ME01991B - Polimerizovane micele - Google Patents

Description

Opis

Pronalazak za predmet ima polimerizovane micele, postupke za njihovu proizvodnju i njihove primene.

Veliki broj molekula sa terapeutskom aktivnosti i naročito anti-kancerozni molekuli ispoljavaju neznatnu rastvorljivost u vodi, poreklo osobine molekula da su unutrašnji hidrofobi. Naime, ovi molekuli moraju imati izvestan stepen hidrofobnosti da bi mogli biti uneti u ćelije. Vektorizacija terapeutskih molekula ima za cilj da zaokruži probleme koji su povezani naročito sa rastvorljivošću, stabilnošću, farmakokinetikom, bioraspodelom navedenih molekula i njihovih specifičnih ciljeva.

Različiti sistemi vektorizacije hidrofobnih jedinjenja su opisani u literaturi, kako mogu prenositi dovoljne količine molekula sa terapeutskom aktivnosti kroz različite biološke barijere da bi se postigla njihova delotvornost na mestu dejstva.

Jedna od tih tehnika vektorizacije se sastoji od inkapsuliranja aktivnog principa u mikrosferične oblike putem matrice polimera kao što je poli(alkilcijanoakrilati), poli(anhidridi), poli(mlečne kiseline). Ove mikrosfere imaju veličine od 20 nm do 100 nm što ih isključuje za korišćenje intravenskim putem i omogućava relativno slabu veličinu inkluzije hidrofobnih jedinjenja, između 0. 2% i 3. 5%.

Micele polimera, druga tehnika vektorizacije, označava koloidne disperzije jedinjenja amfifilnih polimera sa udaljenim hidrofilnim i hidrofobnim domenima. Ove micele polimera su supramolekularne strukture sa jezgrom/čaurom. Micele polimera su jedinjenja polietara koja se koriste u kombinaciji sa polietilen glikolom) da bi se formirali amfifilni polimeri u obliku diblokova kopolimera (pluronijski: PPO-co-PEG) ili triblokova kopolimera (poloksameri: PEG-co-PPO-co-PEG). Ove micele polimera imaju veličinu između 50 nm i 100 nm. Veličina inkluzije jedinjenja u micele polimera je između 0. 1% i 40% u skladu sa postupkom inkluzije koji se koristi: inkluzija evaporacijom, inkluzija dijalizom ili inkluzija nanoprecipitacijom. Micele polimera su, prema tome, vektori koji omogućavaju inkorporaciju bitnih količina hidrofobnih jedinjenja, ali je neophodno sprovesti tehniku (sinteze i inkluzije) i olakšati industrijalizaciju.

Sistemi vektorizacije putem lipozoma i vezikula polimera su intenzivno ispitivani i nekoliko formulacija lekova u ovim sistemima je trenutno u fazi kliničkog od kojih su neki već dokazali svoju kliničku opravdanost. Lipozomi i vezikule polimera mogu ugraditi hidrofilne aktivne principe u vodeno jezgro vezikule ili hidrofobnih molekula u dvostrukom omotaču polimera. Lipozomi i vezikule polimera imaju strukture (MLV multilamelarne vezikule, SUV unilamelarne vezikule malih veličina, LUV unilamelarne vezikule velikih veličina, GUV gigantske vezikule) i veoma raznovrsne veličine između 100 nm i 1000 nm. Lipozomi i vezikule polimera su vehikulumi aktivnih principa koji su važni u vektorizaciji hidrofilnih molekula.

2003. godine, dokazan je novi tip organizacije na površini nanocevčica ugljenika: nanoprstenovi, tj., struktura amfifila u obliku prstena duž celih nanocevčica. Nanoprstenovi su prstenovi polimerizovanih surfaktanata koji su formirani na površini nanocevčica a zatim razdvojeni od svog ugljenog nosača kako bi se koristili kao sredstva za solubilizaciju hidrofobnih aktivnih principa.

(WO 2004/092231). Nanoprstenovi su prema tome nanovektori koji se teško mogu industrijalizovati.

Vektori za oslobađanje, koji su gore opisani, manje ili više dobro odgovaraju izazovu vektorizacije što znači transport samo aktivnog principa na efikasan način i neznatno toksičan kako bi se lečila bolest. Ovi vektori odgovaraju na problem rastvorljivosti hidrofobnih aktivnih principa bez uzvratnog poništavanja problema veličine vektora, sprovođenja u delo ili industrijalizacije. Ovaj pronalazak zato ima za cilj da predloži novu strategiju za dobijanje nanovektora koji imaju kapacitet za ugrađivanje hidrofobnih aktivnih principa koji je veći od onog kod klasičnih vektora iz literature i uz jednu jednostavnu formulaciju koja će olakšati buduću industrijalizaciju.

Ovaj pronalazak se odnosi na polimerizovane micele, koje se karakterišu time da sadrže polimerizovane amfifilne molekule dobijene polazeći od amfifilnih molekula koji se sastoje od jednog ili dva lipidna lanca od kojih svaki sadrži jedan ili dva motiva koji se mogu polimerizovati, tipa diacetilena, vinila, akrilata ili stirena, a koji su povezani u jednu polarnu glavu.

U skladu sa ovim pronalaskom, pod “micelama” se podrazumevaju samo-organizovani sferni objekti sa jednom hidrofilnom površinom i jezgrom koje je lipofilno i koje su veličine manje od 100 nm.

