MD3551664T2 - Anticorpi și polipeptide direcționate împotriva CD 127 - Google Patents

Abstract

Inventia se referă la domeniul anticorpilor utilizati in terapia si diagnosticul prin tintirea CD127, a lantului alfa al receptorului IL7 si in particular asigura anticorpi monoclonali umanizati impotriva CD127, in particular CD127 uman, utilizarile lor terapeutice si utilizarea in diagnostic.

Description

Invenţia se referă la domeniul polipeptidelor sau anticorpilor utili în aplicaţii terapeutice şi de diagnosticare care vizează CD 127, lanţul alfa al receptorului IL7 şi oferă în special anticorpi monoclonali umanizaţi împotriva CD127, în special CD127 uman, utilizări terapeutice ale acestora şi aplicaţii de diagnosticare.

Scurtă descriere a invenţiei

Lanţul alfa (sau subunitatea) receptorului pentru interleukină7 (IL-7), este desemnat CD 127 sau p90 IL-7R sau IL-7Ralpha sau IL-7Rα (uneori notat şi IL-7Ra). Într-un aspect particular, anticorpii, în special anticorpii monoclonali furnizaţi aici sunt direcţionaţi împotriva lanţului alfa al receptorului pentru IL-7 uman exprimat pe celule umane. Într-un aspect particular, anticorpii furnizaţi aici au proprietăţi antagoniste pentru interacţiunea IL-7-IL-7R, pot prezenta activitate citotoxică împotriva celulelor CD 127 pozitive, dar nu măresc maturarea celulelor dendritice (DC) induse de TSLP. În special, anticorpii furnizaţi aici recunosc un epitop CD 127 uman care cuprinde secvenţe din situsul 2b al CD127, în special epitopul cuprinde secvenţe CD127 umane din domeniul D1 şi situsul 2b al CD 127, în special epitopul cuprinde cel puţin unul secvenţă din D1 şi cel puţin o secvenţă din situsul 2b, de preferinţă din a treia foaie beta a situsului 2b din CD127. Alternativ, sau în plus, într-un aspect particular, anticorpii furnizaţi aici nu induc internalizarea de CD 127 şi / sau inhibă internalizarea de CD7 indusă de IL7. Într-un aspect particular, anticorpii furnizaţi aici sunt umanizaţi şi cuprind cel puţin 80% şi, preferabil, cel puţin 84%, sau cel puţin 85% din reziduuri umane. Într-un aspect particular, anticorpii furnizaţi aici au un efect rapid asupra celulelor T cu memorie efectoare, un efect de lungă durată asupra celulelor T cu memorie efectoare sau, de preferinţă, un efect rapid şi de lungă durată asupra celulelor T cu memorie efectoare. Într-un aspect particular, anticorpii furnizaţi aici permit o producţie eficientă. Într-un aspect particular, nivelurile de expresie ale CD127, IL-7 şi / sau TSLP pot fi măsurate pentru a evalua probabilitatea de răspuns, în special folosind anticorpii anti-CD 127 furnizaţi aici. În plus faţă de anticorpi, sunt furnizatei aici polipeptide, în special ca instrumente pentru producerea anticorpilor şi / sau pentru utilizări similare cu anticorpii menţionaţi, în special domenii variabile ale lanţului uşor ale anticorpilor sau lanţuri uşoare ale anticorpilor, fragmente care leagă antigenul şi molecule mimetice ale anticorpilor din astfel de anticorpi şi polinucleotide.

Inventatorii au căutat să obţină anticorpi umanizaţi îmbunătăţiţi în comparaţie cu anticorpii N13B2-h1, N13B2-h2 şi N13B2-h3 descrişi în WO 2015/189302. Deşi se ştie că unele reziduuri din secvenţele cadrului domeniului variabil, inclusiv reziduuri în zona Vernier, reziduuri canonice, reziduuri la interfaţa VH / VL, etc., sunt critice în structura unui anticorp şi nu ar trebui mutate pentru a păstra activitatea biochimică şi biologică a unui anticorp, inventatorii au constatat în mod surprinzător că unele mutaţii din secvenţa cadru a domeniului variabil al lanţului uşor al N13B2, inclusiv unele dintre aceste reziduuri critice, permit creşterea conţinutului de reziduuri umane (mai mult decât N13B2-h3 şi până la 86,3%) şi producţie îmbunătăţită (de până la de 4 ori mai mare decât N13B2-h3), păstrând în acelaşi timp toate caracteristicile funcţionale.

