MX2007005277A - Formulaciones de bacteriofagos estabilizadas. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan composiciones de bacteriofagos estabilizadas y metodos para preparar composiciones de bacteriofagos estabilizadas. El metodo para producir una composicion antibacterial involucra absorber una solucion acuosa de uno o mas bacteriofagos o uno o mas componentes fago en una matriz para producir una composicion y secar la composicion para producir la composicion antibacterial. Tambien se proporciona una composicion antibacterial que comprende una o mas hebras de bacteriofagos o uno o mas componentes fago, absorbidos en una matriz. La composicion antibacterial tambien puede encapsularse. La composicion antibacterial o la composicion antibacterial incrustada en un soporte solido, puede usarse dentro de una crema, locion o gel a mezclarse con un portador farmaceutico y administrada topica, oral, nasalmente como un inhalante en polvo o la composicion antibacterial o composicion antibacterial encapsulada, puede agregarse a un alimento para usos animales, acuaticos o aviares.

Description

FORMULACIONES DE BACTERIÓFAGOS ESTABILIZADAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a formulaciones de bacteriófagos estabilizadas y su uso como sistemas de liberación Más particularmente, la presente invención se refiere a formulaciones de bacteriófagos estabilizados, los métodos para preparar las formulaciones de bacteriófagos estabilizados y los usos de las formulaciones de bacteriófagos estabilizados como sistemas de liberación ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La terapia con bacteriófagos tiene el potencial de proporcionar un método efectivo para controlar específicamente la multiplicación de vanas hebras de bacteria Sin embargo, para ser comerclalmente viable, los bacteriófagos por si mismos deberán tener un cierto grado de estabilidad para permitir el almacenaje Vanos métodos se han usado para almacenar los fagos, incluyendo congelar a bajas temperaturas, hofilizar y almacenar en un medio líquido Todos los métodos han mostrado vanos grados de éxito al mantener una alta concentración de bacteriófagos viables Prouty (1953, Appl Microbiol, 1 250-351 ) reportó que los bacteriófagos disecados del ácido láctico que producen el Streptococci permanecieron viables a 0CC por 42 meses a 37°C por 72 meses y a 12°C y 25°C por al menos 78 meses Sin embargo, no existe mención del efecto para el almacenamiento de bacteriófagos disecados en la concentración de los bacteriófagos Keogh y Pettingill (1966, Appl Microbiol, 14 4421-424) mostraron que los bacteriófagos para el ácido láctico que produce Streptococ en la presencia de la proteína del suero son resistentes al congelamiento y el almacenaje en frío El fago almacenado a 4°C y -18°C mostró poca reducción en la concentración del bacteriófago, los ciclos de descongelación-congelamiento también no mostraron pérdida significante de la concentración. Warren y Hatch (1969, Appl Microbiol, 17:256-261) reportaron una disminución significante en la concentración y la viabilidad de una suspensión de bacteriófagos almacenados (sin estabilizadores) a 4°C, mientras el almacenaje a -20°C y 20°C resultó en la supervivencia más grande de los fagos. También reportó que el almacenaje a largo plazo de los bacteriófagos a -20°C tiene a resultar en la formación de macizos.

Jepson y March (2004, Vaccine, 22:2413-2419) describe que una suspensión líquida de bacteriófagos (en el estabilizador SM o una dilución 1/200 del estabilizador SM en agua) fue estable por 6 meses a 4°C y -70°C con los fagos permaneciendo sin afectarse por el congelamiento-descongelación. La temperatura incrementada entre 20°C y 42°C resultó en una pérdida significante de la concentración. La liofilización y la reconstitución inmediata de los bacteriófagos en la presencia o ausencia de estabilizadores resultaron en una pérdida de la concentración de 80-95%. De los bacteriófagos restantes siguiendo la liofilización en la presencia de polvo de leche desnatada seca, el almacenaje a temperaturas entre 20°C y 42°C resultó en una pérdida de la concentración similar a la de esa suspensión líquida. Sin embargo, la liofilización en la presencia de trehalosa resultó en una media vida del bacteriófago entre 20°C y 42°C. El efecto del pH del medio de almacenaje también se examinó. No existió cambio en la concentración de bacteriófagos sobre un periodo de 24 horas a un pH 3-11. Sin embargo, la concentración goteó rápidamente cuando se almacenó por 5 minutos a valores de pH debajo de 2.4.

Scott et al (WO 03/0934462) describe la estabilización e inmovilización de los virus, incluyendo los bacteriófagos mediante el enlace covalente de los virus al sustrato. Este proceso requiere los químicos para activar el sustrato y acoplar los agentes para ayudar en la formación de los enlaces covalentes entre el sustrato y los virus. El uso de estos reactivos incrementa el gasto requerido para la inmovilización. Por lo tanto, el virus o los bacteriófagos no son capaces de liberarse al ambiente debido a su unión covalente al sustrato. Por lo tanto, el fago inmovilizado solamente puede actuar en ubicaciones discretas.

El congelamiento o liofilización de las suspensiones de bacteriófagos o suspensiones de bacteriófagos opcionalmente conteniendo estabilizadores son métodos inconvenientes que requieren equipo especializado y ayudan al costo de una preparación comercial. Mientras es deseable ser capaces de almacenar los bacteriófagos en un estado disecado, el proceso de liofilización resulta en una pérdida significante de la concentración. Por lo tanto, la unión covalente de los bacteriófagos a un sustrato no permite la liberación de los bacteriófagos del sustrato y limita su utilidad para las aplicaciones. Los métodos alternos para la estabilización de bacteriófagos se requieren.

SUMARIO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a formulaciones de bacteriófagos estabilizadas y su uso como sistemas de liberación. Más particularmente, la presente invención pertenece a las formulaciones de bacteriófagos estabilizadas, métodos para preparar las formulaciones de bacteriófagos estabilizadas y los usos de las formulaciones de bacteriófagos estabilizadas.

Es un objeto de la presente invención proporcionar una formulación de bacteriófagos estabilizada que muestra estabilidad mejorada.

La presente invención proporciona un método para producir una composición antibacterial comprendiendo absorber una solución acuosa de uno o más de un bacteriófago, componentes fago o una combinación de los mismos en una matriz en polvo o sólido para producir la composición y secar la composición para producir una composición antibacterial.

La presente invención también se refiere al método anteriormente descrito en donde la matriz puede seleccionarse del grupo que consiste de polvo de leche desnatada, polvo de proteína de soya, polvo de proteína de suero de leche, polvo de albúmina, caseína, gelatina, proteínas de célula simple, proteína de algas, peptona de plantas, trehalosa, manitol, azúcar en polvo, alcohol de azúcar, carbón vegetal, lechos de látex, un material basado en carbohidratos solubles en agua, talco, quitina y cartílago de pescado.

La presente invención también proporciona una composición antibacterial comprendiendo una o mas de una hebra de bacteriófago, componente fago o ambos absorbidos en una matriz.

La presente invención incluye el material antibacterial como se definió anteriormente, en donde la matriz soluble se selecciona del grupo que consiste de polvo de leche desnatada, proteína de soya, polvo de albúmina, proteínas de célula simple, trehalosa, manitol, azúcar y alcohol de azúcar.

Las composiciones antibacteriales de la presente invención son fáciles de preparar y exhibir la propiedad de ser estables sobre varias longitudes de tiempo en el refrigerador y a temperatura ambiente, desde aproximadamente -10°C a aproximadamente 25CC o cualquier cantidad entre las mismas. Por lo tanto, uno o más bacteriófagos, componentes fago o ambos pueden liberarse rápidamente de las composiciones antibacteriales de la presente invención con poco o nada de pérdida en la concentración. Las composiciones antibacteriales de la presente invención pueden usarse con lociones, cremas, geles y lubricantes, pasta de dientes puede mezclarse con un portador farmacéuticamente aceptable para las aplicaciones orales, nasales o tópicas por ejemplo pero no limitadas a la piel, vaginal, oftálmica, nasal, aural, anal, rectal y otros tipos de administración o se usan con vendajes curativos y exhiben actividad antimicrobial.

La presente invención proporciona preparaciones de fago estabilizadas en una forma seca como un sistema de liberación para inhalantes en polvo. La presente invención también proporciona una matriz apropiada parar preparar composiciones de fago o fago para encapsularlas y liberarlas al intestino pasando los ácidos estomacales.

