MX2007003279A - Carne producida mediante bioingenieria para consumo y un metodo para producir carne producida mediante bioingenieria para consumo. - Google Patents

Abstract

Se describe un producto de carne no humana producida mediante bioingenieria y un metodo para producir dicho producto de carne; el producto de carne comprende celulas de musculo que crecen ex vivo y que se utilizan para el consumo alimenticio; las celulas de musculo pueden crecer y unirse una estructura de soporte, y se pueden derivar a partir de cualquier celula no humana; el producto de carne tambien comprende otras celulas como celulas grasas o celulas de cartilago, o ambas, que crecen ex vivo junto con las celulas de musculo.

Description

CARNE PRODUCIDA MEDIANTE BIOINGENIERIA PARA CONSUMO Y UN MÉTODO PARA PRODUCIR CARNE PRODUCIDA MEDIANTE BIOINGENIERIA PARA CONSUMO CAMPO DE LA INVENCIÓN El campo de la presente invención se refiere a la producción y cosecha de productos de carne para consumo. En particular, se refiere a carne producida mediante bioingeniería para consumo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los productos de carne tales como res, puerco, cordero, aves de corral o pescado son productos convenientes para consumo de alimentos. Los productos de carne actualmente se producen a partir de animales enteros, lo cual es un método de producción altamente ineficiente debido a que una porción importante de todo el grano agricolamente producido se utiliza para consumo animal más que humano. En los Estados Unidos, por ejemplo, la alimentación de ganado justifica aproximadamente el 70% de todo el trigo, maíz, y otros granos producidos. Además, para producir 0.453 kilogramos de res, es necesario que el animal beba miles de kilogramos de agua y que aumente la alimentación del ganado. Mientras tanto, en todo el mundo, según se informa, más de 800 millones de personas están desnutridas y 50,000 personas mueren cada día por inanición. Los métodos actuales para producción de carne también son dañinos al ambiente. Los bosques tropicales se agotan a una velocidad de aproximadamente 46.5 m2 de bosque tropical para que crezca cada kilogramo de res. Asimismo, las técnicas modernas para pescar vida marina se han vuelto tan eficientes que los océanos y lagos están sobre-explotados. Las especies que alguna vez eran comunes, ahora están en peligro o están extintas. Los esfuerzos científicos actuales para enfrentar estos problemas se han enfocado en incrementar la efectividad de reproducción y crianza de ganado. Por ejemplo, se han utilizado hormonas de crecimiento para hacer que el ganado crezca más rápido y por lo tanto, consuma menos grano y agua. Las hormonas de crecimiento típicamente se inyectan en el ganado, pero también se han desarrollado nuevos métodos para introducir la hormona de crecimiento utilizando tecnologías de ingeniería genética tales como transgénica o clonación del animal entero. No obstante, los métodos actuales de producción de carne requieren agua, granos y tierra para criar el ganado. Otro problema con los métodos actuales de producción de carne involucra la contaminación de alimentos. Cada año, en promedio, cada americano se enferma y 9,000 personas mueren de algo que ingirieron. Para controlar la contaminación de alimentos, la estrategia actual del gobierno es inspeccionar la carne durante el procesamiento. Sin embargo, la USDA y la FDA, raramente regulan las granjas en donde se originan los patógenos debido a que carecen de las facultades reguladoras con respecto a las granjas. No obstante, excepto E. coli 0156:H7, las bacterias peligrosas son legalmente consideradas "inherentes" para la carne cruda. Sin embargo, dos de las "bacterias inherentes", - campylobacter y salmonella - justifican el 80% de todas las enfermedades y 75% de todas las muertes por consumo de carne y aves de corral. En la industria avícola, por ejemplo, se informa que se permite que el 25% de carne de pollos tiernos para asar y 45% de carne de pollo molida resulte positivo en salmonella. El Centro de Control de Enfermedades estima que campylobacter infecta 70% a 90% de todos los pollos. Las infecciones de campylobacter ocasionan retortijones, diarrea con sangre, y fiebre. Cada año en los Estados Unidos, la infección de campylobacter da como resultado aproximadamente 800 muertes. Las infecciones con campylobacter también pueden conducir al síndrome de Guillian-Barre, una enfermedad que requiere cuidado intensivo durante varias semanas. La incidencia de enfermedad grave y muerte a partir de estas bacterias puede incrementar a medida que se desarrollan más cepas resistentes a antibióticos. Esto ha ocasionado que algunos científicos cuestionen el continuo uso de antibióticos como un suplemento alimenticio para el ganado.

