MX2007002294A

MX2007002294A - Suministro de acidos nucleicos funcionales a celulas mamiferas via minicelulas intactas, derivadas bacterialmente.

Info

Publication number: MX2007002294A
Application number: MX2007002294A
Authority: MX
Inventors: Jennifer Macdiarmid; Himanshu Brahmbhatt
Original assignee: Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd
Priority date: 2004-08-26
Filing date: 2005-08-25
Publication date: 2007-10-19
Also published as: EP1791959A2; HK1163160A1; US20190091160A1; AU2005276145A1; US9066982B2; CA2577938A1; PT2386640E; EP1791959A4; HUE024999T2; US10383827B2; US8735566B2; US9242007B2; DK2386640T3; ES2535235T3; US20160113883A1; CN102921019A; US20160051687A1; US10441546B2; US20170258734A1; US20180028456A1

Abstract

Los acidos nucleicos funcionales que contienen minicelulas derivadas bacterialmente, intactas, o los plasmidos que codifican para los acidos nucleicos funcionales pueden reducir, en los codocitos de mamifero, la resistencia a farmacos, la resistencia a la apoptosis, y la neoplasticidad respectivamente. La metodologia que emplea minicelulas para suministrar acidos nucleicos funcionales, que se dirigen a los transcriptos de las proteinas que contribuyen a la resistencia a farmacos o resistencia a la apoptosis, inter alia, se puede combinar con quimioterapia para aumentar la efectividad de la quimioterapia.

Description

SUMINISTRO DE ÁCIDOS NUCLEICOS FUNCIONALES A CÉLULAS MAMÍFERAS VIA MINICÉLULAS INTACTAS, DERIVADAS BACTERIALMENTE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con esfuerzos que se han llevado a cabo para alcanzar un suministro efectivo de ácidos nucleicos funcionales a células de mamífero. Más específicamente, la invención se relaciona con la utilización de vectores minicelulares bacterianos para suministrar ácidos nucleicos funcionales a células de mamífero. La invención tiene utilidad particular para eliminar la resistencia a fármacos, en especial en el contexto de la terapia del cáncer y el SIDA, para estimular la apoptosis y para contrarrestar la neoplasticidad en codocitos .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Recientes avances han resaltado una variedad de técnicas para introducir ácidos nucleicos funcionales en células. Por ejemplo, los métodos de transfección con base en liposomas pueden suministrar ácidos nucleicos producidos exógenamente . Sin embargo, este procedimiento exógeno tiene la desventaja de efectuar sólo una inhibición transitoria de un blanco. Adicionalmente, los liposomas son inestables in vivo . Como alternativa para el suministro de ácidos nucleicos producidos exógenamente, los vectores pueden suministrar plásmidos que codifican para ácidos nucleicos funcionales, y que se producen endógenamente. Sin embargo, los vectores virales actualmente útiles para este fin poseen graves problemas de seguridad. Los problemas ilustrativos incluyen la recombinación con virus tipo silvestre, inmunosupresión, virus-inducida, de inserción y oncogénica potencial, capacidad limitada de los vectores virales para portar grandes segmentos de ADN, reversión o virulencia de virus atenuados, dificultades en la elaboración y distribución de virus recombinantes, baja estabilidad, y reacciones adversas, tales como por ejemplo, respuesta inflamatoria, provocada por una inmunidad existente. Un procedimiento que evita estos problemas podría ofrecer un beneficio significativo para la elaboración y suministro de ácidos nucleicos funcionales más seguros y más efectivos. Un método efectivo para suministrar ácidos nucleicos funcionales podría ser particularmente benéfico para revertir la resistencia a fármacos. Las células de mamífero emplean una variedad de procesos biológicos para resistir fármacos, que es el principal obstáculo para el tratamiento exitoso del cáncer. De manera similar, la resistencia a fármacos limita la eficacia del tratamiento del VIH, en particular para una terapia anti-retroviral bastante activa (HAART, por sus siglas en inglés) , con base en una combinación de inhibidores de transcriptasa nucleósido inversa (NRTI, por sus siglas en inglés) e inhibidores de proteasa (Pl, por sus siglas en inglés) o un inhibidor de transcriptasa sin nucleósido inversa (NNRTI, por sus siglas en inglés) . La resistencia de los tumores clínicos a la quimioterapia puede ser intrínseca o adquirida. La resistencia intrínseca existe en el momento del diagnóstico de tumores que fracasan en la respuesta a la quimioterapia de primera línea. La resistencia adquirida se presenta en tumores que pueden responder bien a un tratamiento inicial, pero que exhiben un fenotipo de resistencia al momento de la recurrencia. Estos tumores ganan resistencia tanto para los fármacos utilizados anteriormente como para los fármacos novedosos, incluyendo los fármacos con diferentes estructuras y mecanismos de acción. El término MDR (resistencia a múltiples fármacos) describe este fenómeno en el cual las células tumorales desarrollan resistencia cruzada a diversos fármacos no relacionados estructuralmente después de la exposición a un fármaco individual . Los mecanismos para la resistencia de múltiples fármacos son complejos y multifactoriales, debido en gran medida al alto nivel de inestabilidad genómica y a las mutaciones en las células cancerosas. Los mecanismos de ejemplo son inactivación de fármacos, expresión del fármaco mediante bombas de membrana celular, influjo disminuido de fármacos, mutaciones de los blancos del fármaco y falla para iniciar la apoptosis (Bredel, 2001; Chen et al . , 2001; White and McCubrey, 2001; Sun et al . , 2001). La extrusión de fármacos es particularmente común, y puede resultar de una sobre-expresión de las proteínas membrana asociadas que bombean los fármacos desde el entorno intracelular al extracelular. Estas bombas con frecuencia son miembros de la superfamilia del transportador con cassette de unión de ATP (ABC, por sus siglas en inglés) (Doige et al . , 1993). La P-glucoproteína (PgP/ por sus siglas en inglés) es uno de estos ejemplos, y es el principal contribuyente de MDR en una variedad de células cancerosas (Endicott et al . , 1989; Litman y et al . , 2001). Otros ejemplos incluyen la proteína MDR-asociada (MRP; Colé et al . , 1992), la proteína con resistencia al cáncer de mama (BCRP; Litman et al . , 2000), y la proteína relacionada con la resistencia pulmonar (LRP; una proteina bóveda mayor; Scheffer et ai., 2000). En células cancerosas también se han identificado otras proteínas transportadoras de múltiples fármacos (Gottesman et al . , 2002) y en microorganismos patogénicos (Van Bambeke et al . , 2000) . La resistencia a la apoptosis (muerte celular programada) de células tumorales inducida por agentes citotóxicos y radiación (Sellers and Fisher, 1999) es otro mecanismo común. Este mecanismo con frecuencia implica la sobre-expresión de proteínas anti-apoptóticas, tales como por ejemplo, la proteína 2 de leucemia de linfocitos B (Bcl-2, por sus siglas en inglés) Bcl-XL, Bcl-W, Al/Bfll, Mcl-1 y las mutaciones en la proteína p53. Aunque sigue siendo difícil la comprensión precisa de la forma en que las proteínas similares a Bcl-2 ejercen sus efectos anti-apoptóticos, las proteínas se sobre-expresan en muchos cánceres entre los que se incluyen los cánceres colorectal, prostático, y mamario (Hanada, et al . , 1995; Bakhshi et al . , 1985; Wang et al . , 1996). La expresión aumentada del factor nuclear kappa B con factor de transcripción (NF-?B, por sus siglas en inglés) también es un mecanismo principal para que las células tumorales adquieran resistencia a la quimioterapia (Wang et al . , 1999) . Se han identificado fármacos para contrarrestar la MDR, tales como por ejemplo, fármacos que bloquean la acción de P-glucoproteína (List et al . , 1993; Millar et al . , 1991; Wishart et al., 1992). Sin embargo, muchos de estos fármacos fueron inefectivos en pruebas clínicas, debido a que al unirse al plasma de los pacientes, podrían no alcanzar su destinación (Ayesh et al . , 1996a; Broxterman et al . , 1987; Lehnert et al . , 1996) y fueron tóxicos para células normales. También se ha intentado el uso de ácidos nucleicos funcionales para contrarrestar la MDR. Hasta ahora, como se observó anteriormente, los vectores existentes para este fin son inestables o tóxicos, o poseen otros problemas graves de seguridad, lo cual dificulta su utilización en seres humanos (Sioud, 2004). Por consiguiente, sigue habiendo una necesidad por herramientas y métodos para suministrar ácidos nucleicos funcionales que reduzcan la resistencia a fármacos, estimulen la apoptosis, y contrarresten la neoplasticidad en codocitos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Para enfrentar estas y otras necesidades, la presente invención proporciona, en un aspecto, un método para suministrar un ácido nucleico funcional, que comprende (a) proporcionar una minicélula intacta que contenga una molécula de ácido nucleico funcional o que contenga un plásmido que comprende un segmento que codifica para una molécula de ácido nucleico funcional, después (b) poner la minicélula en contacto con un codocito de mamífero, de tal forma que la célula mamífera envuelve la minicélula.

Después de envolver la minicélula, la molécula de ácido nucleico funcional se libera en el citoplasma, se transporta al núcleo y se expresa por el codocito. El plásmido mencionado anteriormente también puede contener un elemento regulador, tal como por ejemplo, un promotor, un terminador, un intensificador o una secuencia de señal que se vincula operativamente al segmento que codifica para una molécula de ácido nucleico funcional. Es particularmente ventajoso para el plásmido comprometer a un promotor para que sea dependiente ya sea de la ARN polimerasa (pol) II o pol III, tal como por ejemplo, los promotores humanos de ARN III polimerasa 7SK Hl y U6. Además, el plásmido puede contener un elemento reportero, tal como por ejemplo, un segmento de ácido nucleico que codifica para la proteína fluorescente verde. El contacto entre la minicélula y la célula mamífera puede ser in vi tro o in vivo. Con relación a esta invención, la categoría de "ácidos nucleicos funcionales" abarca: moléculas de siARN, incluyendo las moléculas de shARN; moléculas de miARN, moléculas de antisentido; y moléculas de ribozima. De preferencia, la molécula de ácido nucleico funcional se dirige al gen o transcripto de una proteína que estimule la resistencia a fármacos, inhiba la apoptosis, o contribuya a un fenotipo neoplásico. Los blancos particularmente útiles que contribuyen a la resistencia a fármacos incluyen los transportadores con cassette de unión con ATP tales como' por ejemplo, la p-glucoproteína, MDR-2, MDR-3, BCRP, APTlla y LRP. Los blancos particularmente útiles que contribuyen a la resistencia a la apoptosis incluyen Bcl-2 (leucemia/linfoma de linfocitos B) , Bcl-XL, Al/Bfl 1, cinasa de adhesión focal y la proteína mutante p53. Otros blancos útiles son proteínas oncogénicas y proteínas supresoras de tumores mutantes. En otro aspecto, la invención proporciona un método para superar la resistencia a fármacos o la resistencia a la apoptosis y el tratamiento de una malignidad en un sujeto. El método comprende (a) proporcionar una minicélula intacta que contenga una molécula de ácido nucleico funcional o un plásmido que comprenda un segmento que codifique para una molécula de ácido nucleico funcional, en donde la molécula de ácido nucleico funcional se dirige al transcripto de una proteína que promueve la resistencia a fármacos (b) poner en contacto la minicélula con un codocito de mamífero, de tal forma que la célula mamífera envuelva a la minicélula, y (c) suministrar un fármaco quimioterapéutico al codocito de mamífero. De preferencia, el paso (c) se realiza después de los pasos (a) y (b) , para permitir que el ácido nucleico funcional disminuya la resistencia al fármaco antes de la administración del fármaco. El fármaco se puede suministrar por cualquier medio convencional, aunque de preferencia se suministra vía una minicélula intacta. En ciertas modalidades de la invención, la minicélula se pone en contacto con el codocito de mamífero vía un ligando biespecífico. El ligando biespecífico tiene especificidad tanto para un componente superficial sobre la minicélula como para un componente superficial sobre la célula mamífera, tal como por ejemplo, un receptor. Como resultado, el ligando provoca que la minicélula se una a la célula mamífera, la minicélula se envuelve por la célula mamífera, y la minicélula cargada se libera en el citoplasma de la célula mamífera, en otras modalidades de la invención, la minicélula entra en contacto con un codocito de mamífero que sea fagocitosis o endocitosis-competente. El uso de ligandos biespecíficos es opcional cuando un codocito es fagocitosis-competente. En otro aspecto, la invención proporciona una composición que comprende (i) minicélulas intactas y (ii) un portador farmacéuticamente aceptable para las mismas, en donde las minicélulas contienen una molécula de ácido nucleico funcional o un plásmido que codifica para una molécula de ácido nucleico funcional. La molécula de ácido nucleico funcional puede ser una molécula de shARN o miARN u otra de siARN, una molécula antisentido, o una molécula de ribozima. De preferencia, la molécula de ácido nucleico funcional se dirige al gen o transcripto de una proteína que estimule la resistencia a fármacos, inhiba la apoptosis, o contribuya a un fenotipo neoplásico. Los blancos particularmente útiles que contribuyen a la resistencia a fármacos incluyen transportadores con cassette de unión con ATP tales como por ejemplo, P-glucoproteína, MDR-2 y MDR-3. Los blancos particularmente útiles que contribuyen a la resistencia a la apoptosis incluyen Bcl-2 (leucemia/linforna de linfocitos B) , BC1-XL, Al/Bfl 1, cinasa de adhesión focal y la proteína mutante p53. Otros blancos útiles son las proteínas oncogénicas y proteínas supresoras tumorales mutantes. El plásmido puede contener un elemento regulador, tal como por ejemplo, un promotor, un terminador, un intensificador o una secuencia de señal que se vincule operativamente al segmento que codifica para una molécula de ácido nucleico funcional. Además, el plásmido puede contener un elemento reportero. La molécula de ácido nucleico funcional puede comprender múltiples secuencias de interferencia con ARN como miARN o shARN y éstas pueden ser co-cistrónicas o se pueden expresar a partir de promotores por separado para permitir la descomposición simultánea de múltiples blancos asociados con la resistencia a fármacos. En modalidades preferidas, la composición contiene menos de una célula madre contaminante por 107, 108, 109, 1010, 1011 ó 1012 minicélulas.