Pod “amfifili” ili “surfaktanti”, podrazumevaju se organski molekuli koji imaju svojstvo da su istovremeno hidrofilni i hidrofobni. Amfifili, opisani svojim antagonističkim osobinama, imaju naročita svojstva u rastvoru i u vodenoj sredini se spontano organizuju u različite mikrostrukture.

Pronalazak se odnosi na polimerizovane micele koje sadrže polimerizovane amfifilne molekule, koji se dobijaju polazeći od amfifilnih molekula opšte formule A-X-B-L-Z u kojoj A predstavlja CH3-(CH2)m-C≡C-C≡C-(CH2)n- ili

CH2=CH- ili CH2=CH-C6H4-, n i m su, isti ili različiti, celi brojevi od 1 do 16; gde X predstavlja CO-NH ili NH-CO ili jednu vezu, X je veza kada je B jedna veza i kada je L jedna veza; gde B predstavlja -(CH2)m-C≡C-C≡C-(CH2)n- ili -CH=CH-C6H4- ili jednu vezu, n i m su, isti ili različiti, ćeli brojevi od 1 do 16; gde L predstavlja -(CH2)r-CH[NH-CO-A']- ili jednu vezu, r je između 1 i 16 i, A' predstavlja A; gde Z predstavlja

ili

s je ceo broj od 1 do 16 i R2 predstavlja COOH ili S03H ili 0S03H ili 0P03H2 ili 0P02H2 i R1 predstavlja H ili radikal COOH ili S03H ili 0S03H ili 0P03H2 ili 0P02H2 ili grupu -CO-NH-(CH2)t-CH3, t je ceo broj od 1 do 16, ili Z je moguće, isto tako, neutralne polarne hidrofilne glave, tipa šećera ili polisaharida, kao i njihove adicione soli sa farmaceutski prihvatljivom kiselinom ili bazom.

Od farmaceutski prihvatljivih kiselina, mogu se, bez namere limitiranja, navesti: hlorovodonična, bromovodonična, sumporna, fosforna, sirćetna,

trifluorosirćetna, mlečna, piruvična, malonska, ćilibarna, glutarna, fumarna, vinska, maleinska limunska, askorbinska, oksalna, metansulfonska, benzensulfonska i kamforna kiselina.

Od farmaceutski prihvatljivih baza, mogu se, bez namere limitiranja, navesti: natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, trietilamin, tercbutilamin.

Ispred svega, pronalazak se odnosi na polimerizovane micele koje sadrže polimerizovane amfifilne molekule, koji su dobijeni polazeći od amfifilnih molekula opšte formule A-X-B-L Z gde A predstavlja

n i m, isti ili različiti, jesu celi brojevi od 1 do 16;

gde X predstavlja CO-NH ili NH-CO ili jednu vezu, X je veza kada je B jedna veza i kada je L jedna veza; gde B predstavlja

ili jednu vezu, n i m su, isti ili različiti, celi brojevi od 1 do 16;

gde L predstavlja -(CH2)rCH[NH-CO-A']- ili jednu vezu, r je ceo broj od 1 do 16 i A' predstavlja A ili CH2=CH- ili CH2=CH-C6H4-; gde Z predstavlja

ili

s je ceo broj od 1 do 16 sa R1 koji predstavlja H ili radikal COOH ili grupu -CO-NH-(CH2)t-CH3, t je ceo broj od 1 do 16, ili Z može isto tako biti neutralna hidrofilna polarna glava, tipa šećera ili polisaharida, kao i njihove adicione soli sa farmaceutski prihvatljivom kiselinom ili bazom.

Pronalazak se, takođe, odnosi na polimerizovane micele koje su izgrađene od amfifilnih molekula čije su polarne neutralne hidrofilne glave po tipu krunasti etri.

Korisno, pronalazak je usmeren na polimerizovane micele čije su polarne Z glave funkcionalizovane.

Pod polimerizovanim „funkcionalizovanim" micelama se podrazumevaju polimerizovane micele koje su modifikovane pomoću liganada za prepoznavanje molekula zbog čega se razvijaju u pravcu pametnih i selektivnih vektora kako bi se na specifičan način identifikovali antigeni ili receptori eksprimovani na površini ciljanih ćelija, kao što su kancerozne ćelije ili infektivne. Zbog toga, polimerizovane micele se podvrgavaju funkcionalizaciji putem specifičnih liganada koji vise sa površine vektora što se dobija hemijskim kuplovanjem.

Korisno, ligandi koji se kače na površini polimerizovanih micela su: fluorofori ili sredstva za nuklearni imidžing (99Tc, 11ln, 125J, 18F, 64Cu) ili optički (cijanin, fluorescein, luciferaza, kvantum dots) ili magnetni (čestice oksida gvožđa), folna kiselina, manoza, galaktoza, antitela, ligandi tipa RGD.

Poželjno, polimerizovane micele su prema pronalasku funkcionalizovane na nivou polarne glave Z sa folnom kiselinom.

U jednom poželjnom načinu izvođenja, polimerizovane micele su funkcionalizovane u skladu sa postupkom koji je opisan u primeru 5.

Funkcionalizacija površine polimerizovanih micela čini pomenute polimerizovane micele skrivenim i omogućava ciljanje specifičnih ćelija.

Pronalazak se, takođe, odnosi na polimerizovane micele koje uključuju jedno ili hidrofobna jedinjenja u sredini polimerizovanih amfifila u skladu sa pronalaskom.

