pueden comprender una porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno, en donde dicha porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno se selecciona del grupo consistiendo de un aficuerpo, un dominio SpA, un dominio de clase A del receptor LDL, un dominio EGF, y un avímero. El ligando también puede comprender una porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno en donde la porción es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, tales como un fragmento Fv, un fragmento Fv de cadena única, un fragmento Fv unido de disulfuro, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un diacuerpo, un dominio variable único de inmunoglobulina (por ejemplo, VH humano, V humano, VHHH) Si se desea, el ligando puede comprender además una porción extendiendo la vida media como se describe en la presente. Por ejemplo, el ligando puede comprender una porción extendiendo la vida media seleccionada del grupo consistiendo de una porción de glicol de polialquileno, albúmina de suero o un fragmento del mismo, receptor de transferrina o una porción de unión a transferrina del mismo, o una porción comprendiendo un sitio de unión para un polipéptido que mejora la vida media in vivo. Porciones adecuadas comprendiendo un sitio de unión para un polipéptido que mejora la vida media in vivo incluyen un aficuerpo, un dominio SpA, un dominio de clase A del receptor LDL, un dominio EGF, un avímero, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, tales como un fragmento Fv, un fragmento Fv de cadena única, un fragmento Fv unido de disulfuro, un fragmento Fab, un fragmento Fab' , un fragmento F(ab')2, un diacuerpo, y un dominio variable único de inmunoglobulina (por ejemplo, VH humano, VL humano, VHH) - Como se describe en la presente, los ligandos de l a invención no inhiben substancialmente la actividad del compuesto objetivo endógeno al cual se unen. Sin embargo, donde un objetivo tiene más de una actividad (por ejemplo, actividad de unión y actividad de señalización), el ligando puede inhi bir l a actividad que no se asocia con la actividad o beneficio terapéutico propuesto. Por ejemplo, un ligando o monómero de dAb puede unir un receptor soluble y también unir la forma de transmembrana del receptor. En tal situación, la forma de transmembrana del receptor puede tener actividad de unión a ligando y también actividad de señalización. Preferentemente, el ligando de la invención no inhibirá la actividad de unión del ligando (de las formas soluble y de transmembrana del receptor) que actúa para inhibir los procesos inducidos por ligando, pero puede inhibir la actividad de señalización de la forma de transmembrana del receptor. Para ilustrar más la invención, modalidades de ligandos ejemplificativos que unen TNFR1 soluble se describen abajo. Modalidades de ligandos que une TNFR1 soluble son ilustrativas de ligandos de la invención que unen otros receptores. TNFR1 es un receptor de transmembrana conteniendo una región extracelular que une el ligando y un dominio intracelular que carece de actividad de transducción de señal intrínseca pero puede asociarse con moléculas de transducción de señal. El complejo de TNFR1 con TNF unido contiene tres cadenas TNFR 1 y tres cadenas TNF. (Banner et al, Cell, 75(3) 431 -445 ( 1993)) . El ligando TNF está presente como un trímero, que se une por tres cadenas TNFR1 . (Id.) Las tres cadenas TNFR1 se agrupan de manera cercana juntas en el complejo receptor-ligando, y este agrupamiento es un prerequisito a transducción de señal mediada por TNFR 1 . de hecho, los agentes multivalentes que unen TNFR1 , tales como anticuerpos anti-TNFR1 , pueden inducir agrupamiento de TNFR1 y transducción de señal en la ausencia de TNF y se utilizan comúnmente como agonistas TNFR1. (Ver, por ejemplo, Belka et al, EMBO, 14(6):1156-U65 (1995); Mandik-Nayak et al, J. Immunol, 167:1920-1928 (2001)). De acuerdo con lo anterior, agentes multivalentes que unen TNFR1, son generalmente antagonistas no efectivos de TNFR1 aún si bloquean la unión de TNFa a TNFR1. La región extracelular de TNFR1 comprende un segmento de terminal amino de trece aminoácidos (aminoácidos 1-13 de SEQ ID NO:2 (humano); aminoácidos 1-13 de SEQ TD NO:4 (ratón)), Dominio 1 (aminoácidos 14-53 de SEQ ID NO: 2 (humano); aminoácidos 14-53 de SEQ ID NO: 4 (ratón)), Dominio 2 (aminoácidos 54-97 de SEQ ID NO: 2 (humano); aminoácidos 54-97 de SEQ ID NO: 4 (ratón)), Dominio 3 (aminoácidos 98-138 de SEQ ID NO: 2 (humano); aminoácidos 98-138 de SEQ ID NO: 4 (ratón)), y Dominio 4 (aminoácidos 139-167 de SEQ ID NO: 2 (humano); aminoácidos 139-167 de SEQ ID NO: 4 (ratón)) que se sigue por una región próxima a la membrana (aminoácidos 168-182 de SEQ ED NO: 2 (humano); aminoácidos 168-183 SEQ ID NO: 4 (ratón)). (Ver, Banner et al, Cell 73(3) 431-445 (1993) y Loetscher er al., Cell 61(2) 351-359 (1990)). Dominios 2 y 3 hacen contacto con ligando unido (TNFß, TNFa). (Banner et al, Cell, 73(3) 431-445 (1993)). La región extracelular de TNFR1 también contiene una región referida como el dominio de ensamble de unión de pre-ligando o dominio PLAD (aminoácidos 1-53 de SEQ ID NO: 2 (humano); aminoácidos 1-53 de SEQ ID NO: 4 (ratón)) (El Gobierno de E E. UU. WO 01 /58953; Deng et al. , Nature M edicine, doi : 10.1038/nml304 (2005)). TNFR 1 se difunde de la superficie de células in vivo a través de un proceso que incluye proteolisis de TNFR1 en Dominio 4 o en la región próxima a membrana (aminoácidos 168-182 de SEQ I D NO: 2; aminoácidos 168-183 de SEQ ED NO: 4), para producir una forma soluble de TNFR1 . TNFR1 soluble retiene la capacidad para unir TNFa, y funciona así como un inhibidor endógeno de la actividad de TNFa. En algunas modalidades, un ligando o monómero de dAb que une TNFR1 soluble puede unir también TNFR1 de transmembrana e inhibir agrupamiento inducido por TNFa de TNFR1 en la superficie celular, que precede la transducción de señal a través del receptor, pero no inhibe la unión de TNFa a TNFR 1 de transmembrana y TNFR1 soluble. En modalidades particulares, el ligando o monómero de dAb no inhibe la actividad de unión a TNF de formas soluble y de transmembrana de TNFR1 pero puede inhibir la actividad de señalización de TNFR1 . Un ligando o monómero de dAb de este tipo puede unir Dominio 1 o Dominio 4 de TNFR1 . Tal un ligando o monómero de dAb puede unir TNFR1 soluble y TNFR1 de transmembrana, pero no inhibe la actividad de unión a TNF de cualquier forma de TNFR1 . De acuerdo con lo anterior, tal un ligando o dAb puede administrarse, por ejemplo, para extender la vida media de TNFR1 soluble o para mejorar la actividad de unión de TN FR1 soluble. De acuerdo con lo anterior, administrar tal ligando o monómero de dAb a un mamífero en necesidad del mismo puede aprovechar y explotar las trayectorias reguladoras endógenas que inhiben la actividad de TNFR1 de superficie celular para propósitos terapéuticos. En otras modalidades, la invención proporciona ligandos y monómeros de dAbs similares que unen otros receptores solubles pero no inhiben la unión de ligandos endógenos a receptores solubles. En modalidades más particulares, el ligando comprende un dAb que une Dominio 1 de TNFR1 y compite con TAR2m-21 -23 para unión a TNFR1 de ratón o compite con TAR2h-205 para unión a TNFR1 de humano. En modalidades más particulares, el ligando es un dímero de tal un dAb y, si se desea, comprende además una porción PEG. En ciertas modalidades, el ligando o monómero de dAb es substancialmente resistente a agregación. Por ejemplo, en algunas modalidades, menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 9%, menos de aproximadamente 8%, menos de aproximadamente 7%, menos de aproximadamente 6%, menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 4%, menos de aproximadamente 3%, menos de aproximadamente 2% o menos de aproxi madamente 1 % del ligando o monómero de agregados de dAb cuando una solución de 1 -5 mg/ml, 5-10 mg/ml , 10-20 mg/ml , 20-50 mg/ml , 50-100 mg/ml, 100-200 mg/ml o 200-500 mg/ml de ligando o dAb en un solvente que se utiliza de manera rutinaria para formulación de fármaco tales como salina, salina regulada, salina de regulador de citrato, agua, una emulsión, y, cualquiera de estos solventes con un excipiente aceptable tales como aquellos aprobados por FDA, se mantiene a aproximadamente 22°C, 22-25°C, 25-30°C, 30-37°C, 37-40°C, 40-50°C, 50-60°C, 60-70°C, 70-80°C, 15-2O°C, 10-15°C, 5-10°C, 2-5°C, 0-2°C, -10°C a 0°C, -20°C a -10°C, -40°C a -20°C, -60°C a -40°C, o -80°C a -60°C, por un periodo de tiempo de aproximadamente, por ejemplo, 10 minutos, 1 hora , 8 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 6 meses, 1 año, o 2 años. La agregación puede valorarse utilizando cualquier método adecuado, tal como, por microscopia, valorando turbidez de una solución por inspección visual o espectroscopia o cualquier otro método adecuado. Agregación puede valorarse utilizando cualquier método adecuado, tal como, por microscopia, valorando turbidez de una solución por inspección visual o espectroscopia o cualquier otro método adecuado. Preferentemente, agregación se valora por difusión de luz dinámica. Ligandos o monómeros de dAb que son resistentes a agregación proporcionan varias ventajas. Por ejemplo, tales ligandos o monómeros de dAb pueden producirse fácilmente en alta producción como proteínas sol ubles por expresión utilizando un sistema de producción biológico adecuado, tal como E. coli, y puede formularse y/o almacenarse a concentraciones más altas que los polipéptidos convencionales, y con menos agregación y pérdida de actividad. Además, ligandos o monómeros de dAb que son resistentes a agregación pueden producirse de manera más económica que otros polipéptidos de unión a antígeno o epítopo (por ejemplo, anticuerpos convencionales). Por ejemplo, generalmente, preparación de polipéptidos de unión a epítopo o antígeno propuestos para aplicaciones in vivo incluye procesos (por ejemplo, filtración de gel) que remueven polipéptidos agregados. La falla para remover tales agregados puede resultar en una preparación que no es adecuada para aplicaciones in vivo debido a que, por ejemplo, los agregados de un polipéptido de unión a antígeno que se propone actuar como un antagonista, pueden funcionar como un agonista al inducir la degradación o agrupamiento del antigeno objetivo. Los agregados de proteína también pueden reducir la eficacia de polipéptido terapéutico al inducir una respuesta inmune en el sujeto al cual se administran. En contraste, los ligandos resistentes a agregación o monómeros de dAb de la invención pueden prepararse para aplicaciones in vivo sin la necesidad de incluir etapas del proceso que remueven agregados, y pueden utilizarse en aplicaciones in vivo sin las desventajas arriba mencionadas causadas por agregados de polipéptido. En algunas modalidades, el ligando o monómero de dAb se desdobla de manera reversible cuando se calienta a una temperatura (Ts) y enfría a una temperatura (Te), en donde Ts es mayor que la temperatura de fusión (Tm) de dAb, y Te es i nferior que l a temperatura de fusión de dAb. Por ejempl o, el monómero de dAb puede desdoblarse de manera reversible cuando se calienta a 80°C y enfría a aproximadamente temperatura ambiente. Un poli péptido que se desdobla de manera reversible pierde función cuando se desdobla pero vuelve a ganar función al volverse a doblar. Tales polipéptidos se disti nguen de poli péptidos que se agregan cuando se desdoblan o que se vuelven a doblar de manera inapropiada (poli péptidos mal doblados), es decir, no vuelve a ganar función . El desdoblado y redoblado del polipépfido puede valorarse, por ejemplo, al detectar directa o indirectamente la estructura de polipéptido utilizando cualquier método adecuado. Por ejemplo, estructura de poli péptido puede detectarse por dicroí smo ci rcul ar (CD) (por ejemplo, lejos de UV CD, cerca de UV CD), fl uorescencia (por ejemplo, fl uorescencia de cadenas laterales de tri ptofan) , suscepti bilidad a proteolisis, resonancia magnética nuclear ( N M R) , o al detectar o medi r una función de poli péptido que es dependiente del doblado apropiado (por ejemplo, unión a li gando objetivo, unión a ligando genérico). En un ejemplo, el desdoblado de poli péptido se valora utilizando un ensayo funcional en el cual la pérdida de función de unión (por ejemplo, unión de un li gando genérico y/u objetivo, uniendo un substrato) i ndica que el poli péptido se desdobla. El grado de desdoblado y redoblado de un ligado o monómero de dAb puede determinarse utilizando una curva de desdoblado o desnaturalización. Una curva de desdoblado puede producirse al trazar la temperatura como la ordenada y la concentración relativa de polipéptido doblado como la abscisa. La concentración relativa de ligando doblado o monómero de dAb puede determinarse directa o indirectamente utilizando cualquier método adecuado (por ejemplo, CD, fluorescencia, ensayo de unión) . Por ejemplo, una solución de monómero de dAb o ligando puede prepararse y la elipticidad de la solución determinarse por CD. El valor de elipticidad obtenido representa una concentración relativa de ligando doblado o monómero de dAb del 100%. El ligando o monómero de dAb en la solución se desdobla entonces al elevar de manera creciente la temperatura de la solución y la eli pticidad se determina en incrementos adecuados (por ejemplo, después de cada incremento de un grado en temperatura). El ligando o monómero de dAb en solución se dobla de nuevo entonces al reducir de manera creciente la temperatura de la solución y elipticidad se determina a incrementos adecuados. Los datos pueden trazarse para producir una curva de desdoblado y una curva de redoblado. Las curvas de desdoblado y redoblado tienen una forma sigmoidal característica que incluye una porción en la cual las moléculas de ligando o monómero de dAb se desdoblan a varios grados, y una porción en la cual las moléculas de ligando o monómero de dAb se desdoblan. La intercepción del eje y de la curva de redoblado es la cantidad relativa de ligando redoblado o monómero de dAb recuperado. Una recuperación de al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60%, o al menos aproximadamente 70%, o al menos aproximadamente 75%, o al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 85%, o al menos aproximadamente 90% , o al menos aproximadamente 95% es indicativa de que el ligando o monómero de dAb se desdobla de manera reversible. En una modalidad preferida, la capacidad de reversa del desdoblado del ligando o monómero de dAb se determina al preparar una solución de monómero de dAb o ligando y trazar las curvas de redoblado y desdoblado por calor. La solución de monómero de dAb o ligando puede prepararse en cualquier solvente adecuado, tal como un regulador acuoso que tiene un pH adecuado para permitir que el ligando o monómero de dAb se disuelva (por ejemplo, pH que es aproximadamente 3 unidades arriba o debajo del punto isoeléctrico (pl )). La solución de monómero de dAb o ligando se concentra lo suficiente para permitir que se detecte el desdoblado/doblado. Por ejemplo, la solución de monómero de dAb o ligando puede ser aproximadamente 0.1 µM a aproximadamente 100 µM , o preferentemente aproximadamente 1 µM a aproximadamente 10 µM . Si la temperatura de fusión (Tm) del ligando o monómero de dAb se conoce, la solución puede calentarse a aproximadamente diez grados por debajo de la Tm (Tm-10) y el doblado valorarse por elipticidad o fluorescencia (por ejemplo, exploración lejos de UV CD de 200 nm a 250 nm, longitud de onda fija CD a 235 nm o 225 nm; espectros de emisión fluorescente de triptofan a 300 a 450 nm con excitación a 298 nm) para proporcionar 100% ligando doblado o monómero de dAb relativo. La solución se calienta entonces a al menos diez grados arriba de Tm (Tm+ 10) en incrementos predeterminados (por ejemplo, incrementos de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1 grado), y elipticidad o fluorescencia se determina en cada incremento. Entonces, el ligando o monómero de dAb se dobla de nuevo al enfriar a al menos Tm-10 en incrementos predeterminados y elipticidad o fluorescencia se determina en cada incremento. Si la temperatura de fusión del ligando o monómero de dAb no se conoce, la solución puede desdoblarse al calentar de manera creciente de aproximadamente 25°C a aproximadamente 100°C y después volver a doblar al enfriar de manera creciente a al menos aproximadamente 25°C, y elipticidad o fluorescencia en cada incremento de calentamiento y enfriamiento se determina. Los datos obtenidos pueden trazarse para producir una curva de desdoblado y una curva de redoblado, en la cual la intercepción del eje y de la curva de redoblado es la cantidad relativa de proteína redoblada recuperada. El ligando o monómero de dAb puede comprender cualquier dominio variable de inmunoglobulina adecuado, y preferentemente comprende un dominio variable de humano o un dominio variable que comprende regiones de estructura de humano. En ciertas modalidades, el monómero de dAb comprende una estructura universal, como se describe en la presente. La estructura universal puede ser una estructura VL (V? o VK) , tal como una estructura que comprende las secuencias de aminoácidos de la estructura codificadas por el segmento de gen de inmunoglobulina DPK1, DPK2, DPK3, DPK4, DPK5, DPK6, DPK7, DPK8, DPK9, DPK10, DPK12, DPK13, DPK15, DPK16, DPK18, DPK19, DPK20, DPK21, DPK22, DPK23, DPK24, DPK25, DPK26 o DPK 28 de la línea germinal de humano. Si se desea, la estructura VL puede comprender además la secuencia de aminoácidos de la estructura codificada por el segmento de gen de inmunoglobulina J?1, J?2, J?3, J?4, o J?5 de la línea germinal de humano. En otras modalidades la estructura universal puede ser una estructura VH, tal como una estructura que comprende las secuencias de aminoácidos de la estructura codificada por el segmento de gen de inmunoglobulina DP4, DP7, DP8, DP9, DP10, DP31, DP33, DP38, DP45, DP46, DP47, DP49, DP50, DP51, DP53, DP54, DP65, DP66, DP67, DP68 o DP69 de la linea germinal de humano. Si se desea, la estructura VH puede comprender además la secuencia de aminoácidos de la estructura codificada por el segmento de gen de inmunoglobulina JH1, JH2, JH3, JH4, JH4b, JH5 y JH6 de la línea germinal de humano. En modalidades particulares, el ligando de monómero de dAb comprende la estructura VL DPK9, o una estructura VH seleccionada del grupo consistiendo de DP47, DP45 y DP38. El monómero de dAb puede comprender un sitio de unión para un ligando genérico, tal como proteína A, proteína L y proteína G. En ciertas modalidades, el monómero de dAb comprende una o más regiones de estructura comprendiendo una secuencia de aminoácidos que es la misma que la secuencia de aminoácidos de una región de estructura correspondiente codificada por un segmento de gen de anticuerpo de línea germinal de humano, o las secuencia de aminoácidos de una o más de dichas regiones de estructura colectivamente comprenden hasta 5 diferencias de aminoácido en relación a la secuencia de aminoácidos de dicha región de estructura correspondiente codificada por un segmento de gen de anticuerpo de línea germinal de humano. En otras modalidades, las secuencia de aminoácidos de FW1 , FW2, FW3 y FW4 del monómero de dAb son las mismas que las secuencias de aminoácidos de regiones de estructura correspondientes codificadas por un segmento de gen de anticuerpo de línea germinal de humano, o las secuencia de aminoácidos de FW1 , FW2, FW3 y FW4 colectivamente contienen hasta 10 diferencias de aminoácido en relación a las secuencias de aminoácidos de regiones de estructura correspondientes codificadas por dicho segmento de gen de anticuerpo de línea germinal de humano.

En otras modalidades, el monómero de dAb comprende regiones FW1 , FW2 y FW3, y la secuencia de aminoácidos de dichas regiones FW1 , FW2 y FW3 son las mismas que las secuencia de aminoácidos de regiones de estructura correspondientes codificadas por segmentos de gen de anticuerpo de línea germinal de humano. En algunas modalidades, el monómero de dAb no comprende un dominio variable de inmunoglobulina Camelid, o uno o más aminoácidos de estructura que son únicos para dominios variables de inmunoglobulina codificados por segmentos de gen de anticuerpo de línea germinal Camelid. En ciertas modalidades, los ligandos (por ejemplo, monómeros de dAb) de la invención son eficaces en modelos de enfermedades cuando una cantidad efectiva se administra. Generalmente una cantidad efectiva es aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg (por ejemplo, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg, o aproximadamente 10 mg/kg). Muchos modelos adecuados de enfermedades existen. Los modelos de enfermedad inflamatoria crónica descritos en la presente se reconocen por aquellos expertos en la materia como siendo predictivos de eficacia terapéutica en humanos. La técnica anterior no sugiere utilizar ligandos que comprenden una porción que une un compuesto objetivo endógeno, tal como un receptor de citoqui na soluble (por ejemplo, TNFR1 soluble) en estos modelos, o que serían eficaces En modalidades particulares, el ligando o monómero de dAb es eficaz en el modelo de artritis inducido por colágeno de ratón estándar Por ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del ligando puede reducir la puntuación artrítica promedio de la suma de los cuatro miembros en el modelo de artritis inducido por colágeno de ratón estándar, por ejemplo, por aproximadamente 1 a aproximadamente 16, aproximadamente 3 a aproximadamente 16, aproximadamente 6 a aproximadamente 16, aproximadamente 9 a aproximadamente 16, o aproximadamente 12 a aproximadamente 16, en comparación con un control adecuado En otro ejemplo, la admi nistración de una cantidad efectiva del ligando puede retrasar el inicio de síntomas de artritis en el modelo de artritis inducida por colágeno de ratón estándar, por ejemplo, por aproximadamente 1 día, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproxi madamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 14 días, aproximadamente 21 días o aproximadamente 28 días, en comparación con un control adecuado En otro ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del ligando puede resultar en una puntuación artrítica promedio de la suma de los cuatro miembros en el modelo de artritis inducida por colágeno de ratón estándar de O a aproximadamente 3, aproximadamente 3 a aproximadamente 5, aproximadamente 5 a aproximadamente 7, aproxi madamente 7 a aproximadamente 15, aproximadamente 9 a aproxi madamente 15, aproximadamente 10 a aproximadamente 15, aproximadamente 12 a aproximadamente 15, o aproximadamente 14 a aproximadamente 15. En otras modalidades, el ligando o monómero de dAb es eficaz en el modelo ?ARE de ratón de artritis. (Kontoyiannis et al. , J Exp Med 196: 1563-74 (2002)). Por ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del ligando puede reducir la puntuación artrítica promedio en el modelo ?ARE de ratón de artritis, por ejemplo, por aproximadamente 0.1 a aproximadamente 2.5, aproxi madamente 0.5 a aproximadamente 2.5, aproximadamente 1 a aproximadamente 2.5, aproximadamente 1.5 a aproximadamente 2.5, o aproximadamente 2 a aproximadamente 2.5, en comparación con un control adecuado. En otro ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del ligando puede retrasar el inicio de síntomas de artritis en el modelo ?ARE de ratón de artritis por, por ejemplo, aproximadamente 1 día, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproxi madamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 14 días, aproximadamente 21 días o aproximadamente 28 días, en comparación con un control adecuado. En otro ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del ligando puede resultar en una puntuación artrítica promedio en el modelo ?ARE de ratón de artritis de 0 a aproximadamente 0.5, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 1 , aproximadamente 1 a aproximadamente 1 .5, aproximadamente 1 .5 a aproximadamente 2, o aproximadamente 2 a aproximadamente 2.5. En otras modalidades, el ligando o monómero de dAb es eficaz en el modelo ?ARE de ratón de enfermedad de intesti no inflamatorio (I BD). (Kontoyiannis ef al, J Exp Med 196: 1563-74 (2002)). Por ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del ligando puede reducir la puntuación de inflamación crónica y/o aguda promedio en el modelo ?ARE de ratón de I BD, por ejemplo, por aproximadamente 0.1 a aproximadamente 2.5, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 2.5, aproximadamente 1 a aproximadamente 2.5, aproximadamente 1.5 a aproximadamente 2.5, o aproximadamente 2 a aproximadamente 2.5, en comparación con un control adecuado. En otro ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del ligando puede retrasar el inicio de síntomas de I BD en el modelo ?ARE de ratón de I BD por, por ejemplo, aproximadamente 1 día, aproximadamente 2 dias, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 14 días, aproximadamente 21 días o aproximadamente 28 días, en comparación con un control adecuado. En otro ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del ligando puede resultar en una puntuación de inflamación crónica y/o aguda promedio en el modelo ?ARE de ratón de I BD de 0 a aproximadamente 0.5, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 1 , aproximadamente 1 a aproximadamente 1 .5, aproximadamente 1 .5 a aproximadamente 2, o aproximadamente 2 a aproximadamente 2.5. En otras modalidades, el ligando o monómero de dAb es eficaz en el modelo de I BD inducida por sodio de sulfato de dextran (DSS). Ver, por ejemplo, Okayasu I . et al, Gastroenterology 98:694-702 (1990); Podolsky K. , J Gasteroenterol 38 suppl X\/:63-66 (2003)). Por ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del ligando puede reduci r la puntuación de severidad promedio en el modelo DSS de ratón de I BD, por ejemplo, por aproximadamente 0.1 a aproximadamente 2.5, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 2.5, aproxi madamente 1 a aproximadamente 2.5, aproximadamente 1 .5 a aproximadamente 2.5, o aproximadamente 2 a aproximadamente 2.5, en comparación con un control adecuado. En otro ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del ligando puede retrasar el inicio de síntomas de IBD en el modelo DSS de ratón de I BD por, por ejemplo, aproximadamente 1 día, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproxi madamente 7 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 14 días, aproximadamente 21 días o aproxi madamente 28 días, en comparación con un control adecuado. En otro ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del ligando puede resultar en una puntuación de severidad promedio en el modelo DSS de ratón de I BD de 0 a aproxi madamente 0.5, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 1 , aproximadamente 1 a aproximadamente 1 .5, aproximadamente 1 .5 a aproximadamente 2, o aproximadamente 2 a aproximadamente 2.5. En modalidades particulares, el ligando o monómero de dAb es eficaz en el modelo de humo de tabaco de ratón de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD). (Ver, Wright and Churg, Chest, 122:301 -306 (2002), Groneberg, DA er al, Respiratory Research 5: 18 (2004) , Coffman RL et al, J. Exp. Med. 207( 12): 1875-1879 (2001 ), Van Scott, M R et al, J. App. Physiol. 96: 1433-1444 (2004)). En modalidades adicionales, el ligando de monómero de dAb es eficaz en un modelo animal de asma (ver, Coffman RL et al, J. Exp. Med. 207( 12): 1875-1879 (2001 ); Van Scott, M R er al, J. App. Physiol. 96: 1433-1444 (2004)), fibrosis pulmonar (por ejemplo, Venkatesan, N et al. , Lung 287: 1342-1347 (2004) , lupus sistémico eritematoso (SLE) (Knight et al. ( 1978) J. Exp. Med. , 147: 1653; Reinersten et al. ( 1978) New Eng. J. Med., 299: 515), miastenia gravis (Lindstrom er al. ( 1988) Adv. Immunol. , 42: 233), artritis (Stuart et al. (1984) Ann. Rev. Immunol. , 42: 233; Van Edén et al. ( 1988) Nature, 331 : 171 ), tiroiditis (Marón et al. ( 1980) J. Exp. Med. , 152: 1 1 15), diabetes mellitus dependiente de insuli na (I DDM ) (Kanasawa et al. ( 1984) Diabetologia, 27: 1 13), y el modelo EAE de esclerosis múltipe (ver Paterson ( 1986) Textbook of Immunopathology, Mischer et al. , eds. , Gruñe and Stratton, New York, pp. 179-213; McFarlin et al. ( 1973) Science, 179: 478: y Satoh et al. ( 1987) J. Immunol, 138: 179). Preferentemente, el ligando o monómero de dAb se secreta en una cantidad de al menos aproximadamente 0.5 mg/L cuando se expresa en especies E. coli o en Pichia (por ejemplo, P. pastoris). En otras modalidades preferidas, el monómero de dAb se secreta en una cantidad de al menos aproximadamente 0.75 mg/L, al menos aproximadamente 1 mg/L, al menos aproximadamente 4 mg/L, al menos aproximadamente 5 mg/L, al menos aproximadamente 10 mg/L, al menos aproximadamente 15 mg/L, al menos aproximadamente 20 mg/L, al menos aproximadamente 25 mg/L, al menos aproximadamente 30 mg/L, al menos aproximadamente 35 mg/L, al menos aproximadamente 40 mg/L, al menos aproximadamente 45 mg/L, o al menos aproximadamente 50 mg/L, o al menos aproximadamente 100 mg/L, o al menos aproximadamente 200 mg/L, o al menos aproxi madamente 300 mg/L, o al menos aproximadamente 400 mg/L, o al menos aproximadamente 500 mg/L, o al menos aproximadamente 600 mg/L, o al menos aproximadamente 700 mg/L, o al menos aproximadamente 800 mg/L, al menos aproximadamente 900 mg/L, o al menos aproximadamente 1 g/L cuando se expresa en especies E. coli o en Pichia (por ejemplo, P. pastoris). En otras modalidades preferidas, el monómero de dAb se secreta en una cantidad de al menos aproximadamente 1 mg/L a al menos aproximadamente 1 g/L, al menos aproxi madamente 1 mg/L a al menos aproximadamente 750 mg/L, al menos aproximadamente 100 mg/L a al menos aproximadamente 1 g/L, al menos aproximadamente 200 mg/L a al menos aproximadamente 1 g/L, al menos aproximadamente 300 mg/L a al menos aproxi madamente 1 g/L, al menos aproximadamente 400 mg/L a al menos aproximadamente 1 g/L, al menos aproximadamente 500 mg/L a al menos aproximadamente 1 g/L, al menos aproximadamente 600 mg/L a al menos aproximadamente 1 g/L, al menos aproximadamente 700 mg/L a al menos aproximadamente 1 g/L, al menos aproximadamente 800 mg/L a al menos aproximadamente Ig/L, o al menos aproximadamente 900 mg/L a al menos aproximadamente Ig/L cuando se expresa en especies E. coli o en Pichia (por ejemplo, P. pastoris). Aunque, los ligandos y monómeros de dAb descritos en la presente pueden secretarse cuando se expresan en especies E. coli o en Pichia (por ejemplo, P. pastoris), pueden producirse utilizando cualquier método adecuado, tales como métodos químicos sintéticos o métodos de producción biológica que no emplean especies E. coli o Pichia. En algunas modalidades, el ligando es un anticuerpo que tiene especificidad de unión para un compuesto objetivo endógeno o un fragmento de unión a antígeno del mismo, tales como un fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento F(ab')2 o fragmento Fv (por ejemplo, scFV). En otras modalidades, el antagonista o ligando es monovalente, tal como un dAb o un fragmento de unión a antígeno monovalente de un anticuerpo, tales como un fragmento Fab, fragmento Fab' , o fragmento Fv. En otras modalidades de la invención descritas por toda esta descripción, en lugar del uso de un "dAb" en un ligando de la invención, se contempla que el experto puede utilizar un dominio que comprende las CDRs de un dAb que une un compuesto objetivo endógeno (por ejemplo, CDRs injertadas en una estructura o microandamio de proteína adecuada, por ejemplo, un aficuerpo, un microandamio SpA, un dominio de clase A del receptor LDL o un dominio EGF) o puede ser un dominio de proteína comprendiendo un sitio de unión para TNFR1 , por ejemplo, en donde el dominio se selecciona de un aficuerpo, un dominio SpA, un dominio de clase A del receptor LDL o un dominio EGF. La descripción como una totalidad debe construirse de acuerdo con lo anterior para proporcionar descripción de antagonistas, ligandos y métodos utilizados tales dominios en lugar de un dAb. Además, los ligandos de la invención pueden formatearse (por ejemplo, formatos de vida media extendidos) como se descri be en l a presente. Usos de Ligandos que Unen un Compuesto Objetivo Endógeno y Métodos Terapéuticos La i nvención se refiere a ligandos que comprenden una porción ( por ejemplo, dAb) que tiene un sitio de unión con especificidad de unión para un compuesto objetivo endógeno pero no i nhi ben substancialmente la actividad de dicho compuesto objetivo endógeno. Preferentemente, el ligando no se une al siti o activo de un compuesto objetivo endógeno. Características adicionales de los ligandos de la invención se describe en l a presente. Para conciencia y para evitar la repetición, no todas las características descritas de los ligandos se descri ben específicamente con respecto a los usos y métodos de l a i nvención. Se propone que los usos y métodos de la i nvención incl uyen el uso, y métodos que comprenden admi ni strar, cualquiera de los ligandos descritos en la presente. La i nvención se refiere a composiciones comprendiendo un ligando que comprende una porción (por ejemplo, dAb) que tiene un sitio de unión con especificidad de unión para un compuesto objetivo endógeno, pero no i nhi be substancialmente la actividad de dicho compuesto objetivo endógeno, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, dil uyente o excipiente. La invenci ón también se refiere a métodos de diagnóstico y terapéuticos que emplean l os ligandos o composiciones de la invención . Los ligandos descritos en la presente pueden utilizarse para aplicaciones profilácticas y terapéuticas in vivo, aplicaciones de diagnóstico in vivo y lo si milar. Por ejemplo, los ligandos (por ejemplo, monómeros de dAb) , de la presente invención típicamente encontrarán uso en prevenir, suprimir o tratar enfermedades (por ejemplo, enfermedades inflamatorias crónicas y/o agudas). Por ejemplo, los antagoni stas y/o ligandos pueden administrarse para tratar, suprimir o preveni r una enfermedad inflamatoria (por ejemplo, inflamación aguda y/o crónica), cánceres y neoplasmas (por ejemplo, linfomas (por ejemplo, linfomas de célula B, linfomas de célula T, linfoma mieloide agudo), mieloma múltiple, cáncer de pulmón, carcinomas), enfermedades metabólicas (por ejemplo, diabetes, obesidad), hipersensibilidad alérgica, infección viral o bacteriana , desordenes autoinmunes (que incluyen, pero no se limitan a, diabetes Tipo I , asma, esclerosis múltiple, artritis (por ejemplo, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil , artritis psoriática, espondilartropatía (por ejemplo, espondilitis de anquilosión)) , lupus eritematoso sistémico, enfermedad del intestino inflamatorio (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa), miastenia gravis y síndrome de Behcet), psoriasis, endometriosis, adhesiones abdominales (por ejemplo, cirugía post abdominal), osteoartritis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, u otra enfermedad que es adecuada para terapia con un compuesto objetivo endógeno. En la presente solicitud, el término "prevención" incluye administración de la composición protectora antes de la inducción de la enfermedad. "Supresión" se refiere a la administración de la composición después de un evento inductivo, pero antes de la aparición cl ínica de la enfermedad. "Tratamiento" incluye la administración de la composición protectora después de que los síntomas de la enfermedad se manifiestan. La invención se refiere al uso de un ligando, como se descri be en la presente, para la fabricación de un medicamento que puede administrarse a un paciente para aprovechar y explotar las actividades benéficas de compuestos endógenos para producir efectos benéficos (por ejemplo, efectos terapéuticamente benéficos, efectos benéficos de manera diagnosticada). De acuerdo con lo anterior, la invención se refiere al uso de un ligando para la fabricación de un medicamento para incrementar la cantidad de dicho compuesto objetivo endógeno en un sujeto (por ejemplo, la cantidad del compuesto objetivo endógeno en la circulación sistémica, la cantidad en un sitio particular, tales como un órgano particular, tejido o región (por ejemplo, en una articulación, en el pulmón, en un músculo, en sitio de la piel, en el CNS)), para incrementar la biodisponibilidad de dicho compuesto objetivo endógeno en un sujeto (por ejemplo, sistémicamente o en un sitio deseado de acción (por ejemplo, en una articulación, en el pulmón, en un músculo, en sitio de la piel, en el CNS)), para incrementar la vida media in vivo de dicho compuesto objetivo endógeno, o para tratar una enfermedad que es apta para tratamiento con un compuesto objetivo endógeno (por ejemplo, tal como una enfermedad como se describe en la presente), por ejemplo. El medicamento puede ser para administración local o sistémica. La invención se refiere al uso de un ligando comprendiendo una porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno para la fabricación de un medicamento para incrementar la vida media de dicho compuesto objetivo endógeno en un sujeto. El medicamento puede administrarse a un paciente para incrementar la vida media de un compuesto objetivo endógeno al cual el ligando se une al, por ejemplo, unir el compuesto objetivo endógeno e incrementar así el tamaño hidrodinámico del compuesto objetivo endógeno, al unir y estabilizar el compuesto objetivo endógeno, o al unir y disminuir la velocidad de despeje o metabolismo del compuesto objetivo endógeno. Generalmente, el ligando incrementará la vida media del compuesto objetivo endógeno al cual se une por un factor de al menos aproximadamente 1 .5, al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 6, al menos aproximadamente 7, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 9, o al menos aproximadamente 10, en relación a la vida media del compuesto objetivo endógeno en la ausencia de ligando. Por ejemplo, un compuesto objetivo endógeno puede tener una vida media de aproximadamente 1 hora, y después de l a admi nistración de un ligando que comprende una porción con un sitio de unión que une dicho compuesto objetivo endógeno, la vida media del compuesto objetivo endógeno puede incrementarse a aproximadamente 1 .5 horas, a aproximadamente 10 horas, o más tiempo. La invención se refiere al uso de un ligando comprendiendo una porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno para la fabricación de un medicamento para incrementar la cantidad de dicho compuesto objetivo endógeno en un sujeto. El nivel o cantidad de compuesto objetivo endógeno puede aumentar después de la administración de un ligando, como se describe en la presente, por ejemplo, debido al efecto creciente de la vida media de los ligandos. Por ejemplo, el nivel o cantidad de ligando objetivo endógeno (por ejemplo, en suero) 1 hora, o 2 horas, o 3 horas, o 4 horas, o 5 horas, o 6 horas, o 7 horas, o 8 horas, o 9 horas, o 10 horas, o 1 1 horas, o 12 horas, o 1 día después de la administración de un ligando de la invención puede aumentarse por un factor de al menos aproximadamente 1 .5, al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 500, al menos aproximadamente 1 ,000, al menos aproximadamente 5,000, al menos aproximadamente 10,000, al menos aproximadamente 50, 000, o al menos aproximadamente 100,000. El incremento de los niveles o cantidades de un compuesto objetivo endógeno puede detectarse fácilmente utilizando cualquier método adecuado. Por ejemplo, una muestra adecuada (por ejemplo, suero) puede obtenerse antes de la administración del ligando y en uno o más puntos de tiempo después de la administración, y el nivel o cantidad de compuesto objetivo endógeno en las muestras puede determinarse utilizando cualquier método adecuado. La muestra puede ser, por ejemplo, una muestra de sangre, suero, fluido cerebroespinal , fluido sinovial, lavado broncoalveolar, enema o una biopsia. En algunas modalidades, la cantidad o nivel de ligando en tal una muestra se incrementa, en relación a la cantidad o nivel antes de que el ligando se administre. La invención se refiere al uso de un ligando comprendiendo una porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno para la fabricación de un medicamento para incrementar la biodisponibilidad de dicho compuesto objetivo endógeno en un sujeto. El medicamento puede administrarse a un sujeto para incrementar la biodisponibilidad de un compuesto objetivo endógeno sistémicamente, o en un sitio deseado de acción (por ejemplo, en un sitio donde el ligando se administra localmente) . Por ejemplo, un ligando puede unir un compuesto objetivo endógeno que tiene actividad benéfica en la circulación sistémica pero se distribuye rápidamente en los tejidos o despeja (por ejemplo, un esteroide y hormona de péptido), y disminuir la velocidad de distribución o despeje. Tal un ligando puede incrementar la biodisponibilidad del compuesto objetivo endógeno en la circulación sistémica donde la actividad benéfica del compuesto objetivo endógeno puede tener un efecto benéfico (por ejemplo, terapéutico). Un ligando puede incrementar la biodisponibilidad de un compuesto objetivo endógeno en un sitio deseado al reclutar el compuesto objetivo endógeno a ese sitio. Por ejemplo, un ligando comprendiendo un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno deseado puede administrarse localmente a un paciente (por ejemplo, como una formulación de depósito). El ligando localmente administrado puede unir el compuesto objetivo endógeno deseado, y reclutar el compuesto objetivo endógeno adicional al sitio. De esta manera, una cantidad o nivel incrementado de compuesto objetivo endógeno puede estar presente en el sitio para producir efectos benéficos. Por ejemplo, en una modalidad, el ligando comprende una porción con un sitio de unión para isoforma de TGF beta 3. Tal un ligando puede administrarse localmente para unir isoforma de TGF beta 3 y recl utar la isoforma de TGF beta 3 al sitio de administración local , y de esta manera promover la curación de la herida. Generalmente, el ligando incrementará la biodisponi bilidad (por ejemplo, en la circulación sistémica, en un sitio deseado de acción) del compuesto objetivo endógeno al cual se une por un factor de al menos aproximadamente 1 .5, al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5, al menos aproxi madamente 6, al menos aproximadamente 7, al menos aproxi madamente 8, al menos aproximadamente 9, o al menos aproximadamente 10, en relación a la biodisponibilidad del compuesto objetivo endógeno en la ausencia de ligando. Por ejemplo, cuando el ligando incrementa la biodisponibilidad en la circulación sistémica, una curva de tiempo de concentración para el ligando endógeno iniciando en el tiempo de administración del ligando puede prepararse, y la curva y área bajo la curva (AUC) puede compararse con niveles sistémicos normales del ligando objetivo endógeno para determinar el grado de incremento en la biodisponibilidad sistémica. La invención se refiere al uso de un ligando comprendiendo una porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno para la fabricación de un medicamento para incrementar la actividad de dicho objetivo endógeno. Los ligandos pueden incrementar la actividad (por ejemplo, actividad de unión) de los objetivos endógenos a los cuales se unen. Por ejemplo, un ligando puede unir un compuesto objetivo endógeno tal como un agonista endógeno (por ejemplo, una citoqui na) o un receptor de citoquina soluble y mejorar la actividad de unión del compuesto objetivo endógeno al incrementar la afinidad y/o avidez del compuesto objetivo endógeno para su compañero de unión endógeno. Ligandos que comprenden dos o más porciones que tienen sitios de unión con especificidad de unión para un compuesto objetivo endógeno deseado pueden unir dos o más moléculas de compuesto objetivo endógeno individuales produciendo así un dímero, trímero, oligómero o multímero de compuesto objetivo endógeno. Tal un dímero, trímero, oligómero o multímero tendrán actividad de unión mejorada hacia, por ejemplo, una célula que expresa el compañero de unión natural para el compuesto objetivo endógeno debido a avidez más alta. General mente, tal un ligando puede mejorar la actividad de unión del compuesto objetivo endógeno. Por ejemplo, la i ntensidad de unión (por ejemplo, afinidad o avidez) de un dímero de compuesto objetivo endógeno para su compañero de unión puede ser al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 1 ,000 o al menos aproximadamente 10,000 veces más fuerte que la intensidad de unión del compuesto objetivo endógeno como un monómero (es decir, no en un complejo con un ligando de la invención). En una modalidad específica, el ligando comprende dos o más porciones (dAbs) que tienen especificidad de unión para TNFR 1 soluble pero no une el sitio activo (el sitio activo de TNFR1 sol uble se contiene dentro de Dominios 2 y 3). Tal un ligando puede uni r dos o más cadenas de TN FR1 soluble para formar un dímero, trímero, oligómero o multímero de TNFR1 soluble, que tiene actividad de unión mejorada hacia su ligando trimérico, TNF, debido a avidez incrementada. También debe apreciarse que la vida media de tal un dímero, trímero, oligómero o multímero de TNFR 1 soluble, que tiene un tamaño hidrodinámico más grande que una cadena de TNFR1 soluble única, puede también extenderse en relación a un TNFR1 único. Como un resultado, tal un ligando puede mejorar la actividad de unión a TNF de TN FR 1 sol uble y mejorar su eficacia terapéutica. Por ejemplo, tal un ligando puede mejorar la eficacia de TNFR1 soluble por un factor de al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 1 ,000 o al menos aproximadamente 10,000. En un ejemplo de esta modalidad, un ligando que es un dímero de un dAb que une Dominio 1 de TNFR1 de ratón se utiliza para demostrar que ligandos que inducen dimerización de TN FR1 soluble mejoran la eficacia de TNFR1 soluble . Por ejemplo, tal un ligando puede agregarse a un ensayo conteniendo células M RC5 de humano, TNF de humano y TNFR1 de ratón soluble . TNFR 1 de ratón soluble competirá con TNFR1 de humano en las cél ulas M RC5 con TNF de humano. El ligando que es un dímero de un dAb que une Dominio 1 de TNFR1 de ratón une dos cadenas de TNFR 1 de ratón soluble para formar un dímero de TNFR1 de ratón que será mucho más efectivo en inhibir los efectos de TNF en el ensayo. Por ejemplo, la IC 50 para TNFR1 de ratón puede reducirse del rango nanomolar al rango picomolar (aproximadamente 10 o aproximadamente 100 o aproximadamente 1000 veces de reducción) por la adición del ligando que induce la dimerización de TNFR1 soluble. Preferentemente, ligando que induce dimerización (o trimerización u oligomerización) de cadenas de receptor soluble no agoniza substancialmente las formas de transmembrana o superficie celular del receptor en un ensayo de célula estándar (es decir, cuando presente en una concentración de 1 nM, 10 nM , 100 nM , 1 µM , 10 µM , 100 µM , 1000 µM o 5,000 µM , resulta en no más de aproximadamente 5% de la actividad mediada por el receptor inducida por ligando natural del receptor en el ensayo). En una modalidad particular, la invención se refiere al uso de un ligando comprendiendo dos o más porciones que tienen un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno para la fabricación de un medicamento para incrementar la actividad de unión de dicho compuesto objetivo endógeno, en donde dicho ligando une dicho objetivo endógeno, no une el sitio activo de dicho objetivo endógeno, y no inhibe substancialmente la actividad de unión de dicho compuesto objetivo endógeno. La invención también se refiere a un ligando que une un compuesto objetivo endógeno teniendo actividad adecuada para tratar una enfermedad en un sujeto, en donde dicho ligando no une el sitio activo de dicho compuesto objetivo endógeno o substancialmente inhibe la actividad de dicho compuesto objetivo endógeno, para uso en terapia de una enfermedad apta para tratamiento con dicho compuesto objetivo endógeno. Por ejemplo, el ligando puede incrementar la vida media in vivo de dicho compuesto objetivo endógeno, incrementar la cantidad de dicho compuesto objetivo endógeno en un sujeto, incrementar la biodisponibilidad de dicho compuesto objetivo endógeno, y/o incrementar la actividad de unión de dicho compuesto endógeno.

