MX2007000784A

MX2007000784A - Inhibidores de proteina 4 tipo angiopoietina, combinaciones y su uso.

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Publication number: MX2007000784A
Application number: MX2007000784A
Authority: MX
Inventors: Napoleone Ferrara; Hans-Peter Gerber; Xiao Huan Liang
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2004-07-20
Filing date: 2005-07-19
Publication date: 2007-04-09
Also published as: KR101254815B1; RU2392966C2; EP1771474A2; EP2172482A1; US20060093607A1; AU2011201436A1; SI1771474T1; ES2339789T3; JP4947717B2; EP1771474B1; EP2361931A1; CA2574758A1; US20070026002A1; ZA200701183B; WO2006014729A3; RU2007106076A; EP2361931B1; CY1109931T1; PT1771474E; KR20070043010A

Abstract

Se proporcionan moduladores de la proteina 4 de tipo angiopoietina junto con los metodos para su uso en el tratamiento de enfermedades y estados patologicos. Tambien se proporcionan combinaciones de los antagonistas de la ANGPTL4 y otros agentes terapeuticos, por ejemplo, agentes antineoplasicos, y metodos para su uso en el tratamiento de mamiferos suceptibles a padecer cancer o con un crecimiento reincidente del tumor o crecimiento reincidente de celula cancerosa.

Description

INHIBIDORES DE PROTEINA 4 DE TIPO ANGIOPOIETINA, COMBINACIONES Y SU USO CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere en general al tratamiento de enfermedades y estados patológicos humanos, tal como el cáncer. La invención se refiere a inhibidores de la proteina 4 de tipo angiopoietina (ANGPTL4) y a las combinaciones de los inhibidores de la ANGPTL4 con otras terapias y métodos que utilizan las combinaciones para el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades o estados patológicos. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer es la primera causa de muerte en Estados Unidos de Norteamérica. Para el tratamiento del cáncer se han utilizado varios tipos de terapias. Por ejemplo, para extirpar tejidos cancerosos o muertos se utilizan métodos quirúrgicos. La radioterapia, que actúa reduciendo el tamaño de los tumores sólidos, y la quimioterapia, que mata a las células que se dividen con gran rapidez, se utilizan como terapéuticas contra el cáncer. En 1971, Folkman propuso que la antiangiogénesis podria ser una estrategia efectiva para combatir el cáncer.

Folkman, N. Engl . J. Med. 285, 1182-1186 (1971). La angiogénesis es el desarrollo de nueva vasculatura a partir de los vasos sanguíneos preexistentes y/o de las células REF. 179092 madre endoteliales circulantes (ver, por ejemplo, Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12)1359-1364 (1999)). La angiogénesis es un proceso en serie que consiste en 1) la degradación de la matriz extracelular de una zona localizada después de la liberación de proteasa, 2) la proliferación de células endoteliales en los capilares y 3) la migración de los túbulos capilares hacia el estimulo angiogénico. Ferrara y col. Endocrine Rev. 13:18-32 (1992). La formación de nuevos vasos sanguíneos es un prerrequisito durante los procesos fisiológicos normales de desarrollo embriónico y posnatal, por ejemplo, embriogénesis, curación de heridas y menstruación. Ver, por ejemplo, Folkman y Klagsbrun Science 235:442-447 (1987). Esta proliferación de nuevos vasos sanguíneos a partir de capilares preexistentes desempeña además un papel clave en el desarrollo patológico de una variedad de trastornos, que incluyen por ejemplo, aunque sin limitarse a ellos, tumores, retinopatias proliferativas, degeneración macular relacionada con el envejecimiento, psoriasis, inflamación, diabetes y artritis reumatoide (AR) . Ver, por ejemplo. Ferrara, Recent Prog:. Horm . Res . 55:15-35 (2000), argumento 35-6. En vista de la notable importancia fisiológica y patológica de la angiogénesis, gran parte del trabajo se ha dedicado al esclarecimiento de los factores capaces de regular este proceso. Se ha sugerido que el proceso de la angiogénesis es regulado por un equilibrio entre las moléculas pro y antiangiogénicas y es la causa desencadenante de varias enfermedades, especialmente el cáncer. Ver, por ejemplo, Carmeliet and Jain Nature 407:249-257 (2000). Por ejemplo, la angiogénesis depende de factores segregados como el factor A del crecimiento endotelial vascular (VEGF, también conocido como factor de permeabilidad vascular (VPF) y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) . Ver, por ejemplo, Ferrara y Davis-Smyth Endocrine Rev. 18:4-25 (1997); y Ferrara J. Mol . Med. 77:527-543 (1999). Además de ser un factor angiogénico en la angiogénesis y en la vasculogénesis, el VEGF, como factor de crecimiento pleiotrópico, presenta múltiples efectos biológicos en otros procesos fisiológicos, como la supervivencia de las células endoteliales, la permeabilidad de los vasos y la vasodilatación, la quimiotaxia de monocitos y el influjo de calcio. Ferrara and Davis-Smyth (1997), supra . Asimismo, los estudios han revelado los efectos mitogénicos del VEGF en algunos tipos de células no endoteliales, como las células epiteliales del pigmento de la retina, las células de los conductos pancreáticos y las células de Sch ann. Ver, por ejemplo, Guerrin y col. J. Cell Physiol . 164:385-394 (1995); Oberg- elsh y col. Mol . Cell . Endocrinol . 126:125-132 (1997); y Sondell y col. J. Neurosci . 19:5731-5740 (1999). El VEGF pertenece a una familia de genes que incluye el factor de crecimiento de la placenta (PIGF), el VEGF-B, el VEGF-C, el VEGF-D y el VEGF-E. Estos ligandos aglutinan y unen a los receptores de la tirosina cinasa expresados en células endoteliales. Por ejemplo, la familia de receptores de la tirosina cinasa del VEGF incluye a los siguientes factores: Fltl (VEGF-Rl) (que une a los ligandos VEGF, VEGF-B y PIGF), Flkl/KDR (VEGF-R2) (que une a VEGF, VEGF-C, VEGF-D y VEGF-E) y Flt4 (VEGF-R3) (que une a VEGF-C y VEGF-D). Ver, por ejemplo, Ferrara y col., Nature Medicine 9(6):669-676 (2003); y Robinson & Stringer, Journal of Cell Science, 114 (5) : 853-65 (2001). Las Angiopoietinas son otro grupo de factores de crecimiento del endotelio vascular. Ver, por ejemplo, Davis y col., Cell, 87:1161-1169 (1996); Suri y col., Cell, 87:1171-1180 (1996); Maisonpierre y col. Science 277:55-60 (1997); y Valenzuela y col., Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 96:1904-1909 (1999). Las angiopoietinas parecen actuar de manera complementaria y coordinada con el VEGF, donde el VEGF actúa en el crecimiento vascular, mientras que es más probable que las angiopoietinas actúen modulando y remodelando en la maduración y estabilización de la vasculatura. Ver, por ejemplo, Holash y col., Oncogene 18:5356-5362 (1999). La Angiopoietina 1, Angiopoietina 2, Angiopoietina 3 y Angiopoietina 4 se unen a los receptores de la tirosina cinasa Tie2 (también conocidos como Tek) , que son los receptores encontrados en las células endoteliales. Ver, por ejemplo, Ward & Dumont, Seminars in Cell & Developmental Biology, 13:19-27 (2002). También existe un receptor huérfano Tiel. La angiogénesis no sólo depende de los factores de crecimiento, sino que también es influenciada por las moléculas de adhesión celular (MAC) , incluidas las integrinas, que se unen a los ligandos presentes dentro de la matriz extracelular. Ver, por ejemplo, Ferrara & Alitalo, Na ture Medicine 5(12)1359-1364 (1999); y Carmeliet, Nature Medicine, 6(3): 389-395 (2000). Las integrinas facilitan la adhesión celular y la migración en las proteínas de la matriz extracelular encontradas en los espacios intercelulares y en las membranas básales. La familia de las integrinas de las proteínas de adhesión celular está compuesta como minimo por 18 subunidaes a y 8 subunidades ß que se expresan como minimo en 22 combinaciones heterodiméricas ß. Ver, por ejemplo, Byzova y col., Mol . Cell . , 6(4): 851-860 (2000); y Hood y Cheresh, Nature Reviews, 2:91-99 (2002) . Entre éstas, al menos seis ( vß3, avßs, oc5ß?, ot2ß?, ovßx y aißi) de las combinaciones han estado implicadas en la angiogénesis (ver, por ejemplo, Hynes y Bader, Thromb. Haemost . , 78(l):83-87 (1997); y Hynes y col., Braz. J. Med. Biol . Res . , 32(5) :501- 510 (1999) ) . La inactivación de varios genes que codifican receptores de adhesión específicos o la administración de anticuerpos bloqueantes en modelos animales tuvieron profundos efectos sobre la respuesta angiogénica de las células endoteliales. Ver,- por ejemplo, Elicieri y Cheresh, Mol . Med. , 4:741-750 (1998). Estas moléculas han sido objetivos de terapias contra el cáncer. Por ejemplo, la identificación del VEGF como un regulador primario de la angiogénesis en estados patológicos ha conducido a numerosos intentos de bloquear sus actividades. Se ha propuesto el uso de inhibidores de anticuerpos receptores anti-VEGF, constructos receptores solubles, estrategias antisentido, aptámeros de ARN anti-VEGF e inhibidores del receptor tirosina cinasa (RTK) del VEGF de bajo peso molecular para interferir las señales del VEGF. Ver, por ejemplo, Siemeister y col. Cáncer Metástasis Rev. 17:241-248 (1998). Los anticuerpos neutralizantes anti-VEGF han demostrado que inhiben el desarrollo de una variedad de lineas de células tumorales humanas en ratas desnudas (Kim y col. Nature 362:841-844 (1993); Warren y col. J. Clin . Invest . 95:1789-1797 (1995); Borgstrdm y col. Cáncer Res . , 56:4032-4039 (1996); y Melnyk y col. Cáncer Res . , 56:921-924 (1996) ) y también inhiben la angiogénesis intraocular en modelos con trastornos retinianos isquémicos (Adamis y col., Arch. Ophthalmol . 114:66-71 (1996)). En realidad, la FDA (Food and Drug Administration) de Estados Unidos de Norteamérica ha aprobado un anticuerpo anti-VEGF humanizado, el bevacizumad (AVASTIN®, Genentech) , como terapia de primera linea para el tratamiento del cáncer colorrectal metastásico. Ver, por ejemplo, Ferrara y col., Nature Reviews Drug Discovery, 3:391-400 (2004). Sin embargo, los métodos actuales para el tratamiento del cáncer no siempre dan resultados óptimos. Con frecuencia no es possible eliminar completamente un estado patológico mediante un solo tipo de terapia. Por ejemplo, los procedimientos quirúrgicos no suelen estar en condiciones de eliminar por completo el crecimiento canceroso. Otros tratamientos para el cáncer, como la quimioterapia, tienen numerosos efectos secundarios, y/o la terapia resulta inefectiva, por ejemplo porque el cáncer desarrolla resistencia al medicamento o tratamiento. A veces la inhibición de un receptor de VEGF o VEGR o del sistema del receptor Tie2 no elimina totalmente el desarrollo del tumor. Ver, por ejemplo, Gerber y col., Cáncer Research, 60:6253-6258 (2000); Ferrara y col., Nature Reviews :Drug Discovery, 3:391-400 (2004); Millauer y col., Nature 367, 576-579 (1994); Kim y col., Nature 362: 841-844 (1993); Millauer y col., Cáncer Res . 56:1615-1620 (1996); Goldman y col., Proc . Nati . Acad. Sci . USA 95:8795-8800 (1998); Asano y col., Cáncer Research, 55:5296-5301 (1995); Warren y col., J. Clin . Invest . , 95:1789-1797 (1995); Fong y col., Cáncer Res . 59:99-106 (1999); Wedge y col., Cáncer Res . 60:970-975 (2000); Wood y col. Cáncer Res . , 60:2178-2189 (2000); Siemeister y col., Cáncer Res . 59:3185-3191 (1999); Lin y col., J. Clin . Invest . 103:159-165 (1999); Lin y col., Proc . Nati . Acad. Sci . USA 95:8829-8834 (1998); y Siemeister y col., Cáncer Res . 59, 3185-3191, (1999) . Por lo tanto, existe una urgente necesidad de nuevas y más efectivas terapias para controlar el cáncer. La invención aborda estas y otras necesidades, como revelará el análisis de la siguiente descripción. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a los inhibidores de la proteina 4 de tipo angiopoietina (ANGPTL4) y a los métodos de utilización de los inhibidores para tratar enfermedades y estados patológicos, por ejemplo para bloquear o reducir el crecimiento del tumor o de las células cancerosas, bloquear o reducir la reincidencia del crecimiento tumoral, etc. La invención brinda combinaciones de inhibidores de la ANGPTL4 y de los agentes antineoplásicos, y métodos de utilización de las combinaciones para inhibir el crecimiento tumoral. La invención ofrece también combinaciones de inhibidores de la ANGPTL4 e inhibidores de la angiogénesis y métodos de utilización de las combinaciones para inhibir el crecimiento canceroso y/o los trastornos que implica la angiogénesis, por ejemplo trastornos neoplásicos (por ejemplo crecimiento tumoral) y no neoplásicos.

Se proporcionan moduladores de la ANGPTL4, por ejemplo antagonistas o agonistas de la ANGPTL4. Los antagonistas de la ANGPTL4 de la invención son moléculas que inhiben o reducen la actividad de la ANGPTL4. Un inhibidor de la ANGPTL4 puede incluir una sustancia de bajo peso molecular, un polinucleótido, moléculas antisentido, aptámeros de ARN, ribozimas contra la ANGPTL4 o sus polipéptidos receptores, un polipéptido, variantes de antagonistas de la ANGPTL4, una proteina aislada, una proteina recombinante, un anticuerpo, o conjugados o proteínas de fusión de los mismos, que inhibe, directa o indirectamente, la actividad de la ANGPTL4. En ciertas modalidades, un antagonista de la ANGPTL4 incluye un anticuerpo que se une a la ANGPTL4. En ciertas modalidades de la invención, un anticuerpo antagonista de la ANGPTL4 es un anticuerpo que inhibe o reduce la actividad de la ANGPTL4 mediante la unión a una subsecuencia o región especifica de la proteina ANGPTL4. por ejemplo N-terminal, dominio de doble espiral N-terminal, C-terminal, dominio de tipo fibrinógeno C-terminal, o ANGPTL4 (1-183), ANGPTL4 (23-183), ANGPTL4 (1 hasta aproximadamente 162), ANGPTL4 (aproximadamente 162- 406), ANGPTL4 (23-406), o subsecuencia de aminoácidos ANGPTL4 (184-406) de la ANGPTL4 humana, y/o mANGPTL4 (1-183), mANGPTL4 (23-183), mANGPTL4 (1 hasta aproximadamente 165), mANGPTL4 (23 hasta aproximadamente 165), mANGPTL4 (23-410) o subsecuencia de aminoácidos mANGPTL4 (184-410) de la ANGPTL4 del ratón. Otras subsecuencias incluyen también, aunque sin limitarse a ellas, por ejemplo 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-406, 60-406, 80-406, 100-406, 120-406, 140-406, y 160-406 de hANGPTL4 y, por ejemplo, 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-410, 60-410, 80-410, 100-410, 120-410, 140-410 y 160-410 de mANGPTL4. En ciertas modalidades de la invención, un antagonista de la ANGPTL4 incluye un anticuerpo anti-avßs, por ejemplo un anticuerpo antagonista anti-avßs. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención son anticuerpos humanizados. En ciertas modalidades de la invención, un antagonista de la ANGPTL4 es una molécula SiRNA. En una modalidad, la molécula SiRNA es una molécula ANGPTL4-SÍRNA, donde la molécula tiene como objetivo una secuencia de ADN (por ejemplo GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA) (ID. SECNO. 3) de un ácido nucleico que codifica a la ANGPTL4. Se proporcionan métodos de bloqueo o reducción del crecimiento de un tumor o de un cáncer. En ciertas modalidades, los métodos incluyen la administración a la célula tumoral o cancerosa de una cantidad efectiva de un antagonista de la proteina 4 de tipo angiopoeitina (ANGPTL4) . En otra modalidad, el antagonista de la ANGPTL4 es un anticuerpo antagoinsta anti-avßs. La cantidad efectiva bloquea o reduce el crecimiento del tumor o de la célula cancerosa. También se proporcionan métodos para inhibir la migración de las células tumorales. Por ejemplo, un método incluye la administración de una cantidad efectiva de un antagonista de la ANGPTL4 a las células tumorales, inhibiendo asi su migración. En una modalidad de la invención, la administración del antagonista de la ANGPTL4 inhibe la metástasis. Agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo uno o más agentes antineoplásicos, anticuerpos múltiples para el mismo o diferentes antigenos, uno o más agentes antiangiogénesis o inhibidores, medicación para el dolor, etc., pueden combinarse y/o administrarse con un antagonista de la ANGPTL4. También pueden aplicarse o administrarse a las células tumorales y/o cancerosas procedimientos terapéuticos adicionales, por ejemplo procedimientos quirúrgicos, radioterapia, etc. en los métodos o con las composiciones de la invención. La invención también proporciona composiciones de combinación, por ejemplo, una composición que incluye una agente anti-cancer (por ejemplo un agente anti-angiogénesis, etc.), una antagonista de la ANGPTL4, y un portador (por ejemplo, portador farmacéuticamente aceptable) . Un agente antineoplásico incluye, por ejemplo, aunque sin limitarse a ellos, agentes antineoplásicos conocidos en la especialidad y aquellos que se describen en la presente. En ciertas modalidades, un agente antineoplásico comprende uno o más agentes antiangiogénesis, por ejemplo un antagonista o inhibidor del VEGF, etc. En una modalidad, un antagonista del VEGF comprende un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento activo del mismo (por ejemplo A4.6.1 humanizado, Avastin®, etc.). En ciertas modalidades, un agente antineoplásico comprende uno o más agentes quimioterapéuticos . Se proporcionan métodos de combinación de bloqueo o reducción del crecimiento tumoral o de una célula cancerosa. En ciertas modalidades, los métodos incluyen la administración a la célula tumoral o cancerosa de una cantidad efectiva de un agente antineoplásico, y la administración a la célula tumoral o cancerosa de una cantidad efectiva de un antagonista de la ANGPTL4. En forma alternativa, o adicional, puede administrarse una composición de combinación que comprenda una cantidad efectiva de agente antineoplásico (por ejemplo, un agente antiangiogénesis, etc.) y una cantidad efectiva de un antagonista de la ANGPTL4. Las cantidades efectivas combinadas bloquean o reducen el crecimiento del tumor o de la célula cancerosa. También se proporcionan métodos de bloqueo o reducción de la reincidencia del crecimiento de un tumor o de un cáncer. En ciertas modalidades ' de la invención, el sujeto habia estado o estaba actualmente sometido a una terapia contra el cáncer con al menos un agente antineoplásico y se le administró una cantidad efectiva de un antagonista de la ANGPTL4. La administración de la cantidad efectiva del antagonista de . la ANGPTL4 bloquea o reduce la reincidencia del crecimiento del tumor o de la célula cancerosa. En ciertas modalidades, el sujeto habia estado o estaba actualmente sometido a una terapia con un antagonista de la ANGPTL4 y se le administró una cantidad efectiva de un agente antineoplásico (por ejemplo, un agente antiangiogénesis) , donde la administración de la cantidad efectiva del' agente antineoplásico bloquea o reduce la reincidencia del crecimiento del tumor o de la célula cancerosa. Habitualmente, el tumor o la célula cancerosa están presentes en el sujeto. En ciertas modalidades, el sujeto habia estado, estaba actualmente o estarla más adelante sometido a una terapia contra el cáncer con al menos un agente antineoplásico. Habitualmente, el sujeto es un mamífero (por ejemplo, un ser humano) . En ciertas modalidades, los agentes de la invención se administran a un sujeto. Los pasos de la administración o del procedimiento pueden efectuarse en cualquier orden. En una modalidad se efectuaron secuencialmente. En otra modalidad se efectuaron simultáneamente. Una posibilidad alternativa, o adicional, es que estos pasos se sigan secuencial y simultáneamente, combinando ambos métodos en cualquier orden.

También se suministran kits de moduladores de la ANGPTL4. En ciertas modalidades, un kit incluye un antagonista de la ANGPTL4, un vehículo farmacéuticamente aceptable, o diluyente, y un contenedor. En una modalidad, un kit incluye una primera cantidad de un agente antineoplásico (por ejemplo un agente antiangiogénesis, etc.), una segunda cantidad de un antagonista de la ANGTPL4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, vehículo o diluyente, y un contenedor. En otra modalidad, un kit incluye una cantidad de un agente antineoplásico (por ejemplo un agente antiangiogénesis, etc.) y un vehículo farmacéuticamente aceptable, vehículo o diluyente en una primera dosis, y una cantidad de un antagonista de la ANGPTL4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, vehículo o diluyente en una segunda dosis, y un contenedor. También pueden incluirse instrucciones de uso. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: representa una secuencia de ácido nucleico de la ANGPTL4 humana (SEC ID NO. 1) Figura 2: representa una secuencia de aminoácido de la ANGPTL4 humana (SEC ID NO. 2) Figura 3, Panel A: representa la ANGPTL4 (23-410) de la murina recombinante separada por electroferesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) (4-20%) en presencia (10 mM) o ausencia de ditriotretiol (DDT) . Figura 3, Panel B: ilustra la cepa salvaje (via 1) y la variante hANGPTL4 (via 2) separada en un gel SDS y detectada mediante Western Blotting, donde la variante hANGPTL4 tiene una sustitución R162G y R164E. Figura 4, Paneles A, B y C: ilustra esquemáticamente que la ANGPTL4 estimula la proliferación de la célula tumoral A673 (Panel A y B) y la célula tumoral U87MG (Panel B) mediante la transducción de las células tumorales con un constructo de la expresión de la ANGPTL4 y por el vehículo condicionado desde las células COS (C) transducidas con un constructo de la expresión de la ANGPTL4 (2) (Panel C) . En el Panel B, las células tumorales son transducidas con (1) que es un control del constructo de la expresión de AdLacZ, con (2) que es el constructo de la expresión de Ad-ANGPTL4 o con (3) que es el constructo de la ANGPTL4 Ad-SiRNA. En el Panel C, la proliferación de la célula tumoral A673 se realiza mediante vehículo condicionado desde las células (C) Hepa (A) , HMVEC (B) o COS transducidas con (1) un constructo de la expresión de LacZ, (2) un constructo de la expresión de la ANGPTL4 o (3) un constructo de la expresión de la ANGPTL3. Figura 5 : ilustra esquemáticamente que la mANGPTL4 estimula la proliferación de A673 cuando se coloca sobre placas de cultivo. Figura 6, Paneles A y B: ilustra esquemáticamente diversas formas (Panel A) de unión de la ANGPTL4 a las células tumorales A673 y en distintas condiciones (Panel B) . Figura 7, Paneles A y B: ilustra esquemáticamente la proliferación de A673 con vehículos que contienen ANGPTL4 al cabo de 7 dias (Panel A) o 4 dias (Panel B) de crecimiento. En el Panel A, (1) es un control del constructo de la expresión de AdLacZ, (2) es un constructo de la expresión de Ad-hANGPTL4 y (3) es un constructo de la expresión de AdLacZ y rmANGPTL4. En el Panel B, (1) no se añade nada, (2) es un control tampón, (3) mANGPTL4 (2.5 µg/ml), (4) es hANGPTL4 (2.5 µg/ml), (5) es hIgG-hANGPTL4 (2.5 µg/ml) y (6) hIgG-mANGPTL4 (2.5 µg/ml). Figura 8, Paneles A, B y C: ilustra esquemáticamente que la ANGPTL4 estimula el crecimiento del tumor N?in vivo" (Panel A y Panel B) y la tendencia a eludir el tratamiento antitumoral, por ejemplo con un anticuerpo anti-VEGF (AVASTIN® (Genentech, South San Francisco) ) , en tumores con administración intratumoral de constructos de la Angptl4 del adenovirus (Panel C) . Los Paneles A y C representan el tamaño del tumor en cm3 frente a los dias de implantación post-tumor. El Panel B representa el peso del tumor A673 xenotransplantado 20 dias después de la implantació . Figura 9: ilustra la ANGPTL4 que induce la migración de las células tumorales, A673 y 4T-1, donde (1) no hay suero añadido, (2) hay suero fetal de ternera (SFT) al 10%, (3) hay PDGF-BB y (4) ANGPTL4. Figura 10, Paneles A y B: ilustra que el anticuerpo anti-hANGPTL4 inhibe el crecimiento de las células tumorales, por ejemplo Panel A (células HeLa-S3 y Caki) y Panel B (células U87MG, 293 y A673) , donde (1) es anticuerpos anti-hANGPTL4, (2) es control del anticuerpo de la proteina 1 de la región critica del síndrome de Down (DSCR) y (3) no se añade nada, donde los números debajo del gráfico de barras indican la concentración de anticuerpos en (µg/ml) . Figura 11: ilustra la adhesión de las células 293-1953 (avßs) a una placa cubierta con ANGPTL4 o vitronectina en la concentración indicada en la parte inferior en (µg/ml) , donde BSA se usa como control. Figura 12 : ilustra que los anticuerpos anti-avßs y anti-hANGPTL4 anulan la actividad de adhesión celular de la ANGPTL4, donde (1) es BSA, (2) es vitronectina y (3) es ANGPTL4. Figura 13, Paneles A, B y C: ilustra la unión de la ANGPTL4 a la integrina avßs. El Panel A ilustra la unión de la proteina (mANGPTL4, h?NGPTL4-Nterinai o hANGPTL4-Cterminai) usando la cantidad indicada para las placas cubiertas con avß5. El Panel B ilustra la inhibición de la unión de la proteina (mANGPTL4, hANGPTL4-Nterminai o hANGPTL4-Cterminai) a las placas cubiertas de avßs con anticuerpos anti-hANGPTL4. El Panel C ilustra la unión de ANGPTL4 y vß5? donde (1) es hANGPTL4-Cterminal recubriendo la placa, (2) es hANGPTL4-Cterminal recubriendo la placa' e incubado con anti-hANGPTL4, (3) es hANGPTL4-Cterminal recubriendo la placa e incubado con anti-DSCR, (4) es vitronectina recubriendo la placa y (5) es BSA recubriendo la placa, antes de añadir avß5-DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Antes de describir la invención en forma detallada, debe entenderse que la misma no se limita a composiciones o sistemas biológicos particulares, que pueden variar. También" debe entenderse que la terminología utilizada en la presente se propone describir solamente determinadas modalidades y no pretende ser limitante. Tal como se utilizan en esta especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "uno/una" y "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que el contenido establezcla claramente lo contrario. Asi, por ejemplo, la referencia a "una molécula" incluye opcionalmente una combinación de dos o más de las moléculas y similares. A menos que se defina lo contrario, todos los términos científicos y técnicos tienen el mismo significado que se utiliza comúnmente en la especialidad a la cual pertenecen. Para los fines de esta invención, a continuación se definen los siguientes términos. El término "ANGPTL4 o "Angptl4" se refiere al polipéptido o a la proteina 4 de tipo angiopoietina, junto con las formas alélicas, segregadas y procesadas de los mismos que se produzcan naturalmente. Por ejemplo, la ANGPTL4 de origen humano es una proteina aminoácida 406, mientras que la ANGPTL4 del ratón es una proteina aminoácida 410. El término "ANGPTL4" también se utiliza para referirse a fragmentos (por ejemplo, subsecuencias, formas truncadas, etc.) del polipéptido que comprende, por ejemplo, fragmento N-terminal, dominio de doble espiral, fragmento C-terminal, dominio tipo fibrinógeno, aminoácidos 1-183, 23-183, 1 hasta aproximadamente 162, 23 hasta aproximadamente 162, 23-406, 184-406, aproximadamente 162-406, ó 23-184 de la proteina 4 de tipo angiopoietina humana, y aminoácidos 1-183, 23-183, 1 hasta aproximadamente 165, 23 hasta aproximadamente 165, 23-410, o 184-410 de la proteina 4 de tipo angiopoeitina del ratón. Otros fragmentos incluyen, aunque sin limitarse a ellos, por ejemplo 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-406, 60-406, 80-406, 100-406, 120-406, 140-406, y 160-406 of hANGPTL4 y, por ejemplo, 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-410, 60-410, 80-410, 100-410, 120-410, 140-410 y 160-410 of mANGPTL4. La referencia a cualquiera de las formas de la ANGPTL4 también puede identificarse en la aplicación, por ejemplo, mediante "ANGPTL4 (23-406)," "ANGPTL4 (184-406)," "ANGPTL4 (23-183)," "mANGPTL4 (23-410)," "mANGPTL4 (184-410)," etc., donde m" indica la secuencia de la murina. La posición del aminoácido para la ANGPTL4 nativa de un fragmento se numera como se indica en la secuencia de la ANGPTL4 nativa. Por ejemplo, la posición del aminoácido 22 (Ser) en la ANGPTL4 de un fragmento es también la posición 22 (Ser) en la ANGPTL4 nativa humana, por ejemplo, ver la Figura 2. Generalmente, la ANGPTL4 nativa de un fragmento tiene actividad biológica. El término "modulador de la ANGPTL4" se refiere a una molécula que puede activar, por ejemplo, un agonista, la ANGPTL4 o su expresión, o que puede inhibir, por ejemplo, un antagonista (o inhibidor) , la actividad de la ANGPTL4 o su expresión. Los agonistas de la ANGPTL4 incluyen a los anticuerpos y fragmentos activos . Un antagonista de la ANGPTL4 se refiere a una molécula capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, anular, reducir o interferir las actividades de la ANGPTL4, por ejemplo, la proliferación o el crecimiento celular, la migración, la adhesión o actividad metabólica, por ejemplo, lipido, modulación, o su expresión, incluyendo su unión a un receptor de la ANGPTL4, por ejemplo, avßd. Los antagonistas de la ANGPTL4 incluyen, por ejemplo, los anticuerpos anti-ANGPTL4 y los fragmentos de unión a antigeno de la misma, moléculas receptoras y derivadas que unen específicamente a la ANGPTL4 impidiendo asi su unión a uno o más receptores, anticuerpos receptores de la anti-ANGPTL4 y antagonistas receptores de la ANGPTL4 como los inhibidores de moléculas pequeñas del receptor. Otros antagonistas de la ANGPTL4 incluyen también variantes de antagonistas de la ANGPTL4, moléculas antisentido (por ejemplo ANGPTL4-SiRNA) , aptámeros de ARN y ribozimas contra la ANGPTL4 o su receptor. En ciertas modalidades, los anticuerpos antagonistas de la ANGPTL4 son anticuerpos que inhiben o reducen la actividad de la ANGPTL4 mediante la unión a una subsecuencia o región especifica de la ANGPTL4, por ejemplo, fragmento N-terminal, dominio de doble espiral, fragmento C-terminal, dominio tipo fibrinógeno, aminoácidos 1-183, 23-183, 1 hasta aproximadamente 162, 23 hasta aproximadamente 162, 23-406, 184-406, o 23-184 de la proteina 4 de tipo angiopoietina humana, y aminoácidos 1-183, 23-183, 1 hasta aproximadamente 165, 23 hasta aproximadamente 165, 23-410, o 184-410 de la proteina 4 de tipo angiopoeitina del ratón. Otros fragmentos incluyen, aunque sin limitarse a ellos, por ejemplo 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-406, 60-406, 80-406, 100-406, 120-406, 140-406, y 160-406 de hANGPTL4 y, por ejemplo, 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-410, 60-410, 80-410, 100-410, 120-410, 140-410 y 160-410 de mANGPTL4. El término "anticuerpo anti-ANGPTL4" es un anticuerpo que une a la ANGPTL4 con afinidad y especificidad suficientes. El anticuerpo anti-ANGPTL4 de la invención puede usarse como agente terapéutico para seleccionar e interferir en el desarrollo de enfermedades o estados que implican actividad de la ANGPTL4. En general, un anticuerpo anti-ANGPTL4 no se unirá a otros homólogos de la ANGPTL4, por ejemplo, la ANGPTL3. Los términos "VEFG" y "VEGF-A" se utilizan indistintamente para referirse al factor de crecimiento de las células endoteliales vasculares aminoácidos 165 y 121-, 145-, 183-, 189- relacionados, y los factores de crecimiento de las células endoteliales vasculares aminoácido 206-, como han descrito Leung y col. Science, 246:1306 (1989), Houck y col. Mol . Endocrin . , 5:1806 (1991), y Robinson & Stringer, Journal of Cell Science, 144 (5) : 853-865 (2001), junto con las formas alélicas y procesadas de las mismas que se producen naturalmente. El término "VEGF" se utiliza también para referirse a fragmentos del polipéptido, por ejemplo, comprendiendo aminoácidos 8 hasta 109 ó 1 hasta 109 del factor de crecimiento celular endotelial vascular humano aminoácido 165. La referencia a cualquiera de las formas del VEGF puede identificarse en esta aplicación mediante "VEGF (8-109)," "VEGF (1-109)" o "VEGF165." Las posiciones del aminoácido para el VEGF nativo de un "fragmento" se numeran como se indica en la secuencia del VEGF nativo. Por ejemplo, la posición del aminoácido 17 (metionina) en el VEGF nativo de un fragmento es también la posición 17 (metionina) en el VEFG nativo. El VEGF nativo de un fragmento puede tener afinidad de unión con los receptores KDR y/o Flt-1 comparable a la del VEFG nativo. Un "anticuerpo anti-VEGF" es un anticuerpo que une al VEGF con afinidad y especificidad suficientes. El anticuerpo anti-VEGF de la invención puede usarse como agente terapéutico para seleccionar e interferir en el desarrollo de enfermedades o estados que implican actividad del VEGF. En general, un anticuerpo anti-VEGF no se unirá a otros homólogos del VEGF como VEGF-B o VEGF-C, ni a otros factores de crecimiento como PIGF, PDGF o bFGF. Véanse, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 6,582,959; 6,703,020; W098/45332; WO 96/30046; WO94/10202; EP 0666868B1; las Solicitudes de Patentes Norteamericanas 20030206899, 20030190317, 20030203409 y 20050112126; Popkov y col., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004); y el Expediente NO. P2072R1. El anticuerpo anti-VEGF "Bevacizumab (BV)", también conocido como "rhuMAb VEGF" o "Avastin™", es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante generado según Presta y col. Cáncer Res . 57:4593-4599 (1997). Incluye regiones estructurales del IgGl humano mutado y regiones determinantes de la complementariedad de unión del antigeno procedente del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF de la murina A.4.6.1 que bloquea la unión del VEGF humano a sus receptores. Aproximadamente el 93% de la secuencia de aminoácidos del Bevacizumab, incluida la mayoría de las .regiones estructurales, deriva del IgGl humano, y aproximadamente el 7% de la secuencia deriva del anticuerpo de la murina A4.6.1. El Bevacizumab tiene una masa molecular de aproximadamente 149,000 daltons y es glicosilado. Asimismo, el Bevacizumab y otros anticuerpos anti-VEGF humanizados son descritos en la Patente Norteamericana No. 6,884,879 concedida el 26 de febrero de 2005. Un "antagonista VEGF" se refiere a una molécula capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, anular, reducir o interferir las actividades del VEGF, incluida su unión a uno o más receptores del VEGF. Los antagonistas del VEGF incluyen los anticuerpos del VEGF y los fragmentos de unión al antigeno del mismo, las moléculas receptoras y derivadas que se unen específicamente al VEGF impiendo asi su unión a uno o más receptores, anticuerpos receptores anti-VEGF y antagonistas receptores del VEGF como inhibidores de molécula pequeña de las tirosinas cinasas del VEGFR y proteínas de fusión, por ejemplo VEGF-Trap (Regeneron) , VEGF?21-gelonina (Peregine) . Los antagonistas del VEGF incluyen también las varianes de los antagonistas del VEGF, moléculas antisentido dirigidas al VEGF, aptámeros - de ARN y ribozimas contra el VEGF o los receptores del VEGF. Un polipéptido de "secuencia nativa" contiene un polipéptido que tenga la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido natural. Asi, un polipéptido de secuencia nativa puede tener la secuencia de aminoácido de los polipéptidos de cualquier mamífero que se generan naturalmente. Los polipéptidos con secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o producirse por medios sintéticos o de recombinación. El término polipétidos de "secuencia nativa" engloba específicamente formas segregadas o truncadas del polipéptido que se producen de forma natural (por ejemplo, una secuencia de un dominio extracelular) , las variantes que se producen de forma natural (por ejemplo, formas alternativamente empalmadas) y las variantes alélicas del polipéptido que se producen de forma natural. Una "cadena de polipéptidos" es un polipéptido en el que cada uno de los dominios del mismo está unido a otro(s) dominio (s) mediante enlace (s) peptidicos, en oposición a las interacciones no covalentes o enlaces de disulfuros . Una "variante" de polipéptido es un polipéptido biológicamente activo que tiene al menos aproximadamente una identidad de secuencia de aminoácido del 80% con el polipéptido de secuencia nativa correspondiente. Las variantes incluyen, por ejemplo, a los polipéptidos en los que se han añadido, o eliminado, uno o más residuos de aminoácidos (de producción natural y/o no natural) en el extremo terminal N- y/o C- del polipéptido. Normalmente, con el polipéptido de secuencia nativa una variante tendrá al menos una identidad de secuencia de aminoácido del 80% aproximadamente, o al menos del 90% o el 95% o más. Las variantes también incluyen los fragmentos de polipéptidos (por ejemplo, subsecuencias, truncamientos, etc.), por lo general biológicamente activos, de la secuencia nativa. El "Porcentaje (%) de identidad de la secuencia de aminoácidos" se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia seleccionada, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de la secuencia y no considerar a ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de la secuencia. A efectos de determinar el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos, la alineación se puede conseguir de varias formas que son conocidas en este alcance; por ejemplo, usando un programa informático comercializado públicamente como BLAST, BLAST-2, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR) . Los expertos en este campo pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluidos los algoritmos necesarios para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los fines de la presente los valores en porcentaje de la identidad de las secuencias de aminoácidos se obtienen como se describe a continuación usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. Este programa fue autorizado por Genentech, Inc. y ha sido archivado con la documentación del usuario en la Oficina de Derechos de Autor de Estados Unidos de Norteamérica, Washington D.C., 20559, donde está registrado bajo el NO. de Registro de Derechos de Autor de Estados Unidos . de Norteamérica NO. TXU510087, y se comercializa públicamente a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California. El programa ALIGN-2 debe ser compilado para su uso en un sistema operativo UNIX, por ejemplo UNIX V4.0D digital. El programa ALIGN-2 define todos los parámetros de comparación de secuencias, que no varian. Para los fines de la presente, el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos de una determinada secuencia aminoacidica A con respecto a una determinada secuencia aminoacidica B (lo que también puede expresarse diciendo que una determinada secuencia aminoacidica A tiene o contiene un porcentaje determinado de identidad de la secuencia aminoacidica con respecto a una determinada secuencia aminoacidica B) se calcula de la siguiente manera: 100 veces la fracción X/Y donde X es el número de residuos de aminoácidos puntuados como coincidencias al 100% por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación en ese programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se detectará que, cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no sea igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el porcentaje de la identidad de la secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no será igual al porcentaje de la identidad de la secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. El término "variante de ANGPTL4" como se utiliza en la presente se refiere a una variante como la descrita anteriormente y/o a una ANGPTL4 que incluye una o más mutaciones de aminoácido en la secuencia nativa de la ANGPTL4. Opcionalmente, las una o más mutaciones del aminoácido incluyen sustitución (es) de aminoácido. La ANGPTL4 y las variantes de la misma para uso en la invención pueden prepararse mediante distintos métodos muy conocidos en la especialidad. Las variantes de la secuencia de aminoácidos de la ANGPTL4 pueden prepararse mediante mutaciones en el ADN de la ANGPTL4. Las variantes incluyen, por ejemplo, la supresión, incorporación o sustitución de residuos dentro de la secuencia aminoacidica de la ANGTPL4, por ejemplo una secuencia aminoacidica humana codificada por el ácido nucleico depositada bajo el número de depósito ATCC 209284, o como se muestra en la Figura 2. Puede hacerse cualquier combinación de supresión, incorporación y sustitución para llegar al constructo final que tenga la actividad deseada.