Pod „hidrofobnim jedinjenjima" se podrazumevaju molekuli malih veličina koji imaju neznatnu rastvorljivost u vodi, koja je manja od 1 g po litru u svim ili delu pH zona, ili proteini ili nukleinske kiseline koji imaju probleme rastvorljivosti ili stabilnosti u vodenoj sredini.

Poželjno, polimerizovane micele u skladu sa pronalaskom se sastoje od polimerizovanih amfifilnih molekula dobijenih polazeći od amfifilnog molekula II-4, koji ima formulu:

Isto tako poželjno, polimerizovane micele se sastoje od polimerizovanih amfifilnih molekula dobijenih polazeći od amfifilnog molekula II-23, koji ima formulu:

Korisno, polimerizovane micele u skladu sa pronalaskom se, takođe, sastoje od polimerizovanih amfifilnih molekula koji se dobijaju polazeći od amfifilnog molekula koji ima formulu:

Polimerizovane micele se, takođe, formiraju polazeći od polimerizovanih amfifilnih molekula dobijenih polazeći od amfifilnog molekula koji ima formulu:

Poželjno, polimerizovane micele u skladu sa pronalaskom se sastoje od polimerizovanih amfifilnih molekula koji se dobijaju polazeći od amfifilnog molekula koji ima formulu:

Poželjno, polimerizovane micele se formiraju polazeći od polimerizovanih amfifilnih molekula dobijenih polazeći od amfifilnog molekula koji ima formulu:

Korisno, polimerizovane micele u skladu sa pronalaskom se sastoje od polimerizovanih amfifilnih molekula koji se dobijaju polazeći od amfifilnog molekula koji ima formulu:

Ovaj pronalazak, takođe, za predmet ima postupak izrade smeša koje su u skladu sa pronalaskom, a koji se karakteriše sledećim:

(Base = baza; ou = ili; avec = sa; tête polaire = polarna glava, prim. prev. ).

Pronalazak se, isto tako, odnosi na farmaceutske smeše koje sadrže polimerizovane micele, koje su u skladu sa pronalaskom. Korisno, ove farmaceutske smeše sadrže jednu ili više farmaceutski prihvatljivih podloga, tj., jedan ili više vehikuluma ili podloga koje su inertne, nisu otrovne i koje su odgovarajuće.

Što se tiče farmaceutski prihvatljivih podloga, mogu se bez namere ograničavanja, navesti: sredstva za vezivanje, razblaživači, sredstva za oslobađanje, stabilizatori, konzervansi, sredstva za podmazivanje, mirisi, arome ili zaslađivači.

Od farmaceutskih smeša koje su u skladu sa pronalaskom, mogu se naročito istaći one koje su pogodne za primenjivanje oralnim putem, parenteralnim i pre svega intravenskim, per ili transkutanim, nazalnim, rektalnim, perlingvalnim,

okularnim, respiratornim i preciznije, jednostavne pilule ili dražeje, sublingvalne pilule, želatinske kapsule, glosete, kapsule, tablete, injektabilni preparati, aerosoli, kapi za oči ili nos, supozitorije, kreme, masti ili kožni gelovi.

Put primenjivanja koji ima prednost jeste intravenski i farmaceutske smeše koje su odgovarajuće mogu omogućiti trenutno oslobađanje ili odloženo oslobađanje aktivnih principa.

Ovaj pronalazak je, takođe, usmeren na korišćenje polimerizovanih micela koje su u skladu sa pronalaskom, kao vektora hidrofobnih molekula. Pronalazak se, isto tako, odnosi na upotrebu polimerizovanih micela kao vektora hidrofobnih aktivnih principa.

Pod „vektorom" se podrazumeva ceo molekul ili skup molekula koji može prenositi aktivni princip, protein ili nukleinsku kiselinu prema njegovom mestu dejstva putem ciljanja specifičnih figanada ili pasivnim načinom, putem rastvaranja ili stabilizacije vrste koja je u pitanju.

Pod „aktivnim principom" se podrazumeva ukupni molekul, protein ili nukleinska kiselina koji imaju terapeutski efekat.

Razvijeni su različiti postupci inkluzije aktivnih principa kako bi se optimizirala veličina inkluzije ili inkorporacije u polimerizovane micele. Postupci inkluzije, koji su u skladu sa pronalaskom su:

- postupak „vorteksa" koji se sastoji u inkluziji putem mešanja vodenog rastvora polimerizovanih micela i aktivnog principa u praškastom stanju na vorteksu, u toku otprilike 30 minuta;

- postupak „vorteks/ozvučivanje" koji se sastoji u inkluziji putem mešanja na vorteksu u kombinaciji sa ciklusima ozvučivanja vodenog rastvora polimerizovanih micela i aktivnog principa u praškastom stanju, u toku otprilike 2 sata;

- postupak „mešanja na 20°C“ koji se sastoji od inkluzije putem magnetnog mešanja vodenog rastvora polimerizovanih micela i aktivnog principa u praškastom stanju, na temperaturi sredine, u toku otprilike 12 sati;

- postupak „mešanja na 50°C“, koji se sastoji od inkluzije putem magnetnog mešanja vodenog rastvora polimerizovanih micela i aktivnog principa koji je u vidu praškaste materije na 50°C, tokom otprilike 12 sati;

- postupak „uparavanja DCM", koji se sastoji od inkluzije dodavanjem aktivnog principa koji je rastvoren u dihlorometanu (DCM) u vodeni rastvor polimerizovanih micela koji se greje na oko 50°C.