Las composiciones antibacteriales de la presente invención pueden usarse para propósitos humanos, veterinarios, agrícolas o de acuacultivo. Por lo tanto, las composiciones como se describió en este documento puede usarse para tratamiento de árboles y plantas y aplicaciones ambientales. Las composiciones antibacteriales pueden usarse dentro de una crema, loción o gel, se mezclan con un portador farmacéutico y se administran tópica, oral, nasalmente usadas como un inhalante en polvo o la composición antibacterial puede agregarse a un alimento para usos animales, acuáticos o aviares.

Este sumario de la invención no necesariamente describe todas las características necesarias de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Estas y otras características de la invención llegarán a ser más aparentes a partir de la descripción detallada en la cual se hace referencia a los dibujos anexos, en donde: La Figura 1 muestra la concentración del fago aplicado al polvo de leche desnatada (Antes) y que se obtiene después de la inmovilización y resuspensión (Después), en donde: D = concentración de fago E = control F = antes G = después A = control B = antes C = después.

La Figura 2 muestra la concentración del fago aplicado al polvo de proteína de soya (Antes) y que se obtiene después de la inmovilización y resuspensión (Después).

La Figura 3 muestra estabilidad de los fagos inmovilizados sobre un periodo de 4.5 meses (131 días) y 10 meses (31 1 días) cuando se almacenan a temperatura ambiente (TA) o a 4°C.

La Figura 4 muestra la concentración del fago aplicada al polvo de proteína de peptona de plantas (Antes) y que se obtiene después de la inmovilización y resuspensión (Después), en donde: H = condiciones de almacenaje.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a formulaciones de bacteriófagos estabilizadas. Más particularmente, la presente invención se refiere a formulaciones de bacteriófagos estabilizadas, métodos para preparar las formulaciones de bacteriófagos estabilizadas y usos de las formulaciones de bacteriófagos estabilizadas.

La siguiente descripción es de una modalidad preferida.

La presente invención proporciona una composición antibacterial comprendiendo una o más de una hebra de bacteriófagos o uno o más de un componente fago o una combinación de los mismos absorbidos en una matriz. La presente invención también proporciona un método para producir una composición antibacterial comprendiendo absorber una solución acuosa de bacteriófagos, componentes fago o una combinación de los mismos en una matriz para producir una composición antibacterial y secar la composición antibacterial. La solución de bacteriófagos, componentes fago o una combinación de los mismos puede comprender uno o más de una hebra de bacteriófagos, componentes fago o una combinación de los mismos que son capaces de infectar el mismo o diferentes blancos bacteriales. Este método es simple de realizar, no requiere equipo especializado y los bacteriófagos, componentes fagos o una combinación de los mismos preparados de esta manera son estables.

La composición antibacterial puede usarse en una variedad de formas para el control del crecimiento bacterial y pueden usarse para una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, lo cual no se considera limitante en ninguna manera, las composiciones antibacteriales pueden usarse para aplicaciones humanas, veterinarias, agrícolas y de acuacultivo. Por lo tanto, las composiciones pueden usarse para el tratamiento de árboles y plantas y aplicaciones ambientales. En un ejemplo adicional no limitante, las composiciones antibacteriales de la presente invención pueden usarse dentro de lociones, lubricantes, geles y cremas para aplicaciones en heridas o dermatológicas, aplicarse directamente para aplicaciones tópicas por ejemplo pero no limitadas a aplicadas a la piel, vaginales, oftálmicas, nasales, aurales, anales o áreas rectales, usadas dentro de la pasta de dientes o aplicadas en el hilo dental para las aplicaciones de higiene oral. La composición antibacterial también puede aplicarse a un vendaje para tratar las heridas. La composición antibacterial también puede encapsularse y usarse como un aditivo alimenticio o como un tratamiento oral para el control de bacterias dentro de la especie humana, un mamífero o una ave.

El término "bacteriófago" o "fago" es bien conocido en la técnica y generalmente indica un virus que infecta la bacteria. Los fagos son parásitos que se multiplican dentro de las células bacteriales mediante usar alguna o toda la maquinaria biosintética de los huéspedes y pueden ser líticos o lisogénicos. Los bacteriófagos usados de conformidad con la presente invención puede ser cualquier bacteriófago, lítico o lisogénico que es efectivo en contra de un patógeno blanco de interés.

Por el término "patógeno blanco" o "bacteria blanco" se entiende la bacteria patogénica que puede causar enfermedad en humanos, animales peces, aves o plantas. Los patógenos blanco pueden ser de cualquier tipo de bacteria patogénica para humanos, animales, peces, aves y plantas.

Por el término "animal" o "animales" se entiende cualquier animal que puede afectarse mediante o llevar un patógeno. Por ejemplo pero sin desear ser limitado en ninguna manera, los animales pueden incluir humanos, aves, tales como pollos o pavo, etc. cerdos, ganado cuyo término incluye todos los animales que tienen garras como caballos, reses, cabras y ovejas, etc. peces finos y mariscos y mascotas de casa tales como perros y gatos.

El fago específico para uno o más de un patógeno blanco puede aislarse usando técnicas estándar en la técnica por ejemplo como se observa en Maniatis et al (1982, Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. que se incorpora en este documento como referencia). Si se desea, un cóctel de diferentes bacteriófagos puede usarse para señalar uno o más de un patógeno como se describe en este documento.

El término "componente fago" o "componentes fago" se refiere a cualquier componente fago incluyendo pero no limitado a la cola o una proteína fago u otro ensamble molecular que es efectivo para matar, reducir el crecimiento o la reproducción de una bacteria blanco o una pluralidad de bacterias blanco.

Si se desea, un cóctel de bacteriófagos, componentes fago o ambos puede usarse en contra de un blanco bacterial simple o múltiples blancos bacteriales. La bacteria blanco puede ser cualquier tipo de bacteria, por ejemplo pero no limitada a las especies bacteriales y hebras de Escherichia coli, Streptococci, Humicola, Salmonella, Campylobacter, Listeria, Lawsonia. Staphylococcus, Pasteurella, Mycobacterium, Hemophilius, Helicobacter, Mycoplasmi, Enseria, Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Bactercides, Pseudomona, Borrelius, Citrobacter, Propionobacter, Treponema, Chlamidia, Tricomonas, Gonorrhea, Clostridium, Shigella, Enterococcus, Leptospirex, Bacillii incluyendo Bacillus anthracis, y otras bacterias patogénicas a humanos, ganado o aves. De interés son las bacterias que son conocidas por contaminar los alimentos de los animales, los alimentos líquidos de los animales o los lotes de alimentos de animales generalmente. De particular interés son las bacterias son las bacterias que también infectan al ganado, incluyendo cerdos y aves de corral destinadas para el consumo humano por ejemplo pero no limitadas a Samonella, Carpylobactery E. coli 0157:H7.

Uno o más de un bacteriófago, componentes fago o ambos pueden proporcionarse en una solución acuosa. La solución acuosa puede ser cualquier solución apropiada para el propósito de la presente invención. Por ejemplo, uno o más de un bacteriófago, componentes fago o ambos pueden proporcionarse en agua o en un medio apropiado como se conoce en la técnica, por ejemplo caldo LB, SM, TM, PBS, TBS u otro estabilizador común como se conoce en la técnica (ver Maniatis et al, 1982, Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., que se incorpora en este documento como referencia). Por ejemplo, pero sin desear ser limitados, los bacteriófagos pueden almacenarse en el caldo LB.

Por el término "matriz" se entiende cualquier matriz sólida apropiada que es soluble en agua, ingerible por un mamífero o apropiada para usarse con lociones, lubricantes, geles o cremas o geles. Adicionalmente, la matriz puede ser no soluble en agua, con la condición de que cualquier fago absorbido pueda ser liberado de la matriz. La matriz puede ser capaz de absorber uno o más de un bacteriófago, los componentes fago o ambos en su superficie y liberando uno o más de un bacteriófago, componentes fago o ambos en un ambiente apropiado. Uno o más de un bacteriófago, componentes fago o ambos no deberán adherirse muy fuertemente a la matriz que ellos no pueden liberarse en la re-suspensión apropiada en un medio. Si los bacteriófagos se asocian en una manera no liberable con la matriz, se prefiere que la matriz este presente en una forma particulada, desde aproximadamente 0.1 nm a aproximadamente 100 µm en tamaño, de manera que se minimice cualquier obstáculo estérico entre el bacteriófago y su acción en el huésped blanco.