Las mutaciones que se hagan en el ADN que codifica a la variante no deben situar a la secuencia fuera de la estructura de lectura y preferiblemente no deben crear regiones complementarias que podrían producir una estructura mRNA secundaria. EP 75,444A. Opcionalmente, las variantes de la ANGPTL4 se preparan mediante mutagénesis puntual dirigida de los nucleótidos presentes en el ADN que codifica a la ANGPTL4 nativa o técnicas de presentación en fagos, produciendo asi el ADN que codifica a la variante y expresando en lo sucesivo el ADN en el cultivo celular recombinante. Aunque el sitio para la introducción de una variación de una secuencia de aminoácidos esté predeterminado, no es necesario que la mutación per se esté predeterminada. Por ejemplo, para optimizar el rendimiento de una mutación en un lugar dado puede realizarse una mutagénesis aleatoria en el codón o región seleccionada monitorizando las variantes de la ANGPTL4 expresadas para obtener la combinación óptima de la actividad deseada. Están muy difundidas las técnicas para realizar mutaciones de sustitución en puntos predeterminados en el ADN que tienen una secuencia conocida, como por ejemplo la mutagénesis especifica puntual. La preparación de las variantes de la ANGPTL4 aquí descritas puede conseguirse mediante las técnicas de presentación en fagos, como las que se describen en la publicación PCT WO 00/63380. Una vez seleccionado el clon, se puede extraer la región de la proteina mutada y colocarla en un vector apropiado para la producción de proteina, generalmente un vector de expresión del tipo que puede utilizarse para la transformación de un hospedador apropiado. Las eliminaciones de secuencias de aminoácidos generalmente van desde aproximadamente 1 a 30 residuos, opcionalmente 1 a 10 residuos, 1 a 5 residuos o menos, y suelen ser contiguas. Las inserciones en las secuencias de aminoácidos incluyen fusiones en los extremos amino y/o carboxi terminal que varían en longitud desde un simple residuo hasta polipéptidos de longitud ilimitada, así como inserciones dentro de la secuencia de uno o múltiples residuos de aminoácidos. Las inserciones dentro de la secuencia (es decir, inserciones dentro de la secuencia nativa de la ANGPTL4) pueden variar desde aproximadamente 1 a 10 residuos, opcionalmente l a 5 o l a 3. Un ejemplo de inserción terminal incluye una fusión de una secuencia de señal, tanto heterológa como homologa de la célula hospedadora, al extremo terminal N para facilitar la secreción desde los hospedadores recombinantes . Las variantes adicionales de la ANGPTL4 son aquellas en las que se ha eliminado al menos un residuo de aminoácido en la ANGPTL4 nativa insertando en su lugar un residuo diferente. En una modalidad de la invención, la variante ANGPTL4 incluye una sustitución en el 162 y/o 164 de la ANGPTL4 o una sustitución en el 169 de la mANGPTL4. Las sustituciones pueden realizarse según lo indicado en la Tabla 1. Las variantes de la ANGPTL4 también pueden incluir aminoácidos no naturales como se ha descrito en la presente. Los aminoácidos pueden agruparse de acuerdo con similitudes en las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, en Biochemistry, segunda ed. , págs. 73-75, Worth Publishers, New York (1975) ) : (1) apolares: Ala (A), Val (V), Leu (L) , He (I), Pro (P), Fe (F) , Trp (W) , Met (M) (2) polares no cargados: Gli (G) , Ser (S) , Tr (T) , Cis (C) , Tir (Y) , Asn (N) , Gln (Q) (3) ácidos: Asp (D) , Glu (E) (4) básicos: Lis (K) , Arg (R) , His (H) Alternativamente, los residuos que aparecen naturalmente se pueden dividir en grupos basándose en las propiedades comunes de las cadenas laterales: (1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe. Tabla 1 xLos residuos de aminoácidos que se producen naturalmente" (es decir, los residuos de aminoácidos codificados por el código genético) pueden seleccionarse del grupo compuesto por: alanina (Ala; arginina (Arg); asparagina (Asn) ; ácido aspártico (Asp) ; cisteina (Cys) ; glutamina (Gln) ; ácido glutámico (Glu); glicina (Gly); histidina (His); isoleucina (He) : leucina (Leu) ; lisina (Lys) ; metionina (Met) ; fenilalanina (Pha) ; prolina (Pro) ; serina (Ser) ; treonina (Trp) ; triptofán (Trp) ; tirosina (Tyr) ; y valina (Val) . Un "residuo de aminoácido que se produce de manera no natural" se refiere a un residuo que no es ninguno de los residuos de aminoácido que se producen naturalmente mencionados anteriormente y es capaz de unirse covalentemente al (a los) residuo (s) de aminoácido adyacentes en una cadena de polipéptidos. Los ejemplos de residuos de aminoácidos que se producen de manera no natural incluyen, por ejemplo, a la norleucina, la ormitina, la norvalina, la homoserina y otros residuos de aminoácidos análogos a los descritos en Ellman y col. Meth . Enzym . 202:301-336 (1991) & Publicaciones de Solicitud de Patentes 20030108885 y 20030082575. En síntesis, estos procedimientos implican la activación de un tRNA supresor con un residuo de aminoácido que se produce de manera no natural seguida de la transcripción y traducción in vitro e in vivo del RNA. Ver, por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patentes de Estados Unidos de Norteamérica 20030108885 y 20030082575; Noren y col. Science 244:182 (1989); y, Ellman y col., supra . Un polipéptido "aislado" es aquél que se ha identificado y separado, y/o recuperado, a partir de un componente de su entorno natural . Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos y no proteicos. En ciertas modalidades, el polipétido se purificará (1) en más del 95% de su peso tal como se determina por el método de Lowry, o en más del 99% de su peso, (2) en un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de una secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta alcanzar la homogeneidad mediante SDS-PAGE, en condiciones reductoras o no reductoras, utilizando la tinción con azul de Coomassie o plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ dentro de células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del polipéptido no estará presente. En cualquier caso, normalmente el polipéptido aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación. El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y comprende específicamente los anticuerpos monoclonales (incluidos los anticuerpos monoclonales intactos o de longitud completa) , anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos (ver a continuación) mientras muestren la actividad o función biológicas deseada. A menos que se indique lo contrario, la expresión "anticuerpo multivalente" se utiliza a lo largo de esta especificación para referirse a un anticuerpo que comprende tres o más puntos de unión con el antigeno. Normalmente, se procede a modificar el anticuerpo multivalente para tener tres o más puntos de unión con el antígeno y por lo general no es un anticuerpo IgM o IgA de secuencia nativa. Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden sólo una parte de un anticuerpo intacto, que generalmente incluye un punto de unión del antigeno del anticuerpo intacto y por lo tanto conserva la capacidad de unirse al antigeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos comprendidos en esta definición incluyen: (i) el fragmento Fab, que tiene los dominios VL, CL, VH y CH1; (ii) el fragmento Fab' , que es un fragmento Fab que tiene uno o más residuos de cisteina en el extremo terminal C del dominio CHl; (iii) el fragmento Fd que tiene los dominios VH y CHl; (iv) el fragmento Fd' que tiene los dominios VH y CH1 y uno o más residuos de cisteína en el extremo terminal C del dominio CHl; (v) el fragmento Fv que tiene los dominios VL y VH de un brazo único de un anticuerpo; (vi) el fragmento dAb (Ward y col., Nature 341, 544-546 (1989) ) compuesto por un dominio VH; (vii) las regiones CDR aisladas; (viii) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab' unidos por un puente de disulfuro en la región bisagra; (ix) moléculas de anticuerpo de cadena única (por ejemplo Fv de cadena única; scFx) (Bird y col., Science 242:423-426 (1988); y Huston y col., PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)); (x) "diacuerpos" con dos puntos de unión con el antigeno, comprendiendo un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena liviana (VL) en la misma cadena del polipéptido (ver, por ejemplo, EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger y col., Proc . Nati . Acad. Sci . USA, 90:6444-6448 (1993)); (xi) "anticuerpos lineales" que comprenden un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto, con los polipéptidos de la cadena liviana complementaria, forman un par de regiones de unión con el antígeno (Zapata y col. Protein Eng. 8(10):1057 1062 (1995); y Patente Norteamericana No. 5,641,870). En la presente, por "anticuerpo monoclonal" se entiende un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que forman la población son idénticos excepto en posibles mutaciones de formación natural que podrían estar presentes en pequeñas cantidades. Los anticuerpos monoclonales son sumamente específicos y se dirigen contra un único antígeno. Asimismo, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que típicamente incluyen distintos anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos) , cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante del antigeno. El modificador "monoclonal" no está construido como lo requiere la producción del anticuerpo mediante algún método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que deben usarse de acuerdo con la invención pueden conseguirse por el método del hibridoma, descrito por primera vez en Kohier y col., Nature, 256:495 (1975), o con métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de librerías de anticuerpos fágicos utilizando las técnicas descritas en Clackson y col., Nature, 352:624-628 (1991) o Marks y col., J. Mol . Biol . , 222:581-597 (1991), por ejemplo. En la presente, los anticuerpos monoclonales incluyen específicamente los anticuerpos "quiméricos" en los cuales una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes de anticuerpos obtenidos de una especie en particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpos en particular, mientras que el resto de la(s) cadena (s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes de anticuerpos obtenidos de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, asi como fragmentos de los anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (Patente Norteamericana No. 4.816.567 y Morrison y col., Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 81:6851-6855 (1984)). Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, los murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región hipervariable del receptor se sustituyen por los residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) , como el ratón, la rata, el conejo o los primates no humanos, que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de estructura (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por sus correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentren en el anticuerpo receptor o donante. Estas modificaciones se llevan a cabo para refinar aún más el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos los dominios variables (o al menos uno, y habitualmente dos) en los que todos, o sustancialmente todos, los bucles hipervariables correspondan a los de una inmunoglobulina no humana y todas, o sustancialmente todas, las FR sean las de una secuencia de inmunoglobulina humana. Opcionalmente, el anticuerpo humanizado también comprenderá al menos una porción de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, habitualmente de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, ver Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986), Riechmann y col., Nature, 332:323-329 (1988) y Presta, Curr. Op . Struct . Biol . , 2:593-596 (1992) . Un "anticuerpo humano" es aquel que contiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano y/o que se ha producido utilizando cualquiera de las técnicas para producción de anticuerpos humanos expuestas en la presente. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que contenga residuos de unión a antígenos no humanos . Los anticuerpos humanos pueden producirse utilizando varias técnicas conocidas en la especialidad. En una modalidad, se procede a seleccionar el anticuerpo humano de una librería de fagos, donde la librería de fagos expresa los anticuerpos humanos. (Vaughan y col.

Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets y col., PNAS (USA) 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom y Winter, J. Mol .

Biol . , 227:381 (1991); Marks y col., J. Mol . Biol . , 222:581 (1991) ) . Los anticuerpos humanos también pueden obtenerse introduciendo loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones cuyos genes de inmunoglobulina endógena han sido inactivados parcial o totalmente. Tras la prueba de provocación, se observa la producción de anticuerpos humanos, muy parecida en todos sus aspectos a lo que puede verse en humanos, que incluye el reordenamiento, el ensamblaje y el repertorio de anticuerpos de los genes. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks y col., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg y col., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild y col., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern . Rev. Immunol . 13:65-93 (1995).

Alternativamente, los anticuerpos humanos pueden prepararse mediante la inmortalización de los linfocitos B humanos que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (los linfocitos B pueden obtenerse de un individuo o pueden haber sido inmunizados in vitro) . Ver, por ejemplo, Colé y col., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner y col., J. Immunol . , 147 (1): 86-95 (1991); y la Patente Norteamericana No. 5,750,373. El término "variable" se refiere al hecho de que determinadas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en sus secuencias de un anticuerpo a otro y se utilizan para la unión y especificidad de cada anticuerpo concreto con su antígeno correspondiente. No obstante, la variabilidad no se distribuye uniformemente en todos los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos, denominados regiones hipervariables, tanto de los dominios variables de la cadena ligera como de la pesada. Las porciones más conservadas de los dominios variables se llaman regiones de estructura (FRs) . Cada dominio variable de las cadenas pesada y ligera nativas comprende cuatro FR que, en gran parte, adoptan una configuración de hoja-ß, conectada por tres regiones hipervariables, que crean bucles que conectan la estructura de la hoja-ß y en algunos casos forman parte de ella. Las regiones hipervariables en cada cadena son mantenidas unidas y en estrecha proximidad por las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del punto de unión con el antigeno de los anticuerpos (ver Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de la Salud, Bethesda, MD. (1991) ) . Los dominios constantes no participan directamente en la unión de un anticuerpo a un antigeno, pero desarrollan diversas funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad con mediación celular dependiente de anticuerpos (ADCC) . El término "región hipervariable", en el contexto de la presente memoria descriptiva, se refiere a los residuos aminoácidos de un anticuerpo responsables de la unión con el antigeno. La región hipervariable generalmente comprende residuos de aminoácidos de una "región de determinación de complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, los residuos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) del dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) del dominio variable de la cadena pesada; Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, los residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) del dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (Hl), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) del dominio variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk, J. Mol . Biol . , 196:901-917 (1987)). Los residuos de una "región estructural" o "FR" son aquellos residuos de un dominio variable distintos de los de una región hipervariable, tal como se define en la presente. Según la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos pueden asignarse a distintas "clases". Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas pueden seguir dividiéndose en "subclases" (isotipos) , por ejemplo, IgGl (incluyendo alotipos A y no A), IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las distintas clases de anticuerpos se denominan , d, e, ? y µ, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las distintas clases de inmunoglobulinas son muy conocidas . Las cadenas ligeras de anticuerpos de cualquier especie vertebrada pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa (K) y lambda (?) , sobre la base de las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes . El término "región Fc" se utiliza para definir la región terminal C de una cadena pesada de inmunoglobulina que puede generarse mediante la digestión con papaina de un anticuerpo intacto. La región Fc puede ser una región Fc de secuencia nativa o una variante de la región Fc. Aunque los limites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de la cadena pesada IgG humana se suele definir como la extensión desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226, o desde la posición Pro230, hasta el terminal carboxilo de la región Fc. Por lo general, la región Fc de una inmunoglobulina comprende dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3, y opcionalmente incluye un dominio CH4.