Na kraju sekvence inkluzije, rastvor se filtrira da bi se uklonio višak aktivnog principa koji nije ugrađen.

Pronalazak se, pre svega, odnosi na postupak inkluzije magnetnim mešanjem rastvora polimerizovanih micela i aktivnog principa tokom 12 sati, na 50°C. Inkluzija aktivnog principa u polimerizovane micele se kontroliše energijom mešanja i temperaturom. Veličina ugrađivanja se poboljšava energičnijim mešanjem, dužim kontaktom i višom temperaturom.

Poželjno, micelarni rastvori koji su dobijeni na završetku etape inkluzije se sterilišu, filtracijom kroz filtre od 0. 22 μm, imajući u vidu intravenoznu injekciju bez gubitaka u koncentraciji aktivnog principa.

Ispitivanje inkluzije izvedeno na micelama dokazuje efekat polimerizacije micela na kapacitet inkorporacije aktivnog principa. Micele se podvrgavaju polimerizovanju kako bi nanovektor imao kapacitet za inkluziju veoma važne količine aktivnog principa. Veličina inkorporacije S39625 od 48% se dobija za transporter, ili se postiže 5 puta veća veličina sa formulacijom nanoprstenova.

Ispitivanje inkluzije izvedeno za različite aktivne principe potvrđuje sposobnost nanovektora da solubilizuje različite vrste hidrofobnih molekula uz visok udeo inkluzije. Predmet je ostvaren na referentnom molekulu, paklitakselu, sa dozvolom poređenja vrednosti veličine inkorporacije sa onima iz literature. Polimerizovane micele amfifila II-4 omogućavaju ugrađivanje paklitaksela u veličini inkluzije od 33%. U literaturi, veličine inkluzije paklitaksela su između 6, 7% i 14, 3% postignute sa različitim vrstama vezikula, veličine inkorporacije između 0, 2% i 27% sa nanočesticama i veličine inkluzije između 0, 2% i 25% sa polimerizovanim micelama. Polimerizovane micele se zato predstavljaju kao nanovektor sa mogućnostima značajne solubilizacije koja omogućava rastvaranje aktivnih principa sa različitim strukturama i molekulskim težinama.

Ovaj pronalazak donosi postupak za dobijanje polimerizovanih micela u skladu sa pronalaskom. Ovaj postupak dobijanja obuhvata sledeće etape:

- lipidne smeše za polimerizaciju u skladu sa pronalaskom se samo organizuju u sferne micele;

- auto-organizovane sferne micele se polimerizuju.

Pod,, auto-organizovanjem“ amfifilnih molekula se podrazumeva spontana organizacija amfifilnih molekula u sferne micele u vodenoj sredini pri koncentraciji koja je viša od kritične micelarne koncentracije ili CMC.

Kritična micelama koncentracija amfifilnog molekula II-4, kako je gore opisan, određena je eksperimentalno i iznosi 0. 082 mg/ml. Pronalazak se, isto tako, odnosi i na postupak dobijanja polimerizovanih micela u kome je etapa polimerizacije tipa svetlosnog ozračivanja ili fotopolimerizacija.

Fotopolimerizacija je postupak polimerizacije koji je naročito dobro prilagođen za polimerizaciju diacetilenskih motiva. Fotopolimerizacija je jedan „podesan" postupak koji koristi svetlosno ozračivanje na 254 nm i nikakvo spoljašnje hemijsko sredstvo. Fotopolimerizacija diacetilenskih motiva utiče na formiranje diradikalskih intermedijera: prva etapa se sastoji od formiranja diradikalske vrste putem fotonske ekscitacije; druga etapa je reakcija širenja radikala na novi motiv koji se može polimerizovati i koji se može naći u blizini time utičući na povećavanje polimernog lanca; poslednja etapa je etapa završavanja putem kuplovanja dva radikala.

Takođe, pronalazak se odnosi na postupak dobijanja polimerizovanih micela u kome je etapa polimerizacije polimerizacija radikalskog tipa. Motivi vinila i akrilata se generalno polimerizuju putem radikalske polimerizacije. Taj način polimerizacije je poznat i lako se koristi. Otpočinjanje radikalske polimerizacije se može izvesti uz pomoć radikalskog inicijatora stvorenog termičkom disocijacijom i homolitički, reakcijom oksido-redukcije ili ozračivanjem.

Na kraju, pronalazak se, takođe, odnosi na postupak dobijanja polimerizovanih micela u kome etapa polimerizacije podrazumeva više vrsta uzastopnih polimerizacija, na primer, jednu fotopolimerizaciju i zatim jednu polimerizaciju pomoću radikalskog podsticanja.