De esta manera, existe la necesidad de producir productos de carne para consumo que sean más eficientes, más seguros, y más sanos que los métodos actuales de producción.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a productos de carne producidos mediante bioingenieria y métodos para producir tales productos de carne. En una modalidad de la invención, el producto de carne comprende células de músculo que crecen ex vivo. Estas células de músculo pueden crecer y fijarse a una estructura de soporte y se pueden derivar de cualquier célula no humana. En una modalidad preferida de la invención, el producto de carne está sustancialmente libre de cualquier contaminación dañina microbiana o parásita. Otra modalidad de la invención se refiere a un producto de carne que comprende células de músculo y otras células tales como células grasas o células de cartílago, o ambas, que crecen ex vivo junto con las células de músculo. En otra modalidad de la invención, el producto de carne comprende células de músculo que han sido expuestas a una corriente eléctrica u oscilante.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA MODALIDAD PREFERIDA De manera general, los productos de carne se toman de los músculos de animales. Los carniceros realizan cortes correspondientes de res, aves de corral, cordero, pescado, o puerco para venderlas como bistec, pechuga de pollo, trozos de cordero, filete de pescado, trozos de puerco, etc. Los productos de carne también incluyen derivados de productos de carne tales como carne molida que puede ser procesada en albóndigas, carne para hamburguesa, albóndigas de pescado, salchicha, salami, mortadela, jamón, etc. Los productos de carne también pueden incluir tejidos musculares o carne que ha sido condimentada o secada tal como cecina. Una modalidad de la presente invención involucra un método para producir productos de carne que pueden ser utilizados para consumo. El método puede incluir cultivar células madre de músculo in vivo y permitir que estas células se diferencien en tipos específicos de células de músculo tales como células de músculo esquelético o células de músculo liso ex vivo. Las células de músculo se pueden derivar de cualquier animal no humano consumido por humanos tales como mamíferos (por ejemplo, ganado vacuno, búfalo, cerdos, borrego, ciervo, etc.), aves (por ejemplo pollo, patos, avestruz, pavo, faisán, etc.), pescado (por ejemplo pez espada, salmón, atún, lubina, trucha, bagre, etc.), invertebrados (por ejemplo, langosta, cangrejo, camarón, almejas, ostiones, mejillones, erizo de mar, etc.), reptiles (por ejemplo, serpiente, cocodrilo, tortuga, etc.), y anfibios (por ejemplo, ancas de rana).

Preferiblemente, las células de músculo se derivan de células madre mesenquimatosas embriónicas pluri-potentes que dan origen a células de músculo, células grasas, células óseas, y células de cartílago. Las células de músculo también se pueden derivar de células madre embriónicas toti-potentes tales como células de la etapa blastocística, óvulos fertilizados, placenta o cordones umbilicales de estos animales. Las células de músculo pueden crecer en cultivo en tejidos musculares que se fijan a una estructura de soporte tal como una estructura de soporte o andamiaje bi- o tridimensional. Las células de músculo pueden crecer en la estructura de soporte bidimensional tal como una caja de Petri formando varias capas de células que se pueden desprender y procesar para consumo. Otros ejemplos de estructuras de soporte bidimensionales pueden incluir membranas porosas que permiten la difusión de nutrientes desde los medios de cultivo en un lado de la membrana hacia el otro lado en donde las células se fijan. En este tipo de condiciones de cultivo, se pueden obtener capas adicionales de células al exponer las células a medios de cultivo desde ambos lados de la membrana, es decir, células que reciben nutrientes a través de la difusión desde un lado de la membrana y también de los medios de cultivo que cubren las células que crecen en la membrana.