De preferencia uno o más de un bacteriófago, componentes fago o una combinación de los mismos absorbidos, inmovilizados se asocian no covalentemente con la matriz de manera que pueden liberarse de la matriz cuando se desee. Los ejemplos no limitantes de una matriz que puede usarse de conformidad con la presente invención incluyen polvo de leche desnatada, polvo de proteína de soya, polvo de proteína de suero de leche, polvo de albúmina, caseína, gelatina, proteína de algas y otras proteínas de células simple, peptona en plantas, trehalosa, manitol o otros azúcares o alcoholes de azúcar en polvo, carbón vegetal o lechos de látex u otras superficies inertes, materiales basados en carbohidratos solubles en agua, talco, quitina, cartílago de pescado y los similares o una combinación de los mismos. De preferencia, la matriz es generalmente considerada como segura (GRAS). En la presente descripción, uno o más de un bacteriófago, componentes fago o una combinación de los mismos que se asocian con o se absorben a, la matriz se referirá como "fagos inmovilizados" o "bacteriófagos inmovilizados".

Uno o más de un bacteriófago, componentes fago o una combinación de los mismos en solución acuosa pueden aplicarse a la matriz por un método conocido en la técnica, por ejemplo chorro o rocío con la condición de que la cantidad de la matriz excede la cantidad de solución acuosa de bacteriófago, componentes fago o ambos. Se prefiere que la matriz permanezca en un estado seco o semi-seco y que una suspensión líquida de bacteriófagos (o componentes fago) y la matriz no se forme. De estos métodos, rociar la solución de bacteriófago sobre la matriz se prefiere.

La composición antibacterial comprendiendo uno o más de un bacteriófago, componentes fago o ambos y la matriz puede secarse a una temperatura de aproximadamente 0o a aproximadamente 50°C o cualquier cantidad entre las mismas, por ejemplo en una temperatura de 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 ó 50°C. La composición bacterial puede secarse en una temperatura de aproximadamente 10°C a aproximadamente 30°C o cualquier cantidad entre las mismas o desde aproximadamente 1°C a aproximadamente 2°C o cualquier cantidad entre las mismas. El proceso de secado también puede acelerarse mediante proporcionar un flujo de aire sobre o a través de la composición antibacterial. Alternativamente, el secado puede realizarse mediante calentar el material inmovilizado bajo vacío.

Después de un periodo de secado, la solución acuosa adicional puede aplicarse a la matriz si se desea y la matriz re-secarse. Este proceso puede repetirse como se requiera para obtener la cantidad deseada de fago en la matriz La concentración del fago en la matriz puede determinarse rápidamente usando técnicas estándares Además, uno o más de un bacteriófago, componentes fago o ambos absorbidos a una matriz puede incrustarse en un soporte sólido Adicionalmente, una solución acuosa de bacteriófagos puede incrustarse dentro de un soporte sólido y secarse Cualquier soporte sólido apropiado conocido en la técnica puede usarse para proporcionar una liberación retrasada Por ejemplo, pero no para limitarse en ninguna manera, microlechos, material basado en celulosa, material basado en carbohidratos, laca, polímeros, metacplatos, azúcares por ejemplo pero no limitados a manitol y sorbitol, proteína de soya, proteína de suero de lecha, proteina de alga y otras proteínas celulares simples, caseína, gelatina, polvo de leche, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCP), ftalato de acetato de celulosa (CAP) y Succinato de Acetato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCAS) pueden usarse como un soporte sólido Las composiciones antibacteriales anteriormente descritas, ya sean bacteriófagos inmovilizados, componentes fago o una combinación de los mismos, o bacteriófagos inmovilizados, componentes fago o una combinación de los mismos, incrustados en un soporte sólido también pueden referirse como "bacteriófagos estabilizados o componentes fago" o "fagos estabilizados o componentes fago" Los fagos estabilizados descritos en este documento pueden, cuando se introducen al ambiente liquido apropiado, de preferencia liberar los bacteriófagos, componentes fagos o una combinación de los mismos de manera que los bacteriófagos o componentes fago estarían libres en solución Los bacteriófagos estabilizados o los componentes fago anteriormente descritos pueden formularse usando cualquier método apropiado conocido en la técnica Por ejemplo, pero no limitado en ninguna manera, los bacteriófagos estabilizados pueden encapsularse, incorporarse en una cápsula, tableta o una combinación del mismo Por "encapsulado", se entiende que la composición bacterial se cubre con una sustancia que incrementa la resistencia de los fagos al estrés físico-químico de su ambiente Los fagos estabilizados o los componentes fago pueden cubrirse con cualquier sustancia conocida en la técnica, mediante cualquier método apropiado conocido en la técnica, por ejemplo, pero no se limita al método descrito en la publicación Norteamericana 2003/0109025 (Durand et al, que se incorpora en este documento como referencia) En este método, las micro-gotas de la sustancia de recubrimiento se inyectan en una cámara que contiene el componente a encapsularse y rápidamente se enfrían Alternativamente, una composición de recubrimiento puede mezclarse con uno o más de un bacteriófago estabilizado o componentes fago de la presente invención con constante agitación o movimiento y se enfría o se seca como se requiera En otro método alterno de la presente invención de encapsulación de los bacteriófagos estabilizados puede usarse la atomización de disco devanado (es decir, EUA 5,643,594, EUA 6,001 ,387, EUA 5,578,314, Senuma Y et al 2000, Biomaterials 21 1135-1144, Senuma Y et al 2000, Biotechnol Bioeng 67 616-622, que se incorpora en este documento como referencia) Como entendería un experto en la técnica, los fagos estabilizados pueden dispersarse en una fusión caliente o una solución orgánica conteniendo la sustancia de recubrimiento deseada La dispersión posteriormente puede alimentarse en el centro de un disco giratorio y el material se atomiza como se dejara la periferia del disco, resultando en bacteriófagos estabilizados encapsulados El material encapsulado posteriormente puede colectarse usando un separador de ciclón o un lecho de almidón de comida modificado La composición encapsulada puede re-introducirse en el atomizador del disco devanado para incrementar el espesor del recubrimiento De esta manera, las composiciones de bacteriófagos encapsulados que tienen diferente espesor de recubrimiento pueden obtenerse de manera que exhiban propiedades de tiempo liberado vanadas dentro de un ambiente apropiado El recubrimiento de suspensión de aire es otro ejemplo de un método de encapsulación que puede usarse En este método, un recubndor de rocío de lecho de fluido se usa para aplicar un recubrimiento uniforme en partículas sólidas (es decir Jones, D. 1994, Drug Development and Industrial Pharmacy 20:3175-3206; Hall et al. 1980, The Wurster Process, en "Controlled Reléase Technologies: Methods, Theory and Applications", Kyonieus A.F. ed Vol 2 pp. 133-154, CRC Press, Boca Ratón Fia; Deasy, P.B. 1988, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sist.. S(2):99-139, que se incorporan en este documento como referencia). La composición antibacterial puede suspenderse mediante un chorro de aire que se designa para inducir un flujo cíclico suave pasando una boquilla usado para atomizar la sustancia de recubrimiento. Una vez rociado, las partículas de la composición antibacterial pueden levantarse por el chorro de aire a medida que el recubrimiento se seca. Las partículas entonces pueden circularse pasando la boquilla hasta que se aplica un recubrimiento uniforme. Las partículas pueden circularse hasta que el espesor de película deseado se ha aplicado. Las partículas pueden entonces circularse pasando la boquilla hasta que un recubrimiento uniforme se obtiene o hasta que el espesor de la película deseada se ha aplicado. De esta manera, las composiciones de bacteriófagos encapsuladas que tienen diferente espesor de recubrimiento pueden obtenerse de manera que exhiban propiedades de liberación en tiempo variadas dentro de un ambiente apropiado.

Alternativamente, puede usarse un solvente orgánico comprendiendo el compuesto de recubrimiento o la sustancia. Los ejemplos no limitantes de los solventes orgánicos incluyen cloruro de metileno, acetato de metilo, acetato de etilo, cetona del éter metílico, acetona, alcoholes y otros solventes o combinaciones de los mismos.

