MX2007004822A

MX2007004822A - Formulaciones de dosificacion oral de polipeptidos resitentes a proteasas.

Info

Publication number: MX2007004822A
Application number: MX2007004822A
Authority: MX
Inventors: Gilles Borrelly; Caroline Chauchard; Lila Drittanti; Manuel Vega
Original assignee: Nautilus Biotech
Priority date: 2007-04-19
Filing date: 2007-04-19
Publication date: 2009-03-02

Abstract

Se proporciona formulaciones de dosificación oral de polipéptidos terapéuticos resistentes a proteasas. Las formulaciones de dosificación para administración por dosis y por día o por semana son mayores que la dosificación subcutánea. Se incluye entre las formulaciones de dosificación oral tabletas y cápsulas, incluyendo formas con recubrimiento entérico. Se proporciona métodos para el tratamiento o la prevención de enfermedades o condiciones que son tratables o prevenibles mediante la administración de tales formulaciones de dosificación oral de polipéptidos resistentes a las proteasas.

Description

FORMULACIONES DE DOSIFICACIÓN ORAL DE POLIPEPTIDOS RESISTENTES A PROTEASAS Y USOS DE LOS MISMOS PARA TRATAMIENTO SOLICITUDES RELACIONADAS La solicitud está relacionada con la Solicitud de los Estados Unidos con número de serie 11/176.830, de Rene Gantier, Thierry Guyon, Manuel Vega y Lila Drittanti, titulada "RATIONAL EVOLUTION OF CYTOKINES FOR HIGHER STABILITY, THE CYTOKINES AND ENCODING NUCLEIC ACID MOLECULES" (EVOLUCIÓN RACIONAL DE CITOQUINAS PARA OBTENER UNA MAYOR ESTABILIDAD, DICHAS CITOQUINAS Y LAS MOLÉCULAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS QUE LAS CODIFICAN"), presentada el 6 de julio de 2005 y publicada como la Solicitud de los Estados Unidos No. US-2006-0020116, la cual es una continuación de la Solicitud de los Estados Unidos con número de serie 10/658.834, de Rene Gantier, Thierry Guyon, Manuel Vega y Lila Drittanti, titulada "RATIONAL EVOLUTION OF CYTOKINES FOR HIGHER STABILITY, THE CYTOKINES AND ENCODING NUCLEIC ACID MOLECULES" (EVOLUCIÓN RACIONAL DE CITOQUINAS PARA OBTENER UNA MAYOR ESTABILIDAD, DICHAS CITOQUINAS Y LAS MOLÉCULAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS QUE LAS CODIFICAN"), presentada el 8 de septiembre de 2003, y publicada como la Solicitud de los Estados Unidos No. US-2004-0132977-A1. Esta solicitud también está relacionada con la Solicitud de los Estados Unidos con número de serie 11/196.067, de Rene Gantier, Thierry Guyon, Cruz Ramos Hugo, Manuel Vega y Lila Drittanti, titulada "RATIONAL DIRECTED PROTEIN EVOLUTION USING TWO-DIMENSIONAL RATIONAL MUTAGENESIS SCANNING" ("EVOLUCIÓN DIRIGIDA RACIONAL DE PROTEÍNAS USANDO EXPLORACIÓN RACIONAL BIDIMENSIONAL POR MUTAGENESIS"), presentada el 2 de agosto de 2005, y publicada como la Solicitud de los Estados Unidos No. US-2006-0020396-A1, la cual es una continuación de la Solicitud de los Estados Unidos con número de serie 10/658.355, de Rene Gantier, Thierry Guyon, Cruz Ramos Hugo, Manuel Vega y Lila Drittanti, titulada "RATIONAL DIRECTED PROTEIN EVOLUTION USING TWO-DIMENSIONAL RATIONAL MUTAGENESIS SCANNING" ("EVOLUCIÓN DIRIGIDA RACIONAL DE PROTEÍNAS USANDO EXPLORACIÓN RACIONAL BIDIMENSIONAL POR MUTAGENESIS"), presentada el 8 de septiembre de 2003 y publicada como la Solicitud de los Estados Unidos No. US 2005-0202438. Esta solicitud está relacionada también con la Solicitud de los Estados Unidos con número de serie 10/658.834, presentada el 8 de septiembre de 2003, y con la Solicitud Internacional PCT publicada número WO 2004/022593, de Rene Gantier, Thierry Guyon, Manuel Vega y Lila Drittanti, titulada "RATIO AL EVOLUTION OF CYTOKINES FOR HIGHER STABILITY, THE CYTOKINES AND ENCODING NUCLEIC ACID MOLECULES" (EVOLUCIÓN RACIONAL DE CITOQUINAS PARA OBTENER UNA MAYOR ESTABILIDAD, DICHAS CITOQUINAS Y LAS MOLÉCULAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS QUE LAS CODIFICAN"). Esta solicitud está relacionada también con la Solicitud de los Estados Unidos con número de serie 10/658.355, presentada el 8 de septiembre de 2003, y con la Solicitud Internacional PCT número WO 2004/022747, de Rene Gantier, Thierry Guyon, Cruz Ramos Hugo, Manuel Vega y Lila Drittanti, titulada "RATIONAL DIRECTED PROTEIN EVOLUTION USING TWO-DIMENSIONAL RATIONAL MUTAGENESIS SCANNING" ("EVOLUCIÓN DIRIGIDA RACIONAL DE PROTEÍNAS USANDO EXPLORACIÓN RACIONAL BIDIMENSIONAL POR MUTAGENESIS"). Cuando esté permitido, la materia sujeto de cada una de las solicitudes relacionadas anteriormente referenciadas se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Se proporciona formulaciones de dosificación oral de polipéptidos resistentes a las proteasas . Se proporciona métodos para el tratamiento o la prevención de enfermedades o condiciones que son tratables o prevenibles mediante la administración de los polipéptidos resistentes a las proteasas.

ANTECEDENTES Se ha aprobado polipéptidos terapéuticos para el tratamiento de una variedad de enfermedades y condiciones, incluyendo, pero no limitándose a, enfermedades proliferativas , tales como cáncer, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, infecciones virales, infecciones bacterianas, desórdenes sanguíneos, enfermedades cardiovasculares, enfermedades respiratorias, desórdenes neurológicos , desórdenes gastrointestinales, y enfermedades metabólicas, tales como la obesidad. Aunque se desea una administración oral, las proteínas terapéuticas se administran típicamente vía inyección o a través de otra ruta que evite el tracto digestivo. Después de la administración oral, estas proteínas son digeridas continuamente por proteasas luminales del tracto gastrointestinal, lo que resulta en baja o nula absorción de la proteína terapéutica hacia la sangre. La degradación gastrointestinal u otra degradación proteolítica de las proteínas terapéuticas impiden la administración per-oral. De esta manera, la administración oral de las proteínas terapéuticas para uso clínico es un desafío para la ciencia farmacéutica que aún queda por resolver. Es deseable contar con formulaciones de dosificación oral de tales polipéptidos terapéuticos. Por ende, entre los objetivos del presente documento, está el proporcionar formulaciones orales de polipéptidos terapéuticos.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Se proporciona formulaciones de dosificación oral, tales como tabletas o cápsulas, de polipéptidos terapéuticos. Los polipéptidos terapéuticos están modificados en sus secuencias primarias, típicamente con uno o dos cambios aminoacídicos , para hacerlos más resistentes a las proteasas que cuando dichas modificaciones no están presentes. Las formulaciones contienen una cantidad de polipéptidos terapéuticos modificados de manera tal que después de su administración oral se entrega a la corriente sanguínea una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido. Las formulaciones de dosificación pueden incluir una o más unidades de dosificación, cada una de las cuales contiene una cantidad de dosificación completa o una fracción de la misma. Las formulaciones de dosificación generalmente contienen una cantidad de polipéptido terapéutico que es mayor, alrededor de T-200 veces, tales como alrededor de 10-100 veces, incluyendo, por ejemplo, 15-50, 20-30, 10-35, 10-45, típicamente alrededor de 15-40 veces mayor (dependiendo de la proteína terapéutica, la indicación de tratamiento y la formulación) para administración diaria, en comparación con las cantidades que son administradas en forma subcutánea para la misma indicación usando la misma proteína terapéutica que no tiene los aminoácidos modificados que la hacen resistente a proteasas . Por ende, si, por ejemplo, se administra 1 mg/día a un hombre de 70 kg por vía subcutánea, se administra 6 a 200 mg o más por vía de formulaciones orales. La dosificación en particular depende del polipéptido terapéutico y la formulación de dosificación oral y, si es necesario, puede ser determinada empíricamente. Los regímenes de dosificación, tal como el número de administraciones por semana, pueden variar dependiendo de la proteína terapéutica y la indicación. Para la administración oral, la dosificación total por semana, por ejemplo, es mayor, 10-200 veces o más, que la dosificación semanal subcutánea de la misma proteína terapéutica que no está modificada para ser resistente a proteasas . En particular, se proporciona formulaciones de dosificación para polipéptidos terapéuticos resistentes a proteasas que contienen una cantidad de una proteína terapéutica suficiente, después de su administración oral a un sujeto, para alcanzar niveles terapéuticamente efectivos en el torrente sanguíneo del sujeto. La proteína terapéutica está modificada en su secuencia primaria de aminoácidos, por medio de lo cual se hace más resistente a proteasas que en ausencia de las modificaciones, y la proteína puede alcanzar niveles terapéuticamente efectivos en el torrente sanguíneo después de la administración oral; y la cantidad es de alrededor de 10-100 veces, típicamente 10-50, 15-45, 15-40 veces la dosis subcutánea para la misma indicación y para la misma proteína terapéutica que no ha sido modificada para ser resistente a proteasas. La dosificación se refiere a lo que se administra en un día. Cuando se compara en base semanal, la diferencia es mayor, tal como 10-1000, 10-600 veces mayor, para una dosificación oral en comparación con una dosificación subcutánea. La dosificación oral, sin embargo, tiene una administración más conveniente y con ella se observa un mayor compromiso por parte del paciente. También, como se muestra en este documento, la farmacocinética de la administración de dosificaciones orales puede ser mejor controlada y más uniforme. Las unidades de dosificación en las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos terapéuticos resistentes a proteasas pueden ser formuladas con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables . Las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos terapéuticos resistentes a proteasas pueden contener unidades de dosificación que están recubiertas para liberar el polipéptido en el tracto gastrointestinal o partes del mismo. Por ejemplo, se proporciona formulaciones de dosificación oral o unidades de dosificación oral que contienen una o más unidades de dosificación que poseen recubrimientos entéricos. Los polipéptidos terapéuticos resistentes a proteasas en las unidades de dosificación o en las formulaciones de dosificación oral pueden están modificados en su actividad o estructura, tal como para incluir glicosilación, carboxilación, hidroxilación, hasilación, carbamilación, sulfatación, fosforilación y/o PEGilación. Se incluye polipéptidos terapéuticos resistentes a proteasas que están hiperglicosilados .

También pueden modificarse otras actividades y propiedades de los polipéptidos . El polipéptido terapéutico resistente a proteasas puede contener modificaciones adicionales. Tales modificaciones pueden incluir modificaciones de aminoácidos que contribuyen a una actividad aumentada, inmunogenicidad alterada, estabilidad, tolerancia térmica, resistencia a proteasas, glicosilación, carboxilación, hidroxilación, hasilación, carbamilación, sulfatación, fosforilación o PEGilación. Tales modificaciones de aminoácidos pueden ser aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales y/o una combinación de aminoácidos naturales o no naturales. Entre las proteínas terapéuticas que son modificadas, se encuentran variantes resistentes a proteasas de factores de coagulación, citoquinas, factores de crecimiento, hormonas, hidrolasas, inmunoglobulinas , proteínas inhibitorias, proteínas nucleares y proteasas, tales como, pero no limitadas a, interleuquina-10 , un interferón- ß , un interferón alfa, interferón gamma, factor estimulador de colonias de granulocitos , factor de inhibición de leucemia, una hormona de crecimiento, factor neurotrófico ciliar, leptina, insulina, oncostatina M, relaxina, interleuquina- 6 , interleuquina- 12 , eritropoyetina, factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos, interleuquina-2 , interleuquina-3 , interleuquina-4 , interleuquina-5 , interleuquina- 13 , ligandos de receptores, tales como ligandos Flt3, anticuerpos monoclonales , fragmentos de anticuerpos, cameloides y factores de células troncales. Las modificaciones que aumentan la resistencia a proteasas pueden ser sólo modificaciones en la secuencia de aminoácidos en comparación con una proteina de tipo salvaje. Los polipéptidos terapéuticos resistentes a proteasas pueden incluir modificaciones adicionales que alteran otras propiedades aparte de la resistencia a proteasas en la secuencia de aminoácidos, en comparación con una proteina de tipo salvaje. Las modificaciones adicionales incluyen aquéllas que, después de la expresión en sistemas de expresión adecuados, añaden uno o más sitios de glicosilación para producir proteínas hiperglicosiladas . La modificación con respecto a la resistencia a proteasas se compara con la ausencia de las modificaciones que resultan en resistencia a proteasas. Los ejemplos de proteínas terapéuticas no modificadas que pueden ser modificadas para exhibir una resistencia a proteasas aumentada son cualquiera de las proteínas expuestas en el Listado de Secuencias, tales como, pero no limitadas a, interleuquina- 10 (IL-10; ID SEC NO: 809), interferón beta (IFN-ß; ID SEC NO: 147), interferón alfa-2a (IFNa-2a; ID SEC NO: 2162), interferón alfa-2b (IFNa-2b; ID SEC NO: 2067), interferón gamma (IFN-?; ID SEC NO: 661), factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF; ID SEC NO: 47) , factor inhibidor de leucemia (LIF; ID SEC NO: 1148) , hormona del crecimiento (GH; ID SEC NO: 1260) , factor neurotrófico ciliar (CNTF; ID SEC NO: 1) , leptina (ID SEC NO: 1126) , oncostatina M (ID SEC NO: 1181), interleuquina- 6 (IL-6; ID SEC NO: 1080), interleuquina- 12 (IL-12; ID SEC NO: 860); eritropoyetina (EPO; ID SEC NO: 1886) , factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF; ID SEC NO: 85), interleuquina-2 (IL-2; ID SEC NO: 946), interleuquina-3 (IL-3; ID SEC NO: 995), interleuquina-4 (IL-4; ID SEC NO: 1018), interleuquina-5 (IL-5; ID SEC NO: 1044), interleuquina- 13 (IL-13; ID SEC NO: 917), ligando de Flt3 (ID SEC NO: 118) y factor de células troncales (SCF; ID SEC NO: 1215) . Los polipéptidos terapéuticos resistentes a proteasas particulares incluyen interferón-a2a y -a2b, y hormona de crecimiento humana. Los polipéptidos terapéuticos resistentes a proteasas modificados incluyen polipéptidos cuyas secuencias se exponen en cualquiera de los ID SEC NOS: 2-46, 48-84, 86-117, 119-146, 148-660, 662-808, 810-859, 861-916, 918-945, 947-994, 996-1017-, 1019-1043, 1045-1079, 1081-1125, 1127-1147, 1149-1180, 1182-1214, 1216-1259, 1261-1885, 1887-1981, 1983-2066, y 2176-2182. Se proporciona aquí formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de IFN- resistentes a las proteasas. Los polipéptidos de IFN-a resistentes a proteasas pueden ser cualquier polipéptido de IFN-a que esté modificado en su secuencia primaria, típicamente con uno o dos cambios aminoacídicos , para hacerlo más resistente a las proteasas que cuando dichas modificaciones no están presentes. Aquí se proporciona formulaciones de dosificación oral de un polipéptido de IFN- resistente a proteasas, donde la modificación es el reemplazo de un residuo de ácido glutámico (E) con un residuo de glutamina (Q) en la posición 41 de un polipéptido de IFN-OÍ maduro expuesto en la ID SEC NO: 2067 o en una posición correspondiente en una variante alélica o de especies del mismo, y otras variantes modificadas en otros sitios. Aquí se proporciona unidades de dosificación oral de polipéptidos de IFN-OÍ terapéuticos resistentes a proteasas, formulados con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables . Las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de IFN-a resistentes a proteasas pueden ser recubiertas o no, de manera de liberar el polipéptido en el tracto gastrointestinal o partes del mismo. Aquí se proporciona formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de IFN-a resistentes a proteasas que están recubiertas con una cubierta entérica para liberar el polipéptido en el tracto gastrointestinal inferior. Aquí se proporciona formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de hormona del crecimiento resistentes a las proteasas. Los polipéptidos de hormona del crecimiento resistentes a proteasas pueden ser cualquier polipéptido de hormona del crecimiento que esté modificado en su secuencia primaria, típicamente con uno o dos cambios aminoacídicos , para hacerlo más resistente a las proteasas que cuando dichas modificaciones no están presentes. Aquí se proporciona formulaciones de dosificación oral de un polipéptido de hormona del crecimiento resistente a proteasas, donde la modificación es el reemplazo de un residuo de tirosina (Y) con un residuo de isoleucina (I) en la posición 42 de un polipéptido de hormona del crecimiento maduro expuesto en la ID SEC NO: 1260 o en una posición correspondiente en una variante alélica o de especies del mismo. Aquí se proporciona formulaciones de dosificación oral de un polipéptido de hormona del crecimiento resistente a proteasas, donde la modificación es el reemplazo de un residuo de tirosina (Y) con un residuo de histidina (H) en la posición 42 de un polipéptido de hormona del crecimiento maduro expuesto en la ID SEC NO: 1260 o en una posición correspondiente en una variante alélica o de especies del mismo. Aquí se proporciona unidades de dosificación oral de polipéptidos terapéuticos de hormona del crecimiento resistentes a proteasas, formulados con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de hormona del crecimiento resistentes a proteasas pueden ser recubiertas, por ejemplo con recubrimiento entérico, de manera de liberar el polipéptido en el tracto gastrointestinal o partes del mismo. También se proporciona tabletas o cápsulas que contienen un polipéptido terapéutico resistente a proteasas . Las tabletas y cápsulas son unidades de dosificación. Se proporciona unidades de dosificación que contienen una o más, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de las tabletas o cápsulas.

También se proporciona tabletas y cápsulas que contienen alrededor de 10-100 pg, tal como 3, 5 o 10 pg - 50 pg, 3, 5 O 10 pg - 30 pg, 3, 5 o 10 pg-40 pg, 3, 5 o 10 pg-45 pg, tal como 10-50 pg de un interferón-a (IFN-a) . Las tabletas o cápsulas ejemplares contienen 20, 30, 40 o 50 pg del IFN-a, tal como IFN-a2a o -a2b. El IFN-a2a es resistente a proteasas en virtud de modificaciones en su secuencia primaria de aminoácidos. El IFN-a puede ser IFN-a2a o IFN-a2b. La tableta o cápsula puede incluir agentes terapéuticos o activos adicionales, tales como un segundo agente terapéutico para la misma indicación que el interferón. Los agentes terapéuticos secundarios ejemplares incluyen, pero no están limitados a, análogos de nucleósidos, tal como ribavirina, un L-nucleósido, un antagonista del receptor de interferón de tipo II, un antagonista del factor de necrosis tumoral (TNF) , timosina, un inhibidor de SAPK, amantidina, un inhibidor de NS3 , un inhibidor de NS5B y un inhibidor de alfa-glucosidasa . El IFN-a, tal como IFN-a2b, puede incluir modificaciones adicionales, por medio de las cuales es hiperglicosilado después de su expresión. La cantidad se corrige para reflejar la masa adicional debida a la hiperglicosilación u otra modificación. La tableta o cápsula puede tener recubrimiento entérico. Un ejemplo del IFN-a2b modificado es el IFN-2a, tal como IFN-a2b, que contiene una modificación igual o correspondiente a E41Q en el ID SEC NO: 2067, tal como el polipéptido cuya secuencia se expone en ID SEC NO: 1995, o variantes alélicas o de especies del mismo. También se proporciona tabletas o cápsulas que contienen polipéptidos terapéuticos resistentes a proteasas, tales como hormona del crecimiento humana. La tableta o cápsula que contiene la hGH modificada puede contener, por ejemplo, 1-, 3- o 5-50 mg, 10-50 mg, 10-40 mg, 15-35 mg, 1-40 mg, 1-45 mg, 5-30 mg, 10-20 mg o 3-30 mg de hormona del crecimiento humana, en donde la hormona del crecimiento humana es resistente a proteasas. La tableta o cápsula puede contener agentes activos o terapéuticos adicionales, tales como un segundo agente terapéutico para la misma indicación que la hormona del crecimiento, tal como, por ejemplo, un análogo de hormona de liberación de gonadotropina (GNRH) , factor de crecimiento tipo insulina 1 (rhlGF-1) , un péptido de liberación de hormona del crecimiento (GRP) , un agente de regulación de ácidos grasos libres, hormona de liberación de hormona luteinizante , y un esteroide anabólico. Las tabletas o cápsulas contienen 3 mg, 12 mg, 24 mg o 30 mg del polipéptido de hormona del crecimiento resistente a proteasas . Las tabletas y capsulas pueden ser formuladas de manera de tener un recubrimiento entérico. La hormona del crecimiento humana puede contener modificaciones adicionales que alteren otras propiedades funcionales y/o actividades, tales como adición de sitios de glicosilación, de manera que durante la expresión en un sistema adecuado el polipéptido sea hiperglicosilado . Un ejemplo de polipéptidos terapéuticos resistentes a proteasas es una hormona del crecimiento humana que contiene una modificación igual o correspondiente a Y42I en el ID SEC NO: 1260 y/o variantes alélicas o de especies del mismo, tal como una hormona del crecimiento humana cuya secuencia de aminoácidos se expone en el ID SEC NO: 1318. Aquí se proporciona unidades de dosificación, tales como tabletas y cápsulas, y formulaciones de dosificación oral que contienen una o más unidades de dosificación de polipéptidos de hormona del crecimiento o IFN-a resistentes a proteasas. Las unidades de dosificación pueden tener un recubrimiento entérico o ser formuladas a partir de un recubrimiento entérico de manera que la tableta o cápsula tenga una resistencia aumentada a la digestión o degradación en el tracto digestivo. Por ejemplo, se proporciona tabletas o cápsulas que contienen alrededor de 1-100 mg, 1-50 mg, 10-50 mg, 10-40 mg, 15-35 mg, 1-40 mg, 1-45 mg, 5-30 mg, 10-20 mg o 3-30 mg de hormona del crecimiento humana. La hormona del crecimiento humana es resistente a proteasas en virtud de modificaciones de la secuencia primaria de aminoácidos. Las tabletas y cápsulas poseen opcionalmente un recubrimiento entérico. Se proporciona tabletas y cápsulas que contienen alrededor de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 90, 100, 125 o más de IFN-a. El polipéptido de IFN-a es resistente a proteasas en virtud de modificaciones de la secuencia primaria de aminoácidos. Las tabletas y cápsulas poseen opcionalmente un recubrimiento entérico. Se proporciona usos de las formulaciones de dosificación y unidades de dosificación y/o de las tabletas y cápsulas para el tratamiento de una enfermedad o condición. También se proporciona usos de una proteína terapéutica modificada para el tratamiento de una enfermedad, en donde la proteína terapéutica está modificada en su secuencia primaria de aminoácidos, por medio de lo cual se hace más resistente a proteasas que en ausencia de las modificaciones, y la proteína puede alcanzar niveles terapéuticamente efectivos en el torrente sanguíneo después de la administración oral; y la cantidad de la proteína terapéutica en la formulación es 15-40 veces la dosis subcutánea para la misma indicación y para la misma proteína terapéutica que no ha sido modificada para ser resistente a proteasas. Se proporciona usos de una proteína terapéutica modificada para la formulación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad. El polipéptido terapéutico resistente a proteasas está modificado en su secuencia primaria de aminoácidos, por medio de lo cual se hace más resistente a proteasas que en ausencia de las modificaciones; el polipéptido puede alcanzar niveles terapéuticamente efectivos en el torrente sanguíneo luego de su administración oral; y la cantidad de la proteína terapéutica en la formulación es 15-40 veces la dosis subcutánea para la misma indicación y para la misma proteína terapéutica que no ha sido modificada para ser resistente a proteasas. Cualquier polipéptido terapéutico resistente a proteasas puede ser empleado, incluyendo, por ejemplo, el tratamiento de una enfermedad o condición para la cual esté indicado el tratamiento mediante administración de IFN-a u hormona del crecimiento, en donde la proteína es un IFN-a para un tratamiento en donde el IFN-a está indicado; y la proteína es hormona del crecimiento para un tratamiento en donde la hormona del crecimiento esté indicada. También se proporciona métodos para el tratamiento de una enfermedad o condición mediante administración de una formulación de dosificación o tableta o cápsula proporcionada aquí. La formulación de dosificación puede contener una o una pluralidad de unidades de dosificación y todas son administradas en un único día. Puede seguirse cualquier régimen adecuado, tal como uno en el que se administra una formulación de dosificación una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete veces o más en una semana, o uno en el que se administra una formulación de dosificación una, dos, tres o cuatro veces por día, cada día o 2, 3, 4, 5, 6 o 7 veces a la semana. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 (A) ilustra el proceso mediante el cual los polipéptidos terapéuticos de tipo salvaje son degradados por proteasas gastrointestinales del lumen intestinal, lo que resulta en baja o nula absorción del polipéptido hacia la sangre. Los gráficos encima de cada figura ilustran la cantidad de polipéptido activo en la sangre .

La Figura 1(B) ilustra el proceso mediante el cual los polipéptidos resistentes a proteasas son resistentes a las proteasas gastrointestinales del lumen intestinal, lo que resulta en una absorción sostenida del polipéptido hacia la sangre. Los gráficos encima de cada figura ilustran la cantidad de polipéptido activo en la sangre. La Figura 2 ilustra los efectos de hGH nativa y de hGH(Y42I) sobre el peso corporal después de la administración de formulaciones líquidas de las proteínas por vía oral o subcutánea (SC) en un modelo de rata hipofisectomizada de deficiencia de hormona del crecimiento . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION ORGANIZACIÓN A. Definiciones B. Absorción Gastrointestinal y Detección de Polipéptidos Resistentes a Proteasas C. Formulaciones de Dosificación Oral 1. Unidades de Dosificación Oral 2. Preparación de Formulaciones de Dosificación Oral y Unidades de Dosificación Oral a . Control de Entrega i. Recubrimientos Entéricos ii. Recubrimientos Múltiples y Sub- recubrimientos b. Otros Aditivos y Portadores de Entrega D. Polipéptidos Resistentes a Proteasas para Formulaciones de Dosificación Oral 1. Polipéptidos Resistentes a Proteasas 2. Citoguinas a. Familia del Interferón/Interleuquina- 10 b. Familia de las Citoquinas de Cadena Larga c. Familia de las Citoguinas de Cadena Corta 3. Otros Polipéptidos a. Factores Sanguíneos b. Insulina c. Relaxina d. Anticuerpos e. Factores de Crecimiento f. Receptores Solubles g. Quimioquinas h. Agentes Angiogénicos i . Péptidos Neuroactivos j . Proteínas Adicionales E. Formulaciones de Dosificación Oral de Polipeptidos de IFN-o Resistentes a Proteasas 1. Polipéptidos de IFN-cc Resistentes a Proteasas a. Modificaciones Adicionales de Polipéptidos de IFN-ot Resistentes a Proteasas 2. Expresión de Polipéptidos de IFN-a Resistentes a Proteasas 3. Formulaciones Orales y Formas de Dosificación Unitarias F. Formulaciones de Dosificación Oral de Polipéptidos de Hormona del Crecimiento Resistentes a Proteasas 1. Polipéptidos de Hormona del Crecimiento Resistentes a Proteasas a. Modificaciones Adicionales de Polipéptidos de Hormona del Crecimiento Resistentes a Proteasas 2. Expresión de Polipéptidos de Hormona del Crecimiento Resistentes a Proteasas 3. Formulaciones Orales y Formas de Dosificación Unitarias Métodos de Tratamiento 1. Métodos de Tratamiento Usando IFN-a a. Desórdenes Fibróticos i. Fibrosis Pulmonar Idiopática ii. Fibrosis Hepática iii. Fibrosis Renal b. Cáncer c. Infecciones Virales i. Infección por Virus de la Hepatitis 2. Métodos de Tratamiento Usando Hormona del Crecimiento a. Deficiencias del Crecimiento b. Caquexia c . Anti -envejecimiento d. Osteodistrofia Renal e. Fibrosis Quistica f. Otras Condiciones Terapias de Combinación Artículos Manufacturados y Kits Ejemplos A. Definiciones A menos que se indique lo contrario, todos los términos científicos y técnicos usados en este documento tienen el mismo significado que les asigna comúnmente alguien con experiencia en el arte al cual pertenece la invención o las invenciones . Todas las patentes, solicitudes de patentes, solicitudes publicadas y publicaciones, secuencias de GenBank, sitios de Internet y otros materiales publicados a los que se hace referencia a lo largo de toda esta divulgación, a menos que se indique lo contrario, se incorporan aquí como referencia en su totalidad. En el evento de que exista una pluralidad de definiciones para los términos utilizados en este documento, aquéllos definidos en esta sección tienen preponderancia. Cuando se hace referencia a un URL u otro identificador o dirección tales, se entiende que tales identificadores pueden cambiar, y que la información particular en Internet puede cambiar, pero puede encontrarse información equivalente buscando en la Internet o en otras fuentes. La referencia a los mismos evidencia la disponibilidad y diseminación pública de tal información. Cuando se utiliza en este documento, un régimen de dosificación se refiere al número de formulaciones de dosificación oral administrado en un período de tiempo, tal como un día o una semana. Cuando se utiliza en este documento, una formulación de dosificación oral se refiere a una formulación que contiene una o más unidades de dosificación de un polipéptido terapéutico resistente a proteasas formulado para administración oral, en donde la formulación de dosificación oral que contiene las una o más unidades de dosificación administrada en una dosis única proporciona una cantidad del polipéptido terapéutico resistente a proteasas suficiente para lograr una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido en la sangre mediante la absorción a través del tracto gastrointestinal. De acuerdo a lo anterior, una formulación de dosificación oral se refiere a la cantidad del polipéptido terapéutico resistente a proteasas que se administra por dosis y que logra un nivel terapéuticamente efectivo en el torrente sanguíneo . Cuando se utiliza en este documento, una "unidad de dosificación oral" contiene una cantidad con efecto terapéutico completo o parcial de un polipéptido resistente a proteasas . Por ende, una formulación de dosificación oral puede incluir una o más unidades de dosificación oral. De esta manera, una pildora, tableta o cápsula que contiene el polipéptido resistente a proteasas es un ejemplo de una unidad de dosificación oral. La pildora, tableta o cápsula puede contener el polipéptido resistente a proteasas, por ejemplo, en forma de un polvo liofilizado, gránulos, partículas, gel o solución. También puede incluir uno o más ingredientes inactivos, tales como excipientes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, agentes de suspensión, surfactantes , desintegrantes, ligantes, diluyentes, lubricantes, estabilizantes, antioxidantes, agentes osmóticos, colorantes, plastificantes y coberturas) que se utilizan para fabricar y administrar agentes farmacéuticos, tales como polipéptidos resistentes a proteasas. Tales pildoras, tabletas o cápsulas pueden estar recubiertos para entrega entérica o pueden no estar recubiertos . Las cápsulas pueden contener grageas o gránulos del polipéptido resistente a proteasas con recubrimiento entérico. Cuando se utiliza en este documento, una "cantidad administrada terapéuticamente efectiva" o una "dosis terapéuticamente efectiva" , se refiere a una cantidad de un agente, compuesto o material en una formulación de dosificación que es al menos suficiente para producir un efecto terapéutico en un sujeto. Típicamente, la cantidad es suficientemente alta como para alcanzar una cantidad terapéuticamente efectiva en la sangre. La cantidad terapéuticamente efectiva que se quiere lograr en la sangre, es conocida para muchos de los polipéptidos terapéuticos empleados en los métodos, y se ha establecido formulaciones de dosificación efectivas para las proteínas no modificadas. Para las proteínas modificadas, la dosificación puede ser seleccionada para lograr el mismo efecto. La cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido resistente a proteasas a ser utilizada en un tratamiento variará con la condición particular que está siendo tratada, la edad y condición física del paciente que está siendo tratado, la severidad de la condición, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia simultánea, el polipéptido resistente a proteasas particular que está siendo utilizado, los excipientes farmacéuticamente aceptables particulares y/o los factores que entran dentro del conocimiento y experiencia del médico tratante . Cuando se utiliza en este documento, una cantidad terapéuticamente efectiva en la sangre es una cantidad al menos suficiente como para producir un efecto terapéutico en un sujeto. Cuando se utiliza en este documento, un "polipéptido resistente a proteasas" es una proteína que contiene una o más modificaciones en su secuencia primaria de aminoácidos en comparación con un polipéptido nativo o de tipo salvaje y que exhibe una resistencia aumentada a la proteólisis en comparación con el polipéptido nativo o de tipo salvaje que no tiene la una o más modificaciones de aminoácidos. Por ende, un polipéptido resistente a proteasas, tal como un polipéptido terapéutico resistente a proteasas, es un polipéptido que, en virtud de cambios en su secuencia primaria de aminoácidos, típicamente sólo uno, dos o tres cambios, puede ser formulado para administración oral y, después de la administración, puede entrar en el torrente sanguíneo. Generalmente, tales polipéptidos son resistentes a proteasas presentes en el tracto digestivo, pero, debido al parentesco entre las proteasas, puede exhibir resistencia o puede ser seleccionado para ser resistente a proteasas de la sangre. Tal aumento puede manifestarse como un aumento concomitante en la vida media en el suero. Resistencia aumentada a proteasas significa un aumento evaluado a través de ensayos in vitro o in vivo, incluyendo aquéllos que se ejemplifican en este documento, en comparación al mismo polipéptido sin los cambios de secuencia de aminoácidos. Todo aumento en resistencia es contemplado siempre que el polipéptido resultante pueda ser administrado oralmente de manera que sea absorbido hacia la sangre en cantidades terapéuticamente efectivas . La resistencia aumentada a proteasas puede ser evaluada mediante una búsqueda de actividad después de una exposición a proteasas particulares presentes en el tracto gastrointestinal y/o en el suero. Típicamente, el aumento de resistencia a proteasas es de al menos alrededor de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más, en comparación con el mismo polipéptido sin los cambios en la secuencia de aminoácidos que confieren la resistencia. En otras implementaciones , la resistencia a las proteasas de los polipéptidos variantes para ser utilizados en formulaciones de dosificación oral que se proporcionan en este documento, está aumentada en una cantidad de al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, 200 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces, 600 veces, 700 veces, 800 veces, 900 veces, 1000 veces o más, en comparación con el mismo polipéptido sin los cambios en la secuencia de aminoácidos que confieren la resistencia . Cuando se utiliza en este documento, "resistencia a la proteólisis" se refiere a cualquier cantidad de ruptura disminuida del polipéptido por parte de un agente proteolítico, tal como una proteasa. Esto puede lograrse modificando residuos particulares de aminoácidos en un polipéptido que son susceptibles de ruptura por parte de una proteasa particular para hacer que los polipéptidos sean menos susceptibles de ruptura en comparación con la ruptura del polipéptido sin la modificación, por parte de la misma proteasa, en las mismas condiciones. Un polipéptido modificado que exhibe resistencia aumentada a la proteólisis exhibe, por ejemplo, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más resistencia a la proteólisis, en comparación con el mismo polipéptido sin las modificaciones en la secuencia de aminoácidos. Cuando se utiliza en este documento, una proteína nativa o de tipo salvaje se refiere a una proteína que no ha sido modificada para ser resistente a proteasas . Tales proteínas no alcanzan niveles terapéuticamente efectivos para cualquier indicación, cuando son administradas de forma oral . Cuando se utiliza en este documento, "proteasas", "proteinasas" o "peptidasas" son palabras usadas de manera intercambiable para referirse a enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces peptídicos covalentes . Las proteasas incluyen, por ejemplo, proteasas de serina y metaloproteinasas de matriz. Las proteasas de serina o endopeptidasas de serina constituyen una clase de peptidasas, las cuales están caracterizadas por la presencia de un residuo de serina en el centro activo de la enzima. Las proteasas de serina participan en un amplio rango de funciones en el cuerpo, incluyendo coagulación sanguínea e inflamación, así como en la digestión en procariontes y eucariontes. El mecanismo de ruptura de las "proteasas de serina" está basado en el ataque nucleofílico de un enlace peptídico particular por parte de la serina. Una cisteína, treonina o moléculas de agua asociadas con aspartato o con metales también pueden jugar este papel. Las cadenas laterales alineadas de una serina, una histidina y un aspartato forman una tríada catalítica común a la mayor parte de las proteasas de serina. El sitio activo de las proteasas de serina tiene la forma de una hendidura en donde se uno el sustrato polipeptídico . Los residuos aminoacídicos son nombrados desde el extremo N-terminal hacia el extremo C-terminal de un sustrato polipeptídico (Pi, ..., P3 , P2, Pl, Pl', ?2·, P3', Pj). Los sub- sitios de unión respectivos son llamados Si,..., S3, S2, SI, SI', S2 ' , S3 ' , ... , Sj . Se cataliza la ruptura entre Pl y Pl'. Las proteasas del tracto gastrointestinal inferior son proporcionadas por el páncreas, el cual secreta bilis hacia el tracto gastrointestinal a través del duodeno. Tales proteasas incluyen, por ejemplo, tripsina, quimotripsina , elastasa y carboxipeptidasa . Cuando se utiliza en este documento, el término "excipientes farmacéuticamente aceptables" incluye cualquier material fisiológicamente inerte y farmacológicamente inactivo conocido para alguien experimentado en el arte, el cual es compatible con las características físicas y químicas del polipéptido resistente a proteasas particular seleccionado para ser utilizado. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitados a, polímeros, resinas, plastificantes , cargas, lubricantes, solventes, co-solventes , sistemas de tampones, surfactantes , preservantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes , colorantes o pigmentos de grado farmacéutico y agentes que afectan la viscosidad. Todos o parte de los excipientes farmacéuticamente aceptables contenidos en las composiciones farmacéuticas descritas en este documento pueden ser parte del recubrimiento entérico . Cuando se utiliza en este documento, el término "formulación de dosificación oral con recubrimiento entérico" o "forma de dosificación oral con recubrimiento entérico" se relaciona con una formulación de dosificación oral que contiene una proteína terapéutica modificada que tiene un recubrimiento entérico para hacer que se libere el polipéptido resistente a proteasas en el tracto gastrointestinal inferior. El recubrimiento entérico evita la digestión o degradación temprana de la tableta, cápsula u otra forma de dosificación oral. Las formulaciones de dosificación oral con recubrimiento entérico incluyen, por ejemplo, una tableta comprimida (con o sin recubrimiento) que contiene granulos o partículas, las cuales están a su vez recubiertas o no, o un polvo liofilizado del polipéptido resistente a proteasas. La formulación de dosificación oral con recubrimiento entérico puede ser una cápsula de gelatina (con o sin recubrimiento) que contiene granos, gránulos o partículas, las cuales están a su vez recubiertas o no, o un polvo liofilizado del polipéptido resistente a proteasas. Cuando se utiliza en este documento, el término "recubrimiento entérico" se refiere a una mezcla de excipientes farmacéuticamente aceptables que se aplica, se combina, se mezcla o se agrega de otra manera al polipéptido resistente a proteasas. El recubrimiento puede ser aplicado a una tableta comprimida, a una cápsula de gelatina y/o a los granos, gránulos, partículas, o a un polvo liofilizado del polipéptido resistente a proteasas, los cuales son encapsulados en cápsulas de almidón o gelatina o son comprimidos en tabletas . De acuerdo a lo anterior, un recubrimiento entérico puede ser aplicado a una tableta comprimida que contiene gránulos, partículas o un polvo liofilizado del polipéptido resistente a proteasas; sin embargo, en el evento de que los gránulos o partículas posean un recubrimiento entérico propio antes de ser comprimidos en una tableta, entonces el recubrimiento entérico de la tableta en sí es opcional. El recubrimiento entérico también puede ser aplicado a los granos o pequeñas partículas del polipéptido resistente a proteasas, los cuales pueden ser encapsulados en una cápsula de almidón o gelatina. La cápsula puede ser recubierta con un recubrimiento entérico, si se desea. Debido a su recubrimiento entérico, estas formulaciones de dosificación oral evitarán la entrega indeseada del polipéptido resistente a proteasas hacia los tejidos mucosos y epiteliales del tracto gastrointestinal superior, especialmente boca, faringe y esófago. El recubrimiento también permite la entrega del ingrediente activo hacia el tracto gastrointestinal inferior en un punto que puede ser seleccionado por alguien con experiencia en el arte escogiendo los excipientes que constituyen el recubrimiento, su tipo y/o su espesor. Cuando se utiliza en este documento, un "polipéptido terapéutico" se refiere a cualquier polipéptido que sea administrado a un animal, incluyendo un humano, para tratamiento. Tales polipéptidos pueden ser preparados mediante cualquier método y, por ende, incluyen, pero no están limitados a, un polipéptido producido de manera recombinante , un polipéptido producido sintéticamente, polipéptidos terapéuticos extraídos de células o tejidos, y otras fuentes. Ya sea aislados a partir de cualquier fuente o producidos, los polipéptidos terapéuticos maduros pueden ser heterogéneos en longitud. La heterogeneidad de los polipéptidos terapéuticos puede diferir dependiendo de la fuente de los polipéptidos terapéuticos. Por lo tanto, la referencia a polipéptidos terapéuticos hace referencia a su vez a la población heterogénea tal como fue producida o aislada. Cuando se quiera hablar de una población homogénea, se dejará en claro. Las referencias a polipéptidos terapéuticos en este documento se refieren a sus formas monoméricas, diméricas u otras formas multiméricas , según sea apropiado . Los polipéptidos terapéuticos humanos incluyen isoformas variantes alélicas, moléculas sintéticas producidas a partir de moléculas de ácidos nucleicos codificantes, proteínas aisladas a partir de tejido y células humanos, proteínas sintéticas, y formas modificadas de los mismos. Los ejemplos de polipéptidos terapéuticos humanos maduros sin modificar incluyen, pero no están limitados a, polipéptidos terapéuticos no modificados y nativos (es decir, de tipo salvaje) y los polipéptidos terapéuticos precursores no modificados y nativos que incluyen un péptido señal y/o propéptido, y polipéptidos terapéuticos nativos polimórficos . Otros polipéptidos terapéuticos humanos ejemplares son aquéllos que están truncados en el extremo N- o C-terminal. La referencia a polipéptidos terapéuticos también incluye variantes alélicas o de especies de los polipéptidos terapéuticos, y formas truncadas o fragmentos de los mismos y formas que contienen modificaciones además de aquéllas que aumentan la resistencia a proteasas . Los polipéptidos terapéuticos incluyen polipéptidos homólogos de diferentes especies, incluyendo, pero no limitándose a, animales, incluyendo especies humanas y no humanas, tales como otros mamíferos. Al igual que con los polipéptidos terapéuticos humanos, los polipéptidos terapéuticos no humanos también incluyen largos heterogéneos o fragmentos o porciones de polipéptidos terapéuticos que poseen un largo suficiente o incluyen regiones suficientes para retener al menos una actividad del polipéptido maduro completo. Los polipéptidos terapéuticos no humanos incluyen polipéptidos, isoformas variantes alélicas, moléculas sintéticas preparadas a partir de ácidos nucleicos, proteínas aisladas a partir de tejidos y células no humanos, y formas modificadas de los mismos. Los polipéptidos terapéuticos de origen no humano incluyen, pero no están limitados a, polipéptidos terapéuticos bovinos, ovinos, porcinos, equinos, murinos, leporinos, caninos, felinos, aviares y de otros primates, tales como de chimpancé y macaco. Cuando se utiliza en este documento, "tratar" a un sujeto que tiene una enfermedad o condición significa que los síntomas del sujeto son parcial o totalmente aliviados, o permanecen estáticos, después del tratamiento. Por ende, el tratamiento engloba profilaxis, terapia y/o cura. La profilaxis se refieres a la prevención de una enfermedad o condición potencial y/o la prevención del empeoramiento de los síntomas o la progresión de una enfermedad o condición. La prevención de una enfermedad o condición engloba el alivio o la eliminación de uno o más factores de riesgo para el desarrollo de la enfermedad o condición. El tratamiento también engloba cualquier uso farmacéutico de un polipéptido terapéutico modificado y composiciones orales proporcionadas en este documento.

Cuando se utiliza en este documento, un "paciente" o "sujeto" a ser tratado incluye humanos o animales no humanos. Los mamíferos incluyen primates, tales como humanos, chimpancés, gorilas y monos; animales domésticos, tales como perros, caballos, gatos, cerdos, cabras, vacas; y roedores tales como ratones, ratas, hámsteres y gerbos. Cuando se utiliza en este documento, el término "tracto gastrointestinal" se refiere al canal alimentario, es decir, el tubo musculomembranoso que tiene alrededor de treinta pies de largo en un sujeto humano, por ejemplo, que se extiende entre la boca y el ano. Cuando se utiliza en este documento, el término "tracto gastrointestinal superior" se refiere a la cavidad bucal, la faringe, el esófago y el estómago. Cuando se utiliza en este documento, el término "tracto gastrointestinal inferior" se refiere al intestino delgado y al intestino grueso. Cuando se utiliza en este documento, el término "cavidad bucal" se refiere a la boca o la cavidad oral, y está tapizada por una membrana mucosa que se continúa con el integumento de los labios y con el tapizado mucoso de la faringe. Cuando se utiliza en este documento, el término "faringe" se refiere a aquélla parte del tracto gastrointestinal superior que está ubicada por detrás de la nariz, boca y laringe. La faringe es un tubo mucomembranoso de alrededor de 4 pulgadas de largo y es la continuación posterior de la boca y se continúa posteriormente con el esófago, y está compuesta de una capa mucosa, una capa fibrosa y una capa muscular. Cuando se utiliza en este documento, el término "esófago" se refiere a un canal muscular de alrededor de nueve pulgadas de largo que se extiende desde la faringe hasta el estómago. El esófago posee tres capas: una capa interna mucosa que rodea al lumen, una capa media areolar y una capa externa muscular. Cuando se utiliza en este documento, el término "estómago" se refiere a la parte del tracto gastrointestinal entre el esófago y el intestino delgado . Cuando se utiliza en este documento, el término "intestino delgado" se refiere a aquélla parte del tracto gastrointestinal inferior que incluye el duodeno, el yeyuno y el íleon, es decir, la porción del tracto intestinal justo distal al esfínter duodenal del fondo del estómago y proximal al intestino grueso. Cuando se utiliza en este documento, el término "intestino grueso" incluye la parte del tracto gastrointestinal inferior justo distal al intestino delgado, comenzando por el ciego e incluyendo el colon ascendente, el colon transverso, el colon descendente, el colon sigmoidal y el recto.

Cuando se utiliza en este documento, "oromucosa" se refiere a la mucosa que tapiza las cavidades oral y/o nasofaríngea. Cuando se utiliza en este documento, el término "liberación retardada" se refiere a la entrega de un polipéptido resistente a proteasas que se lleva a cabo formulando el polipéptido resistente a proteasas en una composición farmacéutica de manera tal que la liberación se produzca en algún lugar generalmente predecible en el tracto intestinal inferior, más distal al que se hubiera obtenido si no hubiera habido una alteración en la entrega del polipéptido resistente a proteasas. Un método ejemplar para lograr la liberación retardada del ingrediente activo involucra el recubrimiento (o alternativamente el encapsulamiento) del ingrediente activo con una sustancia que no es absorbida, o alternativamente degradada, por los fluidos gastrointestinales para liberar el ingrediente activo hasta que se alcance un punto específico deseado en el tracto intestinal. Un tipo ejemplar de formulación de liberación retardada para ser utilizada en esta divulgación, se logra recubriendo la tableta, cápsula, o partículas, gránulos o granos de ingrediente activo con una sustancia que depende del pH, es decir, que se degrada a un pH que es el que se encuentra generalmente presente en el intestino delgado, pero no se degrada a un pH que es el que se encuentra generalmente presente en la boca, faringe, esófago o estómago. Sin embargo, si se desea lograr la entrega tópica a través de la administración oral de una composición farmacéutica que contiene el polipéptido resistente a proteasas sólo al intestino grueso, o a lo largo de todo el tracto intestinal, comenzando con el intestino delgado, entonces la selección del material de recubrimiento y/o del método de recubrimiento, o alternativamente la combinación del polipéptido resistente a proteasas con el material de recubrimiento seleccionado u otros excipientes farmacéuticamente aceptables, puede ser variada o alterada como se describe en este documento o mediante cualquier método conocido para alguien con experiencia en el arte. Cuando se utiliza en este documento, el emaciamiento asociado a SIDA u otras formas de caquexia son desórdenes metabólicos que hacen que el cuerpo consuma tejidos vitales de músculo y órganos (masa corporal magra) para obtener energía, en lugar de apoyarse primariamente en las reservas corporales de grasa. Los sujetos con emaciamiento asociado a SIDA típicamente experimentan una pérdida de 5-10% o más de masa corporal magra, lo que incluye tejido muscular, órganos corporales, células sanguíneas y fluidos linfáticos . Cuando se utiliza en este documento, el término "liberación prolongada" se refiere al tipo de mecanismo de liberación diseñado para lograr la entrega del ingrediente activo a lo largo de un período prolongado de tiempo, en contraste con la entrega de una dosis tipo de liberación retardada. Un método de liberación retardada ejemplar involucra el recubrimiento de los gránulos de polipéptido resistente a proteasas con un recubrimiento independiente del pH, escogido a partir del grupo que incluye, pero no está limitado a, etilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa y carboximetilcelulosa sódica. Alguien con experiencia en el arte puede diseñar varias formas de dosificación de liberación prolongada para lograr la entrega del polipéptido resistente a proteasas en el intestino delgado y en el intestino grueso, sólo en el intestino delgado, o sólo en el intestino grueso, dependiendo de la elección de varios materiales de recubrimiento y/o del espesor del recubrimiento . Cuando se utiliza en este documento, un dímero de polipéptido terapéutico se refiere a una combinación de dos polipéptidos terapéuticos que tienen el mismo número o un número distinto de aminoácidos y/o la misma o distinta secuencia de aminoácidos. Típicamente, las formas diméricas del polipéptido incluyen aquéllas que contienen dos monómeros unidos a través de interacciones no covalentes, incluyendo interacciones hidrofóbicas , puentes de hidrógeno, interacciones de van der Waals y otras interacciones similares. Tales dímeros pueden formarse espontáneamente durante la expresión y típicamente se forman espontáneamente, tal como ocurre, por ejemplo, usando los métodos de producción de proteínas descritos en este documento. Los dímeros también pueden producirse como proteínas de fusión, tal como en forma de un polipéptido terapéutico dimérico de cadena única, debido a la unión directa o indirecta del mismo monómero o de diferentes monómeros. Para los propósitos de este documento, al primer monómero de un dímero se le llama "A" y al segundo monómero de un dímero se le llama "B" . Las hélices en cada monómero son numeradas, de manera tal que las hélices en un polipéptido con seis hélices son llamadas A1-A6 para el monómero A y B1-B6 para el monómero B. Cuando se utiliza en este documento, una variante alélica o una variación alélica se refiere a un polipéptido codificado por un gen que es diferente de una forma de referencia para dicho gen (es decir, es codificado por un alelo) dentro de una población. Típicamente, la forma de referencia del gen codifica una forma nativa y/o una forma predominante de un polipéptido en una población o en un único miembro de referencia de una especie. Típicamente, las variantes alélicas tienen al menos 80%, 90%, 95% o más identidad de aminoácidos con respecto a una forma nativa y/o predominante proveniente de la misma especie. Cuando se utiliza en este documento, una variante de especie se refiere a variantes del mismo polipéptido entre y dentro de especies. Generalmente, las variantes alélicas interespecies tienen al menos alrededor de 60%, 70%. 80%, 85%, 90% o 95% de identidad o más respecto a una forma nativa y/o predominante de otra especie, incluyendo 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad con una forma nativa y/o predominante de un polipéptido . Cuando se utiliza en este documento, un "polipéptido terapéutico nativo" o un "polipéptido terapéutico de tipo salvaje" se refiere a un polipéptido codificado por un gen de origen natural que está presente en un organismo en la naturaleza, tal como en un animal, incluyendo un humano u otro mamífero. Dentro de los polipéptidos terapéuticos nativos se encuentran los polipéptidos precursores codificados, fragmentos de los mismos, y formas procesadas de los mismos, tales como una forma madura que carece del péptido señal, así como cualquier forma de los mismos procesada pre- o post-traduccionalmente . Por ejemplo, los humanos expresan polipéptidos terapéuticos. Los ejemplos de un polipéptido terapéutico humano nativo incluyen un polipéptido terapéutico precursor que contiene el péptido señal, así como un polipéptido terapéutico maduro que carece del péptido señal. También están incluidos dentro de los polipéptidos terapéuticos nativos aquéllos que están modificados post-traduccionalmente, incluyendo aquéllos que son procesados proteolíticamente o que incluyen otras modificaciones post-traduccionales tales como, por ejemplo, glicosilaciones . Otros animales, tales como mamíferos, expresan polipéptidos terapéuticos nativos, e incluyen, pero no están limitados a, hámsteres, ratones, ratas, conejos, pájaros, vacas, caballos, cerdos, gatos, perros, monos, orangutanes, babuinos, chimpancés, macacos, gibones y gorilas. Como se hizo notar anteriormente, los polipéptidos se presentan como una mezcla heterogénea que contiene polipéptidos de largos y modificaciones epigenéticas variados, tales como diferencias en patrones de glicosilacion. Cuando se utiliza en este documento, una "porción o fragmento de un polipéptido terapéutico" o una "porción activa" se refiere a cualquier porción de un polipéptido terapéutico humano o no humano que exhibe una o más actividades en el polipéptido completo . Cuando se utiliza en este documento, una "actividad" de un polipéptido terapéutico se refiere a cualquier actividad exhibida por el polipéptido terapéutico. Tales actividades pueden ser probadas in vitro y/o in vivo. La actividad puede ser cualquier nivel de porcentaje de actividad del polipéptido, incluyendo, pero no limitándose a, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más de la actividad funcional en comparación con el polipéptido completo. Por ejemplo, el porcentaje de actividad del polipéptido también incluye 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más de la actividad funcional en comparación con el polipéptido completo. Las actividades pueden ser medidas in vitro y/o in vivo usando ensayos reconocidos. Los resultados de tales ensayos que indican que un polipéptido exhibe una actividad pueden ser correlacionados con la actividad del polipéptido in vivo, que puede ser llamada actividad biológica. Cuando se utiliza en este documento, "EC50" se refiere a la concentración efectiva de un polipéptido terapéutico necesaria para entregar la mitad de una respuesta máxima. Para los propósitos de este documento, la respuesta medida es cualquier actividad de un polipéptido terapéutico, tal como, pero no limitada a, actividad antiviral o actividad proliferativa . Cuando se utiliza en este documento, "vida media" se refiere al tiempo requerido para que un parámetro medido, tal como la potencia, actividad o concentración efectiva de un polipéptido o molécula, caiga a la mitad de su nivel original, tal como la mitad de su potencia, actividad o concentración efectiva original en tiempo cero. Así, el parámetro, tal como potencia, actividad o concentración efectiva de una molécula de polipéptido, se mide generalmente a través del tiempo. Para los propósitos de este documento, la vida media puede ser medida in vi tro y/o in vivo. Por ejemplo, la vida media de un polipéptido terapéutico o un polipéptido terapéutico modificado puede medirse in vitro evaluando su actividad en el tiempo durante una incubación bajo ciertas condiciones, tales como por ejemplo, durante una exposición a proteasas . En otro ejemplo, la vida media de un polipéptido terapéutico o de un polipéptido terapéutico modificado puede medirse in vivo después de la administración (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intraduodenal , oral) del polipéptido a un humano u otro animal, seguida de un muestreo de la sangre a lo largo del tiempo para determinar la concentración efectiva y/o la actividad remanente del polipéptido en la muestra de sangre. Cuando se utiliza en este documento, una "propiedad" de un polipéptido terapéutico se refiere a cualquier propiedad exhibida por dicho polipéptido. Tales propiedades incluyen, pero no están limitadas a, estabilidad de la proteína, resistencia a la proteólisis, estabilidad conformacional , tolerancia térmica y tolerancia a condiciones de pH. Los cambios en las propiedades pueden alterar una "actividad" del polipéptido . Cuando se utiliza en este documento, "estabilidad en el suero" se refiere a la estabilidad de la proteína en el suero. Cuando se utiliza en este documento, un "método de evolución dirigida" se refiere a métodos que "adaptan" proteínas, incluyendo proteínas naturales, proteínas sintéticas o dominios proteicos para que tengan propiedades alteradas, tal como la capacidad de actuar en medios químicos o biológicos artificiales o naturales diferentes o ya existentes, y/o para producir nuevas funciones, y/o para aumentar o disminuir una actividad dada, y/o para modular una característica dada. Los ejemplos de métodos de evolución dirigida incluyen, entre otros, los métodos de evolución dirigida racionales descritos en la solicitud de los Estados Unidos con número de serie 10/011.249; y en la Solicitud Publicada de los Estados Unidos No. US-2004/0132977-A1. Cuando se utiliza en este documento, "exploración racional bidimensional por mutagénesis (exploración 2-D) " se refiere a los procesos en los que se explora dos dimensiones de una secuencia proteica particular: (1) una dimensión es para identificar residuos específicos de aminoácidos a lo largo de la secuencia de la proteína que pueden ser reemplazados con diferentes aminoácidos, llamadas posiciones objetivo is-HIT, y (2) la segunda dimensión es el tipo de aminoácidos seleccionado para reemplazar el objetivo is-HIT particular, llamado aminoácido de reemplazo. Cuando se utiliza en este documento, "variante", "variante de un polipéptido terapéutico" , "polipéptido terapéutico modificado" y "proteína terapéutica modificada" se refieren a un polipéptido terapéutico que tiene una o más mutaciones en comparación con un polipéptido terapéutico no modificado. Las una o más mutaciones pueden ser uno o más reemplazos de aminoácidos, inserciones o deleciones y cualquier combinación de los mismos. Típicamente, un polipéptido terapéutico modificado tiene una o más modificaciones en secuencia primaria en comparación con un polipéptido terapéutico no modificado. Por ejemplo, un polipéptido terapéutico modificado proporcionado en este documento puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más mutaciones en comparación con un polipéptido terapéutico no modificado. Los polipéptidos terapéuticos modificados proporcionados en este documento incluyen la modificación especificada o referenciada, pero pueden ser producidos como mezclas homogéneas y/o pueden ser producidos con una variedad de largos. Cualquier largo de polipéptido está contemplado, siempre que el polipéptido resultante exhiba al menos una actividad de polipéptido terapéutico. Cuando se utiliza en este documento, un "reemplazo de un único aminoácido" se refiere al reemplazo de un aminoácido por otro aminoácido. El reemplazo puede hacerse con un aminoácido natural o con aminoácidos no naturales . Cuando un aminoácido se reemplaza con otro aminoácido en una proteina, el número total de aminoácidos en la proteína no cambia. Cuando se utiliza en este documento, "residuos correspondientes" se refiere a residuos comparados entre polipéptidos que son variantes alélicas o de especies u otras isoformas . Alguien con experiencia en el arte puede identificar fácilmente residuos correspondientes entre tales polipéptidos. Por ejemplo, alineando las secuencias de tales polipéptidos, alguien con experiencia en el arte puede identificar residuos correspondientes, usando residuos de aminoácidos conservados e idénticos como guías . En otras oportunidades, puede identificarse regiones correspondientes. Alguien con experiencia en el arte puede emplear residuos de aminoácidos conservados como guías para encontrar residuos de aminoácidos correspondientes entre secuencias humanas y no humanas.

Cuando se utiliza en este documento, la frase "homología estructural" se refiere al grado de coincidencia espacial entre dos o más esqueletos de proteínas. Los esqueletos proteicos que adoptan la misma estructura proteica, se pliegan y muestran similitud al ser estructuralmente superpuestos en tres dimensiones espaciales, pueden ser considerados estructuralmente homólogos. La homología estructural no está basada en homología de secuencia, sino que en homología tridimensional. Dos aminoácidos en dos proteínas diferentes que son homólogos basados en una homología estructural entre dichas proteínas no tienen que estar necesariamente en regiones homologas según secuencia. Por ejemplo, los esqueletos de proteínas que poseen una desviación cuadrática media (RMS) de menos de 3,5, 3,0, 2,5, 2,0, 1,7 o 1,5 ángstroms entre sí en una posición espacial dada o región definida, pueden ser considerados como estructuralmente homólogos en dicha región y son referidos en este documento como proteínas que poseen una "alta coincidencia" entre sus esqueletos . Se contempla en este documento que las posiciones de aminoácidos sustancialmente equivalentes (por ejemplo, "estructuralmente relacionadas") que están localizadas en dos o más secuencias de proteínas diferentes que comparten un cierto grado de homología estructural, poseen labores funcionales comparables; también son llamadas en este documento "loci estructuralmente homólogos" . Se considera que estos dos aminoácidos son "estructuralmente similares" o están "estructuralmente relacionados" entre sí, incluso si sus posiciones lineales precisas en las secuencias de aminoácidos, cuando se alinea estas secuencias, no son correspondientes entre sí. Los aminoácidos que están "estructuralmente relacionados" pueden estar alejados entre sí en las secuencias proteicas primarias, cuando estas secuencias se alinean siguiendo las reglas de la homología de secuencias clásica. Cuando se utiliza en este documento, "en una posición correspondiente a" se refiere a una posición de interés (es decir, número de base o número de residuo) en una molécula de ácido nucleico o proteína en relación a la posición en otra molécula de ácido nucleico o proteína de referencia. La posición de interés para la posición en otra proteína de referencia puede estar, por ejemplo, en una proteína precursora, una variante alélica, una proteína heteróloga, una secuencia de aminoácidos de la misma proteína de otra especie (es decir, una variante de especie), etc. Las posiciones correspondientes pueden ser determinadas comparando y alineando secuencias para maximizar el número de nucleótidos o residuos coincidentes, por ejemplo, de manera que la identidad entre las secuencias sea mayor que un 95%, tal como 96%, 97%, 98%, 99% y mayores. Luego, a la posición de interés se le otorga el número asignado en la molécula de ácido nucleico de referencia.

Cuando se utiliza en este documento, los términos "homología" e "identidad" son utilizados de manera intercambiable, pero la homología para proteínas puede incluir cambios conservativos de aminoácidos. En general, para identificar posiciones correspondientes las secuencias de aminoácidos se alinean de manera de obtener la coincidencia de mayor orden (véase, por ejemplo: Computational Molecular Biology (Biología Molecular Computacional) , Lesk, A.M., ed. , Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing : Informatics and Genome Projects (Biocomputación: Proyectos Informáticos y de Genomas) , Smith, D.W., ed. , Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Análisis Computacional de Datos de Secuencia, Parte I) , Griffin, A.M. y Griffin, H.G., eds . , Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology (Análisis de Secuencia en Biología Molecular) , von Heinje, G. , Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer (Bases del Análisis de Secuencias) , Gribskov, M. y Devereux, J. , eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; Carillo y cois. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073) . Cuando se utiliza en este documento, "identidad de secuencia" se refiere al número de aminoácidos (o base nitrogenadas) idénticos en una comparación entre un polipéptido o polinucleótido de prueba y otro de referencia. Polipéptidos homólogos se refiere a un número predeterminado de residuos de aminoácidos idénticos u homólogos. La homología incluye sustituciones conservativas de aminoácidos, así como residuos idénticos. La identidad de secuencia puede ser determinada mediante programas con algoritmos de alineamiento estándares utilizados con las penalizaciones por apertura de separaciones (gaps) por defecto establecidas por cada proveedor. Moléculas homologas de ácidos nucleicos se refiere a un número predeterminado de residuos de nucleótidos idénticos u homólogos. La homología incluye sustituciones que no cambian el aminoácido codificado (es decir, "sustituciones silentes"), así como residuos idénticos. Las moléculas de ácidos nucleicos sustancialmente homologas hibridan típicamente bajo condiciones moderadas o de alta demanda, en todo el largo del ácido nucleico o a lo largo de al menos alrededor de 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de la molécula de ácido nucleico completa de interés . También se contempla moléculas de ácidos nucleicos que contienen codones degenerados en lugar de los codones en la molécula de ácido nucleico que híbrida con ellas. (Para la determinación de homología de proteínas, los aminoácidos conservados pueden ser alineados tal como los aminoácidos idénticos; en este caso, el porcentaje de identidad y el porcentaje de homología varían) . El que dos moléculas cualesquiera de ácidos nucleicos poseen secuencias nucleotídicas (o dos polipéptidos cualesquiera tienen secuencias de aminoácidos) que son al menos idénticas en un 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, puede ser determinado usando algoritmos computacionales conocidos, tales como el programa "FASTA", usando, por ejemplo, los parámetros por defecto que aparecen en Pearson y cois. Proc . Nati. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988) (otros programas incluyen el paquete de programas GCG (Devereux, J. y cois., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Altschul, S.F. y cois., J". Molec . Biol . 215:403 (1990) ; Guide to Huge Computers (Guía a los Computadores Gigantescos) , Martin J. Bishop, ed. , Academic Press, San Diego (1994), y Carillo y cois. SIAM J Applied Math 48: 1073 (1988)). Por ejemplo, la función BLAST de la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (National Center for Biotechnology Information) puede ser utilizada para determinar la identidad. Otros programas disponibles comercial o públicamente incluyen el programa "MegAlign" de DNAStar (Madison, Wisconsin) y el programa "Gap" del Grupo de Genética Computacional (UWG) de la Universidad de Wisconsin (Madison, Wisconsin) ) . El porcentaje de homología o identidad de moléculas proteicas o de ácidos nucleicos puede ser determinado, por ejemplo, comparando la información de la secuencia usando un programa computacional GAP (por ejemplo, en Needleman y cois. J". Mol. Biol . 48: 443 (1970), revisado por Smith y Waterman (Adv. Appl . Math. 2: 482 (1981)). Brevemente, un programa GAP define la similitud como el número de símbolos (es decir, nucleótidos o aminoácidos) alineados que son similares, dividido por el número total de símbolos en la más corta de las dos secuencias. Los parámetros por defecto del programa GAP pueden incluir: (1) una matriz de comparación unitaria (que contiene un valor de 1 para las identidades y 0 para no identidades) y la matriz de comparación de pesos de Gribskov y cois. Nucí. Acids Res. 14: 6745 (1986), como se describe en Schwartz y Dayhoff, eds . , Atlas of Protein Sequence and Structure (Atlas de Secuencia y Estructura de Proteínas) , National Biomedical Research Foundation (Fundación Nacional para la Investigación Biomédica) , págs . 353-358 (1979); (2) una penalización de 3,0 por cada apertura (gap) y una penalización adicional de 0,10 por cada símbolo en cada apertura o gap; y (3) sin penalizaciones para aperturas o gaps terminales. Por lo tanto, cuando se utiliza en este documento, el término "identidad" representa una comparación entre un polipéptido o un polinucleótido de prueba y otro de referencia. En un ejemplo no limitante, "idéntico (a) en al menos un 90%" se refiere a porcentajes de identidad entre 90% y 100% en relación a los polipéptidos de referencia. La identidad a un nivel de 90% o más es indicativa del hecho de que, asumiendo con propósitos ilustrativos un largo de 100 aminoácidos para un polinucleótido de prueba y otro de referencia, no más del 10% de los aminoácidos (es decir, 10 de los 100) en el polipéptido de prueba son diferentes a los aminoácidos de los polipéptidos de referencia. Puede hacerse comparaciones similares entre un polinucleótido de prueba y otro de referencia. Tales diferencias pueden ser representadas como mutaciones puntuales distribuidas al azar en toda la longitud de una secuencia de aminoácidos, o pueden estar agrupadas en uno o más sitios de largo variable hasta el máximo permisible, por ejemplo, una diferencia de aminoácidos de 10/100 (aproximadamente 90% de identidad) . Las diferencias están definidas como sustituciones, inserciones o deleciones de nucleótidos o aminoácidos.

A un nivel de homología o identidad superior a alrededor de un 85-90%, el resultado debería ser independiente del programa y del conjunto de parámetros de aperturas (gaps) ; tales altos niveles de identidad pueden ser evaluados fácilmente, a menudo sin necesidad de un programa . Cuando se utiliza en este documento, la frase "proteínas relacionadas en secuencia" se refiere a proteínas que tienen al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, u homología, entre sí. Cuando se utiliza en este documento, "familias de proteínas no relacionadas" o "proteínas no relacionadas en secuencia" se refieren a proteínas que poseen menos de un 50%, menos de un 40%, menos de un 30% o menos de 20% de identidad de aminoácidos, u homología, entre sí. Cuando se utilizan en este documento, también se entiende que los términos "sustancialmente idénticos" o "similares" varían según el contexto, tal como podrán entender aquéllos con experiencia en el arte relevante. Cuando se utiliza en este documento, "una cadena polipeptídica desnuda" se refiere a un polipéptido que no ha sido modificado post-traduccionalmente o modificado químicamente de otra manera, sino que contiene sólo aminoácidos unidos covalentemente . Cuando se utilizan en este documento, los aminoácidos que se encuentran en las varias secuencias de aminoácidos que se proporcionan en este documento son identificados de acuerdo a sus abreviaturas de tres letras o de una letra (Tabla 1) . Los nucleótidos que se encuentran en los varios fragmentos de ácidos nucleicos se identifican con las designaciones estándares de una letra que se usan rutinariamente en el arte. Cuando se utiliza en este documento, un "aminoácido" es un compuesto orgánico que contiene un grupo amino y un grupo ácido carboxílico. Un polipéptido contiene dos o más aminoácidos. Para los propósitos de este documento, los aminoácidos incluyen los veinte aminoácidos que se encuentran naturalmente, aminoácidos no naturales, y análogos de aminoácidos (por ejemplo, aminoácidos en los que el carbono a tiene una cadena lateral) . Cuando se utilizan en este documento, las abreviaturas para cualquier grupo protector, aminoácido u otros compuestos están de acuerdo, a menos que se indique lo contrario, con su uso acostumbrado, con abreviaturas reconocidas o con la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de IUPAC-IUB (1972) Biochem. 11:1726). Cada L-aminoácido natural es identificado mediante el código estándar de una letra (o código de una letra) o mediante el código estándar de tres letras (o código de tres letras) con una "L-"; una "D-" indica que la forma estereoisomérica del aminoácido es D. Cuando se utiliza en este documento, "residuo de aminoácido" o "residuo aminoacídico" se refiere a un aminoácido formado después de la digestión química (hidrólisis) de un polipéptido en sus uniones peptídicas. Se asume que los residuos de aminoácidos descritos en este documento tienen la forma isomérica "L" . Puede sustituirse cualquier residuo de L-aminoácido con un residuo en la forma isomérica "D" , indicada expresamente, siempre que el polipéptido mantenga la propiedad funcional deseada. "NH2" se refiere al grupo amino libre presente en el extremo amino- terminal de un polipéptido. "COOH" se refiere al grupo carboxilo libre presente en el extremo carboxilo-terminal de un polipéptido. Adoptando la nomenclatura polipeptídica estándar descrita en J". Biol. Chem. , 243: 3552-3559 (1969), y adoptada en 37 C.F.R. . §§ 1.821-1.822, las abreviaturas para los residuos de aminoácidos se muestran en la Tabla 1: Debe hacerse notar que todas las secuencias de residuos de aminoácidos representadas en este documento tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal. Además, la frase "residuo de aminoácido" o "residuo aminoacídico" está definida ampliamente para incluir los aminoácidos listados en la Tabla de Correspondencia (Tabla 1 ) y los aminoácidos modificados e inusuales, tales como los que se menciona en 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, se incorporan aquí como referencia. Adicionalmente , debe hacerse notar que un guión al inicio o al final de una secuencia de residuos aminoacídicos indica un enlace peptídico con una secuencia adicional de uno o más residuos aminoacídicos, con un grupo amino-terminal tal como NH2 o con un grupo carboxilo-terminal tal como COOH. Cuando se utiliza en este documento, "aminoácidos naturales" se refiere a los 20 L-aminoácidos que están presentes en polipéptidos . Cuando se utiliza en este documento, el término "aminoácido no natural" se refiere a un compuesto orgánico que posee una estructura similar a un aminoácido natural, pero que ha sido modificado estructuralmente para imitar la estructura y reactividad de un aminoácido natural. Los aminoácidos no naturales incluyen, por ejemplo, aminoácidos o análogos de aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos naturales e incluyen, pero no están limitados, los D-isostereómeros de los aminoácidos. Los aminoácidos ejemplares no naturales se describen aquí y son conocidos por aquéllos con experiencia en el arte. Cuando se utiliza en este documento, las preparaciones "purificadas" preparadas a partir de células, hospederos u otras fuentes se refiere al menos a cierta pureza de un extracto celular que contiene el ADN o proteina indicados, incluyendo un extracto crudo del ADN o la proteina de interés. Por ejemplo, en el caso de una proteina, una preparación purificada puede ser obtenida siguiendo una técnica individual o una serie de técnicas preparativas o bioquímicas, y el ADN o proteína de interés puede estar presente en varios grados de pureza en estas preparaciones. Los procedimientos pueden incluir, pero no están limitados a, fraccionamiento con sulfato de amonio, filtración por geles, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, centrifugación con gradiente de densidad, y electroforesis . Cuando se utiliza en este documento, una preparación de ADN o proteína que está "sustancialmente pura" o "aislada" se refiere a una preparación sustancialmente libre de materiales que ocurren en la naturaleza con los cuales tales ADN o proteína está normalmente asociada en la naturaleza y generalmente contiene 5% o menos de los otros contaminantes. Cuando se utiliza en este documento, una composición se refiere a cualquier mezcla de dos o más productos o compuestos (por ejemplo, agentes, moduladores, reguladores, etc.). Una composición incluye una solución, una suspensión, un líquido, un polvo, una pasta, formulaciones acuosas, formulaciones no acuosas o cualquier combinación de los mismos. Cuando se utiliza en este documento, una combinación se refiere a cualquier asociación entre dos o más ítems. Los ítems de una combinación para administración a un sujeto pueden ser administrados separadamente o en conjunto, pueden ser usados simultánea o secuencialmente , o pueden ser empacados juntos o por separado. Cuando se utiliza en este documento, un "artículo manufacturado" es una composición empacada. Cuando se utiliza en este documento, el término está concebido para englobar composiciones farmacéuticas de polipéptidos modificados y/o ácidos nucleicos como se describe en este documento contenidos en artículos empacados, conteniendo opcionalmente instrucciones para su administración, particularmente como una formulación de dosificación oral. Cuando se utiliza en este documento, un "kit" se refiere a una combinación de polipéptidos o moléculas de ácidos nucleicos modificados como se describe en este documento, proporcionados en composiciones farmacéuticas, y otro ítem para un propósito que incluye, pero no está limitado a, administración, diagnosis y evaluación de una actividad o propiedad de los polipéptidos aquí descritos. Los kits, opcionalmente , incluyen instrucciones para su uso.

B. ABSORCIÓN GASTROINTESTINAL Y DETECCIÓN DE POLIPÉPTIDOS RESISTENTES A PROTEASAS Como se muestra en este documento, para las proteínas terapéuticas que no están modificadas para ser resistentes a proteasas en virtud de cambios en su secuencia primaria, no se puede administrar ninguna cantidad de proteína a través de administración oral que logre entregar cantidades terapéuticamente efectivas de polipéptidos nativos, o de tipo salvaje, al torrente sanguíneo. Esto es el resultado de la degradación de los polipéptidos en el tracto gastrointestinal por parte de proteasas gastrointestinales (Figura 1A) . Los polipéptidos nativos son susceptibles a una rápida degradación por proteasas presentes en el tracto gastrointestinal inferior (Figura lA(a-c)) . Por lo tanto, no se encuentra proteínas terapéuticas disponibles para ser absorbidas a partir del tracto gastrointestinal debido a la degradación proteolítica . Aunque los polipéptidos nativos pueden ser formulados con recubrimientos para entrega entérica, esto no es suficiente para obtener una resistencia a proteasas en el tracto gastrointestinal suficientemente alta como para permitir una liberación hacia el torrente sanguíneo. Una vez que el recubrimiento entérico es disuelto y que los polipéptidos nativos son liberados hacia el lumen del tracto gastrointestinal, los altos niveles de degradación proteolítica de los polipéptidos evitan la absorción eficiente de los polipéptidos desde el intestino hacia la sangre (Figura lA(d-e)). Por ende, no puede obtenerse cantidades terapéuticamente efectivas del polipéptido terapéutico en la sangre mediante entrega oral del polipéptido nativo. Las proteínas terapéuticas modificadas que se usan en las formulaciones de dosificación oral y en las unidades de dosificación oral proporcionadas en este documento son más resistentes a las proteasas en el torrente sanguíneo que las proteínas terapéuticas que no han sido modificadas de esa manera. En contraste, como se muestra en este documento, los polipéptidos resistentes a proteasas que son resistentes a la degradación por parte de proteasas, tales como las proteasas gastrointestinales, están disponibles para ser absorbidos y distribuidos hacia la sangre (Figura IB) . Cuando se liberan dentro del lumen del tracto gastrointestinal, los polipéptidos resistentes a proteasas están presentes en altas concentraciones, debido a su resistencia a las proteasas gastrointestinales (Figura lB(a-c)). Como resultado, puede absorberse cantidades terapéuticamente efectivas de los polipéptidos desde el intestino hacia el torrente sanguíneo (Figura lB(d-e)). Adicionalmente , la resistencia a la degradación proteolítica en el tracto digestivo y en el torrente sanguíneo permite la captación sostenida de los polipéptidos terapéuticos resistentes a proteasas. Por ende, los polipéptidos resistentes a proteasas pueden ser absorbidos y mantenidos en concentraciones terapéuticamente efectivas en el torrente sanguíneo durante períodos más largos de tiempo (Figura lB(f-h)). Así, los polipéptidos resistentes a proteasas pueden ser administrados por vía oral . Se proporciona aquí formulaciones de dosificación que proporcionan formulaciones de los polipéptidos resistentes a las proteasas. Típicamente, tales formulaciones son tabletas o cápsulas. De manera ventajosa, ellas incluyen recubrimientos entéricos que protegen contra las condiciones de pH del estómago y permiten una entrega eficiente de los polipéptidos hacia el tracto digestivo inferior.

La absorción hacia el torrente sanguíneo de los polipéptidos resistentes a proteasas contenidos en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas en este documento puede ser evaluada después de la administración oral. Típicamente, después de la administración oral de la formulación de dosificación, se toman muestras de sangre a las 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 24, o 48 horas después de la administración, y se evalúa la cantidad de polipéptido presente en la sangre. La evaluación de los niveles de proteína a lo largo del tiempo permite el análisis de la presencia sostenida del polipéptido en la sangre. Si se desea, también puede determinarse la vida media del polipéptido en la sangre. En un ejemplo, puede evaluarse la presencia de polipéptido en la sangre usando ensayos de medición de proteínas de rutina. Tales ensayos de medición incluyen, pero no están limitados a, tinción con Azul de Coomassie, tinción con plata, Western Blot y ELISA. En otro ejemplo, puede evaluarse la presencia de polipéptido en la sangre usando ensayos de medición de actividad funcional. Por ejemplo, puede usarse ensayos de actividad antiviral, anti-proliferativa, quimiotáctica, de coagulación, y otros análisis semejantes, dependiendo de la proteína a ser analizada.

Como se ejemplifica en los ejemplos de este documento, la absorción y actividad de un polipéptido de interferón-alfa (IFN-a) resistente a proteasas en la sangre después de la administración oral, se evalúa en un ensayo de actividad antiviral. En otro ejemplo, la absorción y actividad de un polipéptido de hormona del crecimiento (GH) resistente a proteasas en la sangre después de la administración oral, se evalúa en un ensayo de proliferación. Típicamente, tales ensayos funcionales se correlacionan con la cantidad de polipéptido activo presente en el torrente sanguíneo y pueden ser un indicador preciso de los polipéptidos que retienen actividad y, por ende, son terapéuticamente activos . Generalmente, la administración oral de las formulaciones de dosificación proporcionadas en este documento permite la absorción del polipéptido resistente a proteasas en una cantidad terapéuticamente efectiva. La cantidad de polipéptido presente en la sangre que es un nivel terapéuticamente efectivo puede ser determinada experimentalmente , y será diferente según el polipéptido terapéutico particular administrado y la enfermedad o desorden a ser tratado. En algunos casos, el nivel terapéuticamente efectivo de un polipéptido en el torrente sanguíneo se conoce en base a tratamientos estándar que usan las drogas aprobadas del mismo polipéptido original. En otros casos, tal nivel terapéuticamente efectivo puede ser determinado experimentalmente . Por ejemplo, la cantidad terapéuticamente efectiva puede ser deducida a partir de varios ensayos de actividad in vitro e in vivo. Por ende, puede determinarse la formulación de dosificación oral requerida para obtener una absorción del polipéptido hacia la sangre en niveles suficientes para producir cierta actividad. Por ejemplo, los Ejemplos en este documento ejemplifican la evaluación de formulaciones de dosificación oral requeridas para obtener una absorción del polipéptido hacia la sangre de manera tal que la cantidad de polipéptido en la sangre sea suficiente para obtener cierta actividad (es decir, actividad antiviral o antiproliferativa) . En otro ejemplo, puede usarse modelos animales para una enfermedad o condición para evaluar la formulación de dosificación oral requerida para tener un efecto de mejoría o efecto terapéutico sobre una enfermedad o condición. Por ejemplo, los Ejemplos muestran un estudio que evalúa los efectos de la administración oral de formulaciones de dosificación de hormona del crecimiento en ratas hipofisectomizadas . Las ratas hipofisectomizadas han sido utilizadas como modelo para estudiar los efectos de la deficiencia de hormona del crecimiento sobre los huesos. Así, el uso de tal modelo animal permite la evaluación de la formulación de dosificación oral requerida para una absorción hacia el torrente sanguíneo de una cantidad terapéutica de polipéptido requerida para superar tal deficiencia. Típicamente, tales resultados en modelos animales pueden ser extrapolados a humanos . De esta manera, en virtud de su resistencia a proteasas en el tracto digestivo, particularmente proteasas en el esófago, estómago e intestino, tales formulaciones de dosificación que contienen proteínas terapéuticas resistentes a proteasas permiten una liberación y absorción sostenida de las proteínas hacia el torrente sanguíneo después de su administración oral en cantidades que son terapéuticamente efectivas. La ventaja de una formulación de dosificación oral de una proteína terapéutica por sobre una proteína inyectable es que puede llevar a un mayor compromiso (conflabilidad) del paciente y a ahorros en relación con asistencia médica y cuidado de pacientes, dispositivos para inyección, fabricación y purificación de la proteína y almacenamiento y transporte de productos. Por ejemplo, una de las desventajas de los inyectables es la frecuencia de inyección requerida, lo cual es contraproducente frente al compromiso del paciente. Aunque el desarrollo de algunas proteínas terapéuticas se ha enfocado en la modificación de polipéptidos de manera de disminuir la frecuencia de administración (es decir, mediante pegilación, glicosilación, albuminación, conjugación con un Fe) , una frecuencia disminuida de administración no es un prerrequisito para las proteínas administradas oralmente, particularmente aquéllas en forma de tabletas y cápsulas que pueden ser fácil y eficientemente administradas simplemente tragando (es decir, mediante toma oral) la formulación de dosificación para obtener una liberación en el tracto gastrointestinal. En algunos regímenes de dosificación, sin embargo, las formulaciones de dosificación pueden ser administradas en una frecuencia menor, si se desea. Además, los polipéptidos resistentes a proteasas contenidos en las formulaciones de dosificación proporcionadas en este documento están modificados con sólo unos pocos cambios de aminoácidos (en muchos casos con un único cambio) en la secuencia primaria del polipéptido. Las mutaciones en la secuencia primaria por sí mismas hacen que los polipéptidos sean resistentes a proteasas. Adicionalmente, debido a que el polipéptido sólo contiene unos pocos cambios, éste puede retener su actividad en niveles iguales o, en algunos casos, mayores que la actividad del mismo polipéptido cuando las modificaciones están ausentes. Esto presenta ventajas por varias razones. Primero, esto significa que la formulación de dosificación requerida para lograr un efecto terapéutico no está limitada por ningún cambio (es decir, una disminución) de la actividad del polipéptido. Esto es un problema con muchos polipéptidos terapéuticos tales como, por ejemplo, polipéptidos pegilados, en donde la modificación del polipéptido hace que la proteína sea menos activa. De esta manera, para lograr un efecto terapéutico, tales polipéptidos terapéuticos deben ser administrados en una dosis más alta. Segundo, un cambio sólo en la secuencia primaria del polipéptido significa que no hay otros requerimientos de procesamiento para mezclar la proteína terapéutica con otros compuestos en la formulación para obtener resistencia a proteasas o absorción del polipéptido hacia el torrente sanguíneo. De acuerdo a lo anterior, la fabricación de las formulaciones de dosificación se simplifica. Por ejemplo, como se ejemplifica en este documento en los ejemplos, las tabletas que contienen sólo la proteína liofilizada pueden ser fabricadas para administración oral, es decir, las proteínas resistentes a proteasas se encuentran disponibles por sí mismas para su administración oral. Como se ha hecho notar, también es ventajoso incluir la formulación de dosificación en un recubrimiento entérico para aumentar adicionalmetne la resistencia del polipéptido frente a proteasas, particularmente mientras está en camino hacia el tracto gastrointestinal después de su administración oral.