La i nvención se refiere al uso de un ligando comprendiendo una porción de unión que tiene un sitio de uni ón para un compuesto objetivo endógeno para incrementar la vida media, biodi sponi bilidad o actividad de dicho compuesto endógeno, en donde dicha porción de unión que tiene un sitio de unión para un compuesto endógeno es dicho compuesto endógeno o una porción o variante del mismo, y en donde dicho ligando une dicho compuesto objetivo endógeno y no inhibe substancialmente la actividad de dicho compuesto objetivo endógeno. La i nvención se refiere al uso de un ligando comprendi endo una porción de unión que tiene un sitio de unión para un miembro de la superfamilia de receptor TNF para incrementar la vida media, biodi sponi bilidad o actividad de dicho miembro de la superfamilia de receptor TN F , en donde dicho ligando une dicho mi embro de la superfamilia de receptor TNF y no inhibe substancial mente la actividad de dicho miembro de la superfamilia de receptor TN F, y en donde dicha porción de unión que tiene un sitio de unión para un mi embro de la superfamilia de receptor TNF es un domi nio de ensamble de pre-ligando (PLAD) o una variante del mismo. La i nvención se refiere a un método para incrementar la vida media de un compuesto objetivo endógeno en un sujeto, comprendiendo admi nistrar a un sujeto en necesidad del mi smo una cantidad efectiva de un ligando comprendiendo una porción que tiene un sitio de unión con especificidad de unión para dicho compuesto objetivo endógeno.

La i nvención se refiere a un método para incrementar la cantidad de un compuesto objetivo endógeno en un sujeto, comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un ligando comprendiendo una porción que tiene un sitio de unión con especificidad de unión para dicho compuesto objetivo endógeno. La invención se refiere a un método para incrementar la biodisponibilidad de un compuesto objetivo endógeno en un sujeto, comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un ligando comprendiendo una porción que tiene un sitio de unión con especificidad de unión para dicho compuesto objetivo endógeno. La invención se refiere a un método para incrementar l a actividad (por ejemplo, actividad de unión) de un compuesto objetivo endógeno en un sujeto, comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un ligando comprendiendo una porción que tiene un sitio de unión con especificidad de unión para dicho compuesto objetivo endógeno. La invención se refiere a un método para tratar un sujeto teniendo una enfermedad que es apta para tratamiento con un compuesto objetivo endógeno en un sujeto, comprendiendo admi nistrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un ligando comprendiendo una porción que tiene un sitio de unión con especificidad de unión para dicho compuesto objetivo endógeno.

La invención se refiere a un método para incrementar la vida media, biodisponibilidad o actividad de un compuesto objetivo endógeno, comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un ligando comprendiendo una porción que tiene un sitio de unión con especificidad de unión para dicho compuesto objetivo endógeno, en donde dicha porción de unión que tiene un sitio de unión para un compuesto endógeno es dicho compuesto endógeno o una porción o variante del mismo, y en donde dicho ligando une dicho compuesto objetivo endógeno y no inhi be substancialmente la actividad de dicho compuesto objetivo endógeno. La invención se refiere a un método para incrementar la vida media, biodisponibilidad o actividad para un miembro de la superfamilia de receptor TNF, comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un ligando comprendiendo una porción de unión que tiene un sitio de unión para un miembro de la superfamilia de receptor TNF, en donde dicho ligando une dicho miembro de la superfamilia de receptor TNF y no inhibe substancialmente la actividad de dicho miembro de la superfamilia de receptor TNF, y en donde dicha porción de unión que tiene un sitio de unión para un miembro de la superfamilia de receptor TNF es un dominio de ensamble de pre-ligando (PLAD) o una variante del mismo. Usos profilácticos y terapéuticos de ligandos de la invención incluyen la administración de ligandos de acuerdo a la invención a un mamífero receptor, tal como un humano. Ligandos multi-específicos y dual-específicos (por ejemplo, formatos de anticuerpo dual-específicos) se unen a antígeno multimérico con mayor avidez. Ligandos dual o multi-específicos pueden permitir la degradación de dos antígenos, por ejemplo para producir dímeros, trímeros o multimeros de alta avidez de receptores solubles. Ligandos substancialmente puros de al menos 90 a 95% homogeneidad se prefieren para administración a un mamífero, y 98 a 99% o más homogeneidad se prefiere más para usos farmacéuticos, especialmente cuando el mamífero es un humano. Una vez purificados, parcialmente o homogeneidad según se desea, los ligandos pueden utilizarse de manera de diagnóstico o terapéuticamente (incluyendo extracorporalmente) o en desarrollar y realizar procedimientos de ensayo, coloraciones inmunofluorescentes y lo similar (Lefkovite and Pernis, ( 1979 y 1981 ) I mmunological Methods, Volumes I y I I , Academic Press, NY) . Generalmente, los ligandos se utilizarán en forma purificada junto con vehículos farmacológicamente apropiados. Típicamente, estos vehículos incluyen soluciones alcohólicas o acuosas/acuosas, emulsiones o suspensiones, cualquiera incluyendo salina y/o medios regulados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio y Ringer lactado. Los adyuvantes fisiológicamente aceptables, si es necesario mantener un complejo de polipéptido en suspensión, pueden elegirse de espesadores tales como carboximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, gelatina y alginatos. Vehículos intravenosos incluyen fluido y rellenos nutrientes y rellenos de electrolito, tales como aquellos basados en dextrosa de Ringer. Conservadores y otros aditivos, tales como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes, pueden también estar presentes (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition). Una variedad de formulaciones adecuadas puede utilizarse, incluyendo formulaciones de liberación extendida. La vía de administración de composiciones farmacéuticas de acuerdo a la invención puede ser cualquiera de las comúnmente utilizadas por aquellos de experiencia ordinaria en la materia. Para terapia, incluyendo sin limitación inmunoterapia, los ligandos seleccionados de la misma de la invención pueden administrarse a cualquier paciente de acuerdo con técnicas estándar. La administración puede ser por cualquier modo apropiado, incluyendo parenteralmente, intravenosamente, intramuscularmente, intraperitonealmente, transdérmicamente, a través de la vía pulmonar, o también, de manera apropiada, por infusión directa con un catéter. La administración parenteral también puede ser por infusión o inyección intraarteria, intratecal, intraarticular, subcutánea, u otra. Los modos adecuados adicionales de administración incluyen administración pulmonar, administración intranasal, intravaginal , administración intrarectal (por ejemplo, por supositorio o enema). La dosificación y frecuencia de administración dependerá de la edad, sexo y condición del paciente, administración concurrente de otros fármacos, contraindicaciones y otros parámetros para tomarse en cuenta por el médico. La administración puede ser local (por ejemplo, suministro local al pulmón por administración pulmonar, por ejemplo, administración intranasal) o sistémica como se indica. Los ligandos de la presente invención pueden utilizarse como composiciones administradas de manera separada o en conjunción con otros agentes. Estos pueden incluir varios fármacos inmunoterapéuticos, tales como ciclosporina, metotrexato, adriamici na o cisplatino, e inmunotoxinas. Composiciones farmacéuticas pueden incluir "cocktails" de varios agentes citotóxicos u otros junto con los antagonistas (por ejemplo, ligandos) de la presente invención, o aún combinaciones de ligandos de acuerdo a la presente invención teniendo diferentes especificidades, tales como ligandos seleccionados utilizando diferentes epítopos o antígenos objetivo, ya sea o no se agrupen antes de la administración. Generalmente, el ligando y cualquier agente adicional se administran en una manera que proporciona un recubrimiento de efecto terapéutico. En ciertas modalidades, el ligando comprendiendo una porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno se administra junto con una dosis baja del compuesto objetivo endógeno (por ejemplo, una forma recombi nante del compuesto objetivo endógeno). Como se describe en la presente, el ligando puede, por ejemplo, incrementar la vida media o biodisponibilidad del compuesto objetivo endógeno, o incrementar la actividad del compuesto objetivo endógeno, volviendo a la dosis baja terapéuticamente efectiva. Este planteamiento terapéutico es ventajoso debido a que los efectos secundarios asociados con dosis de agentes más altas para tratar enfermedad (por ejemplo, formas recombinantes de proteínas objetivo endógenas) pueden evitarse. En otras modalidades, un ligando que se ha precargado con un compuesto objetivo endógeno (por ejemplo, incubado con y que permite unir una forma recombinante de un compuesto objetivo endógeno) se administra. Los ligandos precargados se adecúan bien para administración local para proporcionar alta biodisponibilidad de un ligando objetivo endógeno que está normalmente presente a niveles sub-terapéuticos o que es difícil de reclutarse en un sitio en donde la actividad del ligando objetivo endógeno se desea. Ligandos de acuerdo a la invención que son capaces de unirse a objetivos extracelulares incluidos en endocitosis (por ejemplo, Clatrin) pueden endocitosarse, permitiendo acceso a objetivos intracelulares. Además, los ligandos duales o multiespecíficos, proporcionan un medio por el cual un domi nio de unión (por ejemplo, un monómero dAb) que es específicamente capaz de unirse a un objetivo intracelular puede suministrarse en un ambiente intracelular. Esta estrategia requiere, por ejemplo, un ligando específico dual con propiedades físicas que le permiten permanecer funcional dentro de la célula. Alternativamente, si el compartimiento intracelular de destino final se oxida, un ligando bien doblado puede no necesitarse que esté libre de disulfuro. Ventajosamente, los ligandos duales y multiespecíficos pueden utilizarse para citoquinas objetivo y otras moléculas que cooperan de manera sinergística en situaciones terapéuticas en el cuerpo de un organismo. La invención por lo tanto proporciona un método para sinergizar la actividad de dos o más dominios de unión (por ejemplo, dAbs) que unen citoquinas u otras moléculas, comprendiendo administrar un ligando dual o multiespecífico capaz de unirse a dichas dos o más moléculas (por ejemplo, citoquinas) . En este aspecto de la invención, el ligando dual o multiespecífico puede ser cualquier ligando dual o multiespecífíco, incluyendo un ligando compuesto de dominios complementarios y/o no complementarios, un ligando en una conformación abierta, y un ligando en una conformación cerrada. Por ejemplo, este aspecto de la invención se refiere a combinaciones de dominios VH y domi nios V , dominios VH solamente y dominios VL solamente. Si nergia en un contexto terapéutico puede lograrse en un número de maneras. Por ejemplo, combinaciones objetivo pueden ser terapéuticamente activas solamente si ambos objetivos se tienen como objetivo por el ligando, mientras que el objetivo de un objetivo solo no es terapéuticamente efectivo En otra modalidad, un objetivo solo puede proporcionar un efecto terapéutico algo bajo o mínimo, pero junto con un segundo objetivo la combinación proporciona un incremento sinergístico en efecto terapéutico Sistemas de modelo animal que pueden utilizarse para seleccionar la efectividad de los ligandos para proteger contra o tratar la enfermedad están disponibles El modelo animal adecuado puede utilizarse, tales como los modelos descritos en la presente Los hgandos de esta invención pueden liofihzarse para almacenamiento y reconstituirse en un vehículo adecuado antes de utilizarse Esta técnica se ha mostrado efectiva con inmunoglobulinas convencionales y técnicas de reconstitución y liofilización conocidas en la materia pueden emplearse Se apreciará por aquellos expertos en la materia que liofihzación y reconstitución pueden conducir a grados variables de pérdida de actividad de anticuerpo (por ejemplo, con inmunoglobulinas convencionales, anticuerpos IgM tienden a tener mayor pérdida de actividad que anticuerpos IgG) y que niveles de uso puede que se tengan que ajustar hacia arriba para compensar Las composiciones conteniendo los presentes ligandos o un de los mismos pueden administrarse para tratamientos terapéuticos y/o profilácticos En ciertas aplicaciones terapéuticas, una cantidad adecuada para realizar al menos inhibición parcial , supresión, modulación, muerte, o algún otro parámetro medible, de una población de células seleccionadas se define como una "dosis terapéuticamente efectiva". Las cantidades necesarias para lograr esta dosificación dependerán de la severidad de la enfermedad y el estado general del sistema inmune propio del paciente, pero generalmente variarán de 0.005 a 5.0 mg de ligando por kilogramo de peso corporal , con dosis de 0.05 a 2.0 mg/kg/dosis utilizándose de manera más común. Para aplicaciones profilácticas, las composiciones conteniendo los ligandos presentes o cocktails del mismo también pueden administrarse en dosificaciones similares o ligeramente inferiores, para prevenir, inhibir o retrasar el inicio de enfermedad (por ejemplo, para sostener la remisión o quiescencia, o para prevenir la fase aguda). El médico experto será capaz de determinar el intervalo de dosificación apropiado para tratar, suprimir o prevenir la enfermedad. Cuando un antagonista de TNFR1 (por ejemplo, ligando) se administra para tratar, suprimir o prevenir una enfermedad inflamatoria crónica, puede administrarse hasta cuatro veces por día, dos veces semanalmente, una vez semanalmente, una vez cada dos semanas, una vez al mes, o una vez cada dos meses, a una dosis, por ejemplo, aproximadamente 10 µg/kg a aproximadamente 80 mg/kg, aproximadamente 100 µg/kg a aproximadamente 80 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 80 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 70 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproxi madamente 60 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproxi madamente 30 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg , aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 10 µg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 10 µg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 10 µg/kg a aproximadamente 2.5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproxi madamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg o aproxi madamente 10 mg/kg. En modalidades particulares, el antagonista de TNFR1 (por ejemplo, ligando) se administra para tratar, suprimir o prevenir una enfermedad inflamatoria crónica una vez cada dos semanas o una vez al mes a una dosis de aproximadamente 10 µg/kg a aproximadamente 10 mg/kg (por ejemplo, aproximadamente 10 µg/kg, aproximadamente 100 µg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproxi madamente 7 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg o aproximadamente 10 mg/kg. ). Los ligandos también pueden administrarse (por ejemplo, sistémicamente o localmente), por ejemplo, a una dosis de aproxi madamente 1 mg/día a aproximadamente 10 mg/día (por ejemplo, 10 mg/día, 9 mg/día, 8 mg/día, 7 mg/día, 6 mg/día, 5 mg/día, 4 mg/día, 3 mg/día, 2 mg/día, o 1 mg/día). De acuerdo con lo anterior, el agente puede administrarse localmente a tejido pulmonar a una dosis de aproximadamente 1 µg/kg/dia a aproximadamente 200 µg/kg/día (por ejemplo, aproximadamente 10 µg/kg/día, aproximadamente 20 µg/kg/dí a, aproximadamente 30 µg/kg/día, aproximadamente 40 µg/kg/dí a, aproximadamente 50 µg/kg/día, aproximadamente 60 µg/kg/dí a, aproximadamente 70 µg/kg/día, aproximadamente 80 µg/kg/dí a, aproximadamente 90 µg/kg/día, aproximadamente 100 µg/kg/dí a, aproximadamente 1 10 µg/kg/día, aproximadamente 120 µg/kg/dí a, aproximadamente 130 µg/kg/día, aproximadamente 140 µg/kg/dí a, aproximadamente 150 µg/kg/día, aproximadamente 160 µg/kg/dí a, aproximadamente 170 µg/kg/día, aproximadamente 180 µg/kg/día, o aproximadamente 190 µg/kg/día). Tratamiento o terapia realizada utilizando las composiciones descritas en la presente se considera "efectivo" si uno o más síntomas se reducen (por ejemplo, por al menos 10% o al menos un punto en una escala de valoración clínica), en relación a tales síntomas presentes antes de tratamiento, o en relación a tales síntomas en un individuo (humano o modelo animal) no tratado con tal composición u otro control adecuado. Los síntomas obviamente variarán dependiendo de la enfermedad o desorden objetivo, pero pueden medirse por un técnico o médico experto ordinario Tales síntomas pueden medirse, por ejemplo, al monitorear el nivel de uno o más indicadores bioquímicos de la enfermedad o desorden (por ejemplo, niveles de una enzima o metabolito correlacionado con la enfermedad, números de célula afectados, etc ) , al monitorear las manifestaciones físicas (por ejemplo, inflamación, tamaño de tumor, etc ) o por una escala de valoración cl ínica aceptada, por ejemplo, la Escala de Estado de I ncapacidad Expandida (para esclerosis múltiple), el Cuestionario de Enfermedad de Intestino I nflamatoria Irvine (valoración de 32 puntos evalúa la calidad de vida con respecto a función del intestino, síntomas sistémicos, función social y estado emocional, rangos de de puntuación de 32 a 224, con puntuaciones más altas indicando una mejor calidad de vida), la Calidad de Escala de Artritis Reumatoide en Vida, el Cuestionario Respiratorio de St George, u otra valoración clínica aceptada como se sabe en la materia Una reducción sostenida (por ejemplo, un día o más, preferentemente más larga) en síntomas de desorden o enfermedad por al menos 10% o por uno o más puntos en una escala clínica dada es indicativa de tratamiento "efectivo" De manera similar, la profilaxis realizada utilizando una composición como se describe en la presente es "efectiva" si el i nicio o severidad de uno o más síntomas se retrasa, reduce o elimina en relación a tales síntomas en un individuo similar (modelo animal o humano) no tratado con la composición Una composición conteniendo un ligando o cocktail del mismo de acuerdo a la presente invención puede utilizarse en establecimientos terapéuticos y profilácticos para ayudar en la alteración, inactivación, muerte o retiro de una población celular objetivo selecta en un mamífero. además, los repertorios seleccionados de polipéptidos descritos en la presente pueden utilizarse de manera extracorporal o in vitro selectivamente para matar, eliminar o de otra manera remover de manera efectiva una población celular objetivo de una colección heterogénea de células. La sangre de un mamífero puede combi narse extracorporalmente con los ligandos, por ejemplo, anticuerpos, receptores de superficie celular o proteínas de unión de los mismos mediante los cuales las células no deseadas se mueren o de otra manera remueven de la sangre para regresar al mamífero de acuerdo con técnicas estándar. Una composición conteniendo un ligando de acuerdo a la presente invención puede utilizarse en establecimientos terapéuticos o profilácticos para ayudar en la alteración , inactivación, muerte o retiro de una población celular objetivo selecta en un mamífero. Además, los repertorios seleccionados de polipéptidos descritos en la presente pueden utilizarse extracorporalmente o in vitro selectivamente para matar, eliminar o de otra manera remover de manera efectiva una población celular objetivo de una colección heterogénea de células. La sangre de un mamífero puede combinarse extracorporalmente con los ligandos, por ejemplo, anticuerpos, receptores de superficie celular o proteínas de unión de los mismos mediante los cuales las células indeseadas se mueren o de otra manera remueven de la sangre para regresar al mamífero de acuerdo con técnicas estándar.

