MD3573983T2 - N-[4-fluoro-5-[[(2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]-1-piperidil]metil]tiazol-2-il]acetamidă în calitate de inhibitor OGA - Google Patents

Abstract

Prezenta invenţie furnizează un compus cu Formula (I) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, şi utilizarea compuşilor cu Formula (I) pentru tratamentul bolilor sau tulburărilor neurodegenerative, cum ar fi boala Alzheiemer.

Description

Prezenta invenţie se referă la noi compuşi 5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il, la compoziţii farmaceutice cuprinzând compuşii, la compuşii pentru utilizare în tratamentul tulburărilor fiziologice, şi la intermediari şi procedee utile în sinteza compuşilor.

Prezenta invenţie este în domeniul tratamentului bolii Alzheimer, paraliziei supranucleare progresive (PSP) şi a altor boli şi tulburări care implică neurodegenerarea mediată de tau, cunoscută colectiv ca tauopatie.

Boala Alzheimer este o tulburare neurodegenerativă devastatatoare care afectează milioane de pacienţi în întreaga lume. În lumina agenţilor aprobaţi în prezent pe piaţă care aduc doar beneficii tranzitorii, simptomatice pacientului, există o necesitate semnificativă nesatisfăcută în tratamentul bolii Alzheimer.

Oligomerizarea proteinei tau asociată cu microtubulele din structurile filamentoase cum ar fi filamentele elicoidale împerecheate (PHF-uri) şi filamentele drepte sau răsucite, care dau naştere la încȃlciri neurofibrilare (NFT-uti) şi fire neuropile (NT-uri), este una dintre caracteristicile patologice de definire a bolii Alzheimer şi a altor tauopatii. S-a descoperit că numărul de NFT-uri din creierele indivizilor cu boală Alzheimer este strȃns corelat cu severitatea bolii, sugerând că tau are un rol cheie în disfuncţia şi neurodegenerarea neuronală (Nelson şi colab., JNeuropathol Exp Neurol., 71(5), 362-381(2012)). S-a arătat că patologia tau se corelează cu durata bolii în PSP; cazurile cu un curs mai agresiv al bolii au o sarcină tau mai ridicată decât cazurile cu un progres mai lent. (Williams şi colab., Brain, 130, 1566-76 (2007)).

Studiile recente (Yuzwa şi colab., Nat Chem Biol, 4(8), 483-490 (2008)) susţin potenţialul terapeutic al inhibitorilor O-GlcNAcase (OGA) pentru a limita hiperfosforilarea şi agregarea tau în tau patologic pentru tratamentul bolii Alzheimer şi tulburărilor neurodegenerative mediate de tau înrudite. Specific, inhibitorul OGA Tiamet-G a fost legat de încetinirea pierderii neuronilor motori în modelul tau JNPL3 la şoarece (Yuzwa şi colab., Nat Chem Biol, 8, 393-399 (2012)) şi de o reducere în patologia tau şi în neuritele distrofice în modelul tau Tg4510 la şoarece (Graham şi colab., Neuropharmacology, 79, 307-313 (2014)). Corespunzător, inhibitorii OGA sunt recunoscuţi ca abordare terapeutică validă pentru a reduce acumularea de forme hiperfosforilate, patologice de tau, cum ar fi NFT-urile şi NT-urile.

Brevetul S.U.A. nr. 9.120.781 divulgă derivaţi hexahidrobenzooxazol şi hexahidrobenzotiazol care posedă activitate inhibitoare OGA şi sunt divulgaţi ca utili în tratarea bolilor şi tulburărilor înrudite cu deficienţa sau supraexprimarea de OGA, şi/sau acumularea sau deficienţa de 2-acetamido-2-deoxi-Sβ-D-glucopiranoside (O-GlcNAc). În plus, US 2016/0031871 divulgă anumiţi inhibitori de glicosidază pentru tratarea bolii Alzheimer.

Inhibitorii OGA care sunt penetranţi în creier sunt doriţi pentru a furniza tratamente pentru tulburările neurodegenerative mediate de tau, cum ar fi boala Alzheimer şi PSP. Prezenta invenţie furnizează anumiţi noi compuşi care sunt inhibitori de OGA.

Corespunzător, prezenta invenţie furnizează un compus cu Formula I:

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

În plus, prezenta invenţie furnizează un compus cu Formula Ia:

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Mai mult, această invenţie furnizează un compus cu Formulele I sau la, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestora pentru utilizare în terapie, în particular pentru utilizare în tratamentul bolii Alzheimer sau pentru utilizare în prevenirea progresului deprecierii cognitive usoare cu boala Alzheimer. În plus, această invenţie furnizează un compus cu Formulele I sau la, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestora pentru utilizare în tratamentul paraliziei supranucleare progresive.

Invenţia furnizează de asemenea un compus cu Formulele I sau la, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestora pentru utilizare în tratarea tulburărilor neurodegenerative mediate de tau.

Chiar mai mult, această invenţie furnizează utilizarea unui compus cu Formulele I sau la, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestora, pentru fabricarea unui medicament pentru tratamentul bolii Alzheimer sau pentru prevenirea progresului unei deprecieri cognitive uşoare cu boala Alzheimer. În plus, această invenţie furnizează utilizarea unui compus cu Formulele I sau la, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestora, pentru fabricarea unui medicament pentru tratamentul paraliziei supranucleare progresive. Invenţia furnizează de asemenea utilizarea unui compus cu Formulele I sau la, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestora, pentru fabricarea unui medicament pentru tratarea tulburărilor neurodegenerative mediate de tau.

Invenţia mai furnizează o compoziţie farmaceutică, cuprinzând un compus cu Formulele I sau la, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestora, cu unul sau mai mulţi purtători, diluanţi, sau excipienţi acceptabili farmaceutic. Invenţia mai furnizează un procedeu pentru prepararea unei compoziţii farmaceutice, cuprinzând amestecarea unui compus cu Formulele I sau la, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestora, cu unul sau mai mulţi purtători, diluanţi, sau excipienţi acceptabili farmaceutic. Această invenţie cuprinde de asemenea noi intermediari şi procedee pentru sinteza compuşilor cu Formulele I şi Ia.

Deprecierea cognitivă uşoară a fost definită ca potenţială fază prodromală de demenţă asociată cu boala Alzheimer pe baza prezentării clinice şi a progresului pacienţilor care prezintă depreciere cognitivă uşoară cu demenţă Alzheimer în timp. Termenul „prevenirea progresului deprecierii cognitive uşoare cu boala Alzheimer« include restrȃngerea, încetinirea, oprirea, sau inversarea progresului deprecierii cognitive uşoare cu boala Alzheimer la un pacient.

Aşa cum s-a utilizat în acest document, termenii „tratarea« sau „pentru a trata« includ restrȃngerea, încetinire, oprirea, sau inversarea progresului sau severităţii unui simptom sau tulburare existente.

Aşa cum s-a utilizat în acest document, termenul „pacient« se referă la un om.

Aşa cum s-a utilizat în acest document, termenul „cantitate eficientă« se referă la cantitatea sau doza compusului invenţiei, sau a unei săruri acceptabile farmaceutic a acestuia care, după o singură sau multiple doze administrate pacientului, furnizează efectul dorit la pacientul sub diagnostic sau tratament.