Por "cadena de la región Fc" en la presente se entiende una de las cadenas de dos polipéptidos de una región Fc. El "dominio CH2" de una región Fc IgG humana (también mencionada como dominio "Cg2") suele extenderse desde un residuo de aminoácido en la posición 231 a un residuo de aminoácido en la posición 340. El dominio CH2 es único en el sentido de que no está estrechamente emparejado con otro dominio. En cambio, dos cadenas de carbohidratos ramificadas con enlace N se interponen entre los dos dominios CH2 de una molécula IgG nativa intacta. Se ha especulado con que el carbohidrato puede actuar como un sustituto del emparejamiento dominio-dominio y contribuir a estabilizar el dominio CH2. Burton, Molec. Immunol .22 : 161-206 (1985). El dominio CH2 a que se hace referencia en la presente puede ser un dominio CH2 de secuencia nativa o una variante del dominio CH2. El "dominio CH3" comprende la extensión de residuos de terminal C hasta un dominio CH2 en una región Fc (es decir, desde un residuo de aminoácido en la posición 341 hasta un residuo de aminoácido en la posición 447 de una IgG) . La región CH3 a que se hace referencia puede ser un dominio CH3 de secuencia nativa o una variante del dominio CH3 (por ejemplo, un dominio CH3, con una "protuberancia" introducida en una cadena del mismo y una "cavidad" introducida correspondiente en la otra cadena del mismo, ver Patente Norteamericana No. 5.821.333, expresamente incorporada a esta memoria como referencia) . La variante de los dominios CH3 puede usarse para producer anticuerpos multiespecificos (por ejemplo biespecificos) como se describe en la presente. La "región bisagra" suele definirse como la extensión desde Glu216, o Cys226, hasta Pro230 del IgGl humano (Burton, Molec . Immunol .22 : 161-206 (1985)). Las regiones bisagra de otros isotipos IgG pueden alinearse con la secuencia del IgGl colocando los primeros y últimos residuos de cisteina formando enlaces S-S entre las cadenas pesadas en las mismas posiciones. La región bisagra puede ser de secuencia nativa o una variante de la región bisagra. Las dos cadenas de polipéptidos de una variante de la región bisagra generalmente conservan al menos un residuo de cisteína por cadena de polipéptido, de modo que las dos cadenas de polipéptidos de la variante de la región bisagra pueden formar un enlace de disulfuro entre ambas cadenas. La región bisagra preferente es una región bisagra humana de secuencia nativa, po ejemplo una región bisagra IgGl humana de secuencia nativa. Una "región Fc funcional" tiene al menos una "función efectora" de una región Fc de secuencia nativa. Algunos ejemplos de "funciones efectoras" incluyen la unión al Ciq, la citotoxicidad dependiente de complementos (CDC) , la unión al receptor de Fc, la citotoxicidad con mediación celular dependiente de anticuerpos (ADCC) , la fagocitosis, la regulación por disminución de receptores en la superficie celular (por ejemplo, el receptor de células B, BCR) , etc. Estas funciones efectoras generalmente requieren que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, el dominio variable de un anticuerpo) , y se pueden valorar mediante diversos ensayos conocidos en la especialidad para la evaluación de las funciones efectoras del anticuerpo. Una "región Fc de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácido idéntica a la secuencia de aminoácido de una región Fc que se pueda encontrar en la naturaleza. Una "variante de la región Fc" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia nativa en al menos una modificación de aminoácidos. En algunas modalidades, la variante de la región Fc tiene al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con una región Fc de secuencia nativa o la región Fc de un polipéptido parental, por ejemplo, entre una y diez sustituciones de aminoácidos, y preferentemente entre una y cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fc de secuencia nativa o en la región Fc del polipéptido parental. En la presente, la variante de la región Fc tendrá al menos una identidad de secuencia del 80% con una región Fc de secuencia nativa y/o una región Fc de un polipéptido parental, o al menos una identidad de secuencia del 90% o del 95% o más. La "citotoxicidad con mediación celular dependiente de anticuerpos" y las siglas "ADCC" se refieren a una reacción con mediación celular en que las células citotóxicas no especificas que expresan receptores de Fc (FcRs) (por ejemplo, las células asesinas naturales (NK) , los neutrófilos y los macrófagos) reconocen en una célula diana el anticuerpo unido a ella y posteriormente producen la lisis de la célula. Las células primarias para mediar en la ADCC, las células NK, expresan sólo Fc?RIII, mientras que los monocitos expresan Fc?RI, Fc?RII y Fc?RIII. La expresión del FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu . Rev. Immunol, 9:457-92 (1991). A fin de evaluar la actividad de la ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo de ADCC in vitro, como el que se describe en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,500,362 ó 5,821,337. Entre las células efectoras útiles para estos ensayos se encuentran las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y las células asesinas naturales (NK) . Como alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal como el que se muestra en Clynes y col. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. En general, las células expresan al menos el FcyRIII y realizan la función efectora de la ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median en la ADCC serían las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , las células asesinas naturales (NK) , los monocitos, las células T citotóxicas y los neutrófilos, pero las preferentes son las células PBMC y las NK. Las células efectoras pueden aislarse de una fuente nativa de las mismas, por ejemplo, la sangre o las PBMC tal como se describe en la presente. Los términos "receptor de Fc" y "FcR" se utilizan para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferente es un FcR humano con secuencia nativa. Además, un FcR preferente es aquél que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye las subclases de receptores Fc?RI, Fc?RII y Fc?RIII, incluidas las variantes alélicas y las formas empalmadas alternativamente de estos receptores. Los receptores Fc?RII incluyen el FcyRIIA (un "receptor promotor") y el Fc?RIIB (un "receptor inhibidor"), los cuales tienen secuencias aminoácidas similares que difieren principalmente en sus dominios citoplasmáticos . El receptor promotor Fc?RIIA contiene en su dominio citoplasmático un motivo promotor inmunorreceptor basado en la tirosina (ITAM) . El receptor inhibidor Fc?RIIB contiene en su dominio citoplasmático un motivo inhibidor inmunorreceptor basado en la tirosina (ITIM) (ver una reseña al respecto en Daéron, Annu . Rev. Immunol . , 15:203-234 (1997)). En Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol, 9:457-92 (1991), Capel y col., Immunomethods , 4:25-34 (1994) y de Haas y col., J. Lab . Clin . Med. , 126:330-41 (1995) también se revisan los FcR. Otros FcRs, incluidos aquellos que se identifiquen en el futuro, se engloban en el término "FcR" utilizado en la presente. Este término también incluye el receptor neonatal, FcRn, responsable de la transferencia de los IgGs maternos al feto (Guyer y col., J. Immunol . , 111 : 581 (1976) y Kim y col., J. Immunol . , 24:249 (1994)). La "citotoxicidad dependiente de complemento" y "CDC" se refieren a la lisis de una célula diana en presencia del complemento. La ruta de activación del complemento se inicia mediante la unión del primer componente del sistema del complemento (Ciq) a una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) que forme complejo con un antígeno cognado. Para evaluar la activación del complemento, se puede efectuar un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro y col . , J. Immunol . Methods, 202:163 (1996). Un anticuerpo con "maduración de afinidad" es aquél con una o más alteraciones en una o más CDR del mismo que dan lugar a una mejora de la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo padre que no incluye la(s) alteración (es) . Los anticuerpos con maduración de afinidad preferentes tendrán afinidades nanomolares e incluso picomolares para el antigeno diana. Los anticuerpos con maduración de afinidad se producen mediante procedimientos bien conocidos en el sector. En Marks y col., Bio/Technology, 10:779-783 (1992), se describe la maduración de afinidad a través de la transposición de los dominios VH y VL. La mutagénesis aleatoria de la CDR y/o los residuos estructurales se describen en: Barbas y col. Proc Nat . Acad. Sci , USA, 91:3809-3813 (1994), Schier y col., Gene, 169:147-155 (1995), Yelton y col., J. Immunol . , 155:1994-2004 (1995), Jackson y col., J. Immunol . , 154 (7) : 3310-9 (1995) y Hawkins y col., J. Mol . Biol . , 226:889-896 (1992). En la presente un "enlazador flexible" se refiere a un péptido que comprende dos o más residuos aminoácidos unidos por enlace (s) peptidico(s) y brinda más libertad de rotación para los dos polipéptidos (como las dos regiones Fd) enlazados al mismo. La libertad de rotación permite a dos o más puntos de unión con el antigeno unidos a cada uno de ellos por el enlazador flexible acceder con más eficacia al (a los) antigeno (s) diana. Los ejemplos de secuencias de péptidos del enlazador flexible incluyen gly-ser, gly-ser-gly-ser, ala-ser, y gly-gly-gly-ser . Un "dominio de dimerización" está formado por la asociación de al menos dos residuos aminoácidos (generalmente residuos de cisteina) o al menos por dos péptidos o polipéptidos (que pueden tener las mismas, o diferentes, secuencias de aminoácidos) . Los péptidos o polipéptidos pueden interactuar unos con otros a través de la(s) asociación (es) covalentes y/o no covalentes. En la presente los ejemplos de dominios de dimerización incluyen una región Fc; una región bisagra; un dominio CH3; un dominio CH4, un par CH1-CL; una "interfaz" con una "perilla" modificada y/o una "protuberancia" como se describe en la Patente Norteamericana No. 5.821.333, expresamente incorporada aqui como referencia; una cremallera de leucina (por ejemplo una cremallera de leucina jun/fos, ver Kostelney y col., J. Immunol . , 148: 1547-1553 (1992); o una cremallera de leucina GCN4 de levadura; una cremallera de isoleucina; un par de receptores diméricos (por ejemplo interleucina-8 receptor (IL-8R) ; y heterodimeros de integrina como LFA-1 y GPIIIb/IIIa) , o la(s) región (es) de dimerización de los mismos; polipéptidos diméricos del ligando (por ejemplo factor de crecimiento nervioso) , neutrotrofina-3 (NT-3) , interleucina-8 (IL-8), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , VEGF-C, VEGF-D, miembros PDGF y factor neurotrófico derivado del cerebro (BNDF) ; ver Arakawa y col. J. Biol . Chem . 269(45): 27833-27839 (1994) y Radziejewski y col. Biochem . 32(48): 1350 (1993)), o la(s) región (es) de dimerización del mismo; un par de residuos de cisteina capaces de formar un enlace de disulfuro; un par de péptidos o polipéptidos, comprendiendo cada uno de ellos al menos un residuo de cisteina (por ejemplo procedente de uno, dos o tres hasta aproximadamente diez residuos de cisteina) para que pueda (n) formarse el (los) enlace (s) de disulfuro entre los péptidos o polipéptidos (en lo sucesivo, "una bisagra sintética") ; y dominios variables del anticuerpo. El dominio de dimerización preferente en la presente es una región Fc o una región bisagra. Un "punto de unión con el antigeno funcional" de un anticuerpo es un punto capaz de unirse con un antígeno diana. La afinidad de unión del punto de unión del antigeno no es necesariamente tan fuerte como el anticuerpo padre del cual deriva el punto de unión del antigeno, pero la capacidad para unirse al antígeno debe medirse usando cualquiera de los distintos métodos conocidos para evaluar la unión del anticuerpo a un antigeno. Además, no es necesario que la afinidad de unión con el antigeno de cada uno de los puntos de unión con el antigeno de un anticuerpo multivalente sea la misma cuantitativamente. Para los anticuerpos multiméricos, el número de puntos de unión con el antigeno funcional puede evaluarse usando el análisis de ultracentrifugación. Según este método de análisis, se combinan diferentes proporciones de antigeno diana para un anticuerpo multimérico y el peso molecular medio de los complejos se calcula suponiendo los diferentes números de puntos de unión funcionales. Estos valores teóricos se comparan con los valores experimentales reales obtenidos para evaluar el número de puntos de unión funcionales . Un anticuerpo que tiene una "característica biológica" de un anticuerpo determinado es aquel que posee una o más de las características biológicas de ese anticuerpo que lo distinguen de otros anticuerpos que se unen al mismo antigeno . A fin de examinar los anticuerpos que se unen a un epitopo en un antigeno unido por un anticuerpo de interés, se puede llevar a cabo un ensayo rutinario de bloqueo cruzado como el descrito en Antiiodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lañe (1988). La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos incluye la administración simultánea (concurrente) y/o consecutiva en cualquier orden. A efectos de tratamiento, "mamífero" se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluidos humanos, animales domésticos y de granja, animales de compañía, utilizados en actividades deportivas o en zoos, como perros, caballos, gatos, vacas, ovejas, cerdos, etc. En general, el mamífero es un humano. Un "trastorno" es un proceso que se beneficiaría del tratamiento con las moléculas de la invención. Comprende trastornos o enfermedades crónicas y agudas, incluidos los procesos patológicos que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitantes de los trastornos que se tratan en la presente memoria incluyen cualquier forma de tumor, tumores benigos y malignos; tumores vascularizados; hipertrofia; leucemias y malignidades linfoideas; trastornos neuronales, gliales, astrocitales, hipotalámicos y otros trastornos glandulares, macrofágicos, epiteliales, estromales y blastocélicos; y trastornos inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos, trastornos vasculares como consecuencia de vascularidad inadecuada, anómala, excesiva y/o patológica y/o permeabilidad vascular. El término "cantidad efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un medicamento efectivo para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva del fármaco puede reducir el número de células cancerosas o el tamaño del tumor, inhibir (es decir, aminorar hasta cierto grado y en general detener) la infiltración de células cancerosas en los órganos periféricos, la metástasis tumoral y, hasta cierto punto, el crecimiento tumoral y/o aliviar en cierta medida uno o más de los síntomas asociados al cáncer. Con relación a su capacidad para evitar el crecimiento y/o eliminar las células cancerosas existentes, el fármaco puede ser citostático y/o citotóxico. Para la terapia contra el cáncer, la eficacia in vivo puede medirse, por ejemplo, mediante la evaluación de la duración de la supervivencia, del tiempo de progresión de la enfermedad (TTP) , de las tasas de respuesta (RR) , de la duración de la respuesta y/o de la calidad de vida. El "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. Entre las personas que necesitan tratamiento se incluyen aquéllas que sufren el trastorno así como las que deben tomar medidas para prevenirlo. Los términos "actividad biológica" y "biológicamente activo" en relación con las moléculas de la ANGPTL4 se refieren a la capacidad de una molécula para unirse específicamente y regular respuestas celulares, por ejemplo, proliferación, adhesión, migración, modulación de lípidos, etc. Las respuestas celulares comprenden también aquellas mediadas a través de un receptor de la ANGPTL4, por ejemplo un receptor de la integrina avßs, incluyendo, aunque si limitarse a ellas, la adhesión, la migración y/o la proliferación. En este contexto, el término "modular" incluye tanto a la promoción como a la inhibición. Las moléculas de la invención incluyen también a los agonistas y antagonistas de un receptor de la ANGPTL4, por ejemplo el receptor de la integrina avßs- La "hipertrofia", como se usa en la presente, se define como un aumento en masa de un órgano o estructura independiente del crecimiento natural que no implica formación de- tumor. La hipertrofia de un órgano o tejido se debe a un aumento en la masa de las células individuales (hipertrofia verdadera) o a un aumento del número de células que forman el tejido (hiperplasia), o a ambas causas. Los términos "cáncer" y "canceroso" describen o se refieren al estado fisiológico de los mamíferos típicamente caracterizado por un crecimiento celular no regulado. Entre los ejemplos de cáncer se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el carcinoma, el linfoma, el blastoma, el sarcoma y la leucemia o las malignidades linfoideas. Entre los ejemplos más específicos de los cánceres se incluyen cáncer renal o de riñon, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón incluido el cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer de células escamosas (por ejemplo cáncer de las células escamosas epiteliales) , cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico incluido el cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, cáncer de cabeza y cuello, glioblastoma, retinoblastoma, astrocitoma, tecomas, arrenoblastomas, hepatoma, malignidades hematológicas incluido el linfoma no de Hodgkins (LNH) , malignidades hematológicas agudas y mieloma múltiple, carcinoma endometrial o uterino, endometriosis, fibrosarcomas, coriocarcinoma, carcinoma de las glándulas salivares, cáncer vulval, cáncer de tiroides, carcinomas esofágicos, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma del pene, carcinoma nasofaríngeo, carcinomas de la laringe, sarcoma de Karposi, melanoma, carcinomas de la piel, Schwannoma, oligondendroglioma, neuroblastomas, rabdomiosarcoma, sarcoma osteogénico, leiomiosarcomas, carcinomas del tracto urinario, carcinomas de la tiroides, tumor de Wilm, asi como linforma de las células B (incluido el linfoma folicular no de Hodking (LNH) de bajo grado; LNH linfocítico de célula pequeña (CP) ; LNH folicular de grado intermedio; LHN difuso de grado intermedio; LNH inmunoblástico de alto grado; LNH linfoblástico de alto grado; LNH de células pequeñas no divididas de alto grado; LNH voluminoso; linfoma de las células de la corteza cerebral; linfoma relacionado con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom) ; leucemia linfocitica crónica (LLC) ; leucemia linfoblástica aguda (LLA) ; leucemia por tricoleucitos; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo postransplante (TLPT) , asi como proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edemas (como los asociados con los tumores cerebrales) y síndrome de Meig.

El término "composición antineoplásica" se refiere a una composición útil en el tratamiento del cáncer que comprende al menos un agente terapéutico activo, por ejemplo, "agente antineoplásico". Entre los ejemplos de agentes terapéuticos (agentes antineoplásicos) se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, agentes quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, agentes citotóxicos, agentes usados en radioterapia, agentes antiangiogénicos, agentes apoptóticos, agentes antitubulina, toxinas y otros agentes para tratar el cáncer, por ejemplo, anticuerpo neutralizador anti-VEGF, antagonista de VEGF, anti-HER-2, anti-CD20, un antagonista del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (por ejemplo, un inhibidor de la tirosina cinasa), inhibidor de HERl/EGFR, erlotinib, un inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib), interferones, citocinas, antagonistas (por ejemplos, anticuerpos neutralizadores) que se une a uno o más de los receptores de ErbB2, ErbB3, ErbB4 o VEGF, inhibidores para tirosina cinasas receptoras para factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) y/o factor de células madre (SCF) (por ejemplo, imatinib mesilato (Gleevec ® Novartis) ) , TRAIL/Apo2 y otros agentes bioactivos y químicos orgánicos, etc. En la invención también se incluyen combinaciones de los mismos. El término "agente citotóxico", en el contexto de la presente memoria descriptiva, se refiere a una sustancia que inhibe o impide la función de las células y/o causa su destrucción. El término pretende incluir isótopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 y los isótopos radiactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos y toxinas como las de molécula pequeña o las enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo los fragmentos y/o las variantes de las mismas. Un "agente inhibidor del crecimiento" se refiere, en el contexto de la presente memoria descriptiva, a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula in vitro y/o in vivo. Asi, el agente inhibidor del crecimiento puede reducir significativamente el porcentaje de células en la fase S. Ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento serian los agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un punto distinto de la fase S) , como los agentes que inducen la detención de la Gl y la fase M. Entre los bloqueadores clásicos de la fase M se incluyen las vincas (vincristina y vinblastina) , los TAXOL® y los inhibidores de la topo II como la doxorrubicina, la epirrubicina, la daunorrubicina, el etopósido y la bleomicina. Esos agentes que detienen la Gl también actúan en la detención de la fase S, por ejemplo, los agentes de alquilación del ADN como el tamoxifeno, la prednisona, la dacarbacina, la mecloretamina, el cisplatino, el metotrexato, el 5-fluouracilo y la ara-C.

Puede encontrarse más información al respecto en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn and Israel, eds., capitulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" ("Regulación del anillo celular, oncogenes y fármacos antineoplásicos" por Murakami y col. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente la página 13. Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos serian los agentes alquilantes como la tiotepa y la ciclofosfamida (CYTOXAN®) ; los sulfonatos de alquilo como el busulfán, el improsulfán y el piposulfán; las aziridinas como la benzodopa, la carboquona, la meturedopa y la uredopa; las etiloniminas y metilamelaminas incluyendo la altretamina, la trietilenomelamina, la trietilenofosforamida, la trietilenotiofosforamida y la trimetilo.lomelamina; los acetogeninos (en especial, el bullatacin y la bullatacinona) ; el delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®) ; la beta-lapachona; el lapachol; las colchicinas; el ácido betulinico, una camptotecina (incluyendo el topotecán análogo sintético (HYCAMTIN®) , el CPT-11 (irinotecán, CAMPTOSAR®) , la acetilcamptotecina, la escopolectina y la 9-aminocamptotecina) ; la briostatina; la callistatina; el CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adocelesina, carcelesina y bicelesina) ; la podofilotoxina; el ácido podofilínico; la teniposida; las criptoficinas (particularmente la criptoficina 1 y la 8) ; la dolastatina; la duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos KW-2189 y CB1-TM1) ; la eleuterobina; la pancratistatina; una sarcodictina; la espongistatina; la mostaza nitrogenada como el clorambucil, la clornafacina, la colofosfamida, la estramustina, la ifosfamida, la mecloretamina, el clorhidrato de óxido de mecloretamina, el melfalán, la novembichina, la fenesterina, la prednimustina, la trofosfamida y la uramustina; las nitrosureas como la carmustina, la clorozotocina, la fotemustina, la lomustina, la nimustina y la ranimustina; los antibióticos como los de enedina (por ejemplo, la caliqueamicina, especialmente la caliqueamicina gamma II y la omega II (ver, por ejemplo, Agnew, Chem Intl . Ed. Engl . , 33: 183-186 (1994)); la dinemicina, incluyendo la dinemicina A; una esperamicina; asi como el cromóforo de neocarcinostatina y los cromóforos de antibióticos de enedina cromoproteína relacionados, las aclacinomisinas, la actinomicina, la autramicina, la azaserina, las bleomicinas, la cactinomicina, la carabicina, la carminomicina, la carcinofilina, las cromomicinas, la dactinomicina, la daunorrubicina, la detorrubicina, la 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, la doxorrubicina (incluido ADRIAMYCIN®, la orfolino-doxorrubicina, la cianomorfolino-doxorrubicina, la 2-pirrolino-doxorrubicina, la inyección de liposomas de doxorrubicina HCl (DOXIL®) y la desoxidoxorrubicina) , la epirrubicina, la esorrubicina, la idarrubicina, la marcelomicina, las mitomicinas como la mitomicina C, el ácido micofenólico, la nogalamicina, las olivomicinas, la peplomicina, la potfiromicina, la puromicina, la quelamicina, la rodorrubicina, la estreptonigrina, la estreptozocina, la tubercidina, el ubenimex, la cinostatina y la zorrubicina; los antimetabolitos como el metotrexato, la gemcitabina (GEMZAR®) , el tegafur (UFTORAL®) , la capecitabina (XELODA®) , una epotilona y el 5-fluouracilo (5-FU) ; los análogos del ácido fólico como la denopterina, el metotrexato, la teropterina y el trimetrexato; los análogos de la purina como la fludarabina, la 6-mercaptopurina, la tiamiprina y la tioguanina; los análogos de la pirimidina como la ancitabina, la azacitidina, la 6-azauridina, el carmofur, la citarabina, la didesoxiuridina, la doxifluridina, la enocitabina y la floxuridina; los antiadrenales como la aminoglutetimida, el mitotano y el trilostano; un reabastecedor del ácido fólico como el ácido folinico; la aceglatona; el glucósido aldofosfamida; el ácido aminolevulinico; el eniluracilo; la amsacrina; el bestrabucil; el bisantreno; el edatraxato; la defofamina; la demecolcina; la diaziquona; la elfornitina; el acetato de eliptinio; el etoglúcido; el nitrato de galio; la hidroxiurea; el lentinán; la lonidainina; los maitansinoides como la maitansina y las ansamitocinas; la mitoguazona; la mitoxantrona; el mopidanmol; la nitraerina; el pentostatín; el fenamet; la pirarrubicina; la losoxantrona; la 2-etilhidracida; la procarbacina; el complejo polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; el razoxano; la rizoxina; el sizofirán; el espirogermanio; el ácido tenuazónico; la triaciquona; la 2, 2 ' , 2"-triclorotrietilamina; los tricotecenos (especialmente la toxina T-2, el verracurin A, el roridin A y la anguidina) ; el uretano; la vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) ; la dacarbacina; la manomustina; el mitobronitol; el mitolactol; el pipobromán; la gacitosina; la arabinosida ("Ara-C"); la tiotepa; los taxoides, por ejemplo, el paclitaxel (TAXOL®) , la formulación de nanoparticulas de paclitaxel mediante ingeniería de albúmina (ABRAXANE™) y el doxetaxel (TAXOTERE®) ; el clorambucil; la 6-tioguanina; la mercaptopurina; el metatrexato; los análogos de platino o los basados en platino como el cisplatino y el carboplatino; la vinblastina (VELBAN®) ; el platino; el etopósido (VP-16) ; la ifosfamida; la mitoxantrona; la vincristina (ONCOVIN®) ; el oxaliplatino; la leucovovina; la vinorrelbina (NAVELBINE®) ; la novantrona; el edatrexato; la daunomicina; la aminopterina; el ibandronato; el inhibidor RFS 2000 de la topoisomerasa; la difluometilornitina (DMFO) ; los retinoides como el ácido retinoico y las sales, los ácidos o los derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de las sustancias anteriores, así como las combinaciones de una o más de las sustancias anteriores como la CHOP, la abreviatura de una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona, y la FOLFOX, la abreviatura de un régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovovina. También se incluyen en esta definición los agentes antihormonales que regulan, reducen, bloquean o inhiben los efectos de las hormonas que pueden promover el crecimiento del cáncer y se presentan a menudo en la forma de un tratamiento sistémico o del cuerpo entero. Estos agentes pueden ser hormonas. Entre los ejemplos se incluyen los antiestrógenos y los moduladores selectivos de receptores de estrógenos (SERMs), incluyendo, por ejemplo, el tamoxifeno ' (también el tamoxifeno NOLVADEX®) , el raloxifeno (EVISTA®) , el droloxifeno, el 4-hidroxitamoxifeno, el trioxifeno, el keoxifeno, el LY117018, la onapristona y el toremifeno (FARESTON®) ; las antiprogesteronas; los reguladores a la baja de los receptores de estrógenos (ERDs) ; los agentes que oprimen o cierran los ovarios, por ejemplo, los agonistas de la hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH) como el acetato de leuprolida (LUPRON® y ELIGARD®) , el acetato de goserelina, el acetato de buserelina y la tripterelina; otros antiandrógenos como la flutamida, la nilutamida y la bicalutamida y los inhibidores de la aromatasa que inhiben el enzima aromatasa, encargado de regular la producción de estrógenos en las glándulas adrenales, como, por ejemplo, las 4 (5) -imidazolas, la aminoglutetimida, el acetato de megestrol (MEGASE®) , el exemestano (AROMASIN®) , la formestania, la fadrozola, la vorozola (RIVISOR®) , la letrozola (FEMARA®) y la anastrozola (ARIMIDEX®) . Además, esta definición de agentes quimioterapéuticos incluye a los bisfosfonatos como el clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®) , el etidronato (DIDROCAL®) , el NE-58095, el ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA®) , el alendronato (FOSAMAX®) , el pamidronato (AREDIA®) , el tiludronato (SKELID®) o el risedronato (ACTONEL®) , asi como la troxacitabina (un análogo de la citosina nucleósida 1, 3-dioxolano) ; los oligonucleótidos antisentido, en particular los que inhiben la expresión génica en las rutas de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante, como, por ejemplo, el PKC-alfa, el Raf, el H-Ras y el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) ; las vacunas como THERATOPE® y las que se aplican para terapias génicas, por ejemplo, la ALLOVECTIN®, la LEUVECTIN® y la VAXID®; el inhibidor de la topoisomerasa 1 (por ejemplo, LURTOTECAN®) ; el rmRH (por ejemplo, ABARELIX®) ; el ditosilato de lapatiniba (un inhibidor de molécula pequeña doble tirosina cinasa del ErbB-2 y el EGFR conocido también como GW572016) ; inhibidores COX-2 como el celecoxib (CELEBREX®; 4- (5- (4-metilfenilo) -3-(trifluometilo) -lH-pirazol-1-yl) benzenesulfonamida; y las sales, los ácidos o los derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de las sustancias anteriores. El término "citocina" es un término genérico para aquellas proteínas, liberadas por una población de células, que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de tales citocinas serían las linfoquinas, las monoquinas y las hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citocinas se incluyen las hormonas del crecimiento como la hormona humana del crecimiento, la hormona humana del crecimiento N-metionilo y la hormona bovina del crecimiento, la hormona paratiroidea, la tiroxina, la insulina, la proinsulina, la relaxina, la prorrelaxina, las hormonas glicoproteicas como la hormona estimuladora del folículo (FSH) , la hormona estimuladora de la tiroides (TSH) y la hormona luteinizante (LH) , el factor de crecimiento hepático, el factor de crecimiento fibroblástico, la prolactina, el lactógeno placentario, los factores alfa y beta de necrosis tumoral, las sustancias de inhibición mulleriana, los péptidos asociados a la gonadotropina de los ratones, la inhibina, la activina, los factores de crecimiento endotelial vascular (por ejemplo, VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D Y VEGF-E) ; el factor de crecimiento derivado de la placena (PIGF) ; los factores de crecimiento derivados de las plaquetas (PDGF, por ejemplo, PDGFA, PDGFB, PDGFC Y PDGFD), la integrina, la trombopoietina (TPO) , los factores de crecimiento nervioso como el NGF-alfa, el factor de crecimiento plaquetario, los factores de crecimiento tumoral (TGFs) como el TGF-alfa y el TGF-beta; los factores -I y -II de crecimiento similar a la insulina, la eritropoietina (EPO) , los factores osteoinductivos, los interferones como el interferón-alfa, -beta y -gama, los factores de estimulación colonial (CSFs) como el CSF macrófago (M-CSF) , el CSF granulocito macrófago (GM-CSF) y el CSF granulocito (G-CSF) , las interieucinas (ILs) como la IL-1, la IL-lalfa, la ILl-beta, la IL-2, la IL-3, la IL-4, la IL-5, la IL-6, la IL-7, la IL-8, la IL-9, la IL-10, la IL-11 y la IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20-IL-30; secretoglobina/uteroglobina; la oncostatina M (OSM); un factor de necrosis tumoral como el TNF-alfa o el TNF-beta; y otros factores polipéptidos incluyendo el LIF y el ligando de kit (KL) . En el contexto de la presente memoria descriptiva, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o cultivos de células recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citocinas con secuencia nativa. El término "profármaco" como se usa en esta solicitud se refiere a un precursor o forma derivada de un principio farmacéuticamente activo que es menos citotóxico para células tumorales que el fármaco padre y es capaz de ser activado enzimáticamente o de convertirse en la forma padre más activa. Ver, por ejemplo, Wil an, "Prodrugs in Cáncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella y col., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt y col., (ed. ) , pp. 247-267, Humana Press (1985) . Los profármacos de esta invención incluyen profármacos con fosfato, profármacos con tiofosfato, profármacos con sulfato, profármacos con péptidos, profármacos modificados con D-aminoácido, profármacos glicosilados, profármacos que contienen beta-lactamo, profámacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, profármacos 5-fluocitosina y otros profármacos 5-fluouridina que se pueden transformar en el fármaco más activo no citotóxico. Ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden ser derivados para obtener un profármaco para su uso en esta invención son los agentes quimioterapéuticos antes descritos. Un "factor o agente angiogénico" es un factor de crecimiento que estimula el desarrollo de los vasos sanguíneos, por ejemplo favorece la angiogénesis, el crecimiento celular endotelial, la estabilidad de los vasos sanguíneos, y/o la vasculogénesis, etc. Por ejemplo, los factores angiogénicos incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el VEGF y los miembros de la familia de los VEGF, el PIGF, la familia de los PDGF, la familia del factor de crecimiento de los fibroblastos (FGF), los ligandos TIE (Angiopoietinas), las efriñas, la ANGPTL3, la ANGPTL4, etc. También incluirían a los factores que aceleran la curación de las heridas, como la hormona del crecimiento, el factor-I de crecimiento (IGF-I) similar a la insulina, el VIGF, el, factor de crecimiento de la epidermis (EGF) , el CTGF y los miembros de su familia, y el TGF-a y el TGF-ß. Ver, por ejemplo, Klagsbrun y D'Amore, Annu . Rev. Physiol . , 53:217-39 (1991); Streit y Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5 (12) : 1359-1364 (1999); Tonini y col., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (por ejemplo, Tabla 1 que enumera los factores angiogénicos) ; y Sato Int . J. Clin . Oncol . , 8:200-206 (2003). Un "agente antiangiogénico" o "inhibidor angiogénico" es una sustancia de bajo peso molecular, un polinucleótido, un polipéptido, una proteina aislada, una proteina recombinante, un anticuerpo, o conjugados o proteínas de fusión de los mismos, que inhiben la angiogénesis, la vasculogénesis o la permeabilidad vascular no deseada, bien directa bien indirectamente. Por ejemplo, un agente antiangiogénico es un anticuerpo u otro antagonista a un agente angiogénico como se definió anteriormente; por ejemplo, anticuerpos anti-VEGF, anticuerpos de receptores anti-VEGF, pequeñas moléculas que bloquean la señalización de los receptores del VEGF (por ejemplo, PTK787/ZK2284, SU6668) .

Los agentes antiangiogénicos también incluyen inhibidores nativos de la angiogénesis, por ejemplo, angiostatina, endostatina, etc. Ver, por ejemplo, Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991); Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003) (por ejemplo, la Tabla 3 que enumera las terapias antiangiogénicas en el melanoma maligno); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5 (12) : 1359-1364 (1999); Tonini y col., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (por ejemplo, la Tabla 2 enumera factores antiangiogénicos) ; y, Sato Int . J. Clin . Oncol . , 8:200-206 (2003) (por ejemplo, la Tabla 1 recoge antiangiogénicos usados en ensayos clínicos) . La palabra "marca" utilizada en la presente se refiere a un compuesto o composición detectables que se conjuga directa o indirectamente con el polipéptido. La marca puede ser detectable por si misma (por ejemplo, marcas de isótopos radioactivos o marcas fluorescentes) o, en el caso de una marca enzimática, puede catalizar la alteración quimica de un sustrato de compuestos o composiciones que sea detectable. Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de, al menos, una molécula contaminante de ácido nucleico con la que se asocia habitualmente en la fuente natural del ácido nucleico del polipéptido'. Una molécula de ácido nucleico aislada es distinta de la forma o entorno en los que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico que existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que habitualmente expresan el polipéptido donde, por ejemplo, la molécula del' ácido nucleico está en una posición cromosómica distinta de la que tiene en las células naturales. La expresión "secuencias de control" se refiere a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación operativamente enlazada en un organismo hospedador concreto. Las secuencias de control que son aptas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operadores y un punto de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucarióticas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores. El ácido nucleico esta "operativamente enlazado" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o un líder secretor está operativamente enlazado al ADN de un polipéptido si está expresado como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente enlazado a una secuencia de codificación si afecta a la transcripción de la secuencia; y un punto de unión al ribosoma está operativamente enlazado a una secuencia de codificación si está situado para facilitar la traducción. Por lo general, por "operativamente enlazado" se entiende que las secuencias de ADN que se enlazan son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que estar contiguos. La unión se consigue mediante ligazón en sitios de restricción apropiados. Si esos sitios no existen, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se utilizan de conformidad con la práctica habitual.

Tal como se utilizan en la presente, las expresiones "célula", "linea celular" y "cultivo celular" son intercambiables y todas sus denominaciones incluyen la progenie. Asi, los términos "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula primaria del sujeto y los cultivos derivados de la misma con independencia del número de transmisiones. También se entiende que no es posible identificar toda la progenie en un contenido de ADN debido a mutaciones deliberadas o accidentales. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica monitorizada en la célula transformada originalmente. Cuando se propongan denominaciones diferentes, resultará evidente a partir del contenido.

ANGPTL4 La proteina 4 de tipo angiopoietina (ANGPTL4) es una proteína segregada que integra la familia de las angiopoietinas. También se conoce como proteina hepática fibrinógena/relacionada con la angiopoietina (HFARP) (Kim y col., Biochem . J. 346:603-610 (2000)), PGAR (PPAR? angiopoietin related protein) (Yoon, y col., Mol . Cell Biol . , 20:5343-5349 (2000)), factor adiposo inducido por el ayuno (FIAF) (Kerten y col., J. Biol . Chem . , 275:28488-28493 (2000) ) ; proteína relacionada con la angiopoietina (ARP-4) ; NL2 (ver Patentes Norteamericanas Nos. 6,348,350; 6,372,491; y 6,455,496) ; y Ang6. La proteína ANGPTL4 de origen humano es una proteína de aminoácido 406 (por ejemplo, Patentes Norteamericanas No. 6,348,350, 6,372,491 y 6,455,496), mientras que la ANGPTL4 del ratón es una proteína de aminoácido 410 (Kim y col., Biochem . J. 346:603-610(2000)). El ratón y el humano comparten aproximadamente el 75% de la identidad en el nivel de aminoácidos. Kim y col., Biochem . J. 346:603-610(2000). La ANGPTL4 tiene un peptido de señal, tres puntos potenciales de N-glicosilación y cuatro cisteínas que pueden estar implicadas en los enlaces disulfuro intramoleculares. Por ejemplo, la ANGPTL4 forma estructuras moleculares superiores, por ejemplo, como se indica en la Figura 3, Panel A. Ver también, por ejemplo, Ge y col., J.