Compuestos Objetivo Endógenos Los compuestos objetivo endógenos adecuados incluyen, por ejemplo, receptores de citoquina solubles (por ejemplo, TN FR1 soluble, TNFR2 soluble, receptor I L-1 soluble, receptor I L-4 soluble, receptor I L-13 soluble), antagonistas de receptor endógeno ( I L-1 ra, I L-6ra), enzimas (por ejemplo, beta-glucocerebrosidasa (E.C. 3.2.1 .45)), factores sanguíneos (por ejemplo, Factor I I , Factor Vl l l), eritropoyetina, hormona de factor de crecimiento, TPO, interferón-alfa, interferón-beta, interferón-gamma, GLP-1 , OXM, hormonas sexuales (por ejemplo, testosterona, estrógeno), proteínas morfogénicas óseas (por ejemplo, BM P-1 , BMP-2, BM P-3, BM P-4, BM P-5, BM P-6, BM P-7) , isoforma beta 1 del factor de crecimiento de transformación (TGF-beta), isoforma TGF-beta 2, isoforma TGF-beta 3, I L-10, I L-2, factor estimulante de colonia de macrófago-granulocito, factor estimulante de colonia de granulocito, insulina, glucagón, GI P. Los compuestos objetivo endógenos adecuados incluyen citoquinas, tales como interleuquinas, interferones, factores estimulantes de colonia y quimoquinas. Ejemplos de tales citoquinas incluyen, interleuquinas IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, IL13, IL14, IL15 (IL-T), IL16, IL17, IL17B, IL17C, IL17E, IL17F, IL18, IL19, IL20, IL21, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL30, IL-31 e IL-32, e interferones IFN-alfa, IFN-beta, IFN-delta, IFN-gamma, IFN-kappa, IFN-lambda-1, IFN-lambda-2, IFN-lambda-3, IFN-omega, y IFN-tau. Los compuestos objetivo endógenos adecuados incluyen quimoquinas tales como, CCF18, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCL10, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, ECEP-1, EDNAP, ENA-78, ENAP, ENAP-alfa, ENAP-beta, inhibidor de crecimiento celular endotelial, IL8 endotelial, FIC, FDNCF, FINAP, GDCF-2, GCF, GCP-2, GRO-alfa, GRO-beta, GRO-gamma, proteína neutralizante de Heparina, Humig, I-309, ILC, ILINCK, MAC, l-TAC, IL8, IP-9, IP-10, Linfotactina, LAG-1, LARC, LCC-1, LD78-alfa, LD78-beta, LD78-gamma, LDCF, LEC, Lkn-1, LMC, LAI, LCF, LA-PF4, LDGF, LDNAP, LIF, LIX, MARC, MCAF, MCIF, Mexiquina, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, MDC, MEC, MIP-1-alfa, MIP-1-beta, MIP-1-delta, MIP-1-gamma, MIP-3, MIP-3-alfa, MIP-3-beta, MIP-4, MIP-4-alpha, MIP-5, Monotactin-1 , MPIF-1, MPIF-2, MRP-1, MRP-2, MDGF, MDNAP, MDNCF, factor estimulador de megacariocito, MGSA, MGSA-alfa, MGSA-beta, Mig, MIP-2, MIP-2-alfa, MIP-2-beta, MIP-2-gamma, NAF, NAP-1, NAP-2, NAP-3, NAP-4, NCP, Oncostatin A, PARC, PBP, como PBP, PBSF, PF4, PLF, PPBP, RANTES, Regaquina-1, SCM-1-alfa, SCYC1, SCYC2, SCI, SCYA1, SCYA2, SCYA3, SCYA4, SCYA5, SCYA6, SCYA7, SCYA8, SCYA9, SCYA10, SCYA11, SCYA12, SCYA13, SCYA14, SCYA15, SCYA16, SCYA17, SCYA19, SCYA20, SCYA21, SCYA22, SCYA23, SCYA24, SCYA25, SCYA26, SCYA27, SCYA28, SLC, SMC-CF, STCP-1, SCYB1, SCYB2, SCYB3, SCYB4, SCYB5, SCYB6, SCYB7, SCYB8, SCYB9, SCYB9B, SCYB10, SCYB11, SCYB12, SCYB13, SCYB14, SCYB15, SCYB16, SDF-1-alfa, SDF-1-beta, SR-PSOX, SCYD1, SR-PSOX, TARC, TCA-3, TCA-4, TDCF, TECK, TSC-1, TSG-8, TCF, TCK-1, TLSF-alfa, TLSF-beta, TPAR-1, TSG-1, WECHE. Los compuestos objetivo endógenos adecuados incluyen factores estimulantes de colonia (CSFs). CSFs son citoquinas que estimulan la proliferación de células germinales pluripotentes específicas de la médula ósea en adultos. Granulocito-CSF (G-CSF) es específico para efectos proliferativos en células del linaje de granulocito. Macrófago-CSF (M-CSF) es específico para células de linaje de macrófago. Granulocito-macrófago-CSF (GM-CSF) tiene efectos proliferativos en ambas clases de células linfoides. Epo también se considera un CSF así como también un factor de crecimiento, ya que estimula la proliferación de unidades formadoras de colonia de eritrocitos. IL-3 (secretado principalmente de células T) también se conoce como multi-CSF, ya que estimula las células germinales para producir todas las formas de células hematopoyéticas. Los compuestos objetivo endógenos adecuados incluyen Eritropoyeti na (Epo). Epo se sintetiza por el riñon y es el regulador primario de eritropoyesis. Epo estimula la proliferación y diferenciación de eritrocitos inmaduros; también estimula el crecimiento de células progenitoras de eritoide (por ejemplo, unidades formadoras de colonia y formadoras de impulsión de eritrocito) e induce la diferenciación de unidades formadoras de columna de eritrocito en proeritroblastos. Cuando a los pacientes que padecen de anemia debido a falla de riñon se da Epo, el resultado es un incremento rápido y significativo en conteo de glóbulos rojos. Los compuestos objetivo endógenos adecuados incluyen Factor I de Crecimiento Similar a Insulina (IGF-I ). IGF-I (originalmente llamado somatomedina C) es un factor de crecimiento estructuralmente relacionado con insulina. I GF-I es la proteína primaria incluida en la respuesta de células a la hormona de crecimiento (GH): es decir, IGF-I se produce en respuesta a G H e i nduce entonces las actividades celulares subsiguientes, particularmente en crecimiento óseo. Es la actividad de I GF-I en respuesta a G H que da origen al término somatomedina. Los estudios subsiguientes han demostrado, sin embargo, que IGF-I tiene actividades de paracrina y autocrina además de las actividades de endocrina inicialmente observadas en hueso. El receptor IGF-1 , como el receptor de insulina, tiene actividad de quinasa de tirosina intrínseca. Perteneciente a sus similitudes estructurales IGF-1 puede unirse al receptor de insulina pero lo hace a una afinidad mucho más baja a la que la hace la insulina por si misma. Los compuestos objetivo endógenos adecuados i ncluyen Factor I de Crecimiento Similar a Insulina (IGF-II ). IGF-I I se expresa casi de manera exclusiva en tejidos neonatales y embriónicos. Después del nacimiento, el nivel de proteína IGF-I I detectable cae de manera significativa. Por esta razón I G F-I I se piensa que es un factor de crecimiento fetal. El receptor IGF-I I es idéntico al receptor de manosa-6-fosfato que es responsable de la integración de enzimas lisozomales (que contienen residuos de manosa-6-fosfato) para la lisosomas. Los compuestos objetivo endógenos adecuados incluyen factor de necrosis de tumor beta. TNF-beta (también llamado linfotoxina) se caracteriza por su habilidad para matar un número de ti pos celulares diferentes, así como también la habilidad de inducir diferenciación terminal en otros. Una respuesta no proliferativa significativa a TNF-beta es una inhibición de lipasa de lipoproteína presente en la superficie de células endoteliales vasculares. El sitio predominante de síntesis de TNF-beta es T-linfocitos, en particular la clase especial de células T llamados T-linfocitos citotóxicos (células CTL). La inducción de expresión de TNF-beta resulta de las elevaciones en I L-2 así como también la interacción de antígeno con receptores de célula T. Los compuestos objetivo endógenos adecuados incluyen factor de necrosis de tumor alfa (TN F-alfa). TNF-alfa (también llamada linfotoxina B, o caquectina) es una citoquina inflamatoria pleiotrópica y puede causar necrosis de algunos tipos de tumores. TNF-alfa comparte solamente 36% de homología de secuencia de ami noácidos con TNF-beta. Aún, las estructuras terciarias de las dos proteínas son remarcadamente similares y ambas se unen a los receptores de TNF, TNFR-1 y TNFR-2. TNF-alfa es una proteína trimérica codificada dentro del principal complejo de histocompatibilidad. Se identifica primero en su forma secretada 17 kd, pero búsqueda adicional mostró entonces que un precursor 27kd no desdoblado también existe en forma de transmembrana. Los macrófagos estimulados producen TNF-alfa 27kd, que pueden ya sea unirse directamente a receptores TNFR-1 y TNFR-2 a través de contacto de célula a célula o experimentan desdoblamiento y se unen en su forma soluble. La citoqui na se produce por varios tipos de células, pero especialmente por macrófagos. Bajos niveles de TNF-alfa promueven el remodelado o reemplazo de tejido senescente o lesionado al estimular el crecimiento de fibroblasto. Las funciones benéficas adicionales de TNF-alfa incluyen su papel en la respuesta inmune a invasiones bacterianas, y ciertas fúngicas, virales y parásitas así como también su papel en la necrosis de tumores específicos. Por último, actúa como una clave mediática en la respuesta inmune inflamatoria local . TNF-alfa es una proteína de fase aguda que inicia una cascada de citoquinas e incrementa la permeabilidad vascular, reclutando así el macrófago y neutrófilos a un sitio de infección. TNF-alfa secretada por el macrófago causa la coagulación sanguínea que sirve para contener la infección. TNF-alfa también muestra efectos crónicos (por ejemplo, en inflamación) y sobreproducción prolongada de TNF-alfa también resulta en una condición conocida como caquexia, que se caracteriza por anorexia, catabolismo neto, pérdida de peso y anemia y que ocurre en enfermedad tal como cáncer y SI DA. Los compuestos objetivo endógenos adecuados incl uyen citoquinas y factores de crecimiento en hematopoyesis, tales como, CD34, CI L (linfoquina inhibiendo la colonia), Daniplestim , GADS (adaptador relacionado con GRB2 aguas abajo de shc), factor de crecimiento de célula Hepatopoyética, quinasa de célula Hematopoyética, fosfatasa de célula Hematopoyética, quinasa que carece de tirosina consenso Hematopoyética, factor estimulante de colonia Hematopoyética-309, Hematopoyetina-1 , Hematopoyetina-2, péptido Hemoregulador, HI M , Hiwi, HnudC, progenipoyetina, progenipoyetina-1 , progenipoyetina-2, progenipoyetina-4, Promegapoyetina, Promegapoyetina-1 , Promegapoyetina-1 a, y Sintoquina. Otros factores de crecimiento hematopoyético en un sentido amplio incluyen los diversos factores estimulantes de colonia (ver: CSF, incluyendo G-CSF, GM-CSF, M-CSF), Epo, SCF (factor de célula germinal, SCPF (factor de proliferación de célula germinal), varias Interleuquinas (IL1, IL3, IL4, IL5, IL6, IL11, IL12), LIF, TGF-beta, MIP-1-alfa, TNF-alfa, también muchos otros factores de peso molecular bajo, y varias otras citoquinas. Muchas de estas proteínas son multifuncionales. Actúan en etapas de diferenciación muy tempranas o en etapas posteriores; también pueden actuar en una manera específica de linaje o pueden influenciar más de un linaje. La proliferación y maduración de progenitores comprometidos se controla por los factores específicos de linaje que actúan al último tales como Epo, M-CSF, G-CSF, e IL5. Los progenitores multipotenciales comenzando la proliferación celular activa se regulan por varias citoquinas de recubrimiento, incluyendo IL3, GM-CSF, e IL4. La activación al ciclar por progenitores primitivos durmientes y mantenimiento de célula B potencial de los progenitores primitivos parece requerir interacciones de citoquinas de actuación temprana incluyendo IL6, G-CSF, IL11, IL12, LIF, y SCF. Dependiendo de sus actividad biológicas se han clasificado las hematopoyetinas en varios subgrupos. El término hematopoyetinas tipo 1 se utiliza ocasionalmente para describir estos factores incluidos en la regulación de hematopoyesis que actúan directamente en algunos tipos celulares. Este grupo incluye IL3 (multi-CSF) y GM-CSF. Los factores que sinergizan con factores estimulantes de colonia pero que por ellos mismos no poseen actividad estimulante de colonia intrínseca se han referido ocasionalmente como hematopoyeti nas tipo 2. I ncluyen I L1 , I L4, I L5 y I L6. Hematopoyetinas ti po 3 son aquellas modulando el crecimiento hematopoyético al estimular la liberación de factores estimulantes de colonia por sus cél ulas productoras respectivas. I ncluyen I L1 , I L2, TNF-beta e I FN-gamma. Algunos factores regulan negativamente los procesos de hematopoyesis. Pueden inhibir selectivamente la proliferación de algunos tipos de células hematopoyéticas y pueden aún inducir la muerte celular. El factor de crecimiento de transformación TGF-beta, por ejemplo, actúa predominantemente en cél ulas hematopoyéticas primitivas y células linfoides. El factor llamado M I P-1 -alfa (proteína inflamatoria de macrófago-1 -alfa) muestra actividad similar en células mielopoyéticas primitivas. Compuestos objetivo endógenos adecuados incluyen compuestos endógenos incluidos en angiogenesis. Ejemplos de compuestos endógenos incluidos en angiogenesis incluyen, Prolacti na 16K, ADAMTS-1 , ADAMTS-8, Adrenomedulin, proteína celular migratoria Angio-asociada, Angiogenin, proteína relacionada con angiogenin, Angiomodulin, Angiomotin, Angiopoyetina-1 , Angiopoyetina-2, Angiopoyetina-3, Angiopoyetina-4, Angiopoyetina-5, Angiopoyetina-similar a 1 , angiopoyetina-similar a 2, angiopoyetina-similar a 3, angiopoyetina-similar a 4, Angiopoyetina-relacionada con proteína-2, Angiostatin, Angiotensin-2, Angiotropin, ARP-2, factor de motilidad autocrina de melanoma B16-F1 , inhibidor-1 de angiogénesis específico de cerebro, inhibidor-2 de angiogénesi s específico de cerebro 2, inhibidor-3 de angiogénesis específico de cerebro C49a, ensayo CAM, factor de anti-tumor derivado de cartílago, inhibidor derivado de cartílago, CATF, cCAF, CD55, CDl , CDT6, inhibidor derivado de condrocito, inhibidor derivado de condrocito de angiogénesis y actividad de metaloproteinasa, Condromodulin-1 , factor de crecimiento derivado de Condrosarcoma, CLAF de ensayo de membrana corioalantóico, colágeno tipo 18, factor de crecimiento de tejido conectivo, factor angiogénico de lúteo hábeas, proteína inhibidora de degranulación, EGF, EG-VEGF, factor-1 de angiogénesis derivado de riñon embriónico, factor-2 de angiogénesis derivado de riñon embriónico, factor de crecimiento endotelial vascular derivado de glándula endocrina, Endorepelin, endostatin, factor angiogénico estimulante de célula endotelial, factor de crecimiento derivado de célula endotelial , polipéptido-2 activador de monocito endotelial , ESAF, f-ECGF, FGF, FGF-4, fragmento E de fibrina, factor de crecimiento celular endotelial derivado de Fibroblasto, proteína-12 secretada inducible por fibroblasto, FrzB2, GFB-1 1 1 , factor inhibidor de angiogénesis derivado de glioma, hormona de creci miento, GSM , HAP, Haptoglobin, factor promotor de neurita de unión a heparina, factor de crecimiento de hepatocito, HGF, HUAF, factor angiogénico de humano, factor-1 de angiogénesis de inhibidor de humano, factor de angiogénesis uterino de humano, I FN-alfa, I FN-gamma, IGF, IGF-1 , IGF-BP-7, jagged, KAF , kalistatin, K-FGF, factor angiogénico de riñon, quinostatina, factor estimulante de migración, proteína/proliferina regulada de mitógeno, proteína-4 regulada de mitógeno, Monocito-Angiotropin, M RP/PLF, M RP-4, Neuroleuquina, Neuropilin-1 , NKG5, NLK, Notch-1 , Notch-4, ORF-74, factor de crecimiento ovárico, PAF, proteína relacionada con hormona paratiroidea, PD-ECGF, PDGF, PDGF-BB, PEDF, PF4, PGI , factor de crecimiento de placenta de factor derivado de epitelio de pigmento, factor angiogénico placental , factor-4 de plaqueta, factor de crecimiento celular endotelial derivado de plaqueta, PIGF, PrGF, Prokinetici n-1 , proteína relacionada con proliferina, factor estimulante de Prostaciclina, factor de crecimiento prostético, dominio PRP kringle-2 de protrombina, PTHrP, RNASE5, factor Scatter, semaforin-3, Sprouty, TAF, TAM F, TGF-alfa, TGF-beta, trombina, Trombospondina, TI E-1 , TIE-2, factor de tejido, TNF-alfa, TNF-beta, inductor de apoptosis débil similar a TNF, Transferrina, TSP, factor de angiogénesis de tumor, factor de motilidad autocri na de tumor, Tumstatin, TWEAK, factor de angiogénesis uterino, factor de permeabilidad vascular, Vasculotropina, VEGF, VEGF-162, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGI , VPF. M uchos factores de crecimiento diferentes y citoquinas han mostrado ejercer actividades quimiotácticas, mitogénicas, modulares o inhibidoras en células endoteliales, célula muscular lisa y fibroblastos y, por lo tanto, puede esperarse que participen en procesos angiogénicos en una manera u otra. El proceso incluye la acción concertada de enzimas proteolíticas , componentes de matriz extracelular, moléculas de adhesión celular, y factores vasoactivos. Los factores modulando el crecimiento, conducta quimiotáctica y/o actividades funcionales de células musculares lisas incluyen Activina A, Adrenomedulin, aFGF, ANF, Angiogenin , Angiotensin-2 , Betacelulin, bFGF, CLAF , ECDGF (factor de crecimiento derivado de célula endotelial), ET (Endotelinas), Factor X, Factor Xa, HB-EGF, inhibidor derivado del corazón de proliferación celular vascular, I FN-gamma, I L1 , LDGF (factor de crecimiento derivado de Leiomioma), MCP-1 , M DGF (factor de crecimiento derivado de macrófago, factor de crecimiento derivado de monocito), NPY, Oncostatina M , PD-ECGF, PDGF, Prolactin, Proteína S, SDGF (factor de crecimiento derivado de célula muscular lisa), SDMF (factor de migración derivado de célula muscular lisa), Taquiquinins, TGF-beta, Trombospondin. Los factores modulando crecimiento, conducta quimiotáctica y/o actividades funcionales de células endoteliales vasculares incluyen AcSDKP, aFGF, ANF, Angiogenin, angiomodulin, Angiotropin, AtT20-ECGF, B61 , bFGF, actividad inducida por bFGF, CAM-RF, ChDI , CLAF, ECGF, ECl, EDMF, EGF, EMAP-2, Neurotelin (ver: EMM PRI N), Endostatin, inhibidor del factor de crecimiento endotelial , factor de mantenimiento de viabilidad celular endotelial, Epo, FGF-5, IGF-2 (ver: actividad promotora del crecimiento para células endoteliales vasculares), HBNF, HG F, HUAF, I FN-gamma, I L1 , K-FGF, LI F, M D-ECI , M ECI F, N PY , Oncostatin M , PD-ECGF, PDGF, PF4, PIGF, Prolactin, TNF-alfa, TNF-beta, Transferrina, VEGF. Algunos de estos factores son factores de proteína detectados inicialmente debido a algunas otras actividades biológicas y después muestran promover angiogénesis. La lista de factores de proteína angiogénicamente activos in vivo incluyen factores de crecimiento de fibroblasto (ver: FGF), Angiogenin, Angiopoyetina-1 , EGF, HGF, NPY , VEGF, TN F-alfa, TGF-beta, PD-ECGF, PDGF, IGF, I L8, Hormona de crecimiento. Fragmento E de fibrina se ha mostrado también por tener actividad angiogénica. Además hay factores tal como Angiopoyetina-1 que no se comportan como factores de crecimiento clásicos para células endoteliales pero juegan un papel prominente en procesos angiogénicos y vasculogénicos. PF4 y un fragmento 16 kDa de Prolactina son inhibidores in vivo. Compuestos objetivo endógenos adecuados incluyen compuestos endógenos incluidos en la formación y mantenimiento de los sistemas nervioso periférico y/o central, tales como factores neurotróficos que mejoran la diferenciación neuronal, inducen proliferación, influencian funciones sinápticas, y promueven la supervivencia de neuronas que se destinan normalmente a morir durante diferentes fases del desarrollo del sistema nervioso periférico y central. Ejemplos de tales proteínas incluyen neurotrofinas, tales como BDNF (factor neurotrófico derivado del cerebro) , NGF, NT-3 (neurotrofin-3), NT-4, NT-5, NT-6, NT-7, CNTF (factor neurotrófico ciliar), GDNF (factor neurotrófico derivado de línea celular glial), y Purpurina. Factores de crecimiento tales como bFGF o LI F también se encuentran de manera frecuente entre las neurotrofinas debido a sus actividades tróficas en un número de neuronas. BDNF, NGF y NT-3 se refieren algunas veces también colectivamente como la familia de proteína NGF ya que NGF es el miembro fundador de esta familia de proteínas. Ha sido posible, por combinación de elementos estructurales de NGF, BDNF y NT-3, formar la Pan-Neurotrofin-1 (PNT-1 ) multifuncional que activa eficientemente todos los receptores trk y despliega múltiples especificidades neurotróficas. Otro factor de supervivencia neuronal es NSE (enolasa específica de neurona). Otros factores con actividades neurotróficas normalmente no se clasifican como neurotrofi nas y con frecuencia poseyendo un espectro más amplio de funciones son EGF, HBNF (factor promotor de neurita de unión a hepari na), IGF-2, aFGF y bFGF, PDGF, NSE (enolasa específica de neurona), y Activina A. Para factores de crecimiento antiproliferativos afectando las células neurales ver también: proteína antiprolfierativa neural , Astrostatina, GGI F (factor de crecimiento inhibidor glial). Dependiendo de sus bioactividades se hace una distinción entre los factores promotores de neurita (NPFs) y factores de diferenciación neuronal . Los factores promotores de neurita no promueven la supervivencia neuronal o crecimiento general por ellos mismos sino que requieren además uno o más factores neurotróficos para inducir el crecimiento de procesos dendríticos o axonales. Los factores con actividad NPF incluyen NGF, S 100, GM F-beta (factor de maduración glial), proteoglicanos, merosin , colágenos, moléculas de adhesión celular, y laminin. Compuestos objetivo endógenos adecuados incluyen compuestos endógenos incluidos en la curación de herida. Las plaquetas son una fuente rica de citoquinas y factores de crecimiento localmente activos. Entre otras cosas los factores derivados de plaqueta incluyen dinucleótido de adenosina (que induce la agregación de plaqueta y también estimula la migración y proliferación celular), Beta-Tromboglobulina, bFGF, CTAP-3 (proteína-3 de activación de tejido conector), EGF, polipéptido-1 quimiotáctico de eosinóficlo (es decir, RANTES), f-ECGF (factor de creci miento de célula endotelial derivado de fibroblasto), fi bronecti na (que sirve como un ligando de matriz temprano para agregación de plaqueta), HCl (inhibidor de colagenaza de humano), HGF (factor de crecimiento de hepatocito), HRF (factores de liberación de histamina), IGF-BP-3, NAP-2 (proteína-2 de activación de neutrófilo), NAP-4 (proteína-4 de activación de neutrófilo), PBP (proteína básica de plaqueta), PD-ECGF (factor de crecimiento de célula endotelial derivada de plaqueta), PDG F, PF4, factor de activación de plaqueta (PAF, incluido también en agregación de plaqueta), serotonin (que induce permeabilidad vascular y es un quimioatrayente para neutrófilos), Somatostatin , TG F-alfa, TGF-beta, tromboxano A2 (que se i ncluye en vasoconstricción, agregación de plaqueta, y quimiotaxis) , Vitronectin. Los leucocitos de sangre periféricos circulantes migran en el espacio de la herida. Las primeras células que aparecen en el área de la herida son neutrófilos. Los números de neutrófilo alcanzan niveles máximos aproximadamente 24 horas después de la lesión. Su migración se estimula por varios factores quimiotácticos y citoquinas, incluyendo factores de complemento, I L1 , TNF-alfa, TGF-beta, y quimioquinas tales como I L8, GRO-alfa, PF4, MCP-1 , I P-10, mig, y también por polisacáridos bacterianos. Los neutrófilos se adhieren al endotelio por medio de selecti nas, que funcionan como receptores de neutrófilo en la superficie de célula endotelial. Los receptores de integrina en las superficies celulares de neutrófilo facilitan la unión de neutrófilos a la matriz extracelular. Los neutrófilos no parecen jugar un papel crítico en la curación de la herida en la ausencia de infecciones a medida que las heridas pueden curarse en animales en los cuales los neutrófilos se eliminan. Los neutrófilos se remueven por macrófagos de tejido cuando no se necesitan más. Los monocitos aparecen aproximadamente 24 horas después de la lesión y tienen valores máximos 48 después de la lesión. Ya que los monocitos maduran en los macrófagos pueden considerarse una fuente esencial de citoquinas accionando los procesos de reparación. Los macrófagos y monocitos también se atraen por una variedad de quimioquinas. Estas qui mioquinas contribuyen a la infiltración espacial y temporalmente diferente de subconjuntos de leucocito y de esta manera integran los procesos reparativos e inflamatorios durante la reparación de la herida. Los macrófagos de tejido son las células que esencialmente controlan y regulan el proceso de curación de la herida y las heridas no pueden curarse sin la participación de estas células como se muestra por los experimentos incluyendo eliminación de macrófagos de herida. La diferenciación de macrófagos se i nicia por varias citoquinas específicas. Muchas citoquinas producidas y secretadas por macrófagos activados favorecen la migración adicional de células inflamatorias en el área de la herida. Los macrófagos también controlan la degradación de la matriz extracelular y regulan la remodelación de la matriz de herida. Los macrófagos secretan las citoquinas y factores de crecimiento incluyendo TGF-beta, FGF, VEGF, y quimioquinas tal como J E . TGF-beta parece ser el factor principal responsable de la formación de tejido de granulación y la síntesis de proteínas de la matriz extracelular y de esta manera se ha referido como una "hormona de la herida" . TGF-beta es un miembro de uno de los grupos más complejos de superfamilias de citoquina, consistiendo de varias isoformas de TGF-beta y otros miembros de la familia, por ejemplo, Activina A y BMP. La complejidad del proceso de curación de heridas se ilustra por la observación que la manipulación de las proporciones de miembros de la superfamilia de TGF-beta, particularmente la proporción de TG F-beta-l en relación a TGF-beta-3, reduce la cicatrización y fibrosis. Re-epitelización se media por factores de crecimiento mitogénicos y quimiotácticos de la familia EGF de factores de crecimiento. Leptina se ha mostrado ser un factor de crecimiento potente para queratinocitos durante la curación de la herida. La fase final de la curación de la herida se caracteriza por el reemplazo gradual de los tejidos de granulación por tejido conectivo. Este proceso también requiere accionar localmente las citoquinas. Sin embargo, poco se conoce acerca de los factores y mecanismos que limitan eventualmente el crecimiento del tejido una vez que el proceso de reparación se ha completado. La síntesis de colágeno e inhibidores de proteinaza se estimula, entre otras cosas, por TGF-beta y factores relacionados. El cierre de la herida y la evolución de una cicatriz se asocia con una disminución de golpe en celularidad, incluyendo desaparición de miofibroblastos típicos. Se ha sugerido que la muerte celular por apoptosis es el mecanismo responsable de la evolución de tejido de granulación en una cicatriz. La curación de la herida fetal es sobresaliente por su ausencia de cicatrización. Existe alguna evidencia de que los fibroblastos adultos y fetales despliegan diferencias fenotípicas en términos de actividad migratoria, respuesta motogénica a citoquinas y la síntesis de citoquinas motogénicas, factores de creci miento y macromoléculas de matriz. Al manipular las acciones del factor de crecimiento y citoqui nas, es posible acelerar o modificar la curación de la herida. Los experimentos de animal y también experiencia clínica han demostrado que la administración tópica de varias citoqumas, incluyendo bFGF, EGF, KGF, PDGF, TGF-beta, ya sea solos o en combi nación, acelera considerablemente la curación de la herida al estimular la formación de tejido de granulación y mejorar la epitelización. Los compuestos objetivo endógenos adecuados i ncluyen proteínas de fase aguda de inflamación. Los ejemplos adecuados de tales proteínas y sus funciones se proporciona en la Tabla 2. Tabla 2 Los inductores principales de proteínas de fase aguda son I L1 , I L6, y TNF. Los dos mediadores I L1 y I L6 se han utilizado para clasificar las proteínas de fase aguda en dos subgrupos. Las proteínas de fase aguda tipo 1 son aquellas que requieren la acción sinergística de I L6 e I L1 para síntesis máxima. Ejemplos de proteínas Tipo 1 son proteína C-reactiva, amiloide de suero A y glicoproteína de ácido alfa-1 . Proteínas de fase aguda tipo 2 son aquellos que requieren I L6 solamente para inducción máxima. Ejemplos de proteínas Tipo 2 son cadenas de fibrinógeno, haptoglobina, y alfa-2-Macroglobulina. Expresión de genes codificando proteínas de fase aguda tipo 2 se suprime en lugar de mejorarse frecuentemente por I L1 (Ramadori et al; Fey et al). Los efectos aditivos, sinergísticos, co-operativos y antagonísticos entre citoquinas y otras substancias mediadores que influencian la expresión de proteínas de fase aguda ocurren y se han observado en casi todas las combinaciones. Muchas citoquinas también muestran efectos diferenciales, induciendo la síntesis de una o dos proteínas de fase aguda pero no otros. Por ejemplo, Activi na A induce un subconjunto de proteínas de fase aguda en células HepG2. Lipopolisacáridos bacterianos y varias citoquinas (principalmente I L1 , I L6 y TNF pero también LI F, CNTF, oncostatin M , I LI 1 , y cardiotrofin-1 ) se incluyen en la inducción de síntesis SAA y algunas de estas citoquinas actúan de manera sinergística (Benigni er al).

I L1 y también I FN-gamma reducen algunos de los efectos de I L6. Algunos de los efectos de I L2 e I L6 se antagonizan por TGF-beta. La acción combinada de dos o aún más citoquinas que puede producir efectos que no tienen factor propio sería capaz de lograrse. En células de hepatoma HepG2 cultivadas, I L1 , I L6, TNF-alfa y TGF-beta inducen la síntesis de antiquimotripsina y al mismo tiempo reprime la síntesis de albúmina y AFP (alfa-Fetoproteína). La síntesis de fibrinógeno se induce por I L6 y este efecto es, a su vez, suprimida por I L1 -alfa, TNF-alfa o TGF-beta-1 . Compuestos objetivo endógenos adecuados incluyen compuestos endógenos incluidos en hemostasis y cascadas de coagulación. Aparte de incluirse en la regulación de permeabilidad capilar y los vasos el endotelio de los vasos sanguíneos juegan un papel decisivo para mantener una superficie no trombogénica al proporcionar activadores e inhibidores de coagulación y fibrinolisis. El endotelio también se incluye en modulación de varios procesos inmunológicos. En células endoteliales I L1 induce, entre otras cosas, la síntesis de varios factores estimulantes de colonia, I L6, TNF-alfa, prostaglandinas, factor de activación de plaqueta (PAF), inhibidor de activador de plasminógeno (PAI). Un regulador endógeno importante de I L1 es PGE2 que inhibe secreción de I L1 y TNF-alfa. TNF-alfa, entre otras cosas, induce la síntesis de tromboplastina de tejido (TPL) que participa en la formación del complejo activador del factor X que cataliza la generación de trombina. El complejo también activa el factor IX. TNF-alfa también induce la síntesis de I L1 por células endoteliales y esta I L1 también puede promover la producción de TPL, por células endoteliales. La síntesis de TNF-alfa también puede inducirse por I L1 . TNF-alfa e I L1 también inducen la síntesis de antígenos de superficie celular. La expresión de moléculas de adhesión incrementa la adhesión de linfocitos y leucocitos en la pared del vaso y facilita de esta manera la migración transendotelial de estas células. TNF-alfa e I L1 subregulan el sistema de inactivación de Proteína C al i nhibir la síntesis de trombomodulina. La trombomodulina compuesta con trombina activa proteína C que puede entonces formar los complejos con proteína S unida por membrana. Estos complejos inhiben el factor Va. La proteína C activada también neutraliza el inhibidor de activador de plasminógeno (PAI ) por composición. TNF-alfa y también I L1 de esta manera reducen la inactivación del factor Va. Otros compuestos objetivo endógenos adecuados incluidos en coagulación incluyen Kalikrein, Factor Xl l , Factor Xl b, Factor XI , Factor Xla, Factor IX, Factor IXa, Factor Vll l , Factor Villa, Factor X, Factor Xa, Factor Va, Factor XI I la, Protrombina, Trombina, Fibrinógeno, Fibrina, Plasminigen, Plasmina. Compuestos objetivo endógenos adecuados también incluyen hormonas, tales como hormonas de tensión (por ejemplo, Adrenalina, hormona Adrenocorticotrópica, Corticosterona, Epinefrina, Hormona de Crecimiento, Hidrocortisona), fluido/electrolito y hormonas vasculares (por ejemplo, Aldosterona, Androstenodiona, Vasopresina, Bradiquinina, Calcitonina, Neurotensina), hormonas digestivas y de hígado (por ejemplo, Colecistoquinina, Colesterol, VI P), hormonas reproductivas (por ejemplo, Gonadotrophin Crónica, Epogen, Estradiol , Estriol , Estrona, Etiocolanolona, FSH, Hormona Lactogénica, Hormona Luteinizante, Testosterona, Oxitocina, Progesterona, Prolactina, Gonadotrofina), hormonas que manejan azúcar (por ejemplo, Glucagon, I nsulina), hormonas de tiroide (por ejemplo, T2, T3, T4, Hormona Trirotrópica, factor de liberación Tirotrópico, TSH, Hormona Paratiroidea), hormonas óseas (por ejemplo, CSF-1 , RANK1 , miembros de la familia de Proteína Morfogénica ósea), y otras hormonas, tales como, hormona estimulante de tiroide (TS H) , hormona estimulante de folículo (FSH), hormona luteinizante ( LH) , Prolactina (PRL), hormona de crecimiento (GH), hormona Adrenocorticotrópico (ACTH), hormona Antidiurética (ADH) (vasopresina), Oxitocina, hormona de liberación de Tirotropina (TRH), hormona de liberación de Gonadotropina (GnRH), hormona de liberación de hormona de crecimiento (GHRH), hormona de liberación de corticotropina (CRH), Somatostatina, Dopamina, Melatonina, Tiroxina (T4), Calcitonina, hormona de paratiroide (PTH), Glucocorticoides (por ejemplo, Cortisol) , Mineralocorticoides (por ejemplo, aldosterona), Andrógenos (por ejemplo, testosterona), Adrenalina (epinefrina), Noradrenalina (norepinefrina) , Estrógenos (por ejemplo, estradiol), Progesterona , gonadotropina crónica de humano (HCG), Insulina, Gl ucagón, Somatostatina, Amilina, Eritropoyetina (EPO), Calcitriol , Calciferol (vitamina D3), péptido Atrial-natriurético (ANP), Gastri na, Secretina, Colecistoquinina (CCK), Somatostatina, Neuropéptido Y , Grelina, PYY3-36, factor de crecimiento-1 similar a insulina ( IG F-1 ), Angiotensinogen, Trombopoyetina, Leptina, Proteína 4 de Unión a Retinol, y Adiponectina. Además hormonas adecuadas se enlistan en la Tabla 3. Tabla 3 Tabla 4 proporciona una lista no exhaustiva de compuestos objetivo endógenos adecuados y terapéuticos preferidos para tener como objetivo el compuesto endógeno con un ligando como se describe en la presente. La columna de "Identificador Ejemplificativo" proporciona los Números de Registro de los Servicios de Resúmenes Químicos (CAS) (publicados por la Sociedad Química Americana) y/o Números de Acceso al Banco Genético ((por ejemplo, Locus I D, NP_XXXXX (Proteína de Secuencia de Referencia), y XP_XXXXX (Proteína de Modelo) identiticadores disponibles en la página web del Centro Nacional para I nformación de Biotecnología (NCBI ) www. ncbi . nl m. nih. gov) que corresponden a las entradas en el Registro CAS o bases de datos del Banco Genético que contienen una secuencia de aminoácidos del compuesto objetivo endógeno o de un fragmento o variante del compuesto objetivo endógen. Las páginas de resumen asociadas con cada uno de estos Números de Acceso GenSeq y Banco Genético y CAS así como también las publicaciones periodísticas citadas (por ejemplo, número I D PubMed (PM I D)) se incorporan cada una para referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a las secuencias de aminoácidos descritas en la presente. La columna de "actividad biológica" describe las actividades biológicas asociadas con la molécula objetivo endógena. La columna "I ndicación Preferida" descri be la enfermedad, desordenes, y/o condiciones que pueden tratarse, prevenirse, diagnosticarse, o mejorarse por un ligando que comprende una porción que tiene un sitio de unión con especificidad de unión para el compuesto objetivo endógeno indicado La i nvención también se refiere a un ligando que comprende una porción teniendo un sitio de unión con especificidad de unión para cualquiera de los compuestos objetivo endógenos enlistados en la Tabla 4 para utilizarse en la fabricación de un medicamento para tratar cualquiera de las indicaciones preferidas correspondientes descritas en la Tabla 4. La invención también se refiere a un método para tratar cualquiera de las indicaciones preferidas enlistadas en la Tabla 4, comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un ligando que comprende una porción teniendo un sitio de unión con especificidad de unión para el compuesto objetivo endógeno correspondiente enlistado en la Tabla 4. Tabla 4 Las listas presentadas de compuestos objetivo endógenos por ningún medio son exhaustivas. Donde un ligando se une a dos epitopos (en los mismos o diferentes antígenos), el(los) antígeno(s) pueden seleccionarse de esta lista. En modalidades particulares, el ligando comprende un dAb que une TNFR1 y un segundo dAB o dominio de unión a epítopo que une cualquiera de estos antígenos. En tales modalidades, el ligando multiespecífico puede comprender cualquier combinación de dominios variables de inmunoglobulina (por ejemplo, VHVH, VHVL, V VL).