Aceste mutaţii constau din 16 substituţii de aminoacizi în secvenţa cadru a domeniului variabil al lanţului uşor al N13B2 şi, în special, suplimentar în substituţia reziduului de valină în poziţia 48 cu un reziduu de leucină (V48L) şi / sau în substituţia reziduului de fenilalanină în poziţia 87 cu un reziduu de tirozină (F87Y). Aceste poziţii şi orice poziţii de aminoacizi cu lanţuri de anticorpi furnizate aici, dacă nu se specifică altfel, sunt furnizate folosind numerotarea Kabat. Sunt furnizate aici domeniile variabile ale lanţului uşor de anticorpi îmbunătăţite constând din următoarele secvenţe:

• SECV. ID Nr: 9 (incluzând respectivele 16 substituţii de aminoacizi - domeniul variabil al lanţului uşor de anticorp menţionat fiind denumit în continuare N 13B2-hVL3); • SECV. ID Nr: 10 (incluzând respectivele 16 substituţii de aminoacizi şi suplimentar cu mutaţie V48L - domeniul variabil al lanţului uşor de anticorp menţionat fiind denumit în continuare N13B2-hVL4); • SECV. ID Nr: 11 (incluzând respectivele 16 substituţii de aminoacizi şi suplimentar cu mutaţia F87Y - domeniul variabil al lanţului uşor de anticorp menţionat fiind denumit în continuare N 13B2-hVL5); şi • SECV. ID Nr: 12 (incluzând respectivele 16 substituţii de aminoacizi şi suplimentar cu ambele mutaţii V48L şi F87Y - domeniul variabil al lanţului uşor de anticorp menţionat fiind denumit în continuare N13B2-hVL6). Astfel, domeniul variabil al lanţului uşor de anticorp desemnat aici N13B2-hVL3, cuprinde CDR-urile de N13B2-h3, respectivele 16 substituţii de aminoacizi şi reziduurile originale de N13B2 în poziţiile critice 48 şi 87 (adică, respectiv, V şi F) în secvenţe de cadru uman şi are secvenţa SECV ID Nr: 9. Domeniul variabil al lanţului uşor al anticorpului îmbunătăţit preferat furnizat aici, desemnat N13B2-hVL6, cuprinzând în plus ambele mutaţii V48L şi F87Y, constă din secvenţa prezentată în SECV ID Nr: 12. Persoana calificată nu s-ar fi aşteptat ca mutaţiile menţionate, în special în astfel de poziţii în cadrul domeniului variabil al lanţului uşor, să lase neafectată afinitatea anticorpului cu CD 127: V48 este un reziduu canonic şi F87 este localizat la interfaţa VH / VL; mutaţia unor astfel de reziduuri, aşa cum este cunoscută persoanei calificate şi discutată, de ex., de Clark, 2014, este de aşteptat să afecteze afinitatea şi / sau stabilitatea anticorpului. Aşa cum este utilizat aici, termenul de reziduu „canonic" se referă la un reziduu dintr-un CDR sau cadru care defineşte o anumită structură CDR canonică, aşa cum este definită de Chothia şi colab., J. Mol. Biol. 196: 901- 907 (1987); Chothia şi colab., J. Mol. Biol. 227: 799 (1992)). Conform lui Chothia şi colab., Porţiuni critice ale CDR-urilor multor anticorpi au conformaţii ale scheletului peptidic aproape identice, în ciuda diversităţii mari la nivelul secvenţei de aminoacizi. Fiecare structură canonică specifică în primul rând un set de unghiuri de torsiune a scheletului peptidic pentru un segment adiacent de reziduuri de aminoacizi care formează o buclă. Nu a fost previzibil faptul că introducerea mutaţiilor dezvăluite în ambele poziţii ar avea ca rezultat o producţie îmbunătăţită, păstrând în acelaşi timp caracteristicile de legare şi, în mod avantajos, alte caracteristici funcţionale ale anticorpilor. În consecinţă, este prezentată aici o polipeptidă utilă în special pentru producerea unor astfel de anticorpi, în special un domeniu variabil al lanţului uşor de anticorp sau un lanţ uşor de anticorp, constând dintr-o secvenţă, în special de până la 250 de aminoacizi, cuprinzând sau, constând din secvenţa stabilită în SECV ID NR: 9; SECV ID NR: 10; sau SECV ID NR: 11; sau SECV ID NR: 12, sau un fragment care leagă antigenul sau o moleculă mimetică a anticorpului acestuia, aşa cum este definit în continuare. Invenţia se referă la anticorpi sau la fragmentul de legare a antigenului acestora, în special anticorpi monoclonali umanizaţi, care se leagă în mod specific de CD127, în special de CD127 uman, şi cuprind: • un lanţ uşor al anticorpului care cuprinde sau, un domeniu variabil al lanţului uşor al anticorpului constând dintr-o secvenţă selectată din grupul constând din SECV. ID Nr: 9; SECV ID Nr: 10; SECV ID Nr: 11; SECV ID Nr: 12; în special SECV ID Nr: 12; şi • un domeniu variabil al lanţului greu al anticorpului constând din secvenţa stabilită în SECV ID Nr: 7.