Ovaj pronalazak je ilustrovan, bez namere ograničavanja, sledećim slikama i primerima:

Slika 1: hemijska struktura S39625;

Slika 2: postupak inkulzije S39625 u polimerizovane i ne-polimerizovane micele;

Slika 3: (1) hromatogram S39625 u acetonitrilu, (2) hromatogram micela nepolimerizovanih / polimerizovanih, (3) hromatogram S39625 obuhvaćenog nepolimerizovanim micelama, (4) hromatogram S39625 obuhvaćenog nepolimerizovanim micelama;

Slika 4; (1) hromatogram S39625 solubilizovanog u acetonitrilu, (2) hromatogram S39625 obuhvaćenog polimerizovanim micelama;

Slika 5: strukture hidrofobnih aktivnih principa (1) S44563, (2) 42909, (3) paklitaksela i (4) pirena;

Slika 6: hemijska struktura 4-amino-3-hidroksi-1-sulfonatnaftalena;

Slika 7: spektri fluorescencije 4-amino-3-hidroksi-1-sulfonatnaftalena, nanoprstenova i polimerizovanih micela funkcionalizovaih sa fluoroforom i uzorka kontrole (ekscitacija na 345 nm);

Slika 8: (A) spektri apsorbancije amina 111-9, polimerizovanih micela i polimerizovanih micela koje su funkcionalizovane sa aminom 111-9 (B) spektri fluorescencije amina III-9, polimerizovanih micela koje su funkcionalizovane sa aminom 111-9 i uzorka kontrole (ekscitacija na 280 nm).

PRIMER 1: SINTEZA AMFIFILNIH MOLEKULA II-4 I II-23

1. 1 Sinteza amfifilnog molekula 11-4

Prva etapa ove sinteze, prema šemi 1, sastoji se od pripreme hidrofilnog dela amfifilnog molekula (poreklom od nitrilotriacetatne kiseline) polazeći od N-benziloksikarbonil-L-lizina (Z-L-lizin).

Šema 1

Druga etapa sinteze prema šemi 2 se sastoji od kuplovanja hidrofilne glave 11-2 sa 10, 12-pentakosadiinoinskom kiselinom koja je prethodno aktivirana.

Šema 2

Pentakosadiinoinska kiselina je aktivirana sa N-hidroksisukcinimidom u prisustvu N-(3-dimetilaminopropil)-N -etilkarbodiimida kako bi se dobila aktivirana kiselina 11-3. Površinski-aktivni 11-4 se dobija peptidnim kuplovanjem između hidrofilne glave NTA 11-2 i aktivirane kiseline 11-3. Čist proizvod se dobija taloženjem u vodi dodatkom hlorovodonične kiseline.

1. 2 Sinteza amfifilnog molekula II-23

Amfifilni molekul 11-23 je surfaktant koji sadrži dve vrste motiva koji se mogu polimerizovati: jedan motiv je diacetilenski, koji se može polimerizovati pomoću svetlosnog obasjavanja na 254 nm, a jedan motiv je akrilatni, koji se može umrežiti putem elektronskog bombardovanja.

Prva etapa sinteze se sastoji od pripreme hidrofilnog dela amfifilnog molekula (glava NTA) polazeći od N-benziloksikarbonil-L-lizina (2-L-iizin) prema šemi 1, a zatim, zaštite karboksilnih kiselina u obliku terc-butilnih estara. Dobija se hidrofilna glava koja je zaštićena tBu-NTA, nazvana IM 4.

Druga etapa sinteze je zbirno prikazana u reakcionoj šemi 3 u nastavku:

Šema 3

PRIMER 2: IZRADA I OPIS POLIMERIZOVANIH MICELA

2. 1 Izrada polimerizovanih micela

Sferne micele su amfifilno organizovane i dobijaju se polazeći od kritične micelarne koncentracije (CMC). Ovakve organizacije sfernih oblika imaju hidrofilnu površinu i lipofilno ili hidrofobno jezgro.

Površinski aktivni II-4 je organizovan u obliku sfernih micela dok je pH vodenog rastvora veći od 10. Pri većem od pH=10, nevezani dublet tercijernog amina hidrofilnog dela površine je oslobođen dovodeći do povećavanja zapremine polarne glave, a ispod te vrednosti pH, veze vodonika se mogu učvrstiti između karboksilata i vodonika protonizovanog tercijernog amina dovodeći do umanjivanja zapremine glave NTA amfifila II-4.

Auto-skupljene i polimerizovane micele amfifila II-4 su proizvedene prema šemi 4 putem svetlosnog ozračivanja vodenog rastvora II-4 koji ima pH=12, na 254 nm i u toku 5 sati, a zatim, pH se podešava na fiziološki pH putem dijalize spram rastvora koji ima pH između 7 i 8.

Šema 4

Zapaža se da je polimerizacija putem svetlosnog ozračivanja strukture amfifila II-4 koja je u vidu micelarnog oblika, jedan proces relativno spor i da konverzija celokupnog amfifila II-4 u polidiacetilenski dostiže polimerizaciona vremena i preko 5 sati.

2. 2 Opis polimerizovanih micela

Analiza polimerizovanih micela amfifila II-4 je ostvarena granulometarskim laserom. Ova tehnika se zasniva na kvazi elastičnoj difuziji svetlosti i spektroskopiji korelacije ukrštanja fotona što omogućava određivanje veličine raspodele u uzorku.

Analiza intenziteta u uzorku polimerizovanih micela od 50 mg/ml, pomoću aparata Nanophox, pokazuje jedan glavni pik za populaciju na 4, 9 nm. Analiza broja u uzorku polimerizovanih micela od 1 mg/ml, pomoću aparata Malvem Zetasizer, pokazuje prisustvo jedinstvene populacije na 5, 1 nm.

Polimerizacija micela indukuje jedan fenomen kontrakcije micela, koji se može objasniti time što polimerizacija zgušnjava skup amfifila i ograničava fenomen povećavanja zapremine.