O cantitate eficientă poate fi cu uşurinţă determinată de către o persoană calificată în domeniu prin utilizarea tehnicilor cunoscute şi prin observarea rezultatelor obţinute în circumstanţe analoage. În determinarea cantităţii eficiente pentru un pacient, este luat în considerare un număr de factori, incluzând, dar fără a se limita la: speciile de pacienţi; dimensiunea, vârsta, şi sănătatea generală a acestora; boala sau tulburarea specifică implicată; gradul, sau implicarea sau severitatea bolii sau tulburării; răspunsul pacientului individual; compusul particular administrat; modul de administrare; caracteristicile de biodisponibilitate ale preparatului administrat; regimul de dozare selectat; utilizarea medicaţiei concomitente; şi alte circumstanţe relevante.

Compuşii prezentei invenţii sunt în general eficienţi pe un interval de dozare larg. De exemplu, dozajele pe zi se încadrează în mod normal în intervalul de la aproximativ 0,1 până la aproximativ 15 mg/kg din greutatea corporală. În unele cazuri niveluri ale dozajului sub limita inferioară a intervalului menţionat mai sus pot fi mai mult decȃt adecvate, în timp ce în alte cazuri încă doze mai mari pot fi utilizate cu efecte secundare acceptabile.

Compuşii prezentei invenţii sunt formulaţi preferabil ca compoziţii farmaceutice administrate pe orice cale care face compusul biodisponibil, incluzând căile orale şi transdermale. Cel mai preferabil, astfel de compoziţii sunt pentru administrare orală. Astfel de compoziţii farmaceutice şi procedee pentru prepararea acestora sunt bine cunoscute în domeniu (vezi, de exemplu, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, L.V. Allen, Editor, ediţia a 2-a, Pharmaceutical Press, 2012).

Compuşii cu Formulele I şi la, sau sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora sunt în special utili pentru utilizările terapeutice ale invenţiei, dar anumite configuraţii sunt preferate. Următoarele paragrafe descriu astfel de configuraţii preferate. Se va înţelege că aceste preferinţe sunt aplicabile atȃt utilizărilor terapeutice cȃt şi compuşilor invenţiei.

Compuşii prezentei invenţii includ:

şi săruri acceptabile farmaceutic ale acestora.

Compusul cu Formula I în care substituenţii metil şi oxigen pe inelul de piperidină sunt în configuraţie cis sau trans, sau sarea acceptabilă farmaceutic a acestora, sunt incluşi în domeniul invenţiei, cu configuraţia cis fiind preferată. De exemplu, cineva având calificare obişnuită în domeniu va aprecia că metilul din poziţia 2 este în configuraţie cis faţă de oxigenul din poziţia 4 aşa cum se arată în Schema A mai jos:

În plus, cineva având calificare obişnuită în domeniu va aprecia că metilul din poziţia 2 este în configuraţie trans faţă de oxigenul din poziţia 4 aşa cum se arată în Schema B mai jos:

Compuşii în care centrul chiral în poziţia 2 a inelului de piperidină este în configuraţie S sunt preferaţi în continuare. Deşi prezenta invenţie are în vedere toţi enantiomerii şi diasteromerii individuali, precum şi amestecuri de enantiomeri ai respectivilor compuşi, incluzând racemaţii, compuşii cu configuraţia absolută cum s-a stabilit mai jos sunt în special preferaţi:

N-[4-fluoro-5-[[(2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]-1-piperidil]metil] tiazol-2-il]acetamidă, şi săruri acceptabile farmaceutic ale acestuia; şi N-[4-fluoro-5-[[(2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]-1-piperidil]metil]tiazol-2-il]acetamidă sunt în special preferaţi.

Forma cristalină de N-[4-fluoro-5-[[(2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]-1-piperidil]metil]tiazol-2-il]acetamidă este în special preferată. Forma cristalină de N-[4-fluoro-5-[[(2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]-1-piperidil]metil]tiazol-2-il]acetamidă care este caracterizată printr-un maxim în spectrul de difracţie cu raze X pe pulbere la unghiul de difracţie 2-teta de 12,1° în combinaţie cu unul sau mai multe maxime selectate din grupul constând din 15,3°, 21,6°, 22,2°, 22,7°, 23,5°, 24,3°,şi 26,8°, cu o toleranţă pentru unghiulurile de difracţie de 0,2 grade, este în plus preferată.

Izomerii, enantiomerii, şi diastereomerii individuali pot fi separaţi sau rezolvaţi de cineva având calificare obişnuită în domeniu la orice punct convenabil în sinteza compuşilor invenţiei, prin metode cum ar fi tehnici de cristalizare selective sau cromatografie chirală (vezi de exemplu, J. Jacques, şi colab., „Enantiomers, Racemates, and Resolutions«, John Wiley & Sons, Inc., 1981, şi E.L. Eliel şi S.H. Wilen«, Stereochemistry of Organic Compounds«, Wiley-Interscience, 1994).

O sare acceptabilă farmaceutic a compuşilor invenţiei poate fi formată, de exemplu, prin reacţia unei baze libere adecvate dintr-un compus al invenţiei şi un acid acceptabil farmaceutic adecvat într-un solvent adecvat în condiţii standard bine cunoscute în domeniu. Formarea de astfel de săruri este bine cunoscută şi apreciată în domeniu. Vezi, de exemplu, Gould, P.L., „Salt selection for basic drugs«, International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.J., şi colab. „Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities«, Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000); şi Berge, S.M., şi colab., „Pharmaceutical Salts«, Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977).

Compuşii prezentei invenţii, sau sărurile acestora, pot fi preparate printr-o varietate de proceduri cunoscute cuiva având calificare obişnuită în domeniu, din care unele sunt ilustrate în schemele, preparările, şi exemplele de mai jos. Cineva având calificare obişnuită în domeniu recunoaşte că etapele de sinteză specifice pentru fiecare din căile descrise pot fi combinate în diferite moduri, sau în conjuncţie cu etape din diferite scheme, pentru a prepara compuşii invenţiei, sau sărurile acestora. Produsele fiecărei etape în schemele de mai jos pot fi recuperate prin metode convenţionale bine cunoscute în domeniu, incluzând extragerea, evaporarea, precipitarea, cromatografia, filtrarea, triturarea, şi cristalizarea. În schemele de mai jos, toţi substituenţii, dacă nu se indică altfel, sunt cum s-au definit anterior. Reactivii şi materiile prime sunt cu uşurinţă disponibile cuiva având calificare obişnuită în domeniu. Următoarele scheme, preparări, şi exemple sunt furnizate pentru a ilustra suplimentar invenţia. În plus, cineva având calificare obişnuită în domeniu apreciază că compuşii cu Formulele la, Ib, Ic, şi Id pot fi preparaţi prin utilizarea materiei prime cu configuraţia stereochimică corespunzătoare care poate fi preparată de o persoană calificată în domeniu. De exemplu, Schemele de mai jos utilizează materii prime cu configuraţia corespunzătoare în final Formulei Ia.