Într-o realizare preferată, invenţia se referă la anticorpi sau fragmente de legare a antigenului acestora, furnizate aici, în special anticorpi monoclonali umanizaţi, care se leagă în mod specific la CD 127 uman, şi cuprind:

• un domeniu variabil al lanţului uşor constând dintr-o secvenţă selectată din grupul format din SECV ID Nr: 9, SECV ID Nr: 10, SECV ID Nr: 11 şi SECV ID Nr: 12, în special SECV ID Nr: 12; şi • un domeniu variabil al lanţului greu constând din secvenţa stabilită în SECV ID NR: 7. Într-un aspect particular, anticorpul furnizat aici cuprinde un lanţ uşor cu un domeniu variabil ca mai sus şi un domeniu constant constând dintr-o secvenţă selectată dintre SECV ID Nr: 27 sau 28, preferabil SECV ID Nr: 27 şi un lanţ greu cu domeniu variabil ca mai sus şi un domeniu constant alcătuit din secvenţa stabilită în SECV ID NR: 26. De asemenea, aici este prevăzută o polipeptidă izolată formată dintr-o secvenţă de până la 250 de aminoacizi, în special de până la 217, până la 214, până la 211, mai ales până la 200, până la 175, până la 150, până la 135, până la 120, până la 107 şi, chiar mai ales, de până la 100, de până la 90, de până la 80, de până la 74, de până la 70, de până la 60 amino acizi, în care respectiva secvenţă cuprinde sau, constă dintr-o secvenţă selectată din grupul constând din: • SECV ID Nr: 9 (CDR-uri de N13B2-h3 în secvenţe cadru umane); • SECV ID Nr: 10 (CDR-uri de N13B2-h3 în secvenţe cadru umane, inclusiv mutaţia V48L); • SECV ID Nr: 11 (CDR-uri de N13B2-h3 în secvenţe cadru umane, inclusiv mutaţia F87Y); • SECV ID NR: 12 (CDR-uri de N13B2-h3 în secvenţe cadru umane, incluzând atât mutaţiile V48L, cât şi mutaţiile F87Y); şi • un fragment care leagă antigenul acesteia, în special fragmentul menţionat cuprinzând cele trei CDR-uri constând din secvenţele prezentate în SECV ID Nr: 4, SECV ID Nr: 5 şi SECV ID Nr: 6, mai ales un fragment cuprinzând cel puţin 74 de aminoacizi constând din aminoacizii 24 până la 97 din SECV ID Nr: 12. De asemenea, sunt furnizate aici polinucleotidele care codifică polipeptidele furnizate aici, în special anticorpii sau fragmentele acestora care leagă antigenul conform invenţiei. Astfel de polinucleotide codifică în special polipeptide care cuprind sau, constau dintr-o secvenţă selectată din grupul constând din SECV ID Nr: 9 până la 12 şi codifică, de asemenea, polipeptide care cuprind sau, constau din secvenţa SECV ID Nr: 7, şi pot codifica, de asemenea, polipeptide care conţin sau constau din secvenţe selectate din grupul constând din SECV ID Nr: 26 până la 28. În special, respectivele polinucleotide cuprind sau, constau din combinaţia a cel puţin două secvenţe izolate de acid nucleic (molecule), o primă moleculă de acid nucleic izolată care cuprinde sau constă dintr-o secvenţă selectată din grupul format din SECV ID Nr: 15 până la 18; în special SECV ID Nr: 18; combinaţia menţionată cuprinzând sau, constând dintr-o a doua moleculă de acid nucleic izolată, cuprinzând sau, constând dintr-o secvenţă selectată din grupul constând din SECV ID Nr: 13 şi SECV ID Nr: 29 până la 31, în special SECV ID Nr: 13. În particular, polipeptida conform invenţiei cuprinde un domeniu variabil al lanţului uşor de anticorp sau un lanţ uşor de anticorp, polipeptida menţionată cuprinzând cel puţin 84% şi, mai ales, cel puţin 85% din reziduuri umane. Respectiva polipeptidă poate fi un fragment care leagă antigenul şi / sau o moleculă mimetică a anticorpului dintr-un anticorp descris aici. Sunt furnizate aici compoziţii care cuprind polipeptidele menţionate, în special domenii variabile ale lanţului uşor de anticorpi sau lanţuri uşoare de anticorpi, anticorpi, fragment de legare la antigen sau molecula mimetică a anticorpilor acestora, metode de obţinere a anticorpilor menţionaţi, molecule de acid nucleic care codifică polipeptidele şi anticorpii menţionaţi, şi utilizări ale polipeptidelor, anticorpilor şi compoziţiilor menţionate. În consecinţă, polipeptidele, domeniile variabile ale lanţului uşor ale anticorpilor, lanţurile uşoare ale anticorpilor, anticorpii, fragmentele care leagă antigenul, moleculele mimetice ale anticorpilor şi compoziţia furnizate aici pot fi destinate şi / sau adecvate pentru utilizare cu scopul de a remedia o afecţiune diagnosticată la un pacient uman care rezultă din patogeneza legată de limfopoieză, când căile de semnalizare IL-7 oferă o contribuţie la patogeneza menţionată, mai ales atunci când este nedorită o creştere a maturării, mai precis reglarea în sus a moleculelor costimulatoare, a celulelor dendritice.

