ME00426B - Liječenje autoimunih bolesti kod pacijenata sa neadekvatnim odgovorom na tnf-alfa inhibitor - Google Patents

Abstract

Sadašnja prijava opisuje terapiju sa antagonistom koji se vezuje za površinske markere B ćelije, kao što je CD20. Posebno, prijava opisuje upotrebu takvih antagonista da se leči autoimuna bolest kod sisara koji doživljava neadekvatan odgovor na TNF-α inhibitor.

Description

Oblast pronalaska

Sadašnji pronalazak se odnosi na lečenje sa antagonistima koji vezuju markere B ćelijske površine, kao što je CD20. Posebno, pronalazak se odnosi na upotrebu takvih antagonista za lečenje autoimune bolesti kod sisara koji doživljavaju neadekvatni odgovor na TNFa-inhibitor.

Stanje tehnike

Limfociti su jedan od mnogih tipova belih krvnih zrnaca proizvedenih u koštanoj srži tokom postupka hematopoeze. Postoje dve glavne populacije limfocita: B limfociti (B ćelije) i T limfociti (T ćelije). Limfociti koji su ovde od posebnog interesa su B ćelije.

B ćelije sazrevaju u koštanoj srži i napuštaju srž eksprimujući antigen- vezujuće antitelo na njihovoj ćelijskoj površini. Kada se prirodna B ćelija prvo susretne sa antigenom za koji je njeno membranom ograničeno antitelo* specifično, ćelija počinje da se brzo deli i njen progen se diferencira u

memoriji B ćelija i efektor ćelija koje se nazivaju "plazma ćelije". Memorijske B ćelije imaju duži vek trajanja i nastavljaju da eksprimuju za membranu vezano antitelo sa istom specifičnošću kao i originalne matične ćelije. Plazma ćelije ne proizvode za membranu vezano antitelo već umesto toga proizvode antitelo u obliku koji se može izlučivati. Antitela koja se izlučuju su glavni molekul efektor humoralnog imuniteta.

CD20 antigen (koji se takođe naziva humani B-limfocit-ograničen antigen diferencijacije, Bp35) je hidrofobni protein transmembrane sa molekularnom težinom od otprilike 35 kD lociran na pred-B i zrelim B limfocitima (Valentine et al. J. Biol. Chem. 264(19): 11282-11287 (1989); i Einfeld et al. EMBO J. 7(3): 711-717 (1988)). Antigen se takođe eksprimuje na više od 90% B ćelija ne-Hodgkin-ovih limfoma (NHL) (Anderson et al. Blood 63(6): 1424-1433 (1984)), ali nije pronađen na hematopoetičnim stem ćelijama, pro-B ćelijama, normalnim plazma ćelijama ili drugim normalnim tkivima (Tedder et al. J. Immunol. 135(2):973-979 (1985)). CD20 reguliše raniji(e) korak(e) u postupku aktiviranja radi iniciranja ćelijskog ciklusa i diferencijacije (Tedder et al., supra) i moguće je da funkcioniše kao kanal kalcijpvog jona (Tedder et al., J. Cell. Biochem. 14D: 195 (1990)).

Imajući u vidu ekspresiju CD20 u limfome B ćelije, ovaj antigen može da služi kao kandidat za "ciljanje" takvih limfoma. U suštini, takvo ciljanje može se generalizovati na sledeći način: antitela specifična za CD20 površinski antigen B ćelija se daje pacijentu. Ova anti-CD20 antitela se specifično vezuju za CD20 antigen (prividno) i normalnih i malignih B ćelija; antitelo vezano za CD20 površinski antigen može voditi do destrukcije i smanjivanja količine neoplastičnih B ćelija. Dodatno, hemijski agensi ili radioaktivne oznake koje imaju potencijal da unište tumor mogu biti konjugovani sa anti-CD20 antitelom na takav način da se agens specifično "isporučuje" neoplastičnim B ćelijama. Bez obzira na pristup, primami cilj je da se uništi tumor; specifični pristup može se utvrditi određenim anti-CD20 antitelom koje se iskorištava i, tako, raspoloživi pristupi ciljanja CD20 antigena mogu da se značajno razlikuju.

CD 19 je sledeći antigen koji se eksprimuje na površini ćelija B roda. Kao i CD20, CD19 je pronađen na ćelijama kroz diferencijaciju roda faze stem ćelije sve do tačke neposredno pre krajnje diferencijacije u plazma ćelije (Nadler, L. Lymphocyte Typing II2: 3-37 i Appendix, Renling et al. Eds. (1986) by Springer Verlag). Za razliku od CD20, ipak antitelo koje se vezuje za CD 19 izaziva intemalizaciju CD 19 antigena. CD 19 antigen se identifikuje sa HD237-CD19 antitelom (koje se takođe naziva "B4" antitelo) (Kiesel et al. Leukemia Research II, 12: 1119 (1987)), između ostalih.

CD 19 antigen je prisutan na 4-8% perifernih krvnih mononukleamih ćelija i na više od 905 B ćelija izolovanih iz periferne krvi, slezine, limfnog čvora ili krajnika. CD 19 nije primećen na perifernim krvnim T ćelijama, monocitima ili granulocitima. Praktično sve ne-T ćelijske akutne limfoblastične leukemije (ALL), B ćelijske hronične limfocitne leukemije (CLL) i B ćelijski limfomi eksprimuju CD19 koji se može opaziti antitelom B4 (Nadler et al. J. Immunol. 131:244 (1983); i Nadler et al. In Progress in Hematology Vol. XII pp. 187-206. Brown, E. ed. (1981) od Grune & Stratton, Ine).

Identifikovana su dodatna antitela koja prepoznaju za fazu diferencijacije specifične antigene ekspresovane od strane ćelija B ćelijskog roda. Među njima su B2 antitelo usmereno spram CD21 antigena; B3 antitelo usmereno spram CD22 antigena; i J5 antitelo usmereno spram CD 10 antigena (koje se takođe naziva CALLA). Videti US patent br. 5,595,721 izdat 21. januara 1997.godine (Kaminski et al.).

Rituksimab (RITUXAN®) antitelo je himemo mišje/humano monoklonalno antitelo dobij eno genetičkim inženjeringom usmereno spram CD20 antigena. Rituksimab je antitelo koje se naziva "C2B8" u US patentu br. 5,736,137 izdatom 7. aprila 1998.godine (Anderson et al.). RITUXAN® je naznačen za lečenje pacijenata, sa povraćenim ili teško izlečivim niskog stepena ili folikulamim, CD20 pozitivnim, B ćelijskim ne-Hodgin-ovim limfomom. Studije in vitro mehanizma dejstva demonstriraju da RITUXAN® vezuje humani komplement i lizuje limfoid B ćelijske linije kroz dopunjenu-zavisnu citotoksičnost (CDC) (Reff et al. Blood 83(2):435-445 (1994)). Dodatno, ima značajnu aktivnost u ogledima za od antitela zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADCC). U skorije vreme, za RITUXAN® je pokazano da ima anti-proliferativna dejstva u ogledima inkorporacije timidina na koju se deluje tritijumom i da izaziva direktno apoptozu, dok druga anti-CD19 i CD20 antitela to ne čine (Maloney et al. Blood 88(10): 637a (1996)). Sinergija između RITUXAN®-a i hemoterapija i toksina je takođe eksperimentalno primećena. Posebno, RITUXAN® čini osetljivim na lek otporne humane ćelijske linije limfoma B ćelije na citotoksične efekte doksorubicina, CDDP, VP-16, difteriju toksina i ricina (Demidem et al. Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3): 177-186 (1997)). Predkliničke studije in vivo pokazuju pokazuju da RITUXAN® smanjuje količinu B ćelija iz periferne krvi, limfnih čvorova, i koštane srži

cynomoIgus majmuna, pretpostavljeno kroz dopunjene i ćelijski posredovane postupke (Reff et al. Blood 83(2):435-445 (1994)).

Patenti i patentne publikacije koje se tiču CD20 antitela uključuju US patent br. 5,776,456, 5,736,137, 6,399,061, i 5,843,439, kao i US patentne prijave br. US 2002/0197255Al i US 2003/0021781 Al (Anderson et al.); US patent br. 6,455,043B1 i W000/09160 (Grillo-Lopez, A.); WOOO/27428 (Grillo- Lopez i White); WOOO/27433 (Grillo-Lopez i Leonard); WOOO/44788 (Braslawsky et al.); W001/10462 (Rastetter, W.); WO01/10461 (Rastetter i White); W001/10460 (White i Grillo-Lopez); US prijava br. US2002/0006404 i W002/04021 (Hanna i Hariharan); US prijava br. US2002/0012665 Al i WO01/74388 (Hanna, N.); US prijava br. US2002/0009444A1, i W001/80884 (Grillo-Lopez, A.); WO01/97858 (White, C.); US prijava br. US2002/0128488A1 i W002/34790 (Reff, M.); W002/060955 (Braslawsky et al.); WO2/096948 (Braslawsky et al.); WO02/079255 (Reff i Davies); US Patent br. 6,171,586B1, i W098/56418 (Lam et al.); W098/58964 (Raju, S.); W099/22764 (Raju, S.); W099/51642, US Patent br. 6,194,551B1, US Patent br. 6,242,195B1, US Patent br. 6,582,624B1 i US Patent Br. 6,538,124 (Idusogie et al.); W000/42072 (Presta, L.); WOOO/67796 (Curd et al.); WO01/03734 (Grillo- Lopez et al.); US prijava br. US 2002/0004587A1 i WO01/77342 (Miller i Presta); US prijava br. US2002/0197256 (Grewal, I.); US Patent br. 6,090,365B1, 6,287,537B1, 6,015,542, 5,843,398 i 5,595,721, (Kaminski et al.); US Patent br. 5,500,362, 5,677,180, 5,721,108, i 6,120,767 (Robinson et al.); US Patent br. 6,410,391B1 (Raubitschek et al.); US Patent br. 6,224,866B1 i W000/20864 (Barbara-Guillem, E.); WO01/13945 (Barbera- Guillem, E.); WOOO/67795 (Goldenberg); WOOO/74718 (Goldenberg i

Hansen); WO00/76542 (Golay et al.); WO01/72333 (Wolin i Rosenblatt); US Patent br. 6,368,596B1 (Ghetie et al.); US Prijava br.

US2002/0041847A1, (Goldenberg, D.); US Prijava br. US2003/0026801A1 (Weiner i Hartmann); W002/102312 (Engleman, E.), od kojih je svaka izričito ovde inkorporisana puteni reference. Videti, takođe, US Patent br. 5,849,898 i EP prijava br. 330,191 (Seed et al.); US Patent br. 4,861,579 i EP332,865A2 (Meyer i Weiss); i W095/03770 (Bhat et al.).

Publikacije koje se tiču terapije sa Rituksimabom uključuju: Perotta and Abuel "Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to Rituximab" Abstract # 3360 Blood 10(1 )(part 1-2): p. 88B (1998); Stashi et al. "Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody treatment for adults with chronic idopathic thrombocytopenic purpura" Blood 98(4):952- 957 (2001); Mathevvs, R. "Medical Heretics" New Scientist (7 April, 2001); Leandro et al. "Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion" Ann Rheum Dis 61:833-888 (2002); Leandro et al. "Lymphocyte depletion in thrumatoid arthritis: early evidence for safety, efflcacy and dose response." Arthritis and Rheumatism 44(9): S370 (2001); Leandro et al. "An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus", Arthritis & Rheumatism 46(l):2673-2577 (2002); Edwards and Cambridge "Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes" Rheumatology 40:205-211 (2001); Edvvards et al. "B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders" Biochem. Soc. Trans. 30(4): 824-828 (2002); Edvvards et al. "Efficacy and safety of Rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: A randomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis." Arthritis and

Rheumatism 46(9): S197 (2002); Levine and Pestronk "IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using Rituximab"

Neurology 52: 1701-1704 (1999); De Vita et al. "Efficacy of selective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis" Arthritis & Rheumatism 46:2029-2033 (2002); Hidashida et al. "Treatment of DMARD-Reffactory rheumatoid arthritis with rituximab." Predstavljena na Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orleans, LA 2002; Tuscano, J. "Successful treatment of Infliximab- reffactory rheumatoid arthritis with rituximab" Predstavljena na Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29;

New Orleans, LA 2002.

Reumatoidni artritis (RA) je autoimuni poremećaj nepoznate etiologije. Najviše pacijenata sa RA pate od hroničnog toka bolesti koja, čak i sa terapijom, može rezultirati u progresivnom oštećenju zglobova, deformitetu, nesposobnosti i čak i preranoj smrti. Kao rezultat RA imamo više od 9 miliona poseta lekaru i više od 250.000 hospitalizacija na godišnjem nivou. Ciljevi RA terapije su da se spreči ili kontroliše oštećenje zglobova, spreči gubitak funkcije i umanji bol. Inicijalna terapija RA uobičajeno uključuje davanje jednog ili više od sledećih lekova: nesteroidnih antiinflamatomih lekova (NSAID-ovi), glukokortikoidi (putem zajedničkog ubrizgavanja), prednison niske doze. Videti "Guidelines for the management of rheumatoid arthritis "Arthritis & Rheumatism 46(2): 328-346 (February, 2002). Većina pacijenata sa u skorije vreme dijagnostikovanim RA su započeli sa terapijom antireumatskim lekom koji modifikuje bolest (DMARD) u okviru 3 meseca • od dijagnoze. DMARD-ovi koji se uobičajeno upotrebljavaju kod RA su hidroksiklorohin, sulfasalazin, metotreksat, leflunomid, etanercept, infliksimab (plus oralni i potkožni metotreksat), azatioprin, D-penicilamin, Gold (oralni), Gold (intramuskulami), minociklin, ciklosporin, Stafilokokni protein A imunoadsorpcije.

Usled toga što telo proizvodi alfa faktor nekroze tumora (TNFa) tokom RA, TNFa inhibitori se upotrebljavaju za terapiju te bolesti.

Etanercept (ENBREL®) je ubrizgavajući lek odobren u SAD za terapiju aktivnog RA. Etanercept se vezuje za TNFa i služi da se ukloni najveći broj TNFa sa zglobova i iz krvi, čime se sprečava TNFa od promovisanja zapaljenja i drugih simptoma reumatoidnog artritisa. Etanercept je "imunoadhezivni" fiizioni protein koji sadrži deo za vezivanje ekstracelulamog Uganda humanog kD (p75) receptora faktora nekroze tumora (TNFR) povezan za Fc deo humanog IgGl. Lek je povezan sa negativnim sporednim efektima uključujući ozbiljne infekcije i sepsu, poremećaje nervnog sistema kao što je multipleks skleroza (MS), Videti, n.pr.,

www.remicade-infliximab.com/pages/enbrel_embrel.html

Infliksimab, koji se prodaje pod trgovačkim imenom REMICADE®, je imuno-supresivni lek koji se propisuje za lečenje RA i Crohn-ove bolesti. Inflikismab je himemo monoklonalno antitelo koje se vezuje za TNFa i smanjuje inflamaciju u telu ciljanjem i vezivanjem za TNFa koji proizvodi inflamaciju. Infliksimab je povezan za fatalne reakcije kao što je prestanak rada srca i infekcije uključujući tuberkulozu kao i demijelinizaciju koja rezultira u MS.

U decembru 2002.godine, Abbot Laboratories su dobile FDA odobrenje da izađu na tržište se adalimumab-om (HUMIRA™), prethodno poznatim kao D2E7. Adalimumab je humano monoklonalno antitelo koje se vezuje za TNFa i odobrenje za smanjenje znakova i simptoma i inhibiciju progresije strukturalnog oštećenja kod odraslih sa blago do ozbiljno aktivnim RA koji imaju nedovoljan odgovor na jedan ili više DMARD-ova za tradicionalno modifikovanje bolesti.