PRIMER 3: INKLUZIJA S39625 U U POLIMERIZOVANE MICELE I U NE-POLIMERIZOVANE MICELE

3. 1 Postupak inkluzije S39625

S39625je inkapsuliran u rastvoru od 10 mg/ml ne-polimerizovanih micela i polimerizovanih micela putem postupka „mešanja i grejanja na 50°C“, kako je pojašnjeno u Opisu i predstavljeno na Slici 2.

3. 2 Određivanje veličine inkluzije S39625 pomoću HPLC

Veličina inkluzije S39625 je određena pomoću HPLC metode na inverznoj fazi. Ova tehnika se zasniva na razlici u interakciji molekula između mobilne faze i stacionarne faze. Ova razlika se odražava na retenciona vremena ovih molekula. Za date HPLC uslove, jedan isti molekul uvek ima ista retenciona vremena. Uslovi za HPLC na inverznoj fazi za određivanje veličine inkluzije S39625 su bili: kolona silike dodate RP-180 kao stacionarna faza i gradijent vode i acetonitrila od 5% do 100% kao mobilna faza. Detekcija S39625 na izlasku iz kolone je ostvarena UV detektorom na talasnoj dužini od 385 nm. Obrazac krive S39625 u acetonitrilu je dobijen putem inverzne HPLC. Pod tim HPLC uslovima, aktivni princip S39625 je imao retenciono vreme od 25, 8 minuta.

Retenciona vremena S39625 koji je inkapsuliran u polimerizovanim micelama je, takođe, određen pomoću HPLC na inverznoj fazi pri čemu je gradijent rastvarača zamenjen izokratskim režimom sa čistim acetonitrilom. Acetonitril je jedan od boljih rastvarača za S39625 i njegova upotreba kao eluanta omogućava osigurani veoma brzi prolazak aktivnog principa i njegovu eluaciju kao slobodnog entiteta.

3. 3 Rezultati veličine inkluzije za S39625

Rezultati inkorporacije S39625 su izračunati polazeći od Slike 3.

Hromatogram za S39625 koji se uključio u ne-polimerizovane micele ima tri pika na 3, 2 minuta, 25, 8 minuta i 31, 9 minuta. Prema površini pika na 25, 8 minuta, inkorporacija aktivnog principa u ne-polimerizovane micele je iznosila između 1, 7 i 3, 3%.

Hromatogram za S39625 koji se uključio u polimerizovane micele ima široki pik u neznatnom retencionom vremenu. Ovo izražajno smanjenje retencionog vremena dokazuje, sa jedne strane, da je hidrofobnost S39625 snažno maskirana izrazito hidrofilnom površinom polimerizovanih micela i, sa druge strane, da je asocijacija S39625/polimerizovane micele posebno izdržljiva.

Hromatogram za S39625 koji je rastvoren u acetonitrilu ima pik na 5, 2 minuta dok S39625 obuhvaćen u polimerizovane micele ima dva pika na 4, 0 i na 4, 9 minuta. Veličina inkluzije S39625 u polimerizovanim micelama i količina njihovih degradacionih proizvoda je izmerena integrisanjem dva pika. Tako je veličina inkorporacije ovih molekula u polimerizovane micele 48%. Za jednu koncentraciju jednakog amfifila (10 mg/ml), rastvorljivost i, prema tome, kapacitet inkapsuliranja polimerizovanih micela se poboljšava sa faktorom 5 u odnosu na nanoprstenove i sa faktorom 13 u odnosu na ne-polimerizovane micele.

PRIMER 4: INKLUZIJA HIDROFOBNIH AKTIVNIH PRINCIPA U POLIMERIZOVANE MICELE

Testovi inkluzije su izvedeni na hidrofobnim aktivnim principima S42909, S44563, paklitakselu jednom referentnom hidrofobnom aktivnom molekulu i pirenu jednom izrazito hidrofobnom molekulu. Hemijske formule ovih hidrofobnih aktivnih principa su predstavljene na Slici 5. Inkluzija ovih aktivnih principa je izvedena sa rastvorima polimerizovanih micela pri 10 mg/ml pomoću postupka grejanja na 50°C u toku 12 sati.

Skup rezultata u Tabeli 1 pokazuje snažnu inkorporaciju hidrofobnih molekula u polimerizovane micele sa vrednostima inkluzije većim od 24% i povećanjem rastvorljivosti aktivnih principa u vodi od 30 000 do 500 000.

PRIMER 5: FUNKCIONALIZACIJA POLIMERIZOVANIH MICELA

5. 1 Funkcionalizacija pomoću 4-amino-3-hidroksi-sulfonatnaftalena

Polimerizovane micele su funkcionalizovane pomoću hidrofilnog fluorofora, 4-amino-3-hidroksi-sulfonatnaftalena, što je opisano na Slici 6. Ovaj fluorofor ima talasnu dužinu ekscitacije na 340 nm i talasnu dužinu emisije na 455 nm.

Kačenje fluorofora se izvodi peptidnim kuplovanjem u vodi, pri baznom pH (pH=12) sa dicikloheksilkarbodiimidom (DCC), kao sredstvom za kuplovanje. Ovo kalemljenje se realizuje u velikom višku fluorofora (50 ekvivalenata) i sredstva za kuplovanje (100 ekvivalenata) i, uzorci se prečišćavaju pomoću kolone za isključivanje prema veličini.