Biol . Chem . , 279 (3) : 2038-2045 (2004); Ge et al., J. Lipid Res 45:2071-2079 (2004); y Mandard y col., J. of Biol . Chem . , 279(33) :34411-34420 (2004). La ANGPTL4 también puede procesarse proteoliticamente. Ver también, por ejemplo, Ge y col., J. Biol . Chem . , 279 (3) : 2038-2045 (2004); y Mandard y col., J. of Biol . Chem . , 279 (33) : 34411-34420 (2004). Como se describe en la presente memoria, la sustitución de R162G y R164E de la ANGPTL4 provoca que la variante de la ANGPTL4 actúe a un peso molecular mayor en un Gel-SDS que la proteina de tipo natural (o nativa) (ver Figura 3, Panel B) . Las regiones conservadas de la familia de la angiopoietina incluyen un dominio de doble espiral y un dominio de tipo fibrinógeno del terminal C. Ver, por ejemplo, Kim y col., Biochem . J. 346:603-610(2000). Se sugiere que la ANGPTL4 se procesa proteoliticamente de manera regulada para liberar un dominio de tipo fibrinógeno de terminal C. Ver, por ejemplo, Ge y col., Biol . Chem . 279(3) :2038-2045 (2004). Otros miembros de la familia de las angiopoietinas son la angiopoietina 1, la angiopoietina 2 y la angiopoietina3/angiopoietina4, que se unen al receptor Tie2. Ver, por ejemplo, Davis y col., Cell 87, 1161-1169 (1996); Maisonpierre et al., Science 277, 55-60 (1997); Valenzuela y col, Proc. Nati . Acad. Sci . USA 96, 1904-1909 (1999); y las Patentes Norteamericanas Nos. 5,521,073; 5,650,490 y 5,814,464. Las angiopoietinas 1 y 4 parecen ser agonistas del receptor Tie2, mientras que las angiopoietinas 2 y 3 parecen ser antagonistas (y posiblemente agonistas) del receptor Tie2. Ver, por ejemplo, Folkman & D'Amore, Cell , 87:1153-1155 (1996); Suri y col., Cell , 87:1171-1180 (1996); Masionpierre y col., Science 277:55-60 (1997); y Ward & Dumont, Seminars in Cell & Developmental Biology, 13:19-27 (2002) . Otro miembro de la familia, la proteina 3 de tipo angiopoietina (ANGPTL3) es un factor angiogénico que se une a la integrina avß3. Ver, por ejemplo, la Solicitud de Patente Norteamericana 20030215451, publicada el 20 de noviembre de 2003, y Camenisch y col., J. Biol . Chem . , 277 (19) : 17281-17290 (2002). La ANGPTL3 no parece unirse al receptor Tie2. Camenish y Col., Journal of Biol . Chem . 277 (19) : 17281-17290 (2002) . La ANGPTL3 es también un regulador de los niveles de lipidos en el plasma. Ver, por ejemplo, Koishi y col., Nat . Genetics 30:151-157 (2002). La ANGPTL4 se une a la integrina avßs. Ver, por ejemplo, las Figuras 11, 12 y 13. La integrina avß5 es un receptor de las proteínas de la matriz extracelular incluida la vitronectina, y Del-1 (ver, por ejemplo, Stupack and Cheresh, Journal of Cell Science 115:3729-3738 (2002)). Las integrinas V alfa han estado implicadas en la progresión y la metástasis de tumores. Ver, por ejemplo, Marshall, J F and Hart, I R Semin . Cáncer Biol . 7(3): 129-38 (1996). Además, también se ha demostrado la intervención de las integrinas V alfa durante la angiogénesis. Ver, por ejemplo, Eliceiri, B P and Cheresh, D A Molecular Medicine 4: 741-750 (1998). Por ejemplo, se demostró que un anticuerpo monoclonal para avßs inhibe la angiogénesis inducida por VEGF en la córnea del conejo y en el modelo de membrana corioaliantoico del pollo. Ver, por ejemplo, M. C. Friedlander, y col., Science 270:1500-1502 (1995). Los antagonistas de avß3 y avß5 también demostraron inhibir el factor de crecimiento y la angiogénesis inducida por el tumor. Ver, por ejemplo, Eliceiri and Cheresh, Current Opinión in Cell Biology, 13:563-568 (2001). La invención presenta composiciones de moduladores, por ejemplo agonistas o antagonistas, de la proteína 4 de tipo angiopoietina (ANGPTL4) y combinaciones de esos moduladores con otros agentes terapéuticos. Por ejemplo, se proporcionan combinaciones de antagonistas de la ANGPTL4 con agentes antineoplásicos y sus métodos de uso en el bloqueo o la reducción del crecimiento del tumor o el crecimiento de las células cancerosas. La invención también ofrece métodos de bloqueo o reducción del crecimiento tumoral o de las células cancerosas reincidente con antagonistas de la ANGPTL4 y/u otros agentes antineoplásicos. También se proporcionan composiciones de antagonistas de la ANGPTL4 y combinaciones de agentes antiangiogénesis y métodos para su utilización en el bloqueo o la reducción de la neovascularización de trastornos neoplásicos o no neoplásicos. MODULADORES DE LA ANGPTL4 Y USOS DE LOS MISMOS Los moduladores de la ANGPTL4 son moléculas que modulan la actividad de la ANGPTL4, por ejemplo, agonistas y antagonistas. El término "agonista" se utiliza para referirse a los péptidos y no péptidos análogos de la ANGPTL4 y a los anticuerpos específicamente de unión como las moléculas de ANGPTL4, siempre que tengan la capacidad de hacer señales a través de un receptor de la ANGPTL4 nativo (por ejemplo, la integrina avßs) . El término "agonista" se define en el contexto del papel biológico de un receptor ANGPTL4 (por ejemplo avßs) • En ciertas modalidades, los agonistas tienen las actividades biológicas de una ANGPTL4 nativa, según se ha definido anteriormente, como la promoción de la proliferación, la migración y/o la adhesión de células, y/o la modulación de la homestasis de los lípidos. El término "antagonista" se utiliza para referirse a las moléculas que tienen la capacidad de inhibir la actividad biológica de la ANGPTL4 con independencia de que tenga la capacidad de unirse a la ANGPTL4 o a su receptor, por ejemplo avßs. Por consiguiente, los antagonistas que tienen la capacidad de unirse a la ANGPTL4 o a su receptor incluyen a los anticuerpos anti-ANGPTL4 y anti- vßs. El antagonista de la ANGPTL4 puede evaluarse, por ejemplo, mediante la inhibición de la actividad de la ANGPTL4, por ejemplo- la adhesión, migración, proliferación y/o modulación de la actividad de homestasis de los lípidos de la ANGPTL4. Con respecto a la actividad del receptor de la integrina avßs, es posible determinar un modulador del receptor de una integrina avßs mediante métodos conocidos en la especialidad. Por ejemplo, puede usarse el método descrito por J. W. Smith y col. en J. Biol . Chem . 265:12267-12271 (1990). USOS TERAPÉUTICOS La ANGPTL4 está implicada como objetivo del cáncer, cuando la ANGPTL4 se expresa en algunas células tumorales provoca la proliferación de las mismas, in vitro e in vivo (véanse, por ejemplo, las Figuras 4, 5, 7 y 8, Paneles A y B) . Cuando la ANGPTL4 se expresa en tumores que están siendo tratados con un factor anti-angiogénesis, por ejemplo un anticuerpo anti-VEGF, el tumor puede conservar la capacidad de crecer (ver, por ejemplo, la Figura 8, Panel C) . La ANGPTL4 también provoca la migración de las células tumorales (ver, por ejemplo la Figure 9) . También se ha demostrado una regulación al alza en los cánceres renales. Ver, por ejemplo, el documento NO. P5032R1; WO 02/07941; y Le Jan et al., American Journal of Pa thology, 162 (5) : 1521-1528 (2003). Además, la ANGPTL4 es un factor proangiogénico (ver, por ejemplo, S. Le Jan y col., Am . J. Pathol . , 162 (5) : 1521-1528 (2003)), que es objetivo de la terapia contra el cáncer.

Como el VEGF (Shweiki y col., Proc. Nati . Acad. Sci , USA 92:768-772 (1995), la expresión de la ANGPTL4 aumenta en respuesta a la hipoxia. Ver, por ejemplo, Le Jan y col., American Journal of Pathology, 162 (5) : 1521-1528 (2003). La ANGPTL4 se une a las células tumorales, por ejemplo las células A673, en distintas condiciones (por ejemplo, Figura 6, Panel A y B) . Como se ha visto, por ejemplo en la Figura 4, Panel A y Panel B, la ANGPTL4 estimula el crecimiento celular de algunos tumores in vitro cuando las células son transducidas con un constructo de la expresión que expresa la ANGPTL4. La Figura 4, Panel C también muestra que la adición de medios condicionados desde las células COS7 transducidas con la ANGPTL4 induce la proliferación de las células A673. Ver también la Figura 7, Panel A y B. La ANGPTL4 induce la proliferación celular de A673 cuando se la coloca sobre placas de cultivo (ver la Figura 5) , pero no induce la proliferación celular de las células epiteliales del riñon, la célula mesangial renal o HUVEC. La ANGPTL4 también induce la migración de las células tumorales. Ver, por ejemplo, la Figura 9. La ANGPTL4 se expresa de manera predominante en el tejido adiposo, la placenta, el hígado y el riñon y también es regulada al alza en el ratón ob/ob (bloqueo de la leptina) y db/db (bloqueo del receptor de la leptina) . Ver, por ejemplo, Yoon et al., Mol . Cell . Biol . 20:5343-5349 (2000); Kim et al., Biochem . J. , 346:603-610 (2000); Kersten y col., J. Biol . Chem . , 275:28488-28493 (2000); y Le Jan y col., American Journal of Pathology 162 (5) : 1521-1528 (2003). También se informó que la ANGPTL4 es un modulador de los lipidos y un inhibidor de la lipasa lipoproteína. Ver, por ejemplo, Yu y col., PNAS USA 102 (5) : 1767-1772 (2005); Yoshida y col., J. Lipid Res . 43:1770-1772 (2002); y Wiesner y col., J. Endocrinology 180:R1-R6 (2004). La expressión de la ANGPTL4 también es inducida por gama y alfa PPAR en el tejido adiposo y es inducida por el hambre. También modula la proliferación de los preadipocitos y de los hepatocitos y /o la migración celular de los preadipocitos, junto con la modulación de los niveles de triglicéridos y colesterol en el suero. Ver la Solicitud de Patente Provisional Norteamericana 60/589,875 y el Documento P2156R1 registrado simultáneamente, que se incluye como referencia. Los investigadores han informado de la existencia de conexiones entre la angiogénesis y la adipogénesis. Ver, por ejemplo, Sierra-Honigmann y col., "Biological Action of Leptin as an Angiogenic Factor" Science 281:1683-1686; (1998); Rupnick y col., "Adipose tissue mass can be regulated through the vasculature" Proc. Nat . Acad. Sci . USA, 99 (16) : 10730-10735 (2002); y Fukumura y col., "Paracrine Regulation of Angiogenesis and Adipocyte Differentiation During In Vivo Adipogenesis". Circ. Res . 93:e88-e97 (2003).

De acuerdo con la invención, se considera que pueden usarse los moduladores de la ANPTL4 y/o las combinaciones de los moduladores de la ANGPTL4 y otros agentes terapéuticos para tratar diversos neoplasmas o estados neoplasmáticos . En una modalidad se usaron moduladores de la ANGPTL4, por ejemplo antagonistas de la ANGPTL4, en la inhibición de las células cancerosas o crecimiento tumoral. Por ejemplo, como se ha visto en la Figura 10, Panel A y B, los anticuerpos policlonados anti- ANGPTL4 inhibieron el crecimiento celular del tumor en función de la dosis. La ANGPTL4 puede provocar la migración 'de las células tumorales (ver, por ejemplo la Figure 9) . De acuerdo con la invención, se considera que los antagonistas de la ANGPTL4 también pueden usarse para inhibir la metástasis de un tumor. La ANGPTL4 también induce la migración de los preadipocitos . Ver la Solicitud de Patente Provisional Norteamericana 60/589.875 y el documento P2156R1 registrado simultáneamente. En ciertas modalidades, pueden administrarse uno o más agentes antineoplásicos con los antagonistas de la ANGPTL4 para inhibir el crecimiento de las células cancerosas o del tumor. Ver el apartado de la presente titulado Terapias combinadas . Los ejemplos de trastornos neoplásicos que deben tratarse incluyen, aunque sin limitarse a ellos, a los descritos en la presente bajo los términos "cáncer" y "canceroso". Los procesos no neoplásicos sensibles al tratamiento con antagonistas de la invención incluyen, aunque sin limitarse a ellos, por ejemplo hipertrofia aberrante o no deseada, artritis, artritis reumatoide (AR) , psoriasis, placas psoriáticas, sarcoidosis, ateroesclerosis, placas ateroescleróticas, edema consecuencia de un infarto de miocardio, retinopatía diabética y otras retinopatías proliferativas, incluida retinopatia de premadurez, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneración macular asociada a la edad, edema macular diabético, neovascularización corneal, neovascularización de trasplante de córnea, rechazo de trasplante de córnea, neovascularización retiniana/del coroides, neovascularización del ángulo (rubeosis) , enfermedad neovascular ocular, reestenosis vascular, malformaciones arterivenosas (MAV) , meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasias de tiroides (incluida enfermedad de Grave) , trasplante de córnea y otros tejidos, inflamación crónica, inflamación pulmonar, lesión pulmonar aguda/sindrome de distrés respiratorio del adulto, hipertensión pulmonar primaria, efusiones pulmonares malignas, edema cerebral (por ejemplo, asociado a infarto cerebral/traumatismo craneal cerrado/traumatismo) , inflamación sinovial, formación de paño en AR, miositis osificante, formación osea hipertrófica, osteoartritis (OA) , ascitis refractaria, enfermedad de ovario poliquístico, endometriosis, enfermedades en el tercer espacio de fluido (pancreatitis, síndrome compartimental, quemaduras, enfermedad intestinal) , fibroides uterinos, parto prematuro, inflamación crónica como enfermedad intestinal inflamatoria (enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa) , rechazo de trasplante renal, enfermedad intestinal inflamatoria, síndrome nefrítico, crecimiento de masa tisular anómala o no deseada (no cáncer) , obesidad, crecimiento de la masa tisular adiposa, articulaciones hemofilicas, cicatrices hipertróficas, inhibición de crecimiento del cabello, síndrome de Osler-Weber, granuloma piogénico, fibroplasias retrolentales, escleroderma, tracoma, adherencias vasculares, sinovitis, dermatitis, preclampsia, ascitis, efusión pericárdica (como la asociada a pericarditis) y efusión pleural. Para el tratamiento de los trastornos patológicos pueden utilizarse los moduladores de la ANGPTL4, por ejemplo agonistas o activadores de la ANGPTL4. Los moduladores de la ANGPTL4, por ejemplo agonistas de la ANGPTL4, pueden utilizarse en el tratamiento de trastornos patológicos en los que se desea la angiogénesis o neovascularización y/o la hipertrofia; estos trastornos incluyen, aunque sin limitarse a ellos, trauma vascular, heridas, laceraciones, incisiones, quemaduras, úlceras (por ejemplo úlceras diabéticas, úlceras de presión, úlceras hemofilicas, úlceras varicosas) , crecimiento tisular, aumento de peso, enfermedad arterial periférica, inducción del parto, crecimiento del pelo, epidermólisis bulosa, atrofia retinal, fracturas óseas, fusión de los huesos de la columna, desgarros del menisco, etc. Ver también la Solicitud de Patente Provisional Norteamericana 60/589,875 y el Documento P2156R1 registrado simultáneamente . TERAPIAS DE COMBINACIÓN Como se ha indicado anteriormente, la invención proporciona tratamientos combinados en los que un antagonista de la ANGPTL4 se administra con otro tratamiento. Por ejemplo, se usan antagonistas de la ANGTPL4 en combinación con antineoplásicos o tratamientos antineovascularizantes para tratar diversos procesos neoplásicos o no. En una modalidad, el proceso neoplásico o no neoplásico se caracteriza por un proceso patológico asociado a angiogénesis anómala o no deseada. El antagonista de la ANGTPL4 se puede administrar en serie o en combinación con el otro agente terapéutico que es efectivo para estos fines, bien en la misma composición o en otra. Alternativamente, o adicionalmente, se pueden administrar diversos inhibidores de la ANGTPL4. La administración del antagonista y/o de los agentes de la invención se puede efectuar simultáneamente, por ejemplo, en composición única o como dos o más composiciones distintas, utilizando la misma vía de administración o vías de administración diferentes. Otra posibilidad, que se puede combinar con lo anterior, es la administración secuencial, en cualquier orden. En algunas formas de modalidad, pueden transcurrir intervalos de tiempo que oscilen de minutos a días, semanas o meses entre la administración de las distintas composiciones. Por ejemplo, el agente antineoplásico se puede administrar primero, seguido por el inhibidor de la ANGPTL4. Sin embargo, también está prevista la administración simultánea o la administración en primer lugar del antagonista de la ANGPTL4. Las cantidades efectivas de agentes terapéuticos administrados en combinación con un antagonista de la ANGPTL4 serán fijadas por el médico o veterinario, según su criterio. La administración y el ajuste de la dosis se realiza para lograr el máximo control de los procesos que se van a tratar. La dosis dependerá, además, de factores como el tipo de agente terapéutico que se vaya a utilizar y el paciente específico que vaya a ser tratado. Las dosis adecuadas para cualquiera de los antineoplásicos son aquellas que se utilizan actualmente y se pueden disminuir debido a la acción combinada (sinergia) del antineoplásico y el antagonista de la ANGPTL4. En ciertas formas de modalidad, la combinación de los inhibidores potencia la eficacia de un único inhibidor. El termino "potenciar" se refiere a una mejora de la eficacia de un agente terapéutico a su dosis habitual o aprobada. Ver también el apartado Composiciones farmacéuticas de la presente. Por lo general, los antagonistas de la ANGTPL4 y los agentes antineoplásicos son aptos para las mismas enfermedades o enfermedades similares para bloquear o reducir un trastorno patológico como crecimiento tumoral o crecimiento de una célula cancerosa. En una modalidad, el antineoplásico es un antiangiogénico. La terapia antiangiogénica en relación con el cáncer es una estrategia de tratamiento para el cáncer destinada a inhibir el desarrollo de vasos sanguíneos tumorales necesario para proporcionar nutrientes que promuevan el crecimiento tumoral. Como la angiogénesis interviene tanto en el crecimiento del tumor primario como en la metástasis, el tratamiento angiogénico proporcionado por la invención es capaz de inhibir el crecimiento neoplásico del tumor en el sitio primario, así como prevenir la metástasis de tumores en sitios secundarios, lo que permite atacar los tumores con otros agentes terapéuticos. Se han identificado muchos otros agentes antiangiogénicos y son bien conocidos en el sector, incluidos los enumerados en la presente, por ejemplo, enumerados en Definiciones y, por ejemplo, por Carmeliet and Jain, Nature 407:249-257 (2000); Ferrara y col., Nature Reviews :Drug Discovery, 3:391-400 (2004); y Sato Int. J. Clin . Oncol . , 8:200-206 (2003). Ver también Solicitud de Patente Norteamericana US20030055006. En una modalidad, el antagonista de la ANGPTL4 se utiliza en combinación con un anticuerpo neutralizador anti-VEGF (o de un fragmento del mismo) y/u otro antagonista de VEGF o un antagonista del receptor de VEGF, incluidos, aunque sin limitarse a ellos, por ejemplo, fragmentos del receptor soluble de VEGF (por ejemplo, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, neuropilinas (por ejemplo, NRP1, NRP2) ) , aptámeros capaces de bloquear el VEGF o el VEGFR, neutralizar anticuerpos anti-VEGFR, inhibidores de bajo peso molecular de tirosina cinasas (RTK) del VEGFR, estrategias antisentido para el VEGF, ribozimas contra el VEGF o receptores del VEGF, variantes antagonistas del VEGF y cualquier combinación de todos ellos. Como alternativa, o adicionalmente, pueden coadministrarse al paciente dos o más inhibidores de la angiogénesis. En alguna modalidad, uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, agentes antineoplásicos, se pueden administrar en combinación con el antagonista de la ANGPTL4 y un agente antiangiogénico. En determinados aspectos de la invención, otros agentes terapéuticos útiles para el tratamiento neoplásico combinado con un antagonista de la invención incluyen otros tratamientos contra el cáncer (por ejemplo, tratamiento quirúrgico, radioterapia (por ejemplo, con irradiación o administración de sustancias radiactivas) , quimioterapia, tratamiento con antineoplásicos enumerados en la presente y conocidos en el sector, o combinaciones de ellos) . Alternativamente, o adicionalmente, dos o más anticuerpos que se unen al mismo antígeno o a dos o más antígenos distintos divulgados en la presente se pueden administrar conjuntamente al paciente. En ocasiones, puede ser beneficioso administrar también una o más citocinas al paciente.

AGENTES QUIMIOTERAPEUTICOS En determinados aspectos, la invención proporciona un método de bloquear o reducir el tratamiento tumoral o el crecimiento de una célula cancerosa, mediante la administración de cantidades eficaces de un antagonista de la ANGPTL4 y/o uno o más inhibidores de la angiogénesis y uno o más agentes quimioterapéuticos a un paciente propenso al cáncer o al que se le ha diagnosticado cáncer. Se pueden usar diversos antineoplásicos en los métodos de tratamiento combinado de la invención. Una lista no exhaustiva y que puede servir como ejemplo de antineoplásicos se incluye en la presente en "Definiciones". Como comprenderán los expertos en la técnica, las dosis apropiadas de agentes quimioterapéuticos estarán en torno a las ya utilizadas en tratamientos clínicos en los que los agentes quimioterapéuticos se administran solos o en combinación con otros. Es probable que la dosis varíe en función del proceso que se esté tratando. El médico que administre el tratamiento podrá determinar la dosis apropiada para el sujeto. CRECIMIENTO TUMORAL REINCIDENTE La invención también proporciona métodos y composiciones para inhibir o prevenir el crecimiento tumoral reincidente o la proliferación de células cancerosas reincidente. Por ejemplo, la Figura 8, Panel C ilustra esquemáticamente la capacidad de un tumor que es tratado con un anticuerpo anti-VEGF (AVASTIN) para eludir el tratamiento, (por ejemplo un tipo de reincidencia) cuando el tumor también expresa la ANGPTL4. El término "crecimiento tumoral reincidente" o "proliferación reincidente de células tumorales" se utiliza para describir un proceso en el que los pacientes sometidos o tratados con uno o más de los tratamientos actualmente disponibles (por ejemplo, tratamientos para el cáncer, como quimioterapia, radioterapia, tratamiento quirúrgico, tratamiento hormonal y/o tratamiento biológico/inmunoterapia, especialmente un tratamiento estándar para el cáncer de que se trate) no es clínicamente adecuado para tratar a los pacientes o los pacientes ya no están experimentando efecto beneficioso alguno con el tratamiento y necesitan otro tratamiento adicional efectivo. Como se usa en la presente, la frase también se puede referir a un proceso de un paciente "refractario/que no responde al tratamiento", por ejemplo, que describa pacientes que responden a tratamiento pero sufran efectos secundarios, desarrollen resistencia, no respondan al tratamiento, no respondan satisfactoriamente al tratamiento, etc. En diversas formas de modalidad, un cáncer es un crecimiento tumoral reincidente o una proliferación reincidente de células cancerosas en los que el número de células cancerosas no se ha reducido aún significativamente, o ha aumentado, o el tamaño del tumor no se ha reducido significativamente, o ha aumentado, o no sigue reduciéndose su tamaño o el número de células cancerosas. Se puede determinar si las células cancerosas constituyen un crecimiento tumoral reincidente o una proliferación reincidente de células tumorales bien in vivo bien in vitro mediante cualquier método conocido en el sector para analizar la eficacia del tratamiento en células cancerosas, utilizando los sentidos aceptados en el sector de "reincidente" o "refractario" o "que no responde al tratamiento" en este contexto. La presente invención proporciona métodos para bloquear o reducir el crecimiento tumoral reincidente o la proliferación reincidente de células cancerosas en un sujeto mediante la administración de uno o más antagonistas de la ANGPTL4 de la invención para bloquear o reducir el crecimiento tumoral reincidente o la proliferación reincidente de células cancerosas en el sujeto. En algunas formas de modalidad, el antagonista de la ANGPTL4 se puede administrar tras el tratamiento antineoplásico. En algunas modalidades la ANGPTL4 se administra simultáneamente con el tratamiento antineoplásico. Alternativamente, o adicionalmente, el tratamiento con antagonistas de la ANGPTL4 se alterna con otro tratamiento para el cáncer, en cualquier orden. La invención también engloba métodos de administración de uno o más anticuerpos inhibidores de la ANGPTL4 para prevenir el desarrollo o la reincidencia de cáncer en pacientes predispuestos a sufrir cáncer. Por lo general, el sujeto estaba o está recibiendo simultáneamente tratamiento para el cáncer. En una modalidad, el tratamiento antineoplásico es un tratamiento con un agente antiangiogénico. El agente antiangiogénico incluye los conocidos en el sector y los encontrados en Definiciones en la presente. En una modalidad, el antiangiogénico es un anticuerpo neutralizador anti-VEGF o fragmento del mismo (por ejemplo A4.6.1 humanizado, AVASTIN ® (Genentech, South San Francisco, CA) , Y0317, M4, G6, B20, 2C3, etc.). Ver, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas 6,582,959; 6,884,879; 6,703,020; W098/45332; WO 96/30046; WO94/10202; EP 0666868B1; las Solicitudes de Patentes Norteamericanas 20030206899, 20030190317, 20030203409 y 20050112126; Popkov y col., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004); y el Documento No. PR2072-4. Pueden administrarse agentes adicionales en combinación con los antagonistas de la ANGPTL4 para bloquear o reducir el crecimiento de un tumor reincidente o el crecimiento celular canceroso reincidente, por ejemplo, ver el apartado de la presente titulado Terapias de combinación . En una modalidad, los antagonistas de la ANGPTL4 de la invención, u otros procedimientos terapéuticos que reducen la expresión de la ANGPTL4, se administran para invertir la resistencia o sensibilidad reducida de las células cancerosas a ciertos agentes biológicos, hormonales, radiológicos y quimioterapéuticos, resensibilizando así a las células cancerosas a uno o más de esos agentes, que entonces pueden administrarse (o seguir siendo administrados) para tratar o controlar un cáncer, incluida la prevención de metástasis. ANTICUERPOS Los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos anti-ANGPTL4 y de fragmentos anti-ANGPTL4, anticuerpos que son agentes antiangiogénicos o inhibidores de la angiogénesis, anticuerpos que son agentes antineoplásicos, anticuerpos para un receptor de la ANGPTL4, por ejemplo, anticuerpo anti-avßs u otros anticuerpos descritos en la presente. Los ejemplos de anticuerpos incluyen, por ejemplo, a los anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, fragmentos, multiespecificos, heteroconjugados, multivalente, de función efectora, etc. ANTICUERPOS POLICLONALES Los anticuerpos de la invención pueden comprender anticuerpos policlonales. Los métodos para la preparación de los anticuerpos policlonales son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales contra un anticuerpo de la invención se generan en animales mediante una o múltiples inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante con una proteína que sea inmunogénica en la especie que se pretende inmunizar, por ejemplo, la hemocianina de la lapa californiana (keyhole limpet) , la albúmina sérica, la tiroglobulina bovina o un inhibidor de la tripsina de la soja utilizando un agente bifuncional o derivativo, por ejemplo, el éster de maleimidobenzol sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteina) , la N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina) , el glutaraldehído, el anhídrido succínico, el S0C12 o el R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes. Los animales se inmunizan contra una molécula de la invención, conjugados inmunogénicos, o derivados combinando, por ejemplo, 100 µg o 5 µg de la proteina o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con tres volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución intradérmicamente en múltiples puntos. Un mes más tarde, los animales se refuerzan con entre 1/5 y 1/10 de la cantidad original del péptido o el conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples puntos . Entre siete y catorce dias más tarde, los animales se desangran y el suero se analiza para valorar los anticuerpos. Los animales se refuerzan hasta obtener los niveles adecuados de valoración. Normalmente, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antigeno, pero conjugado con una proteína diferente y/o a través de un reactivo reticulante diferente. Los conjugados también se pueden obtener en cultivos celulares recombinantes como fusiones proteínicas. También, los agentes agregantes como el alumbre se utilizan adecuadamente para incrementar la respuesta inmune. ANTICUERPOS MONOCLONALES Los anticuerpos monoclonales contra un antígeno que se describen en la presente pueden obtenerse utilizando el método del hibridoma, descrito por primera vez en Kohier y col., Nature, 256:495 (1975), o con los métodos del ADN recombinante (Patente Norteamericana No. 4,816,567). En el método del hibridoma, un ratón u otro animal hospedador apropiado, como un hámster o un mono macaco, se inmuniza como se describió anteriormente para obtener linfocitos que produzcan es decirn capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Después, los linfocitos se fusionan con las células de mieloma utilizando un agente fusionador adecuado, como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986) ) . Las células de hibridoma preparadas de este modo se siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado que generalmente contiene una o más sustancias que inhiban el crecimiento o la supervivencia de las células parentales de mieloma sin fusionar. Por ejemplo, si las células parentales de mieloma no contienen la enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas generalmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) , que son sustancias que evitan el crecimiento de células con déficit de HGPRT. Las células de mieloma típicas son aquellas que se fusionan efectivamente, soportan altos niveles estables de producción de anticuerpos por parte de las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio como el HAT. Entre éstas, las líneas celulares de mieloma preferidas son lineas de mieloma murino, como aquellas derivadas de los tumores de ratones MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EEUU, y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles en el American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Estados Unidos de Norteamérica. Las lineas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol . , 133:3001 (1984); Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)). Se analiza el medio de cultivo en el que crecen las células de hibridoma para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra, por ejemplo, ANGPTL4, avßs o una molécula que interviene en la angiogénesis. La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma puede determinarse por medio de la inmunoprecipitación o de un ensayo de unión in vitro, como el ensayo de radioinmunidad (RÍA) o el ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) . Los ensayos y técnicas son conocidos en el sector. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal . Biochem . , 107:220 (1980). Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos con la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar limitando los procedimientos de dilución y pueden crecer mediante procedimientos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, un medio D-MEM o un RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden crecer en vivo en un animal como tumores con ascitis. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, los fluidos asciticos o el suero mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas, como por ejemplo, la proteína A-sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografia de afinidad. Los anticuerpos monoclonales también puden ser métodos de ADN recombinante, como los que se describen en la Patente Norteamericana No. 4,816,567. La codificación del ADN de los anticuerpos monoclonales se aisla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleótidas que son capaces de unir específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales) . Las células de hibridoma sirven como fuente del ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que después se transfectan en células hospedadores, como por ejemplo las células E. coli, las células COS de monos, las células de ovario de hámster chino (CHO) o las células de mieloma que, de otro modo, no producen la proteina de la inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. A continuación se describirá con más detalle la producción de anticuerpos recombinantes . En otra modalidad, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se pueden aislar de las librerías de fagos de anticuerpos generados mediante las técnicas descritas en McCafferty y col., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson y col., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks y col., J. Mol . Biol . , 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando librerías de fagos. Las publicaciones subsiguientes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) mediante combinación de cadenas (Marks y col., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), asi como una infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir librerías de fagos muy grandes (Waterhouse y col., Nuc. Acids . Res . , 21:2265-2266 (1993)). Por tanto, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridoma de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de los mismos.