Descriere detaliată a invenţiei

Biochimie

CD127 este comun receptorului IL-7 (IL-7R) şi receptorului TSLP (TSLPR). IL-7R este constituit dintr-un heterodimer al CD127 şi lanţul gamma comun (yc) al receptorilor interleukinici. Lanţul gamma comun yc este uneori menţionat aici şi în literatură ca CD 132. IL-7R este legat de interleukină 7. Receptorul TSLP este un heterodimer al CD 127 şi al factorului 2 al receptorului citokinei (CRLF2). Receptorul TSLP este legat de TSLP. În literatură, TSLPR este uneori utilizat pentru a desemna atât lanţul CRLF2 al receptorului, cât şi complexul CD127 / CRLF2. Pentru a evita confuzia, în cele ce urmează TSLPR desemnează de obicei complexul.

CD127 (numărul de acces Swiss Prot P16871) poate exista în patru izoforme. Izoforma canonică, denumită şi H20 (Swiss Prot P16871 .1) este o proteină transmembranară cu o singură trecere şi are 459 de aminoacizi constând, de la N- la C-terminal, dintr-o peptidă semnal de 20 aminoacizi, un domeniu extracelular de 219 aminoacizi, un domeniu transmembranar de 25 de aminoacizi şi un domeniu intracelular de 195 de aminoacizi. Alte izoforme împărtăşesc secvenţa tuturor (sau majorităţii) domeniului extracelular al H20 şi afişează secvenţe C-terminale variate. Izoformele 2 şi 4 sunt secretate (Swiss Prot P16871 -4 şi P16871 -3), în timp ce izoforma 3 (Swiss Prot P16871-2) este, de asemenea, o proteină transmembranară. Se raportează că CD127 are secvenţa din SECV ID Nr: 21, iar domeniul său extracelular, atunci când peptida semnal este îndepărtată, are secvenţa din SECV ID Nr: 22. Dacă nu se specifică altfel, numerotarea utilizată aici pentru aminoacizii CD127 este numerotarea din SECV ID Nr: 22.