Las células de músculo también pueden crecer en, alrededor, o dentro de una estructura de soporte tridimensional. La estructura de soporte puede ser esculpida en diferentes tamaños, configuraciones, y formas, según se desee, para proveer la configuración y forma para que las células de músculo crezcan y se asemejen a diferentes tipos de tejidos musculares tales como bistec, lomo, pierna, pechuga de pollo, muslo, trozos de cordero, filete de pescado, cola de langosta, etc. La estructura de soporte puede estar hecha de biomateriales naturales o sintéticos que de preferencia no sean tóxicos para que no puedan ser dañinos si se ingieren. Los biomateriales naturales pueden incluir, por ejemplo, colágeno, fibronectina, laminina, u otras matrices extracelulares. Los biomateriales sintéticos pueden incluir, por ejemplo, hidroxiapatita, alginato, ácido poliglicólico, ácido poliláctico, o sus copolímeros. La estructura de soporte se puede formar como un soporte sólido o semisólido. Para proveer crecimiento óptimo de célula y tejido, la estructura de soporte de preferencia tiene alta porosidad para proveer un área superficial máxima para fijación celular. También se puede moldear una estructura de soporte tridimensional para incluir una red vascular ramificada que provee el suministro de nutrientes hacia y fuera de los metabolitos de las células en la masa interna del producto de carne. En esta modalidad particular, la red vascular ramificada puede ser comestible utilizando biomateriales no tóxicos naturales o sintéticos como se mencionó anteriormente. Además, la estructura de soporte también puede incluir péptidos de adhesión, moléculas de adhesión celular, u otros factores de crecimiento asociados de manera covalente o no covalente con la estructura de soporte. Ejemplos de los péptidos incluyen secuencias tales como Arg-Gly-Asp o Arg-Glu-Asp-Val. Niklason, L., et. Al., Advances in Tissue Engineering of Blood Vessels and Other Tissues, Transplant Immunoloqy, 5(4):303-306 (1997). Esta cita se incorpora a la presente como referencia como si se expusiera totalmente en la presente. Por otro lado, las condiciones de cultivo para estas células de músculo pueden incluir condiciones de flujo estático, agitado o dinámico. Para producción en aumento progresivo, el método preferido es utilizar un biorreactor, el cual produce un mayor volumen de células y permite un mayor control sobre el flujo de nutrientes, gases, metabolitos, y moléculas reguladoras. Además, los biorreactores pueden proveer señales físicas y mecánicas tales como compresión para estimular células para producir biomoléculas específicas. Vacanti, J., et al., Tissue Engineering: The Design and Fabrication of Living Replacement Devices for Surgical Reconstruction and Transplantation, Lancet. 354 Supl. 1 , pSI32-34 (1999). Esta cita se incorpora a la presente como referencia como si se expusiera totalmente en la presente. En otra modalidad de la invención, los productos de carne derivados de células de músculo crecidas ex vivo pueden incluir células grasas derivadas también de cualquier animal no humano. La carne con más grasa generalmente tiene más sabor, pero con un contenido mayor de grasa viene un riesgo mayor de consecuencias adversas de salud tales como enfermedad cardiaca. De esta manera, la relación de células de músculo a células grasas puede ser regulada in vitro para producir los productos de carne con efectos óptimos en sabor y salud. La regulación se puede alcanzar al controlar la relación de células de músculo y grasa que inicialmente son sembradas en cultivo y/o al variar, según se desee, las concentraciones y relación de factores de crecimiento o factores de diferenciación que actúan sobre las células de músculo o células grasas. En otra modalidad de la invención, el cartílago derivado de condrocitos puede primeramente formar una capa de soporte o estructura subyacente junto con la estructura de soporte. Posteriormente, las células de músculo o células grasas, o ambas, se pueden sembrar en la capa de condrocitos. La interacción de células de músculo y condrocitos puede proveer adicionalmente las señales reguladoras necesaria requeridas para formación de tejido. Ejemplos de productos de carne que tienen células de músculo y células de cartílago incluyen pechuga de pollo o costillas de puerco. En una modalidad preferida de la invención, se pueden utilizar técnicas asépticas para cultivar las células de músculo dando como resultado productos de carne que están sustancialmente libres de microbios dañinos tales como bacterias, hongos, virus, priones, protozoarios, o cualquier combinación de los anteriores. Los microbios dañinos pueden incluir microorganismos tipo patogénicos tales como salmonella, campylobacter, E. coli_0156:H7, etc. Además, las células de músculo crecidas en cultivo pueden estar sustancialmente libres de parásitos tales como solitarias que infectan los músculos de animales enteros y que son transferidas a humanos a través del consumo de carne cocida de manera insuficiente. También se pueden emplear técnicas asépticas para empaquetar los productos de carne conforme salen de la línea de producción biológica. Dicha garantía de calidad puede ser monitoreada a través de ensayos estándar para microorganismos o químicos que ya son conocidos en la técnica. "Sustancialmente libre" significa que la concentración de microbios o parásitos está por debajo de un nivel clínicamente importante de contaminación, es decir, debajo de un nivel en donde la ingestión conduciría a enfermedad o a condiciones adversas de salud. En otra modalidad preferida de la invención, el producto de carne derivado de células de músculo crecidas ex vivo puede estar expuesto a una corriente eléctrica u oscilante. A diferencia de tejidos musculares derivados de animales enteros, los tejidos musculares crecidos ex vivo o in vitro pueden nunca haber sido ejercitados (por ejemplo, nunca haber sido utilizados para mover una pierna). De esta manera, la exposición de las células de músculo, tejido muscular, o los productos de carne in vitro a una corriente eléctrica u oscilante puede imitar el ejercicio e incrementar la similitud en textura entre la carne crecida ex vivo y la carne derivada de animales enteros. La corriente eléctrica u oscilante también puede incrementar la velocidad de crecimiento de células de músculo ex vivo. La corriente eléctrica u oscilante se puede aplicar a las células madre de músculo o a las células de músculo después de que han sido diferenciadas de las células madre. En otra modalidad de la invención, otros nutrientes tales como vitaminas que normalmente no están presentes en productos de carne de animales enteros se pueden añadir para incrementar el valor nutricional de la carne. Esto se puede obtener ya sea a través de adición directa de los nutrientes al medio de crecimiento o a través de técnicas de ingeniería genética. Por ejemplo, el gen o genes para enzimas responsables de la biosíntesis de una vitamina particular, tal como vitamina D, A, o los diferentes complejos de vitamina B, pueden ser transfectados en las células de músculo cultivadas para producir la vitamina particular. En otra modalidad de la invención, también se pueden introducir de manera genética en las células de músculo factores reguladores, factores de crecimiento, u otros productos génicos. Estos factores, conocidos como factores reguladores miogénicos ("MRF"), pueden estimular y regular el crecimiento de músculos in vivo, pero normalmente no pueden ser producidos a través de células de músculo ex vivo o in vitro. De esta forma, la expresión de factores reguladores miogénicos en células de músculo cultivados puede incrementar la producción de células de músculo in vitro. En otra modalidad de la invención, los productos de carne derivados de células de músculo in vitro pueden incluir diferentes derivados de productos de carne. Estos derivados se pueden preparar, por ejemplo, al moler o triturar los tejidos de músculo crecidos in vitro y mezclarlos con un condimiento adecuado para hacer albóndigas, albóndigas de pescado, carne para hamburguesas etc. Los derivados también se pueden preparar a partir de capas de células de músculo cortadas y condimentadas, por ejemplo, en cecina de res, jamón, mortadela, salami, etc. Asi, los productos de carne de la presente invención se pueden utilizar para generar cualquier clase de producto alimenticio que se origine de la carne de un animal. Los siguientes ejemplos ilustran cómo un experto en la técnica puede hacer uso de la invención actual para producir productos de carne in vitro. Los métodos en biología celular, cultivo celular, e inmunohistoquímica que no están explícitamente detallados en esta descripción ya han sido ampliamente reportados en la bibliografía científica.