C. FORMULACIONES DE DOSIFICACIÓN ORAL Los polipéptidos terapéuticos resistentes a proteasas proporcionados en este documento se administran por vía oral en una cantidad tal que se entregue una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido terapéutico hacia el torrente sanguíneo. La cantidad es efectiva para el tratamiento de una enfermedad, desorden o condición, y depende de la indicación de tratamiento. Las cantidades terapéuticamente efectivas de los polipéptidos terapéuticos resistentes a proteasas se proporcionan en formulaciones de dosificación, las cuales pueden contener una o una pluralidad de unidades de dosificación. Una unidad de dosificación contiene desde una cantidad parcial hasta la cantidad completa de proteína terapéuticamente efectiva. Las unidades de dosificación contienen cualquier forma apropiada de un polipéptido terapéutico resistente a proteasas, y opcionalmente contienen portadores y recubrimientos farmacéuticamente aceptables, tales como recubrimientos entéricos . Las cantidades de polipéptido terapéutico resistente a proteasas en una formulación de dosificación son generalmente más altas, generalmente alrededor de 6-200 veces, tal como 10-100 veces, incluyendo, por ejemplo, 15-50 veces, 20-30 veces, típicamente 15-40 veces más altas (dependiendo de la proteína terapéutica, de la indicación tratada y de la formulación) por día, en comparación con las cantidades en una formulación de dosificación de una proteína terapéutica que no ha sido modificada para ser resistente a proteasas para administración subcutánea con la misma indicación. Los regímenes de dosificación para administración oral pueden ser diferentes de aquéllos para administración subcutánea. Por ejemplo, las proteínas terapéuticas administradas por vía subcutánea varias veces a la semana, pueden ser administradas diariamente en un régimen oral. Por ende, las dosificaciones totales en un período de tiempo particular, tal como una semana, pueden ser sustancialmente más altas, tal como 10-500 veces más para administración oral en comparación con la cantidad total administrada en una semana por vía subcutánea. La cantidad de un polipéptido resistente a proteasas depende de las velocidades de absorción, inactivación y excreción del compuesto activo, el programa de dosificación, y la cantidad administrada, así como de otros factores conocidos para aquéllos con experiencia en el arte. Su cantidad en una unidad de dosificación también puede variar, pero debe ser una cantidad que sea adecuada para la ingestión oral. Como se describe adicionalmente en este documento, las dosificaciones pueden ser determinadas empíricamente usando las dosificaciones conocidas en el arte para la administración de polipéptidos terapéuticos no modificados y las comparaciones de propiedades y actividades (por ejemplo, resistencia a proteasas y actividades) del polipéptido resistente a proteasas en comparación con el polipéptido no modificado y/o nativo. Como se proporcionan en este documento, las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos terapéuticos resistentes a proteasas son más altas, típicamente 10-600 veces, generalmente 10-100, 10-50, 15-40, 15-30 o 20-40 veces, que una formulación de dosificación comparable del polipéptido terapéutico no modificado para ser resistente a proteasas . Cualquier proteína terapéutica puede ser modificada para ser resistente a proteasas y ser proporcionada para administración oral como se describe en este documento. Aquí se proporciona formulaciones de dosificación oral ejemplares, y unidades de dosificación para las mismas, para polipéptidos resistentes a proteasas ejemplares, tales como interferón-a (E41Q) (ID SEC NO: 1995) y hormona del crecimiento (Y42I) (ID SEC NO: 1318) (véase, por ejemplo, los Ejemplos de más abajo) . Las unidades de dosificación y formulaciones de dosificación oral ejemplares para el interferón-a (E41Q) se presentan en los Ejemplos 3 y 4. Las unidades de dosificación y formulaciones de dosificación oral para la hormona del crecimiento (Y42I) se presentan en el Ejemplo 22. 1. Unidades de Dosificación Oral Típicamente, se proporciona las formulaciones de dosificación oral como unidades de dosificación, tales como tabletas y/o cápsulas que contienen una cantidad de dosificación única o una fracción de la misma. Se proporciona las formulaciones de dosificación oral en forma de formulaciones de dosificación que contienen una cantidad suficiente de la proteina terapéutica como dosificación diaria para entregar una cantidad terapéuticamente efectiva hacia el torrente sanguíneo después de su administración oral . Las formulaciones de dosificación pueden contener una o una pluralidad de unidades de dosificación. Se proporciona formulaciones de dosificación oral de proteínas terapéuticas resistentes a proteasas . Las formulaciones proporcionan una cantidad de cada proteína que es suficiente para lograr un nivel terapéuticamente efectivo en el torrente sanguíneo después de su administración. El nivel terapéuticamente efectivo depende de la proteína y de la indicación a ser tratada. Las formulaciones típicamente contienen unidades de dosificación, tales como tabletas y/o cápsulas, y pueden contener una o una pluralidad de las mismas . Las unidades de dosificación que se proporcionan en este documento incluyen un polipéptido resistente a proteasas formulado aisladamente o en combinación con aditivos o excipientes apropiados. Para la administración oral, las unidades de dosificación proporcionadas en este documento que contienen un polipéptido resistente a proteasas pueden tomar la forma de, por ejemplo, tabletas, pildoras o cápsulas preparadas mediante medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones de polipéptidos resistentes a proteasas para administración oral pueden formularse con factores adicionales, tales como uno o más agentes terapéuticos, útiles en la enfermedad o desorden que está siendo tratado. Tales combinaciones de agentes terapéuticos para ser utilizadas en las composiciones proporcionadas en este documento se describen más adelante. Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en este documento pueden ser formuladas para administración (directa) de una dosis única o para dilución u otra modificación. La cantidad del polipéptido en la unidad de dosificación o en las formulaciones de dosificación oral es efectiva para la entrega de una cantidad, después de su administración, que es efectiva para el tratamiento que se lleva a cabo. Las composiciones pueden ser formuladas para administración de dosificaciones únicas o para administración de dosificaciones múltiples. Las formulaciones de dosificación oral proporcionadas en este documento incluyen formulaciones de liberación retardada y formulaciones de liberación prolongada. 2. Preparación de Formulaciones de Dosificación Oral y Unidades de Dosificación Oral Las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos resistentes a proteasas proporcionadas en este documento pueden ser formuladas de cualquier manera convencional mezclando una cantidad seleccionada del polipéptido con uno o más portadores o excipientes fisiológicamente aceptables. Para formular una composición, la fracción en peso de un compuesto o mezcla de los mismos es disuelta, suspendida, dispersada o mezclada de otra manera en un vehículo seleccionado, en una cantidad predeterminada. La cantidad depende del número de unidades de dosificación que van a ser administradas por día o por semana, de la proteína terapéutica y de la condición tratada. La selección del portador o excipiente está dentro de las habilidades del profesional administrador y puede depender de varios parámetros. Éstos incluyen, por ejemplo, la forma para administración oral (por ejemplo, tableta, pildora o cápsula) y el desorden que está siendo tratado. Los portadores o vehículos farmacéuticos adecuados para la administración de los compuestos proporcionados en este documento incluyen cualquiera de los portadores que son conocidos por aquéllos con experiencia en el arte como portadores adecuados para administración oral. Se conoce una variedad de excipientes farmacéuticamente aceptables en el arte (véase, por ejemplo, A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (Remington: La Ciencia y Práctica Farmacéutica"), 2a edición, Lippincott, Williams, & Wilkins; "Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems" ("Formas de Dosificación Farmacéutica y Sistemas de Entrega de Drogas") (1999) H.C. Ansel y cois., eds . , 7a edición, Lippincott, Williams, & Wilkins; y "Handbook of Pharmaceutical Excipients" ("Manual de Excipientes Farmacéuticos") (2000) A.H. Kibbe y cois., eds., 3a edición, Arner. Pharmaceutical Assoc . , cada uno de los cuales describe excipientes ejemplares) . Por ende, los aditivos y excipientes ejemplares que pueden ser utilizados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas incluyen, pero no están limitados a, agentes ligantes (por ejemplo, almidón de maíz pre-gelatinizado, almidón de papa, acacia, polivinilpirrolidona, silicato de magnesio y aluminio, pectinas, alginatos, gelatina, gomas tales como goma arábica, goma tragacanto, goma guar, o un derivado de celulosa tal como etilcelulosa, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, o carboximetilcelulosa) ; cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o fosfato de calcio e hidrógeno); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, sulfato de calcio, talco o sílice) ; desintegrantes (por ejemplo, almidón de papa, glicolato de almidón sódico, carboximetil-almidón sódico, agar, ácido algínico y su sal de sodio, croscarmelosa, crospovidona, arcillas y resinas de intercambio iónico); agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio); y diluyentes, agentes tamponeantes , solventes, co-solventes , surfactantes , preservantes, colorantes o pigmentos de grado farmacéutico, agentes que alteran la viscosidad, polímeros, resinas, plastificantes y agentes saborizantes . Se proporciona el polipéptido terapéutico resistente a proteasas en forma sólida o en otra forma adecuada, tal como en forma de polvo, cristal o gel, y se mezcla con uno o más excipientes. Los procedimientos para la preparación del polvo liofilizado, partículas y gránulos del polipéptido resistente a proteasas para formular una composición oral, tal como una tableta comprimida o una pildora, o para rellenar cápsulas, son conocidos y/o pueden ser modificados para producir composiciones con propiedades deseadas, incluyendo, pero no limitándose a, tamaño de partícula, untuosidad (tackiness) , rendimiento y formación de dímeros del polipéptido. Tales procedimientos pueden incluir la alteración de las condiciones del tampón de liofilización, tal como el ajuste del pH, el contenido de sales, el contenido de azúcar y su selección (por ejemplo, manitol o sacarosa) o la adición de otros agentes de estabilización, tales como, por ejemplo, L-arginina. La manipulación de tales condiciones está dentro del conocimiento de cualquiera con experiencia en el arte. Los procedimientos ejemplares para modificar tales condiciones se presentan en este documento en los Ejemplos de más adelante, y pueden ser utilizados para modificar las propiedades del polipéptido resistente a proteasas liofilizado resultante, incluyendo, por ejemplo, tamaño de partícula, untuosidad, rendimiento y formación de dímeros del polipéptido. Además, el contenido de humedad de la composición oral puede variarse con la adición o remoción de uno o más pasos de secado en la producción del polvo liofilizado, partículas o gránulos del polipéptido resistente a proteasas o en la preparación de la tableta comprimida o pildora.

Además de las variaciones mencionadas anteriormente, para obtener el patrón de liberación deseado, los excipientes también pueden variarse, siempre que no afecten la actividad del polipéptido resistente a proteasas particular seleccionado. a. Control de Entrega Como se describa en este documento, el sitio o la velocidad de liberación de los polipéptidos resistentes a proteasas en el tracto intestinal pueden ser controlados por alguien con experiencia en el arte, manipulando uno cualquiera o más de uno de los siguientes: el tipo de recubrimiento, y el espesor y permeabilidad, o propiedades de hinchamiento, deseables concomitantes del recubrimiento; las condiciones dependientes del tiempo del recubrimiento en sí o en el interior de la tableta, cápsula, partícula, grano o gránulo recubierto; el tamaño de partícula del polipéptido resistente a proteasas o las propiedades de disolución de la formulación de tabletas, tal como la densidad de empaque de la tableta o el espesor de la tableta; y las condiciones dependientes del pH del recubrimiento en sí y en el interior de la tableta, cápsula, partícula, grano o gránulo recubierto. En particular, la solubilidad, acidez y susceptibilidad a la hidrólisis de los diferentes polipéptidos resistentes a proteasas, y las propiedades del polvo liofilizado pueden ser utilizadas como guías para una elección apropiada. Además, las condiciones adecuadas de pH pueden ser establecidas en el interior de las tabletas, partículas, granulos o granos recubiertos, añadiendo un tampón adecuado al ingrediente activo de acuerdo al patrón de liberación deseado. Además, algunos polipéptidos resistentes a proteasas son sensibles a la humedad y se comportan mejor si se entregan en formas particulares, tales como una forma de dosificación en tabletas. Las unidades de dosificación en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas en este documento permiten una entrega confiable de la proteína terapéutica hacia el tracto intestinal superior o inferior, o cualquier parte del mismo. Si se desea sólo una entrega en el tracto intestinal inferior, las formulaciones de dosificación oral descritas en este documento pueden realizar tal entrega, evitando de esta manera la exposición del polipéptido resistente a proteasas en los tejidos mucosos y epiteliales de la boca, faringe y/o esófago e inhibiendo su liberación en el estómago. Las formulaciones de dosificación oral hacen que el polipéptido resistente a proteasas esté fácilmente disponible para ser absorbido a partir del tracto gastrointestinal inferior. De acuerdo a lo anterior, las formulaciones de dosificación oral adecuadas para ser utilizadas en este documento pueden ser formulaciones de liberación retardada con recubrimiento entérico o formulaciones de liberación prolongada con recubrimiento entérico. Los métodos ejemplares adecuados para ser usados en el recubrimiento de una tableta comprimida que contiene un polipéptido resistente a proteasas, que hará que la entrega del polipéptido se realice en el intestino delgado, se proporcionan en este documento en los Ejemplos. Los Ejemplos proporcionados en este documento describen formulaciones de dosificación oral para polipéptidos resistentes a proteasas, tales como interferón-a (E41Q) (ID SEC NO: 1995) y hormona del crecimiento (Y42I) (ID SEC NO: 1318) . Las formulaciones de dosificación oral ejemplares para el interferón-a (E41Q) se presentan en los Ejemplos 3 y 4. Las formulaciones de dosificación oral para la hormona del crecimiento (Y42I) se presentan en el Ejemplo 22. i. Recubrimientos Entéricos Las formulaciones de dosificación oral con recubrimiento entérico de polipéptidos resistentes a proteasas pueden ayudar a realizar la entrega en el intestino inferior (por ejemplo, en el intestino delgado) de un humano o de otro animal. Las formulaciones de dosificación oral con recubrimiento entérico contienen una cantidad de un polipéptido resistente a proteasas y excipientes farmacéuticamente aceptables. El recubrimiento entérico de la tableta o cápsula no es soluble en los fluidos de la boca, la faringe, el esófago o el estómago y, por ende, impide la liberación del polipéptido resistente a proteasas hasta alcanzar el intestino inferior, por ejemplo, el intestino delgado. Además de tabletas y cápsulas recubiertas, las formulaciones de dosificación oral pueden tomar otras formas, tales como una cápsula de gelatina que contiene granos o pequeñas partículas del polipéptido resistente a proteasas, las cuales han sido recubiertas con un recubrimiento entérico. Los recubrimientos entéricos están hechos típicamente con excipientes farmacéuticos que incluyen, pero no están limitados a, Eudragit® L, Eudragit® L- 100, Eudragit® S, Eudragit® S-100, Eudragit® L 30 D-55, Eudragit® 100-55, succinato acetato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCAS) , ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCP) , ftalato acetato de celulosa (CAP) , ftalato acetato de polivinilo (PVPA) , acetato trimelitato de celulosa, polietilenglicol 400-8000, triacetina, ftalato de dibutilo, monoglicéridos acetilados, laca, citrato de trietilo, talco y óxido de hierro . Una formulación de dosificación oral ejemplar de un polipéptido resistente a proteasas es una tableta comprimida con recubrimiento entérico, la cual está formulada a partir de gránulos, partículas o un polvo liofilizado del polipéptido resistente a proteasas. Las tabletas pueden hacerse combinando, mezclando o agregando de otra manera el polipéptido resistente a proteasas a excipientes farmacéuticamente aceptables como se ejemplifica más arriba. Dicha mezcla es luego comprimida en una tableta usando varias técnicas de tableteo conocidas para aquéllos con experiencia en el arte . La tableta comprimida se recubre luego con un material de recubrimiento entérico, utilizando métodos bien conocidos en el arte, incluyendo numerosas técnicas de aspersión conocidas para aquéllos con experiencia en el arte.

Una formulación de dosificación oral que efectúa la entrega en el intestino delgado contiene un polipéptido resistente a proteasas y posee un material de recubrimiento entérico dependiente del pH hecho a partir de un polímero de ácido metacrílico parcialmente esterificado con metilo. La formulación de dosificación oral puede estar en forma de una tableta comprimida con un recubrimiento entérico hecha de granulos, partículas o un polvo liofilizado del polipéptido resistente a proteasas. En un ejemplo particular, el polipéptido resistente a proteasas es producido en forma de un polvo liofilizado. Cualquier recubrimiento entérico que sea insoluble a un pH por debajo de 5,5 (es decir, el pH que se encuentra generalmente en la boca, faringe, esófago y estómago) , pero soluble a un pH de 5,5 o superior (es decir, el pH que se encuentra presente en el intestino delgado y en el intestino grueso) puede ser utilizado en la formulación de dosificación oral proporcionada. De acuerdo a esto, cuando se desee efectuar la entrega del polipéptido resistente a proteasas en el intestino delgado, es adecuado cualquier recubrimiento entérico que sea total o parcialmente insoluble a un pH por debajo de 5,5 y soluble a un pH de 5,5 o superior.

El polímero de ácido metacrílico parcialmente esterificado con metilo puede ser aplicado a la tableta comprimida, la cápsula de gelatina y/o los granos, partículas o gránulos del polipéptido resistente a proteasas en un espesor suficiente como para que todo el recubrimiento no se disuelva en los fluidos gastrointestinales a un pH por debajo de 5,5, pero se disuelva a un pH de 5,5 o superior. La disolución o desintegración del recubrimiento de excipiente no ocurre generalmente hasta la entrada de la forma de dosificación en el intestino delgado. En particular, prácticamente no existe liberación del polipéptido resistente a proteasas río arriba del duodeno. Puede usarse cualquier polímero aniónico que exhiba el perfil de solubilidad dependiente del pH requerido como recubrimiento entérico en la práctica de los presentes métodos para lograr la entrega del polipéptido resistente a proteasas en el intestino inferior. El recubrimiento escogido debe ser compatible con el polipéptido resistente a proteasas particular escogido. Los polímeros ejemplares para ser utilizados en las formas de dosificación proporcionadas son polímeros carboxílieos aniónicos . En un ejemplo particular, los polímeros son polímeros acrílicos, tales como polímeros de ácido metacrílico parcialmente esterificados con metilo, en los cuales la razón entre los grupos carboxilo libres aniónicos y los grupos éster es de alrededor de 1:1. Un copolímero de ácido metacrílico-metil metacrilato ejemplar, el cual es adecuado para ser utilizado en el recubrimiento de las formulaciones de dosificación oral y/o de los gránulos, partículas o granos del polipéptido resistente a proteasas que puede ser empleado en el método de tratamiento aquí descrito, ya sea solo o en combinación con otros recubrimientos, es el Eudragit L®, particularmente el Eudragit® L-100, fabricado por Rohm Pharma GmbH, Weiterstadt, Alemania. En el Eudragit® L-100, la razón entre los grupos carboxilo y los grupos éster es de aproximadamente 1:1. Además, se sabe que el copolímero es insoluble en fluidos gastrointestinales que poseen un pH por debajo de 6,0, generalmente 1,5-6,0, es decir, el pH generalmente presente en el fluido del tracto gastrointestinal superior (por ejemplo, en el estómago, pH < 5,5) y en el duodeno (por ejemplo, pH 5,5-6,0), pero es fácilmente soluble a pH por encima de 6,0, es decir, aquél pH generalmente presente en el fluido del tracto gastrointestinal inferior, particularmente en el yeyuno del intestino delgado.

Otras formulaciones de Eudragit® L incluyen el Eudragit® L 30 D-55, que permite entregar el polipéptido resistente a proteasas a pH>5,5. Tal recubrimiento puede ser utilizado para entregar el polipéptido resistente a proteasas en el duodeno, antes de entrar al yeyuno del intestino delgado. Otro copolímero de ácido metacrílico-metil metacrilato ejemplar, el cual es adecuado para ser utilizado en el recubrimiento de las formulaciones de dosificación oral y/o de los granulos, partículas o granos del polipéptido resistente a proteasas que puede ser empleado en el método de tratamiento aquí descrito, ya sea solo o en combinación con otros recubrimientos, es el Eudragit® S-100, fabricado por Rohm Pharma GmbH, Weiterstadt, Alemania . El Eudragit S difiere del Eudragit® L-100 sólo en que la razón entre los grupos carboxilo libres y los grupos éster es de aproximadamente 1:2. El Eudragit® S-100, igual que el Eudragit® L-100, es también insoluble a pH por debajo de 5,5, generalmente 1,5-5,5, tal como el pH presente en los jugos gástricos, pero contrariamente al Eudragit® L-30-D, es pobremente soluble en los fluidos gastrointestinales que tienen un pH de 5,5-7,0, tal como el pH presente en los jugos del intestino delgado superior. El copolímero es soluble a pH 7,0 y superiores, es decir, el pH generalmente presente en el intestino delgado inferior (es decir, el íleon) y en el colon . El Eudragit® S-100 puede ser utilizado solo como un recubrimiento que proporciona una entrega del polipéptido resistente a proteasas en el íleon a través de un mecanismo de liberación retardada. Además, como el Eudragit® S-100 es pobremente soluble en los jugos intestinales por debajo de pH 7,0, puede ser utilizado en combinación con recubrimientos tipo Eudragit® L, tales como Eudragit® L-100 o Eudragit® L 30 D-55, para efectuar una liberación retardada, composición que puede ser formulada para entregar el ingrediente activo en varios segmentos del tracto intestinal; cuanto más Eudragit® L se use, la liberación y entrega comienzan más proximales, y cuanto más Eudragit® S se use, la liberación y entrega comienzan más distales. El recubrimiento puede contener un plastificante y posiblemente otros excipientes de recubrimiento tales como agentes colorantes, talco y/o estearato de magnesio, muchos de los cuales son bien conocidos en el arte de los recubrimientos. En particular, los polímeros acrílicos carboxílicos aniónicos pueden contener 10-25% en peso de un plastificante, por ejemplo ftalato de dibutilo, polietilenglicol , citrato de trietilo, triacetina, triacetato de glicerilo, citrato de acetiltrietilo, sebacato de dibutilo, ftalato de dietilo, polietilenglicol con un peso molecular en el intervalo entre 200 y 8000, glicerol, aceite de castor, copolímeros de óxido de propileno y óxido de etileno, o mezclas de los mismos. Puede emplearse técnicas de recubrimiento convencionales para aplicar el recubrimiento, tales como recubrimiento por asperjado o en cazo. Como se describe en este documento, el espesor del recubrimiento debe ser suficiente para asegurar que la formulación de dosificación oral permanece intacta hasta alcanzar el sitio deseado de entrega tópica en el tracto intestinal inferior. Como se describe en este documento, la formulación de dosificación oral sólida puede estar en forma de una tableta comprimida recubierta que contiene gránulos, partículas o un polvo liofilizado del polipéptido resistente a proteasas o una cápsula de gelatina, recubierta o no recubierta, que contiene granos del polipéptido resistente a proteasas que tienen recubrimiento entérico sobre sí mismos. En un método ejemplar de recubrimiento descrito en este documento utilizando copolímeros de metilmetacrilato, en donde el sitio de entrega es el intestino delgado, se requiere usualraente un espesor de recubrimiento entre alrededor de 20 y 100 micrones . En un ejemplo particular, el espesor del recubrimiento está entre 30 y 75 micrones. En otro ejemplo particular, el espesor del recubrimiento está entre 30 y 50 micrones. El espesor de recubrimiento requerido sobre las tabletas o cápsulas dependerá del perfil de disolución de los materiales de recubrimiento particulares y, posiblemente, también del perfil de disolución del recubrimiento entérico sobre la cápsula. Dentro de las capacidades de alguien con experiencia en el arte está el determinar mediante procedimientos de prueba estándares el espesor óptimo de un recubrimiento particular requerido para una forma de dosificación particular. ii. Recubrimientos Múltiples y Sub-recubrimientos En otro ejemplo no limitante de una formulación de dosificación oral, los polipéptidos resistentes a proteasas pueden ser formulados con uno o más excipientes farmacéuticos y pueden ser recubiertos con un recubrimiento entérico (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6.346.269). Por ejemplo, una solución que contiene un solvente, un polipéptido resistente a proteasas y un estabilizante es recubierta sobre un núcleo que contiene excipientes farmacéuticamente aceptables, para formar un núcleo recubierto con un agente activo; se aplica una capa de sub-recubrimiento al núcleo recubierto con agente activo, el cual se recubre con una capa de recubrimiento entérico. El núcleo incluye generalmente el polipéptido resistente a proteasas y uno o más aditivos o excipientes farmacéuticamente aceptables como se describe en este documento. La capa de sub-recubrimiento puede contener uno o más de entre un adhesivo, un plastificante y un agente modificador de untuosidad. Los agentes modificadores de untuosidad incluyen, pero no están limitados a, talco, ácido esteárico, estearatos, estearil- fumarato de sodio, behenato de glicerilo, caolín y aerosil. Los adhesivos ejemplares incluyen polivinil pirrolidona (PVP) , gelatina, hidroxietilcelulosa (HEC) , hidroxipropilcelulosa (HPC) , hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) , acetato de vinilo (VA) , alcohol polivinílico (PVA) , metilcelulosa (MC) , etilcelulosa (EC) , ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCP) , acetato ftalato de celulosa (CAP) , goma xantana, ácido algínico, sales de ácido algínico, Eudragit®, copolímeros de ácido raetilacrílico/metil metacrilato con acetato ftalato de polivinilo (PVAP) . Los plastificantes adecuados incluyen glicerina, polietilenglicol , citrato de trietilo, citrato de tributilo, triacetato de propanilo y aceite de castor. Los materiales ejemplares solubles de recubrimiento entérico incluyen acetato succinato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCAS) , ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCP) , acetato ftalato de celulosa (CAP) , ftalato acetato de polivinilo (PVPA) , Eudragit® y laca. b. Otros Aditivos y Portadores de Entrega En otros ejemplos no limitantes de una formulación de dosificación oral, los polipéptidos resistentes a proteasas pueden ser formulados junto con cualquiera de los siguientes: microgránulos (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6.458.398); macrómeros biodegradables (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6.703.037); hidrogeles biodegradables (véase, por ejemplo, Graham y cNeill (1989) Biomaterials 5:27-36); vectores particulados biodegradables (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5.736.371); polímeros de lactonas bioabsorbibles (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5.631.015); polímeros proteicos de liberación lenta (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6.699.504; Pelias Technologies, Inc.); un polímero de bloques de poli (lacturo-co-glicólido/polietilenglicol) (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6.630.155; Atrix Laboratories, Inc.); una composición que contiene un polímero biocompatible y partículas de un agente estabilizado con cationes metálicos dispersado dentro del polímero (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6.379.701; Alkermes Controlled Therapeutics , Inc.); y microesferas (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6.303.148; Octoplus, B.V.). En otros ejemplos no limitantes de una formulación de dosificación oral, los polipéptidos resistentes a proteasas pueden ser formulados junto con cualquiera de los siguientes: un portador tal como, por ejemplo, EmisphereQ (Emisphere Technologies, Inc.); TIMERx, una matriz hidrofílica que combina gomas xantana y carob (carubina) que, en presencia de dextrosa, forma un gel ligante fuerte en agua (Penwest) ; Geminex™ (Penwest) ; Procise™ (Glaxo SmithKline) ; SAVIT™ (Mistral Pharma Inc.); RingCap™ (Alza Corp.); Smartrix® (Smartrix Technologies , Inc.); SQZgel™ (MacroMed, Inc.); Geomatrix™ (Skye Pharma, Inc.); Oros® Tri-layer (Alza Corporation) . En otros ejemplos no limitantes de una formulación de dosificación oral, los polipéptidos resistentes a proteasas pueden ser formulados como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 6.296.842 (Alkermes Controlled Therapeutics , Inc.); y en la Patente de los Estados Unidos No. 6.187.330 (Scios, Inc.). En otros ejemplos no limitantes de una formulación de dosificación oral, los polipéptidos resistentes a proteasas pueden contener un agente para aumentar la absorción intestinal. Los agentes para aumentar la absorción intestinal adecuados incluyen, pero no están limitados a, quelantes de calcio (por ejemplo, citrato, ácido etilendiaminotetraacético) ; surfactantes (por ejemplo, dodecilsulfato de sodio, sales biliares, palmitoilcarnitina y sales sódicas de ácidos grasos) ; y toxinas (por ejemplo, toxina de Zonula occludens) . Los polipéptidos modificados para ser utilizados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas en este documento, exhiben una resistencia aumentada a la proteólisis en el tracto gastrointestinal. De esta manera, puede formularse preparaciones para administración oral sin usar inhibidores de proteasas, tales como el inhibidor de Bowman-Birk, un inhibidor de Bowman-Birk conjugado, aprotinina y camostatina. Sin embargo, tales compuestos no están excluidos de ser utilizados en las composiciones proporcionadas.

D. POLIPEPTIDOS RESISTENTES A PROTEASAS PARA FORMULACIONES DE DOSIFICACIÓN ORAL 1. Polipéptidos Resistentes a Proteasas Los polipéptidos resistentes a proteasas a ser utilizados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas en este documento, incluyen cualquier polipéptido que tenga resistencia aumentada a la acción de una o más proteasas en comparación con la forma nativa del polipéptido, debido al reemplazo de uno o más aminoácidos en la secuencia primaria de aminoácidos del polipéptido. Los polipéptidos resistentes a proteasas a ser utilizados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas en este documento, incluyen polipéptidos terapéuticos. Tales polipéptidos incluyen, pero no están limitados a, formas resistentes a proteasas de polipéptidos seleccionados a partir de familias ejemplares de proteínas, tales como, pero no limitados a, factores de coagulación, citoquinas, factores de crecimiento, hormonas, hidrolasas, inmunog1obulinas , proteínas inhibitorias, proteínas nucleares y proteasas . Las proteasas a cuya acción las proteínas son resistentes o más resistentes que antes de su modificación, incluyen aquéllas que están presentes en el torrente sanguíneo. Se conoce y se han descrito numerosos de tales polipéptidos (véase, por ejemplo, las Publicaciones de Solicitudes de Patentes de los Estados Unidos Nos. 2004/0132977-A1, US 2005/0202438 -Al , US 2006/0251619-Al, US 2006/0094655-A1 ; las Solicitudes Provisionales de los Estados Unidos Nos. 60/787,208, 60/861,615; las Publicaciones de Solicitudes PCT Internacionales Nos. O2006/020580, WO 2004/022593, WO 2004/022747, WO2006048777 ; y la Solicitud PCT Internacional No. IB2006/002034) . Los polipéptidos resistentes a proteasas ejemplares para ser utilizados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas en este documento, se proporcionan en los ID SEC NOS: 2-46, 48-84, 86-117, 119-146, 148-660, 662-808, 810-859, 861-916, 918-945, 947-994, 996-1017-, 1019-1043, 1045-1079, 1081-1125, 1127-1147, 1149-1180, 1182-1214, 1216-1259, 1261-1885, 1887-1981, 1983-2066, y 2176-2182, así como variantes alélicas y de especies de los mismos. Con propósitos ilustrativos, los Ejemplos, más adelante, detallan estudios usando formulaciones orales de interferón-a (IFN-a) y hormona del crecimiento (hGH) . Los Ejemplos muestran cómo puede seleccionarse dosificaciones para una proteína terapéutica particular, y también demuestran la efectividad de las formulaciones orales en tabletas y cápsulas de IFN-a y hGH. Los polipéptidos resistentes a proteasas ejemplares para ser utilizados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas en este documento, incluyen variantes de especies y alélicas de los polipéptidos ejemplificados en este documento. Las modificaciones en la secuencia primaria de aminoácidos para inducir resistencia a proteasas con respecto a un polipéptido ejemplar que se proporcionan en este documento, también pueden realizarse en posiciones correspondientes en variantes de especies o alélicas del polipéptido. Tales variantes de especies o alélicas modificadas también pueden ser utilizadas en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas. Las modificaciones en la secuencia primaria de aminoácidos para inducir resistencia a proteasas en posiciones aminoacídicas correspondientes, pueden realizarse en polipéptidos que son variantes de especies o alélicas, o son homólogos, o son miembros de la misma familia de proteínas que los polipéptidos ejemplificados en este documento. Por ejemplo, en virtud del conocimiento de las posiciones estructurales tridimensionales dentro de las mutantes resistentes a proteasas proporcionadas en este documento que confieren una mayor resistencia a la acción de proteasas o de lisados sanguíneos o de suero, al mismo tiempo que mantienen o mejoran la actividad biológica requerida, se puede identificar los residuos aminoacídicos correspondientes estructuralmente relacionados (por ejemplo, estructuralmente similares) en una variedad de otros polipéptidos. Tales polipéptidos homólogos modificados o miembros modificados de una familia de proteínas, también pueden ser utilizados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas (véase, por ejemplo, la Solicitud de los Estados Unidos con número de serie 10/658.834, que describe tales métodos) . Se conoce numerosos métodos en el arte para identificar posiciones aminoacídicas estructuralmente relacionadas con proteínas homologas estructuralmente en tres dimensiones. Los métodos ejemplares incluyen, pero no están limitados a: CATH ( superfamilias de Clase, Arquitectura, Topología y Homología) , que es una clasificación jerárquica de estructuras de dominios de proteínas basada en cuatro niveles diferentes (Orengo y cois., Structure, 5 (8) : 1093-1108 (1997)); CE (Extensión Combinatoria del camino óptimo) , que es un método que calcula alineamientos estructurales de a pares (Shindyalov y cois., Protein Engineering, 11 (9) : 739-747 (1998)); FSSP (clasificación de plegamientos basada en alineamientos estructura-estructura de proteínas) , que es una base de datos basada en la comparación completa de todas las estructuras tridimensionales de proteínas que están incluidas en el Banco de Datos de Proteínas (Protein Data Bank, PDB) (Holm y cois., Science, 273:595-602 (1996)); la base de datos SCOP® (Structural Classification of Proteins, Clasificación Estructural de Proteínas) , que proporciona una base de datos descriptiva basada en las relaciones estructurales y evolutivas entre todas las proteínas de estructura conocida (Murzin y cois., J". Mol. Biol . , 247:536-540 (1995)); y la base de datos VAST (Vector Alignment Search Tool, Herramienta de Búsqueda de Alineamientos Vectoriales) , que compara las coordenadas estructurales tridimensionales de proteínas recientemente determinadas con aquéllas que se encuentran en la base de datos MMDB/PDB (Gibrat y cois., Current Opinión in Structural Biology, 6:377-385 (1995)). En un ejemplo, puede usarse programas disponibles públicamente, tales como el programa llamado TOP (Lu, G., J. Appl . Cryst . , 33:176-189 (2000) ) para la comparación de estructuras de proteínas. Este programa corre dos pasos para cada comparación de estructuras de proteínas. En el primer paso, se compara la topología de la estructura secundaria en las dos estructuras. El programa usa dos puntos para representar cada elemento de estructura secundaria (hélices alfa y hojas beta) y luego busca sistemáticamente todas las posibles superposiciones de estos elementos en un espacio tridimensional (definido como la desviación cuadrática media (rmsd) del ángulo entre las dos líneas formadas por los dos puntos y la distancia línea- línea) . El programa busca determinar si los elementos adicionales de estructura secundaria pueden hacerse calzar mediante la misma operación de superposición. Si las estructuras secundarias que pueden calzar entre sí exceden cierto número, el programa identifica las dos estructuras como similares. El programa entrega como información de salida un puntaje de comparación llamado "Diversidad Estructural" , que considera la distancia entre los átomos de carbono a que se hicieron calzar y el número de residuos que se hicieron calzar. Cuanto más bajo sea el puntaje de "Diversidad Estructural", más se parecen las dos estructuras . Entre los polipéptidos resistentes a proteasas a ser utilizados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas en este documento, se encuentran polipéptidos modificados para incrementar su estabilidad frente a condiciones inherentes a la administración oral, las cuales incluyen la administración hacia el tracto gastrointestinal, pero también la resistencia a proteasas presentes en el torrente sanguíneo. Tales modificaciones pueden incluir aquéllas que dan como resultado un aumento detectable en la vida media de la proteína bajo una o más condiciones, tales como exposición a la saliva, exposición a proteasas en el tracto gastrointestinal, y exposición a condiciones particulares de pH, tales como el bajo pH del estómago y/o las condiciones de pH en el intestino. Las modificaciones pueden incluir la inducción de resistencia frente a una o más proteasas, incluyendo pepsina, tripsina, quimotripsina, elastasa, aminopeptidasa, gelatinasa B, gelatinasa A, a-quimotripsina, carboxipeptidasa, endoproteinasa Arg-C, endoproteinasa Asp-N, endoproteinasa Glu-C, endoproteinasa Lys-C, y tripsina, pepsina luminal, endopeptidasa microvilar, dipeptidil-peptidasa, enteropeptidasa, hidrolasa, NS3 , elastasa, factor Xa, Granzima B, trombina, tripsina, plasmina, uroquinasa, tPA y PSA. Las modificaciones también pueden incluir aumentar la estabilidad global frente a condiciones potencialmente denaturantes o alteradoras de la conformación, tales como tolerancia térmica y tolerancia al mezclado y la aireación (por ejemplo, masticación) . Los polipéptidos resistentes a proteasas pueden ser generados o identificados o producidos mediante cualquier método conocido en el arte, incluyendo, pero no limitándose a, métodos de evolución dirigida tales como métodos de exploración por mutagénesis bidimensional o tridimensional para evolución racional de proteínas (véase, por ejemplo, las Publicaciones de los Estados Unidos Nos. US 2005/0202438 Al y US-2004/0132977-A1, y las solicitudes Internacionales publicadas WO 2004/022593 y WO 2004/022747) . La modificación de los polipéptidos para ser adecuados para administración oral puede incluir la remoción de sitios de digestión proteolítica y/o aumentar la estabilidad global de la estructura de la proteína. Tales variantes de polipéptidos exhiben una resistencia aumentada frente a proteasas en comparación con el polipéptido no modificado y/o nativo, en una o más condiciones para la administración oral, las cuales pueden incluir exposición a proteasas. En un ejemplo, la resistencia a proteasas de los polipéptidos variantes para ser utilizados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas en este documento, es evaluada midiendo la concentración de proteína o la actividad residual en presencia de una o más proteasas tales como pepsina, tripsina, quimotripsina, elastasa, aminopeptidasa, gelatinasa B, gelatinasa A, a-quimotripsina, carboxipeptidasa, endoproteinasa Arg-C, endoproteinasa Asp-N, endoproteinasa Glu-C, endoproteinasa Lis-C, y tripsina, pepsina luminal, endopeptidasa microvilar, dipeptidil-peptidasa, enteropeptidasa, hidrolasa, NS3, elastasa, factor Xa, Granzima B, trombina, tripsina, plasmina, uroquinasa, tPA y PSA. El polipéptido variante puede ser mezclado con una o más proteasas y luego puede ser evaluado según su actividad y/o estructura proteica después de un tiempo de reacción apropiado. La evaluación de la actividad residual también puede incluir la exposición a temperatura elevada, tal como la temperatura corporal de un sujeto; la exposición a jugos gástricos y/o jugos gástricos simulados; la exposición a condiciones de pH particulares y/o a una combinación de dos o más condiciones. Después de la exposición a una o más condiciones, la actividad y/o la evaluación de la estructura de la proteína pueden ser utilizadas para evaluar la estabilidad y/o resistencia a la digestión proteolítica del polipéptido variante en comparación con un control apropiado (por ejemplo, un polipéptido no modificado y/o nativo) . Las formas resistentes a proteasas de polipéptidos terapéuticos pueden ser administradas a un sujeto para la prevención o tratamiento de cualquier enfermedad o condición para la cual la forma nativa del polipéptido haya sido usada para la prevención o tratamiento de tal enfermedad o condición. Los polipéptidos modificados para ser usados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas también incluyen polipéptidos resistentes a proteasas que han sido modificados adicionalmente mediante glicosilación, carboxilación, hidroxilación, hasilación, carbamilación, sulfatación, fosforilación y/o pegilación. Los polipéptidos modificados para ser usados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas también incluyen polipéptidos resistentes a proteasas que han sido modificados adicionalmente mediante uno o más modificaciones de aminoácidos que contribuyen a, por ejemplo, obtener una actividad aumentada, inmunogenicidad alterada, estabilidad, tolerancia térmica, resistencia a proteasas, glicosilación, carboxilación, hidroxilación, hasilación, carbamilación, sulfatación, fosforilación y/o pegilación. Tales modificaciones de aminoácidos pueden ser aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales y una combinación de aminoácidos naturales o no naturales. Los polipéptidos resistentes a proteasas para ser utilizados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas también pueden ser conjugados o expresados como proteínas de fusión con una o más proteínas o péptidos, tales como albúmina. 2. Citoquinas Los polipéptidos resistentes a proteasas ejemplares para ser utilizados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas en este documento, incluyen polipéptidos de la superfamilia de las citoquinas. Los polipéptidos de citoquina modificados para ser utilizados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas contienen uno o más reemplazos de aminoácidos en una o más posiciones objetivo y exhiben una mayor resistencia a la proteólisis en comparación con la proteína de citoquina sin los uno o más reemplazos de aminoácidos. Todas las citoquinas comparten un plegamiento en un haz de hélices, el cual se usa para definir estructuralmente la superfamilia de las citoquinas de 4 -hélices en la base de datos de clasificación estructural de proteínas SCOP® (Structural Classification of Proteins; véase, por ejemplo, Murzin y cois., J. Mol. Biol., 247:536-540, (1995), y el sitio "scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/"). Esta superfamilia incluye tres diferentes familias: 1) la familia de proteínas de los interferones/interleuquina-10 ; 2) la familia de las citoquinas de cadena larga; y 3) la familia de las citoquinas de cadena corta. Aunque el grado de similitud entre las secuencias subyacentes de aminoácidos de estas citoquinas no es alto, sus estructuras tridimensionales correspondientes presentan un alto nivel de similitud. Efectivamente, la mejor similitud estructural se obtiene entre dos estructuras tridimensionales de proteínas de la misma familia en la superfamilia de las citoquinas de 4 -hélices. Una característica ejemplar distintiva de las citoquinas de la familia de los interferones/interleuquina-10 es una hélice adicional (quinta) . Esta familia incluye, por ejemplo, la interleuquina-10 (IL-10; ID SEC NO: 809), el interferón beta (IFN-ß; ID SEC NO: 147), el interferón alfa-2a (IFNa-2a; ID SEC NO: 2162), el interferón alfa-2b (IFNa-2b; ID SEC NO: 2067), y el interferón gamma (IFN-?; ID SEC NO: 661) . La familia de proteínas de las citoquinas de cadena larga incluye, entre otros, el factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF ID SEC NO: 47) , el factor de inhibición de leucemia (LIF; ID SEC NO: 1148) , la hormona del crecimiento (hGH; ID SEC NO: 1260) , el factor neurotrófico ciliar (CNTF; ID SEC NO: 1), la leptina (ID SEC NO: 1126), la oncostatina M (ID SEC NO: 1181), la interleuquina- 6 (IL-6; ID SEC NO: 1080) y la interleuquina- 12 (IL-12; ID SEC NO: 860) . La familia de proteínas de las citoquinas de cadena corta incluye, entre otros, la eritropoyetina (EPO; ID SEC NO: 1886) , el factor estimulador de colonias de granulocitos -macrófagos (GM-CSF; ID SEC NO: 85), la interleuquina- 2 (IL-2; ID SEC NO: 946), la interleuquina- 3 (IL-3; ID SEC NO: 995) , la interleuquina-4 (IL-4; ID SEC NO: 1018) , la interleuquina- 5 (IL-5; ID SEC NO: 1044) , la interleuquina- 13 (IL-13; ID SEC NO: 917) , el ligando de Flt3 (ID SEC NO: 118) y el factor de células troncales (SCF; ID SEC NO: 1215) . Las citoquinas modificadas para ser utilizadas en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas incluyen variantes alélicas y de especies de tales citoquinas que contienen modificaciones correspondientes para resistencia a proteasas. a. Familia de Interferón/Interleuquina-10 Como se expuso más arriba, en este documento se proporciona formulaciones de dosificación oral que contienen citoquinas modificadas, las cuales contienen uno o más reemplazos de aminoácidos en una o más posiciones objetivo en polipéptidos de la familia de los interferones/interleuquina- 10. En un ejemplo particular de una formulación de dosificación oral, el polipéptido resistente a proteasas es un interferón modificado, tal como interferón-a (IFN- ). Los polipéptidos de IFN-a resistentes a proteasas incluyen una o más modificaciones de aminoácidos en un polipéptido de IFN-a2b, en donde los uno o más reemplazos conducen a una mayor resistencia a proteasas. Tales modificaciones incluyen, pero no están limitadas a, las modificaciones mostradas en la Tabla 2, en donde los reemplazos se hacen en comparación con la secuencia de aminoácidos expuesta en el ID SEC NO: 2067. En referencia a tales mutantes, el primer aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido reemplazado, el número corresponde a la posición en la secuencia del polipéptido de IFN-a2b en referencia al ID SEC NO: 2067, y el segundo aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido seleccionado que reemplaza al primer aminoácido en dicha posición. En la Tabla 2, el identificador de secuencia (ID SEC NO.) para el Listado de Secuencias adjunto se encuentra entre paréntesis junto a cada sustitución. Tales polipéptidos ejemplares pueden ser utilizados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas.

TABLA 2 Modificaciones al lnterferón-a (IFN-a) para Aumentar la Resistencia a la Proteólisis P4A(1983) L3V(1984) R12H (1985) R13H (1986) M16V(1987) M16I (1988) R22H (1989) F27I (1990) F27V(1991) L30I (1992) K31Q (1993) R33H (1994) E41Q(1995) E41H (1996) E58Q (1997) E58H (1998) K70T(1999) E78Q (2000) E78H (2001) Y89I (2002) E107Q (2003) E107H (2004) P109A (2005) L110V (2006) M111I (2007) E113Q (2008) E113H (2009) L117V (2010) L117I (2011) K121Q(2012) K121T(2013) R125H (2014) R125Q (2015) L128V (2016) L128I (2017) K131Q (2018) K131T(2019) E132Q (2020) E132H (2021) K133Q (2022) K133T (2023) K134Q (2024) Y135H (2025) Y135I (2026) P137A (2027) M148V (2028) M148I (2029) R149H (2030) R149Q (2031) E159Q (2032) E159H (2033) P4S (2034) M111V(2035) Y89H (2036) L3I (2037) R12Q (2038) R13Q (2039) R22Q (2040) R23H (2041) R23Q (2042) L30V (2043) K31T(2044) R33Q (2045) K49Q (2046) K49T (2047) K70Q (2048) K83Q (2049) K83T (2050) E96Q (2051) E96H (2052) P109S (2053) L110I (2054) R120H (2055) R120Q (2056) K134T (2057) P137S (2058) L161V(2059) L161I (2060) R162H (2061) R162Q (2062) K164Q (2063) K164T (2064) E165Q (2065) E165H (2066) N45D D94G G102R A139G E41H/Y89H/ E58Q/F27V R125H/M111V E159H/Y89H K121Q/P109A N45D (2176) (2177) (2178) (2179) (2180) K121Q/P109A E78H/R33H/ /K133Q/ E58H/L110V G102R (2181) (2182) Además del IFN-a, los polipéptidos resistentes a proteasas de esta familia que pueden ser utilizados en las formulaciones de dosificación oral incluyen, pero no están limitados a, polipéptidos de interleuquina-10 (IL-10; SEQ ID NO: 809), interferón beta (IFN-ß; SEQ ID NO: 147) , e interferón gamma (IFN-?; SEQ ID NO: 661) . Los polipéptidos resistentes a proteasas incluyen una o más modificaciones en dichos polipéptidos, en donde los uno o más reemplazos conducen a una mayor resistencia a proteasas . Tales modificaciones incluyen, pero no están limitadas a, las modificaciones mostradas en las Tablas 3-5, en donde los reemplazos se hacen en comparación con la secuencia de aminoácidos expuesta en los ID SEC NOS: 809, 147, o 661, respectivamente. En referencia a tales mutantes, el primer aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido reemplazado, el número corresponde a la posición en la secuencia del polipéptido de IL-10, IFN-ß o IFN-? en referencia a los ID SEC NO: 809, 147 o 661, respectivamente, y el segundo aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido seleccionado que reemplaza al primer aminoácido en dicha posición. En las tablas, el identificador de secuencia (ID SEC NO.) para el Listado de Secuencias adjunto se encuentra entre paréntesis junto a cada sustitución. Tales polipéptidos ejemplares pueden ser utilizados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas.

TABLA 3 Modificaciones a la lnterleuquina-10 (IL-10) para Aumentar la Resistencia a Da Proteólisis K49N (810) K49Q (81 1 ) E50N (812) E50Q (813) E50H (814) L52I (815) L52V (816) L53I (817) L53V (818) E54N (819) E54Q (820) E54H (821 ) D55N (822) D55Q (823) F56I (824) F56V (825) K57N (826) K57Q (827) Y59H (828) Y59I (829) L60I (830) L60V (831 ) E67N (832) E67Q (833) E67H (834) M68I (835) M68V (836) F71 I (837) F71V (838) Y72H (839) Y72I (840) E74N (841 ) E74Q (842) E74H (843) E75N (844) E75Q (845) E75H (846) P78A (847) P78S (848) E81 N (849) E81 Q (850) E81 H (851 ) D84N (852) D84Q (853) P85A (854) P85S (855) D86N (856) D86Q (857) K88N (858) K88Q (859) TABLA 4 M1I (148) M1V(149) M1T(150) M1Q(151) M1A(152) Y3H (153) Y3I (154) L5I (155) L5V(156) L5T(157) L5Q (158) L5H (159) L5A(160) L6I (161) L6V(162) F8I (163) F8V(164) L9I (165) L9V(166) L9T(167) L9Q (168) L9H (169) L9A(170) R11H (171) R11Q (172) F15I (173) F15V(174) K19N (175) K19Q(176) K19T(177) K19S (178) K19H (179) L20I (180) L20V(181) L21I (182) L21V(183) W22S (184) W22H (185) L24I (186) L24V(187) N25H (188) N25Q (189) N25S(190) R27H (191) R27Q (192) L28I (193) L28V(194) L28T(195) L28Q (196) L28H (197) L28A(198) E29N (199) E29Q (200) E29H (201) Y30H (202) Y30I (203) L32I (204) L32V (205) L32T (206) L32Q (207) L32H (208) L32A (209) K33N (210) K33Q (211) K33T (212) K33S (213) K33H (214) D34N (215) D34Q (216) R35H (217) R35Q (218) M36I (219) M36V (220) M36T (221) M36Q (222) M36A (223) F38I (224) F38V (225) D39N (226) D39Q (227) D39H (228) D39G (229) P41A(230) P41S (231) E42N (232) E42Q (233) E42H (234) E43N (235) E43Q (236) E43H (237) K45N (238) K45Q (239) K45T (240) K45S (241) K45H (242) L47I (243) L47V (244) L47T (245) L47Q (246) L47H (247) L47A (248) F50I (249) F50V (250) K52N (251) K52Q (252) K52T (253) K52S (254) K52H (255) E53N (256) E53Q (257) E53H (258) D54N (259) D54Q (260) L57I (261) L57V (262) Y60H (263) Y60I (264) E61N (265) E61Q (266) E61H (267) M62I (268) M62V (269) L63I (270) L63V (271) F67I (272) F67V (273) F70I (274) F70V (275) R71H (276) R71Q (277) D73N (278) D73Q (279) D73H (280) D73G (281) W79S (282) W79H (283) E81N (284) E81Q (285) E81H (286) E85N (287) E85Q (288) E85H (289) L87I (290) L87V (291) L88I (292) L88V (293) Y92H (294) Y92I (295) L98I (296) L98V (297) K99N (298) K99Q (299) K99T (300) K99S (301) K99H (302) L102I (303) L102V (304) E103N (305) E103Q (306) E103H (307) E104N (308) E104Q (309) E104H (310) K105N (311) K105Q (312) K105T (313) K105S (314) K105H (315) L106I (316) L106V (317) E107N (318) E107Q (319) E107H (320) K108N (321) K108Q (322) K108T (323) K108S (324) K108H (325) E109N (326) E109Q (327) E109H (328) D110N (329) D110Q (330) D110H (331) D110G (332) F 11I (333) F111V(334) R113H (335) R113Q (336) K115N (337) K 15Q (338) L116I (339) L116V (340) L116T (341) L116Q (342) L116H (343) L116A (344) M117I (345) M117V (346) L120I (347) L120V (348) L120T(349) L120Q (350) L120H (351) L120A (352) L122I (353) L122V (354) K123N (355) K123Q (356) K123T (357) K123S (358) K123H (359) R124H (360) R124Q (361) Y125H (362) Y125I (363) Y126H (364) Y126I (365) R128H (366) R128Q (367) L130I (368) L130V (369) L130T (370) L130Q (371) L130H (372) L130A(373) Y132H (374) Y132I (375) L133I (376) L133V (377) K134N (378) K134Q (379) K134T (380) K134S (381) K134H (382) K136N (383) K136Q (384) K136T (385) K136S (386) K136H (387) E137N (388) E137Q (389) E137H (390) Y138H (391) Y138I (392) TABLA 4 W143S (393) W143H (394) R147H (395) R147Q (396) E149N (397) E149Q (398) E149H (399) L151I (400) L151V(401) R152H (402) R152Q (403) F154I (404) F154V (405) Y155H (406) Y155I (407) F156I (408) F156V (409) R159H (410) R159Q (411) L160I (412) L160V (413) Y163H (414) Y163I (415) L164I (416) L164V (417) R165H (418) R165Q (419) M1D (420) M1E (421) M1K(422) M1N (423) M1R (424) M1S (425) L5D (426) L5E (427) L5K (428) L5R (429) L5N (430) L5S (431) L6D (432) L6E (433) L6K (434) L6N (435) L6Q (436) L6R (437) L6S (438) L6T (439) F8D (440) F8E (441) F8K (442) F8R (443) L9D (444) L9E (445) L9K (446) L9N (447) L9R (448) L9S (449) Q10D (450) Q10E (451) Q10K(452) Q10N (453) Q10R (454) Q10S (455) Q10T (456) S12D (457) S12E(458) S12K(459) S12R (460) S13D (461) S13E(462) S13K(463) S13N (464) S13Q (465) S13R (466) S13T (467) N14D (468) N14E (469) N14K(470) N14Q (471) N14R (472) N14S (473) N14T (474) F15D (475) F15E (476) F15K(477) F15R (478) Q16D(479) Q16E (480) Q16K (481) Q16N (482) Q16R (483) Q16S (484) Q16T (485) C17D (486) C17E (487) C17K(488) C17N (489) C17Q (490) C17R (491) C17S (492) C17T (493) L20N (494) L20Q (495) L20R (496) L20S (497) L20T (498) L20D (499) L20E (500) L20K(501) W22D (502) W22E (503) W22K (504) W22R (505) Q23D (506) Q23E (507) Q23K (508) Q23R (509) L24D (510) L24E (511) L24K (512) L24R (513) G78D (514) G78E (515) G78K(516) G78R (517) W79D (518) W79E (519) W79K (520) W79R (521) N80D (522) N80E (523) N80K (524) N80R (525) T82D (526) T82E (527) T82K (528) T82R (529) I83D (530) I83E (531) I83K (532) I83R (533) I83N (534) I83Q (535) I83S (536) I83T (537) N86D (538) N86E (539) N86K (540) N86R (541) N86Q (542) N86S (543) N86T (544) L87D (545) L87E (546) L87K (547) L87R (548) L87N (549) L87Q (550) L87S (551) L87T (552) A89D (553) A89E (554) A89K (555) A89R (556) N90D (557) N90E (558) N90K (559) N90Q (560) N90R (561) N90S (562) N90T (563) V91D(564) V91E(565) V91K(566) V91N (567) V91Q (568) V91R (569) V91S (570) V91T(571) Q94D (572) Q94E (573) Q94K (574) Q94N (575) Q94R (576) Q94S (577) Q94T (578) I95D (579) I95E (580) I95K (581) I95N (582) I95Q (583) I95R (584) I95S (585) I95T (586) H97D (587) H97E (588) H97K (589) H97N (590) H97Q (591) H97R (592) H97S (593) H97T (594) L98D (595) L98E (596) L98K (597) L98N (598) L98Q (599) L98R (600) L98S (601) L98T (602) V101D (603) V10 E (604) V101K(605) V101N (606) V101Q (607) V101R (608) V101S (609) V101T(610) M1C (611) L6C (612) Q10C (613) S13C (614) Q16C (615) N90C (616) V91C (617) Q94C (618) H97C (619) L98C (620) V101C (621) L5D/L6E (622) L5E/Q10D L5Q/M36I L6E/L47I (625) L5E/K108S L5E/L6E (627) (623) (624) (626) TABLA 5 Modificaciones al lnterferón-? (IFN-?) para Aumentar la Resistencia a la Proteólisis Y2H (662) Y2I (663) D5N (664) D5Q (665) P6A (666) P6S (667) Y7H (668) Y7I (669) K9N (670) K9Q (671 ) E10N (672) E10Q (673) E10H (674) E12N (675) E12Q (676) E12H (677) L14I (678) L14V (679) K15N (680) K15Q (681 ) K16N (682) K16Q (683) Y17H (684) Y17I (685) F18I (686) F18V (687) D24N (688) D24Q (689) D27N (690) D27Q (691 ) N28Q (692) N28S (693) L31 I (694) L31V (695) F32I (696) F32V (697) L33I (698) L33V (699) L36I (700) L36V (701 ) K37N (702) K37Q (703) W39S (704) W39H (705) K40N (706) K40Q (707) E41 N (708) E41 Q (709) E41 H (710) E42N (711 ) E42Q (712) E42H (713) D44N (714) D44Q (715) R45H (716) R45Q (717) F57I (718) F57V (719) K58N (720) K58Q (721 ) L59I (722) L59V (723) F60I (724) F60V (725) K61 N (726) K61 Q (727) F63I (728) F63V (729) K64N (730) K64Q (731 ) D65N (732) D65Q (733) D66N (734) D66Q (735) K71 N (736) K71 Q (737) E74N (738) E74Q (739) E74H (740) K77N (741 ) K77Q (742) E78N (743) E78Q (744) E78H (745) D79N (746) D79Q (747) K83N (748) K83Q (749) F84I (750) F84V (751 ) K89N (752) K89Q (753) K90N (754) K90Q (755) K91 N (756) K91 Q (757) R92H (758) R92Q (759) D93N (760) D93Q (761 ) D94N (762) D94Q (763) F95I (764) F95V (765) E96N (766) E96Q (767) E96H (768) K97N (769) K97Q (770) L98I (771 ) L98V (772) Y101 H (773) Y101 I (774) D105N (775) D105Q (776) L106I (777) L106V (778) E1 15N (779) E115Q (780) E115H (781 ) E122N (782) E122Q (783) E122H (784) L123I (785) L123V (786) P125A (787) P125S (788) K128N (789) K128Q (790) K131 N (791 ) K13 Q (792) R132H (793) R132Q (794) K133N (795) K133Q (796) R134H (797) R134Q (798) M137I (799) 137V (800) L138I (801 ) L138V (802) F139I (803) F139V (804) R142H (805) R142Q (806) R143H (807) R143Q (808) b. Familia de las Citoquinas de Cadena Larga Como se expuso más arriba, en este documento se proporciona formulaciones de dosificación oral que contienen citoquinas modificadas, las cuales contienen uno o más reemplazos de aminoácidos en una o más posiciones objetivo en polipéptidos de la familia de la familia de las citoquinas de cadena larga, incluyendo, pero no limitándose a, el factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF; ID SEC NO: 47) , el factor inhibidor de leucemia (LIF; ID SEC NO: 1148) , la hormona del crecimiento (hGH; ID SEC NO: 1260) , el factor neurotrófico ciliar (CNTF; ID SEC NO: 1) , la leptina (ID SEC NO: 1126) , la oncostatina M (ID SEC NO: 1181), la interleuquina-6 (IL-6; ID SEC NO: 1080) y la interleuquina-12 (IL-12; ID SEC NO: 860). Los polipéptidos resistentes a proteasas incluyen una o más modificaciones en dichos polipéptidos, en donde los uno o más reemplazos conducen a una mayor resistencia a proteasas. Tales modificaciones incluyen, pero no están limitadas a, las modificaciones mostradas en las Tablas 6-13, en donde los reemplazos se hacen en comparación con la secuencia de aminoácidos expuesta en los ID SEC NOS: 47, 1148, 1260, 1, 1126, 1181, 1080, o 860, respectivamente. En referencia a tales mutantes, el primer aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido reemplazado, el número corresponde a la posición en la secuencia del polipéptido de G-CSF, LIF, hGH, CNTF, leptina, oncostatina M, IL-6, o IL-12 en referencia a los ID SEC NOS: 47, 1148, 1260, 1, 1126, 1181, 1080, O 860, respectivamente, y el segundo aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido seleccionado que reemplaza al primer aminoácido en dicha posición. En las tablas, el identificador de secuencia (ID SEC NO.) para el Listado de Secuencias adjunto se encuentra entre paréntesis junto a cada sustitución. Tales polipéptidos ejemplares pueden ser utilizados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas.

TABLA 6 Modificaciones al G-CSF para Aumentar la Resistencia a la Proteólisis E38N (48) E38Q (49) E38H (50) E41 N (51 ) E41 Q (52) E41 H (53) E45N (54) E45Q (55) E45H (56) M46I (57) M46V (58) D48N (59) D48Q (60) L49I (61 ) L49V (62) E51 N (63) E51 Q (64) E51 H (65) E60N (66) E60Q (67) E60H (68) K63N (69) K63Q (70) P92A (71 ) P92S (72) E93N (73) E93Q (74) E93H (75) F119I (76) F1 19V (77) D120N (78) D120Q (79) E123N (80) E123Q (81 ) E123H (82) P124A (83) P124S (84) TABLA 7 Modificaciones al Factor Inhibidor de Leucocitos (LIF) para Aumentar la Resistencia a la Proteólisis P69A(1149) P69S (1150) F70I (1151) F70V(1152) R85H (1 53) R85Q (1154) R99H (1155) R99Q (1156) K102N (1157) K102Q (1158) L104I (1159) L104V(1160) P106A(1161) P106S(1162) L109I (1163) L109V(1164) Y137H (1165) Y137I (1166) D143N (1167) D143Q (1168) Y146H (1169) Y146I (1170) P148A(1171) P148S (1172) D149N (1173) D149Q (1174) K153N (1175) K153Q (1176) D154N (1177) D154Q (1178) F156I (1179) F156V(1180) TABLA 8 Modificaciones a la Hormona del Crecimiento (GH) para Aumentar la Resistencia a la Proteólisis R94H (1376) R94Q (1377) F97I (1378) F97V(1379) L101I (1380) L101V (1381) Y103H (1382) Y103I (1383) D107N (1384) D107Q(1385) Y111H (1386) Y111I (1387) D112N (1388) D112Q (1389) L113I (1390) L113V (1391) L114I (1392) L114V(1393) K115N (1394) K115Q (1395) D116N (1396) D116Q(1397) L117I (1398) L117V(1399) E118N (1400) E118Q (1401) E118H (1402) E119N (1403) E119Q (1404) E119H (1405) L124I (1406) L124V(1407) M125I (1408) M125V(1409) R127H (1410) R127Q (1411) L128I (1412) L128V(1413) E129N (1414) E129Q (1415) E129H (1416) D130N (1417) D130Q (1418) P133A(1419) P133S (1420) R134H (1421) R134Q (1422) F139I (1423) F139V(1424) K140N (1425) K140Q (1426) Y143H (1427) Y143I (1428) K145N (1429) K145Q (1430) F146I (1431) F146V(1432) D147N (1433) D147Q (1434) D153N (1435) D153Q (1436) D154N (1437) D154Q (1438) L156I (1439) L156V(1440) L157I (1441) L157V(1442) K158N (1443) K158Q (1444) Y160H (1445) Y160I (1446) L162I (1447) L162V(1448) L163I (1449) L163V(1450) Y164H (1451) Y164I (1452) F166I (1453) F166V(1454) R167H (1455) R167Q (1456) K168N (1457) K168Q (1458) D169N (1459) D169Q (1460) M170I (1461) M170V(1462) D171N (1463) D171Q (1464) K172N (1465) K172Q (1466) E174N (1467) E174Q (1468) E174H (1469) F176I (1470) F176V(1471) L177I (1472) L177V(1473) R178H (1474) R178Q(1475) R183H (1476) R183Q (1477) E186N (1478) E186Q(1479) E186H (1480) F191I (1481) F191V(1482) TABLA 9 Modificaciones al Factor Neurotrófico Ciliar (CNTF) para Aumentar la Resistencia a la Proteólisis D62N (2) D62Q (3) W64S (4) W64H (5) E66N (6) E66Q (7) E66H (8) L67I (9) L67V(10) L86I (11) L86V(12) R89H (13) R89Q (14) E92N (15) E92Q(16) E92H (17) P100A(18) P100S(19) E102N (20) E102Q (21) E102H (22) D104N (23) D104Q (24) E131N (25) E131Q (26) E131H (27) Y132H (28) Y132I (29) K133N (30) K133Q (31) P135A (32) P135S (33) R136H (34) R136Q (35) E138N (36) E138Q (37) E138H (38) D140N (39) D140Q (40) P143A (41) P143S (42) D148N (43) D148Q (44) L151I (45) L151V(46) TABLA 12 Modificaciones a la lnterleuquina-6 (IL-6) para Aumentar la Resistencia a la Proteólisis P64A(1081) P64S (1082) K65N (1083) K65Q(1084) M66I (1085) M66V(1086) E68N (1087) E68Q (1088) E68H (1089) K69N (1090) K69Q (1091) F73I (1092) F73V(1093) F77I (1094) F77V(1095) E92N (1096) E92Q (1097) E92H (1098) E98N (1099) E98Q (1100) E98H (1101) R103H (1102) R103Q(1103) E105N (1104) E105Q(1105) E105H (1106) E108N (1107) E108Q (1108) E108H (1109) D133N (1110) D133Q (1111) P138A (1112) P138S (1113) D139N (1114) D139Q(1115) P140A(1116) P140S (1117) K149N (1118) K149Q (1119) W156S (1120) W156H (1121) R178H (1122) R178Q (1123) R181H (1124) R181Q (1125) TABLA 13 Modificaciones a la lnterleuquina-12 (IL-12) para Aumentar la Resistencia a Da Proteólisis Familia de las Citoquinas de Cadena Corta Como se expuso más arriba, en este documento se proporciona formulaciones de dosificación oral que contienen citoquinas modificadas, las cuales contienen uno o más reemplazos de aminoácidos en una o más posiciones objetivo en polipéptidos de la familia de proteínas de las citoquinas de cadena corta, incluyendo, pero no limitándose a, eritropoyetina (EPO; ID SEC NO: 1886) , factor estimulador de colonias de granulocitos -macrófagos (GM-CSF; ID SEC NO: 85) , interleuquina-2 (IL-2; ID SEC NO: 946), interleuquina-3 (IL-3; ID SEC NO: 995), interleuquina-4 (IL-4; ID SEC NO: 1018), interleuquina-5 (IL-5; ID SEC NO: 1044), interleuquina-13 (IL-13; ID SEC NO: 917), ligando de Flt3 (ID SEC NO: 118) y factor de células troncales (SCF; ID SEC NO: 1215) . Los polipéptidos resistentes a proteasas incluyen una o más modificaciones en dichos polipéptidos, en donde los uno o más reemplazos conducen a una mayor resistencia a proteasas. Tales modificaciones incluyen, pero no están limitadas a, las modificaciones mostradas en las Tablas 14-22, en donde los reemplazos se hacen en comparación con la secuencia de aminoácidos expuesta en los ID SEC NOS: 1886, 85, 946, 995, 1018, 1044, 917, 118, o 1215, respectivamente. En referencia a tales imitantes, el primer aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido reemplazado, el número corresponde a la posición en la secuencia del polipéptido de EPO, GM-CSF, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, ligando de Flt3 , o SCF en referencia a los ID SEC NOS: 1886, 85, 946, 995, 1018, 1044, 917, 118, O 1215, respectivamente, y el segundo aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido seleccionado que reemplaza al primer aminoácido en dicha posición. En las tablas, el identificador de secuencia (ID SEC NO.) para el Listado de Secuencias adjunto se encuentra entre paréntesis junto a cada sustitución. Tales polipéptidos ejemplares pueden ser utilizados en formulaciones de dosificación oral proporcionadas.

TABLA 14 Modificaciones a la Eritropoyetina (EPO) para Aumentar la Resistencia a la Proteólisis P2S (1483) P2A(1484) P3S (1485) P3A(1486) R4H (1487) R4Q (1488) L5I (1489) L5V(1490) C7S(1491) C7V(1492) C7A(1493) C7I (1494) C7T(1495) D8Q (1496) D8H (1497) D8N (1498) R10H (1499) R10Q(1500) L12V(1501) L12I (1502) E13Q (1503) E13H (1504) E13N (1505) R14H (1506) R14Q (1507) Y15H (1508) Y15I (1509) Y15K(1510) Y15R (1511) L16I (1512) L16V(1513) L16E (1514) L16D (1515) L16K(1516) L16R (1517) L17I (1518) L17V(1519) L17E(1520) L17D(1521) L17K(1522) L17R (1523) E18Q (1524) E18H (1525) E18N (1526) E18K(1527) E18R (1528) 20Q (1529) K20T(1530) K20N (1531) E21Q (1532) E21H (1533) E21N (1534) E21K(1535) E21R (1536) E23Q (1537) E23H (1538) E23N (1539) E23K(1540) E23R (1541) I25K(1542) I25R (1543) T26E (1544) T26D(1545) T26K(1546) T26R (1547) T27E (1548) T27D (1549) T27K(1550) T27R (1551) G28E (1552) G28D (1553) G28K(1554) G28R (1555) C29S(1556) C29V(1557) C29A(1558) C29I (1559) C29T(1560) C29K(1561) C29R(1562) A30E (1563) A30D (1564) A30K(1565) A30R (1566) E31Q (1567) E31H (1568) E31N (1569) H32K(1570) H32R (1571) C33K(1572) C33R (1573) S34K(1574) S34R (1575) L35V(1576) L35K(1577) L35R (1578) L35I (1579) N36E (1580) N36D(1581) N36K(1582) N36R (1583) E37Q (1584) E37H (1585) E37N (1586) E37K(1587) E37R (1588) I39K (1589) I39R (1590) T40E (1591) T40D(1592) T40K(1593) T40R(1594) P42S (1595) P42A(1596) P42K(1597) P42R (1598) D43Q (1599) D43H (1600) D43N (1601) K45Q (1602) K45T(1603) K45N (1604) F48I (1605) F48V(1606) Y49H (1607) Y49I (1608) W51S (1609) W51H (1610) K52Q (1611) K52T(1612) K52N (1613) R53H (1614) R53Q(1615) M54V(1616) M54I (1617) E55Q (1618) E55H (1619) E55N (1620) V61K(1621) V61R (1622) E62Q(1623) E62H (1624) E62N (1625) E62K(1626) E62R (1627) W64S ( 628) W64H (1629) W64K(1630) W64R (1631) Q65K(1632) TABLA 14 Modificaciones a la Eritropoyetina (EPO) para Aumentar la Resistencia a la Proteólisis Q65R (1633) L67I (1634) L67V(1635) A68K(1636) A68R (1637) L69V(1638) L69I (1639) L69K(1640) L69R(1641) L70I (1642) L70V(1643) S71K(1644) S71R(1645) E72Q(1646) E72H (1647) E72N (1648) E72K(1649) E72R (1650) V74K(1651) V74R (1652) L75V(1653) L75I (1654) L75E (1655) L75D(1656) L75K (1657) L75R (1658) R76H (1659) R76Q (1660) Q78E(1661) Q78D(1662) Q78K(1663) Q78R (1664) A79K(1665) A79R (1666) L80V(1667) L80I (1668) L80K(1669) L80R (1670) L81I (1671) L81V(1672) V82E (1673) V82D (1674) V82K(1675) V82R (1676) S84E (1677) S84D (1678) S84K(1679) S84R (1680) S85D(1681) S85K(1682) S85R (1683) Q86E(1684) Q86D (1685) Q86K(1686) Q86R (1687) P87S (1688) P87A(1689) P87K(1690) P87R (1691) W88S (1692) W88H (1693) W88E(1694) W88D(1695) W88K(1696) W88R (1697) E89Q (1698) E89H (1699) E89N (1700) E89K(1701) E89R (1702) P90S (1703) P90A(1704) P90K(1705) P90R (1706) L91I (1707) L91V(1708) L91K(1709) L91R(1710) Q92E (1711) Q92D(1712) Q92K(1713) Q92R (1714) L93V(1715) L93I (1716) L93E (1717) L93D (1718) L93K(1719) L93R(1720) H94K(1721) H94R (1722) V95K(1723) V95R (1724) D96Q (1725) D96H (1726) D96N (1727) K97Q(1728) K97T(1729) K97N (1730) L102V(1731) L102I (1732) R103H (1733) R103Q (1734) L105I (1735) L105V(1736) L108I (1737) L108V(1738) L109I (1739) L109V(1740) R110H (1741) R110Q (1742) L112V(1743) L112I (1744) K116Q (1745) K116T(1746) K116N (1747) E117Q (1748) E117H (1749) E117N (1750) A118E (1751) A118D (1752) A118K(1753) A118R (1754) 1119E (1755) I119D (1756) I119K (1757) I119R (1758) S120E (1759) S120D (1760) S120K(1761) S120R (1762) P121S (1763) P121A(1764) P121E(1765) P121D (1766) P121K(1767) P121R (1768) P122S (1769) P122A(1770) P122E(1771) P122D (1772) P122K(1773) P122R (1774) D123Q (1775) D123H (1776) D123N (1777) D123E(1778) D123K(1779) D123R (1780) A124E(1781) A124D (1782) A124K(1783) A124R(1784) A125E(1785) A125D (1786) A125K(1787) A125R(1788) S126E (1789) S126D(1790) S126K(1791) S126R (1792) A127E (1793) A127D(1794) A127 (1795) A127R (1796) A128E(1797) A128D(1798) A128K(1799) A128R (1800) P129S(1801) P129A(1802) P129K(1803) P129R (1804) P129E (1805) P129D (1806) L130V(1807) L130I (1808) L130K(1809) L130R (1810) L130E (1811) L130D(1812) R131H (1813) R131Q (1814) T132K(1815) T132R (1816) I133K (1817) I133R (1818) I133E (1819) I133D (1820) T134K(1821) T134R (1822) T134E (1823) T134D (1824) D136Q (1825) D136H (1826) D136K(1827) D136R (1828) T137K(1829) T137R (1830) T137E (1831) T137D (1832) F138I (1833) F138V(1834) R139H (1835) R139Q (1836) K140N (1837) K140Q (1838) L141I (1839) L141V(1840) L141K(1841) L141R(1842) F142I (1843) F142V(1844) F142K(1845) F142R (1846) R143H (1847) D136N (1848) R143Q (1849) V144K(1850) V144R (1851) Y145H (1852) Y145I (1853) Y145K(1854) Y145R(1855) S146K(1856) S146R(1857) F148I (1858) F148V(1859) L149I (1860) L149V(1861) R150H (1862) R150Q(1863) K152Q(1864) K152T(1865) K152N (1866) L153I (1867) L153V(1868) K154Q (1869) K154T(1870) K154N (1871) L155V(1872) TABLA 16 Modificaciones a la lnterleuquina-2 (IL-2) para Aumentar la Resistencia a la Proteólisis K43N (947) K43Q (948) Y45H (949) Y45I (950) K48N (951 ) K48Q (952) K49N (953) K49Q (954) E52N (955) E52Q (956) E52H (957) L53I (958) L53V (959) E60N (960) E60Q (961 ) E60H (962) E61 N (963) E61 Q (964) E61 H (965) P65A (966) P65S (967) E67N (968) E67Q (969) E67H (970) E68N (971 ) E68Q (972) E68H (973) L72I (974) L72V (975) E100N (976) E100Q (977) E100H (978) F103I (979) F103V (980) M104I (981 ) M104V (982) E106N (983) E106Q (984) E106H (985) Y107H (986) Y107I (987) D109N (988) D109Q (989) E110N (990) E110Q (991 ) E1 10H (992) L132I (993) L132V (994) TABLA 17 Modificaciones a la lnterleuquina-3 (IL-3) para Aumentar la Resistencia a la Proteólisis F37I (996) F37V (997) E43N (998) E43Q (999) E43H (1000) D46N (1001 ) D46Q (1002) E59N (1003) E59Q (1004) E59H (1005) R63H (1006) R63Q (1007) K66N (1008) K66Q (1009) P96A (1010) P96S (101 1 ) K100N (1012) K100Q (1013) D101 N (1014) D101 Q (1015) D103N (1016) D103Q (1017) TABLA 20 Modificaciones a la lnterleuquina-13 (IL-13) para Aumentar la Resistencia a la Proteólisis M32I (918) M32V (919) W34S (920) W34H (921 ) L38I (922) L38V (923) E48N (924) E48Q (925) E48H (926) F79I (927) F79V (928) L82I (929) L82V (930) R85H (931 ) R85Q (932) D86N (933) D86Q (934) K88N (935) K88Q (936) R107H (937) R107Q (938) E108N (939) E108Q (940) E108H (941 ) R110H (942) R1 10Q (943) F11 1 I (944) F111V (945) TABLA 21 Modificaciones al Ligando de Flt3 para Aumentar la Resistencia a la Proteólisis D3N (119) D3Q (120) D40N (121 ) D40Q (122) E42N (123) E42Q (124) E42H (125) L43I (126) L43V (127) R55H (128) R55Q (129) E58N (130) E58Q (131 ) E58H (132) R59H (133) R59Q (134) K61 N (135) K61 Q (136) P89A (137) P89S (138) P90A (139) P90S (140) P91A (141 ) P91 S (142) R95H (143) R95Q (144) F96I (145) F96V (146) TABLA 22 Modificaciones al Factor de Células Troncales (SCF) para Aumentar la Resistencia a la Proteólisis M27I (1216) M27V (1217) K31 N (1218) K31 Q (1219) P34A (1220) P34S (1221 ) D37N (1222) D37Q (1223) D54N (1224) D54Q (1225) D58N (1226) D58Q (1227) D61 N (1228) D61 Q (1229) K62N (1230) K62Q (1231 ) F63I (1232) F63V (1233) K96N (1234) K96Q (1235) L98I (1236) L98V (1237) K99N (1238) K99Q (1239) K100N (1240) K100Q (1241 ) F102I (1242) F102V (1243) K103N (1244) K103Q (1245) E106N (1246) E106Q (1247) E106H (1248) P107A (1249) P107S (1250) R108H (1251 ) R108Q (1252) L109I (1253) L109V (1254) E134N (1255) E134Q (1256) E134H (1257) D137N (1258) D137Q (1259) 3 . Otros Pol ipéptidos Ej emplares Otros polipéptidos resistentes a proteasas adicionales de las proteínas ejemplificadas más adelante pueden ser utilizados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas. Los polipéptidos resistentes a proteasas pueden ser producidos modificando proteínas terapéuticas usando cualquier método conocido en el arte para generarlos, incluyendo, pero no limitándose a, los métodos descritos en las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos Nos. US 2004/0132977 y US 2005/0202438. Los ejemplos de estos polipéptidos que pueden ser modificados para hacerlos resistentes a proteasas para ser utilizados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas, son proteínas de interés farmacológico y/o terapéutico, tales como las descritas más arriba. Las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos resistentes a proteasas proporcionadas en este documento pueden incluir polipéptidos resistentes a proteasas que pertenecen a familias de polipéptidos terapéuticos, incluyendo, pero no limitándose a, factores sanguíneos, insulina, relaxina, anticuerpos, factores de crecimiento, receptores solubles, quimioquinas , agentes angiogénicos y péptidos neuroactivos , algunos de los cuales también incluyen polipéptidos ya mencionados más arriba. Las citoquinas modificadas para ser utilizadas en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas incluyen variantes alélicas y de especies de tales polipéptidos que contienen modificaciones correspondientes para resistencia a proteasas . a. Factores Sanguíneos Las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos resistentes a proteasas proporcionadas en este documento, pueden incluir un polipéptido resistente a proteasas que es un factor sanguíneo. Los ejemplos de factores sanguíneos incluyen, pero no están limitados a, activador de plasminógeno tisular (tissue plasminogen activator, tPA) (No. de Acceso de GenBank P00750; ID SEC NO: 2122), Factor VII (No. de Acceso de GenBank P08709; ID SEC NO: 2123), Factor VIII (No. de Acceso de GenBank P00451; ID SEC NO: 2124), Factor IX (No. de Acceso de GenBank P00740; ID SEC NO: 2125), ß-globina (No. de Acceso de GenBank P68871; ID SEC NO: 2126) , y hemoglobina. Los polipéptidos de factores sanguíneos pueden ser modificados usando cualquier método conocido en el arte para generar un polipéptido resistente a proteasas, incluyendo, pero no limitándose a, los métodos descritos en las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos Nos. US 2004/0132977 y US 2005/0202438. Tales polipéptidos de factores sanguíneos resistentes a proteasas pueden ser preparados como una formulación de dosificación oral usando los métodos proporcionados en este documento. b. Insulina Las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos resistentes a proteasas, pueden incluir un polipéptido resistente a proteasas que es una insulina. Los ejemplos de insulinas incluyen, pero no están limitados a, insulina humana (No. de Acceso de GenBank P01308; ID SEC NO: 2127) y las formas de preproinsulina, proinsulina e insulina divulgadas en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4.992. 417; 4.992. 418; 5.474.978; 5.514.646; 5.504.188; 5.547.929; 5.650.486; 5.693.609; 5.700.662; 5.747.642; 5.922.675; 5.952.297; 6.034.054 y 6.211.144, y en las Solicitudes PCT publicadas WO 00/121197; WO 09/010645 y O 90/12814. Los polipéptidos de insulina también incluyen derivados y análogos de insulina, incluyendo, pero no limitándose a, análogos de insulina superactivos , insulinas monoméricas, y análogos de insulina hepatoespecífieos . Las variadas formas de análogos de insulina incluyen, pero no están limitadas a, insulina lispro (Humalog®) , insulina lispro mezclada con insulina lispro protamina (comercializada como Humalog® 50/50™, Humalog®75/25™) , insulina isofano (comercializada como Humulin®, Humulin® N, Humulin®N Pen, NPH Iletin® II Cerdo, Insulina Purificada NPH Cerdo, Novolin® N, Novolin® N Innolet, Novolin® N PenFill) , insulina regular (comercializada como Humulin® R, Iletin® II Regular Cerdo, Insulina Purificada Regular Cerdo, Novolin® R, Velosulin® BR) , insulina isofano mezclada con insulina regular (comercializada como Humulin®50/50™, Humulin®70/30™, Humulin® 70/30Pen™, Novolin® 70/30, Novolin® 70/30 Innolet) , insulina zinc (comercializada como Lente®, Humulin® L, Iletin® Lente, Insulin Lente Cerdo, Novolin® L) e insulina glargina (Lantus®) . Los polipéptidos de insulina usados para generar polipéptidos resistentes a proteasas para ser utilizados en los métodos de este documento, pueden incluir sustituciones de aminoácidos en una o más posiciones aminoacídicas en la cadena B de la insulina (expuesta en el ID SEC NO: 2128, que corresponde a las posiciones de aminoácidos 25-54 en el ID SEC NO: 2127) , o pueden ser glicosilados o acilados. Por ejemplo, un polipéptido de insulina puede ser derivatizado con un ácido graso C6-C2 (por ejemplo, ácidos mirístico, pentadecílico, palmitico, heptadecílico o esteárico) en un grupo amino a o e de un residuo de glicina, fenilalanina o lisina (Patente de los Estados Unidos No. 5.922.675) . Los ejemplos de análogos y derivados de insulina humana incluyen, pero no están limitados a, polipéptidos de insulina en donde el aminoácido en la posición 28 de la cadena B (es decir, B28, correspondiente a la posición aminoacídica 28 de la secuencia expuesta en el ID SEC NO: 2128) es Asp, Lys, Leu, Val o Ala y el residuo de aminoácido en la posición 29 de la cadena B (es decir, B29) es Lys o Pro; polipéptidos de insulina en los que la posición aminoacídica B28 es Asp y la posición B29 es Lys o Pro; polipéptidos de insulina en los que la posición aminoacídica B28 es Lys y la posición B29 es Lys o Pro; polipéptidos de insulina en los que la posición B28 es Asp (es decir, AspB28) ; insulina humana des (B26-B30) ; insulina humana des (B28-B30) ; insulina humana des(B27); insulina humana des(B30); polipéptidos de insulina que contienen LysB28 y ProB29; B29-Ne-miristoil-insulina humana des(B30); B29-NE-palmitoil-insulina humana des(B30); B29-NE-miristoil-insulina humana; ?29-?e-palmitoil- insulina humana; B28-N -miristoil Lys Pro insulina humana; B28-N NE-palmitoil LysB28 ProB29 insulina humana,- B30-Ní:-miristoil ThrB29 LysB30 insulina humana; B30 -?e-palmitoil ThrB29 LysB30 insulina humana; B29- ?e - (N-palmitoil-glutamil) -insulina humana des(B30); B29- ?e - (N-litocolil-glutamil) -insulina humana des(B30); B29- ?e - ( -carboxiheptadecanoil ) -insulina humana des(B30); y B29- ?e - (G-carboxiheptadecanoil ) -insulina humana. Los polipéptidos de insulina, incluyendo variantes, análogos y derivados de insulina, pueden ser modificados usando cualquier método conocido en el arte para generar un polipéptido resistente a proteasas , incluyendo, pero no limitándose a, los métodos descritos en las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos Nos. US 2004/0132977 y US 2005/0202438. Tales polipéptidos de insulina resistentes a proteasas pueden ser preparados como una formulación de dosificación oral usando los métodos proporcionados en este documento. c. Relaxina Las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos resistentes a proteasas proporcionadas en este documento, pueden incluir un polipéptido resistente a proteasas que es una relaxina. El polipéptido de relaxina puede ser una relaxina natural o sintética. La relaxina natural puede ser de origen humano, murino (es decir, rata o ratón) , porcino o de otra especie de mamífero. Los polipéptidos de relaxina humana incluyen, pero no están limitados a, relaxina Hl (No. de Acceso de GenBank No. P01137; ID SEC NO: 2155), relaxina H2 (No. de Acceso de GenBank P01137; ID SEC NO: 2156), relaxina H3 (No. de Acceso de GenBank P01137; ID SEC NO: 2157), y relaxina humana recombinante (rhRLX) . Los polipéptidos de relaxina incluyen, pero no están limitados a, polipéptidos de preprorrelaxina, los cuales son polipéptidos precursores y contienen una secuencia señal; polipéptidos de prorrelaxina, en los que la secuencia señal ha sido removida y las cadenas B y A están unidas por la cadena conectora (C) ; y el polipéptido de relaxina maduro, en el que la cadena C ha sido separada y las cadenas A y B están conectadas por enlaces disulfuro. Los polipéptidos de relaxina también pueden contener cadenas A y B que poseen truncamientos N- y/o C-terminales . Por ejemplo, en la relaxina H2, la cadena A puede ser variada desde una cadena que contiene los aminoácidos A1-A24 hasta una cadena que contiene A10-A24 (correspondientes a las posiciones aminoacídicas 162-185 y 171-185, respectivamente, de la secuencia expuesta en el ID SEC NO: 2156) , y la cadena B puede ser variada desde una cadena que contiene los aminoácidos B1-B33 hasta una cadena que contiene B10-B22 (correspondientes a las posiciones aminoacídicas 25-58 y 35-47, respectivamente, de la secuencia expuesta en el ID SEC NO: 2156); y en la relaxina Hl , la cadena A puede ser variada desde una cadena que contiene los aminoácidos A1-A24 hasta una cadena que contiene A10-A24 (correspondientes a las posiciones aminoacídicas 162-185 y 171-185, respectivamente, de la secuencia expuesta en el ID SEC NO: 2155) , y la cadena B puede ser variada desde una cadena que contiene los aminoácidos B1-B32 hasta una cadena que contiene B10-B22 (correspondientes a las posiciones aminoacídicas 26-57 y 35-47, respectivamente, de la secuencia expuesta en el ID SEC NO: 2155) (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5179195) . Los polipéptidos de relaxina que pueden ser modificados para ser resistentes a proteasas para ser utilizados en los métodos proporcionados en este documento, incluyen análogos y variantes de relaxina, incluyendo, pero no limitándose a, los polipéptidos de relaxina divulgados en la Patente de los Estados Unidos No. 5.811.395 y en la Patente de los Estados Unidos No. 6.200.953. Otras relaxinas incluyen aquéllas formuladas como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5.945.402. Los análogos y variantes de la relaxina pueden incluir polipéptidos que poseen una reemplazo de uno o más aminoácidos en las cadenas B y/o A con un aminoácido diferente, incluyendo una forma D de un aminoácido natural. Por ejemplo, el polipéptido de relaxina puede contener una sustitución de la metionina en B24 (correspondiente a la posición aminoacidica 49 de las secuencias expuestas en los ID SEC NOS: 2155-2157) con norleucina (Nle) , valina (Val) , alanina (Ala) , glicina (Gly) , serina (Ser) u homoserina (Homo Ser) . Otros polipéptidos de relaxina pueden incluir sustituciones de aminoácidos en las uniones B/C y C/A de la prorrelaxina, o pueden contener un péptido C no natural, tal como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5.759.807. Los polipéptidos de relaxina pueden ser modificados usando cualquier método conocido en el arte para generar un polipéptido resistente a proteasas, incluyendo, pero no limitándose a, los métodos descritos en las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos Nos. US 2004/0132977 y US 2005/0202438. Tales polipéptidos de relaxina resistentes a proteasas pueden ser preparados como una formulación de dosificación oral usando los métodos proporcionados en este documento. d. Anticuerpos Las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos resistentes a proteasas, pueden incluir un polipéptido resistente a proteasas que es un anticuerpo. Los ejemplos de anticuerpos incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos de varios isotipos (por ejemplo, IgGl, IgG3 e IgG4), anticuerpos monoclonales producidos mediante cualquier método conocido en el arte, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos de cadena única, fragmentos de anticuerpos, tales como Fv, F(ab') 2, Fab', Fab y Facb, y cualquier anticuerpo o fragmento del mismo que sea capaz de unirse a un antígeno. Los ejemplos de anticuerpos incluyen anticuerpos que son específicos para un receptor de superficie celular y que funcionan como antagonistas del receptor, incluyendo, pero no limitándose a, anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento transformante ß (TGF-ß), anticuerpos contra el receptor del factor de necrosis tumoral a (TNF-a) , anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6.617.160, 6.448.077, y 6.365.157) y anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico; anticuerpos específicos para ligandos de receptores, incluyendo, pero no limitándose a, anticuerpos contra TGF-ß, anticuerpos contra TNF- , y anticuerpos contra VEGF; anticuerpos específicos contra un antígeno asociado a tumores; anticuerpos específicos contra CD20; anticuerpos específicos contra el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico; anticuerpos específicos contra el dominio de unión de receptores de la IgE; anticuerpos específicos contra moléculas de adhesión, tal como la subunidad OÍ (CDlla) de LFA-1 y anticuerpos específicos contra a4ß7. Los polipéptidos de anticuerpos pueden ser modificados usando cualquier método conocido en el arte para generar un polipéptido resistente a proteasas, incluyendo, pero no limitándose a, los métodos descritos en las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos Nos. US 2004/0132977 y US 2005/0202438. Tales polipéptidos de anticuerpos resistentes a proteasas pueden ser preparados como una formulación de dosificación oral usando los métodos proporcionados en este documento. e. Factores de Crecimiento Las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos resistentes a proteasas proporcionadas en este documento, pueden incluir un polipéptido resistente a proteasas que es un factor de crecimiento. Los ejemplos de factores de crecimiento incluyen, pero no están limitados a, factor de crecimiento de queratinocitos (No. de Acceso de GenBank P21781; ID SEC NO: 2129) , factor ácido de crecimiento de fibroblastos (No. de Acceso de GenBank P05230; ID SEC NO: 2130), f ctor de células troncales (No. de Acceso de GenBank P21583; ID SEC NO: 2131), factor básico de crecimiento de fibroblastos (No. de Acceso de GenBank P09038; ID SEC NO: 2132) , factor de crecimiento de hepatocitos (No. de Acceso de GenBank P14210; ID SEC NO: 2133), factor de crecimiento tipo insulina 1A (No. de Acceso de GenBank P01343; ID SEC NO: 2134), factor de crecimiento tipo insulina IB (No. de Acceso de GenBank P05019; ID SEC NO: 2135) y cualquier fragmento de los mismos. También están contempladas proteínas que contienen un factor de crecimiento o un fragmento del mismo. Los polipéptidos de factores de crecimiento pueden ser modificados usando cualquier método conocido en el arte para generar un polipéptido resistente a proteasas, incluyendo, pero no limitándose a, los métodos descritos en las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos Nos. US 2004/0132977 y US 2005/0202438. Tales polipéptidos de factores de crecimiento resistentes a proteasas pueden ser preparados como una formulación de dosificación oral usando los métodos proporcionados en este documento. f. Receptores Solubles Las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos resistentes a proteasas proporcionadas en este documento, pueden incluir un polipéptido resistente a proteasas que es un receptor soluble. Los ejemplos de receptores solubles incluyen, pero no están limitados a, un receptor soluble de unión de TNF-a, un receptor soluble de VEGF, un receptor soluble de interleuquina, un receptor soluble de IL-1, un receptor soluble de IL-1 de tipo II, un receptor soluble celular de ?d?, un receptor soluble de EGFR o cualquier otro receptor soluble de ErbB y cualquier porción activa, tal como un fragmento de unión de ligando, de un receptor soluble . Los receptores solubles se unen a un ligando que, en condiciones fisiológicas normales, se une a un receptor asociado a membrana o receptor de superficie celular, lo cual puede conducir a varios eventos de activación y/o señalización. De esta forma, un receptor soluble es uno que puede funcionar como antagonista de un receptor, al unir el ligando y evitar la activación y/o señalización a través del receptor asociado a membrana o receptor de superficie celular. Las secuencias aminoacídicas de varios receptores solubles son conocidas en el arte y pueden ser utilizadas para generar polipéptidos resistentes a proteasas para ser utilizados en los métodos proporcionados en este documento. Por ejemplo, se conoce en las bases de datos secuencias de receptores solubles de VEGF (No. de Acceso de GenBank AAC50060; ID SEC NO: 2136, y No . de Acceso de GenBank NP_002010; ID SEC NO: 2137) y se los describe en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6.383.486, 6.375.929 y 6.100.071; se describe receptores solubles de IL-4 en la Patente de los Estados Unidos No. 5.599.905; y se describe receptores solubles de IL-1 en la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 20040023869. Los polipéptidos de receptores solubles pueden ser modificados usando cualquier método conocido en el arte para generar un polipéptido resistente a proteasas, incluyendo, pero no limitándose a, los métodos descritos en las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos Nos. US 2004/0132977 y US 2005/0202438. Tales polipéptidos de receptores solubles resistentes a proteasas pueden ser preparados como una formulación de dosificación oral usando los métodos proporcionados en este documento. g. Quimioguinas Las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos resistentes a proteasas proporcionadas en este documento, pueden incluir un polipéptido resistente a proteasas que es una quimioquina. Los ejemplos de quimioquinas incluyen, pero no están limitados a, IP-10 (No. de Acceso de GenBank P02778; ID SEC NO: 2138), MIG (No. de Acceso de GenBank Q07325; ID SEC NO: 2139 ) , Groa (No. de Acceso de GenBank P0934 1 ; ID SEC NO: 2140), RANTES (No. de Acceso de GenBank P13501; ID SEC NO: 2124), ???-?a (No. de Acceso de GenBank P10147; ID SEC NO: 2142), MIP-?ß (No. de Acceso de GenBank P13236; ID SEC NO: 2143), MCP-1 (No. de Acceso de GenBank P13500; ID SEC NO: 2144), PF-4 (No. de Acceso de GenBank P02776; ID SEC NO: 2145) y cualquier otra quimioquina, fragmento de la misma y proteína de fusión que contenga los mismos. Las secuencias aminoacídicas de quimioquinas y variantes de las mismas son conocidas en el arte y pueden ser utilizadas para generar polipéptidos resistentes a proteasas para ser utilizados en los métodos proporcionados en este documento. Por ejemplo, se divulga secuencias de aminoácidos de IP-10 en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6.491.906, 5.935.567, 6.153.600, 5.728. 377 y 5.994.292; se divulga secuencias de aminoácidos de MIG en la Patente de los Estados Unidos No. 6.491.906 y en Farber y cois. (1993) Biochem. Biophys . Res. Comm. 192 ( 1 ) : 223 -230 ; y se divulga secuencias de aminoácidos de RANTES en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6.709.649, 6.168.784 y 5.965.697. Los polipéptidos de quimioquinas pueden ser modificados usando cualquier método conocido en el arte para generar un polipéptido resistente a proteasas, incluyendo, pero no limitándose a, los métodos descritos en las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos Nos. US 2004/0132977 y US 2005/0202438. Tales polipéptidos de quimioquinas resistentes a proteasas pueden ser preparados como una formulación de dosificación oral usando los métodos proporcionados en este documento. h. Agentes Angiogénicos Las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos resistentes a proteasas, pueden incluir un polipéptido resistente a proteasas que es un agente angiogénico. Los ejemplos de agentes angiogénicos incluyen, pero no están limitados a, polipéptidos tipo VEGF, incluyendo VEGF121 (No. de Acceso de GenBank AAF19659; ID SEC NO: 2152 y No. de Acceso de GenBank AB026344; ID SEC NO: 2153), VEGF165 (No. de Acceso de GenBank P15692-4; ID SEC NO: 2154), VEGF-A (No. de Acceso de GenBank P15692; ID SEC NO: 2146), VEGF-B (No. de Acceso de GenBank P49765; ID SEC NO: 2147), VEGF-C (No. de Acceso de GenBank P49767; ID SEC NO: 2148) y VEGF-D (No. de Acceso de GenBank 043915; ID SEC NO: 2149), factor de crecimiento transformante beta (No. de Acceso de GenBank P01137; ID SEC NO: 2150), factor básico de crecimiento de fibroblastos (No. de Acceso de GenBank P09038; ID SEC NO: 2132), angiogenina (No. de Acceso de GenBank P03950; ID SEC NO: 2151) y factor de crecimiento derivado de gliomas. Las secuencias aminoacídicas de agentes angiogénicos y variantes de las mismas son conocidas en el arte y pueden ser utilizadas para generar polipéptidos resistentes a proteasas para ser utilizados en los métodos proporcionados en este documento. Por ejemplo, se divulga secuencias de aminoácidos de polipéptidos de VEGF en las Patentes de los Estados Unidos Nos . 5.194.596, 5.332.671, 5.240.848, 6.475.796, 6.485.942 y 6.057.428; se divulga secuencias de aminoácidos de polipéptidos de VEGF-C (también conocido como VEGF- 2) en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.726.152 y 6.608.182; y se divulga secuencias de aminoácidos de factores de crecimiento derivados de gliomas con actividad angiogénica en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.338.840 y 5.532.343. Los polipéptidos de agentes angiogénicos pueden ser modificados usando cualquier método conocido en el arte para generar un polipéptido resistente a proteasas, incluyendo, pero no limitándose a, los métodos descritos en las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos Nos. US 2004/0132977 y US 2005/0202438. Tales polipéptidos de agentes angiogénicos resistentes a proteasas pueden ser preparados como una formulación de dosificación oral usando los métodos proporcionados en este documento. i . Péptidos Neuroactivos Las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos resistentes a proteasas proporcionadas en este documento, pueden incluir un polipéptido resistente a proteasas que es un péptido neuroactivo. Los ejemplos de péptidos neuroactivos incluyen, pero no están limitados a, factor de crecimiento de nervios, bradiquinina, colecistoquinina, gastina, secretina, oxitocina, hormona liberadora de gonadotropinas , beta-endorfina, encefalina, sustancia P, somatostatina, prolactina, galanina, hormona liberadora de hormona del crecimiento, bombesina, dinorfina, neurotensina, motilina, tirotropina, neuropéptido Y, hormona luteinizante , calcitonina, insulina, glucagones, vasopresina, angiotensina II, hormona liberadora de tirotropina, péptido intestinal vasoactivo y péptido del sueño. Los polipéptidos de péptidos neuroactivos pueden ser modificados usando cualquier método conocido en el arte para generar un polipéptido resistente a proteasas, incluyendo, pero no limitándose a, los métodos descritos en las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos Nos. US 2004/0132977 y US 2005/0202438. Tales polipéptidos de péptidos neuroactivos resistentes a proteasas pueden ser preparados como una formulación de dosificación oral usando los métodos proporcionados en este documento. j . Proteínas Adicionales Los ejemplos de polipéptidos adicionales para ser utilizados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas en los métodos de este documento, incluyen otras proteínas de interés farmacológico incluyendo, pero no limitándose a, agentes trombolíticos , péptidos natriuréticos atriales, proteína morfogénica de hueso, trombopoyetina, proteína ácida fibrilar glial, hormona estimulante del folículo, alfa-1 antitripsina, factor inhibidor de leucemia, factor de crecimiento transformante, factor de crecimiento tipo insulina, hormona luteinizante , factor activador de macrófagos, factor de necrosis tumoral, factor de quimiotaxis de neutrófilos, factor de crecimiento de nervios, inhibidor tisular de metaloproteinasas , péptido intestinal vasoactivo, angiotropina, fibrina, hirudina y factor inhibidor de leucemia .