Suština pronalaska

Sadašnji pronalazak obezbeđuje, u prvom aspektu, postupak lečenja autoimune bolesti kod sisara koji doživljava neadekvatan odgovor na TNFa- inhibitor, koji se sastoji od davanje sisaru terapeutski efiksane količine antagonista koji se vezuje za površinski marker B ćelije.

Na primer, pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje reumatoidnog artritisa kod sisara koji doživljavaju neadekvatni odgovor na TNFa- inhibitor, koji se sastoji od davanja sisaru terepeutski efiksane količine antitela koje se vezuje za CD20.

Pronalazak se takođe tiče postupka smanjenja rizika negativnog sporednog efekta odabranog od grupe koja sadrži infekciju, prestanak rada srca i demijelinizaciju, koji se sastoji od davanja sisaru sa autoimunom bolešću terapeutski efiksane količine antagonista koji se vezuje za površinski marker B ćelije.

I. Definicije

U ove svrhe, "alfa faktor nekroze tumora (TNFa)" se odnosi na humani TNFa molekul koji sadrži sekvencu amino kiseline kao stoje opisano kod Pennica et al., Nature, 312:721 (1984) ili Agganval et al., JBC, 260:2345 (1985).

" TNFa inhibitor" je ovde sredstvo koje inhibira, do određene mere, biološku funkciju TNFa, generalno kroz vezivanje TNFa i neutrališući njegovu aktivnost. Primeri TNF inhibitora koji su specifično ovde razmatrani su Etanercept (ENBREL®), Infliksimab (REMICADE®) i Adalimumab (HUMIRA™).

Pojam "neadekvatni odgovor na TNFa-inhibitor" se odnosi na neadekvatni odgovor na prethodni ili trenutni tretman sa TNFa-inhibitorom usled toksičnosti i/ili neadekvatne efikasnosti. Neadekvatni odgovor može proceniti kliničar koji je stručan u lečenju bolesti koja je u pitanju.

Sisar koji doživljava "toksičnost" usled prethodnog ili trenutnog tretmana sa TNFa-inhibitorom doživljava jedan ili više negativnih sporednih efekata povezanim sa tretmanom kao što su infekcija (posebno ozbiljne infekcije), kongestivni prestanak rada srca, demijelinizacija (koja vodi do multipleks

skleroze), hipersenzitivnost, neurološki događaji, autoimunitet, ne-Hodgkin- sov limfom, tuberkuloza (TB), autoantitela, itd.

Sisar koji doživljava "neadekvatnu efikasnost" nastavlja da ima aktivnu bolest nakon prethodnog ili trenutnog tretmana sa TNFa-inhibitorom. Na primer, pacijent može da ima aktivnost aktivne bolesti nakon 1 meseca ili 3 meseca terapije sa TNFa-inhibitorom.

Pod "smanjenjem rizika od negativnih sporednih efekata" se podrazumeva smanjenje rizika od sporednog efekta koji rezultira iz terapije sa antagonistom koji se vezuje za površinski marker B-ćelije u nižoj meri neko onaj koji se vidi sa terapijom sa TNFa-inhibitorom. Takvi sporedni efekti uključuju infekciju (posebno ozbiljne infekcije), prestanak rada srca, i demijelinizaciju (multipleks skleroza), itd.

"Površinski marker B-ćelije" je ovde antigen koji se eksprimuje na površini B ćelije koja može biti ciljan sa antagonistom koji se vezuje na njega. Primemi površinski markeri B ćelije uključuju CD 10, CD 19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 i CD86 površinske markere leukocita. Površinski marker B ćelije od posebnog interesa je pretpostavljeno ekspresovan na B ćelijama upoređeno sa drugim bez B ćelijama tkiva sisara i mogu biti ekspresovani na oba i prekursoru B ćelija i zrelim B ćelijama. U jednoj realizaciji, marker je jedan, kao što je to CD20 ili CD 19, koji je pronađen na B ćelijama tokom diferencijacije roda iz stem ćelijske faze do tačke neposredno pre završne

diferencijacije u ćelije plazme. Pretpostavljeni površinski markeri B ćelije su ovde CD20.

"CD20" antigen je -35kDa, ne-glikozilovani fosforoprotein pronađen na površini većoj od 90% od B ćelija iz periferne krvi ili limfoidnih organa. CD20 je ekspresovan tokom ranog pre-B ćelijskog razvoja i ostaje sve do diferencijacije ćelje plazme. CD20 je prisutan na oba i normalnoj B ćeliji kao i na malignim B ćelijama. Drugi nazivi za CD20 u literaturi uključuju "B-limfocit-ograničeni antigen" i "Bp35". CD20 antigen je opisan, na primer, u Clark et al. PNAS (USA) 82:1766 (1985).

"Autoimuna bolest" je ovde bolest ili poremećaj koji se pojavljuje od i usmeren je na sopstvena tkiva individue. Primeri autoimune bolesti ili poremećaja uključuju, ali nisu ograničene na artritis (reumatoidni artritis, mladalački reumatoidni artritis, osteoartritis, psorijatički artritis), psorijazu, dermatitis, polimiozitis/dermatomiozitis, toksičnu epidermalnu nekrolizu, sistemsku sklerodermu i sklerozu, odgovore povezane sa inflamatomom bolesti creva, Crohn-ovu bolest, ulcerativni kolitis, sindrom respiratornog bola, sindrom respiratornog bola kod odraslih (ARDS), meningitis, encefalitis, uveitis, kolitis, glomeruloneffitis, alergijska stanja, ekcem, astmu, uslove koji uključuju infiltraciju T ćelija i hronične inflamatome odgovore, aterosklerozu, autoimuni miokarditis, nedostatak adhezije leukocita, sistemski lupus eritematozus (SLE), mladalački početni dijabetis, multipleks sklerozu, alergijski encefalomijelitis, imune odgovore povezane sa akutnom ili zakasnelom hipersenzitivnošću povezanu citokinima i T- limfocitima, tuberkulozu, sakoidozu, granulomatozu uključujući Wegener- ovu granulomatozu, agranulocitozu, vaskulitis (uključujući ANCA),

aplastičnu anemiju, Diamond Blackfan anemiju, imunu hemolitičku anemiju uključujući autoimunu hemolitičnu anemiju (AIHA), ubitačnu anemiju, čistu aplaziju crvenih krvnih zrnaca (PRCA), nedostatak Faktora VII, hemofiliju A, autoimunu neutropeniju, pancitopeniju, leukopeniju, bolesti koje uključuju diapedezu leukocita, inflamatame poremećaje centralnog nervnog sistema (CNS), sindrom višestruke povrede organa, mizateniju gravis, bolesti posredovane antigen-antitelo kompleksom, bolest anti-glomerulame osnove membrane, sindrom anti-fosfolipidnog antitela, alergijski neuritis, Bechet bolest, Castleman-ov sindrom, Goodpasture-ov sindrom, Lambert- Eaton Miastenički Sindrom, Reynaud-ov sindrom, Sjorgen-ov sindrom, Stevens-Johnson sindrom, odbacivanje transplanta čvrstih organa, bolest presađenog organa spram domaćina (GVHD), bulozni pemfigoid, pemfigus, autoimune poliendokrinopatije, Reiter-ovu bolest, sindrom ukočenog čoveka, arteritis džinovske ćelije, nefritis imunog kompleksa, IgA nefropatiju, IgM polineuropatije ili sa IgM posredovana neuropatija, idiopatsku trombocitopeničnu krvavu pegu (ITP), trombotičnu trombocitopeničnu krvavu pegu (TTP), autoimunu trombocitopeniju, autoimunu bolest testisa i jajnika uključujući autoimuni orhitis i ooforitis, primami hipotiroidizam; autoimune endokrine bolesti uključujući autoimuni tiroiditis, hronični tiroiditis (Hashimoto-ov tiroiditis), subakutni tiroiditis, idiopatski hipotiroidizam, Addison-ovu bolest, Grav-ovu bolest, autoimune poliglandulame sindrome (ili sindrome poliglandulame endokrinopatije), Tip I dijabetis na koji se takođe poziva kao na od insulina zavisni dijabetis melitus (IDDM) i Sheehan-ov sindrom; autoimuni hepatitis, limfoidni interstitialni pneumonitis (HIV), bronhiolitis obliterans (bez-transplanta) spram NSIP, Guillain-Barre sindrom, vaskulitis velikog suda (uključujući polymyalgia rheumatica i (Takayas-ov) arteritis džinovske ćelije), vaskulitis srednjeg suda (uključujući Kawasaki-jevu bolest i polyarteritis nodosa), ankilozni spondilitis, Berger-ovu bolest (IgA nefropatija), rapidni progresivni glomerulonefritis, primarnu žučnu cirozu, trbušnu psilozu (gluten eneropatija), krioglobulinemiju, amiotrofnu lateralnu sklerozu (ALS), bolest srčanje arterije itd.

"Antagonist" je molekul koji, nakon vezivanja za površinski marker B ćelije, uništava ili smanjuje količinu B ćelija kod sisara i/ili remeti jednu ili više funkcija B ćelije, n.pr. smanjivanjem ili sprečavanjem humoralnog odgovora izvedenog od strane B ćelije. Antagonist je pretpostvljeno sposoban da smanji količinu B ćelija (odnosno, smanji cirkulišuće nivoe B ćelije) kod sisara koji je njime tretiran. Takvo smanjivanje količine može biti postignuto putem različitih mehanizama kao što su od antitela-zavisna ćelijom-posredovana citotoksičnost (ADCC) i/ili komplementarno zavisna citotoksičnost (CDC), inhibicija proliferacije B ćelije i/ili izazivanje smrti B ćelije (n.pr., putem apoptoze). Antagonisti koji su uključeni u okvir sadašnjeg pronalaska uključuju antitela, sintetičke ili prirodne sekvence peptida i antagoniste malih molekula koji se vezuju za marker B ćelije, opciono konjugovani ili spojeni sa citotoksičnim sredstvom. Pretpostavljeni antagonist se sastoji od antitela.

"Od antitela-zavisna ćelijom-posredovana citotoksičnost" i "ADCC" se odnose na ćelijom-posredovanu reakciju u kojima nespecifične citotoksične ćelije koje eksprimuju Fc receptore (FcR-ovi) (n.pr., ćelije prirodne ubice (NK), neutrofile, i makrofage) prepoznaju vezano antitelo za ciljanu ćeliju i potom izazivaju ližu ciljane ćelije. Primame ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelija, eksprimuju samo FcyRIII, dok monociti eksprimuju FcyRI,

FcyRII i FcyRIII. FcR ekspresija na hematopoetičnim ćelijama je data sumarno u Tabeli 3 na strani 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Da se oceni ADCC aktivnost molekula od interesa, može se izvesti in vitro ADCC ogled, kao što je onaj opisan u US Patentu br. 5,500,362 ili 5,821,337. Korisne efektor ćelije za takve oglede uključuju mononukleame ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost molekula od interesa može se proceniti in vivo, n.pr., u životinjskom modelu kao što je onaj otkriven kod Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

"Humane efektor ćelije" su leukociti koji eksprimuju jedan ili više FcR-a i obavljaju efektor funkcije. Pretpostavljeno, ćelije eksprimuju bar FcγRIII i obavljaju ADCC efektor funkciju. Primeri humanih leukocita koji posreduju ADCC uključuju mononukleame ćelije periferne krvi (PBMC), ćelije prirodne ubice (NK), monocite, citotoksične T ćelije i neutrofile; sa PBMC- ima i NK ćelijama kao pretpostavljenim.

Pojmovi Fc receptor" ili "FcR" se upotrebljavaju da opišu receptor koji se vezuje za Fc region antitela. Pretpostavljeni FcR je prirodna sekvenca humanog FcR. Šta više, pretpostavljeni FcR je onaj koji vezuje IgG antitelo (gama receptor) i uključuje receptore podklasa FcγRI, FcyRII i FcγRIII, uključujući alelične varijante i alternativno spletene oblike ovih receptora. FcγRII receptori uključuju FcγRIIA ("aktivirajući receptor") i FcγRIIB ("inhibirajući receptor"), koji imaju slične sekvence amino kiseline koje se primamo razlikuju u njihovim citoplazmičnim domenima. Aktivirajući receptor FcγRIIA sadrži imunoreceptor tirozin-bazirani aktivirajući motiv

(ITAM) u svom citoplazmičnom domenu. Inhibirajući receptor FcγRIIB sadrži imunoreceptor tirozin-bazirani inhibirajući motiv (ITIM) u svom citoplazmičnom domenu, (videti, Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Dat je pregled FcR-ova kod Ravetch and Kinet, Annu. Rev.

Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); i de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Drugi FcR-i, uključujući one koji se imaju identifikovati u budućnosti, su ovde obuhvaćeni pojmom "FcR". Pojam takođe uključuje neonatalni receptor, FcRn, koji je odgovoran za transfer materijala IgG-ova u fetus (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) i Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).

"Od komplementa zavisna citotoksičnost" ili "CDC" je odnosi na sposobnost molekula da lizuje cilj u prisustvu komplementa. Putanja aktiviranja komplementa se inicira vezivanjem prve komponente komplementarnog sistema (Clq) za molekul {n.pr., antitelo) u kompleksu sa srodnim antigenom. Da se oceni aktiviranje komplementa, može se obaviti CDC ogled, n.pr., kao što je opisano kod Gazzano-Santoro et al., J. Immuno. Methods 202:163 (1996).

"Inhibitomi antagonisti rasta" su oni koji sprečavaju ili smanjuju proliferaciju ćelije koja eksprimuje antigen za koji se antagonist vezuje. Na primer, antagonist može sprečiti ili smanjiti proliferaciju B ćelija in vitro i/ili in vivo.

Antagonisti koji "izazivaju apoptozu" su oni koji izazivaju programiranu ćelijsku smrt, n.pr. B ćelije, kao stoje to utvrđeno standardnim ogledima apoptoze, kao stoje vezivanje aneksina V, fragmentacija DNK, opadanje ćelija, proširenje endoplazmičnog retikuluma, ćelijska fragmentacija, i/ili formiranje mehurića membrane (nazvani apoptotična tela).

Pojam "antitelo" se ovde upotrebljava u najširem smislu i specifično pokriva nedirnuta monoklonalna antitela, poliklonalna antitela, multispecifična antitela (n.pr., bispecifična antitela) koja se formiraju od bar dva ćela antitela, i fragmente antitela sve dok prikazuju željenu biološku aktivnost.

"Fragmenti antitela" sadrže deo celog antitela, koji pretpostavljeno sadrži njegov antigen-vezujući ili promenjljivi region. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab', F(ab')2, i Fv fragmente; diatela; linearna antitela; molekule antitela sa jednim lancem; i multispecifična antitela formirana iz fragmenata antitela.

"Prirodna antitela" su obično heterotetramerični glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. Svaki laki lanac je povezan za teški lanac jednom kovalentnom disulfidnom vezom, dok broj disulfidnih povezivanja varira između teških lanaca različitih imunoglobulin izotipova. Svaki teški i laki lanac takođe ima redovno postavljen u prostoru intra-lanac disulfidnih mostova. Svaki teški lanac ima najednom kraju promenjljivi domen (VH) praćen brojnim konstantnim domenima. Svaki laki lanac ima promenjljivi domen najednom kraju (Vl) i konstantni domen na svom drugom kraju; konstantni domen lakog lanca je u istoj liniji sa promenjljivim domenom teškog lanca. Za određene ostatke amino kiseline se veruje da formiraju interfejs između promenljivi domena lakog lanca i teškog lanca.