La sustancia de recubrimiento puede ser cualquier sustancia de recubrimiento apropiada conocida en la técnica. Por ejemplo, pero sin desear ser limitada, la sustancia de recubrimiento puede comprender una sustancia con una temperatura de fusión entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 100°C, o cualquier temperatura entre ellas, por ejemplo entre aproximadamente 30°C y aproximadamente 80°C o cualquier temperatura entre ellas o entre aproximadamente 60°C y aproximadamente 80°C o cualquier temperatura entre ellas, por ejemplo, la temperatura de fusión puede ser 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 ó 100°C o cualquier cantidad entre ellas Si la sustancia de recubrimiento es para ingerirse o usarse para una aplicación oral, entonces se prefiere que la sustancia sea una sustancia de grado alimenticio Sin embargo, el bacteriófago estabilizado o el componente fago de la presente invención también puede cubrirse con otras sustancias que no son de grado alimenticio, dependiendo del uso intentado de la composición antibacterial Por ejemplo, la composición antibacterial puede encapsularse en un recubrimiento compatible con la emulsión para usarse en lociones o lubricantes o cremas o geles Otras moléculas aditivas pueden agregarse a la sustancia de recubrimiento, de manera que el aditivo puede incluir antioxidantes, azúcares, proteínas u otro material sintético Los ejemplos no limitantes de las sustancias de recubrimiento apropiados incluyen materiales basados en lípidos tales como ácidos grasos vegetales, ácidos grasos tales como acido palmítico y ácido esteárico, por ejemplo Stéanne™, ceras animales por ejemplo, cera de abejas, ceras vegetales por ejemplo cera de Carnauba o cera candelilla, derivados de la cera, otros lípidos o derivados de lípidos y laca Las sustancias de recubrimiento adicionales también pueden usarse, por ejemplo materiales basados en no lípidos (ver por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos 6,723,358 y 4,230,687 ambas de las cuales se incorporan en este documento como referencia ), por ejemplo azúcares, componentes basados en celulosa y otros componentes basados en carbohidratos que puede ser agua soluble Por ejemplo y sin desear ser limitados en ninguna manera, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCP), ftalato de acetato de celulosa (CAP) o Succinato de Acetato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCAS), pueden usarse como materiales basados en no lípidos apropiados para encapsulación Los polímeros también pueden usarse para encapsular los bacteriófagos estabilizados o componentes fago Cualquier polímero conocido en la técnica puede usarse y puede seleccionarse para la liberación inmediata de los bacteriófagos o componentes fago o para la liberación controlada. Por ejemplo y sin desear limitarse en ninguna manera, los polímeros apropiados incluyen aquellos descritos por Mehta (Patente Norteamericana No. 6,296,909), Hussain et al (Patente Norteamericana No. 6,649,187)0 Yang et al (Patente Norteamericana No. 5,576,022), todas de las cuales se incorporan en este documento como referencia. En un ejemplo no limitante, los polímeros tales como ftalato de poli(vinilacetato) (PVAP), basados en metacrilato o laca pueden usarse.

Como se entendería por una persona experta en la técnica, una o más de una sustancia de recubrimiento pueden usarse. Por ejemplo, los bacteriófagos estabilizados o los componentes fago pueden encapsularse usando o incrustándolos en un tipo de sustancia de recubrimiento, seguido por una segunda encapsulación o sobre-recubrimiento usando otra sustancia de recubrimiento. En un ejemplo no limitante, los bacteriófagos estabilizados o los componentes fago primero pueden encapsularse con o incrustarse en un componente basado en celulosa, seguidos por el sobre-recubrimiento con un material basado en lípidos, alternativamente, los bacteriófagos estabilizados o los componentes fago primero pueden encapsularse con o incrustarse en un polímero, seguido por el sobre-recubrimiento con un material resistente al agua u otro basado en lípidos.

El proceso de encapsulación basado en lípidos protege uno o más de un bacteriófago, componentes fago o ambos para extender algo de un ambiente duro uno o más de un bacteriófago, componentes fago o ambos que pueden exponerse a, por ejemplo, el ambiente de pH bajo sobre un rango de condiciones líquidas de fermentación de alimentos o el sistema digestivo de un animal. El material basado en lípidos seleccionado para la encapsulación también deberá exhibir la propiedad que se rompe dentro de un ambiente deseado de manera que uno o más de un bacteriófago, componentes fago o ambos puede liberarse, proporcionando una forma de liberación cronometrada. Por ejemplo, las enzimas de digestión pueden degradar el material de encapsulación y ayudar en la liberación de uno o más de un bacteriófago, componentes fago o ambos dentro del intestino de un animal o enzimas dentro del alimento líquido de fermentación, por ejemplo, puede ayudar en la liberación de lago o de uno o más de un bacteriófago, componentes fago o ambos de la encapsulación. Otros mecanismos de liberación inducen el pH basado y la reacción con químicos liberados dentro de una cámara definida como ácidos de bilis. Como un resultado, varios materiales para encapsular uno o más bacteriófago, componentes fago o ambos pueden usarse de manera que si se desea, existe la liberación seleccionada del bacteriófago mientras al mismo tiempo se proyecta uno o más de un bacteriófago o componentes fago o ambos. Variando el espesor del recubrimiento de los bacteriófagos encapsulados o los componentes fago también pueden proporcionar características de liberación cronometrada adicionales.

Además, un material de encapsulación del polímero o basado en un no lípido puede disolverse en agua, por lo tanto liberando uno o más de un bacteriófago, componentes fago o ambos inmediatamente o muy pronto después de la mezcla con el medio de alimentación líquido. Uno o más de un bacteriófago, componentes fago o ambos también puede liberarse en un diseño de tiempo controlado dependiendo del material y la formulación seleccionados o si las preparaciones se proporcionan dentro de una cápsula o forma de tableta. La cápsula o las formulaciones de tableta pueden ayudar en la liberación cronometrada de los bacteriófagos estabilizados o componentes fago dentro del animal u otro ambiente. Por lo tanto, las mezclas de bacteriófagos de liberación controlada, los componentes fago o ambos se mezclan, se encapsulan o ambos con diferentes materiales pueden combinarse y mezclarse con el alimento del animal, la alimentación líquida del animal o de otra manera administrarse a un animal.

Los bacteriófagos, componentes fago o una combinación de los mismos o los bacteriófagos encapsulados, componentes fago o una combinación de los mismos o una mezcla de ambos del fago estabilizado y encapsulado también pueden proporcionarse en una forma encapsulada. Mediante "forma encapsulada" se entiende que los bacteriófagos estabilizados, fagos encapsulados, componentes fago encapsulados o estabilizados o una combinación de los mismos se proporcionan en una forma de cápsula, por ejemplo, una cápsula suave apropiada para uso farmacéutico, que puede solubilizarse dentro de un ambiente acuoso. La cápsula puede hacerse de cualquier sustancia apropiada conocida en la técnica, por ejemplo, pero no limitada a gelatina, laca, derivados de metacrilato, un sintético, u otros compuestos y puede comprender componentes adicionales tales como estabilizadores y colorantes como serían conocidos por una persona experta en la técnica.

Los bacteriófagos estabilizados, los componentes fago o una combinación de los mismos, los bacteriófagos encapsulados, los componentes fago o una combinación de los mismos también pueden proporcionarse en una forma de tableta. Por "forma de tableta" se entiende que los fagos estabilizados o componentes fago o una mezcla de ambos los fagos estabilizados y encapsulado se proporcionan en una tableta comprimida que se disuelve en un ambiente acuoso. La tableta puede hacerse de cualquier sustancia apropiada conocida en la técnica, por cualquier método conocido apropiado en la técnica. Por ejemplo, la tableta puede comprender aglomerantes y otros componentes necesarios en la producción de una tableta como se conoce por un experto en la técnica. La tableta puede ser una tableta de liberación inmediata, en donde los bacteriófagos o componentes fago se liberan en el alimento líquido en la disolución de la tableta o puede comprender una composición de liberación cronometrada, en donde los bacteriófagos, componentes fago o ambos se liberan dentro de un ambiente acuoso en una manera tiempo dependiente. Ver WO 02/45695; WO 03/051333; US 4,6001 ,894; US 4,687,757, US 4,680,323, US 4,994,276; US 3,538,214 US (que se incorporan en este documento como referencia) para varios ejemplos de formulaciones de liberación en tiempo que pueden usarse para ayudar en la liberación del tiempo controlada de los bacteriófagos o componentes fago.