E. FORMULACIONES DE DOSIFICACIÓN ORAL DE POLIPÉPTIDOS DE IFN-a RESISTENTES A PROTEASAS Se proporciona formulaciones para administración oral de cantidades de polipéptidos resistentes a proteasas capaces de obtener cantidades terapéuticamente efectivas en el torrente sanguíneo. Un ejemplo de tales polipéptidos es el interferón-a (IFN-a) . Tales polipéptidos resistentes a proteasas pueden ser utilizados en el tratamiento de cualquier enfermedad o condición para la que se administra una forma nativa, o de tipo salvaje, u otra forma mutante del polipéptido, tal como IFN-OÍ. Las formas nativas o de tipo salvaje u otras formas del IFN-a son administradas para el tratamiento de una variedad de enfermedades o condiciones, algunas de las cuales se describen más adelante, incluyendo infecciones virales crónicas por hepatitis C, infección viral crónica por hepatitis B, condiloma acuminado, y cánceres tales como leucemia de tricoleucocitos , linfoma maligno, linfoma folicular, y sarcoma de Kaposi asociado a SIDA. Sin embargo, el tratamiento de estas enfermedades o condiciones con otras formas de IFN-a se realiza mediante rutas subcutáneas e intravenosas; los polipéptidos no resistentes no alcanzan niveles terapéuticos en el torrente sanguíneo cuando se administran por vía oral. Como se muestra en los Ejemplos proporcionados más abajo, muy poco o nada del IFN-OÍ (es decir, IFN-a que no ha sido modificado para ser resistente a proteasas) se absorbe hacia el torrente sanguíneo después de su administración oral, incluso si se entrega la formulación de polipéptido de IFN-OÍ en el tracto del intestino delgado usando un recubrimiento entérico (véase, por ejemplo, los Ejemplos 9 y 11 para los estudios hechos tanto en ratas como en primates). Contrariamente, las formulaciones de dosificación oral proporcionadas en este documento contienen polipéptidos de IFN-a resistentes a proteasas que pueden ser absorbidos hacia el torrente sanguíneo cuando se administran por vía oral.

Como se muestra en los Ejemplos, la administración oral de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas, IFN-OÍ (E41Q) , a través de varias formas de administración oral, incluyendo tabletas y cápsulas con recubrimiento entérico, entrega intraduodenal y alimentación líquida por sonda nasogástrica, da como resultado altos niveles de absorción de polipéptido de IFN-OÍ hacia el torrente sanguíneo. Adicionalmente , la administración de formulaciones de dosificación oral de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas puede lograr niveles de IFN-a en la sangre comparable con los niveles observados para administración subcutánea (véase, por ejemplo, la Tabla 69) . Por ende, las formulaciones orales de polipéptidos de IFN-a resistentes a proteasas proporcionadas en este documento proveen de una manera de lograr cantidades terapéuticamente efectivas de IFN-a mediante administración oral. 1. Polipéptidos de IFN-a Resistentes a Proteasas Los polipéptidos de IFN-a resistentes a proteasas incluyen una o más modificaciones de aminoácidos en la secuencia primaria de aminoácidos de un polipéptido de IFN-a, tal como un polipéptido de IFN-a2b (ID SEC NO: 2067) , en donde los uno o más reemplazos de aminoácidos conducen a una mayor resistencia a proteasas, incluyendo, pero no limitándose a, proteasas del tracto gastrointestinal. Tales modificaciones incluyen, pero no están limitadas a, las modificaciones mostradas en la Tabla 2 , en donde los reemplazos se hacen en comparación con la secuencia de aminoácidos expuesta en el ID SEC NO: 2067. Tales modificaciones pueden realizarse en un polipéptido de IFN-a2b (ID SEC NO: 2067) o en cualquier variante de especie o alélica del mismo . Las formulaciones de dosificación oral proporcionadas para polipéptidos de IFN-a resistentes a proteasas también pueden contener variantes alélicas y homólogos estructurales de IFN-a2b que están modificados por uno o más reemplazos de aminoácidos en la secuencia primaria de aminoácidos del polipéptido que conducen a una mayor resistencia a proteasas, incluyendo, pero no limitándose a, proteasas del tracto gastrointestinal. Tales variantes alélicas y homólogos estructurales del IFN- 2b incluyen, pero no están limitados a, IFNa-2a (ID SEC NO: 2162), IFNa-c (ID SEC NO: 2163), IFNa-2c (ID SEC NO: 2164), IFNa-d (ID SEC NO: 2165), IFNa-5 (ID SEC NO: 2166), IFNa-6 (ID SEC NO: 2167), IFNa-4 (ID SEC NO: 2168), IFNa-4b (ID SEC NO: 2169), IFNa-I (ID SEC NO: 2170), IFNa-J (ID SEC NO: 2171), IFN -H (ID SEC NO: 2172), IFN -F (ID SEC NO: 2173), IFNa-8 (ID SEC NO: 2174) e IFNa-citoquina consenso (ID SEC NO: 2175) , y otras citoquinas consenso divulgadas, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4.695.623 y 4.897.471 (por ejemplo, IFN-conl es el agente de interferón consenso en el producto InfergenB alfacon-1 (interferón alfacon-1, InterMune, Inc., Brisbane, California)) . De acuerdo a lo anterior, las citoquinas de IFN-a para ser utilizadas en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas son aquéllas con uno o más reemplazos de aminoácidos en una o más posiciones aminoacídicas en IFNa-2a, IFNa-c, IFNa-2c, IFNa-d, IFNa-5, IFNa-6, IFNa-4, IFNa-4b, IFNa-I, IFNa-J, IFNa-H, IFNa-F, IFNa-8, o IFNa-citoquina consenso, correspondientes a una posición de aminoácido modificado estructuralmente relacionada dentro de la estructura tridimensional de las proteínas de IFN-a2b modificadas para una mayor resistencia a proteasas , tales como, por ejemplo, las modificaciones presentadas en la Tabla 2. En un ejemplo particular de un IFN-a resistente a proteasas que puede ser utilizado en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas, la modificación de un polipéptido de IFN-a es el reemplazo de un residuo de ácido glutámico (E) por un residuo de glutamina (Q) . Un ejemplo de tales reemplazos es el reemplazo de un residuo de ácido glutámico (E) con un residuo de glutamina (Q) en la posición 41 en un IFN- maduro (por ejemplo, se expone un IFN- maduro en el ID SEC NO: 2067) o en cualquier variante de especie o alélica del mismo. Adicionalmente , un ejemplo de polipéptido resistente a proteasas es un polipéptido de IFN-a2b maduro, en donde el residuo de ácido glutámico (E) en la posición 41 se reemplaza con un residuo de glutamina (Q) (llamado en este documento IFN- 2b (E 1Q) ; ID SEC NO: 1995) . Un ejemplo de un polipéptido de IFN-a2b humano maduro que puede ser utilizado en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas en este documento, posee la siguiente secuencia de aminoácidos : CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQQEFGNQFQKAETIPV LHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPL MKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEWRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE (ID SEC NO: 1995) . a. Modificaciones Adicionales de Polipéptidos de IFN-oc Resistentes a Proteasas Los polipéptidos de IFN-a resistentes a proteasas para ser usados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas también incluyen polipéptidos de IFN-a resistentes a proteasas que han sido modificados adicionalmente mediante glicosilación, carboxilación, hidroxilación, hasilación, carbamilación, sulfatación, fosforilación y/o pegilación. Los polipéptidos de IFN-a resistentes a proteasas para ser usados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas también incluyen polipéptidos de IFN-a resistentes a proteasas que han sido modificados adicionalmente mediante uno o más modificaciones de aminoácidos que contribuyen a, por ejemplo, obtener una actividad aumentada (por ejemplo, actividad antiviral aumentada) , inmunogenicidad alterada, estabilidad, tolerancia térmica, resistencia a proteasas, glicosilación, carboxilación, hidroxilación, hasilación, carbamilación, sulfatación, fosforilación y/o pegilación. Tales modificaciones de aminoácidos pueden ser aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales y una combinación de aminoácidos naturales o no naturales. Los polipéptidos de IFN-a resistentes a proteasas para ser utilizados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas también pueden ser conjugados o expresados como proteínas de fusión con una o más proteínas o péptidos, tales como albúmina. Además, las modificaciones proteicas también pueden incluir modificaciones para facilitar la detección, purificación y desarrollo de ensayos para un polipéptido de IFN-a, tal como, por ejemplo, la modificación de un polipéptido con Sulfo-NHS-LC-biotina para que pueda unirse covalentemente con una amina primaria en una proteína, u otra modificación similar para mareaje fluorescente, no- isotópico o radioactivo. Generalmente, la modificación da como resultado una estabilidad aumentada sin pérdida de al menos una actividad, tal como actividad antiviral (es decir, retiene al menos una actividad como se define en este documento) , de un polipéptido de IFN-a no modificado. Las modificaciones para disminuir la inmunogenicidad del polipéptido de IFN-a típicamente involucran el reemplazo de al menos un residuo de aminoácido, lo que resulta en una reducción sustancial o una eliminación de la actividad de uno o más epítopos de células T de la proteína, es decir, una desinmunización del polipéptido. Una o más modificaciones de aminoácidos en posiciones particulares dentro de cualquiera de los ligandos del MHC de clase II pueden resultar en un polipéptido de IFN-a desinmunizado con una inmunogenicidad reducida cuando se administra terapéuticamente a un receptor, tal como, por ejemplo, un receptor humano. Los ejemplos de modificaciones para disminuir la inmunogenicidad del polipéptido de IFN-a incluyen, por ejemplo, mutaciones divulgadas en la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. US2006/0062761 Al, tales como, pero no limitadas a, modificaciones de aminoácidos en una o más posiciones correspondientes a cualquiera de las siguientes posiciones: I24P, L26P, F27S, F38E, I63T, F64A, F64C, F64D, F64E, F64G, F64H, F64K, F64M, F64N, F64P, F64Q, F64R, F64S, F64T, F64 , F64Y, N65A, N65C, N65D, N65E, N65F, N65G, N65H, N65I, N65K, N65L, N65M, N65P, N65Q, N65R, N65S, N65T, N65V, N65W, N65YL66A, L66C, L66D, L66E, L66G, L66H, L66K, L66N, L66P, L66Q, L66R, L66S, L66T, L66M, L66V, L66W, L66Y, F67A, F67C, F67D, F67E, F67G, F67H, F67K, F67N, F67P, F67Q, F67R, F67S, F67T, F67M, F67V, F67W, F67Y, S68A, S68F, S68G, S68H S68I, S68M, S68P, S68T, S68V, S68W, S68Y, K70A, K70C K70H, K70P, D71F, D71H, D71I, D71L, D71P, D71T, D71V D71W, D71Y, S72D, S72H, S72P, S72T, S72W, S72Y, S73A S73C, S73G, S73P, S73T, A74D, A74P, A74Q, A74R, A74S A74T, A75C, A75D, A75E, A75G, A75H, A75K, A75N, A75P A75Q, A75R, A75S, A75T, A75 , A75, A75, AW76A, W76C W76D, W76E, 76G, W76H, 76K, 76N, W76P, W76Q, W76R, W76S, W76T, W76M, 76, WE78A, E78C, E78G, F84D, F84E, FY85S , ?89?, ?89?, Y89D, V103E, L110G, LllOS, M111T, MUIS, M111E, K112A, K112C, K112G, K112P, D114P, S115A, S115C, S115D, S115F, S115G, S115H, S115I, S115P, S115W, S115Y, I116A, I116C, I116D, I116E, I116G, I116H, I116K, I116N, I116P, I116Q, I116R, I116S, I116T, I116W, I116Y, L117A, L117C, L117D, L117E, L117G, L117H, L117K, L117N, L117P, L117Q, L117R, L117S, L117T, L117M, L117W, L117Y, V118D, V118E, V118H, V118K, V118N, V118P, V118Q, V118R, V118S, V118T, V118 , V118, V118, V118, V119A, V119C, V119G, V119P, V119T, R120P, Y122A, Y122C, Y122D, Y122E, Y122G, Y122H, Y122K, Y122N, Y122P, Y122Q, Y122R, Y122S, Y122T, Y122, F123A, F123C, F123D, F123E, F123G, F123H, F123K, F123N, F123P, F123Q, F123R, F123S, F123T, F123, Q124A, Q124C, Q124G, Q124H, Q124I, Q124M, Q124P, Q124T, Q124V, Q124W, Q124Y, Q124 , Q124 , Q124, R125P, R125T, R125W, R125Y, I126A, I126C, I126D, I126E, I126G, I126H, I126K, I126N, I126P, I126Q, I126R, I126S, I126T, I126M, T127P, T127W, T127Y, L128A, L128C, L128G, L128P, L128Q, L128R, L128S, L128T, Y129D, Y129E, Y129H, Y129K, Y129P, Y129Q, Y129R, Y129S, Y129T, Y129M, y L153S de un polipéptido de IFN-a maduro expuesto en el ID SEC NO: 2067 o de una variante de especie o alélica del mismo.

El grado de glicosilación de los polipéptidos de IFN-a para ser utilizados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas puede ser alterado para obtener 1) inmunogenicidad reducida; 2) administración menos frecuente de la proteína; 3) estabilidad aumentada de la proteína, tal como vida media aumentada en el suero; y 4) reducción de los efectos colaterales, tales como inflamación. La glicosilación adicional de un polipéptido de IFN-a le confiere una o más ventajas, incluyendo una mayor vida media en suero; inmunogenicidad reducida; vida media funcional aumentada in vivo; degradación reducida por parte de condiciones en el tracto gastrointestinal, tales como proteasas del tracto gastrointestinal; y mayor velocidad de absorción por parte de las células epiteliales del intestino. Una mayor velocidad de absorción por parte de las células epiteliales del intestino y una degradación reducida por parte de las condiciones en el tracto gastrointestinal, son importantes para las formulaciones entéricas de un polipéptido de IFN-OÍ. Un polipéptido de IFN-a hiperglicosilado para utilizarse en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas puede incluir O-glicosilación, N-glicosilación y/o una combinación de las mismas. En algunos ejemplos, un polipéptido de IFN-hiperglicosilado puede incluir 1, 2, 3, 4, 5 o más grupos de carbohidratos, cada uno unido a sitios de glicosilacion distintos. El sitio de glicosilacion puede ser un sitio de glicosilacion nativo o no nativo. En otros ejemplos, el polipéptido hiperglicosilado puede estar glicosilado en un único sitio de glicosilacion no nativo. En otros ejemplo, el polipéptido hiperglicosilado puede estar glicosilado en más de un sitio de glicosilacion no nativo, por ejemplo, el polipéptido de IFN-a hiperglicosilado puede estar glicosilado en 1, 2, 3, 4, 5 o más sitios de glicosilacion no nativos. Los sitios de glicosilacion en un polipéptido de IFN- pueden ser creados, alterados, eliminados o redistribuidos. Por ejemplo, los sitios de glicosilacion nativos pueden ser modificados para evitar la glicosilacion o para aumentar o disminuir la glicosilacion, mientras que otras posiciones en el polipéptido de IFN-a pueden ser modificadas para crear nuevos sitios de glicosilacion o para aumentar o disminuir la glicosilacion en sitios existentes. En algunos ejemplos, el contenido de carbohidratos del polipéptido de IFN-a puede ser modificado. Por ejemplo, puede alterarse el número de la posición, la fuerza del enlace, la estructura y la composición de las uniones de los carbohidratos (es decir, la estructura del carbohidrato basada en la naturaleza de las uniones glicosídicas o ramificaciones del carbohidrato) o los grupos de carbohidratos agregados al polipéptido de IFN-a. Los cambios en el contenido de carbohidratos de los polipéptidos de IFN-a glicosilados para ser utilizados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas, incluyendo el contenido de ácido siálico, pueden ser generados a través de cualquier método conocido en el arte, incluyendo, pero no limitándose a, la modificación de la secuencia primaria del polipéptido de IFN-a, la modificación enzimática o química, la producción en células hospederas diferentes o en células hospederas modificadas, para producir diferencias en el patrón de glicosilación, y los métodos de purificación para enriquecer los polipéptidos de IF -a con perfiles de glicosilación específicos. Adicionalmente , las condiciones de crecimiento (por ejemplo, la composición del medio) en las que las células hospederas expresan los polipéptidos de IFN-a modificados, pueden ser alteradas para proporcionar cambios en la glicosilación, en particular, en el contenido de ácido siálico. Cualquier modificación de aminoácidos que contribuya a una glicosilación alterada del polipéptido de IFN-a puede ser combinada con una o más modificaciones que aumentan la resistencia a proteasas del polipéptido de IFN-a para ser utilizado en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas. Los ejemplos de modificaciones de aminoácidos para modificación de sitios de glicosilación de un IFN-a, para unión de un grupo carbohidrato, son descritas, por ejemplo, en la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2004/0132977-A1 y en las Publicaciones de Solicitud PCT Internacional Nos. WO2006/020580 y WO 2004/022593, e incluyen modificaciones ejemplares correspondientes a D2N/P4S, D2N/P4T, L3N/Q5S, L3N/Q5T, P4N/T6S, P4N/T6T, Q5N/H7S, Q5N/H7T, T6N/S8S, T6N/S8T, H7N/L9S, H7N/L9T, S8N/G10S, S8N/G10T, L9N/S11S, L9N/S11T, M21N/K23S, M21N/K23T, R22N/I24S, R22N/I24T, R23N/S25S, R23N/S25T, I24N/L26S, I24N/L26T, S25N/F27S, S25N/F27T, L26N/S28S, L26N/S28T, S28N/L30S, S28N/L30T, L30N/D32S, L30N/D32T, K31N/R33S, K31N/R33T, D32N/H34S, D32N/H34T, R33N/D35S, R33N/D35T, H34N/F36S, H34N/F36T, D35N/G37S, D35N/G37T, F36N/F38S, F36N/F38T, G37N/P39S, G37N/P39T, F38N/Q40S, F38N/Q40T, P39N/E41S, P39N/E41T, Q40N/E42S, Q40N/E42T, E41N/F43S, E41N/F43T, E42N/G44S, E42N/G44T, F43N/N45S, F43N/N45T, G44N/Q46S, G44N/Q46T, N45N/F47S, N45N/F47T, Q46N/Q48S, Q46N/Q48T, F47N/K49S, F47N/K49T, Q48N/A50S, Q48N/A50T, K49N/E51S, K49N/E51T, A50N/T52S, A50N/T52T, S68N/K70S, S68N/K70T, K70N/S72S, K70N/S72T, A75N/D77S, A75N/D77T, D77N/T79S, D77N/T79T, I100N/G102S, I100N/G102T, Q101N/V103S, Q101N/V103T, G102N/G104S, G102N/G104T, V103N/V105S, V103N/V105T, G104N/T106S, G104N/T106T, V105N/E107S, V105N/E107T, T106N/T108S, T106N/T108T, E107N/P109S, E107N/P109T, T108N/I110S, T108N/I110T, K134N/S136S, K134N/S136T, S154N/N156S, S154N/N156T, T155N/L157S, T155N/L157T, N156N/Q158S, N156N/Q158T, L157N/E159S, L157N/E159T, Q158N/S160S, Q158N/S160T, E159N/L161S, E159N/L161T, S160N/R162S, S160N/R162T, L161N/S163S, L161N/S163T, R162N/K164S, R162N/K164T, S163N/E165S, S163N/E165T, D71N, D77N, T106N, D71N/D77N, D71N/T106N, D77N/T106N y D71N/D77N/T106N de un polipéptido de IFN-a maduro expuesto en el ID SEC NO: 2067 o una variante de especies o alélica del mismo 2. Expresión de Polipéptidos de IFN-a Resistentes a Proteasas Los polipéptidos de IFN-a resistentes a proteasas para ser utilizados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas pueden ser generados mediante cualquier método conocido en el arte, incluyendo, por ejemplo, la introducción de moléculas de ácidos nucleicos que codifican por el polipéptido de IFN-a resistente a proteasas, tal como IFN-o¡2b ( E 1Q) , en una célula hospedera o animal hospedero, y la expresión a partir de las moléculas de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido de IFN-a resistente a proteasas. Los hospederos de expresión incluyen E. coli, levadura, plantas (por ejemplo, algas) , células de insectos, células de mamíferos, incluyendo líneas celulares (por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO) , células de riñon de hámster bebé (BHK) , células VERO, HT1080, MDCK, W138, Balb/3T3, HeLa, MT2 , NSO de ratón (no secretoras) y otras líneas celulares de mieloma, líneas celulares de hibridoma y heterohibridoma, linfocitos, células RPMI 1788, fibroblastos, células Sp2/0, COS, NIH3T3 , HEK293, 293S, 2B8, EBNA-1 y HKB (véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.618.698, 6.777.205)) y animales transgénicos (por ejemplo, producción en suero, orina, leche y huevos) . Los hospederos de expresión pueden ser diferentes en sus niveles de producción de proteínas, así como en los tipos de modificaciones post-traduccionales que están presentes en las proteínas expresadas . La elección del hospedero de expresión puede hacerse en base a estos y otros factores, tales como las consideraciones regulatorias y de seguridad, los costos de producción y la necesidad y los métodos de purificación. 3. Formulaciones Orales y Formas de Dosificación Unitarias Los polipéptidos de IFN-a resistentes a proteasas, tales como los polipéptidos de IFN-a2b (E41Q) pueden ser formulados para administración oral como se describe en este documento. Por ejemplo, los polipéptidos de IFN-a resistentes a proteasas pueden ser formulados con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables y ser liofilizados para generar un polvo que puede ser utilizado para llenar una cápsula o ser comprimido en una tableta. Tales tabletas o cápsulas que contienen el polipéptido de IFN-a resistente a proteasas pueden incluir opcionalmente un recubrimiento entérico para efectuar la entrega del polipéptido en el tracto intestinal inferior. En los Ejemplos de más abajo se proporciona ejemplos de formulaciones de dosificación oral de un polipéptido de IFN-a2b (E41Q) resistente a proteasas. Los ejemplos de pasos para la producción de las formulaciones de dosificación oral de un polipéptido de IFN-a2b ( E41Q) resistente a proteasas se proporcionan en los Ejemplos, tales como para la producción y purificación del polipéptido de IFN-a2b (E41Q) resistente a proteasas (véase, por ejemplo, los Ejemplos 2, 3 y 4) y para la producción y purificación de la proteína liofilizada (Ejemplo 5) . Las formulaciones de dosificación oral que contienen un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas, tal como un polipéptido de IFN-a2b (E41Q) , contienen una o una pluralidad de unidades de dosificación oral. Los ejemplos de unidades de dosificación oral incluyen tabletas o cápsulas que contienen una cantidad de polipéptido de IFN-a resistente a proteasas que corresponde a la dosificación completa o a una fracción de la dosificación a ser administrada para el tratamiento de una enfermedad o condición. La cantidad de polipéptido contenida en una tableta o en una cápsula depende de varios factores, incluyendo la dosificación unitaria deseada para la enfermedad o condición a ser tratada, el tamaño máximo de la tableta o cápsula, las propiedades de los excipientes farmacéuticos y las propiedades del polipéptido liofilizado. Típicamente, la forma de dosificación unitaria contiene alrededor de 0,001-100 mg del polipéptido. Los ejemplos de procesos para la producción de formas de dosificación unitaria que contienen un polipéptido de IFN-oí2b ( E 1Q) , incluyendo las formas de dosificación unitaria con recubrimiento entérico que contienen un polipéptido de IFN-a2b ( E41Q) , se proporcionan en los Ejemplos de más abajo (véase, por ejemplo, el Ejemplo 6) . Los ejemplos de formas de dosificación unitaria de IFN-a2b (E41Q) se describen en el Ejemplo 6 de más abajo, e incluyen, por ejemplo, 40 , 200 µ? y 450 yg del polipéptido de IFN-a2b(E41Q), en una tableta comprimida de 150 mg . Tales formas de dosificación unitaria son ejemplares, y no están concebidas para limitar la cantidad de polipéptido de IFN-a resistente a proteasas que puede ser formulada en una forma de dosificación unitaria, tal como una tableta o una cápsula. Para tratamiento, la formulación de dosificación oral puede ser administrada diariamente, dos o más veces por día, 6 veces por semana, 5 veces por semana, 4 veces por semana, 3 veces por semana, 2 veces por semana o una vez por semana. Típicamente, la formulación de dosificación oral se administra diariamente . Las formulaciones de dosificación oral de los polipéptidos de IFN-a resistentes a proteasas, son generalmente más altas, generalmente alrededor de 6-400 veces, tal como 10-100 veces, incluyendo, por ejemplo, 15-50 veces, 20-30 veces, típicamente 15-40 veces más altas (dependiendo de la proteína terapéutica, de la indicación tratada y de la formulación) por día, que las cantidades administradas por vía subcutánea para la misma indicación usando una proteína terapéutica no modificada en el mismo individuo. Para el tratamiento del VHC, los polipéptidos de IFN-a, nativos u otros, son administrados de forma subcutánea a una dosis de 12 µ? por dosis para un humano de 70 kg, tres veces a la semana, para proporcionar una dosificación oral de 36 µ? por semana. En un ejemplo de una formulación de dosificación oral para IFN-a2b (E41Q) , en donde la enfermedad tratada es una infección viral por VHC, los ejemplos de formulación de dosificación proporcionados en este documento se seleccionan generalmente en el intervalo entre generalmente alrededor de 6-200 veces, tal como 10-100 veces, incluyendo, por ejemplo, 15-50 veces, 20-30 veces, típicamente 15-40 veces más que la dosis subcutánea de péptidos de IFN-a nativos. Por ejemplo, el polipéptido de IFN-a resistente a proteasas puede ser administrado en una dosificación generalmente alrededor de 70-2400 pg, tal como 120-1200 yg, incluyendo, por ejemplo, 180-600 pg, 240-360 yg, típicamente 180-480 pg. Las formulaciones de dosificación se proporcionan como cápsulas o tabletas de dosificación unitaria que contienen 6, 12, 18, 24, 32, 40, 50, 60 pg o más por unidad de dosificación. Se administra múltiples unidades de dosificación como formulación de dosificación oral. Tales formulaciones orales pueden ser administradas diariamente para el tratamiento de la infección por VHC para proporcionar una dosificación semanal de generalmente alrededor de 500-16800 pg, tal como 840-8400 pg, incluyendo, por ejemplo, 1260-4200 pg, 1680-2520 pg, típicamente 1260-3360 pg . De forma alternativa, tales formulaciones orales pueden ser administradas más o menos frecuentemente. Por ejemplo, las formulaciones de dosificación oral para el tratamiento del VHC pueden ser administradas 3 veces a la semana para proporcionar una dosis semanal generalmente de alrededor de 210-7200 pg , tal como 360-3600 pg, incluyendo, por ejemplo, 540-1800 pg, 720-1080 pg, típicamente 540-1440 pg. Se proporciona unidades de dosificación que contienen 10 pg, 20 pg, 30 pg, 40 pg, 50 pg, 60 pg, 70 pg, 80 pg, 90 pg, lOOpg, 120 pg, 150 pg, 300 pg o más IFN-a2b modificado. Tales unidades de dosificación pueden administrarse una a la vez o una pluralidad por vez. Por ejemplo, para el tratamiento de la infección por VHC, el tratamiento se efectúa mediante administración diaria de 30 - 950 pg/día o alrededor de 80 pg a 6600 pg/semana. Por ejemplo, puede administrarse unidades de dosificación de 80 pg- 2200 pg diariamente o tres veces a la semana durante tanto tiempo como el tratamiento sea indicado.

F. FORMULACIONES DE DOSIFICACIÓN ORAL DE POLIPEPTIDOS DE HORMONA DEL CRECIMIENTO RESISTENTES A PROTEASAS Como se menciona anteriormente, las formulaciones de dosificación oral proporcionadas pueden contener un polipéptido resistente a proteasas que es una hormona del crecimiento modificada, tal como una hormona del crecimiento humana (hGH) . Tales polipéptidos resistentes a proteasas pueden ser utilizados en el tratamiento de cualquier enfermedad o condición para la que se administre una forma nativa o de tipo salvaje del polipéptido de hGH. Las formas nativas o de tipo salvaje de la hGH son administradas para el tratamiento de una variedad de enfermedades o condiciones, algunas de las cuales se describen más abajo, e incluyendo desórdenes de deficiencia de crecimiento, pediátricos o de adultos (incluyendo, pero no limitándose a, síndrome de Turner, retardo de crecimiento intrauterino, corta estatura idiopática, síndrome de Prader illi, talasemia) , enlaciamiento asociado a SIDA, envejecimiento, función inmunitaria dañada en sujetos infectados por VIH, dolencias catabólicas (incluyendo aquéllas asociadas con falla respiratoria y daño por quemaduras) , recuperación quirúrgica, cardiomiopatía congestiva, transplante hepático, regeneración hepática tras hepatectomía, falla renal crónica, osteodistrofia renal, osteoporosis , acondroplasia/hipocondroplasia, displasia esquelética, desórdenes inflamatorios o nutricionales crónicos (tales como enfermedad de Crohn) , síndrome de intestino corto, artritis crónica juvenil, fibrosis quística, infertilidad masculina, raquitismo hipofosfatémico asociado al cromosoma X, síndrome de Down, espina bífida, síndrome de Noonan, obesidad, potencia muscular dañada y fibromialgia . Sin embargo, el tratamiento de estas enfermedades o condiciones con hGH nativa está limitado a rutas subcutáneas e intravenosas, dado que la degradación del polipéptido nativo en el tracto gastrointestinal, cuando se administra por la vía oral, impide la absorción del polipéptido terapéutico hacia el torrente sanguíneo. Como se muestra en los Ejemplos proporcionados más abajo, poco o nada de la hGH se absorbe hacia el torrente sanguíneo después de la administración oral (véase, por ejemplo, el Ejemplo 26) . Contrariamente, las formulaciones de dosificación oral proporcionadas en este documento contienen polipéptidos de hGH resistentes a proteasas que pueden ser absorbidos hacia el torrente sanguíneo cuando se administran por vía oral. Como se muestra en los Ejemplos, la administración oral de polipéptidos de hGH resistentes a proteasas, hGH(Y42I) y hGH (Y42H) , a través de varias formas de administración oral, incluyendo cápsulas y alimentación líquida por sonda nasogástrica, da como resultado altos niveles de absorción de los polipéptidos de hGH hacia el torrente sanguíneo. Los polipéptidos de hGH resistentes a proteasas absorbidos exhiben actividad de hormona del crecimiento comparable a la hGH nativa administrada por vía subcutánea (véase, por ejemplo, el Ejemplo 28) . Adicionalmente , la administración de formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de hGH resistentes a proteasas puede lograr niveles de hGH en la sangre comparables con los niveles observados para administración subcutánea (véase, por ejemplo, los Ejemplos 26 y 27) . Por ende, las formulaciones orales de polipéptidos de hGH resistentes a proteasas proporcionadas en este documento proveen de una manera de lograr cantidades terapéuticamente efectivas de hGH mediante administración oral. 1. Polipéptidos de Hormona del Crecimiento Resistentes a Proteasas Los ejemplos de polipéptidos de hGH resistentes a proteasas incluyen una o más modificaciones de aminoácidos en la secuencia primaria de aminoácidos de un polipéptido de hormona del crecimiento, tal como un polipéptido de hormona del crecimiento humana (ID SEC NO: 1260) , en donde los uno o más reemplazos de aminoácidos conducen a una mayor resistencia a proteasas, incluyendo, pero no limitándose a, proteasas del tracto gastrointestinal. Tales modificaciones incluyen, pero no están limitadas a, las modificaciones mostradas en la Tabla 8, en donde los reemplazos se hacen en comparación con la secuencia de aminoácidos expuesta en el ID SEC NO: 1260. Las modificaciones pueden realizarse en el polipéptido de hGH (ID SEC NO: 1260) o en cualquier variante de especies o alélica del mismo . En un ejemplo particular de un polipéptido de hGH resistente a proteasas que puede ser utilizado en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas, la modificación de un polipéptido de hGH es el reemplazo de un residuo de tirosina (Y) por un residuo de isoleucina (I) o por un residuo de histidina (H) . Los ejemplos de tal reemplazo es el reemplazo de un residuo de tirosina (Y) con un residuo de isoleucina (I) en la posición 42 en una hGH madura (por ejemplo, ID SEC NO: 1318) o en variantes alélicas o de secuencia de la misma. Otro ejemplo de tal reemplazo es el reemplazo de un residuo de tirosina (Y) con un residuo de histidina (H) en la posición 42 en una hGH madura (por ejemplo, ID SEC NO: 1317) o en variantes alélicas o de secuencia de la misma. Un ejemplo de un polipéptido de hGH maduro que puede ser utilizado en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas en este documento es el polipéptido hGH(Y42I), y posee la siguiente secuencia de aminoácidos: CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQQEFGNQFQKAETIPV LHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPL MKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEWRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE (ID SEC NO: 1995) . Un ejemplo de un polipéptido de hGH maduro que puede ser utilizado en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas en este documento es el polipéptido hGH (Y42H) , y posee la siguiente secuencia de aminoácidos: FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKHSFLQNPQT SLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFA SLVYGA SDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNY GLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF (ID SEC NO: 1317) . a. Otras Modificaciones de Polipéptidos de Hormona del Crecimiento Resistentes a Proteasas Los polipéptidos de hGH resistentes a proteasas para ser usados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas también incluyen polipéptidos de hGH resistentes a proteasas que han sido modificados adicionalmente mediante glicosilación, carboxilación, hidroxilación, hasilación, carbamilación, sulfatación, fosforilación y/o pegilación. Los polipéptidos de hGH resistentes a proteasas para ser usados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas también incluyen polipéptidos de hGH resistentes a proteasas que han sido modificados adicionalmente mediante uno o más modificaciones de aminoácidos que contribuyen a, por ejemplo, obtener una actividad aumentada (por ejemplo, actividad de proliferación celular aumentada) , inmunogenicidad alterada, estabilidad, tolerancia térmica, resistencia a proteasas , glicosilación, carboxilación, hidroxilación, hasilación, carbamilación, sulfatación, fosforilación y/o pegilación. Tales modificaciones de aminoácidos pueden ser aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales y una combinación de aminoácidos naturales o no naturales. Los polipéptidos de hGH resistentes a proteasas para ser utilizados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas también pueden ser conjugados o expresados como proteínas de fusión con una o más proteínas o péptidos, tales como albúmina. Además, las modificaciones proteicas también pueden incluir modificaciones para facilitar la detección, purificación y desarrollo de ensayos para un polipéptido de hGH, tal como, por ejemplo, la modificación de un polipéptido con Sulfo-NHS-LC-biotina para que pueda unirse covalentemente con una amina primaria en una proteína, u otra modificación similar para mareaje fluorescente, no- isotópico o radioactivo. Generalmente, la modificación da como resultado una estabilidad aumentada sin pérdida de al menos una actividad, tal como actividad de proliferación celular (es decir, retiene al menos una actividad como se define en este documento) , de un polipéptido de hGH no modificado . Otros han proporcionado moléculas de hGH, incluyendo hGH modificadas y esquemas para su producción recombinante, purificación y uso terapéutico [EP 0107890, Patente de los Estados Unidos No. 4.517.181, EP 0105759; Patente de los Estados Unidos No. 4.703.035; Patente de los Estados Unidos No. 4.658.021; EP0022242; EP0001929; EP0001939; Patente de los Estados Unidos No. 4.342.832; Patente de los Estados Unidos No. 4.601.980; Patente de los Estados Unidos No. 4.604.359; Patente de los Estados Unidos No. 4.634.677; Patente de los Estados Unidos No. 4.898.830; Patente de los Estados Unidos No. 5.424.119; Patente de los Estados Unidos No. 4.366, 246; Patente de los Estados Unidos No. 4.425.437; Patente de los Estados Unidos No. 4.431.739; Patente de los Estados Unidos No. 4.563, 424; Patente de los Estados Unidos No. 4.571.421; EP 0131843; EP 0319049; Patente de los Estados Unidos No. 4.831, 120; Patente de los Estados Unidos No. 4.871.835; Patente de los Estados Unidos No. 4.997.916; Patente de los Estados Unidos No. 5, 612.315; Patente de los Estados Unidos No .5.633.352 ; Patente de los Estados Unidos No. 5.618.697; Patente de los Estados Unidos No. 5, 635.604; EP 0127658; EP 0217814; Patente de los Estados Unidos No. 5.898.030; EP0804223; Patente de los Estados Unidos No. 7.153.943; Patente de los Estados Unidos No. 6.451.561; Lowman H. B. y Wells J. A. (1993) J. Mol. Biol. 243: 564-578] . Tales proteínas de hGH modificadas pueden ser combinadas con una o más modificaciones para obtener una resistencia aumentada a proteasas para ser utilizadas en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas . Las modificaciones para disminuir la inmunogenicidad del polipéptido de hGH típicamente involucran el reemplazo de al menos un residuo de aminoácido, lo que resulta en una reducción sustancial o una eliminación de la actividad de uno o más epítopos de células T de la proteína, es decir, una desinmunización del polipéptido. Una o más modificaciones de aminoácidos en posiciones particulares dentro de cualquiera de los ligandos del MHC de clase II pueden resultar en un polipéptido de hGH desinmunizado con una inmunogenicidad reducida cuando se administra terapéuticamente a un receptor, tal como, por ejemplo, un receptor humano. Los ejemplos de modificaciones para disminuir la inmunogenicidad del polipéptido de hGH incluyen, por ejemplo, las mutaciones divulgadas en la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. US2005/0020494 -Al . El grado de glicosilación de los polipéptidos de hGH para ser utilizados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas puede ser alterado para obtener 1) inmunogenicidad reducida; 2) administración menos frecuente de la proteína; 3) estabilidad aumentada de la proteína, tal como vida media aumentada en el suero; y 4) reducción de los efectos colaterales, tales como inflamación. La glicosilación adicional de un polipéptido de hGH le confiere una o más ventajas, incluyendo una mayor vida media en suero; inmunogenicidad reducida; vida media funcional aumentada in vivo; degradación reducida por parte de condiciones en el tracto gastrointestinal, tales como proteasas del tracto gastrointestinal; y mayor velocidad de absorción por parte de las células epiteliales del intestino. Una mayor velocidad de absorción por parte de las células epiteliales del intestino y una degradación reducida por parte de las condiciones en el tracto gastrointestinal, son importantes para las formulaciones entéricas de un polipéptido de hGH. Un polipéptido de hGH hiperglicosilado para utilizarse en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas puede incluir O-glicosilación, N-glicosilación y/o una combinación de las mismas. En algunos ejemplos, un polipéptido de hGH hiperglicosilado puede incluir 1, 2, 3, 4, 5 o más grupos de carbohidratos, cada uno unido a sitios de glicosilación distintos. El sitio de glicosilación puede ser un sitio de glicosilación nativo o no nativo. En otros ejemplos, el polipéptido hiperglicosilado puede estar glicosilado en un único sitio de glicosilación no nativo. En otros ejemplos, el polipéptido hiperglicosilado puede estar glicosilado en más de un sitio de glicosilación no nativo, por ejemplo, el polipéptido de hGH hiperglicosilado puede estar glicosilado en 1, 2, 3, 4, 5 o más sitios de glicosilación no nativos. Los sitios de glicosilación en un polipéptido de hGH pueden ser creados, alterados, eliminados o redistribuidos. Por ejemplo, los sitios de glicosilación nativos pueden ser modificados para evitar la glicosilación o para aumentar o disminuir la glicosilación, mientras que otras posiciones en el polipéptido de hGH pueden ser modificadas para crear nuevos sitios de glicosilación o para aumentar o disminuir la glicosilación en sitios existentes. En algunos ejemplos, el contenido de carbohidratos del polipéptido de hGH puede ser modificado. Por ejemplo, puede alterarse el número de la posición, la fuerza del enlace, la estructura y la composición de las uniones de los carbohidratos (es decir, la estructura del carbohidrato basada en la naturaleza de las uniones glicosidicas o ramificaciones del carbohidrato) o los grupos de carbohidratos agregados al polipéptido de hGH. Los cambios en el contenido de carbohidratos de los polipéptidos de hGH glicosilados para ser utilizados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas, incluyendo el contenido de ácido siálico, pueden ser generados a través de cualquier método conocido en el arte, incluyendo, pero no limitándose a, la modificación de la secuencia primaria del polipéptido de hGH, la modificación enzimática o química, la producción en células hospederas diferentes o en células hospederas modificadas, para producir diferencias en el patrón de glicosilación, y los métodos de purificación para enriquecer los polipéptidos de hGH con perfiles de glicosilación específicos. Adicionalmente , las condiciones de crecimiento (por ejemplo, la composición del medio) en las que las células hospederas expresan los polipéptidos de hGH modificados, pueden ser alteradas para proporcionar cambios en la glicosilacion, en particular, en el contenido de ácido siálico. Cualquier modificación de aminoácidos que contribuya a una glicosilacion alterada del polipéptido de hGH puede ser combinada con una o más modificaciones que aumentan la resistencia a proteasas del polipéptido de hGH para ser utilizado en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas. Los ejemplos de modificaciones de aminoácidos para modificación de sitios de glicosilacion de un hGH, para unión de un grupo carbohidrato, son descritos, por ejemplo, en la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. US2005/0250678 y en las Publicaciones de Solicitud PCT Internacional Nos. O2006/121569 y WO2002/055532. 2. Expresión de Ácidos Nucleicos que Codifican Polipeptidos de Hormona del Crecimiento Resistentes a Proteasas Los polipéptidos de hGH resistentes a proteasas para ser utilizados en las unidades de dosificación y las formulaciones orales proporcionadas en este documento pueden ser producidos mediante cualquier método conocido en el arte, incluyendo, por ejemplo, la introducción de moléculas de ácidos nucleicos que codifican por el polipéptido de hGH resistente a proteasas, tal como hGH(Y42I) o hGH (Y42H) , en una célula hospedera o animal hospedero, y la expresión a partir de las moléculas de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido de hGH resistente a proteasas. Los hospederos de expresión incluyen E. coli, levadura, plantas (por ejemplo, algas), células de insectos, células de mamíferos, incluyendo líneas celulares (por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO) , células de riñon de hámster bebé (BHK) , células VERO, HT1080, MDCK, W138, Balb/3T3, HeLa, MT2 , NSO de ratón (no secretoras) y otras líneas celulares de mieloma, líneas celulares de hibridoma y heterohibridoma, linfocitos, células RPMI 1788, fibroblastos, células Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8 , EBNA-1 y HKB (véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.618.698, 6.777.205)) y animales transgénicos (por ejemplo, producción en suero, orina, leche y huevos) . Los hospederos de expresión pueden ser diferentes en sus niveles de producción de proteínas, así como en los tipos de modificaciones post-traduccionales que están presentes en las proteínas expresadas. La elección del hospedero de expresión puede hacerse en base a estos y otros factores, tales como las consideraciones regulatorias y de seguridad, los costos de producción y la necesidad y los métodos de purificación. 3. Formulaciones Orales y Formas de Dosificación Unitarias Los polipéptidos de hGH resistentes a proteasas, tales como los polipéptidos de hGH(Y42I) y hGH (Y42H) , pueden ser formulados para administración oral como se describe en este documento. Se proporciona tabletas y/o cápsulas que contienen los polipéptidos de hGH modificados. Por ejemplo, los polipéptidos de hGH resistentes a proteasas pueden ser formulados con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables y ser liofilizados para generar un polvo que puede ser utilizado para llenar una cápsula o ser comprimido en una tableta. Tales tabletas o cápsulas que contienen un polipéptido de hGH resistente a proteasas pueden incluir opcionalmente un recubrimiento entérico para efectuar la entrega del polipéptido en el tracto intestinal inferior. En los Ejemplos de más abajo se proporciona ejemplos de formulaciones unitarias de dosificación oral de un polipéptido de hGH(Y42I) resistente a proteasas. Los ejemplos de pasos para la producción de las formulaciones de dosificación oral de un polipéptido de hGH(Y42I) resistente a proteasas se proporcionan en los Ejemplos, tales como para la producción y purificación del polipéptido de hGH(Y42I) resistente a proteasas (véase, por ejemplo, el Ejemplo 21) y para la producción y purificación de la proteina liofilizada (Ejemplo 22) . Las formulaciones de dosificación oral que contienen un polipéptido de hGH resistente a proteasas, tal como un polipéptido de hGH(Y42I) o hGH (Y42H) , contienen una o una pluralidad de unidades de dosificación oral. Los ejemplos de unidades de dosificación oral incluyen tabletas o cápsulas que contienen una cantidad de polipéptido de hGH resistente a proteasas que corresponde a la dosificación completa o a una fracción de la dosificación a ser administrada para el tratamiento de una enfermedad o condición. La cantidad de polipéptido contenida en una tableta o en una cápsula depende de varios factores, incluyendo la dosificación unitaria deseada para la enfermedad o condición a ser tratada, el tamaño máximo de la tableta o cápsula, las propiedades de los excipientes f rmacéuticos y las propiedades del polipéptido liofilizado. Típicamente, la forma de dosificación unitaria contiene alrededor de 0,001-100 mg, tal como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 mg del polipéptido. Las unidades de dosificación más altas contienen más, tal como 125 mg o 150 mg . Las formulaciones de dosificación oral para administración diaria o semanal pueden contener una pluralidad de unidades de dosificación. Los ejemplos de procesos para la producción de formas de dosificación unitaria que contienen un polipéptido de hGH(Y42I) o hGH (Y42H) , incluyendo las formas de dosificación unitaria con recubrimiento entérico que contienen un polipéptido de hGH(Y42I) o hGH(Y42H), se proporcionan en los Ejemplos de más abajo (véase, por ejemplo, los Ejemplos 24, 25). Puede usarse cualquier proceso basado en los mismos. Los ejemplos de formas de dosificación unitaria de hGH(Y42I) se describen en el Ejemplo 25 de más abajo, e incluyen, por ejemplo, 3 mg, 12 mg y 24 mg del polipéptido de hGH(Y42I), en una tableta comprimida de 400 mg. Tales formas de dosificación unitaria son ejemplares, y no están concebidas para limitar la cantidad de polipéptido de hGH resistente a proteasas que puede ser formulada en una forma de dosificación unitaria, tal como una tableta o una cápsula. Para tratamiento, la formulación de dosificación oral puede ser administrada diariamente, dos o más veces por día, 6 veces por semana, 5 veces por semana, 4 veces por semana, 3 veces por semana, 2 veces por semana o una vez por semana, o cualquier régimen determinado empíricamente o por un médico, para un paciente o sujeto en particular. Típicamente, la formulación de dosificación oral se administra diariamente . Las formulaciones de dosificación oral de los polipéptidos de hGH resistentes a proteasas, son generalmente más altas, generalmente alrededor de 6-400 veces, tal como 10-100 veces, incluyendo, por ejemplo, 15-50 veces, 20-30 veces, típicamente 15-40 veces más altas (dependiendo de la proteína terapéutica, de la indicación tratada y de la formulación) por día, que las cantidades administradas por vía subcutánea para la misma indicación usando una proteína terapéutica no modificada en el mismo individuo. Las unidades de dosificación contienen 0,1, 0,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10 mg o mayores cantidades del polipéptido de hGH modificado. Por ende, se proporciona unidades de dosificación que contienen las cantidades mencionadas, así como 15 mg, 20 mg, 30 mg, 50, mg, 75 mg, 100 mg, y cantidades superiores. Las formulaciones de dosificación pueden contener una o una pluralidad de unidades de dosificación.

Para el tratamiento de una deficiencia de hormona del crecimiento en adultos, los péptidos de hGH nativas se administran normalmente por vía subcutánea en una dosis de alrededor de 0,00625 mg/kg/día durante un mes, seguido de una dosis de mantenimiento de alrededor de 0,0125 mg/kg/día. De acuerdo a lo anterior, para un humano de 70 kg, la dosis de hGH nativa es 0,4375 mg por día durante un mes, seguida de una dosis de mantenimiento de 0,9375 mg por día. En un ejemplo de formulación de dosificación oral para la hGH(Y42I), cuando la enfermedad a ser tratada es una deficiencia en hormona del crecimiento, las formulaciones de dosificación ejemplares varían generalmente entre 2-90 mg, tal como 4-45 mg, incluyendo, por ejemplo, 6-25 mg, 8-15 mg, y típicamente 6-18 mg por día. Tales dosificaciones pueden ser administradas de manera continua o pueden administrarse durante un tiempo inicial, tal como un régimen de dosis de 1 mes, seguido por una dosis de mantenimiento inferior, tal como, por ejemplo, alrededor de 5-190 mg, tal como 9-95 mg, incluyendo, por ejemplo, 14-47 mg, 18-28 mg, y típicamente 14-38 mg por día. Tales formulaciones orales pueden ser administradas más o menos frecuentemente que una vez por día. Las cantidades y regímenes dependen de la condición tratada, del sujeto y del criterio del médico tratante.

G. MÉTODOS DE TRATAMIENTO Y USOS DE LAS FORMULACIONES DE DOSIFICACIÓN ORAL Las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos terapéuticos resistentes a proteasas proporcionadas en este documento, pueden ser utilizadas en métodos para tratar cualquier enfermedad, desorden o condición para los cuales se administre el polipéptido terapéutico nativo. La formulación de dosificación oral de un polipéptido resistente a proteasas o las unidades de dosificación del mismo es/son administrada (s) por vía oral a un paciente, en una cantidad que puede producir un aumento en la concentración sanguínea del polipéptido hasta una cantidad que es terapéuticamente efectiva para el tratamiento de la enfermedad, desorden o condición. Típicamente, la cantidad de un polipéptido resistente a proteasas en una composición para administración oral es mayor que la cantidad de un polipéptido resistente a proteasas que se administra por métodos tales como inyección intravenosa o subcutánea. La cantidad de un polipéptido resistente a proteasas en una composición para administración oral puede ser determinada empíricamente con respecto a la cantidad de un polipéptido resistente a proteasas o nativo que se administra por métodos tales como inyección intravenosa o subcutánea. En algunos ejemplos, la cantidad de un polipéptido resistente a proteasas en una composición para administración oral es generalmente alrededor de 6-400 veces, tal como 10-100 veces, incluyendo, por ejemplo, 15-50 veces, 20-30 veces, típicamente 15-40 veces más altas (dependiendo de la proteína terapéutica, de la indicación tratada y de la formulación) por día, que las cantidades administradas por vía subcutánea para la misma indicación usando una proteína terapéutica no modificada en el mismo individuo. La concentración de un polipéptido resistente a proteasas en una formulación para administración oral es efectiva para el tratamiento de la enfermedad, desorden o condición en un paciente cuando se administra por vía oral. Adicionalmente , dado que los polipéptidos variantes usados en las formulaciones de dosificación oral proporcionadas en este documento exhiben una mayor estabilidad proteica, hay más flexibilidad en la administración de composiciones farmacéuticas que en sus contrapartes de polipéptidos nativos. Típicamente, los polipéptidos ingeridos por vía oral son administrados en la mañana antes de comer (es decir, antes de que se activen las enzimas digestivas) . Los polipéptidos modificados proporcionados en este documento exhiben resistencia a proteasas frente a enzimas digestivas y pueden ofrecer la capacidad de administrar composiciones farmacéuticas orales que contienen un polipéptido resistente a proteasas en otros períodos durante el día y en condiciones en las que las enzimas digestivas están presentes y activas. 1. Métodos de Tratamiento Usando IFN-alfa En un ejemplo, la formulación de dosificación oral de un polipéptido resistente a proteasas se administra a un paciente que tiene una enfermedad, desorden o condición que puede ser tratado mediante la administración de un interferón, tal como un polipéptido de IFN-a. Típicamente, las formulaciones de dosificación oral de los polipéptidos de IFN-a resistentes a proteasas proporcionadas en este documento, se administran por vía oral usando una cantidad de IFN-a que es generalmente alrededor de 6-400 veces, tal como 10-100 veces, incluyendo, por ejemplo, 15-50 veces, 20-30 veces, típicamente 15-40 veces más altas (dependiendo de la proteína terapéutica, de la indicación tratada y de la formulación) por día, que las cantidades administradas por vía subcutánea para la misma indicación usando una proteína terapéutica no modificada en el mismo individuo . El IFN-OÍ nativo ha sido administrado para el tratamiento de la infección por virus de la hepatitis C (VHC) en una dosis de 2 millones de unidades (o 15 microgramos u 8,0xl0"10 moles) por día, tres veces a la semana durante 48 semanas, mediante inyección subcutánea. Las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de IFN-a resistentes a proteasas proporcionadas en este documento, se administran por vía oral usando una cantidad de IFN-a que es mayor que 2 millones de unidades (o 15 microgramos u 8,0xl0"10 moles) . Típicamente, las formulaciones de dosificación oral de los polipéptidos de IFN-a resistentes a proteasas proporcionadas en este documento, se administran por vía oral usando una cantidad de IFN-a resistente a proteasas en una formulación oral que es generalmente alrededor de 6-400 veces, tal como 10-100 veces, incluyendo, por ejemplo, 15-50 veces, 20-30 veces, típicamente 15-40 veces más altas por día, que las cantidades administradas por vía subcutánea para el tratamiento del VHC usando una proteína terapéutica no modificada en el mismo individuo. Los ejemplos de dosis de un polipéptido de IFN- resistente a proteasas para administración oral pueden, por ende, ser determinados empíricamente en base a las dosis de polipéptidos de IFN-a administrados mediante otros métodos, tales como métodos subcutáneos o intravenosos . En un ejemplo no limitante, las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de IFN-a resistentes a proteasas proporcionadas en este documento, contienen un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas, el cual contiene uno o más reemplazos de aminoácidos en una o más posiciones objetivo, tales como por ejemplo, E41 en el ID SEC NO: 2067. El reemplazo de aminoácidos en las posiciones objetivo altera o destruye un sitio nativo de corte para proteasas. Un ejemplo de reemplazo para generar un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas incluye, pero no está limitado a, E41Q (ID SEC NO: 1995) . Las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de IFN-a resistentes a proteasas proporcionadas en este documento, pueden ser utilizadas para tratamiento de cualquier condición para la cual se emplee IFN-a no modificado. Esta sección proporciona ejemplos de usos de polipéptidos de IFN-a resistentes a proteasas y métodos de administración. Estas terapias descritas son ejemplos y no limitan las aplicaciones de formulaciones de dosificación oral de IFN-a resistente a proteasas . Las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de IFN-OÍ resistentes a proteasas proporcionadas en este documento, están concebidas para ser usadas en varios métodos terapéuticos, así como diagnósticos, en los cuales se usa IFN-a para su tratamiento. Tales métodos incluyen, pero no están limitados a, métodos para tratamiento de condiciones fisiológicas y médicas descritas y listadas más abajo. En virtud de su estabilidad mejorada, los polipéptidos de IFN-OÍ resistentes a proteasas proporcionados en este documento exhiben una mejora en sus actividades correspondientes in vivo y en sus efectos terapéuticos. Los ejemplos de enfermedades y/o desórdenes humanos para los cuales pueden administrarse formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de IFN-a resistentes a proteasas incluyen, pero no están limitados a, cánceres y tumores, enfermedades infecciosas, enfermedades venéreas, enfermedades relacionadas con la inmunidad y/o enfermedades y desórdenes autoinmunes, enfermedades cardiovasculares, enfermedades metabólicas, enfermedades del sistema nervioso central, y desórdenes conectados con tratamientos de quimioterapia. Los ejemplos de cánceres y tumores que pueden ser tratados con una formulación de dosificación oral de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas proporcionada en este documento incluyen carcinomas, incluyendo carcinomas renales metastásicos , melanomas, linfornas, incluyendo linfornas foliculares y linfoma cutáneo de células T, leucemias, incluyendo leucemia de tricoleucocitos , leucemia linfocítica crónica y leucemia mieloide crónica, cánceres de hígado, cuello, cabeza y riñones, mielomas múltiples, tumores carcinoides y tumores que aparecen después de una deficiencia inmune, tales como el sarcoma de Kaposi en un caso de SIDA. Los ejemplos de enfermedades infecciosas que pueden ser tratadas con una formulación de dosificación oral de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas proporcionada en este documento incluyen enfermedades virales, tales como hepatitis B y C crónicas y VIH/SIDA, neumonías infecciosas y enfermedades venéreas, tales como verrugas genitales. Los ejemplos de enfermedades inmunes y auto-inmunes que pueden ser tratadas con una formulación de dosificación oral de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas proporcionada en este documento incluyen el rechazo de tejidos o de órganos transplantados, alergias, asma, psoriasis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa. Los ejemplos de enfermedades metabólicas que pueden ser tratadas con una formulación de dosificación oral de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas proporcionada en este documento incluyen enfermedades no asociadas a inmunidad, tales como obesidad. Los ejemplos de enfermedades inflamatorias que pueden ser tratadas con una formulación de dosificación oral de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas proporcionada en este documento incluyen enfermedades inflamatorias, tales como la enfermedad de Behcet . Los ejemplos de enfermedades del sistema nervioso central que pueden ser tratadas con una formulación de dosificación oral de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas proporcionada en este documento incluyen enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esquizofrenia y depresión. Los ejemplos de enfermedades y desórdenes que pueden ser tratadas con una formulación de dosificación oral de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas proporcionada en este documento también incluyen la curación de heridas, anemia en pacientes dializados y osteoporosis . Una formulación de dosificación oral de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas es útil para tratar varios desórdenes mediados por IFN-a, incluyendo enfermedades virales, desórdenes fibróticos y desórdenes proliferativos . De esta forma, se proporciona métodos para tratar infecciones virales, desórdenes fibróticos y/o desórdenes proliferativos en este documento. Tales métodos generalmente involucran la administración de una cantidad efectiva de una formulación de dosificación oral de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas a un individuo que lo necesita, en donde el polipéptido de IFN-a resistente a proteasas particular se prepara como se describió anteriormente, por ejemplo, como una tableta, pildora o cápsula con recubrimiento entérico. En algunos ejemplos, un método de tratamiento incluye adicionalmente la administración de al menos un agente terapéutico adicional para tratar un desorden viral, un desorden fibrótico o un desorden proliferativo . En algunos ejemplos, un método de tratamiento incluye adicionalmente administrar un agente para el manejo de los efectos colaterales, para tratar un efecto colateral inducido por un agente terapéutico. a. Desórdenes Fibróticos En este documento se proporciona métodos para tratar un desorden fibrótico en un individuo que tiene un desorden fibrótico. El método generalmente involucra la administración de una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN- resistente a proteasas en una formulación de dosificación oral provista a un individuo que lo necesita, en donde el polipéptido de IFN-a resistente a proteasas particular se prepara como se describió anteriormente, por ejemplo, como una tableta, pildora o cápsula con recubrimiento entérico. El método incluye el tratamiento de enfermedades fibróticas, incluyendo aquéllas que afectan el pulmón, tales como fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis pulmonar de etiología conocida, fibrosis hepática o cirrosis, fibrosis cardíaca y fibrosis renal. La etiología puede deberse a cualquier injuria aguda o crónica, incluyendo agentes tóxicos, metabólicos, genéticos e infecciosos. La fibrosis está caracterizada generalmente por la acumulación patológica o excesiva de tejido conectivo con colágeno. Los desórdenes fibróticos incluyen, pero no están limitados a, enfermedades del colágeno, enfermedad pulmonar intersticial, enfermedad de pulmón fibrótico en humanos (por ejemplo, bronquiolitis obliterativa, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis pulmonar de etiología conocida, estroma tumoral en una enfermedad pulmonar, esclerosis sistémica que afecta al pulmón, síndrome de Hermansky-Pudlak, neumoconiosis del trabajador del carbón, asbestosis, silicosis, hipertensión pulmonar crónica, hipertensión pulmonar asociada a SIDA, y sarcoidosis) , enfermedad fibrótica vascular, esclerosis arterial, aterosclerosis , venas varicosas, infartos coronarios, infartos cerebrales, fibrosis del miocardio, fibrosis musculoesquelética, adhesiones post-quirúrgicas , enfermedades del riñon humano (por ejemplo, síndrome nefrítico, síndrome de Alport, nefropatía asociada a VIH, enfermedad del riñon poliquístico, enfermedad de Fabry, nefropatía diabética, glomerulonefritis crónica, y nefritis asociada a lupus sistémico) , formación de queloides cutáneos, esclerosis sistémica progresiva (PSS) , colangitis esclerosante progresiva (PSC) , fibrosis hepática, cirrosis hepática, fibrosis renal, fibrosis pulmonar, fibrosis quística, enfermedad del transplante contra el huésped crónica, escleroderma (local y sistémico) , oftalmopatía de Grave, retinopatía diabética, glaucoma, enfermedad de Peyronie, fibrosis peneana, uretrostenosis después de un análisis usando un cistoscopio, acreción interna después de cirugía, cicatrización defectuosa, mielofibrosis , fibrosis retroperitoneal idiopática, fibrosis peritoneal de etiología conocida, ergotismo inducido por drogas, fibrosis asociada a cáncer benigno o maligno, fibrosis asociada a infección microbiana (por ejemplo, viral, bacteriana, parasítica, y fúngica) , enfermedad de Alzheimer, fibrosis asociada a enfermedad inflamatoria intestinal (incluyendo formación de constricciones en la enfermedad de Crohn y en colitis microscópica) , fibrosis inducida por injuria química o ambiental (por ejemplo, quimioterapia contra el cáncer, pesticidas, y radiación (por ejemplo, radioterapia contra el cáncer) ) . En algunos ejemplos, una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas es una cantidad que, cuando se administra a un individuo que tiene un desorden fibrótico, es efectiva para reducir la fibrosis o reducir la velocidad de progresión de la fibrosis en al menos alrededor de un 10%, al menos alrededor de un 15%, al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 25%, al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 35%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 45% o al menos alrededor de un 50% o más, en comparación con el grado de fibrosis en el individuo antes del tratamiento o en comparación con la velocidad de progresión de la fibrosis que hubiera sido experimentada por el paciente en ausencia del tratamiento. En algunos ejemplos, una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas es una cantidad que, cuando se administra a un individuo que tiene un desorden fibrótico, es efectiva para aumentar o reducir la velocidad de deterioro de al menos una función del órgano afectado por la fibrosis (por ejemplo, pulmón, hígado o riñon) en al menos alrededor de un 10%, al menos alrededor de un 15%, al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 25%, al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 35%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 45% o al menos alrededor de un 50% o más, en comparación con el nivel de deterioro basal de la función del órgano en el individuo antes del tratamiento o en comparación con la velocidad de deterioro de la función del órgano que hubiera sido experimentada por el individuo en ausencia del tratamiento.

Los métodos para medir la extensión de la fibrosis en un órgano dado, y los métodos para medir la función de cualquier órgano dado, son bien conocidos en el arte . i. Fibrosis Pulmonar Idiopática Se proporciona métodos para tratar la fibrosis pulmonar idiopática (FPI) . Los métodos generalmente involucran la administración de una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas en una formulación de dosificación oral proporcionada, a un individuo con FPI . En algunos ejemplos, se confirma una diagnosis de FPI mediante el hallazgo de neumonía intersticial usual (NIU) en una evaluación histopatológica de tejido pulmonar obtenido por biopsia quirúrgica. Los criterios para el diagnóstico de FPI son conocidos. Ryu y cois. (1998) Mayo Clin. Proc . 73:1085-1101. En otros ejemplos, el diagnóstico de FPI es un diagnóstico de FPI definido o probable realizado mediante tomografía computada de alta resolución (HRCT por su sigla en inglés) . En un diagnóstico por HRCT, se nota la presencia de las siguientes características: (1) presencia de anormalidad reticular y/o bronquiectasis por tracción con predominancia basal y periférica; (2) presencia de formación de panal con predominancia basal y periférica; y (3) ausencia de características atípicas tales como micronódulos , nodulos peribroncovasculares , consolidación, quistes aislados (sin forma de panal) , atenuación tipo vidrio molido (o, si está presente, es menos extensa que una opacidad reticular) , y adenopatía mediastínica (o, si está presente, no es suficientemente extensa como para ser visible en una radiografía de pecho) . Un diagnóstico de FPI definida se obtiene si se cumplen las características (1), (2) y (3) . Un diagnóstico de FPI probable se obtiene si se cumplen las características (1) y (3) . En algunos ejemplos, una "cantidad efectiva" de un polipéptido de IFN- resistente a proteasas es una dosis que es efectiva para disminuir la progresión de la enfermedad en al menos alrededor de un 10%, al menos alrededor de un 15%, al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 25%, al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 35%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 45%, al menos alrededor de un 50%, al menos alrededor de un 55%, al menos alrededor de un 60%, al menos alrededor de un 65%, al menos alrededor de un 70% o más, en comparación con un control de placebo o un control no tratado. La progresión de la enfermedad es la ocurrencia de uno o más de los siguientes: (1) una disminución de un 10% o más en la FVC; (2) un aumento en el gradiente A-a de 5 mmHg o mayor; (3) una disminución de 15% o más en la DLc en respiración única; Se determina si ha ocurrido una progresión en la enfermedad midiendo uno o más de estos parámetros en dos oportunidades consecutivas separadas por 4 a 14 semanas, y comparando el valor con la línea de base. De esta forma, por ejemplo, mientras un individuo no tratado o tratado con placebo exhibe un 50% de disminución en la FVC a lo largo de un período de tiempo, un individuo al que se le administra una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas exhibe una disminución en la FVC de 45%, alrededor de 42%, alrededor de 40%, alrededor de 37%, alrededor de 35%, alrededor de 32%, alrededor de 30% o menos, durante el mismo período. En algunos ejemplos, una "cantidad efectiva" de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas es una dosificación que es efectiva para aumentar el tiempo de supervivencia sin progresión, por ejemplo, el tiempo desde una línea de base (por ejemplo, un punto temporal entre 1 y 28 días antes de comenzar el tratamiento) hasta que sobreviene la muerte o que aumenta la progresión de la enfermedad en al menos alrededor de un 10%, al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 25%, al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 50%, al menos alrededor de un 60%, al menos alrededor de un 70%, al menos alrededor de un 80%, al menos alrededor de un 90%, al menos alrededor dos veces, al menos alrededor de tres veces, al menos alrededor de 4 veces, al menos alrededor de 5 veces o más, en comparación con un individuo de control tratado con placebo o no tratado. De esta forma, por ejemplo, en algunos ejemplos, una "cantidad efectiva" de un polipéptido de IFN-OÍ resistente a proteasas es una dosificación que es efectiva para aumentar el tiempo de supervivencia sin progresión en al menos alrededor de 1 semana, al menos alrededor de 2 semanas, al menos alrededor de 3 semanas, al menos alrededor de 4 semanas, al menos alrededor de 2 meses, al menos alrededor de 3 meses, al menos alrededor de 4 meses, al menos alrededor de 5 meses, al menos alrededor de 6 meses, al menos alrededor de 8 meses, al menos alrededor de 10 meses, al menos alrededor de 12 meses, al menos alrededor de 18 meses, al menos alrededor de 2 años, al menos alrededor de 3 años o m s, en comparación con un individuo tratado con placebo o no tratado. En algunos ejemplos, una "cantidad efectiva" de un polipéptido de IFN- resistente a proteasas es una dosificación que es efectiva para aumentar al menos un parámetro de la función pulmonar, por ejemplo, una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas aumenta al menos un parámetro de la función pulmonar en al menos alrededor de un 10%, al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 25%, al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 50%, al menos alrededor de un 60%, al menos alrededor de un 70%, al menos alrededor de un 80%, al menos alrededor de un 90%, al menos alrededor dos veces, al menos alrededor de tres veces, al menos alrededor de 4 veces, al menos alrededor de 5 veces o más, en comparación con un individuo de control tratado con placebo o no tratado. En algunos de estos ejemplos, la comparación de si un parámetro de la función pulmonar es aumentado se hace comparando el valor de la línea de base con el valor en cualquier punto temporal después del comienzo del tratamiento, por ejemplo, 48 semanas después del comienzo del tratamiento, o entre dos puntos temporales, por ejemplo, entre alrededor de 4 y alrededor de 14 semanas de separación, después del comienzo del tratamiento. En algunos ejemplos, una "cantidad efectiva" de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas es una dosis que es efectiva para aumentar la FVC en al menos alrededor de un 10%, al menos alrededor de un 15%, al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 25%, al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 50%, al menos alrededor de un 60%, al menos alrededor de un 70%, al menos alrededor de un 80%, al menos alrededor de un 90%, al menos alrededor de 2 veces, al menos alrededor de 3 veces, al menos alrededor de 4 veces, al menos alrededor de 5 veces o más, en comparación con la línea de base en dos oportunidades consecutivas separadas por entre 4 a 14 semanas . En algunos de estos ejemplos, una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas es una dosis que da como resultado una disminución en el gradiente alveolar : arterial (A-a) de al menos alrededor de 5 mmHg, al menos alrededor de 7 mmHg, al menos alrededor de 10 mmHg, al menos alrededor de 12 mmHg, al menos alrededor de 15 mmHg o más, en comparación con la línea de base.

En algunos de estos ejemplos, una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas es una dosis que aumenta la DLco en respiración única en al menos alrededor de un 15%, al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 50%, al menos alrededor de un 60%, al menos alrededor de un 70%, al menos alrededor de un 80%, al menos alrededor de un 90%, al menos alrededor de 2 veces, al menos alrededor de 3 veces, al menos alrededor de 4 veces, al menos alrededor de 5 veces o más, en comparación con la línea de base. La DLco es la capacidad difusiva pulmonar para monóxido de carbono, y se expresa en mL CO/mmHg/ segundo . Los parámetros de la función pulmonar incluyen, pero no están limitados a, la capacidad vital forzada (FVC, según su sigla en inglés) ; volumen espiratorio forzado (FEVi) ; capacidad pulmonar total; presión parcial de oxígeno arterial en reposo; presión parcial de oxígeno arterial en esfuerzo máximo. La función pulmonar puede medirse usando cualquier método conocido, incluyendo, pero no limitándose a, espirometría .