Pojam "promenjljivi" se odnosi na činjenicu da se određeni delovi promenjljivih domena razlikuju ekstenzivno u sekvenci među antitelima i upotrebljavaju se u vezivanju i specifičnosti svakog određenog antitela za njegov određeni antigen. Ipak, promenjljivost nije ravnomemo distribuirana kroz sve promenjljive domene antitela. Ona je koncentrisana u tri segmenta koji se nazivaju hiperpromenjljivi regioni u promenjljivim domenima kako lakog lanca tako i teškog lanca. Više konzervisani delovi promenjljivih domena se nazivaju okvirni regioni (FR-i). Promenjljivi domeni prirodnih lakih i teških lanaca svaki sadrže četiri FR-a, uveliko prihvatajući konfiguraciju P-površine, spojenu sa tri hiperpromenjljiva regiona, koji formiraju petlje koje povezuju, i u nekim slučajevima čine deo, strukture P- površine. Hiperpromenjljivi regioni u svakom lancu se drže zajedno u neposrednoj blizini putem FR-a i, sa hiperpromenjljivim regionima sa drugog lanca, doprinose formiranju antigen-položaja vezivanja antitela (videti Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Konstantni domeni nisu uključeni direktno u vezivanje antitela za antigen, ali prikazuju različite efektor funkcije, kao stoje učestvovanje antitela u od antitela zavisnoj ćelijskoj citotoksičnosti (ADCC).

Papain varenje antitela proizvodi dva identična antigen-vezujuća fragmenta, koji se nazivaju "Fab" fragmenti, svaki sa jednim antigen-vezujućim položajem, i preostali "Fc" fragment, čije ime reflektuje njegovu sposobnost da spremno kristališe. Pepsin tretman prinosi F(ab')2 fragment koji ima dva antigen-vezujuća položaja i još uvek je sposoban za unakrsno povezivanje antigena.

"Fv" je minimum antitelo fragment koji sadrži potpun antigen-prepoznavanje i antigen-vezivanje položaj. Ovaj region se sastoji od dimera promenjljivog domena jednog teškog lanca i jednog lakog lanca u tesnoj, ne-kovalentnoj povezanosti. U ovoj konfiguraciji dešava da tri hiperpromenjljiva regiona svakog promenjljivog domena međusobno reaguju da defmišu antigen- vezujući položaj na površini VH-VL dimera. Kolektivno, ovih šest hiperpromenjljivih regiona prenose antigen-specifičnost vezivanja na antitelo. Ipak, čak ijedan promenjljivi domen (ili pola Fv-a koji sadrži samo tri hiperpromenjljiva regiona specifična za antigen) ima sposobnost da prepozna i veže antigen, iako pri nižem afinitetu nego što je to kod celokupnog položaja vezivanja.

Fab fragment takože sadrži konstantni domen lakog lanca i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. Fab' fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata dodatkom nekoliko ostataka na karboksi završetku CH1 domena teškog lanca uključujući jedan ili više cisteina iz uneravnoteženog regiona antitela. Fab'-SH je ovde ozanak za Fab' u kome cistein ostatak(ci) konstantnih domena nose bar jednu slobodnu tiol grupu. F(ab')2 fragmenti antitela originalno su proizvedeni kao parovi Fab' fragmenata koji imaju uneravnotežene cisteine između njih. Takođe su poznata druga hemijska sparivanja fragmenata antitela.

"Laki lanci" antitela (imunoglobulini) bilo koje vrste vertebrata mogu biti upućeni jednom ili dva jasno različita tipa, nazvanih kapa (k) i lamda (A.), na osnovu sekvenci amino kiseline njihovih konstantnih domena.

U zavisnosti od sekvence amino kiseline konstantnog domena njegovih teških lanaca, antitela mogu biti upućena različitim klasama. Postoji pet glavnih klasa celih antitela: IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM, i nekoliko njih može dalje biti podeljeno u podklase (izotipove), n.pr., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji korespondiraju sa različitim klasama antitela se nazivaju α, δ, ε, γ i μ, svaka posebno.

Strukture podjedinice i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate.

"Jedan-lanac Fv" ili "scFv" fragmenti antitela sadrže Vh i VL domene antitela, pri čemu su ovi domeni prisutni u jednom lancu polipeptida. Pretpostavljeno, Fv polipeptid dalje sadrži polipeptid linker između VH i VL domena koji omogućava scFv da formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Za pregled scFv videti Pliickthun u The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburd and Moore eds., Springer- Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

Pojam "diatela" se odnosi na male fragmente antitela sa dva antigen- vezujuća položaja, fragmente koji sadrže promenjljiv domen teškog lanca (VH) spojene za promenjljiv domen lakog lanca (VL) u istom polipeptidnom lancu (VH - VL). Upotrebom linkera koji je isuviše kratak da dopusti sparivanje između dva domena na istom lancu, domeni su prisiljeni da se spare sa komplementarnim domenima drugog lanca i kreiraju dva antigen- vezujuća položaja. Diatela su potpunije opisana kod, na primer, EP 404,097; WO 93/11161; i Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 • (1993).

Pojam "monoklonalno antitelo" kako se to ovde upotrebljava se odnosi na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, odnosno, individualnih antitela koja sadrže populaciju su identična osim za moguće prirodno nastale mutacije koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonalna antitela su krajnje specifična, pošto su usmerena spram jednog antigenskog položaja. Dalje, za razliku od konvencionalnih (poliklonalnih) preparata antitela koji tipično uključuju različita antitela usmerena spram različitih determinanti (epitopi), svako monoklonalno antitelo je usmereno spram jedne determinante na antigenu. Dodatno ovoj specifičnosti, monoklonalna antitela su pogodna zato što se sintetišu kulturom hibrida, nezagađeni drugim imunoglobulinima. Modifikator "monoklonalan" naznačava karakter antitela pošto je dobijeno od suštinski homogene populacije antitela, i ne treba se smatrati da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim određenim postupkom. Na primer, monoklonalna antitela koja se imaju upotrebiti u skladu sa sadašnjim pronalaskom mogu biti sačinjena hibridnim postupkom prvi put opisanim kod Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ili mogu biti sačinjeni rekombinantnim DNK postupcima (videti, n.pr., U.S. Patent br. 4,816,567). "Monoklonalna antitela" mogu takođe biti izolovana iz biblioteka fage antitela upotrebom tehnika opisanih kod na primer, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) i Marks et al„ J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991).

Monoklonalna antitela ovde specifično uključuju "himema" antitela (imunoglobuline) u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan sa ili homolog korespondirajućoj sekvenci u antitelima izvedenim iz određene vrste ili koja pripada određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je ostatak lanca(aca) identičan sa ili pripada drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i

fragmente takvih antitela, sve dok prikazuju željenu biološku aktivnost (U.S. Patent br. 4,816,567; Moirrison etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851- 6855 (1984)). Himema antitela koja su ovde od interesa uključuju "primatizovana" antitela koja sadrže promenjljivi domen antigen-vezujućih sekvenci izvedenih iz ne-humanog primata (n.pr. Old World Monkey, kao stoje babun, rezus ili cynomolgus majmun) i humanog konstantnog regiona sekvenci (US Patent br. 5,693,780).

"Humanizovani" oblici ne-humanih (n.pr., mišja) antitela su himema antitela koja sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz ne-humanog imunoglobulina.

U najvećem delu, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (antitelo primalac) u kojima su ostatci za hiperpromenjljivog regiona primaoca zamenjeni ostatcima za hiperpromenjljivog regiona ne-humane vrste (antitelo davalac) kao što je miš, pacov, zec ili nehumani primat koji ima željenu specifičnost, afinitet, i kapacitet. U nekim instancama, ostatci okvirnog regiona (FR) humanog imunoglobulina se zamenjuju odgovarajućim ne-humanim ostatcima. Šta više, humanizovana antitela mogu sadržati ostatke koji nisu pronađeni u antitelu primaocu ili u antitelu davaocu. Ove modifikacije su učinjene da se dalje prečisti performanca antitela. Generalno, humanizovano antitelo će suštinski sadržati sve od bar jednog, a tipično dva, promenjljiva domena, u kojima sve ili suštinski sve hiperpromenjljive petlje korespondiraju sa onima od ne-humanog imunoglobulina i svi ili suštinski svi FR-i su oni koji pripadaju sekvenci humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo će opciono takođe sadržati bar jedan deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onaj od humanog imunoglobulina. Za dalje podatke, videti Jones et al.,

Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Pojam "hiperpromenjljivi region" kada se ovde koristi odnosi se na ostatke amino kiseline antitela koje je odgovorno za antigen-vezivanje. Hiperpormenjljivi region sadrži ostatke amino kiseline od "regiona koji utvrđuje komplementarnost" ili "CDR-a" (n.pr., ostatci 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) u lakom lancu promenjljivog domena i 31-35 (Hl), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) u teškom lancu promenjljivog domena; Kabar et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD. (1991)) i/ili one ostatke za "hiperpromenjljive petlje" (n.pr. ostatke 26-32 (LI), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) u lakom lancu promenjljivog domena i 26-32 (Hl), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) u teškom lancu promenjljivog domena; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). "Okvir" ili ’TR" ostataka su oni ostatci promenjljivog domena koji nisu ostatci hiperpromenjljivog regiona kako je ovde definisan.

Antagonist "koji vezuje" antigen od interesa, n.pr. površinski marker B ćelije, je onaj koji je sposoban za vezivanje tog antigena sa dovoljnim afinitetom i/ili žudnjom tako daje antagonist koristan kao terapeutsko sredstvo za ciljanje ćelije koja eksprimuje antigen.

Primeri antitela koja vezuju CD20 antigen uključuju: "C2B8" koji se sada naziva "rituksimab" ("RITUXAN®") (US Patent br. 5,736,137, ovde izričito inkorporisan putem reference); itrium-[90]-označeno 2B8 mišje antitelo naznačeno kao "Y2B8" (US Patent br. 5,736,137, ovde izričito inkorporisano putem reference); mišje IgG2a "B1" opciono označeno sa 131 i da generiše

"I31I-B1" antitelo (BEXXAR™) (US Patent br. 5,595,721, ovde izričito inkorporisano putem reference); mišje monoklonalno antitelo "1F5" (Press et al. Blood 69(2):584-591 (1987)); "himemo 2H7 antitelo" (US Patent br. 5,677,180, ovde izričito inkorporisano putem reference); "humanizovano 2H7 vi6" (videti dole); huMax-CD20 (Genmab, Danska); AME-133 (Primenjena molekulama evolucija); i monoklonalna antitela L27, G28-2, 93-1B3, B-Cl ili NU-B2 dostupan od strane International Leukocyte Typing Workshop (Valentine et al., U: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p.440, Oxford University Press (1987)).

Primeri antitela koji vezuju CD 19 antigen uključuju anti-CD19 antitela kod Hekman et al., Cancer lmmunol. Immunother. 32:264-372 (1991) i Vlasveld et al. Cancer lmmunol. Immunother. 40:37-47 (1995); i B4 antitelo kod Kiesel et al. Leukemia Research II, 12: 1119 (1987).

Pojmovi "rituksimab" ili "RITUXAN®" ovde se odnosi na genetičkim inženjeringom dobijeno himemo mišje/humano monoklonalno antitelo usmereno spram CD20 antigena i naznačeno kao "C2B8" u US Patent br. 5,736,137, ovde izričito inkorporisano putem reference. Antitelo je IgG] kapa imunoglobulin koji sadrži mišji sekvence mišjeg lakog i teškog lanca promenjljivi region i sekvence humanog konstantnog regiona. Rituksimab ima afinitet vezivanja za CD20 antigen od otprilike 8,0 nM.

Isključivo u ove svrhe, "humanizovano 2H7 vl6" se odnosi na antitelo koje sadrži promenjljive lake i promenjljive teške sekvence koje su dole pokazane.

Promenjljivi domen lakog lanca hu2H7 vi6

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAP KPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWS FNPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 1)

Promenljivi domen teškog lanca hu2H7 v16

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAP GKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:2)

Pretpostavljeno humanizovana 2H7 vi6 sadrži sekvencu lakog lanca amino kiseline

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYWWKPGKAPKPL IYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPP TFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 3);

i sekvencu teškog lanca amino kiseline

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGL

EWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDT

AVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS

KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG

LYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT

CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV

KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGD

EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS

LTCLVKFYPSDIVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQSLSLSPGK (SEQ ID N0:4).

"Izolovani" antagonist je onaj koji je identifikovan i odvojen i/ili dobijen od komponente njegovog prirodnog okruženja. Zagađene komponente njihovog prirodnog okruženja su materijali koji se mešaju sa dijagnostičkim i terapeutskim upotrebama za antagonist, i mogu uključiti enzime, hormone, i druge proteinska ili neproteinska rastvorljiva sredstva. U pretpostavljenim realizacijama, antagonist će biti prečišćen (1) do više od 95 tež % antagonista kako se to utvrđuje prema Lowry postupku, i najpoželjnije više od 99 tež %, (2) so stepena dovoljnog da se dobije bar 15 ostataka N-krajnje ili interne sekvence amino kiseline upotrebom sekvencijatora sa obrtnim sudom, ili (3) do homogeničnosti prema SDS-PAGE pod redukovanim ili ne-redukovanim uslovima upotrebom Coomassie plave ili, pretpostavljeno, srebrne boje. Izolovani antagonist uključuje antagonist in situ u okviru rekombinantnih ćelija pošto bar jedna komponenta antagonistovog prirodnog okruženja neće biti prisutna. Uobičajeno, ipak, izolovani antagonist će biti pripremljen putem bar jednog od koraka prečišćavanja.

"Sisar" u svrhe lečenja se odnosi na bilo koju životinju klasifikovanu u sisare, uključujući ljude, domaće i životinje koje se čuvaju na farmi, kao i zološke, sportske, ili životinje kućni ljubimci, kao što su psi, konji, mačke, krave, itd. Pretpostavljeno, sisar je čovek.

"Lečenje" se odnosi i na terapeutsko lečenje i na profilaktičke ili preventivne mere. U one kojima je neophodno lečenje uključuju one koji već imaju bolest ili poremećaj kao i one kod kojih se bolest ili poremećaj ima sprečiti.

Prema tome, kod sisara može biti dijagnostikovana bolest ili poremećaj ili može biti predisponiran ili prijemčiv za bolest.

Izraz "terapeutski efikasna količina" se odnosi na količinu antagonista koji je efikasan za prevenciju, ublažavanje ili lečenje autoimune bolesti koja je u pitanju.

Pojam "imunosupresivno sredstvo" kako se to ovde upotrebljava za povezanu terapiju se odnosi na supstance koje deluju da potisnu ili maskiraju imuni sistem sisara koji se ovde leči. Ovo uključuje supstance koje potiskuju proizvodnju citokina, regulišu naniže ili potiskuju ekspresiju samo-antigena, ili maskiraju MHC antigene. Primeri takvih sredstava uključuju 2-amino-6-aril-5-supstituisane pirimidine (videti U.S. Pat. br. 4,665,077, otkriće koje je ovde inkorporisano putem reference), nesteroidne antiinflamatome lekove (NSAID-ovi); azatioprin; ciklofosfamid; bromokriptin; danazol; dapson; glutaraldehid (koji maskira MHC antigene, kao stoje to opisano u U.S. Pat.br. 4,120,649); anti-idiotipska antitela za MHC antigene i MHC fragmente; ciklosporin A; steroidi kao što su glukokortikosteroidi, n.pr., prednison, metilprednisolon, i dekametazon; metotreksat (oralno ili potkožno); hidroksiklorohin; sulfasalazin; leflunomid; citokin ili citokin receptor antagonisti uključujući anti-interferon-γ, -β ili-α antitela, anti-tumor nekroza faktor-a antitela (infliksimab ili adalimumab), anti-TNFa imunoahezin (etanercept), anti-tumor nekroza faktor-β antitela, anti-interleukin-2 antitela i anti-IL-2 receptor antitela; anti-LFA-1 antitela, . uključujući anti-CDl la i anti-CD18 antitela; anti-L3T4 antitela; heterologi anti-limfocit globulin; pan-T antitela, pretpostavljeno anti-CD3 ili anti-

CD4/CD4a antitela; rastvorljivi peptid koji sadrži LFA-3 domen vezivanja (WO 90/08187 objavljeno 7/26/90); streptokinaza; TGF-p; streptodomaza; RNK ili DNK sa domaćina; FK506; RS-61443; deoksispergualin; rapamicin; T-ćelija receptor (Cohen et al., U.S. Pat. br. 5,114,721); T-ćelija receptor fragmenti (Offtier et al., Science, 251: 430-432 (1991); WO 90/11294; Ianeway, Nature, 341: 482 (1989); i WO 91/01133); i T ćelija receptor antitela (EP 340,109) kao stoje T10B9.