Todavía en otro aspecto, la invención proporciona el uso de minicélulas intactas para la preparación de un medicamento que se pueda utilizar en un método para superar la resistencia a fármacos o estimular la apoptosis mediante la administración del medicamento a la célula, tejido u órgano. En el medicamento, las minicélulas contienen una molécula de ácido nucleico funcional o un plásmido que codifica para una molécula de ácido nucleico funcional, en donde la molécula de ácido nucleico funcional se dirige al transcripto de una proteína que estimula la resistencia a fármacos o inhibe la apoptosis. La enfermedad tratada en este contexto puede ser un cáncer, por ejemplo, o una enfermedad adquirida, tal como por ejemplo, SIDA y tuberculosis . La invención proporciona mejoras significativas con respecto a los métodos y formulaciones convencionales para suministrar ácidos nucleicos funcionales en el contexto de cáncer y VIH al (i) proporcionar vehículos seguros y estables para el suministro de ácidos nucleicos funcionales, (ii) contrarrestar el mecanismo principal de la resistencia a fármacos en células enfermas, (iii) reducir los efectos secundarios tóxicos asociados con la superación de la resistencia a fármacos, y (iv) proporcionar vehículos dirigidos y fármaco-empacados para tratar la enfermedad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra el efecto de diversos tratamientos sobre la viabilidad de la linea celular de cáncer de colon humano Caco-2. Los tratamientos se muestran sobre el eje x (las minicélulas se designan con "M") y la viabilidad celular porcentual se muestra mediante las barras. Cada barra es un promedio de seis mediciones independientes y se muestra la desviación estándar del promedio . La Figura 2 muestra la regresión de xenoinjertos de cáncer de colon humano (Caco-2) en ratones desnudos (11 ratones por grupo) siguiendo un tratamiento dual con (1) minicélulas recombinantes dirigidas que portan el shARN que codifica para los plásmidos) (anti-bcl2 o anti-Mdrl) y (2) minicélulas dirigidas empacadas con el fármaco quimioterapéutico Irinotecano. El anticuerpo biespecífico utilizado para dirigir las células de cáncer de colon portaron especificidad contra el O-antígeno de S . typhimuri um sobre una ramificación y el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (EGFR, por sus siglas en inglés) sobre la otra ramificación. Las minicélulas recombinantes dirigidas se inyectaron intravenosamente en los días 9 y 23, y las minicélulas empacadas de Irinotecano dirigidas se proporcionaron intravenosamente en los días 15, 18, 29 y 32. Otros tratamientos administrados intravenosamente incluyen: Grupo 1 - exclusivamente tumores, Grupo 2 - libre de Irinotecano, Grupo 3 EGFRminicélulas?rino, Grupo 4 - EGFRminicélulasShARN-MDR-?.- Grupo 5 - EGFRminicélulasshARN_bci-2 y Grupo 6 - EGFRminicélulass ARN-MDR-?, seguidos por Irino libre. El volumen de tumores se muestra en el eje y. SEM se muestra para cada medición. La Figura 3 muestra la regresión de xenoinjertos de cáncer de colon humano (Caco-2) en ratones desnudos (11 ratones por grupo) siguiendo un tratamiento dual con (1) minicélulas recombinantes dirigidas que portan el shARN que codifica para los plásmidos (anti-bcl2 o anti-Mdrl) y (2) minicélulas dirigidas empacadas con el fármaco quimioterapéutico 5-FU. El anticuerpo biespecífico utilizado para dirigir las células de cáncer de colon portaron especificidad contra el O-antígeno de S . typhimuri um en una ramificación y el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (EGFR) en la otra ramificación. Las minicélulas recombinantes dirigidas se inyectaron intravenosamente en los días 9 y 23, y las minicélulas empacadas 5-FU dirigidas se administraron intravenosamente en los días 15, 18, 29 y 32. Otros tratamientos control administrados intravenosamente incluyen: Gl - exclusivamente tumores, G2 (control), 5-FU libre (5 x 104 ng/gm de peso corporal de ratón ~1 x 106) , G3 (control), EGFRminicélulas5-Fu, G4 (control), EGFRminicélulasshARN-MDR-?, G5 (control), EGFRminicélulasshARN-c?-2, G6 (control) , EGFRmihicélulasshARN-MDR-? seguidos por CMVminicélulas5-Fu, G7 (control) , EGFRminicélulasshARN-ant-.sent--do. seguidos por EGFRminicélulass-Fur G8 (control) , EGFRminicélulasshARN-MDR-? seguidos por 5-FU libre, G9 (expt) , EGFRminicélulasShAR-MDR-? seguidos por EGFRminicélulas5-FUf y G10 (expt) , EGFRminicélulasshAR-bci-2 seguidos por EGFRminicélulas5-FU- El volumen de tumores se muestra en el eje y. SEM se muestra para cada medición. La Figura 4 muestra la regresión de xenoinjertos de cáncer de mama humano (MDA-MB-468) en ratones desnudos (11 ratones por grupo) siguiendo un tratamiento dual con (1) minicélulas recombinantes dirigidas que portan shARN que codifica para el plásmido (anti-MDR-1) y (2) minicélulas dirigidas empacadas con el fármaco quimioterapéutico, doxorubicina. El anticuerpo biespecífico utilizado para dirigir las células de cáncer de mama portaron especificidad contra el O-antígeno de S. typhimuri um en una ramificación y el EGFR humano en la otra ramificación. Las minicélulas recombinantes dirigidas se inyectan intravenosamente en el día 21 y las minicélulas Dox-empacadas dirigidas se administraron intravenosamente en los días 27, 34 y 41. Los tratamientos administrados intravenosamente incluyen: Gl - exclusivamente tumores, G2 (control), EGFRminicélulasDox, y G3 (expt), EGFRminicélulasshAR-MDR-? seguidos por EGFRminicélulasDox. El volumen de tumores se muestra en el eje y. SEM se muestra para cada medición. La Figura 5 muestra el efecto de los programas de dosificación sobre la inversión de resistencia a fármacos y el efecto terapéutico. Los xenoinjertos de cáncer de colon humano (Caco-2) se establecieron en ratones desnudos y se administraron los siguientes tratamientos intravenosos: Gl exclusivamente tumores, G2 (control) , libre de Irinotecano, G3 (expt) , EGFRminicélulasShARN-MDR-? seguido por 96 horas más tarde por EGFRminicélulas?r?no, G4 (expt) , EGFRminicélulasshARN-DR-? seguido por 120 horas más tarde por EGFRminicélulasirino, y G5 (expt) , EGFRminicélulasshARN-DR-? seguido por 144 horas más tarde por EGFRminicélulas?r?no. El anticuerpo biespecífico utilizado para dirigir las células de cáncer de mama portaron especificidad contra el 0-antígeno de S . typhimurium en una ramificación y el EGFR humano en la otra ramificación. El volumen de tumores se muestra en el eje y. SEM se muestra para cada medición. La Figura 6 muestra el efecto de los programas de dosificación sobre la inversión de la resistencia a fármacos y el efecto terapéutico. Los xenoinjertos de cáncer de colon humano (Caco-2) se establecieron en ratones desnudos y se administraron los siguientes tratamientos intravenosos: Gl - exclusivamente tumores, G2 (control), 5- FU libre, G3 (expt) , EGFRminicélulasshARN-MDR-? seguido por 96 horas más tarde -por EGFRminicélulas5-FU, G4 (expt) , EGFRminicélulasshARN-MDR-? seguido por 120 horas más tarde por EGFRminicélulass5-FU, y G5 (expt) , EGFRminicélulasshARN-MDR-? seguido por 144 horas más tarde por EGFRminicélulas5-FU. El anticuerpo biespecífico utilizado para dirigir las células de cáncer de mama portaron especificidad contra el 0-antígeno de S . typhimurium en una ramificación y el EGFR humano en la otra ramificación. El volumen de tumores se muestra en el eje y. SEM se muestra para cada medición.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los inventores han descubierto que las minicélulas intactas derivadas bacterialmente pueden introducir segura y efectivamente en codocitos de mamífero cualquiera de una variedad de ácidos nucleicos funcionales, tales como por ejemplo, una molécula de siARN, una molécula de miARN, una ribozima, o un ácido nucleico antisentido. En el contexto particular de la infección por cáncer y VIH, los inventores han encontrado que la introducción de ácidos nucleicos funcionales en codocitos, vía minicélulas intactas, puede disminuir la resistencia a fármacos o la resistencia a la apoptosis en los codocitos. Los inventores también han descubierto que las minicélulas pueden transfectar secuencialmente los mismos codocitos de mamífero, particularmente in vivo, y que las minicélulas pueden suministrar secuencialmente una variedad de diferentes cargas a los mismos codocitos de mamífero. Estos descubrimientos en primer lugar son para cualquier vehículo para suministro de macropartículas y proporcionar, por primera vez, un método para el tratamiento de enfermedades multifactoriales complejas similares al cáncer y VIH, en donde se necesitan suministrar diferentes cargas terapéuticas a la misma célula antes de que se alcance un efecto terapéutico. De manera similar, los inventores han descubierto que el problema complejo de la resistencia a fármacos asociado con múltiples mutaciones en diferentes genes se puede enfrentar con minicélulas que introducen múltiples secuencias de ARNi en una célula hospedera para contrarrestar la multitud de defectos genéticos, y que permitan el suministro de ARNi suministrado por minicélulas y que permitan un tiempo suficiente para la descomposición de las proteínas con resistencia suministrada fármaco dirigidas, las células cancerosas anteriormente resistentes a fármacos y quimioterapéuticos específicos se pueden tratar efectivamente con minicélulas empacadas con los mismos fármacos. Es decir, la primera demostración in vivo para tratar efectivamente el cáncer que es refractario para todos los métodos de tratamiento. La concentración de fármacos quimioterapéuticos, suministrados vía minicélulas, requeridos para tratar células cancerosas resistentes a fármacos se descubrió para ser aproximadamente 1000 veces menor que el tratamiento libre de fármacos. Esto es un descubrimiento sorprendente debido a que todos los métodos anteriores para invertir la resistencia a fármacos utilizando ARNi o inhibidores de proteínas suministradoras de resistencia a fármacos todavía requirieron concentraciones de fármacos que pueden provocar grave toxicidad a un sujeto mamífero. De esta forma, el método de la invención, es decir, el suministro proporcionado por minicélulas de ARNi seguido por un fármaco quimioterapéutico suministrado por minicélulas, tiene el potencial de tratar el cáncer efectivamente sin una toxicidad grave. Adicionalmente, los inventores han descubierto que el serotipo de las minicélulas se puede adaptar para superar una respuesta inmunitaria del hospedero contra las minicélulas . La siguiente descripción señala la invención relacionada con estos descubrimientos, sin limitar la invención a las modalidades particulares, metodología, protocolos, o reactivos descritos. Asimismo, la terminología utilizada en la presente describe únicamente modalidades particulares y no limita el alcance de la invención.

I . Definiciones A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en esta descripción tienen el mismo significado según se comprende en general por aquellos con experiencia en la técnica relevante . Por conveniencia, más adelante se proporciona el significado de ciertos términos y frases empleados en la especificación, ejemplos, y reivindicaciones anexas. A lo largo de la especificación se definen otros términos y frases . Las formas singulares "un", "una", y "el" incluyen las referencias al plural a menos que el contexto lo dicte claramente de otra manera. "Oligonucleotido antisentido" hace referencia a una molécula de ácido nucleico complementaria para una proporción de un transcripto génico particular que pueda hibridarse al transcripto y bloquear su traducción. Un oligonucleótido antisentido puede comprender ARN o ADN. "Secuencia biomolecular" o "secuencia" hace referencia a la totalidad o una porción de una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos. "Cáncer", "neoplasma", "tumor", "malignidad" y "carcinoma", utilizados indistintamente en la presente, hacen referencia a células o tejidos que exhiban un fenotipo de crecimiento aberrante caracterizado por una pérdida significativa de control de proliferación celular. Los métodos y composiciones de esta invención se aplican particularmente a células precancerosas, malignas, pre-metastáticas, metastáticas, y no metastáticas. "Complementario" se refiere a la compatibilidad topológica o coincidencia junto con las superficies interactuantes de dos moléculas, tales como por ejemplo una molécula de ácido nucleico funcional y su blanco. Las moléculas se pueden describir como complementarias, y además, las características superficiales de contacto son complementarias entre si. "Corresponde a" o "representa" cuando se utilizan en el contexto de, por ejemplo, un polinucleótido o secuencia que "corresponde a" o "representa" un gen significa que una secuencia del polinucleótido está presente en el gen o en el producto génico de ácido nucleico, por ejemplo, ARNm. El polinucleótido puede estar presente en su totalidad dentro de un exón o una secuencia genómica del gen, o diferentes porciones de la secuencia del polinucleótido pueden estar presentes en diferentes exónes, por ejemplo, de tal forma que la secuencia de polinucleótidos contigua esté presente en un ARNm, ya sea antes o después del empalme, es decir un producto de expresión del gen.

"Citosina" es un término genérico para las proteínas liberadas por una población celular que actúan sobre otra población celular como mediadores intercelulares . "Fármaco" se refiere a cualquier sustancia fisiológica o farmacológicamente activa que produzca un efecto local o sistémico en animales, en particular mamíferos y seres humanos. "Expresión" en general se refiere al proceso mediante el cual una secuencia de polinucleótidos experimenta una transcripción y traducción exitosa de tal forma que se expresen en los niveles detectables de la secuencia de aminoácidos o la proteína. En ciertos contextos de la presente, expresión se refiere a la producción de ARNm. En otros contextos, expresión se refiere a la producción de proteínas. "Ácido nucleico funcional" se refiere a una molécula de ácido nucleico que, en el momento de la introducción en una célula hospedera, interfiera específicamente con la expresión de una proteína. En general, las moléculas de ácido nucleico funcional tienen la capacidad de reducir la expresión de una proteína al interactuar directamente con un transcripto que codifica para la proteína. Ribozimas, ácidos nucleicos antisentido y moléculas siARN, incluyendo las moléculas shARN, los ARN cortos (típicamente menores de 400 pares de bases de longitud) , los micro-ARN (miARN, por sus siglas en inglés) constituyen los ácidos nucleicos funcionales de ejemplo. "Gen" se refiere a una secuencia de polinucleótidos que comprende las secuencias control y de codificación necesarias para la producción de un polipéptido o precursor. El polipéptido puede estar codificado por una secuencia de codificación de longitud total o por cualquier porción de la secuencia de codificación. Un gen puede constituir una secuencia de codificación ininterrumpida o puede incluir uno o más intrones, unidos por las uniones de empalme adecuadas. Además, un gen puede contener una o más modificaciones en las regiones ya sea de codificación o sin traducir que podrían afectar la actividad biológica o la estructura química del producto de expresión, la velocidad de expresión, o la manera de controlar la expresión. Estas modificaciones incluyen de manera enunciativa, mutaciones, inserciones, supresiones y sustituciones de uno o más nucleótidos. Con respecto a esto, estos genes modificados se pueden denominar como "variantes" del gen "nativo". "Célula hospedera" se refiere a una célula que se puede utilizar o, que se ha utilizado como un recipiente para un vector recombinante u otra transferencia de polinucleótidos, e incluye la progenie de la célula original que se haya transfectado. La progenie de una célula individual no necesariamente puede ser totalmente idéntica en morfología o en el complemento genómico o con ADN total que la madre original debido a una mutación natural accidental o deliberada. "Hibridación" se refiere a cualquier proceso mediante el cual una secuencia de polinucleótidos se une a una secuencia complementaria a través de un pareo de bases. "Individuo", "sujeto", "hospedero" y "paciente", utilizados indistintamente en la presente, se refieren a cualquier sujeto mamífero para el cual se desea un diagnóstico, tratamiento, o terapia. En una modalidad preferida, el individual, sujeto, hospedero, paciente es un ser humano. Otros sujetos pueden incluir de manera enunciativa, cabras, caballos, perros, gatos, cobayos, conejos, ratas, primates, y ratones. "Marca" se refiere a agentes que son capaces de proporcionar una señal detectable, ya sea directamente o a través de una interacción con uno o más miembros adicionales de un sistema para producción de señales. Las marcas que se pueden detectar directamente y que pueden encontrar utilidad en la invención incluyen marcas fluorescentes. Los fluoróforos específicos incluyen tintes de fluoresceína, rhodamina, BODIPY, cianina y lo semejante. La invención también contempla el uso de isótopos radiactivos, tales como por ejemplo, 35S, 32P, 3H, y lo semejante como marcas. También se pueden utilizar marcas colorimétricas tales como por ejemplo, perlas, doradas coloidales o de vidrio coloreado o de plástico (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex) Por ejemplo, véanse las patentes de los Estados Unidos No. 4,366,241, No. 4,277,437, No. 4,275,149, No. 3,996,345, No. 3,939,350, No. 3,850,752, y No. 3,817,837. "Oligonucleótido" se refiere a un polinucleótido que comprende, por ejemplo, entre aproximadamente 10 nucleótidos (nt, por sus siglas en inglés) hasta 1000 nt . Los oligonucleótidos para utilizarse en la invención de preferencia son entre aproximadamente 10 nt hasta 150 nt . El oligonucleótido puede ser un oligonucleótido que se presente en la naturaleza o un oligonucleótido sintético. Los oligonucleótidos se pueden modificar. "Minicélula" se refiere a formas anucleadas de células bacterianas, engendrada por una interrupción en la coordinación, durante la fisión binaria, de la división celular con la segregación de ADN. Las minicélulas son distintas de otras pequeñas vesículas que se generan y liberan espontáneamente en ciertas situaciones y, en contraste con las minicélulas, no son aptas a redisposiciones genéticas específicas o una expresión génica episomal. Para la práctica de la presente invención, es conveniente que las minicélulas tengan paredes celulares intactas ("minicélulas intactas"). "Oligonucleótido modificado" y "polinucleótido modificado" se refieren a oligonucleótidos y polinucleótidos con una o más modificaciones químicas a nivel molecular de las estructuras moleculares naturales de la totalidad o cualquiera de las bases, entidades de azúcar, entidades fosfato internucleósido, así como también moléculas que tengan sustituciones agregadas o una combinación o modificaciones en estos sitios. Los enlaces de fosfato internucleósido pueden ser fosfodiéster, fosfotriéster, fosforamidato, siloxano, carbonato, carboximetiléster, acetamidato, carbamato, tioéter, fosforamidato puenteado, fosfonato de metileno puenteado, fosforotioato, metilfosfonato, fosforoditioato, fosforoditioato puenteado o enlaces internucleotídicos de sulfota, o enlaces 3' -3', 5' -3', ó 5' -5', y combinaciones de estos enlaces similares. El enlace fosfodiéster se puede reemplazar con un enlace sustituto, tal como por ejemplo, fosforotioato, metilamino, metilfosfonato, fosforamidato, y guanidina, y la subunidad de ribosa de los polinucleótidos también se puede sustituir (por ejemplo, hexosa fosfodiéster; ácidos nucleicos peptídicos). Las modificaciones pueden ser internas (individuales o repetidas) o en el extremo o extremos de la molécula de oligonucleótidos, y puede incluir adiciones a la molécula de los enlaces de fosfato internucleósido, tales como por ejemplo, modificaciones con desoxirribosa y fosfato que se escinden o reticulan a las cadenas opuestas o a las enzimas asociadas u otras proteínas. Los términos "oligonucleótidos modificados" y "polinucleótidos modificados" también incluyen oligonucleótidos y polinucleótidos que comprenden modificaciones a las entidades de azúcar (por ejemplo, monómeros de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos 3' -sustituidos) , cualquiera de los mismos se unen conjuntamente vía enlaces 5' a 3' . La frase "moléculas de ácido nucleico" y el término "polinucleótidos" denotan formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos . Los mismos incluyen, ADN o ARN individual, doble o multi-encadenado, ADN genómico, ADNc, híbridos de ADN-ARN, o un polímero que comprende bases de purina y pirimidina u otras bases nucleótido, química o bioquímicamente modificadas, no naturales, o derivadas. La estructura de un polinucleótido puede comprender azúcares y grupos fosfato (como se puede encontrar típicamente en el ARN o ADN) , o grupos de azúcar o fosfato modificados o sustituidos. Alternativamente, la estructura del polinucleótido puede comprender un polímero de subunidades sintéticas tal como por ejemplo, fosforamiditas y de esta forma puede ser un fosforamidato de oligodesoxinucleósido o un oligómero de fosforamidato-fosfodiéster mezclado. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como por ejemplo, nucleótidos metilados y análogos nucleotídicos, uracilo, otros azúcares, y grupos enlazantes tales como por ejemplo, fluororibosa y tioato, y ramificaciones nucleotídicas. Un polinucleótido se puede modificar adicionalmente, tal como por ejemplo, mediante la conjugación con un componente marcador. Otros tipos de modificaciones incluyen remates, la sustitución de uno o más de los nucleótidos que se presentan en la naturaleza con un análogo, y la introducción de medios para unir el polinucleótido a proteínas, iones metálicos, componentes marcadores, otros polinucleótidos, o un soporte sólido. "Farmacéuticamente aceptable" se refiere a la compatibilidad fisiológica. Un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable no anula la actividad biológica de la composición que será administrada, es químicamente inerte y no es tóxico para el organismo en el cual se administrará . "Polipéptido" y "proteína", utilizados indistintamente en la presente, se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden incluir aminoácidos traducidos, sin traducir, modificados químicamente, modificados bioquímicamente, y derivados. Un polipéptido o proteína se puede presentar en la naturaleza, ser recombinante, o sintético, o cualquier combinación de éstos. Además, un polipéptido o proteína puede comprender un fragmento o una proteína o polipéptido que se presenta en la naturaleza. Un polipéptido o proteína puede ser una molécula individual o puede ser un complejo multimolecular. Además, estos polipéptidos o proteínas pueden tener estructuras peptídicas modificadas. Los términos incluyen proteínas de fusión, incluyendo proteínas de fusión con una secuencia de aminoácidos heteróloga, fusiones con secuencias líder, heterólogas y homologas, con o sin residuos de metionina N-terminales, proteínas marcadas inmunológicamente y lo semejante. "Purificado" se refiere a un compuesto que se retira de su entorno natural y está al menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, o 99.99% libre de otros componentes con los cuales se asocia en la naturaleza. "Ribozima" se refiere a una molécula de ARN que tiene una actividad enzimática que puede escindir repetidamente otras moléculas de ARN de una manera secuencia-específica con base de nucleótido. "Interferencia de ARN" (ARNi, por sus siglas en inglés) se refiere a una supresión secuencia-específica o gen-específica de la expresión génica (síntesis de proteínas) que se suministra por un ARN de interferencia corta (siARN, por sus siglas en inglés), ARN de horquilla corta, ARN corto o micro-ARN. "Identidad de secuencias" se refiere a un grado de similitud o complementariedad. Puede haber una identidad parcial o una identidad completa. Una secuencia parcialmente complementaria es aquella que inhibe al menos parcialmente una secuencia idéntica de la hibridación a un polinucleótido blanco; se prefiere utilizar el término funcional "prácticamente idéntico". La inhibición de la hibridación de la secuencia completamente complementaria a la secuencia blanco se puede examinar utilizando un análisis de hibridación (transferencia Southern o Northern, hibridación en solución, y lo semejante) bajo condiciones de bajo rigor. Una secuencia prácticamente idéntica o solución de ensayo se completará para inhibir la unión (es decir, la hibridación) de una secuencia completamente idéntica o solución de ensayo para la secuencia blanco bajo condiciones de bajo rigor. Esto no quiere decir que las condiciones de bajo rigor sean tales que no se permita la unión específica; las condiciones de bajo rigor requieren que la unión de dos secuencias entre sí sea una interacción específica (es decir, selectiva) . La ausencia de unión no específica se puede probar mediante el uso de una segunda secuencia blanco que carezca incluso de un grado parcial de complementariedad (por ejemplo, menor de aproximadamente 30% de identidad) , en ausencia de unión no específica, la solución de ensayo no hibridará a la segunda secuencia blanco no complementaria. Otra forma de observar la identidad de secuencia, en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o polipeptídicas, implica hacer referencia a residuos en las dos secuencias que sean iguales cuando se alinean para una máxima correspondencia con respecto a una región específica. En el sentido en el que se utiliza en la presente, "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado al comparar dos secuencias alineadas óptimamente con respecto a una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacios) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula al determinar el número de posiciones en las cuales se presenta la base de ácido nucleico idéntica en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones que coinciden, dividiendo el número de posiciones que coinciden entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicar el resultado por 100 para obtener el porcentaje de la identidad de secuencia. "ARN de interferencia corta" (siARN) se refiere a moléculas de ARN de doble cadena, en general, entre aproximadamente 10 y 30 nucleótidos de longitud que sean capaces de suministrar una interferencia de ARN (ARNi) . En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término siARN incluye los ARN de horquilla corta, también conocidos como los shARN. Los términos "tratamiento", "tratando", "tratar", y lo semejante hacen referencia a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en los términos de evitar completa o parcialmente una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en los términos de estabilización parcial o completa o la cura para una enfermedad y/o el efecto adverso que se pueda atribuir a la enfermedad. "Tratamiento" cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, en particular un ser humano, e incluye: (a) evitar que la enfermedad o síntoma se presente en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad o síntoma pero que no se le haya diagnosticado todavía; (b) inhibir el síntoma de la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar el síntoma de la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o síntoma.