EJEMPLO I Este ejemplo ilustra el aislamiento de células madre mesenquimatosas pluri-potentes para uso en producción de productos de carne in vitro. Las células madre mesenquimatosas dan origen a células de músculo (miocitos), células grasas (adipocitos), células óseas (osteocitos), y células de cartílago (condrocitos). Las células madre mesenquimatosas se pueden disecar y aislar a partir de tejidos embriónicos de cualquier embrión animal no humano. En el ganado vacuno, por ejemplo, los tejidos mesenquimatosos embriónicos que son ricos en células madre de músculo pluri-potente de preferencia son aislados de embriones en el día 30 a 40 o antes. Una vez disecados, los tejidos embriónicos se pueden cortar en piezas pequeñas de un tamaño de aproximadamente un milímetro por un milímetro en solución salina regulada de fosfato ("PBS") pH 7.45. De cinco a diez piezas del tejido cortado se pueden incubar en 300 µl de tripsina al 0.25% y EDTA al 0.1% en PBS durante treinta minutos a 37°C con agitación uniforme. Después de eso, se puede dejar que los tejidos se sedimenten en el fondo del tubo mediante gravedad o centrifugación uniforme. El sobrenadante que contiene la solución de tripsina/EDTA puede ser posteriormente aspirado y reemplazado con 300 µl de colagenasa al 0.1% en PBS durante diez a treinta minutos a 37°C. La digestión de colagenasa se puede repetir por varios ciclos según se desee. Dependiendo de la viscosidad de la solución debido al ADN liberado de las células dañadas, 40 µl de DNasa I a 1 mg/ml en PBS se pueden agregar a la solución de colagenasa entre los ciclos. La reacción se puede detener al añadir medios tal como DMEM o F-12 de Ham, o ambos en una relación 1 :1 (Life Technologies, Rockville, Maryland) que está suplementada con 10mM Hepes, 2 mM L-glutamina (Sigma-Aldrich), suero fetal de ternera o bovino inactivado con calor al 10-20% (Hyclone Laboratories, Logan, Utah), penicilina a 100 unidades/ml y estreptomicina a 100 µg/ml ("medio completo"). Las células pueden ser completamente disociadas al tratar con pipeta de manera uniforme los tejidos hacia arriba y hacia abajo después de lavado de las células en medio completo una vez o dos veces utilizando una centrífuga. Las células pueden ser posteriormente colocadas sobre placas en una caja de Petri de tamaño adecuado la cual puede ser revestida con biomateriales naturales (por ejemplo, colágeno, fibronectina, laminina u otras matrices extracelulares) o biomateriales sintéticos (por ejemplo, hidroxiapatita, alginato, ácido poliglicólico, ácido poliláctico, o sus copolímeros), o ambos, y pueden crecer a 37°C y equilibrarse con CO2 al 5%.