Pojam "citotoksično sredstvo" kako se to ovde koristi se odnosi na supstancu koja inhibira ili sprečava funkciju ćelija i/ili izaziva destrukciju ćelija. Ovaj pojam ima nameru da uključi radioaktivne izotope (n.pr., At211,1131,1125, Y90, Rel86, Rel88, Sml53, Bi212, P32 i radioaktivne izotope Lu), hemoterapeutska sredstva, i toksine kao što su toksini malih molekula ili enzimatički aktivni toksini bakterijskog, fungalnog, biljnog ili životinjskog porekla, ili njihove fragmente.

"Hemoterapeutsko sredstvo" je hemijsko jedinjenje korisno u lečenju kancera. Primeri hemoterapeutskih sredstava uključuju sredstva za alkiliranje kao što su tiotepa i ciklosfosfamid (CITOXAN™); alkil sulfonati kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridini kao što su benzodopa, karbohuon, meturedopa, i uredopa; etilenimini i metilamelamini uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosfaoramid i trimetilolomelamin; azot senfovi kao što su hlorambucil, hlomafazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembicin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil senf; nitrokiseline kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin;

antibiotici kao što su aklacinomizini, aktinomicitn, autramicin, azaserin, bleomicini, kaktinoraicin, kaliheamicin, karabicin, karminomicin, karzinofilin, hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo- 5-okso-L-norleucin, doksorubicin, epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicini, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, potfiromicin, puromicin, helamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; anti-metaboliti kao što su metotrekat i 5-fluorouracil (5-FU); analozi folne kiseline kao što su denopterin, metotrekat, pteropterin, trimetreksat; analozi purina kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analozi pirimidina kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin, 5-FU; androgeni kao što su kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; anti- adrenali kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; popunjivači folne kiseline kao što je ffolinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glukozid; aminolevulinska kiselina; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazihuon; elfomitin; eliptinium acetat; etoglucid; galijumnitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidamin; mitohuazon; mitoksantron; mopidamol; nitracin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; podifilinska kiselina; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK®; razoksan; sizofiran; spirogermanium; tenuazonska kiselina; triazihuon; 2,2’,2"-trihlorotrietilamin; uretan; vindesin; dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid ("Ara-C"); ciklofosfamid; tiotepa; taksoidi, n.pr., paklitaksel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) i doksetaksel (TAXOTERE®, Rhone-Poulene Rorer, Antony, Francuska); hlorambucil; gemcitabin; 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; analozi platine kao što

su cisplatin i karboplatin; vinblastin; platina; etopozid (VP-16); ifosfamid; mitomicin C; meotksantron; vinkristin; vinorelbin; navelbin; novantron; tenipozid; daunomicin; aminopterin; kseloda; ibandronat; CPT-11; topoizomeraza inhibitor RFS 2000; difluorometilomitin (DMFO); retenska kiselina; esperamicini; kapecitabin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo koje od gore navedenih. Takođe su uključeni u definiciju anti-hormonska sredstva koja deluju da regulišu ili inhibiraju hormonsko dejstvo na tumore kao što su anti-estrogeni uključujući na primer tamoksifen, reloksifen, aromataza inhibirajući 4(5)-imidazoli, 4- hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston, i toremifen (Fareston); i anti-androgeni kao što su flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid, i goserlin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo koje od gore navedenih.

Pojam "citokin" je generički pojam za proteine oslobođene od strane jedne ćelijske populacije koji deluju na drugu ćeliju kao intraćelijski medijatori. Primeri takvih citokina su limfokini, monokini, i tradicionalni polipeptidni hormoni. Među citokine su uključeni hormoni rasta kao stoje humani hormon rasta, N-metionil humani hormon rasta, i volovski hormon rasta; paratiroidni hormon; tiroksin; insulin; proinsulin; relaksin; prorelaksin; glikoprotein hormoni kao što su follicle stimulišući hormon (FSH), tiroidni stimulišući hormon (TSH), i luteinizirajući hormon (LH); hepatički faktor rasta; fibroblast faktor rasta; prolaktin; placentni laktogen; tumor nekroza faktor-a i -(3, mullerian-inhibirajuća supstanca; sa mišjim gonadotropinom povezani peptid; inhibin; aktivin; vaskulami endotelijalni faktor rasta; integrin; trombopoetin (TPO); nervni faktori rasta kao što su NGF-(3;

platelet-faktor rasta; transformišući faktori rasta (TGF-i) kao što su TGF-α i TGF-β; insulinu slični faktor rasta-I i -II; eritropoetin (EPO); osteoinduktivni faktori; interferoni kao što su interferon-α -β i -γ; stimulišući faktori kolonije (CSF-i) kao što su makrofaga-CSF (M-CSF); granulocit-makrofaga-CSF (GM-CSF); i granulocit-CSF (G-CSF); interleukini (IL-i) kao što su IL-1, IL-la, IL-2, IL3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15; tumor nekroza faktor kao što su TNF-α ili - TNF-β i drugi polipeptidni faktori uključujući LIF i pribor ligand (KT). Kako se to ovde koristi, pojam citokin uključuje proteine iz prirodnih izvora ili iz rekombinantne ćelijske kulture i biološki aktivne ekvivalente prirodne sekvence citokina.

Termin "prolek" kako se koristi u ovoj prijavi se odnosi na prekursor ili derivat oblik farmaceutski aktivne supstance koja je manje citotoksična za ćelije tumora upoređeno sa matičnim lekom i sposobna je da bude enizmski aktivirana ili konvertovana u više aktivnih matičnih oblika. Videti, n.pr., Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) i Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed), pp. 247-267, Humana Press (1985). Prolekovi ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, prolekove koji sadrže fosfat, prolekove koji sadrže tiofosfat, prolekove koji sadrže sulfat, prolekove koji sadrže peptid, D-amino kiselina-modifikovani prolekovi, glikozilovani prolekovi, prolekovi koji sadrže β-laktam, opciono supstituisani prolekovi koji sadrže fenoksiacetamid ili opciono supstituisani prolekovi koji sadrže fanilacetamid, 5-fluorocitozin i drugi 5-fluorouridin

prolekovi koji se mogu konvertovati u aktivniji lek bez citotoksičnosti. Primeri citotoksičnih lekova koji mogu biti derivatizovani u oblik proleka za upotrebu u ovom pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na, ona hemoterapeutska sredstva koja su gore opisana.

"Lipozom" je mali mehurić sastavljen od različitih tipova lipida, fosfolipida i/ili površinskih sredstava koji su korisni za davanje leka (kao što su ovde otkriveni antagonisti i, opciono, hemoterapeutsko sredstvo) sisaru. Komponente lipozoma su uobičajeno postavljene u dvoslojnoj formaciji, sličpno postavljanju lipida bioloških membrana.

II. Proizvodnja antagonista

Postupci i članovi proizvodnje sadašnjeg pronalaska upotrebljavaju, ili inkorporišu, antagonist koji se vezuje za površinski marker B ćelije. U skladu sa tim, postupci generisanja takvih antagonista će ovde biti opisani.

Površinski marker B ćelije koji se ima upotrebiti za proizvodnju, ili pretraživanje na, antagonist(e) mogu biti, n.pr., rastvorljivi oblik antigena ili njegov deo, koji sadrži željeni epitop. Alternativno, ili dodatno, ćelije koje eksprimuju površinski marker B ćelije na njihovoj ćelijskoj površini mogu biti upotrebljene da generišu, ili pretražuju na, antagonist(e). Drugi oblici površinskog markera B ćelije korisni za generisanje antagonista će biti očigledni stručnjacima iz ove oblasti nauke. Pretpostavljeno, površinski marker B ćelije je CD20 antigen.

Dok je pretpostavljeni antagonist antitelo, i drugi antagonisti sem antitela se ovde razmatraju. Na primer, antagonist može da sadrži mali molekul antagonist spojen za, ili konjugovan sa, citotoksičnim sredstvom (kao što su ona koja su ovde opisana). Biblioteke malih molekula mogu biti ovde pretraživane spram površinskog markera B ćelije od interesa da bi se identifikovao mali molekul koji se vezuje za taj antigen. Mali molekul dalje može biti pretraživan na njegove antagonističke osobine i/ili konjugovan sa citotoksičnim sredstvom.

Antagonist može takođe biti peptid generisan putem racionalnog dizajna ili izlaganjem fage (videti, n.pr., WO98/35036 objavljen 13. avgustaa 1998 godine). U jednoj realizaciji, molekul od izbora može biti "CDR mimički" ili analog antitela dizajniran na osnovu CDR-a antitela. Dok takvi peptidi mogu biti antagonistički sami po sebi, peptid može opciono biti spojen za citotoksično sredstvo tako da se dodaju ili pojačaju antagonističke osobine peptida.

Opis koji sledi je radi primemih tehnika za proizvodnju antitelo antagonista koji se upotrebljavaju u skladu sa sadašnjim pronalaskom.

(i) Poliklonalna antitela

Poliklonalna antitela se pretpostavljeno uzgajaju u životinjama putem višestrukih potkožnih (sc) ili intraperitonelnih (ip) ubrizgavanja relevantnog antigena i adjuvanta. Može biti korisno da se konjuguje relevantan antigen za protein koji imunogeničan u vrstama da bi se imunizovao, n.pr., prilepljen kroz ključaonicu hemocijanin, serum albumin, volovski tiroglobulin, ili soja tripsin inhibitor upotrebom bifunkcionalnog ili derivatizujućeg sredstva, na primer, melaimidobenzoil sulfosukcinimid estra (konjugacija preko cistein ostataka), N-hidroksisukcinimida (preko lizin ostataka), glutaraldehida, anhidrida ćilibame kiseline, SOCI2, ili R'N=C=NR, gde su R i R1 rezličite alkil grupe.

Životinje se imunizuju spram antigena, imunogenih konjugata, ili derivata kombinovanjem, n.pr., 100 pg ili 5 pg proteina ili konjugata (za zečeve ili miševe, svake posebno) sa 3 zapremine Freund-ovog kompletnog adjuvanta i ubrizgavanjem rastvora intradermalno na više položaja. Mesec dana kasnije kod životinja se podižu vrednosti sa 1/5 do 1/100 od originalne količine peptida ili konjugata u Freund-ovom kompletnom adjuvantu potkožnim ubrizgavanjem na više mesta. Sedam do 14 dana kasnije životinjama se uzme krv i serum se testiraju na antitelo titar. Životinjama se podiže vrednost sve dok se titar ne izravna. Pretpostavljeno, životinjama se podiže vrednost sa konjugatom istog antigena, ali konjugovanim sa različitim proteinom i/ili kroz različit reagens za unakrsno povezivanje. Konjugati mogu takođe biti sačinjeni u rekombinantnoj ćelijskoj kulturi kao spajanja proteina. Takođe, sredstva za nagomilavanje kao stoje alum se pogodno upotrebljavaju da se pojača imuni odgovor.

(ii) Monoklonalna antitela

Monoklonalna antitela se dobijaju od populacije suštinski homogenih antitela, odnosno, individualna antitela od kojih se populacija sastoji su identična osim za moguće prirodno nastale mutacije koje mogu biti prisutne

u manjim količinama. Tako, modifikator "monoklonalan" označava karakter antitela koji nije smeša odvojenih antitela.

Na primer, monoklonalna antitela mogu biti sačinjena upotrebom hibridoma postupka prvog opisanog od strane Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ili mogu biti sačinjena rekombinantnim DNK postupcima (U.S. Patent br. 4,916,567).

U hibridoma postupku, miš ili druga odgovarajuća životinja domaćin, kao što je hrčak, je imunizovan kako je ovde i u gornjem tekstu opisano da se izvedu limfociti koji proizvode ili su sposobni da proizvode antitela koja će se specifično vezivati za protein upotrebljen u ovoj imunizaciji.

Alternativno, limfociti mogu biti imunizovani in vitro. Limfociti se onda spajaju sa mijeloma ćelijama upotrebom odgovarajućeg sredstva za spajanje, kao što je polietilen glikol, da se formira hibridoma ćelija (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).

Tako pripremljene hibridoma ćelije se poseju i rastu u odgovarajućem medijumu kulture koja pretpostavljeno sadrži jednu ili više supstanci koje inhibiraju rast ili opstanak nespojenih, matičnih mijeloma ćelija. Na primer, ukoliko matične mijeloma ćelije imaju nedostatak enzima hipoksantin guanin fosforibosil transferaze (HGPRT ili HPRT), medijum kulture za hibridome će tipično uključiti hipoksantin, aminopterin, i timidin (HAT medijum), čije supstance sprečavaju rast ćelija sa nedostatkom HGPRT.

Pretpostavljene mijeloma ćelije su one koje spajaju efikasno, podržavaju stabilnu proizvodnju antitela visokog nivoa putem odabranih ćelija koje proizvode antitela, i koje su osetljive na medijum kao što je HAT medijum. Među njima, pretpostavljene mijeloma ćelijske linije su mišje mijeloma linije, kao što su one izvedene od MOPC-21 i MPC-11 mišjih tumora dostupne od Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califomia, USA, i SP-2 ili X63-Ag8-653 ćelije dostupne od American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Humana mijeloma i mišja-humana heteromijeloma ćelijske linije su takođe opisane za proizvodnju humanih monoklonalnih antitela (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 5163 (Marcel Dekker, Ine., New York, 1987)).

Medijum kulture u kome hibridoma ćelije rastu se ogleda na proizvodnju monoklonalnih antitela spram antigena. Pretpostavljeno, specifičnost vezivanja monoklonalnih antitela proizvedenih hibridoma ćelijama se utvrđuje imunotaloženjem ili putem in vitro ogleda vezivanja, kao što je radioimunoogled (RIA) ili enzim-povezani imunoabsorbant ogled (ELISA).

Afinitet vezivanja monoklonalnog antitela može, na primer, biti utvrđen putem Scatchard analize od Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Nakon što su hibridoma ćelije identifikovane da proizvode antitela željene specifičnosti, afiniteta, i/ili aktivnosti, klonovi mogu biti sub-klonirani postupcima limitirajuće razblaživanja i uzgajaju se putem standardnih postupaka (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59- 103 (Academic Press, 1986)). Odobarajući medijum kulture za ovu svrhu

uključuje, na primer, D-MEM ili RPMI-1640 medijum. Dodatno, hibridoma ćelije mogu biti uzgajane in vivo kao trbušni vodeni tumori u životinji.

Monoklonalna antitela izlučena putem sub-klonova se odgovarajuće odvajaju od medijuma kulture, trbušnih vodenih bolesti fluida, ili seruma konvencionalnim postupcima imunoglobulin prečišćavanja kao stoje, na primer, protein A-Sefaroza, hidroksilapatit hromatografija, gel elektroforeza, dijaliza, ili hromatografija afiniteta. .