El ADN también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la secuencia de codificación de los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera humanas en lugar de las secuencias murinas homologas (Patente Norteamericana NO. 4.816.567, y Morrison, y col., Proc. Nati Acad. Sci . USA, 81:6851 (1984)), o uniendo covalentemente todo o parte de la secuencia ,de codificación para un polipéptido, que no sea inmunoglobulina, a la secuencia de codificación de la inmunoglobulina. Por lo general, los polipéptidos que no son inmunoglobulinas se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo, o los dominios variables de un punto de combinación con el antigeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprenda un punto de combinación con el antígeno con especificidad para un antígeno y otro punto de combinación con el antígeno con especificidad para otro antígeno diferente. ANTICUERPOS HUMANIZADOS Y HUMANOS Los anticuerpos de la invención pueden comprender comprender anticuerpos humanizados o humanos. Un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducido en el mismo desde una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se conocen generalmente como residuos "importados" que generalmente se toman de un dominio variable de "importación". La humanización se puede realizar esencialmente a través del método de Winter y colaboradores (Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen y col., Science, 239:1534-1536 (1988)), al sustituir las secuencias CDRs o CDR de roedores por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, los anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente Norteamericana NO. 4.816.567) en los que se ha sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son generalmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen por residuos de puntos análogos de anticuerpos de roedores. La elección de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para realizar los anticuerpos humanizados es muy importante para disminuir la antigenicidad. De acuerdo con el llamado método del "más apto", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de un roedor se compara con toda la librería conocida de secuencias de dominio variable de humanos . Se acepta la secuencia humana que sea más parecida a la de los roedores, entonces, como estructura humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims y col., J. Immunol . , 151:2296 (1993); Chothia y col., J. Mol . Biol . , 196:901 (1987)). Otro procedimiento utiliza una estructura concreta derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo en particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma estructura se puede utilizar para diferentes anticuerpos humanizados (Cárter y col., Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 89:4285 (1992); Presta y col., J. Immunol . , 151:2623 (1993)). Es importante también que los anticuerpos se humanicen con retención de alta afinidad con el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, siguiendo el procedimiento típico, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos humanizados conceptuales que utilizan modelos tridimensionales de las secuencias parentales y las humanizadas. Los modelos tridimensionales de la inmunoglobulina están comúnmente disponibles y los expertos en la técnica los conocen sobradamente. Existen programas informáticos que ilustran y muestran las estructuras probables de conformación tridimensional de las secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La inspección de estas visualizaciones permite analizar el papel que los residuos probablemente desempeñan en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antigeno. De esta manera, los residuos de la FR se pueden seleccionar y combinar a partir de las secuencias receptoras y de importación y lograr así la característica deseada del anticuerpo, como por ejemplo una mayor afinidad con el (los) antigeno (s) diana. En general, los residuos CDR influyen directamente y en mayor medida en la unión al antígeno. Alternativamente, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que sean capaces, una vez inmunizados, de generar un repertorio completo de anticuerpos humanos cuando no se produzca inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigótica del gen de la región (JH) del anticuerpo que se une a la cadena pesada en ratones quiméricos y mutantes de linea germinal inhibe por completo la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la matriz de genes humanos de la inmunoglobulina de línea germinal a uno de estos ratones mutantes de línea germinal ocasionará la producción de anticuerpos humanos al actuar sobre el antígeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits y col., Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 90:2551 (1993); Jakobovits y col., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann y col., Year in Immuno . , 7:33 (1993); y Duchosal y col . Nature 355:258 (1992) . Los anticuerpos humanos también pueden derivarse de las bibliotecas de presentación en fagos (Hoogenboom et al . , J. Mol . Biol . , 227:381 (1991); Marks y col., J. Mol . Biol . , 222:581-597 (1991); Vaughan y col. Nature Biotech . 14:309 (1996) ) . Los anticuerpos humanos también pueden producirse usando diversas técnicas conocidas en el sector, incluidas las librerías de presentación en fagos (Hoogenboom y Winter, J. Mol . Biol . , 227:381 (1991); Marks y col., J. Mol . Biol . , 222:581 (1991)). De acuerdo con esta técnica, los genes de los dominios V de los anticuerpos se clonan dentro de la estructura en un gen proteinico de revestimiento o bien mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, como el M13 o fd, y se presentan como fragmentos de anticuerpo funcionales en la superficie de la partícula del fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de una sola fila del genoma del fago, las selecciones que se basan en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan lugar a la selección del gen que codifica el anticuerpo que muestra esas propiedades. Por lo tanto, el fago imita alguna de las propiedades de la célula B. La presentación en fagos se puede realizar en una variedad de formatos, reseñados, por ejemplo, en Johnson, Kevin S. and Chiswell, D J. , Cur Opin in Struct Biol 3:564-571 (1993). Se pueden utilizar varias fuentes de segmentos del gen V para la reproducción de imágenes de fagos. Por ejemplo, Clackson y col., Nature, 352:624-628 (1991) aislaron un conjunto de anticuerpos anti-oxazolona de una pequeña librería combinatorial de genes V aleatoria derivada de bazos de ratones inmunizados. Se puede construir un repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados y se pueden aislar anticuerpos contra un gran conjunto de antígenos (incluidos autoantigenos) , por ejemplo, siguiendo esencialmente las técnicas descritas por Marks y col., J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991), o Griffith y col., EMBO J. 12:725-734 (1993) Consúltense también las Patentes de Estados Unidos de Norteamérica Nos 5,565,332 y 5,573,905. También se dispone de las técnicas de Colé y col. y Boerner y col. para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Colé y col., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) y Boerner y col., J. Immunol . , 147(1): 86-95 (1991)). Los anticuerpos humanos también se pueden generar mediante células B activadas in vitro (véanse las Patentes Norteamericanas Nos. 5,567,610 y 5,229,275). FRAGMENTOS DE ANTICUERPOS Los fragmentos de anticuerpos también se incluyen en la invención. Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos ' se derivaban a través de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto y col., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan y col., Science, 229:81 (1985) ) . Sin embargo, estos fragmentos ahora se pueden producir directamente mediante células hospedadoras recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos se pueden aislar de las librerías de fagos de anticuerpos descritas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH se puede recuperar directamente de E. coli y unir químicamente para formar fragmentos F(ab') (Cárter y col . , Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Según otro planteamiento, los fragmentos F(ab')2 se pueden aislar directamente de cultivos de células hospedadoras recombinantes. Otras técnicas para producir fragmentos de anticuerpos serán obvias para los profesionales expertos. En otras formas de modalidad, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena simple (scFv) . Ver WO 93/16185; Patente Norteamericana No. 5,571,894 y Patente Norteamericana No. 5,587,458. Fv y sFv son las únicas especies con puntos de combinación intactos privados de regiones constantes; así, son adecuadas para la unión no específica reducida durante el uso in vivo. Las proteínas de fusión SFv pueden construirse para obtener la fusión de una proteína efectora en los extremos amino o carbón de una sFv. Ver Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, citado anteriormente. El fragmento de anticuerpo puede ser también un "anticuerpo lineal", por ejemplo, tal y como se describe en la Patente Norteamericana No. 5.641.870. Estos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecificos o biespecíficos . ANTICUERPOS MULTIESPECIFICOS (POR EJEMPLO, BIESPECIFICOS) Los anticuerpos de la invención también incluyen, por ejemplo, anticuerpos multiespecíficos, que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. Aunque normalmente las moléculas sólo se unirán a dos antigenos (es decir, los anticuerpos biespecificos, BsAbs) , los anticuerpos con especificidades adicionales como los anticuerpos triespecíficos están comprendidos en esta expresión cuando se utilizan en la presente memoria. Los ejemplos de BsAbs incluyen a aquellos con un ramal dirigido contra un antígeno de la célula tumoral y el otro ramal dirigido contra una molécula activadora citotóxica como la anti-Fc?RI/anti-CD15, anti-?l85HER2/Fc?RIII (CD16) , anti-CD3/célula B antimaligna (1D10) , anti-CD3/anti-pl85HER2, anti-CD3/anti-p97, anti-CD3/carcinoma celular antirrenal, anti-CD3/anti-OVCAR-3, anti-CD3/L-Dl (carcinoma anticolon), anti-CD3/análogo de la hormona estimuladora antimelanocito, receptor anti-EGF/anti-CD3, anti-CD3/anti-CAMAl, anti-CD3/anti-CD19, anti-CD3/MoV18, molécula de adhesión celular antineural (NCAM) /anti-CD3, proteina de unión antifolato (FBP) /anti-CD3, antigeno asociado al carcinoma anti-pan (AMOC-31) /anti-CD3; BsAbs con un ramal que se une específicamente a un antígeno tumoral y un ramal que se une a una toxina como anti-saporin/anti-Id-1, anti-CD22/anti-saporin, anti-CD7/anti-saporin, anti-CD38/anti-saporin, anti-CEA/cadena A antirricino, antiinterferón-a (IFN-a) /idiotipo antihibridoma, anti-CEA/alcaloide antivinca; BsAbs para convertir los profármacos de enzimas activadas como la fosfatasa anti-CD30/antialcalina (que cataliza la conversión del profármaco fosfato de mitomicina en alcohol de mitomicina) ; BsAbs que pueden usarse como agentes fibrinolíticos como el activador plasminógeno antifibrina/antitisular (tPA) , el activador plasminógeno de tipo antifibrina/antiurocinasa (uPA) ; BsAbs dirigidos a objetivos complejos inmunes a los receptores de la superficie celular como la antilipoproteina de baja densidad (LDL) /receptor anti-Fc (por ejemplo Fc?RI, Fc?RII o FcyRIII) ; BsAbs para uso en el tratamiento de enfermedades infecciosas como virus simplex anti-CD3/anti-herpes (HSV) , receptor anticélula T:CD3 complex/antigripal, anti-Fc?R/anti-HI; BsAbs para la detección de tumores in vitro o in vivo como antí-CEA/anti-EOTUBE, anti-CEA/anti-DPTA, anti-pl85HER2/anti-hapteno; BsAbs como adyuvantes de vacuna; y BsAbs como herramientas de diagnóstico como anticonejo IgG/antiferritina, peroxidasa de rábano picante (HRP) /antihormona, antisomatostatina/antisustancia P, anti-HRP/anti-FITC, anti-CEA/anti-ß-galactosidasa. Los ejemplos de anticuerpos triespecíficos incluyen a anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 y anti-CD3/anti-CD8/anti-CD37. Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')2). Los métodos para realizar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. La producción tradicional de anticuerpos biespecificos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Millstein y col., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una posible mezcla de 10 moléculas diferentes de anticuerpos, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que generalmente se realiza mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante complicada, y la cantidad de producto que se obtiene es baja. Se describen procedimientos similares en el documento WO 93/08829, y en Traunecker y col., EMBO J. , 10:3655-3659 (1991) . Según un planteamiento distinto, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (puntos de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan con las secuencias de los dominios constantes de la inmunoglobulina. La fusión es preferentemente con un dominio constante de cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Es preferible tener la primera región constante de cadena pesada (CHl) que contenga el lugar necesario para la unión de la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican, las fusiones de cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, de cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se co-transfectan a un organismo hospedador adecuado. Esto ofrece una gran flexibilidad a la hora de ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptidos en modalidades donde los Índices desiguales de las tres cadenas de polipéptidos utilizadas en la construcción proporcionan las producciones óptimas. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación de dos o tres cadenas de polipéptidos en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptidos en índices iguales da como resultado producciones elevadas o los índices no tienen particular importancia. En una modalidad de este método, los anticuerpos biespecíficos se componen de una cadena pesada de inmunoglobulina hibrida con una primera especificidad de unión en un brazo y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se descubrió que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas' de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una de las mitades de la molécula biespecifica proporciona una forma sencilla de separación. Este método se describió en el documento WO 94/04690. Para obtener más información sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, consúltese, por ejemplo, Suresh y col., Methods in Enzymology, 121:210 (1986) . Según otro método que se describe en el documento W096/27011, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpos se puede modificar para maximizar el porcentaje de heterodimeros que se recuperan de un cultivo celular recombinante. La interfaz preferente comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante del anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales cortas de aminoácidos de la interfaz de la primera molécula del anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más largas (por ejemplo, tirosina o triptófano) . Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la cadena o cadenas laterales largas se crean en la interfaz de la segunda molécula del anticuerpo al reemplazar las cadenas laterales largas de aminoácidos por cadenas más cortas (por ejemplo, alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar la producción del heterodímero con relación a otros productos finales no deseados como los homodímeros. Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la bibliografía. Por ejemplo, los anticuerpos biespecificos se pueden preparar mediante un enlace químico. Brennan y col., Science, 229: 81 (1985) se describe un procedimiento mediante el cual los anticuerpos intactos se escinden por via proteolitica para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante del ditiol arsénico sódico para estabilizar los ditioles vecinos y evitar la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados se convierten entonces en derivados del tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados del Fab' -TNB se reconvierte entonces en Fa '-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar de otro derivado del Fab ' -TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. Los recientes progresos han facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH de E. coli , que se pueden emparejar químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby y col., J. Exp . Med. , 175: 217-225 (1992) describe la producción de una molécula de anticuerpo biespecífica F(ab')2 completamente humanizada. Cada fragmento Fab' se secretó por separado a partir de E . coli y se sometió a un emparejamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecifico. El anticuerpo biespecífico formado de esta manera fue capaz de unirse a células que sobreexpresaban el receptor VEGF y células T humanas normales, asi como desencadenar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra objetivos del tumor de mama humano . También se han descrito varias técnicas para realizar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente de cultivos celulares recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny y col., J. Immunol . , 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos con cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazaron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros del anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y después se reoxidaron para formar los heterodímeros del anticuerpo. Este procedimiento también se puede utilizar para producir los homodímeros del anticuerpo. La tecnología "diacuerpo" descrita por Hollinger y col., Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para realizar fragmentos de anticuerpos biespecificos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento tienen que emparejarse con los dominios complementarios VL y VH de otro fragmento, con lo que se obtienen dos puntos de unión al antígeno. También se ha informado de otra estrategia para realizar fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante el uso de dímeros Fv de cadena única (sFv) . Ver Gruber y col, J. Immunol . , 152:5368 (1994). También se contemplan los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecífieos. Tutt y col. J. Immunol . 147: 60 (1991). ANTICUERPOS HETEROCONJUGADOS Los anticuerpos biespecíficos incluyen a los anticuerpos reticulados o "heteroconjugados", que son los anticuerpos de la invención. Por ejemplo, uno de los anticuerpos del heteroconjugado se puede emparejar con avidita y el otro con biotina. Estos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para conseguir que las células del sistema inmunitario actúen sobre células no deseadas (Patente Norteamericana No. 4.676.980) y para el tratamiento de la infección de VIH (documentos WO 91/00360 y WO 92/200373 y la patente europea EP 03089) . Los anticuerpos heteroconjugados se pueden obtener utilizando cualquier procedimiento de reticulación oportuno. Los agentes reticulantes adecuados se conocen bien en la técnica y se describen en la Patente Norteamericana No. 4,676,980, junto con una serie de técnicas de reticulación.

ANTICUERPOS MULTIVALENTES Los anticuerpos de la invención incluyen un anticuerpo multivalente. Un anticuerpo multivalente puede internalizarse (y/o catabolizarse) más de prisa que un anticuerpo bivalente por una célula que exprese un antigeno al que se unen los anticuerpos. Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son los que no pertenecen a la clase IgM) con tres o más puntos de unión al antígeno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes) , que pueden producirse fácilmente mediante expresión recombinante del ácido nucleico que codifica las cadenas de polipéptidos del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más puntos de unión al antigeno. El dominio preferente de dimerización comprende una región Fc o una región bisagra o está formado por ellas. En esta situación, el anticuerpo comprenderá una región Fc y tres o más puntos de unión al antígeno amino-terminal a la región Fc. El anticuerpo multivalente preferente en la presente comprende (o consiste en) unos tres a ocho puntos de unión al antígeno, preferiblemente cuatro, o está formado por esos puntos de unión al antígeno. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena de polipéptidos (y preferentemente dos cadenas de polipéptidos), donde la(s) cadena (s) de polipéptidos comprende (n) dos o más dominios variables. Por ejemplo, la(s) cadena (s) de polipéptidos puede (n) comprender VDl- (Xl)n-VD2- (X2)n-Fc, donde VD1 es un primer dominio de variable, VD2 es un segundo dominio de variable, Fc es una cadena de polipéptidos de una región Fc, XI y X2 representan un aminoácido o polipéptido y n es 0 ó 1. Por ejemplo, la(s) cadena (s) de polipéptidos puede (n) comprender: VH-CHl-enlazador flexible-VH-CHl- cadena de la región FC o VH-CHl-VH-CHl-cadena de la región Fc. El anticuerpo multivalente de la presente memoria descriptiva comprende, además, preferentemente, al menos dos (y preferiblemente cuatro) polipéptidos de dominio variable de la cadena ligera. El anticuerpo multivalente de la presente memoria descriptiva, por ejemplo, puede comprender entre dos y cuatro polipéptidos de dominio variable de la cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de la cadena ligera considerados en la presente descriptiva comprenden un dominio variable de cadena ligera y, opcionalmente, un dominio CL. INGENIERÍA DE LA FUNCIÓN EFECTORA Tal vez se desee modificar el anticuerpo de la invención en lo que respecta a la función efectora con el objeto de aumentar la eficacia del anticuerpo en el tratamiento del cáncer, por ejemplo. Por ejemplo, es posible introducir uno o más residuos de cisteína en la región Fc, lo que permite la formación de un enlace de disulfuro entre las cadenas de esta región. El anticuerpo homodimérico generado de esta manera puede tener mayor capacidad de internalización y/o un nivel más elevado de muerte celular mediada por complementos y citotoxicidad con mediación celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Consúltese Carón y col., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol . 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral mejorada también se pueden preparar utilizando reticuladores heterobifuncionales tal como se describe en Wolff y col., Cáncer Research 53:2560-2565 (1993) . De manera alternativa, se puede diseñar un anticuerpo con dobles regiones Fc y, por tanto, potenciar la lisis de los complementos y las capacidades de la ADCC. Ver Stevenson y col., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). Para incrementar la semivida sérica del anticuerpo, se puede incorporar un epitopo de unión a receptor de rescate en el anticuerpo (especialmente un fragmento del anticuerpo) tal como se describe en la Patente Norteamericana 5.739.277, por ejemplo. Tal como se utiliza en la presente, el término "epitopo de unión a un receptor de rescate" se refiere a un epitopo de la región Fc de una molécula IgG (por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable de incrementar la semivida sérica in vivo de la molécula IgG. INMUNOCONJUGADOS La invención también se relaciona con los inmunoconjugados que comprenden el anticuerpo aquí descrito conjugado con un agente citotóxico, como por ejemplo un agente quimioterapéutico, una toxina (por ejemplo una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma) , o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado) . Se dispone de una variedad de radionúclidos para la producción de anticuerpos radioconjugados . Los ejemplos incluyen, aunque sin limitarse a ellos, 212Bi, 131I, 131In, 90Y y 186Re. Los agentes quimioterapéuticos son útiles en la generación de los inmunoconjugados que se han descrito anteriormente. Por ejemplo, BCNU, estreptozoicina, vincristina, 5-fluouracilo, la familia de agentes conocidos colectivamente como complejo LL-E33288 descrito en las Patentes Norteamericanas 5,053,394 y 5,770,710, esperamicinas (Patente Norteamericana 5,877,296), etc. (ver también la definición de agentes quimioterápicos en la presente) pueden conjugarse con los anticuerpos anti-ANGPTL4, antialfaVbetad o antiangiogénesis o fragmentos de los mismos. Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Se dispone de una variedad de isótopos radioactivos para la producción de anticuerpos anti-ANGPTL o antiangiogénesis o fragmentos de los mismos. Los ejemplos incluyen, aunque sin limitarse a ellos, por ejemplo At 211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, p32, Pb212, In111, isótopos radioactivos de Lu, etc. Cuando el conjugado se utiliza para el diagnóstico, puede comprender un átomo radioactivo para gammagrafia, por ejemplo Tc99m o I123, una sonda de espín para resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como diagnóstico por imágenes obtenidas mediante resonancia magnética, IRM) , como yodo-123, yodo-131, indio-111, fluor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. El radio u otros marcadores se pueden incorporar en el conjugado en formas conocidas. Por ejemplo, el péptido se puede biosintetizar o sintetizar mediante síntesis química de aminoácidos utilizando precursores adecuados de aminoácidos que contengan, por ejemplo, fluor-19 en vez de hidrógeno. Marcas como Tc99m o I123, .Re186, Re188 e In111 se pueden unir a través de un residuo de cisteína en el péptido. El itrio-90 se puede unir a través de un residuo de lisina. El método IODOGEN (Fraker y col. (1978) Biochem . Biophys . Res . Commun . 80: 49-57 se puede utilizar para incorporar yodo-123. Ver, por ejemplo "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Anticuerpos monoclonales en inmunogammagrafía) (Chatal, CRC Press 1989) que describe otros métodos detalladamente. Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que se pueden utilizar incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos sin unión de la toxina de la difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa ) , cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de la Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de la Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y el tricotecenos. Ver, por ejemplo, el documento WO 93/21232 publicado el 28 de octubre de 1993. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se realizan utilizando una variedad de agentes de unión a proteina bifuncionales como por ejemplo N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) propionato (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano • (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (como por ejemplo el dimetiladipimidato HCL) , esteres activos (como por ejemplo disuccinimidil suberato) , aldehidos (como por ejemplo glutaráldehidos) , compuestos bis-azido (como por ejemplo bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (como por ejemplo bis- (p-diazoniobenzoil) -etilenodiamina), diisocianatos (como por ejemplo 2,6-diisocianato de tolueno) , y compuestos bis-activos de fluoruro (como por ejemplo 1, 5-difluoruro-2, 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina se puede preparar tal y como se describe en Vitetta y col. Science 238: 1098 (1987). El ácido triaminopentaacético 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de un radionucleótido a un anticuerpo. Consúltese el documento WO94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede utilizar un enlazador lábil al ácido, un enlazador sensible a la peptidasa, un enlazador de fotolabilo o un enlazador que contenga disulfuro (Chari y col., Cáncer Research 52:127-131 (1992); Patente Norteamericana No. 5,208,020). Alternativamente, es posible realizar una fusión de proteínas que contengan el anticuerpo anti-ANGPTL4, anti-avßs, o antiangiogénesis y el agente citotóxico, por ejemplo mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. La longitud del ADN puede incluir regiones respectivas que codifiquen las dos porciones del conjugado, ya sea adyacente uno a otro o en forma separada por una región que codifica un péptido de enlace, el cual no destruye las propiedades deseadas del conjugado. En algunas modalidades, el anticuerpo se conjuga con un "receptor" (como estreptavidina) para su utilización en la prelocalización de objetivos tumorales, donde el receptor del anticuerpo conjugado se administra al paciente, seguido de la eliminación del conjugado no unido de la circulación utilizando un agente aclarador y, luego, la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido) . En algunas modalidades, se forma un inmunoconjugado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN como por ejemplo la desoxiribonucleasa; ADNasa) .

MAITANSINA Y MAITANSINOIDES La invención ofrece un anticuerpo de la invención, que se conjuga con una o más moléculas de maitansinoides.

Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan inhibiendo la polimerización de la tubulina. La maitansina se aisló por primera vez a partir del arbusto de África oriental Maytenus serrata (Patente Norteamericana No. 3,896,111). Posteriormente, se descubrió que determinados microbios también producían maitansinoides, como el maitansinol y los esteres de C-3 amitansinol (Patente Norteamericana No. 4,151,042). El maitansinol sintético y sus derivados y análogos se revelan, por ejemplo, en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; y 4,371,533. El anticuerpo Anti-ANGPTL4, anti-avßs o antiangiogénesis se conjuga con una molécula de maitansinoide sin disminución significativa de la actividad biológica del anticuerpo o de la molécula de maitansinoide. Una media de 3-4 moléculas maitansinoides conjugadas por anticuerpo ha mostrado eficacia en la mejora de la citotoxicidad de las células diana sin afectar negativamente a la función o la solubilidad del anticuerpo, a pesar de que cabría esperar que incluso una molécula toxina/anticuerpo mejore la citotoxicidad en relación con el uso del anticuerpo desnudo. Los maitansinoides son muy conocidos en el sector y pueden sintetizarse mediante técnicas conocidas o aislarse de fuentes naturales. Se revelan maitansinoides adecuados, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 5,208,020 y en otras patentes y publicaciones no patentadas a las que anteriormente se ha hecho referencia. En una modalidad, los maitansinoides son el maitansinol y análogos del maitansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maitansinol, como distintos esteres del maitansinol. Se conocen muchos grupos de enlace en la técnica para producir conjugados maitansinoides de anticuerpos, incluidos, . por ejemplo, los descritos en la Patente Norteamericana No. 5,208,020 o en la Patente Europea 0 425 235 Bl, y Chari y col.,Cáncer Research 52:127-131 (1992). Los grupos de enlace incluyen grupos disulfuro, grupo de tioéter, grupos ácido lábil, grupos fotolábilos, grupos peptidasa lábil o grupos esterasa lábil, como los revelados en las patentes mencionadas anteriormente, y grupos diosulfuro y tioéter son los preferidos. Los conjugados del anticuerpo y el maitansinoide se pueden realizar utilizando una variedad de agentes de unión a proteína bifuncionales como por ejemplo N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (como el dimetiladipimidato HCL) , esteres activos (por ejemplo, disuccinimidil suberato) , aldehidos (por ejemplo, glutaráldehídos) , compuestos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilenodiamina) , diisocianatos (por ejemplo, 2, 6-diisocianato de tolueno), y compuestos bis-activos de flúor (como 1, 5-difluoruro-2, 4-dinitrobenceno) . Típicamente, los agentes de unión incluyen N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson y col., Biochem . J. 173:723-737 [1978]) y N-succinimidil-4- (2-piridilditio) pentanoato (SPP) para proporcionar un enlace disulfuro. El enlazador se puede unir a la molécula de maitansinoide en varias posiciones, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, un enlace con éster se puede formar mediante reacción con un grupo hidroxilo que utilice técnicas de unión convencionales. La reacción puede ocurrir en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. El enlace se forma en la posición 3 del maitansinol o de un análogo del maitansinol.

CALIQUEAMICINA Otro inmunoconjugado de interés comprende un anticuerpo de la invención conjugado con una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos de la caliqueamicina es capaz de producir la ruptura del ADN de hebra doble en concentraciones inferiores a 1 picomol. Para la preparación de conjugados de la familia de la caliqueamicina, véanse las Patentes Norteamericanas 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (todas para American Cyanamid Company) . Los análogos estructurales de la caliqueamicina que se pueden utilizar incluyen, aunque sin limitarse a ellos, Yi1, 0C2-1-, CC31, N-acetil-? 1, PSAG y ?^ (Hinman y col., Cáncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode y col., Cáncer Research 58:2925-2928 (1998) y las Patentes Norteamericanas anteriormente mencionadas para American Cyanamid) . Otro fármaco antineoplásico al que puede conjugarse el anticuerpo es el QFA que es un antifolato. Tanto la caliqueamicina como el QFA tienen sitios intracelulares de acción y no atraviesan fácilmente la membrana plasmática. Por ello, la absorción celular de estos agentes a través de la internalización mediada por el anticuerpo potencia enormemente sus efectos citotóxicos. OTRAS MODIFICACIONES DE ANTICUERPOS En la presente se consideran otras modificaciones del anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo se puede unir a uno o varios polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolimeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. El anticuerpo también se puede atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente), en sistemas de presentación de fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones . Las técnicas se describen en Remington 's Pharmaceutical Sciences, 16 edición, Oslo, A.,'Ed., (1980). LIPOSOMAS Y NANOPARTICULAS Los polipéptidos de la invención pueden formularse en liposomas. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden formularse como inmunoliposomas . Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos en la técnica, como por ejemplo el descrito en Epstei y col., Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 82:3688 (1985); Hwang y col., Proc. Nati Acad. Sci . USA, 77:4030 (1980); y Patentes Norteamericanas Nos. 4,485,045 y 4,544,545. En la Patente Norteamericana No. 5,013,556 se describen los liposomas con mayor tiempo de circulación. Generalmente, la formulación y el uso de los liposomas son conocidos por los expertos en la técnica. Los liposomas particularmente útiles se pueden generar mediante el procedimiento de evaporación de fase inversa con una composición lipídica que comprenda fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE) . Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo presentes en esta invención se pueden conjugar con los liposomas tal y como se describe en Martin y col. J. Biol . Chem . 257: 286-288 (1982) a través de una reacción de intercambio de disulfuro. Opcionalmente, el liposoma puede contener un agente quimioterapéutico (como Doxorrubicina) . Consultar Gabizon y col. J. National Cáncer Inst . 81(19)1484 (1989) . OTROS USOS Los anticuerpos de la invención tienen varias utilidades. Por ejemplo, los anticuerpos anti-ANGPTL4 pueden usarse en pruebas de diagnóstico para identificar la expresión de la ANGPTL4 en células especificas, tejidos o suero con el objeto de detectar la presencia de un cáncer (por ejemplo, en la detección del cáncer renal), etc.). En una modalidad, se usaron anticuerpos de la ANGPTL4 para seleccionar la población de pacientes que se sometería al tratamiento con los métodos que aqui se describen, por ejemplo, pacientes con expresión de la ANGPTL4, niveles elevados de la ANGPTL4 o cánceres sensibles a los niveles de la ANGPTL4. Pueden usarse diversas técnicas de pruebas diagnósticas conocidas en la especialidad, como las pruebas de unión competitiva, las pruebas de fase doble directas o indirectas y las pruebas de inmunoprecipitación realizadas en las fases heterogéneas u homogéneas (Zola, Monclonal Antibodies: A Manual of Techniques,' CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158). Los anticuerpos usados en las pruebas diagnósticas pueden marcarse con una fracción detectable. La fracción detectable debe ser capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la fracción detectable puede ser un radioisótopo, como H3, C14, P32, S35 o I125, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, como el isotiocianato de fluoresceina, la rodamina o el luciferino, o una enzima, como la fosfatasa alcalina, la beta-galactosidasa o la peroxidasa de rábano picante. Puede utilizarse cualquier método conocido en la especialidad para conjugar el anticuerpo con la fracción detectable, incluidos los descritos por Hunter y col., Nature, 144:945 (1962); David y col., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain y col., J. Inmuno 1 . Meth . , 40:219 (1981); y Nygren, J. Histochem . And Cytochem . , 30:407 (1982). Los anticuerpos anti-ANGPTL4 también son útiles para la purificación de la afinidad de la ANGPTL4 o de fragmentos de la ANGPTL4 procedentes de cultivos de células recombinantes o de fuentes naturales. En este proceso, los anticuerpos contra la ANGPTL4 son inmovilizados en un soporte adecuado, como una resina Sephadex o un filtro de papel, utilizando métodos muy conocidos en la especialidad. A continuación, el anticuerpo inmovilizado es puesto en contacto con una muestra que contiene la ANGPTL4 que debe purificarse y después se procede a lavar el soporte con un disolvente adecuado que eliminará todo el material presente en la muestra excepto la ANGPTL4, que está unida al anticuerpo inmovilizado. Por último, se procede a lavar el soporte con otro disolvente adecuado que separará la ANGPTL4 del anticuerpo . MODIFICACIONES COVALENTES DE LOS POLIPEPTIDOS DE LA INVENCIÓN Dentro del alcance de esta invención se incluyen las modificaciones covalentes de un polipéptido de la invención, por ejemplo un fragmento de un polipéptido antagonista, una molécula de fusión (por ejemplo, una molécula de inmunofusión) o un anticuerpo de la invención. Pueden realizarse mediante síntesis química o escisión enzimática o quimica del polipéptido, si es aplicable. En la molécula se introducen otros tipos de modificaciones covalentes del polipéptido mediante la reacción dirigida de residuos de aminoácidos del polipéptido con un agente derivativo orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos en el extremo terminal N o C, o por medio de la incorporación de un aminoácido modificado o no natural a la cadena del polipéptido en formación, por ejemplo Ellman et al. Meth . Enzym . 202:301-336 (1991); Noren y col. Science 244:182 (1989); y las publicacioes de Solicitud de Patentes Norteamericanas 20030108885 y 20030082575.