Fibrosis Hepática Se proporciona métodos para tratar la fibrosis hepática, incluyendo la reducción de la fibrosis hepática clínica, la reducción de la probabilidad de ocurrencia de fibrosis hepática y la reducción de un parámetro asociado con fibrosis hepática. Los métodos generalmente involucran la administración de una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN- resistente a proteasas en una formulación de dosificación oral proporcionada, a un individuo con necesidad del mismo. Es de interés particular en muchos ejemplos el tratamiento de humanos . La fibrosis hepática es un precursor de las complicaciones asociadas con la cirrosis hepática, tales como hipertensión portal, insuficiencia hepática progresiva y carcinoma hepatocelular . De esta forma, una reducción de la fibrosis hepática reduce la incidencia de tales complicaciones. De acuerdo a lo anterior, se proporciona métodos para reducir la probabilidad de que un individuo desarrolle complicaciones asociadas con la cirrosis hepática. Los presentes métodos generalmente involucran la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas en una formulación de dosificación oral. En algunos ejemplos, una "cantidad efectiva" de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas es una cantidad que es efectiva para reducir la fibrosis hepática o reducir la velocidad de progresión de la fibrosis hepática; y/o que es efectiva para reducir la probabilidad de que un individuo desarrolle fibrosis hepática; y/o que es efectiva para reducir un parámetro asociado con fibrosis hepática; y/o que es efectiva para reducir un desorden asociado con cirrosis hepática. Se proporciona métodos para el tratamiento de la fibrosis hepática en un individuo mediante la administración a un sujeto de una cantidad de polipéptido de IFN-a resistente a proteasas que es efectiva para la profilaxis o la terapia de la fibrosis hepática en el individuo, por ejemplo, aumentando la probabilidad de supervivencia, reduciendo el riesgo de muerte, mejorando la carga de la enfermedad o retardando la progresión de la enfermedad en el individuo. Se determina si el tratamiento con un polipéptido de IFN-OÍ resistente a proteasas es efectivo para reducir la fibrosis hepática a través de una variedad de técnicas bien establecidas para medir la fibrosis hepática y la función hepática. Se determina si se reduce la fibrosis hepática mediante el análisis de una muestra de biopsia hepática. Un análisis de una biopsia hepática incluye la evaluación de dos componentes principales: la necroinflamación, evaluada según su "grado" como medida de la severidad y de la actividad del desarrollo de la enfermedad, y las lesiones de fibrosis y remodelación parenquimal o vascular, evaluadas según su "fase" como reflejo de la progresión a largo plazo de la enfermedad. Véase, por ejemplo, Brunt (2000) Hepatol . 31:241-246; y METAVIR (1994) Hepatology 20:15-20. Basándose en los análisis de la biopsia hepática, se asigna un puntaje. Existe un variado número de sistemas de estandarización de puntaje que proporcionan una evaluación cuantitativa del grado y la severidad de la fibrosis. Estos incluyen los sistemas de puntuación METAVIR, Knodell, Scheuer, Ludwig e Ishak. El sistema de puntuación METAVIR está basado en un análisis de varias características de una biopsia hepática, incluyendo fibrosis (fibrosis portal, fibrosis centrilobular y cirrosis) ; necrosis (necrosis por sector y lobular, retracción acidofílica y degeneración globular) ; inflamación (inflamación del tracto portal, agregados linfoides portales y distribución de la inflamación portal) ; cambios en las vías biliares; y el índice Knodell (puntuaciones de necrosis periportal, necrosis lobular, inflamación portal, fibrosis, y actividad de enfermedad global) . Las definiciones de cada fase en el sistema METAVIR son como sigue: puntuación: 0, sin fibrosis; puntuación: 1, agrandamiento estrellado del tracto portal, pero sin formación de septa; puntuación: 2, agrandamiento del tracto portal con formación rara de septa; puntuación: 3, numerosos septa sin cirrosis; y puntuación: 4, cirrosis. El sistema de puntuación de Knodell, también llamado índice de Actividad de Hepatitis, clasifica los especímenes en base a puntuaciones en cuatro categorías de características histológicas: I. Necrosis periportal y/o necrosis en puente; II. Degeneración intralobular y necrosis focal; III. Inflamación portal: y IV. Fibrosis. En el sistema de fases de Knodell, las puntuaciones son como se expone a continuación: puntuación: 0, sin fibrosis; puntuación: 1, fibrosis ligera (expansión portal fibrosa); puntuación: 2, fibrosis moderada; puntuación: 3, fibrosis severa (fibrosis en puente); y puntuación: 4, cirrosis. Cuanto más alta es la puntuación, más severo es el daño en el tejido hepático. Knodell (1981) Hepatol . 1:431. En el sistema de puntuaciones de Scheuer, las puntuaciones son como se expone a continuación: puntuación: 0, sin fibrosis; puntuación: 1, tractos portales agrandados y fibróticos; puntuación: 2, septa periportales o portal-portal, pero arquitectura intacta; puntuación: 3, fibrosis con distorsión de arquitectura, pero sin cirrosis obvia; puntuación: 4, cirrosis probable o definida. Scheuer (1991) J. Hepatol . 13:372. El sistema de puntuación de Ishak se describe en Ishak (1995) J". Hepatol. 22:696-699. Fase 0, Sin fibrosis; Fase 1, Expansión fibrosa de algunas áreas portales, con o sin septa fibrosos cortos; Fase 2, Expansión fibrosa de la mayoría de las áreas portales, con o sin septa fibrosos cortos; Fase 3, Expansión fibrosa de la mayoría de las áreas portales con puentes portal-portal (P-P) ocasionales; Fase 4, Expansión fibrosa de áreas portales con puentes marcados (P-P) , así como puentes portal-central (P-C) ; Fase 5, Puentes marcados (P-P y/o P-C) con nodulos ocasionales (cirrosis incompleta) ; Fase 6, Cirrosis, probable o definida. El beneficio de la terapia anti- fibrótica también puede medirse y evaluarse usando el sistema de puntuación de Child-Pugh, el cual es un sistema de puntos multicomponente basado en las anormalidades en el nivel de bilirrubina en el suero, el nivel de albúmina en el suero, el tiempo de protrombina, la presencia y severidad de ascitis y la presencia y severidad de encefalopatía. En base a la presencia y severidad de anormalidades en estos parámetros, los pacientes pueden ser colocados en una de tres categorías de severidad creciente de la enfermedad clínica: A, B o C. En algunos ejemplos, una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas es una cantidad que produce un cambio de una unidad o más en la fase de fibrosis, basada en biopsias hepáticas pre- y post-terapia . En ejemplos particulares, una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas reduce la fibrosis hepática en al menos una unidad en el sistema de puntuación METAVIR, Knodell, Scheuer, Ludwig o Ishak. Los índices de función hepática secundarios, o indirectos, también pueden ser utilizados para evaluar la eficacia del tratamiento con un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas. También puede medirse una evaluación morfométrica semi-automatizada computacional del grado cuantitativo de fibrosis hepática en base a tinciones específicas de colágeno y/o marcadores séricos de fibrosis hepática, como indicación de la eficacia de un método de tratamiento en un sujeto. Los índices secundarios de función hepática incluyen, pero no están limitados a, niveles de transaminasa sérica, tiempo de protrombina, bilirrubina, recuento de plaquetas, presión portal, nivel de albúmina y evaluación de la puntuación de Child-Pugh. En otro ejemplo, una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas es una cantidad que es efectiva para aumentar un índice de función hepática en al menos alrededor de un 10%, al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 25%, al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 35%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 45%, al menos alrededor de un 50%, al menos alrededor de un 55%, al menos alrededor de un 60%, al menos alrededor de un 65%, al menos alrededor de un 70%, al menos alrededor de un 75%, al menos alrededor de un 80% o más, en comparación con el índice de función hepática de un individuo no tratado o un individuo tratado con placebo. Aquéllos con experiencia en el arte pueden medir fácilmente tales índices de función hepática, usando métodos de ensayo estándar, muchos de los cuales están disponibles en el comercio y se utilizan rutinariamente en ensayos clínicos. También puede medirse marcadores séricos de fibrosis hepática como indicación de la eficacia de un método de tratamiento en un sujeto. Los marcadores séricos de fibrosis hepática incluyen, pero no están limitados a, hialuronato, péptido N-terminal de procolágeno III, dominio 7S del colágeno tipo IV, péptido C-terminal de procolágeno I, y laminina. Los marcadores bioquímicos adicionales de fibrosis hepática incluyen alfa-2 -macroglobulina, haptoglobulina, gammaglobulina, apolipoproteína A, y gamma-glutamil-transpeptidasa . En otro ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de IFN- resistente a proteasas es una cantidad que es efectiva para reducir un nivel sérico de fibrosis hepática en al menos alrededor de un 10%, al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 25%, al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 35%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 45%, al menos alrededor de un 50%, al menos alrededor de un 55%, al menos alrededor de un 60%, al menos alrededor de un 65%, al menos alrededor de un 70%, al menos alrededor de un 75%, al menos alrededor de un 80% o más, en comparación con el nivel del marcador en un individuo no tratado o un individuo tratado con placebo. Aquéllos con experiencia en el arte pueden medir fácilmente tales marcadores séricos de fibrosis hepática, usando métodos de ensayo estándar, muchos de los cuales están disponibles en el comercio y se utilizan rutinariamente en ensayos clínicos. Los métodos para medir marcadores séricos incluyen métodos inmunológicos , por ejemplo, ensayos de inmunosorción unidos con enzimas (ELISA) , radioinmunoensayos , uso de anticuerpos específicos contra un marcador sérico dado. También puede emplearse ensayos cuantitativos de la reserva funcional hepática para evaluar la eficacia del tratamiento con un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas . Estos incluyen: eliminación (clearance) de verde de indocianina (IGC) , capacidad de eliminación de galactosa (GEC) , ensayo de respiración con aminopirina (ABT) , eliminación (clearance) de antipirina, eliminación (clearance) de monoetilglicina-xilididuro (MEG-X) y eliminación (clearance) de cafeína. Cuando se utiliza en este documento, una "complicación asociada con cirrosis hepática" se refiere a un desorden que es una secuela de una enfermedad hepática descompensada, es decir, que ocurre posteriormente y es un resultado de la fibrosis hepática, e incluye, pero no está limitada a, desarrollo de ascitis, sangrado varicoso, hipertensión portal, ictericia, insuficiencia hepática progresiva, encefalopatía, carcinoma hepatocelular, falla hepática que requiere transplante hepático, y mortalidad relacionada con el hígado. En otro ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas es una cantidad que es efectiva para reducir la incidencia (es decir, la probabilidad de que un individuo desarrolle) de un desorden asociado con cirrosis hepática en al menos alrededor de un 10%, al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 25%, al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 35%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 45%, al menos alrededor de un 50%, al menos alrededor de un 55%, al menos alrededor de un 60%, al menos alrededor de un 65%, al menos alrededor de un 70%, al menos alrededor de un 75%, al menos alrededor de un 80% o más, en comparación con un individuo no tratado o un individuo tratado con placebo . Aquéllos con experiencia en el arte pueden determinar fácilmente si la terapia con un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas es efectiva para reducir la incidencia de un desorden asociado con cirrosis hepática. La reducción de la fibrosis hepática aumenta la función hepática. De esta forma, se proporciona métodos para aumentar la función hepática que involucran generalmente la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas . Las funciones hepáticas incluyen, pero no están limitadas a, síntesis de proteínas tales como proteínas séricas (por ejemplo, albúmina, factores de coagulación, fosfatasa alcalina, aminotransferasas (por ejemplo, alanina-transaminasa, aspartato-transaminasa) , 5 ' -nucleosidasa, gamma-glutamil-transpeptidasa, etc.), síntesis de bilirrubina, síntesis de colesterol y síntesis de ácidos biliares; una función hepática metabólica, incluyendo, pero no limitándose a, metabolismo de los carbohidratos, metabolismo de los aminoácidos y del amoníaco, metabolismo hormonal y metabolismo lipídico; detoxificación de drogas exógenas; una función hemodinámica, incluyendo hemodinámica esplácnica y portal . Aquéllos con experiencia en el arte pueden evaluar fácilmente si una función hepática está aumentada, por medio de ensayos bien establecidos de la función hepática. De esta forma, la síntesis de marcadores de la función hepática, tales como albúmina, fosfatasa alcalina, alanina-transaminasa, aspartato-transaminasa y bilirrubina, puede ser evaluada midiendo el nivel de estos marcadores en el suero, usando ensayos inmunológicos y enzimáticos estándar. La circulación esplácnica y la hemodinámica portal pueden ser medidas mediante presión de enclavamiento y/o resistencia portal usando métodos estándar. Las funciones metabólicas pueden medirse a través de la medición del nivel de amoniaco en el suero. Puede determinarse si las proteínas séricas secretadas normalmente por el hígado están en un rango normal midiendo los niveles de tales proteínas, usando ensayos inmunológicos y enzimáticos estándar. Aquéllos con experiencia en el arte conocen los intervalos normales para tales proteínas séricas. Los siguientes son ejemplos no limitantes. El intervalo normal para alanina-transaminasa está entre alrededor de 7 y alrededor de 56 unidades por litro de suero. El intervalo normal para aspartato-transaminasa está entre alrededor de 5 y alrededor de 40 unidades por litro de suero. La bilirrubina se mide usando ensayos estándar. Los niveles normales de bilirrubina son usualmente menores que alrededor de 1,2 mg/dL. Los niveles de albúmina de suero se miden usando ensayos estándar. Los niveles normales de la albúmina de suero están en el intervalo entre alrededor de 35 y alrededor de 55 g/L. La prolongación del tiempo de protrombina se mide usando ensayos estándar. El tiempo de protrombina normal es menor que alrededor de 4 segundos más largo que el control. En otro ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de IFN- resistente a proteasas es una cantidad que es efectiva para aumentar la función hepática en al menos alrededor de 10%, al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80% o más. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de IFN-OÍ resistente a proteasas es una cantidad que es efectiva para reducir un nivel elevado de un marcador sérico de la función hepática en al menos alrededor de 10%, al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80% o más, o de reducir el nivel del marcador sérico de la función hepática hasta dentro de un intervalo normal . Una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas también es una cantidad que es efectiva para aumentar un nivel reducido de un marcador sérico de la función hepática en al menos alrededor de 10%, al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80% o más, o de aumentar el nivel del marcador sérico de la función hepática hasta dentro de un intervalo normal . iii. Fibrosis Renal Se proporciona los presentes métodos para el tratamiento de la fibrosis renal. Los métodos generalmente involucran la administración de una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas en una formulación de dosificación oral, a un individuo con fibrosis renal o con riesgo de desarrollar fibrosis renal. En algunos ejemplos, una "cantidad efectiva" de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas es una cantidad efectiva para reducir la fibrosis renal; y/o que es efectiva para reducir la probabilidad de que un individuo desarrolle fibrosis renal; y/o que es efectiva para reducir un parámetro asociado con fibrosis renal; y/o que es efectiva para reducir un desorden asociado con fibrosis del riñon.

En un ejemplo, una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN-OÍ resistente a proteasas es una cantidad que es suficiente para reducir la fibrosis renal o reducir la velocidad de progresión de la fibrosis renal en al menos alrededor de un 10%, al menos alrededor de un 15%, al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 25%, al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 35%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 45% o al menos alrededor de un 50% en comparación con el grado de fibrosis renal en el individuo antes del tratamiento o en comparación con la velocidad de progresión de la fibrosis renal que hubiera sido experimentada por el paciente en ausencia del tratamiento. Se determina si la fibrosis se ha reducido en el riñon usando cualquier método conocido. Por ejemplo, se realiza un análisis histoquímico de muestras de biopsia de riñon para evaluar la extensión de la deposición de matriz extracelular (ECM) y/o de la fibrosis. Se conoce otros métodos en el arte. Véase, por ejemplo, Masseroli y cois. (1998) Lab. Invest. 78:511-522; Patente de los Estados Unidos No. 6.214.542. En algunos ejemplos, una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas es una cantidad que es efectiva para aumentar la función renal en al menos alrededor de 10%, al menos alrededor de 15%, al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 25%, al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 35%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 45%, al menos alrededor de 50%, en comparación con el nivel basal de función renal en el individuo antes del tratamiento. En algunos ejemplos, una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas es una cantidad que es efectiva para retardar la declinación en la función renal en al menos alrededor de 10%, al menos alrededor de 15%, al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 25%, al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 35%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 45%, al menos alrededor de 50%, en comparación con la declinación en la función renal que ocurriría en ausencia del tratamiento. La función renal puede medirse usando cualquier ensayo conocido, incluyendo, pero no limitándose a, nivel de creatinina plasmática (donde los niveles normales están generalmente dentro de un intervalo entre alrededor de 0,6 y alrededor de 1,2 mg/dL) ; eliminación (clearance) de creatinina (donde el intervalo normal para la eliminación de creatinina está entre alrededor de 87 y alrededor de 137 mL/minuto en hombres, y entre alrededor de 88 y alrededor de 128 mL/minuto en mujeres) ; la velocidad de filtración glomerular (calculada u obtenida ya sea mediante eliminación (clearance) de inulina u otros métodos) , nitrógeno ureico en la sangre (donde el intervalo normal está entre alrededor de 7 y alrededor de 20 mg/dL) ; y niveles de proteína en la orina. b. Cáncer Se proporciona métodos para tratar un desorden proliferativo (por ejemplo, cáncer) , en donde el método generalmente involucra la administración de una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas en una formulación de dosificación oral provista a un individuo que lo necesita, en donde el polipéptido de IFN-OÍ resistente a proteasas particular se prepara como se describió anteriormente. Los métodos son efectivos para reducir la velocidad de crecimiento de un tumor en al menos alrededor de 5%, al menos alrededor de 10%, al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 25%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 75%, al menos alrededor de 85% o al menos alrededor de 90%, hasta una inhibición total del crecimiento del tumor, en comparación con un control apropiado. De esta forma, en estos ejemplos, una "cantidad efectiva" de un polipéptido de IFN-OÍ resistente a proteasas es una cantidad suficiente para reducir la velocidad de crecimiento de un tumor en al menos alrededor de 5%, al menos alrededor de 10%, al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 25%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 75%, al menos alrededor de 85% o al menos alrededor de 90%, hasta una inhibición total del crecimiento del tumor, en comparación con un control apropiado. En un sistema experimental animal, un control apropiado puede ser un animal genéticamente idéntico no tratado con la formulación de dosificación oral del polipéptido de IFN-a resistente a proteasas. En sistemas no experimentales, un control apropiado puede ser la carga tumoral presente antes de administrar la forma de dosificación del polipéptido de IFN-a resistente a proteasas. Otros controles apropiados pueden ser controles de placebo. Se puede determinar si el crecimiento de un tumor es inhibido usando cualquier método conocido, incluyendo, pero no limitándose a, un ensayo de proliferación en donde se mide el número de células en un cultivo celular in vitro después de un período de tiempo, en donde las células son cultivadas en presencia o en ausencia de la composición, y un ensayo de captación de 3H-timidina. Los métodos son útiles para tratar una amplia variedad de cánceres, incluyendo carcinomas, sarcomas, leucemias y linfornas. Los carcinomas que pueden ser tratados usando un método de la invención incluyen, pero no están limitados a, carcinoma esofágico, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células básales (una forma de cáncer de piel) , carcinoma de células escamosas (de varios tejidos), carcinoma de vejiga, incluyendo carcinoma de células transicionales (un neoplasma maligno de la vejiga) , carcinoma broncogénico, carcinoma de colon, carcinoma colorrectal, carcinoma gástrico, carcinoma pulmonar, incluyendo carcinoma pulmonar de células pequeñas y carcinoma pulmonar sin células pequeñas, carcinoma adrenocortical , carcinoma de tiroides, carcinoma pancreático, carcinoma de mama, carcinoma ovárico, carcinoma de próstata, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma de células renales, carcinoma ductal in situ o carcinoma de vías biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, carcinoma cervical, carcinoma uterino, carcinoma testicular, carcinoma osteogénico, carcinoma epitelial, carcinoma nasofaríngeo, etc. Los sarcomas que pueden ser tratados usando un método de la invención incluyen, pero no están limitados a, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, cordoma, sarcoma osteogénico, osteosarcoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, sarcoma de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma y otros sarcomas de tejidos blandos. Otros tumores sólidos que pueden ser tratados usando un método de la invención incluyen, pero no están limitados a, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringeoma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma . Las leucemias que pueden ser tratadas usando un método de la invención incluyen, pero no están limitadas a, a) síndromes mieloproliferativos crónicos (desórdenes neoplásicos de células troncales hematopoyéticas multipotenciales) ; b) leucemias mielógenas agudas (transformación neoplásica de una célula troncal hematopoyética multipotencial o de un linaje de células hematopoyéticas de potencial restringido; c) leucemias linfocíticas crónicas (CLL, por su sigla en inglés; proliferación clónica de pequeños linfocitos inmunológicamente inmaduros y funcionalmente incompetentes) , incluyendo leucemia CLL de células B, leucemia CLL prolinfocítica de células T, y leucemia de tricoleucocitos ; y d) leucemias linfoblásticas agudas (caracterizadas por acumulación de linfoblastos ) . Los linfornas que pueden ser tratados usando un método de la invención incluyen, pero no están limitadas a, linfornas de células B (por ejemplo, linforna de Burkitt) y linforna de Hodgkin. c. Infecciones Virales Se proporciona métodos para tratar una infección viral y métodos para reducir una carga viral o reducir el tiempo hasta la eliminación viral, o reducir la morbilidad o mortalidad en los resultados clínicos, en pacientes que sufren de una infección viral. Se proporciona métodos para reducir el riesgo de que un individuo desarrolle una infección viral patológica que tenga secuelas clínicas. Estos métodos generalmente involucran administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas para el tratamiento de una infección viral, en donde el polipéptido de IFN-a resistente a proteasas se prepara como se describe más arriba. En algunos ejemplos, el polipéptido de IFN-a puede ser administrado de forma profiláctica. Cuando un método de tratamiento de la invención es profiláctico, los métodos reducen el riesgo de que un individuo desarrolle infecciones patológicas con un virus. Una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas en una formulación de dosificación oral es una cantidad que reduce el riesgo o reduce la probabilidad de que un individuo desarrolle una infección patológica con un virus. Por ejemplo, una cantidad efectiva reduce el riesgo de que un individuo desarrolle una infección patológica en al menos alrededor de un 10%, al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 25%, al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 35%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 50%, al menos alrededor de un 60%, al menos alrededor de un 70%, al menos alrededor de un 80%, al menos alrededor de un 90% o más, en comparación con el riesgo de desarrollar una infección patológica con el virus en ausencia del tratamiento con una formulación de dosificación oral de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas.

En algunos ejemplos, una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas en una formulación de dosificación oral es una cantidad que reduce la carga viral en al menos alrededor de un 10%, al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 25%, al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 35%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 50%, al menos alrededor de un 60%, al menos alrededor de un 70%, al menos alrededor de un 80%, al menos alrededor de un 90% o más, en comparación con la carga viral en ausencia del tratamiento con una formulación de dosificación oral de un polipéptido de IFN-OÍ resistente a proteasas. En algunos ejemplos, una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas en una formulación de dosificación oral es una cantidad que reduce el tiempo hasta la eliminación del virus en al menos alrededor de un 10%, al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 25%, al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 35%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 50%, al menos alrededor de un 60%, al menos alrededor de un 70%, al menos alrededor de un 80%, al menos alrededor de un 90% o más, en comparación con el tiempo hasta la eliminación del virus en ausencia del tratamiento.

En algunos ejemplos, una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas en una formulación de dosificación oral es una cantidad que reduce la morbilidad o mortalidad debida a una infección viral en al menos alrededor de un 10%, al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 25%, al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 35%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 50%, al menos alrededor de un 60%, al menos alrededor de un 70%, al menos alrededor de un 80%, al menos alrededor de un 90% o más, en comparación con la morbilidad o mortalidad en ausencia del tratamiento . Alguien con experiencia en el arte puede determinar fácilmente si un método de tratamiento de la invención es efectivo para reducir el riesgo de una infección viral patológica, reducir la carga viral, reducir el tiempo hasta la eliminación del virus o reducir la morbilidad o mortalidad debida a una infección viral. La carga viral puede medirse fácilmente midiendo el título o nivel del virus en el suero. El número de virus en el suero puede ser determinado usando cualquier ensayo conocido, incluyendo, por ejemplo, un ensayo de reacción en cadena de polimerasa usando partidores de oligonucleótidos específicos para el virus que se está determinando. Puede determinarse si la morbilidad es reducida midiendo cualquier síntoma asociado con una infección viral, incluyendo, por ejemplo, fiebre, síntomas respiratorios (por ejemplo, tos, facilidad o dificultad para respirar) . En algunos ejemplos, se proporciona métodos para reducir la carga viral y/o reducir el tiempo hasta la eliminación del virus y/o reducir la morbilidad o mortalidad en un individuo que ha estado expuesto a un virus (por ejemplo, un individuo que se ha puesto en contacto con un individuo infectado por un virus) , involucrando dicho método la administración de una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas en una formulación de dosificación oral. En estos ejemplos, se empieza la terapia entre alrededor de 1 hora y alrededor de 14 días después de la exposición, por ejemplo, entre alrededor de 1 hora y alrededor de 24 horas, entre alrededor de 24 horas y alrededor de 48 horas, entre alrededor de 48 horas y alrededor de 3 días, entre alrededor de 3 días y alrededor de 4 días, entre alrededor de 4 días y alrededor de 7 días, entre alrededor de 7 días y alrededor de 10 días, o entre alrededor de 10 días y alrededor de 14 días después de la exposición al virus.

En algunos ejemplos, se proporciona métodos para reducir el riesgo de que un individuo que ha estado expuesto a un virus (por ejemplo, un individuo que se ha puesto en contacto con un individuo infectado por un virus) desarrolle una infección viral patológica con secuelas clínicas, involucrando dicho método la administración de una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas en una formulación de dosificación oral. En estos ejemplos, se empieza la terapia entre alrededor de 1 hora y alrededor de 35 días después de la exposición, por ejemplo, entre alrededor de 1 hora y alrededor de 24 horas, entre alrededor de 24 horas y alrededor de 48 horas, entre alrededor de 48 horas y alrededor de 3 días, entre alrededor de 3 días y alrededor de 4 días, entre alrededor de 4 días y alrededor de 7 días, entre alrededor de 7 días y alrededor de 10 días, entre alrededor de 10 días y alrededor de 14 días, entre alrededor de 14 días y alrededor de 21 días, o entre alrededor de 21 días y alrededor de 35 días después de la exposición al virus. En algunos ejemplos, se proporciona métodos para reducir la carga viral y/o para reducir el tiempo hasta la eliminación del virus y/o para reducir la morbilidad o mortalidad en un individuo que puede o no haber sido infectado con un virus, y que ha estado expuesto a un virus. En algunos de estos ejemplos, los métodos involucran la administración de una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN-OÍ resistente a proteasas en una formulación de dosificación oral dentro de las primeras 24 horas después de la exposición al virus. En algunos ejemplos, se proporciona métodos para reducir la carga viral y/o para reducir el tiempo hasta la eliminación del virus y/o para reducir la morbilidad o mortalidad en un individuo que no ha sido infectado con un virus, y que ha estado expuesto a un virus. En algunos de estos ejemplos, los métodos involucran la administración de una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas en una formulación de dosificación oral dentro de las primeras 48 horas después de la exposición al virus. En otros ejemplos, los métodos involucran la administración de un polipéptido de IFN-OÍ resistente a proteasas en una formulación de dosificación oral más de 48 horas después de la exposición al virus, por ejemplo, entre alrededor de 72 horas y alrededor de 35 días, por ejemplo, después de 72 horas, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días después de la exposición, o entre alrededor de 7 días y alrededor de 10 días, entre alrededor de 10 días y alrededor de 14 días, entre alrededor de 14 días y alrededor de 17 días, entre alrededor de 17 días y alrededor de 21 días, entre alrededor de 21 días y alrededor de 25 días, entre alrededor de 25 días y alrededor de 30 días, o entre alrededor de 30 días y alrededor de 35 días después de la exposición al virus.

En algunos ejemplos, se proporciona métodos para reducir el riesgo de que un individuo que ha estado expuesto a un virus desarrolle una infección viral patológica con secuelas clínicas. En algunos de estos ejemplos, los métodos involucran la administración de una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas en una formulación de dosificación oral dentro de las primeras 24 horas después de la exposición al virus. En algunos ejemplos, se proporciona métodos para reducir el riesgo de que un individuo que ha estado expuesto a un virus (por ejemplo, un individuo que se ha puesto en contacto con un individuo infectado por un virus) desarrolle una infección viral patológica con secuelas clínicas. En algunos de estos ejemplos, los métodos involucran la administración de una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas en una formulación de dosificación oral dentro de las primeras 48 horas después de la exposición al virus. i. Infección por Virus de la Hepatitis La hepatitis C es un ejemplo de las infecciones virales que pueden ser tratadas mediante la administración de IFN-a. Se proporciona métodos para tratar una infección por virus de la hepatitis. En ejemplos particulares, se proporciona métodos para tratar una infección por virus de la hepatitis C (VHC) ; métodos para reducir la incidencia de complicaciones asociadas a VHC y cirrosis del hígado; y métodos para reducir una carga viral o reducir el tiempo hasta la eliminación viral, o reducir la morbilidad o mortalidad en los resultados clínicos, en pacientes que sufren de una infección por VHC. Los métodos generalmente involucran la administración de una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN- resistente a proteasas en una formulación de dosificación oral, a un individuo. Los métodos disminuyen la carga viral en el individuo, y logran una respuesta viral sostenida. Opcionalmente , el método de la invención proporciona adicionalmente una cantidad efectiva de un análogo nucleosídico, tal como ribavirina, levovirina, isatoribina y viramidina. Es de interés particular en muchos ejemplos el tratamiento de humanos.

Puede determinarse si un método es efectivo para tratar una infección por VHC, por ejemplo, midiendo la carga viral, o midiendo un parámetro asociado con la infección por VHC, incluyendo, pero no limitándose a, fibrosis hepática, elevación de los niveles de transaminasas séricas, y actividad necroinflamatoria en el hígado. Los indicadores de fibrosis hepática se discuten más abajo en detalle. La carga viral puede medirse midiendo el título o nivel del virus en el suero. Estos métodos incluyen, pero no están limitados a, una reacción en cadena de polimerasa (PCR) cuantitativa y un ensayo de ADN ramificado (bADN) . Se ha desarrollado ensayos para medir la carga (título) viral de ARN de VHC. Muchos de tales ensayos están disponibles comercialmente , incluyendo una PCR cuantitativa de transcripción reversa (RT-PCR) (Monitor de VHC Amplicor (M.R.), Roche Molecular Systems, Nueva Jersey); y un ensayo de amplificación de señal de ADN (ácido desoxirribonucleico) ramificado (Ensayo de ARN de VHC (bADN) Quantiplex (M.R.), Chiron Corp., Emeryville, California) . Véase, por ejemplo, Gretch y cois. (1995) Ann. Intern. Med. 123:321-329. También es de interés un ensayo de ácidos nucleicos (NAT, por su sigla en inglés), desarrollado por Gen-Probe Inc. (San Diego) y Chiron Corporation, y distribuido por Chiron Corporation bajo la denominación de marca Procleix.RTM. , en donde NAT evalúa simultáneamente la presencia de VIH-1 y VHC. Véase, por ejemplo, Vargo y cois. (2002) Transfusión 42:876-885. En general, una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas en una formulación de dosificación oral es una cantidad que es efectiva para reducir la carga viral hasta niveles indetectables , por ejemplo, hasta menos de alrededor de 5000, menos de alrededor de 1000, menos de alrededor de 500 o menos de alrededor de 200 copias genómicas/mL de suero. En algunos ejemplos, una cantidad efectiva de un agente de la invención es una cantidad que es efectiva para reducir la carga viral hasta menos de 100 copias genómicas/mL de suero. En muchos ejemplos, los métodos proporcionados logran una respuesta viral sostenida, por ejemplo, la carga viral se reduce hasta niveles indetectables durante un período de al menos alrededor de un mes, al menos alrededor de dos meses, al menos alrededor de tres meses, al menos alrededor de cuatro meses, al menos alrededor de cinco meses, o al menos alrededor de seis meses después del término del tratamiento. Puede determinarse si un método de la invención es efectivo para tratar una infección por VHC midiendo un parámetro asociado con la infección por VHC, tal como fibrosis hepática. Los métodos para determinar la extensión de la fibrosis hepática se discuten en detalle más abajo. En algunos ejemplos, el nivel de un marcador sérico de fibrosis hepática indica el grado de fibrosis hepática. Como un ejemplo no limitante, se mide los niveles séricos de aminotransferasa de alanina (ALT) , usando ensayos estándar. En general, un nivel de ALT de menos de alrededor de 45 unidades internacionales es considerado normal. En algunos ejemplos, una cantidad efectiva de un polipéptido de IFN-a resistente a proteasas en una formulación de dosificación oral para el tratamiento de una infección por VHC es una cantidad efectiva para reducir los niveles de ALT hasta menos de 45 U/mL de suero. 2. Métodos de Tratamiento Usando Hormona del Crecimiento En un ejemplo, la formulación de dosificación oral de un polipéptido resistente a proteasas se administra a un paciente que tiene una enfermedad, desorden o condición que puede ser tratado mediante la administración de un polipéptido de hormona del crecimiento (GH) . Típicamente, las formulaciones de dosificación oral de los polipéptidos de GH resistentes a proteasas proporcionadas en este documento, se administran por vía oral usando una cantidad de GH que es generalmente alrededor de 6-400 veces, tal como 10-100 veces, incluyendo, por ejemplo, 15-50 veces, 20-30 veces, típicamente 15-40 veces más altas por día, que las cantidades administradas por vía subcutánea para la misma indicación que puede ser prevenida o tratada mediante la administración de una proteína terapéutica no modificada en el mismo individuo. Se ha administrado GH nativa para el tratamiento de una deficiencia de hormona del crecimiento a una dosis de alrededor de 0,004-0,016 mg/kg/día mediante inyección subcutánea. Las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de GH resistentes a proteasas proporcionados en este documento son administradas por vía oral usando una cantidad de hormona del crecimiento que es mayor que la dosis de hormona del crecimiento utilizada para administración subcutánea. Típicamente, las formulaciones de dosificación oral de los polipéptidos de hormona del crecimiento resistentes a proteasas proporcionadas en este documento, se administran por vía oral usando una cantidad de hormona del crecimiento que es generalmente alrededor de 6-400 veces, tal como 10-100 veces, incluyendo, por ejemplo, 15-50 veces, 20-30 veces, típicamente 15-40 veces más altas por día, que las cantidades administradas por vía subcutánea para el tratamiento de una deficiencia de hormona del crecimiento usando una proteína terapéutica no modificada en el mismo individuo. Las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de GH resistentes a proteasas proporcionadas en este documento, pueden ser utilizadas para tratamiento de cualquier condición para la cual se emplee GH no modificado. Esta sección proporciona ejemplos de usos de polipéptidos de GH modificados y métodos de administración. Estas terapias descritas son ejemplos y no limitan las aplicaciones de GH. Las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de GH resistentes a proteasas proporcionadas en este documento, están concebidas para ser usadas en varios métodos terapéuticos, así como relacionados a estilo de vida y diagnósticos, en los cuales se usa GH para su tratamiento. Tales métodos incluyen, pero no están limitados a, métodos para tratamiento de condiciones fisiológicas y médicas descritas y listadas más abajo. En virtud de su estabilidad mejorada, los polipéptidos de GH resistentes a proteasas proporcionados en este documento exhiben una mejora en sus actividades correspondientes in vivo y en sus efectos terapéuticos. En particular, las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de GH resistentes a proteasas están concebidas para ser usadas en métodos terapéuticos en los cuales la proteina natural sea usada como tratamiento. El tratamiento de desórdenes puede incluir, pero no está limitado a, desórdenes de deficiencia de crecimiento (incluyendo, pero no limitándose a, síndrome de Turner, retardo de crecimiento intrauterino, corta estatura idiopática, síndrome de Prader Willi, talasemia) , emaciamiento asociado a SIDA, envejecimiento, función inmunitaria dañada en sujetos infectados por VIH, dolencias catabólicas (incluyendo aquéllas asociadas con falla respiratoria y daño por quemaduras) , recuperación quirúrgica, cardiomiopatía congestiva, transplante hepático, regeneración hepática tras hepatectomía, falla renal crónica, osteodistrofia renal, osteoporosis , acondroplasia/hipocondroplasia, displasia esquelética, desórdenes inflamatorios o nutricionales crónicos (tales como enfermedad de Crohn) , síndrome de intestino corto, artritis crónica juvenil, fibrosis quística, infertilidad masculina, raquitismo hipofosfatémico asociado al cromosoma X, síndrome de Down, espina bífida, síndrome de Noonan, obesidad, potencia muscular dañada y fibromialgia . Las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de GH resistentes a proteasas también pueden administrarse en combinación con otras terapias, incluyendo otros compuestos biológicos y moléculas pequeñas. En particular, las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de GH resistentes a proteasas también están concebidas para ser usadas en métodos relacionados con estilo de vida en los cuales la proteína natural sea usada como tratamiento. Las aplicaciones relacionadas con el estilo de vida pueden incluir, pero no están limitadas a, anti-envejecimiento, sarcopenia (enlaciamiento muscular asociado con la edad) , mejora del impulso sexual y/o la libido, mejora de la química y/o metabolismo corporal, aumento en la fuerza y/o masa muscular. Las formulaciones orales de polipéptidos de GH resistentes a proteasas también pueden administrarse en combinación con otras terapias, incluyendo otros compuestos biológicos y moléculas pequeñas. El tratamiento de enfermedades y condiciones con formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de GH resistentes a proteasas puede efectuarse mediante administración oral, usando formulaciones de dosificación oral adecuadas como se describe aquí. Si fuera necesario, una dosificación, duración y protocolo de tratamiento particular pueden ser determinados o extrapolados empíricamente en base a dosificaciones y regímenes empleados para otros modos de administración de GH, tales como inyecciones subcutáneas o intravenosas. Por ejemplo, se puede usar dosis de ejemplo de polipéptidos nativos y recombinantes de GH como punto de partida para determinar dosificaciones apropiadas. Las dosificaciones proporcionadas aguí para tratamientos y terapias con GH y formas recombinantes son dosis de ejemplo. Sin embargo, tales dosis de ejemplo pueden proporcionar una guía para la selección de regímenes de dosificación para formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de GH resistentes a proteasas . Dado que los polipéptidos de GH mutantes proporcionados en este documento exhiben una estabilidad aumentada, los regímenes de dosificación y administración pueden diferir de aquéllos de las hormonas de crecimiento no modificadas. Las dosificaciones y regímenes particulares pueden ser determinados empíricamente. Los niveles de dosificación son aparentes para alguien con experiencia en el arte y pueden determinarse en base a una variedad de factores, tales como peso corporal del individuo, salud general, edad, actividad del compuesto específico que se emplea, sexo, dieta, tiempo de administración, velocidad de excreción, combinación de drogas, severidad y curso de la enfermedad o condición, y la disposición del sujeto hacia la enfermedad/condición y el juicio del médico tratante. La cantidad de ingrediente activo que puede ser combinada con los materiales portadores para producir una forma de dosificación única puede variar dependiendo del sujeto tratado y del modo particular de administración . Después del reestablecimiento de la condición de un sujeto, puede administrarse una dosis de mantenimiento de un compuesto o composición proporcionado en este documento, si es necesario; y puede variarse la dosis, la forma de dosificación, o la frecuencia de administración o una combinación de las mismas. En algunos casos, el sujeto puede requerir un tratamiento intermitente a largo plazo en base a la recurrencia de los síntomas de la enfermedad.

Deficiencias del Crecimiento El crecimiento de un infante hasta un adulto es un proceso complejo que involucra cierto número de genes y hormonas, así como nutrición, dieta, ejercicio y descanso. La hormona del crecimiento es central en el crecimiento y desarrollo, y es la hormona principal que gobierna la altura en un individuo. La deficiencia de hormona del crecimiento es una enfermedad causada frecuentemente por un problema de la glándula pituitaria o el hipotálamo en el cerebro. La deficiencia de hormona del crecimiento puede se el resultado de que la GH no está presente en la glándula pituitaria en cantidades adecuadas o de que la GH está presente en cantidades adecuadas, pero la hormona requerida para liberarla (GHRH) está ausente. El retardo del crecimiento es una condición médica en la cual se retarda o detiene el crecimiento normal de los niños, debido a una deficiencia en el sistema de la hormona del crecimiento (GH) . Existen dos tipos diferentes de deficiencias en la GH en niños: congénita y adquirida. Las deficiencias de hormona del crecimiento congénitas se presentan por problemas con la glándula pituitaria o el hipotálamo mientras el feto crece en el vientre materno, mientras que las deficiencias de hormona del crecimiento adquiridas ocurren cuando el área alrededor de la pituitaria y el hipotálamo es dañada de alguna manera. En algunas oportunidades, las deficiencias de hormona del crecimiento pueden no tener una causa identificable ( "idiopáticas" ) · Tales instancias incluyen el síndrome de Prader-Willi (un desorden congénito caracterizado por deficiencia de GH y baja estatura) , el síndrome de Turner (un defecto genético que se manifiesta sólo en niñas y que está caracterizado por baja estatura), la insuficiencia renal crónica (malfuncionamiento renal que a menudo puede causar retardo del crecimiento en niños) y la talasemia (una condición hereditaria caracterizada por un desbalance en la síntesis de hemoglobina que causa anemia severa y malformaciones en los glóbulos rojos que pueden causar una secreción reducida de GH y baja estatura) . Las deficiencias de crecimiento no sólo afectan a niños, sino que también pueden ser un problema significativo en adultos. La deficiencia de GH en adultos es un síndrome clínico específico con numerosas consecuencias físicas, incluyendo, pero no limitándose a: cambios en la composición corporal, incluyendo obesidad central; lípidos en la sangre; fuerza muscular; composición ósea; capacidad de esfuerzo y energía; riesgo cardiovascular; y bienestar psicológico (por ejemplo, aislamiento social y depresión) . Adicionalmente , algunos estudios indican que los sujetos con hipo-pituitarismo tienen un riesgo aumentado de mortalidad por parte de enfermedades cardiovasculares, posiblemente atribuibles a su deficiencia de GH. La deficiencia de GH en adultos puede ser resultado de un tumor pituitario o peri-pituitario, o puede ser resultado directo de la cirugía/radiación usada para manejar estas condiciones. Con menor frecuencia, la deficiencia de GH en adultos se origina en una deficiencia adquirida en la niñez. La GH recombinante , usada como tratamiento terapéutico para la deficiencia de crecimiento, suplementa y/o reemplaza la GH que el cuerpo debiera producir normalmente. Los tratamientos para adultos y niños pueden incluir la administración sistémica de GH. Por ejemplo, puede administrarse GH sola o en combinación con, antes de, en forma intermitente con, o posteriormente a otros agentes tratantes . Los modos de administración incluyen, pero no están limitados a, inyección de GH. Las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de GH resistentes a proteasas descritas en este documento pueden ser utilizadas en terapias para la deficiencia de crecimiento. Las GHs resistentes a proteasas de la invención exhiben una resistencia aumentada frente a proteasas del tracto gastrointestinal, mejorando asi la eficacia terapéutica de una composición farmacéutica. Asi, las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de GH resistentes a proteasas pueden ser usadas para entregar terapias más duraderas y más estables para la deficiencia de crecimiento. Los ejemplos de mejorías terapéuticas usando formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de GH resistentes a proteasas incluyen, por ejemplo, pero no están limitadas a, dosificaciones más bajas, administraciones más escasas y/o menos frecuentes, disminución de efectos colaterales y aumento de efectos terapéuticos. Las dosificaciones y regímenes de las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de GH resistentes a proteasas proporcionadas en este documento pueden ser determinadas empíricamente . Las dosis para la GH no modificada pueden usarse como guía para determinar las dosis para la GH modificada. Puede usarse factores tales como el nivel de actividad y la vida media de una GH modificada en comparación con una GH no modificada para realizar dichas determinaciones.

Entre los objetivos de la terapia con GH para el tratamiento de la deficiencia de crecimiento está el reemplazo a largo plazo de la GH a niveles fisiológicos comparables con los de personas sanas del mismo sexo y edad similar. Los regímenes de dosificación de GH pueden depender de cierto número de factores que incluyen, pero no están limitados a, edad del sujeto; estado de la pubertad; tolerancia del sujeto e incidencia de efectos adversos; y fuente de la GH, ya sea recombinante o natural. Por ejemplo, la potencia de la GH recombinante es alrededor de un tercio de la potencia de la GH pituitaria. Las dosis y regímenes de dosificación pueden ser determinados empíricamente. Los ejemplos de dosis de GH pituitaria no modificada pueden ser de 0,1 mg/kg/semana (0,3 UI/kg/semana) ; las dosis de ejemplo de GH recombinante no modificada pueden ser de 0,18 hasta 0,3 mg/kg/semana para niños con deficiencia de hormona del crecimiento (MacGillivray y cois. Pediatrics 102: 527-530 (1998)). La dosis promedio de GH administrada a niños con deficiencia de hormona del crecimiento es de 0,3 mg/kg/semana dividida en dosis diarias administradas por inyección subcutánea. Otras dosis ejemplares en el tratamiento de desórdenes de deficiencia de GH en niños incluyen 0,35 mg/kg/semana para niños con insuficiencia renal crónica; 0,375 mg/kg/semana para niñas con síndrome de Turner; 0.3 mg/kg/semana para niños con baja estatura idiopática; y 0,7 mg/kg/semana para niños con retardo de crecimiento intrauterino (véase, por ejemplo, Vanee y cois. The New England Journal of Medicine 341(6): 1206-1216 (1999) ) . La dosis inicial de GH para adultos es típicamente de 0,01-0,03 mg/kg/semana mediante inyección subcutánea. La dosis diaria máxima para sujetos de hasta 35 años de edad es típicamente de 0,18 mg/kg/semana y de 0,09 mg/kg/semana para sujetos mayores. En varios estudios de tratamiento por reemplazo de hormona del crecimiento, la dosis de hormona del crecimiento no modificada ha estado en el intervalo entre alrededor de 0,04 y alrededor de 0,18 mg/kg/semana (véase Vanee y cois. The New England Journal of Medicine 341(6): 1206-1216 (1999)). Otros recomiendan (véase, por ejemplo, las recomendaciones de la Sociedad de Investigación acerca de la Hormona del Crecimiento (Growth Hormone Research Society) ) una dosis inicial de 105-210 mg/semana, independiente del peso corporal (véase, por ejemplo, Guías de consenso para el diagnóstico y tratamiento de adultos con deficiencia de hormona del crecimiento: Resumen de las declaraciones del Taller de la Sociedad de Investigación acerca de la Hormona del Crecimiento sobre Deficiencia de Hormona del Crecimiento en Adultos. J. Clin. Endocrinol . Metab. 83: 379-381 (1998) ) . b. Caquexia A pesar de la terapia anti-retroviral , que extiende la vida de las personas infectadas con VIH, el enlaciamiento asociado a SIDA es una de las principales causas de mala salud en personas con VIH/SIDA. Las estimaciones de la prevalencia de emaciamiento asociado a SIDA varían entre 4-30% de los individuos infectados con VIH. Los estudios han demostrado que el emaciamiento asociado a SIDA, cuando no se trata, está directamente correlacionado con la mortalidad. Se observa manifestaciones similares de emaciamiento en relación con otras enfermedades, por ejemplo, cánceres.

Las dosificaciones y regímenes de las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de GH resistentes a proteasas proporcionadas en este documento pueden ser determinadas empíricamente. Las dosis para la GH no modificada pueden usarse como guía para determinar las dosis para la GH modificada. Puede usarse factores tales como el nivel de actividad y la vida media de la GH modificada en comparación con la GH no modificada para realizar dichas determinaciones. Las GHs modificadas proporcionadas en este documento poseen resistencia modificada a proteasas del tracto gastrointestinal y a su vez entregan efectos terapéuticos más duraderos y estables en el tratamiento del emaciamiento asociado a SIDA. La GH recombinante fue aprobada por la FDA de los Estados Unidos en 1996 para el tratamiento del emaciamiento asociado a SIDA. La dosificación inicial recomendada de hormona del crecimiento no modificada en un adulto como terapia para el tratamiento de la caquexia es no mayor que 0,04 mg/kg/semana, dividida en seis o siete inyecciones subcutáneas. La dosis puede ser aumentada en intervalos de cuatro a ocho semanas, de acuerdo a los requerimientos de los individuos tratados, hasta un máximo de 0,08 mg/kg/semana, dependiendo de la tolerancia del sujeto al tratamiento (véase el inserto distribuido dentro del empaque de Serostim41) . Estas dosificaciones de ejemplo pueden ser utilizadas como guía en la determinación de regímenes de dosificación para polipéptidos de GH modificadas, junto con determinaciones adicionales de propiedades y actividades de la GH modificada en comparación con una forma no modificada. c. Anti -envejecimiento El envejecimiento está asociado con una declinación de la función de las gonadotropinas , la hormona tiroestimulante y de la función pituitaria; a menudo llamada "somatopausia" . Así, como una de las hormonas pituitarias, también ha sido descrito el descenso de la GH con la edad, comenzando en la tercera década (véase, por ejemplo, Corpas y cois. Endocr Rev 14: 20-39 (1993)). Una disminución de la GH se asocia con muchos de los cambios que se ven en el envejecimiento, incluyendo el aumento de grasa, la disminución de la masa muscular, y la disminución de la masa ósea. El reemplazo de la hormona del crecimiento en individuos más viejos con deficiencia de la hormona del crecimiento puede mejorar la calidad de vida, aumentar la masa ósea y muscular y reducir el riesgo cardiovascular . Las dosis y regímenes de dosificación de las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de GH resistentes a proteasas proporcionadas en este documento pueden ser determinadas empíricamente . La dosis terapéutica inicial de la GH modificada que se proporciona en este documento puede ser determinada usando como guía la dosis inicial recomendada en adultos para una hormona del crecimiento no modificada, y luego puede titularse de acuerdo al efecto terapéutico mejorado que resulta del uso de la GH modificada. La dosis subcutánea de ejemplo de la terapia de hGH recombinante en sujetos masculinos entre 61 y 81 años, puede ser de 0,03 mg/kg de peso corporal, inyectados tres veces por semana en la mañana,- siendo el intervalo entre inyecciones de uno o dos días (2,6 UI por miligramo de hormona) (véase, por ejemplo, Rudman y cois., The New England Journal of Medicine 323(1): 1-6 (1990)). Las dosis recomendadas de ejemplo en la terapia de hGH recombinante en sujetos femeninos puede ser de 0,025 mg/kg de peso corporal/día (Bonello y cois. J. Am. Geriatr. Soc. 44(9): 1038-42 (1996)). Estas dosis pueden ser utilizadas, junto a las comparaciones de propiedades entre los polipéptidos de GH modificados y no modificados, para determinar las dosis para la GH modificada. Por ejemplo, las GHs modificadas proporcionadas en este documento poseen resistencia modificada a proteasas del tracto gastrointestinal y a su vez entregan efectos terapéuticos más duraderos y estables en los efectos terapéuticos enti-envejecimiento. Las dosificaciones subcutáneas típicas para terapia anti-envej ecimiento varían entre 12-24 UI por semana, dependiendo del individuo, edad, sexo y otros parámetros. Las dosis precisas pueden ser determinadas empíricamente y pueden ajustarse en base a parámetros, tales como la medición de niveles de IGF-1. Las formulaciones de dosificación oral proporcionadas deberían contener al menos, típicamente, 15-40 veces más que una dosificación subcutánea diaria para tratamiento anti-envej ecimiento . d. Osteodistrofia Renal La osteodistrofia renal, que incluye una variedad de desórdenes esqueléticos que varían entre lesiones de alta conversión y lesiones de baja conversión, ambas conducentes a una densidad mineral ósea reducida e incidencias de fracturas más altas, es común en sujetos con falla renal crónica. Los ensayos clínicos han mostrado los efectos positivos de la terapia con Gh humana recombinante como tratamiento para mejorar la conversión ósea y la densidad mineral ósea en sujetos con deficiencia de hormona del crecimiento, así como en sujetos con enfermedad renal crónica con hemodiálisis (véase, por ejemplo, Kotzmann y cois. Journal of Nephrology 17(1): 87-94 (2004)). La GH, así como el IGF-1, tiene efectos marcados sobre el metabolismo óseo y la densidad mineral ósea. La GH puede estimular el crecimiento y la función de los condrocitos, así como el incremento, directa o indirectamente, de la conversión ósea mediante la estimulación de los osteoblastos y osteoclastos y la inducción de la síntesis de colágeno, aumentando así el crecimiento de los huesos largos . Las dosis y regímenes de dosificación de las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de GH resistentes a proteasas proporcionadas en este documento pueden ser determinadas empíricamente. La dosis terapéutica inicial de la GH modificada que se proporciona en este documento puede ser determinada usando como guía la dosis inicial recomendada en adultos para una hormona del crecimiento no modificada, y luego puede titularse de acuerdo al efecto terapéutico mejorado que resulta del uso de la GH modificada. Los ejemplos de dosis en sujetos adultos con falla renal crónica en hemodiálisis pueden ser de 0,125 Ul/kg (40,5 yg/kg) de GH inyectada de manera subcutánea 3 veces por semana después de cada sesión de diálisis durante las primeras 4 semanas de tratamiento y 0,25 Ul/kg (81 pg/kg) en lo sucesivo. La extensión y dosis en el tratamiento con GH pueden variar de acuerdo a la tolerancia del sujeto (véase Kotzmann y cois. Journal of Nephrology 17(1): 87-94 (2004)). Las comparaciones de propiedades y actividades de la GH modificada frente a la GH no modificada pueden usarse para determinar dosis y regímenes de dosificación alternativos . e. Fibrosis Quística Los sujetos, en particular niños, con fibrosis quística tienen problemas de pobre crecimiento lineal, ganancia inadecuada de peso y catabolismo proteico. Múltiples estudios han demostrado un crecimiento y peso mejorados en niños tratados con GH. Otros estudios han mostrado que el tratamiento con GH da como resultado una capacidad vital forzada aumentada, mejor tolerancia al ejercicio y acumulación ósea. Otros estudios han encontrado que el tratamiento con GH mejora el estado clínico medido como hospitalizaciones y cursos de tratamiento con antibióticos intravenosos reducidos (véase, por ejemplo, Hardin D.S., Eur. J. Endocrinol . 151(Suppl 1): S81-85 (2004)). Las dosis y regímenes de dosificación de las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de GH resistentes a proteasas proporcionadas en este documento pueden ser determinadas empíricamente . Por ejemplo, puede usarse como guía en la determinación la dosis y dosificaciones de GH no modificada y la comparación de propiedades y actividades de la GH modificada con la GH no modificada. Los ejemplos de dosis en sujetos pediátricos con fibrosis quística incluyen, pero no están limitados a, inyecciones subcutáneas de GH que alcanzan hasta 0,3 mg/kg/semana (véase Hardin D.S., Eur. J. Endocrinol . 151(Suppl 1) : S81-85 (2004)). La dosis terapéutica inicial de la GH modificada que se proporciona en este documento puede ser la dosis inicial recomendada en adultos para tratamientos con una hormona del crecimiento no modificada, y luego puede titularse de acuerdo al efecto terapéutico más duradero y mejorado de la GH modificada proporcionada en este documento. Las GHs modificadas proporcionadas en este documento poseen resistencia aumentada frente a proteasas del tracto gastrointestinal. Tales GH modificadas pueden entregar un efecto terapéutico más prolongado y más estable en el tratamiento de sujetos con fibrosis quística y pueden permitir una menor dosis y dosificaciones menos frecuentes . f. Otras Condiciones Una variedad de otras condiciones fisiológicas o patológicas son blancos potenciales para la terapia con GH. Estas condiciones fisiológicas o patológicas incluyen, pero no están limitadas a, estrés, energía disminuida, poder físico disminuido, dolencias catabólicas, incluyendo, por ejemplo, aquéllas asociadas con falla respiratoria y daños por quemaduras (véase, por ejemplo, Hart y cois. Ann. Surg. 233(6) : 827-34 (2001)), recuperación de cirugía (véase, por ejemplo, Yeo y cois. Grotvth Horm. IGF Res. 13(6) : 361-70 (2003)), cardiomiopatía congestiva (véase, por ejemplo, Adamapolous y cois. Eur. Heart J. 24(24): 2186-96 (2003)), transplante hepático o regeneración hepática después de una hepatectomía (véase, por ejemplo, Luo y cois. World J Gastroenterol . 10(9): 1292-6 (2004)), desórdenes inflamatorios o nutricionales crónicos tales como síndrome del intestino corto, enfermedad de Crohn (véase, por ejemplo, Slonim y cois. N. Engl . J. Med. 342(22): 1633-7 (2000) ) , artritis crónica juvenil (véase, por ejemplo, Saha y cois. J" Rheumatol . 1(7): 1413-7 (2004)), desórdenes de la fertilidad masculina (véase, por ejemplo, Ovesen y cois. Fértil Steril. 66(2) : 292-8 (1996) ) , y otros desórdenes tales como una función inmunitaria dañada en sujetos infectados con VIH, osteoporosis , acondroplasia/ hipocondroplasia, displasia esquelética, raquitismo hipofosfatémico asociado al cromosoma X (véase, por ejemplo, Seikaly y cois. Pediatrics. 100(5): 879-84 (1997)), síndrome de Noonan (véase, por ejemplo, Noordam y cois. Acta Paediatr. 90(8): 889-94 (2001)), obesidad, síndrome de Down, espina bífida, y fibromialgia (véase, por ejemplo, Bennet y cois. Am. J. Med. 104(3): 227-31 (1998) ) .

H. TERAPIAS DE COMBINACIÓN Cualquiera de las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos resistentes a proteasas descritas en este documento pueden ser administradas en combinación con, antes de, de forma intermitente con, o posteriormente a otros agentes terapéuticos, terapias o procedimientos, incluyendo, pero no limitándose a, otros compuestos biológicos o moléculas pequeñas y cirugía. Los compuestos terapéuticos resistentes a proteasas pueden ser formulados con otros agentes activos, particularmente otros para el tratamiento de la misma condición.

Para cualquier enfermedad o condición, incluyendo todas las ejemplificadas anteriormente, para la que se indique o se haya utilizado uno o más polipéptidos terapéuticos y para la que estén disponibles otros agentes terapéuticos y tratamientos, puede utilizarse polipéptidos terapéuticos resistentes a proteasas en combinación con los mismos. Por ende, puede utilizarse de forma similar las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos terapéuticos resistentes a proteasas proporcionadas en este documento. Los agentes terapéuticos, tales como compuestos biológicos o moléculas, usados en combinación con las formulaciones de dosificación oral proporcionadas en este documento pueden formularse en conjunto (por ejemplo, en la misma tableta o cápsula) o separadamente. Para combinaciones formuladas en conjunto en la misma tableta o cápsula, las combinaciones pueden ser formuladas para liberación simultánea de ambos ingredientes activos o para liberación de los componentes activos en diferentes puntos temporales después de la administración oral. Tales combinaciones pueden ser formuladas con combinaciones de varios recubrimientos para producir la liberación de los ingredientes activos en uno o más puntos temporales. Se proporciona combinaciones de las formulaciones de dosificación proporcionadas en este documento con formulaciones de dosificación o composiciones que contienen otros agentes. Tales combinaciones pueden ser proporcionadas en kits, opcionalmente empacadas junto a otros ítems, tales como instrucciones de uso, jeringas, viales y otros ítems. Los agentes biológicos para las combinaciones pueden incluir una o más formas del mismo polipéptido (por ejemplo, nativo o modificado, por ejemplo, mediante modificaciones adicionales de aminoácidos, glicosilación, pegilación o albuminación) o variantes de especie o alélicas del mismo. Adicionalmente , las terapias de combinación de las formulaciones de dosificación oral proporcionadas también incluyen la administración del mismo polipéptido por más de una ruta. Por ejemplo, las terapias de combinación pueden incluir la administración de la formulación de dosificación oral del polipéptido resistente a proteasas además de la administración de una formulación de dosificación del polipéptido resistente a proteasas o de su forma no modificada, nativa u otra forma modificada (por ejemplo, hiperglicosilada o pegilada) del polipéptido, a través de otro modo de administración (por ejemplo, subcutáneo, intravenoso u oromucoso) .

Las terapias de combinación de ejemplo para formulaciones de dosificación oral de polipéptidos de IFN-a resistentes a proteasas para el tratamiento de infecciones virales, tales como infección por VHC, incluyen, pero no están limitadas a, tratamiento con análogos de glucósidos tales como ribavirina y viramidina (prodroga de ribavirina) , L-nucleósidos tales como levovirina, agonistas del receptor de interferón de tipo II (por ejemplo, IFN-?) , antagonistas de TNF (por ejemplo, etanercept, infliximab, o adalimumab) , timosina-a, inhibidores de SAPK (por ejemplo, pirfenidona o análogos de pirfenidona) , amantidina, inhibidores de NS3, inhibidores de NS5B, inhibidores de alfa-glucosidasa o una combinación de los mismos. Los ejemplos de terapias de combinación de formulaciones de dosificación oral proporcionadas de polipéptidos de IFN-a resistentes a proteasas para el tratamiento del cáncer incluyen, pero no están limitados a, citoquinas, quimioquinas , factores de crecimiento, agentes fotosensibilizadores , toxinas, antibióticos anticancerosos, compuestos quimioterapéuticos , radionúclidos , inhibidores de angiotensina, moduladores de señales, anti-metabolitos , vacunas anti-cáncer, oligopéptidos anti-cáncer, proteínas inhibidoras de mitosis, oligopéptidos antimitóticos , anticuerpos anti-cáncer, agentes inmunoterapéuticos , hipertermia o terapia por hipertermia, terapia por radiación o una combinación de los mismos. Los ejemplos de terapias de combinación para formulaciones de dosificación oral proporcionadas de polipéptidos de IFN-a resistentes a proteasas para el tratamiento de desórdenes fibróticos incluyen un tratamiento de combinación con uno o más agentes anti-fibróticos incluyendo, pero no limitándose a, un inhibidor de SAPK (por ejemplo, pirfenidona o un análogo de pirfenidona) , antagonistas de TNF (por ejemplo, etanercept, infliximab o adalimumab) , antagonistas de TGF-ß (por ejemplo, GLEEVEC) y antagonistas del receptor de endotelina (por ejemplo, TRACLEER) . Los ejemplos de terapias de combinación de formulaciones de dosificación oral proporcionadas de polipéptidos de hormona del crecimiento resistentes a proteasas para el tratamiento de deficiencias de hormona del crecimiento, o enfermedades o condiciones para las que se administra hormona del crecimiento, incluyen tratamientos de combinación con uno o más agentes terapéuticos, incluyendo, pero no limitándose a, análogos de hormona liberadora de gonadotropina (GNRH) , factor de crecimiento tipo insulina 1 (rhlGF-1) , péptidos liberadores de hormona del crecimiento (GRP) , Acipimox® u otros agentes de regulación de ácidos grasos libres, hormona liberadora de hormona luteinizante , esteroides anabólicos, tales como oxandrolona y testosterona, letrozol y acetato de ciproterona .

I. ARTÍCULOS MANUFACTURADOS Y KITS Las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos resistentes a proteasas pueden empacarse como artículos manufacturados que contienen material de empaque, una composición farmacéutica que es efectiva para tratar una enfermedad o desorden, y una etiqueta que indica que el polipéptido resistente a proteasas debe ser usado para tratar la enfermedad o desorden. Se contempla una amplia variedad de formulaciones de dosificación oral de los polipéptidos resistentes a proteasas, así como una variedad de tratamientos para cualquier enfermedad o desorden que pueda ser prevenido o tratado mediante administración del polipéptido. La formulación de dosificación oral, si se desea, puede proporcionarse como un empaque, en un kit o dispositivo dispensador, que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen el polipéptido resistente a proteasas . El empaque, por ejemplo, puede contener una lámina de plástico o metal, tal como un empaque de blíster. El empaque o dispositivo dispensador puede estar acompañado por instrucciones para la administración. Las composiciones que contienen los polipéptidos resistentes a proteasas pueden ser empacadas como artículos manufacturados que contienen material de empaque, una formulación de dosificación oral proporcionada en el mismo, y una etiqueta que indica el desorden para el cual se proporciona la formulación de dosificación oral. Los artículos manufacturados proporcionados en este documento contienen materiales de empaque. Los materiales de empaque para ser utilizados en el empaque de productos farmacéuticos son bien conocidos para aquéllos con experiencia en el arte. Véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.323.907, 5.052.558 y 5.033:352, cada una de las cuales se incorpora aquí en su totalidad. Los ejemplos de materiales de empaque farmacéutico para formulaciones de dosificación oral incluyen, pero no están limitados a, empaques de blíster, tarjetas de blíster, una caja, un paquete de metal, botellas, tubos, sobres, viales, contenedores y cualquier material de empaque o una combinación de los mismos que sea adecuado para una formulación de dosificación oral, modo de administración y tratamiento seleccionados. Los kits también pueden ser diseñados de manera tal que sean resistentes a la manipulación o que indiquen que han sido manipulados. Opcionalmente, un kit puede contener la formulación de dosificación oral proporcionada en este documento en combinación con otra composición farmacéutica. Las formulaciones de dosificación oral de polipéptidos resistentes a proteasas pueden proporcionarse como kits. Los kits pueden incluir una composición farmacéutica oral descrita en este documento y un ítem para su administración. Por ejemplo, una formulación de dosificación oral de un polipéptido terapéutico puede entregarse con un dispositivo para su administración, tal como un recipiente de dosificación. El kit puede incluir opcionalmente una nota o instrucciones impresas para su aplicación, incluyendo dosis, regímenes de dosificación e instrucciones para modos de administración. Tales instrucciones impresas también pueden ser de una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, en donde dicha nota refleja la aprobación por parte de la agencia de la fabricación, uso o venta para administración a humanos para tratar una condición que puede ser tratada mediante administración del polipéptido resistente a proteasas . En algunos ejemplos, el kit contiene opcionalmente material impreso u otro medio, tal como un CD, tal como instrucciones para el uso de la forma de dosificación para tratar una condición o enfermedad. Los kits también pueden incluir una composición farmacéutica oral descrita en este documento y un ítem para diagnóstico. Por ejemplo, tales kits pueden incluir un ítem para medir la concentración, cantidad o actividad de un polipéptido terapéutico resistente a proteasas o un sistema regulado por un polipéptido terapéutico en un sujeto.

J. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se incluyen solamente con propósitos ilustrativos y no están concebidos para limitar el alcance de las reivindicaciones proporcionadas en este documento. Los resultados de estudios farmacocinéticos (FC o PK, por su sigla en inglés) presentados en este documento ilustran ejemplos de sistemas modelo para estudiar los perfiles FC de las formulaciones de dosificación oral provistas. Como tales, las dosis empleadas son sustancialmente más altas y no representan necesariamente una relación lineal para la selección de dosificaciones para el tratamiento de humanos, pero pueden ser utilizadas como guia para la determinación empírica de dosis terapéuticamente efectivas para el tratamiento de humanos, en base a la enfermedad o condición a ser tratada.

EJEMPLO 1 Evaluación de Polipéptidos Resistentes a Proteasa LEAD Candidatos I . Métodos ?. Resistencia a Proteólisis El siguiente protocolo fue usado para evaluar la resistencia a proteasas de todas las proteínas puestas a prueba, a menos que se indique lo contrario. Los mutantes fueron tratados con proteasas de manera de identificar moléculas resistentes. La resistencia relativa de las proteínas mutantes comparada con la proteína nativa frente a fragmentación enzimática fue determinada por exposición a una mezcla de proteasas (con 1,5 pg de cada una de las siguientes proteasas (1% p /p , Sigma) : -quimotripsina , carboxipeptidasa, endoproteinasa Arg-C, endoproteinasa Asp-N, endoproteinasa Glu-C, endoproteinasa Lys-C, y tripsina) a 25°C por un periodo de tiempo determinado entre 30 minutos a ya sea 24 o 48 horas dependiendo del experimento. Al final del tiempo de incubación, 10 µ? de medio completo anti-proteasa con mini tabletas de EDTA libres, Roche (una tableta se disolvió en 10 mi de DMEM y luego diluida 1/1000) se agregó a cada reacción de manera de inhibir la actividad proteasa. Las muestras tratadas se usaron para determinar la actividad residual tal como actividad anti-viral o proliferativa como se determina más abajo en parte B y C. Para hGH se usó una mezcla de 3% de endoproteinasa AspN, endoproteinasa GluC, alfa-quimotripsina, y tripsina. Las proteínas fueron incubadas con las proteasas a 25/C por el período determinado entre 30 minutos a 120 minutos. Se determinó la actividad residual como se describió anteriormente .

Para eritropoyetina, la resistencia relativa de proteínas mutantes comparada con la proteína nativa contra fragmentación enzimática fue determinada por exposición a una mezcla de proteasa de 1,5% (p/p) con cada una de las siguientes proteasas: a-quimotripsina , Endoproteinasa GluC y tripsina (Sigma) o por exposición a una mezcla de proteasas de 3% (p/p) cada una con las siguientes proteasas, a-quimotripsina, Endoproteinasa GluC y tripsina (Sigma) . La reacción de proteasas fue procesada por un período de 0,5 a 2 horas como se describió anteriormente y se determinó la actividad residual .

B. Actividad Anti-viral La actividad residual de variantes de polipéptidos de Interferón-alfa (es decir, IFN- -2b) , Interferón-gamma (IFN-?) e Interferón-beta (IFN-ß) fue evaluada en un ensayo anti-viral. La actividad anti-viral puede ser medida por efectos citopáticos (ECP) . La actividad anti-viral de variantes de polipéptidos fue determinada por la capacidad de la citoquina para proteger a células HeLa de los efectos citopáticos inducidos por el virus EMC (encefalomiocarditis en ratón) . El día previo, las células HeLa (2xl05 células/ml) fueron sembradas en placas de 96 pocilios de fondo plano con 100 µ?/pocillo de medio MEM-Glutamax-piruvato de sodio de Dulbecco suplementado con 5% SVF y 0,2% de gentamicina. Las células se crecieron a 37°C en una atmósfera de 5% C02 por 24 horas. Se realizaron diluciones en serie a la mitad de muestras de variantes de polipéptidos preincubadas con proteasa (como se describió en la parte A arriba) con medio MEM completo en placas de 96 pocilios profundos. Veinticuatro (24) horas después de sembrar las células, el medio fue aspirado de cada pocilio y 100 µ? de las muestras diluidas fueron agregados a las células HeLa. Cada muestra diluida fue evaluada en triplicado. Las últimas dos filas de las placas fueron llenadas con 100 µ? de medio sin muestra de manera de usarlo como controles para células con y sin virus. Luego de 24 horas de crecimiento, una dilución 1/1000 de una solución de virus EMC fue colocada en cada pocilio, excepto por la fila de control. Las placas se devolvieron al incubador de C02 por 40-48 horas. El medio fue descartado, y las células fueron lavadas dos veces con 100 µ? de IX PBS y teñidas por 1 hora con 80-100 µ? de solución de tinción (azul tripán o una mezcla azul etanol-formamida-metil) para determinar la proporción de células intactas. Las placas fueron lavadas en un baño de agua destilada y el pigmento unido a las células fue extraído usando 80 - 100 µ? de etilenglicol-mono-etil-éter (Sigma) . La absorbancia del pigmento fue determinada usando un lector de placas ELISA (Spectramax; Molecular devices) a 660 nm.

C. Actividad de Proliferación Celular 1. Células b2-ll La actividad residual de variantes de la Hormona de Crecimiento (es decir hGH) fue puesta a prueba evaluando sus efectos en la proliferación de células de linfoblasto de rata Nb2-ll. Las células Nb2-ll fueron cultivadas en medio Fisher suplementado con 10% de SVF y 10% de suero equino (SE) . Veinticuatro (24) horas antes del ensayo de proliferación, las células fueron centrifugadas y lavadas con solución salina con tampón fosfato (PBS) . Las células fueron cultivadas luego en medio Fisher suplementado solo con 10% de SE a una densidad de 0,5 - 0,8 x 106 células/ml. Luego de 24 horas de cultivo las células fueron sembradas en placas de 96 pocilios a 4 x 104 células/pocilio y tratadas con dilución en serie a un tercio de hormona de crecimiento humana (hGH) nativa pretratada o mutantes entre 6000 pg/ml y 0.3 pg/ml en triplicado. Se usó el estándar de hGH del Instituto Nacional para Estándares y Control (National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC) como control interno para cada ensayo de proliferación. Luego de 48 horas de tratamiento con ya sea hGH nativa o mutante (pretratada con proteasas) se midió la proliferación de células Nb2-ll. Se agregaron veinte microlitros (20 µ?) de Cell Titer 96 AQ (Promega) por pocilio y las células fueron incubadas por 1 hora a 37°C. La conversión de MTS tetrazolio en formazano soluble fue medida. Las muestras fueron leídas en un lector Spectramax (Molecular Devices) a 490 nm. 2. Células TF-1 La actividad residual de variantes de eritropoyetina (EPO) fue puesta a prueba evaluando sus efectos en la proliferación de células humanas de eritroleucemia (línea celular TF-1) . La línea celular TF-1 fue mantenida en medio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado con 10% FCS, 2mM L-glutamina y 2 ng/ml de GM-CSM humano recombinante a 37°C en una atmósfera húmeda con una composición de 7% C02 /95% aire en frascos de cultivo T175 (175cm2) de poliestireno y subcultivados dos veces por semana. Veinticuatro (24) horas antes de usar en ensayos de proliferación, las células son lavadas dos veces en PBS helado y resuspendidas por 16 horas en medio RPMI libre de GM-CSF suplementado con 2mM de glutamina y 10% FCS . Las células TF-1 fueron plaqueadas en placas de 96 pocilios a 4xl04 células por pocilio en 70µ1 de medio RPMI libre de GM-CSF suplementado con 2mM de glutamina y 10% FCS. Cada muestra (EPO nativa o mutante pretratada con proteasa como se describió en la parte A) fue sujeta a una dilución seriada a la mitad en placas de 96 pocilios profundos y se agregaron diluciones de EPO (30µ1) a cada pocilio que contenía 70µ1 de células TF-1 con una concentración en el rango final desde 70000 a 34,2 pg/ml. Cada muestra diluida de EPO fue evaluada en triplicado. No se agregó GM-CSF a la última fila (fila "G" ) de las placas de 96 pocilios de fondo plano de manera de evaluar la absorbancia basal de células no proliferativas . Una dilución seriada a la mitad (70000 a 34,2 pg/ml) de controles internos positivos incluyendo ambos el estándar internacional para EPO (NIBSC, 88/574) y el primer estándar internacional para GM-CSF (NIBSC, 88/646) fueron también realizados y agregados en triplicado a la placa de 96 pocilios y evaluados de manera de estandarizar los resultados de proliferación celular. Las placas fueron incubadas por 48 horas a 37°C en una atmósfera humidificada con 7% C02. Luego de 48 horas de crecimiento, se agregaron 20 µ? de solución de reactivo CellTiter 96 Aqueous One (Promega) a cada pocilio y se incubaron por 3 horas a 37 °C en una atmósfera de 7% C02. Para medir la cantidad de formazano soluble coloreado producido por la reducción celular del MTS, la absorbancia del pigmento fue medida usando un lector de placas ELISA (Spectramax) a 490nm.

II. Resultados Los métodos descritos anteriormente para evaluar la resistencia a proteasas de polipéptidos LEAD candidatos seguido de la evaluación de actividad residual fueron aplicados a miles de polipéptidos. Se proporcionan resultados más abajo para evaluación de resistencia a proteasa de algunos polipéptidos LEAD y SuperLEAD candidatos. Los datos no pretenden ser representativos para todas las proteasas, pero son datos que ejemplifican la resistencia a proteólisis a un cóctel de proteasas como se describió en los métodos más arriba. Por consiguiente, los datos no son exhaustivos y no se pretende que sean indicadores de que otros polipéptidos no exhiban resistencia a proteasas.

A. Interferón-alfa Un total de 184 variantes de polipéptidos LEAD candidatos de interferón-alfa (IFN-a2b) fueron generados y evaluados basados en la propiedad predeterminada de resistencia a proteasas aumentada. Previo a la evaluación de la resistencia a proteasa, LEADs de IFN-a candidatos fueron evaluados por actividad en un ensayo anti -viral usando el ensayo de replicación de EMVC en células HeLa descrito anteriormente. IFN-a nativo y los LEADs seleccionados fueron evaluados en una serie de diluciones en un rango desde 3000 pg/mL a 1,46 pg/mL. La actividad específica (es decir actividad por unidad de masa de proteína; unidades/mg de proteína) de cada mutante de IFN-a fue comparada con aquella de IFN-a nativo y expresada como un millón de unidades internacionales ( IU) determinado desde el EC50 experimental . Las mediciones de actividad anti-viral específica (expresada en MIU/mg) para cuatro polipéptidos LEAD de ejemplo, incluyendo IFN- -2 (E41Q) (LEAD 11) , en comparación con IFN-a nativo son como sigue: 280 MIU/mg para IFN- nativo y entre 200 y 400 MIU/mg para los LEADs seleccionados. El candidato E41Q IFN-a-2b LEAD tuvo una actividad específica de 300 MIU/mg. Por consiguiente se concluyó que IFN- -2b (E41Q) mostraba una actividad antiviral equivalente a IFN-a nativo . Los LEADs candidatos fueron evaluados in vitro por resistencia a proteasas incubando 100 µ? de 1500 pg/ml (500 U/ml) de IFN-a-2b con un cóctel de proteasas como el descrito anteriormente. Seguido el tratamiento de proteasa, la actividad residual fue evaluada por un ensayo anti -viral. La tabla 23 muestra los resultados de algunos de los polipéptidos evaluados. La resistencia a proteólisis es indicada como "sin cambio" o "aumentada" al compararlo con la actividad residual del polipéptido nativo respectivo bajo las mismas condiciones de tratamiento con proteasa. Los resultados muestran que muchos de los polipéptidos evaluados exhiben una resistencia aumentada a proteasa in vitro al compararlos a IFN-a nativo .

TABLA 23 Resistencia a Proteólisis de LEADs de Interferón-alfa Candidatos Muíante Resistencia a proteólisis F27V Sin cambio R33H Sin cambio E41 Q Aumentada E41 H Sin cambio E58Q Aumentada E58H Aumentada E78Q Aumentada E78H Aumentada Y89H Sin cambio E 107Q Aumentada E 107H Aumentada P 109A Sin cambio L 1 10V Sin cambio M 1 1 1 V Sin cambio E 1 13H Aumentada L l 17V Aumentada L 1 17I Aumentada 121 Q Aumentada R 125H Aumentada R125Q Aumentada 133Q Aumentada E 159H Aumentada E 159Q Aumentada Una variante del polipéptido con el reemplazo aminoacídico E41Q fue escogido para mayores análisis cinéticos. La susceptibilidad a proteasas disminuida fue evaluada exponiendo el IFN-a-2b mutante E41Q e IFN-a-2b nativo a los siguientes tratamientos proteolíticos : a) lisado de sangre humana; b) suero humano; c) quimotripsina (10% p/p) ; d) una mezcla de proteasas (1% p/p de a-quimotripsina, carboxipeptidasa, endoproteinasa Arg-C, endoproteinasa Asp-N, endoproteinasa Glu-C, endoproteinasa Lys-C y tripsina) como fue descrito antes en los métodos de ensayo para resistencia a proteasas, excepto que la incubación con mezcla de proteasas fue hecha en un tiempo variable desde 0-48 horas. La reacción de proteasas fue detenida a 0,5h, lh, 4h, 8h, 16h, 24 h y 48 horas de incubación con proteasa, seguido por la evaluación de actividad anti-viral residual. Los resultados representados como un porcentaje de actividad anti-viral de IFN- -2b nativo sin incubar con proteasa. Los resultados muestran que la pérdida de actividad de IFN-a nativo fue mayor a 30% dentro de 1 hora de tratamiento con el lisado de sangre o la mezcla de proteasas, 50% de actividad dentro de 1 hora con tratamiento con suero y 60% de actividad dentro de 1 hora de tratamiento con quimotripsina . El nivel de actividad de IFN-a-2b nativo se mantuvo a solo 25-30% de su actividad luego de 24 horas bajo todas las condiciones de incubación con proteasa evaluadas. En contraste, los resultados muestran que el IFN-a mutante mantuvo aproximadamente el 100% de actividad anti-viral dentro de 1 hora de tratamiento de proteasa bajo todas las condiciones evaluadas, y 50-90% de la actividad se mantuvo dependiendo de la condición de incubación con proteasa por hasta 24 horas comparado con el IFN-a nativo. B. Hormona de Crecimiento Un total de 222 variantes de Hormona de Crecimiento humana (hGH) fueron generadas y evaluadas basadas en la propiedad predeterminada de resistencia a proteasa aumentada. LEADs y SuperLEADs candidatos de hGH fueron evaluados in vitro por resistencia a proteasa incubando 15 ng de hGH nativa o variantes con un cóctel de proteasas como se describió anteriormente, seguido por la evaluación de actividad proliferativa residual en células Nb2-ll como se describió anteriormente, La tabla 24 muestra los resultados de algunos de los polipéptidos evaluados. La resistencia a proteólisis está indicada como "sin cambio" o "aumentada" al compararlo con la actividad residual del polipéptido nativo respectivo bajo las mismas condiciones de tratamiento con proteasas. Los resultados muestran que muchos de los polipéptidos evaluados exhiben una resistencia a proteasas aumentada in vitro al compararlo con hGH nativa.

TABLA 24 Resistencia a Proteólisis de LEADs y Súper LEADs Candidatos de Hormona de Crecimiento 5 10 20 25 TABLA 24 Resistencia a Proteólisis de LEADs y Súper LEADs Candidatos de Hormona de Crecimiento 10 15 20 25 TABLA 24 Resistencia a Proteólisis de LEADs y Súper LEADs Candidatos de Hormona de Crecimiento Interferón gamma Un total de 148 variantes de interferón-gamma (IFN-gamma) fueron generadas y evaluadas en función de la propiedad predeterminada de resistencia a proteasa aumentada. LEADs candidatos de IFN-gamma fueron evaluados in vitro por resistencia a proteasas incubando 15 ng de IFN-gamma nativo o variantes con un cóctel de proteasas como el descrito anteriormente. La tabla 25 muestra los resultados para algunos de los péptidos evaluados. La resistencia a proteólisis es indicada como "sin cambio" o "aumentada" al compararlo con la actividad residual del polipéptido representativo seleccionado nativo bajo las mismas condiciones de tratamiento con proteasas. Los resultados muestran que muchos de los polipéptidos evaluados exhiben una resistencia a proteasas aumentada in vitro al compararlo al IFN-gamma nativo.

TABLA 25: Resistencia a Proteólisis de LEADs de Interferón -gamma Candidatos Mutación Resistencia a Mutación Resistencia a Mutación Resistencia a Proteólisis Proteólisis Proteólisis D5N sin cambio D44N ND D94N ND D5Q sin cambio D44Q ND D94Q ND P6A sin cambio R45H sin cambio F95I ND P6S sin cambio R45Q sin cambio F95V ND Y7H sin cambio F57I sin cambio E96Q Aumentada Y7I sin cambio F57V aumentada E96H Aumentada 9N sin cambio K58N sin cambio E96N Aumentada 9Q sin cambio K58Q sin cambio 97N sin cambio E10Q sin cambio L59I sin cambio 97Q sin cambio El OH sin cambio L59V sin cambio L98I Aumentada E10N sin cambio F601 sin cambio L98V Aumentada E12Q sin cambio F60V ND Y101H sin cambio E12H sin cambio K.61N sin cambio Y101I sin cambio E12N sin cambio 61Q sin cambio D105N Aumentada L14I sin cambio F631 aumentada D105Q Aumentada L14V sin cambio F63V aumentada L106I Aumentada 15N sin cambio 64N ND L106V Aumentada 15Q sin cambio 64Q aumentada E115Q ND 16N sin cambio D65N sin cambio E115H ND 16Q sin cambio D65Q sin cambio E115N ND Y17H sin cambio D66N aumentada E122Q ND Y17I sin cambio D66Q aumentada E122H ND F18I sin cambio 71N sin cambio E122N ND F18V sin cambio 71Q sin cambio L123I ND D24N ND E74Q sin cambio L123V ND D24Q ND E74H sin cambio P125A Aumentada D27N ND E74N sin cambio P125S Aumentada D27Q ND K77N sin cambio 128N sin cambio L31I ND K77Q sin cambio 128Q sin cambio L31V ND E78Q sin cambio 131N ND F32I ND E78H sin cambio 131Q ND F32V ND E78N sin cambio R132H sin cambio L33I aumentada D79N sin cambio R132Q sin cambio L33V aumentada D79Q ND K133N Aumentada L36I sin cambio 83N sin cambio 133Q Aumentada L36V sin cambio 83Q sin cambio R134H Aumentada 37N aumentada F84I ND R134Q Aumentada K37Q aumentada F84V ND M137I ND W39H ND K89N aumentada M137V Aumentada W39S ND K89Q aumentada L138I ND K40N sin cambio 90N aumentada L138V Aumentada K40Q sin cambio K90Q aumentada F139I Aumentada E41Q aumentada 91N ND F139V Aumentada E41H aumentada K91Q ND R142H Aumentada E41N aumentada R92H sin cambio R142Q Aumentada TABLA 25: Resistencia a Proteólisis de LEADs de Interferón -gamma Candidatos E42Q sin cambio R92Q sin cambio R143H Aumentada E42H sin cambio D93N ND R143Q Aumentada E42N sin cambio D93Q ND ND: No determinado D. Eritropoyetina Un total de 199 variantes de eritropoyetina (EPO) fueron generadas y evaluadas basadas en su propiedad predeterminada de resistencia a proteasas aumentada. Los LEADs de EPO candidatos fueron evaluados in vitro por resistencia a proteasas incubando 557,2 ng de EPO nativo o variantes con un cóctel de proteasas con 1,5% de mezcla de proteasas (p/p) como se describió anteriormente, seguido por evaluación de actividad residual anti-proliferativa en células TF-1 como se describió anteriormente. La tabla 26 muestra los resultados de algunos de los polipéptidos evaluados. La resistencia a proteólisis es indicada como "sin cambio" o "aumentada" al compararlo con la actividad residual del péptido nativo respectivo bajo las mismas condiciones de tratamiento con proteasas. Los resultados muestran que muchos de los polipéptidos evaluados exhiben una resistencia a proteasas aumentada in vitro comparado con EPO nativa.

TABLA 26 Resistencia a Proteólisis de LEADs de EPO Candidatos D8Q aumentada 109 K154Q sin cambio D8H sin cambio 1 10 K154T ND R10H aumentada 1 1 1 L155V ND R10Q sin cambio 1 12 L155I ND L12V sin cambio 1 13 E159Q sin cambio L12I sin cambio 1 14 E159H ND E18Q aumentada 1 15 R162H ND E18H sin cambio 1 16 R162Q ND K20Q aumentada 1 17 C29A ND K20T sin cambio 1 18 C29I ND E21Q aumentada 1 19 C29T ND E21 H sin cambio 120 C7A ND E23Q sin cambio 121 C7I ND E23H sin cambio 122 C7T ND C29S ND 123 D123N aumentada C29V ND 124 D136N aumentada E31Q aumentada 125 D43N ND E31H sin cambio 126 D96N sin cambio L35V sin cambio 127 E159N aumentada L35I sin cambio 128 E18N ND E37Q aumentada 129 E21N ND E37H ND 130 E23N ND P42S ND 131 E31N ND P42A ND 132 E37N ND D43Q ND 133 E55N aumentada D43H ND 134 E62N ND K45Q sin cambio 135 E72N ND K45T aumentada 136 E89N ND F48I sin cambio 137 K1 16N aumentada F48V aumentada 138 K152N ND Y49H sin cambio 139 K154N ND Y49I aumentada 140 K20N ND W51 S sin cambio 141 K45N aumentada W51 H ND 142 K52N aumentada K52Q aumentada 143 K97N ND K52T sin cambio 144 D8N ND R53H aumentada 145 D165Q aumentada R53Q ND 146 D165H aumentada M54V sin cambio 147 D165N aumentada ND: No determinado En un segundo conjunto de experimentos, la resistencia a proteólisis fue medida como se describió anteriormente, excepto que se usó una concentración de proteasas mayor con 3% de mezcla de proteasas (p/p) con cada una de las siguientes proteasas, a-quimotripsina, Endoproteinasa GluC y tripsina (Sigma) , para evaluar la resistencia a proteólisis. La tabla 27 muestra los resultados de algunos de los polipéptidos evaluados . Los datos son expresados como resistencia relativa a proteasas entre las muestras evaluadas: ( +) , (++) , o (+++) , con (+++) indicando la mayor resistencia a proteasas, y (-) indicando sin cambio comparado con la eritropoyetina nativa.