DNK koji kodira monoklonalna antitela se lako izoluje i sekvencira upotrebom konvencionalnih postupaka (n.pr., upotrebom oligonukleotidnih proba koje su sposobne za vezivanje specifično za gene koji kodiraju teške i lake lance mišjih antitela). Hibridoma ćelije služe kao pretpostavljeni izvor takve DNK. Jednom izolovana, DNK može biti postavljena u vektore ekspresije, koji se onda transfektuju u ćelije domaćina kao što su E. coli ćelije, simian COS ćelije, jajne ćelije kineskog hrčka (CHO), ili mijeloma ćelije koje inače ne proizvode imunoglobulin protein, da se dobije sinteza monoklonalnih antitela u rekombinantnim ćelijama domaćina. Pregled članaka o rekombinantnoj ekspresiji u bakteriji DNK koja kodira antitelo uključuje Skerra etal., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) i Pliickthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).

U daljoj realizaciji, antitela ili fragmenti antitela mogu biti izolovani iz biblioteka antitelo fage generisane upotrebom tehnika opisanih kod McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) i Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) opisuje izolovanje mišjih i humanih antitela, svakog posebno, upotrebom biblioteka

fage. Potonje publikacije opisuju proizvodnju humanih antitela visokog afiniteta (nM opseg) putem povlačenja lanca (Marks, et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), kao i kombinatomom infekcijom i in vitro rekombinacijom kao strategijom za konstruisanje vrlo velikih biblioteka fage (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Tako su ove tehnike prohodne alternative tradicionalnim tehnikama hibridoma monoklonalnih antitela za izolovanje monoklonalnih antitela.

DNK može takođe biti modifikovana, na primer, supstituisanjem kodirajućih sekvenci za humani teški- i laki-lanac konstantnih domena na mesto homologih mišjih sekvenci (U.S. Patent br. 4,816,567; Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), ili putem kovalentnog pridruživanja za ćelu imunoglobulin kodirajuću sekvencu ili deo kodirajuće sekvence za ne-imunoglobulin polipeptid.

Tipično takvi ne-imunoglobulin polipeptidi se substituišu za konstantne domene antitela, ili su oni supstituisani za promenjljive domene jednog antigen-kombinirajućeg položaja antitela da se kreira himemo bivalentno antitelo koje se sastoji od jednog antigen-kombinirajućeg položaja koji ima specifičnost za antigen i sledećeg antigen-kombinirajućeg položaja koji ima specifičnost za različiti antigen.

(iii) Humanizovana antitela

Postupci za humanizovanje ne-humanih antitela je opisano u nauci. Pretpostavljeno, humanizovano antitelo ima jedan ili više ostataka amino kiseline uvedene u njega iza izvora koji je ne-human. O ovim ne-humanim

ostatcima amino kiseline se često govori kao o "uveženim" ostatcima, koji su tipično uzeti od "uveženog" promenjljivog domena. Humanizacija može biti u osnovi obavljena praćenjem postupka od Winter-a i ko-radnika (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen etal., Science, 239:1534-1536 (1988)), supstituisanjem sekvenci hiperpromenjljivog region za odgovarajuće sekvence humanog antitela. U skladu sa tim, takva "humanizovana" antitela su himema antitela (U.S. Patent br. 4,816,567) pri čemu je suštinski manje od celog humanog promenjljivog domena supstituisano putem korespondirajuće sekvence od ne-humanih vrsta. U praksi, humanizovana antitela su tipično humana antitela u kojima su neki ostatci hiperpromenjljivog regiona i moguće neki FR ostatci supstituisani ostatcima analognih položaja u antitelima glodara.

Izbor humanih promenjljivih domena, kako lakog tako i teškog, koji se ima upotrebiti u pravljenju humanizovanih antitela je vrlo važana da se smanji antigenost. Prema takozvanog "najbolje uklapanje" postupku, sekvenca promenjljivog domena antitela glodara se pretražuje spram ćele biblioteke poznatih humanih sekvenci promenjljivog domena. Humana sekvenca koja je najbliža onoj od glodara se onda prihvata kao humani okvirni region za rad (FR) za humanizovano antitelo (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Sledeći postupak upotrebljava određeni region okvira za rad izveden iz usaglašene sekvence svih humanih antitela određene podgrupe lakih ili teških lanaca. Isti okvir za rad može biti upotrebljen za nekoliko različitih humanizovanih antitela (Čarter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

Dalje je važno da antitela budu humanizovana sa zadržavanjem visokog afiniteta za antigen i druge povoljne biološke osobine. Da se postigne ovaj cilj, prema pretpostavljenom postupku, humanizovana antitela se pripremaju postupkom analize matičnih sekvenci i različitih konceptualnih humanizovanih proizvoda upotrebom tro-dimenzionalnih modela matične i humanizovane sekvence. Tro-dimenzionalni modeli imunoglobulina su uobičajeno dostupni i poznati stručnjacima iz ove oblasti nauke. Dostupni su kompjuterski programi koji ilustruju i prikazuju moguće trodimenzionalne konformacione strukture odabranih kandidata sekvenci imunoglobulina. Inspekcija ovih prikaza dopušta analizu verovatne uloge ostataka u funkcionisanju kandidat sekvence imunoglobulina, odnosno, analizu ostataka koji utiču na sposobnost kandidata imunoglobulina da veže svoj antigen. Na ovaj način, FR ostatci mogu biti odabrani i kombinovani od primaoca i uveženih sekvenci tako da se željena karakteristika antitela, kao stoje povećan afinitet za ciljani(e) antigen(e), postigne. Generalno, ostatci hiperpromenjljivog regiona su direktno i najsuštinski]e uključeni u uticanju na vezivanje antigena.

(iv) Humana antitela

Kao alternativna humanizaciji, mogu biti generisana humana antitela. Na primer, sada je moguće proizvesti trasgenske životinje (n.pr., miševi) koje su sposobne, nakon imunizacije, da proizvode pun reperotoar humanih antitela u ostustvu endogene proizvodnje imunoglobulina. Na primer, opisano je da homozigotno uklanjanje teškog-lanca regiona za pridruživanje antitela (JH) gena kod himeričnih i oplodna ćelijska linija mutant miševa rezultira u kompletnoj inhibiciji endogene proizvodnje antitela. Transfer humane

oplodne ćelijske linije imunoglobina genskog niza u takvu oplodnu ćelijsku linijamu mutant miševa će rezultirati u proizvodnji humanih antitela nakon izazivanja antigenom. Videti, n.pr., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits etal., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); i US Patent br.

5,591,669, 5,589,369 i 5,545,807.

Alternativno, tehnologija prikaza fage (McCafferty et al., Nature 348:552- 553 (1990)) može biti upotrebljena da se proizveđu humana antitela i fragmenti antitela in vitro, od imunoglobulin promenjljivog (V) domena genskog repertoara od neimunizovanih davaoca. Prema ovoj tehnici, antitelo V domen geni se kloniraju u-okvir u bilo veći ili manji protein gen za oblaganje filamentne bekteriofage, kao što je M13 ili fd, i prikazani su kao funkcionalni fragmenti antitela na površini delića fage. Pošto filamentni delić sadrži jedinično-struke DNK kopije fage genoma, selekcije zasnovane na funkcionalnim osobinama antitela takođe rezultira u odabiru gena koji kodira antitela koje prikazuje takve osobine. Tako, faga podražava neke osobine B ćelije. Prikaz fage može biti obavljen u različitim formatima; za njihov pregled videti, n.pr., Johnson, Kevin S. i Chiswell, David J., Current Opinion in StructuralBiology 3:564-571 (1993). Nekoliko izvora V-gen segmenata može biti upotrebljeno za prikaz fage. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) izoluje različit niz anti-oksazolon antitela od malih nasumične kombinatome biblioteke V gena izvedenih iz slezina imunizovanih miševa. Repertoar V gena iz neimunizovanih humanih davaoca mogu biti konstruisani i antitela prema različitom niz antigena (uključujući samo-antigene) mogu biti izolovana u osnovi praćenjem tehnika opisanih kod Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), ili Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Videti, takođe US Patent br. 5,565,332 i 5,573,905.

Humana antitela mogu takođe biti generisana putem in vitro aktiviranih B ćelija (videti US Patente 5,567,610 i 5,229,275).

(v) Fragmenti antitela

Razvijene su različite tehnike za proizvodnju fragmenata antitela. Tradicionalno, ovi fragmenti se izvode putem proteolitičkog varenja celih antitela (videti, n.pr., Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysics Methods 24:107-117 (1992) i Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Ipak, ovi fragmenti mogu sada biti proizvedeni direktno putem rekombinantnih ćelija domaćina. Na primer, fragmenti antitela mogu biti izolovani od biblioteka antitelo fage gore već razmatrane. Alternativno, Fab'-SH fragmenti mogu biti direktno izeti od E. coli i hemijski spareni da formiraju F(ab')2 fragmente (Čarter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Prema sledećem pristupu, F(ab')2 fragmenti mogu biti izolovani direktno iz kulture rekombinantne ćelije domaćina. Druge tehnike za proizvodnju fragmenata antitela će biti očigledni stručnjaku koji ih izvodi.

U drugim realizacijama, izbor antitela je jediničng lanca Fv fragment.

Videti WO 93/16185; US Patent br. 5,571,894; i US Patent br. 5,587,458. Fragment antitela može takođe biti "linearno antitelo", n.pr., kao stoje to na primer opisano u US Patent 5,641,870. Takav linearni fragment antitela može biti monospecifičan ili bispecifičan.

(vi) Bispecifična antitela

Bispecifična antitela su antitela koja ima specifičnosti vezivanja za bar dva različita epitopa. Primema bispecifična antitela mogu vezati dva različita epitopa površinskog markera B ćelije. Druga takva antitela mogu vezat prvi marker B ćelije i dalje vezati drugi površinski marker B ćelije. Alternativno, vezujuća ruka marker anti-B ćelije može biti kombinovana sa rukom koja veže molekul za okidanje na leukocit kao što su molekul T-ćelija receptor (n.pr., CD2 ili CD3), ili Fc receptore za IgG (FcyR), kao što su FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) i FcyRIII (CD 16) da bi se fokusirali ćelijski odbrambeni mehanizmi za B ćeliju. Bispecifična antitela mogu takođe biti upotrebljena da se lokalizuju citotoksična sredstva na B ćeliju. Ova antitela poseduju B ćelija marker-vezujuću ruku i ruku koja vezuje citotoksično sredstvo (n.pr., saporin, anti-interferon-a, vinca alkaloid, ricin A lanac, metotreksat ili radioaktivni izotop hapten). Bispecifična antitela mogu biti pripremljena kao antitela pune dužine ili fragmenti antitela (n.pr. F(ab')2 bispecifična antitela).

Postupci pravljenja bispecifičnih antitela su poznati u nauci. Tradicionalna proizvodnja bispecifičnih antitela pune dužine je zasnovana an ko-ekspresiji dva imunoglobulin teški lanac-laki lanac para, gde dva lanca imaju različite specifičnosti (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983). Zbog nasumičnog odabiranja imunoglobulin teških i lakih lanaca, ovi hibridomi (kvadromi) proizvode potencijalnu smešu 10 različitih antitelo molekula, od kojih samo jedan ima korektnu bispecifičnu strukturu. Prečišćavanje korektnog molekula, koje su uobičajeno radi koracima hromatografije

afiniteta, je prilično teško, i prinosi proizvoda su niski. Slični postupci su otkriveni u WO 93/08829, i kod Traunecker et al., EMBOJ., 10:3655-3659 (1991).

Prema različitom pristupu, promenjljivi domeni antitela sa željenim specifičnostima vezivanja (antitelo-antigen kombinirajući položaji) se spajaju za sekvence imunoglobulig konstantnog domena. Spajanje je pretpostavljeno sa imunoglobulin teškim lancem konstantnog domena, koji sadrža bar deo regiona zgloba, CH2 i CH2. Pretpostavljeno je imati prisutan u bar jednom od spajanja prvi teški lanac konstantnog regiona (CH1) koji sadrži položaj neophodan za vezivanje lakog lanca. DNK-e koje kodiraju spajanja imunoglobulin teškog lanca i, ukoliko se to želi, imunoglobulin lakog lanca, se umeću u odvojene vektore ekspresije, i ko-transferišu se u odgovarajući organizam domaćina. Ovo obezbeđuje veliku fleksibilnost u podešavanju uzajamnih proporcija tri fragmenta polipeptida u realizacijama kada nejednaki odnosi tri polipeptidna lanca upotrebljavaju u konstrukciji daju optimalne prinose. Pa ipak, moguće je umetnuti kodirajuće sekvence za dva ili tri polipeptidna lanca u jedan vektor ekspresije kada ekspresija bar dva polipeptidna lanca u jednakim odnosima rezultira u visokim prinosima ili kada ti odnosi nisu od posebnog značaja.

U pretpostavljenoj realizaciji ovog pristupa, bispecifična antitela su sastavlje od hibridnog imunoglobulin teškog lanca sa prvom specifičnošću vezivanja u jednoj ruci, i hibridnog imunoglobulin teški lanac-laki lanac para (koji obezbeđuje drugu specifičnost vezivanja) u drugoj ruci. Pronađeno je da asimetrična struktura olakšava odvajanje željenog bispecifičnog jedinjenja od neželjenih imunoglobulin lanac kombinacija, pošto prisustvo imunoglobulin lakog lanca samo u jednoj polovini bispecifičnog molekula obezbeđuje lak način odvajanja. Ovaj pristup je otkriven u WO 94/04690. Za dalje detalje generisanja bispecifičnih antitela videti, na primer, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986).

Prema sledećem pristupu opisanom u US Patent br. 5,731,168, međusobna komunikacija između para molekula antitela može biti napravljena da maksimizira procenat heterodimera koji se vade iz rekombinantne ćelijske kulture. Pretpostavljeni interfejs sadrži bar Ch3 domen konstantnog domena antitela. U ovom postupku, jedan ili više malih bočnih lanaca amino kiseline za interfejsa prvog molekula antitela se menjaju sa većim bočnim lancima (n.pr., tirozin ili triptofan). Kompenzatome "šupljine" identične ili slične veličine za velikim bočnim lancem(ima) se kreiraju na interfejsu drugog molekula antitela zamenom veliki bočnih lanaca amino kiseline sa manjima (n.pr., alanin ili treonin). Ovo obezbeđuje mehanizam za povećanje prinosa heterodimera preko neželjenih krajnjih proizvoda kao što su homodimeri.

Bispecifična antitela uključuju unakrsno povezana "heterokonjugat" antitela. Na primer, jedno od antitela u heterokonjugatu može biti spareno sa avidinom, drugi sa biotinom. Takva antitela se predlažu, na primer, za ciljanje ćelija imunog sistema ka neželjenim ćelijama (US Patent br. 4,676,980), i za lečenje HIV infekcije (WO 91/00360, WO 92/200373, i EP 03089). Heterokonjugat antitela mogu biti napravljena upotrebom bilo kog pogodnog postupka za unakrsno povezivanje. Odgovarajuća sredstva za unakrsno povezivanje su dobro poznata u nauci, i otkrivena su u US Patentu br. 4,676,980, zajedno sa velikim brojem tehnika unakrsnog povezivanja.