În general, un compus cu Formula Ia poate fi preparat dintr-un compus cu Formula II (Schema 1). Mai specific, un compus cu Formula IIa este alchilat reductiv cu N-(4-fluoro-5-formyltiazol-2-il)acetamidă în prezenţa unui agent reducător adecvat cum ar fi triacetoxiborohidrură de sodiu într-un solvent adecvat pentru a furniza un compus cu Formula Ia într-un solvent adecvat, cum ar fi acetat de etil. N-(4-fluoro-5-formiltiazol-2-il)acetamida poate fi preparată prin metode cunoscute în domeniul chimic precum şi prin metode furnizate în următoarele Preparări şi Exemple.

Un compus cu Formula IIa poate fi preparat dintr-un compus cu Formula IIIa unde Pg este o grupare de protecţie amină adecvată. Mai specific, un compus cu Formula IIa unde Pg este carboxilat de terţ-butil (t-BOC) este reacţionat cu un acid cum ar fi acidul clorhidric sau acidul trifluoroacetic într-un solvent adecvat cum ar fi dioxan sau diclorometan pentru a furniza un compus cu Formula IIa. Grupările de protecţie amină adecvate sunt cunoscute în domeniul chimic şi includ t-BOC şi Cbz precum şi pe cele discutate în T. W. Green, P. G. M. Wuts, „Protective Groups in Organic Synthesis« Wiley-Interscience, New York, 1999.

Un compus cu Formula IIIa unde Pg este o grupare de protecţie amină adecvată poate fi preparat dintr-un compus cu Formula IVa (Schema 2). Mai specific, un compus cu Formula IVa unde Pg este carboxilat de terţ-butil este reacţionat cu 3-(clorometil)-5-metil-1,2,4-oxadiazol în prezenţa unei baze cum ar fi terţ-butoxid de sodiu pentru a furniza un compus cu Formula IIIa. Reacţia este efectuată convenabil într-un solvent cum ar fi acetonitril sau dimetilformamidă. Un compus cu Formula IVa unde Pg este carboxilat de terţ-butil poate fi preparat în mod esenţial cum s-a descris în WO 2004/094380 A1. Mai specific, un compus cu Formula Va este reacţionat cu un agent reducător cum ar fi tri(sec-butil)borohidrură de litiu într-un solvent cum ar fi tetrahidrofuran pentru a furniza un compus cu Formula IVa unde Pg este carboxilat de terţ-butil. Un compus cu Formula Va unde Pg este o grupare de protecţie amină adecvată poate fi preparat prin procedee cunoscute în domeniul chimic incluzându-le pe cele descrise în WO 2004/094380 A1.

Preparare 1

Sinteză de N-(4-fluoro-5-formil-tiazol-2-il)carbamat de terţ-butil.

Se adaugă fluorură de cesiu (227 g, 1480 mmol) la o soluţie de N-(4-cloro-5-formil-tiazol-2-il)carbamat de terţ-butil (38,8 g, 148 mmol; pentru prepararea N-(4-cloro-5-formil-tiazol-2-il)carbamatului de terţ-butil vezi de exemplu, N. Masuda, şi colab., Bioorg Med Chem, 12, 6171-6182 (2004)) în DMSO (776 mL) la temperatura camerei. Amestecul de reacţie este agitat într-un bloc de încălzire la 145°C cu o temperatură internă de 133°C timp de 48 ore, apoi amestecul este răcit într-o baie de apă cu gheaţă. La amestec se adaugă soluţie apoasă saturată de bicarbonat de sodiu (500 mL), saramură (500 mL) şi acetat de etil (500 mL). Amestecul este agitat la temperatura camerei timp de 10 minute, apoi este filtrat prin pământ de diatomee, spălat cu acetat de etil (500 mL). Filtratul este transferat la o pȃlnie de separare şi straturile sunt separate, apoi stratul apos este extras cu acetat de etil (1 L). Organicele combinate sunt spălate cu saramură (1 L), apoi stratul de saramură este extras cu acetat de etil (300 mL). Organicele combinate sunt uscate pe sulfat de sodiu, filtrate şi concentrate pentru a da un reziduu. Reziduul este trecut printr-un strat de gel de siliciu (330 g) eluând cu 5% acetat de etil în diclorometan (1,5 L) şi filtratul este concentrat pentru a da un reziduu (24,2 g).

Reziduul (32,7 g din loturile combinate, 133 mmol) este dizolvat în izopropanol (303 mL), filtrat şi apoi este purificat prin SFC (cromatografie în fluid supercritic) utilizând o coloană IC (derivat polizaharidic de celuloză: tris (3,5-diclorofenilcarbamat, 30 x 250mm, 5u) cu 10%IPA (fără aditiv) la 180 mL/minut cu injecţii de 3 mL. Fracţiunile care conţin produsul sunt concentrate pentru a da compusul din titlu (16,1 g. MS m/z 247,0 (M+H).

Preparare 2

Sinteza N-(4-fluoro-5-formil-tiazol-2-il)acetamidei (Metoda A)

Într-un vas învelit, se adaugă bromură de zinc (91,9 g,408 mmol) într-o porţie la un amestec de N-(4-fluoro-5-formil-tiazol-2-il)carbamat de terţ-butil (33,5 g, 136 mmol) şi diclorometan (503 mL) la temperatura camerei. Amestecul de reacţie este agitat peste noapte la o temperatură internă de 37°C, apoi temperatura învelişului este stabilită la -10°C şi se adaugă tetrahidrofuran (111 mL) în picătură peste 15 minute, menţinând o temperatură internă sub 6°C. Temperatura învelişului este apoi setată la -30°C şi se adaugă piridină (110 mL, 1360 mmol) în picătură peste 5 minute, menţinând o temperatură internă sub 5°C. Temperatura învelişului este stabilită la 0°C şi se adaugă anhidridă acetică (116 mL, 1220 mmol) în picătură peste 5 minute. Amestecul de reacţie este agitat peste noapte la o temperatură internă de 37°C, apoi este răcit la temperatura camerei şi trecut printr-un strat scurt de pământ de diatomee, eluând cu tetrahidrofuran (500 mL). Filtratul este transferat la un flacon şi amestecul este concentrat pentru a da un reziduu, care este concentrat din toluen (50 mL). La reziduu se adaugă o soluţie de monohidrat de acid citric (57,2 g, 272 mmol) în apă (400 mL) şi 2-metiltetrahidrofuran (400 mL) şi amestecul este agitat la 40°C timp de 5 minute, apoi este trecut printr-un strat scurt de pământ de diatomee, eluând cu 2-metiltetrahidrofuran (100 mL). Filtratul este transferat la o pȃlnie de separare şi straturile sunt separate. Stratul apos este extras cu 2-metiltetrahidrofuran (2 Ч 250 mL) şi organicele combinate sunt diluate cu apă (500 mL). La amestec se adaugă bicarbonat de sodiu solid în porţii peste 5 minute cu agitare până când evoluţia gazului se opreşte. Amestecul este transferat la o pȃlnie de separare şi straturile sunt separate, apoi stratul apos este extras cu 2-metiltetrahidrofuran (200 mL şi 100 mL). Organicele combinate sunt uscate pe sulfat de sodiu, filtrate şi concentrate pentru a da un reziduu, care este diluat cu 2-metiltetrahidrofuran (100 mL) şi amestecul este trecut printr-un tampon scurt de gel de siliciu (250 g), eluând cu 2-metiltetrahidrofuran (2,5 L). Filtratul este concentrat pentru a da un reziduu care este suspendat într-un amestec 1:1 de diclorometan şi heptan (202 mL). Amestecul este agitat la temperatura camerei timp de 30 minute şi apoi filtrat. Filtratul solid este uscat sub vid la 40°C timp de 2 ore pentru a da compusul din titlu (18,0 g, 70%). MS m/z 189,0 (M+H).