ND: No determinado E. Interferon beta Un total de 340 LEADs variantes de Interferon beta (IFN-ß) y 38 SuperLEADs fueron generados y evaluados basados en la propiedad predeterminada de resistencia a proteasas aumentada. LEADs y SuperLEADs de IFN-ß candidatos fueron evaluados in vitro por resistencia a proteasas usando el método descrito anteriormente, excepto que la resistencia a proteasa fue evaluada a medida que pasaba el tiempo. Brevemente, 100 µ? de IFN-ß a 400 y 800 pg/ml fueron incubados por tiempos variables (0 h, 0,5 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h y 48 h) con un cóctel de proteasas como el descrito anteriormente, seguido por la evaluación de actividad anti-viral. El tiempo de incubación con proteasas requerido para dar un 50% del total de actividad (antiviral) comparado con la ausencia de incubación con proteasas fue determinado. La Tabla 28 (LEADs) y Tabla 29 (SuperLEADs) describen los resultados de los análisis cinéticos de actividad residual de algunos LEADs y SuperLEADs de IFN-ß de ejemplo no limitantes después del tratamiento con proteasas y el tiempo de incubación requerido para dar el 50% de la actividad total anti-viral. También descrito en la Tabla 28 y Tabla 29 está la velocidad de proteólisis aumentada, que es una razón entre el tiempo cuando el 50% de la actividad del polipéptido de IFN-ß comparado con el polipéptido de IFN-ß nativo.

TABLA 28 IFN-ß LEADS que Exhiben Resistencia a Proteólisis Aumentada Código Muíante Tiempo de Resistencia a Razón: NEMO Proteólisis con 50% de Mutante/Nativo Actividad Total 9 L5Q 10,00 5 58 M36I 16,00 8 72 L47I 8,00 4 104 105S 9,00 4.5 110 K108S 8,00 4 111 K108H 9,00 4.5 169 L5D 12,00 6 170 L5E 14,00 7 247 L5N 10,00 5 250 L6E 10,00 5 253 L6Q 8,00 4 254 L6R 10,00 5 255 L6S 12,00 6 257 L9N 9,00 4.5 259 Q10D 22,00 11 266 S13D 10,00 5 286 C17N 22,00 11 290 C17T 8,00 4 299 N86Q 12,00 6 301 N86T 6,00 3 321 Q94D 4,00 2 326 Q94S 8,00 4 336 H97D 11,00 5.5 369 N90C 24,00 12 Nativo 2,0 1,0 TABLA 29 IFN-ß SuperLEADS que Exhiben Resistencia a Proteólisis Aumentada Código Mutante Tiempo de Resistencia a Razón: NEMO Proteólisis con 50% de Mutante/ ativo Actividad Total 525 L5E/Q10D 16 8 528 L5E/K108S 24 12 532 L6Q/L47I 24 12 533 L5D/K108S 24 12 534 L5N/L6E 24 12 538 L5Q/K108S 16 8 540 L5N/Q10D 24 12 541 L6Q/M361 16 8 542 L5DN86Q 20 10 543 L5N/ 108S 10 5 544 L5D/L6Q 10 5 545 L6E/Q10D 24 12 547 L5QN86Q 16 8 548 L6E 108S 20 10 551 L5D/L47I 20 10 553 L6Q/K108S 16 8 554 L5N/L6Q 24 12 557 L6EN86Q 24 12 558 L5Q/L6Q 20 10 559 L5D/M36I 24 12 560 L5N/L47I 24 12 561 L6QN86Q 24 12 523 Nativo 2,0 1,0 523 Nativo 2,0 1,0 523 Nativo 2,0 1,0 523 Nativo 2,0 1,0 523 Nativo 2,0 1,0 523 Nativo 2,0 1,0 523 Nativo 2,0 1,0 Promedio EJEMPLO 2 Clonamiento y Expresión de Mutantes IFN-ot-2b e IFN-o-2b El ADNc de Interferón alfa 2b (IFN- -2b) fue clonado para expresión en células animales y para expresión en un sistema de expresión procariótico . El ADNc de IFN-a-2b ADNc clonado para expresión en células animales codifica el péptido precursor de IFN-a-2b que contiene la señal de secuencia, para facilitar la expresión óptima. El ADNc de IFN-a-2b clonado para expresión en células procarióticas codifica solo el polipéptido de IFN-a-2b maduro. Los mutantes de IFN- -2b fueron subsiguientemente generados por mutagénesis sitio-dirigida en ambos sistemas, animal y procariótico .

A. Precursores de Mutantes IFN-cx-2b e IFN- ot- 2b para Expresión en Células animales Ácidos nucleicos que codifican la forma precursora de IFN-a-2b fueron clonados en un vector de expresión animal para expresión subsiguiente en células animales. El plásmido que codifica la forma precursora de IFN-a-2b fue usado en una serie de reacciones de mutagénesis sitio-dirigidas para generar LEADs de IFN-a-2b candidatos descritos en el anterior Ejemplo 1. 1. Clonación del ADNc con el Precursor de IFN-cc-2b ADNc de IFN-a-2b ADNc nativo que codifica el péptido precursor fue generado por amplificación por PCR y clonado en el vector de expresión animal, pSSV9-2EcoRI, previo a mutagénesis sitio-dirigida. a. Generación del Vector de Expresión Animal, pSSV9-2EcoRI El vector de expresión animal, pSSV9-2.Eco.RI, fue generado desde el vector pSSV9 CMV 0.3 pA (véase, Du y cois. (1996) Gene Ther 3:254-261), retirando las funciones de la repetición terminal invertida (ITR, siglas en inglés) e introduciendo un nuevo sitio de restricción enzimático EcoRI . Brevemente, el ADN del vector pSSV9 CMV 0.3 pA fue digerido con PvuII para retirar el fragmento que contiene las funciones ITR, y luego re-ligado. Un nuevo sitio de restricción EcoRI fue introducido por mutagénesis sitio-dirigida usando el kit de mutagénesis Quickchange Site-Directed (Stratagene) , de acuerdo a las instrucciones del fabricante, con oligonucleótidos complementarios específicamente diseñados que sirvieron de partidores que incorporaban un sitio EcoRI en el ADN sintetizado. Los oligonucleótidos partidores complementarios fueron: EcoRI partidor directo: 5' - GCCTGTATGATTTATTGGATGTTGGAATTCCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACG -3' (ID SEC NO: 2072) EcoRI partidor reverso: 5' - CGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGGAATTCCAACATCCAATAAATCATACAGGC-3' (ID SEC NO: 2073) El método QuikChange involucra la amplificación lineal del ADN templado por medio de polimerasa de ADN Pfu de Ultra alta fidelidad. Los partidores EcoRI directo y partidor EcoRI reverso, ambos con el sitio EcoRI, fueron extendidos durante los ciclos usando el vector pSSV9 CMV 0.3 pA (que había sido digerido previamente con PvuII y re- ligado) como un templado. La extensión de los partidores resultó en la incorporación de EcoRI en las hebras recién sintetizadas, y resultó en un plásmido mutado con muescas escalonadas. Luego de la amplificación, el ácido nucleico fue tratado con Dpnl, que digiere las hebras dam-metiladas padre del vector pSSV9 CMV 0.3 pA derivado de E. coli. Esto resultó en "selección" de plásmidos mutados recién sintetizados, que no estaban metilados. El vector de ADN que contiene el nuevo sitio EcoRI fue transformado en células XLIO-Gold ultracompetentes de E. coli, donde la ligasa bacteriana reparó las muescas y permitió que ocurriera la replicación normal. La inclusión del nuevo sitio EcoRI en el constructo resultante fue confirmado por la secuenciación usando los siguientes oligonucléotidos: Seq Clal partidor directo: 5=-CTGATTATCAACCGGGGTACATATGATTGACATGC-3 ' (ID SEC NO: 2074) Seq Xmnl partidor reverso: 5=-TACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAAC-3 ' (ID SEC NO: 2075) El fragmento XmnI-Clal que contiene el nuevo sitio introducido EcoRI fue clonado en pSSV9 CMV 0.3 pA para reemplazar el fragmento nativo correspondiente y producir el constructo pSSV9-2EcoRI . b. Generación de ADNc precursor de IFN-cx-2b Para facilitar la expresión óptima en células animales, el ácido nucleico que codifica el polipéptido precursor de IFN-a-2b fue generado primero. Esto se logró introduciendo los nucleótidos que codifican los 17 amino ácidos del péptido señal de IFN- -2b (primeros 17 amino ácidos de ID SEC NO: 2078) del extremo 5' de la secuencia de IFN-a-2b maduro (ID SEC NO: 2079) , usando dos amplificaciones de PCR. ADNc de IFN-a-2b nativo que codifica el polipéptido maduro fue obtenido desde el constructo pDG6 (ATCC) . La secuencia de ADNc de IFN-a-2b en pDG6 fue confirmada por secuenciación usando los siguientes partidores: Seq partidor directo: 5 ' -CCTGATGAAGGAGGACTC-3' (ID SEC NO: 2076) Seq partidor reverso: 5 ' -CCAAGCAGCAGATGAGTC-3' (ID SEC NO: 2077) Luego de la verificación de secuencia, el ADNc de IFN- -2b maduro fue amplificado por PCR desde el constructo pDG6 usando los siguientes partidores: Seq IFN-a-2b partidor directo: 5 ' -TCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTGTGGGCTG-3 ' (ID SEC NO: 2080) Seq IFN-a-2b partidor reverso Xbal (sitio Xbal subrayado) : 5' - GCTCTAGATCATTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGCAAGTTTGTTGAC-3 ' (ID SEC NO: 2081) El producto de PCR resultante fue luego usado como templado en una reacción de PCR en que el oligonucleótido partidor "directo" fue usado para introducir la señal de secuencia al extremo 5' del ADNc de IFN-a-2b maduro durante la amplificación. Los partidores usados en ésta reacción fueron los siguientes: IFN-a-2b 80bp partidor directo HindIII (sitio HindIII está subrayado; secuencia de péptido señal de IFN-a-2b está en negrita) : 5' -CCCAAGCTTATGGCCTTGACCTTTGCTTTACTGGTGGCCCTCCTGGTGC TCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTGTGGGCTG-3 ' (ID SEC NO: 2082) IFN-a-2b partidor reverso Xbal (sitio Xbal está subrayado) : 5' - GCTCTAGATCATTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGCAAGTTTGTTGAC- 3 ' (ID SEC NO: 2081) La secuencia de ADNc del precursor de IFN-a-2b ADNc contenida en el producto resultante del PCR fue aislado por digestión con HindIII y Xbal y clonado en el vector pTOPO-TA (Invitrogen; ID SEC NO: 2070) para generar pTOPO-IFN-a-2b. La secuencia del precursor de IFN- -2b fue confirmada por secuenciación automática de ADN. El vector pTOPO-IFN-a-2b fue digerido con HindIII y Xbal y el fragmento con la secuencia ADNc del precursor de IFN-a-2b ADNc fue clonado en los sitios correspondientes de pSSV9-2EcoRI (descrito anteriormente) para generar el constructo pAAV-EcoRI-IFN-a-2b (pNB-AAV-IFN-a-2b) . 2. Generación de Mutantes del Precursor de IFN-a-2b por Mutación Sitio- Dirigida Como se describió en el Ejemplo 1 anteriormente, los LEADs de IFN-a-2b candidatos fueron generados basados en la propiedad predeterminada de resistencia a proteasa usando la tecnología de exploración en 2D como se describió aquí y también descrito en la Patente de Estados Unidos U.S. Pat . Pub. Nos. US2004/0132977 y US2005/0202438 publicadas. Los mutantes fueron generados por mutagénesis sitio-dirigida usando partidores mutagénicos que fueron diseñados para generar las mutaciones sitio-específico apropiadas en el ADNc de IFNa-2b ADNc. Las reacciones de mutagénesis fueron realizadas con el kit de mutagénesis Chameleon (Stratagene) usando pNB-AAV-IFNa-2b como templado. Cada reacción de mutagénesis individual fue diseñada para generar una proteína mutante única. Cada reacción de mutagénesis contiene un partidor mutagénico. Por cada reacción, 25 pmoles de cada partidor mutagénico ( fosforilado) fueron mezclados con 0,25 pmoles de templado, 25 pmoles de partidores seleccionados con EcoRI (este partidor cambió un sitio de restricción EcoRI no esencial en un nuevo sitio de restricción EcoRV) , y 2 µ? de tampón de mutagénesis 10X (100 mM Tris-acetato pH 7,5; 100 mM MgOAc ; 500 mM KOAc pH 7,5) en cada pocilio de las placas de 96 pocilios. Para permitir la alineación del ADN de los partidores mutagénicos y de selección al ADN templado, las placas de PCR fueron incubadas a 98 °C durante 5 min e inmediatamente colocadas 5 minutos en hielo, antes de incubar a temperatura ambiente durante 30 min. Las reacciones de elongación y ligación se permitieron por la adición de 7 µ? de mezcla de nucleotidos (2,86 mM de cada nucleótido; 1,43 X tampón de mutagénesis) y 3 µ? de una mezcla enzimática fresca recién preparada de tampón de dilución (20 mM Tris HC1 pH 7,5; 10 mM KCl; 10 mM ß-mercaptoetanol ; 1 mM DTT; 0,1 mM EDTA; 50 % glicerol) , polimerasa ADN T7 nativa (0,025 U/µ?), y ligasa ADN T4 (1 ?7 µ?) en una razón de 1:10, respectivamente. Las reacciones fueron incubadas a 37 °C por lh antes de la inactivación de ligasa de ADN T4 a 72°C por 15 min. A manera de eliminar el plásmido parental, 30 µ? de una mezcla con tampón de enzima IX y 10U de enzima de restricción (EcoRI) se agregó a las reacciones mutagénicas seguido por incubación a 37 °C por al menos 3 horas. Luego, alícuotas de 90 µ? de células competentes XlmutS (Stratagene) con 25 mM ß-mercaptoetanol fueron colocadas en placas de pocilio profundo heladas en hielo. Luego, las placas fueron incubadas en hielo por 10 minutos con agitación suave cada 2 min. La transformación de células competentes XL-mut fue realizada agregando alícuotas de las reacciones de restricción (1/10 del volumen de reacción) e incubadas en hielo por 30 min. Un pulso de calor se realizó en un baño de agua a 42°C por 45 s, seguido por incubación en hielo por 2 minutos. Medio precalentado SOC (0,45 mi) fue agregado a cada pocilio y las placas fueron incubadas a 37 °C por 1 h con agitación. A manera de enriquecer los plásmidos mutados, 1 mi de medio de cultivo YT 2X suplementado con 100 µg/ml ampicilina fue agregado a cada mezcla de transformación seguido por incubación durante la noche a 37 °C con agitación. El aislamiento de ADN de plásmidos fue realizada por lisis alcalina usando el kit Nucleospin Multi-96 Plus Plasmid (Macherey-Nagel ) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La selección de los plásmidos mutantes se realizo por digestión de 500 g de preparación de plásmido con 10 U de endonucleasa de selección en una incubación durante la noche a 37 °C. Una fracción de las reacciones digeridas (1/10 del volumen total) fue transformada en 40 µ? de células competentes Epicurian coli XLl-Blue (Stratagene) suplementado con 25 mM ß-mercaptoetanol . La transformación fue realizada como se describió anteriormente. Las transformantes fueron seleccionadas en placas de agar LB-ampicilina incubadas durante la noche a 37 °C. Se seleccionaron colonias y fueron cultivadas durante la noche a 37 °C en placas de pocilios profundos. Se analizaron cuatro clones por reacción con digestión con endonucleasa para un nuevo sitio de restricción (EcoRV) que fue introducido por el partidor de selección. El ADNc de los clones mutantes seleccionados fue secuenciado para confirmar la presencia de las mutaciones.

B. Expresión de IFN-a-2b e IFN-a-2b (E41Q) Maduros para Expresión Procarionte Ácidos nucleicos codificando la forma madura de IFN-a-2b fueron clonados y sus codones optimizados por mutagénesis sitio-dirigida. El ADN con sus codones optimizados de IFN-a-2b ADN fue entonces usado como templado para generar la variante IFN-a-2 (E41Q) , que puede ser expresada en células procariontes . 1. Clonación de IFN-oc-2b Maduro para Expresión Procarionte Para expresar IFN-a-2b en E. coli, el ADNc que codifica la forma madura de IFN-a-2b (ID SEC NO: 2079) fue inicialmente clonado en el vector pTOPO-TA (Invitrogen) antes de optimizar sus codones. La secuencia de IFN-a-2b maduro con sus codones optimizados fue luego clonada en pETll (Novagen; ID SEC NO: 2183), y luego subclonada en un vector pET24 que había sido modificado por remoción de la región fl y la cola de Histidina. Brevemente, el ADNc de IFN-a-2b ADNc maduro fue amplificado por PCR desde pAAV-EcoRI-IFN-a-2b (descrito anteriormente) usando la ADN polimerasa Herculase (Stratagene) y los siguientes partidores: Seq IFNA partidor directo: 5 ' -AACATATGTGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGC-3 ' (ID SEC NO: 2083) Seq IFNA partidor reverso: 5 ' -AAGGATCCTCATTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGCAAGTTTGTTG-3' (ID SEC NO: 2084) El producto de PCR resultante fue clonado en un vector pTOPO-TA (Invitrogen) para generar pTOPO-IFN-a-2b maduro. La secuencia fue verificada a través de secuenciación usando el partidor directo M13. El vector de ADN de pTOPO-IFN-a-2b maduro fue digerido con Ndel y BamHI y el fragmento resultante fue subclonado en pETll (Novagen; ID SEC NO: 2183) para generar pETll-IFN-a-2b. La secuencia de ADN del constructo resultante pETll-IFN-a-2b fue verificada a través de secuenciación. a. Optimización de Codones A manera de obtener los máximos niveles de expresión de proteínas en E. coli, se realizó una optimización de codones en el transcripto de IFN- -2b maduro usando el kit de mutagénesis sitio-dirigida QuikChange (Stratagene; descrito anteriormente) . Las secuencias que codifican las argininas en las posiciones de amino ácidos 12, 13, 22, 23 y 33 de la secuencia de IFN-a-2b maduro establecidas en ID SEC NO: 2079 fueron mutadas de manera que un codón de arginina óptimo "CGT" fuera introducido en cada sitio. La secuencia que codifica la prolina en la posición de amino ácido 39 fue mutada de manera que un codón de prolina "CCG" fuera introducido. El codón de detención también fue optimizado por mutagénesis, reemplazando la secuencia endógena con un codón de detención "TAA" . La optimización de codones fue realizada en una serie de cuatro reacciones mutagénicas, en que el plásmido mutagenizado de la reacción previa fue usado como templado para la siguiente reacción. Los clones de E. coli que contenían los plásmidos mutagenizados fueron analizados después de cada paso para seleccionar uno que contuviera la(s) nueva(s) mutación (es ) . El ADN del plásmido del clon seleccionado fue entonces aislado y usado como templado en la siguiente reacción. Por consiguiente, las nuevas mutaciones fueron introducidas durante cada reacción hasta que la secuencia final de lFN-a-2b maduro contenía los 8 codones optimizados. La primera mutagénesis sitio-dirigida fue realizada para optimizar los codones que codifican los residuos de arginina en las posiciones de amino ácidos 12 y 13 de la secuencia de IFN-a-2b maduro. El ADN del plásmido pT0P0-IFN-a-2b maduro fue usado como templado, con los siguientes partidores: ARG12/13-5' : CACAGCCTGGGTAGCCGTCGTACCTTGATGCTCCTGGC (ID SEC NO: 2085) ARG12/13-3' : GCCAGGAGCATCAAGGTACGACGGCTACCCAGGCTGTG (ID SEC NO: 2086) Luego del análisis, el clon designado Al fue seleccionado y usado como templado para la segunda reacción de mutagénesis sitio-dirigida. Esta reacción fue realizada para optimizar los codones que codifican los residuos de arginina en las posiciones de amino ácidos 22 y 23 de la secuencia de IFN-a-2b maduro, y se usaron los siguientes partidores: ARG22/23-5' : ATGCTCCTGGCACAGATGCGTCGTATCTCTCTTTTCTCCTGC (ID SEC NO: 2087) ARG22/23-3' : GCAGGAGAAAAGAGAGATACGACGCATCTGTGCCAGGAGCAT (ID SEC NO: 2088) Luego de analizarlos, el clon designado Ala2 fue seleccionado y usado como templado para una tercera reacción de mutagénesis sitio-dirigida. Esta reacción fue realizada para optimizar los codones que codifican el residuo de arginina en la posición de amino ácido 39 de la secuencia de IFN-a-2b madura, y se usaron los siguientes partidores: ARG33/PR039-5' : CTCCTGCTTGAAGGACCGTCATGACTTTGGATTTCCGCAGGAGGAGTTTG GC (ID SEC NO: 2089) ARG33/PR039-3' : GCCAAACTCCTCCTGCGGAAATCCAAAGTCATGACGGTCCTTCAAGCAGG AG (ID SEC NO: 2090) Luego de analizarlos, el clon designado Ala2b34 fue seleccionado. El plásmido fue nombrado pTOPO-IFN-a-2b-MUT4 y fue usado en la última reacción de mutagénesis sitio-dirigida en que el codón de término de IFN-a fue modificado. Los siguientes partidores fueron usados en esta reacción: IFNATAA5 ' : GTTTAAGAAGTAAGGAATAAGGATCCTTAAGGGCG (ID SEC NO: 2091) IFNATAA3 ' : CGCCCTTAAGGATCCTTATTCCTTACTTCTTAAAC (ID SEC NO: 2092) El plásmido resultante con 8 codones optimizados fue designado pTOPO-IFN-a-2b-MUT4MUTSTOP3. b. Clonación de la Secuencia de -2b Optimizada en sus Codones El ADNc de IFN-a-2b con sus codones optimizados (IFN- -2b-MUT4MUTSTOP3) fue clonado en el vector de expresión, pET24a(+) (Novagen; ID SEC NO: 2069) , para expresión procarionte del polipéptido maduro. Previo a la clonación, sin embargo, la región de cola de Histidina fue retirada del vector pET24a(+) vector. Luego de la clonación de IFN-a-2b-MUT4MUTSTOP3 en pET24a(+), el origen de replicación fl también fue retirado . La región de la cola de Histidina en pET24a(+) está rodeada por los sitios de restricción BlpI y Xhol . El vector pET24a(+) fue digerido con BlpI y Xhol para remover la cola de Histidina, y el fragmento de ADN restante de 5,2 kb fue tratado con el fragmento Klenow de la polimerasa de ADN I para crear extremos romos. Luego de la purificación, el fragmento de 5,2 kb fue religado para formar pET24aAHisl. IFN-a-2b-MUT4MUTSTOP3 fue introducido en pET24aAHisl digiriendo primero pTOPO-IFN- -2b-MUT4MUTSTOP3 con Ndel y BamHI y aislando el fragmento de 500 bp . El plásmido pET24aAHisl también fue digerido con Ndel y BamHI, y el fragmento de 500 bp que contiene IFN- -2b-MUT4MUTSTOP3 fue insertado en el plásmido por ligación. El plásmido resultante fue designado pET24aAHisl-IFN-a-2b-MUT4MUTSTOP1. Dos sitios Spel que rodean el origen de replicación fl en pET24aAHisl-IFN- -2b-MUT4MUTSTOPl fueron introducidos por mutagénesis sitio-dirigida con QuikChange para facilitar la remoción de esta región. La primera reacción usó pET24aAHisl-IFN- -2b-MUT4MUTSTOP1 como templado, y el primer sitio Spel fue introducido usando los siguientes partidores: 1SPEI5' : GCTGAAAGGAGGAACTAGTTCCGGATTGGCGAATGG (ID SEC NO: 2093) 1SPEI3' : CCATTCGCCAATCCGGAACTAGTTCCTCCTTTCAGC (ID SEC NO: 2094) El clon resultante pET24aAHisl-IFN-a-2b-MUT4MUTSTOPlMutlSpeICll fue entonces usado como templado en la segunda reacción. Los siguientes partidores fueron usados para introducir el segundo sitio Spel: 2SPEI5' : CAATTTCAGGTGGCACTAGTCGGGGAAATGTGCGC (ID SEC NO: 2095) 2SPEI3' : GCGCACATTTCCCCGACTAGTGCCACCTGAAATTG (ID SEC NO: 2096) El plásmido resultante pET24aAHisl-IFN-a-2b-MUT4MUTSTOPlMutl+2SpeI Cln°3B fue digerido con Spel para remover el origen de replicación fl. El fragmento remanente de 5,2 kb fue purificado y religado. El plásmido resultante pET24aAHisl-IFN-a-2b- MUT4 UTSTOPlMutl+2SpeI Cln°3B fue secuenciado completamente usando el partidor T7 y los siguientes 10 partidores : IFNAT71: CTG GGA GGT TGT CAG AGC (ID SEC NO: 2097) pET24T72: ACC ATG AGT GAC GAC TG (ID SEC NO: 2098) pET24T73: CCC GAC ATT ATC GCG AGC (ID SEC NO: 2099) pET24T74: TCA AGA CGA TAG TTA CCG (ID SEC NO: 2100) pET24T75: CTC CTT ACG CAT CTG TGC (ID SEC NO: 2101) pET24T76: TAC TGA TGA TGA ACA TGC (ID SEC NO: 2102) pET24T77: TCA TCG TCG CGC TCC AGC (ID SEC NO: 2103) pET24T78: ATC CGC ACC AAC GCG CAG (ID SEC NO: 2104) pET24T79: TCG TTC TAC CAT CGA CAC (ID SEC NO : 2105) pET24T710: GCA TGC AAG GAG ATG GCG (ID SEC NO: 2106) Luego de verificar la secuencia, el plásmido fue designado pET24NAUT-IFN-a-2b-WT. El plásmido pET24NAUT-IFN- -2b-WT fue transformado en células competentes de E. coli BLR(DE3) (Novagen) y se generó una reserva de células BLR/pET24NAUT- IFN-a-2b en 40% glicerol que fue guardado en un criotubo a -80°C. 2. Generación de la Variante IFN-o-2b (E41Q) Para generar la variante IFN- a -2b(E41Q), el codón de ácido glutámico fue sustituido con un codón de glutamina en la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el amino ácido en la posición 41 de la secuencia establecida en ID SEC NO: 2067. Esto se logró usando el kit de mutagénesis sitio-dirigida QuikChange (Stratagene) con el ADN del vector pET24NAUT- IFN-a-2b(E41Q) como el templado y los siguientes partidores: E41QMUT4 : GACTTTGGATTTCCGCAGCAGGAGTTTGGCAACCAG (ID SEC NO: 2107) E41QMUT4C: CTGGTTGCCAAACTCCTGCTGCGGAAATCCAAAGTC (ID SEC NO: 2108) . Uno de los clones resultantes, pET24NAUT- IFN-OÍ- 11c , fue seleccionado y el plásmido fue designado pET24NAUT-IFN-a-2b(E41Q) (ID SEC NO: 2068). El ADN de pET24NAUT-IFN-a-2 (E41Q) fue entonces transformado en células competentes de E. coli BLR(DE3) (Novagen) . Las células BLR/pET24NAUT-IFN-a-2b (E41Q) se crecieron en medio YP y una reserva con 40% de glicerol se guardó a -80°C. Las células BLR/pET24NAUT-IFN-o¡-2b (E41Q) también se crecieron en medio LB para generar una reserva con 40% de glicerol que se guardó a -80°C.

EJEMPLO 3 Producción a Escala de Laboratorio de IFN-a- 2b(E41Q) Para la producción de IFN-a-2b (E41Q) para estudios iniciales de toxicología, las células BLR/pET24NAUT-IFN-a-2b (E41Q) fueron cultivadas en medio LB (medio base LB en polvo (Base de Medio Lennox L) , 5 g/L NaCl, 10 g/L Peptona Select 140 (digestión pancreática de caseína) , 5 g/L Extracto de Levadura Select autolisado con bajo sodio ( Invitrogen) ) . Para estudios subsiguientes, las células BLR/pET24NAUT-IFN- a-2b(E41Q) fueron cultivadas en medio YP (1% Extracto de Levadura (Bio Springer) , 2% A3 Peptona de Soya (Organotechnie) , 2% NaCl (Sigraa) ) . La proteína IFN-a-2b(E41Q) fue luego purificada desde el cultivo, solubilizada y replegada. Pasos de purificación adicional usando técnicas de cromatografía fueron realizados antes del paso final de filtración para obtener la proteína IFN-a-2b (E41Q) purificada. 1. Cultivo de un Lote de 1L y Sobre- expresión por Inducción de IFN-cc- 2b(E41Q) Un criotubo con la reserva en glicerol de las células BLR/pET24NAUT- IFN-a- 2b (E41Q) (previamente crecidas en medio LB) fueron cultivadas en 300mL de LB suplementado con 30 g/mL kanamicina (Sigma) por 15-16 h a 37°C. Una solución de 1 litro de LB/kanamicina fue inoculada con un volumen de pre-cultivo suficiente para alcanzar una OD600nm = 0,07 y se creció a 37°C. Cuando el cultivo alcanzó una OD60onm = 0,6 (8,70 x 106 células/mL estimado) , se indujo la sobre-expresión de IFN- -2b(E41Q) agregando 250 µ? de 2 M IPTG (Amersham) . El cultivo inducido se creció por 3 h adicionales a 37 °C. El tiempo de duplicación estimado fue de 45 min. La OD60onm final fue 1,8 a 2,2 con un rendimiento estimado de aproximadamente 30 a 40 mg/L. El cultivo fue centrifugado a 4°C, 5.000xg, por 15 min, y el depósito bacteriana fue cosechado y guardado a -20°C. 2. Purificación La proteína IFN-a-2b (E41Q) fue inicialmente purificada desde el lisado celular y luego solubilizada y replegada. Cromatografías de intercambio aniónico, cromatografía de interacción hidrofóbica y cromatografía de exclusión por tamaño se realizaron antes del paso final de filtración para obtener la proteína IFN-a-2b (E41Q) purificada. a. Remoción de Células, Separación y Disrupción El depósito bacteriana fue descongelado a temperatura ambiente previo a la lisis mecánica. Las células descongeladas fueron resuspendidas en tampón de lisis (lisozima, 10 mM CaCl2 y 1 U/mL DNasa I) y sonicadas por 8 min en hielo. El lisado fue centrifugado a 4°C, 10.000 x g, por30 min. El sobrenadante fue retirado y el depósito fue guardado a -20°C. El rendimiento de este paso fue de 99% y la pureza se estimó > 60%. Debido a la sobre-expresión en E. coli y la naturaleza hidrofóbica de la proteína, la proteína IFN-a-2b(E41Q) se acumuló en cuerpos de inclusión luego de la lisis bacteriana. El depósito lisado congelado que contenía los cuerpos de inclusión fue descongelado a temperatura ambiente. Los contaminantes lípidos fueron retirados desde los cuerpos de inclusión con dos pasos de lavad consecutivos (cada paso de lavado fue repetido dos veces) . En el primer paso de lavado, los cuerpos de inclusión fueron resuspendidos en 0,5% Tritón X100 (Cario Erba) y homogenizados usando un homogenizador UltraTurrax a 4.000 rpm por 8 seg. La muestra homogenizada fue centrifugada a t 4°C, 8.000xg por 30 min y el sobrenadante fue retirado. En el segundo paso de lavado, los cuerpos de inclusión fueron resuspendidos en 5% glicerol (Sigma) y homogenizados usando un homogenizador UltraTurrax a 4.000 rpm por 8 seg. La muestra homogenizada fue centrifugada a 4°C, 8.000xg por 30 min y el sobrenadante fue retirado. El depósito fue resuspendido en 5% glicerol y guardado a -20°C. El rendimiento luego de los dos pasos de lavado fue de 95% y la pureza fue estimada > 70%.

Un paso final de lavado se realizó mezclando proteína IFN-a-2b (E41Q) con un volumen equivalente de 6 M de cloruro de guanidinio (Merck) . La mezcla fue agitada violentamente por 30 segundos y centrifugada a 13.000xg por 10 minutos, produciendo un rendimiento de 95% con una pureza estimada de 75%. El rendimiento fue estimado comparando el rendimiento de recuperación entre la proteína total e IFN-a-2b (E41Q) (OD28o) ; mientras que la pureza fue estimada por un SDS-PAGE teñido con una combinación de Azul de Coomassie Blue y nitrato de plata. Además, la integridad de la proteína fue verificada a través de ensayos de actividad antiviral específica como se describió en Ejemplo 1. Estos métodos para determinar rendimiento, pureza e integridad también fueron usados en pasos subsiguientes de purificación que se describen más adelante. b. Solubilizacion y Replegado de IFN- <x-2b(E41Q) Los cuerpos de inclusión fueron denaturados por 30 minutos en tampón de denaturación (6 M de cloruro de guanidinio) con una razón 5:1 por volumen. La proteína fue diluida en 50 veces el volumen del tampón de renaturación (50 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,2 M L-Arg (Sigma) y 5% glicerol) para efectuar el replegado. El exceso de cloruro de guanidinio fue retirado por un primer paso de diálisis en 20 veces el volumen del tampón de renaturación por 15-16 horas, seguido por un segundo paso de diálisis en 80 veces el volumen 10 mM tampón Tris pH 8,0 por 2,5 horas a 4°C (repetido dos veces) y subsiguiente filtración con una membrana PES de 0,45 pm. El rendimiento y pureza luego de estos pasos fueron estimados ambos en alrededor de 85%. c. Pasos de Purificación Cromatográfica Luego de los pasos de solubilización y replegado descritos anteriormente, IFN- -2b (E41Q) fue purificada a través de cromatografía. El primer paso cromatográfico fue realizado usando una columna de intercambio aniónico de 20 mL (IA) Q Sefarosa FF (Amersham) a una velocidad de flujo de 120 cm/h, a 4°C. La columna fue equilibrada con 5 volúmenes de columna (VC) de 50 mM Tris pH 8,5. Luego de que la muestra fue cargada, la columna fue lavada con 4 VC de 50 mM Tris pH 8,5. La primera elución fue realizada con 3VC de una solución de 50 mM Tris pH 8,5, 200 mM NaCl . Una segunda elución fue realizada con 2VC de una solución de 50 mM Tris pH 8,5, 1 M NaCl . La regeneración fue realizada con 5 VC de 1M NaOH seguido por un paso de lavado con 3VC de 50 mM Tris pH 8,5. La pureza luego del primer paso cromatográfico fue estimado en 90%. La primera fracción eluida fue guardada a 4°C para uso inmediato (es decir menos de 1 semana) o a -20°C para períodos extendidos (es decir más de 1 semana) . El segundo paso cromatográfico fue realizado usando una Columna de Interacción Hidrofóbica de 5 mL (CIH) Hi Trap Fenil Sefarosa HP (Amersham) a una velocidad de flujo de 180 cm/h, a 4°C. La columna fue equilibrada con 5VC de 50 mM Tris pH 8,5, 0,8 M (NH4)2S04. Luego de que la muestra fue cargada, la columna fue lavada con 4VC de 50 mM Tris pH 8 , 5 , 0,8 M (NH )2S04. La primera elución fue realizada con 8VC de 50 mM Tris pH 8 , 5 , 0,4 M (NH4)2S04. Una segunda elución fue realizada con 4VC de 50 mM de Tris pH 8,5. La regeneración fue realizada con 5VC de 1M NaOH seguido por un paso de lavado con 3 VC de 50 mM Tris pH 8,5, 0,8 M (NH4)2S04. Este paso cromatográfico remueve trazas de endotoxinas y ADN, entregando una pureza estimada de 95%. La fracción de la primera elución fue guardada a 4°C para uso inmediato (es decir menos de 1 semana) o a -20 °C para períodos extendidos (es decir, más de 1 semana) . A manera de controlar el nivel de proteína acetilada en el material final, un paso de mejoramiento cromatográfico LP-IA fue introducido luego del segundo paso cromatográfico . Este paso de control de acilación fue programado con una columna de IA de lmL Q HP (Amersham) a una velocidad de flujo de 1,27 cm/min, en 20 mM Tris pH 8,5 a 20°C. Un paso de lavado de 0,2 VC fue realizado con el mismo tampón. Se operó un primer gradiente entre 20 mM Tris pH 8,5 y 20 mM Tris pH 7,2 por 10 VC. Se operó un segundo gradiente entre 20 mM Tris pH 7,2 y 20 mM bis-Tris pH 6,0 por 20 VC, seguido por la aplicación de 60VC de 20 mM bis-Tris pH 6,0. Las fracciones fueron colectadas operando a un nivel de 1VC. Proteínas IFN-a-2 (E41Q) fueron colectadas hasta que el nivel de acetilación alcanzó un máximo de 10%, como se determinó por RP-HPLC. El tercer paso cromatográfico fue realizado usando una columna de Cromatografía de Exclusión por Tamaño (CET) Superdex 75 XK 16/70 (Amersham) a una velocidad de flujo 24 cm/h, a 4°C. La columna fue equilibrada con 280 mL de 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl . Seguido a la equilibración, se cargó 0,5 mL de muestra (~1 mg/mL) en la columna y las proteínas IFN-a- 2b(E41Q) fueron colectadas entre 76 min y 85 min (pico de elución entre 0,6 VC y 0,8 VC) . Este paso cromatográfico remueve trazas de pequeñas proteínas con las mismas propiedades de punto isoeléctrico e hidrofobicidad que las de IFN-a, dando una pureza estimada de 97%. d. Purificación Final En el paso final de purificación, el líquido fue filtrado usando una membrana PES de 0,22 µp\, concentrado hasta entre 0,4 mg/mL a 0,6 mg/mL IFN-a-2b(E41Q) usando el sistema Centricon Plus-80 (Millipore) , y guardado a 4°C para uso inmediato (< 1 semana) o a -20°C (> 1 semana) . Esta sustancia líquida purificada fue usada en estudios de toxicología subcutánea para IFN-a-2b (E41Q) descrito en Ejemplos 8, 15, 16. B.3, 16. C.1-2, 17.A-B, 18.A-C. Lotes adicionales de 4, 10, y 12 L de cultivos líquidos de IFN-a-2b (E41Q) fueron generados para uso en investigaciones animales (ver Ejemplos 9a, 16. A.3). Los métodos para expresión y purificación de IFN-a-2 (E41Q) desde estos lotes fueron idénticos a los métodos para expresión y purificación del lote de 1 L descrito anteriormente, con la excepción de que el paso cromatográfico CET fue omitido previo a la purificación final. Además, tres lotes de IFN-a-2b de 4 , 10 y 11 L fueron producidos y parcialmente purificados (sin el paso CET) de acuerdo a los procedimientos anteriores.

Los variados lotes a escala de laboratorio de IFN-a- 2b(E41Q) e IFN-a-2b nativo se resumen en la Tabla 30 a continuación .

TABLA 30: Lotes a esca a de laboratorio de IFN-a-2b(E41Q) e IFN- a-2b Nativo Producto Lote No. Volumen Método de Forma Usado em de Cultivo Producción de la Ejemplos: de Partida Droga IFN-a- IFN 001- 4 L Escala Líquida 8, 15, 16.B.3, 2b(E41Q) 05; IFN Laboratorio; 16. C.1-2, 003-05 Purificación 17. A-B, completa 18. A-C IFN-a- IFN 005- 4 L Escala Líquida 9 2b(E41 Q) 05 Laboratorio; Purificación parcial IFN-a- IFN 007- 10 L Escala Líquida 9 2b(E41Q) 05 Laboratorio; Purificación parcial IFN-a- IFN 008- 12 L Escala Líquida 16.A.3 2b(E41 Q) 05 Laboratorio; Purificación parcial IFN-a-2b IFN 004- 4 L Escala Líquida 9 05 Laboratorio; Purificación parcial IFN-a-2b IFN 006- 10 L Escala Líquida 9 05 Laboratorio; Purificación parcial IFN-a-2b IFN 002- 1 1 L Escala Líquida 8, 9, 1 1 , 20.C 06 Laboratorio; Purificación parcial EJEMPLO 4 Preparación de IFN-o-2b (E41Q) para Uso Pre-clí y Clínico IFN-a-2 (E41Q) fue preparado desde células BLR/pET24NAUT-IFN-a-2b (E41Q) para uso pre-clínico y clínico de acuerdo a los procedimientos descritos más adelante. Usando materiales de calidad farmacéutica, la producción escalada de IFN-a-2b (E41Q) para uso pre-clínico y clínico resultó en producto final apropiado para uso en humanos. Los métodos para producción de banco maestro de células (BMC) , fermentación, cosecha de biomasa, lisis bacteriana, tratamiento de cuerpos de inclusión (CI) , purificación de IFN-a-2b (E41Q) y formulación de líquido de IFN-a-2b (E41Q) para uso pre-clínico y clínico se describen más adelante. 1. Proceso de Producción de Banco de Células Maestro (BCM) Seis placas de YP agar/ kanamicina (30 g/mL) fueron inoculadas con la reserva en glicerol de BLR/pET24NAUT-IFN-a-2b (E41Q) YP (ver Ejemplo 2B) . Luego de incubar en placas por 15-30 h a 37°C, una colonia única fue transferida desde la placa en 450 mL de medio YP/ kanamicina (30 g/mL) . El cultivo fue incubado a 37°C por 8-12 h, hasta que se alcanzó una OD6oonm = 2,0 + 0,3. Las células fueron colectadas agregando medio para criopreservación a una concentración final de 15% (v/v) y alicuotado en muestras de 1 mL en 240 viales etiquetados. Las alícuotas de BCM fueron criopreservadas usando un congelador de velocidad controlada, y los viales fueron transferidos para almacenaje a-70°C en la fase vapor de nitrógeno líquido. 2. Fermentación Grandes cantidades de células BLR/pET24NAUT-IFN-a-2b (E41Q) se crecieron por fermentación. Para el pre-cultivo, una alícuota congelada de BCM fue descongelada y 830 µ? fueron mezclados con 40 mL de medio de crecimiento YPN 2x (1% Extracto de Levadura, 2% Peptona de Soya, 2% NaCl) , y alícuotas de 8 mL fueron distribuidas en5 frascos agitables de 500 mL. Los frascos fueron incubados con agitación a 250 rpm a 35 °C por alrededor de 17 h. Para cultivos en lote, 100 L de medio de cultivo YPN 2x en un biorreactor B. Braun Biotech International de 150 L fue inoculado con el pre-cultivo con una OD6oonm = 0,007 de partida. La fermentación procedió a 37 °C aproximadamente por 7,30 h, y fue realizado a agitación constante (500 rpm) , flujo de aire a 50 L/min, anti-espumante de alta sensibilidad, sin antibióticos y sin el uso de regulación de p02 y pH. Cuando se alcanza una OD60onm de 3,2 ± 0,5, la expresión de IFN-a-2b (E41Q) fue inducida por la adición de 100 mL de 0,5 M IPTG (agente inductor) . 3. Cosecha de Biomasa Luego de 3 h post-inducción, el cultivo fue cosechado y la biomasa separada del medio de cultivo por filtración con flujo tangencial (FFT) a través de fibras huecas (Amersham UFP- 500 -E- 55 , 2,1 m2 , NMWC 500.000) usando una bomba peristáltica de alto flujo Watson-Marlow 704U/R (equipada con una segunda bomba RX 701, manómetros de entrada/salida, y una bomba peristáltica auxiliar). Específicamente, la suspensión bacteriana fue primero concentrada 20-25 veces, y luego diafiltrada a un volumen constante contra 4 a 5 volúmenes de 10 mM Tris lmM EDTA pH 8,0. El circuito fue enjuagado con 10 mM Tris lmM EDTA pH 8,0 y la solución de enjuague fue colectada con la biomasa diafiltrada. La operación de cosecha fue realizada a temperatura ambiente. La biomasa diafiltrada (10 + 2 L) fue transferida a una bolsa y guardada a -20°C hasta el paso de lisis. 4. Lisis Bacteriana Un paso de lisis mecánico fue realizado para extraer la proteina IFN- -2b (E41Q) desde las células bacterianas . La biomasa bacteriana fue descongelada por 36 a 72 horas a 4°C o a temperatura ambiente. El volumen de biomasa fue ajustado a 12 L con la adición de 10 mM Tris + 1 mM EDTA, pH 8,0. A manera de disgregar los agregados y reducir la viscosidad de la suspensión, la biomasa fue vigorosamente homogenizada por medio de un homogenizador Ultra-Turrax T50 por 15 min a 10.000 rpm. Las células bacterianaes fueron entonces disgregadas mecánicamente a través de un disgregador de células Panda 2K a 750 bares. El lisado bacteriana resultante fue centrifugado por 30 min a 10°C y 15.000xg. El sobrenadante fue retirado y los depósitos resultantes de cuerpos de inclusión fueron ya sea guardados a 4 °C por menos de 24 h o congelados a -20°C hasta el siguiente paso de purificación. 5. Tratamiento de Cuerpos de Inclusión (CI) a. Lavado de CI A manera de remover los contaminantes lípidos, los depósitos de cuerpos de inclusión (CI) fueron sujetos a cuatro pasos de lavado. Los depósitos de CI fueron resuspendidos en 0,5% Tritón X100 y centrifugados por 25 min a 4°C y 15.000xg. Los depósitos fueron colectados y el sobrenadante retirado. Un segundo lavado con 0,5% Tritón X100 se realizó, seguido por dos lavados adicionales con 5% glicerol. Después del cuarto lavado, los depósitos fueron resuspendidos en 400 mL de 5% glicerol y dividido en dos conjuntos del mismo volumen (depositados en dos biocontenedores plásticos) . Ambas suspensiones fueron guardadas a -20°C hasta el siguiente paso de purificación. El almacenaje fue típicamente alrededor de un mes. b. Denaturación de los CI y Renaturación de IFN- -2 (E41Q) Para liberar la proteína desde los cuerpos de inclusión, fue necesario realizar un paso de denaturación seguido de un paso de renaturación para replegar la proteína. Los siguientes pasos fueron realizados sucesivamente en cada biocontenedor con suspensión de CI guardados a -20 °C. La suspensión de CI fue diluida con tampón de denaturación (6 M cloruro de guanidinio, 50 mM Tris 10 mM EDTA, 2 mM DTT, pH 8,0) para alcanzar un volumen 100 veces mayor que el peso de los CI . La solución de CI denaturados fue luego incubada bajo agitación por 1 hr a temperatura ambiente. La solución de CI fue agregada al tampón de renaturación (0,2 M L-Arginina, 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 5% glicerol, pH 8,0) a una velocidad de flujo de 25 mL/min (dilución 1/50) . La solución fue incubada con agitación a 4°C durante la noche. c. Concentración con Diafiltración de la Solución de Proteína Renaturada La concentración y diafiltración fueron realizadas a 4°C con una filtración de flujo tangencial (FFT) , usando una bomba peristáltica, 2 manómetros y una membrana PES Pellicon"^ "Maxi" Filter Biomax (EFA: 2,5 m2, tamaño de corte: 10 kDa) .

Primero la membrana fue enjuagada con agua para inyección (API), luego con 10 L de 0,1 M NaOH sin recirculación. La sanitización de la membrana fue realizada usando 10 L de 0,1 M NaOH con un contacto que duró 2 hr. El sistema fue purgado del 0,1 M NaOH y enjuagado con 20 L de 20 mM NaOH por 5 min. El sistema fue purgado del 20 mM NaOH y enjuagado con 10 L de tampón de renaturación sin recirculación. El sistema fue equilibrado con 10 L de tampón de renaturación hasta que el permeado alcanzó pH 8,0. Las partículas residuales en la solución de proteínas renaturadas fueron eliminadas por filtración usando una cápsula de 2 filtros de 0.45 µp? y 0.2 ym Sartopore (EFA = 0,2 m2 , membrana PES, Sartorius) . La solución clarificada fue concentrada 5 a 10 veces, dependiendo de la turbidez del líquido retenido. La solución fue entonces intercambiada contra 5 volúmenes de 20 mM Tris pH 8,0. Las condiciones de presión fueron establecidas de manera de obtener una presión trans-membrana de 0,5 bares y una velocidad de flujo del permeado de entre 0,3 y 1 L/min. Al final de la diafiltración, el líquido retenido fue colectado y el sistema FFT fue lavado con 3-5 L de 20 mM Tris pH 8,0 que fue agregado a la solución de líquido retenido. Los precipitados residuales fueron eliminados por filtración usando una cápsula de 2 filtros de 0,45 µ?? y 0,2 m Sartopore (EFA 0,45 m2 , membrana PES, Sartorius) . La solución clarificada fue guardada a 4°C hasta proceder con los siguientes pasos de purificación. 6. Purificación A manera de aumentar la pureza de la solución de IFN-a-2b (E41Q) , se realizaron siete pasos de purificación como se describe más adelante. El sistema de cromatografía usado para los pasos de purificación de IFN- -2b (E41Q) fue un Akta Pilot de Amersham. a. Paso 1: Cromatografía de Intercambio Aniónico (CIA) El primer paso de purificación se llevó a cabo a 4°C, usando resina Q Sefarosa FF, empacada con API en una columna BPGIOO con una velocidad de flujo de 240 mL/min. Las características de la resina son como sigue: sección: 78,5 cm2 ; altura: 15 cm; volumen: 1.965 cm3. Una velocidad de flujo de 200 mL/min se usó para los pasos de carga, lavado, elución y regeneración. Antes de usar, la columna fue sanitizada con 2 volúmenes de columna (VC) de 1M NaOH por 2 h seguido por 2-3 VC de 20 raM NaOH con una velocidad de flujo de 200 mL/min. La columna fue mantenida en 20 mM NaOH hasta su uso (por un máximo de 28 días a 4°C) . La columna fue equilibrada con 2-3 VC de 20 mM Tris 1 M NaCl pH 8,0 seguido por 2-3 VC 20 mM Tris pH 8,0. La solución de IFN- -2b (E41Q) fue cargada en la columna seguido por un paso de lavado con 3-4.5 VC de 20 mM Tris, pH 8,0. La proteína fue primero eluida con 2,5-3,5 VC de una solución con 20 mM Tris y 100 mM NaCl, pH 8,0, seguido por una segunda elución con 2,5-7,5 VC de una solución con 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0. La columna fue lavada con 2,5-3,5 VC de 20 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 8,0, regenerada con 2,5-3,5 VC de 20 mM Tris + 1 M NaCl, pH 8,0, y re-sanitizada de acuerdo al procedimiento mencionado anteriormente. El producto del lavado y elución se mantuvo a 4°C por 1-5 días . b. Paso 2: Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (CIH) El segundo paso de purificación fue conducido a 4°C, usando resina Fenil Sefarosa FF, empacada con API en una columna BPG100 a una velocidad de flujo de 240 mL/min. Las características de la resina son como sigue: sección: 78,5 era2 ; altura: 20 cm; volumen: 1.570 cm3. Una velocidad de flujo de 200 mL/min se usó para los pasos de carga, lavado, elución, regeneración y sanitización . Antes de usar, la columna fue sanitizada con 2 volúmenes de columna (VC) de 1M NaOH por 2 h seguido por 2-3 VC de 20 mM NaOH con una velocidad de flujo de 200 mL/min. La columna fue mantenida en 20 mM NaOH hasta su uso (por un máximo de 28 días a 4°C) . La columna fue equilibrada con 3-5 VC de una solución que contenía 20 mM Tris y 0,8 M (NH4)2S04> pH 8,0. Las fracciones eluidas del paso anterior (paso CIA) fueron colectadas juntas y ajustado a la misma conductividad que el tampón de equilibrio con la adición de una solución de 3,4 M (NH4)2S04. La solución de IFN-a-2b (E41Q) fue cargada en la columna seguido por cuatro pasos de lavado: 1) 2-4 VC de 20 mM Tris, 0,8 M (NH4)2S04, pH 8,0; 2) 3-5 VC 20 mM Tris, 0.6 M (NH4)2S04, pH 8,0; 3) 3-5 VC de 20 mM Tris, 0.5 M (NH4)2S04, pH 8,0; y 4) 3-5 VC 20 mM Tris, 0.4 M (NH4)2S04, pH 8,0. Los cuatro pasos de lavado fueron seguidos por tres eluciones: 1) 8-11 VC de 20 mM Tris, 0,3 M (NH4)2S04, pH 8,0; 2) 4-6 VC de 20 mM Tris, 0,2 M (NH4)2S04, pH 8,0; y 3) 3-5 VC de 20 mM Tris, 0,1 M (NH4)2S04, pH 8,0. Los tres pasos de elución fueron seguidos por tres pasos de regeneración: 1) 3-5 VC de 20 mM Tris, 0,05 M (NH )2S0 pH 8,0; 2) 3-5 VC de 20 mM Tris, pH 8,0; y 3) 4-10 VC API (agua para inyección) . La columna fue re-sanitizada de acuerdo al procedimiento descrito anteriormente. El producto de la elución fue mantenido a 4°C por 1-5 días hasta el siguiente paso de purificación (diafiltración) .

Paso 3: Diafiltración Las fracciones eluidas desde el paso de purificación con CIH anterior fueron diafiltradas , usando una bomba peristáltica, 2 manómetros y un cartucho TFF P2B010A05 en PES (Millipore, PMNL: 10 kDa, EFA: 0,5 m2 ) colocado en un carrete Pellicon2 XX42P0060. El paso completo fue conducido a 4°C. Antes de usar, la membrana fue enjuagada con API previo a su sanitización. La membrana fue nuevamente enjuagada con 5 L de 0,1 M NaOH sin recirculación. La sanitización se realizó usando 10 L de NaOH 0,1 M por 2h. El sistema fue purgad del 0,1 M NaOH y enjuagado con 5 L de 20 mM NaOH por 5 min. El sistema fue entonces purgado de 20 mM NaOH y enjuagado con 2 L de 20 mM Tris pH 8,5 sin recirculación, luego de lo cual fue equilibrada con 10 L de 20 mM Tris, pH 8,5, hasta que el permeado alcanzó un pH 8,5. Las fracciones de elución desde CIH fueron colectadas juntas y diafiltradas contra al menos 4 volúmenes de 20 mM Tris, pH 8,5 (= tampón de intercambio) , a una presión trans-membrana de 0,5 bar. Al final de la diafiltración, el líquido retenido fue colectado y el sistema FFT fue lavado con 1-2 L de 20 mM Tris, pH 8,5, que fue agregado al líquido retenido. El sistema completo fue re-sanitizado como se describió previamente. d. Paso 4: Columna LP-CIA (Q Sefarosa HP) El cuarto paso de purificación fue conducido a temperatura ambiente, usando resina Q Sefarosa High Performance (Q HP) , empacada con API en una columna BPG100 a una velocidad de flujo de 100 mL/min. Las características de la resina son como sigue: sección: 78,5 cm2 ; altura: 12 cm; volumen: 943 cm3. Una velocidad de flujo de 100 mL/min fue usado en los pasos de carga, lavado, elución, regeneración y sanitización. Antes de usar, la columna fue sanitizada con 2 volúmenes de columna (VC) de 1 M NaOH por 2 h seguido por 2-3 VC de 20 mM NaOH con una velocidad de flujo de 100 mL/min y almacenaje subsiguiente de la columna en 20 mM NaOH hasta su uso (máximo de 28 días a 4°C) . La columna fue equilibrada con 2-5 VC de 20 mM Tris, 1 M NaCl, pH 8,5, seguido por 2-3 VC de 20 mM Tris, pH 8,5. La solución de IFN-a-2 (E41Q) fue cargada en la columna seguido por un paso de lavado con 0,5-1,0 VC de 20 mM Tris, pH 8,5. Cada paso de elución fue colectado en fracciones. Muestras de cada fracción fueron colectadas juntas de manera de obtener muestras del conjunto representativo de distintos rendimientos en recuperación (por ejemplo, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, etc.) . Luego, cada conjunto de muestra fue analizado para determinar el nivel de acetilación (especificación: < 2%) . La primera elución fue realizada con un gradiente de pH en 10VC desde 20 mM Tris, pH 8,5, a 20 mM Tris, pH 7,2, seguido por una segunda elución con un gradiente de pH en 20 VC desde 20 mM Tris, pH 7,2, a 20 mM bis-Tris, pH 5,9. La columna fue lavada con 30 VC de 20 mM bis-Tris, pH 5,9, regenerado con 3-5 VC de 1 M NaCl, y re-sanitizada de acuerdo al procedimiento mencionado anteriormente. El producto del lavado y elución fue guardado a 4°C por 1-5 días. Todas las fracciones de la primera y segunda elución fueron guardadas a 4°C hasta necesitarlas. e. Paso 5: Concentración Pre-SEC Un paso de concentración fue realizado usando filtración de flujo tangencial (FFT) . Las fracciones de la elución del paso de purificación en Q Sefarosa HP fueron colectadas juntas de manera de obtener un nivel de acetilación < 2%. El conjunto asi obtenido fue concentrado usando una bomba peristáltica, 2 manómetros y un cartucho TFF P2B005A05 en PES (Millipore, PMNL: 5 kDa, EFA: 0,5 m2) colocado en un carrete Pellicon2 XX42P0060. Todo el paso fue realizado a 4°C. Antes de usar, la membrana fue enjuagada con API y nuevamente enjuagada con 5 L de 0,1 M NaOH sin recirculación. La sanitización fue realizada usando 10 L de 0 , 1 M NaOH por 2 h. El sistema fue purgado de 0,1 M NaOH y enjuagado con 5 L de 20 mM NaOH por 5 min. El sistema fue purgado de 20 mM NaOH y enjuagado con 2 L de 20 mM bis-Tris + 150 mM NaCl, pH 5,9, sin recirculación . El sistema fue equilibrado con 10 L de 20 mM bis-Tris + 150 mM NaCl, pH 5,9, hasta que el permeado alcanzó un pH 5,9. Las fracciones de la elución del paso de purificación en Q Sefarosa HP fueron colectadas juntas y se ajustó a 150 mM NaCl con la adición de 2 M NaCl de manera de disminuir el riesgo de precipitación de las proteínas durante la concentración. El conjunto colectado fue concentrado hasta alcanzar una concentración final de alrededor de lmg/mL, a una presión de trans-membrana de 0,5 bares. Al final de la concentración, el líquido retenido fue colectado y el sistema FFT fue lavado con 0,6 L de 20 m bis-Tris + 150 m NaCl, pH 5,9, que fue agregado al líquido retenido. La IFN-a-2b (E41Q) resultante fue filtrada usando un filtro cartucho de 0,45 pm + 0,2 µt? (Sartopore de 2 filtros, 300 era2, Sartorius) . El sistema completo fue sanitizado como se describió anteriormente. f. Paso 6: Cromatografía de Exclusión de Tamaño (CET) El sexto paso de purificación fue conducido a 4°C, usando una resina Superdex 75, empacada con API en una columna BPG100. Las características de la resina son como sigue: sección: 153,9 cm2 ; altura: 72 cm; volumen: 1.108 cm3. Una velocidad de flujo de 40 mL/min fue usado para los pasos de carga, lavado, elución, regeneración y sanitización . El empaque de la resina se realizó de acuerdo al siguiente procedimiento. La resina fue primero empacada con una velocidad de flujo de 40 mL/min por 1,00-1,30 h. El pistón fue bajado y ajustado a 0,5 cm de la altura del gel. La velocidad de flujo fue aumentada hasta alcanzar una presión constante de 4,5 bares por 20 min a 1 h. El pistón fue bajado hasta el gel. Finalmente, la calidad del empaque fue evaluada midiendo la Altura Equivalente a Platos Teóricos (HETP, sigla en inglés) , HETP > 1000, y la asimetría (As) , As= 0,7 - 1,7, con 110,8 mL de 1% acetona. La sanitización de la columna fue realizada corriendo 0,5 M de NaOH a través de la columna por al menos 120 min seguido por su almacenaje en 20 mM NaOH hasta su siguiente uso (máx. 28 días a 4°C) . La columna fue equilibrada con 12 -18 L de tampón CET (1,69 g/L NaH2P04.2H20, 1,8 g/L Na2HP04 , 7,5 g/L NaCl y 0,1 g/L EDTA Na2) con una velocidad de flujo de 40 mL/min. 250 mL de la solución de IFN-a-2b (E41Q) fueron cargados en la columna seguidos por elución con el tampón CET. El pico de elución fue colectado en fracciones para su análisis. Cada fracción colectada fue analizada con SDS-PAGE. Solo las fracciones con mayor nivel de pureza se mantuvieron y se juntaron. Luego de la elución con sal, la columna fue sanitizada con 0,5 NaCl de acuerdo al procedimiento anteriormente mencionado. Se requirió de muchas corridas para tratar el total del volumen de IFN-OÍ-2b(E41Q) (250 mL/corrida) . Todas las fracciones fueron guardadas a 4°C hasta que los resultados de las mediciones de la pureza se obtuvieron. g. Paso 7: Concentración Post-CET Luego de evaluar la pureza, las fracciones seleccionadas desde el paso anterior de CET fueron combinadas. El conjunto resultante fue concentrado por filtración de flujo tangencial (FFT) , usando el mismo sistema que en el Paso 5 (es decir, una bomba peristáltica, 2 manómetros y un cartucho TFF P2B005A05 en PES (Millipore, PMNL: 5 kDa, EFA: 0,5 m2 ) colocado en un carrete Pellicon2 XX42P0060) . El proceso completo se realizó a 4°C. Antes de usar, el sistema FFT fue sanitizado usando 10 L de 0,1 M NaOH por 2 hrs . El sistema fue purgado de 0,1 M NaOH y enjuagado con 5 L de 20mM NaOH por 5 min. El sistema fue entonces purgado de 20 mM NaOH y enjuagado con 2 L de tampón CET sin recirculación . El sistema fue equilibrado con 5 L de tampón CET hasta que el permeado alcanzó un pH 6,7. Las fracciones eluidas seleccionadas desde el paso de purificación CET fueron combinadas. El conjunto resultante fue concentrado hasta lograr una concentración final de 0,4 mg/mL, a una presión transmembrana de 0,5 bares. Al final de la concentración, el líquido retenido fue colectado y el sistema FFT fue lavado con 0,2-0,4 L de tampón CET que fue agregado al líquido retenido. El sistema completo fue sanitizado como se describió anteriormente. La IFN-a-2b (E41Q) resultante fue filtrada usando un cartucho de filtros de 0,45 µp? y 0,2 pm (Sartopore de 2 filtros, 300 cm2, Sartorius) y guardados a 4°C hasta proceder con las operaciones de formulación (= Grueso del Líquido Purificado) . 7. Formulación del Grueso del Líquido La concentración de IFN- -2b (E41Q) en el líquido retenido concentrado fue determinada en base a la absorbancia UV a 280 nm (Coeficiente Extinción = 0,985) . El líquido retenido concentrado fue diluido con tampón CET para obtener una concentración final de IFN-a-2b(E41Q) de 300 ± 60 g/mL. Se agregó sacarosa al Grueso del Líquido Purificado para alcanzar una concentración de sacarosa de 14,7 mg/mL. El grueso del líquido formulado fue esterilizado a través de filtración de 0,2 µp? usando una cápsula de esterilización Sartopore 2 (EFA = 150 cm2, membrana PES, Sartorius) . El grueso del líquido final condicionado fue guardado a -20 °C antes de proceder a uno de los dos esquemas de liofilización descritos en Ejemplo 5. Muchos lotes de IFN-a-2b (E41Q) fueron producidos por los métodos descritos en este Ejemplo, incluyendo dos lotes que fueron liofilizados por el procedimiento descrito en Ejemplo 5.1 más adelante (Método 1) para preparación de una cápsula prototipo con recubrimiento entérico y tres lotes que fueron liofilizados como en el procedimiento descrito en Ejemplo 5.2 más adelante (Método 2) para preparación de tabletas con recubrimiento entérico. Los variados lotes pre-clínicos y clínicos de IFN-a-2b (E41Q) se resumen en la Tabla 31 a continuación.

TABLA 31: Lotes de escala Pre-clínica y clínica de IFN-a-2b(E41Q) Producto Lote No. Volumen Método de Forma de Usado en de Producción la Droga Ejemplos: Partida del Cultivo IFN-a- IFN-001 -06 100 L Pre-clínica Cápsula; 9, 10, 1 1 , 2b(E41 Q) (Método de Solución 16.A.1-2, 20.B liofílización 1) inyectable IFN-a- IFN 003-06 100 L Pre-clínica Cápsula n/a 2b(E41Q) (Método de liofílización 1) IFN-a- G055/0601 18 100 L Clínica Tableta 8, 1 1 , 12, 2b(E41Q) (Método de 16.B.1 , 20.A.3 liofílización 2) IFN-a- G055/LPC 1/060221 100 L Clínica Tableta 1 1 , 20.C 2b(E41 Q) (Método de liofílización 2) IFN-a- G055/LC1/060330 100 L Clínica Tableta n/a 2b(E41 Q) (Método de liofílización 2) EJEMPLO 5 Sustancia de Droga Liofilizada Se produjo un polvo liofilizado de IFN-a- 2b(E41Q) para la manufactura de cápsulas con recubrimiento entérico. Dos métodos de liofílización fueron empleados, como se describe a continuación. 1. Liofilización de Lote Pre-clínico (Método 1) Los lotes de IFN-a-2b (E41Q) pre-clínicos Nos.

IFN-001-06 e IFN 003-06 (Tabla 31) fueron usados para producir un polvo liofilizado para la manufactura de cápsulas con recubrimiento entérico. El grueso de la solución fue filtrado a través de un filtro estéril (0,2 m) usando una bomba peristáltica y tuberías de silicona seguido por un paso de congelación a -80°C por 90 min. La solución filtrada fue distribuida en viales de 5 mL estériles (alrededor de 3 mL por vial) . Durante la etapa primaria de liofilización, la muestra se llevó a-30°C por 60 min hasta que la presión alcanzó 10 Pa (0,1 mbar) . La temperatura ambiente se ajustó a 0°C para facilitar la evaporación. Aproximadamente 100 mL del grueso de la solución fue liofilizada por 24 a 30 h. La liofilización de soluciones de 1 L toma 3 a 5 días. Durante la segunda etapa de liofilización, la temperatura se aumentó en 5°C cada 20 min hasta alcanzar 25°C (temperatura ambiente) hasta que el proceso estuvo completo (6 hrs) . Los viales fueron cerrados con tapones robustos de liofilización, sellados con sellos de cápsulas de aluminio, y guardados a 4°C. El grueso del líquido con IFN-o¡-2b nativo de los lotes de producción escala laboratorio Nos. IFN-004-05, IFN-006-05 e IFN-002-06 (Tabla 30) también fue liofilizado de acuerdo al método anterior para usar como control en estudios subsiguientes. 2. Liofilizacion de Lote Clínico (Método 2) Los lotes de IFN- -2b (E41Q) Nos. G055/060118, G055/LPC1/060221, G055/LC1/060330 (Tabla 31) fueron liofilizados para la manufactura de tabletas con recubrimiento entérico. Además de la proteína IFN-a-2b(E41Q), el polvo contenía lo siguiente: TABLA 32 Excipientes Grados Concentración (mg/mL) NaCl EP, para análisis ACS, ISO 7,5 Fosfato de Na dibásico EP, para análisis ACS 1 ,8 Fosfato de Na monobásico EP, para análisis ACS 1 ,3 EDTA disódico EP, para análisis ACS, ISO 0, 1 Sacarosa EP 14,7 El grueso del líquido de la solución de IFN-a-2b(E41Q) (mantenida a < -20°C) fue descongelada por 26 hrs a temperatura ambiente luego 14 hrs a 5-8 °C, seguido por 3 hr adicionales de incubación a temperatura ambiente. La solución fue filtrada a través de un filtro estéril Pall KA1DFLP (0,2 µt?) (Pall) usando una bomba peristáltica y tuberías de silicona y llenando directamente bandejas Lyoguard® autoclavadas (WL Gore Associates) . Cinco bandejas fueron llenadas con aproximadamente 600 g solución/bandeja. En total, el rendimiento de la solución filtrada fue alrededor de 3.351 g. Las bandejas fueron cargadas en el liofilizador en repisas pre-enfriadas (-30°C) y luego congeladas por 5 hrs. La etapa primaria del proceso de secado fue realizado durante 89 hrs. El producto congelado fue secado a -30°C por 1 hr a 10 Pa (0,1 mbar) , luego a 0°C por 1 hr a 10 Pa (0,1 mbar), y finalmente a 0°C por 87 hrs a 10 Pa (0,1 mbar). La etapa secundaria del proceso de secado fue realizado en vacío a 5°C por 20 min a 10 Pa (0,1 mbar), luego a 5°C por 1,5 h con la menor presión posible (alrededor de = 0,001 mbar) . La temperatura se aumentó en incrementos de 5°C y se mantuvo en cada nivel por 60-90 min hasta alcanzar la temperatura 25°C con la menor presión posible (alrededor de 0,001 mbar). Este proceso tomó aproximadamente 9 hrs . Al final del ciclo de liofilización, las bandejas fueron retiradas y descargadas. El rendimiento fue determinado en 88,6 g de liofilizado en las bandejas. El contenido de todas las bandejas fue mezclado y protegido de la humedad hasta el siguiente paso de procesamiento. EJEMPLO 6 Manufactura de Tabletas, Cápsulas y Soluciones para Inyección IFN-a-2b (E41Q) fue formulado como una solución para inyección, una cápsula con recubrimiento entérico y una tableta con recubrimiento entérico, para uso en estudios pre-clínicos y/o estudios clínicos. 1. Soluciones para Inyección Polvo liofilizado de IFN- -2b (E41Q) del lote IFN 001-06 (descrito anteriormente) fue usado para formular soluciones para administración Per os (PO) e intravenosa (IV) en estudios de farmacocinética pre- clínica (PC) (Ejemplos 9, 11) . El polvo liofilizado IFN-a-2b (E41Q) fue resuspendido en agua milliQ para administración PO, o resuspendido en PBS para administración intravenosa. Las cantidades respectivas de polvo liofilizado de IFN- -2b (E41Q) y diluyente usado para alcanzar una concentración particular, se proporcionan en la Tabla 33.

TABLA 33: Soluciones para Inyección 1 ,00 16,65 1 0,75 12,50 1 0,50 8,32 1 0,20 3,33 1 IV 0,10 1 ,66 1 (mL PBS) Para estudios adicionales en ratas (ver Ejemplos 9, 16. A.3), las soluciones para inyección también fueron preparadas desde los lotes de escala laboratorio de IFN-a-2b (E41Q) : IFN 005-05, IFN 007-05 e IFN 008-05 (Ejemplo 3, Tabla 30). 2. Cápsulas con Recubrimiento Entérico Las cápsulas con recubrimiento entérico usadas en los estudios con ratas y monos (Ejemplos 9, 11, 16. A.1-2, 20B) fueron manufacturadas usando el polvo liofilizado de IFN-a-2 (E41Q) del lote pre-clínico IFN 001-06. Las cápsulas fueron llenadas con la cantidad apropiada de IFN-a-2b (E41Q) liofilizado y el peso se completó con sacarosa. Las cápsulas fueron recubiertas con recubrimiento entérico para liberación en el intestino, con el recubrimiento siendo útil para mantener la integridad de la cápsula a un pH acídico. El recubrimiento fue hecho con 3 capas de una solución que contenía celulosa/acetato/ftalato en acetona (12,5% m/v) . Cada capa fue secada separadamente. Se usaron para los estudios cápsulas Clear Torpac (tamaño 9) y Opaque Capsugel (tamaño 9) . IFN-a-2b (E41Q) fue formulado en cápsulas con recubrimiento entérico en 4 dosis: 0,20 mg, 0,40 mg, 0,60 mg y 0,80 mg. El contenido de proteína fue determinado por OD 280nm luego de diluir con PBS. Las composiciones de las cuatro cápsulas son descritas en Tabla 34.

TABLA 34 : Cápsulas con recubrimiento entérico liofilizado 21,86 Polvo liofilizado 14,81 Capsugel 0,40 Manitol 6,69 Polvo liofilizado 21 ,75 Capsugel 0,60 Polvo liofilizado 29,00 Torpac 0,80 El recubrimiento entérico de cada una de las cápsulas fue evaluado manteniendo las cápsulas en una solución a pH 1,2 por 1 hr a 37°C. Esta solución simulaba el ambiente del fluido intestinal. La solución y las cápsulas fueron agitadas a lo largo de la incubación, luego de lo cual las cápsulas fueron transferidas a PBS y se mantuvieron a 37 °C. Todas las cápsulas con recubrimiento entérico no mostraron señales visibles de filtración durante la hora de exposición a la solución ácida. La desintegración de la cápsula con recubrimiento entérico fue observada dentro de los 30 min cuando la cápsula fue transferida a PBS. 3. Tabletas con Recubrimiento Entérico El grueso del IFN- -2b (E41Q) liofilizado (lote clínico No. G055/LC1/060330) fue formulado como una cápsula con recubrimiento entérico en tres dosificaciones; 40 pg IFN- -2b (E41Q) /tableta con recubrimiento entérico, 200 pg IFN- -2b (E41Q) /tableta con recubrimiento entérico, y 450 g IFN- -2b (E41Q) /tableta con recubrimiento entérico. Las tabletas con recubrimiento entérico fueron formuladas por compresión directa en una prensa excéntrica. El polvo liofilizado de IFN- -2b (E41Q) fue primero mezclado con lactosa monohidrato y triturado. Luego fueron mezcladas celulosa microcristalina, povidona y crospovidona al polvo, seguido por estearato de magnesio. La mezcla de polvo final fue comprimida en una prensa excéntrica usando una herramienta oblonga de 11,0 x 4,4 mm que tenía una marca de corte en un lado. El núcleo de la tableta resultante fue de 150 mg y sus dimensiones fueron 11,0 x 4,4 mm. La película usada para recubrir la tableta se preparó mezclando alcohol isopropílico, acetona y agua purificada. Luego se disolvieron Eudragit y trietilcitrato en esta mezcla. Una solución separada de alcohol isopropílico, talco, dióxido de titanio y estearato de magnesio se preparó, y luego las dos soluciones fueron mezcladas para obtener la solución de recubrimiento. Los núcleos de las tabletas fueron entonces recubiertos con la solución de recubrimiento hasta que se obtuvo un peso final de 165,7 mg por tableta. La composición de la tableta con recubrimiento entérico de IFN-a-2b (E41Q) formulada para uso clínico se muestra en la Tabla 35 más abajo. Los grados de pureza de cada uno de los constituyentes también se muestra (GMP es Buenas Prácticas de Manufactura, EP es Pharmacopeia Europea; USP es Pharmacopeia de Estados Unidos todas por sus siglas en inglés) .

TABLA 35: Tabletas con recubrimiento entérico (lote No. G055/LC1/060330) Fuerza 40 µg Fuerza 200 Fuerza 450 /dosis Materiales crudos Grados unitaria dosis dosis (mg) unitaria unitaria ims) Sustancia de droga: * IFN-a-2b(E41Q) material 10,00 30,00 60,00 liofilizado GMP 0,04 0,20 0,45 Excipientes: * Lactosa 1 H20 EP 105,80 85,80 55,80 * Celulosa microcristalina EP 27,00 27,00 27,00 0,1 mm USP 1 ,80 1 ,80 1 ,80 * Povidona (Polividona USP 3,60 3,60 3,60 K25) USP 1 ,80 1 ,80 1 ,80 * Crospovidona * Estearato de magnesio USP 8,40 8,40 8,40 Recubrimiento entérico: USP 0,84 0,84 0,84 Eudragit L EP/USP 4,20 4,20 4,20 Trietilcitrato USP 1 ,50 1 ,50 1 ,50 Talco micron USP 0,75 0,75 0,75 Dióxido de titanio USP/EP 70,00 70,00 70,00 Estearato de magnesio EP 70,00 70,00 70,00 Alcohol isopropílico* USP 0,42 0,42 0,42 Acetona* Agua purificada* Masa total de la tableta 150,0 150,0 150,0 Para uso en los estudios descritos en los Ejemplos 8, 11, 12, 16.B.1, 20. A.3 más abajo, se manufacturaron tabletas con recubrimiento entérico usando el grueso del IFN-a-2b (E41Q) liofilizado del lote clínico No. G055/060118 a una dosis de 600 yg/ tableta. La composición de las tabletas con recubrimiento entérico de IFN-a-2b (E41Q) usadas en estos Ejemplos se muestra en la Tabla 36 a continuación .

TABLA 36: Tabletas con recubrimiento entérico (lote No. G055/060118) Fuerza 600 µ§/ Materiales crudos Grados dosis unitaria íms) Sustancia de droga: * IFN-a-2b(E41Q) liofilizado 51 ,70 0,60 Excipientes: * Lactosa 1 H20 EP 64,10 * Celulosa microcristalina 0,1 mm EP 27,00 * Povidona (Polividona K25) USP 1 ,80 * Crospovidona USP 3,60 * Estearato de magnesio USP 1 ,80 Recubrimiento entérico: * Eudragit S-100 USP 8,40 * Trietilcitrato USP 0,84 * Talco EP/USP 4,20 * Dióxido de titanio USP 1 ,50 * Estearato de magnesio USP 0,75 * Agua purificada USP/EP 0,42 * Alcohol isopropílico EP 70,00 * Acetona USP 70,00 Masa total de la tableta 150,0 EJEMPLO 7 Resultados de Control de Calidad Los datos de especificaciones y control de calidad (CC) fueron colectados para los lotes clínicos de lFN-a-2b (E41Q) en cuatro etapas de la producción: 1) grueso del líquido purificado (Ejemplo 4.6); 2) grueso del líquido formulado (Ejemplo 4.7); 3) polvo liofilizado (Ejemplo 5.2), y 4) formulación de tableta (Ejemplo 6.3). Los datos de especificaciones y control de calidad también fueron colectados para el prototipo de cápsula con recubrimiento entérico (Ejemplo 6.2) manufacturado del lote pre-clínico. 1. Especificaciones y CC de Grueso del Líquido Purificado Los datos de especificaciones y control de calidad para el grueso del líquido purificado de IFN-a-2b(E41Q) se muestran en la Tabla 37 más abajo.

TABLA 37: Especificaciones y CC del Grueso del líquido purificado Análisis Pruebas Especificaciones Apariencia del determinación visual sin color, líquido transparente grueso del líquido Contenido de OD28onm, µBCA o RP-HPLC Para información proteína Identidad Mapeo de péptidos Conforme al patrón de IFN-a- 2b(E41 Q) secuencia amino ácidos 15 N- Conforme a la secuencia de amino terminal ácidos de referencia pH (IEF) isoeléctrico Por información (valor teórico: ~ 6,78 / 6,34) Western Blot 1 banda específica entre 1 5 y 20 kDa Peso molecular por SDS-PAGE 1 banda principal entre 15 y 20 teñido con plata en condiciones kDa reductoras y no reductoras Pureza SDS-PAGE en condiciones > 98% reductoras y no reductoras teñido con Azul de Coomassie SE-HPLC > 98% pH Medición potenciométrica Por información Potencia Actividad antiviral > 3,00 x 108 IU/mg (A549 células (Texcell) pulmonares)* Impurezas relacionadas Forma acetilada RP-HPLC No más de 2% de IFN- - 2b(E41 Q) acetilado Agregados SE-HPLC < 1 % Contenido ADN método Picogreen < 10 ng/dosis equiv1 Contenido HCP método ELISA < 10 ng/dosis equiv1 Contenido GuaCl HPLC < LOD2 Detección contaminantes Endotoxinas ensayo LAL / método EP < 10 EU/dosis equiv* bacterianaes * Determinación de potencia por el lote clínico GMP G l fue realizado por CPE en células pulmonares A549 1 equivalente a dosis = 100 µg de proteína 2 LOD = límite de detección (LOD sigla en inglés) 2. Especificaciones y CC del Grueso del Líquido Formulado Los datos de especificaciones y control de calidad para IFN-a-2b (E41Q) de grueso del líquido formulado (luego de la adición de sacarosa) se muestran en Tabla 38 a continuación.

TABLA 38: Especificaciones y CC del Grueso del Líquido Formulado Pruebas Métodos Especificaciones Apariencia Claridad, color Sin color, líquido transparente Identidad Detección de IFN- -2b(E41 Q) Al menos 1 banda específica (Western Blot) entre 15 y 20 kDa (condiciones reductoras) Prueba de esterilidad TSB (20-25°C) Ausencia de crecimiento FTM (30-35°C) Ausencia de crecimiento Toxicidad anormal En ratones Ausencia En cobayos Ausencia Contenido de endotoxins LAL < 10 IU/dosis equiv1 Contenido de proteína OD280nm Por información µ??? 300 ± 60 µ ???, Contenido de sacarosa Espectrometría 14,7 mg/mL Potencia Actividad antiviral > 3,00 x 108 IU/mg (células (Texcell) pulmonares A549) Patrón electroforético SDS-PAGE 1 banda principal entre 15 y 2C /Estándar EP IFN-o AgNC>3 - condiciones reductoras kDa y no reductoras dosis equivalente = \ 00 µg de proteína 3 . Especificaciones y CC para el Grueso del Liofilizado Los datos de especif icaciones y control de calidad para el grueso del liof ilizado de IFN-a - 2 ( E41Q) se muestran en la Tabla 39 a continuación .

TABLA 39: Especificaciones y CC para el Grueso del Liofilizado Análisis Métodos Especifícaciones Apariencia Determinación visual Polvo blanco Identidad LC-MS (RP-HPLC y Conforme al patrón EP (M-Scan, Suiza) espectroscopia de masa en la proteína intacta) Conforme al patrón EP Mapeo de péptidos Fuerza LC-U V 0,9%(w/w) ± 0, 1 % (M-Scan, Suiza) Pureza RP-HPLC > 98% (M-Scan, Suiza) Dímeros y HMW RP-HPLC < 2% (M-Scan, Suiza) Potencia Actividad antiviral 3.5 x 108 - 7.5 xlO8 lU/mg (NewLab BioQuality, Alemania) (CPE/A549 células (TBC) pulmonares) Contenido de agua Método Karl Fischer < 10% (Wülfing Pharma, Alemania) 4 . Tableta con Recubrimiento Entérico y CC Las especif icaciones y datos de control de calidad para las tabletas con recubrimiento entérico de IFN-a- 2b ( E41Q) se muestran en la Tabla 40 a continuación .

TABLA 40: Tableta con Recubrimiento Entérico y CC Análisis Métodos Especifícaciones Apariencia* Determinación Tabletas blancas visual Identidad* LC-MS (RP-HPLC y Conforme a patrón EP (M-Scan, Suiza) espectrometría de masa en proteína intacta) Mapeo de péptidos Conforme a patrón EP TABLA 40: Tableta con Recubrimiento Entérico y CC Análisis Métodos Especificaciones Fuerza* LC-UV 40, 200 45(^g ± 10% (M-Scan, Suiza) Pureza* RP-HPLC > 95% (M-Scan, Suiza) Dímeros y HMW* RP-HPLC < 5% (M-Scan, Suiza) Potencia* Actividad antiviral 1 , 1 x 10s - 2,9x l 08 IU/mg (NewLab BioQuality, Alemania) (CPE/A549 células pulmonares) Disolución USP 29 <71 1> > 2 h en condiciones (CBA, Alemania)* gástricas < 45 min en condiciones neutras Examen mícrobiológico (Wülfing EP/USP (USP 29 Pharma, Alemania)* <61 > métodos) Conteo de microbios < 103 CFU/mg aerobios total Conteo de < 102 CFU/mg levaduras/moho combinados Ausencia E. coli Ausencia de E. coli Uniformidad de contenido* USP 29 < 905> por (M-Scan, Suiza) cuantificación LC-UV (M-Scan) Contenido de agua Método Karl Fischer < 10% (Wülfing Pharma, Alemania)** Desintegración EP 5.6 (2.9.1 ) Fluido gástrico > 2 h (Wülfing Pharma, Alemania)** Fluido intestinal < 30 min Masa promedio Peso medido 165 mg ± 5% (Wülfing Pharma, Alemania)** Espesor Sistema Calliper 3 mm ± 10% (Wülfing Pharma, Alemania)** * Pruebas de liberación ** Para caracterización 5. Especificaciones y CC de Cápsul Recubrimiento Entérico Datos sobre especificaciones y control de calidad para el prototipo de cápsulas con recubrimiento entérico de IFN-a-2b (E41Q) (del lote pre-clínico) se muestran en la Tabla 41 a continuación.