Las formulaciones de tableta pueden comprender un polímero ingiriendo el fluido por ejemplo pero no limitadas a polímero s de ácido acrílico con derivados reticulados de alilsucrosa o alilpentaeritritol, incluyendo resinas de polímero acrílico insolubles en agua. Los compuestos simples o una mezcla de compuestos de este grupo de polímeros incluye por ejemplo pero no se limita a Carbopol®971-P, Carbopol®934-P, Carbopol®974P y Carbopol®EX507 (Goodrich GF o cualquier marca comercíalmente disponible con propiedades similares puede usarse). De preferencia, los polímeros de ácido acrílico tienen una viscosidad de aproximadamente 3,000 centipose a aproximadamente 45,000 centipose a 0.5% de peso/peso de la concentración en agua a 25EC y rango de tamaño de partícula primaria de desde aproximadamente 3.00 a aproximadamente 10.00 micrones en diámetro, como se determina por el Contador Coulter, derivados de almidón altamente reticulados o ligeramente reticulados, reticulados por Epiclorohidrina u oxicloruro de fósforo (POC13) o trimetafosfato de sodio solos o en mezclas; poliglucanos tales como amilosa, dextrano, succionatos de pululano y glutaratos conteniendo diésteres, reticulados solos o en mezclas; poliglucanos reticulados diéter tales como aquellos descritos en las Patentes Norteamericanas No. 3,208,994 y 3,042,667 (que se incorporan en este documento como referencia), resinas de poliacrilato reticuladas como pero no limitadas a poliacrilato de potasio y composiciones de polímero reticulado inflable en agua de la polietilenimina reticulada y o polialilamina reticulada.

Los métodos de preparación, por ejemplo de Carbopol®934R - un polímero de ácido acrílico reticulado con éter polialilo de sucrosa teniendo un promedio de 5.8 grupos alilo por cada molécula de sucrosa, puede encontrarse en las Patentes Norteamericanas Nos. 2,909,462; 3,033,754; 3,330,729; 3,458,622; 3,459,850 y 4,248,857 (que se incorporan en este documento como referencia). Cuando Carbopol®971-P se usa, la viscosidad preferida de una solución acuosa de peso/peso 0.5% es 2,000 centipose a 10,000 centipose. Más preferiblemente, la viscosidad de una solución acuosa de peso/peso 0.5% es 3,000 centipose a 8,000 centipose. Cuando se usa el Carbopol®934-P, la viscosidad preferida de una solución acuosa de peso/peso de 0.5% es 30,000 centipose a 60,000 centipose, más preferiblemente, la viscosidad de una solución acuosa de peso/peso 0.5% es 30,000 centipose a 45,000 centipose.

Los derivados de almidón reticulados (reticulados por Epiclorohidrina u oxicloruro de fósforo (POCI3) o trimetafosfato de sodio) incluyen el almidón de alta amilosa conteniendo varios grados de reticulación. Estos compuestos y sus métodos de preparación se conocen en la técnica, por ejemplo en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,807,575 y 5,456,921 (que se incorporan en este documento como referencia) y Rutenberg y Solarek (M.W. Rutenberg y D. Solarek, "Starch denvatives production and uses" en Starch Chemistry and Techology, 2da edición, Capítulo X, páginas 311-379 R L Whistler, J N BeMiller y E F Paschall, Academic Press, 1984, que se incorporan en este documento como referencia) Las formulaciones de tableta que comprenden el polímero que absorbe los fluidos hidrodinámicos también pueden formularse con un agente que se expande rápidamente en la exposición del fluido, por ejemplo un polímero de rápida expansión Por ejemplo, este agente puede comprender polímeros reticulados hidrofílicos que son capaces de la ingesta capilar rápida de agua y una expansión de volumen limitante Los ejemplos no limitantes de los polímeros de rápida expansión incluyen compuestos simples o combinaciones derivadas de la N-v?n?l-2-pirrolidona reticulada (PVP) seleccionada del grupo de po vinilpolipirrolidona químicamente idéntica tal como Polyplasdone®XL, Polyplasdone®XL-10, Polyplasdone®INF-10 (International Specialty Products) De preferencia, la N-v?n?l-2-p?rrol?dona reticulada tiene un tamaño de partícula de aproximadamente 9 micrones a aproximadamente 150 micrones y derivados de celulosa reticulados seleccionados del grupo de compuestos hidrofíhcos tales como carboximetilcelulosa reticulada (por ejemplo croscarmelosa), g colato de almidón de sodio o una combinación de los mismos La cápsula o las formulaciones de tableta pueden comprender uno o más bacteriófagos estabilizados, componentes fago o una combinación de los mismos, bacteriófagos encapsulados, componentes fago o una combinación de los mismos o una mezcla de bacteriófagos encapsulados y estabilizados, componentes fago o una combinación de los mismos Por ejemplo, la cápsula o tableta puede comprender bacteriófagos, componentes fago o una combinación de los mismos absorbidos a una matriz, los bacteriófagos, componentes fago o una combinación de los mismos, absorbidos a una matriz y encapsulados, los bacteriófagos, componentes fago o una combinación de los mismos, absorbidos a una matriz e incrustados en un soporte sólido, los bacteriófagos, componentes fago o una combinación de los mismos, absorbidos a una matriz incrustada en un soporte sólido y encapsulado o mezclas de cualquiera de los anteriores Por "liberación controlada" o "liberación cronometrada", se entiende que el agente administrado al animal se libera de la formulación en una manera tiempo dependiente. Por ejemplo, uno o más de un bacteriófago, componente fago o ambos pueden ser bacteriófagos estabilizados, bacteriófagos encapsulados, componentes fago estabilizados, componentes fago encapsulados, bacteriófagos o componentes fago que se proporcionan en la forma de cápsula, bacteriófagos o componentes fago que se proporcionan en la forma de tableta, bacteriófagos o componentes fago que se encapsulan en cápsulas, en tabletas o una combinación de los mismos, en donde las formas de cápsula encapsulada o tableta de bacteriófagos o componentes fago comprenden composiciones que liberan el bacteriófago o componentes fago en diferentes proporciones dentro del ambiente apropiado, por ejemplo un ambiente acuoso. Las composiciones del material de encapsulación, cápsula o tabletas puede incluir polímeros, ceras, geles, compuestos que absorben el agua, que repelen el agua o ambos, ácidos grasos, azúcares, proteínas o materiales sintéticos para efectuar la liberación de un agente dentro de la composición en una manera controlada. Varias composiciones de liberación controlada comprendiendo uno o más de un bacteriófago, componentes fago o ambos pueden usarse de manera que los bacteriófagos o componentes fago pueden liberarse antes de la administración a un animal, durante el paso a través del tracto digestivo del animal o después de dejar el animal.

Las composiciones antibacteriales de la presente invención exhiben las propiedades de almacenamiento deseable y pueden usarse en una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, que no se considera limitante en ninguna manera, las composiciones antibacteriales pueden usarse para aplicaciones humanas, veterinarias, de acuacultivo y agrícolas. Por ejemplo, los bacteriófagos estabilizados o bacteriófagos estabilizados incrustados en un soporte sólido puede mezclarse con alimento para peces para usarse para usarse dentro de aplicaciones de acuacultivo, incluyendo las granjas y mantenimiento de los peces para la comida y los peces para propósitos decorativos, tales como los peces tropicales. Por lo tanto, las composiciones pueden usarse para el tratamiento de árboles y plantas y aplicaciones ambientales. Por ejemplo, la composición antibacterial puede mezclarse con el alimento del ganado, aves, aves de corral, animales domésticos y pescado para ayudar a reducir el esparcimiento de bacterias blanco. Las composiciones fago de la presente invención pueden mezclarse con otros aditivos o suplementos aplicados al alimento del animal como parte del régimen alimenticio diario como se necesite. Además, el establecimiento de bacteriófagos o componentes fago en el alimento podría evitarse. Alternativamente, la adhesión del alimento o el fago encapsulado o ambos puede mejorarse para proporcionar el mezclado y distribución mejorados. En otro ejemplo, el material adicional solo o en combinación con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable que no afectará la actividad o especificidad de uno o más de un componente bacteriófago, componentes fago o ambos podrían usarse como un medicamento oral, tópico o nasal para especies humanas, mamíferos o aves. Los bacteriófagos encapsulados también pueden usarse dentro de las aplicaciones de terapia de fago incluyendo aplicaciones humanas, veterinarias, agrícolas. Por lo tanto, los bacteriófagos encapsulados pueden mezclarse con alimento para pescado para usarse dentro de aplicaciones de acuacultivo, incluyendo la agricultura y mantenimiento de peces para comida y peces para propósitos decorativos tales como peces tropicales.