Por lo general, los residuos de cisteinilo reaccionan con alfa-halocetatos (y las aminas correspondientes) , como ácido cloroacético o cloroacetamida, para dar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. Los residuos de cisteinilo también se derivan mediante la reacción con bromotrifluoracetona, ácido propiónico a-bromo-ß- (5-imidozoil) , fosfato de cloroacetilo, N-maleimidas de alquilo, disulfuro 3-nitro-2-piridilo, disulfuro metilo 2-piridilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercurio-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l, 3-diazol . Los residuos de histidilo se derivan mediante reacción con dietilpirocarbonato a un pH de 5.5-7.0 porque este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidilo. El bromuro de parabromofenacilo también es útil; normalmente, la reacción se realiza en cocodilato sódico 0.1 M a un pH de 6.0. Los residuos de lisina y aminoterminales se hacen reaccionar con anhídridos succinicos u otros anhídridos de ácido carboxílico. La derivación con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos de lisina. Otros reactivos apropiados para la derivación de residuos que contienen alfa-aminos incluyen a imidoésteres como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, chloroborohidruro, ácido trinitrobenzenosulfónico, 0-metilisourea, 2, 4-pentanodiona y reacción catalizada de transaminasa con glioxilato. Los residuos de arginilo se modifican mediante reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2, 3-butanodiona, 1, 2-ciclohexanodiona y ninidrina. La derivación de los residuos de arginina require que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al elevado pKa del grupo funcional de la guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina tanto como con el grupo epsilon-amino de la arginina. Puede realizarse la modificación específica de los residuos de tirosilo, con particular interés en la introducción de marcas espectrales en los residuos de tirosilo mediante la reacción con compuestos de diazonio aromático o tetranitrometano. Lo más común es el uso de N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetilo tirosilo y derivados 3-nitro, respectivamente. Los residuos de tirosilo se iodinizan usando I125 o I131I para preparar proteínas marcadas para usar en pruebas radioinmunológicas . Los grupos laterales de carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente mediante reacción con carbodiimidas (R-N=C=N-R' ) , donde R y R' son grupos alquilo diferentes, como por ejemplo carbodiimida l-ciclohexilo-3- (2-morgolinilo-4-etilo) o carbodiimida l-etilo-3- (4-azonia-4, 4-dimetilpentilo) . Además, los residuos de aspartilo y glutamilo se convierten en residuos de asparaginilo y glutaminilo mediante reacción con iones de amonio. Los residuos de glutaminilo y asparaginilo suelen ser desamidados en los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente. Estos residuos son desamidados en condiciones neutras o básicas. La forma desamidada de estos residuos queda incluida dentro del alcance de esta invención. Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de serilo o residuos de treonilo, la metilación de los grupos de lisina alfa-amino, arginina y cadenas laterales de histidina (T.E. Creighton, Proteins : Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983) ) , la acetilzación de la amina terminal N y la amidación de cualquier grupo carboxilo terminal C. Otro tipo de modificación covalente implica la unión quimica o enzimática de glicósidos a un polipéptido de la invención. Estos procedimientos son ventajosos en el sentido de que no requieren producción del polipéptido en una célula hospedadora que tenga aptitudes de glicosilación para la glicosilación por enlace de N u 0. Según el modo de unión utilizado, el (los) azúcar (es) puede (n) unirse a (a) la arginina y la histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres como los de la cisteína, (d) grupos hidroxilo libres como los de la serina, la treonina o la hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos como los de la fenilalanina, la tirosina o el triptofán o (f) el grupo amido de la glutamina. Estos métodos se describen en in WO 87/05330 publicado el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin and Wriston, CRC Crit . Rev. Biochem . , pp. 259-306 (1981). La eliminación de todas las fracciones de carbohidratos presentes en un polipéptido de la invención puede realizarse quimica o enzimáticamente. La deglicosilación quimica require la exposición del polipéptido al ácido trifluometanesulfónico compuesto o a un compuesto equivalente. Este tratamiento se traduce en la escisión de la mayoría de todos los azúcares, excepto el azúcar de unión (acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina) , mientras el polipéptido queda intacto. La deglicosilación quimica es descrita por Hakimuddin y col. Arch . Biochem . Biophys . 259:52 (1987) and by Edge et al . Anal . Biochem . , 118:131 (1981). La escisión enzimática de las fracciones de carbohidratos, por ejemplo, en los anticuerpos, puede lograrse mediante el uso de diversas endoglicosidasas y exoglicosidasas, como describen Thotakura et al . Meth . Enzymol . 138:350 (1987). Otro tipo de modificación covalente de un polipéptido de la invención comprende la unión del polipéptido a diversos polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, según el método descrito en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ó 4,179,337. VECTORES, CÉLULAS HOSPEDADORAS Y MÉTODOS RECOMBINANTES Los polipéptidos de la invención pueden producirse mediante recombinación utilizando técnicas y materiales de fácil obtención. Para la producción recombinante de un polipéptido de la invención, por ejemplo un ANGPTL4 o un anticuerpo anti-ANGPTL4, un anticuerpo anti- vßs o un anticuerpo antiangiogénesis, por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF, se aisla el ácido nucleico que lo codifica y se introduce en un vector replicable para la subsiguiente clonación (amplificación del ADN) o para expresión. El AND que codifica al polipéptido de la invención se aisla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales. Por ejemplo, se aisla el ADN que codifica al anticuerpo monoclonal y se secuencia utilizando sondas oligonucleotidicas capaces de unirse específicamente a los genes que codifican a las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo. Hay muchos vectores disponibles. Los componentes del vector suelen incluir, entre otros, uno o más de los siguientes elementos: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes de marcador, un potenciador, un promotor y una secuencia de finalización de la transcripción. COMPONENTE DE LA SECUENCIA DE SEÑAL Los polipéptidos de la invención pueden producirse de forma recombinante no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que típicamente es una secuencia de señal u otro polipéptido con una escisión específica en el término N de la proteina madura o polipéptido. La secuencia de señal heteróloga seleccionada típicamente es aquella que la célula hospedadora reconoce y procesa (es decir, escindida por una peptidasa de señal) . Para las células hospedadoras procarióticas que no reconocen ni procesan la secuencia de señal del polipéptido nativo, la secuencia de señal es sustituida por una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, entre un grupo de fosfatasa alcalina, penicilasa, Ipp o líderes de enterotoxina II termoestable. Para la • secreción de levadura, la secuencia de señal nativa puede ser sustituida, por ejemplo, por el líder de la invertasa de levadura, el líder del factor . (incluidos los líderes del factor o¡ Saccharomyces y Kluyveromyces) , o el líder de la fosfatasa acida, el líder de la glucoamilasa C. albicans, o la señal descrita en el documento WO 90/13646. En la expresión celular de los mamíferos, están disponibles las secuencias de señal de los mamíferos asi como los líderes secretores víricos, por ejemplo, la señal del herpes simplex gD.

El ADN para la región del precursor está ligado en la estructura de lectura al ADN que codifica al polipéptido de la invención. ORIGEN DEL COMPONENTE DE REPLICACION Tanto los vectores de expresión como los vectores de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicarse en una o más células hospedadoras seleccionadas. Por lo general, en los vectores de clonación, esta secuencia permite al vector replicarse independientemente del ADN cromosómico del hospedador e incluye orígenes de replicación o secuencias que se replican autónomamente. Las secuencias son bien conocidas para diversas bacterias, levaduras y virus. El origen de la replicación a partir del plásmido pBR322 es apto para la mayoría de bacterias gramnegativas, el origen plasmádico 2µ es adecuado para la levadura y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamíferos. Por lo general, el componente origen de la replicación no es preciso para los vectores de expresión en mamíferos (el origen SV40 se puede utilizar habitualmente sólo porque contiene el promotor precoz) . COMPONENTE DEL GEN DE SELECCIÓN Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) otorgan resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes básicos no disponibles a partir de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la racemasa alanina D para Bacilli . Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula hospedadora. Estas células que se transforman con éxito con un gen heterólogo producen una proteina que otorga resistencia al fármaco y, asi, sobrevive a la estrategia de selección. Ejemplos de esta selección dominante utilizan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina. Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos son los que permiten la identificación de las células encargadas de absorber el ácido nucleico del anticuerpo, como DHFR, timidina cinasa, metalotioneína I y II, típicamente, genes de metalotioneina en primates) adenosina deaminasa, ornitina decarboxilasa, etc. Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican primero a través del cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx) , un antagonista competitivo del DHFR. Una célula hospedadora adecuada cuando se utiliza el DHFR de tipo natural es la linea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad del DHFR. Alternativamente, las células hospedadoras (en especial los huéspedes naturales que contienen DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican el polipéptido de la invención, la proteína DHFR natural y otro marcador seleccionable como la aminoglicosida 3 '-fosfotransferasa (APH) puede seleccionarse a través del crecimiento celular en un medio que contenga un agente de selección para el marcador seleccionable, como un antibiótico aminoglicosidico, por ejemplo, canamicina, neomicina o G418. Ver la Patente Norteamericana No. 4,965,199. Un gen de selección apto para su uso en levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura Yrp7 (Stinchco b y col., Nature, 282:39 (1979)). El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptofano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977) . La presencia de la lesión trpl en el genoma de la célula hospedadora de la levadura proporciona entonces un entorno efectivo para detectar la transformación mediante crecimiento en ausencia de triptofano. De forma similar, las cepas de levadura deficientes en Leu-2 (ATCC 20.622 ó 38.626) están complementadas por plásmidos conocidos portadores del gen Leu~2. Además, los vectores que se derivan del plásmido circular pKDl de 1,6 µm se pueden utilizar para la transformación de las levaduras Kluyveromyces . Alternativamente, se refirió un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina de ternera recombinante para K. lactis . Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). También se han descubierto los vectores de expresión multicopia estables para la secreción de albúmina sérica humana recombinante madura por cepas industriales de Kluyveromyces . Fleer y col., Bio/Technology, 9:968-975 (1991) . COMPONENTE DEL PROMOTOR Los vectores de expresión y clonación suelen contener un promotor que es reconocido por el organismo hospedador y está operativamente enlazado al ácido nucleico que codifica a un polipéptido de la invención. Los promotores aptos para su uso con hospedadores procarióticos incluyen el promotor phoA, los sistemas promotores de lactosa y beta lactamasa, el promotor de fosfatasa alcalina, un sistema promotor a base de triptofano (trp) y promotores híbridos como el promotor tac. No obstante, también son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) operablemente enlazada al ADN que codifica al polipéptido de la invención. Se conocen las secuencias de promotores para eucariotas. Prácticamente todos los genes eucarióticos tienen una región rica en AT situada aproximadamente entre las bases 25 y 30 antes del extremo 5' del promotor desde el sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada entre las bases 70 y 80 antes del extremo 5' del promotor desde el inicio de la transcripción de muchos genes es la región CNCAAT en la que N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucarióticos se encuentra una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola de poli (A) al extremo 3' de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias se insertan bien en los vectores de expresión eucariótica. Entre los ejemplos de secuencias de promotores adecuados para uso con hospedadores de levadura están los promotores para 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glicolíticas, como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa. Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles con la ventaja adicional de transcripción controlada por condiciones de crecimiento, son las regiones de promotores para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa acida, enzimas degradativas asociadas al metabolismo del nitrógeno, metalotioneina, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de la maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para uso en la expresión de la levadura se describen más en detalle en la Patente Europea 73,657. Los potenciadores de levadura también se usan ventajosamente con los promotores de levadura. La trascripción de los polipéptidos de la invención a partir de los vectores en células hospedadoras de mamíferos está controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos a partir de los genomas de virus como el psliomavirus, el virus de la viruela de las aves de corral, el adenovirus (como el Adenovirus 2) , el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviario, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y el Simian Virus 40 (SV40) , a partir de promotores heterólogos de mamíferos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, o a partir de promotores de choque térmico, siempre que los promotores sean compatibles con los sistemas de las células hospedadoras. Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen fácilmente como un fragmento de restricción del SV40 que también contiene el origen viral de replicación del SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene fácilmente como un fragmento de restricción HindIII E. Un sistema para la expresión del ADN en huéspedes de mamíferos utilizando el virus del papiloma bovino como vector se da a conocer en la Patente Norteamericana No. 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la Patente Norteamericana NO. 4,601,978. Ver también Reyes y col., Nature 297:598-601 (1982) para la expresión del ADNc del interferón beta humano en células de ratón bajo control de un promotor timidina cinasa a partir del virus del herpes simplex. Alternativamente, puede utilizarse como promotor la repetición del terminal largo del virus del sarcoma de Rous . COMPONENTE DEL ELEMENTO POTENCIADOR La trascripción de un ADN que codifica a un polipéptido de esta invención mediante eucariotas más altas suele aumentarse insertando en el vector la secuencia de un potenciador. Se conocen ya muchas secuencias de potenciadores de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, alfa fetoproteina e insulina) . Lo habitual es que se utilice un potenciador procedente de un virus de células eucarióticas. Entre los ejemplos destacan el potenciador SV40 en el lado tardío del origen de la replicación (bp 100-270) , el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de la replicación y los potenciadores de adenovirus. Ver también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) para elementos de potenciación para la activación de los promotores eucarióticos. El potenciador puede empalmarse en el vector en una posición a 5' ó 3' de la secuencia que codifica al polipéptido, pero generalmente está situado a 5' del promotor. COMPONENTE DE FINALIZACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN Los vectores de expresión utilizados en células hospedadoras eucarióticas (células de levadura, hongos, insecto, planta, animal, humanas o nucleadas procedentes de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la finalización de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Estas secuencias están habitualmente disponibles desde las regiones no traducidas del extremo 5' y ocasionalmente el 3' de los ADN o ADNc virales o eucarióticos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica al polipéptido de la invención. Un componente de finalización de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Ver el documento WO94/H026 y el vector de expresión que se da a conocer en el mismo. SELECCIÓN Y TRANSFORMACIÓN DE LAS CÉLULAS HOSPEDADORAS Las células hospedadoras adecuadas para la clonación o expresión del ADN que codifica a los polipéptidos de la invención en los vectores de la presente memoria descriptiva son las células procariotas, de levadura o eucariotas más elevadas descritas anteriormente. Las procariotas adecuadas para este fin incluyen eubacterias, como organismos grampositivos o gramnegativos, por ejemplo, enterobacteriaceas como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli como B . subtilis y B . licheniformis (por ejemplo, B . licheniformis 41P dado a conocer en el documento DD 266.710 publicado el 12 de abril de 1989) , Pseudomonas como P. aeruginosa, y Streptomyces . Generalmente, un hospedador de clonación E. coli es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque también son adecuadas otras cepas como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) y E. coli W3110 (ATCC 27.325). Estos ejemplos tienen carácter ilustrativo y no limitante. Además de procariotas, los microbios eucarióticos como los hongos filamentosos o levadura también son aptos como hospedadores para la expresión o clonación de los polipéptidos de los vectores de codificación de la invención. Saccharomyces cerevisiae, es decir, la levadura habitual del pan, es la más habitualmente utilizada entre los microorganismos hospedadores eucarióticos inferiores. No obstante, también están disponibles diversos géneros, especies y cepas que son útiles en la presente, como Schizosaccharomyces pombe? hospedadores Kluyveromyces como K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. - wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii - (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K . thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (Patente Europea 402,226); Pichia pastoris (Patente Europea 183,070); Candida ; Trichoderma reesia (Patente Europea 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos como Neurospora , Penicillium, Tolypocladium, y hospedadores Aspergillus como A. nidulans y A. niger. Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de los polipéptidos glicosilados de la invención se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de insectos y plantas. Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovirales y las correspondientes células hospedadoras de insectos permisivas procedentes de hospedadoras como Spodoptera frugiperda (oruga) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori . Están disponibles diversas cepas de virus para transfección, por ejemplo, la variante L-1 del NPV Autographa calif ornica y la cepa Bm-5 del NPV Bombyx mori y estos virus se pueden usar como el virus en la presente, de conformidad con la invención, en concreto para la transfección de las células de Spodoptera frugiperda . También se pueden utilizar como hospedadores cultivos de células de plantas como algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco. No obstante, el mayor interés se ha centrado en las células de vertebrados y la propagación de células de vertebrados en cultivos (cultivo histico) se ha convertido en un procedimiento habitual. Ejemplos de líneas celulares útiles de mamíferos son la línea CVl de riñon del mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la linea de riñon embrionario humano (293 ó 293 células subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham y col., J. Gen Virol . 36:59 (1977)); células de riñon de crías de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y col., Proc . Nati . Acad. Sci . USA 77:4216 (1980)); células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol . Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CVl ATCC CCL 70); células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células caninas de riñon (MDCK, ATCC CCL 34); células de riñon de ratas búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células humanas de pulmón (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor de mama de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) ; células TRI (Mather y col., Annals N. Y. Acad. Sci . 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una linea de hepatoma humano (Hep G2) . Las células hospedadoras se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción del polipéptido de la invención y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados como es adecuado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. CULTIVO DE LAS CÉLULAS HOSPEDADORAS Las células hospedadoras utilizadas para producir los polipéptidos de la invención se pueden cultivar en diversos medios. Medios comercialmente disponibles como Ham's FIO (Sigma), Minimal Essential Médium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y Dulbecco 's Modified Eagle 's Médium ( (DMEM) , Sigma) son aptos para el cultivo de células hospedadoras. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y col., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes y col., Anal . Biochem.102: 255 (1980), Patentes de Estados Unidos de Norteamérica Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; ó 5,122,469; el documento WO 90/03430; el documento WO 87/00195; o la Patente Norteamericana Reg. 30,985 se pueden utilizar como medios de cultivo para las células hospedadoras. Cualquiera de estos medios se puede suplementar cuandes decir necesario con hormonas y otros factores de crecimiento (como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico) , sales (como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato) , tampones (como HEPES) , nucleótidos (como adenosina y timidina) , antibióticos (como el fármaco GENTAMYCIN™) , elementos de traza (definidos como compuestos inorgánicos presentes por lo habitual en las concentraciones finales en el rango micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Se pueden incluir también otros suplementos necesarios a concentraciones adecuadas que serán conocidas por los expertos en la técnica. Las condiciones del cultivo, como temperatura o pH entre otras, son las utilizadas anteriormente con la célula hospedadora seleccionada para expresión y serán conocidas por los expertos en la técnica. PURIFICACIÓN DE LOS POLIPEPTIDOS Cuando se utilizan técnicas recombinantes, un polipéptido de la invención, por ejemplo ANGTPL4, anticuerpos de la invención, por ejemplo un anticuerpo anti-ANGTPL4, un anticuerpo anti-avß5 o un anticuerpo de la molécula antiangiogénica, puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o directamente secretado en el medio. Los polipéptidos de la invención pueden recuperarse del medio de cultivo o de los lisatos de la célula hospedadora. Si están unidos a la membrana, pueden separarse de la misma utilizando una solución detergente apropiada (por ejemplo Triton-X 100) o mediante escisión enzimática. Las células utilizadas en la expresión de un polipéptido de la invención pueden alterarse mediante diversos métodos físicos o químicos, como ciclos de congelación-descongelación, sonicación, alteración mecánica o agentes de desintegración de las células a través de usinas. Tal vez se desee purificar un polipéptido de la invención a partir de proteínas células recombinantes o polipéptidos. Los siguientes procedimientos tienen carácter ejemplar en lo que se refiere a procedimientos de purificación adecuados, mediante el fraccionamiento en una columna de intercambio iónica; precipitación de etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en capa fina, cromatografía en heparina SEPHAROSE™, cromatografia en resina de intercambio iónico (como una columna de ácido poliaspártico, DEAE, etc.), cromatoisoenfoque; SDS-PAGE; precipitación de sulfato de amonio; utilizando filtración en gel, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A Sefarosa para eliminar contaminantes como IgG; y columnas de quelatos metálicos para unir las formas marcadas con epítope del polípéptido de la invención. Pueden utilizarse diversos métodos de purificación de las proteínas y los métodos son conocidos en la especialidad y descritos como ejemplo en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990) ; Scopes, Protein Purification : Principies and Practice, Springer-Verlag, Nueva York (1982) . El (Los) paso(s) de la purificación seleccionada dependerá (n) , por ejemplo, de las características del proceso de producción que se utilice y del polipéptido específico de la invención que se produzca. Por ejemplo, la composición del anticuerpo preparado a partir de las células se puede purificar utilizando, por ejemplo, cromatografia en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografia de afinidad. Esta última es la técnica de purificación típica. La idoneidad de la proteina A como ligando de afinidad depende de las especies y del isotipo del domino Fc de la inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. La proteina A se puede utilizar para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas humanas ?l, ?2, o ?4 (Lindmark y col., J. Immunol . Meth . 62:1-13 (1983)). La proteina G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para la ?3humana (Guss y col., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la que el ligando de afinidad se une suele ser la agarosa, pero también están disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables, como vidrio poroso controlado o poli (estirenodivinil) benceno, permiten tasas de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, New Jersey) es útil para la purificación. Se dispone de otras técnicas para la purificación de la proteína, por ejemplo las indicadas anteriormente, según el anticuerpo que deba recuperarse. Ver también, Cárter y col., Bio/Technology 10:163-167 (1992) que describe un procedimiento para el aislamiento de anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli . COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Las formulaciones farmacéuticas de los polipéptidos de la invención, las moléculas de la invención y las combinaciones de los mismos y descritos en la presente . memoria utilizados de acuerdo con la invención se preparan para su almacenamiento mezclando el (los) polipéptidos que tenga (n) el grado de pureza deseado con vehículos farmacéuticamente aceptables, excipientes o estabilizadores opcionales (Remington ' s Pharmaceutical Sciences , 16a edición, Osol, A. Ed. (1980) ) , en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizadores no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen soluciones como el fosfato, el citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen el ácido ascórbico y la metionina; conservantes (como el cloruro de octadecil-dimetilbenzilamonio; el cloruro de hexametonio; el cloruro de benzalconio; el cloruro de bencetonio; el fenol; el alcohol butílico o bencílico; los alquil parabenos como por ejemplo el metil o el propil parabeno; el catecol; el resorcinol; el ciclohexanol; el 3-pentanol y el m-cresol) ; los polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; las proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos como por ejemplo polivinilpirrolidona; aminoácidos como por ejemplo glicina, glutamina, esparraguina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo la glucosa, la mañosa o las dextrinas; agentes quelantes como por ejemplo el EDTA; los azúcares como por ejemplo la sacarosa, el manitol, la trehalosa o el sorbitol; los contraiones que forman sales como por ejemplo el sodio; los complejos metálicos (por ejemplo, los complejos de proteína Zn) y/o los tensoactivos no iónicos como por ejemplo TWEEN™, PLÜRONICS™ o el polietilenglicol (PEG) . Los ingredientes activos también se pueden conservar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y poli- (metilmetacrilato) , respectivamente, en sistemas de presentación de medicamentos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones . Las técnicas se dan a conocer en Remington ' s Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A., Editores, (1980). Las formulaciones para administrar in vivo deben ser estériles. Esto se logra mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

Se pueden elaborar preparaciones de liberación controlada. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación controlada incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen un polipéptido de la invención, cuyas matrices están en forma de elementos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación controlada incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli- (2-hidroxietil-metacrilato) , o poli- (vinilalcohol) ) , poliláctidos (Patente Norteamericana No. 3,773,919), copolimeros del ácido L-glutámico y ?-etil-L-glutamato, acetato de etilenvinilo no degradable, copolímeros del ácido glícólico-ácido - láctico degradables como por ejemplo LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por copolímeros del ácido glicólico-ácido láctico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros como por ejemplo el acetato de etilenvinilo y ácido glicólico-ácido láctico permiten la liberación de moléculas por un periodo de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas por periodos de tiempo menores. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el organismo por un largo periodo de tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37°C, lo cual provoca una pérdida de la actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Es posible concebir estrategias racionales para su estabilización dependiendo del mecanismo que intervenga. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es de formación de uniones intermoleculares S-S mediante el intercambio tio-bisulfuro, se puede lograr la estabilidad mediante la modificación de los residuos sulfidrilos, liofilizando soluciones acidas, controlando la humedad, utilizando aditivos adecuados, y desarrollando composiciones de matrices de polímeros especificas. Ver también, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6,699,501 que describe las cápsulas con revestimiento de polielectrolito. Además, se considera que puede introducirse un agente de la invención (ANGPTL4, agonista o antagonista de la ANGPTL4) en un sujeto mediante terapia génica. La terapia génica se refiere a la terapia realizada mediante la administación a un sujeto de un ácido nucleico. En las aplicaciones de la terapia génica se introducen genes en las células con el objeto de conseguir la síntesis in vivo de un producto genético terapéuticamente efectiva, por ejemplo para la sustitución de un gen defectuoso. La "terapia génica" incluye tanto la terapia génica convencional, con la que se consigue un efecto duradero mediante un único tratamiento, como la administración de agentes génicos terapéuticos, lo cual implica la administración única o repetida de un ADN o ARN terapéuticamente efectivo. El ARN y el ADN antisentido pueden usarse como agentes terapéuticos para bloquear la expresión de determinados genes in vivo. Ver, por ejemplo, Ad-ANGPTL4-SiRNA que se describe en la presente. Ya se ha demostrado que los oligonucleótidos antisentido cortos pueden importarse en células en las que actúan como inhibidores, a pesar de sus bajas concentraciones intracelulares debidas a su absorción limitada por la membrana celular. (Zamecnik y col., Proc. Nati . Acad. Sci . USA 83:4143-4146 (1986)). Los oligonucleótidos pueden modificarse para aumentar su absorción, por ejemplo mediante la sustitución de sus grupos fosfodiésteres cargados negativamente por grupos sin carga eléctrica. Para análisis generales de los métodos de terapia génica, ver, por ejemplo, Godspiel y col. Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu and Wu Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev Ann. .Rev. Pharmacol . Toxicol . 32:573-596 (1993); Mulligan Science 260:926-932 (1993); Morgan and Anderson Ann .