Ligandos y monómeros dAb que une albúmina de suero La invención proporciona un ligando o monómero de dAb (por ejemplo, ligando específico dual comprendiendo tal un dAb) que se une a albúmina de suero (SA) con Kd de 1 nM a 500 µM (es decir, x 10~9 a 5 x 10~4), preferentemente 100 nM a 10 µM . Preferentemente, para un ligando específico dual comprendiendo un pri mer dAb anti-SA y un segundo dAb a otro objetivo, la afinidad (por ejemplo Kd y/o Kapagada como se mide por resonancia de plasmón de superficie, por ejemplo utilizando BiaCore) del segundo dAb para su objetivo de 1 a 100000 veces (preferentemente 100 a 100000, más preferentemente 1000 a 100000, o 10000 a 100000 veces) la afinidad del primer dAb para SA. Por ejemplo, el primer dAb une SA con una afinidad de aproximadamente 10 µM , mientras el segundo dAb une su objetivo con una afinidad de 100 pM . Preferentemente, la albúmina de suero es albúmina de suero de humano (HSA) . En una modalidad, el primer dAb (o un monómero dAb) une SA (por ejemplo, HSA) con Kd de aproximadamente 50, preferentemente 70, y más preferentemente 100, 150 o 200 nM . En ciertas modalidades, el monómero de dAb que une SA resiste agregación, se desdobla de manera reversible y/o comprende una región de estructura como se describe arriba para monómeros de dAb que unen TNFR1 .

Formatos de ligando Ligandos y monómeros de dAb pueden formatearse como anticuerpos mono o multiespecíficos o fragmentos de anticuerpo o en estructuras sin anticuerpo mono o multiespecíficos. Los formatos adecuados incluyen, cualquier estructura de polipéptido adecuada en la cual un dominio variable de anticuerpo o una o más de las CDRs de la misma puede incorporarse para conferir la especificidad de unión para antígeno en la estructura. Una variedad de formatos de anticuerpo adecuados se conocen en la materia, tales como, formatos similares a IgG , anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos de cadena única, anticuerpos biespecíficos, cadenas de pesada de anticuerpo, cadenas de ligera de anticuerpo; homodímeros y heterodímeros de cadenas pesadas de anticuerpo y/o cadenas ligeras, fragmentos de unión a antígeno de cualquiera de lo anterior (por ejemplo, un fragmento Fv (por ejemplo, Fv (scFv) de cadena única, Fv unido a disulfuro), un fragmento Fab, un fragmento Fab' , un fragmento F(ab')2), un dominio variable único (por ejemplo, VH, VL, VHH) , un dAb, y versiones modificadas de cualquiera de lo anterior (por ejemplo, modificados por la unión covalente de glicol de polialquileno (por ejemplo, glicol de polietileno, glicol de polipropileno, glicol de polibutileno) u otro pol ímero adecuado). Ver, PCT/GB03/002804, presentada el 30 de Junio de 2003, que designa los Estados Unidos; (WO 2004/081026) considerando PEGilados de dominios variables únicos y dAbs, métodos adecuados para preparar los mismos, incrementa la vida media in vivo de los dominios variables únicos PEGilados y monómeros dAB y multímeros. La enseñanza completa de PCT/GB03/002804 (WO 2004/081026), incluyendo las porciones referidas arriba, se incorpora en la presente para referencia. El ligando puede formatearse como un dímero, trímero o pol ímero de monómeros de dAb deseados, por ejemplo utilizando un enlazador adecuado como (Gly4S er)n, donde n = de 1 a 8, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 o 7. Si se desea, ligandos, incluyendo monómeros de dAb, dímeros y trímeros, pueden unirse a un anticuerpo región Fe, comprendiendo uno o ambos dominios CH2 y CH3, y opcionalmente una región de andamio. Por ejemplo, los vectores que codifican ligandos unidos como una secuencia de nucleótido única a una región Fe pueden utilizarse para preparar tales polipéptidos.

Los ligandos y monómeros de dAB también pueden combi narse y/o formatearse en estructuras de múltiples ligandos de no anticuerpo para formar complejos multivalentes, que unen moléculas objetivo con el mismo antígeno, proporcionando de tal modo avidez superior. Por ejemplo, los receptores bacterianos naturales tales como SpA pueden utilizarse como andamios para el injerto de CDRs para generar ligandos que se unen específicamente a uno o más epítopos. Los detalles de este procedimiento se describen en EE. UU. 5,831 ,012. Otros andamios adecuados incluyen aquellos basados en fibronecti na y afficuerpos. Los detalles de los procedimientos adecuados se describen en WO 98/58965. Otros andamios adecuados incluyen lipocalina y CTLA4, según se describe en van den Beuken ef al. , J. Mol. Biol. 310:591 -601 (2001 ), y los andamios tales como aquellos descritos en WO 00/69907 (Medical Research Council), los cuales se basan por ejemplo en la estructura de anillo de GroE L bacteriano u otros polipéptidos de chaperona. Los andamios de proteína pueden combinarse; por ejemplo, CDRs pueden injertarse sobre un andamio de CTLA4 y utilizarse junto con dominios de inmunoglobulina VH o VL para formar un ligando. Del mismo modo, fi bronecti na, lipocalina y otros andamios pueden combinarse. Una variedad de métodos adecuados para preparar cualquier formato deseado se conocen en la materia. Por ejemplo, las cadenas de anticuerpo y formatos (por ejemplo, formatos tipo IgG, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos de cadena única, anticuerpos biespecíficos, cadenas pesadas de anticuerpo, cadenas ligeras de anticuerpo, homodímeros y heterodímeros de cadenas pesadas de anticuerpo y/o cadenas ligeras) pueden prepararse por expresión de construcción de expresión adecuada y/o cultivo de cél ulas adecuadas (por ejemplo, hibridomas, heterohibridomas, cél ulas huésped recombinante que contienen construcciones recombinantes que codifican el formato). Además, los formatos tales como fragmentos de unión de antígeno de anticuerpos o cadenas de anticuerpo (por ejemplo, un fragmento Fv (por ejemplo, cadena única Fv (scFv), un Fv unido de disulfuro), un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2), pueden prepararse por expresión de construcciones de expresión adecuadas o por digestión enzimática de anticuerpos, por ejemplo, utilizando papaína o pepsina. El ligando puede formatearse como un ligando específico dual o un ligando multi-específico, por ejemplo, según se describe en WO 03/002609, las enseñanzas completas de las cuales se incorporan en la presente para referencia. Los ligandos específicos duales comprenden dominios variables únicos de inmunoglobulina que tienen especificidades de unión diferentes. Tales ligandos específicos duales pueden comprender combinaciones de dominios de cadena ligera y pesada. Por ejemplo, el ligando específico dual puede comprender un dominio VH y un dominio VL, los cuales pueden unirse juntos en la forma de un scFv (por ejemplo, utilizando un enlazador adecuado tal como Gly4Ser), o formatearse en un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión de antígeno del mismo (por ejemplo, fragmento F(ab')2). Los ligandos específicos duales no comprenden pares VH/VL complementarios que forman un sitio de unión por antígeno de anticuerpo de dos cadenas convencional que une el antígeno o epítopo cooperativamente. A su vez, los ligandos de formato dual comprenden un par complementario Vj/VL, en donde los dominios V tienen especificidades de unión diferentes. Además, los ligandos específicos duales pueden comprender uno o más dominios CH o CL deseados. Un dominio de región de andamio también puede incluirse si se desea. Tales combinaciones de dominios pueden, por ejemplo, imitar anticuerpos naturales, tales como IgG o IgM , o fragmentos del mismo, tales como moléculas Fv, scFv, Fab o F(ab')2. Otras estructuras, tal como un brazo único de una molécula IgG que comprende dominios VH, VL, CHI y CL, se contemplan. Preferentemente, el ligando específico dual de la invención comprende solamente dos dominios variables a pesar de que varios de tales ligandos pueden incorporarse juntos en la misma proteína, por ejemplo, dos de tales ligandos pueden incorporarse en un IgG o una inmunoglobulina multimérica, tal como IgM . Alternativamente, en otra modalidad una pluralidad de ligandos específicos duales se combinan para formar un multímero. Por ejemplo, dos diferentes ligandos específicos duales se combinan para crear una molécula tetra-específica. Se apreciará por u n experto en la materia que las regiones variables pesadas y ligeras de un ligando específico dual producido de acuerdo al método de la presente i nvención puede ser sobre la misma cadena de poli péptido, o alternativamente, en diferentes cadenas de poli péptido. En el caso de que las regiones variabl es se encuentren sobre diferentes cadenas de poli péptido, entonces pueden unirse por medio de un enlazador, generalmente un enlazador flexi ble (tal como una cadena de poli péptido) , un grupo enlazador químico, o cualquier otro método conocido en la materia. El ligando multiespecífico posee más de una especifici dad de unión por epítopo. General mente, el ligando multiespecífico comprende dos o más dominios de unión por epítopo, tales dAbs o domi nio de proteína de no anticuerpo comprendiendo un sitio de unión para un epitopo, por ejemplo, un afficuerpo, un dominio SpA, un domi ni o clase A de receptor LDL, un domi nio EGF , un avímero. Los li gandos multiespecíficos pueden formatearse además según se descri be en la presente. En algunas modalidades, el ligando es un formato ti po I gG .

Tal es formatos tienen la estructura de cuatro cadenas convenci onal de una molécula I gG (2 cadenas pesadas y dos cadenas ligeras), en las cuales una o más de las regiones vari ables (VH y o V ) se han reemplazado con un dAb o domi nio vari able único de una especificidad deseada. Preferentemente, cada una de las regiones variables (2 regiones VH y 2 regiones V ) se reemplaza con un dAb o dominio variable único. Los dAb(s) o dominio (s) variable (s) único (s) que se incluyen en un formato tipo IgG pueden tener la misma especificidad o diferentes especificidades. En algunas modalidades, el formato tipo IgG es tetravalente y puede tener uno, dos, tres o cuatro especificidades. Por ejemplo, el formato tipo IgG puede ser monoespecífico y comprende 4 dAbs que tienen la misma especificidad; biespecíficos y comprende 3 dAbs que tienen la misma especificidad y otro dAb que tiene una diferente especificidad; biespecífico y comprende dos dAbs que tienen la misma especificidad y dos dAbs que tienen la misma especificidad un tercer dAbs con una diferente especificidad y un cuarto dAb con una diferente especificidad de los dAbs primero, segundo y tercero; o tetraespecífico y comprende cuatro dAbs que cada uno tienen una diferente especificidad. Los fragmentos de unión por antígeno de los formatos tipo IgG (por ejemplo, Fab, F(ab')2, Fab' , Fv, scFv) puede prepararse. Preferentemente, los formatos tipo I gG o fragmentos de unión por antígeno del mismo no degradan TNFR 1 .

Formatos Extendidos de Vida Media Los ligandos pueden formatearse para extender in vivo l a vida media de suero. La vida medio in vivo aumentada es útil en aplicaciones in vivo de inmunoglobulinas, especialmente anticuerpos y más especialmente fragmentos de anticuerpo de pequeño tamaño tal como dAbs. Tales fragmentos ( Fvs, Fvs uni do por disulfuro, Fabs, scFvs, dAbs) se aclaran rápidamente del cuerpo, los cuales pueden li mitar severamente las aplicaciones clínicas . Un ligando (por ejemplo, un monómero dAb) puede formatearse para tener un tamaño hidrodi námico más grande, por ejemplo, por unión de un grupo de polialquilénglicol (por ejemplo, grupo polietilénglicol (PEG), grupo polipropilénglicol) , al búmi na de suero, transferi na, receptor de transferina o al menos la parte de unión de transferina del mismo, una región Fe de anticuerpo, o por conjugación a un dominio de anticuerpo. En algunas modalidades , el ligando es PEGilado. Preferentemente, el ligando PEGilado une un compuesto objetivo endógeno con sustancialmente la misma afi nidad como el mismo ligando que no es PEGilado. Por ejemplo, el ligando puede ser un monómero dAb PEGilado que une un compuesto objetivo endógeno, en donde el monómero dAb PEGi lado une dicho compuesto objetivo endógeno con una afi nidad que difiere de la afi nidad de dAb en forma no PEGilada por no más de un factor de aproximadamente 1000, preferentemente no más de un factor de aproximadamente 100, más preferentemente no más de un factor de aproxi madamente 1 0, o con afi ni dad sustanci almente afinidad sin cambiar en relación a una forma no PEGilada. Los ligandos pequeños, tal como monómero dAb, pueden formatearse como un fragmento de unión por antígeno más grande de un anticuerpo o como un anticuerpo (por ejemplo, formatearse como un Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, IgG, scFv). El tamaño hidrodinámico de un antagonista (por ejemplo, ligando, monómero dAb) y su vida media de suero puede también aumentarse al conjugar o unir el antagonista a un dominio de unión (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que une un antígeno o epítopo que aumenta la vida media in vivo, según se describe en la presente. Por ejemplo, el ligando (por ejemplo, monómero dAb) puede conjugarse o unirse a una albúmina de anti-suero o receptor Fe anti-neonatal dAb, Fab, Fab' o scFv, o a un aficuerpo de anti-SA o affiicuerpo de receptor Fe anti-neonatal . El tamaño hidrodinámico de los ligandos (por ejemplo, monómeros dAb y multímeros) de la invención puede determinarse utilizando métodos que se conocen bien en la materia. Por ejemplo, la cromatografía de filtración de gel puede utilizarse para determinar el tamaño hidrodinámico de un ligando. Las matrices de filtración de gel adecuadas para determinar los tamaños hidrodinámicos de ligandos, tal como aglomerantes de agarosa degradada, se conocen bien y fácilmente disponibles. El tamaño de un formato de ligando (por ejemplo, el tamaño de una porción PEG unida a una porción de unidad que tiene un sitio de unión por un compuesto objetivo endógeno, puede variarse dependiendo de la aplicación deseada. Por ejemplo, en donde el ligando se pretende que deje la circulación y entre en tejidos periféricos, es deseable mantener el tamaño hidrodinámico del ligando bajo para facilitar la extravasación de la corriente de sangre. Alternativamente, en donde se desea tener el ligando restante en la circulación sistémica por un período más largo de tiempo el tamaño de ligando puede aumentarse, por ejemplo, al formatear una proteína tipo Ig o por adición de una porción PEG de 30 a 60 kDa. Los ejemplos de albúmina adecuada, fragmentos de albúmina o variantes de albúmina para utilizarse en ligando de acuerdo a la invención se describen en WO 2005/077042A2, la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad.

En particular, la siguiente albúmina, fragmentos de albúmina o variantes de albúmina pueden utilizarse en la presente invención: SEQ ID NO: 1 (como se describe en WO 2005/077042A2, esta secuencia incorporándose explícitamente en la presente descripción para referencia); fragmento de albúmina o variante comprendiendo o consistiendo de aminoácidos 1-387 de SEQ ID NO:1 en WO 2005/077042A2; • albúmina, o fragmento o variante de la misma, comprendiendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistiendo de: (a) aminoácidos 54 a 61 de SEQ ID NO: 1 en WO 2005/077042A2; (b) aminoácidos 76 a 89 de SEQ ID NO: 1 en WO 2005/077042A2; (c) aminoácidos 92 a 100 de SEQ ID NO:1 en WO 2005/077042A2; (d) aminoácidos 170 a 176 de SEQ ID NO:1 en WO 2005/077042A2; (e) aminoácidos 247 a 252 de SEQ ID NO:1 en WO 2005/077042A2; (f) aminoácidos 266 a 277 de SEQ ID NO:1 en WO 2005/077042A2; (g) aminoácidos 280 a 288 de SEQ ID NO: 1 en WO 2005/077042A2; (h) aminoácidos 362 a 368 de SEQ ID NO:1 en WO 2005/077042A2; (i) aminoácidos 439 a 447 de SEQ ID NO:1 en WO 2005/077042A2 (j) aminoácidos 462 a 475 de SEQ ID NO:1 en WO 2005/077042A2; (k) aminoácidos 478 a 486 de SEQ ID NO:1 en WO 2005/077042A2; y (1) aminoácidos 560 a 566 de SEQ ID NO: 1 en WO2005/077042A2. Los ejemplos adicionales de albúmina adecuada, fragmentos y análogos para utilizarse en un ligando de acuerdo a la invención se describen en WO 03/076567A2, el cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. En particular, la siguiente albúmina, fragmentos o variantes pueden utilizarse en la presente invención. albúmina de suero humana según se describe en WO 03/076567 A2, por ejemplo, en la figura 3 (esta información de secuencia incorporándose explícitamente en la presente descripción para referencia); • albúmina de suero humano (HA) consistiendo de una cadena de polipéptido no glicosilado único de 585 aminoácidos con un peso molecular de fórmula de 66,500 (Véase, Meloun, et al, FEBS Letters 58:136 (1975); Behrens, et al, Fed. Proc. 34:591 (1975); Lawn, et al., Nucleic Acids Research 9:6102-6114 (1981); Minghetti, er al., J. Biol. Chem.261:61 Al (1986)); Una variante polimórfica o análogo o fragmento de albúmina según se describe en Weitkamp, et al, Ann. Hum. Genet. 37:219 ( 1973); Un fragmento de albúmina o variante según se describ en EP 322094, por ejemplo, HA(l-373. , HA(l-388), HA(l-389), HA(I-369) , y HA( 1 -419) y fragmentos entre 1 -369 y 1 -419; Un fragmento de albúmina o variante según se describe en EP 399666, eg, HA( 1 -177) y HA(I -200) y fragmentos entre HA(I-X), donde X es cualquier número de 178 a 199. En donde una porción que extiende la vida media (una o más) (por ejemplo, albúmina, transferina y fragmentos y análogos del mismo) se utiliza en el ligando de la invención, puede conjugarse utilizando cualquier método adecuado, tal como, por fusión directa a la porción de unión que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno, por ejemplo, al utilizar una construcción de nucleótido único que codifica una proteína de fusión, en donde la proteína de fusión se codifica como una cadena de polipéptido único con la porción que extiende la vida media ubicada N- o C- terminalmente a la porción de unión TNFR1 . Alternativamente, la conjugación puede lograrse al utilizar un enlazador de péptido entre las porciones, por ejemplo, un enlazador de péptido según se describe en WO 03/076567A2 o WO 2004/003019(estas descripciones del enlazador incorporándose para referencia en la presente descripción para proporcionar ejemplos para utilizarse en la presente invención) .

Típicamente, un polipéptido que mejora la vida media de suero in vivo es un polipéptido que se presenta naturalmente in vivo y que resiste la degradación o remoción por mecanismos endógenos que remueven el material no deseado del organismo (por ejemplo, humano). Por ejemplo, un polipéptido que mejora la vida media de suero in vivo puede seleccionarse de proteínas del aglomerante extracelular, proteínas encontradas en la sangre, proteínas encontradas en la barrera cerebral de sangre o en tejido neural , proteínas ubicadas hacia el riñon, hígado, pulmón , corazón, piel o hueso, proteínas de tensión, proteínas específicas de enfermedad, o proteínas incluidas en transporte Fe. Los polipéptidos adecuados que mejoran la vida media de suero in vivo incluyen, por ejemplo, proteínas de fusión de agente neurofarmacéutico de ligando específico de receptor transferina (véase Patente de EE. UU No. 5,977,307, las enseñanzas de las cuales se incorporan en la presente para referencia), receptor de célula endotelial capilar cerebral, transferina, receptor de transferían (por ejemplo, receptor de transferina soluble), insulina, receptor de factor de crecimiento 1 tipo insulina (IGF 1 ), receptor de factor de crecimiento 2 tipo insulina (IGF2), receptor de insulina, factor de coagulación de sangre X, 1 -antitripsina y HNF 1 a. Los polipéptidos adecuados que mejoran la vida media de suero también incluyen glicoproteína alfa 1 (orosomucoide; AAG), antiquimotripsina alfa 1 (ACT), microglobulina alfa 1 (proteína HC; AI M), antitrombina I I I (AT I I I), apolipoproteína A-1 (Apo A-1 ), apolipoproteína B (Apo B), ceruloplasmína (Cp), componente C3 complemento (C3), componente C4 complemento (C4), inhi bidor de esterasa C1 (C1 NHC), proteína de reactivo C (CRP), ferritina (FER) , hemopexina (HPX), lipoproteína (a) (Lp(a)), proteína de unión mannosa (M BP), mioglobina (Myo), prealbumina (transtiretina; PAL), proteína de unión de retinol (RBP) , y factor reumatoide (RF). Las proteínas adecuadas del aglomerante extracelular incluyen, por ejemplo, colágenos, lamininas, integrinas y fibronectina. Los colágenos son las proteínas principales del aglomerante extracelular. Aproximadamente 15 tipos de moléculas de colágeno se conocen actualmente, encontradas en diferentes partes del cuerpo, por ejemplo, colágeno tipo I (contando para 90% de colágeno de cuerpo) encontrado en huesos, piel, tendón, ligamentos, cornea, órganos internos o colágeno tipo I I encontrado en cartílago, disco vertebral, notocordia, y humor vitreo del ojo. Las proteínas adecuadas de la sangre incluyen, por ejemplo, proteínas de plasma (por ejemplo, fibrina, macroglobulina -2, albúmina de suero, fibrinógeno (por ejemplo, fibrinógeno A, fibrinógeno B), proteína A de amiloide de suero, haptoglobina, profilina, ubiquitina, uteroglobulina y ß-2-microglobulina), enzimas e i nhhibidores de enzima (por ejemplo, plasminogen, lisozima, cistatin aC, antitripsina alfa 1 e inhibidor de tripsina pancreática), proteínas del sistema inmune, tal como proteínas de inmunoglobulina (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM , cadenas ligeras de inmunoglobulina (kappa/lambda)), proteínas de transporte (por ejemplo, proteína de unión de retinol, microglobulina -1), defensinas (por ejepmlo, beta-defensina 1, defensina 1 neutrófilo, defensina 2 neutrófilo y defensina 3 neutrófilo) y lo similar. Las proteínas adecuadas encontradas en la barrera cerebral de sangre o en el tejido neural incluyen, por ejemplo, receptor de melanocortina, mielina, transportador de ascorbato, y lo similar. Los polipéptidos adecuados que mejoran la vida medida de suero in vivo también incluyen las proteínas localizadas en el riñon (por ejemplo, policistina, colágeno tipo IV, transportador de anión orgánico K1, antígeno de Heymann), proteínas ubicadas en el hígado (por ejemplo, dehidrogenasa de alcohol, G250), proteínas ubicadas en el pulmón (por ejemplo, componente secretador, que une IgA), proteínas ubicadas en el corazón (por ejemplo, HSP 27, el cual se asocia con cardiomiopatía dilatada), proteínas ubicadas a la piel (por ejemplo, queratina), proteínas específicos de hueso tales como proteínas morfogénicas (BMPs), las cuales son un subgrupo de la supefamilia de proteínas de factor de crecimiento ß en transformación que demuestran actividad osteogénica (por ejemplo, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8), proteínas específicas de tumor (por ejemplo, antígeno de trofoblasto, receptor de herceptina, receptor de oestrogen, catepsinas (por ejemplo, catepsina B, que pueden encontrarse en hígado y bazo)). Las proteínas específicas de enfermedad adecuadas incluyen, por ejemplo, antígenos expresados solamente en células T activadas, incluyendo LAG-3 (gen de activación de linfocito) , ligando de osteoprotegerina (OPGL; ver Nature 402, 304-309 (1999)), OX40 (un miembro de la familiad e receptor TNF, expresado en células T activadas y específicamente reguladas en células productoras (HTLV-1 ) tipo I del virus de leucemia T humano; véase Immunol. 165( 1 ):263-270 (2000)). Las proteínas específicas de enfermedad adecuadas también incluyen, por ejemplo, metaloproteasas (asociadas con artritis/cánceres) incl uyendo CG6512 Drosophila, paraplegina humana, FtsH humana, AFG3L2 humano, ftsH murino; y factores de crecimiento antiogénicos, incluyendo factor de crecimiento de fibroblasto acídico (FGF-1 ), factor de crecimiento de fibroblasto básico (FGF-2), factor de crecimiento endotelial vascular/factor de permeabilidad vascular (VEGF/VPF), factor a de crecimiento en transformación (TGF a), factor alfa de necrosis tumoral (TNF-a) , angiogenina, interleuquina-3 (IL-3), interleuquina-8 (I L-8), factor de crecimiento endotelial derivado de plaquetas (PD-ECGF), factor de crecimiento placental (P1 GF), factor de crecimiento BB derivado de plaquetas midkine (PDGF), y fractalquina. Los polipéptidos adecuados que mejoran la vida media de suero in vivo también incluyen proteínas de tensión tales como proteínas de choque térmico (HSPs). HSPs se encuentran normalmente en forma intracelular. Cuando se encuentren extracelularmente, es un indicador que una célula ha muerto y derramado sus contenidos. La muerte celular no programada (necrosis) se presenta cuando como un resultado de trauma, enfermedad o lesión, HSPs extracelular activan una respuetsa del sistema inmune. La unión a HSP extracelular puede dar como resultado la localización de las composiciones de la invención a un sitio de enfermedad. Las proteínas adecuadas incluidas en el transporte Fe incluyen, por ejemplo, receptor Brambell (también conocido como FcRB). Este receptor Fe tiene dos funciones, ambos de los cuales son potencialmente útiles para el suministro. Las funciones son ( 1 ) el transporte de IgG de madre a niña a través de la protección de placenta (2) de IgG de la degradación prolongado de tal modo su vida media de suero. Se considera que los reciclos de receptor IgG de endosomas. (Ver, Holliger et al, Nat Biotechnol 15(7):632-6 ( 1 997) . ) Los métodos para análisis farmacocinético y determinación de la vida media de ligando será familiar a aquellos expertos en la materia. Los detalles pueden encontrarse en Kenneth, A et al: Chemical Stability de Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996). También se hace referencia a "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, publicada por M arcel Dekker, 2nd Rev. ex edition (1982), la cual describe parámetros farmacocinéticos tales como vidas media de alfa t y beta t y área bajo la curva (AUC) .