CD127 este un receptor de citokine clasa de omologie I (CRH I). După cum este bine cunoscut în domeniu, domeniul extracelular al acestor receptori constă din două domenii de fibronectină 3, denumite D1 şi D2. Structura cristalografică precisă a lui CD127 a fost publicată şi discutată, de exemplu, de McElroy şi colab., 2009; McElroy şi colab., 2012 şi Walsh, 2012 şi, în special, au fost dezvăluite ca date despre structura proteinelor în baza de date Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (RCSB PDB), cu numărul de acces 3UP1. D1 este în general considerat a fi implicat în legarea cu IL-7, în timp ce D2 este implicat în legarea la lanţul yc (şi, de asemenea, cu IL-7). Important, situsul 2b al domeniului D2 cuprinde trei foi beta, incluzând următoarele secvenţe din SECV ID Nr: 32 (FDLSVIYRE); SECV ID Nr: 33 (NDFVVTFNTS) şi SECV ID Nr: 34 (TKLTLLQR). Situsul 2b al domeniului D2 este inclus, prin urmare, între aminoacizii 109 şi 180 din SECV. ID Nr: 22: (a se vedea Walsh, 2012; Verstraete, K. şi colab., Nature Com 2017). Situsul 2b al domeniului D2 poate fi definit, de asemenea, ca fiind inclus între aminoacizii 109 şi 173 din SECV ID Nr: 22. Situsul 2b din domeniul D2 poate fi definit, de asemenea, ca fiind inclus între aminoacizii 113 şi 180 din SECV ID Nr: 22. Situsul 2b al domeniului 2b poate fi definit, de asemenea, ca fiind inclus între aminoacizii 113 şi 173 din SECV ID Nr: 22. În special, situsul 2b din domeniul D2 cuprinde, în special, constă în principal din aminoacizii 109 la 133 din SECV ID Nr: 22, în special 109 până la 127, în care sunt localizate primele două foi beta; şi aminoacizii 166 până la 180 din SECV ID NR: 22, în care este localizată a treia foaie beta. Mai particular, situsul 2b constă în esenţă din aminoacizii 113 până la 133, în special 113 până la 127, din SECV ID Nr: 22 şi din aminoacizii 166 până la 180 din SECV ID Nr: 22. Mai precis, situsul 2b constă în esenţă din aminoacizii 109 până la 133, în special 109 până la 127, din SECV ID NR: 22 şi aminoacizii 166 până la 173 din SECV ID Nr: 22. Mai ales, situsul 2b constă în principal din aminoacizii 113 până la 133, în special 113 la 127, din SECV ID Nr: 22 şi din aminoacizii 166 până la 173 din SECV ID Nr: 22. Situsul 2b din domeniul D2 este critic pentru interacţiunea CD127-yc, în special pentru a permite sau creşte legarea de CD 127 cu yc în prezenţa IL-7. În special, mutaţiile de la P112 şi L115, care au fost identificate la pacienţii care suferă de imunodeficienţă severă combinată (SCID), sunt considerate a destabiliza nucleul hidrofob al domeniului D2, ceea ce duce probabil la caracteristica lor patogenă. Aşa cum s-a spus mai sus, situsul 2b constă în esenţă din aminoacizii 109 până la 180 din SECV ID NR: 22, sau constă în principal din aminoacizii 109 până la 173 din SECV ID Nr: 22, sau constă în principal din aminoacizii 113 până la 180 din SECV ID Nr: 22, sau constă în esenţă din aminoacizii 113 până la 173 din SECV ID Nr: 22. Persoana calificată va aprecia că extremităţile unui astfel de domeniu nu pot fi neapărat definite fără echivoc cu precizie de o singură bază şi poate să se înţeleagă că situsul 2b cuprinde, la unul sau la ambele capete ale secvenţei menţionate, 1, 2 sau 3 mai mulţi sau mai puţini aminoacizi. Prin urmare, atunci când se face referire aici la situsul 2b al CD127, acest lucru ar trebui înţeles ca referindu-se la o secvenţă a CD127 începând de la poziţiile 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 sau 113, şi terminând la poziţia 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179 sau 180 din SECV ID Nr: 22; în special la o astfel de secvenţă despre care se crede sau, se arată că constituie un situs de legare esenţial cu lanţul yc al IL7-R, în special în prezenţa IL-7. Mai particular, atunci când se face referire aici la situsul 2b al CD127, acest lucru ar trebui înţeles ca referindu-se la o secvenţă a CD127 începând de la poziţia 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 sau 113, şi terminând la poziţia 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132 sau 133 din SECV ID Nr: 22, dar şi la o secvenţă de CD127 începând de la poziţiile 162, 163, 164, 165 sau 166 şi terminând la poziţia 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179 sau 180 din SECV ID Nr: 22. Trebuie remarcat faptul că cele trei foi beta definite aici pot cuprinde secvenţe de epitop specifice pentru anticorpi sau fragmente care leagă antigenul sau mimetice care leagă antigenul conform invenţiei. Anticorpii, fragmentele care leagă antigenul şi mimeticele care leagă antigenul conform invenţiei pot fi capabile să se lege în mod specific la SECV ID Nr: 32, SECV ID Nr: 33 şi / sau SECV ID Nr: 34. Mai mult, o secvenţă de aminoacizi cuprinzând la cel puţin o porţiune dintr-o foaie beta şi câţiva aminoacizi contiguaţi localizaţi la un capăt al oricărei foaie beta pot fi, de asemenea, o secvenţă de epitop specifică pentru un anticorp conform invenţiei. De exemplu, secvenţa SECV ID Nr: 35 (TLLQRKLQPAAMYEI) cuprinde ultimii cinci aminoacizi ai celei de-a treia foi beta şi zece aminoacizi suplimentari localizaţi în afara celei de-a treia foi beta. Ca un alt exemplu, SECV ID Nr: 96 (RKLQPAAM) cuprinde un aminoacid localizat în a treia foaie beta şi şapte aminoacizi suplimentari localizaţi în afara celei de-a treia foi beta. În special, anticorpul sau fragmentul acestuia care leagă antigenul sau mimeticul care leagă antigenul conform invenţiei se poate lega în mod specific la R173 din SECV ID Nr: 22. În special, anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului acestuia sau mimeticul care leagă antigenul conform invenţiei se poate lega în mod specific la cel puţin o secvenţă selectată din grupul constând din SECV ID NR: 32; SECV ID Nr: 33; SECV ID Nr: 34, SECV ID Nr: 35 şi SECV ID Nr: 96. În special, anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului acestuia sau