Funkcionalizovanje polimerizovanih micela je praćeno fluorescentnom spektroskopijom kako bi se dokazalo kalemljenje fluorofora na površinu nanovektora. Spektri fluorescencije funkcionalizovanih polimerizovanih micela pokazuju razvoj pika fluorescencije 4-amino-3-hidroksi-sulfonatnaftalena sa pomakom krive fluorescencije na 492 nm (Slika 7). Kontrola pokazuje da pomak fluorescencije polimerizovanih micela protiče od kovalentno nakalemljenog fluorofora na površini nanovektora.

5. 2 Funkcionalizacija pomoću folne kiseline

Na površini kanceroznih ćelija se eksprimuje receptor za folat, te se folna kiselina uveliko koristi za specifično ciljanje kanceroznih ćelija u mozgu, bubregu, dojci, jajnicima i plućima.

Za ostvarivanje koraka kuplovanja folne kiseline za polimerizovane micele, folna kiselina se modifikuje u smislu uvođenja aminske funkcionalne grupe koja omogućava kalemljenje. Kuplovanje aminskog derivata folne kiseline 111-9 za površinu polimerizovanih micela se ostvaruje peptidnim kuplovanjem u vodi sa baznim pH (pH=12) i sa DCC kao sredstvom za kuplovanje. Ovo kalemljenje se realizuje u velikom višku amina folne kiseline (50 ekvivalenata) i sredstva za kuplovanje (100 ekvivalenata). Uzorci se prečišćavaju filtracijom, a zatim, pomoću kolone za isključivanje prema veličini.

Apsorpcioni spektri na Slici 8 pokazuju da je aminski derivat folne kiseline III-9 prisutan na površini polimerizovanih micela na šta ukazuje prisustvo pika na 285 nm. Spektri fluorescencije funkcionalizovanih polimerizovanih micela pokazuju razvoj pikova fluorescencije aminskog derivata folne kiseline na 360 nm i 450 nm.

5. 3 Funkcionalizovanje pomoću PEG-a

Moguće fagocitovanje micela manometrijske veličine koje su u skladu sa pronalaskom, od strane makrofaga se može izbeći kalemljenjem lanaca PEG-a ili PoliEtilenGlikola na ove micele. Prisustvo PEG-a na površini micela proizvodi jedan inertni spoljašnji sloj koji sprečava adheziju opsonina, te na taj način čini navedene micele nevidljive za makrofage i tako povećava njihovo vreme u cirkulaciji u krvotoku.

Kuplovanje metoksiPEG-amina 5000 za površinu polimerizovanih micela se izvodi pri pH 12 sa DCC kao sredstvom za kuplovanje. Ovo kalemljenje se realizuje u velikom višku derivata PEG-a (25 ekvivalenata) i sredstva za kuplovanje (100 ekvivalenata). Derivatizovane micele se prečišćavaju putem filtracije i zatim, pomoću kolone za isključivanje prema veličini.

PRIMER 6: TOKSIKOLOŠKO ISPITIVANJE POLIMERIZOVANIH MICELA

Raspodela polimerizovanih micela u organizmu je osnovni parametar testiranja da bi se odredio način izlučivanja i način nagomilavanja navedenih polimerizovanih micela.

Da bi se izvelo ovo ispitivanje, amfifilni 11-4 se radio-obeleži na ugljeniku 14 da bi se sintetisala radio-obeležena polimerizovana micela za ispitivanje praćenja putem autoradiografije na pacovima. Radiomarkirani amfifil na ugljeniku 14 se dobija sa specifičnom aktivnošću od 7. 6 μCi/mg. Primenjivanje polimerizovanih micela kod pacova se ostvaruje u dozi od 4 MBq/kg i 100 mg/kg u jednoj zapremini za primenjivanje od 2. 5 ml/kg. Tako, neophodan je rastvor od 40 mg/ml sa specifičnom aktivnošću od 7. 6 μCi/mg.

Ispitivanje nakupljanja/izlučivanja polimerizovanih micela radio-obeleženih na ugljeniku 14 je sprovedeno na 3 mužjaka pacova Wistar vrste. Svakom od pacova je primenjena jedinstvena doza od 100 mg/kg [14C] polimerizovanih micela intravenoznim putem (bolusom) i, životinje su podvrgnute eutanaziji u 10. minutu, 24. satu i 48. satu. Urini pacova, 24-časovni i 48-časovni, sakupljaju se kako bi se u njima izmerila aktivnost pomoću scintilacione tečnosti. Određivanje nivoa radioaktivnosti u tkivima se izvodi radioluminografijom specifičnih isečaka pacova, koji se dobijaju pomoću kriomikrotoma.

Analiza 10-minutnih radioluminograma kod pacova, tj., pacova koji su podvrgnuti eutanaziji u 10. minutu, otkriva generalizovanu raspodelu radioaktivnosti u telima pacova kao posledicu povišene koncentracije polimerizovanih micela u krvi. Povišeni nivoi radioaktivnosti se detektuju u izvesnim tkivima kao što su: plućno, tkivo bubrega i njihovih srži, jetre, adrenalnih žlezda ili slezine.

Analiza 24-časovnih i 48-časovnih radioluminograma kod pacova, tj., pacova koji su podvrgnuti eutanaziji u 24. odnosno 48. satu, pokazuje povišenu koncentraciju radioaktivnosti u: jetri, unutrašnjem zidu creva, slezini, adrenalnim žlezdama, bubrezima i kostnoj srži.