Ensayos para Valorar La Función de Compuesto Objetivo Endógeno Los siguientes ensayos, las variaciones adecuadas de los mismos y otros ensayos adecuados pueden utilizarse para valorar la actividad de compuestos objetivo endógenos, y valorar el si un ligando sustancialmente inhibe la actividad de un compuesto objetivo endógeno al cual se une. La función ABC-1 puede ensayarse al medir el flujo de lípido mediado por polipoproteína de células cultivadas (J Clin I nvest 1999Oct; 104(8): R25-31 ). La función de quimera exotoxina de pseudonomas aFGF1 puede ensayarse in vitro utilizando un ensayo de citotoxicidad (Proc Nati Acad Sci USA 1989 Jun; 86( 1 1 ) : 4215-4219). Una actividad de inhibina A puede ensayarse in vitro al medir su actividad inductora por diferenciación hacia las células de eritroleucemia Amigo de ratón (M EL) y células K-562 humanas (Proc Nati Acad Sci USA 1988 Apr; 85(8): 2434-2438) ; o su supresió de la secreción de hormona estimuladora de folículo pituitario (Biol Reprod 2000 Sep; 63(3): 865-871 ). La actividad de inhi bi na beta C pueden ensayarse in vitro al medir su actividad inductora de diferenciación hacia las células (M EL) de eritroleucemia Amigo de ratón y células K-562 humanas (Proc Nati Acad Sci USA 1988 Apr; 85(8): 2434-2438); o su supresión de la secreción de hormona estimuladora de folículo pituitario (Biol Reprod 2000 Sep; 63(3): 865-871 ). La actividad de deaminasa de adenosina puede ensayarse in vitro al medir el catabolismo de purina (Mol Cell Biol 1985 Apr; 5(4): 762-767). La función de adiposina puede ensayarse in vitro al medir la acumulación de cAM P en células de melanoma de ratón estimuladas por adiposina (Hum Mol Genet 1995 Feb; 4(2): 223-230). La función ASP puede ensayarse in vitro al medir la inhibición de acumulación de cAM P estimulada por alfa-MSH en células de melanoma de ratón (Hum Mol Genet 1995 Feb, 4(2): 223-230). La mielina puede ensayarse in vitro por medición de su fosforilación por quinasa MAP (J Neurochem 1999 Sep; 73(3): 1090-1097); o su efecto en transmisión sináptica entre neuronas (Eur Neurol. 1988; 28(2): 57-63). La proteína básica de mielina puede ensayarse in vitro por medición de su fosforilación por qui nasa MAP (J Neurochem 1999 Sep; 73(3): 1090-1097); o su efecto en transmisión sináptica entre las neuronas (Eur Neurol . 1988; 28(2): 57-63). La función de colágeno puede medirse utilizando un ensayo de estabilidad de fibrilo de colágeno (Cell Mol Life Sci 2000 May; 57(5): 859-863); o un ensayo de adhesión celular in vitro (J Cell Biochem Oct. 1 , 1997; 67( 1 ): 75-83). La gl ucosidasa alfa puede ensayarse por hidrólisis de p-Nitrofenil a-d-glucósido de sustrato artificial cromogénico. Bergmeyer, H . U. (ed) Methods de Enzymatic Analysis, Second English Edition, 1 , 459 ( 1974). Alfa-galactosidasa puede ensayarse por hidrólisis de p-Nitrofenil a-D-galactosidasa de sustrato artificial cromogénico a p-Nitrofenil y D-galactosa-Rietra et al., ( 1975) "Properties of the residual alpha-galactosidase activity in the tissues of a Fabry hemizygote" . Clin Chim Acta; 62(3): 401 -13. Alfa-L iduronidasa puede ensayarse por hidrólisis del sustrato 4-metilumbeliferil alfa-L-iduronido se sigue en un ensayo fluorométrico (Hopwood er al. ( 1979), Clin Chim Acta. ; 92: 257-65); otros ensayos se encuentran en Thompson (1978) "Substratos for the assay of alpha-L-iduronidase" . Clin Chim Acta; 89(3): 435-46. La actividad de angiopoyetina 1 puede ensayarse in vitro utilizando un ensayo de brote capilar (Curr Biol Apr. 23, 1998; 8(9) : 529-532). La actividad de Angiopoeitin 2 puede ensayarse in vitro utilizando un ensayo de brote celular (Curr Biol Apr. 23, 1998; 8(9): 529-532). La angiostatina puede ensayarse en un ensayo de proliferación endotelial (Kringle domains of Human Angiostatin. Cao er al ( 1996) J. Biol . Chem. 271 29461 -29467. La actividad de ADM P puede ensayarse in vitro al medi r su habilidad para regular los factores dorsalizantes noggin, goosecoid o follistati n. (Development 1995 Dec; 121 (12): 4293-4301 ). TRAI L puede ensayarse en un ensayo de apoptosis (TRAI L- R2: a novel apoptosis-mediating receptor for TRAI L, Walczak et al. ( 1996) EM BOJ 16: 5386-5397). La función de arresten puede ensayarse in vitro al medir su habilidad para inhibir la proliferación celular endotelial, migración, formación de tubo, y neovascularización de Matrigel (Cáncer Res May 1 , 2000;60(9): 2520-6). La actividad de arilsulfatasa B puede ensayarse por la medición in vitro de hidrólisis de sulfatos de N-Acetil-D-galactosamina (J Biol Chem Feb. 25, 1990; 265(6): 3374-3381 ). La actividad de asparaginasa puede ensayarse in vitro utilizando un ensayo enzimático de asparaginasa (Anal Biochem Apr. 10, 2000;280(l): 42-45) . La actividad de rBPI puede ensayarse in vitro utilizando un ensayo antibacteriano (J Biol Chem Nov. 5, 1987; 262(31 ): 14891 - 14894). BDNF puede ensayarse en un crecimiento neuronal y ensayo de actividad sináptica (BDNF mejora el crecimiento neural y actividad sináptica en cultivos de célula hipocampal . Bartrupef al ( 1997) Neuroreport 1 ; 8( 17): 3791 -4 Daniels L B, Glew R H, Radi n N S, Vunnam R R). B-glucocerebrosidase puede ensayarse utilizando un ensayo fluorométrico para la enfermedad Gaucher utilizando conduritol-beta-epóxido con hígado como la fuente de Beta-glucosidasa (Clin Chim Acta. Sep. 25, 1980; 106(2): 155-63; Johnson W G, Gal A E , Miranda A F, Pentchev P G . El diagnóstico de enfermedad Gaucher adulta: uso de un nuevo sustrato cromogénico, 2-hexadecanoilamino-4-nitrofenil-beta-D-gl ucopiranoside, en fibroblastos de piel cultivados. Clin Chim Acta. Mar. 14, 1980, 102(1): 91 -7) . BM P-2 puede ensayarse según se describe por Wang, E.A et al. Recombinant humanbone morphogenetic proteína induce boneformation. Proc. NatAcad. Sci . 87: 2220-2224, 1990. La función BT-SD puede ensayarse in vitro al utilizar un ensayo de dismutasa superóxido (Nucleic Acids Res Mar. 25, 1985; 13(6): 2017-34). La actividad de BRCAI puede ensayarse al medir alteraciones en expresión de p21 WAFI/CI PI (Oncogene Jun. 1 1 , 1998; 16(23): 3069-82). La actividad de BRCA2 puede ensayarse al medir alteraciones en expresión de p21 WAF1 /CI P 1 (Oncogene Jun. 1 1 , 1998; 16(23): 3069-82). La actividad vasodilatador de CGRP puede ensayarse utilizando el ensayo de vasodilatación de anillo aórtico descrito en Pharmacol Res. 1999 Mar; 39(3): 217-20; las actividades de proliferación de célula endotelial y osteoblasto in vitro (Eur J Pharmacol . Dec. 15, 2000; 409(3): 273-8; Proc Nati Acad Sci U.S . A. 1990 May; 87(9): 3299-303). La actividad de calreticulin puede medirse in vitro utilizando ensayos de representación por imágenes de calcio (Cell . Sep. 8, 1995; 82(5): 765-71 ) . La función CD4 puede ensayarse in vitro al medir la unión gpl20 (Viral Immunol 2000; 13(4): 547-554); o tomocitoquinas de respuestas de monocito siguiendo la unión de gp120 (J I mmunol Oct. 15, 1998; 161 (8): 4309-4317). El ligando CD40 puede ensayarse según se describe por Hollenbaugh D, et al. , El antígeno de célula T humana gp39, un miembro de la familia de gen TNF, es un ligando para el receptor CD40: expresión de una forma soluble de gp39 con actividad co-estimuladora de célula B. EM BO J. 1992 Dec; 1 1 ( 12): 4313-21. Las proteínas de unión de quimioquina pueden ensayarse utilizando ensayos de unión de receptor (J Biol Chem May 9, 1997; 272(19): 12495-12504). CNTF puede ensayarse in vitro utilizando ensayos de supervivencia y proliferación neuronal (EM BO J. Apr. 2, 2001 ; 20(7) 1692-1703) . La actividad de contortrostatin puede medirse in vitro al medir la unión a integrinas alfavbeta 3 y nalfabvbetad, inhibición de agregación plaqueta ofn, e inhibición de adhesión de célula cancerígena a fibronectina y vitronectina (Arch Biochem Biophys Mar. 15, 2000; 375(2): 278-288) . La actividad de proteína de unión CRF puede medirse utilizando un ensayo de unión CRF (Peptides Jan. 22, 2001 ; 22( 1 ): 47-56). La actividad de CTLA4 actividad puede medirse utilizando un ensayo de activación de célula T (J I mmunol Mar. 1 , 2001 ; 166(5): 3143-3150). La función de Decorin puede medirse utilizando un ensayo de estabilidad de fibrilo colágeno in vitro (Cell Mol Life Sci 2000 May;57(5): 859-863); o un ensayo de adhesión celular in vitro (J Cell Biochem Oct. 1 , 1997;67( 1 ): 75-83). La función de Del-I puede ensayarse in vitro utilizando un ensayo de adhesión de integrina alfavbeta3. (Genes Dev Jan. 1 , 1998; 12( 1 ): 21 -33). La Desmoteplasa puede ensayarse según se describe por Wallen, P. , Biochemistry de plasminogen. ln: Kline D. L. , Reddy, K. N. N . , eds . Fibrinolysis. Boca Ratón, FL: CRC Press, 1980: 1 -25; Saksela, O. , Rifki n, D. B. , Cell-associated plasminogen activation: Regulation and physiological functions.Annu Rev Cell Biol 1988; 4: 93-126; Womack C J , Ivey F M , Gardner A W, Macko R F, Fibrinolytic response to acute exercise in patients with peripheral arterial disease. Med Sci Sports Exerc 2001 Feb; 33(2): 214-9. La actividad de Dnasa puede medirse utilizando el ensayo de degradación de ADN en J Biochem (Tokyo). 1982 Oct; 92(4): 1297-303. La actividad de Ectoapirasa puede ensayarse in vitro utilizando un ensayo de ectoapirasa (J Biol Chem Sep. 18, 1998; 273(38): 24814-24821 ). EGF puede ensayarse utilizando un ensayo de crecimiento celular (J Biol Chem Mar. 31, 1995; 270(13): 7495-500). La actividad de EMAP II puede ensayarse ín vitro utilizando un ensayo de brote celular (Curr Biol Apr. 23, 1998; 8(9): 529-532). FGF-I puede ensayarse utilizando un ensayo de proliferación celular: Cell, vol.50, no.5, pp.729-737 (Aug. 1987). Proc Nati Acad Sci U.S. A, vol.86, no.3, pp.802-806 (1989). FGF-2 puede ensayarse utilizando un ensayo de proliferación utilizando células NR6R-3T3 (Rizzino 1988 Cáncer Res. 48: 4266). La actividad de Fibrolase puede ensayarse in vitro utilizando un ensayo fibrinolítico. (Thromb Res May 15, 1994; 74(4): 355-367). FLT3 puede ensayarse en un ensayo de proliferación utilizando una estirpe de célula pro B transformada Flt-3 (Hannum 1994 Nature 368: 643). La actividad de Follitropina puede ensayarse in vitro al medir la producción de cAMP en células que expresan el receptor FSH (J Reprod Immunol 2001 Jan; 49(1): 1-19). La actividad de GDNF puede ensayarse in vitro al medir aumentos en la fosforilación de tirosina Ret en respuesta al tratamiento GDNF (Mol Cell Biol Mar. 15, 1995; (3): 1613-1619). La actividad de Gelsolin puede ensayarse in vitro al medir proteolisis de actina (Nature 1987 Jan 22-28; 325(6102): 362-364). La actividad de GGF2 puede ensayarse in vitro al medir la activación de quinasas de tirosina de receptor ERBB en células rabdomiosarcoma humana (Int J Cáncer Jul. 1, 2000;87(l): 29-36). La actividad glucogénica de Glucagon se media por un receptor de glucagones de alta afinidad. La actividad biológica de glucagon recombinante puede valorarse por ensayos de unión directa (Science Mar. 12, 1993; 259(5101 ): 1614-6). La actividad de HBNF puede ensayarse in vitro utilizando un ensayo de sobre creimiento de neuritas. (J Biol Chem Oct. 27, 1995; 270(43): 25992-25999). La unión de receptor hCG y la activación puede medirse para valorar la actividad biológica de hCG recombinante (J Biol Chem Oct. 5, 1993; 268(28): 20851 -4). Las proteínas de choque térmico pueden ensayarse por la administración de complejos de péptido HSP en dos modelos de carcinoma inducida por UV en ratones (US 5,837,251 ). Interleuquina 1 puede ensayarse al 1 ) unirse a receptores IL-I receptores en YT-NCI o células C3H/HeJ (Cárter et al. , Nature 344: 633-638, 1990) ; 2) inducción de adhesión de leucocito de célula endotelial (Cárter et al. , Nature 344: 633-638, 1990); 3) ensayos de proliferació en cél ulas A375-C6 (Murai T et al. , J. Biol. Chem. 276: 6797-6806, 2001 ); proliferación D10S: Orencole & Dinarello (1989) Cytokine 1 , 14-20. I L-Ira puede ensayarse por 1 ) competencia para la unión de I L-1 a receptores IL-I en YT-NCI o células C3H/HeJ (Cárter ef al. , Nature 344: 633-638, 1990); 2) inhibición de adhesión de leucocito de célula endotelial inducida por I L-1 (Cárter ef al. , Nature 344: 633-638, 1990); 3) ensayos de proliferación en células A375-C6, una estirpe de célula de melanoma humano susceptible a la acción antiproliferativa de IL-I (Murai T et al. , J. Biol. Chem. 276: 6797-6806, 2001 ). I L-10 puede ensayarse por 1 ) unión de I L- 10 a células NK (carson WE et al. , Blood 85: 3577-3585, 1995); 2) inbhición de la producción TNF-alfa por macrófagos (Riley J K eí al. , J . Biol. Chem. 274: 16513-16521 , 1999); 3) inhibición deproliferación de macrófago (O'Farrell A- M et al. , EM BO 17: 1006- 1018, 1998); MC-9 proliferation: Thompson- Sni pes er al ( 1991 ) J . Exp. Med. 173, 507-510 I L-1 1 puede ensayarse en ensayo de proliferación de célula hematopoyética. «lnterleukin-1 1 enhances humano megakaryocytopoiesis in vitro." Blood. Jan. 15, 1992; 79(2): 327-31 . "Synergistic effects of stem cell factor and interleukin 6 or interleukin 1 1 on the expansión of murine hematopoietic progenitors in liquid suspensión culture." Stem Cells. 1995 Jul ; 13(4): 404-13; B9-11 proliferation: Lu et al (1994) J immunol . Methods 173, 19. I L-12 puede ensayarse en un ensayo de citotoxicidad de célula asesina natural (NK) y ensayo de liberación de interferona-gamma (IFN- gamma). "Requirement for type 2 NO synthase for IL-12 signaling in innate immunity". Science 284: 951 -955, 1999; KIT— 225 proliferation: Hori et al ( 1987), Blood 70, 1069-1078. La actividad de proteína de unión I L18 puede ensayarse in vitro al medir su habilidad para inhibir la temprana respuesta de Th1 (I mmunity 1999 Jan; 10( 1 ): 127-136). La función de quimera de toxina de difteria I L2 in vitro utilizando un ensayo de citotoxicidad. (Exp Hematol 2000 Dec; 28(12): 1390-1400). I L-4 puede ensayarse en un ensayo de citotoxicidad en linfocitos T normales. (PMI D: 8144944); Aumento RAMOS de expresión CD23: Siegel & Mostowski ( 1990) J Immunol Methods 132, 287-295. La actividad de receptor I L-4 puede medirse por la hbilidad para inhibir la proliferación dependiente de I L-4 de células TF-1 (Kitamura, T et al. , 1989, J . Cell. PPhysiol. 140:323). I L-8 puede ensayarse en un ensayo que monitorea el reflujo de calcio en células que llevan I L8R (Holmes ef al (1991 )Science 253, 1278-80). I nterferona gamma puede medir la actividad en ensayo antiviral utilizando las células Hela infectadas con virus EMC (Meager, A. 1987, Lymphokines and Interferons, A Practical Approach, Clemens, MJ ef al., eds. , IRL Press, p. 129); puede medir la modulación de la expresión clase I I M HC en estirpe de célula de carcinoma colorectal humano COLÓ 205 (Gibson y Kramer, 1989, J. I mmunol . Methods, 125: 105- 1 13). La actividad de interferona-omega puede medirse utilizando un ensayo antiviral in vitro (J Med Microbiol 1998 Nov; 47( 1 1 ): 1015-8). La actividad de I P-10 puede medirse in vitro utilizando un ensayo de quimiotaxis de célula de músculo liso de arteria de rata (J Biol Chem Sep. 27, 1996; 271 (39): 24286-24293). La actividad de IL-3 puede medirse in vitro utilizando un ensayo de diferenciación celular hematopoyética (Science 1985; 228(4701 ): 810-815). La actividad de KGF- 1 puede ensayarse in vitro utilizando un ensayo de proliferación celular epitelial . (Proc Nati Acad Sci U . S. A. 1989 Feb; 86(3): 802-806). La actividad de Kistrin puede ensayarse in vitro al ensayar la trombolisis, reoculasión, y sangrado asociado con la administración del activador de plasminógeno tipo tejido recombinante (rt-PA) en un modelo canino de trombosis de arteria coronaria (Circulation 1991 Mar, 83(3) 1038-1047) La actividad de inhibidor 1 de proteasa Kunitz puede ensayarse m vitro al medir la actividad inhibidora hacia el activador HGF (J Biol Chem Mar 7, 1997, 272( 10) 6370-6376) La actividad de Lactotransferpna puede medirse utilizando un ensayo de inhibición viral m vitro (J Med Microbiol 1998 Nov, 47( 1 1 ) 1015-8), y ensayos antimicrobianos (J Clin Invest Sep 1 , 1998, 102(5) 874-80) La Leptina puede ensayarse por modulación m vivo de la toma alimenticia, reducción en peso corporal, y disminución de insulina y niveles de glucosa en ratones ob/ob, radioinmunoensayo (RÍA) y activación del receptor de leptina en un ensayo basado en célula Protein Expr Pupf 1998 Dec, 14(3) 335-42 La actividad de LI F puede medirse m vitro utilizando un ensayo de diferenciación celular hematopoyética (Science 1985, 228(4701 ) 810-815) La actividad de LFA-3 puede ensayarse in vitro al medir su habilidad para inhibir la función de célula T (J Exp Med Jul 1 , 1993, 178( 1 ) 21 1 -222) La actividad de plasminógeno Lys puede medirse utilizando un ensayo de fibpnolisis m vitro (J Biol Chem Dec 25, 1992, 267(36) 26150-6) La actividad de M aspin puede medirse utilizando ensayos angiogénesis m vitro (Nat Med 2000 Feb, 6(2) 196-9) La actividad de Metionmasa puede ensayarse m vitro según se descri be por Ito ef al (J Biochem (Tokyo), 1975 Nov, 78(5) 1 105-1 107) La actividad de MTP puede ensayarse m vitro al utilizar un ensayo de secreción de lipoproteína que contiene apoB. (J Biol Chem Sep. 2, 1994; 269(35): 21951 -21954). La actividad de NG F puede ensayarse por medición de la activación de factor de transcripción CREB en neuronas simpatéticas en cultivo (Science Dec. 17, 1999;286(5448): 2358-2361 ). La actividad de endopeptidasa neutral puede ensayarse in vitro al medir proteolisis de péptidos tipo bombesina (Proc NatlmAcad Sci U.S. A. Dec. 1 , 1991 ; 88(23): 10662- 10666). La actividad de NI F puede ensayarse in vitro utilizando un ensayo de adhesión de leucocito polimorfonuclear (Mol Pharm 1999 Nov; 56(5): 926-932) . La actividad de Noggin puede ensayarse al medir las respuestas del receptor TNF a la estimulación de TNF de células HeLuna. (J Biol Chem Feb. 28, 1997; 272(9): 5861 -5870). La actividad de NT-3 puede ensayarse in vitro al medir su habilidad para proliferar las células progenitoras NC cultivadas crecidas en un medio definido libre de suero (Proc Nati Acad Sci U.S. A Mar. 1 , 1992; 89(5): 1661 - 1665) . La actividad de OP-I puede ensayarse in vitro al medir la expresión VEGF en células calvarías de rata fetal ( Mol Cell Endocrinol Jul . 20, 1999; 153(1-2): 1 13-124). La actividad de osteoprotegerin puede ensayarse in vitro utilizando un ensayo de co-cultivo para osteoclastogenesis, un ensayo de resorción de huesos utilizando un sistema de cultivo de órgano de hueso largo fetal, un ensayo de resorción dentina, o un ensayo de proliferación de fibroblasto (FASEB J. 1998; 12: 845-854). La actividad de acetilhidrolasa PAF de plasma puede determinarse por el método de Staffopni et al (Stroke 1997 Dec, 28( 12) 2417-20) La función parchada puede ensayarse m vitro al medir l a unión de su ligando, hedgehog sónico (Nature Nov 14, 1996, 384(6605) 129-134) La actividad de PDGF puede ensayarse m vitro al medir su habilidad para inducir la fosforilación de tirosina en el receptor PDGF (J Biol Chem May 25, 1989,264(15) 8905-8912) La función de PEDF puede ensayarse m vitro utilizando un ensayo de sobrecrecimiento de neuritas (J Biol Chem Oct 27, 1995, 270(43) 25992-25999) El inhibidor de activador de plasmmogeno puede ensayarse según se describe por Wallen, P , Biochemistry of plasminogen, I n Klme D L , Reddy, K N N , eds Fibpnolysis Boca Ratón, FL CRC Press, 1980 1 -25, Saksela, O , Rifkm, D B , Cell-associated plasminogen activation Regulation and physiological functions Annu Rev Cell Biol 1988, 4 93-126, Womack C J , Ivey F M , Gardner A W, Macko R F, Fibpnolytic response to acute exercisein patients with peppheral arterial disease Med Sci Sports Exerc 2001 Feb, 33(2) 214-9 La actividad de PGP puede ensayarse m vitro al medir el agonismo de la quinasa de tirosina 3 y el factor estimulante de colonia de granulocito (Exp Hematol 2001 Jan, 29( 1 ) 41 -50) La actividad de PM P puede ensayarse m vitro al medir la habilidad para inducir megacapocitopoyesis en células CD43+ purificadas de la médula ósea, células progenitoras de sangre periférica movilizadas, o cordón umbilical (J Hematother 1999 Apr, 8(2) 199-208) La eficacia de prosaptida puede medirse a través de regímenes de múltiples dosis utilizando ratas diabéticas (Anesthesiology 2000 Nov; 93(5): 1271-8). La actividad de Ranpirnase in vitro puede ensayarse al utilizar ribonucleasa y ensayos de actividad citotóxica (J Mol Biol Apr. 19, 1996; 257(5): 992-1007). La actividad de Relaxin puede ensayarse in vitro utilizando una inhibición de ensayo in vitro de contracciones uterinas de rata inducidas por KCl (Can J Physiol Pharmacol 1981 May; 59(5): 507-12). La actividad de S-Antígeno Retinal puede ensayarse in vitro al medir la actividad canales con abertura GMP cíclicas en células fotoreceptoras (J Biol Chem Nov. 25, 1994; 269(47): 29765-29770). La actividad de RhLH puede ensayarse in vitro al medir fluorescencia Fura-2 en células tecales porcinas aisladas en respuesta a la estimulación RhLH (Endocrinology 2000 Jun; 141(6): 2220-2228). La actividad de Saruplasa puede medirse in vitro utilizando un ensayo de división de plasminógeno (J Biol Chem Jan. 18, 2001; epub ahead of print). El receptor tipo 1 complementario puede ensayarse in vitro al medir la unión C3b y C4b. (J Exp Med Nov. 1, 1988; 168(5): 1699-1717). La función de hedgehog sónico puede ensayarse in vitro al medir su unión al parchado (Nature 1996 Nov. 14; 384(6605): 129-134). La actividad de Estafiloquinasa puede medirse in vitro utilizando un ensayo de división de plasminógeno (J Biol Chem Jan. 18, 2001; epub ahead of print). La actividad de SCF puede ensayarse al medir la supervivencia de célula de mastocito, proliferación, o producción de citoquinas pro-inflamatorias (I mmunol Rev 2001 Feb; 179: 57-60). La actividad de etreptoquinasa puede medirse in vitro utilizando un ensayo de activación de plasminógeno (J Biol Chem Jan. 18, 2001 ; epub ahead of print). La actividad de dismutasa superóxida puede ensayarse in vitro utilizando un ensayo de dismutasa superóxida (Nucleic Acids Res Mar. 25, 1985; 13(6): 2017-34). La función T 1 /ST2 puede ensayarse in vitro utilizando un ensayo de activación de célula Th2 (J Immunol Mar. 1 , 2001 ; 166(5): 3143-3150) . La actividad de TGF beta 1 puede ensayarse in vitro al medir la inducción de proliferación de fibroblasto renal por la inducción de FGF-2 (Kidney Int 2001 Feb; 59(2): 579-592). La función TGF Beta 2 puede ensayarse in vitro al medir la inhibición de la transcripción iNOS (I nflamm Res 1997 Sep; 46(9): 327-331 ) . TGF-beta 3 puede ensayarse para estimulación de producción de prostaglandina E2 (PGE2) y resorción de huesos en calvaría de ratón neonatal en cultivo de órganos (PNAS USA 1985 Jul ; 82( 13): 4535-4538) , o estimulación de la síntesis de colágeno, osteopontina, osteonectina, y fosfatasa alcalina, y la habilidad de estimular la duplicación en células tipo osteoblasto (J Biol Chem 1987;262: 2869, J Biol Chem 1988; 263: 13916, J Cell Biol 1988; 106: 915, J Cell Physiol 1987; 133: 426, Endocrinology 1987; 121 : 212, Endocrinology 1986; 19: 2306, y J Cell Biol 1987; 105: 457). Trombopoyetina (TPO) puede ensayarse para determinar la regulación de crecimiento y diferenciación de megacariocitos (Mol Cell Biol 2001 Apr; 21 (8): 2659-2670; Exp Hematol 2001 Jan; 29( 1 ): 51 -58; Leukemia 2000 Oct; 14( 10): 1751 -1756) . La función de Tie-2/Tek puede ensayarse al medir su fosforilación en respuesta a la estimulación por angiopoyetina (I nt Immunol 1998 Aug; 10(8): 1217-1227). El inhibidor de trayectoria de factor de tejido puede ensayarse para la inactivación de factor Xa e inhibición del complejo de factor de tejido Vl la de la trayectoria de coagulación extrínsica (J Biol Chem May 5, 1998; 263( 13): 6001 -6004; Thromb Haemost 1998; 79(2): 306-309). La actividad de proteína de unión TNF puede ensayarse al medir la inhibición de la activación de PI P5K en respuesta a la estimulación TNF de células HeLuna. (J Biol Chem Feb. 28, 1997; 272(9): 5861 -5870). La actividad de proteína de unión TNF puede ensayarse al medir la inhibición de la activación de PI P5K en respuesta a la estimulación TNF de células HeLuna. (J Biol Chem Feb. 28, 1997; 272(9) : 5861 -5870). La actividad de receptor TNF puede ensayarse al medir los aumentos de la activación de PI P5K en respuesta a la estimulación de TNF de células HeLuna (J Biol Chem Feb. 28, 1997; 272(9): 5861 -5870). t-PA puede ensayarse según se describe en Wallen, P. , Biochemistry de plasminogen. I n: Kl ine D. L. , Reddy, K. N . N. , eds. Fibrinolysis. Boca Ratón, FL: CRC Press, 1980: 1 -25; Saksela, O. , Rifkin, D. B. , Cell- associated plasminogen activation: Regulation and physiological functions. Annu Rev Cell Biol 1988; 4: 93-126; Womack C J, IveyFM , Gardner A W, Macko R F, Fibri nolytic response to acute exercise in patients with peripheral arterial disease. Med Sci Sports Exerc 2001 Feb; 33(2): 214-9. La actividad de IFN-tau puede ensayarse in vitro al medir la producción inducida por IFN-tau de una proteína 70 kD acida en explantes cultivados de endometrio preparado de ovejas hembras en el día 13 del ciclo estroso. (Mol Endocrinol 1990 Oct; 4(10): 1506-1514). La actividad de Troponin I puede ensayarse in vitro utilizando un ensayo de unión de miofibrilo (J Muscle Res Cell Motil 1999 Nov; 20(8): 755-760). La actividad de oxidasa urato puede ensayarse in vitro utilizando un ensayo para oxidación catalizada por uricasa de ácido úrico (Anal Chem May 15, 1999; 71(10): 1928-1934); o por inmunoensayo de oxidasa urato recombinante (J Pharm Sci 1996 Sep; 85(9): 955-959). La actividad de uroquinasa puede medirse in vitro utilizando un ensayo de división de plasminógeno. Sazonova ef al. (J Biol Chem Jan. 18, 2001, electronic publication prior to print). La actividad de VEGF-I puede ensayarse in vitro utilizando un ensayo de proliferación celular endotelial. (Proc Nati Acad Sci U.S. A. 1989 Feb; 86(3): 802-806). La actividad de Viscumin puede ensayarse utilizando granulocito y ensayos de activación de neutrófilo. (Anticancer Res 1999 Jul-Aug; 19(4B): 2925-2928; y J Leukoc Biol 2000 Dec; 68(6): 845-853).

Preparación de Ligandos Basados en Inmunoglobulina Los ligandos de unión (por ejemplo, dAbs) como se describe en la presente de acuerdo a la invención puede prepararse de acuerdo a las técnicas previamente establecidas, utilizadas en el campo de elaboración de anticuerpos, para la preparación de scFv, anticuerpos "fago" y otras moléculas de anticuerpo elaboradas. Las técnicas para la preparación de anticuerpos se describen por ejemplo en las siguientes revisiones y las referencias citadas en la presente: Winter & Milstein, ( 1991 ) Nature 349:293-299; Pluckthun (1992) I mmunological Reviews 130: 151 -188; Wright ef al, (1992) Crti . Rev. Immunol .12: 125-168; Holliger, P. & Winter, G. ( 1993) Curr. Op. Biotechn. 4, 446-449; Cárter, ef al. ( 1995) J . Hematother. 4, 463-470; Chester, K.A. & Hawkins, R.E . ( 1995) Trends Biotechn. 13, 294-300; Hoogenboom , H. R. ( 1997) Nature Biotechnol . 15, 125-126; Fearon, D. ( 1997) Nature Biotechnol. 15, 618-619; Pluckthun, A. & Pack, P. ( 1997) Immunotechnology 3, 83-105; Cárter, P. & Merchant, A. M . (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8,449-454; Holliger, P. & Winter, G. ( 1997) Cáncer Immunol. Immunother. 45, 128-130. Las técnicas adecuadas empleadas para la selección de domi nios variables de anticuerpo con una especificidad deseada emplean bibliotectas y procedimientos de selección que se conocen en la materia. Bibliotecas naturales (Marks ef al ( 1991 ) J. Mol. Biol, 222: 581 ; Vaughan ef al (1996) Nature Biotech. , 14: 309) los cuales utilizan genes V recolocados colectados de células B humanas se conocen bien por aquellos expertos en la materia. Bibliotecas Sintéticas (Hoogenboom & Winter ( 1992) J. Mol. Biol, 227: 381 ; Barbas ef al. (1992) Proc. Nati. Acad. ScL USA, 89: 4457; Nissim ef al. ( 1994) EM BO J. , 13: 692; Griffiths ef al. ( 1994) EM BO J, 13: 3245; De Kruif ef al. (1995) J. Mol. Biol, 248: 97) se preparan al clonar los genes V de inmunoglobulina, usualmente utilizando PCR. Los errores en el proceso de PCR pueden conducir a un alto grado de selección al azar. Las bibliotecas VH y/o VL pueden seleccionarse contra antigenos o epítopos objetivo por separado, en cuyo caso la unión de dominio único se selecciona directamente para, o juntos.

Sistemas de Vector de Biblioteca Una variedad de sistemas de selección se conocen en la materia que son adecuados para utilizarse en la presente invención. Los ejemplos de tales sistemas se describen abajo. Los sistemas de expresión lambda de bacteriófago pueden seleccionarse directamente como placas bacteriófagas o como colonias de lisógenos, ambos según se describe previamente (Huse ef al. ( 1989) Science, 246: 1275; Catón y Koprowski ( 1990) Proc. Nati. Acad. ScL U.S. A. , 87; Mullinax ef al. (1990) Proc. Nati Acad. ScL U. S. A. , 87: 8095; Persson ef al. (1991 ) Proc. Nati. Acad. ScL U S A. , 88: 2432) y son de uso en la invención. Mientras que tales sistemas de expresión pueden utilizarse para seleccionar hasta 106 diferentes miembros de una biblioteca, no se adecúan fácilmente para selección de números más grandes (más de 106 miembros). De uso particular en la construcción de bibliotecas son sistemas de despliegue de selección, los cuales permiten a un ácido nucleico unirse al polipéptido que expresa. Según se utiliza en la presente, un sistema de despliegue de selección es un sistema que permite la selección, por medio de despliegue adecuado, de los miembros individuales de la biblioteca al unir los ligandos genéricos y/u objetivos. Los protocolos de selección para aislar a los miembros deseados de grandes bibliotecas se conocen en la materia, según se tipifica por las técnicas de despliegue de fago. Tales sistemas, en los cuales diversas secuencias de péptido se despliegan en la superficie de bacteriófago filamentoso (Scott y Smith (1990) Science, 249: 386), se han probado útiles para crear bibliotectas de fragmentos de anticuerpo (y las secuencias de nucleótido que las codifican) para la selección in vitro y amplificación de fragmentos de anticuerpo específico que unen un antígeno objetivo (McCafferty ef al, WO 92/01047). Las secuencias de nucleótido que codifican las regiones variables se unen a fragmentos de gen que codifican las señales líder que dirigen las mismas al espacio periplásmico de E. coli y como un resultado los fragmentos de anticuerpo resultante se despliegan en la superficie del bacteriófago, típicamente como fusiones a proteínas de cabra bacteriófagas (por ejemplo, pl l l o pVII I). Alternativamente, los fragmentos de anticuerpo se despliegan externamente en cápsidas de fago lambda (fagocuerpos). Una ventaja de los sistemas de despliegue basados en fago es que, debido a que son sistemas biológicos, los miembros de biblioteca seleccionada pueden amplificarse simplemente al crecer el fago que contiene el miembro de biblioteca seleccionada en células bacterianas.

Además, ya que la secuencia de nucleótido que codifica el miembro de biblioteca de polipéptido se contiene en un fago o vector fagomido, secuenciación, expresión y manipulación genética subsiguiente es relativamente hacia adelante. Los métodos para la construcción de bibliotecas de despliegue de anticuerpo bacteriófago y bibliotecas de expresión de fago lambda se conocen bien en la materia (McCafferty ef al. (1990) Nature, 348: 552; Kang et al (1991) Proc. Nati. Acad. Sci.

U.S. A., 88: 4363; Clackson ef al. (1991) Nature, 352: 624; Lowman et al. (1991) Biochemistry, 30: 10832; Burton ef al. (1991) Proc.

Nati. Acad. Sci U.S.A., 88: 10134; Hoogenboom ef al. (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133; Chang ef al. (1991) J. Immunol, 147: 3610; Breitling et al. (1991) Gene, 104: 147; Marks ef al. (1991) supra; Barbas ef al. (1992) supra; Hawkins y Winter (1992) J Immunol, 22: 867; Marks ef al, 1992, J. Biol. Chem., 267: 16007; Lerner et al (1992) Science, 258: 1313, incorporadas en la presente para referencia). Un procedimiento particularmente ventajoso ha sido el uso de bibliotecas de fago scFv (Huston ef al, 1988, Proc. Nati. Acad.

Sci U.S. A., 85: 5879-5883; Chaudhary ef al (1990) Proc. Nati.

Acad. Sci U.S. A., 87: 1066-1070; McCafferty et al (1990) supra; Clackson ef al (1991) Nature, 352: 624; Marks ef al. (1991) J. Mol.

Biol, 222: 581 ; Chiswell ef al ( 1992) Trends Biotech. , 10: 80; Marks ef al ( 1992) J. Biol. Chem. , 267). Varias modalidades de las bibliotecas scFv desplegadas en proteínas de cabra bacteriófaga, se han descrito. Los refinamientos de los procedimientos del despliegue de fago también se conocen, por ejemplo según se descri be en WO96/06213 y WO92/01047 (Medical Research Council ef al.) y WO97/08320 (Morphosys), los cuales se incorporan en la presente para referencia. Otros sistemas para generar las bibliotecas de polipéptidos incluyen el uso de maquinaria enzimática libre de cél ula para la síntesis in vitro de los miembros de biblioteca. En un método, las moléculas de ARN se seleccionan por rondas alternativas de selección contra un ligando objetivo y amplificación PCR (Tuerk y Gold ( 1990) Science, 249: 505; Ellington y Szostak ( 1990) Nature, 346: 818). Una técnica similar puede utilizarse para identificar las secuencias de ADN que se unen al factor de transcripción humano predeterminado (Thiesen y Bach (1990) Nucleic Acids Res. , 18: 3203; Beaudry y Joyce ( 1992) Science, 257: 635; WO92/05258 y WO92/14843) . En una manera similar, la translación in vitro puede utilizarse para sintetizar los polipéptidos como un método para generar las grandes bibliotecas. Estos métodos que generalmente comprenden complejos de polisoma establecidos, se describen además en WO88/08453, WO90/05785, WO90/07003, WO91 /02076, WO91 /05058, y WO92/02536. Los sistemas de despligue alternos que no se basan en fagos, tales como aquellos descritos en WO95/22625 y WO95/1 1922 (Affymax) utilizan los pol ísomas para desplegar los polipéptidos para la selección. Todavía una categoría adicional de las técnicas incluye la selección de repertorios en compartimientos artificiales, los cuales permiten el enlace de un gen con su producto de gen. Por ejemplo, un sistema de selección en el cual los ácidos nucleicos que codifican los productos de gen deseable pueden seleccionarse en microcápsulas formadas por emulsiones de agua en aceite se describe en WO99/02671 , WO00/40712 y Tawfik & Griffiths ( 1998) Nature Biotechnol 16(7), 652-6. Los elementos genéticos que codifican un producto de gen teniendo una actividad deseada se dividen en microcápsulas y después se transcriben y/o trasladan para producir sus productos de gen respectivos (ARN o proteína) dentro de las microcápsulas. Los elementos genéticos que producen el producto de gen que tiene actividad deseada se eligen subsecuentemente. Este procedimiento elige los productos de gen de interés al detectar la actividad deseada por una variedad de medios.