Sinteză alternativă de N-(4-fluoro-5-formil-tiazol-2-il)acetamidă (Metoda B).

Se adaugă diclorometan (1325 g, 15,6 mol) la 2-amino-4-clorotiazol-5-carbaldehidă (100 g, 0,61 mol) şi piridină (194,6 g, 2,46 mol), şi se răceşte la 0-5°C. Se adaugă anhidridă acetică (188,4 g, 1,85 mol) în picătură, menţinând temperatura la 0-5°C. După ce adăugarea este completă, se ajustează temperatura până la 20-25°C şi se agită timp de 41 ore. Se concentrează sub presiune redusă urmată de adăugarea de 35% HCl apos (200 mL) şi apă (1,5 L), menţinând temperatura la mai puţin de 40°C. Se răceşte la 20-25°C şi se agită timp de 18 ore. Se filtrează amestecul şi se spală solidul colectat cu apă. Se usucă solidele la 60-65°C timp de 24 ore pentru a furniza N-(4-cloro-5-formiltiazol-2-il)acetamidă (75 g, 0,4 mol).

Sub o atmosferă inertă, se adaugă sulfolan (1000 ml) la N-(4-cloro-5-formiltiazol-2-il)acetamidă (50 g, 0,244 mol, preparat direct mai sus), tetrametilclorură de amoniu (107,1 g, 0,977 mol), şi fluorură de cesiu (370,6 g, 2,44 mmol). Se încălzeşte până la 130°C şi se agită timp de 23 ore. Analiza HPLC prezintă o conversie de 75% cu un randament in situ de 45% al compusului din titlu.

Sinteză alternativă de N-(4-fluoro-5-formil-tiazol-2-il)acetamidă (Metoda C).

Se adaugă 2-propanol (150 mL) la tetrahidratul de fluorură de tetrametilamoniu (10,2 g, 109,0 mmol) şi se concentrează amestecul până la 2-3 volume sub vid cu temperatura internă menţinută la 70°C pentru a îndepărta apa. Se adaugă 2-propanol (200mL) şi şi se concentrează amestecul până la 2-3 volume sub vid. Se repetă de încă două ori. Se adaugă DMF (200mL) şi se concentrează până la 2-3 volume sub vid. Se adaugă THF (200 mL) şi se concentrează până la 2-3 volume. Se repetă de încă două ori. Se încarcă N-(4-cloro-5-formiltiazol-2-il)acetamidă (1,22 g, 5,96 mmol, preparat mai sus în Metoda B) şi DMF (12 ml). Se încălzeşte până la 110°C şi se agită timp de 12 ore. Se răceşte amestecul de reacţie până la 25°C. Se adaugă 2-metiltetrahidrofuran (40 mL) şi apă (40 mL). Straturile sunt separate şi stratul apos a fost extras cu 2-metiltetrahidrofuran (40 mL). Straturile au fost separate şi straturile organice combinate au fost spălate cu apă (20 mL). Straturile au fost separate şi stratul organic a fost concentrat. Se adaugă acetat de etil (20 mL) şi apă (5 mL). Straturile au fost separate şi stratul organic concentrat pentru a îndepărta solventul. Se adaugă acetat de etil (2mL) şi heptan (2 mL) şi se filtrează. Solidul filtrat este uscat sub vid la 55°C timp de 18 ore pentru a da compusul din titlu ca 93% amestec cu N-(4-cloro-5-formyltiazol-2-il)acetamidă.

Preparare 3

Sinteză de (2S,4S)-4-hidroxi-2-methy1-piperidin-1-carboxilat de terţ-butil.

La un flacon se adaugă (2S)-2-metil-4-oxo-piperidin-1-carboxilat de terţ-butil (50 g, 234,44 mmol) şi tetrahidrofuran (500 mL). Amestecul este răcit la -65°C sub o atmosferă de azot şi se adaugă tri(sec-butil)borohidrură de litiu (304,77 mL, 304,77 mmol; 1 M în tetrahidrofuran) în picătură peste 45 minute, menţinând o temperatură internă sub -60°C. Amestecul de reacţie este agitat la temperatura camerei timp de 1 oră, apoi este răcit la -30°C. La amestecul de reacţie se adaugă un amestec de apă (25,34 mL) şi tetrahidrofuran (100,16 mL), menţinând o temperatură internă sub -20°C. Se adaugă o soluţie apoasă de peroxid de hidrogen (118,88 mL, 1,17 mol, 30 g/g%) în apă (126,70 mL) în picătură într-o oră, menţinând o temperatură internă sub 10°C. La amestec se adaugă soluţie apoasă de acid clorhidric (46,89 mL, 234,44 mmol, 5 M) şi metil t-butil eter (1,00 L) şi amestecul este încălzit la temperatura camerei. Straturile sunt separate şi faza organică este agitată cu o soluţie de metabisulfit de sodiu (222,84 g, 1,17 mol) în apă (500 mL) timp de 10 minute la temperatura camerei. Straturile sunt separate şi faza organică este uscată pe sulfat de magneziu şi concentrată. Reziduul este purificat prin cromatografie rapidă (0-50 % metil t-butil eter /isohexan, gel de siliciu) şi fracţiunile care conţin produsul sunt combinate şi concentrate pentru a da compusul din titlu (40,4 g, 78%). ES/MS (m/e) 238 (M+Na).

Sinteză alternativă de (2S,4S)-4-hidroxi-2-metil-piperidin-1-carboxilat de terţ-butil.