mimeticul de legare a antigenului conform invenţiei se poate lega în mod specific la cel puţin o secvenţă selectată din grupul constând din SECV ID Nr: 36 (LVEVKCLNFR); SECV ID Nr: 37 (ICGALVEVKCLNFR) şi SECV ID Nr: 38 (LVEVKCLNFRK). Alternativ sau complementar, anticorpul sau fragmentul acestuia care leagă antigenul sau mimeticul care leagă antigenul conform invenţiei se poate lega în mod specific la cel puţin o secvenţă selectată din grupul format din SECV ID Nr: 39 (KKFLLIG); SECV ID Nr: 40 (KKFLLIGKSNI) şi SECV ID Nr: 41 (FIETKKFLLIG). SECV ID Nr: 36 până la SECV ID Nr: 41 sunt localizate în domeniul D1 al CD 127 şi sunt secvenţe de epitop recunoscute de un anticorp sau fragment de legare a antigenului acestora sau de o moleculă mimetică a anticorpului conform invenţiei. Într-o variantă alternativă sau complementară a invenţiei, anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului acestuia sau o moleculă mimetică a anticorpului conform invenţiei se poate lega în mod specific la cel puţin o secvenţă selectată din grupul format din SECV. ID Nr: 42: (CLNFR) şi SECV ID Nr: 43 (FIETKKF). Aceste două secvenţe sunt secvenţe epitop localizate în domeniul D1 al CD127. Într-o variantă particulară a invenţiei, anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului sau mimeticul de legare a antigenului conform invenţiei se pot lega în mod specific la cel puţin o secvenţă selectată din grupul constând din SECV ID NR: 32; SECV ID Nr: 33; SECV ID Nr: 34, SECV ID Nr: 35 şi SECV ID Nr: 96, în special din grupul format din SECV ID Nr: 34, SECV ID Nr: 35 şi SECV ID Nr: 96; şi cel puţin o secvenţă selectată din grupul constând din SECV ID NR: 36; SECV ID Nr: 37; SECV ID Nr: 38; SECV ID Nr: 39; SECV ID Nr: 40; SECV ID Nr: 41; SECV ID Nr: 42 şi SECV ID Nr: 43, în special din grupul format din SECV ID Nr: 42 şi SECV ID Nr: 43. Într-o variantă preferată a invenţiei, anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului sau mimeticul de legare a antigenului se poate lega în mod specific de SECV ID Nr: 34 şi cel puţin o secvenţă selectată din grupul format din SECV ID Nr: 42 şi SECV ID Nr: 43, în special de SECV ID Nr: 42 şi SECV ID Nr: 43. Într-o realizare preferată a invenţiei, anticorpul sau fragmentul care leagă antigenul sau mimeticul care leagă antigenul se poate lega în mod specific de SECV ID Nr: 35 şi cel puţin o secvenţă selectată din grupul format din SECV ID Nr: 42 şi SECV ID Nr: 43, în particular de SECV ID Nr: 42 şi SECV ID Nr: 43. Într-o variantă preferată a invenţiei, anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului sau mimeticul de legare a antigenului se pot lega în mod specific de SECV ID Nr: 96 şi cel puţin o secvenţă selectată dintre grupul format din SECV ID Nr: 42 şi SECV ID Nr: 43, în special la SECV ID Nr: 42 şi SECV ID Nr: 43 Într-o variantă de realizare preferată a invenţiei, anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului sau mimeticul de legare a antigenului se pot lega în mod specific de ambele secvenţe SECV ID Nr: 35 şi SECV ID Nr: 96. Într-o realizare preferată a invenţiei, anticorpul sau fragmentul care leagă antigenul sau mimeticul care leagă antigenul se poate lega în mod specific la ambele secvenţe SECV ID Nr: 42 şi SECV ID Nr: 43. Într-o variantă particulară a invenţiei, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen sau mimeticul care leagă antigenul conform invenţia poate recunoaşte în mod specific cel puţin a treia foaie beta a situsului 2b din domeniul D2 al CD127. Cea de-a treia foaie beta este definită preferenţial ca fiind localizată între aminoacizii 166 şi 173 din SECV ID Nr: 22, corespunzător SECV ID Nr: 34, şi mai ales a treia foaie beta corespunde SECV ID Nr: 34. Într-o realizare mai particulară conform invenţiei, anticorpul sau fragmentul care leagă antigenul sau mimeticul care leagă antigenul conform invenţiei poate recunoaşte în mod specific cel puţin două dintre foile beta localizate în situsul 2b din domeniul D2 şi, mai ales, anticorpul sau fragmentul care leagă antigenul sau mimeticul care leagă antigenul conform invenţiei poate recunoaşte în mod specific cele trei foi beta localizate în situsul 2b din domeniul D2, aşa cum este definit mai sus. Într-o variantă mai particulară a invenţiei, anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului sau mimeticul de legare a antigenului pot recunoaşte în mod specific cel puţin o foaie beta localizată în situsul 2b din domeniul D2, în special a treia foaie beta corespunzătoare SECV ID Nr: 34, şi se leagă la cel puţin o secvenţă selectată din grupul constând din SECV ID NR: 36; SECV ID Nr: 37; SECV ID Nr: 38; SECV ID Nr: 39; SECV ID Nr: 40; SECV ID Nr: 41; SECV ID Nr: 42 şi SECV ID Nr: 43. Într-un exemplu de realizare preferat al invenţiei, anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului sau mimeticul de legare a antigenului poate recunoaşte în mod specific cel puţin a treia foaie beta corespunzătoare SECV ID Nr: 34 şi cel puţin o secvenţă selectată din grupul format din SECV ID Nr: 42 şi SECV ID Nr: 43, în special la SECV ID Nr: 42 şi SECV ID Nr: 43. Într-o variantă mai particulară a invenţiei, anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului sau mimeticul care leagă antigenul poate recunoaşte în mod specific o peptidă liniară sau un epitop liniar constând din aminoacizii din SECV ID Nr: 35. Alternativ sau complementar, anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului sau mimeticul de legare a antigenului poate recunoaşte în mod specific o peptidă sau un epitop conformaţional format din aminoacizii secvenţei ID Nr: 96. Într-o variantă mai particulară, anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului sau mimeticul de legare a antigenului pot recunoaşte în mod specific un epitop liniar sau o peptidă liniară din secvenţa de aminoacizi a SECV ID nr: 35 şi un epitop conformaţional sau o peptidă conformaţională din SECV ID nr: 96.