EJEMPLO II Después de que se han aislado las células madre mesenquimatosas, éstas pueden ser enriquecidas con mioblastos o células madre de músculos en cultivo. Inicialmente, las células pueden ser colocadas diferencialmente en placas en diferentes cajas— de- -Petri- después de disociación y lavado según lo descrito en el ejemplo I. Utilizando una caja de Petri de 60mm, las células primero pueden ser incubadas en medio completo durante dos a cuatro horas. Durante este tiempo, las células epiteliales tenderán a fijarse rápidamente en la caja de Petri mientras los mioblastos permanecen en el sobrenadante. El sobrenadante puede ser posteriormente recolectado y los mioblastos pueden ser colocados en placas en una caja de Petri diferente revestida con biomateriales naturales o sintéticos tales como aquellos mencionados en el ejemplo I. Los mioblastos pueden ser enriquecidos al suplementar los medios de crecimiento con factores de crecimiento tales como factor de crecimiento de músculo esquelético, prostaglandina F2a ("PGF2a"), y factor I de crecimiento tipo insulina ("IGF-1").

También, los mioblastos se pueden diferenciar en miocitos o células musculares específicas cultivando los mioblastos en un medio completo o en un medio mínimo (por ejemplo, medio completo menos el suero fetal de becerro) suplementado con factores de crecimiento o de diferenciación específicos del músculo, tales como PGF2a en concentraciones que varían de 24 pg/ml a 28 pg/ml, e insulina de 10"6 M a 10"5 M. Para imitar de manera más cercana in vivo las células del músculo, las cuales normalmente son enervadas por células neuronales, el medio de cultivo también puede ser suplementado con neurotransmisores apropiados, como acetilcolina.

EJEMPLO lll Alternativamente, los mioblastos se pueden enriquecer de células madre embrionales toti-potentes. Las células toti-potentes se pueden derivar in vitro de óvulos fertilizados de un animal utilizando técnicas de fertilización in vitro, de las células madre presentes en los cordones umbilicales o placenta, o de células madre embrionales (ES) aisladas a partir de células en la etapa blastocística. Por ejemplo, las células ES se pueden recoger, disociar suavemente por tripsina, y cultivar in vitro con factor inhibidor de la leucemia recombinante (Chemicon, San Diego, CA) y células alimentadoras tales como células de fibrobáslto embriónico de crecimiento interrumpido. Estas células toti-potentes se pueden tratar con factores del crecimiento tales como PGF2a o IGF-1 para inducir la diferenciación de las células en mioblastos.