Por lo tanto, la presente invención proporciona una composición antibacterial que comprende una o más de una hebra de bacteriófago, uno o más de un componente fago o ambos absorbidos en una matriz y opcionalmente por ejemplo la forma 0% a aproximadamente 95% (en peso) o cualquier cantidad entre los mismos, un portador farmacéuticamente aceptable, una loción, una crema, gel o una combinación de los mismos. La presente invención también proporciona una composición antibacterial comprendiendo una o más de una hebra de bacteriófago, uno o más de un componente fago o una combinación de los mismos, absorbido en una matriz, encapsulado o presente dentro de una formulación de liberación en tiempo. La formulación de bacteriófago de liberación de tiempo o encapsulada puede dispersarse dentro de un portador farmacéuticamente aceptable, una crema, loción, lubricante, gel o una combinación de los mismos.

La presente invención también proporciona un equipo que comprende una inyección estéril comprendiendo una composición antibacterial comprendiendo una o más de una hebra de bacteriófagos, uno o más de un componente fago o una combinación de los mismos, absorbidos en una matriz y una ampolleta de agua estéril o medio para disolver la composición. La presente invención además proporciona un equipo comprendiendo una composición antibacterial, la composición antibacterial comprendiendo una o más de una hebra de bacteriófago, uno o más de un componente fago o una combinación de los mismos, absorbidos en una matriz y encapsulados o dentro de una formulación de liberación en tiempo y una ampolleta de agua estéril o medio para disolver la composición.

La presente invención también proporciona un método para tratar una herida o una infección en la piel comprendiendo aplicar una composición antibacterial o una composición antibacterial encapsulada como se describe en este documento, comprendiendo una o más de una hebra de bacteriófago, uno o más de un componente fago o una combinación de los mismos absorbidos en una matriz, un portador farmacéuticamente aceptable, una crema, loción, lubricante, gel o combinación de los mismos a la herida o la infección de la piel. La presente invención también proporciona un método para tratar una herida o una infección en la piel, comperndeindo aplicar una composición antibacterial como se describe en este documento, por ejemplo una composición antibacterial encapsulada o una composición antibacterial de liberación en tiempo, comprendiendo una o más de una hebra de bacteriófago, uno o más de un componente fago o una combinación de los mismos, un portador farmacéuticamente aceptable, una crema, una loción, gel o una combinación de los mismos a la herida o infección de la piel. Por lo tanto, la composición antibacterial de la presente ¡nvención puede usarse para tratar una infección bacterial en un animal, incluyendo humados. Dicho tratamiento puede involucrar introducir la composición antibacterial al animal nasal u oralmente, por ejemplo, la composición puede administrarse como un inhalante en polvo o como un aditivo en el alimento.

La presente invención también proporciona una composición que comprende un alimento para el animal mezclado con una composición antibacterial inmovilizada, una composición antibacterial que se ha encapsulado o una formulación de liberación controlada o liberada en tiempo de una composición antibacterial, en donde la composición comprende una o más de una hebra de bacteriófago. El alimento del animal puede seleccionarse del grupo que consiste de un alimento para aves, un alimento para peces, un alimento porcino, un alimento para ganado, un alimento para aves de corral, un alimento para animales domésticos y un alimento para acuacultivo.

La presente invención además se ilustrará en los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS Eiemplo 1 : Aislamiento, amplificación y concentración del fago Los bacteriófagos se aislaron de muestras de estiércol obtenidas de las granjas de res diarias a través de Canadá. Las muestras de estiércol se reaccionaron con E. Coli 0157:H7 y se emplataron en platos de agar. Cualquier placa de fago obtenida se aisló y se purificó como mediante los protocolos de purificación de fago estándares (Maniatis et al (1981 ) Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Los fagos purificados aislados como se señala en el Ejemplo 1 se amplificaron usando la hebra de aislamiento E. coli 0157:H7. El fago y la bacteria purificados se mezclaron juntos, se dejaron reposar a temperatura ambiente por 10 minutos y se amplificaron de conformidad con los protocolos estándares comúnmente usados en la técnica (Maniatis et al (1981 ) Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Las muestras amplificadas en el caldo LB se esterilizaron con filtro y se usaron.

Las concentraciones de las soluciones de bacteriófagos se determinaron usando protocolos de concentración de fago estándares (Maniatis et al (1981 ) Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Las preparaciones conteniendo los fagos se diluyeron con LB, se mezclaron y se incubaron con E. coli 0157:H7 por 10 minutos y se emplataron en platos de agar. La concentración de fagos se determinó del número de placas obtenidas en las diferentes diluciones y se multiplicaron con el factor de dilución apropiado.

Eiemplo 2: Inmovilización de fagos Los fagos específicos P10 y R4 E coli 0157:H7 preparados como se describió en el ejemplo 1 , se inmovilizaron en dos diferentes matrices: leche en polvo (libre de grasa), proteína de soya y peptona de plantas. El polvo de leche (Camation) y la proteína de soya (Supro) se obtuvieron en almacenes de comida locales. Se usaron protocolos idénticos para todos los materiales. 50 g de polvo (leche en polvo, proteína de soya o peptona de plantas) se roció en un plato de vidrio. Los fagos en solución se rociaron uniformemente en cada matriz espolvoreada. Variando las concentraciones de fagos, oscilando de 105 pfu/g a 109 pfu/g, se usaron con leche en polvo, cada producción con resultados similares. El polvo de fago se mezcló y se secó a 37°C por 2 horas, o hasta que se secó completamente. La composición de bacteriófagos resultantes se baso en un polvo fino, con tamaños de partículas en el rango de 50-600 µm y un tamaño de partícula promedio de 200 µm. 0.5 gramos de cada composición de bacteriófago en polvo se re-suspendió en 10 ml de agua de osmosis inversa (RO) y la recuperación de los fagos se probó. La leche en polvo, la proteína de soya en polvo o la peptona de plantas, en la ausencia de bacteriófagos se usó como un control. La agrupación ligera de la composición de bacteriófagos comprendiendo proteína de soya se observó cuando se re-suspendió en agua RO. Los resultados para las composiciones de bacteriófagos preparados usando polvo de leche seco como la matriz se presentan en la Figura 1. Los resultados para las composiciones de bacteriófagos preparadas usando proteína de soya como la matriz se presentan en la Figura 2, y la peptona de plantas se muestra en la Figura 4.

Para la leche en polvo o inmovilizada de fago, los resultados muestran que el fago puede recuperarse de la composición de bacteriófagos y no se observo perdida en la actividad. La Figura 1 muestra que la concentración de fago obtenida después de la inmovilización ("Después) es similar a la cantidad de fago agregada al polvo ("Antes"). Se observaron resultados similares para las composición de bacteriófagos comprendiendo proteína de soya (Figura 2: Después - fago inmovilizado, Antes- cantidad de fago agregado a la matriz). Para el fago inmovilizado en la proteína de soya, una disminución ligera en la recuperación del fago se observó la cual puede deberse al rompimiento de la proteína de soya en la adición de agua RO. De nuevo como se muestra en la Figura 4, la concentración de fago obtenido después de la inmovilización ("Después") es similar a la cantidad de fago agregado al polvo ("Antes") usando la peptona de plantas como una matriz.

Estos resultados también muestran que los fagos inmovilizados se liberan rápidamente de una matriz cuando se introduce a un medio acuoso.

Eiemplo 3: Encapsulación de composición de bacteriófagos Las composiciones de bacteriófagos se prepararon como se describe en el Ejemplo 2 y se proporcionan como microcápsulas o microesferas. Generalmente, las microcápsulas se producen mediante incrustar la composición de bacteriófago en un soporte sólido incluyendo proteína de soya o polvo en leche (otros soportes sólidos incluyen microlechos, material basado en celulosa, material basado en carbohidratos, manitol, sorbitol, proteína de suero de leche, proteína de algas, proteína de célula simple, caseína, gelatina, laca) con un tamaño de partícula de aproximadamente 1 mm. Las microesferas se producen mediante triturar la preparación de fago estabilizado y mezclarlo en fusión de lípidos para producir microesferas de desde aproximadamente 0.01 mm a aproximadamente 1 mm.