La un reactor căptuşit cu sticlă conţinând apă deionizată (460 L), şi fosfat diacid de potasiu (6,5 kg, 0,41 echivalenţi) la 20°C este încărcat DMSO (27,4 kg, 1,0 vol) şi monohidrat de D-(+)-glucoză (28,9 kg, 1,25 echiv). Temperatura internă este ajustată până la 30°C, şi pH-ul reacţiei este ajustat până la 6,9 prin adăugarea de hidroxid de sodiu apos (8%, 15 L, 0,28 echivalenţi). Reactorul este încărcat cu (2S)-2-metil-4-oxo-piperidin-1-carboxilat de terţ-butil (24,9 kg, 1,0 echivalenţi (99,1%ee)), şi amestecul este agitat la 30°C timp de 15 min. Ketoreductaza (KRED-130, 250 g, 1% g/g), glucoza dehidrogenază (GDH-101, 250 g, 1% g/g), şi sarea de sodiu NADP (63 g, 0,25% g/g) sunt încărcate direct la amestecul de reacţie printr-un port de deschidere. Amestecul este menţinut la o temperatură de 30°C şi pH 7,0± 0,2 prin adăugarea de 8% NaHCO3. apoasă. După agitare timp de 16,5 ore (99,5% conversie), reacţia este încărcată cu Celite™ (12,5 kg, 50 g/g%) şi toluen (125 L, 5 vol). După agitare timp de 30 min la 30°C, amestecul este transferat la un alt reactor de 2000 L printr-un filtru GAF în linie (4 straturi) pe o perioadă de 1 oră. Amestecul este lăsat să stea 30 min fără agitare, straturile sunt separate, şi stratul apos este reextras cu toluen (2 x 125 L). Straturile organice combinate sunt filtrate (filtru GAF în linie), şi amestecul de toluen este spălat cu soluţie apoasă de clorură de sodiu (25%, 125 L, 5 vol) la 25°C. Soluţia de toluen rezultată este uscată azeotropic (vid parţial, temperatură internă < 60°C) până la 0,10 g/g% apă, şi răcită la 20°C. Amestecul este filtrat din reactor printr-un filtru cu cartuş în tamburi curaţi sub presiune pozitivă de azot. Amestecul de reacţie este apoi transferat din tamburi într-un vas de sticlă aliniat de 500 L şi concentrat sub vid (< 60°C) la un volum ţintă rezidual de 56 L (2,25 vol). n-Heptanul (169 kg, 10 vol) este încărcat la 40°C, şi amestecul este însămânţat cu 25 g de (2S,4S)-4-hidroxi-2-metil-piperidin-1-carboxilat de terţ-butil. Suspensia groasă rezultată este diluată cu n-heptan suplimentar (25 L, 1 vol) şi răcită la 16°C peste 4 ore. Produsul este izolat prin centrifugare, spălat cu n-heptan (25 L pe rotaţie; 4 rotaţii necesare), rezultând 20,3 kg (81%; >99,9% ee) după uscarea timp de 11 ore într-o tavă de uscare la 30°C. ES/MS (m/e) 238 (M+Na).

Preparare 4

Sinteză de (2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]piperidin-1-carboxilat de terţ-butil.

3-(Clorometil)-5-metil-1,2,4-oxadiazol (43,5 g, 301 mmol) se adaugă la o soluţie de (2S,4S)-4-hidroxi-2-metil-piperidin-1-carboxilat de terţ-butil (29,5 g, 137 mmol) în acetonitril (590 mL) la temperatura camerei. Amestecul de reacţie este agitat într-o baie de apă cu gheaţă şi se adaugă terţ-butoxid de sodiu (54,3 g, 548 mmol) în porţii peste 10 minute, menţinând o temperatură internă sub 10°C. Amestecul de reacţie este agitat într-o baie de apă cu gheaţă la o temperatură internă de 5°C timp de 9 ore, apoi este încălzit încet la temperatura camerei şi este agitat peste noapte. Amestecul de reacţie este răcit într-o baie de apă cu gheaţă şi se adaugă soluţie de clorură de amoniu apoasă saturată (200 mL) peste 5 minute, menţinând o temperatură internă sub 10°C în timpul adăugării. Amestecul este apoi diluat cu apă (100 mL) şi încălzit la temperatura camerei. Amestecul este extras cu metil terţ-butil eter (2 Ч 300 mL) şi organicele combinate sunt spălate cu saramură (300 mL). Organicele combinate sunt uscate pe sulfat de sodiu, filtrate şi concentrate pentru a da un reziduu. Reziduul este trecut repede printr-un strat de gel de siliciu (300 g) eluând cu metil terţ-butil eter (1 L) şi filtratul este concentrat pentru a da compusul din titlu (46,5 g, 109%). MS m/z 334,0 (M+Na).

Sinteză alternativă de (2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]piperidin-1-carboxilat de terţ-butil.

La o soluţie de (2S,4S)-4-hidroxi-2-metil-piperidin-1-carboxilat de terţ-butil (0,25g, 1,16 mmol) şi 3-(clorometil)-5-metil-1,2,4-oxadiazol (0,308g, 2,32 mmol) în N,N-dimetilformamidă (3mL) sub azot la 0°C se adaugă în porţii terţ-butoxid de sodiu (0,35 g, 3,5mmol) peste 5 min. Amestecul de reacţie este agitat la temperatura camerei timp de 10 min apoi la 40°C timp de 12 ore. Amestecul de reacţie este răcit la temperatura camerei apoi stins cu apă (10mL). Straturile sunt separate şi faza apoasă este extrasă cu metil terţ-butil eter (2×10mL). Extractele organice combinate sunt spălate cu o soluţie apoasă de clorură de litiu (5%), uscate pe sulfat de magneziu, filtrate şi concentrate sub presiune redusă pentru a da compusul din titlu (0,49 g, 0,7 mmol, randament 81%, puritate 60%) ca ulei maro. MS m/z 334,0 (M+Na).

Preparare 5

Sinteză de clorhidrat de 5-metil-3-[[(2S,4S)-2-metil-4-piperidil]oximetil]-1,2,4-oxadiazol.

Un flacon conţinând (2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]piperidin-1-carboxilat de terţ-butil (4,03 g, 12,9 mmol) este scufundat într-o baie de apă cu gheaţă. La acest flacon se adaugă o soluţie 4 M de acid clorhidric în 1,4-dioxan (25,9 mL, 104 mmol) în picătură peste 5 minute cu agitare, menţinând o temperatură internă sub 20°C în timpul adăugării. Amestecul de reacţie este agitat la temperatura camerei pentru 1 oră, apoi este concentrat pentru a da compusul din titlu (3,56 g, randament 92% pe baza purităţii de 83% măsurate prin 1H RMN. MS m/z 212,0 (M+H).

Sinteză alternativă de 5-metil-3-[[(2S,4S)-2-metil-4-pipelidilloximetil]-1,2,4-oxadiazol clorhidrat.

Se adaugă metanol (50 mL) la (2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]piperidin-1-carboxilat de terţ-butil (12,9 g, 0,041 mol). Amestecul este răcit la 0°C. O soluţie 4M de acid clorhidric în metanol (80 mL) se adaugă în picătură la amestecul răcit, menţinând o temperatură internă sub 20°C. Amestecul de reacţie este apoi agitat la temperatura camerei timp de 18 ore. Amestecul este apoi concentrat pentru a îndepărta solventul. Se adaugă acetonă (10 mL) şi amestecul este agitat timp de 20 min. Se adaugă tetrahidrofuran (40 mL) şi amestecul este agitat timp de 3 ore. Solidul este colectat prin filtrare sub azot şi turta solidă filtrată este clătită cu tetrahidrofuran. Solidul filtrat este apoi uscat sub vid la 45°C timp de 2 ore pentru a da compusul din titlu cu puritate de 90%. Recristalizarea utilizând acetonă poate creşte puritatea compusului din titlu până la 95%.

Preparare 6

Sinteză de 5-metil-3-[[(2S,4S)-2-metil-4-piperidil]oximetil]-1,2,4-oxadiazol.

La o soluţie de (2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]piperidin-1-carboxilat de terţ-butil (0,49g, 1,6 mmol) în diclorometan (10mL) sub azot se adaugă acid trifluoroacetic (1,8 mL, 23 mmol). Amestecul este agitat la temperatura camerei timp de 3 ore. Amestecul este concentrat sub presiune redusă pentru a da un ulei galben. Reziduul este dizolvat în metanol (5mL) şi turnat pe un cartuş cu schimbare de cationi, eluat cu metanol (2Ч 10mL) apoi cu o soluţie de amoniac 2 M în metanol (10mL). Filtratul este concentrat sub presiune redusă pentru a da compusul din titlu (0,3g, 1,4 mmol, 91%). MS m/z 212,0 (M+H).