EJEMPLO IV Utilizando inmunohistoquímica estándar o técnicas de hibridación in situ, se pueden identificar los mioblastos o miocitos (células diferenciadas de músculo). En resumen, los mioblastos o miocitos que crecen en cultivo se pueden transferir a placas de vidrio recubiertas con una matriz extracelular apropiada como se describió antes. Estas células pueden crecer hasta el número y diferenciación deseados utilizando las condiciones que se describieron antes. Después de un crecimiento suficiente y un periodo de diferenciación, las células se pueden fijar con formaldehído al 4%. Si se van a utilizar marcadores de anticuerpo intracelular o sondas de nucleótido, las membranas celulares se pueden permeabilizar con 1% NP-40 o Triton-X. Los anticuerpos contra los marcadores específicos para mioblastos o miocitos, como miosina, titina, alfa-actinina disponibles con Sigma® se pueden utilizar para identificar las células utilizando técnicas estándar de inmunohistoquímica fluorescente. Alternativamente, también se pueden utilizar sondas de ARN o ADN de una sola cadena para estos marcadores, para la hibridación in sit?. Además, cuando las células de músculo se han unido a una estructura de soporte tridimensional, como se describe más adelante, pueden ser crio-congeladas, seccionadas e identificadas utilizando marcadores de anticuerpo como los anticuerpos contra miosina, titina, 12101 , troponina T, alfa actinina disponibles con Sigma®.

EJEMPLO V Se pueden esculpir andamios o soportes de dos o tres dimensiones a partir de biomateriales naturales (por ejemplo colágeno, fibronectina, laminina, u otra matriz extracelular) o biomateriales sintéticos (por ejemplo hidroxiapatita, alginato, ácido poliglicólico, ácido poliglicólico, ácido poliláctico, y sus copolímeros), o con ambos. De preferencia, los andamios de tres dimensiones de esculpen con rutas ramificadas para nutrientes y medio de cultivo para alcanzar la masa interna de los tejidos formadores de músculo. Ejemplos de materiales y métodos de construcción de estos andamios están proporcionados por la patente de E.U.A. Nos. 5,686,091 , titulada "Biodegradable Foams For Cell Transplatation", 5,863,984, Titulada "Biostable Porous Material Comprising Composite Biopolymers", 5,770,417, Titulada "Three-Dimensional Fibrous Scaffold Containing Attached Cells for Producing Vascularized Tissue en vivo"; y 5,916,265, titulada "Method of Producing a Biological Extracellular Matrix for Use as a Cell Seeding Scaffolf and Implant." Estas patentes se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. La estructura de soporte de preferencia se esculpe en diferentes tamaños, configuraciones y formas para permitir el crecimiento de los tejidos musculares asemejando los diferentes tipos de productos de carne como bistec, lomo, pierna, pechuga de pollo, muslo, brochetas de cordero, filete de pescado, cola de langosta, etc.

EJEMPLO VI Los adipocitos, condorcitos y osteoblastos son capaces de diferenciarse de las células madre mesenquimales pluri-potentes o las células madre embrionicas toti-potentes. Las células madre se pueden aislar como se describe en el ejemplo I o lll. Las células madre se pueden cultivar en DMEM, o Ham's F 12, o ambos en una relación de 1 :1. El medio se puede suplementar con hormona tiroidea, transferina, insulina, asi como otros factores de crecimiento, como el factor de crecimiento de tipo insulina (IGF), el factor de crecimiento de fibroblasto básico, y la hormona de crecimiento. Para los adipocitos, se puede lograr la diferenciación tratando las células madre con proteínas morfogéneticas de hueso ("BMP") como BMP-4 y BMP-2, de las cuales se sabe que inducen la conducta del linaje de adipocito. Ahrens et. al., Expresión of human bone morphogenetic proteins-2 o -4 in murine mesenchymal progenitor C3H10T1/2 cells induces differentiation into distinct mesenchymal cell lineales, ADN Cell Biol., 12:871-880 (1993); Wang et. al., Bone Morfogenetic protein-2 causes commitment and differentiation in C3H10T1/2 y 3T3 cells, Growth Factors 9:57 (1993). Estas referencias se incorporan en la presente en su totalidad como referencia.