Tehnike za generisanje bispecifičnih antitela od fragmenata antitela su takođe opisane u literaturi. Na primer, bispecifična antitela mogu biti pripremljena upotrebom hemijskog povezivanja. Brennan et al., Science 229:81 (1985) opisuje postupak gde se ćela antitela proteolitički cepaju da generišu F(ab')2 fragmente. Ovi fragmenti se redukuju u prisustvu ditiol reagensa za obrazovanje kompleksa natrijum arsenita da se stabilizuju susedni ditioli i spreči intermolekulamo formiranje disulfida. Generisani Fab' fragmenti se onda konvertuju u tionobenzoat (TNB) derivate. Jedan od Fab'-TNB derivata se onda ponovo konvertuje u Fab'-tiol redukcijom sa merkaptoetilaminom i smeša se sa ekvimolamom količinom drugog Fab'- TNB derivata da se formira bispecifično antitelo. Proizvedena bispecifična antitela mogu biti upotrebljena kao sredstva za selektivnu imobilizaciju enzima.

Skorašnji progres olakšava direktno vađenje Fab'-SH fragmenata iz E. coli, koji mogu biti hemijski spareni da se formiraju bispecifična antitela.

Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992) opisuje proizvodnju u potpunosti humanizovanog bispecifičnog antitela F(ab')2 molekula. Svaki Fab' fragment se odvojeno izlučuje iz E. coli i podvrgava direktnom hemijskom sparivanju in vitro da se formira bispecifično antitelo. Tako formirano bispecifično antitelo je sposobno da se veže za ćelije koje prekomemo eksprimuju ErbB2 receptor i normalne humane T ćelije, kao i da bude okidač litičkoj aktivnosti humanih citotoksičnih limfocita spram ciljanih humanih tumora dojke.

Takođe su opisane različite tehnike za pravljene i izolovanje fragmenata bispecifičnog antitela direkno iz rekombinantne ćelijske kulture. Na primer,

bispecifična antitela su proizvedena upotrebom leucin ubrzivača. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992). Leucin ubrzivač peptidi iz Fos i Jun proteina se vezuju za Fab' delove dva različita antitela genskim spajanjem. Antitelo homodimeri se redukuju u regionu zgloba da se formiraju monomeri i noda re-oksidišu da formiraju antitelo heterodimere. Ovaj postupak može takođe biti iskorišten za proizvodnju antitelo homodimera. "Diatelo" tehnologija opisana od strane Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) obezbeđuje alternativni mehanizam za pravljenje fragmenata bispecifičnog antitela. Ovi fragmenti sadrže teški lanac promenjljivog domena (VH) spojen za laki lanac promenjljivog domena (VL) putem linkera koji je isu više kratak da dopusti sparivanje između dva domena na istom lancu. U skladu sa tim, VH i Vl domeni jednog fragmenta su prisiljeni da se spariju sa komplementarnim VH i VL domenima drugog fragmenta, pri čemu formiraju dva antigen- vezujuća položaja. Postoje izveštaji i o drugoj strategiji za pravljenje fragmenata bispecifičnog antitela upotrebom jednog-lanca Fv (sFv) dimera. Videti Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Razmatrana su antitela sa više od dve valence. Na primer, mogu biti pripremljena trispecifična antitela. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1994).

III. Konjugati i druge modifikacije antagonista

Antagonist koji se upotrebljava u postupcima ili je uključen u članke o proizvodnji koji se ovde nalaze je opciono konjugovan sa citotoksičnim sredstvom.

Hemoterapeutska sredstva korisna u generisanju takvih antagonist- citotoksično sredstvo konjugata su gore opisana.

Konjugati antagonista ili jednog ili više malih molekula toksina, kao što su kalihemicin, maitanzin (US Patent br. 5,208,020), trihoten, i CC1065 su takođe ovde razmatrani. U jednoj realizaciji pronalaska, antagonist je konjugovan za jedan ili više maitanzin molekula (n.pr., oko 1 do oko 10 maitanzin molekula po molkulu antagonista). Maitanzin može, na primer, biti konvertovan sa May-SS-Me koji može biti redukovan do May-SH3 i reagovati sa modifikovanim antagonistom (Chari et al., Cancer Research 52:127-131(1992)) da se generiše maitanzinoid-antagonist konjugat.

Alternativno, antagonist je konjugovan sa jednim ili više kalihemicin molekula. Kalihemicin familija antibiotika je sposobna za proizvodnju prekida na dvostrukoj DNK pri sub-pikomolamim koncentracijama. Strukturalni analozi kalihemicina koji se mogu upotrebiti uključuju, ali nisu ograničeni na, γ11, α21,α31, N-acetil-γ11, PSAG i ϴ11 (Hinman et al., Cancer Research 53: 3336-3342 (1993) i Lode et al., Cancer Research 58: 2925- 2928 (1998)).

Enzimatički aktivni toksini i njihovi fragmenti koji se mogu upotrebiti uključuju difterija A lanac, nevezujuće aktivne fragmente difetiraj toksina, eksotoksin A lanac (od Pseudomonas aeruginosa), ricin A lanac, abrin A lanac, modecin A lanac, alfa-sarcin, Aleurites fordii proteini, diantin proteini, Phytolaca americana proteini (PAPI, PAPU, i PAP-S), momordica charantia inhibitor, curcin, krotin, sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin i trikoteceni. Videti, na primer, WO 93/21232 objavljena 28. oktobra, 1993. godine.

Sadašnji pronalazak dalje razmatra antagonist konjugovan sa jedinjenjem sa nukleolitičkom aktivnošću (n.pr., ribonukleaza ili DNK endonukleaza kao što je deoksiribonukleaza; Dnaze).

Različiti radioaktivni izotopi su dostupni za proizvodnju radiokonjugovanih antagonista. Primeri uključuju At211,1131,1125, Y90, Re186, Sm153, Bi212, P32 i radioaktivne izotope Lu.

Konjugati antagonista i citotoksičnog sredstva mogu biti napravljeni upotrebom različitih sredstava za sparivanje bifunkcionalnog proteina kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridilditiol) propionat (SPDP), sukcinimidil-4- (N-maleimidometil) cikloheksan-l-karboksilat, iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCL), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehide (kao što je glutareldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), bis-diazonium derivati (kao što je bis-(p-diazoniumbenzoil)- etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat), i bis-aktivna fluor jedinjenja (kao što su l,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, ricin imunotoksin može biti pripremljen kao stoje opisano kod Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). Ugljen-14-označena l-izotiocijanatobenzil-3- metildietilen triaminpenatasirćetna kiselina (MX-DTPA) je primemo sredstvo za helatovanje za konjugaciju radionukleotida za antagonist. Videti W094/l 103+26. Linker može biti "linker koji se može cepati" koji olakšava oslobađanje citotoksičnog leka u ćeliju. Mogu biti upotrebljeni, na primer, kiseli-labilni linker, peptidaza-senzitivni linker, dimetil linker ili linker koji sadrži disulfid (Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992).

Alternativno, protein spajanja koji sadrži antagonist i citotoksično sredstvo može biti napravljen, n.pr., putem rekombinantnih tehnika ili sintezom peptida.

U još jednoj realizaciji, antagonist može biti konjugovan za "receptor" (kao što je streptavidin) za iskorištavanje u prethodnom ciljanju tumora pri čemu se antagonist-receptor konjugat daje pacijentu, praćeno uklanjanjem nevezanog konjugati iz cirkulacije upotrebom sredstva za čišćenje i potom davanjem "liganda" (n.pr., avidin) koji je konjugovan za citotoksično sredstvo (n.pr., redionukleotid).

Antagonist sadašnjeg pronalaska može takođe biti konjugovan sa prolek- aktivirajućim enzimom koji konvertuje prolek (n.pr., peptidil hemoterapeutsko sredstvo, videti WO81/01145) u aktini lek protiv kancera. Videti, na primer, WO 88/07378 i U.S. Patent br. 4,957,278.

Enzim komponenta takvih konjugata uključuje bilo koji enzim sposoban za dejstvovanje na prolek na takav način da se konvertuje u svoj aktivniji, citotoksični oblik.

Enzimi koji su korisni u postupku ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, alkalnu fosfatazu korisnu u konvertovanju prolekova koji sadrže sulfat u slobodne lekove; arilsulfatazu korisnu u konvertovanju prolekova koji sadrže sulfat u slobodne lekove; citozin deaminazu korisnu za konvertovanje ne-toksičnog 5-fluorocitozina u lek protiv kancera, 5- fluorouracil; proteaze, kao što je saratia proteaza, termolizin, subtilizin, karboksipeptidaze i katepsini (kao što su katepsini B i L), koji su korisni u konvertovanju prolekova koji sadrže peptid u slobodne lekove; D- alanilkarboksipeptidaze, korisne u konvertovanju prolekova koji sadrže Damino kiselina supstituente; karbohidrat-cepajući enzimi kao što su p- galaktozidaza i neuramidinaza korisni u konvertovanju glikozilovanih prolekova u slobodne lekove; (3-laktamaza korisna u konvertovanju lekova izvedenih sa (3-Iaktamima u slobodne lekove; i penicilin amidaze, kao što su penicilin V amidaza ili penicilin G amidaza, korisni u konvertovanju lekova izvedenih na njihovim amin azotima sa fenokisacetil ili fenilacetil grupama, svakom posebno, u slobodne lekove. Alternativno, antitela sa enzimatičnom aktivnošću, takođe poznata u nauci kao "abzimi", mogu biti upotrebljena da se konvertuju prolekovi pronalaska u slobodne aktivne lekove (videti, n.pr., Massey, Nature 328: 457-458 (1987). Antagonist-abzim konjugati mogu biti pripremljeni kao stoje to ovde opisano za isporuku abzima populaciji ćelija tumora.

Enzimi ovog pronalaska mogu biti kovalentno vezani za antagonist tehnikama koje su dobro poznate u nauci kao što je upotreba heterobifunkcionalnih za unakrsno povezivanje reagensa koji su gore razmatrani. Alternativno, spojeni protein koji sadrži bar antigen vezujući region antagonista pronalaska povezan za bar funkcionalno aktivni deo enzima pronalaska može biti konstruisan upotrebom rekombinantnih DNK tehnika poznatih u nauci (videti, n.pr., Neuberger et al., Nature, 312: 604608 (1984)).

Druge modifikacije antagonista su ovde razmatrane. Na primer, antagonist može biti povezan za jedan od različitih neproteinskih polimera, n.pr., polietilen glikol, polipropilen glikol, polioksialkileni, ili kopolimeri polietilen glikola i polipropilen glikola.

Antagonisti koji su ovde otkriveni mogu takođe biti formulisani kao lipozomi. Lipozomi koji sadrže antagonist se pripremaju postupcima poznatim u nauci, kao što su oni opisani kod Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); U.S. Pat. br. 4,485,045 i 4,544,545; i W097/38731 objavljena 23. oktobra 1997.godine. Lipozomi sa pojačanim vremenom cirkulacije su otkiveni u U.S. Patent br. 5,013,556.

Posebno korisni lipozomi mogu biti generisani postupkom isparavanja reversne faze sa lipid sastavom koji sadrži fosfatidilholin, holesterol i PEG- derivatizovane fosfatidiletanolamin (PEG-PE). Lipozomi se iscede kroz filtere definisane veličine pore da se dobije prinos lipozoma sa željenim prečnikom. Fab' fragmenti antitela sadašnjeg pronalaska mogu biti

konjugovani za lipozome kao stoje to opisano kod Martin et al. J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) putem reakcije disulfidne interne izmene. Hemoterapeutsko sredstvo se opciono sadržu u okviru lipozoma. Videti Gabizon et al., J. National Cancerlnst. 81(19)1484 (1989).

Razmatrane su modifikacija(e) sekvence amino kiseline protein ili peptid antagonista koje su ovde opisane. Na primer, može biti poželjno da poboljša afinitet vezivanja i/ili druge biološke osobine antagonista. Varijante sekvence amino kiseline antagonista se pripremaju uvođenjem odgovarajućih nukleotidnih promena u antagonist nukleinsku kiselinu, ili putem sinteze peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, uklanjanje sa, i/ili umetanja na i/ili supstitucije, ostataka u okviru sekvenci amino kiseline antagonista. Bilo koja kombinacija uklanjanja, umetanja, i supstitucije je učinjena da dođe do konačnog konstrukta, obezbeđujući da konačni konstrukt poseduje željene karakteristike. Promene amino kiseline mogu takođe promeniti post-traslacione postupke antagonista, kao što je promena broja ili pozicije položaja glikozilacije.

Koristan postupak za identifikaciju određenih ostataka ili regiona antagonista koji su pretpostavljene lokacije za mutagenezu se naziva "mutageneza alanin skeniranjem" kao što je to opisano od Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Ovde, ostatak ili grupa ciljnih ostataka se identifikuje (n.pr., napunjeni ostatci kao što su arg, asp, his, lys, i glu) i zamenjuje putem neutralne ili negativno napunjene amino kiseline (najpoželjnije alanin ili polialanin) da se utiče na interakciju amino kiselina sa antigenom. Ove lokacije amino kiseline koje demonstriraju funkcionalnu senzitivnost na supstitucije se onda prečiste uveđenjem daljih ili drugih

varijanti na, ili za, položaje supstitucije. Tako, dok je položaj za uvođenje varijacije sekvence amino kiseline prethodno određen, priroda mutacije per se ne treba da bude prethodno određena. Na primer, da se anlizira izvršavanje mutacije na datom položaju, ala skeniranje ili nasumična mutageneza se obavljaju na ciljnom kodonu ili regionu i ekspresovane varijante antagonista se pretražuju za željenu aktivnost.

Umeci sekvence amino kiseline, uključuju amino- i/ili karboksil-krajnja spajanja u rasponu dužine od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže sto ili više ostataka, kao i umetaka unutar sekvence jediničnih ili višestrukih ostataka amino kiseline. Primeri krajnjih umetanja uključuju antagonist sa N-krajnjim metionil ostatkom ili antagonist spojen za citotoksični polipeptid. Druge varijante za umetanje antagonist molekula uključuju spajanje za N- ili C-završetak antagonista na enzimu, ili polipeptidu koji povećava poluživot seruma antagonista.

Sledeći tip varijante je varijanta supstitucije amino kiseline. Ove varijante imaju bar jedan ostatak amino kiseline u antagonist molekulu zamenjen različitim ostatkom. Položaji od najvećeg interesa za supstitucionu mutagenzu antitelo antagonista uključuju hiperpromenjljive regione, ali FR alternacije se takođe razmataraju. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 1 pod nalovom "pretpostavljene supstitucije". Ukoliko takve supstitucije rezultiraju u promeni biološke aktivnosti, onda se može uvesti više suštinskih promena, označenih kao "primeme supstitucije" u Tabeli 1, ili kao što je dalje u donjem tekstu opisano u referenci za klase amino kiseline, i proizvod se pretražuje.

Suštinske modifikacije u biološkim osobinama antagonista su postugnute odabiranjem supstitucija koje se značajno razlikuju u njihovom dejstvu na održavanju (a) strukture kičme polipeptida u oblasti supstitucije, na primer, kao pločastog ili spiralnog oblika, (b) punjenja ili hidrofobičnosti molekula

na ciljnom položaju, ili (c) veličine bočnog lanca. Prirodno nastali ostatci se dele u grupe za osnovu uobičajenih osobina bočnog lanca:

(1) hidrofobni: norleucin, met, ala, val, leu, ile;

(2) neutralno hidrofilični: cys, ser, thr;

(3) kiseli: asp, glu;

(4) bazni: asn, gln, his, lys, arg;

(5) ostatci koji utiču na orjentaciju lanca: gly, pro; i

(6) aromatični: trp, tyr, phe.

Nekonzervativne supstitucije će povlačiti za sobom izmenu člana jedne od ovih klasa za drugu klasu.