Exemplul 1

Sinteză de N-[4-fluoro-5-[[(2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]-1-piperidil]metil]tiazol-2-il]acetamidă.

N-(4-Fluoro-5-formil-tiazol-2-il)acetamida (28,3 g, 150 mmol) se adaugă la clorhidratul de 5-metil-3-[[(2S,4S)-2-metil-4-piperidil]oximetil]-1,2,4-oxadiazol (48,7 g, 185 mmol,puritate 94%)) în acetat de etil (707 mL) la temperatura camerei. Amestecul de reacţie este agitat la temperatura camerei şi se adaugă în picătură N,N-diizopropiletilamină (34,1 mL, 195 mmol) peste 1 minut, apoi se adaugă triacetoxiborohidrură de sodiu (98,5 g, 451 mmol) într-o porţie. Amestecul de reacţie este agitat într-un bloc de încălzire la 31°C peste noapte cu o temperatură internă de 30°C, apoi este răcit într-o baie de apă cu gheaţă la o temperatura internă de 5°C. La amestec se adaugă 2 M soluţie de acid clorhidric apos (226 mL) peste 15 minute, menţinând o temperatură internă sub 10°C. La amestec se adaugă apă (250 mL) şi amestecul este agitat la temperatura camerei timp de 5 minute. Straturile sunt separate şi stratul organic este extras cu un amestec de 2 M soluţie de acid clorhidric apos (28 mL) în apă (50 mL). Primul strat apos este agitat într-o baie de apă cu gheaţă şi se adaugă o soluţie apoasă 50% de hidroxid de sodiu (25,7 mL) în picătură peste 10 minute, menţinând o temperatură internă sub 10°C. Amestecul este diluat cu soluţie apoasă saturată de bicarbonat de sodiu (100 mL), apoi este agitat la temperatura camerei timp de 10 minute şi apoi este extras cu acetat de etil (3 Ч 400 mL). Organicele combinate sunt uscate pe sulfat de sodiu, filtrate şi concentrate pentru a da un reziduu. Al doilea strat apos din extragerea cu acid clorhidric apos este diluat cu 2-metiltetrahidrofuran (200 mL) şi amestecul este trecut printr-un tampon scurt de pământ de diatomee. Filtratul este transferat la o pȃlnie de separare şi straturile sunt separate. Stratul apos este agitat într-o baie de apă cu gheaţă şi se adaugă 50% dintr-o soluţie apoasă de hidroxid de sodiu (3,15 mL) în picătură peste 5 minute, menţinând o temperatură internă sub 10°C. Amestecul este diluat cu soluţie apoasă saturată de bicarbonat de sodiu (10 mL), apoi este agitat la temperatura camerei timp de 5 minute şi apoi este extras cu acetat de etil (3 Ч 40 mL) şi 10% izopropanol în acetat de etil (100 mL). Organicele combinate sunt uscate pe sulfat de sodiu, filtrate şi concentrate pentru a da un reziduu, care este combinat cu reziduul din prima parte din proces. Reziduul combinat este trecut printr-un strat de gel de siliciu (350 g) eluând cu acetat de etil (3,5 L) şi filtratul este concentrat pentru a da un reziduu (45,8 g).

Reziduul (47,5 g de loturi combinate, 123,9 mmol) este purificat prin cromatografie rapidă, eluând cu 50-100% acetat de etil în heptan. Fracţiunile care conţin produsul sunt concentrate la reziduu, care este suspendat într-un amestec 1:1 de metil-terţ-butil eter şi heptan (448 mL). Amestecul este agitat într-un bloc de încălzire la 46°C timp de 30 minute la o temperatură internă de 45°C, apoi este răcit la temperatura camerei în 2 ore cu agitare. Amestecul este filtrat, solidul spălat cu un amestec 1:1 de metil-terţ-butil eter şi heptan (30 mL). Solidul filtrat este uscat sub vid la 40°C peste noapte pentru a da compusul din titlu (28,5 g). MS m/z 384,0 (M+H); [α]D 20 = +33,4°(C=0,26, metanol).

Sinteză alternative de N-[4-fluoro-5-[[(2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi1-1-piperidil]metil]tiazol-2-il]acetamidă.

La o soluţie de N-(4-fluoro-5-formil-tiazol-2-il)acetamidă (0,05g, 0,28 mmol) şi 5-metil-3-[[(2S,4S)-2-metil-4-piperidil]oximetil]-1,2,4-oxadiazol (0,04g, 0,19mmol) în diclorometan (10 mL) sub azot se adaugă N,N-diizopropiletilamină (0,1 mL, 0,57 mmol) şi triacetoxiborohidrură de sodiu (0,12g, 0,57 mmol). Amestecul de reacţie este agitat la temperatura camerei timp de 12 ore. Amestecul de reacţie este turnat într-o soluţie apoasă saturată de bicarbonat de sodiu (10mL). Straturile sunt separate şi faza apoasă este extrasă cu diclorometan (2×10mL). Extractele organice combinate sunt uscate pe sulfat de magneziu, filtrate şi concentrate sub presiune redusă pentru a da un ulei portocaliu.

Reziduul este preluat în metanol (la un volum total de 9,8 ml), filtrat şi purificat prin prep-HPLC (Fenomenex Gemini-NX 10 Micron 50*150mm C-18) (CH3CN & apă cu 10 mM bicarbonat de amoniu ajustat la pH 9 cu hidroxid de amoniu, 15 % până la 100% CH3CN peste 10min la 110ml/min) (1 injecţie) (271/204 nm) pentru a da compusul din titlu (0,02g, 0,05 mmol, 28%). MS m/z 384,2 (M+H).

Exemplul 1A

N-[4-fluoro-5-[[(2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]-1-piperidil] metil]tiazol-2-il]acetamidă cristalină.

Se suspendă N-[4-fluoro-5-[[(2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]-1-piperidil]metil]tiazol-2-il]acetamida brută (29,9g) în 448 mL de 50% metil terţ butil eter în heptan la 46°C timp de 30 minute. Se agită amestecul şi se răceşte la 19°C peste două ore înainte de filtrare după care se spală cu 30 mL de 50% metil terţ butil eter în heptan pentru a furniza compusul din titlu (28,5g, randament 95%).