Rev. Biochem . 62:191-217 (1993); y May TIBTECH 11:155-215 (1993) . Los métodos de tecnología recombinante del ADN conocidos en la especialidad que pueden usarse se describen en Ausubel y col. eds. (1993) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; and Kriegler (1990) Gene Transfer and Expression, A Labora tory Manual, Stockton Press, NY. Existe una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varian dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere a una célula en cultivo in vitro, o en células in vivo del hospedador deseado. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico hacia las células de mamíferos in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión de células, DEAE-dextrano, método de precipitación con fosfato de calcio, etc. Las técnicas actualmente preferidas para la transferencia de genes in vivo incluyen la transfección con vectores virales (generalmente retrovirales) y la transfección mediada por envoltura viral liposoma-proteína (Dzau y col., Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993) ) . Por ejemplo, las técnicas para la transferencia de ácido nucleico in vivo incluyen la transfección con vectores virales (como por ejemplo un adenovirus, el virus de la Herpes simple I, el retrovirus o un adenovirus asociado) y sistemas basados en lipidos (los lipidos útiles para la transferencia mediada por lipidos del gen son DOTMA, DOPE y DC-Col, por ejemplo) . Ejemplos de la utilización de vectores virales en la terapia génica pueden encontrarse en Clowes y col. J. Clin . Invest . 93:644-651 (1994); Kie y col. Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); Grossman and Wilson Curr. Opin . in Genetics and Devel . 3:110-114 (1993); Bout y col., Human Gene Therapy 5:3 -10 (1994); Rosenfeld y col. Science, 252:431-434 (1991); Rosenfeld y col., Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli y col., J. Clin . Invest . 91:225-234 (1993); and Walsh y col. Proc. Soc. Exp. Biol . Med. 204:289-300 (1993). En algunas situaciones es deseable proporcionar la fuente del ácido nucleico con un agente que actúe sobre las células objetivos, como por ejemplo un anticuerpo especifico para una proteína de membrana de la superficie celular o la célula diana, un ligando para un receptor en la célula diana, etc. Cuando se utilizen liposomas, las proteínas que se unen a una proteína de membrana de la superficie celular asociada a endocitosis se pueden utilizar para seleccionar y/o facilitar la absorción, por ejemplo proteínas de la cápside o fragmentos de las mismas con tropismo por un tipo de célula en particular, anticuerpos para proteínas que sufren internalización en ciclos y proteínas que actúan en la localización intracelular y mejoran la semivida intracelular. La técnica de endocitosis mediada por un receptor se describe, por ejemplo, en Wu y col., J. Biol . Chem . 262:4429-4432 (1987); y Wagner y col., Proc. Nati . Acad. Sci . USA 87, 3410-3414 (1990) . Para revisión de los protocolos para marcado de genes y terapia génica, ver Anderson y col., Science 256:808-813 (1992). DOSIS Y ADMINISTRACIÓN Las moléculas de la invención se administran a un paciente humano de acuerdo con los procedimientos conocidos, como por ejemplo la administración intravenosa como un bolo o una infusión continua durante un período de tiempo, mediante vías intramusculares, intraperitoneales, cefalorraquídeas, subcutáneas, intraarticulares, intrasinoviales, intratecales, orales, tópicas o por inhalación. En algunas modalidades el tratamiento de la invención implica la administración combinada de un antagonista de la ANGPTLR4 y de uno o más agentes antineoplásicos, por ejemplo, agentes antiangiogénesis. En una modalidad están presentes agentes antineoplásicos adicionales, por ejemplo uno o más agentes antiangiogénesis diferentes, uno o más agentes quimioterápicos, etc. La invención también contempla la administración de inhibidores múltiples, por ejemplo, anticuerpos múltiples para el mismo antigeno o anticuerpos múltiples para diferentes moléculas activas del cáncer. En una modalidad se administró un cóctel de diferentes agentes quimioterapéuticos con el antagonista de la ANGPTL4 y/o uno más agentes antiangiogénesis. La administración combinada incluye la coadministración, usando formulaciones separadas o una formulación farmacéutica única, y/o la administración consecutiva en cualquier orden. Por ejemplo, un antagonista de la ANGPTL4 puede preceder, seguir o alternarse con la administración de los agentes antineoplásicos o puede administrarse simultáneamente con ellos. En una modalidad hay un periodo de tiempo en el que ambos (o todos) agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis adecuada del antagonista de la ANGPTL4 dependerá del tipo de enfermedad que debe tratarse, tal y como se define anteriormente, la gravedad y el curso de la enfermedad, si ei inhibidor se administra para fines preventivos o terapéuticos, la terapia anterior, la historia clínica del paciente y la respuesta al inhibidor, y el criterio del médico tratante. El inhibidor se administra adecuadamente al paciente una vez o en una serie de tratamientos. En un régimen de terapia combinada, las composiciones de la invención se administran en una cantidad terapéuticamente efectiva o en una cantidad terapéuticamente sinérgica. Como se usa en la presente memoria, una cantidad terapéuticamente efectiva es la que consigue que la administración de una composición de la invención y/o la coadministración de un antagonista de la ANGPTL4 y de uno o más agentes terapéuticos dé como resultado la reducción o inhibición de la enfermedad o estado que se combate. El efecto de la administración de una combinación de agentes puede ser aditivo. En una modalidad, el resultado de la administración es un efecto sinérgico. Una cantidad terapéuticamente sinérgica es la cantidad de antagonista de la ANGPTL4 y de uno o más agentes terapéuticos., por ejemplo un inhibidor de la angiogénesis, necesaria para reducir sinérgica o significativamente o eliminar los estados o síntomas asociados a una enfermedad determinada . Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, una dosis inicial candidata para la administración en un paciente es de aproximadamente 1 µg/kg a 50 mg/kg (por ejemplo 0.1-20mg/kg) de antagonista de la ANGPTL4 o de un inhibidor de la angiogénesis, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante una infusión continua. Una dosis diaria típica podría oscilar entre aproximadamente 1 µg/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la enfermedad, el tratamiento se mantiene hasta que ocurriese una supresión deseada de los síntomas de la misma. No obstante, otras pautas posológicas también pueden ser útiles. En general, el medico administrará una o más moléculas de la invención hasta llegar a la(s) dosis que logren el efecto biológico requerido. El progreso de la terapia de la invención se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales. Por ejemplo, la preparación y programación de las dosis para los inhibidores de la angiogénesis, por ejemplo anticuerpos anti-VEGF, como AVASTIN® (Genentech) , pueden realizarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante o según lo determinado empíricamente por el médico cualificado.

En otro ejemplo, la preparación y programación de las dosis para los agentes quimioterapéuticos puede realizarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante o tal y como lo determine empíricamente el médico cualificado. La preparación y la programación de las dosis para la quimioterapia se describen también en Chemotherapy Service Ed. , M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). EFICACIA DEL TRATAMIENTO La eficacia del tratamiento de la invención puede medirse mediante diversos puntos de valoración comúnmente usados en la evaluación de los trastornos neoplásicos o no neoplásicos. Por ejemplo, los tratamientos contra el cáncer pueden evaluarse mediante, por ejemplo, aunque sin limitarse a ello, la regresión del tumor, la reducción del peso o el tamaño del tumor, el tiempo de progresión, la duración de supervivencia, la supervivencia sin progresión, la duración de respuesta y la calidad de vida. Puesto que los agentes antiangiogénicos aquí descritos tienen como objetivo a la vasculatura del tumor y no necesariamente a las células neoplásicas, representan una clase única de fármacos contra el cáncer y por lo tanto pueden requerir mediciones y definiciones únicas de las respuestas clínicas a los fármacos. Por ejemplo, una reducción del tumor superior al 50% en un análisis bidimensional es el limite estándar para proclamar una respuesta. Sin embargo, los inhibidores de la invención pueden provocar inhibición de la extensión metastásica sin reducción del tumor original, o simplemente pueden tener un efecto tumorestático. Por lo tanto, pueden utilizarse distintos procedimientos para determinar la eficacia de la terapia, entre los que se incluyen a modo de ejemplo la medición del plasma o de los marcadores urinarios de la angiogénesis y la medición de la respuesta a través de imágenes radiológicas. En una modalidad, la invención puede usarse para aumentar la duración de la supervivencia de un paciente humano susceptible de padecer cáncer o al que se le ha diagnosticado un trastorno no neoplásico o neoplásico, por ejemplo, cáncer. La duración de la supervicencia se define como el tiempo transcurrido desde la primera administración del medicamento hasta la muerte. En un aspecto, un antagonista de la ANGPTL4 de la invención se administra al paciente humano en combinación con uno o más agentes antineoplásicos; por consiguiente, la duración de la supervivencia del paciente aumenta efectivamente en comparación con el uso de un único tipo de terapia, por ejemplo, el aumento es de aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40% ó 50% o más en comparación con el uso de un único tipo de terapia. En otra modalidad, la invención ofrece métodos para aumentar la duración de la supervivencia sin progresión de un paciente humano susceptible de padecer cáncer o al que se le ha diagnosticado un trastorno no neoplásico o neoplásico, por ejemplo, cáncer. El tiempo de progresión de la enfermedad se define como el tiempo transcurrido desde la administración del medicamento hasta la progresión de la enfermedad. En una modalidad, el tratamiento combinado de la invención usando un antagonista de la ANGPTL4 y uno o más agentes antineoplásicos aumenta significativamente la supervivencia sin progresión en, aproximadamente, al menos 2 meses, 4 meses, 6 meses, 8 meses o un año o más en comparación con la aplicación únicamente de un tratamiento antineoplásico. Sin embargo, en otra modalidad el tratamiento de la invención aumenta significativamente el Índice de respuesta en un grupo de pacientes humanos susceptibles de padecer cáncer o a los que se ha diagnosticado un cáncer que son tratados con diversas terapias. El índice de respuesta se define como el porcentaje de pacientes tratados que responde al tratamiento. En una modalidad de la invención, el tratamiento combinado de la invención usando un antagonista de la ANGPTL4 y uno o más agentes antineoplásicos aumenta significativamente el índice de respuesta en el grupo de pacientes tratados en comparación con el grupo tratado con un único tipo de terapia contra el cáncer (por ejemplo, únicamente quimioterapia) , y el aumento tiene un chi-cuadrado y un valor p, por ejemplo, inferior a 0.010, 0.005 ó 0.001.

En un aspecto, la invención ofrece métodos para aumentar la duración de la respuesta en un paciente humano o en un grupo de pacientes humanos susceptibles de padecer cáncer o a los que se les ha diagnosticado un cáncer. La duración de la respuesta se define como el tiempo transcurrido desde la respuesta inicial a la progresión de la enfermedad. En ciertas modalidades de la invención, un tratamiento combinado de la invención usando un antagonista de la ANGPTL4 y uno o más agentes antineoplásicos aumenta de manera significativa en términos estadísticos, por ejemplo, al menos 2 meses, 4 meses o 6 meses la duración de la respuesta que puede obtenerse. ARTÍCULOS FABRICADOS En otra modalidad de la invención, se proporcionan artículos fabricados que contienen materiales útiles para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. El artículo fabricado comprende un envase, una etiqueta y un prospecto. Entre los envases adecuados se encuentran, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los envases pueden estar hechos de diversos materiales como vidrio o plástico. El envase tiene una composición que es efectiva en el tratamiento de la enfermedad y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa para solución intravenosa o un vial con un tapón perforable por una aguja hipodérmica) . Al menos un agente activo de la composición es un modulador de la ANGPTL4. La etiqueta o el envase indican que la composición se utiliza para el tratamiento de la afección elegida. El artículo fabricado puede comprender además un segundo envase, que contiene una solución tampón farmacéuticamente aceptable, una solución tampón salino fosfatado, una solución de Ringer y una solución de dextrosa. También puede incluir otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluidos agentes activos adicionales, otras soluciones tampón, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. DEPOSITO DE MATERIALES El siguiente material se ha depositado en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC) : El depósito se hizo de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Fines del Procedimiento de la Patente y las Regulaciones siguientes (Tratado de Budapest) . Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años a partir de la fecha de depósito. ATCC hará que los depósitos estén disponibles de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest y con sujeción a un acuerdo entre Genentech, Inc. y ATCC, que asegura la disponibilidad pública permanente e ilimitada de la progenie del cultivo del depósito mediante la emisión de la correspondiente Patente Norteamericana o poniendo a disposición pública cualquier Soli-citud de Patente Norteamericana o de un pais extranjero, lo que suceda primero, y asegura la disponibilidad de la progenie según lo determinado por el Comisionado de Patentes y Marcas de EE.UU. para ser facultado a ello de acuerdo con las consiguientes normas 35 USC § 122 y del Comisionado (incluida la 37 CFR § 1.14 con referencia específica a la 886 OG 638). El beneficiario de la solicitud ha acordado que en caso de que un cultivo de los materiales en depósito muera, se pierda es decir destruido cuando se lo cultive en las condiciones adecuadas, los materiales serán inmediatamente sustituidos por otros similares, previa notificación. La disponibilidad del material depositado no debe interpretarse como una autorización para poner en práctica la invención en contravención de los derechos garantizados por la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes sobre patentes . EJEMPLOS Se entiende que los depósitos, ejemplos y modalidades aqui descritos se proporcionan únicamente a titulo ilustrativo y que a las personas especializadas en la técnica se les sugerirán diversos cambios o modificaciones a la luz de los mismos, que serán incluidos en el espíritu y el articulado de esta solicitud y en el alcance de las reivindicaciones anexas. Los reactivos disponibles comercialmente mencionados en los ejemplos se utilizan de acuerdo con las instrucciones del fabricante, a menos que se indique lo contrario. EJEMPLO 1: LA ANGPTL4 ESTIMULA LA PROLIFERACIÓN CELULAR DEL TUMOR Y LA MIGRACIÓN CELULAR Generación de vectores adenovirales y transducción : Los constructos adenovirales se han realizado mediante la clonación de la inserción del ADNc Notl-Notlen el lugar del poliligador de los kits de construcción del vector Ad-easy de Stratagene (LaJolla, CA) , especialmente como lo describe el fabricante. Ver, por ejemplo, Hesser y col., Blood, 104(1) :149-158 (2004). Generación de las proteínas marcadas con un único señalizador hAngptl4 (23-406) (PUR9384) , mAngptl 4 (184-410) -IgG (PUR9388) y mAngptl4 (23-410) (PUR9452) : El líquido de cultivo de las células recogidas estuvo toda la noche sobre una resina M2 antiseñal (Sigma#A-2220) . La columna fue lavada hasta linea de base estable con PBS y después extraída con citrato de sodio 50 mM pH 3,0. Este volumen fue concentrado en Amicon-15 10.000 MWCO (Millipore #UFC901024). El paso final fue la diálisis en lmM HCl/Super Q H20 y filtración a 0,2 um. Para determinar la pureza se usó un gel de SDS-Page A 4-20% tris/glicina (Invitrogen#EC6028box) +/- lOmM DTT. Las proteínas correctas se identificaron mediante la secuenciación N-terminal de Edman o Espectrografía de masas . Generación del marcador de señalización N-terminal de la hAngptl4 (184-406) -IgG (PUR 9441) seguido en serie por un marcador Fc hu N -terminal : El liquido de cultivo de las células recogidas pasó toda la noche sobre ProSep A (Amersham #113111835) . La columna fue lavada hasta línea de base estable con PBS. A continuación el paso de lavado de un volumen de cuatro columnas 0,5M TMAC/PBS pH 7,5 fue seguido por un lavado PBS hasta linea de base estable. El paso de extracción fue un bump de citrato de sodio 59 mM pH 3,0. Este volumen fue concentrado sobre Amicon-15 10.000 MWCO ( Millipore #UFC901024). El paso final fue la diálisis en liriM HCl/Super Q H20 y filtración 0,2 um. Para determinar la pureza se usó un gel de SDS-Page A 4-20% tris/glicina (Invitrogen#EC6028box) +/- lOmM DTT. Las proteínas correctas se identificaron mediante la secuenciación N-terminal de Edman o Espectrografía de masas. Las proteínas recombinantes también pueden producirse usando técnicas estándar conocidas en la técnica. Generación de Ad -ANGPTL4- SiRNA: Se seleccionaron 4 moléculas ANGPTL4-SÍRNA potenciales (Qiagen) basadas en la secuencia completa de la hANGPTL4. Se seleccionó una ANGPTL4-S1RNA basada en la capacidad de la SiRNA para inhibir la expresión de la hANGPTL4. Se eligió como objetivo la secuencia diana de ADN GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA (SEC ID NO. 3) de la ANGPTL4, por ejemplo, r (GGCCAAGCCÜGCCCGAAGAUU) (SEC ID NO. 4) y/o r (UCUUCGGGCAGGCUUGGCCAC) (SEC ID NO. 5). La SiRNA fue clonada en Transportador CMVp- vector de transferencia Hl.con un promotor RNA, por ejemplo, promotor Hl (GenScript) . A continuación, se clonó el cásete de expresión de la SiRNA para generar un constructo adenoviral AdhANGPTL4-SiRNA. Por ejemplo, los constructos adenovirales se han construido mediante la clonación de la inserción del ADNc Notl-Notlen el lugar del poliligador de los kits de construcción del vector Ad-easy de Stratagene (LaJolla, CA) , especialmente como lo describe el fabricante. Ver, por ejemplo, Hesser y col., Blood, 104(1) .149-158 (2004). La expression de la A?GPTL4 se verificó mediante el análisis Western Blot usando un anticuerpo anti-FLAG. Se seleccionó un clon de expresión fuerte y se amplificaron las concentraciones de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las preparaciones virales se purificaron mediante centrifugación CsCl y se analizaron para detectar revertidos por PCR. Las concentraciones virales se determinaron mediante experimentos de lisis celular de 96 pocilios de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Estos vectores, junto con los Transportadores p CMV-lacZ suministrados, se recombinaron en bacterias electrocompetentes con el vector Ad-Easy conteniendo el genoma Ad5 suprimido para las regiones El y E3. Los stocks virales primarios se prepararon transfectando provisionalmente los plásmidos Ad-Easy en células HEK293 hospedadoras. Además, se amplificaron stocks de adenovirus en células HEK293 y se purificaron usando el método de purificación por gradiente CsCl según lo descrito por el fabricante. Los adenovirus que actúan como anticuerpos se obtuvieron mediante ensayo Elisa. Generación de mANGPTL4 : Se transfectaron provisionalmente 293 células con un constructo que contenía un ácido nucleico que codifica la secuencia completa de la mANGPTL4 (1-410) . La mANGPTL4 se purificó a partir del líquido sobrenadante y se usó para experimentos . Proliferación del tumor in vitro : Proliferación in vitro de las células (HTB 1598) tumorales A673 del rabdomiosarcoma humano estimuladas por la ANGPTL4. Ver la Figura 4, Panel A. Los constructos adenovirales de Ad-Angptl4, Ad-LacZ y Ad-Angptll3 se generaron como se ha descrito anteriormente (Hesser y col., Blood, 104 (1) : 149-158 (2004)). Las células A673 fueron transducidas ya sea con un constructo que comprende el constructo adenoviral-ANGPTL4 (Ad-Angptl4) , el constructo adenoviral-LacZ (Ad-LacZ) como control o el constructo adenoviral-ANGPTL3 (Ad-Angptl3) en la multiplicidad de infección (MOI) de 100. Después de 3 días de crecimiento de las células A673 en DMEM con alto contenido de glucosa, 5% de FCS, se procedió al recuento de las células. Como se indica en la Figura 4, Panel A, la Ad-Angptl4 estimuló la proliferación de las células tumorales . En las células tratadas con Ad-Angptl4 se observó un aumento del número de células aproximadamente superior al doble en comparación con el control Ad-LacZ. La Ad-Angptl4 también estimuló la proliferación de las células MCF7 (adenocarcinoma de mama humano) de aproximadamente el triple, de las células TK10 (cáncer de células renales) de aproximadamente el doble, y de las células A549 (carcinoma pulmonar humano) de aproximadamente 1,5 veces en comparación con el control. La Ad-Angptl4 también estimuló la proliferación de las células U87MG. Ver la Figura 4, Panel B, donde las células (A673, U87MG, 4T-1 o Caki) fueron transducidas con alguno de los siguientes constructor: un constructo que comprende el constructo adenoviral-ANGPTL4 (Ad-Angptl4 (2) ) , el constructo adenoviral-LacZ (Ad-LacZ (1)) como control o el constructo adenoviral -ANGPTL4-SÍRNA (3) en la multiplicidad de infección (MOI) de 500. Después de 2-3 días de crecimiento de las células en DMEM con alto contenido de glucosa, 5% de FCS, se procedió al recuento de las células. Los medios condicionados de las células COS transducidas con ANGPTL4 también indujeron la proliferación de las células A673. Ver la Figura 4, Panel C. A las células A673 se añadieron los medios condicionados (sobrenadantes) de hepatocitos (Hepa) (A) , de células endoteliales microvasculares humanas (HMEC) células (B) o de C0S7 (C) que fueron transducidas con constructos adenovirales (Ad-Angptl4 (2), Ad-LacZ (1) o Ad-Ang?tl3 (3) . Después de 4 días de crecimiento de las células A673 en DMEM con alto contenido de glucosa en 5% de FCS, se procedió al recuento de las células. Como se indica en la Figura 4, Panel C, se compraró la proliferación de las células tumorales estimulada con sobrenadante de cultivo de células COS + Ad-Angptl4 con controles y otros sobrenadantes de otros tipos de células utilizadas, por ejemplo, células Hepa y HMVEC. Actividad de la Angptl4 colocada sobre placas de cultivo : La proliferación de las células A673 por la Angptl4 también se analizó revistiendo con proteína las placas de cultivo. Las placas fueron recubiertas con Angptl4 murina, LZ-hANgptl4, Fibronectina, proteína de control NL4, IgG-hAngptl4 (184-406), mAngptl3, hAngptl3, mAngptl4 (23-410), Lz-hAngptl4 (184-406), Fc-hAngptl4 (184-406) o BSA, en distintas concentraciones, por ejemplo, resin cubrir, 0,3 µg/ml, 3,0 µg/ml o 30 µg/ml. Se recubrieron toda la noche a 4°C placas de fondo plano de 96 pocilios (MaxiSorp, Nunc, Dinamarca) . Las células tumorales A673 humanas fueron recogidas y diluidas a 105 células/ml en un medio HG-DMEM conteniendo 5% de FCS. Las suspensions celulares (104 células/pocilio) en 200 µl se añadieron a los pocilios cubiertos y las placas fueron incubadas a 37 °C durante tiempos seleccionados. Las células no adherentes fueron eliminadas mediante lavados PBS y la adhesión celular se midió utilizando cristal violeta o el método PNAG de Landegren. Ver, Landegren, U. (1984) J. Immunol . Methods 67:379-388. Los resultados se expresaron en valores promedio OD550 u OD05 de pocilios triplicados, respectivamente. De manera similar, se recogieron y ensayaron en condiciones idénticas células endoteliales de la vena umbilical primaria (HUVEC) , células epiteliales (epi) y mesangiales (mesa) aisladas de cordones umbilicales humanos o de riñones humanos (Cambrex) . Para el ensayo de proliferación se utilizaron los medios suministrados por el fabricante (Cambrex) para cada tipo de célula. La ANGPTL4 no pareció inducir la proliferación de las células epiteliales del riñon, las células mesangiales del riñon o las células endotelialbes de la vena umbilical humana (HUVEC) , pero indujo la proliferación de A673 (Figura 5) . Análisis FACS de la ANGPTL4 que se une a las células A673 : Se estudió la unión de la ANGPTL4 a células A673 humanas mediante el análisis FACS. Se colocaron células A673 sobre placas de cultivo de 10 cm entre 500.000 y 1 x 106 células/pocilio de muestra. Las células fueron divididas el día anterior a la FACS. Las células fueron lavadas una vez con PBS y después se añadieron 10 ml de EDTA 20 mM y se incubaron durante 10 a 20 minutos. Al cabo de 20 minutos, se procedió a raspar las células de la placa. Se procedió a añadir 10 ml al 5% de FCSen PBS y las células se transfirieron a un tubo Falcon de 50 ml . Las células fueron agitadas a 1,8 K rpm durante 5 minutos a 4°C. Se eliminó el sobrenadante y se procedió a resuspender las células en 1 ml al 5% de FCS en PBS. Se distribuyeron 100 µl de suspensión cellular en tubos FACS de 5 ml conteniendo 1 µg de proteina y se incubó durante 30 minutos o más sobre hielo. Se usaron las siguientes proteínas: mAngptl4 (23-410), PUR 9452, 0,428 mg/ml (2µl/muestra) ; hAngptl4 (23-406), PUR 9384, +/- 90 µg/ml (10 µl/muestra); hAngptl4 (184-406) -IgG, PUR 9441, 1.5 mg/ml (1 µl/muestra); y control FLAG-BAP (Sigma) 0.1 mg/ml (2 µl/muestra) . Después de la incubación, se procedió a llenar los tubos con 5 ml al 5% de FCS en PBS sobre hielo. Las células fueron agitadas durante 5 minutos a 2 K rpm. Se eliminó el sobrenadante. Se añadió el anticuerpo (Sigma) Anti-FLAG-FITC (2 µl de anticuerpo - 100 µg/ml stock) y se incubó sobre hielo durante 5 minutos o más. La concentración final del anticuerpo fue 1 µg/ml. Se añadieron 5 ml al 5% de FCS en PBS y se agitaron las células durante 5 minutos a 1,8 K rpm a 4°C. Se eliminó el sobrenadante y se procedió a resuspender las células en 0.25 ml PBS al 5% de FCS sobre hielo. Para evitar la internalización del receptor, también puede estar presente azida de sodio al 0.05%. Puede añadirse 1 µl de stock diluido 1:50 de yoduro de propidio (Pl) por muestra. A continuación, las células fueron sometidas a FACS. Diversas formas de ANGPTL4 humana y de roedor se unieron a las células A673 (Figura 6, Panel A) en distintas condiciones (Figura 6, Panel B) , normoxia, hipoxia (0% 02, durante 24 horas, o PMA (200 nM durante 24 horas) . Para los experimentos de hipoxia, las células se incubaron durante 24 horas a 37 °C en C02 al 5% y N2 al 95%. Alternativamente, las células fueron activadas en presencia de éster de forbol a una concentración de 200 nM en un incubador a 37 °C y de C02 al 5% en condiciones normóxicas . Medios condicionados de las células que expresan la ANGPTL4 : Se analizó la proliferación de las células A673 cuando se utilizan medios condicionados de las células que expresan a la ANGPTL4 o se añade ANGPTL4 recombinante. A las células A673 se añadieron 500 µl de medios condicionados (sobrenadante) de COS7 que fueron transducidos con constructos adenovirales (Ad-Angptl4 (2), Ad-LacZ (1) o AdLacZ + rmAngptl4 (23-410) (3) (5 µg/ml)). Se dejó crecer a las células durante 7 días (Figura 7, Panel A) en medios conteniendo DMEM con alto contenido de glucosa, al 5% de FCS, al cabo de los cuales se procedió al recuento de las mismas. También se analizó la proliferación de A673 añadiendo a los medios ANGPTL4 recombinante con FCS al 5%, dejando que las células creciesen durante 4 días. No se añadió nada a los medios (1) o se les agregó control tampón (2), (23-410) (2.5 µg/ml) (3), hAngptl4 (23-406) (2.5 µg/ml) (4), hIgG-hAngptl4 (184-406) (2.5 µg/ml) (5) o hIgG-mAngptl4 (184-410) (2.5 µg/ml) (6) en la concentración indicada. Después se dejó que las células crecieran durante 4 dias (Figura 7, Panel B) en medios conteniendo DMEM con alto contenido de glucosa, FCS al 5%, y se procedió al recuento de las mismas. La proliferación de las células A673 por medios condicionados de las células que expresan la ANGPTL4 o proteína recombinante añadidos a los medios puede depender de la densidad de las células . Ver Figura 7 , Panel A (proliferación celular con crecimiento durante 7 dias en las condiciones enunciadas) y Panel B (proliferación celular con crecimiento durante 4 dias en las condiciones enunciadas) . La ANGPTL4 induce la migración cellular: Analizamos la capacidad de la ANGPTL4 para inducir la migración celular de las células tumorales 4T-1 de roedores. La motilidad cellular se midió como se ha descrito (ver, por ejemplo, Camenisch, y col., J. Biol . Chem . , 277 (19) : 17281-17290 (2002) ) usando insertos de cultivos tisulares de pocilios múltiples HTS con tamaño de poro de 3 µm (Becton Dickinson, NJ) . La hANGPTL4 (1-406) se diluyó en 50/50/0.1% BSA a 5, 1 y 0.2 µg/ml. Como control positivo, las membranas fueron incubadas con suero fetal de ternera (FCS) al 10% conteniendo el medio o 0.1 µg/ml de PDGF-BB humano recombinante (R&D Systems). Como control negativo se usó BSA 50/50/0.1%. Las células tumorales 4T1 del ratón se lavaron tres veces con PBS y se recogieron y suspendieron aproximadamente 105 células/ml en 50/50/0.1%BSA. Se ensayaron las siguientes preparaciones celulares, donde la ANGPTL4 es indicada como NL2.

Las preparaciones se añadieron a la cámara inferior y fueron incubadas a 37 °C durante 19 horas. A la cámara superior se añadió la suspensión celular (250 µl) y se permitió a las células migrar toda la noche a 37 °C en un incubador humidificado en atmósfera al 5% de C02. Después de la incubación, el medio fue aspirado desde las cámaras superior y de fondo, y las células que hablan migrado hacia la superficie inferior de la membrana fueron fijadas con metanol (400 µl de MeOH durante 30 minutes a 4°C, eliminación de MeOH y aire seco durante 4Ó minutos) y teñidas con YO-PRO-1 (Sondas moleculares, OR) (400 µl yoduro de propidio YO-PRO-1 a 10 µm (1:100 de stock 1 mM) ) . Los resultados de la migración se cuantificaron en términos del número promedio de células/campo microscópico a una amplificación de 20 veces usando el programa Openlab (Improvision, MA) . En otro experimento, se descubrió que la ANGPTL4 induce la migración de las células A673 junto con la migración de las células tumorales 4T-1. La mANGPTL4 se diluyó en 50/50/0.1% BSA para 6, 1.5 y 0.375 µg/ml. Como control positivo, las membranas fueron incubadas con suero fetal de ternera (FCS) al 10% conteniendo el medio ó 0,1 µg/ml de PDGF-BB humano recombinante (R&D Systems) . Como control negativo se usó BSA 50/50/0.1%. Las células 4T-1 y A673 se recogieron y resuspendieron en 50/50/0.1% BSA (2xl05células/ml) . Se ensayaron las siguientes preparaciones celulares, donde la ANGPTL4 es indicada como NL2.