Además de los BMP, la diferenciación de los adipocitos se puede mejorar con un agonista del receptor gamma activado por el proliferador de peroxizoma ("PPAR gamma") como BRL 49653 (rosiglitazone). Sottile and Seuwen, Bone morphogenetic protein-2 stimulates adipogenic differentiaction of mesenchymal precursor cells in synergy with BRL 49653 9 (rosiglitzaone), FEBS Lett, 475(3):201-204 (2000). Esta referencia se incorpora en la presente en su totalidad. En ciertas situaciones, los myoblastos pueden incluso ser inducidos a trans-diferenciarse en adipoblastos (precursores de adipocito) con el tratamiento de las células de mioblastos o la célula satélite del músculo con ácidos grasos de cadena larga ("LCFA") o tiazolidinodionas o con ambos. Grimaldi et. al., Trans-differentiation of myoblasts to adipoblasts: triggering effects of fatty acids and thiazolidinediones, Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, 57(1);71-75 (1997); Teboul et. al., Thiazolidinediones and fatty acids convert myogenic cells into adipose-like cells, J. Biol. Chem. 270(47):28183-28187 (1995). Estas referencias se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. Así, se pueden, se pueden producir productos de carne con la cantidad deseada de grasa sembrando y co-cultivando células de músculo y células de adipocito a cierta relación. Alternativamente, se puede permitir la diferenciación de células madre, inicialmente en myoblastos y después más adelante, se puede añadir LCFA o tiadolidinodionas a diferentes concentraciones y en diferentes tiempos de exposición para trans-diferenciar los myoblastos en adipocitos como se desea. Además, se puede regular el crecimiento de las células musculares y las células grasas controlando la concentración de los factores de crecimiento y de diferenciación. Por ejemplo, si se desea menos células grasas en el producto de carne final, se pueden agregar menos concentraciones de factores BMP al cultivo, mientras que se puede añadir una concentración más alta de PGF2a y/o insulina para promover el crecimiento de la célula muscular.

EJEMPLO Vil Los condrocitos o células de cartílago también se pueden aislar a partir de las estructuras de la rodilla o de la costilla de un animal. Utilizando técnicas similares a las que se describieron en el ejemplo 1 , el tejido diseccionado de las estructuras de la rodilla y de las costillas se puede picar, digerir con colagenasa, y lavar con un medio completo. Después las células se pueden colocar en placas en forma diferencial para aumentar la pureza de las células de condorcito. Se sabe que los condrocitos se diferencian como respuestas a la tensión mecánica. Por lo tanto, de preferencia, las células se pueden someter a tensión por flujo de sisayamiento como se describe en la patente de E.U.A. No. 4,928,945, titulada "Application of Shear Flor Stress to Chondrocytes or Chondrocyte Stem Cells to Produce Cartilage", que se incorpora en la presente en su totalidad como referencia.

Los condrocitos pueden forman inicialmente una primera capa de células de soporte en un andamio de tres dimensiones. Los mioblastos o células adipocito o ambos, se pueden sembrar entonces sobre la capa de condorcito y se cultivan hasta un tamaño deseado. De esta manera, la capa de condrocito puede proporcionar una adhesión adicional o factores de crecimiento a las células del músculo.

EJEMPLO VIII Las células de músculo cultivadas in vitro difieren de las células de músculo cultivadas in vivo, en que las células in vivo se utilizan durante el ejercicio o los movimientos corporales. Como los músculos se utilizan in vivo, las células del músculo, en las extremidades, por ejemplo, se contraen y se relajan de acuerdo con el movimiento de las extremidades. De ahí, para imitar de manera más cercana el crecimiento de las células del músculo in vivo, las células cultivadas in vitro se pueden exponer a una corriente eléctrica u oscilatoria, o a pulsos de corriente eléctrica u oscilatoria para contraer las células musculares. Las sondas eléctricas se pueden sumergir en el medio de cultivo para proporcionar una corriente suave. Alternativamente se puede revestir la estructura de soporte con materiales eléctricamente conductores. Ejemplos de materiales eléctricamente conductores y un método para revestirlos sobre la estructura de soporte se describe en la patente de E.U.A. No. 5,843,741 , titulada "Method for Altering the Differentiation of Anchorage Dependent Cells on an Electrically Conducting Polymer", que se incorpora en la presente en su totalidad como referencia. Los ejemplos precedentes ilustran los procedimientos para producir productos de carne ex vivo. Estos pretenden solamente ser ejemplos y no pretenden limitar la invención a estos ejemplos. Deberá entenderse que la modificación y la combinación de ejemplos no se apartan del espíritu de la invención.