Construcción de Biblioteca Las bibliotecas pretendidas para selección, pueden construirse utilizando técnicas conocidas en la materia, por ejemplo según se establece anteriormente, o pueden adquiri rse de fuentes comerciales. Las bibliotecas que son útiles en la presente invención se describen, por ejemplo, en WO 99/20749. Una vez que un sistema de vector se eliga y una o más secuencias de ácido nucleico que codifican poli péptidos de i nterés se cl onan en el vector de bi blioteca, uno puede generar diversidad dentro de las moléculas cl onadas al tomar la mutagenesis antes de la expresión; alternativamente, las proteínas codificadas pueden expresarse y sel eccionarse, según se descri be anteriormente, antes de l a m utagenesis y rondas adicionales de selección se realizan. La mutagenesis de las secuencias de ácido nucleico que codifican poli péptidos estructuralmente opti mizados se lleva a cabo por métodos moleculares estándares. De particular uso se encuentra la reacción en cadena de polimerasa, o PCR, (M ullís y Faloona ( 1 987) Methods Enzymol, 1 55: 335, en la presente i ncorporada para referencia) . PCR, el cual utiliza múltiples ciclos de duplicaci ón de ADN catalizada por un termoestable, poli merasa de ADN dependiente de ADN para amplificar la secuencia objetivo de interés, se sabe bien en la materia. La construcción de varias bi bl iotecas de anticuerpo se han discutido en Wi nter ef al. ( 1 994) Ann Rev. I mmunology 12, 433-55, y referencias citadas en el mismo. PCR se realiza utilizando ADN templado (al menos 1 fg; más útilmente, 1 - 1 000 ng) y al menos 25 pmol de cebadores de oligonucleótido, puede ser ventajoso para utilizar una canti dad más grande de cebador cuando el grupo cebador es altamente heterogéneo, a medida que tal secuencia se representa por solamente una pequeña fracción de las moléculas del grupo, y las cantidades llegan a ser limitantes en los últimos ciclos de amplificación. Una mezcla de reacción típica incluye: 2 µl de ADN, 25 pmol de cebador oligonucleótido, 2.5 µl de 10X de regulador 1 PCR (Perkin-Elmer, Foster City, CA), 0.4 µl de 1 .25 µM de dNTP, 0.15 µl (o 2.5 unidades) de polimerasa de ADN Taq (Perkin Elmer, Foster City, CA) y agua desmineralizada a un volumen total de 25 µl. El aceite mineral se sobre recubre y el PCR se realiza utilizando un ciclador térmico programable. La longitud y la temperatura de cada etapa de un ciclo PCR, así como también el número de ciclos, se ajusta de acuerdo a los requisitos de rigurosidad en efecto. La temperatura de amasamiento y sincronización se determinan tanto por la eficiencia con el cual se espera que un cebador se amase para un templado y el grado de desigualdad que se tolerará; obviamente, cuando las moléculas de ácido nucleico se amplifican y mutagenizan simultáneamente, se requiere la desigualdad, al menos en la primera ronda de síntesis. La habilidad de optimizar la rigurosidad de las condiciones de amasamiento de cebador se encuentra bien dentro del conocimiento de un experto en la materia. Una temperatura de amasamiento de entre 30°C y 72°C se utiliza. La desnaturalización inicial de las moléculas templadas normalmente ocurre en entre 92°C y 99°C por 4 minutos, seguido por 20-40 ciclos consistiendo de desnaturalización (94-99° por 15 segundos a 1 minuto), amasamiento (temperatura determinada según se discute anteriormente; 1 -2 minutos) y extensión (72°C por 1 -5 minutos, dependiendo de la longitud del producto amplificado) . La extensión final generalmente es de 4 minutos a 72°C, y puede seguirse por una etapa infinita (0-24 horas) a 4°C.

Dominios Variables Únicos en Combinación Los dominios útiles en la invención, una vez seleccionados, pueden combinarse por una variedad de métodos conocidos en la materia, incluyendo métodos covalentes y no covalentes. Los métodos preferidos incluyen el uso de enlazadores de polipéptido, según se describe, por ejemplo, en relación con las moléculas scFv (Bird et al, ( 1988) Science 242:423-426). SE proporciona la discusión de enlazadores adecuados en Bird ef al. Science 242, 423-426; Hudson et al, Journal I mmunol Methods 231 ( 1999) 177-189; Hudson et al, Proc Nat Acad Sci USA 85, 5879-5883. Los enlazadores son preferentemente flexibles, permitiendo a los dos dominios únicos interactuar. Un ejemplo enlazador es un enlazador (Gly Ser)n, donde n=1 a 8, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 7. Los enlazadores utilizados en anticuerpos, que son menos flexibles, también pueden emplearse (Holliger ef al, ( 1993) PNAS (USA) 90:6444-6448). En una modalidad, el enlazador empleado no es una región de articulación de inmunoglobulina. Los dominios variables pueden combinarse utilizando métodos diferentes a enlazadores. Por ejemplo, el uso de puentes de disulfuro, proporcionados a través de los residuos de cisteína elaborados o que se presentan naturalmente, pueden explotarse para estabilizar dímeros VH'VH'V 'VL O VR- VL (Reiter et al, (1994) Protein Eng. 7:697-704) o al remodelar la interfase entre los dominios variables para mejorar el "ajuste" y de esta manera la estabilidad de interacción (Ridgeway ef al, (1996) Protein Eng. 7:617-621 ; Zhu ef al, (1997) Protein Science 6:781 -788). Otras técnicas para unir o estabilizar los dominios variables de inmnoglobulinas, y en particular dominios de anticuerpo VH, pueden emplearse como adecuados.

Caracterización de Ligandos La unión de un ligando (por ejemplo, monómero dAb, ligando específico dual) a su (s) antígeno (s) específico (s) o epítopo (s) puede (n) probarse por métodos que serán familiares a aquellos expertos en la materia e incluyen ELISA. En una modalidad preferida de la invención, la unión se prueba utilizando E LISA fago monoclonal . ELISA fago puede realizarse de acuerdo a cualquier procedimiento adecuado: un protocolo ejemplar se establece abajo. Las poblaciones de fago producidas en cada ronda de selección pueden seleccionarse para la unión por ELISA al antígeno o epítopo seleccionado, para identificar los anticuerpos de fago "policlonal". El fago de colonias bacterianas infectadas únicas de estas poblaciones puede seleccionarse así por ELISA para identificar los anticuerpos de fago "monoclonal" . También es deseable seleccionar los fragmentos de anticuerpo soluble para unirse a antígeno o epítopo, y esto también puede tomarse por ELISA utilizando reactivos, por ejemplo, contra una etiqueta de terminal N o C (ver por ejemplo Winter ef al. (1994) Ann. Rev. Inmunology 12, 433-55 y referencias citadas en la presente. La diversidad de los anticuerpos monoclonales de fago seleccionado también pueden valorarse por electroforesis de gel de productos PCR (Marks ef al 1991 , supra; Nissim ef al 1994 supra), probando (Tomlinson ef al, 1992) J. Mol. Biol. 227 ', 776) o al secuencia el vector ADN.

Estructura de ligandos En el aso de que los dominios variables se seleccionan de repertorios de gen V seleccionados por ejemplo utilizando tecnología de despliegue según se describe en la presente, entonces estos dominios variables comprenden una región de estructura universal , de tal forma que pueden reconocerse por un ligando genérico específico según se define en la presente. El uso de estructuras universales, los ligandos genéricos y lo similar se describe en WO 99/20749. En donde los repertorios de gen V se utilizan, la variación en la secuencia de polipéptido se ubica preferentemente dentro de los ciclos estructurales de los dominios variables. Las secuencias de polipéptido ya sea de dominio variable pueden alterarse por cambio de ADN o por mutación a fin de mejorar la interacción de cada dominio variable con su par complementario. El cambio de ADN se conoce en la materia y se enseña, por ejemplo, por Stemmer, 1994, Nature 370: 389-391 y Patente de EE. U U . No. 6,297,053, ambos de los cuales se incorporan en la presente para referencia. Otros métodos de mutagenesis se conocen bien por aquellos expertos en la materia. En general , las moléculas de ácido nucleico y las construcciones de vector requeridas para selección, preparación y formateo de ligandos pueden construirse y manipularse según se establece en manuales de laboratorio estándar, tal como Sambrook ef al. ( 1989, ) Molecular Cloning: A Laboratory M anual , Cold Spring Harbor, USA. La manipulación de ácidos nucleicos útiles en la presente invención se llevan a cabo típicamente en vectores recombinantes.

Según se utiliza en la presente, el vector se refiere a un elemento discreto que se utiliza para introducir ADN heterólogo en células para la expresión y/o duplicación de las mismas. Los métodos por los cuales se selecciona o construye y, por consecuencia, utilizan tales vectores, se conocen bien por un experto en la materia. Los numerosos vectores se encuentran públicamente disponibles, incluyendo plásmidos bacterianos, bacteriófago, cromosomas artificiales y vectores episomales . Tales vectores pueden utilizarse para simple clonación y mutagenesis; se emplea alternativamente el vector de expresión de gen. Un vector para utilizarse de acuerdo a la invención puede seleccionarse para acomodar una secuencia codificadora de polipéptido de un tamaño deseado, típicamente de 0.25 kilobase (kb) a 40 kb o más en célula huésped adecuada de longitud A se transforma con el vector después de las manipulaciones de clonación in vitro. Cada vector contiene varios componentes funcionales, que generalmente incluyen un sitio de clonación (o "polienlazador"), un origen de duplicación y al menos un gen marcador elegible. Si el vector dado es un vector de expresión, adicionalmente posee uno o más de los siguientes: elemento reforzador, promotor, terminación de transcripción y secuencias de señal , cada uno colocado en la proximidad del sitio de clonación, de tal forma que se unen operativamente al gen que codifica un ligando de acuerdo a la invención. Tanto los vectores de clonación como expresión general mente contienen secuencias de ácido nucleico que permiten al vector duplicarse en una o más células huésped seleccionada. Típicamente en los vectores de clonación, esta secuencia es una que permite al vector duplicarse independientemente del ADN cromosómico huésped e incluye orígenes de duplicación o secuencias de duplicación autónoma. Tales secuencias se conocen bien en la materia por una variedad de bacteria, levadura y virus. El origen de duplicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de la bacteria de gramo negativo, el origen plásmido de 2 mieras es adecuado para levadura, y varios orígenes virales (por ejemplo, SV 40, adenovirus) son útiles para los vectores de clonación en células de mamífero. Generalmente, el origen de duplicación no es necesario para los vectores de expresión de mamífero al menos que estos se utilicen en células de mamífero capaces de duplicar niveles altos de ADN, tales como células COS. Ventajosamente, un vector de expresión o clonación puede contener un gen de selección también referido como un marcador elegible. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de células huésped transformadas crecidas en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped no transformadas con el vector que contienen el gen de selección por lo tanto no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típica codifican las proteínas que confieren resistencia a antibióticos y otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomici na, metotrexato o tetraciclina, deficiencias auxotróficas complementarias, o suministro de nutrientes crítico no disponible en el medio de crecimiento. Ya que la duplicación de vectores que codifican un ligando de acuerdo a la presente invención se realiza más preferentemente en E. coli, un marcador elegible E. coli, por ejemplo, el gen ß-lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina antibiótica, es de uso. Estos pueden obtenerse de plásmidos E. coli, tales como pBR322 o un plásmido pUC tal como pUC18 o pUC19. Los vectores de expresión usualmente contienen un promotor que se reconoce por el organismo huésped y se une operativamente a la secuencia codificadora de interés. Tal promotor puede ser inducible o constitutiva. El término "operativamente enlazada" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos se encuentran en una relación que les permite funcionar en su manera pretendida. Una secuencia de control "operativamente enlazada" a una secuencia de codificación se liga de tal manera que la expresión de la secuencia de codificación se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias de control . Los promotores adecuados para utilizarse con huéspedes procarióticos incluyen, por ejemplo, los sistemas de promotor de ß-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, el sistema de promotor triptofan (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac. Los promotores para utilizarse en sistemas bacterianos también generalmente contendrán una secuencia Shine-Delgarno operativamente unida a la secuencia de codificación. Los vectores preferidos son vectores de expresión que permite la expresión de una secuencia de nucleótido correspondiente a un miembro de biblioteca de polipéptido. De esta manera, la selección con el primer y/o segundo antígeno o epítopo puede realizarse por propagación separada y expresión de un clon único que expresa el miembro de biblioteca de polipéptido o por uso de cualquier sistema de despliegue de selección. Según se describe anteriormente, el sistema de despliegue de selección preferido es el despliegue de bacteriófago. De esta manera, los vectores fago o fagomido pueden utilizarse, por ejemplo, plT 1 o plT2. Las secuencias líder útiles en la invención incluyen pe1 B, stll , ompA, phoA, bla y pelA. Un ejemplo son vectores de fagomido que tienen un origen de duplicación E. coli (para duplicación de doble filamento) y también un origen fago de duplicación (para la producción de ADN de filamento único) . La manipulación y expresión de tales vectores se conoce bien en la materia (Hoogenboom y Winter (1992) supra; Nissim ef al. ( 1994) supra). En resumen, el vector contiene un gen ß-lactamasa para conferir selectividad en el fagomido y un promotor lac río arriba de un cásete de expresión que consiste (terminal N o C) de una secuencia líder pe1 B (que dirige el polipéptido expresado al espacio periplásmico), un sitio de clonación múltiple (para clonación de la versión de nucleótido del miembro de biblioteca), opcionalmente, uno o más etiquetas de péptido (para detección), opcionalmente, uno o más de codón de detención TAG y la proteína fago pl l l . De esta manera, utilizando varias cepas supresoras y no supresoras de E. coli y con la adición de glucosa, iso-propilo tio-ß-D-galactosido (I PTG) o un fago auxiliar, tal como VCS M 13, el vector es capaz de duplicarse como un plásmido sin expresión, producir grandes cantidades del miembro de biblioteca de polipéptido solamente o producir fago, algunos de los cuales contienen al menos una copia de la fusión de polipéptido pl l l en su superficie. La construcción de vectores que codifican los ligandos de acuerdo a la invención emplea técnicas de ligación convencionales. Los vectores aislados o fragmentos de ADN se dividen, cortan, y vuelven a ligar en la forma deseada para generar el vector requerido. Si se desea, el análisis para confirmar que las secuencias correctas se presentan en el vector construido pueden realizarse en una forma conocida. Los métodos adecuados para construcción de vectores de expresión, preparar las transcripciones in vitro, introducir el ADN en células huésped, y realizar análisis para valorar la expresión y función se conocen por aquellos expertos en la materia. La presencia de una secuencia de gen en una muestra se detecta, o su amplificación y/o expresión cuantificada por métodos convencionales, tal como análisis southern o Northern, Western blotting, dot blotting de ADN, ARN o proteína, hibridización in situ, inmunocitoquímica o análisis de secuencia de ácido nucleico o moléculas de proteína. Aquellos expertos en la materia fácilmente contemplarán como estos métodos pueden modificarse, si se desea.

Estructuras Las estructuras pueden basarse en moléculas de inmnoglobulina o pueden ser de no inmunoglobulina en origen según se establece anteriormente. Las estructuras de inmunoglobulina preferidas según se definen en la presente incluye cualquiera de uno o más de aquellos seleccionados de lo siguiente: una molécula de inmunoglobulina comprendiendo al menos (i) la CL (subclase kappa o lambda) dominio de un anticuerpo; o (ii) el dominio CH1 de una cadena pesada de anticuerpo; una molécula de inmunoglobulina comprendiendo los dominios CH 1 y CH2 de una cadena pesada de anticuerpo; una molécula de inmunoglobulina comprendiendo los dominios CH 1 , CH2 y CH3 de una cadena pesada de anticuerpo; o cualquiera del subgrupo (ii) junto con el dominio CL (subclase kappa o lambda) de un anticuerpo. Un dominio de región de articulación puede también incluirse. Tales combinaciones de dominios, por ejemplo, pueden imitar los anticuerpos naturales, tales como IgG o IgM , o fragmentos de los mismos, tales como moléculas Fv, scFv, Fab o F(ab')2. Aquellos expertos en la materia estarán concientes de que esta lista no se presenta que sea exhaustiva.

Andamios de Proteína Cada dominio de unión de epítopo comprende un andamio de proteína y uno o más CDRs que se incluyen en la interacción específica del dominio con uno o más epítopos. Ventajosamente, un dominio de unión de epítopo de acuerdo a la presente invención comprende tres CDRs. Los andamios de proteína adecuados incluyen cualquiera de aquellos seleccionados del grupo que consiste de lo siguiente: aquellos basados en dominios de inmunoglobulina, aquellos basados en fibronectina, aquellos basados de afficuerpos, aquellos basados en CTLA4, aquellos basados en chaperonas tales como GroEL, aquellos basados en lipocalina y aquellos basados en receptores Fe bacterianos SpA y SpD. Aquellos expertos en la materia aprecian que esta lista no sea pretende que sea exhaustiva.

Andamios para utilizarse en los Ligandos en Construcción Selección de la Conformación de cadena principal Los miembros de la superfamilia de inmunoglobulina todos comparten un pliegue similar para su cadena de polipéptido. Por ejemplo, a pesar de que los anticuerpos son altamente diversos en términos de su secuencia primaria, la comparación de secuencias y estructuras cristalográficas ha revelado que, contrario a la expectación, cinco de los seis ciclos de unión de antígeno de anticuerpos (H1 , H2, L1 , L2, L3) adoptan un número limitado de conformaciones de cadena principal, o estructuras canónicas (Chothia y Lesk ( 1987) J. Mol. Biol, 196: 901 ; Chothia ef al. ( 1989) Nature, 342: 877). El análisis de longitudes de ciclo y residuos clave han permitido por lo tanto la mayoría de anticuerpos humanos (Chothia ef al. ( 1992) J. Mol. Biol, 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMSO J, 14: 4628; Williams ef al. (1996) J. Mol. Biol, 264: 220). A pesar de que la región H3 es mucho más diversa en términos de secuencia, la longitud y estructura (debido al uso de segmentos D), también forma un número limitado de conformaciones de cadena principal para longitudes de ciclo corto que dependen de la longitud y la presencia de residuos particulares, o tipos de residuo, en posiciones clave en el ciclo y la estructura de anticuerpo (Martin ef al. (1996) J. Mol Biol, 263: 800; Shirai et al ( 1996) FEBS Letters, 399: 1 ). Las bibliotecas de ligandos y/o dominios pueden diseñarse en los cuales ciertas longitudes de ciclo y residuos clave se han elegido para asegurar que la conformación de cadena principal de los miembros se conoce. Ventajosamente, estos son conformaciones reales de las moléculas de superfamilia de inmunoglobulina encontradas en naturaleza, para minimizar los cambios que no son funcionales, según se discute anteriormente. Los segmentos de gen de línea de germen V sirven como una estructura básica adecuada para construir el anticuerpo o bibliotectas de receptor de célula T; otras secuencias también son de uso. Las variaciones pueden presentarse a una baja frecuencia, de tal forma que un pequeño número de miembros funcionales puede poseer una conformación de cadena principal alterada, lo cual no afecta su función. La teoría de estructura canónica es también de uso para valorar el número de diferentes conformaciones de cadena principal codificadas por ligandos, para pronosticar la conformación de cadena principal en base a las secuencias de ligando y para elegir los residuos para la diversificación que no afectan la estructura canónica. Se sabe que, en el dominio V? humano, el ciclo L1 puede adoptar una de cuatro estructuras canónicas, el ciclo L2 tiene una estructura canónica única y que 90% de los dominios V? humanos adoptan una de cuatro o cinco estructuras canónicas para el ciclo L3 (Tomlinson ef al. ( 1995) supra); de esta manera, en el dominio V? solo, diferentes estructuras canónicas pueden combinarse para crear un rango de diferentes conformaciones de cadena principal. Dado que el dominio V? codifica un diferente rango de estructuras canónicas para los ciclos L1 , L2 y L3 y que los dominios V« y V? pueden emparejarse con cualquier dominio VH que puede codificar varias estructuras canónicas para los ciclo H 1 y H2, el número de combinaciones de estructura canónica observadas para estos cinco ciclos es muy grande. Esto implica que la generación de diversidad en la conformación de cadena principal puede ser esencial para la producción de un amplio rango de especificidades de unión. Sin embargo, al construir una biblioteca de anticuerpo en una conformación de cadena principal conocida única se ha encontrado, contrario a la expectación, que la diversidad en la conformación de cadena principal no se requiere para generar suficiente diversidad para tener como objetivo sustancialmente todos los antigenos. Aún más sorprendentemente, la conformación de cadena principal única no necesita ser una estructura consenso - una conformación que se presenta naturalmente única puede utilizarse como la base para una biblioteca entera. De esta manera, en un aspecto preferido, los ligandos específicos duales de la invención poseen una conformación de cadena principal conocida única. La conformación de cadena principal única que se elige es preferentemente de lugar común entre las moléculas del tipo de superfamilia de i nmunoglobulina en cuestión. Una conformación es de lugar común cuando un significante número de moléculas que se presentan naturalmente son observadas para adoptarla. De acuerdo con lo anterior, en un aspecto preferido de la invención, la ocurrencia natural de las diferentes conformaciones de cadena principal para cada ciclo de unión de un dominio de inmunoglobuli na se consideran por separado y después un dominio variable que se presenta naturalmente se elige, el cual posee la combinación deseada de conformaciones de cadena principal para los diferentes ciclos . Si ni nguno está disponi ble, el equival ente más cercano puede elegirse. Es preferible que la combinaci ón deseada de conformaciones de cadena principal para los diferentes ciclos se crea al seleccionar los segmentos de gen de lí nea germinal que codifican las conformaciones de cadena principal deseada. Es más preferible, que los segmentos de gen de l ínea germi nal seleccionados se expresan frecuentemente en naturaleza, y más preferentemente que son los más frecuentemente expresados de todos los segmentos de gen de l i nea germi nal naturales. En el diseño de ligandos (por ejemplo, dAbs) o bi bliotecas de los mismos la i ncidencia de las diferentes conformaciones de cadena pri nci pal para cada uno de los seis ciclos de uni ón de antígeno pueden considerarse por separado. Para H 1 , H2 , L1 , L2 y L3, una conformación dada que se adopta por entre 20% y 100% de los ciclos de unión de antígeno de moléculas que se presentan naturalmente, se elige. Típicamente, su incidencia observada es arriba de 35% (es decir, entre 35% y 100%) e, idealmente, arriba de 50% o aún arriba de 65%. Ya que la mayoría vasta de ciclos H3 no tienen estructuras canónicas, es preferible elegir una conformación de cadena principal que sea de lugar común entre aquellos ciclos que no despliegan las estructuras canónicas. Para cada uno de los ciclos, la conformación que se observa más frecuentemente en el repertorio natural se selecciona por lo tanto. En anticuerpos humanos, las estructuras canónicas más populares (CS) para cada ciclo son como sigue: H 1 - CS 1 (79% del repertorio expresado), H2 - CS 3 (46%), Ll - CS 2 de V? (39%), L2 - CS 1 (100%), L3 - CS 1 de V? (36%) (cálculo asume una relación ?:? ratio de 70:30, Hood ef al. (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol, 48: 133). Para los ciclos H3 que tienen estructuras canónicas, una longitud de CDR3 (Kabat ef al. (1991 ) Sequences of proteins of immunological interest, U .S. Department de Health y Human Services) de siete residuos con un puente de sal de residuo 94 a residuo 101 parece que es el más común. Existen al menos 16 secuencias de anticuerpo humano en la biblioteca de datos EM BL con la longitud H3 requerida y los residuos clave para formar esta conformación y al menos dos estructuras cristalográficas en el banco de datos de proteína que pueden utilizarse como una base para el moldeo de anticuerpo (2 cgr y 1 tet). Los segmentos de gen de línea germinal más frecuentemente expresada que esta combinación de estructuras canónicas son el segmento VH 3-23 (DP-47), el segmento JH J H4b, el segmento V? 02/012 (DPK9) y el segmento J? J? 1 . Los segmentos VH DP45 y DP38 también son adecuados. Estos segmentos pueden por lo tanto utilizarse en combinación como una base para construir una biblioteca con la conformación de cadena principal única. Alternativamente, en lugar de elegir la conformación de cadena principal única en base a la ocurrencia natural de las diferentes conformaciones de cadena principal para cada uno de los ciclos de unión en aislamiento, la ocurrencia natural de combinaciones de conformaciones de cadena principal se utiliza como la base para elegir la conformación de cadena principal única. En el caso de anticuerpos, por ejemplo, la ocurrencia natural de combinaciones de estructura canónica por cualquiera de dos, tres, cuatro, cinco o todos los seis de los ciclos de unión de antígeno, pueden determinarse. Aquí, es preferible que la conformación elegida sea de lugar común en anticuerpos que se presentan naturalmente y más preferentemente que se observa más frecuentemente en el repertorio natural. De esta manera, en anticuerpos humanos, por ejemplo, cuando las combinaciones naturales de los cinco ciclos de unión por antígeno, H 1 , H2, L1 , L2 y L3, se consideran, la combinación más frecuente de las estructuras canónicas se determina y después se combina con la conformación más popular para el ciclo H3, como una base para elegi r la conformación de cadena principal única.

Diversificación de la Secuencia Canónica Habiendo seleccionado varias conformaciones de cadena principal conocidas o, preferentemente una conformación de cadena principal conocida única, los ligandos (por ejemplo, dAbs) o bibliotecas para utilizarse en la invención pueden construirse al variar el sitio de unión de la molécula a fin de generar un repertorio con diversidad estructural y/o funcional. Esto significa que las variantes se generan de tal forma que poseen suficiente diversidad en su estructura y/o su función de tal forma que son capaces de proporcionar un rango de actividades. La diversidad deseada se genera típicamente al variar la molécula seleccionada en una o más posiciones. Las posiciones a cambiar pueden elegirse al azar o se seleccionan preferentemente. La variación puede lograrse así ya sea por selección al azar, durante la cual el aminoácido residente se reemplaza por un aminoácido o análogo del mismo, natural o sintético, produciendo un muy gran número de variantes o al reemplazar el aminoácido residente con uno o más de un subgrupo de aminoácidos definido, produciendo un número más limitado de variantes. Varios métodos se han reportado para introducir tal diversidad. El PCR propenso al error (Hawkins ef al. (1992) J. Mol. Biol, 226: 889), mutagenesis química (Deng ef al (1994) J. Biol. Chem., 269: 9533) o cepas de mutador bacteriano (Low ef al (1996) J. Mol. Biol, 260: 359) pueden utilizarse para introducir las mutaciones al azar en los genes que codifican la molécula. Los métodos para mutar las posiciones seleccionadas también se conocen bien en la materia e incluyen el uso de oli gonucl eótidos desiguales o degenerar los ohgonucleótidos, con o sin el uso de PCR Por ejemplo, vanas bibliotecas de anticuerpo si ntético se han creado al tener como objetivo mutaciones a los ciclos de unión de antígeno La región H3 de Fab de unión por toxoide tétano humano se ha seleccionado al azar para crear un rango de nuevas especificidades de unión (Barbas et al (1992) Proc Nati Acad ScL USA, 89 4457) Las regiones H3 y L3 al azar o semi-azar se han anexado a los segmentos de gen V de l ínea germi nal para producir grandes bibliotecas con regiones de estructura no mutadas (Hoogenboom & Winter ( 1992) J Mol Biol, 227 381 , Barbas ef al (1992) Proc Nati Acad Sci USA, 89 4457, Nissim ef al ( 1 994) EM BOJ , 1 3 692 , Gpffiths ef al ( 1 994) EM BO J , 1 3 3245, De Kruif et al ( 1 995) J Mol Biol, 248 97) Tal diversificación se ha extendido para i ncluir ciertos o todos los otros ciclos de unión de antígeno (Cramep ef al ( 1996) Nature Med , 2 1 00, Riechmann ef al ( 1995) Bio/Technology, 1 3 475, Morphosys, WO97/08320, supra) Ya que la selección al azar del ciclo tiene el potencial de crear aproxi madamente más de 1 015 estructuras para H3 sol o y un de igual forma un gran número de variantes para los otros ci nco ciclos , no es fácil utilizar la tecnología de transformaci ón de corriente o aún utilizar los sistemas libres de célula para reduci r una biblioteca que representa todas las combinaciones posibles Por ejemplo, en una de las bibliotecas más grandes construidas a la fecha, 6 x 1010 diferentes anticuerpos, lo cual es solamente una fracción de la diversidad potencial para una biblioteca de su diseño, se generaron (Griffiths ef al. ( 1994) supra). Preferentemente, solamente los residuos que se incluyen directamente en la creación o modificación de la función deseada de la molécula, se diversifican. Para varias moléculas, la función será unirse a un objetivo y por lo tanto la diversidad deberá concentrarse en el sitio de unión objetivo, mientras que se evita cambiar los residuos que son cruciales al envasado global de la molécula o a mantener la conformación de cadena principal elegida.

Diversificación de la Secuencia Canónica a medida que aplica a los Dominios de Anticuerpo En el caso de ligandos basados en anticuerpo (por ejemplo, dAbs), el sitio de unión para el objetivo es más frecuente el sitio de unión de antígeno. De esta manera, preferentemente solamente aquellos residuos en el sitio de unión de antígeno se varían. Estos residuos son extremadamente diversos en el repertorio de anticuerpo humano y se conocen por hacer contactos en complejos de anticuerpo/antígeno de alta resolución. Por ejemplo, en L2 se sabe que las posiciones 50 y 53 son diversas en anticuerpos que se presentan naturalmente y se observan para hacer contacto con el antígeno. En contraste, el procedi miento convencional pudiera haber sido diversificar todos los residuos en la Región Determinadora de Complementariedad (CDR 1 ) correspondiente según se define por Kabat ef al. (1991 , supra, algunos siete residuos en comparación a los dos diversificados en la biblioteca para utilizarse de acuerdo a la invención. Esto representa una mejora importante en términos de la diversidad funcional requerida para crear un rango de especificidades de unión de antígeno. En naturaleza, la diversidad de anticuerpo es el resultado de dos procesos: recombinación somática de los segmentos de gen V, D y J de línea germinal para crear un repertorio primario natural (tan llamado diversidad en conjunto y línea germinal) e hipermutación somática de los genes V recolocados resultantes. El análisis de las secuencias de anticuerpo humano ha mostrado que la diversidad en el repertorio primario se enfoca en el centro del sitio de unión de antígeno mientras que la hipermutación somática esparce la diversidad a las regiones en la periferia del sitio de unión de antígeno que son altamente conservadas en el repertorio primario (ver Tomlinson ef al. ( 1996) J. Mol. Biol, 256: 813). Esta complementariedad se ha producido probablemente como una estrategia eficiente para buscar el espacio de secuencia y, a pesar de ser aparentemente única a los anticuerpos, puede aplicarse fácilmente a otros repertorios de polipéptido. Los residuos que se varían son un subgrupo de aquellos que forman el sitio de unión para el objetivo. Los diferentes subgrupos (incluyendo recubrimiento) de residuos en el sitio de unión objetivo se diversifican en diferentes etapas durante la selección, si se desea. En el caso de un repertorio de anticuerpo, un repertorio "natural" inicial puede crearse en donde ciertos, pero no todos, los residuos en el sitio de unión de antígeno se diversifican. Según se utiliza en la presente en este contexto, el término "natural" se refiere a moléculas de anticuerpo que tienen objetivo no predeterminado. Estas moléculas se asemejan a aquellas que se codifican por los genes inmunoglobulina de un individuo quien no ha superado la diversificación inmune, como es el caso con individuos recién nacidos y fetales, cuyos sistemas inmunes no se han cambiado aún por una amplia variedad de estímulos antigénicos. Este repertorio se selección así contra un rango de antígenos o epítopos. Si se requiere, la diversidad adicional puede introducirse así fuera de la región diversificada en el repertorio inicial . Este repertorio maduro puede seleccionarse para la función modificada, especificidad o afinidad. Los repertorios naturales de los dominios de unión para la construcción de ligandos en los cuales algunos o todos los residuos en el sitio de unión de antígeno se varían, se conocen en la materia. (Ver, WO 2004/058821 , WO 2004/003019, y WO 03/002609). La biblioteca "primaria" imita el repertorio pri mario natural, con diversidad restringida a residuos en el centro del sitio de antígeno de unión que son diversos en los segmentos de gen V de l ínea germinal (diversidad de l ínea germinal) o diversificarse durante el proceso de recombinación (diversidad conj uncional) . Aquellos residuos que se diversiican incluyen, pero no se limitan a, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91 , L92, L93, L94 y L96. En la biblioteca "somática", la diversidad se restringe a residuos que se diversifican durante el proceso de recombinación (diversional de unión) o se mutan altamente de manera somática. Aquellos residuos que se diversifican incluyen, pero no se limitan a: H31 , H33, H35, H95, H96, H97, H98, L30, L31 , L32, L34 y L96. Todos los residuos anteriormente listados como adecuados para la diversificación en estas bibliotecas se conocen por hacer contactos en uno o más complejos de anticuerpo-antígeno. Ya que en ambas bibliotecas , no todos los residuos en el sitio de unión de antígeno se varían, la diversidad adicional se incorpora durante la selección al variar los residuos restantes, si se desea hacerlo así. Deberá ser aparente para aquellos expertos en la materia que cualquier subgrupo de cualquiera de estos residuos (o residuos adicionales que comprenden el sitio de unión de antígeno) pueden utilizarse para la diversificación inicial y/o subsecuente del sitio de unión de antígeno. En la construcción de bibliotecas para utilizarse en la invención, la diversificación de las posiciones elegidas se logra típicamente en el nivel de ácido nucleico, al alterar la secuencia codificadora que especifica la secuencia del polipéptido de tal forma que un número de posibles aminoácidos (todos 20 o un subgrupo de los mismos) pueden incorporarse en esa posición. Utilizando la nomenclatura I UPAC, el codón más versátil es NNK, el cual codifica todos los aminoácidos así como también el codón de detención TAG. El codón NNK se utiliza preferentemente a fin de i ntroducir la diversidad requerida. Otros codones que l ogran los mismos extremos son también de uso, i ncluyendo el codón N NN , el cual conduce a la producción de los codones de detención adicionales TGA y TAA. Una característica de la diversidad de cadena lateral en el sitio de unión de antígeno de anticuerpos humanos es una derivación pronunciada que favorece ciertos residuos de ami noácido. Si la composición de aminoácido de las diez posiciones más diversas en cada una de las regiones VH, V? y V>. se suman , más de 76% de la diversidad de cadena única llega a ser de solamente siete diferentes residuos , estos siendo, seri na (24%) , tirosi na ( 14%) , asparagi na ( 1 1 %) , glici na (9%) , al ani na (7%) , aspartato (6%) y treonina (6%) . Esta derivación haci a los residuos hidrofílicos y los pequeños residuos que pueden proporci onar la flexibilidad de cadena principal probablemente refleja la evolución de las superficies que se predisponen a la unión de un amplio rango de antígenos o epítopos y pueden ayudar a explicar la promiscuidad requerida de anticuerpos en el repertorio primario. Ya que es preferible imitar esta distribución de aminoácidos , la distribución de aminoácidos en las posiciones a variar preferentemente imita aquella observada en el sitio de unión de antígeno de anticuerpos. Tal derivación en la sustitución de ami noáci dos que permite la selección de ciertos polipéptidos (no sólo polipéptidos de anticuerpo) contra un rango de antígenos objetivo se aplica fácilmente a cualquier repertorio de polipéptido. Existen varios métodos para derivar la distribución de ami noácido en la posición a variar (incluyendo el uso de mutagenesis de tri-nucleótido, ver WO 97/08320), de los cuales el método preferido, debido a la facilidad de síntesis, es el uso de codones degenerados convencionales. Al comparar el perfil de aminoácido codificado por todas las combinaciones de codones degenerados (con degeneración única, doble, triple y cuadruplo en relacione s iguales en cada posición) con el uso de aminoácido natural es posible calcular el codón más representativo. Los codones (AGT)(AGC)T , (AGT)(AGC)C y (AGT)(AGC)(CT) - es decir, DVT, DVC y DVY , respectivamente utilizsando nomenclatura I UPAC- son aquellos más cercanos al perfil de aminoácido deseado: codifican 22% de serina y 1 1 % de tirosina, asparagina, glicina, alanina, aspartato, treonina y cisteína. Preferentemente, por lo tanto, las bibliotecas se construyen utilizando el codón DVT, DVC o DVY en cada una de las posiciones diversificadas.