Las preparaciones se añadieron a la cámara inferior y fueron incubadas en 750 µl a 37°C durante 19 horas. A la cámara superior se añadió la suspensión celular (250 µl) (5xl04) y se permitió a las células migrar durante 7 horas a 37 °C en un incubador humidificado en atmósfera al 5% de C02. Después de la incubación, el medio fue aspirado desde las cámaras superior y de fondo, y las células que habían migrado hacia la superficie inferior de la membrana fueron fijadas con metanol (400 µl de MeOH durante 30 minutes a 4°C, eliminación de MeOH y aire seco durante 40 minutos) y teñidas con yoduro de propidio YO-PRO-1 (Sondas moleculares, OR) (400 µl yoduro de propidio YO-PRO-1 a 10 µm (1:100 de stock 1 mM) ) . Los resultados de la migración se cuantificaron en términos del número promedio de células/campo microscópico a una amplificación de 20 veces usando el programa Openlab (Improvision, MA) . Ver la Figura 9, donde (1) no se añadió ningún suero, (2) se añadió suero fetal de ternera (FCS) al 10%, (3) se añadió PDGF-BB y (4) se añadió ANGPTL4. Las células A673 y 4T-1 migraron usando ANGPTL4 y FCS al 10%. Por lo tanto, los antagonistas de la ANGPTL4 pueden usarse para inhibir la metástasis, por ejemplo, sin circunscribirse a una teoría, impidiendo la migración de las células tumorales . La NAGPTL4 aumenta el tamaño del tumor in vivo : Las células A673 del rabdomiosarcoma humano (HTB 1598) se cultivaron como se ha descrito anteriormente (Kim y col., Nature 362:841-844 (1993); y Gerber y col., Cáncer Research, 60:6253-6258 (2000)). Para establecer xenotrasplantes se inyectaron s.c. 5 x 106 células A673 en 0.1 ml de Matrigel en la región del flanco dorsal del ratón beige desnudo (sin pelo) (Harían Sprague Dawley) . En los dias 1, 7 y 14 se procedió a inyectar 1 x 108 unidades formadoras de placa (PFU) de un constructo adenoviral, de forma intratumoral (1T) , q7d. Las inyecciones se hicieron directamente en la masa tumoral, desde abajo y el costado, usando una aguja calibre 28 y una jeringa de tuberculina de 0.5 ml . Los constructos adenovirales eran un constructo adenoviral ANGPTL4 (Ad-Angptl4) , un constructo adenoviral LacZ (Ad-LacZ) como control o un constructo adenoviral ANGPTL3 (Ad-Angptl3) . En distintos días siguientes a la implantación del tumor se determinó el tamaño del mismo. Las mediciones del tamaño del tumor se realizaron cada dos dias y el volumen del tumor se calculó usando las fórmulas de volumen de elipsoide (p/6 x L x W x H, donde L=longitud, W= ancho y H=altura; Tomayko & Reynolds, Cáncer Chemothe . Pharmacol . , 24:148-154 (1989)). Como puede verse en la Figura 8, el tamaño (Panel A) y el peso del tumor (Panel B) aumentaron estadísticamente (P<0,0001) en las células A673 inyectadas al ratón y en un constructo adenoviral ANGPTL4 (Ad-Angptl4) en comparación con los constructos Ad-LacZ o Ad-Angptl3. EJEMPLO 2: TENDENCIA A ELUDIR EL TRATAMIENTO ANTI-VEGF DE TUMORES TRATADOS CON ANGPTL4 La ANGPTL4 estimuló la proliferación celular del tumor en los tumores tratados con un agente antiangiogénico, por ejemplo, anti-VEGF (como AVASTIN® (Genentech, South San Francisco)). Ver la Figura 8, Panel C. Las células A673 del rabdomiosarcoma humano (HTB 1598) se cultivaron como se ha descrito anteriormente (Kim y col., Nature 362:841-844 (1993); y Gerber y col., Cáncer Research, 60:6253-6258 (2000)). Para establecer xenotrasplantes se inyectaron s.c. 5 x 106 células A673 en 0.1 ml de Matrigel en la región del flanco dorsal del ratón beige desnudo (sin pelo) (Harían Sprague Dawley). En los días 1. 7, 14, 21 y 28 se procedió a inyectar Ix 108 unidades formadoras de placa (PFU) de un constructo adenoviral, de forma intratumoral (1T) , g7d. Los constructos adenovirales fueron un constructo adenoviral ANGPTL4 (Ad-Angptl4) , un constructo adenoviral LacZ (Ad-LacZ) como control o un constructo adenoviral ANGPTL3 (Ad-Angptl3) . También se trató al ratón con Avastin® (Genentech) en una dosis de 5 mg/kg, ip, dos veces por semana. Las inyecciones se hicieron directamente en la masa tumoral, desde abajo y el costado, usando una aguja calibre 28 y una jeringa de tuberculina de 0,5 ml. Las mediciones del tamaño del tumor se realizaron cada dos días y el volumen del tumor se calculó usando las fórmulas de volumen de elipsoide (p/6 x L x W x H, donde L=longitud, W= ancho y H=altura; Tomayko & Reynolds, Cáncer Chemother. Pharmacol . , 24:148-154 (1989)). Como se ha visto en la Figura 8, Panel C, el tamaño del tumor aumentó en los ratones a los que se les inyectó un constructo adenoviral ANGPTL4 (Ad-Angptl4) , aunque estuviesen siendo tratados con AVASTIN®, en comparación con los ratones a los que se les inyectaron células conteniendo un constructo Ad-LacZ o Ad-Angptl3, en combinación con el tratamiento con AVASTIN®. EJEMPLO 3: LOS ANTICUERPOS QUE SE UNEN A LA ANGPTL4 INHIBEN EL CRECIMIENTO DE LAS CÉLULAS TUMORALES Se probó la capacidad de los anticuerpos anti- ANGPTL4 para inhibir una actividad biológica de la ANGPTL4, por ejemplo, la proliferación de células tumorales. Se colocaron IxlO4 células tumorales (por ejemplo, HeLa-S3, Caki, U87MG, 293, A673, HM7 y Calu 6)/ pocilio en placas de 12 pocilios en medios con FCS al 10%. Se dejó incubar a las células toda la noche a 37 °C en un incubador humidificado en atmósfera al 5% de C02. El medio se cambió a FCS al 5% (excepto para las células Calu 6, que estaban en FCS al 10%) y se añadió a los pocilios 1, 2,5, 5 ó 10 µg/ml de anticuerpo anti-hANGPTL4 o anti-Dscr o no se añadió ningún anticuerpo a los pocilios. Las placas fueron colocadas a 37 °C en un incubador humidificado en atmósfera al 5% de C02. En los días 2 ó 3 siguientes a la adición de un anticuerpo anti-hANGPTL4 se procedió a realizar el recuento celular. El anticuerpo anti-ANGPTL4 inhibió el crecimiento celular de las células HeLa-S3, Caki U87MG, 293, A673 y Calu 6, pero no el de las células HM7. Ver Figura 10, Panel A y B. EJEMPLO 4: PREPARACIÓN DE ANTICUERPOS QUE SE UNEN A LA ANGPTL4 Las técnicas para la producción de anticuerpos policlonales y monoclonales son conocidas en la especialidad y se describen en la presente memoria. Los antigenos (o inumonógenos) que pueden utilizarse incluyen a la proteína purificada de la invención, los fragmentos de proteína, las proteínas de fusión que contienen la proteina y las células que expresan a la proteina recombinante y/o a los fragmentos de proteína en la superficie celular. La selección del antígeno puede realizarla un especialisita sin una experimentación indebida. Los ratones, como por ejemplo Balb/c, son inmunizados con el antígeno emulsionado en el adyuvante de Freund completo e inyectados subucutánea o intraperitonealmente en una cantidad de 1-100 microgramos. Alternativamente, el antígeno es emulsionado en el adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, Mont.) e inyectado en la almohadilla de las patas traseras de los animales. A continuación, los ratones inmunizados son reforzados 10 ó 12 dias más tarde con antígeno emulsionado adicional en el adyuvante seleccionado. Más adelante, también podría reforzarse a los ratones con inyecciones de inmunización adiciónales durante varias semanas. Periódicamente pueden obtenerse muestras de suero de los ratones mediante sangrado retroorbital a fin de realizar ensayos ELISA para detectar los anticuerpos. Después de que se haya detectado un título de anticuerpos adecuado, a los animales con resultado "positivo" de anticuerpos se les puede inyectar una inyección intravenosa final del ligando en cuestión. De tres a cuatro días más tarde se sacrifica a los ratones y se recogen las células del bazo. A continuación, las células del bazo se fusionan (usando polietilenglicol al 35%) con una línea celular de mieloma murino, como por ejemplo P3X63AgU.l, disponible de ATCC, No. CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que después pueden colocarse en placas de cultivo tisular de 96 pocilios conteniendo un medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos mieloma e híbridos celulares del bazo. Las células de hibridoma serán sometidas a un ensayo ELISA para determinar la reactividad contra el antígeno. La determinación de las células de hibridoma "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra la ANGPTL4 mencionada en la presente es muy conocida en la especialidad. Alternativamente, las células de hibridoma pueden crecer en frascos de cultivo tisular o en frascos rotativos. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en la ascitis puede realizarse usando precipitación de sulfato de amonio, seguida por cromotografía de gel de exclusión. Alternativamente, puede utilizarse la cromatografía de afinidad basada en la unión de un anticuerpo a la proteína A o a la proteína B. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales de conejo se generaron mediante inmunización del conejo con 500 µg de proteina ANGPTL4 humana recombinante (23-406) generada en E. Coli en los dias 1, 40 y 70. El suero se recogió en los días 80 y 120 siguientes a la inmunización y los anticuerpos se purificaron mediante columnas de Sefadex de proteína A. EJEMPLO 5: BLOQUEO O NEUTRALIZACIÓN DE LOS ANTICUERPOS Los anticuerpos contra los antigenos descritos en la presente pueden identificarse mediante distintas técnicas conocidas en la especialidad, por ejemplo, un ELISA. Las placas pueden cubrise, por ejemplo, con el polipéptido de interés, por ejemplo, ANGPTL4 o un fragmento de la misma, e incubarse con anticuerpos generados contra ese polipéptido, por ejemplo ANGPTL4 (ver, por ejemplo, la descripción en las Patentes Norteamericanas 6,348,350; 6,372,491 y 6,455,496). La unión al anticuerpo puede detectarse mediante distintos métodos . Los anticuerpos del antagonista (por ejemplo de bloqueo o neutralización) pueden identificarse mediante ensayos de competición y/o de actividad. Por ejemplo, la expresión de ANGPTL4 estimula la proliferación, la migración, la adherencia o la unión a avßs de las células tumorales. La determinación de un anticuerpo de bloqueo o neutralización para la ANGPTL4 puede mostrarse mediante la capacidad del anticuerpo para bloquear la proliferación (ver, por ejemplo, la Figura 10, Panel A y Panel B) , la migración, la adhesión (ver, por ejemplo, la Figura 12) o la unión a avßs (USBiological, 37K, Swampscott, Massachusetts) (ver, por ejemplo, la Figura 13, Panel B y C) de las células tumorales. Por ejemplo, las células A673 del rabdomiosarcoma pueden colocarse sobre placas e incubarse con sobrenadante de las células C0S7 transducidas con Ad-hAngptl4 junto con un anticuerpo anti-ANGPTL4, o un anticuerpo de control o PBS. Después de varios dias, puede procederse a tripsinizar y hacer el recuento de las células. Los anticuerpos que reducen los números de células se identifican como anticuerpos de bloqueo o neutralización. La ANGPTL4 también era conocida por inducir la migración de las células tumorales y por ser un factor antiangiogénico. Ver, por ejemplo, Le Jan y col., American Journal of Pathology, 164(5): 1521-1528 (2003). Asi, los anticuerpos de bloqueo o neutralización para la ANGPTL4 pueden identificarse usando los anticuerpos en combinación con la ANGPTL4 en los ensayos de migración de las células tumorales, y/o en los ensayos de angiogénesis, por ejemplo el ensayo CAM. Los anticuerpos de bloqueo o neutralización contra la ANGPTL4 que pueden usarse para bloquear o reducir el crecimiento del tumor o bloquear o reducir el crecimiento de las células cancerosas también pueden identificarse usando células tumorales en cultivo como se ha descrito anteriormente y/o en estudios de ratones beige/desnudos (sin pelo) . Por ejemplo, a los ratones desnudos se les pueden inyectar células tumorales. En distintos momentos después de haberse determinado el crecimiento del tumor, una o dos veces por semana se les puede inyectar a los ratones intraperitonalmente distintas dosis del anticuerpo de la ANGPTL4 de bloqueo o neutralización, un control de anticuerpos o PBS. El tamaño del tumor puede medirse cada semana y al final del estudio del tumor puede procederse a extirpar el tumor y pesarlo. Los anticuerpos de la ANGPTL4 de bloqueo o neutralización se identifican con el bloqueo o la reducción del crecimiento del tumor en el ratón. Las combinaciones de los anticuerpos de la ANGPTL4 y del agente antiangiogénesis para bloquear o reducir el crecimiento del tumor o bloquear o reducir el crecimiento de las células cancerosas pueden identificarse usando células tumorales en cultivo como se ha descrito anteriormente y/o en estudios de ratones beige/desnudos (sin pelo) . Como se ha indicado anteriormente, a los ratones desnudos se les pueden inyectar células tumorales. En distintos momentos después de haberse determinado el crecimiento del tumor, una o dos veces por semana pueden inyectarse intraperitonealmente a los ratones diferentes dosis de la combinación de un antagonista de la ANGPTL4 y un agente antineoplásico, por ejemplo, un agente antigoangiogénico, como por ejemplo, el anticuerpo anti-VEGF, o un antagonista de la ANGPTL4, o un agente antineoplásico, un control de anticuerpos o PBS. El tamaño del tumor puede medirse cada semana y al final del estudio puede procederse a extirpar el tumor y pesarlo. Se identifican las terapias de combinación de los antagonistas de la ANGPTL4 y de los agentes antineoplásicos que bloquean o reducen el crecimiento del tumor en el ratón, o las que aumentan el bloqueo o la reducción del tumor en comparación con las que utilizan un control o agente único. EJEMPLO 6: VARIANTE DE LA ANGPTL4 Se ha producido una ANGPTL4 variante usando un kit de mutagénesis estándar (por ejemplo, el kit de mutagénesis dirigida a un sitio específico QuickChange XL (Invitrogen, Carlsbad, California)) siguiendo el protocolo del fabricante. En la secuencia de la ANGPTL4 humana se realizaron dos sustituciones de aminoácidos (ver, por ejemplo, la Figura 2) . Las sustituciones se realizaron en las posiciones 162 y 164 (R162G y R164E) y dieron como resultado un cambio de RKR a GKE. Del sobrenadante de las células C0S-7 transfectadas provisionalmente se aisló la proteina ANGPTL4 (plásmido L280, aa-406) o la ANGPTL4 variante. El sobrenadante se cargó en una columna de niquel para la purificación. La proteina fue detectada por el Western blot con un anticuerpo HRP anti-FLAG. Ver la Figura 3, Panel B. Cuando se realizaron las sustituciones y se comparó la ANGPTL4 variante con la proteina ANGPTL4 nativa o de tipo natural, el Western blot permitió descubrir que la ANGPTL4 variante tiene un peso molecular mayor al de la ANGPTL4 nativa. La sustitución de RKR a GKE en las posiciones 162 y 164 de la proteina nativa impidió la degradación proteolítica de la ANGPTL4. EJEMPLO 7: LA ANGPTL4 SE UNE A LA INTEGRINA OCvßs Los angiopoetinas son factores secretados que regulan la angiogénesis mediante la unión del receptor de la tirosina cinasa específico de las células endoteliales Tie2 a través de su dominio de tipo fibrinógeno (FBN) . Se descubrió que el dominio de doble espiral presente en la familia de los ligandos secretados es necesario para la oligomerización de los ligandos (ver, por ejemplo, Procopio y col., J. Biol . Chem . , 274:30196-201(1999)). En forma similar a las angiopoietinas, la ANGPTL3 y la ANGPTL4 son glicoproteinas secretadas y cada una de ellas comprende un péptido de señal terminal N, seguido por un dominio de doble espiral y un dominio de tipo FBN terminal C. Se determinó que la ANGPTL3 se une a avß3 a través de un dominio de tipo FBN. Determinamos que la ANGPTL4 se une a avßd. Se sometió a ensayos a la línea celular 293-1953 que se transfecta de manera estable con la integrina avßs para evaluar la capacidad de unirse o adherirse a las placas cubiertas con ANGPTL4. Se recogieron células y se diluyeron a 105 células/ml en un medio sin suero conteniendo PBS, BSA al 1%, lCaCl2 InM y MgCl2 1 nM. Las células se preincubaron durante 15 minutos a 37°C con o sin anticuerpos avßs anti-integrina (MAB1961 (Chemicon, Temecula, CA) ) o péptidos. Se procedió a colocar mANGPTL4 recombinante, BSA o vitronectina (1 µg, 3 µg, 10 µg, o 30 µg/ml) sobre placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocilios Nunc Maxisorp durante toda la noche a 4°C y se bloqueó con 200 µl deBSA al 3% en solución de tampón fosfato salino (PBS), pH 7.4, durante 1.5 horas a 37°C. Se añadieron suspensiones celulares (5xl04 células/lOOµl/pocillo (5xl05/ml) ) a los pocilios cubiertos y se procedió a incubar las placas a 37°C durante 5.5 horas. Las células no adhesivas se eliminaron mediante lavados con PBS y se midió la adhesión celular añadiendo 200 µl de tintura GD CyQuant (Sondas Moleculares (tecnologías de detección de Invitrogen (Carlsbad, California) ) (1 : 400) /solución tampón de lisis celular y se incubó durante 2-5 minutos. La fluorescencia de la muestra se midió usando excitación a 480 nm y emisión máxima a 520 nm. También pueden usarse los métodos PNAG de Lanndegren (ver, por ejemplo Landegren, J. Immunol . Methods, 67:379-388 (1984)). Las células que expresan vßs mostraron adherencia a la ANGPTL4 y la vitronectina (USBiological, Swampscott, Massachusetts) y un control positivo, y un control negativo en comparación con BSA. Ver la Figura 11.

Para determiner si la integrina vßs era suficiente para mediar en la adhesión celular de la ANGPTL4, se probaron anticuerpos de bloqueo a fin de evaluar su capacidad para inhibir la adherencia en el ensayo de adhesión celular. Antes de la incubación con la proteína (BSA (1) , vitronectrina (2) o ANGPTL4(3)) que cubría los pocilios se añadieron a los pocilios 293-1.953 anticuerpos funcionales de bloqueo antibodies (anticuerpo anti-avß5 (MAB1961 (Chemicon, Temecula, CA) ) o anticuerpos anti-hANGPTL4) . Ver la Figura 12. Los anticuerpos anti-avßs y anti-ANGPTL4 anularon la actividad de adhesión celular de la ANGPTL4. Se realizaron experimentos adicionales para confirmar que la ANGPTL4 se une a avßs. Se realizaron experimentos ELISA para detectar si mANGPTL4, IgG-hANGPTL4 terminal N (1-183) y/o IgG-hANGPTL4 terminal C (184-406) se unen a placas cubiertas con avß5 (USBiological, 37K, Swampscott, Massachusetts) . Se incubó toda la noche a 4 °C 100 µl/pocillo de diluyente avßs de la integrina (Iµg/ml de solución tampón de revestimiento (carbonato/bicarbonato, pH 9.6 50 mM) ) con solución tampón de revestimiento. Se procedió a lavar las placas tres veces con solución tampón de lavado (PBS, pH 7.4, Tween-20 al 0.05%) y se añadieron 100 µl/pocillo de solución tampón de bloqueo (PBS, pH 7.4, BSA al 0.5%) durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. En una solución tampón de muestra (BSA al 0.5%, 50 mM Tris, pH 7.4, Tween 20 al 0.05%, MnCl21 mM, CaCl2 50 µM, MgCl2 50 µM, NaCl 100 mM) se prepararon distintas cantidades (0, 0.070µg, 0.22 µg, 0.66 µg, 2 µg ó 6 µg) de muestras, mANGPTL4, IgG-hANGPTL4 terminal N (1-183) y/o IgG-hANGPTL4 terminal C (184-406) . Las muestras se añadieron a las placas (lOOµl/pocillo' en las cantidas incubadas anteriormente) y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave. Las placas se lavaron con solución tampón y se procedió a añadir 100 µl/pocillo de peroxidasa de rábano picante anti-Flag (HRP) (100 ng/ml) (Jackson, #109-036-098) en una solución tampón de ensayo (PBS, pH7.4, BSA al 0.5%, Tween 20 al 0.05%) y a incubar durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. Después se procedió a lavar las placas. Se añadieron 100 µl/pocillo de tetrametilbenzidina (TMB) (Moss, Inc.) y se incubó en las placas hasta que se desarrolló un color aceptable a temperatura ambiente. Se añadieron 100 µl/pocillo de solución de interrupción (H3P04 1 M) para interrumpir la reacción. Se leyeron las placas a 630 nm. mANGPTL4, IgG-hANGPTL4 terminal N e IgG-hANGPTL4 terminal C se unieron a las placas cubiertas con avßs, aunque la unión a las placas de IgG-hANGPTL4 terminal C fue ligeramente mayor. Ver Figura 13, Panel A. Los anticuerpos anti-ANGPTL4 inhiben la unión de la ANGPTL4 a las placas cubiertas con avßs. Se realizaeron experimentos ELISA. Se incubó toda la noche a 4 °C 100 µl/pocillo de diluyente avas de la integrina (lµg/ml de solución tampón de revestimiento (carbonato/bicarbonato 50 mM, pH 9.6)) con solución tampón de revestimiento. Se procedió a lavar las placas tres veces con solución tampón de lavado (PBS, pH 7.4, Tween-20 al 0.5%) y se añadieron 100 µl/pocillo de solución tampón de bloqueo (PBS, pH 7.4, BSA al 0.5%) durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. En una solución tampón de muestra (BSA al 0.5%, 50 mM Tris, pH 7.4, Tween 20 al 0.05%, MnCl21 mM, CaCl250 µM, MgCl2 50 µM, NaCl 100 mM) se incubaron de 0.6 µg a 6.0 µg de muestras, mANGPTL4, IgG-hANGPTL4 terminal N (1-183) y/o IgG-hANGPTL4 terminal C (183-406) con anticuerpos anti-ANGPTL4 (1.5 µg) o anti-Dscr (1.5 µg) durante 30 minutos. Después de la incubación, se incubaron 100 µl/pocillo de muestra de anticuerpo +/- dejando las placas durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave. Las placas se lavaron con solución tampón y se procedió a añadir 100 µl/pocillo de anti-Flag (HRP) en una solución tampón de ensayo (PBS, pH 7.4, BSA al 0.5%, Tween 20 al 0.05%) y a incubar durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. Se lavaron las placas y se procedió a añadir 100 µl/pocillo de TMB y a incubar las placas a temperatura ambiente hasta que se desarrolló un color aceptable. Se añadieron 100 µl/pocillo de solución de interrupción (H3P04 1 M) para interrumpir la reacción. Se realizó la lectura de las placas a 630 nm. Los anticuerpos anti-ANGPTL4 redujeron la cantidad de mANGPTL4, IgG-hANGPTL4 terminal N y IgG-hANGPTL4 terminal C que se unen a las placas cubiertas con ccvß5 en comparación con el anticuerpo anti-Dscr y el anticuerpo o medio monoclonal 5G7. Ver Figura 13, Panel B. En otro experimento, mediante el ensayo ELISA se demostró la unión de la ANGPTL4 y la avßs integrina. En este experimento se añadieron a las placas 80 µl/pocillo de hANGPTL4 terminal C, vitronectina o BSA (5µg/ml) en una solución tapón de revestimiento (carbonato/bicarbonato 50 mM, pH 9,6) y se incubó toda la noche a 4°C. Se procedió a lavar las placas (solución tampón de lavado: PBS, pH 7.4, Tween-20 al 0.05%) y a añadir lOOµl/pocillo de solución tampón de bloqueo (PBS, pH 7.4, BSA al 0.5%) con cualquier medio, anticuerpos anti-hANGPTL4 (15 µg/lOOµl) o anticuerpos anti-Dscr (15 µg/lOOµg) ; después se dejó incubar durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. Se procedió a lavar las placas, se añadieron 100 µl (3-9 µg/ml) de avßs y se dejó incubar durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave. Se procedió a lavar las placas, se añadió 1 µg/ml (1:1000) de anticuerpo anti-avßs (Chemicon) (5 µg/lOOµl) en una solución tampón de ensayo (PBS, pH 7.4, 0.5% BSA, 0.05% Tween 20) y se dejó incubar durante una hora a temperatura ambiente con agitación suave. Después de la incubación, se procedió a lavar las placas y a añadir 100 100 µl/pocillo de peroxidasa de rábano picante (HRP) anti-ratón (a: 5000) en una solución tampón de ensayo. Se procedió a lavar las placas, se añadieron lOOµl/pocillo de tetrametilbenzidina (TMB) y se dejó incubar a temperatura ambiente hasta que se desarrolló un color aceptable. Se procedió a interrumpir la reacción con lOOµl/pocillo de H3P04 1 M y se realizó la lectura a 630 nm. La avß5 se une a la ANGPTL4 (banda 1) y a la vitronectrina (banda 4) que recubre las placas. La unión se bloquea con anticuerpos anti-ANGPTL4 (banda 2) pero no cuando se usa un anticuerpo de control anti-Dscr (banda 3) o si se recubre las placas con una proteína de control (banda 5) . Ver Figura 13, Panel C. Por consiguiente, estos hallazgos demuestran que la ANGPTL4 recombinante se une específicamente a la integrina avß5. Se considera que la especificación es suficiente para permitir que un experto en la especialidad aplique la invención. Se entiende que los ejemplos y las modalidades que aqui se describen sólo se proponen ser ilustrativas. La invención no tiene un alcance de aplicación limitado por el constructo depositado, puesto que el objetivo de las modalidades depositadas es únicamente el de ilustrar sobre determinados aspectos de la invención y en el alcance de aplicación de la invención no se incluye ninguno de los constructos funcionalmente equivalentes. El depósito de material de la presente memoria descriptiva no constituye reconocimiento alguno de que la descripción por escrito no es suficiente para permitir la aplicación de cualquier aspecto de la invención, incluido el mejor modo de la misma, ni se interpretará de forma que limite el alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representa. De hecho, varias modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en la presente, serán evidentes para los expertos en el sector a partir de la descripción anterior y se encuentran dentro del alcance de aplicación de las reivindicaciones incluidas más adelante. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes aqui citadas quedan incorporadas por la presente mediante referencia en su totalidad para todos los fines.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por el solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Método de bloqueo o reducción del crecimiento tumoral o de una célula cancerosa, caracterizado porque comprende : a) administrar al tumor o a la célula cancerosa una cantidad efectiva de un agente antineoplásico; y b) administrar a la célula tumoral o cancerosa una cantidad efectiva de un antagonista de la proteína 4 de tipo angiopoeitina (ANGPTL4), donde las cantidades eficaces combinadas bloquean o reducen el crecimiento del tumor o de la célula cancerosa. 2. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente antineoplásico comprende un agente antiangiogénico.
3. Método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el agente antiangiogénico es un antagonista del VEGF.
4. Método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el antagonista del VEGF es un anticuerpo anti-VEGF.
5. Método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el anticuerpo anti-VEGF es A.4.6.1 humanizado.
6. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antagonista de la ANGPTL4 es un anticuerpo anti-ANGPTL4.
7. Método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el anticuerpo anti-ANGPTL4 se une a la ANGPTL4 (184-406) .
8. Método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el antagonista de la ANGPTL4 es un anticuerpo anti-aVß5.
9. Método de conformidad con la reivindicación , 6 u 8 , caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
10. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antagonista de la ANGPTL4 comprende una molécula SiRNA.
11. Método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la molécula SiRNA es una molécula ANGPTL4-SiRNA.
12. Método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la molécula ANGPTL4-SiRNA tiene como objetivo una secuencia de ADN de un ácido nucleico que codifica a la ANGPTL4, donde la secuencia del ADN comprende al menos GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA (SEC ID NO. 3) .
13. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque adicionalmente comprende la administración al tumor o a la célula cancerosa de un tercer agente antineoplásico.
14. Método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el tercer agente antineoplásico es un agente quimioterápico.
15. Método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el tercer agente antineoplásico es otro inhibidor de la angiogénesis.
16. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las etapas de administración (a) y (b) se realizan secuencialmente.
17. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las etapas de administración (a) y (b) se realizan simultáneamente.
18. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las etapas de administración (a) y (b) se realizan secuencial y simultáneamente.
19. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las etapas de administración se realizan en cualquier orden.
20. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tumor o la célula cancerosa está en un sujeto.
21. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el sujeto es un humano.
22. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el sujeto presenta un crecimiento tumoral reincidente o un crecimiento reincidente de las células cancerosas.
23. Método de bloqueo o reducción del crecimiento tumoral o del crecimiento de una célula cancerosa en un sujeto, caracterizado porque comprende: administrar al sujeto una composición de combinación que comprenda una cantidad efectiva de agente antiangiogénesis y una cantidad efectiva de un antagonista de la proteina 4 de tipo angiopoietina (ANGPTL4) , donde las cantidades eficaces combinadas bloquean o reducen el crecimiento del tumor o el crecimiento de la célula cancerosa.
24. Método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque adicionalmente comprende la administración de un agente adicional, donde el agente adicional es un agente antineoplásico.
25. Método de bloqueo o reducción del crecimiento reincidente del tumor o el crecimiento reincindente de una célula cancerosa en un sujeto, caracterizado porque comprende : administrar al sujeto una cantidad efectiva de un antagonista de la proteína 4 de tipo antiopietina (ANGPTL4) , donde el sujeto estuvo o se está sometiendo simultáneamente a una terapia contra el cáncer con un agente antineoplásico y donde la administración de la cantidad efectiva del antagonista de la ANGPTL4 bloquea o reduce el crecimiento reincidente del tumor o el crecimiento reincidente de la célula cancerosa.
26. Método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el agente antineoplásico es uno o más agentes quimioterápicos .
27. Método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el agente antineoplásico comprende un agente antiangiogénico.
28. Método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el agente antiangiogénesis comprende un inhibidor anti-VEGF.
29. Método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el inhibidor anti-VEGF es un anticuerpo anti-VEGF.
30. Método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el anticuerpo anti-VEGF es A4.6.1 humanizado.
31. Método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el antagonista de la ANGPTL4 es un anticuerpo anti-ANGPTL4.
32 . Método de conformidad con la reivindicación 25 , caracterizado porque el antagonista de la ANGPTL4 es un anticuerpo anti-aVß5 .
33 . Método de conformidad con la reivindicación 29 , 31 ó 32 , caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humanizado .
34 . Método de conformidad con la reivindicación 25 , caracterizado porque el antagonista de la ANGPTL4 comprende una molécula SiRNA.
35 . Método de conformidad con la reivindicación 34 , caracterizado porque la molécula SiRNA es una molécula ANGPTL4- SiRNA.
36. Método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la molécula ANGPTL4 -SiRNA tiene como objetivo una secuencia de ADN de un ácido nucleico que codifica a la ANGPTL4, donde la secuencia del ADN comprende al menos GTGGC<-3^GCCTGCCCGAAGA (SEC ID NO. 3) .
37. Método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque adicionalmente comprende la administración de un agente adicional, donde el agente adicional es un agente antineoplásico .
38. Método de bloqueo o reducción del crecimiento tumoral o del crecimiento de una célula cancerosa, caracterizado porque comprende : administrar al tumor o a la célula cancerosa una cantidad efectiva de un antagonista de la proteina 4 de tipo angiopoietina (ANGPTL4) , donde el antagonista de la ANGPTL4 es un anticuerpo que se une a la ANGPTL4 (184-406) y donde la cantidad efectiva bloquea o reduce el crecimiento del tumor o de la célula cancerosa.
39. Composición, caracterizada porque comprende un anticuerpo que une a la ANGPTL4 (184-406) y a un antagonista del VEGF.
40. Composición, caracterizada porque comprende una molécula ANGPTL4-SiRNA, donde la molécula ANGPTL4-SiRNA tiene como objetivo una secuencia de ADN de un ácido nucleico que codifica a la ANGPTL4, donde la secuencia del ADN comprende al menos GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA (SEC ID NO. 3) .
41. Kit, caracterizado porque comprende una primera cantidad de on agente antiangiogénesis, una segunda cantidad de un agente de la proteína 4 de tipo angiopoietina (ANGPTL4) y un portador, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, y un contenedor.
42. Kit, caracterizado porque comprende una cantidad de un agente antiangiogénesis y un portador, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable en forma de una primera dosis unitaria, una cantidad de un antagonista de la proteína 4 de tipo angiopoietina (ANGPTL4) y un vehículo farmacéuticamente aceptable, vehículo o diluyente en forma de una segunda dosis unitaria, y un contenedor.