Las microcápsulas posteriormente se encapsulan mediante cualquier método apropiado, por ejemplo, atomización de disco devanado, recubrimiento con suspensión de aire usando un recubridor de rocío de lecho de fluido, el bacteriófago también puede cubrirse usando el método descrito en la Patente Norteamericana No. 2003/0109025 (que se incorpora en este documento como referencia en su totalidad), o mediante mezclado de una solución orgánica comprendiendo un solvente, por ejemplo pero no limitado a cloruro de metileno, acetato de metilo, acetato de etilo, cetona éter metílica, acetona, alcoholes y otros solventes o combinaciones del mismo conteniendo la sustancia de recubrimiento Brevemente, para la atomización de disco devanado, las composiciones fago se dispersan en una fusión caliente o una solución orgánica conteniendo la sustancia de recubrimiento La dispersión se alimenta en el centro de un disco giratorio y el material se atomiza a medida que deja la periferia del disco El material encapsulado se colecta usando un separador de ciclón o un lecho de almidón de alimento modificado. En el recubrimiento de suspensión de aire, un recubpdor de roción de lecho de fluido se usa Las partículas sólidas se suspenden por un chorro de aire que induce un flujo cíclico suave pasando una boquilla que atomiza la sustancia de recubrimiento Una vez rociadas, las partículas se levantan por el chorro de aire a medida que el recubrimiento se seca Las partículas se circulan pasando la boquilla hasta que se aplica un recubrimiento uniforme Las partículas se circulan hasta que se ha aplicado el espesor de película deseado Las microesferas se encapsulan usando la atomización de disco devanado Cada una de las microcápsulas y microesferas se encapsulan con cada una de las sustancias de recubrimiento siguientes ácido palmítico, ácido esteárico, laca sobre-cubierta con ácido palmítico, ácido esteárico, HPMCP sobre cubierto con ácido palmítico, ácido esteárico, CAP sobre cubierto con ácido palmítico, ácido esteárico, HPMCAS sobre cubierto con ácido palmítico, ácido esteárico, PVAP sobre cubierto con ácido palmítico, ácido esteárico y metacplato sobre cubierto con ácido palmítico, ácido esteárico Otros ácidos grasos también pueden usarse en una manera similar para el sobre recubrimiento Una vez que la operación de recubrimiento se completa, las partículas de fago estabilizadas encapsuladas se colectan y se almacenan en contenedores herméticos El efecto de encapsulación en la concentración de las composiciones de bacteriófagos se evalúa mediante determinar la actividad de la preparación de fago estabilizada antes ("Antes") y después ("Después") de la encapsulación Para este análisis, los bacteriófagos sé re-suspendieron y se trituraron usando un mezclador Los bacteriófagos re-suspendidos encapsulados estabilizados se mezclan o tratan con el mecanismo de liberación apropiado, por ejemplo la alternación en pH o la exposición a un ambiente acuoso para interrumpir las partículas encapsuladas y liberar los bacteriófagos Para la liberación de bacteriófagos mediante mezclado, 0 5 g de fagos estabilizados encapsulados se mezcla con 45 5 ml del medio de re-suspensión (Caldo LB o agua RO) y 250 µl de agente antiespuma se agrega para prevenir la espuma después de la trituración Los resultados demuestran que los bacteriófagos pueden recuperarse de una composición de bacteriófagos encapsulados y la encapsulación no inactiva el fago inmovilizado Eiemplo 4 Estabilidad y liberación de los bacteriófagos encapsulados Los fagos se encapsulan como se describe en el Ejemplo 3 La liberación de los fagos estabilizados encapsulados en la interrupción física o química se prueba en la siguiente manera 0 5 g de fago encapsulado estabilizado se mezcla con 45 5 ml de medio de re-suspensión (caldo LB o agua RO) 250 µl de agente antiespuma se usa para prevenir la espuma en la trituración Una muestra de control de los fagos encapsulados estabilizados se prepara como se describió anteriormente pero no se someten a trituración para determinar la lixiviación no específica de los bacteriófagos encapsulados dentro del medio de re-suspensión La estabilidad de los bacteriófagos encapsulados en un pH bajo también se examina Después de la re-suspensión (como se señalo anteriormente), los fagos estabilizados encapsulados se incuban por 30 ó 60 minutos en un pH 2 15, se neutralizan a un pH 7 0 usando NaOH, entonces se trituran usando un mezclador, otro ejemplo (control) se resuspende e inmediatamente se tritura Ambas las muestras de control y las muestras de prueba se esterilizan con filtro usando un filtro de jeringa de 0 45 µm antes de usarse Los resultados demuestran que los bacteriófagos pueden liberarse siguiendo la interrupción de partículas de bacteriófagos encapsuladas. Por lo tanto, estos resultados muestran que el bacteriófago puede exponerse a un pH de 2.15 por un periodo de tiempo prolongado, con poca o ninguna actividad de pérdida (concentración). Los resultados para los bacteriófagos no estabilizados y no encapsulados son consistentes con los resultados de Jepson y March (2004, Vaccine, 22:2413-2419), en donde la pérdida dramática de la viabilidad de los bacteriófagos se observó después de solo 5 minutos en un pH debajo de un pH 2.2. Esta pérdida en la actividad es obvia por la encapsulación de los bacteriófagos como se describen en la presente invención.

Eiemplo 5: Estabilidad del fago inmovilizado Los bacteriófagos se inmovilizaron en una matriz, en este caso el polvo de leche como se describe en el Ejemplo 2 y el material se almacenan a temperatura ambiente (TA) o a 4°C (4C9 en contenedores herméticos. Las muestras se obtienen en diferentes puntos de tiempo y las concentraciones de fago se determinan sobre un periodo de 10 meses. La concentración de fago inicial fue 3x106 pfu/g.

La Figura 3 muestra que los fagos inmovilizados (composición de bacteriófagos) son estables a temperatura ambiente o 4°C por al menos 131 días (45 meses) y es estable por al menos 311 días (10 meses) a 4°C. La adición de un desecante, o almacenaje de los bacteriófagos en un ambiente disecado puede además incrementar la viabilidad de la composición de los bacteriófagos.

Eiemplo 6: Fago inmovilizado en crema y loción La viabilidad de los fagos inmovilizados (composición de bacteriófagos) incorporada en una loción o crema también se investigó.

Dos gramos de loción (loción de manos Vaselina) o crema (crema GlicoMed) se pesaron en un plato de Petri estéril. El pfu/g deseado del fago inmovilizado, P10 y R26 se agregaron a la loción o crema y se mezclaron completamente La bacteria se roció en platos de agar LB y se permitió cultivar a 37°C por dos a tres horas para formar un césped uniforme Dos piezas de cm2 de papel de filtro, dos por plato, se colocaron en el césped y la loción comprendiendo los bacteriófagos o la crema comprendiendo los bacteriófagos, fueron cada uno rociados en un papel filtro Las alícuotas de la loción o crema sin el fago (control) se rociaron en el otro papel filtro para determinar si la loción o crema tuvieron propiedades antimicrobiales Una mancha de loción o crema conteniendo los bacteriófagos también se colocó directamente en el césped bacterial Varias diluciones de los bacteriófagos dentro de cada uno de la loción o crema se probaron Los platos se incubaron durante la noche a 37°C Cada tratamiento se registró como un "Sí" o un "No" dependiendo de la presencia o ausencia de la zona de inhibición, respectivamente y los resultados se presentaron en la Tabla 1 Tabla 1 Eficacia de las composiciones de bacteriófagos (fagos inmovilizados) en loción o crema para manos pfug Material Técnica Fago 1 00E+07 1.00E+06 1 00E+05 1.00E+04 Loción Relleno P10 Si Si Si SI (5/6) Loción Mancha P10 SI SI SI Si (1/3) Loción Relleno - No No No No Crema Relleno P10 Si Si Si Si Crema Mancha P10 SI Si SI SI Crema Relleno — No No No No pfug Material Técnica Fago 1 O0E+07 1 00E+06 1 00E+05 1 OOE+04 Loción Relleno R26 Si Sl S il (2/3) Si (1/3) Loción Mancha R26 SI Si Si Si Loción Relleno - No No No No Crema Relleno R26 Si Si Si Si Crema Mancha R26 Si Si SI SI Crema Relleno - No No No No Una zona de inhibición del crecimiento bacterial se observó en donde la actividad de los fagos podría recuperarse La loción y la crema conteniendo los fagos inmovilizados encapsulados ambas mostraron actividad antibacterial, mientras la loción o la crema solas no muestran inhibición del crecimiento bacterial Estos resultados indican que las composiciones de bacteriófagos preparadas de conformidad con la presente invención pueden mezclase dentro de las preparaciones de loción y crema para usarse como lociones o cremas antibacteriales La estabilidad mejorada de los bacteriófagos se observó para los bacteriófagos inmovilizados en cremas.