TABLA 41: Especificaciones y CC de Cápsulas con Recubrimiento Entérico Análisis Pruebas Especificaciones Apariencia de cápsulas con Determinación visual Cápsula blanca recubrimiento entérico Uniformidad de contenido OD280nm Concentración deseada deIFN-a-2b(E41Q) en el polvo formulado ""/cápsula con recubrimiento entérico Determinación de masa Medición de peso 28,00 mg**/ cápsula con recubrimiento entérico o 27,30 mg***/ cápsula con recubrimiento entérico * La formulación de la cápsula con recubrimiento entérico fue preparada con 0,20 mg, 0,40 mg, 0,60 mg y 0,80 mg de lFN- -2b(E41Q) por cápsula. El contenido de proteína fue determinado por la OD 280nm después de diluir con PBS ** Cápsula Torpac = 28,00 mg corresponde a 19,00 mg de polvo formulado + 9,00 mg del peso de la cápsula *** Cápsula Capsugel = 27,30 mg corresponde a 21,50 mg de polvo formulado + 5,80 del peso de la EJEMPLO 8 Evaluación de IFN- -2b (E41Q) con el sistema de replicón VHC La actividad anti-viral de las preparaciones de IFN-a-2b (E41Q) fue evaluado usando el sistema de replicón del virus de hepatitis C (VHC, por sus siglas en inglés) . Éste es un sistema de cultivo de células in vitro en que el VHC se propaga siguiendo la transfección de las células con un replicón VHC (ver por ejemplo Lohmann y cois. (1999) Science 285:26-30). El virus VHC no infecta células en cultivo, asi que se usan replicones auto-ensamblantes para producir proteínas y ARN de VHC en las células. Los replicones de VHC son constructos de ARN que contienen típicamente los genes que codifican las proteínas no estructurales, un IRES (sitio de entrada interna a ribosoma, por siglas en inglés) para facilitar la traducción, y un marcador seleccionable . La transfección de éstos replicones en células animales apropiadas, tales como células Huh7 y Huh7.5.1, resulta en la producción autónoma de ARN y proteínas de VHC. El sistema puede entonces ser usado para evaluar las propiedades anti-virales de varias drogas y moléculas, incluyendo IFN-a-2 (E41Q) . Las actividades anti-virales del lote de escala de laboratorio de IFN- -2b (E41Q) No. IFN-003-05 y el lote clínico No. G055/060118 fueron evaluados usando el sistema de replicón VHC, y comparado con las actividades de IFN-a (IFN 002-06) nativo y un control interno de IFN-a-2b (LAB21, Cambridge CB4 0GA, United Kingdom) . Las células fueron transíectadas con los replicones de VHC sub-tipos la y Ib, y fueron entonces tratadas con las muestras de IFN-a-2b (E41Q) , IFN-a-2b y muestras de IFN-a a 1 , 5 , 20, 100 y 500 IU/mL por 3 días. El nivel de la replicación de los replicones de VHC sub-tipo la y Ib fue determinado por transcripción reversa en tiempo real y PCR, que midió la cantidad de ARN viral producida en las células. El ARNm de GAPDH también fue cuantificado como control endógeno para normalizar los resultados por las diferencias en ARN total agregado a cada reacción. Los valores EC50 (50% de dosis efectiva) fueron calculados por regresión usando la línea generada de los valores de datos promedio en cada concentración. Los valores CC50 (50% concentración citotóxica) es la concentración de IFN requerida para reducir la viabilidad celular en un 50%. El índice de Selectividad (SI) fue determinado midiendo la razón CC50/EC50. Una inhibición dependiente de la dosis en la replicación del replicón de VHC se observó cuando las muestras de IFN-a-2b (E41Q) , IFN-a-2b o IFN-a fueron agregadas al cultivo celular (Tabla 42) . Resultados similares fueron obtenidos en ambos sistemas de replicón VHC subtipos la y Ib. Ambos lotes de IFN-a-2b(E41Q) mostraron actividad anti-viral comparable a la actividad mostrada por las muestras de control estándar TABLA 42 : Inhibición de replicacion de replicón de VHC Muestra VHC 1a VHC 1 b GAPDH SI SI Efecto EC50 EC50 CC50 1a** 1 b** antiviral (1a y 1 b)* IFN-a 3,9 5,5 > 500,0 > 128,2 > 90,0 Activo IFN 002-06 lU/mL lU/mL lU/mL nativo IFN-a-2b(E41 Q) 2,5 6,0 > 500,0 > 200,0 > 83,3 Activo G055/0601 18 lU/mL lU/mL lU/mL IFN-a-2b(E41 Q) 0,8 1 ,5 > 500,0 > 625,0 > 333,3 Activo IFN-003-05 lU/mL lU/mL lU/mL LAB21 IFN-a-2b 1 ,0 2,7 > 500,0 > 500,0 > 185,2 Activo control interno lU/mL lU/mL lU/mL EJEMPLO 9 Estudios In Vivo Farmacocinéticos (PK) de IFN-o- (E41Q) en Ratas Normales Comparado con IFN-a Nativo Siguiendo Varias Rutas de Administración Los estudios farmacocinéticos fueron realizados en ratas macho de 8-semanas de edad Sprague-Dawley (301-325 g) para comparar varias rutas de administración, incluyendo administraciones intraduodenal (ID) , subcutánea (SC) , per os {PO, líquido por sonda y cápsulas con recubrimiento entérico) , e intravenosa (IV) . Las siguientes dosificaciones fueron evaluadas para cada administración como sigue: IV (10 pg por rata de IFN-a- 2b(E41Q) o IFN-a nativo), ID (2 mg por rata de IFN-a-2b(E41Q) o IFN-a nativo), SC (50 por rata de IFN-a-2b(E41Q) o IFN-a nativo), PO (2 rag por rata de IFN-a-2b(E41Q) o IFN-a nativo, . 1, 0,75, 0,5 y 0,25 mg por rata de IFN-a-2b (E41Q) para la formulación de cápsula con recubrimiento entérico; 2 mg por rata de IFN-a-2b(E41Q) o IFN-a . nativo y 3,4, 1,9, 1 y 0,5 mg por rata de IFN-a-2b (E41Q) para la formulación de líquido por sonda) . 1. Procedimientos Generales Se tomaron muestras de sangre (200 µ?) cada cierto tiempo, luego de cada administración en todas las ratas, vía catéter en la vena yugular (insertado 18-24 horas antes de la administración de proteína) para determinación de los niveles de actividad antiviral remanente de IFN-a-2b (E41Q) o IFN-a nativo en el plasma. Las muestras de sangre fueron colocadas en tubos fríos de colección que contenían litio-heparina y mezcladas gentilmente seguido de la adición de la solución anti-proteasa (30 µ?) inmediata. Los tubos se mantuvieron en hielo (dentro de los 30 minutos después de la colección) y centrifugadas a 2000 g por 10 minutos a 4°C. El plasma fue colectado en 3 tubos de al menos 40µ1 cada uno y se mantuvo congelado a-20°C o -80°C hasta su uso. El ensayo de actividad antiviral fue realizado usando 20 µ? de plasma por ruta IV, 10 µ? de plasma por ruta SC o 30 µ? de plasma por rutas ID y PO diluidas en 1 mi de medio de cultivo seguido por diluciones seriadas a la mitad. Luego de 16 horas de tratamiento de células HeLa con muestras de plasma diluidas, las células fueron infectadas con el virus EMC. A las 48 hrs post- infección, el número de células vivas se determinó tiñendo las células viables (azul de metileno) y medición de OD a una longitud de onda de 660nm . EC50 y la actividad especifica (IU/ml de plasma animal) fueron calculadas para cada punto cinético usando NEMO, un software desarrollado internamente con la siguiente ecuación: [ ( (A/B) xC) x (1000/V) ] / [D/B] , con A siendo la actividad remanente especifica detectada en el plasma de la proteína inyectada, B la actividad específica del control estándar de IFN-a-2a NIBSC (código NIBSC 95/650) determinado en el ensayo, C la cantidad NIBSC (en IU) presente en el volumen agregado a las células durante el ensayo, D la actividad específica de la proteína inyectada y V el volumen de plasma evaluado. La actividad antiviral de las muestras de IFN- - 2b(E41Q) o IFN- nativo (expresado como un número de IU/mg de proteína) fue determinado como la concentración necesaria para un 50% de protección de las células contra el efecto citopático inducido por el virus EMC. Usando la solución de software PK (SummitPK) , los parámetros PK incluyendo Tmax, Cmax, vida media, y AUC (área bajo la curva, por sus siglas en inglés) fueron determinadas para cada perfil farmacocinético . AUC se refiere al parámetro PK comúnmente usado que mide el área bajo la curva en un gráfico de la concentración de una droga en el plasma vs . el tiempo. 2. Lotes de Drogas Para los estudios farmacocinéticos presentados en éste Ejemplo, se usaron tres lotes diferentes de IFN-a-2b (E41Q) : IFN-005/05, IFN-007/05 e IFN-001/06 (descritos en Ejemplos 3 y 4) . Para comparar la actividad farmacocinética de IFN-a-2b (E41Q) con IFN-a-2b no modificado, tres lotes diferentes de IFN-a-2b nativo fueron también usados: IFN- 006/05, IFN- 004/05 e IFN-002/06 (descrito en Ejemplo 3) . Especificaciones y rutas de administración para cada lote son presentados en las Tablas 43 (a-g) a continuación. 3. Administración ID Para el estudio intraduodenal, una dosis única de formulación líquida con 2 mg de IFN-a-2b (E41Q) o IFN-a-2b nativo fue administrado por cada rata por ruta intraduodenal (ID) a ratas machos de 8 semanas Sprague-Dawley . Además del catéter a la vena descrito en (1) , un catéter intraduodenal fue insertado en los grupos de animales involucrados en el estudio ID, 18 -24 horas antes de la administración de proteína. La información de dosificación y diseño experimental se presenta en la Tabla 44 a continuación.

TABLA 44: Dosifícación y detalle experimental para estudio ID Grupo Número Cirugía Tratamiento Ruta de Dosis y número de administración volunmen animales 1 6 Cateterización IFN-a-2b Catéter 2 mg intraduodenal; nativo intraduodenal (1800MIU/kg- cateterización 6mg/kg) vía vena 1 mL yugular 2 6 Cateterización IFN-a- Catéter 2 mg intraduodenal; 2b(E41Q) intraduodenal (1800MIU/kg- cateterización 6mg/kg) vía vena 1 mL yugular La colección de muestras de sangre (200 pL) fue realizada vía catéter en vena yugular en los siguientes tiempos: 0, 0,5, 1, 2, 4 y 8 h. La cantidad de IFN-a-2b(E41Q) remanente en el plasma del animal fue determinado por un ensayo de actividad antiviral basado en la protección de CPE del EMVC seguido de la infección de las células HeLa, como se describió en detalle anteriormente. Los parámetros PK calculados del promedio de seis perfiles de animales PK luego de la administración ID a ratas (2 mg/rata) son presentados en la Tabla 45 a continuación .

TABLA 45: Parámetros PK por administración ID IFN-a-2b(E41Q) IFN-a nativo Cmax (IU/mL) 16390 1592 Vida media (h) 3,2 0,9 AUC(0-8) (IU-h/mL) 89987 2991 AUC(0.t) (IU-h/mL) 81623 2486 En seguida de la administración intraduodenal , fue detectado un gran aumento en la actividad antiviral en las muestras de plasma de ratas IFN-a-2b (E41Q) comparado con las muestras de IFN-a-2b nativo. Como se muestra en la Tabla 45 anteriormente, los parámetros de IFN-a-2b (E41Q) Cmax AUC(0-8) fueron respectivamente alrededor de 10,3 veces y 30 veces mayores comparado con aquellos observados para IFN-nativo, debido a la absorción aumentada de IFN- -2b(E41Q) desde el compartimiento duodenal a la circulación sistémica. Además, se observó un aumento de alrededor de 3,6 veces en la vida media de IFN-a-2b(E41Q) en el compartimiento sistémico sanguíneo comparado con aquella del IFN-a nativo, sugiriendo una liberación sostenida de IFN-a-2b (E41Q) desde el compartimento intestinal a la circulación sistémica debido probablemente a una lenta absorción acoplado con la susceptibilidad disminuida de degradación por proteasas en el intestino. 4. Administración SC Para el estudio subcutáneo, una dosis única de la formulación con 50 g de IFN-a-2b (E41Q) o IFN- - 2b nativo fue administrado por rata por vía subcutánea (SC) a ratas macho de 8 semanas Sprague-Dawley . La información de dosificación y detalles de diseño experimental son presentados en la Tabla 46 a continuación.

TABLA 46: Dosificación y detalles experimentales para estudio SC Grupo Número Cirugía Tratamiento Ruta de Dosis y número de administración volumen animales 3 6 Cateterización IFN-a-2b SC 50 µ? de vena nativo (45MIU/kg - yugular 15<^g kg) 0,5 mL 4 6 Cateterización IFN-a- SC 50 µ de vena 2b(E41 Q) (45MlU/kg - yugular 15(^g kg) 0,5 mL La colección de muestras de sangre (200 L) se realizó a través de un catéter en la vena yugular en los siguientes tiempos: 0, 0,5, 1, 2, 4 y 8 h. Los parámetros PK incluyendo Cmax, Tmax, vida media y AUC fueron determinados para cada perfil PK y son presentados en la Tabla 47 a continuación.

La administración de proteína IFN-a nativa e IFN-o¡-2b (E41Q) por ruta subcutánea consiguió una rápida absorción de la proteína desde el compartimiento de tejido presistémico a la circulación sanguínea sistémica con una concentración máxima a las 0,5 hrs post- inyección de alrededor de 17671 IU/mL y 20431 IU/mL, respectivamente. El IFN-a-2b nativo también fue rápidamente eliminado de la sangre con una vida media de alrededor de 0 , 9h mientras que los perfiles PK obtenidos para IFN-a-2b (E41Q) mostraron un plato a 8 h post-inyección. El aumento en la vida media observado para IFN-a-2b (E41Q) comparado con IFN-a nativo fue correlacionado con un aumento en el parámetro AUC(0-t) de alrededor de 4,3 veces. 5. Administración PO de formulación líquida Para determinar la biodisponibilidad oral de las formulaciones líquidas de IFN-a-2b (E41Q) luego de administración per os {PO) (es decir por sonda líquida PO) , un estudio de dosis única por administración PO fue realizado seguido por un estudio multi-dosis. a. Administración de dosis única PO Para el estudio de administración PO inicial, una dosis única de formulación líquida con 2 mg de IFN-a-2b(E41Q) o IFN-a-2b nativo fue administrado por rata por ruta (PO) a ratas macho de 8 semanas Sprague-Dawley. La información de dosificación y diseño experimental son presentados en la Tabla 48 a continuación .

TABLA 48: Dosificación y detalle experimental para estudio PO (líquido, dosis única) Grupo Número de Cirugía Tratamiento Ruta de Dosis y número animales administración volumen 1 6 Cateterización IFN-a-2b PO 2 mg de vena nativo Sonda (líquido) (1800MIU/kg- yugular 6mg/kg) 1 mL 2 6 Cateterización IFN-a- PO 2 mg de vena 2b(E41Q) Sonda (líquido) (1800MIU/kg- yugular 6mg/kg) 1 mL La colección de muestras de sangre (200 L) se realizó a través de un catéter en la vena yugular en los siguientes tiempos: 0, 0,5, 1, 2, 4 y 8 h. Los parámetros PK incluyendo Cmax, Tmax, vida media y AUC fueron determinados para cada perfil PK y son presentados en la Tabla 49 a continuación.

Se detectó una actividad antiviral significativa en el plasma de rata después de la administración PO de IFN-a-2b (E41Q) en formulación líquida con valores Cmax alrededor de 21326 IU/ml y valor de parámetro AUC(0-oo) expo alrededor de 128174 IU- hr/ml a una dosis de 2 mg/rata. Sin embargo, no se observó actividad antiviral en el plasma de ratas a las que se administró el líquido con la formulación de IFN-a-2b nativo a la misma dosis. La vida media de IFN-a-2b(E41Q) fue alrededor de 3,7 h en circulación sanguínea sistémica que fue similar a los datos obtenidos por inyección intraduodenal . b. Administración multi -dosis PO Luego del estudio de administración de dosis inicial única PO, un estudio PK de multi-dosis decreciente fue realizado para determinar la biodisponibilidad oral de formulaciones líquidas de IFN-a-2b (E41Q) luego de administración PO. Una formulación líquida con IFN-a nativo a una dosis de 2 mg/rata o IFN-a-2b (E41Q) en dosis de 3,4, 2, 1,9, 1 o 0,5 mg/rata fueron administradas PO a las ratas. La información de dosificación y detalles de diseño experimental son presentados en la Tabla 50 a continuación .

TABLA 50: Dosificación y detalle experimental para estudio PO (líquido, multi-dosis) Grupo Número de Cirugía Tratamiento Ruta de Dosis y número animales administración volumen 1 5 Cateterización IFN-a-2b PO 2 mg de vena nativo Sonda (líquido) (1800MIU/kg- yugular 6mg/kg) 1 mL 2 5 Cateterización IFN-a- PO 3,4 mg de vena 2b(E41Q) Sonda (líquido) (3000MIU/kg yugular - 10,2 mg/kg) 1 mL 3 5 Cateterización IFN-a- PO 2 mg de vena 2b(E41Q) Sonda (líquido) (1800MIU/kg- yugular 6mg/kg) 1 mL TABLA 50: Dosificación y detalle experimental para estudio PO (líquido, multi-dosis) Grupo Número de Cirugía Tratamiento Ruta de Dosis y número animales administración volumen 4 5 Cateterización IFN-a- PO 1 ,9 mg de vena 2b(E41Q) Sonda (líquido) (1710MIU/kg yugular - 5,7mg/kg) 1 mL 5 5 Cateterización IFN-a- PO 1 mg de vena 2b(E41Q) Sonda (líquido) (900MIU/kg - yugular 3 mg/kg) 1 mL 6 5 Cateterización IFN-a- PO 0,5 mg de vena 2b(E41Q) Sonda (líquido) (450MILVkg - yugular 1 ,5 mg/kg) 1 mi La colección de muestras de sangre (200 µ?.) se realizó a través de un catéter en la vena yugular en los siguientes tiempos: 0, 0,5, 1, 2, 4 y 6 h. Los parámetros PK incluyendo Cmax, Tmax, vida media y AUC fueron determinados para cada perfil PK y son presentados en la Tabla 51 a continuación.

TABLA 51: Parámetros PK para administración PO (líquido, multi-dosis) IFN-o IFN-a-2b(E41Q) nativo Dosis (mg) 3,4 2 1 ,9 1 0,5 2 Cmai (IU/mL) 49074 29938 3321 1 1 1676 1553 1 - Vida media (h) 4,3 3,6 3,4 2,8 2, 1 - AUC(0-8) (IU-h/mL) 220140 13753 1 154234 38212 3 1666 - AÜCM (IU-h/mL) 142022 89227 1 15048 38212 3 1666 - Tmax (h) 1 0,5 0,5 0,5 0,5 - Como se muestra en la Tabla 51 arriba, una actividad antiviral significativa dependiente de la dosis fue detectada en el plasma de rata seguido de la administración PO de formulación líquida de IFN-a- 2b(E41Q) con valores de Cmax alrededor de 49074, 29938, 33211, 11676 y 15531 IU/ml para dosis de 3,4, 2, 1,9, 1 y 0,5 mg/rata, respectivamente. Sin embargo, no se observó detección de actividad antiviral en el plasma de ratas a las que se administró con la formulación líquida de IFN-a nativo a dosis de 2 rag/rata. Estas observaciones también se correlacionan con un aumento dosis-dependiente del parámetro AUC )ex o con valores de alrededor de 31666, 38212, 154234, 137531 y 220140 IU-hr/mL correspondientes a las dosis 0,5, 1, 1,9, 2 y 3,4 mg de formulación líquida de IFN-a-2b (E41Q) , respectivamente. Estos datos concuerdan con los datos obtenidos de la administración PO de formulación líquida de ambos IFN-a-2b (E41Q) e IFN-a nativo con una dosis única (2 mg/rata) (descrito anteriormente) .

Además, una vida media relacionada a la dosis se obtuvo para IFN-a-2b (E41Q) en el compartimiento sanguíneo sistémico con valores alrededor de 4,3, 3,6, 3,4, 2,8 y 2,1 h en dosis de 3,4, 2, 1,9, 1 y 0,5 mg/rata, respectivamente, apoyando la existencia de una liberación prolongada de IFN-a-2b (E41Q) desde el compartimiento intestinal a la circulación sistémica debido a una baja absorción acoplado con la resistencia a degradación por proteasas intestinal. 6. Administración PO de cápsula con recubrimiento entérico Un estudio PK multi-dosis decreciente fue realizado para determinar la biodisponibilidad oral de f ormulaciones en cápsula con recubrimiento entérico de IFN-a-2 (E41Q) luego de administración per os (PO) . Una formulación de cápsula con recubrimiento entérico con IFN-OÍ nativo en dosis de 2 mg/rata o IFN-a-2b (E41Q) en dosis de 2, 1, 0,75, 0,5, 0,25 mg/rata fueron administradas PO a ratas usando un tubo sonda. La información de dosificación y detalles del diseño experimental son presentados en la Tabla 52 a continuación .

TABLA 52: Dosifícacion y detalle experimental para estudio PO (cápsula con recubrimiento entérico) Grupo Número Cirugía Tratamiento Ruta de Dosis y número de administración volumen animales 7 5 Cateterización IFN-a-2b PO 2 mg de vena yugular nativo Cápsula con (1800MIU/kg- recubrimiento 6mg/kg) entérico 1 mL 8 5 Cateterización IFN-a- PO 2 mg de vena yugular 2b(E41Q) Cápsula con (1800MIU/kg- recubrimiento 6mg/kg) entérico 1 mL 9 5 Cateterización IFN-a- PO 1 mg de vena yugular 2b(E41Q) Cápsula con (900MIU/kg - recubrimiento 3 mg/kg) entérico 1 mL 10 5 Cateterización IFN-a- PO 0,75 mg de vena yugular 2b(E41Q) Cápsula con (675MIU/kg- recubrimiento 2,25 mg/kg) entérico 1 mL 11 5 Cateterización IFN-a- PO 0,5 mg de vena yugular 2b(E41Q) Cápsula con (450MILVkg- recubrimiento 1,5 mg/kg) entérico 1 mL 12 5 Cateterización IFN-a- PO 0,25 mg de vena yugular 2b(E41Q) Cápsula con (225MIU/kg - recubrimiento 0,75 mg/kg) entérico 1 mL La colección de muestras de sangre (200 pL) se realizó a través de un catéter en la vena yugular en los siguientes tiempos: 0, 1, 1,5, 2, 4 y 6 h. Los parámetros PK incluyendo Cmax, Tmax, vida media y AUC fueron determinados para cada perfil PK y son presentados en la Tabla 53 a continuación.

TABLA 53: Parámetros PK para administración PO (cápsula con recubrimiento entérico) IFN-a IFN-a-2b(E41Q) nativo Dosis (mg) 2 1 0,75 0,5 0,25 2 Cmax (IU/mL) 40202 34690 27491 25977 1 8034 - Vida media (h) 4,7 3 4,3 1 ,24 0,63 - AUC(0-8) (IU-h/mL) 303209 1 81 0 1 5 1 904 1 9 86 1 39 39537 - AUC,o.,) (IU-h/mL) 1 65892 1 5 1 368 1 03686 6 1 335 23795 - Similar a la formulación líquida, una actividad antiviral significativa dependiente de la dosis fue detectada en el plasma de rata seguido de la administración PO del IFN- -2b (E41Q) en formulación de cápsula con recubrimiento entérico con valores Cmax alrededor de 40202, 34690, 27491, 25977, y 18034 IU/mL para dosis de 2, 1, 0,75, 0,5 and 0,25 mg/rata, respectivamente . Sin embargo, no fue observada la detección de actividad antiviral en el plasma de ratas a las que se administró con una formulación de cápsula con IFN-OÍ nativo a una dosis de 2 mg/rata. Estas observaciones también se correlacionan con un aumento dependiente de la dosis del parámetro AUC(0-8) eXpo con valores de alrededor de 39537, 86139, 190419, 181015 y 303209 IU-hr/mL obtenidos para dosis de 0,25, 0,5, 0,75, 1 y 2 mg/rata de la formulación en cápsula de IFN- -2b (E41Q) , respectivamente. Estos datos concuerdan con datos previamente obtenidos seguido de administración PO de IFN-a-2b (E41Q) en formulación líquida mostrando un aumento en la absorción de IFN-a-2b(E41Q) desde el compartimiento intestinal a la circulación sistémica. Además, se obtuvo una vida media dependiente de la dosis para IFN- -2b (E41Q) en el compartimiento sanguíneo sistémico con valores alrededor de 4,7, 3, 1,24 y 0,63 h para dosis de 2, 1, 0,5 y 0,25 mg/rata excepto para dosis de 0,75 mg/rata que mostró un valor de vida media de alrededor de 4,3 horas. La relación dependiente de la dosis y los valores de vida media observados después de administración PO de la formulación en cápsula de IFN-a-2b (E41Q) fueron similares a los datos obtenidos con formulaciones líquidas administradas ID (comparar con Tabla 45) . 7. Análisis de biodisponibilidad de administración PO versus administración intravenosa (IV) Para cada dosis de IFN-a-2b (E41Q) administrada PO (formulaciones de cápsula con recubrimiento entérico o formulaciones líquidas) a las ratas, fue determinado el porcentaje de biodisponibilidad de IFN- -2b (E41Q) comparado con administración IV. Resultados PK para administración PO de formulaciones líquidas o formulaciones de cápsula con recubrimiento entérico son descritos anteriormente en (3) y (4) . Para administraciones IV, las ratas fueron inyectadas por vía intravenosa con una dosificación de 10 pg por rata de IFN-a-2b (E41Q) o IFN- nativo. La información de dosificación y detalles de diseño experimental para administración IV se presentan en la Tabla 54 a continuación.

La colección de muestras de sangre (200 L) se realizó a través de un catéter en la vena yugular en los siguientes tiempos: 0, 0,08, 0,50, 1, 2 y 4 h. Los parámetros PK incluyendo Cmax, Tmax, vida media y AUC fueron determinados para cada perfil PK comparados a las administraciones PO de IFN- -2b (E41Q) o IFN-OÍ nativo . El porcentaje de biodisponibilidad (BAV, por sus siglas en inglés) de IFN-a-2b (E41Q) luego de administración PO comparado con administración IV fue calculado relativo a Cmax y AUC usando las siguientes ecuaciones : BAV (%) relacionado a Cmax ( (Cmax/dOSÍs) IFN -2b(E41Q) / (Cmax/dOS?S ) IFN 2b(E41Q)-Iv) X 100 BAV (%) relacionado a AUC ( (AUC/dosis) iFN-a-2b(E4io) /(AUC/dosis) ] 2b(E41Q)-Iv) X 100 BAV (%) relacionado a AUC y a IFN-a nativo = ( (AUC/dOSlS) iFN-a-2b(E41Q) / (AUC/dOSis) nativo- IV) X 100 El análisis de biodisponibilidad (en %) realizado en la formulación de cápsula con recubrimiento entérico de IFN-a-2b (E41Q) después de administración PO a las ratas es presentado en la Tabla 55 a continuación.

El análisis de biodisponibilidad (en %) realizado en formulación líquida de IFN-a-2b (E41Q) después de administración PO a las ratas se presenta en la Tabla 56 a continuación.

TABLA 56 8) Resumen Tanto para la formulación líquida como para la cápsula con recubrimiento entérico, se detectó una significativa actividad antiviral dependiente de la dosis en el plasma de rata seguido de la administración PO de IFN-a-2b (E41Q) mientras que no se observó señal en el plasma de ratas a las que se administró proteína IFN-o¡ nativa. Se obtuvieron resultados similares con la administración ID de formulación líquida de IFN-a- 2b(E41Q) mostrando un gran aumento en los parámetros max y AUC(o expo alrededor de 10,3 veces y 30 veces más alto, respectivamente, para IFN-a-2b (E41Q) comparado con IFN-a nativo. Además, un aumento dependiente de la dosis en la vida media se observó para IFN-a-2b (E41Q) seguido de la administración PO (con ambas formulaciones, liquida y cápsula) comparado con la ruta IV. Similarmente , un aumento en la vida media se observó para IFN-a-2b (E41Q) seguido de administración ID versus IV comparado con proteína nativa que apoya fuertemente la existencia de liberación prolongada de IFN-a-2b (E41Q) desde el compartimiento intestinal al sistema de circulación sistémico probablemente relacionado a una lenta absorción acoplado con la resistencia a degradación por proteasas intestinal. Todos estos datos demuestran la capacidad de IFN- a-2b(E41Q) para ser liberado en la circulación sistémica después de la administración oral comparado con IFN-a nativo.

EJEMPLO 10 Farmacocinética e Inmunogenicidad de IFN-oc- (E41Q) Después de Administración Oral en Ratas Como parte del estudio descrito en el Ejemplo 16 más adelante, los perfiles farmacocinéticos fueron determinados para administraciones orales de IFN-a-2b(E41Q) . El propósito de este estudio fue evaluar la farmacocinética, inmunogenicidad e influencia de anticuerpos anti-IFN-a-2b (E41Q) en el perfil PK de IFN-a-2b(E41Q) cuando era administrado a diario por ruta PO a ratas con cápsula con recubrimiento entérico por 2 semanas. Administraciones orales diarias de formulaciones de cápsula con recubrimiento entérico de IFN-a-2b (E41Q) con dosis de 0,2, 0,4 and 0,6 mg por animal fueron realizados en ratas (ratas libres de patógenos Sprague-Dawley) por sobre 14 días. Las ratas Sprague-Dawley fueron elegidas por su utilidad para predecir efectos tóxicos de drogas en humanos y su reconocimiento por autoridades regulatorias como una especie apropiada para estudios de toxicología. Por cada dosis, a seis machos (250-350 g) y seis hembras (150-250 g, sin partos y no grávidas) se administró oralmente dosis de 0,2, 0,4 o 0,6 mg de IFN-a- 2b (E41Q) cada día. El grupo de control (6 machos y 6 hembras) recibieron el placebo (cápsula con recubrimiento entéricos con la misma formulación que la IFN-a-2b(E41Q) cápsula con recubrimiento entéricos sin IFN-OÍ-2b(E41Q) ) . 1. Procedimientos Generales En los días de administración en días 1, 7 y 14 y para cada dosis inmediatamente antes de administración y a las 1, 2, 4, 8 y 24 h después de la administración, se colectaron muestras de sangre desde los senos retro-orbitales de 3 machos y 3 hembras, muestreados por tiempo y por grupo, como se ilustra en la Tabla 57. Un perfil farmacocinético completo de una dosis de IFN-a-2b (E41Q) fue colectado usando 12 ratas (6 machos y 6 hembras), muestreados como sigue: un grupo de 3 machos y 3 hembras elegidos antes de la dosis, 2 y 8h y otro grupo de 3 machos y 3 hembras a 1, 4 y 24h.

TABLA 57 IFN-a-2b(E41Q) 0,2 mg/rata Tiempo ID Rata Predosis 1H 2H 4H 8H 24H M - 200611872 X X X M - 200611807 X X X M - 200611808 X X X M - 200611809 X X X M - 200611810 X X X M - 200611811 X X X F - 200611854 X X X F - 200611855 X X X F - 200611856 X X X F - 200611857 X X X F - 200611858 X X X F - 200611859 X X X TABLA 57 Las muestras de sangre de los sangrados retro-orbitales fueron guardadas a temperatura ambiente por unas pocas horas . El suero fue preparado por centrifugación por 15 min a 3000 rpm (1620 g) , a 4°C ± 2°C. El suero se dividió en 3 tubos de polipropileno (70-80 µ? cada uno) e inmediatamente congelado y guardado congelado (< -70°C) hasta su uso. Las muestras de sangre fueron tomadas desde todos los animales para i) la determinación de los niveles de IFN-a-2b (E41Q) en el plasma (estudios PK, ver métodos en Ejemplo 9) y ii) la medición de ambos niveles de anticuerpos total y neutralizante de anti-IFN-a (ensayos de determinación de anticuerpos) en el suero de rata. Por cada dosis evaluada, ambos anticuerpos total y neutralizante anti-IFN-a-2b (E41Q) fueron determinados usando anticuerpo anti-IFN-a humano ELISA (para medir los anticuerpos totales) de acuerdo a las instrucciones de fabricante (A4-203 - MDS Pharma Services, Zürich, Suiza) y ensayo de Kawade (para medir anticuerpos neutralizantes; Kawade y cois., J". Interferon Research, 1987, Grossberg y cois., J. Interferon Cytokines Research; 2001; Grossberg y cois., Biotherapy, 1997; Kawade Y., J. Interferon Research, 1980; 1:61-70; Kawade y cois., J. Immunological Methods, 2003) . 2. Lotes de Drogas Para los estudios farmacocinéticos y de inmunogenicidad presentados en este Ejemplo, fue usado un lote d IFN-a-2b (E41Q) : IFN-001-06. Como control, se usaron cápsulas placebo con recubrimiento entérico. Las especificaciones y rutas de administración para los lotes experimental y placebo se presentan en las Tablas 58 (a y b) a continuación. 3. Anticuerpos neutralizantes anti-IFN-cc-2b(E41Q) La determinación cuantitativa de anticuerpos neutralizantes se realizó de acuerdo al ensayo de Kawade . Específicamente, 10 UL (Unidades de Laboratorio, por sus siglas en inglés) de IFN-a- 2b(E41Q) fueron tratadas con diluciones seriadas a la mitad de muestras de suero de rata (en un rango desde 14 a 28672 veces) . Después de incubar por 1 h a 37 °C, las mezclas fueron colocadas por 16 h en células HeLa y luego, las células fueron infectadas con el virus EMC. A 48 h post-infección, el número de células vivas fue determinado por tinción de células viables (Azul de metileno) y medición de OD. Los niveles de anticuerpos de neutralización fueron determinados como unidades reductoras en 10 veces por mL de suero de rata (TRU/mL) correspondiente a la dilución del suero de rata requerido para neutralizar la actividad de 10 UL del correspondiente IFN-a-2b (E41Q) calculando el valor neutralizante EC50 (nEC50) · Los resultados representativos de los niveles de anticuerpos neutralizantes medidos para cada dosis de cápsula con recubrimiento entérico de IFN-a-2b (E41Q) (0,2, 0,4 y 0,6 mg) en día 15 se muestran en la Tablas 59(a-c), respectivamente. Un título de anticuerpo neutralizante > 20 TRU/ml (Unidades de Reducción de Diez Veces) fue considerado como umbral para considerarlo positivo.

TABLA 59a: 0,2 mg/rata Dosis 0,2 mg/rata TRU/ml F854 0,0 F855 0,0 F856 0,0 F857 0,0 5 F858 0, 1 F859 0,0 M807 81 ,3 M808 0,0 M809 0,0 M810 0,0 M81 1 0,0 872 0,0 10 TABLA 59c: 0,6 mg/rata Dosis 0,6 mg/rata TRU/ml 20 F866 0,0 F867 0,0 F868 0,0 F869 0,0 F870 0,0 F871 0,0 818 0,0 M819 0,0 M820 0,0 25 M821 0,0 M822 0,0 M823 0,0 No se midieron niveles detectables de anticuerpos neutralizantes en el suero de rata en día 1 para dosis de 0,2, 0,4 y 0,6 mg y para placebo en todos los animales ensayados . Como se muestra en las Tablas 59(a-c), al día 15, no se midieron niveles detectables de anticuerpos neutralizantes (Nab, por sus siglas en inglés) en 11 ratas a las que se administró oralmente con 0,2 mg de IFN-a-2b (E41Q) en cápsula con recubrimiento entérico, solo un macho (M807) exhibió un título positivo de 81,3 TRU/ml (Tabla 59a) . Similarmente , con una dosis de 0,4 mg/rata (Tabla 59b) , 10 ratas exhibieron niveles no detectables de Nab mientras que la hembra F864 y el macho M812 mostraron cantidades detectables de Nab de 118,1 TRU/ml y 53,1 TRU/ml, respectivamente. No se detectó un título de Nab en todas las ratas a las que se administró una dosis oralmente de 0,6 mg/rata (Tabla 59c) . 4. Anticuerpos anti-IFN-a-2b (E41Q) totales Concentraciones de anticuerpos totales anti-IFN-a en las muestras de suero de las ratas fueron determinadas usando un ELISA con anticuerpo humano anti-IFN-oí. Las muestras fueron diluidas 9 veces de acuerdo al protocolo del fabricante (Manual de IFN-alfa ELISA Kit) y los resultados fueron expresados en IU/mL luego de extrapolar una curva estándar de valores OD medidos con un espectrofotómetro a 450nm (SOP-AU-212-IFNA2b en IPM GmbH, Hamburg : determinación en muestras de anti-IFN alfa total por Servicios MDS Pharma ELISA) . Los resultados representando los niveles totales de anticuerpos medidos para cada dosis de cápsula con recubrimiento entérico de IFN-a-2b (E41Q) (0,2, 0,4 y 0,6 mg) se muestran en la Tablas 60(a-c), respectivamente. El límite de detección de anti-IFN-a se determinó en 0,24 IU/mL. El coeficiente de variación total calculado entre ensayos fue un 7,4% con una concentración nominal de 0,35 IU/mL y 2,5% con 4,2 IU/mL (determinación hecha por el fabricante de los kits ELISA) .

TABLA 60a: 0 10 TABLA 60b: 0 15 TABLA 60c: 0,6 mg/rata 25 No se midieron concentraciones detectables de anticuerpos en el suero de rata al día 1 para dosis de 0,2, 0,4 y 0,6 mg ni para placebo en todos los animales ensayados . Como se muestra en las Tablas 60(a-c), al día 15, no se detectaron anticuerpos totales anti-IFN-a-2b(E41Q) en 10 ratas a las que se administró oralmente con 0,2 mg de IFN-a-2b (E41Q) en una cápsula con recubrimiento entérico. Solo dos animales, hembra F858 y macho 807, exhibieron bajas concentraciones de anticuerpos totales de alrededor de 8,3 y 0,3 IU/ml , respectivamente (Tabla 60a) . Similarmente , con una dosis de 0,4 mg/rata (Tabla 60b), 11 ratas exhibieron niveles de concentraciones no detectables de anticuerpos totales excepto por hembra F864 con una cantidad de anticuerpos totales detectable de alrededor de 78,5 IU/ml. Para notar, el animal M812 mostró título positivo de Nab con una dosis de 0 , 4mg (53,1 TRU/ml) pero no exhibió niveles detectables de anticuerpos totales. Una ausencia de anticuerpos totales se observó en todas las ratas a las que se administró una dosis oral de 0,6 mg/animal (Tabla 60c). 5. Actividad antiviral remanente después de administración PO diaria de IFN-a- 2b(E41Q) en formulación de cápsula con recubrimiento entérico Los parámetros PK de la formulación en cápsula con recubrimiento entérico de IFN- -2b (E41Q) después de administración PO a ratas el día 1 con dosis de 0,2, 0,4 y 0,6 mg por animal se presentan en la Tabla 61 a continuación. Promedios de ambos 3 ratas machos y 3 ratas hembras de parámetros PK para cada dosis de IFN-a-2b (E41Q) se muestran.

TABLA 61: Día 1 Cápsulas con Cma Tmax AUC(o-oo) AUC(< ) recubrimiento entérico (IU/mL) (h) (h-IU/mL) (h-IU/mL) IFN-a-2b(E41Q) - 0,2 mg 4909 1 20945 20945 IFN-a-2b(E41Q) - 0,4 mg 53248 1 576002 501338 IFN-a-2b(E41Q) - 0,6 mg 180173 1 1731959 1730200 Los parámetros PK para formulación en cápsula con recubrimiento entérico de IFN-a-2b(E41Q) después de administración PO a ratas al día 7 con dosis de 0,2, 0,4 y 0,6 mg por animal se presentan en la Tabla 62 a continuación. Promedios de ambos 3 ratas machos y 3 ratas hembras de parámetros PK para cada dosis de IFN-a-2b(E41Q) se muestran.

TABLA 62: Día 7 Cápsulas con Cmax Tmax AUC(o-oo) AUC(o-t) recubrimiento entérico (IU/mL) (h) (h-IU/mL) (h-IU/mL) IFN-a-2b(E41Q) - 0,2 mg 4379 1 16386 16386 IFN-a-2b(E41Q) - 0,4 mg 50144 1 413264 413264 IFN-a-2b(E41Q) - 0,6 mg 195917 1 16981 13 16981 13 Los parámetros PK para formulación en cápsula con recubrimiento entérico de IFN-a-2b(E41Q) después de administración PO a ratas al día 14 con dosis de 0,2, 0,4 y 0,6 mg por animal se presentan en la Tabla 63 a continuación. Promedios de ambos 3 ratas machos y 3 ratas hembras de parámetros PK para cada dosis de IFN-a-2b(E41 Q) se muestran.

TABLA 63: Día 1 Cápsulas con Cmax Tmax AUC(0-oo) AUC(0-t) recubrimiento entérico (IU/mL) (h) (h-IU/mL) (h-IU/mL) IFN-a-2b(E41Q) - 0,2 mg 4434 1 19673 19673 IFN-a-2b(E41Q) - 0,4 mg 38829 1 289805 289805 IFN-a-2b(E41Q) - 0,6 mg 1 12320 1 1 175233 1 175233 No se observó impedimento en los perfiles PK al día 1 y día 7 con dosis de 0,2, 0,4 y 0,6 mg. Al día 14, los valores promedio de AUC(0-t) y Cmax medidos para todos los perfiles PK fueron similares comparados al día 1 para cada dosis de IFN-a-2b (E41Q) administrada evaluada excepto para animales tratados con una dosis de 0 , 6 mg presentando una reducción en los valores de Cmax y AUC(o-t) (4909 IU/mL versus 4434 IU/mL para Cmax los días 1 y 14 respectivamente con una dosis de 0,2 mg; 180173 IU/mL versus 112320 IU/mL para Craax al día 1 y 14 respectivamente con una dosis de 0,6 mg; 20945 IU-hr/mL versus 19673 IU/mL para AUC(0-t) al día 1 y 14 respectivamente con una dosis de 0,2 mg y 1730200 IU-hr/mL versus 1175233 IU/mL para AUC(0-t) al día 1 y 14 respectivamente con una dosis de 0,6 mg) . Sin embargo, no se detectó anticuerpo neutralizante o anticuerpos totales en ratas tratadas con una dosis de 0,6 mg al día 15 sugiriendo que la disminución en los parámetros PK observados entre el día 1 y día 14 no se debió a la presencia de anticuerpos pero más probablemente a heterogeneidad de los animales y su variabilidad ínter individual. Una reducción moderada pero significativa de los valores de Cmax y AUC(0-t) también se observó con una dosis de 0,4 mg entre día 1 y día 14 (53248 IU/mL versus 38829 IU/mL para Cmax al día 1 y día 14, respectivamente; 501338 IU-hr/mL versus 289805 IU-hr/mL para AUC(0-t) al día 1 y día 14, respectivamente) . Estos descubrimientos se correlacionan bien con la presencia de niveles positivos de los anticuerpos totales y neutralizantes en suero de rata con una dosis de 0,4 mg al día 15 (dos de los doce animales) . 6. Resumen En resumen, no fueron detectados niveles de anticuerpos neutralizantes o totales con dosis de 0,2 u 0,6 mg por animales en suero de rata después de administración diaria PO de cápsula con recubrimiento entéricos de IFN-a-2b (E41Q) durante 2 semanas. Este descubrimiento fue apoyado por la ausencia de un fuerte impedimento del perfil PK de IFN- -2b (E41Q) observado al día 14 o día 7 con dosis de 0,2, 0,4 y 0,6 mg por animal después de administración diaria por ruta oral de cápsula con recubrimiento entéricos de IFN-a-2b(E41Q) durante 2 semanas. Con una dosis de 0,4 mg, solo dos de los doce animales mostraron títulos positivos de anticuerpos neutralizantes (con solo un animal presentando niveles de anticuerpos totales significativos) . Una reducción moderada de los valores de Cmax y AUC(o-t) fue observada entre el día 1 y día 14 con esta dosis.

EJEMPLO 11 Estudio In Vivo Farmacocinético de IFN-a-2b (E41Q) en monos Cynomolgus {Macaca fascicularis) después de Administración por Ruta Oral e IV Se realizó un estudio farmacocinético in vivo en monos Cynomolgus para evaluar los perfiles PK de IFN-a-2b (E41Q) después de administración por rutas IV y PO. Estos datos fueron entonces comparados con perfiles PK previos obtenidos de administración subcutánea de IFN-OÍ nativo y el producto comercial IFN-a nativo mterferon Intron A . Los resultados obtenidos de la administración intravenosa (IV) de IFN-a-2b (E41Q) e IFN-a nativo a una dosis de 50 pg/kg fueron usados para calcular el porcentaje de ambas biodisponibilidades de IFN-a-2b (E41Q) e IFN-a nativo después de administración PO. 1. Procedimientos Generales Se realizaron estudios farmacocinéticos en muestras de plasma de monos a los que se administró IFN-a-2b (E41Q) e IFN-a nativo. Los perfiles PK fueron basados en la cantidad remanente de IFN-a-2b (E41Q) en el plasma animal que fue determinado por un ensayo de actividad antiviral (como se describió en Ejemplo 9) . 2. Lotes de Drogas Para los estudios farmacocinéticos presentados en este Ejemplo, se usaron tres lotes distintos de IFN-a-2b (E41Q) : G055/LPC1/060221 , IFN-001/06 y G055/060118T (descritos en Ejemplo 4) . Para comparar la actividad farmacocinética de IFN-a-2b (E41Q) a IFN- -2b nativo sin modificar, un lote de IFN-a-2b también fue usado: IFN-002/06 (descrito en Ejemplo 3) . Especificaciones y rutas de administración para cada lote son presentados en la Tabla 64 (a-e) a continuación . 3. Perfiles PK para administración IV y PO El objetivo de éste estudio fue investigar los perfiles PK de IFN-a-2b (E41Q) después de inyección IV o administración oral (como tabletas con recubrimiento entérico o cápsulas con recubrimiento entérico) a monos Cynomolgus . Varias dosis (0,8, 0,55, 0,45 y 0,2 mg/kg) de IFN-a-2b (E41Q) en formulación de tableta con recubrimiento entérico, una dosis única (0,9 mg/kg) de IFN-a-2b (E41Q) en formulación de cápsula con recubrimiento entérico, y una dosis única (0,9 mg/kg) de IFN-a nativo en formulación de cápsula con recubrimiento entérico se evaluaron por administración PO en monos Cynomolgus {Macaca fascicularis) de manera de comparar la PK y perfiles de exposición sistémica de las dos proteínas después de administración oral . Como se muestra en la Tabla 65 más adelante, un total de seis monos Cynomolgus (Macaca fascicularis) , tres machos y tres hembras con pesos entre 2,8 y 5,4 kg se dividieron en tres grupos (un macho y una hembra por grupo) . Cada grupo fue usado en tres experimentos de dosificación separados. Cada dosis administrada por vía IV fue expresada como pg/kg y ajustada al peso individual medido el día de administración. Cada dosis administrada por vía oral fue expresada como mg/kg calculado en base al peso corporal medido en D-6. Para el primer experimento de dosificación, los tres grupos de animales no tratados previamente (referidos en la Tabla 65 como Grupos 1, 2 y 2 Duplicado) , fueron inyectados IV con ya sea 50 pg/kg de IFN-a-2b (E41Q) o IFN-OÍ nativo (día 1) y monitoreado a intervalos de tiempo por un período de 16 horas . Para el segundo experimento de dosificación, 7 días después, a los tres grupos (los mismos animales de los Grupos 1, 2 y 2. Los duplicados son referidos como Grupos 3, 4 y 5 en la Tabla 65, respectivamente, para el segundo experimento de dosificación) , se les dio una dosis ya sea de 0,8 mg/kg de la formulación en tableta con recubrimiento entérico de IFN-a-2b (E41Q) , 0,9 mg/kg de la formulación en cápsula con recubrimiento entérico de IFN-a-2b (E41Q) o IFN-a nativo por ruta PO (día 9) y monitoreados a intervalos de tiempo por un período de 24 horas . Para el tercer experimento de dosificación, 7 días después, los tres grupos (los mismos animales de los Grupos 3, 4 y 5, son referidos en la Tabla 65 como Grupos 6, 7 y 8, respectivamente, para el tercer experimento de dosificación) , se les dio una dosis de ya sea 0,55, 0,45 o 0,2 mg/kg de la formulación en tableta con recubrimiento entérico de IFN- -2b (E41Q) por ruta PO (día 17) y monitoreados a intervalos de tiempo por un período de 24 horas.

TABLA 65: Dosificación y detalle experimental para estudio IV y PO SGrupo Número d Grupo/tratamiem Ruta ítem a ensayar Dosis-niv< Formulación y dosificación número animales día 1 1 macho Grupo 1/D 1 IFN-a nativo 50 µg/kg Líquido 0,5 mL/kg 1 hembra Líquido 0,5 mL/kg 2 1 macho Grupo 2/D 1 IFN-a-2b(E41 Q)50 µ? kg Líquido 0,5 mL/kg 1 hembra Líquido 0,5 mL/kg 2 1 macho Grupo 3/D 1 IFN-a-2b(E41 Q)50 Líquido 0,5 mL/kg Duplicado 1 hembra Líquido 0,5 mL/kg 3 1 macho Grupo 1/D9 IFN-a nativo 0,9 mg kg 4 cápsulas con recubrimiento 1 hembra 0,9 mg/kg entérico/animal 3 cápsulas con recubrimiento 0 entérico/animal 4 1 macho Grupo 2/D9 PO IFN-a-2b(E41 Q)0,9 mg/kg 3 cápsulas con recubrimiento 1 hembra 0,9 mg/kg entérico/animal 3 cápsulas con recubrimiento entérico/animal 1 macho Grupo 3/D9 PO IFN-a-2b(E41 Q)0,8 mg/kg 4 tabletas con recubrimiento 1 hembra 0,8 mg/kg entérico/animal 4 tabletas con recubrimiento entérico/animal 1 macho Grupo PO IFN-a-2b(E41 Q)0,55 mg/k 5 tabletas con recubrimiento 1 hembra 0,55 mg/k entérico/animal 4 tabletas con recubrimiento 5 entérico/animal 1 macho Grupo 2/D 17 PO IFN-a-2b(E41 Q)0,45 mg/k 3 tabletas con recubrimiento 1 hembra 0,45 mg/k entérico/animal 3 tabletas con recubrimiento entérico/animal macho Grupo 3/D 17 PO IFN-a-2b(E41 Q)0,2 mg/kg 1 tableta con recubrimiento hembra 0,2 mg/kg entérico/animal 1 tableta con recubrimiento entérico/animal intravenoso; PO = ruta oral; D = día animales en tres grupos fueron usados repetidamente 0 En cada punto de tiempo (día -1, 0, 0,033, 0,083, 0,17, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8 y 16 h post-inyección para administración IV y día -1, 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 4, 6, 8, 12, 16 y 24 h post-administración para administración oral) , una muestra de sangre (1 mL) fue tomada desde las venas safena o cefálica de todos los monos para determinación de niveles de actividad antiviral remanente de IFN-a-2b (E41Q) o IFN-a nativo en el plasma. Las muestras de sangre se colocaron en tubos pre-enfriados sin anticoagulante y se mezclaron con 70 µ? de solución antiproteasa . Las muestras de sangre se colocaron en hielo húmedo o 4°C después de centrifugar a 4°C por 10 minutos a 3000rpm. El suero se dividió en 3 tubos de polipropileno (2 tubos con 100 µ? y un tubo con el resto) e inmediatamente congelado y guardado a -20°C ± 2°C hasta su uso. Cada animal fue chequeado por mortalidad y signos clínicos al menos dos veces al día durante el período de tratamiento. El peso corporal de cada animal se registró al menos dos veces durante el período previo al tratamiento. Los parámetros PK de la formulación líquida ya sea de IFN-a-2b (E41Q) e IFN-nativo después de administración IV a los monos (50 pg/kg) se presenta en la Tabla 66 a continuación (primer experimento de dosificación) .

TABLA 66: Parámetros PK para administración IV IFN-a-2b(E41Q)- 50 H /kg 421031 322229 2 IFN-a nativo - 50 µg/k 375109 235200 0,5 El valor de concentración inicial (Ci) obtenido para IFN-a-2b (E41Q) fue similar comparado con IFN-a nativo (421031 IU/mL comparado con 375109 IU/mL) . Un aumento en AUC(0-8) de alrededor de 1,4 veces se observó para monos inyectados con IFN-a-2b (E41Q) comparado con IFN-a nativo (322229 IU-h/mL para IFN-a-2b(E41Q) versus 235200 IU-h/mL para IFN- nativo) . Los parámetros PK de IFN- -2b (E41Q) e IFN-a nativo después de administración PO para la formulación en cápsula con recubrimiento entérico (0,9 mg/kg) a monos se presenta en la Tabla 67 a continuación (datos del segundo experimento de dosificación) .

TABLA 67: Parámetros PK para administración PO (cápsula con recubrimiento entérico) Vida Cápsulas con recubrimiento Cmax Tmax entérico (IU/mL) (h) (h-IU/mL) ™ed,a IFN-a nativo- 0,9 mg/kg - - IFN-a-2b(E41Q) - 0,9 mg/kg 11795 4 55803 2,7 Similar a los datos obtenidos con ratas después de administración oral de IFN-a-2b (E41Q) en cápsulas con recubrimiento entérico (0,9 mg/kg), una actividad antiviral significativa fue detectada en el plasma de monos con valores Cmax de alrededor de 11795 IU/mL y valores de parámetro AUC(0-8) alrededor de 55803 IU-hr/mL, mientras no se detectó actividad en animales tratados con IFN-a nativo para la misma dosis (0,9 mg/kg) .

Los parámetros PK de IFN-a-2 (E41Q) en formulación de tableta con recubrimiento entérico después de administración PO de varias dosis (0,8, 0,55, 0,45 y 0,2 mg/kg) a monos se presenta en la Tabla 68 a continuación (datos compilados desde el segundo y tercer experimentos de dosificación) .

TABLA 68: Parámetros PK para administración PO (tableta con recubrimiento entérico) Tabletas con Cmax Tmax AUC(o-00) Vida media recubrimiento entérico (IU/mL) (h) (h-IU/mL) (h) Tableta - 0,8 mg/kg 17165 1 ,5 84505 3,4 Tableta - 0,55 mg/kg 20300 1 100332 3,5 Tableta - 0,45 mg/kg 18686 1 54752 3,4 Tableta - 0,2 mg/kg 4190 1 ,5 10928 1 ,6 Se detectó actividad antiviral significativa en el plasma de monos después de la administración de formulación en tableta con recubrimiento entérico de IFN-a-2b (E41Q) para todas las dosis. Los valores de Cmax y AUC(o-8) obtenidos para administración de IFN- -2b(E41Q) en una dosis de 0,8 mg/kg por tabletas con recubrimiento entérico fueron más altas comparado con los parámetros obtenidos a la dosis de 0,9 mg/kg de cápsulas con recubrimiento entérico (17165 IU/mL comparado con 11795 IU/mL, respectivamente para Cmax y 84505 IU-hr/mL comparado con 55802 IU-hr/mL, respectivamente para AUC(0-8)). Para la formulación de tableta con recubrimiento entérico, ambos Cmax y AUC(0-oo) parecen ser dosis-dependientes y llegar a saturación para una dosis de entre 0,55 y 0,8 mg/kg. Además, una vida media relacionada a la dosis se obtuvo para IFN-a-2b(E41Q) en el compartimiento sanguíneo sistémico con valores de alrededor de 4,3, 3,8, 3,4 y 1,6 h en dosis de 0,8, 0,55, 0,45 y 0,2 mg/kg apoyando la existencia de una liberación prolongada de IFN-a-2b (E41Q) desde el compartimiento intestinal a la circulación sistémica debido a una baja absorción acoplado con la disminución en la susceptibilidad de degradación por proteasas en el intestino. 4. Comparación de los perfiles PK para IFN-oc-2b (E41Q) administrado PO e IFN-o nativo e Intron A® administrados SC Los datos de parámetros PK previamente obtenidos para administración de interferón Intron A* o IFN-a nativo fueron comparados a los datos de PK por administración PO de IFN- -2b (E41Q) (tabletas con recubrimiento entérico) y se presenta en Tabla 69a continuación.

TABLA 69: Comparación de parámetros PK para administración PO y SC Tableta - 0,8 mg/kg 17165 1 ,5 84505 Tableta - 0,55 mg/kg 20300 1 100332 Tableta - 0,45 mg/kg 18686 1 54752 IFN-a nativo - SC - 0,03 mg/kg 23785 2 86618 Intron A® - SC - 0,03 mg/kg 24809 1 102454 Esta comparación mostró un AUC(0-oo) similar después de la administración SC de IFN-a (0,03 mg/kg) nativo y la administración oral de IFN-a-2b (E41Q) (0,55 mg/kg) . Este resultado indica que la cantidad de IFN-a-2b(E41Q) necesaria después de administración oral para alcanzar un AUC similar como se midió por administración SC de IFN-OÍ nativo fue solo 15 veces mayor en monos. 5. Análisis de biodisponibilidad de administración PO versus administración IV El porcentaje de biodisponibilidad de ya sea IFN-a-2b (E41Q) e IFN- nativo después de administración PO fue calculado por comparación a los datos PK para administración IV de IFN-a-2b (E41Q) e IFN-a nativo presentado anteriormente en (1) . Por cada dosis y formulación de IFN-a-2b (E41Q) administrado PO (cápsula con recubrimiento entérico o formulación en tableta) a monos, el porcentaje de biodisponibilidad de IFN-a-2b(E41Q) comparado con administración IV fue calculado relativo a Cmax y AUC(0-8) . Los resultados se presentan en Tablas 70 y 71 para cápsulas con recubrimiento entérico y tabletas con recubrimiento entérico, respectivamente .

TABLA 70: Formulación de Cá sula TABLA 71: Formulación de Tableta Administración PO Administración IV Formulación en Tableta IFN-a IFN-a- IFN-a IFN-a -2b(E41Q) nativo 2b(E41Q) nativo Dosis (mg) 0,8 0,55 0,45 0,2 - 0,05 0,05 AUC(0<0) (UI-hr/mL) 84505 100332 54752 10928 - 322229 235200 Cm0I (UI/ml) 17165 20300 18686 4190 - 42103 1 375109 Cm„/dosis 21456 36909 41524 20950 8420620 7502 180 BA ((Cm„/dosis)Btl/(Cmal/dosis)Bt|. 0,3 0,4 0,5 0,2 -IV) l00 AUC/dosis 10563 1 182422 121671 54640 6444580 4704000 BA (AUC/dosis)Btl/(AUC/dosis 1 ,6 2,8 1 ,9 0,8 - ,v)x ! 00) BA relativo (AUC/dosis)Be|/(AUC/dosis)N„,iv^ 2,2 3,9 22,6 1 ,2 -,v)xl00) El porcentaje de biodisponibilidad calculado para IFN-a-2b (E41Q) en formulación de tableta con recubrimiento entérico a una dosis de 0,8 mg/kg es más alto comparado con IFN-a-2b (E41Q) en formulación en cápsula con recubrimiento entérico a una dosis de 0,9 mg/kg después de administración PO a monos (1,6% versus 1,0%, respectivamente) . El cálculo de biodisponibilidad de IFN- -2b(E41Q) en formulación de tableta con recubrimiento entérico después de administración PO en varias dosis (0,8, 0,55, 0,45 y 0,2 mg/kg) mostró que las dosis de 0,55 mg/kg y en menor medida las de 0,45 mg/kg tienen potencias óptimas (el porcentaje de biodisponibilidad es alrededor de 2,6% y 1,9% para dosis de 0,55 mg/kg y 0,45 mg/kg, respectivamente comparado con 1,6% y 0,8% para dosis de 0,8 mg/kg y 0,2 mg/kg, respectivamente) . 6) Resumen IFN-a-2b (E41Q) puede ser eficientemente entregado a la circulación sanguínea en monos por ruta oral, como proteína liofilizada (cápsulas con recubrimiento entérico o tabletas con recubrimiento entérico) . Una actividad antiviral significativa fue observada en la circulación sanguínea sistémica de monos después de administración PO de ambas formulaciones de tableta con recubrimiento entérico y cápsula con recubrimiento entérico de IFN-a-2b (E41Q) mientras que no se observó actividad antiviral con IFN- nativo dado PO. Los resultados en monos concordaron con datos previos obtenidos en ratas después de administraciones vía sonda y PO de la formulación líquida y de la formulación en cápsula con recubrimiento entérico de IFN-a-2b (E41Q) , respectivamente. Además, el perfil PK observado después de liberación oral imitó el perfil bifásico previamente observado en ratas indicativo de una liberación sostenida en el tiempo, desde un "compartimiento intestinal" a la sangre. Esto también fue apoyado por la vida media relacionada a la dosis para IFN-OÍ-2b(E41Q) en el compartimiento sistémico sanguíneo. El porcentaje de biodisponibilidad calculado para IFN-a-2b (E41Q) en formulación de tableta con recubrimiento entérico a la más alta dosis fue aumentado en un 60% comparado con lo visto para la formulación en cápsula con recubrimiento entérico a dosis similares. La administración de formulación de tableta con recubrimiento entérico de IFN-a-2b (E41Q) a varias dosis fue dependiente de la dosis entre 0,2 mg/kg a 0,55 mg/kg y saturado a dosis entre 0,55 mg/kg y 0,8 mg/kg, El porcentaje de biodisponibilidad fue alrededor de 2,6% (relativo a IV IFN- -2b (E41Q) AUC(0-8)) y 3,2% (relativo a IFN- AUC(0-Oo) nativo) con una potencia óptima alrededor de 0,55 mg/kg de IFN- -2b (E41Q) .

EJEMPLO 12 Farmacocinética e initiunogenicidad de IFN-a- (E41Q) después de administración oral en monos Cynomolgus El propósito de este estudio fue evaluar la farmacocinética, inmunogenicidad e influencia de anticuerpos anti-IFN-a-2b (E41Q) en el perfil PK de IFN-a-2b(E41Q) cuando se administra diariamente por ruta PO a monos Cynomolgus (Macaca fascicularis) vía tabletas con recubrimiento entérico por 2 semanas . El mono Macaca fascicularis se escogió por su aceptación como predictor de efectos farmacológicos para esta clase de drogas en humanos . 1. Procedimientos Generales Administraciones PO repetidas de IFN-OÍ-2b(E41Q) en formulación de tabletas con recubrimiento entérico con dosis de 0,6, 1,2 y 2,4 mg por animal se realizaron diariamente por un período de 2 semanas en dieciocho monos Cynomolgus {Macaca fascicularis) , nueve machos y nueve hembras, criados en cautiverio. Las hembras no habían dado a luz y no estaban preñadas. Al inicio del tratamiento, los animales tenían de 2 a 3 años de edad, y sus pesos estaban entre 2 y 3 kg. Las muestras de sangre se tomaron desde todos los animales para determinación de niveles plasmáticos de IFN- -2b(E41Q) (estudios farmacocinéticos) y para la medición de niveles de anticuerpos totales y neutralizantes anti-IFN-a (ensayos de determinación de anticuerpos) en suero de monos . Los siguientes grupos de tratamiento fueron establecidos de acuerdo a la Tabla 72 a continuación: TABLA 72: Grupos de tratamiento para administración PO (tableta con recubrimiento entérico) Nivel de dosis No. animales Grupo Tratamiento Número de tableta con mg recubrimiento entérico de Mach Hembras proteína/ IFN-a-2b(E41Q) (B) y os animal tabletas con recubrimiento entérico placebo (P) 1 Control - 4 P 3 3 2 IFN-a-2b(E41Q) 0,6 1B + 3P 3 3 3 IFN-a-2b(E41Q) 1 ,2 2B + 2 P 3 3 4 IFN-a-2b(E41Q) 2,4 4B 3 3 La administración PO repetida de IFN-a-2b(E41Q) en formulación de tableta con recubrimiento entérico con dosis de 0,6 mg, 1,2 mg y 2,4 mg por animal fue realizada diariamente por un periodo de 2 semanas . Ya que el peso de los monos macho y hembra incluidos en este estudio es de alrededor de 3 y 2 kg, respectivamente, la dosis de 0,6 mg/animal corresponde a 0,3 mg/kg y 0,2 mg/kg para hembras y machos respectivamente; la dosis de 1,2 mg/animal corresponde a 0,6 mg/kg y 0,4 mg/kg para hembras y machos respectivamente; y la dosis de 2,4 mg/animal corresponde a 1,2 mg/kg y 0,8 mg/kg para hembras y machos respectivamente. Para cada nivel de dosis, se usaron tres machos y tres hembras. El grupo de control recibió tabletas con recubrimiento entérico de placebo solamente . Las muestras de sangre (2 mL) fueron tomadas desde todos los animales en pre-dosis y 24 h después de administración en días 1, 6, y 13. Las muestras se mantuvieron guardadas en baños de hielo/crioestantes seguido por centrifugación a 1620 g por 15 minutos a 4°C para obtener el suero. Las muestras fueron transferidas a dos viales frescos de polipropileno (aprox. 300 µ?) y guardadas a -70 °C hasta su uso. Las muestras de plasma fueron usadas para i) la determinación de niveles plasmáticos de IFN-a-2 (E41Q) y ii) la medición del anticuerpo total y de anticuerpos neutralizantes anti-IFN-a-2b (E41Q) en el suero de los monos. Por cada dosis analizada, ambos anticuerpos totales y neutralizantes anti-IFN-a-2b (E41Q) fueron determinados usando un ELISA con anticuerpo humano anti-IFN-a (para medir anticuerpos totales) de acuerdo a instrucciones del fabricante (A4-203 - MDS Pharma Services, Zürich, Suiza) y ensayo de Kawade (para medir anticuerpos neutralizantes; Kawade y cois., J. Interferon Research, 1987, Grossberg y cois., J. Interferon Cytokines Research; 2001; Grossberg y cois., Biotherapy, 1997; Kawade Y., J". Interferon Research, 1980; 1:61-70; Kawade y cois . , J. Im unological Methods, 2003) . 2. Lotes de Drogas Para los estudios de farmacocinética e inmunogenicidad presentados en este Ejemplo, se usó un lote de IFN-a-2b (E41Q) : G055/060118T (descrito en Ejemplo 4) . Como control, se usaron tabletas con recubrimiento entérico placebo. Las especificaciones y rutas de administración para los lotes experimental y placebo se muestran en las Tablas 73 (a y b) a continuación.

TABLA 73a: IFN-a-2b(E41Q) Lote # G055/060118T Correspondencia MIU vs. 335 MIU = 1 mg mg Presentación Tabletas con recubrimiento entérico con 0,603 mg de IFN- -2b(E41Q) liofilizado y lactosa monohidrato 64,1 mg; celulosa microcristalina 27 mg; polividona kollidon 25 l ,8mg; crospovidona poliplasdona XL 3,6 mg; estearato de magnesio 1 ,8 mg, Tabletas con recubrimiento entérico están recubiertas con recubrimiento gástrico-resistente de Eudragit S I 00; trietil citrato, Talco micron, Dióxido de Titanio y Estearato de magnesio. Número de Tabletas 774 tabletas (masa total por tableta 150 mg) Administraciones Per-os 3. Anticuerpos Neutralizantes y Totales anti-IFN-cc-2b (E41Q) Usando un ELISA con el anticuerpo humano anti-IFN-a y el ensayo de Ka ade para medir los anticuerpos totales y neutralizantes, respectivamente (ambos ensayos son descritos en Ejemplo 10) , no se detectaron anticuerpos anti-IFN-a-2b (E41Q) (anticuerpos totales o neutralizantes) en el suero pre-dosis o en las muestras tomadas en los días 2, 7 y 14 después de la administración diaria de IFN- -2b (E41Q) en tabletas con recubrimiento entérico. En cada caso, las concentraciones de anticuerpos (para anticuerpos totales) o títulos de Kawade (para anticuerpos neutralizantes) medidos en todos las muestras de suero de los monos estuvieron bajo los niveles de fondo medidos en las muestras pre-dosis. Una muestra de suero previa tomada el día D25 para el mono macho 12 al que se administró subcutáneamente dos veces por semana IFN-a-2b (E41Q) a una dosis de 1,26 MIU/kg se usó como control positivo en el ensayo de determinación de título de anticuerpos totales (ELISA de MDS Pharma Services) . El valor obtenido para esta muestra fue de 12,6 ± 1,7 IU/ml . El valor correspondiente obtenido con el Kit Bender Medsystems Immunoassay fue 4299 ng/ml . El título positivo determinado para el mono macho 12 validó los datos que mostraban la no detección de anticuerpos totales en el suero de mono del estudio de toxicidad de dos semanas de administración oral (tableta con recubrimiento entérico) . 4. Perfil PK para Día 1 de Administración Las muestras de plasma fueron tomadas a intervalos de 24 h después de la dosis del día 1 con tabletas con recubrimiento entérico de placebo e IFN-a-2b(E41Q) de los animales tratados para la determinación de PK IFN-a-2b(E41Q) . La cantidad de IFN-a-2b (E41Q) remanente en el plasma de monos a los que se dio tabletas con recubrimiento entérico placebo o 0,6, 1,2 y 2,4 mg tabletas con recubrimiento entérico de IFN-a-2b(E41Q) por animal, fue determinado por el ensayo de actividad antiviral como se describió en Ejemplo 1 anteriormente . Los parámetros PK de IFN- -2b (E41Q) en formulación de tableta con recubrimiento entérico después de administración PO a monos en el día 1 con dosis de 0,6, 1,2 y 2,4 mg por animal se proporcionan en la Tabla 74 a continuación. Se muestran los promedios PK para ambos monos macho y hembra por cada dosis de IFN-a-2b (E41Q) .

TABLA 74: Parámetros PK para administración PO (tableta con recubrimiento entérico) Día 1 Tabletas con recubrimiento Cmax * max AUCJO-OD) AUC(0.,) entérico (RJ/mL) (h) (h-IU/mL) (h-IU/mL) IFN-a-2b(E41Q) - 0,6 mg 1473 1 7767 7767 IFN-a-2b(E41Q) - 1,2 mg 1876 12948 12662 IFN-a-2b(E41Q) - 2,4 mg 5496 32923 32918 Similar a los datos obtenidos previamente en el estudio farmacocinético (Ejemplo 11) realizado en monos Cynomolgus después de administración PO de ya sea cápsula con recubrimiento entérico o en formulación de tabletas con recubrimiento entérico de IFN-a-2b (E41Q) , fue detectada una actividad antiviral significativa en todas las muestras de plasma de monos (ambos macho y hembra) para cada dosis. Se observó una buena correlación dosis -dependiente entre las dosis evaluadas de 0,6 mg y 2,4 mg de IFN-a-2b (E41Q) administradas a los monos y Cmax medido desde los respectivos perfiles PK. Para monos inyectados con 0,6 mg, el valor promedio Cmax fue 1473 IU/mL comparado con 5496 IU/mL para la dosis de 2,4 mg . Similarmente , el valor promedio de AUC(0-t) para monos a los que se administró una dosis de 0,6 mg fue alrededor de 7767 IU-hr/mL comparado con 32918 IU-hr/mL para la dosis de 2,4 mg. Una relación dosis-dependiente también se observó con la dosis intermedia (1,2 mg por animal) para el parámetro AUC(0-t) (12662 IU-hr/mL versus 7767 IU-hr/mL con una dosis de 0 , 6 mg) y una correlación menor se observó para Cmax (1876 IU/mL versus 1473 para una dosis de 0, 6 mg por animal) . 5. Perfil PK para Administración Día 14 Las muestras de plasma se tomaron a intervalos de 24 h después de la dosis del día 14 con tabletas con recubrimiento entérico placebo e iFN-a-2b(E41Q) de animales tratados para la determinación del perfil PK de IFN- -2b (E41Q) . La cantidad remanente de IFN-a-2b (E41Q) en el plasma de monos que se les dio tabletas con recubrimiento entérico placebo o tabletas con recubrimiento entérico de 0,6, 1,2 y 2,4 mg de IFN-a-2b(E41Q) tabletas por animal, se determinó por el ensayo de actividad antiviral descrito en Ejemplo 1 . Los parámetros PK de IFN- -2b (E41Q) en formulación de tableta con recubrimiento entérico después de administración PO a monos en el día 14 con dosis de 0,6, 1,2 y 2,4 mg por animal se proporcionan en la Tabla 75 a continuación. Se muestran los promedios de parámetros PK para ambos monos macho y hembra para cada dosis de IFN-a-2b (E41Q) .

TABLA 75 : Parámetros PK para administración PO (tableta con recubrimiento entérico) Día 14 Tabletas con recubrimiento Cmax Tma, AUC(o-oo) AUC(0-t) entérico (U/mL) (h) (h-IU/mL) (h-IU/mL) IFN-a-2b(E41Q) - 0,6 mg 1977 11021 10975 IFN-a-2b(E41Q) - 1,2 mg 3488 27021 26981 IFN-a-2b(E41Q) - 2,4 mg 5360 40834 40768 Similar a los perfiles PK obtenidos con administración de tableta con recubrimiento entérico de IFN-a-2b (E41Q) en Día 1, se observó una buena correlación entre todas las dosis evaluadas de IFN-a-2b(E41Q) (0,6, 1,2 y 2,4 mg) administradas a monos y el Cmax medido desde los respectivos perfiles PK. Para monos inyectados con 0,6 mg, el valor promedio de Cmax fue 1977 IU/mL comparado con 3488 IU/mL con una dosis de 1,2 mg y 5360 IU/mL con una dosis de 2,4 mg . Similarmente , el valor promedio de AUC(0-t> para monos a los que se administró 0,6 mg es alrededor de 10975 IU-hr/mL comparado con 26981 IU-hr/mL con una dosis de 1,2 mg y 40768 IU-hr/mL con una dosis de 2,4 mg . Además, no fue observado impedimento en los perfiles PK obtenidos para cada dosis de tabletas con recubrimiento entérico de IFN- -2b (E41Q) (0,6, 1,2 y 2,4 mg por animal) al día 14 comparado con el día 1.

Esta observación se apoya en los valores promedio medidos para AUC(0-t) y Cmax de todos los perfiles PK que estuvieron cercanos a todas las dosis evaluadas desde día 1 a día 14 de IFN-a-2b (E41Q) (1473 IU/mL versus 1977 IU/mL para el Cmax en día 1 y 14 respectivamente con una dosis de 0,6 mg; 5496 IU/mL versus 5360 IU/mL para el Cmax en día 1 y 14 respectivamente con una dosis de 2,4 mg; 7767 IU-hr/mL versus 10975 IU/mL para el AUC(o-t) en día 1 y 14 respectivamente con una dosis de 0,6 mg y 32918 IU-hr/mL versus 40768 IU/mL para el AUC(o-t) en día 1 y 14 , respectivamente con una dosis de 2,4 mg) . Más aun, todas estas observaciones PK apoyan fuertemente la evidencia de falta de anticuerpos totales y neutralizantes en suero de monos en el día 14 después de administración diaria PO del IFN- - 2b (E41Q) en formulación de tableta con recubrimiento entérico en dosis de 0,6, 1,2 y 2,4 mg por animal durante 2 semanas . 6. Resumen No fueron detectados niveles de anticuerpos totales o neutralizantes de IFN- -2b (E41Q) con dosis de 0,6, 1,2 y 2,4 mg por animal en suero de mono después de administración diaria PO de IFN-a-2b (E41Q) en tabletas con recubrimiento entérico por 2 semanas . Similar a datos obtenidos del estudio farmacocinético (Ejemplo 11) realizado en monos in Cynomolgus después de administración PO ya sea con formulaciones de cápsula con recubrimiento entérico o de tableta con recubrimiento entérico de IFN- -2b (E41Q) , se detectó una actividad antiviral significativa en todas las muestras de plasmas de mono (ambos macho y hembra) para cada dosis evaluada. No se observó impedimento del perfil PK de IFN-a-2b (E41Q) al día 14 con dosis de 0,6, 1,2 y 2,4 mg después de administración diaria por ruta oral de IFN-a-2b (E41Q) en tableta con recubrimiento entérico por 2 semanas, apoyando la falta de detección de anticuerpos en el suero de monos en el día 14.

EJEMPLO 13 Estudio farmacocinético de administración subcutánea (SC) de IFN-ot-2b (E41Q) en ratones Se determinó el perfil PK de IFN-a- 2b (E41Q) administrado subcutáneamente a ratones comparado con IFN-a nativo e interferón Pegasys®, una proteína de IFN-a-2a comercial, que está modificada por pegilación.

Un perfil PK de una dosis única de IFN-a-2b (E41Q) administrado SC (0,4 MIU/ratón; 1,3 pg/ratón o 65 pg/kg) fue comparado in vivo a IFN-a nativo (0,4 MIU/ratón dosis) e interferón Pegasys* (18 pg/ratón, 720 pg/kg o 36 pg/ratón, 1440 pg/kg ) . 12 ratones macho se usaron para cada administración subcutánea. Todos los ratones recibieron las inyecciones el mismo día. La sangre (200 µ?) fue colectada a 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 24, 36 y 48 horas después de inyección. Los perfiles PK fueron determinados como se describe en Ejemplo 9. Los parámetros PK para IFN-a-2b (E41Q) , IFN-a nativo, e interferón Pegasys® se presentan en la Tabla 76 a continuación.

TABLA 76: Parámetros PK para administración SC Vida media Molécula ? max AUC(0 (Un) (U/mL) (h) (h-IU/mL) Tiempo de eliminación (h) IFN-a-2b(E41Q) 60,2 1 3487 56,2 IFN-a nativo 88,7 1 536 1 ,6 Pegasys® (18 µg/ratón) 38,0 12 1 3 12 39,0 Pegasys® (36 ratón) 65,7 1 2 2870 35, 1 El perfil PK en ratones que reciben IFN-a-2b(E41Q) SC comparado con IFN-a nativo mostró mayores AUC(o-oo) y ti/2. Para AUC ( 0-oo) , se observó un aumento de 6,5 veces, 3,487 para IFN-a-2b (E41Q) versus 536 para IFN-OÍ nativo. Para la vida media, se observó un aumento de 35 veces, 56 h para IFN-a-2b (E41Q) versus 2 h para IFN-a nativo. Los parámetros PK obtenidos de la administración SC para IFN-a-2b (E41Q) comparado con mterferon Pegasys mostraron un aumento levemente superior de AUC ( 0 -8) (un aumento de 1,45 veces de 3.487 para IFN-a-2b (E41Q) versus 2.870 para interferón Pegasys1" y una vida media mayor \LX/2 (un aumento de 1,3 veces de 56 h para IFN-a-2b (E41Q) versus 39 h para mterferon Pegasys .

EJEMPLO 14 Estudio de farmacocinética y toxicidad farmacodinámica de IFN-ct-2b (E41Q) en primates humanos El perfil PK y efectos farmacodinámicos de IFN-a-2b (E41Q) después de administración subcutánea se determinó para administraciones separadas en un régimen de múltiples dosis. 1. Comparación de IFN-a-2b (E41Q) , IFN-a nativo, e Intron A® Se determinó el perfil PK de IFN-a-2b (E41Q) administrado subcutáneamente a monos Cynomolgus {Macaca fascicularis) comparado con IFN-a nativo y la proteína recombinante comercial IFN-a-2b interferón Intron A*. El estudio fue diseñado para investigar la farmacocinética, farmacodinámica, seguridad/patología preliminar clínica e inmunogenicidad, en efectos dependientes de dosis en monos. Para cada grupo, IFN-a-2b(E41Q), IFN-a nativo o interferón Intron A*, se usaron monos 1 macho y 1 hembra. Los siguientes regímenes para administración subcutánea de IFN-a-2b(E41Q), IFN-a nativo e interferón Intron A*, se muestran en Tabla 77 a continuación.

TABLA 77: Régimen de dosificación para administración SC (IFN-a-2b(E41Q); IFN-ot nativo; Intron A®) Día IFN-a- IFN-a nativo Intron A® 2b(E41Q) 1 0,03 mg/kg 0,03 mg/kg tampón (9 MIU/kg) (9 MIU/kg) 4 0,30 mg/kg 0,30 mg/kg tampón (90 MIU/kg) (90 MIU/kg) 8 1 ,00 mg/kg 1 ,00 mg/kg 0,03 mg/kg (300 MIU/kg) (300 MIU/kg) (9 MIU/kg) 12 3,00 mg/kg 3,00 mg/kg 0,30 mg/kg (900 MIU/kg) (900 MIU/kg) (90 MIU/kg) Período de Lavado 66 0,03 mg/kg 0,03 mg/kg 0,03 mg/kg (9 MIU/kg) (9 MIU/kg) (9 MIU/kg) 72 0,03 mg/kg 0,03 mg/kg 0,03 mg/kg (9 MIU/kg) (9 MIU/kg) (9 MIU/kg) 78 0,30 mg/kg 0,30 mg/kg 0,30 mg/kg (90 MIU/kg) (90 MIU/kg) (90 MIU/kg) Se realizaron las siguientes evaluaciones: (i) determinación de concentración en suero de ensayo antiviral in vitro (IFN-a-2b (E41Q) e IFN-a nativo en días 1, 4 por 72 h; en días 66, 72, 78 por 120 h; interferón Intron A* en días 8, 12 por 72 h; en días 66, 72, 78 por 120 h) ; (ii) ensayo RT-PC para expresión de AR m de genes inducibles por IFN-a que son marcadores de actividad antiviral, tal como 2' 5' OAS, neopterin, y MxA, (IFN-a-2b (E41Q) e IFN-a nativo en días 1, 4 por 72 h; en días 66, 72, 78 por 24h (neopterin por 120 h) ; Intron A* en días 8, 12 por 72 h; en días 66, 72, 78 por 24 h (neopterin por 120 h) ) ; (iii) excreción urinaria: pre-dosis, días 3, 10; (iv) medición de anticuerpos totales y neutralizantes (pre- dosis y en días 16, 21 y 28); (v) ensayos para varios parámetros de seguridad y laboratorio tales como señales clínicas, mortalidad, peso corporal, y examen post-mortem. Los resultados de parámetros PK calculados desde los ensayos antivirales in vitro son presentados en Tabla 78 a continuación.

TABLA 78: Parámetros PK para administración SC r AUC(0-72) AUC(o-oo) Vida media Molécula ^max T ? max (h-IU/mL) (h-IU/mL) (ug/mL) ( n) (h) (h) IFN-a-2b(E41Q) 25382 1-4 1023638 1579965 44,9 IFN-a nativo 23785 2 86618 86916 2,02 Intron A® 24809 1 102454 102692 2,28 De estos estudios , se observó que AUC (O-oo) para administración SC de IFN-a-2b (E41Q) fue 15 veces mayor que para interferón Intron A* y 18 veces mayor que IFN-a nativo. La vida media t¾ para administración SC de IFN-a-2b (E41Q) fue 22 veces más larga que para IFN-a nativo, y 20 veces más larga que para Intron A*.

Marcadores inducidos por IFN-a-2b (E41Q) de actividad antiviral similar a Intron A® e IFN-a nativo. La excreción urinaria no fue destacable y no se evidenciaron señales de patología o toxicidad clínica, aunque todos los compuestos indujeron producción de anticuerpos . 2. Comparación de IFN-a-2b (E41Q) e mterferon Pegasys En un experimento separado, el perfil PK de IFN-a-2 (E41Q) administrado subcutáneamente a monos Cynomolgus (Macaca fascicularis) fue comparado con el interferón pegilado IFN-a-2a Pegasys® . Por cada grupo, IFN- -2b (E 1Q) o Pegasys®, se usaron monos 1 macho y 1 hembra. Los siguientes regímenes de dosificación para administración subcutánea de IFN-a-2b (E41Q) o interferón Pegasys® mostrados en la Tabla 79 fueron empleados.

TABLA 79: Régimen de dosifícación para administración SC (IFN-a-2b(E41Q); Pegasys®) Día IFN-a- interferón 2b(E41Q) Pegasys® 1 0,03 mg/kg tampón (9 MIU kg) 7 0,03 mg/kg 0,30 mg/kg (9 MIU/kg) 13 0,30 mg/kg 0,30 mg/kg (90 MIU/kg) Se realizaron las siguientes evaluaciones: (i) determinación de concentración en suero desde un ensayo antiviral in vitro ( IFN-a-2 (E41Q) e interferón Pegasys15 en días 1, 7, 13 por 120 h) ; (ii) Ensayo RT-PCR para expresión de AR m de genes inducibles por IFN-a que son marcadores de actividad antiviral, tal como 2' 5' OAS, neopterin, y MxA (IFN-a-2b (E41Q) e interferón Pegasys1" en días 1, 7, 13 en 24 h (neopterin por 120 h) ) ; (iii) excreción urinaria (pre-dosis, días 3, 10); (iv) medición de anticuerpos totales y neutralizantes (pre-dosis, días 21, 28, 35); (v) ensayos para varios parámetros de seguridad y de laboratorio tal como señales clínicas, mortalidad, peso corporal, y examen post-mortem. Los resultados de parámetros PK calculados desde el ensayo antiviral in vitro son presentados en la Tabla 80 a continuación.

TABLA 80: Parámetros PK para administración SC T AUC(o-i20) AUC(o-oo) Vida inedia Molécula , , 1 max (h-IU/mL) (h-IU/mL) (Un) (h) (h) IFN-a-2b(E41Q) 83700 2-4 4304238 6382257 44,7 Pegasys® 4735 1 48 2256184 2279809 33,9 De estos estudios, se observó que IFN-a-2b(E41Q) tuvo un AUC(0-8) 3 veces mayor que interferón Pegasys®, y una vida media similar t¾ . IFN-a-2b (E41Q) (0,03 mg/kg) e interferón Pegasys* (0,30 mg/kg) mostraron perfiles similares para marcadores de actividad antiviral. La excreción urinaria no fue destacable y no se evidenciaron señales clínicas relevantes de patología o toxicidad, aunque ambos compuestos indujeron la producción de anticuerpos.

EJEMPLO 15 Estudio de toxicidad de IFN-ot-2b (E41Q) administrado SC en monos Cynomolgus El perfil toxicocinético de IFN-a-2b (E41Q) fue evaluado como parte de un estudio de toxicidad de dosis repetida por 13 semanas, en monos Cynomolgus tratados subcutáneamente dos veces por semana con dosis de 0,14 MIU/kg (0,47 g/kg) , 0,42 MIU/kg (1,40 yg/kg) y 1,26 MIU/kg (4,20 yg/kg). Para cada grupo 3 machos y 3 hembras mono fueron usados . Se obtuvieron muestras de sangre periférica para determinación de niveles de IFN-a-2b (E41Q) de todos los monos a pre-dosis, 0,5, 1, 2, 4, 8, y 24 h después de dosificación en día 1. Las muestras de sangre periférica por exposición cumulativa también se obtuvieron a los mismos tiempos en días 26 y 89. El nivel de I FN - OÍ - 2b(E41Q) en la sangre fue determinado usando un ensayo antiviral in vitro (ver Ejemplo 9) . Los parámetros PK para I FN-a-2b (E41Q) calculados desde el ensayo antiviral in vitro para los días 1 , 26 y 89 son presentados en las Tablas 81(a-c), respectivamente.

*No se calcularon valores de parámetros PK para la dosis 0, 14 MIU/kg de días 26 y 89 ya que los niveles séricos de IFN-a-2b(E41 Q) estuvieron bajo el rango de detección del ensayo anti viral.

Como resultado de este estudio, se observó que la inyección SC de IFN- -2b (E41Q) en dosis de 0,14, 0,42 y 1,26 MIU/kg estaba asociada con aumentos dosis-dependientes en Cmax y AUC después de la primera administración. Después de 4 y 13 semanas de tratamiento, la detección de niveles séricos de IFN fue impedida por el desarrollo de títulos de anticuerpos neutralizantes en algunos animales.