II . Suministro de ácidos nucleicos funcionales via minicélulas En un aspecto, la invención proporciona un método para suministrar un ácido nucleico funcional a un codocito, que comprende (a) proporcionar una minicélula intacta que contiene una molécula de ácido nucleico funcional o un plásmido que comprende un segmento que codifica para una molécula de ácido nucleico funcional, luego, (b) poner la minicélula en contacto con un codocito de mamífero, de tal forma que la célula mamífera envuelva a la minicélula. Después de envolver la minicélula, la molécula de ácido nucleico funcional se libera en el citoplasma del codocito o se expresa por el codocito. Las minicélulas pueden entrar en contacto con los codocitos de mamífero vía ligandos biespecíficos, según se describe en la WO 2005/056749. El contacto entre la minicélula y el codocito de mamífero se puede realizar ín vi tro o ín vivo .

A. Minicélulas Las minicélulas de la invención son formas anucleadas de E. coli u otras células bacterianas, engendradas por una interrupción de la coordinación, durante la fisión binaria, de la división celular con segregación de ADN. La replicación cromosómica procariota se vincula con la fisión binaria normal, que implica la formación de un septo a la mitad de la célula. En E . coli , por ejemplo, la mutación de los genes min, tales como por ejemplo, minCD, puede eliminar la inhibición de la formación del septo en los polos celulares durante la división celular, dando por resultado en la producción de una célula hija normal y una minicélula anucleada. Véase Boer et al . , 1992; Raskin y de Boer, 1999; Hu y Lutkenhaus, 1999; Harry, 2001. Las minicélulas son distintas de otras pequeñas vesículas que se generan y liberan espontáneamente en ciertas situaciones y, en contraste con las minicélulas, no son aptas para redisposiciones genéticas específicas o la expresión génica episomal. Para la practicar de la presente invención, es conveniente que las minicélulas tengan paredes celulares intactas ("minicélulas intactas") . Además de las mutaciones min operón, las minicélulas anucleadas también se generan siguiendo una variedad de otras redisposiciones genéticas o mutaciones que afecten la formación del septo, por ejemplo en el ivIVBl en B . subtilis . Véase Reeve and Cornett, 1975; Levin et al . , 1992. Las minicélulas también se pueden formar siguiendo una perturbación en los niveles de expresión génica de las proteínas implicadas en la división celular/segregación de cromosomas. Por ejemplo, la sobre- expresión de minE conduce a una división polar y a la producción de minicélulas. Similarmente, las minicélulas con menos cromosomas pueden dar por resultado en defectos de la segregación de cromosomas por ejemplo la mutación en Bacillus subtílís (Britton et al . , 1998), la supresión de spoOJ en B. subtilis (Ireton et al . , 1994), la mutación mukB en E . coli (Hiraga et al . , 1989), y la mutación parC en E. coli (Stewart and D'Ari, 1992) . Los productos génicos se pueden suministrar in trans . Cuando se sóbreexpresan a partir de un alto número de copias de plásmidos, por ejemplo, CafA puede mejorar la velocidad de la división celular y/o inhibir la división de cromosomas después de la replicación (Okada et al . , 1994), dando por resultado en la formación de células encadenadas y minicélulas anucleadas (Wachi et ai., 1989; Okada et al . , 1993). Las minicélulas se pueden preparar a partir de cualquier célula bacteriana de origen Gram-positivo o Gram-negativo . De acuerdo con la invención, las minicélulas contienen un ácido nucleico funcional o un plásmido que codifica para un ácido nucleico funcional para el cual se desea el suministro. Las moléculas de ácido nucleico "funcional" de la invención tienen la capacidad de reducir la expresión de una proteína al interactuar directamente con un transcripto que codifica para la proteína. Las moléculas de siARN, ribozimas, y ácidos nucleicos antisentido constituyen ácidos nucleicos funcionales de ejemplo .

B . Moléculas de siARN Las moléculas de ARN de interferencia corta (siARN) son útiles para realizar la interferencia del ARN (ARNi) , un mecanismo lentificador de genes pos-transcripcional . siARN en general se refiere a moléculas de ARN de doble cadena entre 10 y 30 nucleótidos de longitud que se denominan por su capacidad específicamente para interferir con la expresión de proteínas. De preferencia, las moléculas de siARN tienen 12-28 nucleótidos de longitud, de mayor preferencia 15-25 nucleótidos de longitud, todavía de mayor preferencia 19-23 nucleótidos de longitud y con la máxima preferencia 21-23 nucleótidos de longitud. Por lo tanto, las moléculas de siARN preferidas tienen 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 28 ó 29 nucleótidos de longitud. La longitud de una cadena designa la longitud de una molécula de siARN. Por ejemplo, un siARN que se describe como 21 ribonucleótidos de longitud (un 21-mer) podría comprender dos cadenas opuestos de ARN que se fijan conjuntamente para 19 pares de bases contiguas. Los dos ribonucleótidos restantes en cada cadena podrían formar una "saliente". Cuando un siARN contiene dos cadenas de diferentes longitudes, la mayor de las cadenas designa la longitud del siARN. Por ejemplo, un dsARN que contiene una cadena que tenga 21 nucleótidos de longitud y una segunda cadena que tenga 20 nucleótidos de longitud, constituye un 21-mer. Los siARN que comprenden una saliente son convenientes. La saliente puede estar en el extremo 5' o 3' de una cadena. De preferencia, está en el extremo 3' de la cadena de ARN. La longitud de una saliente puede variar, aunque de preferencia está entre aproximadamente 1 hasta 5 bases, y de mayor preferencia tiene aproximadamente 2 nucleótidos de longitud. De preferencia, el siARN de la presente invención comprenderá una saliente 3' entre aproximadamente 2 hasta 4 bases. De mayor preferencia, la saliente 3' tiene 2 ribonucleótidos de longitud. Incluso de mayor preferencia, los 2 ribonucleótidos que comprenden la saliente 3' son uridina (U, por sus siglas en inglés) . De acuerdo con la invención, el término siARN incluye los ARN de horquilla corta (shARN, por sus siglas en inglés) . Los shARN comprenden una cadena individual de ARN que forma una estructura de enlace de tronco, en donde el tronco consiste de las cadenas sentido y antisentido complementarias que comprenden un siARN de doble cadena, y el enlace es un enlazante de tamaño variable. La estructura de tronco de los shARN en general está entre aproximadamente 10 hasta 30 nucleótidos de longitud. De preferencia, el tronco de las moléculas de shARN tiene 12- 28 nucleótidos de longitud, de mayor preferencia 15-25 nucleótidos de longitud, incluso de mayor preferencia 19-23 nucleótidos de longitud y con la máxima preferencia 21-23 nucleótidos de longitud. Por lo tanto, las moléculas preferidas de shARN comprenden troncos que tienen 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 28 ó 29 nucleótidos en longitud. Los siARN de la invención se designan para que interactúen con una secuencia de ribonucleótidos blanco, lo que significa que complementan una secuencia blanco suficientemente para que se hibride a la secuencia blanco. En una modalidad, la invención proporciona una molécula de siARN que comprende una secuencia de ribonucleótidos de al menos 70%, 75%, 80%, 85% o 90% idéntica a una secuencia de ribonucleótidos blanco o el complemento de una secuencia de ribonucleótidos blanco. De preferencia, la molécula de siARN es al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de ribonucleótidos blanco o al complemento de la secuencia de ribonucleótidos blanco. De mayor preferencia, un siARN será 100% idéntico a la secuencia de nucleótidos blanco o al complemento de la secuencia de ribonucleótidos. Sin embargo, las moléculas de siARN con inserciones, supresiones o mutaciones de punto individual con relación al blanco también pueden ser efectivas . Las herramientas para ayudar al diseño del siARN están fácilmente disponibles para el público. Por ejemplo, una herramienta de diseño de siARN con base en computadora está disponible en la Internet en WWW.dharmacon.com.

C . Ribozimas Las ribozimas son moléculas de ARN que tienen una actividad enzimática que pueda escindir repetidamente otras moléculas de ARN en una base de nucleótidos de manera secuencia-específica. Estas moléculas de ARN enzimático se pueden dirigir para transcribir virtualmente cualquier ARN, y la escisión eficiente alcanzada in vi tro . Actualmente se conocen seis variedades básicas de los ARN enzimáticos que se presentan en la naturaleza. Cada uno puede catalizar la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster de ARN en trans (y de esta forma pueden escindir otras moléculas de ARN) bajo condiciones fisiológicas. En general, los polinucleótidos enzimáticos actúan al unirse primero a un ARN blanco. Esta unión se presenta a través de la porción de unión blanco de un polinucleótido enzimático que se mantiene en proximidad cercana a una porción enzimática de la molécula que actúa para escindir el ARN blanco. De esta forma, el polinucleótido enzimático se reconoce primero y luego se une a un ARN blanco a través de un par de bases complementario, y una vez unido al sitio correcto, actúa enzimáticamente para cortar el ARN blanco. La escisión estratégica de este ARN blanco destruirá su capacidad para dirigir la síntesis de una proteína codificada. Después de que un polinucleótido enzimático se haya unido y escindido su ARN blanco, éste se libera del ARN en la búsqueda de otro blanco y se puede unir y escindir repetidamente nuevos blancos. La naturaleza enzimática de una ribozima es ventajosa. Debido a que una molécula de ribozima individual es capaz de escindir muchas moléculas del ARN blanco, pueden ser muy bajas las concentraciones efectivas de ribozima. Las ribozimas útiles pueden comprender uno o varios motivos, incluyendo cabeza de martillo, (Rossi et al . , (1992)), horquilla (Hampel and Tritz, (1989), Hampel et al . , (1990)), motivo del virus de hepatitis delta (Perrotta and Been (1992), intrón grupo I (patente de los Estados Unidos No. 4,987,071), ARN de RNasaP en asociación con una secuencia guía de ARN (Guerrier-Takada et al . , (1983)), y neuroespora CONTRA ARN (Saville & Collins (1990); Saville & Collins (1991); Collins & Olive (1993)). Estos motivos específicos no son limitantes, ya que lo importante en una ribozima de esta invención es que tenga un sitio específico de unión a sustratos que sea complementario con una o más regiones del ARN blanco, y que tenga secuencias de nucleótidos dentro o que rodeen ese sitio de unión con sustrato que imparten una actividad de escisión con ARN a la molécula. Las ribozimas de la invención pueden comprender oligonucleótidos modificados (por ejemplo, para una estabilidad, dirección, etc., mejorados). Las secuencias de ácido nucleicos que codifican para las ribozimas pueden estar bajo el control de un promotor constitutivo fuerte, tal como por ejemplo, ARN polimerasa II o un promotor de ARN polimerasa III, de tal forma que las células transfectadas produzcan suficientes cantidades de la ribozima para destruir los mensajes endógenos blanco e inhibir la traducción.

D. Oligonucleótidos antisentido Los oligonucleótidos antisentido de la invención se hibridan específicamente con un ácido nucleicos que codifica para una proteína, e interfieren con la transcripción o traducción de la proteina. En una modalidad, un oligonucleótido antisentido se dirige al ADN e interfiere con su replicación y/o transcripción. En otra modalidad, un oligonucleótido antisentido se hibrida específicamente con un ARN, incluyendo pre-ARNm, y ARNm. Estos oligonucleótidos antisentido pueden afectar, por ejemplo, la translocación del ARN al sitio de la traducción de la proteína, la traducción de la proteína del ARN, el empalme del ARN para proporcionar una o más especies del ARNm, y la actividad catalítica que se puede comprometer o facilitar por el ARN. El efecto global de esta interferencia es modular, disminuir, o inhibir la expresión de proteínas blanco. Existen diversos sitios dentro de un gen que se pueden utilizar para el diseño de un oligonucleótido del antisentido. Por ejemplo, un oligonucleótido antisentido puede unirse a la región que abarca el codón para inicio de traducción, también conocido como el codón de inicio, de la trama de lectura abierta. Con respecto a esto, "codón de inicio" y "codón para inicio de traducción" en general se refieren a la porción de este ARNm o gen que abarca entre al menos 25 hasta 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5' o 3' ) de un codón para inicio de traducción. Otro sitio para que se presente la interacción antisentido es el codón de término de la trama de lectura abierta. Los términos "región de codón de paro" y "región de codón del término de traducción" se refieren en general a una porción de ese ARNm o gen que abarca entre aproximadamente 25 y hasta 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección desde un codón para terminar la traducción. La trama de lectura abierta o región codificante también se puede dirigir efectivamente. La trama de lectura abierta en general se entiende que se refiere a la región entre el codón para inicio de traducción y el codón para término de traducción. Otra región blanco es la región sin traducir 5' , que es la porción de un ARNm en la dirección 5' del codón de inicio de traducción. Incluye los nucleótidos entre el sitio de remate 5' y el codón para inicio de traducción de un ARNm o los nucleótidos correspondientes sobre el gen. De manera similar, la región sin traducir 3' se puede utilizar como un blanco para los oligonucleótidos antisentido. La región sin traducir 3' es aquella porción del ARNm en la dirección 3' del codón para término de traducción, y de esta forma incluye los nucleótidos entre el codón para término de traducción y el extremo 3' de un ARNm o los nucleótidos correspondientes del gen. Un oligonucleótido antisentido también se puede dirigir a la región de remate 5' de un ARNm. El remate 5' comprende un residuo de guanosina N7-metilada unido al mayor residuo 5' del ARNm vía un enlace 5' -5' trifosfato. La región de remate 5' se considera que incluye la estructura de remate 5' misma así como también los primeros 50 nucleótidos adyacentes al remate. Aunque algunos transcriptos de ARNm eucariota se traducen directamente, pueden contener una o más regiones intrón, que se separan de un transcripto antes de que se traduzca. Las regiones exón restantes (y por lo tanto traducidas) se empalman conjuntamente para formar una secuencia de ARNm continuo. Los sitios de empalme con ARNm, es decir, las uniones intrón-exón, representan posibles regiones blanco, y son particularmente útiles en situaciones en donde esté implicada en la enfermedad un empalme aberrante, o en donde esté implicada en la enfermedad una sobre-producción de un producto de empalme de ARNm particular. Además, las uniones de fusión aberrantes debidas a las redisposiciones y supresiones también son posibles blancos para los oligonucleótidos antisentido. Con estos diversos sitios blanco en mente, los oligonucleótidos antisentido que son suficientemente complementarios para los polinucleótidos blanco se deben seleccionar. Debe haber suficiente grado de complementariedad o un pareo preciso de tal forma que se presente una unión estable y específica entre el oligonucleótido y el polinucleótido blanco. De manera importantemente, la secuencia de un oligonucleótido antisentido no necesita ser 100% complementario con el de su polinucleótido blanco para que se pueda hibridar específicamente. Un oligonucleótido antisentido se puede hibridizar específicamente cuando se une al oligonucleótido antisentido para que el polinucleótido blanco interfiera con la función normal del polinucleótido blanco para que provoque una pérdida de utilidad, y haya un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión específica del oligonucleótido antisentido a las secuencias no blanco las condiciones en las cuales se desea la unión específica, es decir, bajo condiciones fisiológicas en el caso de análisis in vivo o un tratamiento terapéutico, y en el caso de análisis in vi tro, bajo condiciones en las cuales se realicen los análisis. Los oligonucleótidos antisentido pueden ser al menos aproximadamente 8 nt o al menos aproximadamente 50 nt de longitud. En una modalidad, los oligonucleótidos antisentido pueden tener entre aproximadamente 12 hasta 30 nt de longitud. Los oligonucleótidos antisentido utilizados de acuerdo con esta invención se pueden preparar conveniente y rutinariamente a través de la técnica bien conocida de síntesis en fase de sólidos. El equipo para esta síntesis se vende por diversos vendedores incluyendo, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA) . Se puede emplear adicional o alternativamente cualquier otro medio para esta síntesis conocida en la técnica. Se conoce bien la utilización de técnicas similares para preparar oligonucleótidos tales como por ejemplo, los fosforotioatos y los derivados alquilados.

E . Ácidos nucleicos que codifican para ácidos nucleicos funcionales En modalidades preferidas de la invención, las minicélulas comprenden ácidos nucleicos que codifican para ácidos nucleicos funcionales. Por ejemplo, un plásmido puede codificar para un ácido nucleico funcional que se expresa dentro de codocitos de mamífero. Esto hace posible el suministro endógeno de ácidos nucleicos funcionales, lo cual tiene ventajas con respecto a la naturaleza transitoria del suministro exógena. De esta forma, las minicélulas intactas recombinantes pueden portar ADN de plásmido que codifica para una o más secuencias de siARN dirigidas a lentificar los genes de resistencia a fármacos o de resistencia a la apoptosis. La utilización de minicélulas que codifiquen para múltiples ácidos nucleicos funcionales, es posible para tratar células que expresan múltiples mecanismos de resistencia a fármacos. A partir de diferentes promotores se pueden expresar individualmente diferentes secuencias de siARN. Por ejemplo, el siARN que se dirige al ARNm del PGP se puede expresar a partir del promotor U6 y el siARN que se dirige al ARNm Bcl-2 se puede expresar a partir del promotor Hl . Estos cassettes de expresión múltiple de preferencia se portan sobre un plásmido individual, aunque también pueden estar en diferentes plásmidos. Las diferentes secuencias de siARN también se pueden expresar a partir de un promotor individual, en donde el plásmido recombinante porta un cassette de expresión comprendido de múltiples secuencias para codificación de siARN, que se enlazan conjuntamente vía secuencias de polinucleótidos sin codificación. Un terminador de transcripción génica individual se puede colocar en la dirección 3' del cassette de expresión completa. En una estrategia, un plásmido codifica las cadenas sentido y antisentido de un siARN como dos transcriptos independientes que, después de la expresión dentro de una codocito, se hibridan para formar duplicados de siARN funcionales. En una segunda estrategia preferida, un plásmido codifica para uno o más de los siARN que cada uno se ' expresan como un transcripto individual que forma una estructura de enlace de tronco con ARN de horquilla corta. La estructura de horquilla se puede procesar mediante una enzima Dicer en un siARN funcional.