Difracţia cu raze X pe pulbere (XRPD) din Exemplul 1A

Tiparele XRPD ale solidului cristalin sunt obţinute pe un difractometru cu raze X pe pulbere Bruker D4 Endeavor, echipat cu o sursă CuKa (λ = 1,54060 Е) şi un detector Vantec, care operează la 35 kV şi 50 mA. Mostra este scanată între 4 şi 40° în 2θ, cu o etapă de dimensionare de 0,0087° în 2θ şi o rată de scanare de 0,5 secunde/etapă, şi cu divergenţă de 0,6 mm, antiîmprăştiere fixată la 5,28 mm, şi fante detectoare de 9,5 mm. Pulberea uscată este ambalată pe un suport de cuarţ pentru mostră şi o suprafaţă netedă este obţinută utilizând o lamelă din sticlă. Este bine cunoscut în domeniul cristalografiei că, pentru orice formă cristalină dată, intensităţile relative ale maximelor de difracţie pot varia din cauza orientării preferate care rezultă din factori cum ar fi morfologia şi comportarea cristalului. Unde sunt prezente efecte de orientare preferată, intensităţile maxime sunt alterate, dar poziţiile maxime caracteristice ale polimorfei sunt nemodificate. (vezi, de exemplu The U. S. Pharmacopeia 38 - National Formulary 35 Capitolul 941 Characterization of crystalline and partially crystalline solids by X-ray powder diffraction (XRPD) Official 1 mai, 2015). Mai mult, este de asemenea bine cunoscut în domeniul cristalografiei că pentru orice formă cristalină dată poziţiile maximelor unghiulare pot varia puţin. De exemplu, poziţiile maxime se pot deplasa din cauza unei variaţii în temperatura sau umiditatea la care o mostră este analizată, în deplasarea mostrei, sau în prezenţa sau absenţa unui standard intern. În cazul prezent, o variabilitate a poziţiei maximului de ± 0,2 în 2θ va ţine seama de aceste potenţiale variaţii fără a stȃnjeni identificarea univocă a formei cristaline indicate. Confirmarea unei forme cristaline poate fi făcută pe baza oricărei combinaţii unice de maxime distinctive (în unităţi de °2θ), de obicei maximele mai proeminente. Tiparele de difracţie ale formei cristaline, colectate la temperatura ambiantă şi umiditate relativă, sunt ajustate pe baza maximelor standard NIST 675 la 8,85 şi 26,77 grade 2-teta.

O mostră preparată de N-[4-fluoro-5-[[(2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]-1-piperidil]metil]tiazol-2-il]acetamidă cristalină este caracterizată printr-un tipar XRPD utilizând radiaţie CuKa ca având maxime de difracţie (valori 2-teta) cum s-a descris în Tabelul 1 de mai jos. Tiparul specific conţine un maxim la 12,1° în combinaţie cu unul sau mai multe maxime selectate din grupul constând din 15,3°, 21,6°, 22,2°, 22,7°, 23,5°, 24,3°, şi 26,8° cu o toleranţă pentru unghiurile de difracţie de 0,2 grade.

Tabelul 1: maximele de difracţie cu raze X pe pulbere ale N-[4-fluoro-5-[[(2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]-1-piperidil]metil]tiazol-2-il]acetamidei cristaline, Exemplul 1A.

Maxim Unghi (2-teta°)+/- 0,2° Intensitate relativă (% celor mai multe maxime intense) 1 7,7 9 2 10,1 9 3 12,1 100 4 15,3 50 5 18,3 11 6 19,3 13 7 21,6 16 8 22,2 16 9 22,7 16 10 23,5 30 11 24,3 35 12 26,8 27

Test de enzimă OGA umană in vitro

Generare de proteine OGA

Secvenţa de nucleotide care codifică O-GlcNAc-β-N-acetilglucosaminidase (NM_012215) umană de lungime completă este inserată în vectorul pFastBac1 (Invitrogen) cu o etichetă poli-histidină (HIS) N-terminală. Generarea baculovirusului este efectuată în conformitate cu protocolul sistemului de expresie al baculovirusului Bac-la-Bac (Invitrogen). Celulele Sf9 sunt infectate la 1,5 x106 celule/mL utilizând 10 mL de virus P1 pe litru de cultură şi incubate la 28°C timp de 48 de ore. Celulele sunt centrifugate, clătite cu PBS şi granulele depozitate la -80°C. Proteinele OGA de mai sus (His-OGA) sunt purificate după cum urmează: 4 L de celule sunt lizate în 200 mL de tampon conţinând 50 mM Tris, pH 8,0, 300 mM NaCl, 10% glicerol, 10 mM imidazol, 1 mM ditiotreitol (DTT), 0,1% triton™ X-100, 4 tablete de inhibitori de protează (EDTA complete liber, Roche) timp de 45 min la 4°C. Acest lizat celular este apoi centrifugat timp de 40 min la 16500 rpm la 4°C, şi supernatantul incubat cu 6 mL de răşină Ni-NTA (nichel-acid nitrilotriacetic) timp de 2 ore la 4°C.

Răşina este apoi ambalată pe coloană şi spălată cu 50 mM tris, pH 8,0, 300 mM NaCl, 10% glicerol, 10 mM imidazol, 0,1% triton™ X-100, 1 mM DTT, urmată de 50 mM tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol, 10% glicerol, 1 mM DTT. Proteinele sunt eluate cu 50 mM tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 300 mM imidazol, 10% glicerol, 1 mM DTT. Fracţiunile grupate care conţin His-OGA sunt concentrate până la 6 ml şi încărcate pe Superdex75 (16/60). Proteina este eluată cu 50 mM tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 10% glicerol, 2 mM DTT. Fracţiunile conţinând His-OGA sunt grupate şi concentraţia de proteine măsurată cu BCA (test colorimetric Bradford).

Test de enzimă OGA

Enzima OGA catalizează la îndepărtarea O-GlcNAc de proteinele nucleocitoplasmatice. Pentru a măsura această activitate, se utilizează fluoresceina di-N-acetil-β-N-acetil-D-glucozaminidă (FD-GlcNAc, Kim, Eun Ju; Kang, Dae Ook; Love, Dona C.; Hanover, John A. Carbohydrate Research (2006), 341(8), 971-982) ca substrat la o concentraţie finală de 10 µM (în format de test cu 96 de godeuri) sau 6,7 µM (în format de test cu 384 de godeuri). Acest substrat fluorogenic devine fluorescent după clivarea cu OGA, astfel încât activitatea enzimei poate fi măsurată prin creşterea fluorescenţei detectate la 535 nm (excitaţie la 485nm).

Tamponul de testare este preparat pentru a da o concentraţie finală de 50 mM H2NaPO3-HNa2PO3, 0,01% albumină din ser bovin şi 0,01% triton™ X-100 în apă, la pH 7. Concentraţia finală a enzimei este 3 nM (în formatul de test cu 96 de godeuri) sau 3,24 nM (în formatul de test cu 384 de godeuri). Ambele formate de test dau în mod esenţial rezultate echivalente.

Compuşii care urmează să fie testaţi sunt diluaţi în dimetil sulfoxid (DMSO) pur utilizând curbe de răspuns la concentraţie în zece puncte. Concentraţia maximă a compusului în amestecul de reacţie este 30 µM. Compuşii la concentraţia adecvată sunt preincubaţi cu enzima OGA timp de 30 minute înainte ca reacţia să înceapă prin adăugarea substratului. Reacţiile sunt lăsate să se desfăşoare timp de 60 minute la temperatura camerei. Apoi, fără oprirea reacţiei, se citeşte fluorescenţa. Valorile IC50 sunt calculate prin reprezentarea grafică a datelor normalizate vs. log compusului şi ajustarea datelor utilizând o ecuaţie logistică cu patru parametri.

Compusul din Exemplul 1 a fost testat în mod esenţial cum s-a descris mai sus şi a prezentat o IC50 de 2,36 nM± 0,786 (n=8). Aceste date demonstrează că compusul din Exemplul 1 inhibă activitatea enzimei OGA in vitro.