Ensayo de Citotoxicidad L929 Los antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, ligandos , monómeros dAb) pueden identificarse por la habilidad para i nhibi r la citotoxicidad inducida por TNF en fibroblastos de ratón L929 (Evans, T. (2000) Molecular Biotechnology 15, 243-248). En resumen, las células L929 laminadas en placas de microconcentración se incuban durante la noche con antagonista de TNFR1 , 100 pg/ml de TNF y 1 mg/ml de actinomicina D (Sigma, Poole, UK). Entonces la viabilidad celular se mide al leer la absorción a 490 nm siguiendo una incubación con 3-(4,5-di meti I ti azol -2-il )-5-(3-carboxi metoxi feni I )-2-(4-sulfof enil )-2-H-tetrazolio (Promega, Madison, USA). Los antagonistas de TNFR 1 inhibirán la citotoxicidad y por lo tanto producen un aumento en la absorción en comparación con TNF solamente control.

Ensayo HeLa I L-8 Los antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, monómeros dAb) pueden identificarse por la habilidad para inhibir la secreción inducida por TNF de I L-8 por células HeLa humanas (método adaptado de aquel de Akeson, L. ef al. (1996) Journal de Biological Chemistry 271 , 30517-30523, que describe la inducción de I L-8 por I L-1 en HUVEC; aquí observamos en inducción por alfa TNF humano y utilizamos células HeLa en lugar de estirpe de célula HUVEC). En resumen, las células HeLa pueden laminarse en placas de microconcentración se incubaron durante la noche con el antagonista de TNFR1 y 300 pg/ml de TNF. Post-incubación, el sobrenadante se aspira de las células y la concentración I L-8 se mide utilizando un ELISA intercalado ( R&D Systems), u otro método adecuado. Los antagonistas de TNFR 1 inhiben la secreción de I L-8, y menos I L-8 se detecta en el sobrenadante en comparación con el control de solamente TNF.

Ejemplos Ejemplo 1. Extensión de la vida media de suero de factor de necrosis tumoral (TN F) Los ratones transgénicos para TNF humano (Tg197) se administraron en grupos de 10 animales con dosis intraperitoneales semanales de dAbs anti-TNF que se habían reformateado como dímeros con un PEG ramificado 40k (denominado PEG TAR1 -5-19) o como una fusión con un dAb de al búmina de anti-suero (denominado trímero TAR1 -5-19/MSA) . La admi nistración de salina se utilizó como un control . Después de 7 semanas de administración de fármaco, el suero de los animales se analizó para circular los niveles TNF utilizando un equipo ELISA intercalado anti-TNF. Los animales administrados con sali na tuvieron un nivel de TNF circulante de 25.6 pg/ml mientras que los animales que reciben trímero TAR1 -5-19/MSA tuvieron niveles eleados a 2315pg/ml . Esto demuestra claramente que los dAbs con una vida media de suero extendida puede aumentar los niveles circulantes de una molécula con una vida media de suero corto tal como una citoquina y por lo tanto aumentar los niveles de suero.

Ejemplo 2. Extensión de la vida media de suero del receptor 1 de factor de necrosis tumoral soluble (sTN FRP. A los ratones CD1 se les administró una dosis intravenosa única 1 mg/kg de un dAb TNFR1 anti-ratón que se había reformateado (formatos de vida media extendidos) con ya sea un PEG ramificado 40k (denominado PEG anti-TNFR1 dAb) o como una fusión con un dAb de albúmina de anti-suero (denominado dímero anti-TNFR 1 /anti-SA). El suero se evaluó en diferentes puntos de tiempo para niveles de TNFR1 soluble utilizando un E LISA intercalado anti-TNFR1 según se detalla abajo.

Medición de TNFR1 Las inmunoplacas de parte inferior plana de 96 cavidades Maxisorp F96 (Nunc, No. de Catálogo: 439454) se revistieron con anticuerpo sTNF R1 /TNFRSF1 A anti-ratón (50 ul por cavidad a 1 ug/ml en PBS). Las placas se incubaron por 1 hr. a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con 200 ul de PBS. La unión no específica se bloqueó co n3% de BSA/PBS por 1 hr. a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con 200 ul de PBS/0.05% de Tween-20. Las diluciones de sTNF R1 de ratón recombinante (R&D Systems, # cat. 4254-R1 ) se prepararon en PBS/1 % de BSA a 5000ng mi' 1 , 500ng ml" 1 , 50ng mi' 1 y 5ng ml"1 y 50ul agregados a la cavidad. Alternativamente, el suero de ratones inmunizados con PEG ramificado TAR2m-21 -23/40K se preparó a 1 /5, 1 /50, 1 /500 y 1 /5000 diluciones en PBS/1 % de BSA y 50ul agregados a la cavidad. Las placas se incubaron a 1 hora, temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con 200 ul de PBS/0.05% de Tween-20. El anticuerpo sTNF R1 de anti-ratón biotinilado ( R&D Systems, # cat. AHFOI) se preparó en 1 ug/ml y 50ul agregados a la cavidad. Las placas se incubaron por 1 hora, temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con 200ul de PBS/0.05% de Tween-20. La anti-biotina de ratón monoclonal de fracción I gG conjugada por peroxidasa (Stratech, No. Cat. : 200-032-096) se preparó a 160ng ml-1 y 50 ul agregados a la cavidad. Las placas se incubaron por 1 hora, temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con 200ul de PBS/0.05% de Tween-20 después tres veces con PBS. El sustrato de peroxidasa de microcavidad de componente TM B-1 SureBlue (KPL, No. Cat. : 52-00-00) se agregó a todas las cavidades. La placa se incubó a temperatura ambiente por 15 minutos y la reacción se detuvo con 1 M de HCl . La absorción se leyó a 450 nM . Todas las muestras se ensayaron en duplicado. Las cavidades sin muestra se incluyeron. Los resultados OD para las diluciones 1/5 de suero de los ratones dosificados con el dAb anti-TNFR1 PEG se diagramaron contra el tiempo (Figura 1 ). Los resultados claramente muestran los niveles crecientes de TNFR1 en el suero antes de caer de regreso a los niveles básicos siguiendo la autorización del dAb.

Ejemplo 3 dAbs que unen las Moléculas de Receptor pero no Un@?p el Sitio de Unión. Este ejemplo ilustra un método para identificar dAbs que unen una molécula receptora deseada pero no unen el sitio activo del receptor. El procedimiento se ilustra utilizando el receptor de factor de necrosis tumoral 1 (TNFR1 ) , y es generalmente aplicable a las moléculas receptoras. Las moléculas receptoras quiméricas hechas de diferentes dominios TNFR1 murino y dominios TNFR1 humano (Banner DW, ef al. Cell, 75(3):431 -45 ( 1993).) de tal forma que la molécula contiene los cuatro dominios extracelulares definidos de TNFR 1 pero que estos varían en origen entre proteínas TNFR1 humana sy de ratón, se produjeron. Los receptores quiméricos producidos compartieron propiedades tanto de TNFR1 humano como TNFR 1 de ratón de acuerdo a los diferentes papeles de dominio y funcionalidad. Las moléculas proporcionaron un medio para la valoración de la especificidad de dominio de dAbs, anticuerpos y fragmentos de unión de antígeno del mismo y otras moléculas (por ejemplo, dominios de proteína tales como afficuerpos, dominios de receptor LDL, o dominios EGF) que unen TNFR1 humano o de ratón.

Métodos Las secuencias TNFR1 de ratón y humanas se clonaron previamente en el vector de expresión Pichia pPicZalpha (Invitrogen) por medio de los sitios de endonucleasa de restricción EcoRI y Notl El ADN de TNFR1 de ratón templado (y por consecuencia, las construcciones de receptor quimérico que terminan con un dominio 4 mupno) contuvieron una etiqueta 3' 6x histidina TNFR1 humano (y por consecuencia las construcciones de receptor quimérico que terminan con un dominio humano 4) contuvieron tanto etiquetas Myc como 6x Histidina en secuencia en el extremo 3' Los PCRs iniciales se realizaron de acuerdo a las condiciones de PCR estándares utilizando polimerasa de ADN RubyTaq (USB Corporation, Cniveland, Ohio), 100 ng de ADN templado (comprendiendo el templado minipreparado de ADN relevante ya sea de longitud completa mTNFRI o ADN hTNFRI ) Las reacciones de PCR típicas se establecieron como sigue 25 µl de 10X regulador PCR RubyTaq que contiene polimerasa, 2 µl de primer cebador (de 10 µM base), 2 µl de segundo cebador (de 10 µM base), 1 µl (100 ng) de ADN templado de longitud completa TNFR1 , 20 µl de dH2O (a un volumen final de 50 µl) Las reacciones se fijaron en tubos de pared delgada y se colocaron en un termociclador en donde la reacción se realizó de acuerdo a los siguientes parámetros Desnaturalización inicial | 3 minutos 94X Desnaturalización 30 segundos 94°C Amasamiento (25 ciclos) 30 segundos 55°C Extensión 1 minuto 72°C Extensión Final | 10 minutos 72°C Resumen de las reacc ones PCR inicia les utilizadas © r. la generación de construcciones quiméricas *Anotación: H = dominio Humano; M = dominio de ratón; por ejemplo, M HHH = Dominio 1 de ratón, dominios humanos 2-4. Los productos PCR generaron estos PCRs iniciales, se cortaron de 1 % de gel de agarosa y se purificaron utilizando un equipo de purificación de gel (Qiagen) antes de la elución en 50 µl de dH2O.

Cebadores utilizados para la generación de construcción de TNFR 1 Quimérico PCR SOE El ensamble de PCR (también conocido como "hal ar a través de" o Divi sión por Extensión de Recubrimiento SOE véase Gene, 75; 77( 1 ):61 -8 (1989)) permite a los productos de PCR primarios traerse junto con digestión o ligación, haciendo uso de los extremos complementarios de productos de PCR primarios. Durante este proceso los productos primarios se traen junto sy se desnaturalizan antes de que se sus extremos complementari os se permitan amasar juntos en la presencia de polimerasa de ADN Taq y dNTPs. Los diversos ciclos de amasamiento y extensión dan como resultado un relleno en los filamentos complementarios y la producción de un templado de longitud completa. Los cebadores que flanquean ahora el cásete de construcción de longitud completa se agregan y un PCR convencional se ejecutó para amplificar el producto instalado. Los PCRs de SOE se realizaron a fin de aminorar juntos y amplificar los diversos dominios de TNFR1 derivados de los PCRs iniciales anteriormente descritos . Los PCRs de SOE i nstalados se fijaron como sigue: 40 µl 1 0x regulador PCR conteniendo MgCI2; ~2 µl ( 100 ng) de producto l impio de PCR 1 i nicial; ~2 µl ( 100 ng) de producto limpio de PCR 2; 36 µl de dH2O (a volumen final de 80 µl) . La mezcla de cebador SOE se agregó después de la etapa de instalación como sigue: 2 µl de cebador de flanqueo 5' (Cebador 1 ); 2 µl de cebador de flanqueo 3" (Cebador 2) ; 10 µl 1 0x regulador PCR; 6 µl de dH2O (a vol umen fi nal 20 µl) . Las reacciones PCR se realizaron utilizando el programa anteriormente descrito. Los ciclos de instalación iniciales requirieron aproximadamente 45 minutos de los cuales el termociclador se fijo a pausa a 94°C. 20 µl de mezcla de cebador se agregó a cada reacción y se mezcló. Condiciones de Instalación Condiciones de amplificación (Pausa a 94°C, mezcla de cebadores agregada después) Los productos PCR se revisaron al ejecutar 3-5 µl de cada reacción en un 1 % de gel de agarosa.

Clonación de quimeras TNFR1 instaladas en el vector de expresión Pichia. El vector pPicZalpha (Invitrogen) se ingirió secuencialmente con enzimas EcoRI y Notl antes de la purificación de columna de filtración de gel Chromaspina TE-1000 (Clontech, Mountain View, CA) .

Transformación de construcciones quiméricas de TNFR1 en E. coli Las construcciones quiméricas ligadas se transformaron en células E. coli electrocompetentes HB2151 y se recuperaron por una hora en medio LB bajo para laminarse en ágar LB bajo en sal con 0.25 µg/ml de ZEOCIN, formulación de antibiótico que contiene Pleomicina D (Cayla, Toulouse, Francia) por 24 hrs. a 37°C. Las colonicas individuales se verificaron así por secuencia para asegurar la secuencia correcta de la construcción quimérica dentro del vector de expresión y las preparaciones de plásmido Maxiprep a gran escala hechas de cada vector de construcción quimérica. Las secuencias de nucleótido de construcciones quiméricas preparadas se presentan abajo. Las construcciones quiméricas se nombraron de acuerdo al origen de sus dominios (ejecutándose de Dominio 1 en la izquierda a Dominio 4 en el derecho). Por ejemplo, HMMM contiene Dominio 1 humano y Dominios 2-4 de ratón. Las proteínas quiméricas que contienen dominio 4 de ratón tienen solamente etiquetas Hag y carecen de la región separadora entre la región de transmembrana y Dominio 4. HMMM AGTGTGTGTCCCCAAGGAAAATATATCCACCCTCAAAATAATTCGATTTGCTGTACCAAGT GCCACAAAGGAACCTACTTGTACAATGACTGTCCAGGCCCGGGGCAGGATACGGACTGCAG GGAGTGTGAAAAGGGCACCTTTACGGCTTCCCAGAATTACCTCAGGCAGTGCCTCAGTTGC AAGACATGTCGGAAAGAAATGTCCCAGGTGGAGATCTCTCCTTGCCAAGCTGACAAGGACA CGGTGTGTGGCTGTAAGGAGAACCAGTTCCAACGCTACCTGAGTGAGACACACTTCCAGTG CGTGGACTGCAGCCCCTGCTTCAACGGCACCGTGACAATCCCCTGTAAGGAGACTCAGAAC ACCGTGTGTAACTGCCATGCAGGGTTCTTTCTGAGAGAAAGTGAGTGCGTCCCTTGCAGCC ACTGCAAGAAAAATGAGGAGTGTATGAAGTTGTGCCTAAGCGCTCATCATCATCATCATCA TTAATGA (SEQ ID NO:19) HHHM AGTGTGTGTCCCCAAGGAAAATATATCCACCCTCAAAATAATTCGATTTGCTGTACCAAGT GCCACAAAGGAACCTACTTGTACAATGACTGTCCAGGCCCGGGGCAGGATACGGACTGCAG GGAGTGTGAGAGCGGCTCCTTCACCGCTTCAGAAAACCACCTCAGACACTGCCTCAGCTGC TCCAAATGCCGAAAGGAAATGGGTCAGGTGGAGATCTCTTCTTGCACAGTGGACCGGGACA CCGTGTGTGGCTGCAGGAAGAACCAGTACCGGCATTATTGGAGTGAAAACCTTTTCCAGTG CTTCAATTGCAGCCTCTGCCTCAATGGGACCGTGCACCTCTCCTGCCAGGAGAAACAGAAC ACCGTGTGCACCTGCCATGCAGGGTTCTTTCTGAGAGAAAGTGAGTGCGTCCCTTGCAGCC ACTGCAAGAAAAATGAGGAGTGTATGAAGTTGTGCCTAAGCGCTCATCATCATCATCATCA TTAATGA (SEQ ID NO:20) HHMH AGTGTGTGTCCCCAAGGAAAATATATCCACCCTCAAAATAATTCGATTTGCTGTACCAAGT GCCACAAAGGAACCTACTTGTACAATGACTGTCCAGGCCCGGGGCAGGATACGGACTGCAG GGAGTGTGAGAGCGGCTCCTTCACCGCTTCAGAAAACCACCTCAGACACTGCCTCAGCTGC TCCAAATGCCGAAAGGAAATGGGTCAGGTGGAGATCTCTTCTTGCACAGTGGACCGGGACA CCGTGTGTGGCTGTAAGGAGAACCAGTTCCAACGCTACCTGAGTGAGACACACTTCCAGTG CGTGGACTGCAGCCCCTGCTTCAACGGCACCGTGACAATCCCCTGTAAGGAGACTCAGAAC ACCGTGTGTAACTGCCATGCAGGTTTCTTTCTAAGAGAAAACGAGTGTGTCTCCTGTAGTA ACTGTAAGAAAAGCCTGGAGTGCACGAAGTTGTGCCTACCCCAGATTGAGAATGTTAAGGG CACTGAGGACTCAGGCACCACAGCGGCCGCCAGCTTTCTAGAACAAAAACTCATCTCAGAA GAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGA (SEQ ID NO:21) HMHH AGTGTGTGTCCCCAAGGAAAATATATCCACCCTCAAAATAATTCGATTTGCTGTACCAAGT GCCACAAAGGAACCTACTTGTACAATGACTGTCCAGGCCCGGGGCAGGATACGGACTGCAG GGAGTGTGAAAAGGGCACCTTTACGGCTTCCCAGAATTACCTCAGGCAGTGTCTCAGTTGC AAGACATGTCGGAAAGAAATGTCCCAGGTGGAGATCTCTCCTTGCCAAGCTGACAAGGACA CGGTGTGTGGCTGCAGGAAGAACCAGTACCGGCATTATTGGAGTGAAAACCTTTTCCAGTG CTTCAATTGCAGCCTCTGCCTCAATGGGACCGTGCACCTCTCCTGCCAGGAGAAACAGAAC ACCGTGTGCACCTGCCATGCAGGTTTCTTTCTAAGAGAAAACGAGTGTGTCTCCTGTAGTA ACTGTAAGAAAAGCCTGGAGTGCACGAAGTTGTGCCTACCCCAGATTGAGAATGTTAAGGG CACTGAGGACTCAGGCACCACAGCGGCCGCCAGCTTTCTAGAACAAAAACTCATCTCAGAA GAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGA (SEQ ID NO:22) MHHH AGCTTGTGTCCCCAAGGAAAGTATGTCCATTCTAAGAACAATTCCATCTGCTGCACCAAGT GCCACAAAGGAACCTACTTGGTGAGTGACTGTCCGAGCCCAGGGCGGGATACAGTCTGCAG GGAGTGTGAGAGCGGCTCCTTCACCGCTTCAGAAAACCACCTCAGACACTGCCTCAGCTGC TCCAAATGCCGAAAGGAAATGGGTCAGGTGGAGATCTCTTCTTGCACAGTGGACCGGGACA CCGTGTGTGGCTGCAGGAAGAACCAGTACCGGCATTATTGGAGTGAAAACCTTTTCCAGTG CTTCAATTGCAGCCTCTGCCTCAATGGGACCGTGCACCTCTCCTGCCAGGAGAAACAGAAC ACCGTGTGCACCTGCCATGCAGGTTTCTTTCTAAGAGAAAACGAGTGTGTCTCCTGTAGTA ACTGTAAGAAAAGCCTGGAGTGCACGAAGTTGTGCCTACCCCAGATTGAGAATGTTAAGGG CACTGAGGACTCAGGCACCACAGCGGCCGCCAGCTTTCTAGAACAAAAACTCATCTCAGAA GAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGA (SEQ ID NO:23) Preparación de construcción quimérica TNFR1 y transformación en Pichia pastoris. El ADN plásmido generado por cada maxiprep se ingirió con la endonucleasa de restricción de corte infrecuente Pmel a fin de linearizar el ADN antes de la transformación pichia. El ADN linearizado se limpió subsecuentemente por la extracción de fenol/cloroformo y precipitación de etanol, antes de la resuspensión en 30 µl de dH2O. 10 µl de la solución de ADN linearizada se mezcló con 80 µl de células Pichia KM71H electro-competentes por 5 minutos antes de la electroporación a 1.5kV, 200? , 25 µF. Las células se recuperaron inmediatamente con YPDS y se incubaron por 2 horas a 30°C antes del laminado en placas ágar Y PDS conteniendo 100 µg/ml de ZEOCI N, formulación antibiótica que contiene Fleomicin D (Cayla, Toulouse, Francia) , por 2 días.

Expresión de construcciones en Pichia Una colonia de transformante individual para cada construcción se colectó en 5 ml de BMGY como un cultivo iniciador y creció por 24 hrs. a 30°C. Este cultivo se utilizó para inocular 500 ml de medio BMGY que creció por 24 hrs. a 30°C antes de que las células se colectaran por centrifugación a 1500-3000 g por 5 minutos a temp. ambiente. Las células se volvieron a suspender en 100 ml de BM MY y crecieron por 4 días con aumentos graduados en concentración de metanol (0.5% día 1 , 1 % día 2, 1 .5% día 3 y 2% día 4). Después el sobrenadante de expresión se recubrió después de la centrifugación de los cultivos de 3300 g por 15 minutos.

Purificación de construcciones quiméricas TNFR1 utilizando resina Níquel . Los sobrenadantes de cultivo se regularon inicialmente a través de la adición de 10 mM de concentración final de imidazol y 2x PBS . La proteína con etiqueta His se absorbió por grupo por 4 horas (agitación) a temperatura ambiente a través de la adición de resina Níquel-NTA. La mezcla de sobrenadante/resina se fluyó así en una columna poli-prep (Biorad). La resina se lavó así con 10 volúmenes de columna de 2xPBS antes de la elución utilizando 250 mM de imidazol 1x PBS. Después del intercambio de regulador la expresión de construcción quimérica se deglicosilató utilizando la deglicosilasa EndoH antes de la verificación por SDS-PAGE.

Secuencias de ADN templado utilizadas durante PCR TNFR1 Humano (Homo sapiens) (región extracelular acceso Genbank 33991418) CTGGTCCCTCACCTAGGGGACAGGGAGAAGAGAGATAGTGTGTGTCCCCAAGG AAAATATATCCACCCTCAAAATAATTCGATTTGCTGTACCAAGTGCCACAAAGG AACCTACTTGTACAATGACTGTCCAGGCCCGGGGCAGGATACGGACTGCAGGG AGTGTGAGAGCGGCTCCTTCACCGCTTCAGAAAACCACCTCAGACACTGCCTCA GCTGCTCCAAATGCCGAAAGGAAATGGGTCAGGTGGAGATCTCTTCTTGCACAG TGGACCGGGACACCGTGTGTGGCTGCAGGAAGAACCAGTACCGGCATTATTGG AGTGAAAACCTTTTCCAGTGCTTCAATTGCAGCCTCTGCCTCAATGGGACCGTG CACCTCTCCTGCCAGGAGAAACAGAACACCGTGTGCACCTGCCATGCAGGTTTC TTTCTAAGAGAAAACGAGTGTGTCTCCTGTAGTAACTGTAAGAAAAGCCTGGAG TGCACGAAGTTGTGCCTACCCCAGATTGAGAATGTTAAGGGCACTGAGGACTCA GGCACCACA (SEQ ID NO:1) La región extracelular codificada de TNFR1 humano tiene la siguiente secuencia de aminoácido. LVPHLGDREKRDSVCPQGKYIHPQNNSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGQDTDCRECE SGSFTASENHLRHCLSCSKCRKEMGQVEISSCTVDRDTVCGCRKNQYRHYWSENLF QCFNCSLCLNGTVHLSCQEKQNTVCTCHAGFFLRENECVSCSNCKKSLECTK1CLP QIENVKGTEDSGTT (SEQ ID NO:2) Murino (Mus musculus) TNFR1 (región extracelular acceso Genbank 31560798) CTAGTCCCTTCTCTTGGTGACCGGGAGAAGAGGGATAGCTTGTGTCCCCAAGGA AAGTATGTCCATTCTAAGAACAATTCCATCTGCTGCACCAAGTGCCACAAAGGA ACCTACTTGGTGAGTGACTGTCCGAGCCCAGGGCGGGATACAGTCTGCAGGGA GTGTGAAAAGGGCACCTTTACGGCTTCCCAGAATTACCTCAGGCAGTGTCTCAG TTGCAAGACATGTCGGAAAGAAATGTCCCAGGTGGAGATCTCTCCTTGCCAAGC TGACAAGGACACGGTGTGTGGCTGTAAGGAGAACCAGTTCCAACGCTACCTGA GTGAGACACACTTCCAGTGCGTGGACTGCAGCCCCTGCTTCAACGGCACCGTGA CAATCCCCTGTAAGGAGACTCAGAACACCGTGTGTAACTGCCATGCAGGGTTCT TTCTGAGAGAAAGTGAGTGCGTCCCTTGCAGCCACTGCAAGAAAAATGAGGAG TGTATGAAGTTGTGCCTACCTCCTCCGCTTGCAAATGTCACAAACCCCCAGGAC TCAGGTACTGCG (SEQ ID NO:3) La región extracelular codificada de murino (Mus musculus) TNFR1 tiene la siguiente secuencia de aminoácido. LVPSLGDREKRDSLCPQGKYVHSKNNSICCTKCHKGTYLVSDCPSPGRDTVCRJECE KGTFTASQNYLRQCLSCKTCRKEMSQVEISPCQADKDTVCGCKENQFQRYLSETHF QCVDCSPCFNGTVTIPCKETQNTVCNCHAGFFLRESECVPCSHCKKNEEC K1CLP PPLANVTNPQDSGTA (SEQ ID NO:4) Especificidad de Dominio de dAbs anti-TNFR1 La especificidad de dominio de dAbs anti-TNFR1 se determinó utilizando la resonancia de plasmón de superficie (SPR) ('Detection de immuno-complex formation via resonancia de plasmón de superficie on gold-coated diffraction gratings.' Biosensors. 1987- 88;3(4):211-25.) para determinar la habilidad de anticuerpos para unir TNFR1 biotinilado de ratón o completamente humano que se inmovilizó en una superficie de chip SPR, después de que los anticuerpos se habían incubado y equilibrado con un exceso de los receptores quiméricos anteriormente descritos. En este ensayo, el flujo de un dAb anti-TNFR1 sobre la superficie TNFR1 genera una señal SPR indicadora de la cantidad de dAb que une el TNFR1 inmovilizado sobre el chip SPR. Si el dAb se pre-incuba y equilibra con una molécula quimérica que comprende el (los) dominio (s) de TNFR1 que el dAb particular une, entonces el flujo de esta mezcla sobre la superficie de TNFR1 producirá una señal SPR más pequeña en relación al dAb solo. Sin embargo, si el dAb se pre-incuba y se equilibra con una molécula quimérica que no comprende el (los) dominio (s) de TNFR1 que el dAb particular une, entonces el flujo de esta mezcla sobre la superficie de TNFR1 producirá una señal SPR que es aproximadamente la misma que la señal obtenida durante el dAb solo.

Método Generación de una superficie TN FR1 de chip SPR La elección de superficie de TNFR1 se determina por la especificidad de especia del dAb anti-TNFR1 a probar. Por lo tanto, los dAbs de TNFR1 anti-humano se evaluaron utilizando una superficie revestida TNFR1 humano y los dAbs TNFR1 de antiratón se evaluaron utilizando un chip revestido con TNFR 1 de ratón. El TNFR1 biotinilado se diluyó en el regulador SPR adecuado y se ejecuta a través de un chip sensor de estreptavidina (SA) en un instrumento SPR BIACORE 3000 (Biacore International AB, Uppsala, Suiza) . Una velocidad de bajo flujo (5-10 µl/minuto) se utilizó a fin de maximizar el tiempo de contacto entre el TNFR1 bioti nilado y la superficie de estreptavidina. El flujo continúo hasta que la superficie de estraptividina se saturó con material biotinilado, a fin de generar un chip con superficie de TNFR 1 máximo. El chip típicamente unió varias cientos a varios miles de unidades de respuesta de SPR del material biotinilado.

Concentración de una respuesta anti-TNFR1 en el chip SPR Un experimento de competencia exitosa requiere l a optimización inicial de la concentración de dAb antí-TNFR1 de tal forma que la cantidad mínima de dAb se fluye sobre la superficie que da una señal de SPR importante. Dentro de un cierto rango de concentración, el dAb unirá la superficie en una manera dependiente de dosis de tal forma que el número de RUs de dAb unido reflejan la concentración de dAb fluido a través de la superficie de chip. A fin de lograr el rango de concentración de esta dependencia de dosis, los dAbs anti-TNFR 1 se concentraron en una serie de dilución de 10 veces de regulador Biacore variando de 1 en 10 dilución a 1 en 1 ,000,000 de dilución. Las diluciones se inyectaron así individualmente y secuencialmente a través de la superficie de chip de TNFR1 , comenzando con la muestra más diluida. El número máximo de RUs logrado en cada dilución se midierion. Después de cada inyección la superficie de TNFR 1 se regeneró para remover el dAb anti-TNFR1 unido en donde era necesario utilizando un regulador de regeneración de SPR adecuado. Utilizando este método la concentración máxima de dAb anti-TNFR1 requerido para generar una señal que representa aproximadamente 100RU se determinó. Pre-equilibrio de dAbs/quiméricos anti-TNFR1 Una vez que la concentración de dAb anti-TNFR1 óptimo se determinó, las mezclas de TNFR1 de dAb/quimérico anti-TNFR1 se fijaron. Las mezclas se fijaron de tal forma que la concentración final de dAb anti-TNFR1 fue idéntica a la concentración óptima determinada previamente. Las reacciones se fijaron típicamente en 100 µl volúmenes que contienen 50 microlitros de un concentrado 2 x de dAb anti-TNFR1, 40 microlitros de regulador biacor y 10 microlitros de proteína quimérica purificada neta. Las concentraciones típicas para la mezcla final fueron aproximadamente 10-100 µM de proteína quimérica y aproximadamente 10-100 nM de dAb anti-TNFR1. Las mezclas de dejaron equilibrar por 30 minutos a temperatura ambiente.

Experimento Biacore de Competencia Después del equilibrio, cada mezcla de TNFR1 dAb anti-TNFR1/quimérico se ejecutó secuencialmente sobre la superficie SPR de TNFR1 y el número de unidades de respuesta se midió. Después de que cada mezcla se inyectó, la superficie se regeneró para remover el dAb anti-TNFR1 unido antes de que se inyectara la siguiente mezcla. Las diferentes respuestas generadas utilizando los diferentes quiméricos permitieron la determinación de los dominios TNFR1 unidos por dAbs particular. Estos estudios revelaron que TAR2m-21-23 une el Dominio 1 de TNFR1 de ratón, y que TAR2h-205 une el Dominio 1 de TNFR1 humano. TAR2m-21 -23 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFN-RYSMG-WLRQAPGKG LEWVS— R ID SYGRGTYYEDPVKG-R FSISR D NSKNTLYLQMN SLRAEDTAV?YCAK 1 SQ FG SNA FDY WGQGTQVTVSS ( S EQ I D NO : 24) TAR2h-205 EVQ LLESGGG LVQPGGSLR LSCA?SGFTFV~KYSMG~WVRQA PGKGLEWVS~~QI S NTGGHTYYADSVKG— R FTISRDNSKNTLYLQ N SLRAEDTAVYYCAK YTGRW EP F DY WGQGTLVTVSS (SEQ I D NO:25) En las secuencias de aminoácido de TAR2M-21 -23 y TAR2h-205 CDR1 se flanquea por ~, CDR2 se flanquea por — , y CDR3 se flanquea por ~ — . Las secuencias de aminoácidos presentadas son continuas sin aberturas.