F . Elementos reporteros Una molécula de ácido nucleico que se introducirá vía el procedimiento de la presente invención puede incluir un elemento reportero. Un elemento reportero confiere sobre su hospedero recombinante un fenotipo fácilmente perceptible o característica, típicamente mediante la codificación de un polipéptido, no producido de otra manera por el hospedero, que se pueda detectar, en el momento de la expresión, mediante análisis histológico o in si tu, tal como por ejemplo, mediante técnicas para formación de imagen in vivo . Por ejemplo, un elemento reportero suministrado por una minicélula intacta, de acuerdo con la presente invención, podría codificar para una proteína que produzca, en el envolvimiento de la célula hospedera, un cambio colorimétrico o fluorométrico que sea detectable mediante análisis in si tu y que sea una función cuantitativa o semi-cuantitativa de la activación transcripcional. Lo ilustrativo de estas proteínas son esterasas, fosfatasas, proteasas y otras enzimas, la actividad de las mismas genera un cromóforo o fluoróforo detectable. Los ejemplos preferidos son ß-galactosidasa, de E . coli , que efectúa un cambio de color vía la escisión de un sustrato indigogénico, indolil-ß-D-galactosida, y una luciferasa, que oxida un aldehido de cadena larga (luciferasa bacteriana) o un ácido carboxílico heterocíclico (luciferina) , con la nivelación concomitante de luz. En este contexto también es útil un elemento reportero que codifica para la proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés) de las medusa, Aequorea victoria , según se describe por Prasher et al . , (1995). El campo de la tecnología relacionada con GFP se ilustra por dos solicitudes del PCT publicadas, WO 095/21191 (expone una secuencia de polinucleótidos que codifica para una apoproteína GFP de 238 aminoácidos, que contiene un cromóforo formado de 65 hasta 67 aminoácidos) y la WO 095/21191 (expone una modificación del ADNc para el apopéptido de la GFP del A . victoria , que proporciona un péptido que tiene propiedades fluorescentes alteradas) , y mediante un reporte de Heim et al . , (1994) de una GFP mutante, caracterizada por una mejora en la amplitud de excitación de 4 hasta 6 veces. Otro tipo de un elemento reportero se asocia con un producto de expresión que proporciona la minicélula recombinante resistente a una toxina. Por ejemplo, el gen neo protege a un hospedero contra niveles tóxicos de antibiótico G418, mientras que un gen que codifica para dihidrofolato reductasa confiere resistencia a metotrexato, y el gen de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT, por sus siglas en inglés) confiere resistencia a cloranfenicol.

Otros genes para utilizarse como un elemento reportero incluyen aquellos que puedan transformar una minicélula hospedera para que exprese de manera diferente antígenos de superficie celular, por ejemplo, proteínas con envoltura viral tales como por ejemplo, gpl20 de VIH o gD de herpes, que se pueden detectar fácilmente mediante inmunoensayos .

G . Elementos reguladores Una molécula de ácido nucleicos que será introducida vía el procedimiento de la presente invención también puede tener un segmento de codificación deseado enlazado funcionalmente a un elemento regulador, tal como por ejemplo, un promotor, un terminador, un intensificador y/o una secuencia de señal. Un promotor adecuado puede ser tejido específico o incluso tumor específico, según lo dicte el contexto terapéutico. Un promotor es "tejido-específico" cuando se activa de preferencia en un tejido dado y, por lo tanto, es efectivo para conducir la expresión, en el tejido blanco, de una secuencia estructural enlazada funcionalmente. La categoría de promotores tejido-específicos incluye, por ejemplo: el promotor hepatocito-específico para albúmina y ai-antitripsina, respectivamente; la región para control de gen elastasa I, que es activo en las células acinares pancreáticas; la región para control del gen de insulina, activo en células beta pancreáticas; la región para control del virus en tumores mamarios de ratón, que es activo en células testiculares, de mama, linfoideas y mastocitos; la región para control de genes proteínicos básicos con mielina, las células activas en oligodendrocitos en el cerebro; y la región para el control de genes de la hormona para liberación gonadotrópica, que es activa en las células del hipotálamo. Véase, Frain et al . , (1990), Ciliberto et al . , (1985), Pinkert et al . , (1987), Kelsey et al . , (1987), Swift et ai., (1984), MacDonald (1987), Hanahan, (1985), Leder et al . , (1986), Readhead et al . , (1987), y Masón et al . , (1986) . También existen promotores que se expresan de preferencia en ciertas células tumorales o en células tumorales per se, y que son útiles para tratar diferentes cánceres de acuerdo con la presente invención. La clase de promotores que son específicos para las células cancerosas se ilustra por: el promotor de tirosinasa, para melanomas blanco; el promotor MUC1/DÍ3, para carcinoma de mama blanco; el intensificador myoD híbrido/SV40, que dirige la expresión a rabdomiosarcoma (RMS, por sus siglas en inglés); el promotor del antígeno carcinoembriónico (CEA, por sus siglas en inglés), que es específico para las células que expresan CEA tales como por ejemplo, células de cáncer de colon, y el promotor del gen tipo II de hexocinasa, para dirigirse a carcinomas pulmonares de célula no pequeña. Véase Hart (1996), Morton & Potter (1998), Kurane et al . , (1998) y Katabi et al . , (1999). Los promotores que dependen de su ARN polimerasa (pol) II o pol II son los promotores preferidos. Los promotores altamente preferidos son los promotores Hl y U6 de ARN III polimerasa. Se puede utilizar una secuencia de señal, de acuerdo con la presente invención, para efectuar la secreción de un producto de expresión o localización de un producto de expresión hacia un compartimiento celular particular. De esta forma, una molécula de polinucleótidos terapéuticos que se suministra vía minicélulas intactas puede incluir una secuencia de señal, en una trama de lectura adecuada, de tal forma que el producto de expresión de interés se secrete por una célula envolvente o su progenie, para influir mediante esto a las células circundantes, manteniendo el paradigma del tratamiento seleccionado. Las secuencias de señales ilustrativas incluyen la secuencia de secreción C-terminal de haemolisina, descrita en la patente de los Estados Unidos No. 5,143,830, la secuencia de secreción de BARÍ, expuesta en la patente de los Estados Unidos No. 5,037,743, y la porción de secuencia de señal del polipéptido zsig32, destrito en la patente de los Estados Unidos No. 6,025,197.

H . Blancos de ácidos nucleicos f ncionales Los ácidos nucleicos funcionales de la invención se dirigen al gen o transcripto de una proteína que estimula la resistencia a fármacos, inhibe la apoptosis o estimula un fenotipo neoplásico. La aplicación exitosa de estrategias de ácido nucleico funcional en este contexto se ha alcanzado en la técnica, aunque sin los beneficios de los vectores minicelulares . Véase, por ejemplo, Sioud (2004), Caplen (2003), Wu et al . , (2003), Nieth et al . , (2003), Caplen and Mousses (2003), Duxbury et al . , (2004), Yague et al . , (2004), Duan et al . , (2004), Las proteínas que contribuyen a la resistencia a fármacos constituyen las blancos preferidos de ácidos nucleicos funcionales. Las proteínas pueden contribuir a la resistencia a fármacos adquirida o la resistencia a fármacos intrínseca. Cuando las células enfermas, tales como por ejemplo, células tumorales, responden inicialmente a fármacos, aunque se tornan refractarias en ciclos posteriores de tratamiento, se adquiere el fenotipo resistente. Las blancos útiles implicados en la resistencia a fármacos adquirida incluyen los transportadores con cassette de unión de ATP tales como por ejemplo, P-glucoproteína (PGP, P-170, PGYl, MDR1, ABCB1, proteína MDR-asociada, proteína con resistencia a múltiples fármacos 1), MDR-2 y MDR-3. MRP2 (proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos), BCR-ABL (región grupo con punto de ruptura-protooncogen Abelson) , una proteina asociada con la resistencia a STI-571, proteína relacionada con resistencia pulmonar, ciclooxigenasa-2, factor nuclear kappa, XRCC1 (grupo 1 para complementación cruzada con rayo X) , ERCC1 (gen de complemento cruzado para escisión) , GSTP1 (Glutatión S-transferasa ß-tubulina mutante, y factores de crecimiento tales como por ejemplo, IL-6 son blancos adicionales implicados en la resistencia a fármacos adquirida. Cuando las células sin tratar anteriormente fracasan en responder a uno o más fármacos, el fenotipo resistente es intrínseco. Un ejemplo de una proteina que contribuye a la resistencia intrínseca es LRP (proteína relacionada con la resistencia pulmonar) . Los blancos útiles también incluyen proteínas que contribuyen a la resistencia a la apoptosis. Estos incluyen Bcl-2 (leucemia/linforna de linfocitos B) , Bcl-XL, Al/Bfl 1, cinasa de adhesión focal y proteína mutante p53. Los blancos útiles incluyen además proteínas supresoras de tumor oncogénico y mutante. Los ejemplos incluyen ß-catenina, PKC-a (proteina cinasa C) , C-RAF, K-Ras (V12), Dead box ARN helicasa DP97, DNMT1 (metiltransferasa 1 de ADN) , FLIP (proteína inhibidora similar a Flice) , C-Sfc, 53BPI, proteína del grupo Polycomb EZH2 (intensificador del homólogo zeste) ErbBl, HPV-16 E5 y E7 (papilomavirus humano antes de 5 y antes de 7), Fortilin & MCI1P (proteína de leucemia celular mieloidea 1) , DIP13a (proteína de interacción de DDC 13a) , MBD2 (dominio de unión con CpG y metilo) p21, KLF4 (factor 4 similar a Kruppel) , tpt/TCTP (proteína tumoral controlada traduccional), SPK1 & SPK2 (Esfingosina cinasa), P300, PLK1 (cinasa-1 similar a Polo), Trp53, Ras, ErbBl, VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) , y BAG-1 (atanogen 1 asociado con BCL2). Con respecto a la infección por VIH, los blancos incluyen VIH-Tat, VIH-Rev, VIH-Vif, VIH-Nef, VIH-Nef, VIH-Env, LtR, CD4, CXCR4 (receptor qumiosina) y CCR5 (receptor de qumiosina) . Debido a la heterogeneidad de las células tumorales, varias de diferentes trayectorias de resistencia a fármacos o resistencia a la apoptosis pueden ser funcionales en codocitos. Por lo tanto, los ácidos nucleicos funcionales utilizados en los métodos de la invención pueden requerir cambio a través del tiempo. Por ejemplo, si las muestras sometidas a biopsia revelan nuevas mutaciones que resulten en resistencia a fármacos adquirida, los siARN específicos se pueden designar y codificar sobre un plásmido de expresión adecuado, que se transforma en una cepa bacteriana productora de minicélulas, que se utiliza para producir minicélulas recombinantes que se administran para enfrentar la resistencia a fármacos adquirida.

III . Método para superar la resistencia a fármacos y tratar la enfermedad En otro aspecto, la invención proporciona un método para superar la resistencia a fármacos y tratar una enfermedad, tal como por ejemplo, cáncer o SIDA, en un sujeto. El método comprende: (a) proporcionar una minicélula intacta que contenga una molécula de ácido nucleico funcional o un plásmido que comprenda un segmento que codifique para una molécula de ácido nucleico funcional, en donde la molécula de ácido nucleico funcional se dirige al gen o transcripto de una proteína que estimula la resistencia a fármacos, (b) poner la minicélula en contacto con un codocito de mamífero, de tal forma que la célula mamífera envuelva a la minicélula, y (c) suministrar un fármacos al codocito de mamífero. De preferencia, el paso (c) se realiza antes de los pasos (a) y (b) , para permitir que el ácido nucleico funcional disminuya la resistencia al fármaco antes de la administración del fármaco. El suministro del fármaco y la introducción del ácido nucleico funcional se pueden presentar consecutivamente, en cualquier orden, o simultáneamente. De acuerdo con la invención, los fármacos se pueden suministrar por cualquier medio convencional. Por ejemplo, los fármacos se pueden suministrar oral, parenteral (incluyendo subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitonealmente, y mediante infusión) , tópica, transdérmicamente o mediante inhalación. El modo adecuado de suministro y dosificación de cada fármaco se puede determinar fácilmente por aquellos con experiencia en las técnicas médicas.

A. Suministro de fármacos via minicélulas Aunque el suministro de fármacos se puede presentar vía medios convencionales, se prefiere el suministro vía minicélulas. Con respecto a esto, los inventores han descubierto que las mismas células de mamífero se pueden volver a transfectar exitosamente mediante minicélulas intactas dirigidas que se empacan con diferentes cargas. Por ejemplo, las minicélulas empacadas en plásmidos que codifican para el siARN se pueden transfectar a una célula de mamífero, después de lo cual, las minicélulas fármaco-empacadas pueden suministrar el fármaco a la misma célula de mamífero. Este descubrimiento fue una sorpresa, e indica que los procesos intracelulares asociados con la descomposición minicelular, la liberación endosomal de una carga y escape de la carga a los blancos intracelulares sigue totalmente funcional después del primer ciclo de transfección y suministro de carga. El fármaco se puede empacar en una minicélula por separado a partir del ácido nucleico funcional o el plásmido que codifica para el ácido nucleico funcional. Alternativamente, el fármaco se puede empacar en la misma minicélula como la molécula de ácido nucleico funcional o el plásmido que codifica para la molécula de ácido nucleico funcional. Ciertos fármacos pueden interactuar con los ácidos nucleicos y excluyen el co-empaque del fármaco y ácido nucleicos en la mismo minicélula. Por ejemplo, se sabe que Doxorubicina interactúa con el ADN. De preferencia, las minicélulas de la invención contienen una cantidad suficiente de fármaco para ejercer el efecto fisiológico o farmacológico del fármaco sobre una célula blanco. De preferencia, los fármacos también contenidos dentro de las minicélulas son heterólogos, o extraños, para las minicélulas, lo que significa que las células bacterianas madre de las minicélulas no producen normalmente el fármaco. Los fármacos tanto hidrofílicós como hidrofóbicos se pueden empacar en minicélulas al crear un gradiente de concentración del fármacos entre un medio extracelular que contiene minicélulas y el citoplasma minicelular. Cuando el medio extracelular contiene una concentración mayor del fármaco que el citoplasma minicelular, el fármaco se mueve naturalmente hacia abajo de su gradiente de concentración, dentro del citoplasma minicelular. Cuando el gradiente de concentración se invierte, sin embargo, el fármaco no se mueve de las minicélulas. Para cargar minicélulas con fármacos que normalmente no son solubles en agua, los fármacos inicialmente se pueden disolver en un solvente adecuado. Por ejemplo, Paclitaxel se puede disolver en una mezcla 1:1 de etanol y cremóforo EL (aceite de resino polietoxilado) , seguido por una dilusión en PBS hasta alcanzar una solución de Paclitaxel que se diluya parcialmente en medio acuoso y porte cantidades mínimas del solvente orgánico para asegurar que el fármaco permanezca en solución. Las minicélulas se pueden incubar en este medio final para la carga del fármaco. De esta forma, los inventores descubrieron que incluso los fármacos hidrofóbicos se pueden difundir en el citoplasma o de las minicélulas para alcanzar una carga de fármaco citoplásmica alta y terapéuticamente significativa. Esto es inesperado debido a que la membrana minicelular se compone de una bicapa de fosfolípidos hidrofóbicos, lo cual se podría esperar que evite la difusión de las moléculas hidrofóbicas en el citoplasma.

Otro método para cargar minicélulas con un fármaco implica cultivar una célula bacteriana madre recombinante bajo condiciones en donde la célula bacteriana madre transcriba y traduzca un ácido nucleico que codifica para el fármaco, de tal forma que el fármacos se libere en el citoplasma de la célula bacteriana madre. Por ejemplo, un grupo génico que codifica para la trayectoria biosintética celular para un fármaco deseado se puede clonar y transferir en una cepa bacteriana madre que sea capaz de traducir minicélulas. La transcripción y traducción genéticas del gen del grupo génico da por resultado en la biosíntesis del fármaco dentro del citoplasma de las células bacterianas madre, rellenando el citoplasma bacteriano con el fármaco. Cuando la célula bacteriana madre se divide y forma minicélulas hijas, las minicélulas también contienen el fármaco en su citoplasma. Las minicélulas pre-empacadas se pueden purificar mediante cualquiera de los procesos para purificación minicelular conocidos en la técnica y descritos anteriormente. Similarmente, otro método para cargar minicélulas con un fármaco implica cultivar una minicélula recombinante que contiene un plásmido de expresión que codifica para el fármaco bajo condiciones de tal forma que el gen que codifica para el fármaco se transcriba y traduzca dentro de la minicélula.

B . Fármacos Los fármacos útiles en la invención pueden ser cualquier sustancia fisiológica o farmacológicamente activa que produzca un efecto local o sistémico deseado en animales, en particular mamíferos y seres humanos. Los fármacos pueden ser compuestos inorgánicos u orgánicos, sin limitación, incluyendo péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, y pequeñas moléculas, cualquiera de los mismos puede estar caracterizado o sin caracterizar. Los mismos pueden estar en diversas formas, tales como por ejemplo, moléculas sin cambio, complejos moleculares, sales farmacológicamente aceptables, tales como por ejemplo, clorhidrato, bromhidrato, sulfato, laurato, palmitato, fosfato, nitrito, nitrato, borato, acetato, maleato, tartrato, oleato, salicilato, y lo semejante. Para fármacos ácidos, se pueden utilizar sales de metales, aminas o cationes orgánicos, por ejemplo, amonio cuaternario. También se pueden utilizar derivados de fármacos, tales como por ejemplo, bases, esteres y amidas. Se puede utilizar un fármaco que sea insoluble en agua en una forma que sea un derivado soluble en agua del mismo, o como un derivado básico del mismo, que en cualquier caso, o mediante su suministro, se convierta mediante enzimas, se hidrolice por el pH corporal, o mediante otros procesos metabólicos a la forma terapéuticamente activa original.