Claims (19)

1.Polimerizovane micele, naznačene time što sadrže polimerizovane amfifilne molekule dobijene polazeći od amfifilnih molekula opšte formule A-X-B-L-Z u kojoj A predstavlja ili CH2=CH- ili CH2=CH-C6H4-, n i m su, isti ili različiti, celi brojevi od 1 do 16; gde X predstavlja CO-NH ili NH-CO ili jednu vezu, X je veza kada je B jedna veza i kada je L jedna veza; gde B predstavlja ili -CH=CH-C6H4- ili jednu vezu, n i m su, isti ili različiti, ćeli brojevi od 1 do 16; gde L predstavlja -(CH2)rCH[NH-CO-A']- ili jednu vezu, r je između 1 i 16 i, A' predstavlja A; gde Z predstavlja ili s je ceo broj od 1 do 16 i R2 predstavlja COOH ili SO3H ili OSO3H ili 0P03H2 ili OPO2H2 i R1 predstavlja H ili radikal COOH ili S03H ili 0S03H ili 0P03H2 ili 0P02H2 ili grupu -CO-NH-(CH2)t-CH3, t je ceo broj od 1 do 16, ili Z je moguće, isto tako, neutralna polarna hidrofilna glava, tipa šećera ili polisaharida, kao i njihove adicione soli sa farmaceutski prihvatljivom kiselinom ili bazom.

2.Polimerizovane micele, prema zahtevu 1, naznačene time što sadrže polimerizovane amfifilne molekule dobijene polazeći od amfifilnih molekula opšte formule: A-X-B-L-Z gde A predstavlja n i m, isti ili različiti, jesu ćeli brojevi od 1 do 16; gde X predstavlja CO-NH ili NH-CO ili jednu vezu, X je veza kada je B jedna veza i kada je L jedna veza; gde B predstavlja ili jednu vezu, n i m su, isti ili različiti, celi brojevi od 1 do 16; gde L predstavlja -(CH2)rCH[NH-CO-A']- ili jednu vezu, r je ceo broj od 1 do 16 i A' predstavlja A ili CH2=CH- ili CH2=CH-C6H4-; gde Z predstavlja ili s je ceo broj od 1 do 16, sa R1 koji predstavlja H ili radikal COOH ili grupu -CO-NH-(CH2)t-CH3, t je ceo broj od 1 do 16, ili Z može isto tako biti neutralna hidrofilna polarna glava, tipa šećera ili polisaharida, kao i njihove adicione soli sa farmaceutski prihvatljivom kiselinom ili bazom.

3. Polimerizovane micele, prema jednom od zahteva 1 do 2, naznačene time što je polama glava Z funkcionalizovana.

4. Polimerizovane micele, prema zahtevu 3, naznačene time što je polarna glava Z funkcionalizovana sa folnom kiselinom.

5. Polimerizovane micele, prema ma kom od zahteva 1 do 4, naznačene time što one sadrže jedno ili više hidrofobnih jedinjenja.

6. Polimerizovane micele, prema ma kom od zahteva 1 do 5, naznačene time što se polimerizovani amfifilni molekuli dobijaju polazeći od amfifilnog molekula II-4, koji ima formulu:

7. Polimerizovane micele, prema ma kom od zahteva 1 do 5, naznačene time što se polimerizovani amfifilni molekuli dobijaju polazeći od amfifilnog molekula II-23, koji ima formulu:

8. Polimerizovane micele, prema ma kom od zahteva 1 do 5, naznačene time što se polimerizovani amfifilni molekuli dobijaju polazeći od amfifilnog molekula koji ima formulu:

9. Polimerizovane micele, prema ma kom od zahteva 1 do 5, naznačene time što se polimerizovani amfifilni molekuli dobijaju polazeći od amfifilnog molekula koji ima formulu:

10. Polimerizovane micele, prema ma kom od zahteva 1 do 5, naznačene time što se polimerizovani amfifilni molekuli dobijaju polazeći od amfifilnog molekula koji ima formulu:

11. Polimerizovane micele, prema ma kom od zahteva 1 do 5, naznačene time što se polimerizovani amfifilni molekuli dobijaju polazeći od amfifilnog molekula koji ima formulu:

12. Polimerizovane micele, prema ma kom od zahteva 1 do 5, naznačene time što se polimerizovani amfifilni molekuli dobijaju polazeći od amfifilnog molekula koji ima formulu:

13. Smeša, naznačena time što sadrži polimerizovane micele, prema ma kom od zahteva 1 do 12.

14. Smeša, prema zahtevu 13, naznačena time što sadrži jednu ili više farmaceutskih podloga.

15. Upotreba polimerizovanih micela, prema ma kom od zahteva 1 do 12, kao vektora hidrofobnih molekula.

16. Upotreba polimerizovanih micela, prema zahtevu 15, naznačena time što su hidrofobni molekuli hidrofobni aktivni sastojci.

17. Postupak za dobijanje polimerizovanih micela, prema ma kom od zahteva 1 do 12, naznačen time što obuhvata sledeće korake: -    amfifilna jedinjenja koja su za polimerizovanje, kao u patentnim zahtevima 1 do 12, samo se organizuju u sferne micele; -    auto-organizovane sferne micele se polimerizuju.

18. Postupak, prema zahtevu 17, naznačen time što su samo-organizovane sferne micele fotopolimerizovane.

19. Postupak, prema zahtevu 17, naznačen time što su samo-organizovane sferne micele polimerizovane polimerizacijom sa slobodnim radikalom.