EJEMPLO 16 Estudios de Toxicología A. Ratas 1. Estudio de toxicidad aguda en la rata por ruta oral La toxicidad aguda de IFN-a-2b (E41Q) fue evaluada en ratas a las que se administró vía cánula sonda 2,4 mg/rata (9mg/kg) de proteína por administración de tres cápsulas con recubrimiento entérico (0,8 mg cada una; cápsulas con recubrimiento entérico tamaño 9) . Seis ratas hembra (ratas de 7-9 semanas SPF Sprague-Dawley, cada una con peso entre 255,2 g y 274,3 g) , con acceso libre a comida y agua, fueron usadas para el experimento. Después de la administración con IFN-a-2b (E41Q) por 14 días, se monitorearon mortalidad, señales clínicas, pruebas funcionales y de neurocomportamiento, temperatura y peso corporal. Al final del período de observación, todos los animales fueron sacrificados y se realizaron exámenes post-mortem. No murieron animales a los que se dosificó con cápsulas con recubrimiento entérico de IFN-a-2b(E41Q) administrado a 2,4 mg/rata (9 mg/kg) durante el período de observación. No se observó efectos en la temperatura corporal en las hembras, y para la mayoría de los animales, no se observó efecto en ganancia de peso corporal. Cuatro de seis hembras mostraron una disminución en fuerza de agarre y cinco de seis hembras mostraron una disminución en el tono muscular corporal y abdominal a las 24 h post-dosis. No se registraron efectos macroscópicos en la necropsia. En resumen, IFN-a-2b (E41Q) administrado una vez por ruta oral a una dosis de 2,4 mg/rata (9 mg/kg) en las hembras Sprague-Dawley no indujo mortalidad pero indujo una disminución en el tono muscular 24 h postdosis. La mediana de dosis letal (LD50) para IFN-a-2b(E41Q) después de administración oral a ratas hembra se observó durante un período de 14 días y fue mayor que 9 mg/kg de peso corporal. 2. Estudio de toxicidad de 2 semanas en ratas por ruta oral El estudio involucró la evaluación de cuatro grupos principales de ratas y cuatro grupos satélite después de administración con varias dosis de IFN-a-2b(E41Q) por ruta oral. Los grupos principales fueron usados para evaluar la toxicidad basada en la mortalidad y señas clínicas. Los grupos satélite fueron usados para evaluación de toxicocinética (ver resultados en Ejemplo 10) y análisis de anticuerpos (ver resultados en Ejemplo 20. B) . Un total de cuarenta y ocho ratas (SPF) Sprague-Dawley de 8 semanas de edad (veinticuatro machos y veinticuatro hembras, divididos equitativamente entre los grupos (seis animales/sexo/grupo) ; con pesos entre 250-350 g) fueron usados en el estudio. Los cuatro grupos de tratamiento (por cada grupo principal y satélite, para un total de ocho grupos) se establecen en la Tabla 82 a continuación : TABLA 82: Grupos de Tratamiento Toxicológico Principal (No. de Satélite (No. de ratones/grupo) ratones/grupo) Grupo (IFN-a-2b(E41Q) dosis) Macho Hembra Macho hembra 1. solo vehículo (una cápsula con 6 6 6 6 recubrimiento entérico placebo tamaño 9) 2. 0,2 mg/rata (1 mg/kg para 6 6 6 6 hembras y 0,6 mg/kg para machos) 3. 0,4 mg/rata (2 mg/kg para 6 6 6 6 hembras y 1 ,2 mg/kg para machos) 4. 0,6 mg/rata (3 mg/kg para 6 6 6 6 hembras y 1 ,8 mg/kg para machos) Animales que reciben administración oral de IFN-a-2b (E41Q) por cápsulas con recubrimiento entérico (una cápsula con recubrimiento entérico tamaño 9) diariamente por 2 semanas a la dosis indicada anteriormente para el grupo respectivo, para un total de catorce administraciones. Los animales del grupo principal fueron observados dos veces al día para mortalidad y señas clínicas. Fueron pesados a los días -1, 3, 7, 10 y 14 y antes del sacrificio. La temperatura corporal fue registrada antes de las administraciones en los días 1, 7, 14 y también 1 h después del tratamiento. Exámenes oftalmoscópicos y de análisis de sangre fueron realizados pre-dosis y en los días 7 y 14 del período de administración. Se condujeron exámenes hematológicas, bioquímicas clínicas y análisis de orina previo a la primera dosis y a los días 8 y 15. Al final del período de tratamiento, una necropsia total y un examen histopatológico fueron conducidos en todos los animales de los grupos principales. Las ratas de los grupos satélites fueron separadamente evaluadas para estudios de toxicocinética e inmunogenicidad . Las muestras de sangre para la determinación de los niveles de plasma de IFN-a-2b(E41Q) (toxicocinéticos) fueron tomados a los días correspondientes a las administraciones en días 1, 7 y 14 a pre-dosis, 1, 2, 4, 8 y 24 h. Métodos y resultados se reportan por separado en Ejemplo 10. Las muestras de sangre para estudios de inmunogenicidad (evaluación de anticuerpos totales y neutralizantes) fueron tomadas a pre-dosis y al día 15 después de administración. Métodos y resultados son reportados en Ejemplo 20.B. a. Resultados de Toxicidad en el Grupo Principal i . Muertes no programadas No se observó mortalidad ni muertes no programadas en las ratas al tratarlas con cualquier dosis de IFN-a-2b (E41Q) evaluada o vehículo solo. Un macho al que se dosificó con 0,6 mg/rata IFN- -2b (E41Q) presentó dificultad en respiración y fue sometido a eutanasia por razones éticas y se realizó su necropsia al día 10. El animal tenía lesiones en el esófago y alrededor de la tráquea probablemente como resultado de la dosis. ii. Señas Clínicas Una disminución en el tono corporal se observó en dos machos y dos hembras con dosis de 0,2 mg/rata con IFN-a-2b (E41Q) , un macho y dos hembras con dosis a 0,4 mg/rata con IFN-a-2b (E41Q) y tres machos con dosis a 0,6 mg/rata con IFN-a-2b (E41Q) . Además, un macho y una hembra con dosis a 0,2 mg/rata con IFN- -2b(E41Q), una hembra con dosis a 0,4 mg/rata con IFN-a-2b(E41Q) y tres machos con dosis a 0,6 mg/rata con IFN-a-2b(E41Q) mostró una disminución de tono abdominal. Observaciones similares fueron hechas con el placebo con vehículo solo para un macho (en tono corporal) y algunas hembras (en tono abdominal y corporal) . Finalmente, una disminución del tono de miembros en un macho de cada grupo con dosis de IFN-a-2b(E41Q) y en fuerza de agarre para dos hembras con dosis a 0,2 mg/rata con IFN-a-2b (E41Q) y para una hembra con dosis 0,4 mg/rata también con IFN-a-2b (E41Q) fue observado . Durante la necropsia, se observó una masa cerca de la tráquea en un macho con dosis con el placebo (solo vehículo) y cerca del esófago en una hembra con dosis de IFN-a-2b (E41Q) de 0,4 mg/rata. El macho con dosis de IFN-a-2b (E41Q) a 0,6 mg/rata y sometido a eutanasia a DIO mostró adhesión entre la tráquea y esófago y entre el timo y corazón. iii. Peso Corporal No se observaron efectos particulares en machos y hembras tratados con ambos el vehículo e IFN-a-2b(E41Q). Una disminución estadísticamente significativa en el peso absoluto y relativo de la glándula pituitaria fue observada en machos con IFN-a-2b(E41Q) a 0,6 mg/rata (-20% y -18% respectivamente). En hembras con dosis de IFN-a-2b (E41Q) a 0,2 mg/rata, un aumento estadísticamente significativo fue observado en el peso relativo del hígado (+11%) . iv. Temperatura Corporal No se observó efecto en machos y hembras tratados con ambos el vehículo e IFN-a-2b (E41Q) en todas las dosis evaluadas. v. Exámenes Oftalmoscópicos No se detectó anormalidad en machos y hembras tratados con ambos el vehículo e IFN- -2b (E41Q) . vi. Análisis de Sangre No se observó cambio particular relacionado al tratamiento en machos y hembras con dosis de IFN-OÍ-2b(E41Q) para cualquier dosis evaluada. Un aumento estadísticamente significativo de eosinófilos (+144%) fue observado al día 8 en machos con dosis de IFN-a-2b(E41Q) a 0,4 mg/rata. vii. Parámetros Urinarios Todos los parámetros estuvieron en el rango de valores usualmente encontrados en estas especies para todos los animales tratados con ambos IFN-OÍ-2b(E41Q) y el vehículo. vii. Histopatología No hubo lesiones relacionadas al tratamiento en ratas tratadas con IFN-a-2b (E41Q) a 0,6 mg/rata. Cambios de histopatología se observaron en todos los grupos de tratamiento e incluyó a) inflamación edematosa, inflamación crónica mural, hemorragia en esófago, b) inflamación edematosa de tráquea y c) ingesta con absceso. Estos cambios no estuvieron relacionados a la dosis de IFN-a-2b (E41Q) sino que al trauma asociado con la dosificación mecánica. Los mayores cambios en esófago estuvieron presentes en el grupo de control de hembras . b. Conclusiones No se observó mortalidad ni hallazgos anormales bajo las condiciones experimentales con IFN-a-2b(E41Q) para cualquiera de las dosis administradas. El NOAEL (Nivel de Efecto Adverso No Observado, por siglas en inglés) de IFN-a-2b (E41Q) fue 0,6 mg/rata cuando se administra por la ruta oral en ratas macho y hembra . 3. Toxicidad de Dosis Única y Repetida en Ratas por Ruta Intraduodenal (ID) La toxicidad de IFN-a-2b (E41Q) fue evaluada en ratas después de administración oral única y administraciones repetidas. Por cada grupo (Grupos 1-4), seis ratas macho de 8 semanas de edad (ratas SPF Sprague-Dawley, pesando entre 215,2 g a 263,0 g) , con acceso libre a agua y comida, fueron usadas para el experimento. Las ratas fueron cateterizadas en el lumen duodenal 18-24 horas antes de la administración de IFN- -2b(E41Q) o vehículo. Los animales fueron tratados con anestesia de acuerdo a los procedimientos descritos a continuación . Los Grupos 1 y 2 fueron evaluados por toxicidad después de la administración única vía catéter intraduodenal. Grupos 1 recibieron 6 mg/kg de IFN-a-2b (E41Q) en 1 mL (2 mg/mL) y Grupo 2 recibieron 1 mL solo de vehículo como control. Un examen clínico diario y de peso fue realizado de manera de detectar cualquier señal de toxicidad hasta el día 7. Al día 7, los animales fueron sometidos a eutanasia y el intestino fue preparado para análisis histopatológico . Los grupos 3 y 4 fueron evaluados por toxicidad después de administraciones repetidas diariamente por siete días vía catéter intraduodenal . Grupos 3 recibieron 6 mg/kg de IFN-a-2b (E41Q) en 1 mL (2 mg/mL) cada día por siete días y Grupo 4 recibieron 1 mL solo de vehículo como un control diario por siete días. Un examen clínico y de peso diario fue realizado de manera de detectar cualquier señal de toxicidad hasta el día 10. Al día 10, los animales fueron sometidos a eutanasia y el intestino fue preparado para análisis histopatológico . No murieron animales durante el período de observación. Se observó pelaje levemente erizado en un animal . Los pesos corporales de los animales restantes estuvieron dentro del rango comúnmente registrado para esta cepa y edad. No se observaron señas clínicas anormales. El análisis de los animales mostró evidencia de efectos localizados probablemente asociados a la ruta de administración y presumiblemente debido a desgarros traumáticos, mecánicos (cateterización) e inflamación resultante. Estos efectos fueron separados de efectos más extendidos en la mucosa, que más probablemente se debe a toxicidad del artículo evaluado. Por ejemplo, en el examen histológico, todos los especímenes (Grupos 1, 2, 3 y 4) presentaron una peritonitis local leve, excepto una rata (rata no 1, Grupo 4) que presentó desgarro/ inflamación focal del muro duodenal. Esto no se interpretó como evidencia producto de la toxicidad sino más bien como una indicación de trauma mecánico resultado del proceso de cateterización. La mayoría de los especímenes (Grupos 1,2, 3 y 4) tuvieron fusión de vili mínima, a menudo fusionados en las puntas. Además, la mayoría de los especímenes tuvieron un aumento mínimo de leucocitos (linfocitos y células plasmáticas) en la lámina propia del vili. Los vili fusionados pueden también observarse ocasionalmente en animales normales. El aumento de leucocitos en la lámina propia puede también ser interpretado cautamente, ya que algunos leucocitos están normalmente presentes. Por consiguiente, debido al daño transmural frecuentemente observado en todos los grupos, incluyendo la inflamación granulomatosa y peritonitis leve en el duodeno, la fusión del vili e infiltración leucocítica, la administración de IFN- -2b (E41Q) por administración intraduodenal y todas las dosis evaluadas y horarios no fueron considerados tóxicos.

B. Monos Cynomolgus 1 . Estudio de toxicidad de 2 semanas en monos Cynomolgus (Macaca fascicularis) por ruta oral El estudio involucró la evaluación de cuatro grupos de monos después de administración oral diariamente con varias dosis de IFN-a-2 (E41Q) . Un total de veinticuatro monos Cynomolgus (Macaca fascicularis) de 24-36 meses de edad pesando entre 1,8-2,8 kg (doce machos y doce hembras, divididos equivalentemente entre los grupos (tres animales/sexo/grupo)) fueron usados en el estudio. Los cuatro grupos de tratamiento se establecen en la Tabla 83 a continuación: TABLA 83: Grupos de Tratamiento para Toxicología No. de ratones/grupo Grupo (dosis de IFN-a-2b(E41Q)) Macho Hembra 1. solo vehículo (cuatro tabletas con recubrimiento entérico 3 3 placebo) 2. 0,6 mg/mono (0,26 mg/kg; una tableta con recubrimiento entérico 3 3 de 600 mg IFN-a-2b(E41 Q) + tres tabletas con recubrimiento entérico placebo) 3. 1 ,2 mg/mono (0,52 mg/kg; dos tabletas con recubrimiento 3 3 entérico de 600 mg IFN-a-2b(E41 Q) + dos tabletas con recubrimiento entérico placebo) 4. 2,4 mg/mono (1 ,04 mg/kg; cuatro tabletas con recubrimiento 3 3 entérico 0,6 mg IFN-a-2b(E41 Q)) Se dosificó a los animales diariamente por dos semanas consecutivas por administración oral de 4 tabletas con recubrimiento entérico como se indica anteriormente para cada grupo. Los animales fueron observados dos veces por día por mortalidad y señas clínicas. Fueron pesados una vez a la semana durante el período de aclimatación y en días de tratamiento 1, 8, y 14 y antes de sacrificar. La temperatura corporal fue registrada antes de las administraciones 1, 7, 13 y también a 0,5, 1, 2, 4 h después del tratamiento. Exámenes oftalmoscópicos y análisis de sangre fueron realizados a pre-dosis y a la semana 2 del período de administración. Exámenes hematológicos , bioquímicos, clínicos y análisis de orina fueron conducidos previo a la primera dosis y a la semana 2. Al fin del período de tratamiento, una necropsia total y un examen histopatológico fueron conducidos en todos los animales . No se observaron mortalidad, ni señas clínicas relevantes, ni alteración ocular, ni variaciones en peso corporal o temperatura ni lesiones microscópicas fueron notadas durante y al final del estudio completo para todos los animales. Además, el análisis de sangre y de orina no mostraron ninguna diferencia relevante entre los grupos. No hubo alteraciones histopatológicas que distinguieran los controles de los animales evaluados . Además de la evaluación de toxicidad, las muestras de sangre se tomaron previas a la primera dosis y después de la administración en día 1, día 6 y día 13 para estudios de inmunogenicidad . Los métodos y resultados son reportados por separado en Ejemplo 20. A.3. Muestras de sangre para la determinación de los niveles de plasma de IFN-a-2b (E41Q) ( toxicocinética) fueron tomadas en los días correspondientes a administración en días 1 y día 14. Los métodos y resultados son reportados separadamente en Ejemplo 12. 2. Comparación de toxicidad de IFN-a- 2b(E41Q) con interferón comercial IFN-alpha ® · - ® - Intron A e interferón Pegasys después de administración subcutánea Los análisis de toxicidad fueron realizados en monos Cynomolgus {Macaca fascicularis) que recibieron varias dosis de IFN-a-2b (E41Q) , interferón Intron A®, interferón Pegasys® e IFN-a-2b nativo después de administración por ruta subcutánea descrito en Ejemplo 14. En los estudios en Ejemplo 14, numerosos parámetros de seguridad fueron evaluados, incluyendo seguridad general (es decir, mortalidad, peso corporal, consumo de comida, temperatura rectal) ; hematología (es decir, eritrocitos, hemoglobina, volumen celular promedio, volumen de células empacadas, concentración de hemoglobina en célula promedio, hemoglobina en célula promedio, trombocitos, leucocitos, conteo de células blancas diferencial, tiempo de protrombina, fibrinógeno, tiempo de tromboplastina activada parcial) ; química de la sangre (es decir, sodio, potasio, cloruro, calcio, fósforo inorgánico, glucosa, urea, creatinina, urea, bilirrubina total, colesterol, triglicéridos , proteínas totales, albúmina, razón albúmina/globulina, fosfatasa alcalina, aspartato aminotransferasa, alanina aminotransferasa, creatina quinasa, lactato deshidrogenasa, g-glutamil transferasa) ; y patología clínica (es decir, peso de órganos y estatus en la necropsia) . No hubo muertes o sacrificios prematuros durante el estudio, relacionados con el tratamiento. No hubo señas clínicas ni cambios en peso corporal en cualquier grupo durante el estudio relacionados al tratamiento. El consumo de comida tampoco se vio afectado durante el período de tratamiento . Los resultados del análisis mostraron solo un leve aumento en la temperatura corporal (rango: -0,3 a +2,1 °C) dentro de 2 h después de cada tratamiento, que no apareció relacionado a la dosis y fueron de amplitud similar a lo largo de los diferentes grupos de tratamiento. Los parámetros hematológicos y de sangre no fueron afectados por el tratamiento en cualquiera de los grupos durante el estudio. No hubo modificaciones relacionadas al tratamiento de cualquier parámetro de los análisis de orina en cualquier grupo. Tampoco hubo efectos relacionados al tratamiento en el peso de órganos, ni hallazgos anormales relacionados a tratamiento en el examen macroscópico post-mortem. Se detectaron generalmente niveles bajo a moderado de IFN-a en la orina durante parte 1 del estudio (ver Ejemplo 14 para detalles del estudio) , excepto para una hembra a la que se administró IFN-a nativo que mostró un nivel marcado de IFN-a en la orina. Durante parte 2 del estudio (ver Ejemplo 14 para detalles del estudio) , los únicos animales que mostraron niveles relevantes de IFN-a en la orina fueron observados en dos animales que recibieron interferón Pegasys"5. 3. Estudio de toxicidad de 13 semanas en monos Cynomolgus {Macaca fascicularis) por ruta subcutánea (SC) El estudio involucró la evaluación de cuatro grupos de monos después de inyecciones subcutáneas dos veces por semana (a días 1 y 5 de cada semana) por trece semanas con varias dosis de IFN-a-2b (E41Q) (0,5 mL/kg peso corporal) en salina fisiológica. Un total de veinticuatro monos Cynomolgus (Macaca fascicularis) a 42-60 meses de edad con pesos entre 2,1-3,6 kg (doce machos y doce hembras, divididos equitativamente entre los tres grupos (tres animales/sexo/grupo) ) fueron usados en el estudio. Las inyecciones se dieron alternadamente en cuatro zonas previamente afeitadas en la espalda, dos a cada lado de la línea mediodorsal, para un total de veintiséis administraciones. Los cuatro grupos de tratamiento se establecen en la Tabla 84 a continuación: Los animales fueron observados diariamente por mortalidad y señas clínicas. Fueron pesados dos veces a la semana y una vez antes del sacrificio. La temperatura corporal fue registrada antes y después de administraciones 1, 3, 7, 12 y 26. Exámenes oftalmoscópicos y análisis de sangre fueron realizados a pre-dosis y en semanas 6 y 13 del período de administración. Exámenes de orina fueron conducidas en semanas 6 y 13. Al fin del período de tratamiento, una necropsia total y examen histopatológico fueron conducidos en todos los animales. a. Resultados i. Análisis de Toxicidad No resultaron muertes o mortalidad de los tratamientos. No hubo diferencias en señas clínicas o ganancia promedio de peso corporal entre los grupos de tratamiento. No hubo diferencias relevantes en los valores promedio de temperatura corporal entre grupos. No se observaron alteraciones oculares. Tampoco los resultados del estudio mostraron diferencias en parámetros urinarios entre grupos, ni tampoco diferencias relevantes en histopatología . No hubo alteraciones macroscópicas ni variación en peso de órganos . ii. Toxicocinética Las muestras de sangre también fueron tomadas para la determinación de los niveles plasmáticos de IFN-a-2b (E41Q) ( toxicocinética) en días correspondientes a administraciones 1 (día 1) , 8 (día 26) y 26 (día 89) . Los resultados no mostraron diferencias en parámetros hematológicos y hemostáticos entre grupos. Un leve aumento en niveles de globulina sérica fue observado en hembras a las que se administró 0,42 MIU/kg o 1,26 MIU/kg IFN-a-2b (E41Q) , sin variaciones en las condiciones físicas ni conductuales en los animales. Una dosis de 1,26 MIU/kg puede ser considerada como el nivel sin efecto observado (NOEL por sus siglas en inglés) . Toxicocinética : Dos veces por semana la inyección SC de IFN-a-2b (E41Q) a dosis de 0,14, 0,42 y 1,26 MIU/Kg en un estudio de toxicidad de dosis repetida fue asociado con aumentos lineales relacionados a la dosis en Cmax y AUC después de la primera administración. Después de 13 semanas de tratamiento, la detección de niveles séricos de IFN-a-2b(E41Q) fue impedido por el desarrollo de anticuerpos neutralizantes en algunos animales. iii. Inmunogenicidad Las muestras de sangre fueron tomadas para estudios de inmunogenicidad (evaluación de anticuerpos totales y neutralizantes) a pre-dosis (día 1) y después de administraciones 4 (día 12) , 8 (día 26) , 12 (día 40) y 26 (día 89) . Los resultados muestran que a través de todos los grupos, aparecen anticuerpos neutralizantes en 6-18 animales en 40 días y en 14-18 animales en 89 días. La aparición fue más tardía y con menores niveles en el grupo de baja dosis, y fue más temprana y mayor en el grupo de dosis media. Ambos anticuerpos ligantes y neutralizantes anti-IFN-a aumentaron con la duración del tratamiento y dosis administrada. Los resultados muestran que hasta 26 días, casi no hubo anticuerpos evidenciados en cualquier grupo de dosis, pero para el día 40, los anticuerpos habían aparecido en 3-5 animales de cada grupo de dosis (n=6) . La dosis intermedia (0,42 MIU/kg) pareció generar más anticuerpos que la dosis más alta (1,26 MIU/kg) . Por consiguiente, la interferencia de anticuerpos debe ser considerada en estudios toxicológicos donde la duración del tratamiento es mayor a un mes.

En conclusión, IFN-a-2b (E41Q) fue bien tolerado por monos cuando se inyectaron SC repetidas dosis hasta 1,26 MIU/kg por 13 semanas dos veces por semana .

C. Ratones 1. Toxicidad Aguda en Ratones por Ruta Intravenosa (IV) La toxicidad aguad de IFN-a-2b (E41Q) fue evaluada en ratones después de una inyección única de 50 MIU/kg (5 mL/kg) de IFN-a-2b (E41Q) en 0,9% cloruro de sodio por administración en la vena caudal. Seis ratones hembra (HanRcc: NMRI-SPF) de 7-8 semanas de edad y con pesos entre 26,1-30,1 g, con acceso libre a comida y agua, fueron usadas para el experimento. Se monitorearon mortalidad, señas clínicas y peso corporal durante 14 días, Al final del período de observación, todos los animales fueron sacrificados por inyección intraperitoneal (IP) de Vetanarcol (dosis > 2,0 mL/kg) y se realizaron exámenes post-mortem. No murieron animales durante el período de observación y no se observaron señas clínicas ni reacciones locales. Un leve aumento en el peso corporal (4,6%) fue observado en un animal entre día 8 y día 15, mientras no se observó aumento significativo en peso corporal en otro animal durante el período de observación completo. El peso corporal de los animales restantes estuvo dentro del rango comúnmente registrado para esta cepa y edad. No se encontraron hallazgos macroscópicos en la necropsia. Los resultados muestran que IFN-a-2b (E41Q) fue bien tolerado en los ratones evaluados a la dosis de 50 MIU/kg. La dosis media letal (LD50) de IFN- -2b(E41Q) después de administración IV a ratones hembra observado durante un período de 14 días fue mayor que 50 MIU/kg de peso corporal. 2. Toxicidad Aguda en Ratones por Ruta Subcutánea (SC) La toxicidad aguda de IFN-a-2b (E41Q) fue evaluada en ratones después de una inyección única SC de MIU/kg (5 mL/kg peso corporal) de IFN-a-2b (E41Q) en 0,9% cloruro de sodio en la región de cuello. Seis ratones hembra (HanRcc: NMRI-SPF) 7-8 semanas de edad con pesos entre 26, 1-30, lg, con acceso libre a agua y comida, fueron usadas para el experimento. Se monitoreó mortalidad, señas clínicas y peso corporal por 14 días.

Al final del período de observación, todos los animales fueron sacrificados por inyección intreperitoneal (IP) de Vetanarcol (dosis 2,0 mL/kg) y se realizaron exámenes post-mortem. No murieron animales durante el período de observación. Pelaje levemente erizado se observó en un animal. Una leve disminución en peso corporal (2,4 y 1,8%) fue observada en dos animales durante el curso del estudio. El peso corporal de los animales remanentes estuvo dentro del rango comúnmente registrado para esta cepa y edad. No hubo hallazgos macroscópicos registrados en la necropsia. En conclusión, IFN-a-2b (E41Q) fue bien tolerado en todas las dosis evaluadas de 50 MIU/kg. La dosis media letal de IFN-a-2b (E41Q) después de administración SC en ratones hembra observados durante un período de 14 días (LD50) fue mayor a 50 MIU/kg de peso corporal . EJEMPLO 17 Estudios de Genotoxicidad (Mutagenicidad) A. Ensayo de mutación reversa en Salmonella typhimurium El propósito de este ensayo fue evaluar la genotoxicidad midiendo la habilidad de IFN-a-2b (E41Q) para inducir mutaciones reversas en loci seleccionados. Las cepas bacterianaes en el ensayo fueron 5 cepas de Salmonella typhimurium (TA1535, TA1537, TA98, TA100 y TA102) , que tienen una única mutación que ha apagado la bios ntesis de histidina. Como resultado de esta mutación, la bacteria requiere histidina exógena para sobrevivir y morirá si se crece sin histidina. El ensayo depende en la habilidad de la bacteria para experimentar una mutación reversa del gen esencial para así permitir a la célula crecer en la ausencia de histidina. Cada cepa bacteriana fue creada con una mutación específica. Por ejemplo, las cepas usadas fueron construidas para diferenciar entre mutación de par de bases (TA 1535, TA100 y TA102) y corrimiento del marco de lectura (TA1537 y TA98) . Por consiguiente, el experimento fue realizado para evaluar el potencial de IFN-a-2b (E41Q) para inducir la mutación en el gen en éstas 5 cepas de Salmonella typhimurium (TA1535, TA1537, TA98, TA100 y TA102) . El ensayo fue realizado en dos experimentos independientes ambos con y sin mezcla S9, que es una mezcla suplementada con cofactor post-mitocondrial preparada con hígados de roedores y que funciona como un sistema de activación metabólico en este ensayo. En cada uno de los experimentos, varias concentraciones de IFN-a-2b (E41Q) (lote número # IFN 003-05) fueron evaluadas en triplicado en concentraciones entre 0,0390625; 0,078125; 0,15625; 0,3125; 0,625; 1,25; 2,5 Y 5 pg/placa. Los controles también fueron evaluados en triplicado . Las bacterias fueron plaqueadas en placas de agar en la presencia o ausencia de las dosis indicadas de IFN-a-2b (E41Q) , con o sin la mezcla S9. Los resultados muestran crecimiento de fondo normal de las bacterias en todas las placas con concentraciones de IFN- -2b (E41Q) hasta 5 pg/placa, con y sin mezcla S9, en todas las cepas usadas . No ocurrieron efectos tóxicos, evidenciables como la reducción en el número de bacterias que revierten la mutación, en los grupos evaluados con y sin activación metabólica. No hubo aumento sustancial en el número de colonias de bacterias que revierten la mutación en cualquiera de las cinco cepas evaluadas después del tratamiento con IFN- -2b (E41Q) a cualquier nivel de dosis, ya sea en presencia o ausencia de activación metabólica (mezcla S9) . No hubo tampoco tendencia en aumento de las tasas de mutación que aumentan las concentraciones en el rango bajo el borde de relevancia biológica conocida. Durante el ensayo descrito de mutagenicidad y bajo las condiciones reportadas, el ítem evaluado no indujo mutaciones en genes por cambios en pares de base o corrimiento en el marco de lectura en el genoma de las cepas usadas. Por consiguiente, IFN-a-2b (E41Q) es considerado como no mutagénico en este ensayo de mutación reversa en Salmonella typhimurium.

B. Ensayo en Ratón de Micronúcleos El potencial mutagénico de IFN-a-2b (E41Q) fue determinado por su habilidad para inducir micronúcleos en eritrocitos policromáticos (PCE, por sus siglas en inglés) en la médula de ratones. Setenta y dos ratones NMRI de 9-11 semanas de edad (treinta y seis machos, treinta y seis hembras; peso: valores promedio 33,3 g para machos y 34,7 para hembras), fueron divididos en seis grupos de tratamiento (seis machos y seis hembras por grupo) . Los ratones recibieron administraciones de dosis única oralmente de IFN-a-2b (E41Q) (en 0,9% NaCl;10 mL/kg peso corporal) a varias dosis, o controles como sigue: Grupo 1: Vehículo (control negativo, 0,9% NaCl) Grupo 2: IFN-a-2b (E41Q) 1.25 MIU/kg peso corporal (colección de médula después de 24 h) Grupo 3: IFN- -2b (E41Q) 2.5 MIU/kg peso corporal (colección de médula después de 24 h) Grupo 4: IFN-a-2b (E41Q) 5.0 MIU/kg peso corporal (colección de médula después de 24 h) Grupo 5: IFN-a-2b (E41Q) 5.0 MIU/kg peso corporal (colección de médula después de 48 h) Grupo 6: Ciclofosfamida (control positivo) 40 mg/kg peso corporal (colección de médula después de 24 h) . Las células de médula fueron colectadas a los tiempos indicados para el análisis de micronúcleos . Al menos 2000 eritrocitos policromáticos (PCEs) fueron evaluados por animal para micronúcleos . A manera de determinar un efecto citotóxico debido al tratamiento, la razón entre eritrocitos policromáticos y totales se determinó en la misma muestra y se reporta como el número de PCEs por cada 2000 eritrocitos. Después del tratamiento con IFN-a-2 (E41Q) a las dosis y tiempos indicados, el número de PCEs no fue sustancialmente disminuido al compararlo con el valor promedio de PCEs del vehículo control, por consiguiente indicando que IFN-a-2b (E41Q) no ejerció ningún efecto citotóxico en la médula . En comparación a los correspondientes vehículos de control, no hubo mejora biológicamente o estadísticamente relevante en la frecuencia de los micronúcleos detectados en cualquier intervalo de preparación después de administración de IFN-a-2b (E41Q) en cualquier nivel de dosis usado. Mientras la administración oral del control positivo a ratones (40 mg/kg peso corporal ciclofosfamida) resultó en un aumento sustancial de la frecuencia de micronúcleos inducida, e IFN-a-2b (E41Q) no indujo micronúcleos en la condición experimental descrita para cualquier dosis evaluada, y puede por tanto ser considerado no mutagénico .

EJEMPLO 18 Farmacología de Seguridad A. Prueba de Exploración de Irwin Modificada en Ratones Una prueba de exploración de observación (prueba de Irwin modificada) se realizó para determinar si la administración de IFN-a-2b (E41Q) inducía cualquier cambio conductual en los animales tratados . Dieciocho ratones macho HanRcc: NMRI de 5 semanas de edad y con peso 30-35g (seis animales por grupo) fueron evaluados para determinar cambios conductuales inmediatamente después y a 0,5, 1, 2 y 4 h después de una inyección única subcutánea (SC) en la región del cuello de IFN-a-2b (E41Q) (5 mL/ Kg peso corporal) a dosis de 1) 0,05 MIU/kg peso corporal (0,167 pg/kg) , 2) 0,15 MIU/kg peso corporal (0,50 pg/kg) y 3) 0,45 MIU/kg peso corporal (1,50 pg/kg). Un grupo control de seis animales fue tratado con vehículo solamente (salina fisiológica) . Los pesos corporales fueron registrados antes de aplicar las dosis. Los ratones fueron observados por respuestas en sus jaulas como también en respuestas a un nuevo ambiente (arena) y manipulación. Aumento en estado de alerta, posición de cuerpo anormal (postura encorvada) , manera de andar anormal (caminar más bajo que sus miembros) , actividad exploratoria, respuesta al dolor, agresión, vocalización fueron registrados antes de aplicar la dosis, inmediatamente después de aplicarla, y respectivamente a 0,5, 1, 2, y 4 h después de aplicarla. Cuando se observaron conductas similares, y con frecuencia similar, antes y después de aplicar la dosis de IFN-a-2b (E41Q) o en el grupo de control con vehículo, no se consideró que tales conductas estuvieran relacionadas a la administración de IFN-a-2b(E41Q) . Después de tratamiento con IFN-a-2b (E41Q) , el máximo en respuesta al dolor y estado de alerta se observó inmediatamente y 0,5 h después de administrar la dosis en el grupo 0,45 MIU/kg, en dos de seis animales. Adicionalmente , se registró una postura anormal, demostrada como una postura encorvada, inmediatamente después de aplicar la dosis y duró por hasta 2 h después. Ninguno de estos hallazgos alcanzó significancia estadística y se consideró que no estaban relacionados a IFN-a-2b (E41Q) . Una inyección única SC de IFN-a-2b (E41Q) en dosis de hasta 0,15 MIU/kg peso corporal (0,50 µg/kg) no tuvo efectos significativos en la conducta general usando la prueba de exploración de Irwin modificada en ratones macho NMRI . Después del tratamiento con 0,45 MIU/kg peso corporal (1.50 yg/kg) de IFN-a-2b (E41Q) , hubo alguna evidencia de aumento en estado de alerta, postura corporal anormal y un aumento en la respuesta al dolor pero estas conductas no fueron significativas y no ocurrieron con frecuencia suficiente para ser estadísticamente significativas.

B. Efectos en las Corrientes de cola en HER6-1 Registradas en Células HEK 293 Transfectadas Estables El propósito de este estudio fue investigar el potencial de IFN-a-2b (E41Q) para bloquear los canales de potasio HERG-1, que está asociado a arritmias ventriculares . Las corrientes de cola de HERG-1 fueron registradas en células HEK 293 establemente transfectadas expresando los canales de potasio HERG-1. Los efectos de IFN- -2b (E41Q) a niveles de concentración de 100, 1000 y 10000 IU/mL fueron investigados usando la técnica de patch clamp de célula completa a temperatura ambiente. Cada concentración fue evaluada en al menos cuatro células aisladas de distintas placas de cultivo para evitar la contaminación. Al menos cuatro células separadas fueron tratadas con vehículo solo (137 mmol NaCl /l, 4 mmol/1 KC1, 1,8 mmol/1 CaCl2, 1 mmol/1 MgCl, 10 mmol/1 HEPES (ácido N-2 -hidroxietilpiperazin-N' -2-etansulfónico) , 10 mmol/1 D-Glucosa) como control negativo. Dos células adicionales fueron tratadas con 100 nM del bloqueador selectivo IKr E-4031, que se conoce por bloquear los canales HERG-1, de manera de asegurar la exactitud del método . Este estudio mostró que las concentraciones de 100, 1000 y 10000 IU/mL, IFN-a-2b (E41Q) no tuvieron efecto en las corrientes de cola de HERG-1. Por consiguiente , IFN-a- 2b (E41Q) no interactúa con el canal HERG-1 a las concentraciones evaluadas y bajo las condiciones descritas, y no debiera tener efecto en la repolarización ventricular.

C. Estudio de Telemetría en Monos Cynomolgus Cinco monos macho Cynomolgus (Macaca fasciculata) de 5-7 años de edad (sexualmente maduros) , con pesos de 4-6,1 kg, fueron anestesiados con ketamina-HCl 9 mg/kg y diazepam a 0,5 mg/kg vía inyección intramuscular (IM) . Se indujo anestesia a nivel quirúrgico y se mantuvo por goteo intravenoso (IV) (aprox. 50-70 mg/kg/h como solución al 1%) en la vena cefálica izquierda durante el procedimiento de registro cardiovascular completo. Seguido a la administración de anestesia, se permitió a los animales descansar por 15 minutos para estabilizar las funciones circulatorias . Luego fueron tratados primero con vehículo (solución 0,9% NaCl) y luego con dosis de niveles increméntales de IFN-a-2b (E41Q) (2mL/kg peso corporal) [0,14 MIU/kg (0,47 yg/kg) , 0,42 IU/kg (1,40 µ?/kg) , y 1,26 MIU/kg (4,20 g/kg) ] , administrados por inyecciones de bolo subcutáneas (SC) en la región dorsal a intervalos de 90minutos (período de observación de 60 minutos y período de estabilización de 30 minutos) . Antes de la primera administración y durante otros tiempos apropiados después de la administración, se administraron por vía intravenosa noradrenalina (2 g/kg) e isoproterenol (2 g/kg) , de manera de confirmar que las reacciones cardiovasculares a noradrenalina e isoproterenol fueran influenciadas por la administración de IFN-a-2b (E41Q) a los animales. Los animales fueron evaluados para los siguientes parámetros: presión arterial periférica (sistólica, diastólica y promedio de presión sanguínea) , presión arterial pulmonar, latido cardíaco, electrocardiografía, gasto cardíaco y volumen sistólico, presión ventricular izquierda, presión venosa central, respiración (velocidad de respiración y volumen por minuto) y análisis de gases en la sangre. Los datos no mostraron evidencia de cualquier efecto en la presión arterial sistólica, diastólica y promedio después de la administración SC de IFN-a-2b(E41Q) a dosis de 0,14 MIU/kg y 0,42 MIU/kg. Bajo las condiciones de prueba, una disminución marginal, aunque no significativa estadísticamente (p < 0.01), de la presión arterial sistólica, diastólica y promedio fue notada 30 y 60 minutos después de la administración SC de IFN-a-2b (E41Q) a una dosis de 1,26 MIU/kg. Ya que hipotensión es un efecto bien conocido de los interferones , esta reducción se considera relacionada a IFN-a-2 (E41Q) . No se notó influencia en cualquiera de los siguientes parámetros cardiovasculares: presión arterial diastólica y sistólica, presión sanguínea capilar (presión en cuña) , latido cardíaco, intervalo QRS, intervalo QT, intervalo QTc, intervalo P, gasto cardíaco, volumen sistólico, presión ventricular izquierda, dp/dTmax, presión venosa central como también velocidad de respiración y volumen, valores de pH en la sangre y gases sanguíneos . No hubo evidencia notoria en prolongación de intervalo QT. Las reacciones cardiovasculares a noradrenalina e isoproterenol no fueron influenciadas. IFN-a-2b (E41Q) no ejerció ninguna influencia estadísticamente significativa en cualquiera de los parámetros respiratorios que fueron tomados en consideración. Una disminución estadísticamente no significativa en la presión arterial (sistólica, diastólica y promedio) fue atribuida a IFN- -2b (E41Q) , ya que hipotensión es un efecto bien conocido de interferón .

EJEMPLO 19 Predicción de Inmunogenicidad Se ha examinado el potencial inmunogénico de IFN-a-2b (E41Q) durante la selección inicial de polipéptidos candidatos LEAD y en el desarrollo del programa mismo. Esto ha incluido un análisis in silico de ep topos de células B y T para IFN-a-2b (E41Q) comparado con aquellos para IFN-a nativo como también en la determinación de la presencia de anticuerpos totales y neutralizantes para IFN- como se describe en Ejemplo 20 a continuación. La predicción de cambios en epitopos de células B y T causado por el reemplazo de un amino ácido único E41Q en IFN-a-2b fue realizado in silico usando dos algoritmos : algoritmo de epítopo para célula B (BCEPRED por sus siglas en inglés) y algoritmo de epítopo para célula T (SYFPEITHI por sus siglas en inglés), respectivamente.

A. Predicción de epítopo de célula B El algoritmo BCEPRED (Saha S. y cois., in G. Nicosia, V. Cutello, P.J. Bentley y J. Timis (Eds.) ICARIS 2004, LNCS 3239, 197-204, Springer, 2004) es usado para predecir regiones de epítopo de célula B en una secuencia de antígeno. Esta predicción depende de las propiedades físico-químicas (Ronni y cois., J. Immunol., 1993 ; 150:1715-1726) . El algoritmo BCEPRED puede predecir epítopos de células B con una exactitud de 58,7% usando propiedades de Flexibilidad, Hidrofilicidad, Polaridad, y Superficie combinadas a un umbral de 2,38. Este algoritmo gráfica las propiedades de residuos a lo largo del esqueleto de la proteína. El pico del segmento de amino ácido sobre el valor umbral (por omisión es 2,38) se considera como un epítopo de célula B predicho. No se observó diferencia en las predicciones de los epítopos de células B entre IFN-cx-2b(E41Q) e IF -a nativo.

B. Predicción de epítopo de célula T El algoritmo SYFPEITHI fue usado para predecir la fuerza de unión a un tipo definido de HLA para una secuencia de amino ácidos (Rammensee y cois. (1999) Immunogenetics, 50:213-9; www.syfpeithi.de). El algoritmo se basa en el libro "MHC Ligands and Peptide Motifs" de H.G. Rammensee, J. Bachmann y S. Stevanovic .

La probabilidad de ser procesado y presentado se entrega de manera de predecir los epítopos de células T.

Usando el algoritmo, no se observó evidencia para nuevos epítopos de células T en IFN-a-2b (E41Q) comparado con IFN- nativo. Además, cuatro regiones, al comienzo de las posiciones aminoacídicas 34, 38, 40 y 41 en IFN-a-2b nativo, y que fueron predichas como epítopos de célula T, mostraron un puntaje de probabilidad de procesamiento mayor en IFN- -2b nativo que en la región correspondiente en IFN- -2b (E41Q) . El epítopo de células T predicho en aquellas regiones y los puntajes predichos para IFN-a-2b nativo y la mutación IFN- oí-2b (E41Q) se muestran en la Tabla 85 a continuación. El residuo amino ácido correspondiente a la mutación E41Q es indicado en negrita.

TABLA 85: Epítopos predichos de células T para IFN-a- ¦2b(E41Q) ID SEC Puntaje % de reducción Epítopo de Puntaje IFN- Posición NO : IFN-a en célula T a-2b(E41Q) nativo inmunogenicidad 34-43 HDFGFPQQEF 2158 12 10 17 38-47 FPQQEFGNQF 2159 1 1 10 17 40-49 QQEFGNQFQK 2160 1 1 1 99 41 -50 QEFGNQFQKA 2161 15 5 66 Todos los datos de predicción de células B y células T apoyaron el hecho de que IFN-a-2b (E41Q) no tenia un potencial inmunogénico mayor que el IFN-a nativo .

EJEMPLO 20 Estudios de Análisis de Inmunogenicidad en Modelo Animal Farmacocinético y Farmacodinámico Los animales de los estudios farmacocinéticos y de toxicidad descritos en Ejemplos 10, 12, 14, 15, y 16 también fueron evaluados por presencia de anticuerpos totales y neutralizantes como una evaluación de la inmunogenicidad de IFN- -2b (E41Q) . Los resultados más adelante muestran 1) determinación de anticuerpos totales y neutralizantes para IFN- -2b(E41Q), IFN-a nativo, interferón Intron A® e interferón Pegasys® en un estudio de seguridad PK/PD/clínico de dosis ascendentes en monos; 2) determinación de anticuerpos neutralizantes y ligantes en un estudio de toxicidad de 13 semanas de dosis repetidas en monos; 3) determinación de anticuerpos neutralizantes y ligantes en un estudio de toxicidad de 2 semanas en monos; 4) determinación de anticuerpos neutralizantes y ligantes en un estudio de toxicidad de 2 semanas con dosis repetidas en ratas; 5) determinación de una generación de nuevos epítopos en ratones transgénicos ; y 6) estudios de reactividad cruzada entre anticuerpos para IFN-a-2 (E41Q) e IFN-a nativo .

A. Monos 1. Evaluación de Inmunogenicidad en estudio de toxicidad de IFN- -2b (E41Q) , IFN- alfa comercial Intron A y Pegasys después de administración subcutánea En el estudio de toxicidad descrito en Ejemplo 14 y Ejemplo 16. B.2 anteriormente, se administró a grupos de monos de 1 macho y 1 hembra dosis escaladas de IFN-a-2b (E41Q) , IFN-a nativo, interferón Intron A® e interferón Pegasys*. Muestras de sangre se tomaron para exámenes preliminares en días especificados después de administración para evaluación de formación de anticuerpos. a. Medición de Anticuerpos Neutralizantes La cuantificación de anticuerpos neutralizantes se desarrolló de acuerdo al ensayo de Kawade (Kawade y cois., J. Interferon Research, 1987; Grossberg y cois., J. Interferon Cytokines Research; 2001; Grossberg y cois., Biotherapy, 1997; Kawade Y., J. Interferon Research, 1980; 1:61-70; Kawade y cois., J. Immunological Methods, 2003). Brevemente, 10 UL (Unidades de Laboratorio) de IFN-a nativo o IFN-a-2b(E41Q) se agregaron a 12 diluciones en serie de muestras de sangre de mono que hablan sido colectadas en días específicos después de la administración de proteína. Después de incubar por 4 h, las mezclas se colocaron en células HeLa infectadas con EMVC para medir la actividad antiviral remanente como se describió en Ejemplo 1. Los niveles de anticuerpos neutralizantes fueron determinados como una unidad de reducción en 10 veces por mL de suero de mono (TRU/mL) correspondiente a la dilución del suero de mono necesario para obtener un 50% de actividad total de IFN-a-2 (E41Q) e IFN-a nativo no tratado con suero. Los resultados son descritos en Tablas 86 y 87 a continuación. Niveles bajos de anticuerpos neutralizantes de IFN-OÍ fueron observados después del final del período de dosificación en todos los animales tratados con interferón Intron ?F . Durante el Paso 2 (después del período de lavado) , los niveles de anticuerpos neutralizantes detectados desde el comienzo del tratamiento a niveles mayores o similares que aquellos encontrados durante Paso 1. No fueron detectados anticuerpos neutralizantes para IFN-a en animales a los que se administró interferón Intron A ' como también en animales sin tratamiento previo a los que se administró interferón Pegasys e IFN-a-2b (E41Q) . Los niveles de anticuerpos neutralizantes anti-IFN-a anticuerpos de IFN-a-2b (E41Q) (TRU/mL) obtenidos en Parte 1 (Pasos 1 y 2) comparado con IFN-a nativo e interferón Intron A* se muestran en la Tabla 86 a continuación.

TABLA 86: Anticuerpos Neutralizantes (parte 1) IFN-a nativo Intron A® IFN-a-2b(E41Q) (TRU/mL) (TRU/mL) (TRU/mL) M F M F M F Día - 3 ND ND ND ND ND ND Paso 1 : inyección en días 1 , 4, 8 y 12 con dosis de 0,03, 0,3, 1 ,0 y 3,0 mg/kg para IFN-a nativo e IFN-a-2b(E41 Q); 0,0, 0,0, 0,03 y 0,3 mg/kg para interferón Intron A® Día 16 ND ND ND ND ND ND Día 21 ND ND ND ND ND ND Día 28 125 1 1 1 14 ND 27 ND Día 51 50 43 ND ND 67 29 Paso 2: inyección en días 66, 72 y 78 con dosis de 0,03, 0,03 y 0,3 mg/kg; animales con tratamiento previo Día 86 83 40 ND ND 37 125 Día 93 83 50 ND ND 29 26 Día 100 1667 1 1 1 ND ND 100 26 TRU = Unidades de Reducción de Diez Veces; ND = No Detectable Los niveles de de anticuerpos neutralizantes anti-IFN-a de IFN-a-2b (E41Q) (TRU/mL) obtenidos en Parte 2 comparado con interferón Pegasys® se muestran en la Tabla 87 a continuación. b. Cuantificación de Anticuerpo Totales anti-IFN-o La determinación cuantitativa de anticuerpos totales anti-IFN-a fue determinada en monos con varias proteínas IFN-a como se describió en Ejemplo 14. Los niveles de anticuerpos fueron evaluados usando el Kit con human anti-IFN-a humano Bender Medsystems Immunoassay (BMS217-Tebu, Francia) . Brevemente, plasma de mono fue colectado a tiempos específicos después de la administración como se indica en Ejemplo 14, y las muestras de plasma fueron diluidas 5 veces de acuerdo al protocolo del fabricante. La densidad óptica (OD) a 450 nm en las muestras fue medida usando un espectrofotómetro . Los resultados son expresados en ng/mL. Los resultados son descritos en las Tablas 88 y 89 a continuación. No se observaron anticuerpos contra IFN-a antes de la primera administración bajo ninguna de las condiciones o regímenes de dosis evaluados. Durante Parte 1, Paso 1, un nivel elevado de anticuerpos contra IFN-a fue observado en todos los animales tratados al final del período de tratamiento, excepto en los animales a los que se administró interferón Intron A"". La falta de anticuerpos totales detectado con interferón Intron A*" es probablemente debido a que la dosis más alta para este compuesto fue 10 veces menor que comparado con los otros grupos. Durante el Paso 2 los anticuerpos fueron detectados en altos niveles similares a aquellos detectados durante Paso 1. Niveles bajo a moderado de anticuerpos fueron detectados en animales a los que se administró interferón Intron ?F, mientras en Parte 2 fueron detectados altos niveles en Parte 2 en animales sin tratamiento previo a los que se administró interferón Pegasys" e IFN-a-2b (E41Q) pero en una menor medida que animales con tratamiento previo del Paso 2 como se muestra en las Tablas 88-89 a continuación. Los títulos de anticuerpos totales anti-IFN-a de IFN-a-2 (E41Q) (ng/mL) obtenidos en Parte 1 (Pasos 1 y 2) comparado con IFN-a nativo e interferón Intron A se muestran en la Tabla 88 a continuación: Los niveles de anticuerpos totales anti-IFN-a de IFN-a-2b (E41Q) (ng/mL) obtenidos en Parte 2 comparado con interferón Pegasys* se muestran en la Tabla 89 a continuación: No se observaron diferencias relevantes en los niveles de anticuerpos totales y neutralizantes entre IFN-a-2b (E41Q) , IFN-a nativo e interferón Pegasys"1. Las comparaciones fueron hechas con interferón Intron A® ya que la máxima dosis para F interferón Intron A fue 10 veces menor. 2. Estudio de Toxicidad con Dosis Repetida por 13 semanas en Monos Cynomolgus (Macaca fascicularis) por Ruta SC - Anticuerpos Totales y Neutralizantes Durante el estudio de toxicidad de 13 semanas en monos (descrito en Ejemplo 15), IFN-a-2b (E41Q) fue administrado por inyección subcutánea (SC) durante 13 semanas dos veces por semana. Las muestras de sangre para estudios de inmunogenicidad (evaluación de anticuerpos totales y neutralizantes) fueron tomadas a pre-dosis (día 1) y después de las administraciones 4 (día 12), 8 (día 26), 12 (día 40) y 25 (día 89). Ambos anticuerpos totales y neutralizantes anti IFN- en suero de mono fueron medidos y estudiados en días 1, 12, 26, 40 y 89. a. Medición de Anticuerpos Neutralizantes Determinación cuantitativa de anticuerpos neutralizantes fue realizado de acuerdo al bien conocido ensayo de Kawade como se describió en Ejemplo 20. A.1.a anteriormente, excepto que la incubación fue de 1 hora antes de colocar las mezclas en células infectadas con EMVC para medir la actividad antiviral remanente como se describió en Ejemplo 1. Los niveles de anticuerpos neutralizantes (TRU/mL) fueron determinados como se describió anteriormente . Los resultados se describen en las Tablas 90 (a-c) a continuación. En los días 1 y 12, no se detectaron anticuerpos neutralizantes en cualquiera de las dosis evaluadas. En el día 26, los anticuerpos neutralizantes fueron detectados en solo dos animales, uno en el grupo de dosis intermedia (0,42 MIU/kg) y uno en el grupo de dosis alta (1,26 MIU/kg), con valores marginalmente positivos de 27 TRU/mL y 23 TRU/mL, respectivamente. En el día 40, no se detectaron anticuerpos neutralizantes fueron encontrados en animales del grupo de dosis más baja. En el grupo de dosis intermedia (0,42 MIU/kg), se encontraron títulos de anticuerpos de 240465 TRU/mL en cuatro animales. En el grupo de dosis alta (1,26 MIU/kg) , se encontraron títulos de 85386 TRU/mL en dos animales. En el día 89, cinco animales del grupo de dosis baja (0,14 mg/kg) habían alcanzado niveles claramente positivos de anticuerpos neutralizantes con títulos de 77348 TRU/mL. En el grupo de dosis intermedia (0,42 MIU/kg), cuatro animales alcanzaron títulos 5012198 TRU/mL, y en el grupo de dosis alta, tres animales alcanzaron títulos de 203929 TRU/mL.

TABLA 90a: Dosis de 0,14 MIU/kg TRU/mL Día F16 F17 F18 M4 M5 M6 1 Nd nd nd nd nd nd 12 Nd nd nd nd nd nd 26 Nd nd nd nd nd nd 40 Nd nd nd nd 4 nd 89 150 227 nd 87 348 77 nd = no detectable umbral para positividad = título de anticuerpos neutralizantes >20 TRU/mL TRU/mL = Unidades de Reducción de Diez Veces /mL (valores de ensayo cuantitativo de neutralización) b . Cuanti f icación de Anti cuerpos Totales anti - IFN- ot Determinación cuantitativa de anticuerpos totales anti-IFN-a fue determinada usando el Kit con anti - I FN- OÍ humano Bender Medsystems Immunoassay (BMS217-Tebu, Francia) (SOP-TST-003/06 revi) como se describió Ejemplo 20.A.l.b anteriormente. El límite inferior de detección para anticuerpos anti-IFN-a fue determinado alrededor de 1,38 ng/mL. El coeficiente de variación ínter-ensayo total calculado es 4,1 % (determinado por el fabricante) . Los resultados son descritos en Tablas 91 (a-d) a continuación. Los anticuerpos anti-IFN-a totales determinados para cada dosis de IFN- -2b (E41Q) (0,14, 0,42 y 1,26 MIU/kg) y dosis de control se muestran en las Tablas . Los monos Macho y Hembra son indicados por el número de animal precedido por una M o H, respectivamente. En días 1, 12 y 26 con dosis de 0,14 MIU/kg, no se observaron niveles de anticuerpos totales detectables, (correspondiente a valores bajo el límite inferior de la curva estándar del ensayo, es decir valores similares a la dosis control que variaron entre 109 y 759 ng/mL), excepto para el animal M5 , que mostró una concentración de anticuerpos de 1744 ng/mL al día 26. En las dosis intermedia y alta, los anticuerpos fueron detectables en algunos animales: el animal M9 tuvo un nivel de anticuerpos totales de 11943 ng/mL al día 26 con la dosis 0,42 MIU/kg y animales H22 y M12 tuvieron niveles de anticuerpos de 2423 y 4299 ng/mL, respectivamente, para la dosis 1,26 MIU/kg al día 26.

Al día 40, todos los animales que recibieron la dosis 0,14 MIU/kg tuvieron anticuerpos totales de menos de 2800 ng/mL (no se detectaron niveles en los animales H18 y H17 y M4) . Para la dosis 0,42 MIU/kg, cuatro monos presentaron niveles de concentración entre 10000 y 25000 ng/mL (no fueron detectados niveles en F21 y menos de 2700 ng/mL en M7). Para la dosis 1,26 MIU/kg, tres monos mostraron concentraciones de anticuerpos de menos de 1.000 ng/mL, H22 presentó un título de alrededor de 2909 ng/mL y solo un mono (H24) mostró una concentración de 28000 ng/mL. Al día 89, menos de 21000 ng/mL de anticuerpos totales fueron detectados en suero de mono para las dosis 0,14 MIU/kg y 1,26 MIU/kg, excepto para H24 que mostró 60497ng/mL para la dosis 1,26 MIU/kg. Para la dosis 0,42 MIU/kg, cuatro de los seis monos mostraron concentraciones de anticuerpos totales entre 40000 y 70000 ng/mL y un mono (H21) presentó anticuerpos detectables de menos de 1000 ng/mL. Por consiguiente, similar a los resultados para anticuerpos neutralizantes anti-IFN- , los anticuerpos totales anti-IFN- aumentaron con la dosis y duración de los tratamientos y fueron más pronunciados en el grupo de dosis intermedia que en el grupo de dosis más alta y la variación entre animales fue aparente . valor de X estimado < 610 ng/ml (límite inferior de la curva estándar) nd = no detectado SD = desviación estándar valor de X estimado < 584 ng/mL (límite inferior de la curva estándar) nd = no detectado SD = desviación estándar valor de X estimado < 351 ng/mL (límite inferior de la curva estándar) nd = no detectado SD = desviación estándar valor de X estimado X < 759 ng/mL (límite inferior de la curva estándar) nd = no detectado SD = desviación estándar No fueron detectados niveles de anticuerpos para dosis de 0,14, 0,42 y 1,26 MIU/kg en monos inyectados hasta el día 26 del estudio. Similarmente , bajas cantidades de anticuerpos fueron detectadas al día 26 en muestras de sangre de dos animales (sin efecto negativo en el perfil farmacocinético de IFN-a-2b(E41Q)) . Al día 40 del estudio, un aumento moderado de los anticuerpos totales y neutralizantes fue observado en cuatro animales . Al día 89 del estudio, se observó una alta heterogeneidad en la respuesta individual de anticuerpos a la administración repetida SC de IFN-a-2b(E41Q) en monos a los que se administró la dosis de 0,42 MIU/kg y en menor medida con la dosis 1,26 MIU/kg para ambos anticuerpos totales y neutralizantes. Un impedimento en el perfil farmacocinético fue observado en varios monos que mostraron altos niveles de anticuerpos neutralizantes (dos machos y dos hembras para la dosis 0,42 MIU/kg y una hembra para la dosis 1,26 MIU/kg) . Para concluir, no se observó una inducción de la inmunogenicidad que condujera al impedimento del perfil farmacocinético de IFN-a-2b (E41Q) hasta el día 26 del estudio con dosis de 0,14, 0,42 y 1,26 MIU/kg dos veces por semana. c. Estudio de Inmunogenicidad Comparativa en Muestras Positivas para Anticuerpos Las muestras de sangre que mostraron valores positivos para anticuerpos totales y neutralizantes de los estudios anteriores fueron evaluadas para determinación de títulos de anticuerpos ligantes (BA por sus siglas en inglés) y anticuerpos neutralizantes (NAb por sus siglas en inglés) usando ensayos RIA y CPE, respectivamente (realizados por BioMonitor ApS, Copenhague, DK) . Un ensayo de reactividad cruzada adicional fue también realizado para ambos anticuerpos ligantes y neutralizantes dirigidos contra IFN-a-2b(E41Q) e IFN-a nat ivo . i . Ensayo RIA Después de diluciones seriadas de las muestras de sangre en tampón (1:10, 1:100, 1:1000 y 1:10000) , el ensayo de titulación RIA fue realizado incubando 50 L de suero diluido durante la noche con 50 iL de IFN-a-2b (E41Q) marcado con 125I (4000-4500 cpm) a 4°C. Los anticuerpos ligantes fueron detectados después de la elución de la muestra desde una columna con Proteina G. Las cuentas (cpm) unidas a los anticuerpos fueron expresadas como porcentajes de cpm totales eluidas . Los resultados fueron comparados a los resultados de las concentraciones de anticuerpos totales anti- IFN-OÍ en el plasma de mono usando el Kit con anti-IFN-a humano Bender Medsystems Immunoassay (BMS, 217-Tebu, Francia) como se estableció en la parte ii más arriba. Las muestras fueron diluidas 5 veces de acuerdo al protocolo del fabricante. Los resultados fueron expresados en ng/mL después de extrapolación de la curva estándar de OD medida con un espectrofotómetro a 450 nm. Los datos de anticuerpos totales obtenidos de los ensayos RIA y ELISA se correlacionan bien para todas las muestras de sangre de monos. El análisis estadístico demostró que los dos conjuntos de datos fueron casi superponibles (p < 0,0001). Las muestras con bajas cantidades de anticuerpos totales determinados por ELISA presentaron un bajo porcentaje de anticuerpos ligantes después del ensayo RIA. Similarmente , las muestras que mostraron mayor cantidad de anticuerpos en el ensayo ELISA presentaron un alto porcentaje de anticuerpos ligantes. Las diferencias en los valores absolutos obtenidos para cada una de las muestras con los dos ensayos resultó producto de las diferentes metodologías usadas. ii. Ensayo CPE Un ensayo de efecto citopático (CPE) fue realizado para medir la habilidad de las muestras de sangre anteriores de proteger la viabilidad de células C-5 (un subclon de las células pulmonares A549) expuestas a un nivel normalmente tóxico del virus de encefalomiocarditis (CPE-EMVC) . Diluciones seriadas a la mitad de IFN-a-2b (E41Q) fueron evaluadas para determinar la dilución más alta que resulta en una reducción de la actividad de IFN desde 10 a 1 LU/mL (1 UL (Unidad de Laboratorio) /mL es la cantidad de IFN necesaria para reducir en un 50% la protección contra el virus) . Las muestras de suero obtenidas de animales tratados anteriormente fueron incubadas con IFN-a-2b(E41Q) a una concentración final de 10 LU/mL por 1 h a 37°C. Luego de este período de incubación, se agregó virus EMC, y las placas con células fueron incubadas durante la noche a 37 °C en un incubador a 5% C02, luego de lo cual se agregó MTS y se incubó por otras 2 h a 37 °C en un incubador a 5% C02. Los resultados son entregados como un título de Kawade.

Los resultados del ensayo CPE fueron comparados a los resultados obtenidos de la determinación cuantitativa de anticuerpos neutralizantes específicos a IFN-a-2b (E41Q) como se describe anteriormente usando el ensayo de Kawade . Las muestras de sangre de mono con altos títulos neutralizantes en el ensayo de Kawade usando células HeLa también presentaron un alto nivel de anticuerpos neutralizantes en el ensayo realizado usando células pulmonares A549. Similarmente , las muestras con niveles bajo o intermedio de NAb detectadas usando células HeLa también se correlacionan con los resultados obtenidos del ensayo con células pulmonares A549. Las diferencias en valores absolutos obtenidos para cada una de las muestras con el ensayo usando las células HeLa y células pulmonares A549 fueron probablemente debidos a una mayor sensibilidad de las células HeLa en el ensayo Kawade . iii. Ensayos de Reactividad Cruzada Para definir más precisamente las propiedades inmunogénicas de IFN- -2b (E41Q) comparado con IFN-a nativo, se realizaron ensayos de reactividad cruzada en muestras de suero de monos tratados para anticuerpos ligantes y neutralizantes. Los anticuerpos neutralizantes y ligantes específicos para IFN-a-2b(E41Q) e IFN-a nativo fueron titulados usando los ensayos Kawade y RIA, respectivamente. Las muestras tituladas para anticuerpos neutralizantes exhibieron cantidades iguales de anticuerpos específicos para IFN-a-2 (E41Q) e IFN-a nativo, excepto para 3 muestras de sangre que mostraron un claro aumento en anticuerpos neutralizantes específicos a IFN-a nativo comparado con IFN-a-2b(E41Q). Similarmente, no se observaron diferencias significativas en el porcentaje de anticuerpos ligantes específicos contra IFN-a-2b (E41Q) comparado con IFN-a nativo para todas las muestras de suero de mono positivas evaluadas. Por consiguiente, los resultados muestran que los anticuerpos específicos neutralizantes y ligantes para IFN-a-2b (E41Q) e IFN-a nativo reaccionaron en forma cruzada con excelente correspondencia (p < 0,0001 en ambos casos) . d. Resumen Estos resultados demuestran que la mutación molecular IFN-a-2b (E41Q) no indujo nuevos epítopos inmunogénicos comparado con IFN-a nativo. Esta observación está en acuerdo con los datos obtenidos de la predicción de inmunogenicidad in silico que mostraba una disminución en el puntaje de epitopo de células T resultante de la mutación IFN-a-2b (E41Q) . En los estudios emprendidos, el comportamiento inmunológico de IFN-a-2 (E41Q) y el de IFN-a nativo fueron casi superponibles . Por consiguiente, IFN-a-2b (E41Q) no debiera presentar una antigenicidad nueva o aumentada. 3. Anticuerpos Totales y Neutralizantes en Estudio de Toxicidad en Monos Cynomolgus (Macaca fascicularis) de 2 semanas Oral (Tabletas con recubrimiento entérico) por Ruta Oral Los monos fueron tratados como se describe en Ejemplo 16.B.1. Las muestras de sangre se tomaron de todos los animales a pre-dosis y 24 h después de las administraciones en días 1, 6, y 13 para cada dosis evaluada y se determinaron ambos anticuerpos totales y neutralizantes anti-IFN-a-2b (E41Q) usando anticuerpos anti- IFN-a humano con ELISA y usando el ensayo de Kawade, respectivamente, como se describió anteriormente . Los resultados no muestran anticuerpos (totales y neutralizantes) detectables anti- IFN-a- 2b(E41Q) a pre-dosis y en los días 2, 7 y 14 después de la administración diaria oral de IFN-a-2b (E41Q) en tabletas con recubrimiento entérico. En cada caso, las concentraciones de anticuerpos (para anticuerpos totales) o títulos de Kawade (para anticuerpos neutralizantes) medidos en todos los sueros de mono estuvieron por debajo de los límites de fondo determinados con las muestras pre-dosis. Tampoco se detectaron niveles de anticuerpos neutralizantes y totales con dosis de IFN-a-2b (E41Q) de 0,6, 1,2 y 2,4 mg por animal en suero de mono después de administración diaria PO de IFN- -2b (E41Q) en tabletas con recubrimiento entérico durante 2 semanas. Por consiguiente, la administración oral repetida de IFN-a-2b(E41Q) (en formulación de tableta con recubrimiento entérico) a monos Cynomolgus durante 2 semanas no indujo anticuerpos totales o neutralizantes a dosis de 0,6, 1,2 y 2,4 mg por animal .

B. Ratas - Anticuerpos Totales y Neutralizantes: Estudio de Toxicidad Oral Semanas en Ratas por Administración Oral Las ratas fueron tratadas como se describe en Ejemplo 16. A.2. Las muestras de sangre fueron tomadas de todos los animales del grupo satélite para la medición de ambos niveles de anticuerpos totales y neutralizantes de anti-IFN-a. 1. Anticuerpos Neutralizantes Los anticuerpos neutralizantes fueron determinados usando el ensayo de Kawade usando células HeLa como se describió anteriormente. Un titulo de anticuerpos neutralizantes > 20 TRU/mL (Unidad de Reducción en Diez Veces) fue considerado como el umbral para positividad. Los resultados no mostraron niveles detectables de anticuerpos neutralizantes (NAb) en suero de rata al día 1 para animales tratados con dosis de 0,2, 0,4 y 0,6 mg o para tabletas placebo con recubrimiento entérico en cualquiera de los animales evaluados. Al día 15, no se midieron niveles detectables de NAb en once ratas a las que se administró oralmente con 0,2 mg de IFN-a-2b (E41Q) en cápsula con recubrimiento entérico, y solo un macho exhibió un título positivo de 81,3 TRU/mL. Similarmente , al día 15, no fueron medidos niveles detectables de NAb en diez ratas a las que se administró oralmente con la dosis de 0,4 mg/rata, mientras que una hembra y un macho mostraron cantidades detectables de NAb de 118,1 TRU/mL y 53,1 TRU/mL, respectivamente. No se detectaron títulos de NAb en ninguna rata a la que se hubiera administrado oralmente la dosis de 0,6 mg/animal. 2. Anticuerpos Totales Los anticuerpos totales fueron medidos usando ELISA como se describió anteriormente. No fueron medidas concentraciones detectables de anticuerpos totales en el suero de rata al día 1 de animales tratados con dosis de 0,2, 0,4 y 0,6 mg, o tabletas placebo con recubrimiento entérico en todos los animales evaluados. Al día 15, no fue detectado anticuerpos total anti- IFN-a-2b (E41Q) en diez ratas a las que se administró oralmente con 0,2 mg de IFN-a-2b(E41Q) en cápsula con recubrimiento entérico. Al día 15, solo dos animales, una hembra y un macho, exhibieron bajas concentraciones de anticuerpos totales de alrededor de 8,3 y 0,3 IU/mL, respectivamente. Similarmente , once ratas a las que se administró una dosis de 0,4 mg/rata no exhibieron niveles detectables de anticuerpos, excepto por una hembra con una cantidad detectable de anticuerpos totales de alrededor de 78,5 IU/mL. De notar es que un animal mostrando títulos positivos de NA con una dosis de 0,4 mg (53,1 TRU/mL) , pero no exhibió niveles detectables de anticuerpos totales. Finalmente una ausencia de anticuerpos totales se observó en todas las ratas observadas a las que se administró oralmente IFN- a-2b (E41Q) con una dosis de 0 , 6 mg/animal . 3. Resumen No se detectaron niveles de anticuerpos neutralizantes y totales con dosis de 0,2 y 0,6 mg por animal en suero de rata después de administración diaria PO de IFN- a-2b (E41Q) en cápsulas con recubrimiento entérico durante 2 semanas. Basados en los resultados farmacocinéticos de los mismos animales presentados en Ejemplo 16. A.2, estos hallazgos apoyan la ausencia de un impedimento fuerte del perfil farmacocinético de IFN- a-2b (E41Q) observado al día 14 o al día 7 con dosis de 0,2, 0,4 y 0,6 mg por animal después de administración diaria por ruta oral de IFN-a-2b(E41Q) en cápsulas con recubrimiento entérico durante 2 semanas. Con una dosis de 0,4 mg, dos animales de un total de doce animales mostraron títulos positivos de NAb (solo un animal presentó niveles de anticuerpos totales significativos) . Una reducción moderada de los valores Cmax y AUC(0-t) fue observado entre el día 1 y 14 con esta dosis.

C. Ratones - Inmunogenicidad de IFN-a- 2b(E41Q) en Ratones Transgénicos Inmunotolerantes a IFN-a La inmunogenicidad de IFN- -2b fue evaluada en ratones transgénicos (Universidad de Utrecht, Prof Schellekens) . Los ratones inmunotolerantes han sido usados para evaluar la introducción de nuevos epítopos de insulina y activador de plasminógeno tisular. Estos ratones han sido extensamente usados para estudiar la inmunogenicidad de preparaciones de IFN-a. Para evaluar la posible presencia de un nuevo epítopo en IFN-a-2b(E41Q) que podría inducir inmunogenicidad en humanos, la inmunogenicidad de IFN-a e IFN-a-2b (E41Q) fueron comparadas en ratones transgénicos inmunotolerantes nativos y IFN-a-2. Los grupos de cinco ratones nativos FVB/N o transgénicos IFN-a-2 se les inyectó intraperitonealmente (IP) con 10 g de IFN-a-2b (E41Q) o IFN-a-2a 5 días a una semana por 3 semanas. Las muestras de sangre fueron tomadas semanalmente (al día 0 antes de la primera inyección de interferón en días 7, 14, 21 y 28) y evaluados por la presencia de anticuerpos contra IFN-a en un ensayo de unión ELISA de MDS Pharma Services (Zürich, Suiza) . Este ensayo hizo uso de IFN-a recombinante para atrapar anticuerpos anti-IFN-a circulantes en las muestras de suero de ratones nativos y transgénicos tratados con IFN-a nativo y mutante, respectivamente. Los anticuerpos unidos fueron detectados por la adición de antígeno marcado (biotinilado) y con detección enzimática acoplada con estreptavidina . Los resultados mostraron que ambos IFN-a-2b(E41Q) e IFN-a nativo indujeron altos niveles de anticuerpos en ratones nativos. Los ratones inmunotolerantes no mostraron respuesta inmune a IFN-a o IFN-a-2 (E41Q) . Estos resultados indican que la única mutación aminoacídica de IFN-a-2b (E41Q) no introdujo un nuevo epítopo ya que no hubo diferencia en los niveles de anticuerpos para ambos ratones inmunotolerante y nativo inyectados con IFN-a-2b (E41Q) versus IFN-a nativo .

EJEMPLO 21 Clonación y Generación de hGH(Y42I) 1. Clonación de hGH nativa para expresión en Células Animales Una molécula de ácido nucleico codificando la proteína hGH (ver ID SEC NO: 1260) fue clonada en un vector de expresión animal, previo a la generación de las mutaciones seleccionadas. Una colección de mutantes blanco prediseñada fue entonces generada de manera que cada individuo mutante fuera creado y procesado individualmente, físicamente separado de los otros y en arreglos accesibles independientemente. El ADNc de hGH fue obtenido por síntesis in vitro desde el ARNm de glándula pituitaria humana (Clontech) usando el kit SMART (Clontech) . Primero, el ADNc codificando hGH fue clonado por amplificación de PCR usando los siguientes partidores: directo GH1 5 ' -ATGGCTACAGGCTCCCGGACGTCCCTGCCTCC-3 ' (ID SEC NO: 2109) y reverso GH1 REV 5 ' -CTAGAAGCCACAAGCTGCCCCTCCACAGAGCGGCACT-3 ' ( ID SEC NO: 2110) . El producto amplificado por PCR fue clonado en un vector de E. coli (pTOPO-TA (ID SEC NO: 2070) para producir el plásmido designado pT0P0-hGH4 (ID SEC NO: 2120) . La secuencia del ADNc codificando la hGH fue confirmado por secuenciación. El ADNc secuenciado fue entonces amplificado por PCR usando los siguientes partidores : hGHFORHIND (sitios HindII subrayados) 5 ' -AAAAAGCTTATGGCTACAGGCTCCCGGACG-3 ' (ID SEC NO: 2111) y hGHREV (sitio Xbal subrayado) 5 ' -GCCCTTCTAGAAGCCACAGCTGCCCTCCACAG-3 ' (ID SEC NO: 2112) . hGHFORHIND y hGHREV generan sitios de restricción HindIII y Xbal, respectivamente, en cualquier final del clon. Después de la digestión de restricción con HindIII y Xbal, el fragmento de PCR con el ADNc codificando hGH fue subclonado en los sitios correspondientes en pUC-CMVhGHpA para producir pNAU -hGH (ID SEC NO: 2119) . b) Diseño de variantes GH por exploración en 2D Por tecnología de exploración en 2D, descrita aquí y también descrita en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos con números de serie 10/658,355 y 11/267,871, fue usada para diseñar y obtener mutantes hGH con resistencia a proteólisis mejorada. Js-HITs fueron identificados basados en (1) propiedad de la proteína de ser evolucionada (es decir, resistencia a proteólisis); (2) secuencia de amino ácidos; y (3) propiedades de amino ácidos individuales. Las posiciones seleccionadas (is-HITs) en hGH pituitaria (ID SEC N0:1) fueron (números corresponden a la posición aminoacídica en la proteína madura): Fl, P2, P5, L6, R8, L9, FIO, Dll, L15, R16, R19, L20, L23, F25, D26, Y28, E30, F31, E32, E33, Y35, P37, K38, E39, K41, Y42, F44, L45, P48, L52, F54 , E56, P59, P61, R64, E65, E66, K70, L73, E74 , L75, L76, R77, L80, L81, L82, W86, L87, E88, P89, F92, L93 , R94 , F97, L101, Y103, D107, Ylll, D112, L113 , L114, K115, D116, L117, E118, E119, L124, M125, R127, L128, E129, D130, P133, R134 , F139, K140, Y143, K145, F146, D147, D153, D154, L156, K158, Y160, L162, L163, Y164, F166, R167, K168, D169, M170, D171, K172, E174 , F176, L177, R178, R183, E186, y F191. Las sustituciones de residuos realizados son listados en la Tabla 92.