Los fármacos útiles incluyen agentes quimioterapéuticos, agentes inmunosupresores, citosinas, agentes citotóxicos, compuestos nucleolíticos, isótopos radiactivos, receptores, y enzimas activantes de pro-fármacos, que se puedan presentar en la naturaleza o que se produzcan mediante métodos recombinantes. Los fármacos que se ven afectados por la resistencia clásica a múltiples fármacos tienen particular interés en la invención, tales como por ejemplo, los alcaloides vinca (por ejemplo, vinblastina y vincristina) , las antraciclinas (por ejemplo, doxorubicina y daunorubicina) , inhibidores de transcripción del ARN (por ejemplo, actinomicina-d) y fármacos estabilizantes microtubulares (por ejemplo, paclitaxel). (Ambudkar et al . , 1999) En general, los agentes para quimioterapia del cáncer son los fármacos preferidos. Los agentes para quimioterapia del cáncer útiles incluyen mostazas de nitrógeno, nitrosoureas, etilenimina, alcanosulfonatos, tetrazina, compuestos de platino, análogos de pirimidina, análogos de purina, antimetabolitos, análogos folato, antraciclinas, taxanos, alcaloides vinca, inhibidores de topoisomerasa y agentes hormonales. Los fármacos para quimioterapia de ejemplo son actinomicina-d, Alkeran, Ara-C, Anastrozol, Asparaginasa, BiCNU, Bicalutamida, Bleomicina, Busulfano, Capecitabina, Carboplatina, Carboplatino, Carmustina, CCNU, Clorambucilo, Cisplatina, Cladribina, CPT-ll, Ciclofosfamida, Citarabina, Arabinosido de citosina, Citoxano, Dacarbazina, Dactinomicina, Daunorubicina, Dexrazoxano, Docetaxel, Doxorubicina, DTIC, Epirubicina, Etilenimina, Etopósido, Floxuridina, Fludarabina, Fluorouracilo, Flutamida, Fotemustina, Gemcitabina, Herceptina, Hexametilamina, Hidroxiurea, Idarubicina, Ifosfamida, Irinotecano, Lomustina, Mecloretamina, Melfalano, Mercaptopurina, Metotrexato, Mitomicina, Mitotano, Mitoxantrona, Oxaliplatina, Paclitaxel, Pamidronato, Pentostatina, Plicamicina, Procarbazina, Rituximab, esferoides, Estreptozocina, STI-571, Estreptozocina, Tamoxifeno, Temozolomida, Tenipósido, Tetrazina, Tioguanina, Tiotepa, Tomudex, Topotecano, Treosulfano, Trimetrexato, Vinblastina, Vincristina, Vindesina, Vinorelbina, VP-16, y Xeioda. Los fármacos para quimioterapia del cáncer útiles también incluyen agentes alquilantes tales como por ejemplo, Tiotepa y ciclosfosfamida; sulfonatos de alquilo tales como por ejemplo, Busulfano, Improsulfano y Piposulfano; aziridinas tales como por ejemplo, Benzodopa, Carboquona, Meturedopa, y Uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosfaramida y trimetilolmelamina; mostazas de nitrógeno tales como por ejemplo, Clorambucilo, Clornafazina, Colofosfamida, Estramustina, Ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato óxido de mecloretamina, Melfalano, Novembieina, Fenésterina, Prednimustina, Trofosfamida, mostaza de uracilo; nitroureas tales como por ejemplo, Carmustina, Clorozotocina, Fotemustina, Lomustina, Nimustina, y Ranimustina; antibióticos tales como por ejemplo, Aclacinomisinas, Actinomicina, Autramicina, Azaserina, Bleomicinas, Cactinomicina, Calicheamicina, Carabicina, Carminomicina, Carzinofilina, Cromoinicinas, Dactinomicina, Daunorubicina, Detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, Doxorubicina, Epirubicina, Esorubicina, Idambicina, Marcelomicina, Mitomicinas, ácido micofenolico, Nogalamicina, Olivomicinas, Peplomicina, Potfiromicina, Puromicina, Quelamicina, Rodorubicina, Estreptonigrina, Estreptozocina, Tubercidina, Ubenimex, Zinostatina, y Zorubicina; antimetabolitos tales como por ejemplo, Metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácidos fólico tales como por ejemplo, Denopterina, Metotrexato, Pteropterina, y Trimetrexato; análogos de purina tales como por ejemplo, Fludarabina, 6-mercaptopurina, Tiamiprina, y Tioguanina; análogos de pirimidina tales como por ejemplo, Ancitabina, Azacitidina, 6-azauridina, Carmofur, Citarabina, Didesoxiuridina, Doxifluridina, Enocitabina, Floxuridina, y -FU; andrógenos tales como por ejemplo, Calusterona, Propionato de Dromostanolona, Epitiostanol, Rnepitiostano, y Testolactono; anti-adrenales tales como por ejemplo, aminoglutetimida, Mitotano, y Trilostano; regenerador de ácido fólico tal como por ejemplo, ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; Amsacrina; Bestrabucilo; Bisantreno; Edatraxato; Defofamina; Demecolcina; Diaziquona; Elfornitina; acetato de eliptinio; Etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; Lentinano; Lonidamina; Mitoguazona; Mitoxantrona; Mopidamol; Nitracrina; Pentostatina; Fenamet; Pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida, Procarbacina; PSK®; Razoxano; Sizofrano; Espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2, 2', 2"-triclorotrietilamina; Uretano; Vindesina; Dacarbazina; Mannomustina; Mitobronitol; Mitolactol; Pipobromano; Gacitosina; Arabinosido ("Ara-C") ; ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, Paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y Doxetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia) ; Clorambucilo; Gemcitabina; 6-tioguanina; Mercaptopurina; Metotrexato; análogos de platino tales como por ejemplo, Cisplatina y Carboplatina; Vinblastina; platino; etopósido (VP-16) ; Ifosfamida; Mitomicina C; Mitoxantrona; Vincristina; Vinorelbina; Navelbina; Novantrona; Tenipósido; Daunomicina; Aminopterina; Xeioda; Ibandronato; CPT-ll; inhibidor RFS 2000 de topoisomerasa; difluorometilornitina (DMFO) ; ácido retinoico; Esperamicinas; Capecitabina; y sales ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre los tumores tales como por ejemplo, antiestrógenos incluyendo por ejemplo, Tamoxifeno, Raloxifeno, (5) -imidazol para la inhibición de aromatasa, 4-Hidroxitamoxifeno, Trioxifeno, Keoxifeno, Onapristona, y Toremifeno (Fareston) ; y anti-andrógenos tales como por ejemplo, Flutamida, Nilutamida, Bicalutamida, Leuprólido, y Goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Los fármacos útiles también incluyen citosinas.

Los ejemplos de estas citosinas son linfosinas, monosinas, y hormonas polipeptídicas tradicionales. Se incluyen entre las citosinas hormonas del crecimiento tales como por ejemplo, la hormona de crecimiento humano, hormona del crecimiento humano con N-metionilo, y hormona del crecimiento bovino; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas de glucoproteínas tales como por ejemplo, hormona estimulante de folículos (FSH, por sus siglas en inglés), hormona estimulante de la tiroides (TSH, por sus siglas en inglés), y hormona luteinizante (LH, por sus siglas en inglés); factor del crecimiento hepático; factor del crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factor a y ß de necrosis tumoral; sustancia inhibidora de muleriano, péptido gonadotropina asociado de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO, por sus siglas en inglés); factores de crecimiento nervioso tales como por ejemplo, NGF-ß; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento transformante (TGF, por sus siglas en inglés) tales como por ejemplo, TGF-a y TGF-ß; Factor I y II de crecimiento similar a insulina; eritropoyetina (EPO, por sus siglas en inglés); factores osteoinductivos; interferones tales como por ejemplo interferón-a, -ß y -?; factores estimuladores de colonias (CSF, por sus siglas en inglés) tales como por ejemplo, CSF de macrófagos (M-CSF, por sus siglas en inglés); CSF de granulocitos-macrófagos (GM-CSF, por sus siglas en inglés) ; y CSF de granulocitos (GCSF, por sus siglas en inglés); interleucinas (IL, por sus siglas en inglés) tales como por ejemplo, IL-1, IL-la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15; un factor de necrosis tumoral tal como por ejemplo, TNF-a o TNF-ß; y otros factores polipeptídicos entre los que se incluye LIF y ligando kit (kilolitro) . En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término citosina incluye proteínas provenientes de fuentes naturales o de un cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citosinas de secuencia natural. Los fármacos pueden ser profármacos, posteriormente activados mediante una enzima activadora de profármacos que convierta un pr?fármaco similar a un agente quimioterapéutico de peptidilo a un fármaco anticáncer activo. Véase, por ejemplo, WO 88/07378; WO 81/01145; patente de los Estados Unidos No. 4,975,278. En general, el componente enzimático incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un profármaco de tal forma que se convierta en su forma citotóxica, más activa.

IV. Dirección de minicélulas a células mamiferas especificas En un aspecto de la invención, una minicélula se dirige a un codocito de mamífero vía un ligando biespecífico, según se describe en la WO 2005/056749. El ligando biespecífico, que tiene especificidad para componentes tanto de minicélulas como de células mamíferas, provoca que la minicélula se una a la célula mamifera, de tal forma . que la minicélula se envuelva por la célula mamífera, y la célula mamífera produce la molécula de ácido nucleico funcional. Este método para suministro dirigido se puede realizar in vivo o ín vi tro, o tanto in vivo como in vi tro. El contacto entre el ligando biespecífico, la minicélula y la célula mamífera se puede presentar en varias formas diferentes. Para el suministro in vivo, se prefiere administrar una minicélula que ya tenga unido a la misma el ligando biespecífico. De esta forma, la minicélula, el ligando biespecífico y el codocito entran en contacto cunado la minicélula ligando dirigida biespecífica alcanza al codocito in vivo . Alternativamente, el ligando biespecífico y la minicélula se pueden administrar por separado in vivo . El contacto entre los ligandos biespecíficos, las minicélulas y las células mamíferas también se puede presentar durante una o más incubaciones in vi tro . En una modalidad, los tres elementos se incuban juntos a la vez. Alternativamente, se pueden realizar incubaciones paso a paso. En un ejemplo de un procedimiento paso a paso, las minicélulas y los ligandos bi-específicos primero se incuban juntos para formar minicélulas ligando-dirigidas biespecíficas, que luego se incuban con codocitos. En otro ejemplo, los ligandos biespecíficos primero se incuban con codocitos, seguidos por una incubación con minicélulas. Una combinación de unas o más incubaciones in vi tro y las administraciones in vivo también puede dar por resultado en ligandos biespecíficos, minicélulas y codocitos de mamífero en contacto. Los inventores encontraron que el procedimiento para suministro blanco se aplica ampliamente a una variedad de células mamíferas, incluyendo las células que normalmente son refractarias a la adhesión específica y endocitosis de minicélulas. Por ejemplo, los ligandos de anticuerpos biespecíficos con especificidad anti-O-polisacárido en una ramificación y la especificidad del receptor anti-HER2, el receptor anti-EGF o el receptor anti-andrógeno en la otra ramificación une eficientemente a las minicélulas a los receptores respectivos en una variedad de codocitos no fagocíticos. Estas células incluyen células cancerosas de pulmón, ovario, cerebro, mama, próstata y piel. Además, la unión eficiente precede a la rápida endocitosis de las minicélulas por cada una de las células no fagocíticas. Los codocitos de la invención incluyen cualquier célula en la cual se introduce un ácido nucleico funcional. Los codocitos convenientes se caracterizan por la expresión de un receptor de superficie celular que, en el momento de la unión a un ligando, facilita la endocitosis. Los codocitos preferidos son no fagocíticos, lo que significa que las células no son fagocitos profesionales, tales como por ejemplo, los macrófagos, células dendríticas y células citolíticas naturales (NK, por sus siglas en inglés) . Los codocitos preferidos también son de mamífero. Los ligandos útiles en los métodos para suministro dirigido de esta invención incluyen cualquier agente que se una a un componente superficial sobre un codocito y a un componente superficial sobre una minicélula. De preferencia, el componente superficial sobre una codocito es un receptor, en especial un receptor capaz de provocar la endocitosis. Los ligandos pueden comprender un componente polipeptídico y/o de carbohidrato. Los anticuerpos son ligandos preferidos. Por ejemplo, un anticuerpo biespecífico que porta especificidades duales para un componente superficial sobre minicélulas intactas derivadas bacterialmente y para un componente superficial en los codocitos de mamífero, se puede utilizar eficientemente para dirigir las minicélulas a los codocitos de mamífero in vi tro e in vivo. Los ligandos útiles también incluyen receptores, enzimas, péptidos de unión, proteínas de fusión/quiméricas y pequeñas moléculas. La selección de un ligando particular se realiza sobre dos criterios principales: (i) la unión específica a uno o más dominios sobre la superficie de minicélulas intactas y (ii) la unión específica a uno o más dominios sobre la superficie de los codocitos. De esta forma, los ligandos de preferencia tienen una primera ramificación que porta la especificidad para una estructura intacta bacteriana derivada de la superficie de la minicélula y una segunda ramificación que porta la especificidad para una estructura de superficie célula mamífera. Cada una de la primera y segunda ramificaciones puede ser multivalente. De preferencia, cada ramificación es monoespecífica, incluso si es multivalente. Para la unión a minicélulas derivadas bacterialmente, es conveniente que una ramificación del ligando sea específica para el componente de O-polisacárido de un lipopolisacárido encontrado sobre la célula bacteriana madre. Otras estructuras superficiales minicelulares que se pueden aprovechar para la unión del ligando incluyen polipéptidos de superficie expuesta y carbohidratos sobre membranas externas, tales como por ejemplo, los segmentos peptídicos expuestos de superficie celular de pilli, fimbrae y flagella. Para la unión a codocitos, una ramificación de ligando es específica para un componente superficial de una célula mamífera. Estos componentes incluyen proteínas de superficie celular, péptidos y carbohidratos, ya sea que estén caracterizados o sin caracterizar. Los receptores de superficie celular, en especial aquellos capaces de activar la endocitosis suministrada por receptores, son componentes superficiales celulares convenientes para ser dirigidos. 72. - .-•',. , • Estos receptores, si se sobre-expresan sobre la superficie de los codocitos, confieren selectividad adicional para dirigirse a las células que serán tratadas, reduciendo con esto la posibilidad para el suministro hacia los no codocitos . A manera de ejemplo, se pueden dirigir células tumorales, células metastáticas, células de vasculatura, tales como por ejemplo, células endoteliales y células de músculo liso, células pulmonares, células renales, células sanguíneas, células de médula ósea, células cerebrales, células hepáticas, etc., o precursores de cualquier célula seleccionada al seleccionar un ligando que se una específicamente a un motivo receptor de superficie celular sobre las células deseadas. Los ejemplos de receptores de superficie celular incluyen antígeno carcinoembriónico (CEA) , que se sobre-expresa en la mayoría de carcinomas de colon, recto, mama, pulmón, páncreas y del tracto gastrointestinal (Marshall, 2003); receptores de heregulina (HER-2, neu o c-erbB-2 ) , que con frecuencia se sobre-expresan en cánceres de mama, ovario, colon, pulmón, próstata y cervical (Hung et al . , 2000); receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) , que se expresa bastante en una variedad de tumores sólidos incluyendo aquellos de mama, cabeza y cuello, pulmonares de célula no pequeña y prostáticos (Salomón et al . , 1995); receptor de asialoglucoproteina (Stockert, 1995); receptor de transferrina (Singh, 1999) ; receptor del complejo enzimático serpin, que se expresa en hepatocitos (Ziady et al . , 1997); receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR, por sus siglas en inglés) , que se sobre-expresa sobre células de adenocarcinoma ductal pancreáticas (Kleeff et al . , 2002); receptor del factor del crecimiento endotelial vascular (VEGFR, por sus siglas en inglés), para la terapia génica de anti-angiogénesis (Becker et al . , 2002 y Hoshida et al . , 2002); receptor de folato, que se sobre-expresa selectivamente en el 90% de carcinomas ováricos no mucinosos (Gosselin and Lee, 2002); glicocalix de superficie celular (Batra et al . , 1994); receptores de carbohidrato (Thurnher et al . , 1994); y el receptor de inmunoglobulina polimérica, que es útil para el suministro de genes para células epiteliales respiratorias y atractivo para el tratamiento de enfermedades pulmonares tales como por ejemplo, fibrosis quística (Kaetzel et al . , 1997) . Los ligandos preferidos comprenden anticuerpos y/o derivados de anticuerpos. En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" abarca una molécula de inmunoglobulina obtenida mediante generación in vi tro o in vivo de una respuesta inmunogénica. El término "anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales, monoespecíficos y monoclonales, así como también derivados de anticuerpos, tales como por ejemplo, fragmentos de anticuerpo de cadena individual (scFv, por sus siglas en inglés) . Los anticuerpos y derivados de anticuerpos útiles en la presente invención también se pueden obtener mediante técnicas de ADN recombinante. Los anticuerpos tipo silvestre tienen cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas. Ambos tipos de cadenas polipeptídicas tienen regiones constantes, que no varían o lo hacen de forma mínima entre los anticuerpos de la misma clase, y regiones variables. Las regiones variables son únicas para un anticuerpo particular y comprenden un dominio de unión con antígenos que reconoce un epítope específico. Las regiones del dominio de unión con antígenos que están implicadas de manera más directa en la unión del anticuerpo son "regiones determinantes de complementaridad" (CDR, por sus siglas en inglés) . El término "anticuerpo" también abarca derivados de anticuerpos, tales como por ejemplo, fragmentos de anticuerpos que conserven la capacidad para unirse específicamente a antígenos. Estos fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab (un fragmento que contiene el dominio de unión con antígenos y comprende una cadena ligera y parte de una cadena pesada puenteada mediante un enlace disulfuro) , Fab (un fragmento de anticuerpos que contiene un dominio de unión con antígenos individual que comprende un Fab y una porción adicional de la cadena pesada) a través de la región articulada, F(ab')2 (dos moléculas de Fab' unidas mediante enlaces disulfuro intercadena en las regiones articuladas de las cadenas pesadas) , un Fab biespecífico (una molécula Fab que tiene dos dominios de unión con antígenos, cada uno de los mismos se puede dirigir a un epítope diferente) , y un scFv (la región determinante de unión con antígenos, variable, de una cadena ligera y pesada individual de un anticuerpo vinculado conjuntamente mediante una cadena de aminoácidos) . Cuando los anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpos, constituyen parte o la totalidad de los ligandos, de preferencia los mismos son de origen humano o se modifican para que sean adecuados para utilizarse en seres humanos. Son bien conocidos en la técnica los denominados "anticuerpos humanizados". Véase, por ejemplo, Osbourn et al . , 2003. Los mismos se han modificado mediante manipulación genética y/o tratamiento in vi tro para reducir su antigenicidad en un ser humano. En las patentes de los Estados Unidos No. 6,639,055, No. 5,585,089, y No. 5,530,101 se describen los métodos para la inmunización de anticuerpos. En el caso más simple, los anticuerpos humanizados se forman al injertar las trazas de unión con antígenos, conocidas como regiones determinantes de complementaridad (CDR) , a partir de un Abm de ratón en un IgG humano. Véase Jones et al . , 1986; Riechmann et al . , 1988; y Verhoeyen et al . , 1988. La generación de anticuerpos humanizados de alta afinidad, sin embargo, en general requiere la transferencia de uno o más residuos adicionales a partir de las denominadas regiones estructurales (FR, por sus siglas en inglés) del Abm original de ratón. Se han desarrollado diversas variantes de la tecnología de humanización. Véase Vaughan et al . , 1998. Los anticuerpos humanos, en lugar de "anticuerpos humanizados", también se pueden emplear en la invención. Las mismas tienen alta afinidad para sus antígenos respectivos y se obtienen rutinariamente a partir de fragmentos variables de cadena individual, muy largos (scFvs, por sus siglas en inglés) o las bibliotecas que exhiben Fab fago. Véase, Griffiths et al . , 1994; Vaughan et al . , 1996; Sheets et al . , 1998; de Haard et al . , 1999; y Knappik et al . , 2000. Los ligandos útiles también incluyen anticuerpos de cadena individual biespecífica, que típicamente son polipéptidos recombinantes que constan de una porción de cadena ligera variable unida covalente a través de una molécula enlazante con una porción de cadena pesada variable correspondiente. Véanse la patente de los Estados Unidos No. 5,455,030, No. 5,260,203, y No. 4,496,778. Los anticuerpos biespecífico también se pueden elaborar mediante otros métodos. Por ejemplo, los heterocon ugados químicos se pueden tratar mediante anticuerpos intactos de enlace químico o fragmentos de anticuerpo de diferentes especificidades. Véase Karpovsky et al . , 1984. Sin embargo, estos' heteroconjugados son difíciles de producir de una forma reproducible y son al menos dos veces tan grandes como los anticuerpos monoclonales normales. Los anticuerpos biespecíficos también se pueden crear mediante intercambio disulfuro, que implica la escisión enzimática y reasociación de los fragmentos de anticuerpo. Véase Glennie et al . , 1987. Debido a que los fragmentos Fab y scFv son monovalentes los mismos con frecuencia tienen baja afinidad para las estructuras blanco. Por lo tanto, los ligandos preferidos producidos a partir de estos componentes se someten a ingeniería en conjugados diméricos, triméricos o tetraméricos para aumentar la afinidad funcional. Véase Tomlinson and Holliger, 2000; Cárter, 2001; Hudson and Souriau, 2001; y Todorovska et al . , 2001. Estas estructuras conjugadas se pueden crear mediante reticulaciones químicas y/o genéticas.