Bilo koji cistein ostatak koji nije uključen u održavanje pravilnog sastava antagonista može biti supstituisan, generalno sa serinom, da poboljša oksidativna stabilnost molekula i spreči nenormalno unakrsno povezivanje. Suprotno tome, cistein veza(e) mogu biti dodate antagonistu da se povoljša njegova stabilnost (posebno gde je antagonist fragment antitela kao što je to Fv fragment).

Posebno pretpostavljeni tip supstitucione varijante ukljčuje supstituisanje jednog ili više heperpromenjljivih regiona ostataka matičnog antitela. Generalno, rezultirajuća(e) varijanta(e) odabrane za daljii razvoj će imati poboljšane biološke osobine u poređenju sa matičnim antitelom iz koga su generisane. Pogodan način za generisanje takvih supstitucionih varijanti je sazrevanje afiniteta upotrebom prikaza fage. Ukratko, nekoliko položaja hiperpromenjljivog regiona (n.pr., 6-7 položaji) mutiraju da generišu sve moguće amino supstitucije na svakom od položaja. Tako generisane

varijante antitela se prikazuju na monovalentni način iz filamentnih čestica fage pošto su spajanja za gen III proizvod od Ml3 spakovana u okviru svake čestice.č varijante koje se prikazuju fagom se onda pretražuju na njihovu biološku aktivnost (n.pr., afinitet vezivanja) kako je to ovde otkriveno. Da bi se identifikovali kandidati položaji hiperpromenjljivog regiona za modifikaciju, može se obaviti mutageneza skeniranja alanina da se idetifikuju ostatci hiperpromenjljivog regiona koji značajno doprinose vezivanju antigena. Alternativno, ili dodatno, može biti korisno da se analizira struktura kristala antigen-antitelo kompleksa da se identifikuju kontaktne tačke između antitela i antigena. Takvi kontaktni ostatci i susedni ostatci su kandidati za supstituciju prema tehnikama koje su ovde elaborirane. Kada se jednom takve varijante generišu, panel varijanti se podvrgava pretraživanju kako je to ovde opisano i antitela sa superiornim osobinama u jednom od više relevantnih ogleda se mogu odabrati za dalji razvoj.

Sledeći tip varijante amino kiseline antagonista menja originalni model glikozilacije antagonista. Pod menjanjem se misli uklanjanje jednog ili više ostataka ugljenih hidrata pronađenih u antagonistu, i/ili dodavanje jednog ili više položaja glikozilacije koji nisu prisutni u antagonistu.

Glikozilacija polipeptida je tipično bila N-povezana ili O-povezana. N- povezanost se odnosi na kačenje ostatka ugljenog hidrata za bočni lanac asparagin ostatka. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serina i asparagin-X- treonina, gde je X bilo koja amino kiselina sem prolina, su sekvence za prepoznavanje za enzmsko kačenje ostatka ugljenog hidrata za bočni lanac asparagina. Tako, prisustvo bilo koje od ovih tripeptidnih sekvenci u

polipeptidu kreira potencijalni položaj glikozilacije. O-povezana glikozilacija se odnosi na kačenje jednog ili više šećera N- aceilgalaktozamina, galaktoze, ili ksiloze za hidrokiamino kiselinu, najuobičajenije treonin, iako se takođe mogu upotrebiti 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin.

Dodavanje položaja glikozilacije za antagonist se uobičajeno postiže menjanjem sekvence amino kiseline na takav način da on sadrži jednu ili više od gore opisanih tripeptidnih sekvenci (za N-povezane položaje glikozilacije). Menjanje može takođe biti učinjeno dodavanjem, ili supstitucijom sa, jednog ili više serin ili treonin ostataka sekvenci originalnog antagonista (za O-povezane položaje glikozilacije).

Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju varijante sekvence amino kiseline antagonista se pripremaju različitim postupcima poznatim u nauci. Ovi postupci uključuju, ali nisu ograničeni na, izolovanje iz prirodnog izvora (u slučaju prirodno nastalih varijanti sekvence amino kiseline) ili pripremanjem putem oligonukleotidom-posredovane (ili položaj em-usmerene) mutageneze, PCR mutageneze, i kasetne mutageneze ranije pripremljene varijante ili ne- varijantne verzije antagonista.

Može biti poželjno da se modifikuje antagonist pronalaska u pogledu efektor funkcije, n.pr., da se pojača antigen-zavisna ćelijski-posredovana citotoksičnost (ADCC) i/ili komplementarno zavisna citotoksičnost (CDC) antagonista. Ovo može biti postignuto uvođenjem jedne ili više supstitucija amino kiseline u Fc regionu antitela antagonista. Alternativno ili dodatno, cistein ostatak(ci) mogu biti uvedeni u Fc region, čime se dopušta unatar

lančana formacija disulfidne veze u ovom regionu. Tako generisano homodimerično antitelo može imati poboljšanu intemalizaciju i/ili povećano komplementamo-posredovano ubijanje ćelija i od antitela zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADCC). Videti Caron et al., J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992) i Shopes, B.J. Immunol. 148:2918-2922(1992). Homodimerična antitela sa pojačanom anti-tumor aktivnošću mogu takođe biti pripremljena upotrebom heterobifunkcionalnih unakrsnih-linkera kao što je to opisano kod Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativno, antitelo može biti napravljeno da ima dvostruke Fc regione i može prema tom imati pojačanu komplementarnu ližu i ADCC sposobnosti. Videti Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).

Da se poveća poluživot seruma antagonista, možemo inkorporisati spasilački epitop za povezivanje receptora u antagonistu (posebno fragmentu antitela) kao što je to na primer opisano u US Patent 5,739,277. Kako se to ovde upotrebljava, pojam "spasilački epitop za povezivanje receptora" se odnosi na epitop Fc regiona IgG molekula (n.pr., IgGb IgG2, IgG3 ili IgG4) koji je odgovoran za povećavanje in vivo poluživota seruma IgG molekula.

III. Farmaceutske formulacije

Terapeutske formulacije antagonista koji se upotrebljava u skladu sa sadašnjim pronalaskom se pripremaju za skladištenje mešanjem antagonist koji ima željeni stepen čistoće sa opcionim farmaceutski prihvatljivim nosačima, inertnim puniocima ili stabilizatorima (Remington ’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku liofilisanih formulacija ilki vodenih rastvora. Prihvatljivi nosači, inertni punioci, ili stabilizatori su netoksični za receptore u dozama i koncentracijama koje se upošljavaju, i uključuju pufere kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidante uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; prezervative (kao što su oktadecildimetilbenzil amonijumhlorid; heksametonijumhlorid; benzalkonijumhlorid, benzetonijumhlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene kao što su metili ili propil paraben; katehol; resorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m- krezol); polipeptidi niske molekularne težine (manje od oko 10 ostataka); proteini, kao što su serum albimin, želatin, ili imunoglobulini; hidrofilični polimeri kao što je polivinilpirolidon; amino kiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin, ili lizin; monosaharidi, disaharidi, i drugi ugljeni-hidrati uključujući glukozu, trehalozu ili sorbit; so-formirajući kontra-joni kao stoje natrijum; metalni kompleksi (n.pr., Zn-protein kompleksi); i/ili ne-jonska površinska sredstva kao što su TWEEN™, PLURONICS™ ili polietilen glikol (PEG).

Primeme formulacije anti-CD antitela su opisane u W098/56418, i izričito ovde inkorporisane putem reference. Ova objava opisuje tečnu multidoznu formulaciju koja sadrži 40 mg/mL rituksimab, 25 mM acetat, 150 mM trehalozu, 0,9% benzil alkohola, 0,02% polisorbat 20 at pH 5,0 koja ima minimalni život na polici od dve godine skladištenja na 2-8°C. Sledeća anti- CD20 formulacija od interesa sadrži 10 mg/mL rituksimab u 9,0 mg/mL natrijumhloridu, 7,35 mg/mL natrijumcitrat dihidrata, 0,7 mg/mL polisorbat 80, i sterilnu vodu za ubrizgavanje, pH 6,5.

Liofilisane formulacije adaptirane za potkožno davanje su opisane u W097/04801. Takve liofilisane formulacije mogu biti rekonstituisane sa

odgovarajućim razređivačem do visoke proteinske koncentracije i rekonsituisana formulacija može biti data potkožno sisaru koji se ovde ima tretirati.

Ova formulacija može takođe sadržati više od jednog aktivnog jedinjenja ukoliko je to neophodno za određenu indikaciju koja se tretira, pretpostavljeno ona sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču škodljivo jedna na drugu. Na primer, može biti poželjno da se dalje obezbedi citotoksično sredstvo, hemoterapeutsko sredstvo, citokin ili iminosupresivno sredstvo {n.pr., ono koje deluje na T ćelije, kao što je ciklosporin ili antitelo koje vezuje T ćelije, n.pr., ono koje vezuje LFA-1). Efikasna količina takvih drugih sredstava zavisi od količine antagonista prisutne u formulaciji, tipa bolesti ili poremećaja ili lečenja, i drugih faktora koji su gore razmatrani. Ona se uglavnom upotrebljavaju u istim dozama i sa putevima davanja kako se to ovde u ranijem tekstu upotrebljava ili oko od 1 do 99% od ranije uposlenih doza.

Aktivni sastojci mogu takođe biti uvedeni u mikrokapsule pripremljene, na primer, putem tehnika stapanja ili putem interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloza ili želatin-mikrokapsule i poli-(metilmetacilat) mikrokapsule, svaka posebno, u koloidnim sistemima isporuke leka (na primer, lipozomi, albumin mikrosfere, mikroemulzije, nano-čestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su otkrivene u Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Mogu biti pripremljeni preparati sa odloženim dejstvom. Pogodni primeri preparata sa odloženim dejstvom uključuju polupropustljive matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže antagonist, matrice koje su u obliku oblikovanih artikala, n.pr., filmova, li mikrokapsula. Primeri matrica sa odloženim dejstvom uključuju poliestre, hidrogelove (na primer, poli(2- hidroksietil-metakrilat), ili poli(vinilalkohol), polilaktidi (U.S. Pat.br. 3,773,919), kopolimeri L-glutaminske kiseline i y etil-L-glutamat, ne- degradirajući etilen-vinil acetat, degradirajući mlečna kiselina-glikolna kiselina kopolimeri kao stoje LUPRON DEPOTTM (mikrosfere za ubrizgavanje sastavljene od kopolimera mlečna kiselina-glikolna kiselina i leuprolid acetata), i poli-D-(-)-3-hidroksibutema kiselina.

Formulacije koje se imaju upotrebiti in vivo davanjem moraju biti sterilne. Ovo se postiže filtriranjem kroz sterilne membrane za filtriranje.

IV. Lečenje sa antagonistom

Sadašnji pronalazak se tiče terapije subpopulacije sisara, posebno ljudi, sa, ili prijemčivih za, autoimunu bolest, koji doživljavaju neadekvatan odgovor na raniji ili trenutni tretman sa TNFa-inhibitorom. Generalno, sisar koji se ovde ima lečiti će biti identifikovan nakon terapije sa jednim ili više tretmana sa jednim ili više od TNFa-inhibitora kao što su Etanercept (ENBREL®), Infliksimab (REMICADE®) ili Adalimumab (HUMIRA™), pošto doživljava neadekvatan odgovor na prethodni ili trenutni tretman sa TNFa-inhibitorom usled toksičnosti i/ili neadekvatne efikasnosti. Ipak, pronalazak nije ograničen na korak prethodne terapije sa takvim TNFa- inhibitorom; na primer, pacijent se može smatrati daje sklon da doživi toksičnost, n.pr., srčanu toksičnost, sa TNFa-inhibitorom pre nego što je sama terapija sa njim započela, ili za pacijenta može biti utvrđeno daje onaj za koga je malo verovatno da će odgovoriti na terapiju sa TNFa- inhibitorom.

Različite autoimune bolesti koje se ovde imaju tretirati su navedene u gornjem delu sa definicijama. Ovde pretpostavljene indikacije su reumatoidni artritis, psorijatični artritis, ili Crohn-ova bolest.

Generalno, sisar koji se ovde tretira neće patiti od malignosti B-ćelija.

Prema jednoj realizaciji pronalaska koja se ovde razmatra, terapeutski prilaz će smanjiti negativne sporedne efekte (kao što su infekcije, prestanak rada srca i demijelinizacija) povezane sa terapijom sa TNFa-inhibitorom.

Sastav koji sadrži antagonist koji se vezuje za površinski marker B ćelije će biti formulisan, doziran, i dat na način koji je konzistentan sa dobrom lekarskom praksom. Faktori koji se imaju uzeti u obzir u ovom kontekstu uključuju određenu bolest ili poremećaj koji se tretira, određenog sisara koji se ima tretirati, kliničko stanje individualnog pacijenta, uzrok bolesti ili poremećaja, položaj isporuke sredstva, postupak davanja, vremensko određenje davanja, i druge faktore poznate medicinskog praktičara. Terapeutski efikasna količina antagonist koji se ima dati će biti određena uz razmatranje takvih faktora.

Kao generalni predlog, terapeutski efikasna količina antagonista koji se daje parenteralno po dozi će biti u rasponu od oko 0,1 do 20 mg/kg pacijentove

telesne težine na dan, za tipičnim inicijalnim rasponom antagonista koji se ima upotrebiti koji je u rasponu od oko 2 do 10 mg/kg.

Pretpostavljeni antagonist je antitelo, n.pr., antitelo kao stoje RITUXAN®, koji nije konjugovan za citotoksično sredstvo. Pogodne doze za nekonjugovano antitelo, su, na primerr, u rasponu od 20 mg/m2 do oko 1000 mg/m2. U jednoj realizaciji, doza antetela se razlikuje od trenutno preporučene za RITUXAN®. Na primer, može se dati pacijentu jedna ili više doza suštinski manja od 375 mg/m2 antitela, n.pr., gde je doza u rasponu od oko 20 mg/m2 do oko 250 mg/m2, na primer od oko 50 mg/m2 do oko 200 mg/m2.

Primemi režimi doziranja uključuju 375 mg/m2 nedeljno x 4; ili 1000 mg x 2 (n.pr., na dan prvi i petnaesti).

Sta više, može se dati jedna ili više inicijalna(ih) doza antitela praćeno sa jednom ili sa više inicijalnom(ih) dozom(a), pri čemu mg/m doza antitela u potonjoj (im) dozi(ama) prelazi mg/m2 doze antitela u inicjalnoj(im) dozi(ama). Na primer, inicijalna doza može biti u rasponu od oko 20 mg/m do oko 250 mg/m2 {n.pr, od oko 50 mg/m2 do oko 200 mg/m2) i potonja doza može biti u rasponu od oko 250 mg/m do oko 1000 mg/m .

Kako je to gore zabeleženo, ipak, ove sugerisane količine antagonista su podložne u velikoj meri terapeutskom diskrecionom pravu. Ključni faktor u odabiranju odgovarajuće doze i rasporedu davanja je dobijeni rezultat, kako je to u gornjem tekstu naznačeno. Na primer, relativno više doze mogu biti inicijalno neophodne za lečenje bolesti koje su u toku i akutnih bolesti. Da se dobiju najefikasniji rezultati, u zavisnosti od bolesti ili poremećaja, antagonist se daje što je moguće bliže prvom znaku, dijagnozi, pojavljivanju, i nastanku bolesti ili poremećaja ili tokom remisije bolesti ili poremećaja.

Antagonist se daje bilo kojim pogodnim sredstvom, ukljčujući parenteralno, potkožno, intraperitonelno, intrapulmonalno, i intranazalno, i, ukoliko se želi za lokalno imunosupresivno lečenje, davanje unutar povređenog organa. Parenteralne infuzije uključuju intramuskulamo, intravenozno, intraarterijsko, intraperitonelno, ili potkožno davanje. Dodatno, antagonist se može pogodno dati putem pulsne infuzije, n.pr., sa smanjivanjem doza antagonista. Pretpostavljeno se doze daju putem ubrizgavanja, najpoželjnije intravenoznim ili potkožnim ubrizgavanjima, koje delimično zavisi od toga da li je davanje kratko ili hronično.