Semnalizarea IL-7R. Legarea IL-7 la IL-7R declanşează activarea mai multor căi de semnalizare, incluzând kinazele Janus (JAK) -1 şi -3, traductorul de semnal şi activatorul transcripţiei 5 (STAT5) şi fosfatidilinostol 3-kinaza (PI3-k). Se raportează că respectiv căile STAT1 şi STAT3 sunt activate, deşi nu par a fi căile principale. Activarea căii STAT5 este necesară pentru inducerea proteinei anti-apoptotice Bcl-2 şi prevenirea intrării proteinei pro-apoptotice Bax în mitocondrie şi, astfel, pentru supravieţuirea precursorilor de celule T în dezvoltarea timică. Activarea căii PI3-k are ca rezultat fosforilarea şi retenţia citoplasmatică a proteinei pro-apoptotice Bad.

Semnalizarea TSLPR. Limfopoietina timică stromală (TSLP) este o citokină celulară epitelială care este activă în limfopoieză şi este implicată în special în reglarea dezvoltării celulelor sistemului imunitar, reglarea menţionată afectând în special maturarea celulelor respective. TSLP uman (numărul de acces Genbank AF338732) este un factor care exercită polarizarea celulelor dendritice şi promovează proliferarea şi diferenţierea celulelor T şi B. TSLP suprimă, de asemenea, generarea de celule Treg (Lei şi colab., 2011).