Los ligandos biespecíficos de la invención de preferencia son monoespecíficos en cada extremo, es decir, específicos para un componente inhibidor sobre las minicélulas en un extremo y específicos para un componente individual sobre los codocitos en el otro extremo. Los ligandos pueden ser multivalentes en uno o ambo extremos, por ejemplo, en la forma de los denominados dicuerpos, tricuerpos y tetracuerpos . Véase Hudson and Souriau, 2003. Un dicuerpo es un dímero bivalente formado mediante una asociación no covalente de dos scFvs, que proporciona dos sitios de unión con Fv. Asimismo, un triacuerpo resulta de la formación de un trímero trivalente de tres scFvs, proporcionando tres sitios de unión, y un tetracuerpo resulta de la formación de un tetrámero tetravalente de cuatro scFvs, que proporciona cuatro sitios unión. Diversos anticuerpos humanos y de ratón monoclonales, humanizados, y fragmentos de los mismos que tengan especificidad para los receptores sobre las células mamíferas se han aprobado para uso terapéutico en humanos, y la lista sigue creciendo rápidamente. Véase Hudson and Souriau, 2003. Un ejemplo de este anticuerpo que se puede utilizar para formar una ramificación de un ligando biespecífico tiene la especificidad para HER2 : HerceptinMR; Trastuzumab. Las regiones variables del anticuerpo también se pueden fusionar a una amplia gama de dominios proteínicos. La fusión a dominios de inmunoglobulina humana, tales como por ejemplo, IgGl CH3 ambos agregan masa y estimulan la dimerización. Véase Hu et al . , 1996. La fusión a regiones Fc de articulación de Ig humano pueden agregar funciones efectoras. También, la fusión a dominios proteínicos heterólogos a partir de proteínas multiméricas estimula la multimerización. Por ejemplo, la fusión a un scFv corto a hélices antipáticas cortas se ha utilizado para producir minianticuerpos . Véase Pack and Pluckthun, 1992. Los dominios provenientes de las proteínas que forman heterodímeros, tales como por ejemplo, fos/jun, se pueden utilizar para producir moléculas biespecíficas (Kostelny et al . , 1992) y, alternativamente, los dominios de homodimerización se pueden someter a ingeniería para formar heterodímeros mediante estrategias de ingeniería tales como por ejemplo, "salientes en orificios" (Ridgway et al . , 1996) . Por último, se pueden seleccionar compañeros de proteínas de fusión que proporcionen tanto multimerización así como también una función adicional, por ejemplo estreptavidina. Véase, Dubel et al . , 1995.

V. Suministro a células competentes para fagocitosis o endocitosis La invención proporciona además el suministro por medio de la unión de minicélulas derivadas bacterialmente en contacto con células mamíferas que sean competentes para fagocitosis o endocitosis. Estas células mamíferas, que son capaces de envolver las células bacterianas madre en la forma en que lo hacen los patógenos bacterianos intracelulares, asimismo envuelven las minicélulas, que liberan su carga en el citoplasma de las células mamíferas. Este procedimiento de suministro se puede efectuar sin la utilización de ligandos blanco. Puede estar implicada en la envoltura de las minicélulas una variedad de mecanismos mediante un tipo dado de célula, y la presente invención no depende de ningún mecanismo particular con respecto a esto. Por ejemplo, la fagocitosis es un proceso bien documentado en el cual los macrófagos y otras células fagocíticas, tales como por ejemplo, neutrófilos, partículas de ingestión al extender la pseudopodia sobre la superficie de las partículas hasta que la partícula esté totalmente envuelta. Aunque se describe como fagocitosis "no específica", se ha demostrado en el proceso la implicación de receptores específicos. Véase Wright & Jong (1986); Speert et al . , (1988) . De esta forma, una forma de fagocitosis implica la interacción entre ligandos superficiales y receptores de lignados ubicados en la membrana de la pseudopodia (Shaw and Griffin, 1981) . Este paso de unión, suministrado por receptores específicos, se piensa que depende las adhesinas de superficie bacteriana. Con respecto a bacterias menos virulentas, tales como por ejemplo, E. coli no enterotoxigénica, la fagocitosis también se puede presentar en ausencia de ligandos superficiales para receptores de fagocitos. Véase Pikaar et al., (1995), por ejemplo. De esta forma la presente invención abarca, aunque no se limita, al uso de minicélulas que ya sea posean o carezcan de adhesinas superficiales, en mantenimiento con la naturaleza de sus células bacterianas madre, y se envuelven por fagocitos {es decir, células hospederas "competentes para fagocitosis") , de las cuales los neutrófilos y macrófagos son los tipos principales en mamíferos. Otro proceso para envolver es la endocitosis, mediante la cual los patógenos intracelulares ejemplificados por las especies de Salmonella , Escherichia , Shigella , Helicobacter , Pseudomonas y Lactobacilli entran a las células epiteliales mamíferas y se replican en las mismas. Con respecto a esto dos mecanismos básicos son la endocitosis suministrada por receptores dependiente de Clathrin, también conocida como "endocitosis fovea recubierta" (Riezman, 1993), y endocitosis independiente de Clathrin (Sandvig and Deurs, 1994). Cualquiera o ambas puede estar implicadas cuando una célula competente para envolver que actúa mediante endocitosis (es decir, una célula hospedera "competente para endocitosis") envuelve las minicélulas de acuerdo con la invención. Las células competentes para endocitosis representativas son células epiteliales de mama, enterositos en tracto gastrointestinal, células epiteliales estomacales, células epiteliales pulmonares, y células epiteliales del tracto urinario y vejiga. Cuando se lleva acabo el suministro a una célula de mamífero competente para envolver sin la utilización de un ligando dirigido, la naturaleza de la aplicación contemplada influenciará en la elección de las bacterias fuente para las minicélulas empleadas. Por ejemplo, las especies Salmonella , Escheríchía y Shigella portan adhesinas que se reconocen por los receptores para el suministro de endocitosis sobre los enterositos en el tracto gastrointestinal, y pueden ser adecuadas para suministrar un fármaco que sea efectivo para las células de cáncer de colon. De manera similar, las minicélulas derivadas de Helicobacter pilory, que portan adhesinas específicas para células epiteliales estomacales, podrían ser adecuadas para el suministro dirigido a las células cancerosas del estómago. La inhalación o insuflación puede ser ideal para administrar minicélulas intactas derivadas de una especie Pseudomonas que porta adhesinas reconocidas por los receptores en células epiteliales pulmonares. Las minicélulas derivadas de las bacterias Lactobacilli que portan adhesinas específicas para células epiteliales del tracto urinario y vejiga, podrían ser bastante adecuadas para el suministro intrauretral de un fármaco hacia un tracto urinario o un cáncer de vejiga.

VI . Formulaciones La invención incluye dentro de su alcance composiciones, o formulaciones, que comprenden (a) una minicélula intacta y (b) un portador farmacéutico aceptable de la misma, en donde la minicélula contiene una molécula de ácido nucleico funcional o un plásmido que comprende un segmento que codifica para una molécula de ácido nucleico funcional. El ácido nucleico funcional puede ser cualquiera de aquellos de siARN, shARN, ribozimas o moléculas antisentido descritas en la presente. El ácido nucleico funcional también se puede codificar por otro ácido nucleico, tal como por ejemplo, un plásmido, según se describe en la presente. El ácido nucleicos que codifica para el ácido nucleico funcional puede tener cualquiera de los elementos reguladores o elementos reporteros, según se describe en la presente. La formulación comprende opcionalmente un fármaco, según se describe en la presente. De preferencia, la minicélula de la formulación contiene el fármaco. Alternativamente, la minicélula puede contener una molécula de ácido nucleico, tal como por ejemplo, un plásmido, que codifica para el fármaco. Las formulaciones que contienen minicélulas de preferencia contienen menos de aproximadamente 1 célula bacteriana madre contaminante por 107 minicélulas, de mayor preferencia contienen menos de aproximadamente 1 célula bacteriana madre contaminante por 108 minicélulas, incluso de mayor preferencia contienen menos de aproximadamente 1 célula bacteriana madre contaminante por 109 minicélulas, todavía de mayor preferencia contienen menos de aproximadamente 1 célula bacteriana madre contaminante por 1010 minicélulas y con la máxima preferencia contienen menos de aproximadamente 1 célula bacteriana madre contaminante por 1011 minicélulas. Las formulaciones opcionalmente también contienen un ligando biespecífico para dirigir la minicélula hacia codocito. La minicélula y el ligando pueden ser cualquiera de aquellas descritas en la presente. De esta forma, la minicélula contiene un ácido nucleico que codifica para un ácido nucleico funcional y el ligando biespecífico de preferencia es capaz de unirse a un componente superficial de la minicélula y a un componente superficial de un codocito de mamífero.

Una formulación que consiste esencialmente de minicélulas y, opcionalmente fármacos y ligandos biespecíficos, de la presente invención (es decir, una formulación que incluye estas minicélulas, fármacos y ligandos con otros constituyentes que no interfieren indebidamente con el ácido nucleico o la calidad para suministro de fármacos de la composición) se puede formular de forma convencional, utilizando uno o más portadores excipientes farmacéuticamente aceptables. Las formulaciones se pueden presentar en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampolletas o en frascos, o en recipientes de múltiples dosis, con o sin un conservador agregado. La formulación puede ser una solución, una suspensión, o una emulsión en vehículos oleosos o acuosos, y puede contener agentes formuladores, tales como por ejemplo, agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Una solución adecuada es la isotónica con la sangre del recipiente y se ilustra mediante solución salina, solución de Ringer, y solución de dextrosa. Alternativamente, las formulaciones pueden estar en forma de polvo liofilizado, para reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril, libre de pirógenos o solución salina fisiológica. Las formulaciones también pueden estar en la forma de una preparación de depósito. Estas formulaciones de acción prolongada se pueden administrar mediante implantación (por ejemplo, subcutánea o intramuscularmente) o mediante inyección intramuscular .

A. Vias de administración Las formulaciones de la invención se pueden administrar vía diversas rutas y/o diversos sitios en un cuerpo de mamífero, hasta alcanzar los efectos terapéuticos deseados, ya sea local o sistémicamente. El suministro se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante administración oral, mediante la aplicación de la formulación a una cavidad corporal, mediante inhalación o insuflación, o mediante administración parenteral, intramuscular, intravenosa, intraportal, intrahepática, peritoneal, subcutánea, intratumoral, o intradérmica. El modo y sitio de administración depende de la ubicación de los codocitos. Por ejemplo, las células de fibrosis quística se pueden dirigir eficientemente mediante el suministro inalado de las minicélulas dirigidas. De manera similar, la metástasis tumoral puede ser tratada de manera más eficientemente vía el suministro intravenoso de minicélulas dirigidas. El cáncer ovárico primario se puede tratar vía el suministro intraperitoneal de minicélulas dirigidas.

B . Pureza Las minicélulas de la invención están prácticamente libres de células bacterianas madre contaminantes. De esta forma, las formulaciones que contienen minicélulas de la invención de preferencia contienen menos de aproximadamente 1 célula bacteriana madre contaminante por 107 minicélulas, de mayor preferencia contienen menos de aproximadamente 1 célula bacteriana madre contaminante por 108 minicélulas, incluso de mayor preferencia contienen menos de aproximadamente 1 célula bacteriana madre contaminante por 109 minicélulas, todavía de mayor preferencia contienen menos de aproximadamente 1 célula bacteriana madre contaminante por 1010 minicélulas y con la máxima preferencia contienen menos de aproximadamente 1 célula bacteriana madre contaminante por 1011 minicélulas. Los métodos para purificar minicélulas se conocen en la técnica y se describen en la PCT/IB02/04632. Uno de estos método combina la filtración de flujo cruzado (el flujo de alimentación es paralelo a una superficie membranosa; Forbes, 1987) y filtración sin salida (el flujo de alimentación es perpendicular a la superficie membranosa) . Opcionalmente, la combinación de filtración puede ser precedida por una centrifugación diferencial, a una baja fuerza centrífuga, para retirar alguna porción de las células bacterianas y con esto enriquecer el sobrenadante para las minicélulas. Otro método de purificación emplea centrifugación de gradiente por densidad en un medio biológicamente compatible. Después de la centrifugación, se recolecta una banda de minicélulas de gradiente, y, opcionalmente, las minicélulas se someten a ciclos adicionales de centrifugación de gradiente por densidad para aumentar al máximo la pureza. El método puede incluir además un paso preliminar para realizar una centrifugación diferencial sobre la muestra que contiene las minicélulas. Cuando se realiza a una baja fuerza centrífuga, la centrifugación diferencial eliminará alguna porción de las células bacterianas madre, enriqueciendo con esto el sobrenadante para las minicélulas. Los métodos de purificación particularmente efectivos aprovechan la filamentación bacteriana para aumentar la pureza minicelular. De esta forma, un método de purificación de minicélulas puede incluir los pasos de (a) someter una muestra que contiene minicélulas a una condición que induzca que las células bacterianas madre adopten una forma filamentosa, seguidas por (b) el filtrado de la muestra hasta obtener una preparación de minicélulas purificadas . También se pueden combinar métodos de purificación en minicélulas conocidos. Una combinación de métodos bastante efectiva es como sigue: Paso A: Centrifugación diferencial de un cultivo de células bacterianas para producir minicélulas. Este paso, que se puede realizar a 2000 g durante aproximadamente 20 minutos, elimina la mayoría de células bacterianas madre, mientras que deja minicélulas en el sobrenadante . Paso B: Centrifugación de gradiente por densidad utilizando un medio de gradiente por densidad isotónico y no tóxico. Este paso separa las minicélulas de cualesquiera contaminantes, incluyendo células bacterianas madre, con pérdida mínima de minicélulas. De preferencia, este paso se repite sin un método de purificación. Paso C: Filtración de flujo cruzado a través de un filtro de 0.45 µm para reducir adicionalmente la contaminación de células bacterianas madre. Paso D: Filamentación inducida por tensión de células bacterianas madre residuales. Esto se puede llevar a cabo al someter la suspensión de minicélulas a cualquiera de las severas condiciones ambientales para inducir tensión. Paso E: Tratamiento antibiótico para exterminar células bacterianas madre. Paso F: Filtración de flujo cruzado para eliminar pequeños contaminantes, tales como por ejemplo, ampollas de membrana, fragmentos de membrana, restos bacterianos, ácidos nucleicos, componentes de los medios etc., y concentrar las minicélulas. Se puede emplear un filtro de 0.2 µm para separar las minicélulas de pequeños contaminantes, y un filtro 0.1 µm se puede emplear para concentrar las minicélulas. Paso G: Filtración sin salida para eliminar las células bacterianas muertas. Para este paso se puede emplear un filtro de 0.45 µm. Paso H: Eliminación de la endotoxina a partir de la preparación de minicélulas. Para este paso se pueden emplear perlas magnéticas recubiertas con anti-lípido A.

C. Programas de administración En general, las formulaciones expuestas en la presente se pueden utilizar a dosificaciones adecuadas definidas mediante prueba de rutina, para obtener el efecto fisiológico óptimo, mientras que reduzca al mínimo cualquier toxicidad potencial. El régimen de dosificación se puede seleccionar de acuerdo con una variedad de factores entre los que se incluyen: la edad, peso, sexo, condición médica del paciente, la gravedad de la condición que será tratada, la vía de administración, y la función renal y hepática del paciente.

La precisión óptima para alcanzar las concentraciones de minicélulas y fármacos dentro de la variedad que proporciona una eficacia máxima con mínimos efectos secundarios puede requerir un régimen con base en la cinética de la minicélula y la disponibilidad de los fármacos a los sitios blanco y los codocitos. Cuando se determina la concentración óptima para un régimen de tratamiento, se pueden considerar la distribución, equilibrio y eliminación de una minicélula o fármaco. Las dosificaciones de minicélulas y fármacos se pueden ajustar cuando se utilizan en combinación, para alcanzar los efectos deseados. Además, la administración de la dosificación de las formulaciones se puede optimizar utilizando un sistema de modelaje farmacocinético/farmacodinámico . Por ejemplo, se pueden seleccionar uno o más regímenes de dosificación y se puede utilizar un modelo farmacocinético/farmacodinámico para determinar el perfil farmacocinético/farmacodinámico de unos o más regímenes de dosificación. Después, se puede seleccionar uno de los regímenes de dosificación para administración que alcance la respuesta farmacocinética/farmacodinámica deseada con base en el perfil farmacocinético/farmacodinámico particular. Véase, por ejemplo, WO 00/67776. Específicamente, las formulaciones se pueden administrar al menos una vez a la semana durante el curso de varias semanas. En una modalidad, las formulaciones se administran al menos una vez a la semana durante varias semanas hasta varios meses. Más específicamente, las formulaciones se pueden administrar al menos una vez al día durante aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ó 31 días. Alternativamente, la formulación se puede administrar aproximadamente una vez al dia, a aproximadamente una vez cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ó 31 días o más. Las formulaciones alternativamente se pueden administrar aproximadamente una vez a la semana, aproximadamente una vez cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 semanas o más. Alternativamente, las formulaciones se pueden administrar al menos una vez a la semana durante aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 semanas o más. Alternativamente, las formulaciones se pueden administrar aproximadamente una vez al mes, a aproximadamente una vez cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 meses o más.