Eiemplo 7: Liberación de los bacteriófagos activos Los bacteriófagos específicos E coli 0157 se encapsularon como se describió previamente en los Ejemplos 3 y 4. Los fagos encapsulados posteriormente se mezclaron con otros suplementos y se agregaron al alimento del animal en una cantidad de aproximadamente 1-50 g por animal por dosis. La alimentación posteriormente se alimentó al animal una vez por día por 5 a 7 días antes de la matanza. Alternativamente, una dosis de mantenimiento se da al animal cada 1-3 días.

El análisis del estiércol de animal reveló un incremento en el E. coli 0157 en el animal, indicando que los bacteriófagos activos se liberaron al intestino del animal.

Todas las citas se incorporan en este documento como referencia.

La presente invención se ha descrito con respecto a una o más modalidades. Sin embargo, será aparente para aquellas personas expertas en la técnica que un número de variaciones y modificaciones pueden hacerse sin apartarse del alcance de la invención como se define en las reivindicaciones.

Claims (26)

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir una composición antibacterial que comprende: absorber uno o más de un bacteriófago, uno o más de un componente fago o una combinación de los mismo, en una solución acuosa en una matriz seca para producir una composición estabilizada, la matriz permanece en un estado semi-seco o seco y secar la composición estabilizada para producir la composición antibacterial.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la matriz se selecciona del grupo que consiste de polvo de lecha desnatada, proteína de soya, polvo de proteína de suero de leche, polvo de albúmina, caseína, gelatina, proteína de algas y otras proteínas celulares simples, peptona de plantas, trehalosa, manitol, azúcar, alcohol de azúcar, lechos de látex, materiales basados en carbohidratos solubles en agua, quitina y cartílago de pescado.

3. Una composición antibacterial producida por: absorber uno o más de un bacteriófago, uno o más de un componente fago o una combinación de los mismos en una solución acuosa en una matriz seca para producir una composición estabilizada, la matriz permaneciendo en un estados semi-seco o seco y secar la composición estabilizada para producir la composición antibacterial, en donde existe poca o ninguna pérdida de bacteriófagos en la composición antibacterial cuando se compara con la cantidad de bacteriófagos en la solución acuosa.

4. La composición antibacterial de conformidad con la reivindicación 3, en donde uno o más de un componente fago se selecciona del grupo que consiste de una cola de fago, una proteína fago y una combinación de los mismos.

5. La composición antibacterial de conformidad con la reivindicación 4, en donde la matriz soluble se selecciona del grupo que consiste de polvo de leche desnatada, proteína de soya, polvo de proteína de suero de leche, polvo de albúmina, caseína, gelatina, proteína de algas y otras proteínas celulares simples, peptona de plantas, trehalosa, manitol, azúcar, alcohol de azúcar, lechos de látex, materiales basados en carbohidratos solubles en agua, quitina y cartílago de pescado.

6. La composición antibacterial de conformidad con la reivindicación 3, además comprende un portador farmacéuticamente aceptable.

7. La composición antibacterial de conformidad con la reivindicación 6, que además comprende una crema, loción, lubricante o gel.

8. Un equipo que comprende una ampolleta estéril comprendiendo la composición antibacterial de conformidad con la reivindicación 6 y una ampolleta de agua estéril para disolver la composición.

9. Un método para tratar una herida o una infección en la piel que comprende aplicar la composición antibacterial de conformidad con la reivindicación 7 a la herida o la infección de la piel.

10. Un método para almacenar el bacteriófago comprendiendo mezclar la composición antibacterial de conformidad con la reivindicación 3 con una crema, loción o gel.

11. Un método para almacenar el bacteriófago comprendiendo preparar la composición antibacterial de conformidad con el método de la reivindicación 1 y colocar la composición antibacterial en un contenedor hermético al aire.

12. Un método de tratamiento de una infección bacterial en un animal comprendiendo introducir la composición antibacterial de la reivindicación 3 al animal nasal u oralmente.

13 El método de conformidad con la reivindicación 12, en donde la etapa de introducir la composición antibacterial se administra nasalmente

14 El método de conformidad con la reivindicación 12, en donde en la etapa de introducir la composición antibacterial se administra oralmente

15 El método de conformidad con la reivindicación 14, en donde la composición antibacterial se administra como un inhalante en polvo

16 El método de conformidad con la reivindicación 14, en donde la composición antibacterial se administra como un aditivo en la comida

17 Una composición que comprende un alimento para animal mezclado con la composición antibacterial de la reivindicación 3

18 La composición de conformidad con la reivindicación 17, en donde el alimento del animal se selecciona del grupo que consiste de un alimento para humanos, un alimento para aves, un alimento para peces, un alimento para cerdos, un alimento para ganado, un alimento para aves de corral, un alimento para animales domésticos y un alimento para acuacultivo

19 La composición de bacteriófagos de conformidad con la reivindicación 3, en donde la composición se formula en una tableta

20 La composición de bacteriófagos de conformidad con la reivindicación 19, en donde la matriz se selecciona del grupo que consiste de polvo de leche desnatada, polvo de suero de leche, polvo de proteína de soya, polvo de proteína de suero de leche, polvo de albúmina, caseína, gelatina, proteina de algas y otras proteínas celulares simples, peptona de plantas, trehalosa, manitol, azúcar en polvo, alcohol de azúcar, lechos de látex, un material basado en carbohidratos solubles en agua, quitina y cartílago de pescado.

21. La composición de bacteriófagos de conformidad con la reivindicación 19, en donde la tableta además comprende componentes que permiten la liberación controlada del bacteriófago estabilizado, uno o más de un componente fago estabilizado o una combinación de los mismos.

22. La composición de bacteriófagos de conformidad con la reivindicación 3, en donde la composición se formula con una cápsula.

23. La composición de bacteriófagos de conformidad con la reivindicación 22, en donde la matriz se selecciona del grupo que consiste de polvo de leche desnatada, polvo de suero de leche, polvo de proteína de soya, polvo de proteína de suero de leche, polvo de albúmina, caseína, gelatina, proteína de algas y otras proteínas celulares simples, peptona de plantas, trehalosa, manitol, azúcar en polvo, alcohol de azúcar, lechos de látex, un material basado en carbohidratos solubles en agua, quitina y cartílago de pescado.

24. La composición de bacteriófagos de conformidad con la reivindicación 22, en donde la cápsula está comprendida de gelatina, cera, metacrilatos o laca.

25. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la matriz se incrusta en un soporte sólido.

26. El método de conformidad con la reivindicación 25, en donde el soporte sólido se selecciona del grupo que consiste de microlechos, material basado en celulosa, material basado en carbohidratos, laca, metacrilatos, azúcar, manitol, sorbitol, proteína de soya, proteína de suero de leche, proteína de algas, proteína de célula simple, caseína, gelatina y polvo de leche. 27 La composición antibacterial de conformidad con la reivindicación 3, en donde la matriz se incrusta en un sólido soporte 28 La composición antibacterial de conformidad con la reivindicación 27, en donde el soporte sólido se selecciona del grupo que consiste de un microlecho, material basado en celulosa, material basado en carbohidratos, laca, metacnlatos, azúcar, manitol, sorbitol, proteína de soya, proteína de suero de leche, proteína de algas, proteína de células simples, caseína, gelatina y polvo de leche 29 El método de conformidad con la reivindicación 12, en donde el animal es un humano