Ejemplo 4. Métodos de Selección Las proteínas de receptor quimérico tales como proteínas TNFR1 quimérico descritas en la presente pueden utilizarse en ensayos o selecciones para aislar agentes (por ejemplo, anticuerpos, dAbs) que se unen a dominios particulares dentro de un receptor deseado. Utilizando TNFR1 como un modelo para una proteina de receptor deseado, estos métodos describen la adición de proteínas quiméricas a preparaciones de anticuerpo crudosantes de su selección para la unión de receptor ya sea por ELISA o resonancia de plasmón de superficie. Adicionalmente, describen el uso de proteínas quiméricas revestidas sobre una superficie (por ejemplo, placa ELISA o chip SPR) y la selección de anticuerpos a través de prueba de su unión a proteínas quiméricas en esta superficie. Los métodos similares pueden utilizarse para identificar los agentes (por ejemplo, anticuerpos, dAbs) que se unen a dominios deseados (por ejemplo, fuera del sitio activo) de otros receptores.

Selección de ELI SA Soluble Este método puede utilizarse para aislar rápidamente los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, dAbs) que unen dominios específicos de TNFR1 de un gran repertorio de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de especificidad desconocida. Una placa de ensayo de 96 cavidades se revestirá durante la noche a 4°C con 100 µl por cavidad de TNFR1 quimérico. Las cavidades se lavaron 3 veces con 0.1 % de TPBS (sali na regulada por fosfato conteniendo Tween-20 a una concentración de 0.1 %). 200 µl por cavidad de 1 % de TPBS se agregará para bloquear la placa, y la placa se incubó 1 -2 horas a temperatura ambiente. Las cavidades se lavarán así 3 veces con PBS antes de la adición de 50 µl de sobrenadante bacteriano o periprep, conteniendo el anticuerpo soluble o fragmento de anticuerpo (que contienen la etiqueta de epítopo c-Myc), en 50 µl de 0.2% de TPBS. La placa se incubará así por 1 hora a temperatura ambiente. Después de que esta placa se lavará 5 veces con 0.1 % de TPBS (0.1 % de Tween-20 en PBS). 100 µl de un monoclonal de ratón anti-c-Myc primario se agregará así en 0.1 % de TPBS a cada cavidad y la placa se incubará por 1 hora a temperatura ambiente. Esta solución de anticuerpo primaria se descartará y la placa se lavará así 5 veces con 0.1 % de TPBS. 100 µl de conjugado HRP de IgG de anti-ratón prediluido (específico Fe) de cabra se agregará así (Sigma No. De Cat. A0168) y la placa se incubará por 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo secundario se descartará así y la placa se lavará 6 veces con 0.1 % de TPBS seguido por 2 lavados con PBS. 50 µl de solución de peroxidasa de TM B se agregará así a cada cavidad y la placa se dejará así a temperatura ambiente por 2-60 minutos. La reacción se detectará por la adición de 50 µl de 1 M de ácido hidroclórico. La OD a 450 nm de la placa se leerá en un lector de placas de 96 cavidades dentro de 30 minutos de adición acida. Aquellos anticuerpos presentes en sobrenadante bacteriano crudo o peripreps que unen los dominios de TN FR1 presentes dentro de la proteína quimérica darán una señal ELISA más fuerte que aquellas que no.

Ensayo ELI SA Competitiva Este método puede utilizarse para seleccionar rápidamente un grupo diverso de anticuerpo crudo o preparaciones de fragmento de anticuerpo que unen TNFR1 a fin de determinar su especificidad de unión de dominio. Una placa de ensayo de 96 cavidades se revestirá durante la noche a 4°C con 100 µl por cavidad de TNFR1 humano o murino (ya sea humano o de ratón). Las cavidades se lavarán 3 veces con 0.1 % de TPBS (salina regulada por fosfato que contiene Tween 20 a una concentración de 0.1 %). 200 µl por cavidad de 1 % de TPBS ( 1 % de Tween-20 en PBS) se agregará para bloquear la placa, y la placa se incubó por 1 -2 horas a temperatura ambiente. Las cavidades se lavaran así 3 veces con PBS . Al mismo tiempo los sobrenadantes bacterianos o peripreps se pre-equilibrarán con una concentración pre-optimizada de proteína TNFR1 quimérica en solución. 50 µl de esta preparación bacteriana cruda/mezcla de proteína quimérica, conteniendo el anticuerpo soluble o fragmento de anticuerpo se agregará así a la placa ELISA. La placa se incubará por 1 hora a temperatura ambiente. Después, la placa se lavará 5 veces con 0.1 % de TPBS (0.1 % de Tween-20 en PBS), y 100 µl de un anticuerpo de detección primaria (o Proteína A-HRP o Proteína L HRP) se agregará en 0.1 % de TPBS, a cada cavidad y la placa se incubará por 1 hora a temperatura ambiente. Esta solución de anticuerpo primaria se descartará y la placa se lavará 5 veces con 0.1 % de TPBS. Si se requiere 100 µl de un conjugado HRP/anticuerpo secundario prediluido de cabra se agregará así, y la placa se incubará por 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo secundario se descartará así y la placa se lavará 6 veces con 0.1 % de TPBS seguido por 2 lavados con PBS. 50 µl de sol ución de peroxidasa TM B se agregará a cada cavidad y la placa se dejara a temperatura ambiente por 2-60 minutos. La reacción se detendrá por la adición de 50 µl de 1 M de ácido clorhídrico. La OD a 450 nm de la placa se leerá en un lector de placas de 96 cavidades dentro de 30 minutos de adición acida. Una reducción en señal ELISA será indicadora de la unión de anticuerpo de los dominios de TNFR 1 quimérico en lugar de TNFR1 completo revestidos en la placa, y por lo tanto, que el anticuerpo una de los dominios dentro de la proteína quimérica.

Ensayo De ELISA Competitiva Para Anticuerpos Y Fragmentos De Anticuerpo Que Compiten Con Un Anticuerpo De Referencia O Fragmento De Anticuerpo Para Unión A TNFR1 Este método puede utilizarse para seleccionar rápidamente diversos grupos de anticuerpo crudo o preparaciones de fragmento de anticuerpo que unen TNFR1 para aquellos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que compiten con un anticuerpo de referencia o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, TAR2m-21 -23) para unirse a TNFR1 o unir un dominio deseado de TNFR1 (por ejemplo, dominio 1 ). El método utiliza un anticuerpo de referencia o fragmento de anticuerpo y anticuerpo de prueba o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, una población de anticuerpos a seleccionar) que contienen diferentes etiquetas detectables (etiquetas epítopos). Una placa de ensayo de 96 cavidades se revestirá durante la noche a 4°C con 100 µl por cavidad de TNFR1 humano o murino. Las cavidades se lavarán 3 veces con 0.1 % de TPBS (salina regulada por fosfato que contiene Tween 20 a una concentración de 0.1 %). 200 µl por cavidad de 1 % de TPBS ( 1 % de Tween-20 en PBS) se agregará para bloquear la placa, y la placa se incubó por 1 -2 horas a temperatura ambiente. Las cavidades se lavaran así 3 veces con PBS. Al mismo tiempo las preparaciones de anticuerpo crudo a probar se mezclarán con una concentración pre-optimizada de anticuerpo de referencia o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo de unión de dominio 1 ; TAR2m-21 -23) en solución. Según ya se establece es importante que este anticuerpo no incluya las mismas etiquetas de detección como presentes en los anticuerpos se seleccionan para la especificidad de unión de dominio. 50 µl de esta preparación bacteriana cruda/mezcla de proteina quimérica, se agregará así a la placa ELISA. La placa se incubará por 1 hora a temperatura ambiente. Después, la placa se lavará 5 veces con 0.1 % de TPBS, 100 µl de un anticuerpo de detección primaria (que une la etiqueta presente solamente en la población de anticuerpo que se selecciona) se agregará en 0.1 % de TPBS a cada cavidad y la placa se incubará por 1 hora a temperatura ambiente. Esta solución de anticuerpo primaria se descartará y la placa se lavará 5 veces con 0.1 % de TPBS. 100 µl de un conjugado HRP/anticuerpo secundario que reconoce el anticuerpo de detección primaria se agregará así, y la placa se i ncubará por 1 hora a temperatura ambiente. La solución de anticuerpo secundario se descartará así y la placa se lavará 6 veces con 0.1 % de TPBS seguido por 2 lavados con PBS. 50 µl de solución de peroxidasa TMB se agregará a cada cavidad y la placa se dejara a temperatura ambiente por 2-60 minutos La reacción se detendrá por la adición de 50 µl de 1 M de ácido clorhídrico La OD a 450 nm de la placa se leerá en un lector de placas de 96 cavidades dentro de 30 minutos de adición acida Un ELI SA preparado y separado utilizando este método pero si n la adición del anticuerpo de referencia o fragmento de anticuerpo deberá hacerse en paralelo Una reducción en señal de ELISA en la presencia de anticuerpo de referencia o fragmento de anticuerpo, en comparación a la señal ELISA para la misma preparación de anticuerpo sin competir el anticuerpo de referencia o fragmento de anticuerpo, será indicadora de que el anticuerpo particular o fragmento de anticuerpo compite con el anticuerpo de referencia o fragmento de anticuerpo para unirse a TNFR 1 , y une el mismo dominio de TNFR 1 como el anticuerpo de referencia o fragmento de anticuerpo Selección SPR Los métodos ELISA anteriormente descritos pueden adaptarse fácilmente a un formato que utiliza la resonancia de plasmón de superficie, por ejemplo, utilizando un instrumento SPR BIACORE 3000 (Biacore International AB, Uppsala, Suiza) General mente, la proteína quimérica se equilibrará con sobrenadante bacteriano crudo contenido anticuerpos ant?-TN FR 1 o fragmentos de anticuerpo, y la mezcla resultante fluyó sobre un chi p SPR revestido con TNFR1 humano de longitud completa o TNFR1 murino.

Ejemplo 5. PEGilación de dAbs Los efectos de PEGilación de dAbs en la habilidad de los dAbs para unir TNFR1 en un ensayo de unión de receptor libre de célula y para inhibir la función de TNFR1 en la superficie de cél ulas en un ensayo basado en célula se estudió.

Ensayo de célula Ensayo de liberación I L-8 M RC-5 Las actividades de ciertos dAbs que unen TNFR1 humano se valoraron en el siguiente ensayo de célula M RC-5. El ensayo se basa en la inducción de secreción I L-8 por TNF en células M RC-5 y se adapta del método descrito en Alceson, L. ef al. Journal of Biological Chemistry 27.7: 30517-30523 ( 1996), que descri be la inducción de I L-8 por I L-1 en HUVEC. La actividad de los dAbs se ensayó al valorar la inducción de I L-8 por TNFa humano utilizando células M RC-5 en lugar de la estirpe de célula HUVEC. En resumen, las células MRC-5 se laminaron en placas de microconcentración y las placas se incubaron durante la noche con dAb y TNFa humano (300 pg/ml). Siguiendo la incubación, el sobrenadante de cultivo se aspiró y la concentración de I L-8 en el sobrenadante se midió por medio de un ELISA intercalado (R&D Systems). La actividad de dAb anti-TNFR1 dio como resultado una reducción en la secreción de I L-8 en el sobrenadante en comparación con las cavidades de control que se incubaron con TNFa solo Ensayo de Unión de Receptor Los dAbs de anti-TNF se probaron para la habilidad para unir la unión de TNF a receptor de TNF recombinante 1 (p55) En resumen, las placas de Maxisorp se incubaron durante la noche con 30 mg/ml de anticuerpo monoclonal de ratón Fe anti-humano (Zymed, San Francisco, USA) Las cavidades se lavaron con salina regulada por fosfato (PBS) conteniendo 005% de Tween-20 y después se bloquearon con 1% de BSA en PBS antes de incubarse con 100 ng/ml de receptor TNF 1 proteína de fusión Fe (R&D Systems, Mmneapohs, USA) El dAb anti-TNF se mezcló con TNF que se agregó a las cavidades lavadas a una concentración final de 10 ng/ml La unión de TNF se detectó con 02 mg/ml de anticuerpo anti-TNF biotinilado ((HyCult biotechnology, Uben, Países Bajos) seguido por 1 en 500 de dilución de estreptavidina marcada con peroxidasa de rábano picante (Amersham Biosciences, UK) y después la incubación con sustrato TMB (KPL, Gaithersburg, USA) La reacción se detuvo por la adición de HCl y la absorción se leyó a 450 nm La actividad de dAb anti-TNF condujo a una reducción en unión de TNF y por lo tanto una reducción en absorción en comparación con el control único de TNF Los efectos comparativos de dAbs PEGilación en TNFR1 de superficie de célula se ilustran en los datos presentados en la Tabla 5. Tabla 5 El ensayo de unión de receptor (RBA), que utiliza una forma recombinante de receptor, conteniendo solamente la parte extracelular del receptor en un formato de ensayo basado en no célula, se muestra en la izquierda, y en donde los efectos de PEGilación son mínimos y en el caso de 5K PEG, no se observó diferencia en la unión. En contraste, según se observa en los datos obtenidos en el ensayo de célula, PEGilación de dAbs sustancialmente redujo la efectividad de los dAbs en el ensayo. En algunos casos, la efectividad con reducción hasta a un factor de 33 veces. Los datos colectados en el ensayo de cultivo basado en célula en donde se basó en la habilidad de los dAbs para bloquear la actividad de receptor a la superficie celular. Los resultados del estudio muestran que la PEGilación de dAs tuvieron un efecto mucho más grande en la habilidad de los dAbs para inhibir la función de TNFR1 sobre la superficie celular que en la habilidad para unir TNFR1 en un ensayo libre de cél ula.

Ejemplo 6. dAbs Que Unen Las Moléculas Combatientes Endógenas Pero No Unen El Sitio De Unión. Este ejemplo ilustra un método para identificar los dAbs que unen una molécula combatiente endógena deseada pero no unen el sitio activo del combatiente endógeno. El procedimiento se ilustra utilizando eritropoyetina (epo), y es generalmente aplicables los combatientes endógenos. Los anticuerpos de dominio que unen EPO pueden identificarse y aislarse utilizando cualquier método de selección adecuado. Una estirpe de célula que expresa el receptor E PO recombinante y que es dependiente de los factores hemoatopoyéticos para crecimiento puede utilizarse en un ensayo para identificar los dAbs que unen EPO pero no se unen en el sitio activo, y por lo tanto no previenen la unión de EPO al receptor de EPO. Por ejemplo, las células Ba/F3, que es una estirpe de célula dependiente de I L-3 murino que se ha transfectado con receptor de EPO humano y supera el crecimiento epo-dependiente, puede utilizarse. (D'Andrea et al. , Blood 82:46-52 ( 1993). Las células Ba/F3 pueden cultivarse en un plato de cultivo adecuado, tal como PBS. Las células pueden cultivarse así por aproximadamente 48 horas en medio de cultivo que contiene EPO. Los anticuerpos de dominio a ensayar pueden agregarse a cultivos individuales (por ejemplo, cavidades individuales de una placa de ensayo de cultivo celular adecuado). Después de aproximadamente 48 horas, la proliferación celular puede ensayarse utilizando cualquier método adecuado, tal como el ensayo de reducción de bromuro de difenil-tetrazoho dimetiltiazol (MTT) Una falta de inhibición de proliferación de célula es de cavidades que contienen un dAb en relación a las cavidades de control que contienen medio de cultivo pero ningún dAb indicará que el dAb no une el sitio activo de epo Todas las publicaciones mencionadas en la presente especificación, y las referencias citadas en dichas publicaciones, se incorporan en la presente para referencia Varias modificaciones y variaciones de los métodos y sistema de la invención descritos serán aparentes para aquellos expertos en la materia sin alejarse del alcance y espíritu de la invención A pesar de que la invención se ha descrito en relación con las modalidades preferidas específicas, deberá entenderse que la invención según se reivindica no deberá limitarse indebidamente a tales modalidades específicas A su vez, varias modificaciones de los modos para llevar a cabo la invención, descritos, los cuales son obvios para aquellos expertos en la biología molecular o campos relacionados se pretende que se encuentren dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones

Claims

REIVINDICACION ES 1 . Uso de un ligando comprendiendo una porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno para la fabricación de un medicamento para incrementar la cantidad de dicho compuesto objetivo endógeno en un sujeto, en donde dicho ligando une dicho compuesto objetivo endógeno y no inhibe substancialmente la actividad de dicho compuesto objetivo endógeno.
2. Uso de un ligando comprendiendo una porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno para la fabricación de un medicamento para incrementar la biodisponibilidad dicho compuesto objetivo endógeno en un sujeto, en donde dicho ligando une dicho compuesto objetivo endógeno y no inhibe substancialmente la actividad de dicho compuesto objetivo endógeno.
3. Uso de un ligando comprendiendo una porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno para la fabricación de un medicamento para incrementar la vida media in vivo de dicho compuesto objetivo endógeno, en donde dicho ligando une dicho compuesto objetivo endógeno, y no inhibe substancialmente la actividad de dicho compuesto objetivo endógeno.
4. Uso de un ligando comprendiendo una porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno para la fabricación de un medicamento para administración local que incrementa la cantidad de dicho compuesto objetivo endógeno en el sitio de administración, en donde dicho ligando une dicho compuesto objetivo endógeno, y no inhibe substancialmente la actividad de dicho compuesto objetivo endógeno.
5. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en donde la cantidad de ligando objetivo endógeno en dicho sujeto aproximadamente 4 horas después de la administración de dicho medicamento se incrementa por al menos 1.5 veces, en relación a la cantidad antes de la administración de dicho medicamento.
6. El uso de la reivindicación 5 en donde la cantidad de ligando objetivo endógeno en dicho sujeto aproximadamente 4 horas después de la administración de dicho medicamento se incrementa por al menos 10 veces, en relación a la cantidad antes de la administración de dicho medicamento.
7. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde dicho ligando une dicho compuesto objetivo endógeno e incrementa la vida media in vivo de dicho compuesto objetivo endógeno por al menos 1 .5 veces.
8. El uso de la reivindicación 7 en donde dicho ligando une dicho compuesto objetivo endógeno e incrementa la vida media in vivo de dicho compuesto objetivo endógeno por al menos 10 veces.
9. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde dicho ligando inhibe la actividad de dicho compuesto objetivo endógeno por no más de aproximadamente 10%.
10. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde la concentración inhibidora 50 (IC50) de dicho ligando es al menos 1 micromolar.
1 1 . El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en donde dicho ligando une dicho compuesto objetivo endógeno pero no se une al sitio activo de dicho compuesto objetivo endógeno.
12. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 en donde dicho ligando comprende dos o más copias de dicha porción que tiene un sitio de unión para un objetivo endógeno.
13. El uso de la reivindicación 12 en donde dicho ligando es un dímero de dicha porción que tiene un sitio de unión para un objetivo endógeno.
14. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 1 3 en donde dicha porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno se selecciona del grupo consistiendo de un aficuerpo, un dominio SpA, un dominio de clase A del receptor LDL, un dominio EGF, y un avímero.
15. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 -14 en donde dicha porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
16. El uso de la reivindicación 15 en donde dicha porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo consistiendo de un fragmento Fv, un fragmento Fv de cadena única, un fragmento Fv unido de disulfuro, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un diacuerpo, un dominio variable único de inmunoglobulina.
17. El uso de la reivindicación 16 en donde dicha porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno es un dominio variable único de inmunoglobulina.
18. El uso de la reivindicación 17 en donde dicho dominio variable único de inmunoglobulina se selecciona del grupo consistiendo de un VH de humano, y un VL de humanó
19. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 en donde dicho ligando comprende además una porción extendiendo la vida media.
20. El uso de la reivindicación 19 en donde dicha porción extendiendo la vida media es una porción de glicol de polialquileno, albúmina de suero o un fragmento del mismo, receptor de transferrina o una porción de unión a transferrina del mismo, o una porción comprendiendo un sitio de unión para un polipéptido que mejora la vida media in vivo.
21. El uso de la reivindicación 20 en donde dicha porción extendiendo la vida media es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene un sitio de unión para un polipéptido que mejora la vida media in vivo.
22. El uso de la reivindicación 21 en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un dAb.
23. El uso de la reivindicación 20 en donde dicha porción extendiendo l a vida media es una porción comprendiendo un sitio de unión para un polipéptido que mejora la vida media in vivo seleccionado del grupo consistiendo de un aficuerpo, un dominio SpA, un domi nio de clase A del receptor LDL, un dominio EG F, y un avímero.
24. El uso según cualquiera de las reivi ndicaciones 21 a 23 en donde el polipéptido que mejora la vida media in vivo es al búmi na de suero o receptor Fe neonatal .
25. El uso de la reivi ndicación 20, en donde dicha porción extendiendo la vida media es una porción de glicol de polietileno.
26. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 en donde dicho medicamento es substancialmente no inmunogénico.
27. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26 en donde dicho medicamento es una formulación de depósito.
28. El uso según cualquiera de las reivi ndicaciones 1 a 27 en donde dicho compuesto objetivo endógeno se selecciona del grupo consistiendo de un receptor de citoquina soluble, un antagonista de receptor endógeno, una enzi ma, una citoqui na, un factor de crecimiento, y una hormona.
29. El uso de la reivi ndicación 28 en donde dicho compuesto objetivo endógeno es un receptor de citoquina soluble.
30. El uso de la reivindicación 28 en donde dicho receptor de citoqui na soluble es TN FR 1 soluble
31 . El uso según cualquiera de las reivi ndicaciones 1 -30 en donde la porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno une dicho compuesto objetivo endógeno con Kd de 1 x 10'7 M o menos.
32. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 -30 en donde el ligando une dicho compuesto objetivo endógeno con Kd de 1 x 10"7 M o menos.
33. Uso de un ligando comprendiendo una porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno para la fabricación de un medicamento para incrementar la actividad de dicho objetivo endógeno, en donde dicho ligando une dicho objetivo endógeno y no inhibe substancialmente la actividad de dicho compuesto objetivo endógeno.
34. El uso de la reivindicación 33 en donde dicho ligando no se une al sitio activo de dicho compuesto objetivo endógeno.
35. El uso de la reivindicación 33 o reivindicación 34 en donde dicho ligando inhibe la actividad de dicho compuesto objetivo endógeno por no más de aproximadamente 10%.
36. El uso de la reivindicación 33 o reivindicación 34 en donde la concentración inhibidora 50 (IC50) de dicho ligando es al menos 1 micromolar.
37. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 33-36 en donde dicho ligando comprende dos o más porciones que tienen un sitio de unión para dicho objetivo endógeno.
38. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 33-36 en donde dicho ligando comprende dos o más copias de dicha porción que tiene un sitio de unión para un objetivo endógeno.
39. El uso de la reivindicación 38 en donde dicho ligando es un dímero de dicha porción que tiene un sitio de unión para un objetivo endógeno.
40. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 33-39 en donde dicha porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno se selecciona del grupo consistiendo de un aficuerpo, un dominio SpA, un dominio de clase A del receptor LDL, un dominio EGF, y un avímero.
41 . El uso según cualquiera de las reivindicaciones 33-40 en donde dicha porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
42. El uso de la reivindicación 41 en donde dicha porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo consistiendo de un fragmento Fv, un fragmento Fv de cadena única, un fragmento Fv unido de disulfuro, un fragmento Fab, un fragmento Fab' , un fragmento F(ab')2, un diacuerpo, un dominio variable único de inmunoglobulina.
43. El uso de la reivindicación 42 en donde dicha porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno es un dominio variable único de inmunoglobulina.
44. El uso de la reivindicación 43 en donde dicho dominio variable único de inmunoglobulina se selecciona del grupo consistiendo de un VH de humano, y un VL de humano-
45. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 44 en donde dicho ligando comprende además una porción extendiendo la vida media.
46. El uso de la reivindicación 45 en donde dicha porción extendiendo la vida media es una porción de glicol de polialquileno, albúmina de suero o un fragmento del mismo, receptor de transferrina o una porción de unión a transferrina del mismo, o una porción comprendiendo un sitio de unión para un polipéptido que mejora la vida media in vivo.
47. El uso de la reivindicación 46 en donde dicha porción extendiendo la vida media es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene un sitio de unión para un polipéptido que mejora la vida media in vivo.
48. El uso de la reivindicación 47 en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un dAb.
49. El uso de la reivindicación 46 en donde dicha porción extendiendo la vida media es una porción comprendiendo un sitio de unión para un polipéptido que mejora la vida media in vivo seleccionado del grupo consistiendo de un aficuerpo, un dominio SpA, un dominio de clase A del receptor LDL, un dominio EGF, y un avímero.
50. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 47 a 49 en donde el polipéptido que mejora la vida media in vivo es albúmina de suero o receptor Fe neonatal .
51 . El uso de la reivindicación 46 en donde dicha porción extendiendo la vida media es una porción de glicol de polietileno.
52. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 51 en donde dicho medicamento es substancialmente no inmunogénico.
53. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27 en donde dicho medicamento es una formulación de depósito.
54. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 53 en donde dicho compuesto objetivo endógeno se selecciona del grupo consistiendo de un receptor de citoquina soluble, un antagonista de receptor endógeno, una enzima, una citoquina, un factor de crecimiento, y una hormona.
55. El uso de la reivindicación 54 en donde dicho compuesto objetivo endógeno es un receptor de citoquina sol uble.
56. El uso de la reivindicación 55 en donde dicho receptor de citoqui na soluble es TNFR1 soluble.
57. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 33-56 en donde la porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno une dicho compuesto objetivo endógeno con Kd de 1 x 10"7 M o menos.
58. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 33-56 en donde el ligando une dicho compuesto objetivo endógeno con Kd de 1 x 10"7 M o menos.
59. Uso de un ligando comprendiendo dos o más porciones que tienen un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno para la fabricación de un medicamento para incrementar la actividad de unión de dicho compuesto objetivo endógeno, en donde dicho ligando une dicho objetivo endógeno, no une el sitio activo de dicho objetivo endógeno, y no inhibe substancialmente la actividad de unión de dicho compuesto objetivo endógeno.
60. El uso de la reivindicación 59 en donde dicho ligando comprende dos copias de una porción que tiene un sitio de unión para un objetivo endógeno.
61 . El uso de la reivindicación 61 en donde dicho ligando es un dímero de dicha porción que tiene un sitio de unión para un objetivo endógeno.
62. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 59-61 en donde dicha actividad de unión se incrementa por al menos un factor de 10.
63. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 59-63 en donde dicho compuesto objetivo endógeno es un receptor de citoquina soluble.
64. El uso de la reivindicación 64 en donde dicho receptor de citoquina soluble es TNFR1 soluble, y dichas porciones que tienen un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno independientemente unen un dominio de TNFR1 seleccionado del grupo consistiendo de Dominio 1 y Dominio 4.
65. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 59-64 en donde dicha porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno se selecciona del grupo consistiendo de un aficuerpo, un dominio SpA, un dominio de clase A del receptor LDL, un dominio EGF, y un avímero.
66. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 59-64 en donde dicha porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
67. El uso de la reivindicación 66 en donde dicha porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo consistiendo de un fragmento Fv, un fragmento Fv de cadena única, un fragmento Fv unido de disulfuro, un fragmento Fab, un fragmento Fab' , un fragmento F(ab')2, un diacuerpo, un dominio variable único de inmunoglobulina.
68. El uso de la reivindicación 67 en donde dicha porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno es un dominio variable único de inmunoglobulina.
69. El uso de la reivindicación 68 en donde dicho dominio variable único de inmunoglobulina se selecciona del grupo consistiendo de un VH de humano, y un VL de humano-
70. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 59 a 69 en donde dicho ligando comprende además una porción extendiendo la vida media.
71 . El uso de la reivindicación 70 en donde dicha porción extendiendo la vida media es una porción de glicol de polialquileno, albúmina de suero o un fragmento del mismo, receptor de transferrina o una porción de unión a transferrina del mismo, o una porción comprendiendo un sitio de unión para un polipéptido que mejora la vida media in vivo.
72. El uso de la reivindicación 71 en donde dicha porción extendiendo la vida media es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene un sitio de unión para un polipéptido que mejora la vida media in vivo.
73. El uso de la reivindicación 72 en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un dAb.
74. El uso de la reivindicación 71 en donde dicha porción extendiendo la vida media es una porción comprendiendo un sitio de unión para un polipéptido que mejora la vida media in vivo seleccionado del grupo consistiendo de un aficuerpo, un dominio SpA, un dominio de clase A del receptor LDL, un dominio EG F, y un avímero.
75. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 72 a 74 en donde el polipéptido que mejora la vida media in vivo es albúmina de suero o receptor Fe neonatal .
76. El uso de la reivindicación 71 en donde dicha porción extendiendo la vida media es una porción de glicol de polietileno.
77. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 59 a 76 en donde dicho medicamento es substancialmente no inmunogénico.
78. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 59 a 77 en donde dicho medicamento es una formulación de depósito.
79. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 59-78 en donde la porción que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno une dicho compuesto objetivo endógeno con Kd de 1 x 10" 7 M o menos.
80. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 59-78 en donde el ligando une dicho compuesto objetivo endógeno con Kd de 1 x 10"7 M o menos.
81 . Un ligando que une un compuesto objetivo endógeno teniendo actividad adecuada para tratar una enfermedad en un sujeto, en donde dicho ligando no une el sitio activo de dicho compuesto objetivo endógeno o substancialmente inhibe la actividad de dicho compuesto objetivo endógeno, para uso en terapia de una enfermedad apta para tratamiento con dicho compuesto objetivo endógeno.
82. El ligando de la reivindicación 81 en donde dicho ligando incrementa la vida media in vivo de dicho compuesto objetivo endógeno.
83. El ligando de la reivindicación 81 o reivindicación 82 en donde dicho ligando incrementa la cantidad de dicho compuesto objetivo endógeno en un sujeto.
84. El ligando según cualquiera de las reivindicaciones 81 -83 en donde dicho ligando incrementa la biodisponibilidad de dicho compuesto objetivo endógeno.
85. El ligando según cualquiera de las reivindicaciones 81 -84 en donde dicho ligando incrementa la actividad de unión de dicho compuesto endógeno.
86. El ligando según cualquiera de las reivindicaciones 81 - 85 en donde dicho ligando es como se describe en cualquiera de de las reivindicaciones 1 -80.
87. Una composición farmacéutica comprendiendo un ligando que une un compuesto objetivo endógeno teniendo actividad adecuada para tratar una enfermedad en un sujeto y un vehículo fisiológicamente aceptable, en donde dicho ligando no une el sitio activo de dicho compuesto objetivo endógeno o substancialmente inhibe la actividad de dicho compuesto objetivo endógeno.
88. La composición farmacéutica de la reivindicación 87 en donde dicho ligando incrementa la vida media in vivo de dicho compuesto objetivo endógeno.
89. La composición farmacéutica de la reivindicación 87 o reivindicación 88 en donde dicho ligando incrementa la cantidad de dicho compuesto objetivo endógeno en un sujeto.
90. La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 87-89 en donde dicho ligando incrementa la biodisponibilidad de dicho compuesto objetivo endógeno.
91 . La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 87-90 en donde dicho ligando incrementa la actividad de unión de dicho compuesto endógeno.
92. La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 87-91 en donde dicho ligando es como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 -80.
93. Un dispositivo de suministro de fármaco comprendiendo una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 87-92.
94. El dispositivo de suministro de fármaco de la reivindicación 93 en donde dicho dispositivo de suministro de fármaco se selecciona del grupo consistiendo de un dispositivo de suministro parenteral, dispositivo de suministro intravenoso, dispositivo de suministro intramuscular, dispositivo de sumi nistro intraperitoneal , dispositivo de suministro transdérmico, dispositivo de suministro pulmonar, dispositivo de suministro intraarterial, dispositivo de suministro intratecal , dispositivo de suministro intraarticular, dispositivo de suministro subcutáneo, dispositivo de sumi nistro intranasal, dispositivo de suministro vaginal , y dispositivo de suministro rectal.
95. El dispositivo de suministro de fármaco de la reivindicación 94 en donde dicho dispositivo se selecciona del grupo consistiendo de una jeringa, un dispositivo de sumi nistro transdérmico, una cápsula, una tableta, un nebulizador, un inhalador, un atomizador, un aerosolizador, un vaporizador, un inhalador de polvo seco, un inhalador de dosis medida, un rociador de dosis medida, un vaporizador de dosis medida, un atomizador de dosis medida, un catéter.
96. Uso de un ligando comprendiendo una porción de unión que tiene un sitio de unión para un compuesto objetivo endógeno para incrementar la vida media, biodisponibilidad o actividad de dicho compuesto endógeno, en donde dicha porción de unión que tiene un sitio de unión para un compuesto endógeno es dicho compuesto endógeno o una porción o variante del mismo, y en donde dicho ligando une dicho compuesto objetivo endógeno y no inhibe substancialmente la actividad de dicho compuesto objetivo endógeno.
97. El uso de la reivindicación 96 en donde dicho compuesto endógeno es un receptor soluble que es un miembro de la superfamilia de receptor TNF.
98. Uso de un ligando comprendiendo una porción de unión que tiene un sitio de unión para un miembro de la superfamilia de receptor TNF para incrementar la vida media, biodisponibilidad o actividad de dicho miembro de la superfamilia de receptor TNF, en donde dicho ligando une dicho miembro de la superfamilia de receptor TNF y no inhibe substancialmente la actividad de dicho miembro de la superfamilia de receptor TNF, y en donde dicha porción de unión que tiene un sitio de unión para un miembro de la superfamilia de receptor TNF es un dominio de ensamble de pre-ligando (PLAD) o una variante del mismo.