Las formulaciones se pueden administrar en una dosis diaria individual, o la dosificación diaria total se puede administrar en dosis divididas de dos, tres, o cuatro veces al día. En el método en el cual se administran las minicélulas antes de un fármaco, la administración del fármaco se puede presentar en cualquier momento desde varios minutos hasta varias horas después de la administración de las minicélulas. El fármaco alternativamente se puede administrar en cualquier momento desde varias horas hasta varios días, posiblemente varias semanas hasta varios meses después de la administración de las minicélulas. Más específicamente, las minicélulas se pueden administrar al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ó 24 horas antes del fármaco. Además, las minicélulas se pueden administrar al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ó 31 días ante de la administración del fármaco. Todavía en otra modalidad, las minicélulas se pueden administrar al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 semanas o más antes del fármaco. En una modalidad adicional, las minicélulas se pueden administrar al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 meses antes del fármaco. En otra modalidad, la minicélula se administra después del fármaco. La administración de la minicélula se puede presentar en cualquier momento desde varios minutos hasta varias horas después de la administración del fármaco. La minicélula se puede administrar alternativamente en cualquier momento desde varias horas hasta varios días, posiblemente varias semanas hasta varios meses después del fármaco. Los siguientes ejemplos son únicamente ilustrativos, en lugar de ser limitantes, y proporcionan una compresión más completa de la invención. Los ejemplos demuestran que las células tumorales resistentes a fármacos se pueden tratar efectivamente in vivo medíante (1) la administración de minicélulas recombinantes dirigidas que portan secuencias de ARNi designadas para reducir o eliminar la expresión de los genes que codifican para la resistencia a fármacos, y (2) la administración de minicélulas empacadas en fármacos, dirigidas, que portan el fármaco al cual las células cancerosas se harán sensibles.

Ejemplo 1. plásmidos de expresión anti-MDRl y anti-bcl- 2 shARN y purificación de minicélulas recombinantes . Las minicélulas recombinantes que portan plásmidos que codificaban para las secuencias de shARN (Mdrl o bcl-2) se generaron como sigue. La secuencia shARN de Mdrl utilizado en este estudio se describe por Wu et al . , 2003 (5'-TCGAAAGAAACCAACTGTCAGTGTA gagtactg TACACTGACAGTTGGTTTCTTTTTTT-3' ) (SEQ ID NO: 1) y la secuencia shARN de bcl-2 utilizada se describió por Wacheck et al . , 2003 (5' -TCGATGTGGATGACTGAGTACCTGA gagtactg TCAGGTACTCAGTCATCCACATTTTT-3' ) (SEQ ID NO: 2). Las secuencias de shARN respectivas se sintetizaron y se subclonaron individualmente en el plásmido IMG-800 (Imgenex Corp., San Diego, CA, E.U.A.) de tal forma que las secuencias se pudieran expresar a partir del promotor U6 del plásmido. El plásmido porta el origen pUC de replicación que permite un alto número de copia del plásmido en las células bacterianas. Los plásmidos recombinantes se secuenciaron para asegurarse de que las secuencias de shARN se corrigieran y estuvieran en trama para la expresión del promotor U6. Los plásmidos recombinantes se transformaron en la cepa mutante de minCDE de S . typhimurium y las minicélulas que portan los plásmidos se purificaron como se describe en la U.S. 10/602,201. Las minicélulas recombinantes se designaron como minicélulasshARN-MDR1 y minicélulasshARN-bc?2 respectivamente .

Ejemplo 2. Demostración del suministro de plásmidos de shARN suministrado a minicélulas recombinantes receptor- dirigidas a células cancerosas resistentes a fármacos y la inversión de la resistencia a fármacos in vitro. Mientras que se ha mostrado que los siARN dirigidos contra una gama de diferentes transcriptos que codifican para resistencia a fármacos para invertir la resistencia a fármacos en células cancerosas in vitro, el problema crítico se dirige al suministro de los siARN en células cancerosas, particularmente in vivo . Las minicélulas recombinantes que portan el plásmido shARN de anti-Mdrl (minicélulasShARN-MDRi) y el shARN control contra una secuencia de ARN antisentido (minicélulasshARN-antisent?do) se purificaron y el anticuerpo biespecífico que porta las especificidades EGFR O-antígeno y anti-humano de anti-S. typhimuri um se preparó y se unió a las minicélulas recombinantes, según se describe en la solicitud de patente WO 2005/056749. Las minicélulas recombinantes blanco se designaron EGFRminicélulasshARN-MDR-? y EGFRminicélulasshAR-.-ant?sentido-Las minicélulas empacadas con el fármaco quimioterapéutico 5-FU es Irinotecano también se prepararon y se dirigieron como en lo anterior y se designaron EGFRminicélulas5-FU y EGFRminicélulas?rino respectivamente . La línea de células cancerosas de colon humano Caco-2 (ATCC) que es bastante resistente a Irinotecano y 5- FU, se seleccionó por este estudio ín vi tro para determinar en primer lugar, si las minicélulas recombinantes EGFR-dirigidas podrían suministrar exitosamente los plásmidos shARN a las células cancerosas y en segundo lugar, si la expresión del siARN de anti-MDR-1 podría invertir la resistencia a fármacos y hacer que las células Caco-2 sean sensibles a las minicélulas EGFR-dirigidas y fármaco-empacadas. Las células Caco-2 se sembraron en células/matraz a 3 x 106 en medio mínimo esencial con 10% de suero de ternera y se incubaron durante 3 horas a 37 °C, 5% de C02. Las células se trataron con (a) EGFRminicélulasShARN-MDR-?, y (b) EGFRminicélulasShARi.-ant--se--t?do- Se incluyó un matraz para control que no recibió ningún tratamiento. Las minicélulas se agregaron a una concentración de 1010 por matraz y todos los matraces se incubaron durante 72 horas. Las células provenientes de cada tratamiento se trataron con tripsina y se sembraron a 1 x 104 células/ml/cavidad en placas de 24 cavidades y se incubaron durante 3 horas a 37°C, 5% de C02. Las células sin tratar control luego se incubaron con (6 cavidades/tratamiento) (a) Irinotecano libre (25 µM) , (b) 5-FU libre (25 µM) , (c) EGFRminicélulas?r?no, y (d) EGFRminicélulas5-FU . Las EGFRminicélulasshARN-DR-? tratadas con células Caco-2 se incubaron con (6 cavidades/tratamiento) (a) CMVminicélulas5-F0 (no dirigidas específicamente ya que el anticuerpo biespecífico se dirigió a una proteína superficial en citomegalovirus), (b) Irinotecano libremente, (c) 5-FU libre, (d) EGFRminicélulasIr?no, y (e) EGFRminicélulas5-Fü. Las EGFRminicélulasshARN-ant?sent?do tratadas con células Caco-2 luego se trataron con EGFRminicélulas5-Fü. Todas las células se incubaron durante unas 72 horas adicionales seguidas por un análisis de proliferación celular MTT calorimétrico (Cory et al . , 1991) utilizando el análisis de proliferación celular en una solución acuosa CellTiter 96 AQue?us (Promega Corp., Madison, Wl, E.U.A.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las mediciones colorimétricas se leyeron a 490 nanómetro. Los resultados mostraron (Figura 1) que las células Caco-2 fueron bastante resistentes a los fármacos para quimioterapia de primera línea para cáncer de colon, es decir, Irinotecano y 5-FU. Adicionalmente, las células siguieron siendo resistentes después de los tratamientos con EGFRminicélulasIr?no, EGFRminicélulas5_FU y tn?n?celulaSsARN-MDR-1- Las células que recibieron el tratamiento dual, es decir, EGFRminicélulasshARN-MDR-? seguidas por EGFRminicélulas?r?no o EGFRminicélulas5-FU mostraron que este tratamiento fue bastante exitoso para invertir la resistencia a fármacos y después de un tratamiento de combinación individual se observó una muerte celular de > 50%. Por el contrario, un tratamiento dual de EGFRminicélulasshARN-antisentido seguidos por EGFRminicélulas5-FU no tuvo efecto sobre la resistencia a fármacos, lo que sugiere que la expresión de shARN de anti-MDR-1 en las células Caco-2 fue responsable específicamente de la inversión de la resistencia a fármacos. El tratamiento de combinación de EGFRminicélulasshARN-MDR-? seguido por Irinotecano libre o 5-FU también fue efectiva en invertir la resistencia a fármacos pero no para disminuir el grado proporcionado de -30% de reducción en la supervivencia celular. Estos datos también sugieren que el suministro de fármacos para quimioterapia vía minicélulas receptor-dirigidas y fármacos-empacadas puede suministrar una concentración más potente del fármaco intracelularmente en comparación con el fármaco libre proporcionado en el entorno extracelular. Este resultado demostró que (a) los shARN se pueden suministrar efectivamente a células mamíferas no fagocíticas vía minicélulas recombinantes receptor-dirigidas, (b) el ácido nucleico funcional (shARN) que codifica para los plásmidos escapa de los organelos intracelulares en donde se descomponen las minicélulas, (c) el plásmido se transporta hacia el núcleo de la célula mamífera en donde se expresa el shARN, (d) el shARN es efectivo para degradar el ARNm que codifica para la proteína con resistencia a múltiples fármacos, MDR-1, (e) las mismas células mamíferas son receptivas para la siguiente ola de minicélulas receptor-dirigidas que ahora portarán un fármaco en lugar de un plásmido, (f) el protocolo del tratamiento dual, es decir, el suministro de shARN receptor-dirigido minicélula-suministrado seguido por el suministro de fármacos quimioterapéuticos receptor-dirigidos, minicélula-suministrados es bastante efectivo para invertir la resistencia a fármacos en células mamíferas no fagocíticas.

Ejemplo 3. Demostración in vivo de la regresión tumoral alcanzada utilizando el método de la invención, es decir el tratamiento dual del suministro de shARN receptor- dirigido minicélula-suministrada seguido por el suministro de fármacos receptor-dirigido minicélula- suministrado . Este ejemplo demuestra que las minicélulas receptor-dirigidas se pueden utilizar para invertir la resistencia a fármacos en células cancerosas in vivo . Las minicélulas minCDE-drivadas de S . typhimuri um se purificaron y se empacaron con el fármaco quimioterapéutico Irinotecano. Se sometieron a centrifugación 7 x 109 minicélulas en solución de BSG, el subrenadante se descartó y las minicélulas se volvieron a suspender en 940 µl BSG y 60 µl de solución de Irinotecano (1 mg/ml; disuelto en agua destilada estéril). La suspensión se incubó durante la noche a 37 °C con rotación para permitir que el Irinotecano se difunda en el citoplasma minicelular. El exceso de Irinotecano no unido específicamente a la superficie externa de las minicélulas entonces se lavó mediante ultrafiltración celular agitada como sigue. El modelo 8010 de célula para ultrafiltración agitada Amicon (Millipore, Billerica, MA, E.U.A) se ensambló de acuerdo con las instrucciones del fabricante con un disco de membrana para ultrafiltración (poliéstersulfona; corte de peso molecular de 300 kDa; Millipore) . La célula se lavó tres veces con agua destilada estéril seguida por tres veces adicionales con BSG. La célula luego se rellenó con de 9 ml de BSG recién preparado y se agregó 1 ml de solución de minicélulas empacadas con Irinotecano. Las células se mantuvieron bajo una presión de 0.7031 kg/cm2 (10 psi), se agitaron hasta que el volumen se redujo a 5 ml y se remataron con 5 ml de BSG. La ultrafiltración se continuó hasta que el volumen decayó nuevamente a 5 ml . Este procedimiento de remate/ultrafiltación se realizó 6 veces para permitir un lavado completo de las superficies exteriores de las minicélulas empacadas con Irinotecano. Durante la última ultrafiltración, el volumen se redujo a 1 ml y la muestra se transfirió a un tubo para centrifugadora Eppendorf estéril, seguido por centrifugación a 13,200 rpm durante 10 minutos para convertir a granulos las minicélulas empacadas con Irinotecano. Se construyó un anticuerpo biespecífico según se describió anteriormente y en la Solicitud de Patente Publicada No. 2004-0265994. En resumen, el lipopolisacárido de anti-S. typhimuri um (Biodesign, Saco, Maine, E.U.A.) y los anticuerpos monoclonales de ratón con receptor con factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (Oncogene Research Products, Cambridge, MA, E.U.A.) se enlazaron a la proteína recombinante purificada A/G vía los fragmentos Fc de cada anticuerpo monoclonal. Un anticuerpo monoclonal anti-EGFR se seleccionó debido a que las células xenoinjertadas fueron células de cáncer de colon humano (Caco-2) que se saben que sobre-expresan el EGFR sobre la superficie celular (Nyati et al . , 2004). La proteína recombinante purificada A/G (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, E.U.A) se diluyó a una concentración final de 100 µg/ml en una solución tampón para unión inmunopura (Pierce Biotechnology) y se incubaron 0.5 ml de la solución durante la noche a 4°C con una solución premezclada que contuvo 20 µg/ml cada una de anticuerpos monoclonales EGFR LPS y anti-humanos de anti-S. typhimurium . Los anticuerpos en exceso disgregados de la proteína A/G luego se retiraron como sigue. La solución de proteína G Dynabeads® (Dynabeads® [2.8 µm] recubierta con la proteína G recombinante acoplado covalente a la superficie de las partículas magnéticas; Dynal Biotech, Oslo, Noruega) se mezcló suavemente y se transfirieron 100 µl de la solución en un tubo para centrifugación Eppendorf. El tubo se colocó en un Dynal MPC-S (concentración de partículas magnéticas, tipo S) para inmovilizar las perlas y el sobrenadante se descartó. Las perlas se volvieron a suspender en 0.5 ml de solución para lavado que contenía solución tampón de Na-fosfato 0. ÍM (pH 5.0). La inmovilización de perlas y los pasos de lavado se repitieron tres veces. La solución que contiene la mezcla de anticuerpos A/G-biespecíficos proteínicos se agregó a las perlas y se incubó con mezclado suave a temperatura ambiente durante 40 minutos. El tubo se colocó en descanso MPC-S para inmovilizar las perlas y el anticuerpo A/G-biespecífico proteínico se retiró con una pipeta. Este paso eliminó el exceso disgregado de anticuerpos monoclonales y proporcionó una solución que porta el anticuerpo biespecífico enlazado a la proteína A/G vía sus fragmentos Fc. Las minicélulas recombinantes se incubaron con el anticuerpo A/G-biespecífico proteínico durante 1 hora a temperatura ambiente, para recubrir las minicélulas con el anticuerpo vía su región anti-LPS Fab.

Los ratones utilizados en este ejemplo se adquirieron de Animal Resources Cente, Perth, WA, Australia, y todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con la guía de cuidado y uso de animales de laboratorio y con la aprobación del comité de ética animal. Los experimentos se realizaron en el NSW Agriculture que acreditó una pequeña instalación para animales en EnGenelC Pty Ltd (Sydney, NSW, Australia) . Se desarrollaron células cancerosas de colon humano (Caco-2, ATCC) en el tejido de cultivo en RPMI 1640 medio suplementado con suero de ternero bovino al 5% (GIBCO-BRL Life Technologies, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, E.U.A.) y glutamina (Invitrogen) en una atmósfera húmeda con 95% de aire y 5% de C02 a 37°C. 1 x 106 células en 50 µl de medio libre de suero junto con 50 µl del factor de crecimiento redujeron el matrigel (Biosciences, Frankiin, Lakes, NJ, E.U.A.) se inyectaron subcutáneamente entre los omóplatos de cada ratón utilizando una aguja calibre 23. Los tumores se inhibieron dos veces a la semana utilizando un calibrador electrónico digital (Mitutoyo, Japón, precisión a 0.001) y se calculó el volumen tumoral mediano utilizando la fórmula, longitud (mm) x anchura al cuadrado (mm) X 0.5 = volumen (mm)3. Los diversos tratamientos comenzaron una vez que los tumores alcanzaron volúmenes entre 50 mm3 y 80 mm3, y los ratones se seleccionaron aleatoriamente a ocho grupos diferentes de 11 por grupo. Los diversos grupos recibieron los siguientes tratamientos: Grupo 1 (control) no recibió tratamiento. Grupo 2 (control), Irinotecano libre (1.2 x 104 ng/gm de peso corporal de ratón ~2.4 x 105 ng por ratón) intravenosamente. Este control se incluyó para confirmar los resultados in vi tro de que las células tumorales son resistentes al fármaco. Grupo 3 (control), las minicélulas EGFR-dirigidas, empacadas con Irinotecano (designadas como EGFRminicélulasIrin0) - Grupo 4 (control) , EGFRminicélulasShARN-MDR-i- Grupo 5 (control), EGFRminicélulasshARN-bci-2 • Grupo 6 (control) , EGFRminicélulasshAR-MDR-? seguido por Irinotecano libre. Grupo 7 (experimental), EGFRminicélulasShARN-MDR-? seguido por EGFRminicélulasIrino. Grupo 8 (expt.), EGFRminicélulasShARN-bci-2 seguido por EGFRminicélulas?rino. Los estudios de cuantificación con Irinotecano mediante EPLC mostraron que 5 x 108 minicélulas empacadas a ~80 ng del fármaco. Todos los tratamientos con minicélula recibieron 5 x 108 de minicélulas y tratamientos con shARN se administraron en los días 9 y 23. Todos los tratamientos con fármacos se administraron en los 15, 18, 29 y 32. Esto permitió un intervalo de seis días entre los tratamientos con shARN y fármaco para asegurar que se dejó suficiente tiempo para el suministro intracelular y nuclear del shARN, la expresión génica y la supresión de la expresión de la proteína para suministrar resistencia a fármacos, es decir, ya sea MDR-1 o bcl-2. Los resultados revelaron (Figura 2) un contraste llamativo entre los volúmenes tumorales medianos en los grupos control (G 1 hasta 6) y los grupos experimentales (G 7 y 8). Los volúmenes de tumores en los grupos experimentales se estabilizaron rápidamente y mostraron una estabilización significativa en la mayoría de los 11 animales en cada grupo. Por el contrario, los volúmenes tumorales medianos en todos los diferentes grupos control siguieron aumentando y en el día 36 del establecimiento después del injerto el experimento se terminó debido a que los animales control estuvieron muy enfermos. Los animales experimentales, por otro lado, fueron sanos y no mostraron ningún efecto tóxico del tratamiento. Los análisis estadísticos de los datos utilizando un ANOVA de un sentido mostró que los grupos experimentales (7 y 8) fueron bastante significativos en comparación con los grupos control 1 hasta 6 (p = 0.0004). Esto da por resultado en una primera demostración del suministro dirigido in vivo del shARN para enfrentar el serio problema de la resistencia a fármacos en el cáncer. El resultado también demostró que la invención tiene aplicación general, debido a que dos métodos mecánicamente diferentes de resistencia a fármacos, es decir, la bomba de proteínas asociadas con membranas sobre-expresadas (MDR-1, por sus siglas en inglés) y la proteína anti-apoptosis citoplásmica (bcl-2, por sus siglas en inglés) , se pueden regular en las células de cáncer con resistencia a fármacos in vivo . El tratamiento de las mismas células con otra oleada de minicélulas empacadas con el fármaco quimioterapéutico receptor-dirigidas podría tratar efectivamente estos tumores .