Los aminoácidos a is-HITs (columna izquierda de Tabla 92) fueron reemplazados por los aminoácidos de reemplazo (columna derecha de Tabla 92) para producir variantes de GH con resistencia aumentada a proteólisis. Un total de 222 variantes de hGH fueron generadas (ver Ejemplo l.II.B y Tabla 24). c) Resistencia a Proteólisis Las variantes de hGH fueron tratadas con proteasas de manera de identificar moléculas resistentes. La resistencia relativa de proteínas mutantes comparado con la proteína nativa contra fragmentación enzimática fue determinada por exposición a una mezcla de proteasas (como fue descrito en Ejemplo l.I.A) . Las muestras tratadas fueron usadas para determinar la actividad residual tal como actividad proliferativa en un ensayo de proliferación celular (como fue descrito en Ejemplo l.I.C.l; ver Tabla 24 para resultados) . Los resultados muestran que muchos de los polipéptidos evaluados muestran una resistencia a proteasas in vi tro aumentada comparándolo con hGH nativa . 4. Clonación de hGH nativa para Expresión Procariótica Para expresar hGH en E. coli, el fragmento de ADNc que codifica hGH fue amplificado por PCR desde pNAUT-hGH (ID SEC NO: 2119) , usando los partidores hGHFORPET (ID SEC NO: 2113) y hGHREVPET (ID SEC NO: 2114), usando la ADN polimerasa Herculase (Invitrogen) . El partidor directo hGHFORPET fue diseñado para introducir un sitio de restricción Ndel y para cambiar los codones de Prolina 2 y Prolina 5 de codones humanos por codones de mayor uso en E. coli (CCA a CCG y CCC a CCG) . hGHFORPET (sitio Ndel subrayado) : 5 ' -GGGAATTCCATATGTTCCCGACCATTCCGTTATCCAGG- 3 ' (ID SEC NO: 2113) El partidor reverso hGHREVPET fue diseñado para introducir un sitio de restricción BamHI y para cambiar el codón STOP desde TAG a TAA de manera de optimizar el rendimiento en producción de hGH en E. coli. hGHREVPET (sitio BamHI subrayado) : 5 ' -CGGGATCCCTTAAGAAGCCACAGCTGCCCTCCACAGAGC-3 ' (ID SEC NO: 2114) El fragmento de PCR fue subclonado en pET-24 ( Invitrogen; ID SEC NO: 2069) . A manera de optimizar el rendimiento de hGH en E. coli, se hicieron cambios adicionales a la secuencia de hGH. Ciclos de mutagénesis fueron usados para cambiar los codones que codifican para arginina en las posiciones Arg 8 y Arg 16 en el polipéptido de hGH maduro. Los codones de Arginina fueron cambiados por codones de mayor uso en E. coli. Los siguientes partidores de mutagénesis fueron usados: Partidores para mutagénesis de codón Arg8, hGHARG8FOR : 5 ' -CCGACCATTCCGTTACCCGTCTTTTTGACAA-3 ' (ID SEC NO: 2115) y hGHARG8REV : 5 ' -GAGCATAGCGTTGTCAAAAAGACGGGATAACG-3 ' (ID SEC NO : 2116) . Partidores para mutagénesis de codón Argl6, hGHARGl6FOR 5 ' -GACAACGCTATGCTCCGTGCCCATCGTCTGCACCAG-3 ' ( ID SEC NO: 2117) y hGHARGl6REV 5 ' -CTGGTGCAGACGATGGGCACGGAGCATAGCGTTGTC-3 ' ( ID SEC NO: 2118) . Después de las rondas de mutagénesis, los constructos resultantes fueron verificados por secuenciación. El plásmido de expresión final fue designado pET-24Naut-hGH (ID SEC NO: 2121) . La generación de la mutación del ejemplo, Y42I, en pET-24Naut-hGH fue realizada usando técnicas de mutagénesis sitio-dirigida análogas a las descritas en EJEMPLO 2d. El diseño del partidor mutagénico fue hecho para efectuar la mutación de codones en las posiciones nucleotídicas 4719 a 4721 de ID SEC NO: 2121 desde TAT a ATC. El plásmido pET-24Naut-hGH (Y42I) tuvo la siguiente secuencia de aminoácidos: 1 CTAGTCGGGG AAATGTGCGC GGAACCCCTA TTTGTTTATT TTTCTAAATA 51 CATTCAAATA TGTATCCGCT CATGAATTAA TTCTTAGAAA AACTCATCGA 101 GCATCAAATG AAACTGCAAT TTATTCATAT CAGGATTATC AATACCATAT 151 TTTTGAAAAA GCCGTTTCTG TAATGAAGGA GAAAACTCAC CGAGGCAGTT 201 CCATAGGATG GCAAGATCCT GGTATCGGTC TGCGATTCCG ACTCGTCCAA 251 CATCAATACA ACCTATTAAT TTCCCCTCGT CAAAAATAAG GTTATCAAGT 301 GAGAAATCAC CATGAGTGAC GACTGAATCC GGTGAGAATG GCAAAAGTTT 351 ATGCATTTCT TTCCAGACTT GTTCAACAGG CCAGCCATTA CGCTCGTCAT 401 CAAAATCACT CGCATCAACC AAACCGTTAT TCATTCGTGA TTGCGCCTGA 451 GCGAGACGAA ATACGCGATC GCTGTTAAAA GGACAATTAC AAACAGGAAT 501 CGAATGCAAC CGGCGCAGGA ACACTGCCAG CGCATCAACA ATATTTTCAC 551 CTGAATCAGG ATATTCTTCT AATACCTGGA ATGCTGTTTT CCCGGGGATC 601 GCAGTGGTGA GTAACCATGC ATCATCAGGA GTACGGATAA AATGCTTGAT 651 GGTCGGAAGA GGCATAAATT CCGTCAGCCA GTTTAGTCTG ACCATCTCAT 701 CTGTAACATC ATTGGCAACG CTACCTTTGC CATGTTTCAG AAACAACTCT 751 GGCGCATCGG GCTTCCCATA CAATCGATAG ATTGTCGCAC CTGATTGCCC 801 GACATTATCG CGAGCCCATT TATACCCATA TAAATCAGCA TCCATGTTGG 851 AATTTAATCG CGGCCTAGAG CAAGACGTTT CCCGTTGAAT ATGGCTCATA 901 ACACCCCTTG TATTACTGTT TATGTAAGCA GACAGTTTTA TTGTTCATGA 951 CCAAAATCCC TTAACGTGAG TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA 1001 GAAAAGATCA AAGGATCTTC TTGAGATCCT TTTTTTCTGC GCGTAATCTG 1051 CTGCTTGCAA ACAAAAAAAC CACCGCTACC AGCGGTGGTT TGTTTGCCGG 1101 ATCAAGAGCT ACCAACTCTT TTTCCGAAGG TAACTGGCTT CAGCAGAGCG 1151 CAGATACCAA ATACTGTCCT TCTAGTGTAG CCGTAGTTAG GCCACCACTT 1201 CAAGAACTCT GTAGCACCGC CTACATACCT CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC 1251 CAGTGGCTGC TGCCAGTGGC GATAAGTCGT GTCTTACCGG GTTGGACTCA 1301 AGACGATAGT TACCGGATAA GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA CGGGGGGTTC 1351 GTGCACACAG CCCAGCTTGG AGCGAACGAC CTACACCGAA CTGAGATACC 1401 TACAGCGTGA GCTATGAGAA AGCGCCACGC TTCCCGAAGG GAGAAAGGCG 1451 GACAGGTATC CGGTAAGCGG CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA 1501 GCTTCCAGGG GGAAACGCCT GGTATCTTTA TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC 1551 ACCTCTGACT TGAGCGTCGA TTTTTGTGAT GCTCGTCAGG GGGGCGGAGC 1601 CTATGGAAAA ACGCCAGCAA CGCGGCCTTT TTACGGTTCC TGGCCTTTTG 1651 CTGGCCTTTT GCTCACATGT TCTTTCCTGC GTTATCCCCT GATTCTGTGG 1701 ATAACCGTAT TACCGCCTTT GAGTGAGCTG ATACCGCTCG CCGCAGCCGA 1751 ACGACCGAGC GCAGCGAGTC AGTGAGCGAG GAAGCGGAAG AGCGCCTGAT 1801 GCGGTATTTT CTCCTTACGC ATCTGTGCGG TATTTCACAC CGCAATGGTG 1851 CACTCTCAGT ACAATCTGCT CTGATGCCGC ATAGTTAAGC CAGTATACAC 1901 TCCGCTATCG CTACGTGACT GGGTCATGGC TGCGCCCCGA CACCCGCCAA 1951 CACCCGCTGA CGCGCCCTGA CGGGCTTGTC TGCTCCCGGC ATCCGCTTAC 2001 AGACAAGCTG TGACCGTCTC CGGGAGCTGC ATGTGTCAGA GGTTTTCACC 2051 GTCATCACCG AAACGCGCGA GGCAGCTGCG GTAAAGCTCA TCAGCGTGGT 2101 CGTGAAGCGA TTCACAGATG TCTGCCTGTT CATCCGCGTC CAGCTCGTTG 2151 AGTTTCTCCA GAAGCGTTAA TGTCTGGCTT CTGATAAAGC GGGCCATGTT 2201 AAGGGCGGTT TTTTCCTGTT TGGTCACTGA TGCCTCCGTG TAAGGGGGAT 2251 TTCTGTTCAT GGGGGTAATG ATACCGATGA AACGAGAGAG GATGCTCACG 2301 ATACGGGTTA CTGATGATGA ACATGCCCGG TTACTGGAAC GTTGTGAGGG 2351 TAAACAACTG GCGGTATGGA TGCGGCGGGA CCAGAGAAAA ATCACTCAGG 2401 GTCAATGCCA GCGCTTCGTT AATACAGATG TAGGTGTTCC ACAGGGTAGC 2451 CAGCAGCATC CTGCGATGCA GATCCGGAAC ATAATGGTGC AGGGCGCTGA 2501 CTTCCGCGTT TCCAGACTTT ACGAAACACG GAAACCGAAG ACCATTCATG 2551 TTGTTGCTCA GGTCGCAGAC GTTTTGCAGC AGCAGTCGCT TCACGTTCGC 2601 TCGCGTATCG GTGATTCATT CTGCTAACCA GTAAGGCAAC CCCGCCAGCC 2651 TAGCCGGGTC CTCAACGACA GGAGCACGAT CATGCGCACC CGTGGGGCCG 2701 CCATGCCGGC GATAATGGCC TGCTTCTCGC CGAAACGTTT GGTGGCGGGA 2751 CCAGTGACGA AGGCTTGAGC GAGGGCGTGC AAGATTCCGA ATACCGCAAG 2801 CGACAGGCCG ATCATCGTCG CGCTCCAGCG AAAGCGGTCC TCGCCGAAAA 2851 TGACCCAGAG CGCTGCCGGC ACCTGTCCTA CGAGTTGCAT GATAAAGAAG 2901 ACAGTCATAA GTGCGGCGAC GATAGTCATG CCCCGCGCCC ACCGGAAGGA 2951 GCTGACTGGG TTGAAGGCTC TCAAGGGCAT CGGTCGAGAT CCCGGTGCCT 3001 AATGAGTGAG CTAACTTACA TTAATTGCGT TGCGCTCACT GCCCGCTTTC 3051 CAGTCGGGAA ACCTGTCGTG CCAGCTGCAT TAATGAATCG GCCAACGCGC 3101 GGGGAGAGGC GGTTTGCGTA TTGGGCGCCA GGGTGGTTTT TCTTTTCACC 3151 AGTGAGACGG GCAACAGCTG ATTGCCCTTC ACCGCCTGGC CCTGAGAGAG 3201 TTGCAGCAAG CGGTCCACGC TGGTTTGCCC CAGCAGGCGA AAATCCTGTT 3251 TGATGGTGGT TAACGGCGGG ATATAACATG AGCTGTCTTC GGTATCGTCG 3301 TATCCCACTA CCGAGATATC CGCACCAACG CGCAGCCCGG ACTCGGTAAT 3351 GGCGCGCATT GCGCCCAGCG CCATCTGATC GTTGGCAACC AGCATCGCAG 3401 TGGGAACGAT GCCCTCATTC AGCATTTGCA TGGTTTGTTG AAAACCGGAC 3451 ATGGCACTCC AGTCGCCTTC CCGTTCCGCT ATCGGCTGAA TTTGATTGCG 3501 AGTGAGATAT TTATGCCAGC CAGCCAGACG CAGACGCGCC GAGACAGAAC 3551 TTAATGGGCC CGCTAACAGC GCGATTTGCT GGTGACCCAA TGCGACCAGA 3601 TGCTCCACGC CCAGTCGCGT ACCGTCTTCA TGGGAGAAAA TAATACTGTT 3651 GATGGGTGTC TGGTCAGAGA CATCAAGAAA TAACGCCGGA ACATTAGTGC 3701 AGGCAGCTTC CACAGCAATG GCATCCTGGT CATCCAGCGG ATAGTTAATG 3751 ATCAGCCCAC TGACGCGTTG CGCGAGAAGA TTGTGCACCG CCGCTTTACA 3801 GGCTTCGACG CCGCTTCGTT CTACCATCGA CACCACCACG CTGGCACCCA 3851 GTTGATCGGC GCGAGATTTA ATCGCCGCGA CAATTTGCGA CGGCGCGTGC 3901 AGGGCCAGAC TGGAGGTGGC AACGCCAATC AGCAACGACT GTTTGCCCGC 3951 CAGTTGTTGT GCCACGCGGT TGGGAATGTA ATTCAGCTCC GCCATCGCCG 4001 CTTCCACTTT TTCCCGCGTT TTCGCAGAAA CGTGGCTGGC CTGGTTCACC 4051 ACGCGGGAAA CGGTCTGATA AGAGACACCG GCATACTCTG CGACATCGTA 4101 TAACGTTACT GGTTTCACAT TCACCACCCT GAATTGACTC TCTTCCGGGC 4151 GCTATCATGC CATACCGCGA AAGGTTTTGC GCCATTCGAT GGTGTCCGGG 4201 ATCTCGACGC TCTCCCTTAT GCGACTCCTG CATTAGGAAG CAGCCCAGTA 4251 GTAGGTTGAG GCCGTTGAGC ACCGCCGCCG CAAGGAATGG TGCATGCAAG 4301 GAGATGGCGC CCAACAGTCC CCCGGCCACG GGGCCTGCCA CCATACCCAC 4351 GCCGAAACAA GCGCTCATGA GCCCGAAGTG GCGAGCCCGA TCTTCCCCAT 4401 CGGTGATGTC GGCGATATAG GCGCCAGCAA CCGCACCTGT GGCGCCGGTG 4451 ATGCCGGCCA CGATGCGTCC GGCGTAGAGG ATCGAGATCT CGATCCCGCG 4501 AAATTAATAC GACTCACTAT AGGGGAATTG TGAGCGGATA ACAATTCCCC 4551 TCTAGAAATA ATTTTGTTTA ACTTTAAGAA GGAGATATAC ATATGTTCCC 4601 GACCATTCCG TTATCCCGTC TTTTTGACAA CGCTATGCTC CGTGCCCATC 4651 GTCTGCACCA GCTGGCCTTT GACACCTACC AGGAGTTTGA AGAAGCCTAT 4701 ATCCCAAAGG AACAGAAGAT CTCATTCCTG CAGAACCCCC AGACCTCCCT 4751 CTGTTTCTCA GAGTCTATTC CGACACCCTC CAACAGGGAG GAAACACAAC 4801 AGAAATCCAA CCTAGAGCTG CTCCGCATCT CCCTGCTGCT CATCCAGTCG 4851 TGGCTGGAGC CCGTGCAGTT CCTCAGGAGT GTCTTCGCCA ACAGCCTGGT 4901 GTACGGCGCC TCTGACAGCA ACGTCTATGA CCTCCTAAAG GACCTAGAGG 4951 AAGGCATCCA AACGCTGATG GGGAGGCTGG AAGATGGCAG CCCCCGGACT 5001 GGGCAGATCT TCAAGCAGAC CTACAGCAAG TTCGACACAA ACTCACACAA 5051 CGATGACGCA CTACTCAAGA ACTACGGGCT GCTCTACTGC TTCAGGAAGG 5101 ACATGGACAA GGTCGAGACA TTCCTGCGCA TCGTGCAGTG CCGCTCTGTG 5151 GAGGGCAGCT GTGGCTTCTA AGGATCCGAA TTCGAGCTCC GTCGACAAGC 5201 TTGCGGCCGC ACTCGATGAG CAATAACTAG CATAACCCCT TGGGGCCTCT 5251 AAACGGGTCT TGAGGGGTTT TTTGCTGAAA GGAGGAA Otro ejemplo de mutación Y42H, también fue generada de manera similar por mutagénesis ; el diseño del partidor mutagénico fue hecho para efectuar la mutación del codón en las posiciones nucleotídicas 4719 a 4721 de ID SEC NO: 2121 desde TAT a CAC. El plásmido pET-24Naut-hGH (Y42I) tuvo la siguiente secuencia de aminoácidos: 1 CTAGTCGGGG AAATGTGCGC GGAACCCCTA TTTGTTTATT TTTCTAAATA 51 CATTCAAATA TGTATCCGCT CATGAATTAA TTCTTAGAAA AACTCATCGA 101 GCATCAAATG AAACTGCAAT TTATTCATAT CAGGATTATC AATACCATAT 151 TTTTGAAAAA GCCGTTTCTG TAATGAAGGA GAAAACTCAC CGAGGCAGTT 201 CCATAGGATG GCAAGATCCT GGTATCGGTC TGCGATTCCG ACTCGTCCAA 251 CATCAATACA ACCTATTAAT TTCCCCTCGT CAAAAATAAG GTTATCAAGT 301 GAGAAATCAC CATGAGTGAC GACTGAATCC GGTGAGAATG GCAAAAGTTT 351 ATGCATTTCT TTCCAGACTT GTTCAACAGG CCAGCCATTA CGCTCGTCAT 401 CAAAATCACT CGCATCAACC AAACCGTTAT TCATTCGTGA TTGCGCCTGA 451 GCGAGACGAA ATACGCGATC GCTGTTAAAA GGACAATTAC AAACAGGAAT 501 CGAATGCAAC CGGCGCAGGA ACACTGCCAG CGCATCAACA ATATTTTCAC 551 CTGAATCAGG ATATTCTTCT AATACCTGGA ATGCTGTTTT CCCGGGGATC 601 GCAGTGGTGA GTAACCATGC ATCATCAGGA GTACGGATAA AATGCTTGAT 651 GGTCGGAAGA GGCATAAATT CCGTCAGCCA GTTTAGTCTG ACCATCTCAT 701 CTGTAACATC ATTGGCAACG CTACCTTTGC CATGTTTCAG AAACAACTCT 751 GGCGCATCGG GCTTCCCATA CAATCGATAG ATTGTCGCAC CTGATTGCCC 801 GACATTATCG CGAGCCCATT TATACCCATA TAAATCAGCA TCCATGTTGG 851 AATTTAATCG CGGCCTAGAG CAAGACGTTT CCCGTTGAAT ATGGCTCATA 901 ACACCCCTTG TATTACTGTT TATGTAAGCA GACAGTTTTA TTGTTCATGA 951 CCAAAATCCC TTAACGTGAG TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA 1001 GAAAAGATCA AAGGATCTTC TTGAGATCCT TTTTTTCTGC GCGTAATCTG 1051 CTGCTTGCAA ACAAAAAAAC CACCGCTACC AGCGGTGGTT TGTTTGCCGG 1101 ATCAAGAGCT ACCAACTCTT TTTCCGAAGG TAACTGGCTT CAGCAGAGCG 1151 CAGATACCAA ATACTGTCCT TCTAGTGTAG CCGTAGTTAG GCCACCACTT 1201 CAAGAACTCT GTAGCACCGC CTACATACCT CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC 1251 CAGTGGCTGC TGCCAGTGGC GATAAGTCGT GTCTTACCGG GTTGGACTCA 1301 AGACGATAGT TACCGGATAA GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA CGGGGGGTTC 1351 GTGCACACAG CCCAGCTTGG AGCGAACGAC CTACACCGAA CTGAGATACC 1401 TACAGCGTGA GCTATGAGAA AGCGCCACGC TTCCCGAAGG GAGAAAGGCG 1451 GACAGGTATC CGGTAAGCGG CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA 1501 GCTTCCAGGG GGAAACGCCT GGTATCTTTA TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC 1551 ACCTCTGACT TGAGCGTCGA TTTTTGTGAT GCTCGTCAGG GGGGCGGAGC 1601 CTATGGAAAA ACGCCAGCAA CGCGGCCTTT TTACGGTTCC TGGCCTTTTG 1651 CTGGCCTTTT GCTCACATGT TCTTTCCTGC GTTATCCCCT GATTCTGTGG 1701 ATAACCGTAT TACCGCCTTT GAGTGAGCTG ATACCGCTCG CCGCAGCCGA 1751 ACGACCGAGC GCAGCGAGTC AGTGAGCGAG GAAGCGGAAG AGCGCCTGAT 1801 GCGGTATTTT CTCCTTACGC ATCTGTGCGG TATTTCACAC CGCAATGGTG 1851 CACTCTCAGT ACAATCTGCT CTGATGCCGC ATAGTTAAGC CAGTATACAC 1901 TCCGCTATCG CTACGTGACT GGGTCATGGC TGCGCCCCGA CACCCGCCAA 1951 CACCCGCTGA CGCGCCCTGA CGGGCTTGTC TGCTCCCGGC ATCCGCTTAC 2001 AGACAAGCTG TGACCGTCTC CGGGAGCTGC ATGTGTCAGA GGTTTTCACC 2051 GTCATCACCG AAACGCGCGA GGCAGCTGCG GTAAAGCTCA TCAGCGTGGT 2101 CGTGAAGCGA TTCACAGATG TCTGCCTGTT CATCCGCGTC CAGCTCGTTG 2151 AGTTTCTCCA GAAGCGTTAA TGTCTGGCTT CTGATAAAGC GGGCCATGTT 2201 AAGGGCGGTT TTTTCCTGTT TGGTCACTGA TGCCTCCGTG TAAGGGGGAT 2251 TTCTGTTCAT GGGGGTAATG ATACCGATGA AACGAGAGAG GATGCTCACG 2301 ATACGGGTTA CTGATGATGA ACATGCCCGG TTACTGGAAC GTTGTGAGGG 2351 TAAACAACTG GCGGTATGGA TGCGGCGGGA CCAGAGAAAA ATCACTCAGG 2401 GTCAATGCCA GCGCTTCGTT AATACAGATG TAGGTGTTCC ACAGGGTAGC 2451 CAGCAGCATC CTGCGATGCA GATCCGGAAC ATAATGGTGC AGGGCGCTGA 2501 CTTCCGCGTT TCCAGACTTT ACGAAACACG GAAACCGAAG ACCATTCATG 2551 TTGTTGCTCA GGTCGCAGAC GTTTTGCAGC AGCAGTCGCT TCACGTTCGC 2601 TCGCGTATCG GTGATTCATT CTGCTAACCA GTAAGGCAAC CCCGCCAGCC 2651 TAGCCGGGTC CTCAACGACA GGAGCACGAT CATGCGCACC CGTGGGGCCG 2701 CCATGCCGGC GATAATGGCC TGCTTCTCGC CGAAACGTTT GGTGGCGGGA 2751 CCAGTGACGA AGGCTTGAGC GAGGGCGTGC AAGATTCCGA ATACCGCAAG 2801 CGACAGGCCG ATCATCGTCG CGCTCCAGCG AAAGCGGTCC TCGCCGAAAA 2851 TGACCCAGAG CGCTGCCGGC ACCTGTCCTA CGAGTTGCAT GATAAAGAAG 2901 ACAGTCATAA GTGCGGCGAC GATAGTCATG CCCCGCGCCC ACCGGAAGGA 2951 GCTGACTGGG TTGAAGGCTC TCAAGGGCAT CGGTCGAGAT CCCGGTGCCT 3001 AATGAGTGAG CTAACTTACA TTAATTGCGT TGCGCTCACT GCCCGCTTTC 3051 CAGTCGGGAA ACCTGTCGTG CCAGCTGCAT TAATGAATCG GCCAACGCGC 3101 GGGGAGAGGC GGTTTGCGTA TTGGGCGCCA GGGTGGTTTT TCTTTTCACC 3151 AGTGAGACGG GCAACAGCTG ATTGCCCTTC ACCGCCTGGC CCTGAGAGAG 3201 TTGCAGCAAG CGGTCCACGC TGGTTTGCCC CAGCAGGCGA AAATCCTGTT 3251 TGATGGTGGT TAACGGCGGG ATATAACATG AGCTGTCTTC GGTATCGTCG 3301 TATCCCACTA CCGAGATATC CGCACCAACG CGCAGCCCGG ACTCGGTAAT 3351 GGCGCGCATT GCGCCCAGCG CCATCTGATC GTTGGCAACC AGCATCGCAG 3401 TGGGAACGAT GCCCTCATTC AGCATTTGCA TGGTTTGTTG AAAACCGGAC 3451 ATGGCACTCC AGTCGCCTTC CCGTTCCGCT ATCGGCTGAA TTTGATTGCG 3501 AGTGAGATAT TTATGCCAGC CAGCCAGACG CAGACGCGCC GAGACAGAAC 3551 TTAATGGGCC CGCTAACAGC GCGATTTGCT GGTGACCCAA TGCGACCAGA 3601 TGCTCCACGC CCAGTCGCGT ACCGTCTTCA TGGGAGAAAA TAATACTGTT 3651 GATGGGTGTC TGGTCAGAGA CATCAAGAAA TAACGCCGGA ACATTAGTGC 3701 AGGCAGCTTC CACAGCAATG GCATCCTGGT CATCCAGCGG ATAGTTAATG 3751 ATCAGCCCAC TGACGCGTTG CGCGAGAAGA TTGTGCACCG CCGCTTTACA 3801 GGCTTCGACG CCGCTTCGTT CTACCATCGA CACCACCACG CTGGCACCCA 3851 GTTGATCGGC GCGAGATTTA ATCGCCGCGA CAATTTGCGA CGGCGCGTGC 3901 AGGGCCAGAC TGGAGGTGGC AACGCCAATC AGCAACGACT GTTTGCCCGC 3951 CAGTTGTTGT GCCACGCGGT TGGGAATGTA ATTCAGCTCC GCCATCGCCG 4001 CTTCCACTTT TTCCCGCGTT TTCGCAGAAA CGTGGCTGGC CTGGTTCACC 4051 ACGCGGGAAA CGGTCTGATA AGAGACACCG GCATACTCTG CGACATCGTA 4101 TAACGTTACT GGTTTCACAT TCACCACCCT GAATTGACTC TCTTCCGGGC 4151 GCTATCATGC CATACCGCGA AAGGTTTTGC GCCATTCGAT GGTGTCCGGG 4201 ATCTCGACGC TCTCCCTTAT GCGACTCCTG CATTAGGAAG CAGCCCAGTA 4251 GTAGGTTGAG GCCGTTGAGC ACCGCCGCCG CAAGGAATGG TGCATGCAAG 4301 GAGATGGCGC CCAACAGTCC CCCGGCCACG GGGCCTGCCA CCATACCCAC 4351 GCCGAAACAA GCGCTCATGA GCCCGAAGTG GCGAGCCCGA TCTTCCCCAT 4401 CGGTGATGTC GGCGATATAG GCGCCAGCAA CCGCACCTGT GGCGCCGGTG 4451 ATGCCGGCCA CGATGCGTCC GGCGTAGAGG ATCGAGATCT CGATCCCGCG 4501 AAATTAATAC GACTCACTAT AGGGGAATTG TGAGCGGATA ACAATTCCCC 4551 TCTAGAAATA ATTTTGTTTA ACTTTAAGAA GGAGATATAC ATATGTTCCC 4601 GACCATTCCG TTATCCCGTC TTTTTGACAA CGCTATGCTC CGTGCCCATC 4651 GTCTGCACCA GCTGGCCTTT GACACCTACC AGGAGTTTGA AGAAGCCTAT 4701 ATCCCAAAGG AACAGAAGCA CTCATTCCTG CAGAACCCCC AGACCTCCCT 4751 CTGTTTCTCA GAGTCTATTC CGACACCCTC CAACAGGGAG GAAACACAAC 4801 AGAAATCCAA CCTAGAGCTG CTCCGCATCT CCCTGCTGCT CATCCAGTCG 4851 TGGCTGGAGC CCGTGCAGTT CCTCAGGAGT GTCTTCGCCA ACAGCCTGGT 4901 GTACGGCGCC TCTGACAGCA ACGTCTATGA CCTCCTAAAG GACCTAGAGG 4951 AAGGCATCCA AACGCTGATG GGGAGGCTGG AAGATGGCAG CCCCCGGACT 5001 GGGCAGATCT TCAAGCAGAC CTACAGCAAG TTCGACACAA ACTCACACAA 5051 CGATGACGCA CTACTCAAGA ACTACGGGCT GCTCTACTGC TTCAGGAAGG 5101 ACATGGACAA GGTCGAGACA TTCCTGCGCA TCGTGCAGTG CCGCTCTGTG 5151 GAGGGCAGCT GTGGCTTCTA AGGATCCGAA TTCGAGCTCC GTCGACAAGC 5201 TTGCGGCCGC ACTCGATGAG CAATAACTAG CATAACCCCT TGGGGCCTCT 5251 AAACGGGTCT TGAGGGGTTT TTTGCTGAAA GGAGGAA EJEMPLO 22 Estudios de Desarrollo de un Producto de Droga hGH(Y42I) para Uso Pre-clínico y Clínico Usando métodos de producción análogos a aquellos descritos para IFN-a-2b (E41Q) aquí, un grueso de la solución con proteína hGH(Y42I) fue generado para uso en estudios pre-clínicos y clínicos. Muchas condiciones de ejemplo de tampón para liofilización fueron evaluadas y los datos de dichas pruebas son presentadas a continuación. El polvo liofilizado generado de la condición seleccionada fue usado para manufacturar cápsulas y tabletas con recubrimiento entérico de hGH(Y42I). Se presentan a continuación formulaciones de drogas de ejemplo. 1. Selección de Condiciones de Liofilización Previo a la liofilización del grueso del líquido para la manufactura de cápsulas y tabletas con recubrimiento entérico, fue necesario probar varias condiciones de tampones del grueso del líquido de manera de generar una sustancia en polvo óptima para las formulaciones en cápsula y tableta. Seis condiciones de tampones de ejemplo se presentan en la Tabla 95 a continuación. Muestras de proteína hGH(Y42I) obtenida de la preparación del grueso del líquido con la proteína hGH(Y42I) expresada en E. coli fueron formulados en seis diferentes tampones. Concentraciones de los componentes del tampón se presentan en la Tabla 95 y representan la concentración final del tampón previo a la liofilización .

TABLA 95: Condiciones del Tampón de Liofilización Condición Formulación de Tampón Condición 1 20 g/L Manitol + 1 g/L NaCl + 7.5 mM Na2RP04/ UáH2POt, pH 7,5 Condición 2 2 g/L Manitol + 15 mM NajH/W NaH2 04, pH 7,5 Condición 3 7.5 g/L Sacarosa + 2mM H3 04/ NaOH, pH 6.5 Condición 4 6 g/L Sacarosa + 7.5 g/L NaCl + 20 mM Na2H íty NaH2/><¾, pH 7,5 Condición 5 6 g/L Sacarosa + 20 mM Na2riP(¾/ NaHj O,, pH 7,5 Condición 6 6 g/L Sacarosa + 8.5 g/L arginina + 20 mM Na2HP(¾/ NaH2 O,, pH 7,5 La actividad, porcentaje de rendimiento y porcentaje de dimerización de hGH(Y42I) fueron analizados para cada muestra líquida previo a la liofilización. La actividad fue determinada usando el ensayo de proliferación celular para hGH descrito en Ejemplo 1. SE-HPLC fue usado para la determinación de monómero/dímero . Todas las condiciones fueron estimadas como aceptables para liofilización de acuerdo a los parámetros evaluados. Los resultados son presentados en Tabla 96: Las muestras fueron liofilizadas usando procedimientos similares a aquellos descritos para IFN-a-2b(E41Q) . Después de la liofilización, la apariencia del polvo fue analizada para cada condición. Los resultados del análisis son presentados en la Tabla 97 a continuación.

Basado en la conducta física (es decir, pegajosidad) del polvo, condiciones 2 y 6 fueron eliminadas, y las condiciones 1, 3, 4 y 5 fueron escogidas para mayor análisis. Después del análisis físico, muestras de los polvos liofilizados fueron resuspendidos y analizados por actividad (por ensayo de proliferación celular con hGH) , rendimiento (determinado por ensayos OD28o y ácido bicinchonínico (BCA) ) y porcentaje de dimerización (por SE-HPLC) . Los resultados de éstos análisis son presentados en la Tabla 98a a continuación .

* Ya que las condiciones 2 y 6 fueron eliminadas para mayores consideraciones, los ensayos de BCA no fueron realizados en estas muestras Adición de un paso de purificación cromatográfica En un segundo experimento , un paso de columna de cromatograf ía fue agregado al proceso de liof ilización previo al paso de liof ilización de manera de determinar el grado de pureza que puede alcanzarse con cada condición de tampón . Las muestras de proteína hGH ( Y42 I ) fueron preparadas como se describió anteriormente en 23 . 1 usando las condiciones de tampón especif icadas para las condiciones 1 , 3 , 4 y 5 . El grueso del líquido (previo a liof ilización) fue purif icado por cromatograf ía de exclusión de tamaño (CET) usando columnas Sefacril S100. Previo a la adición de las muestras, las columnas fueron equilibradas con el tampón apropiado (sin el azúcar) para cada condición. Las muestras de proteína fueron entonces cargadas, lavadas y eluidas. Las fracciones de eluciones para cada muestra fueron analizadas para rendimiento y pureza (determinado por resolución de pico en análisis de espectrometría de masa) . Las muestras para condiciones 1, 4, y 5 exhibieron buena resolución del pico de hGH cuando se analizó con espectrometría de masa. La muestra para condición 3 se encontró con una resolución de pico pobre. Los resultados de los análisis son presentados en la Tabla 99 a continuación.

Después de purificación CET, las muestras del grueso del líquido de las condiciones 1, 3, 4 y 5 fueron liofilizadas como se describió anteriormente. La cantidad de proteína hGH(Y42I) por mg de polvo fue determinada desde las mediciones de OD2so Y BCA. Además, la cantidad máxima de polvo que podía cargarse en una cápsula tamaño 9 fue medida. Basados en estas cantidades (mg de proteína por mg de polvo y mg de polvo por cápsula) la cantidad máxima de proteína hGH ( Y42 I ) que podía ser contenida en una cápsula fue calculado para cada una de las cuatro condiciones seleccionadas. Estos datos se presentan en la Tabla 100 a continuación. Un resumen de los datos colectados durante la optimización de la liofilización también se presenta en la Tabla 100 , incluyendo la apariencia del polvo, actividad de hGH ( Y42 I ) después de liofilización, % de dimerización de hGH ( Y42 I ) antes y después de liofilización, y calidad de resolución de los picos en espectrometrías de masa después de la purificación CET.

TABLA 100: Resumen de las muestras purificadas por CET liofilizadas Muestra Apariencia Actividad Dimerizació OD280 Mg polvo/ Mg hGH/ Purificación del polvo (EC50, n (%) BCA (mg Cápsula cápsula CET pg/mL) hGH/ mg polvo) Condición Buena 188,72 Antes 10,23 OD:0,027 22,3 0,594 Buena 1 Después 9,97 BCA:0,041 resolución ^ndición Pegajoso 140,97 Antes 4,4 n/a n/a n/a n/a Después 7, 19 Condición Buena 137,93 Antes 5,49 OD:0,057 26,2 1 ,508 Buena 3 Después 6,94 BCA:0,099 resolución Condición Buena 121 ,67 Antes 7,46 OD:0,033 36,6 1 ,227 Buena 4 Después 6,72 BCA:0,057 resolución Condición Buena 135,96 Antes 8,83 OD:0,057 24,6 1 ,398 Buena 5 Después BCA:0, 103 resolución 10,05 Condición Pegajoso 15 1 ,37 Antes 10,23 n/a n/a n/a n/a 6 Después 25 10,88 NIBSC n/a 144,76 n/a n/a n/a n/a n/a Como resultado de estos estudios, la condición 4 fue seleccionada para las siguientes formulaciones de producto de droga de hGH(Y42I) basado en su buena resolución de pico y bajo porcentaje de dimerización .

EJEMPLO 23 Cinéticas de Transporte de hGH(Y42I) La permeabilidad celular de hGH(Y41I) fue determinada usando un ensayo en mono capa de células Caco-2. Caco-2 es una línea celular de carcinoma colorrectal humano que forma una monocapa de células epiteliales diferenciadas unidas por junturas intercelulares impermeables . Debido a que forma una barrera selectiva para transporte celular, la mono capa Caco-2 es comúnmente usada como un modelo de permeabilidad de drogas en el tracto intestinal humano. Típicamente, las células Caco-2 son sembradas en una membrana microporosa que está suspendida en un pocilio. Con la mono capa en posición, el pocilio es dividido en el compartimiento superior (apical) e inferior (basolateral) . Para evaluar la absorción, la muestra de droga se aplica al compartimiento apical y se retira del compartimento basolateral a varios tiempos . El coeficiente de permeabilidad aparente (Papp) puede entonces ser calculado desde la siguiente ecuación: Papp(cm/s) = VA x Cinf dtx CT=0 x A donde VA es el volumen del pocilio aceptor, Cinf es la concentración del compuesto (es decir, droga) en el compartimento basolateral después del transporte, A es el área de superficie (cm2) de la mono capa de células, y CT=0 es la concentración en el compartimiento apical antes del transporte. a. Experimentos de Permeabilidad En este Ejemplo, las células Caco-2 fueron mantenidas en medio Dulbecco modificado por Eagle suplementado con 20% suero fetal bovino, glutamina y gentamicina. Las células se usaron entre 22-28 pasajes (las células fueron subcultivadas típicamente una vez por semana) . Las células fueron sembradas a una densidad de 2 x 105 células por pocilio sobre insertos de membrana de policarbonato en placas de 24 pocilios Transwell™ (Costar) y usadas a los días 21-23 después de la siembra. La integridad de la monocapa de células fue validada usando evaluación TEER (resistencia eléctrica transepitelial , por sus siglas en inglés) donde el movimiento de iones a través de una vía paracelular fue medido. La medición de TEER a través de células crecidas sobre membranas permeables proporciona una evaluación indirecta del establecimiento de las junturas impermeables y su estabilidad. Los experimentos de permeabilidad para hGH(Y42I) comparado con hGH nativa fueron realizados en la dirección apical-basolateral (es decir la concentración de hGH(Y42I) en el compartimiento basolateral fue mucho menor que la del compartimiento apical al comienzo del ensayo) . La concentración de hGH(Y42I) en el compartimiento apical al comienzo del ensayo fue (CT=o) 75 µ?/mL y la concentración en el compartimiento basolateral fue ~0. Un lote pre clínico de hGH(Y42I) preparado de acuerdo a la condición #4 como se describe en Ejemplo 22 fue usado en este ensayo. El ensayo se realizó en tampón Ringer, pH 7,8, a 37 °C con agitación. Las muestras fueron retiradas del compartimiento basolateral en t = 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas y 6 horas. La concentración de hGH(Y42I) y hGH nativa a cada tiempo fueron determinados usando un ELISA para hGH (Mediagnost's) . Los coeficientes de permeabilidad aparente (Papp) fueron calculados para hGH(Y42I) y hGH nativa a cada tiempo usando la ecuación descrita anteriormente. Los valores aproximados de Papp son presentados en la Tabla 93 : En un experimento separado, los valores de Papp fueron determinados para varias condiciones de partida de hGH(Y42I) o hGH nativa en el compartimiento apical (CT=0) después de 6 horas de tiempo de transporte total . Los valores aproximados de Papp son presentados en la Tabla 94 a continuación.

TABLA 94 CT=O Papp hGH(Y42I) Papp hGH nativa (µß ml) (cm/seg x 108) (cm/seg x 108) 5 0,30 0,25 10 0,20 0,25 30 0,25 0,30 50 0,40 0,60 100 1 ,10 1 ,10 140 - 0,90 150 0,90 - 200 0,90 - 230 - 1 ,10 260 0,90 - 270 - 0,80 Como se muestra en las Tablas 93 y 94 anteriormente, hGH(Y42I) y hGH nativa muestran cinéticas de transporte a través de monocapas de células Caco- 2 comparables.

Experimentos de Inmunofluorescencia A manera de visualizar el transporte de hGH(Y42I) a través de las células Caco-2, se realizaron ensayos de inmunofluorescencia . Para estos experimentos, se sembraron células Caco-2 a una densidad de 2 x 105 células por pocilio en insertos de membrana de poliéster (PET) en placas de 24 pocilios Transwell™ (Costar) y usadas a los días 21-23 después de la siembra. El ensayo de permeabilidad fue conducido como se describió anteriormente excepto que la concentración inicial de hGH(Y42I) en el compartimiento apical fue de 300 yg/mL. Después de seis horas de transporte de membrana, las células se fijaron en un tampón fosfato al 4% con sacarosa con 4% de formaldehído por 15 minutos a temperatura ambiente. Las células fueron lavadas con PBS y guardadas a 4°C hasta la tinción. Previo a la tinción, las células fueron permeabilizadas para la penetración de anticuerpos de acuerdo al siguiente método: 1) las células fueron incubadas por 10 minutos a temperatura ambiente en TBS con 1% BSA y 0,1% Tritón X-100; 2) las células fueron lavadas tres veces en lx TBS; y 3) las células fueron incubadas en lx TBS con 1% BSA por 2 horas a temperatura ambiente. Las células fueron teñidas para: hGH(Y42I), actina (marcador de membrana apical) , receptor de transferrina (marcador de membrana basal) y ocludina (marcador de juntura impermeable) . La tinción de hGH(Y42I) y los marcadores celulares fue realizada por 1 hora a temperatura ambiente usando anticuerpo cabra anti-hGH (T20) (Santa Cruz; 10365) a una dilución 1:50 (para tinción de hGH(Y42I)); sonda molecular faloidina Alexa-568 (A12380) a una dilución de 1:200 (para tinción de actina) ; ratón anti- receptor de transferrina (Zymed; 136800) a una dilución de 1:500 (para tinción de receptor de transferrina) ; o anticuerpo ratón anti-ocludina FITC (Zymed; 33-1511) a una dilución de 1:250 (para tinción de ocludina) . Las monocapas fueron cortadas en 50 µ? de Vectashield Mounting Médium con solución Dapi (Vector Laboratories) y la tinción celular fue observada usando microscopía confocal . Los resultados no mostraron diferencia en la fluorescencia entre hGH nativa y hGH(Y42I). Esto apoya los resultados que describen anteriormente que hGH(Y42I) y hGH nativa muestran cinéticas de transporte comparables a través de mono capas de células Caco-2.

EJEMPLO 24 Tabletas de hGH(Y42I) de Formulación Normal Baja Humedad Para las formulaciones de tableta de hGH(Y42I), se examinó el efecto de la humedad en la estabilidad de hGH(Y42I). Dos formulaciones de tabletas de hGH(Y42I) de ejemplo, referidas aquí como normales y de baja humedad, fueron manufacturadas y evaluadas. Las formulaciones fueron producidas por fabricantes separados. Las especificaciones para estas dos formulaciones son presentadas en la Tabla 101 a continuación .

TABLA 101: Formulaciones de tabletas normal versus baja humedad Tiempo de desintegración de acuerdo a USP (701) para Tabletas de Liberación Retardada (min.:seg.) Tabletas con recubrimiento 10:47 12:09 entérico Parámetros de Recubrimiento Temperatura de Entrada de 34-36 34-36 Aire °C Temperatura del Producto °C 26-28 26-28 Ganancia en peso (%) Sub recubrimiento con - 2,7 Opadryl Clear Recubrimiento entérico con 13,0 13,4 Acryl EZE El análisis de estabilidad fue realizado en tabletas con formulación normal (normal C) y de baja humedad (bajo WC) en una cámara climatizada (30 °C/ 60% humedad relativa (RH) y 45°C/ 75% RH) . Se colectaron datos de determinación monómero/dímero (SE-HPLC) y actividad (ensayo de proliferación celular con hGH) para cada tiempo. Los resultados de estas pruebas se presentan en la Tabla 102 a continuación. Basados en este estudio, la formulación de baja humedad se escogió para la manufacturacion de las tabletas de hGH(Y42I) .

TABLA 102: Análisis de estabilidad para contenidos de humedad bajo versus normal EJEMPLO 25 Formulaciones de Ejemplo de Cápsulas y Tabletas hGH(Y42I) 1. Cápsulas con recubrimiento entérico Las cápsulas con recubrimiento entérico para estudios pre clínicos en ratas fueron llenadas con la cantidad apropiada de hGH(Y42I) liofilizado. El peso de llenado fue completado con sacarosa. Las cápsulas fueron recubiertas con recubrimiento entérico (para mantener la integridad a pH ácido) para liberar el producto en el intestino (soluble a pH normal) . Se usaron cápsulas Clear Torpac (tamaño 9, lote # 1684) y Opaque Capsugel (tamaño 9, lote # 1402) para estudios PK en ratas . El recubrimiento entérico estaba comprendido de 3 capas de una solución con celulosa/acetato/ftalato en acetona (12,5% m/v) . Cada capa fue secada separadamente. La calidad del recubrimiento entérico fue evaluada exponiéndolas a pH 1,2 por 1 h a 37 °C, con agitación seguido por disolución completa en PBS a 37 °C. Este procedimiento fue entonces aplicado a cápsulas con recubrimiento entérico con diferentes potencias de dosis usadas en estudios preclínicos. Todas las cápsulas evaluadas con recubrimiento entérico no mostraron signos visuales de fuga durante el período de exposición de 1 h. La transferencia a PBS permitió la desintegración de la cápsula con recubrimiento entérico dentro de 30 min. 2. Tabletas con Recubrimiento entérico Ejemplos de formulaciones para tabletas con recubrimiento entérico de hGH(Y42I) son presentados en la Tabla 103 a continuación.

TABLA 103: Formulación de Tableta con Recubrimiento entérico de hGH(Y42I) 3,0 mg 12,0 mg 24,0 mg Ingredientes potencia potencia potencia hGH(Y42I) Polvo liofilizado 21,75 mg 87,0 mg 174,0 mg Pearlitol 200 SD 15,0 mg 60,0 mg 120,0 mg Glicina 3,0 mg 12,0 mg 24,0 mg Pharmatosa DCL 22 172,125 1 12,5 mg 33,0 mg Avicel 1 12 172,125 1 12,5 mg 33,0 mg Croscarmelosa de sodio 12,0 mg 12,0 mg 12,0 mg Acido esteárico 4,0 mg 4,0 mg 4,0 mg Peso Total de Tableta 400,0 mg 400,0 mg 400,0 mg EJEMPLO 26 Perfiles Farmacocinéticos (PK) de Mutantes de hGH Resistentes a Proteasas en Administración Intraduodenal vers s Subcutánea El perfil farraacocinético después de una administración única intraduodenal (ID) o inyección subcutánea de ya sea proteína hGH nativa o una de las variantes de hGH resistente a proteasa fue comparado. Las variantes hGH usadas en el estudio son referidos por los siguientes números de variantes (la mutación de hGH correspondiente se muestra entre paréntesis) : variante 15 (D11N) , variante 18 (M14V) , variante 27 (L23I) , variante 28 (L23V) , variante 57 (Y42H) , variante 58 (Y42I) , variante 100 (L81V) , variante 143 (E119Q) y variante 148 (M125I) . El estudio involucró 120 machos rata de 8 semanas de edad Sprague-Dawley (20 grupos de 6 animales) y fue conducido en dos partes: 1) administración ID y 2) inyección subcutánea. 1. Parte I: Dosificación Intraduodenal Para la administración ID, 2mg por animal de una formulación líquida (1 mL/animal) de hGH nativa o variante hGH (15, 18, 27, 28, 58, 57, 100, 143 o 148) fue administrado a ratas de 8 semanas libre de patógenos Sprague-Dawley vía catéter intraduodenal. Las muestras de sangre fueron tomadas desde todos los animales para la determinación de los niveles plasmáticos de proteína hGH nativa y hGH variantes 15, 18, 27, 28, 58, 57, 100, 143 y 148 (estudios farmacocinéticos ) en suero de rata.

Los grupos de tratamiento (10 grupos de 6 ratas macho incluyendo un grupo de control) establecido para el estudio son presentados en la Tabla 104 : TABLA 104: Dosificación y detalle experimental para estudio ID Grupo Número de animales Tratamiento Dosis y número volumen 1 6 machos (1 a 6) hGH nativa 2mg l ml 2 6 machos (7 a 12) hGH variante 15 2mg l ml 3 6 machos (13 a 18) hGH variante 18 2mg l ml 4 6 machos ( 19 a 24) hGH variante 27 2mg l ml 5 6 machos (25 a 30) hGH variante 28 2mg l ml 6 6 machos (3 1 a 36) hGH variante 58 2mg l ml 7 6 machos (37 a 42) hGH variante 57 2mg l ml 8 6 machos (43 a 48) hGH variante 100 2mg l ml 9 6 machos (49 a 54) hGH variante 143 2mg l ml 10 6 machos (55 a 60) hGH variante 148 2mg l ml Las muestras de sangre se tomaron al día de administración 1 para cada grupo inmediatamente antes de la administración y en día 0,5, 1, 2, 4 y 8 horas después de la administración. A cada tiempo, una muestra de sangre (200 µ?) fue tomada vía un catéter en la vena yugular y colocada en un tubo frío con litio-heparina y fue gentilmente mezclado. 30 µ? de la solución anti-proteasa fue inmediatamente agregado. Los tubos se mantuvieron en hielo (dentro de los 30 minutos desde la colección) y fueron centrifugados a 2000 x g por 10 minutos a 4°C. El plasma fue colectado en 3 tubos de al menos 40 µ? cada uno y se mantuvo congelado a -20°C o -80°C hasta evaluarlo para presencia de hGH. La cantidad de hGH remanente en el plasma animal de cada tiempo fue determinada usando un kit ELISA anti-hGH (Roche Diagnostics GmbH, referencia n°11585 878 001) , de acuerdo al protocolo del fabricante. Los resultados de los Kit ELISA de hGH humano fueron expresados en pg/ml después de la extrapolación de la curva estándar de valores OD medidos con un espectrofotómetro a 405 nm. Usando un software con soluciones para análisis PK (SummitPK, Montrose, CO, USA) , los parámetros PK incluyendo Tmax, max, vida media y AUC fueron determinados para cada perfil farmacocinética . Los parámetros PK calculados del promedio de perfiles PK de animales obtenido después de la administración ID de la formulación líquida de las variantes de hGH y proteína hGH nativa son presentados en la Tabla 105.

TABLA 105: Parámetros PK para administración ID Intraduodenal Cmax AUC (0-t) Tma (2mg/anímales) (ng/ml) (h-ng/ml) (h) Variante 15 431 ,4 1548,7 0,5 Variante 18 367,6 1281 ,6 0,5 Variante 27 313,1 720,4 0,5 Variante 28 363,3 1278,3 0,5 Variante 57 361 ,3 1363,3 1 Variante 58 223,0 983,8 0,5 Variante 100 289,9 1067,0 0,5 Variante 143 274,7 575,0 1 Variante 148 266,8 1079,0 2 hGH nativa 22,3 16,2 0,5 Todas las variantes de hGH resistentes a proteasas evaluadas mostraron perfiles farmacocinéticos mejorados comparado con hGH nativa por administración intraduodenal. Por ejemplo, las variantes exhibieron valores de Cmax que fueron 12 a 20 veces aquel de hGH nativa y valores AUC que variaron entre 35 a 96 veces con respecto al de hGH nativa. Similar a los resultados observados para otros polipéptidos resistentes a proteasas, tal como IFN-a-2b (E41Q) descrito en los Ejemplos anteriores, las variantes resistentes a proteasa de hGH mostraron perfiles PK que sugieren una liberación sostenida del polipéptido resistente a proteasa desde el compartimiento intestinal a la circulación sistémica probablemente debido a una baja absorción acoplado con una susceptibilidad a proteasas intestinales reducida. 2. Parte II: dosificación subcutánea Para la administración subcutánea, 50 pg por animal de hGH nativa o variantes hGH (15, 18, 27, 28, 58, 57, 100, 143 o 148) en un volumen de 0,5 mL por animal fue administrado vía ruta subcutánea en ratas de 8 semanas libres de patógenos Sprague-Dawley . Las muestras de sangre fueron tomadas desde todos los animales para determinación de niveles plasmáticos de proteína hGH nativa y hGH variantes 15, 18, 27, 28, 58, 57, 100, 143 y 148 (estudios farmacocinéticos ) en suero de rata. Los grupos de tratamiento (10 grupos de 6 ratas macho incluyendo un grupo de control) establecidos para el estudio son presentados en la Tabla 106: Las muestras de sangre fueron tomadas en el día de administración 1 para cada grupo inmediatamente antes de la administración y a 0,5, 1, 2, 4 y 8 horas después de la administración. A cada tiempo, una muestra de sangre (200 µ?) fue tomada vía catéter en vena yugular y colocada en un tubo frío con litio-heparina y fue gentilmente mezclado. 30 µ? de solución anti-proteasa fue inmediatamente agregado. Los tubos se mantuvieron en hielo (hasta 30 minutos después de la colección) y centrifugado a 2000 g por 10 minutos a 4°C. El plasma fue colectado en 3 tubos de al menos 40 µ? cada uno y se mantuvo congelado a -20°C o -80°C hasta evaluarlos por la presencia de hGH. La cantidad de hGH remanente en el plasma animal a cada tiempo fue determinado usando un kit ELISA anti-hGH (Roche Diagnostics GmbH, referencia n°11585 878 001) , de acuerdo al protocolo del fabricante. Los resultados del Kit ELISA hGH fueron expresados en pg/ml después de extrapolación desde la curva estándar de valores OD medidos con un espectrofotómetro a 405 nm. Usando un software con soluciones para análisis PK (SummitPK, Montrose, CO, USA) , los parámetros PK incluyendo Tmax, Cmax, vida media y AUC fueron determinados para cada perfil farmacocinética . Los parámetros PK calculados del promedio de perfiles PK de animales obtenido después de la administración ID de la formulación líquida de las variantes de hGH y proteína hGH nativa son presentados en la Tabla 107.

TABLA 107: Parámetros PK para administración SC Subcutánea max AUC (o-t) Tmax (5(^g/animal) (ng/ml) (h-ng/ml) 00 Variante 15 355,6 2204,6 2 Variante 18 353,5 2494,3 1 Variante 27 370,9 1917,3 1 Variante 28 417,6 2335,8 1 Variante 57 433,6 2609,3 1 Variante 58 277,6 1845,2 1 Variante 100 329,5 1785,8 1 Variante 143 321 ,6 2066,9 1 Variante 148 322,0 2144,4 2 hGH nativa 362,4 205,1 0,5 Similar a los resultados observados para la administración ID, todas las variantes de hGH resistentes a proteasa evaluadas exhiben perfiles farmacocinéticos mejorados comparado con hGH nativa por administración subcutánea. Por ejemplo, las variantes exhibieron valores AUC que variaron entre 8 a 12 veces al valor para hGH nativa.

EJEMPLO 26 Estudio In Vivo Farmacocinético (PK) de hGH(Y42I) hGH (Y42H) en Ratas Normales Comparado con hGH Nativa Después de Administraciones Per Os (PO) e IV Se realizaron estudios farmacocinéticos en ratas macho de 8 semanas de edad Sprague-Dawley para comparar rutas per os (PO, formulaciones de sonda con líquido y cápsulas) e intravenosa (IV) de administración. El objetivo de este estudio fue investigar el perfil PK y calcular la biodisponibilidad de hGH variante 57 (Y42H) y hGH variante 58 (Y42I) . El estudio involucra 120 ratas macho 120 Sprague-Dawley (24 grupos de 5 animales) y fue conducido en dos partes: 1) per os para formulaciones líquidas y de cápsula y 2) inyección intravenosa. 1. Formulaciones hGH Preparaciones de hGH nativa y variantes de hGH usadas se establecen en las Tablas 108 (a-k) .

TABLA 108g: hGH(Y42I) Lote # hGH-003/06 (Grupo 12, 24) Fecha de Manufactura 06/06 Fecha Expiración 12/06 TABLA 108¡: hGH(Y42H) Lote # hGH57-002/06 (0,6 mg/cápsula (Grupo 14, 15), 0,3 mg/cápsula (Grupo 16), 0,15 mg/cápsula (Grupo 17)) Fecha de Manufactura 05/06 Fecha Expiración 1 1/06 Correspondencia MIU vs. 141 MIU = lmg mg Presentación Cápsulas con 0,6, 0,3 y 0,15 mg de hGH LEAD 58 solución en 7,5 mg/mL NaCl, 6 mg/mL sacarosa, 2,38 mg/mL fosfato de sodio dibásico, 0,44 mg/mL fosfato de sodio monobásico Administración Per os 2. Parte I: Dosificación Per os {PO) Para administración PO, se usaron ratas de 8 semanas de edad libres de patógenos Sprague-Dawley (301-325 g) a las que se administró una formulación líquida por sonda o una composición de cápsula. A los animales se les administró ya sea 1,2 mg de hGH nativa o 1,2, 0,6, 0,3 y 0,15 mg de ya sea hGH (Y42H) o hGH(Y42I) . Los grupos de tratamiento son presentados en la Tabla 109: grupos 1-9 fueron usados para administración PO de la formulación líquida y los grupos 13-21 para administración PO de la formulación en cápsula. Los números en paréntesis representan el número de referencia de los animales en el estudio.

TABLA 109: Dosificación y detalle experimental para estudio de administración oral Grupo Estudio principal Tratamiento Dosis y volumen número número de animales 1 5 (1 a 5) hGH nativa 1 ,2 mg en 1 mL 2 5 (6 a 10) hGH(Y42H) 1 ,2 mg en 1 mL 3 5 (1 1 a 15) hGH(Y42H) 0,6 mg en 1 mL 4 5 (16 a 20) hGH(Y42H) 0,3 mg en 1 mL 5 5 (21 a 25) hGH(Y42H) 0,15 mg en lmL 6 5 (26 a 30) hGH(Y42I) 1,2 mg en lmL 7 5 (31 a 35) hGH(Y42I) 0,6 mg en lmL 8 5 (36 a 40) hGH(Y42I) 0,3 mg en lmL 9 5 (41 a 45) hGH(Y42I) 0,15 mg en lmL 13 5 (61 a 65) hGH nativa 1 ,2 mg en lmL 14 5 (66 a 70) hGH(Y42H) 1 ,2 mg en 1 mL 15 5 (71 a 75) hGH(Y42H) 0,6 mg en 1 mL 16 5 (76 a 80) hGH(Y42H) 0,3 mg en lmL 17 5 (81 a 85) hGH(Y42H) 0,15 mg en lmL 18 5 (86 a 90) hGH(Y42I) 1,2 mg en l mL 19 5 (91 a 95) hGH(Y42I) 0,6 mg en lmL 20 5 (96 a 100) hGH(Y42I) 0,3 mg en 1 mL 21 5 (101 a 105) hGH(Y42I) 0,15 mg en lmL Las muestras de sangre fueron tomadas desde todos los animales para la determinación de niveles de plasma de la proteína hGH nativa, hGH (Y42H) o hGH(Y42I) en suero de rata. Las muestras de sangre fueron obtenidas en día de administración 1 para cada grupo inmediatamente antes de la administración y a 0,5, 1, 2, 4 y 6 horas después de la administración. 5 machos fueron muestreados por tiempo y por grupo. A cada tiempo, una muestra de sangre (200 L) fue tomada y colocada en un tubo frío con litio-heparina y mezclados gentilmente. Inmediatamente, 30 L de una solución anti-proteasa fue agregada. Los tubos se mantuvieron en hielo y centrifugados a 2000 x g para 10 minutos a 4°C dentro de 30 minutos de colección. El plasma fue colectado en tres tubos de al menos 40 µ? cada uno, que fue mantenido congelado a -20°C o -80°C. La cantidad de hGH remanente en plasma animal fue determinado usando un kit ELISA con anti-hGH (Mediagnost GmbH, referencia E022) , de acuerdo al protocolo del fabricante. Los resultados del Kit ELISA Humano GH fueron expresados en pg/ml después de extrapolación de los datos desde la curva estándar de valores OD medidos con un espectrofotómetro a 450 nm. Usando un software con soluciones para análisis PK (SummitPK, Montrose, CO, USA) , los parámetros PK incluyendo Tmax, Cmax, vida media y AUC fueron determinados para cada perfil farmacocinética . Los datos obtenidos después de administración PO de formulación líquida para hGH(Y42I) y hGH (Y42H) (a dosis de 1,2, 0,6, 0,3 y 0,15 mg por rata) son presentados en las Tablas 110a y 110b, respectivamente. Estos datos fueron comparados con los datos obtenidos para la proteína hGH nativa (a una dosis única de 1,2 mg por rata) . Los perfiles PK de hGH (Y42I) y proteína hGH nativa detectados en la circulación sanguínea sistémica por ensayo ELISA representa el promedio de ratas macho para cada proteína. Los parámetros PK calculados desde el promedio de perfiles PK obtenidos después de administración en formulación líquida de hGH(Y42I), hGH (Y42H) y proteína hGH nativa son presentados en las Tablas 110a y 110b.

TABLA 110a: Parámetros PK para administración oral líquida Formulación hGH(Y42I) hGH nativa líquida Dosis (mg) 1 ,2 0,6 0,3 0,15 TABLA 110b: Parámetros PK para administración oral líquida Formulación hGH(Y42H) hGH nativa líquida Dosis (mg) 1 ,2 0,6 0,3 0, 15 1 ,2 Cmax (ng/ml) 1030,1 958,6 461 ,7 378,0 Vida media (h) 3, 1 2,5 3,0 1 ,9 AUCexpoío-oo) (ng- 4392,3 3446,1 2130,0 1280,7 Los datos obtenidos después de administración PO de formulación en cápsula para hGH(Y42I) y hGH (Y42H) (a dosis de 1,2, 0,6, 0,3 y 0,15 mg por rata) son presentados en las Tablas Illa y 111b, respectivamente.

Estos datos fueron comparados con datos obtenidos para proteína hGH nativa (en una dosis única de 1,2 mg por rata) . Los perfiles PK hGH(Y42I) y proteína hGH nativas detectadas en la circulación sanguínea sistémica por ensayo ELISA representa el promedio de ratas macho para cada proteína. Los parámetros PK calculados desde el promedio de los perfiles PK de los animales obtenidos después de la administración de la formulación en cápsula de hGH(Y42I), hGH (Y42H) y proteína hGH nativa son presentados en las Tablas Illa y 111b.

TABLA Il la: Parámetros PK para administración oral de cápsula Formulación de hGH(Y42I) hGH nativa cápsula Dosis (mg) 1 ,2 0,6 0,3 0, 15 1 ,2 Cmax (ng/ml) 1360,0 916,8 732,6 829,0 - Vida media (h) 4, 1 2,8 2,4 0,7 - AUC expo(O-oo) (ng- 4970,5 3685,0 2204,5 930,6 - h/mt) AUC(o.t) (ng- /ml) 2794,2 2587,9 1755,3 804,2 - Tmax (h) 0,5 0,5 0,5 0,5 TABLA 111b: Parámetros PK para administración oral de cápsula Formulación de hGH(Y42H) hGH nativa cápsula Dosis (mg) 1 ,2 0,6 0,3 0,15 1 ,2 Cmax (ng/ml) 454,8 1082,3 nd 586,8 Vida media (h) 3,5 2,5 nd 1 ,2 AUCeip„(o-8) (ng- /ml) 1996,5 2908, 1 nd 1253, 1 AUC(0.«) (ng-h/ml) 1406,3 2217,3 nd 103 1 ,5 - Tmax (h) 0,5 1 nd 1 nd: no se calcularon parámetros PK para el perfil PK obtenido con la dosis 0,3 mg para variante 57 debido a la falta de resultados del ensayo ELISA para todas las muestras de sangre de las ratas a los tiempos 2, 4 y 6 h Tanto para la formulación líquida como para la cápsula, se detectó una concentración de hGH remanente y dependiente de la dosis en el plasma de rata después de administración PO de hGH(Y42I) y hGH(Y42H) mientras no se observó señal de proteína hGH nativa en el plasma de las ratas en tratamiento. Además , un aumento en la vida media dependiente de la dosis de hGH(Y42I) y hGH (Y42H) después de administración PO con ambas formulaciones de cápsula y líquida comparado con ruta intravenosa (ver más adelante) que apoya fuertemente la existencia de liberación sostenida de hGH(Y42I) y hGH (Y42H) desde el compartimiento intestinal a la circulación sistémica relacionada a una lenta absorción acoplada con la resistencia a proteasas intestinales. 3. Parte II: Dosificación Intravenosa Para la administración IV, ratas de 8 semanas de edad libres de patógeno Sprague-Dawley (301-325 g) fueron inyectadas i.v. con 0,1 mL de una solución de 100 pg/ml hGH (ya sea hGH nativa, hGH (Y42H) , o hGH(Y42I)) por animal (es decir una dosis de 10 pg) . El tratamiento de grupos es presentado en la Tabla 112 para la dosificación IV. Los números en paréntesis representan los números de referencia de los animales en el estudio.

Las muestras de sangre se tomaron de todos los animales para la determinación de niveles plasmáticos de la proteína hGH nativa, hGH(Y42H) o hGH(Y42I) en suero de rata. Las muestras de sangre fueron tomadas el día de administración 1 para cada grupo inmediatamente después de la administración y a 0,083, 0.5, 1, 2, y 4 horas después de la administración. 5 machos fueron muestreados por tiempo y por grupo. A cada tiempo, una muestra de sangre (200 L) fue tomada y colocada en un tubo helado con litio-heparina y mezclado gentilmente. Inmediatamente, 30 pL de una solución anti-proteasa fue agregada. Los tubos se mantuvieron en hielo y centrifugaron 2000 x g por 10 minutos a 4°C dentro de los 30 minutos de colección. El plasma fue colectado en tres tubos de al menos 40 µ? cada uno, que se mantuvieron congelados a -20°C o -80°C. La cantidad de hGH en plasma animal fue determinada usando un kit ELISA anti-hGH (Mediagnost GmbH, referencia E022), de acuerdo al protocolo del fabricante. Los resultados del kit ELISA de GH humana fueron expresados en pg/ml después de extrapolación desde la curva estándar de OD medidos con el espectrofotómetro a 450nm. Usando un software con soluciones para análisis PK (SummitPK, Montrose, CO, USA) , los parámetros PK incluyendo Tmax, Cmax, vida media y AUC fueron determinados para cada perfil farmacocinético . Los datos obtenidos después de administración IV de hGH (Y42H) , hGH(Y42I), y proteína hGH nativas (dosis de 10 g/animal) son presentados en Tabla 113. Los perfiles PK de proteínas hGH detectadas en circulación sanguínea sistémica por ensayo ELISA representan el promedio de ratas macho para cada proteína. Los parámetros PK calculados desde el promedio de los perfiles PK de los animales son presentados en la Tabla 113.

TABLA 113: Parámetros PK para administración IV hGH(Y42I) - 10 µ8 1357,4 1158,5 0,6 hGH(Y42H) - - 10 µ8 1153,3 1166,3 0,7 hGH nativa - 10 µg 2088,3 331,0 0,11 valor de concentración inicial (Cil obtenido para hGH(Y42I) fue similar a hGH (Y42H) (1357,4 ng/ml para hGH(Y42I) versus 1153,3 ng/ml para hGH (Y42H) ) . Sin embargo, proteína hGH nativa mostró valores de Ci mayores comparado con ambos hGH(Y42I) y hGH (Y42H) (2088,3 ng/ml para hGH nativa comparado con 1357,4 ng/ml para hGH(Y42I)). Un aumento de AUCeXpo(o-8) alrededor de 3,5 veces fue observado en ratas inyectadas con ya sea hGH(Y42I) o hGH(Y42H) comparado con proteína hGH nativa, Similarmente , ambos hGH(Y42I) o hGH(Y42H) exhibieron una vida media aumentada, 5,5 veces y 6,4 veces, respectivamente, comparado con proteína hGH nativa. 4. Datos Farmacocinéticos de Análisis de Biodisponibilidad de PO versus IV Para cada dosis de hGH(Y42I) y hGH (Y42H) administrado PO en ambas formulaciones de cápsula y líquido a las ratas, el porcentaje de biodisponibilidad de hGH(Y42I) comparado con administración IV fue calculado usando las siguientes ecuaciones: Biodisponibilidad (en %) relacionado a Cmax /dosis)hGH / (Cmax/dosis) hGH- IV I x XUU Biodisponibilidad (en %) relacionado a AUC ( (AUC/dosis)hGH/ (AUC/dosis)hGH-iv) x 100 Biodisponibilidad (en %) relacionado a AUC y relativo a IFN-alfa nativo ( (AUC/dosis) hGHmut / (AUC/dosis)nativo-IV) x 100 Por cada dosis de hGH(Y42I) y hGH (Y42H) formulaciones líquidas administradas PO a ratas, el porcentaje de biodisponibilidad de hGH(Y42I) y hGH(Y42H) comparado con administración IV fue calculado relacionado a Cmax y AUC. Los resultados son presentados en la Tabla 114a para hGH (Y42H) (etiquetado hgh-57 en la Tabla) y Tabla 114b para hGH(Y42I) (etiquetado hgh-58 en la Tabla) .

TABLA 114a: Datos de biodisponibilidad para formulaciones líquidas de TABLA 114b: Datos de biodisponibilidad para formulaciones líquidas de Por cada dosis de formulaciones en cápsula de hGH(Y42I) y hGH (Y42H) administradas PO a ratas, el porcentaje de biodisponibilidad de hGH(Y42I) y hGH(Y42H) comparado con administración IV fue calculado relacionado a Cmax y AUC. Los resultados son presentados en Tabla 115a para hGH (Y42H) (etiquetado hgh-57 en la Tabla) y Tabla 115b para hGH(Y42I) (etiquetado hgh-58 en la Tabla) .

TABLA 115a: Datos de biodisponibilidad para formulaciones en cápsula de hGH(Y42H) TABLA 115b: Datos de biodisponibilidad para formulaciones en cápsula hGH(Y42I) hgh-58 en cápsulas hgh-58 IV hgh nativa IV Dosis (mg) 1 ,2 0,6 0,3 0,01 0,01 AUC(o >)expo (ng-hr/mL) 4970,5 3685,0 2204,5 1 158,5 33 1 ,0 Cmal (Ul/ml) 1360 916,8 732,6 1357,4 2088,3 Cm„/dosis 1 133 1528 2442 135740 208830 ((Cmal/dosis)58/(Cmal/dosis)5,.,v)x l00 0,8 1 , 1 1 ,8 AUC/dosis 4142 6142 7348 1 15850 33 100 (AUC/dosis)5,/(AUC/dosis)58.,v)x l00) 3,6 5,3 6,3 (AUC/dosis)58/(AUC/dosis)N„livo.,v)x l00) 12,5 18,6 22,2 EJEMPLO 27 Estudio Farmacocinético (PK) In Vivo (PK) de hGH(Y42I) y hGH (Y42H) en Ratas Normales Comparado con hGH nativa Después de Administraciones SC e IV Los estudios farmacocinéticos fueron realizados en ratas macho de 8 semanas de edad Sprague-Dawley para comparar las rutas de administración subcutánea (SC) e intravenosa (IV) . El objetivo del estudio fue investigar los perfiles PK para la variante 57 de hGH (Y42H) y hGH variante 58 (Y42I) . El estudio involucró 72 ratas macho Sprague-Dawley (6 grupos de 12 animales) y fue conducido en dos partes: 1) subcutánea y 2) inyección intravenosa. 1. Formulaciones de hGH Usadas en el estudio Preparaciones de hGH nativa y variantes hGH usadas en el estudio son presentados en las Tablas 116 (a-f ) .

Parte I: Dosificación subcutánea Para administración SC, a ratas de 8 semanas de edad libres de patógenos Sprague-Dawley (301-325 g) se les administró una formulación líquida vía inyección subcutánea. A los animales fueron administrados con 0,5 mL de solución de 100 pg/mL de ya sea hGH nativa, hGH (Y42H) o hGH(Y42I). Tres grupos de 12 animales fueron usados . Los grupos de tratamiento son presentados en la Tabla 117. Los números en paréntesis son las referencias de los animales en el estudio.

TABLA 117: Dosificación y detalle experimental para estudio SC Grupo Estudio principal Tratamiento Dosis y volumen número número de animales 1 12 machos ( 1 a 12) hGH nativa 100 µ^p?? 0,5ml 2 12 machos ( 13 a 24) hGH(Y42H) 100 µ^??? 0,5ml 3 12 machos (25 a 36) hGH(Y42I) 100 µ^??\ 0,5ml Las muestras de sangre fueron tomadas desde animales para la determinación de niveles plasmáticos de hGH nativa, hGH (Y42H) o hGH(Y42I) en suero de rata. Las muestras de sangre fueron tomadas el día de administración 1 para cada grupo inmediatamente después de la administración y a 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 24 y 32 horas después de la administración. 6 machos fueron muestreados por tiempo y por grupo. Para el perfil farmacocinético completo para cada proteína (hGH, hGH (Y42H) o hGH(Y42I)) dosis, el grupo de 12 ratas fue muestreado como sigue: un grupo de 6 machos colectados a pre-dosis, 0,5, 1, 2, 16 y 48 horas y otro grupo de 6 machos a 0,25, 4, 8, 12, 24 y 32 horas. En cada tiempo, una muestra de sangre (200 pL) fue tomada y colocada en un tubo frío con litio-heparina y mezclado gentilmente. Inmediatamente, 30 L de una solución anti-proteasa fue agregada. Los tubos se mantuvieron en hielo y se centrifugaron a 2000 x g por 10 minutos a 4°C dentro de los 30 minutos después de la colección. El plasma fue colectado en tres tubos de al menos 40 µ? cada uno, que fueron mantenidos congelados a -20°C o -80°C. La cantidad de hGH remanente en el plasma animal fue determinado usando un kit ELISA anti-hGH (Mediagnost GmbH, referencia E022) , de acuerdo al protocolo del fabricante. Los resultados del kit ELISA para GH humana fueron expresados en pg/ml después de extrapolación de la curva estándar de valores OD medidos con un espectrofotómetro a 450 nm. Usando un software con soluciones para análisis PK (SummitPK, Montrose, CO, USA) , los parámetros PK incluyendo Tmax, Cmax, vida media y AUC fueron determinados para cada perfil farmacocinético . Los datos obtenidos después de la administración SC de hGH(Y42I) y proteína hGH nativas (a una dosis de 100 g/ml) son presentados en la Tabla 118. Los perfiles PK de hGH(Y42I) y proteína hGH nativas detectados en la circulación sanguínea sistémica por ensayos ELISA representan el promedio de ratas macho para cada proteína. Los parámetros PK calculados desde el promedio de los perfiles PK de animales obtenidos después de la administración SC de hGH(Y42I) y proteína hGH nativas es presentado en la Tabla 118. La determinación de la concentración de hGH remanente en suero de rata después de administración SC con hGH(Y42H) no fue realizada. TABLA 118: Parámetros PK para administración SC g Cmax AUC(o-oo) AUC(o-t) Vida media Tmax (ng/ml) (h-ng/ml) (h-ng/ml) (h) (h) hGH(Y42I) - 10(^g/m 132,8 1706,6 1704,4 14,5 1 * í¡?nH /atíVa " 134,9 249 249,2 0,7 0,5 100µ8/??1 ,2 *E1 valor de Tmax fue considerado como 1 h en lugar de 2 h (cálculo del software PK) tomando en cuenta las heterogeneidades entre animales de los perfiles PK El valor de Cmax obtenido para hGH(Y42I) fue similar a proteína hGH nativa (132,8 ng/ml para hGH(Y42I) comparado con 134,9 ng/ml para hGH nativa). Un aumento de AUC(0-t) alrededor de 6,8 veces fue observado para ratas inyectadas con hGH(Y42I) comparado con proteína hGH nativa (1706,6 ng-h/ml para hGH(Y42I) versus 249,2 ng-h/ml para proteína hGH nativa). Similarmente , la vida media para hGH(Y42I) fue aumentada 20,7 veces comparado con proteína nativa (14,5 h para hGH(Y42I) versus 0,7 h para hGH nativa) . 3. Parte II: Dosificación Intravenosa Para administración SC, a ratas de 8 semanas de edad libres de patógenos Sprague-Dawley (301-325 g) se administró una formulación líquida vía inyección intravenosa. A los animales se les administró con 0,3 mL de 50 µg/mL una solución de ya sea hGH nativa, hGH (Y42H) o hGH(Y42I) . Tres grupos de 12 animales fueron usados . Los grupos de tratamiento son presentados en la Tabla 119. Los números entre paréntesis representa el número de referencia del animal en el estudio.

TABLA 119: Dosificación y detalle experimental para estudio IV Grupo número Estudio Principal Tratamiento Dosis y volumen Número de animales 4 12 machos (37 a 48) hGH nativa 50 µ^??? 0,3ml 5 12 machos (49 a 60) hGH variante 57 50 µ^? ? 0,3ml 6 12 machos (61 a 72) hGH variante 58 50 µ^??? 0,3 mi Las muestras de sangre fueron tomadas desde los animales para determinación de niveles de plasma de hGH nativa, hGH (Y42H) o hGH(Y42I) en suero de rata. Las muestras de sangre fueron tomadas en el día de administración 1 para cada grupo inmediatamente antes de la administración y a 0,05, 0,083, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 4, 6, 8 y 12 horas después de la administración. 6 machos fueron muestreados por tiempo y grupo. Para el perfil farmacocinético completo para cada proteína (hGH, hGH (Y42H) o hGH(Y42I)) dosis, el grupo de 12 ratas fue muestreado como sigue: un grupo de 6 machos colectados a pre-dosis, 0,083, 0,5, 1,5, 6 y 8 horas y otro grupo de 6 machos a 0,05, 0,25, 1, 2, 4 y 12 horas. Para cada tiempo, una muestra de sangre (200 L) fue tomada y colocada en un tubo frío con litio-heparina y mezclado gentilmente. Inmediatamente, 30 pL de una solución anti-proteasa fue agregada. Los tubos se mantuvieron en hielo y se centrifugaron a 2000 x g por 10 minutos a 4°C dentro de los 30 minutos de la colección. El plasma fue colectado en tres tubos de al menos 40 µ? cada uno, que fue mantenido congelado a -20°C o -80°C. La cantidad de hGH remanente en el plasma animal fue determinada usando un kit ELISA anti-hGH (Mediagnost GmbH, referencia E022) , de acuerdo al protocolo del fabricante. Los resultados del kit ELISA para GH humana fueron expresados en pg/ml después de extrapolación desde la curva estándar de valores OD medidos en un espectrofotómetro a 450 nm. Usando un software con soluciones para análisis PK (SummitPK, Montrose, CO, USA) , los parámetros PK incluyendo Tmax, Cmax, vida media y AUC fueron determinados para cada perfil farmacocinético . Los datos obtenidos después de la administración IV de hGH(Y42I) y proteína hGH nativas (a una dosis de 50 pg/ml) es presentado en la Tabla 120. Los perfiles PK de hGH(Y42I) y proteína hGH nativas detectados en circulación sanguínea sistémica por ensayo ELISA representa el promedio de ratas macho para cada experimento. Los parámetros PK calculados desde los parámetros PK promedio de animales obtenidos después de administración IV de hGH(Y42I) y proteína hGH nativas son presentados en la Tabla 120. La determinación de la concentración de hGH remanente en el suero de rata después de administración IV con hGH (Y42H) no fue realizada.

TABLA 120: Parámetros PK para administración IV hGH nativa - 50µ ml 338,0 56, 1 0,25 Los valores de concentración inicial (Ci) obtenidos para hGH(Y42I) fue similar a proteina hGH nativa (303,4 ng/ml para hGH(Y42I) comparado con 338,0 ng/ml para hGH nativa) . Un aumento de AUC(0-8) alrededor de 3 , 7 veces fue observado para ratas inyectadas con hGH(Y42I) comparado con proteína hGH nativa (209,8 ng-h/ml para hGH(Y42I) versus 56,1 ng-h/ml para proteína hGH nativa) . Similarmente , la vida media para hGH(Y42I) fue aumentado en alrededor de 3 veces comparado con proteína nativa (0,73 h para hGH(Y42I) versus 0,25 h para hGH nativa) .

EJEMPLO 27 Estudio In Vivo de Actividad de hGH(Y42I) en Ratas Hipofisectomizadas Comparado con hGH nativa Después de Administraciones Oral y SC La deficiencia de hormona del crecimiento en humanos es asociado con adiposidad aumentada y densidad mineral ósea disminuida. Ratas hipofisectomizadas fueron usadas como un modelo de deficiencia de hormona pituitaria para estudiar los efectos de la deficiencia de la hormona de crecimiento en hueso (Appiagyei-Dankah y cois. (2003) Am. J. Physiol. Endocrinol Metab. , 284:566-573). Se ha demostrado que la administración de hormona de crecimiento en el modelo de rata hipofisectomizada tiene efectos estimuladores en crecimiento y recambio óseo y puede prevenir las alteraciones esqueléticas en ratas hipofisectomizadas (Cheng y cois. (1997) Anat . Rec . , 249: 163-172). Los efectos de las formulaciones de dosificación de polipéptidos de hormona del crecimiento resistentes a proteasas administrados por ruta subcutánea u oral en revertir los efectos de la deficiencia de hormona del crecimiento en el modelo animal hipofisectomizado fueron evaluados.

A las ratas Sprague-Dawley hipofisectomizadas se les administró formulaciones líquidas (descritas en Ejemplo 26) de hGH nativa hGH(Y42I) por ruta oral (sonda líquida) subcutánea. Los grupos de tratamiento fueron como sigue: 1) 1200 pg/rata hGH nativa (oral) ; 2) 300 pg/rata hGH(Y42l) (oral); 3) 600 pg/rata hGH(Y42l) (oral); 4) 16 pg/rata hGH nativa (subcutáneo); y 5) vehículo solo como control. Cambios en el peso corporal fueron monitoreados diariamente a 1, 2, 3, 4, 5, 5, 7, y 8 días después de la administración del polipéptido. Los resultados son mostrados en Figura 2. Los resultados de este experimento demuestran que el tratamiento de ratas hipofisectomizadas tratadas subcutáneamente con hormona de crecimiento nativa a 16 pg/rata resultó en un aumento de peso corporal, evidenciando así la actividad de la hormona de crecimiento en este modelo. En contraste, la administración de hormona de crecimiento oralmente, incluso en dosis tan altas como 1200 pg/rata, no mostró un aumento en peso corporal. La administración de hGH(Y42l) oralmente en dosis de 300 pg/rata y 600 pg/rata resultó en un aumento de peso corporal en niveles que fueron similares a los vistos en ratas a las que se administró hGH nativa subcutánea. Este resultado establece que una formulación de dosificación de hGH resistente a proteasas de 15 - 40 veces que la de hGH nativa subcutánea es suficiente para entregar una actividad y efecto similar en un modelo de deficiencia de hormona de crecimiento.

Ya que varias modificaciones serán aparentes para aquéllos expertos en el arte, se pretende que esta invención esté limitada sólo por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención, considera como novedad y por lo tanto, se reclama propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Una formulación de dosificación oral que comprende una cantidad de un polipéptido terapéutico suficiente, cuando se administra por vía oral a un sujeto, para alcanzar niveles terapéuticamente efectivos en el torrente sanguíneo en el sujeto, CARACTERIZADA porque: la proteína terapéutica está modificada en su secuencia primaria de aminoácidos, por medio de lo cual se hace más resistente a proteasas que en ausencia de las modificaciones, y la proteína puede alcanzar niveles terapéuticamente efectivos en el torrente sanguíneo después de la administración oral ; y la cantidad es de alrededor de 10-100 veces la dosis subcutánea para la misma indicación y para el mismo polipéptido terapéutico que no ha sido modificado para ser resistente a proteasas.

2. La formulación de dosificación de la reivindicación 1, CARACTERIZADA porgue el polipéptido terapéutico contiene una o dos sustituciones de aminoácidos en su secuencia que lo hacen más resistente frente a la acción de proteasas que en ausencia de las modificaciones.

3. La formulación de dosificación de la reivindicación 1, CARACTERIZADA porque la cantidad es 10-50 veces la dosis subcutánea para la misma indicación y para el mismo polipéptido terapéutico.

4. La formulación de dosificación de la reivindicación 1, CARACTERIZADA porque la cantidad es 15-40 veces la dosis subcutánea para la misma indicación y para el mismo polipéptido terapéutico.

5. La formulación de dosificación de la reivindicación 1, CARACTERIZADA porque: la formulación de dosificación comprende una pluralidad de unidades de dosificación; y cada unidad de dosificación comprende una cantidad parcial de la cantidad total del polipéptido terapéutico en la formulación de dosificación.

6. La formulación de dosificación de la reivindicación 5, CARACTERIZADA porque la unidad de dosificación es una tableta o cápsula.

7. La formulación de dosificación de la reivindicación 6, CARACTERIZADA porque la unidad de dosificación posee un recubrimiento entérico.

8. La formulación de dosificación de la reivindicación 1, CARACTERIZADA porque: la formulación de dosificación comprende una o más unidades de dosificación que contienen el polipéptido terapéutico; y cada unidad de dosificación es una tableta o cápsula .

9. La formulación de dosificación de la reivindicación 8, CARACTERIZADA porque la unidad de dosificación es una tableta.

10. La formulación de dosificación de la reivindicación 9, CARACTERIZADA porque la unidad de dosificación posee un recubrimiento entérico.

11. La formulación de dosificación de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, CARACTERIZADA porque el polipéptido terapéutico es una citoquina o un factor de coagulación sanguínea.

12. La formulación de dosificación de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, CARACTERIZADA porque el polipéptido terapéutico se selecciona entre interleuquina-10 , un interferón- ß ; un interferón alfa, interferón gamma, factor estimulador de colonias de granulocitos , factor inhibidor de leucemia, una hormona de crecimiento, factor neurotrófico ciliar, leptina, insulina, oncostatina M, relaxina, interleuquina- 6 , interleuquina- 12 , eritropoyetina, factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos , interleuquina-2 , interleuquina-3 , interleuquina-4 , interleuquina- 5 , interleuquina- 13 , ligando de Flt3, un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo y factor de células troncales.

13. La formulación de dosificación de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, CARACTERIZADA porque las modificaciones para aumentar la resistencia a proteasas son las únicas modificaciones en la secuencia de aminoácidos en comparación con un polipéptido de tipo salvaje o polipéptido no modificado para exhibir una resistencia aumentada a proteasas.

14. La formulación de dosificación de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, CARACTERIZADA porque el polipéptido incluye modificaciones adicionales en la secuencia de aminoácidos que alteran propiedades distintas a la resistencia a proteasas, en comparación con un polipéptido de tipo salvaje o polipéptido no modificado para exhibir resistencia aumentada frente a proteasas .

15. La formulación de dosificación de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, CARACTERIZADA porque el polipéptido incluye modificaciones que agregan nuevos sitios de glicosilación al polipéptido, por medio de las que el polipéptido es hiperglicosilado.

16. La formulación de dosificación de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, CARACTERIZADA porque el polipéptido resistente a proteasas se selecciona entre variantes resistentes a proteasas de factores de coagulación, citoquinas, factores de crecimiento, hormonas, hidrolasas, inmunoglobulinas , polipéptidos inhibidores, polipéptidos nucleares y proteasas.

17. La formulación de dosificación de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, CARACTERIZADA porque el polipéptido no modificado se selecciona entre interleuquina-10 (IL-10; ID SEC NO: 809), interferón beta (IFN-ß; ID SEC NO: 147), interferón alfa-2a (IFNa-2a; ID SEC NO: 2162), interferón alfa-2b (IFNa-2b; ID SEC NO: 2067), interferón gamma (IFN-?; ID SEC NO: 661), factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF ID SEC NO: 47) , factor inhibidor de leucemia (LIF; ID SEC NO: 1148) , hormona del crecimiento (GH; ID SEC NO: 1260) , factor neurotrófico ciliar (CNTF; ID SEC NO: 1) , leptina (ID SEC NO: 1126) , oncostatina M (ID SEC NO: 1181) , interleuquina- 6 (IL-6; ID SEC NO: 1080), interleuquina- 12 (IL-12; ID SEC NO: 860) ; eritropoyetina (EPO; ID SEC NO: 1886) , factor estimulador de colonias de granulocitos -macrófagos (GM-CSF; ID SEC NO: 85), interleuquina- 2 (IL-2; ID SEC NO: 946), interleuquina- 3 (IL-3; ID SEC NO: 995), interleuquina-4 (IL-4; ID SEC NO interleuquina-5 (IL-5; ID SEC NO: interleuquina-13 (IL-13; ID SEC NO: 917), de Flt3 (ID SEC NO: 118) y factor de troncales (SCF; ID SEC NO: 1215) .

18. La formulación de dosificación de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, CARACTERIZADA porque el polipéptido se selecciona a partir de los polipéptidos terapéuticos modificados cuyas secuencias se exponen en cualquiera de los ID SEC NOS: 2-46, 48-84, 86-117, 119-146, 148-660, 662-808, 810-859, 861-916, 918-945, 947-994, 996-1017-, 1019-1043, 1045-1079, 1081-1125, 1127-1147, 1149-1180, 1182-1214, 1216-1259, 1261-1885, 1887- 1981, 1983-2066, y 2176-2182.

19. La formulación de dosificación de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, CARACTERIZADA porque el polipéptido modificado es IFN- a2b u hormona del crecimiento humana.

20. La formulación de dosificación de la reivindicación 19, CARACTERIZADA porque el polipéptido es un IFN-a2b que contiene una modificación que es o corresponde a E41Q del ID SEC NO: 2067.

21. La formulación de dosificación de la reivindicación 19, CARACTERIZADA porque el polipéptido terapéutico modificado es una hormona del crecimiento humana que contiene una modificación que es o corresponde a Y42I del ID SEC NO: 1260.

22. La formulación de dosificación de la reivindicación 20, CARACTERIZADA porque la secuencia de aminoácidos del IFN-a2b se expone en el ID SEC NO: 1995.

23. La formulación de dosificación de la reivindicación 21, CARACTERIZADA porque la secuencia de la hormona del crecimiento se expone en el ID SEC NO: 1318.

24. Una tableta o cápsula que comprende 10-100 g de un interferón-a (IFN-a), CARACTERIZADA porque el IFN-a es resistente frente a proteasas en virtud de modificaciones en su secuencia primaria de aminoácidos.

25. La tableta o cápsula de la reivindicación 24, CARACTERIZADA porque el IFN-a es IFN- 2a o IFN- 2b.

26. La tableta o cápsula de la reivindicación 24, CARACTERIZADA porque comprende un segundo agente terapéutico para la misma indicación que el interferón.

27. La tableta o cápsula de la reivindicación 26, CARACTERIZADA porque el segundo agente terapéutico se selecciona entre un análogo de nucleósido, un L-nucleósido, un antagonista de un receptor de interferón de tipo II, un antagonista de factor de necrosis tumoral (TNF) , timosina-a, un inhibidor de SAPK, amantidina, un inhibidor de NS3, un inhibidor de NS5B y un inhibidor de alfa-glucosidasa .

28. La tableta o cápsula de la reivindicación 27, CARACTERIZADA porque el análogo de nucleósido es ribavirina.

29. Una tableta o cápsula de la reivindicación 24, CARACTERIZADA porque comprende 10-50 µ? de un polipéptido de interferón-a resistente a proteasas .

30. La tableta o cápsula de la reivindicación 25, CARACTERIZADA porque el IFN-a2b comprende además modificaciones adicionales por medio de las cuales es hiperglicosilado .

31. La tableta o cápsula de la reivindicación 24, CARACTERIZADA porque posee un recubrimiento entérico.

32. La tableta o cápsula de la reivindicación 24 o de la reivindicación 25, CARACTERIZADA porque el IFN-a2b contiene una modificación que es o corresponde a E41Q del ID SEC NO: 2067.

33. La tableta o cápsula de la reivindicación 24 o de la reivindicación 25, CARACTERIZADA porque el IFN-a2b comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en el ID SEC NO: 1995.

34. Una tableta o cápsula que contiene 1-50 mg, 10-50 mg, 10-40 mg, 15-35 mg, 1-40 mg, 1-45 mg, 5-30 mg, 10-20 mg o 3-30 mg de hormona del crecimiento humana, CARACTERIZADA porque la hormona del crecimiento humana es resistente a proteasas.

35. La tableta o cápsula de la reivindicación 34, CARACTERIZADA porque comprende un segundo agente terapéutico para la misma indicación que la hormona del crecimiento.

36. La tableta o cápsula de la reivindicación 35, CARACTERIZADA porque el segundo agente terapéutico se selecciona entre un análogo de hormona liberadora de gonadotropina (GNRH) , un factor de crecimiento tipo insulina 1 (rhIGF-1) , un péptido liberador de hormona del crecimiento (GRP) , un agente de regulación de ácidos grasos libres, una hormona liberadora de hormona luteinizante y un esteroide anabólico.

37. La tableta o cápsula de la reivindicación 34, CARACTERIZADA porque la tableta o cápsula contiene 3 mg, 12 mg, 24 mg o 30 mg del polipéptido de hormona del crecimiento resistente a proteasas .

38. La tableta o cápsula de la reivindicación 34, CARACTERIZADA porque posee un recubrimiento entérico.

39. La tableta o cápsula de la reivindicación 34, CARACTERIZADA porque la hormona del crecimiento comprende además modificaciones adicionales por medio de las cuales es hiperglicosilada .

40. La tableta o cápsula de la reivindicación 34, CARACTERIZADA porque la hormona del crecimiento contiene una modificación que es o corresponde a Y42I del ID SEC NO: 1260.

41. La tableta o cápsula de la reivindicación 34, CARACTERIZADA porque la hormona del crecimiento humana comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en el ID SEC NO: 1318.

42. El uso de la formulación de dosificación de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 o de la tableta o cápsula de cualquiera de las reivindicaciones 24-31 y 34-41 para el tratamiento de una enfermedad.

43. El uso de un polipéptido terapéutico modificado para el tratamiento de una enfermedad, CARACTERIZADO porque : el polipéptido terapéutico está modificado en su secuencia primaria de aminoácidos, por medio de lo cual se hace más resistente a proteasas que en ausencia de las modificaciones y el polipéptido puede alcanzar niveles terapéuticamente efectivos en el torrente sanguíneo después de la administración oral; la cantidad del polipéptido terapéutico en la formulación es 15-40 veces la dosis subcutánea para la misma indicación y para el mismo polipéptido terapéutico que no ha sido modificado para ser resistente a proteasas.

44. El uso de un polipéptido terapéutico modificado para la formulación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, CARACTERIZADO porque: el polipéptido terapéutico está modificado en su secuencia primaria de aminoácidos, por medio de lo cual se hace más resistente a proteasas que en ausencia de las modificaciones y el polipéptido puede alcanzar niveles terapéuticamente efectivos en el torrente sanguíneo después de la administración oral; y la cantidad del polipéptido terapéutico en la formulación es 15-40 veces la dosis subcutánea para la misma indicación y para el mismo polipéptido terapéutico que no ha sido modificado para ser resistente a proteasas.

45. Una formulación de dosificación CARACTERIZADA porque comprende una pluralidad de tabletas o cápsulas según cualquiera de las reivindicaciones 24-31 y 34-41.

46. El uso de la formulación de dosificación para el tratamiento de una enfermedad o condición para la cual se indica la administración de IFN-a o de hormona del crecimiento, CARACTERIZADO porque: el polipéptido es un IFN-a para un tratamiento para el que se indica IFN-a; y el polipéptido es hormona del crecimiento para un tratamiento en donde se indica hormona del crecimiento .