Sa ovim antagonistom mogu se davati druga jedinjenja, kao što su citotoksična sredstva, hemoterapeutska sredstva, imunosupresivna sredstva i/ili citokini. Kombinovano davanje uključuje zajedničko davanje, upotrebom odvojenih formulacija ili jedne farmaceutske formulacije, i uzastopna davanje po bilo kom redu, pri čemu pretpostavljeno postoji vremenski period kada oba (ili sva) aktivna sredstva simultano ispoljavaju svoje biološke aktivnosti. Za RA, i druge autoimune bolesti, antagonist {n.pr., CD20 antitelo) može biti kombinovan sa jednim ili više antireumatskih lekova koji modifikuju bolest (DMARD-ovi) kao što su hidroksiklorohin, sulfasalazin, metotreksat, leflunomid, azatioprin, D- penicilamin, Gold (oralni), Gold (intramuskulami), minociklin, ciklosporin, Stafilokokni protein A imunoadsorbcija; intravenozni imunoglobulin ((IVIG); nesteroidni antiinflamatomi lekovi (NSAID-ovi); glukokortikoid

(n.pr., putem ubrizgavanja u zglob); kortikosteroid {n.pr., metilprednisolon i/ili prednison); folat itd. Pretpostavljeno, TNFa-inhibitor se ne daje sisaru tokom perioda lečenja sa CD20 antagonistom.

Po strani od davanje protein antagonista pacijentu sadašnja prijava razmatra davanje natagonista putem genske terapije. Takvo davanje nukleinske kiseline koja kodira antagonist je obuhvaćeno putem izraza "davanje terapeutski efiksane količine antagonista". Videti, na primer, WO96/07321 objavljene 14. marta 1996. godine tiče se upotrebe genske terapije da se generišu intraćelijska antitela.

Postoje dva glavna prilaza dobijanja nukleinske kiseline (koja se opciono sadrži u vektoru) u pacijentovim ćelijama; in vivo i ex vivo. Za in vivo isporuku nukleinska kiselina se ubrizgava direktno u pacijenta, uobičajeno na položaj gde se antagonist zahteva. Za ex vivo lečenje, pacijentove ćelije se uklanjaju, neukleinska kiselina se uvodi u ove izolovane ćelije i modifikovane ćelije se daju pacijentu bilo direktno ili, na primer, kapsulirane u okviru poroznih membrana koje se implantiraju u pacijenta (videti, n.pr., U.S. Patent br. 4,892,538 i 5,283,187). Postoje različite raspoložive tehnike za uvođenje nukleinskih kiselina u žive ćelije. Tehnike se razlikuju u zavisnosti od toga da li se nukleinska kiselina transferiše u kultivisane ćelije in vitro, ili in vivo u ćelije nameravanog domaćina. Pogodne tehnike za transfer nukleinske kiseline u sisarske ćelije in vitro uključuju upotrebu lipozoma, elektroporaciju, mikroubrizgavanje, spajanje ćelije, DEAE-dekstran, postupak taloženja kalcijum fosfata, itd. Uobičajeni vektor gena koji se upotrebljava za ex vivo isporuku je retrovirus.

Trenutno pretpostavljene in vivo tehnika transfera nukleinske kiseline uključuju transfekciju sa viralnim vektorima (kao što su adenovirus, Herpes simpleks I virus, ili adeno-povezani virus) i sisteme koji se baziraju na lipidima (korisni lipidi za transfer gena posredovan lipidom su DOTMA, DOPE i DC-Chol, na primer). U nekim situacijama je poželjno da se obezbedi izvor nukleinske kiseline sa sredstvom koje cilja ciljane ćelije, kao što su to antitelo specifično sa protein membrane na ćelijskoj povrišini ili ciljanu ćeliju, ligand za receptor na ciljanoj ćeliji, itd. Gde se lipozomi upošljavaju, proteini koji se vezuju za protein membrane površine ćelije povezanom sa endocitozom mogu biti upotrebljeni za ciljanje i/ili olakšavanje primanja, n.pr., kapsid proteini ili njihovi fragmenti odgovarajući za određeni tip ćelije, antitela za proteine koji se podvrgavaju intemalizaciji u toku ciklusa, i proteini koji ciljaju intraćelijsku lokalizaciju i pojačavaju intraćelijski polu-život. Tehnika receptorom-posredovane endocitoze je opisana, na primer, od strane Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987); i Wagner etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410- 3414 (1990). Za pregled trenutno poznatih markiranja gena i protokole genske terapije videti Anderson et al, Science 256:808-813 (1992). Videti takođe WO 93/25673 i reference koje su tu navedene.

Dalji detalji pronalaska su ilustrovani sledećim neograničavajućim primerima. Otkrića svih navoda u specifikaciji su izričiti inkorporisana ovde putem reference.

Pacijent sa aktivnim reumatoidnim artritisom koji ima neadekvatan odgovor na jedan ili više TNFa-inhibitor terapija se tretira sa antitelom koje vezuje B-ćelija površinski antigen, CD20.

Kandidati za terapiju prema ovom primeru uključuju one koji doživljavaju neadekvatan odgovor na prethodni ili trenutni tretman sa etanerceptom, invliksimabom i/ili adalimumabom usled toksičnosti ili neadekvatne efikasnosti (etanercept tokom > 3 meseca pri 25 mg dva puta nedeljno ili bar 4 infuzije infliksimaba pri > 3 mg/kg).

Pacijenti mogu imati otečen broj zgloba (SJC) > 8 (66 broj zgloba), i mekan broj zgloba (TJC) > 8 (68 broj zgloba) na pretraživanju i nasumičnosti; bilo CRP > 1,5 mg/dL (15 mg/L) ili ESR > 28 mm/h; i/ili radiografska evidencija od bar jednog zgloba sa definitivnom erozijom koja se može pripisati reumatoidnom artritisu, kako se to utvrđuje putem položaja za centralno čitanje (bilo koji zglob šaka, zglobova šaka ili stopala može se uzeti u razmatranje uz izuzetak DIP zglobova šaka).

CD20 antitelo koje se upotrebljava za terapiju može biti Rituksimab (komercijalno dostupan od Genentech, Ine.) ili humanizovani 2H7 vi6.

Pacijenti se tretiraju sa terapeutski efektivnom dozom CD20 antitela, na primer, 1000 mg i.v. na Dane 1 i 15, ili 375 mg/m2 i.v. nedeljno x 4.

Pacijenti mogu takođe primiti istovremeno MTX (10-25 mg/nedelja oralno (p.o) ili parenteralno), zajedno režimom kortikosteroida koji se sastoji od metilprednisolona 100 mg i.v. 30 minuta pre infuzija CD20 antitela i prednisona 60 mg p.o. na dane 2-7, 30 mg p.o. na dane 8-14, za povratkom na osnovnu dozu sa danom 16. Pacijenti mogu takođe primiti folat (5 mg/nedelja) dat bilo kao jedna doza ili podeljen na dnevne doze. Pacijenti opciono nastavljaju da primaju bilo koji pozadinski kortikosteroid (< 10 mg/d prednison ili ekvivalent), tokom celog vremenskog perioda lečenja.

Primarna krajnja tačka može biti proporcija pacijenata sa ACR20 odgovorom na nedelju 24 upotrebom Cochran-Mante.-Haenszel (CMH) testa za upoređivanje razlika grupe, podešen za reumatoidni faktor i region.

Potencijalne sekundarne krajnje tačke uključuju:

1. Proporcija pacijenata sa ACR50 i 70 odgovorima na nedelju 24. Ovo može biti analizirano kao specifično za primarnu krajnju tačku.

2. Promena skoru aktivnosti bolesti (DAS) od pretraživanja do nedelje 24. Ovo može biti ocenjeno upotrebom ANOVA modela sa osnovom DAS, reumatoidni faktor, i lečenje kao stoje to uslovljeno u modelu.

3. Kategorički DAS responderi (EULAR odgovor) na nedelju 24. Oni mogu biti ocenjeni upotrebom CMH testa podešenog za reumatoidni faktor.

4. Promene od pretraživanja u ACR podešenom jezgru (SJC, TJC, globalne procene pacijenat i lekara, HAQ, bol, CRP, i ESR). Opisne statistike mogu biti u izveštajima za ove parametre.

5. Promene od pretraživanja u SF-36. Opisne statistike mogu biti u izveštajima za 8 skorova, i skorove mentalne i fizičke komponente.

Dodatno, skorovi mentalne i fizičke komponente mogu biti dalje kategorizovani i analizirani.

6. Promena u modifikovanom Sharp-ovom radiografskom ukupnom skoru, skoru erozije, i skoru sušavanja prostora u zglobu. Oni mogu biti analizirani upotrebom kontinuirane i kategoričke metodologije, kako je to već odgovarajuće.

Istraživane krajnje tačke i analiza mogu uključiti:

ACR(20/50/70 i ACR n) i promena u DAS odgovorima tokom nedelja 8, 12, 16, 20, 24 i nadalje će biti ocenjeni upotrebom binarnog ili kontinuirano ponavljanja modela mera, kako je to već odgovarajuće. Istraživane radiografičke analize uključuju proporciju pacijenata bez erozivne progresije mogu biti ocenjene na nedelje 24 i nadalje.

Dalje istraživane krajnje tačke (na primer kompletan klinički odgovor, period bez bolesti) će se analizirati opisano kao deo proširenog perioda posmatranja.

Promene Screen-a u FACIT-F zamoru će biti analizirane sa opisnim statistikama.

Terapija RA sa CD20 antitelom u pacijentima sa neadekvatnim odgovorom za terapiju TNFa inhibitorom kako je to gore opisano će rezultirati u korisnom kliničkom odgovoru prema bilo kojoj pojedinačnoj ili više od jedne krajnjoj tački koja je gore zabeležena.

Claims (13)

1. Postupak lečenja autoimune bolesti kod sisara koji doživljava neadekvatan odgovor na TNFa-inhibitor, naznačen time, što se sastoji od davanja sisaru terapeutski efiksane količine antagonista koji se vezuje za površinski marker B ćelije.

2. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što je površinski marker B ćelije odabran od grupe koja sadrži CD 10, CD 19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 i CD86.

3. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što antagonist sadrži antitelo.

4. Postupak prema zahtevu 3, naznačen time, što antitelo vezuje CD20.

5. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što je autoimuna bolest odabrana od grupe koja sadrži artritis (reumatoidni artritis, mladalački reumatoidni artritis, osteoartritis, psorijatički artritis), psorijazu, dermatitis, polimiozitis/dermatomiozitis, toksičnu epidermalnu nekrolizu, sistemsku sklerodermu i sklerozu, odgovore povezane sa inflamatomom bolesti creva, Crohn-ovu bolest, ulcerativni kolitis, sindrom respiratornog bola, sindrom respiratornog bola kod odraslih (ARDS), meningitis, encefalitis, uveitis, kolitis, glomerulonefritis, alergijska stanja, ekcem, astmu, uslove koji uključuju infiltraciju T ćelija i hronične inflamatome odgovore, aterosklerozu, auto imuni miokarditis, nedostatak adhezije leukocita, sistemski lupus eritematozus (SLE), mladalački početni dijabetis, multipleks sklerozu, alergijski encefalomijelitis, imune odgovore povezane sa akutnom ili zakasnelom hipersenzitivnošću povezanom citokinima i T-limfocitima, tuberkulozu, sakoidozu, granulomatozu uključujući Wegener-ovu granulomatozu, agranulocitozu, vaskulitis (uključujući ANCA), aplastičnu anemiju, Diamond Blackfan anemiju, imunu hemolitičku anemiju uključujući autoimunu hemolitičnu anemiju (AIHA), ubitačnu anemiju, čistu aplaziju crvenih krvnih zrnaca (PRCA), nedostatak Faktora VII, hemofiliju A, autoimunu neutropeniju, pancitopeniju, leukopeniju, bolesti koje uključuju diapedezu leukocita, inflamatame poremećaje centralnog nervnog sistema (CNS), sindrom višestruke povrede organa, mizateniju gravis, bolesti posredovane antigen-antitelo kompleksom, bolest anti-glomerulame osnove membrane, sindrom anti-fosfolipidnog antitela, alergijski neuritis, Bechet bolest, Castleman-ov sindrom, Goodpasture-ov sindrom, Lambert- Eaton Miastenički Sindrom, Reynaud-ov sindrom, Sjorgen-ov sindrom, Stevens-Johnson sindrom, odbacivanje transplanta čvrstih organa, bolest presađenog organa spram domaćina (GVHD), bulozni pemfigoid, pemfigus, autoimune poliendokrinopatije, Reiter-ovu bolest, sindrom ukočenog čoveka, arteritis džinovske ćelije, nefritis imunog kompleksa, IgA nefropatiju, IgM polineuropatije ili sa IgM posredovana neuropatija, idiopatsku trombocitopeničnu krvavu pegu (ITP), trombotičnu trombocitopeničnu krvavu pegu (TTP), autoimunu trombocitopeniju, autoimunu bolest testisa i jajnika uključujući autoimuni orhitis i ooforitis, primami hipotiroidizam; autoimune endokrine bolesti uključujući autoimuni tiroiditis, hronični tiroiditis (Hashimoto-ov tiroiditis), subakutni tiroiditis, idiopatski hipotiroidizam, Addison-ovu bolest, Grav-ovu bolest, autoimune poliglandularae sindrome (ili sindrome poliglandulame endokrinopatije), Tip I dijabetis na koji se takođe poziva kao na od insulina zavisni dijabetis melitus (IDDM) i Sheehan-ov sindrom; autoimuni hepatitis, limfoidni interstitialni pneumonitis (HIV), bronhiolitis obliterans (bez-transplanta) spram NSLP, Guillain-Barre sindrom, vaskulitis velikog suda (uključujući polymyalgia rheumatica i (Takayas-ov) arteritis džinovske ćelije), vaskulitis srednjeg suda (uključujući Kawasaki-jevu bolest i polyarteritis nodosa), ankilozni spondilitis, Berger-ovu bolest (IgA nefropatija), rapidni progresivni glomerulonefiritis, primarnu žučnu cirozu, trbušnu psilozu (gluten eneropatija), krioglobulinemiju, amiotrofhu lateralnu sklerozu (ALS), bolest srčanje arterije.

6. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što je sisar čovek.

7. Postupak prema zahtevu 3, naznačen time, što antitelo nije konjugovano sa citotoksičnim sredstvom.

8. Postupak prema zahtevu 4, naznačen time, što antitelo sadrži rituksimab.

9. Postupak prema zahtevu 4, naznačen time, što antitelo sadrži humanovani 2H7 vl6 koji se sastoji od promenjljivih domena kao što je to u SEQ ID Nos. 1 i 2.

10. Postupak prema zahtevu 3, naznačen time, što je antitelo konjugovano sa citotoksičnim sredstvom.

11. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što se u osnovi sastoji od davanja antagonista sisaru.

12. Postupak lečenja reumatoidnog artritisa kod sisara koji doživljava neadekvatan odgovor na TNFa-inhibitorom, naznačen time, što se sastoji od davanja terapeutski efiksane količine antitela koje se vezuje za CD20.

13. Postupak smanjenja rizika od negativnih sporednih efekata odabranih od grupe koja se sastoji od infekcije, prestanka rada srca i demijelinacije, naznačen time, što se sastoji od davanja sisaru sa autoimunom bolešću terapeutski efiksane količine antagonista koji se vezuje za površinski marker B ćelije.