Ejemplo 4. Segunda demostración in vivo de la eficacia de regresión tumoral alcanzado utilizando el método de la invención, es decir, el tratamiento dual de suministro de shARN minicélula-suministrado seguido por suministro de fármacos minicélula-suministrados . También se sabe que las células cancerosas colorectales son bastante resistentes a otro fármaco quimioterapéutico de primera línea, 5-fluorouracilo (5-FU, por sus siglas en inglés), y este ejemplo muestra que los métodos de la invención permiten no sólo la inversión de la resistencia a fármacos in vivo sino que también permiten la estabilización/regresión tumoral . Como se describió anteriormente, los minicélulas se obtuvieron de una cepa mutante minCDE de S. typhimuri um y se purificaron utilizando el procedimiento de centrifugación por gradiente /filamentación/filtración/ eliminación de endotoxina. Las minicélulas similarmente recombinantes que portan los plásmidos shARN, shARN-MDR-1, shARN-bcl-2 y shARN-antisentido se obtuvieron y se purificaron a partir de las cepas recombinantes minCDE- de S. typhimurium . Las minicélulas vacías purificadas se empacaron con el fármaco 5-FU quimioterapéutico como se describió para Irinotecano en el Ejemplo 3. Se utilizó un análisis de HPLC para determinar la concentración de 5-FU empacado en las minicélulas. Un anticuerpo biespecífico que comprende EGFR anti-humano y las especificidades duales O-antígeno y anti-S. typhimurium se construyó como se describe en el Ejemplo 3. Las minicélulas recombinantes (1010) se incubaron con el anticuerpo biespecífico durante 1 hora a temperatura ambiente, para recubrir las minicélulas con el anticuerpo vía su región Fab anti-O-antígeno. Los xenoinjertos de células cancerosas Caco-2 se estabilizaron en ratones desnudos Balb/c y una vez que los tumores alcanzaron un volumen entre 50 mm3 y 80 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente en 10 grupos (n = 11 ratones por grupo) . Los 10 tratamientos intravenosos incluyeron: (a) Gl - control exclusivo de tumor. G2 (control), 5-FU libre (5 x 10 ng/gm de peso corporal de ratón ~1 x 106 ng por ratón) . Este control se incluyó para confirmar los resultados in vi tro de que las células tumorales fueron resistentes al fármacos. G3 (control), EGFR-dirigidas, minicélulas 5-FU-empacadas (designadas como EGFRminicélulas5-FU) . G4 (control), EGFRminicélulasshRN-MDR-? • G5 (control), EGFRminicélulasshARN-bc?-2 • G6 (control), EGFRminicélulasshAN-MDR-? seguidas por CMVminicélulas5_FU. El anticuerpo CMV se dirige a una proteína superficial en citomegalovirus y sirve como un contfol específicamente dirigido. G7 (control), EGFRminicélulasshAR-ant?sent?do seguidas por EGFRminicélulas5_FU. G8 (control) , EGFRminicélulasShARN-DR-? seguidas por 5-FU libre. G9 (expt.), EGFRminicélulasShARN-MDR-? seguidas por EGFRminicélulas5_FU. G10 (expt.), EGFRminicélulasshAR-bci-2 seguidas por EGFRminicélulas5-FU. Los tratamientos con shARN se administraron en los días 9 y 23 y los tratamientos con el fármaco se administraron en los días 15, 18, 29 y 32. Esto permitió un intervalo de seis días entre el shARN y los tratamientos con fármacos para asegurar que se dejó un tiempo suficiente para el suministro intracelular y nuclear del shARN, la expresión génica y la supresión de la expresión de la proteína que suministra la resistencia a fármacos, es decir, ya sea MDR-1 o bcl-2. Los resultados revelaron (Figura 3) un contraste llamativo entre los volúmenes tumorales medianos en los grupos control (G 1 hasta 8) y los grupos experimentales (G 9 y 10) . Los volúmenes tumorales en los grupos no experimentales mostraron una estabilización significativa en la mayoría de los 11 animales en cada grupo. Por el contrario, los volúmenes tumorales medianos en todos los diferentes grupos control siguieron aumentando y en el día 36 después del establecimiento del xenoinjerto, el experimento se terminó debido a que los animales control estaban demasiado enfermos. Los animales experimentales, por otro lado, estuvieron sanos y no mostraron ninguno de los efectos secundarios tóxicos del tratamiento. El análisis estadístico de los datos utilizando ANOVA de una vía mostró que los grupos experimentales (9 y 10) fueron bastante significativos en comparación con los grupos control 1 hasta 8 (p = 0.0008).

Ejemplo 5. Demostración in vivo de la regresión tumoral alcanzada en células de cáncer de mama humano resistentes a doxorubicina utilizando el método de la invención . Los inventores han mostrado que la línea celular de adenocarcinoma de mama humano, MDA-MB-468 es bastante sensible a doxorubicina y que los xenoinjertos de ratón tratados intravenosamente con EGFRminicélulasDox se estabilizaron/regresaron. En este ejemplo, las células MDA-MB-468 se cultivaron en cultivos de tejido y se trataron con concentraciones cada vez mayores de Dox para desarrollar un clon resistente a Dox. Se estableció bien que este tratamiento con fármacos in vi tro e in vivo sobre-reguló la expresión de las proteínas con resistencia a múltiples fármacos tal como por ejemplo, MDR-1 y bcl-2. _ Se obtuvieron varios clones resistentes a Dox y uno se utilizó para establecer un xenoinjerto en ratones desnudos Balb/c. Los grupos de tratamiento intravenoso (n = 11 ratones por grupo) incluyeron G2 - EGFRminicélulasDox y G3 EGFRminicélulasShAR-MDR-? seguida por EGFRminicélulasD??- Gl los ratones fueron un control exclusivo de tumor. El tratamiento con shARN se administró en el día 21 y los tratamientos con fármacos se administraron en los días 27, 34 y 41. Los resultados mostraron (Figura 4) que el tratamiento con EGFRminicélulasShARN-MDR-? seguido por EGFRminicélulasDox en ratones G3 fue bastante efectivo para revertir la resistencia a Dox en las células cancerígenas y que los tumores se estabilizaron. El tratamiento control con EGFRminicélulasD?? (G2) mostró que las células tumorales fueron bastante resistentes a Dox y los tumores crecieron rápidamente .

Ejemplo 6. Demostración in vivo del efecto de los programas de dosificación sobre la inversión de la resistencia a fármacos y el efecto terapéutico. Este ejemplo demuestra el efecto de los programas de dosificación sobre la inversión de la resistencia a fármacos y el efecto terapéutico. Dejando suficiente tiempo para el suministro eficiente del shARN a las células tumorales antes de que las minicélulas receptor-dirigidas, fármaco-empacadas se administren mejora los resultados. Un experimento en curso de tiempo se realizó, en donde las EGFRminicélulasShARN-MDR-? se administraron intravenosamente en ratones desnudos que portan el xenoinjerto celular Caco-2. En grupos por separado ( n = ratones 11 ratones por grupo) , a los ratones se les administró EGFRminicélulas?rino ya sea a las 96 horas (G3) , 120 horas (G4) o 144 horas (G5) después del tratamiento con EGFRminicélulasshARN-MDRi • Gl y G2 fueron controles exclusivos de tumores y libres de Irinotecano (~2.4 x 105 ng/dosis) . Las minicélulas se administraron a 5 x 108 por dosis y cada dosis portó -80 ng de Irinotecano empacado en minicélulas, el cual es menor a 3,000 veces la dosis que de la que se administró como el fármaco libre. Los resultados mostraron (Figura 5) una clara correlación entre el tiempo transcurrido durante la expresión de shARN y la posterior administración de EGFRminicélulaS?rino dentro de 144 horas (G5) que es el más efectivo para revertir la resistencia a fármacos y alcanzar un efecto terapéutico significativo.

Ejemplo 7. Segunda demostración in vivo del efecto de los programas de dosificación sobre la inversión de la resistencia a fármacos y el efecto terapéutico. Este ejemplo demuestra que el efecto del programa de dosificación observado en el Ejemplo 6 es bastante aplicable . El experimento descrito en el Ejemplo 6 se repitió con los mismos controles y grupos experimentales excepto que G2 recibió 5-FU libre (1 x 106 ng/dosis) y en G3, G4 y G5, el segundo tratamiento se llevó a cabo con EGFRminicélulas5-F0. Las minicélulas se administraron a 1 x 109 por dosis y cada dosis portó -80 ng de 5-FU, es decir, -12,500 veces menos que la administración libre de fármacos en los ratones G2. Los resultados mostraron (Figura 6) que la administración de EGFRminicélulas5-FU a las 144 horas después de la administración de EGFRminicélulasShARN-DR-? (G5) dio por resultado en una eficacia máxima de la inversión de la resistencia a fármacos y la eficacia terapéutica. La potencia de la invención es evidente a partir de la concentración del fármaco requerida para tratar efectivamente estos tumores bastante resistentes ya que las minicélulas portaron 3,000 veces y 12,500 veces menos fármaco en comparación con los tratamientos de Irinotecano libre y 5-FU respectivamente. Los fármacos libres no tuvieron efecto sobre el crecimiento tumoral según se observa en las Figuras 5 y 6.

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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES : 1. Una composición caracterizada porque comprende: (a) una minicélula intacta que contiene una molécula de ácido nucleico funcional o un plásmido que comprende un segmento que codifica para una molécula de ácido nucleico funcional, y (b) un portador farmacéuticamente aceptable de la misma, en donde la molécula de ácido nucleico funcional se dirige al transcripto de una proteína que contribuye a la resistencia a fármacos, la resistencia a la apoptosis, o la neoplasticidad.
2. La composición según la reivindicación 1, caracterizada porque el plásmido comprende un elemento regulador enlazado funcionalmente al segmento que codifica para un ácido nucleico funcional.
3. La composición según la reivindicación 2, caracterizada porque el elemento regulador es un promotor que depende de la ARN polimerasa.
4. La composición según la reivindicación 3, caracterizada porque el promotor es el promotor de ARN polimerasa III Hl o U6 o 7SK o el promotor de ARN polimerasa II CMV del promotor reciente. '
5. La composición según la reivindicación 1, caracterizada porque el ácido nucleico funcional es una molécula de siARN, shARN o miARN que se dirige al transcripto de una proteína que contribuye a la resistencia a fármacos.
6. La composición según la reivindicación 1, caracterizada porque el ácido nucleico funcional es una molécula antisentido que se dirige al transcripto de una proteína que contribuye a la resistencia a fármacos.
7. La composición según la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico funcional es una ribozima que se dirige al transcripto de una proteína que contribuye a la resistencia a fármacos.
8. La composición según la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico funcional se dirige al transcripto de P-glucoproteína, MDR-2 o de MDR-3.
9. La composición según la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico funcional se dirige al transcripto de la proteína asociada con la resistencia a MRP2, BCR-ABL, STI-571, la proteina relacionada con la resistencia pulmonar, ciclooxigenasa-2 , factor kappa nuclear, XRCC1, ERCC1, GSTP1, ß-tubulina mutante, o un factor de crecimiento.
10. La composición según la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico funcional se dirige al transcripto de una proteína que contribuye a la resistencia a la apoptosis.
11. La composición según la reivindicación 10, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico funcional se dirige a un transcripto de Bcl-2, BCI-XL, Al/Bfl 1, cinasa de adhesión focal o proteína p53.
12. La composición según la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico funcional se dirige a un transcripto de una proteína que contribuye a la neoplasticidad.
13. La composición según la reivindicación 12, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico funcional se dirige a un transcripto de ß-Catenina, PKC-a, C-RAF, K-Ras, Dead box ARN helicasa DP97, DNMTl, FLIP, C-Sfc, 53BPI, proteína del grupo Polycomb EZH2, ErbBl, HPV-16 E5 y E7, Fortilin & MCI1P, DIP13a, MBD2, p21, KLF4, tpt/TCTP, SPK1 & SPK2, P300, PLK1, Trp53, Ras, ErbBl, VEGF, o BAG-1.
14. La composición según la reivindicación 1, caracterizada porque el plásmido codifica para múltiples moléculas de ácido nucleico funcional.
15. La composición según la reivindicación 14, caracterizada porque el plásmido comprende además un promotor para cada molécula de ácido nucleico funcional codificado.
16. La composición según la reivindicación 1, caracterizada además porque comprende un fármaco.
17. La composición según la reivindicación 16, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico funcional se dirige al transcripto de una proteína que contribuye a la resistencia al fármaco.
18. La composición según la reivindicación 16, caracterizada porque se empaca en una minicélula intacta.
19. La composición según la reivindicación 18, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico funcional o el plásmido, y el fármaco se empacan dentro de la misma minicélula.
20. La composición según la reivindicación 1, caracterizada además porque comprende un ligando biespecífico .
21. La composición según la reivindicación 20, caracterizada porque el ligando biespecífico comprende una primera ramificación que porta especificidad para una estructura superficial de la minicélula y una segunda ramificación que porta especificidad para un receptor de superficie celular de mamífero no fagocítico.
22. La composición según la reivindicación 21, caracterizada porque la estructura superficial de la minicélula es un componente de O-polisacárido de un lipopolisacárido sobre la superficie minicelular.
23. La composición según la reivindicación 21, caracterizada porque el receptor de superficie de mamífero es capaz de activar la endocitosis receptor-suministrada de la minicélula.
24. La composición según la reivindicación 20, caracterizada porque el ligando biespecífico comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
25. La composición según la reivindicación 1, caracterizada porque la composición contiene menos de aproximadamente 1 célula bacteriana madre contaminante por 107 minicélulas.
26. La composición según la reivindicación 1, caracterizada porque la composición contiene menos de aproximadamente 1 célula bacteriana madre contaminante por 108 minicélulas.
27. La composición según la reivindicación 1, caracterizada porque la composición contiene menos de aproximadamente 1 célula bacteriana madre contaminante por 109 minicélulas.
28. La composición según la reivindicación 1, caracterizada porque la composición contiene menos de aproximadamente 1 célula bacteriana madre contaminante por 1010 minicélulas.
29. La composición según la reivindicación 1, caracterizada porque la composición contiene menos de aproximadamente 1 célula bacteriana madre contaminante por 1011 minicélulas.
30. Un método para suministrar un ácido nucleico funcional, caracterizado porque comprende (a) proporcionar una minicélula intacta que contiene (i) una molécula de ácido nucleico funcional o (ii) un plásmido que comprende un segmento que codifica para una molécula de ácido nucleico funcional y luego (b) poner la minicélula en contacto con una codocito de mamífero, de tal forma que la célula mamífera envuelva a la minicélula, mediante esto el ácido nucleico funcional se libera en el citoplasma de la célula del codocito.
31. El método según la reivindicación 30, caracterizado porque el ácido nucleico funcional se expresa mediante el codocito.
32. El método según la reivindicación 30, caracterizado porque la minicélula contiene un plásmido que comprende un elemento regulador que está enlazado funcionalmente al segmento.
33. El método según la reivindicación 31, caracterizado porque el elemento regulador es un promotor que depende de la ARN polimerasa.
34. El método según la reivindicación 33, caracterizado porque el promotor es el promotor de ARN III polimerasa Hl o U6.
35. El método según la reivindicación 30, caracterizado porque el contacto entre la minicélula y el codocito se presenta in vi tro .
36. El método según la reivindicación 30, caracterizado porque el contacto entre la minicélula y el codocito se presenta ín vivo .
37. El método según la reivindicación 30, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico funcional es una molécula de siARN que se dirige al transcripto de una proteína que contribuye a la resistencia a fármacos.
38. El método según la reivindicación 30, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico funcional es una molécula antisentido que se dirige al transcripto de una proteína que contribuye a la resistencia a fármacos.
39. El método según la reivindicación 30, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico funcional es una ribozima que se dirige al transcripto de una proteína que contribuye a la resistencia a fármacos.
40. El método según la reivindicación 30, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico funcional se dirige al transcripto de P-glucoproteína, MDR- 2 o de MDR-3.
41. El método según la reivindicación 30, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico funcional se dirige al transcripto de la proteína asociada con la resistencia a MRP2, BCR-ABL, STI-571, la proteína relacionada con la resistencia pulmonar, ciclooxigenasa-2, factor kappa nuclear, XRCC1, ERCC1, GSTP1, ß-tubulina mutante, o un factor de crecimiento.
42. El método según la reivindicación 30, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico funcional se dirige al transcripto de una proteína que contribuye a la resistencia a la apoptosis.
43. El método según la reivindicación 42, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico funcional se dirige a un transcripto de Bcl-2, BCI-XL, Al/Bfl 1, cinasa de adhesión focal o la proteína p53.
44. El método según la reivindicación 30, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico funcional se dirige a un transcripto de una proteína que contribuye a la neoplasticidad.
45. El método según la reivindicación 44, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico funcional se dirige a un transcripto de ß-Catenina, PKC-a, C-RAF, K-Ras, Dead box ARN helicasa DP97, DNMT1, FLIP, C-Sfc, 53BPI, proteína del grupo Polycomb EZH2, ErbBl, HPV-16 E5 y E7, Fortilin & MCHP, DIPl3a, MBD2, p21, KLF4, tpt/TCTP, SPK1 & SPK2, P300, PLK1, Trp53, Ras, ErbBl, VEGF, o BAG-1.
46. El método según la reivindicación 30, caracterizado porque el plásmido codifica para múltiples moléculas de ácido nucleico funcional.
47. El método según la reivindicación 46, caracterizado porque el plásmido comprende además un promotor para cada molécula de ácido nucleico funcional codificada.
48. El método según la reivindicación 30, caracterizado además porque comprende los pasos de: (c) suministrar un fármaco al codocito de mamífero.
49. El método según la reivindicación 48, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico funcional se dirige al transcripto de una proteína que contribuya a la resistencia al fármaco.
50. El método según la reivindicación 48, caracterizado porque el fármaco se empaqueta en una minicélula intacta.
51. El método según la reivindicación 50, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico funcional o el plásmido, y el fármaco se empacan dentro de la misma minicélula.
52. El método según la reivindicación 48, caracterizado porque el paso (c) se presenta posterior a los pasos (a) y (b) .
53. El método según la reivindicación 48, caracterizado porque el fármaco se suministra concurrentemente con el paso (b) .
54. El método según la reivindicación 30, caracterizado porque el paso (b) implica colocar un ligando biespecífico en contacto con una minicélula intacta y el codocito de mamífero, de tal forma que (i) el ligando biespecifico provoque que la minicélula se una a la célula mamífera.
55. El método según la reivindicación 54, caracterizado porque el codocito de mamífero es una célula no fagocítica.
56. El método según la reivindicación 54, caracterizado porque el ligando biespecífico comprende una primera ramificación que porta especificidad para una estructura de superficie minicelular y una segunda ramificación que porta especificidad para un receptor de superficie celular de mamífero no fagocítica.
57. El método según la reivindicación 56, caracterizado porque la estructura de superficie minicelular es un componente de O-polisacárido de un lipopolisacárido en la superficie minicelular.
58. El método según la reivindicación 56, caracterizado porque el receptor de la superficie celular de mamífero es capaz de activar la endocitosis receptor-suministrada de la minicélula.
59. El método según la reivindicación 54, caracterizado porque el ligando biespecífico comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
60. El método según la reivindicación 30, caracterizado porque la célula mamífera es competente para fagocitosis o endocitosis.