Testul întregii celule pentru măsurarea inhibării activităţii enzimei OGA

Placarea celulei:

Se utilizează condiţiile standard cunoscute în domeniu, celulele TRex-293 modificate pentru expresia inductibilă a P301S-1N4R care formează proteina tau asociată microtubulelor, sunt generate şi menţinute în mediu de creştere, constând din DMEM bogat în glucoză (Sigma# D5796), suplimentat cu 10 % ser fetal bovin fără tetraciclină (FBS, Sigma F2442), 20 mM HEPES, 5 µg/mL blasticidină (Life Technologies# A11139-03) şi 200 µg/mL zeocin (Life Technologies# R250-01). Pentru experimente, celulele sunt placate în mediu de creştere la 10.000-14.000 celule pe godeu într-o placă cu 384 de godeuri Corning Biocoat (356663) acoperită cu poli-D-lizină, şi incubate 20-24 ore într-un incubator celular la 37°C/5% CO2. Experimentele sunt efectuate fără inducerea expresiei Tau.

Tratamentul compusului:

Compuşii care urmează să fie testaţi sunt diluaţi serial 1/3 în DMSO pur utilizând curbe de răspuns la concentraţie în zece puncte şi sunt diluaţi în continuare în mediu de creştere. La 20-24 ore după placare, celulele sunt tratate cu compus de testat în mediu de creştere; concentraţia maximă a compusului este 15 µM (0,15% DMSO). Inhibarea maximă este definită de măsurătorile replicate de 15 uM Tiamet G şi inhibarea minimă este definită de măsurătorile replicate de tratament cu 0,15% DMSO. Celulele sunt întoarse în incubator la 37°C/5% CO2 timp de 20-24 ore. Compuşi sunt testaţi în duplicate în fiecare placă.

Imunocolorare:

După 20-24 ore de tratament al compusului, mediul este îndepărtat de pe placa de test şi 25 µL de 3,7 % soluţie de formaldehidă (Sigma # F1635) în DPBS (Sigma #D8537) se adaugă la fiecare godeu şi se incubează timp de 30 minute. Celulele sunt apoi spălate o dată cu DPBS şi apoi permeabilizate cu 0,1% triton™ X-100 (Sigma# T9284). După 30 minute, celulele sunt spălate de două ori cu DPBS şi apoi se adaugă soluţie de blocare (1% BSA/DPBS/0,1% triton™ X-100) la fiecare godeu şi se incubează timp de 60 minute. Soluţia de blocare este îndepărtată şi se adaugă 0,40-0,33 µg/mL de soluţie de anticorp proteic O-GlcNAc (clonă RL2, Thermo, MA1072) în soluţie de blocare la celule şi se lasă să stea peste noapte la 2-8°C. Următoarea zi, celulele sunt spălate de două ori cu DPBS şi se adaugă anticorpul secundar, lgG anti-şoarece de capră Alexa Fluor 488 (Life Technologies # A11001) la 2 ug/mL în DPBS, la fiecare godeu şi se lasă să stea la temperatura camerei timp de 90 min. Anticorpul secundar este îndepărtat, celulele spălate de două ori cu DPBS şi o soluţie de DAPI (Sigma #D9564) şi RNază (Sigma, R6513) în DPBS la o concentraţie de 1 şi 50 ug/mL, respectiv, se adaugă la fiecare godeu. Placa este etanşată, incubată timp de o oră şi analizată pe un Acumen eX3 hci (TTP Labtech). Toate incubările şi etapele de spălare descrise mai sus sunt făcute la temperatura camerei, cu excepţia anticorpului primar.

Analiză şi rezultate:

Plăcile sunt analizate pe un instrument Acumen eX3 utilizând lasere de excitaţie de 488 şi 405 nm şi două filtre de emisie FL2 (500-530 nm) şi FL1 (420-490 nm). Filtrul FL2 este semnalul corespunzător la anticorpul proteic O-GlcNAc (clonă RL2) şi filtrul FL1 este semnalul corespunzător la nucleul celulei (DAPI). Raportul FL2 total/FL1 total (fluorescenţa totală a fiecărei godeu fără obiect sau selecţie de populaţie) este utilizat pentru analiza datelor. Datele sunt normalizate la o inhibare maximă cum s-a referit printr-un tratament de 15 µM de Tiamet G şi o inhibare minimă cum s-a obţinut printr-un tratament cu 0,15% DMSO. Datele sunt ajustate cu o aplicaţie de ajustare pe o curbă neliniară (ecuaţie logistică cu 4 parametri) şi valorile IC50 sunt calculate şi raportate.

Compusul din Exemplul 1 a fost testat în mod esenţial cum s-a descris mai sus şi a prezentat o IC50 de 21,9 nM± 7,3 (n=5). Aceste date demonstrează că compusul din Exemplul 1 inhibă activitatea enzimei OGA într-un test celular.

Claims (12)

1. Un compus cu formula:

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia. 2. Compusul sau sarea în conformitate cu revendicarea 1 în care metilul din poziţia 2 este în configuraţie cis faţă de oxigenul din poziţia 4 pe inelul de piperidină:

3. Compusul sau sarea în conformitate fie cu revendicarea 1 sau revendicarea 2 în care compusul este N-[4-fluoro-5-[[(2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]-1-piperidil]metil]tiazol-2-il]acetamidă.

4. Compusul în conformitate cu revendicarea 3 care este N-[4-fluoro-5-[[(2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]-1-piperidil]metil]tiazol-2-il] acetamidă.

5. Compusul în conformitate cu revendicarea 4 în care compusul este cristalin.

6. Compusul în conformitate cu revendicarea 5 care este caracterizat printr-un maxim în spectrul de difracţie cu raze X pe pulbere, la unghiul de difracţie 2-teta de 12,1° în combinaţie cu unul sau mai multe maxime selectate din grupul constând din 15,3°, 21,6°, 22,2°, 22,7°, 23,5°, 24,3°, şi 26,8°, cu o toleranţă pentru unghiurile de difracţie de 0,2 grade.

7. Un compus sau sare acceptabilă farmaceutic a acestuia în conformitate cu oricare dintre revendicările 1-6 pentru utilizare în terapie.

8. Un compus sau sare acceptabilă farmaceutic a acestuia în conformitate cu oricare dintre revendicările 1-6 pentru utilizare în tratamentul bolii Alzheimer.

9. Un compus sau sare acceptabilă farmaceutic a acestuia în conformitate cu oricare dintre revendicările 1-6 pentru utilizare în tratarea progresului deprecierii cognitive uşoare cu boala Alzheimer.

10. Un compus sau sare acceptabilă farmaceutic a acestuia în conformitate cu oricare dintre revendicările 1-6 pentru utilizare în tratarea paraliziei supranucleare progresive.

11. O compoziţie farmaceutică, cuprinzând un compus sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia în conformitate cu oricare dintre revendicările 1-6 cu unul sau mai mulţi purtători, diluanţi, sau excipienţi acceptabili farmaceutic.

12. Un procedeu pentru prepararea unei compoziţii farmaceutice, cuprinzând amestecarea unui compus sau a unei săruri acceptabile farmaceutic a acestuia în conformitate cu oricare dintre revendicările 1-6 cu unul sau mai mulţi purtători, diluanţi, sau excipienţi acceptabili farmaceutic.