Claims (9)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un producto de carne no humana para el consumo que comprende células de músculo no humanas que crecen ex vivo.

2.- El producto de carne no humana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque también comprende: una estructura de soporte; y en donde las células de músculo no humanas se unen a la estructura de soporte.

3.- El producto de carne no humana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las células de músculo no humanas son células de músculo esquelético.

4.- El producto de carne no humana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las células de músculo no humanas se derivan de animales seleccionados del grupo que consiste en mamíferos, pájaros, peces, invertebrados, reptiles, y anfibios.

5.- El producto de carne no humana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el producto de carne no humana está sustancialmente libre de contaminación microbiana dañina.

6.- El producto de carne no humana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las células de músculo no humanas se derivan de células pluri-potentes o toti-potentes. 7 '.- El producto de carne no humana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las células de músculo no humanas han sido expuestas a una corriente eléctrica. 8.- El producto de carne no humana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque también comprende células de adipocito no humanas que crecen ex vivo. 9.- El producto de carne no humana de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque las células de adipocito no humanas son trans-diferenciadas a partir mioblastos no humanos. 10.- El producto de carne no humana de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque las células de adipocito no humanas se derivan de células madre no humanas pluri-potentes o totipotentes. 11.- El producto de carne no humana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende células de cartílago no humanas que crecen ex vivo. 12.- El producto de carne no humana de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque las células de cartílago no humanas se ubican entre una estructura de soporte y las células de músculo no humanas. 13.- El producto de carne no humana de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque las células de cartílago no humanas han sido expuestas a tensión mecánica. 14 - Un método para producir productos de carne no humana para consumo, que comprende los pasos de: cultivar ex vivo células madre no humanas de músculo, sembrar las células madre de músculo no humanas en una estructura de soporte; y hacer crecer las células madre de músculo no humanas para producir un producto de carne no humana. 15.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque el paso de hacer crecer las células madre de músculo no humanas comprende: diferenciar las células madre de músculo no humanas en diferentes tipos de células de músculo no humanas. 16.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque también comprende el paso de: exponer las células de músculo no humanas a una corriente eléctrica u oscilatoria. 1

7.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque también comprende el paso de: añadir nutrientes para incorporarlos en los productos de carne no humana. 1

8.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque las células de músculo no humanas se derivan a partir de animales seleccionados del grupo que consiste en mamíferos, pájaros, peces, invertebrados, reptiles y anfibios. 1

9.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque el producto de carne no humana está sustancialmente libre de contaminación microbiana dañina. 20 - Un método para producir carne no humana para el consumo, que comprende los pasos de: co-cultivar ex vivo células de músculo no humanas y células grasas no humanas; sembrar las células de músculo no humanas y las células grasas no humanas en una estructura de soporte; y hacer crecer las células de músculo no humanas y las células grasas no humanas para producir un producto de carne no humana. 21.- Un método para producir carne no humana para el consumo, que comprende los pasos de: co-cultivar ex vivo células madre de músculo no humanas; sembrar las células madre de músculo no humanas en una estructura de soporte; tratar las células madre de músculo no humanas con ácidos grasos para trans-diferenciar las células madre de músculo no humanas en adipocitos; y hacer crecer los adipocitos para producir un producto de carne no humana. 22.- Un método para producir carne no humana para el consumo, que comprende los pasos de: co-cultivar ex vivo células de cartílago no humanas; sembrar las células de cartílago no humanas en un estructura de soporte; cultivar las células de músculo no humanas junto con las células de cartílago no humanas en o alrededor de la estructura de soporte; y hacer crecer las células de músculo no humanas para producir un producto de carne no humana. 23.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque las células de cartílago no humanas han sido expuestas a tensión mecánica.