Căile de semnalizare induse de TSLP s-au dovedit a fi diferite, la nivel molecular, de căile induse de IL-7. În special, în timp ce legarea TSLP la receptorul său activează şi Jak-1, nu activează Jak-3, dar activează Jak-2. Aceste diferenţe sunt în concordanţă cu observaţia că Jak-1 se asociază cu CD127, împărtăşită de ambii receptori, în timp ce Jak-2 se asociază cu CRLF2 şi Jak-3 cu yc (Rochman şi colab., 2010). Activarea căii STAT5 este raportată şi pentru semnalizarea indusă de TSLP (Zhong şi colab., 2014). Un efect major al TSLP este de a conduce la activarea celulelor dendritice, inducând supraexprimarea moleculelor costimulatoare, cum ar fi CD80, promovând astfel răspunsuri inflamatorii mediate de TH-2 (Reche şi colab., 2001).

Biologie celulară

„Celule CD127-pozitive» desemnează celulele care exprimă CD127 la suprafaţa lor celulară. În majoritatea cazurilor, celulele CD127-pozitive exprimă CD127 într-un complex care formează IL-7R (celule IL-7R-pozitive) şi / sau într-un complex care formează TSLPR (celule TSLPR-pozitive). CD127 este exprimat de diferite celule, inclusiv de memorie şi celule T naive. CD 127 este exprimat în special de celule T efectoare (Teff), inclusiv celule T în repaus şi de memorie, şi de celule B imature, dar nu este exprimat în special prin celule T reglatoare naturale (Treg naturale) în repaus. CD 127 este esenţial pentru promovarea diferenţierii timocitelor şi a expansiunii clonale a limfocitelor.

Importanţa căii IL7-CD127 pentru homeostazia naivă a celulelor T este subliniată de mai multe studii recente care arată că nivelurile de expresie ale CD127 legate de membrană pe celulele T (RTE)-CD4+ convenţionale se corelează cu frecvenţele celulele T CD4+ emigrante timice recente la persoanele sănătoase şi la pacienţii infectaţi cu HIV, precum şi la pacienţii cu SM (Albuquerque şi colab., 2007) (Broux şi colab., 2010). CD127 este, de asemenea, o componentă a receptorului TSLP. S-a demonstrat că secreţia de TSLP de către corpusculii lui Hassall, structuri compuse din celule epiteliale în medula timică, condiţionează celulele dendritice mieloide (MDC) CD11c+ pentru a induce diferenţierea timocitelor în Treg (Watanabe şi colab., 2005a). În consecinţă, semnalele de la receptorul IL-7 sunt necesare pentru dezvoltarea Treg, aşa cum se arată în şoarecii knockout CD127 (Mazzucchelli şi colab., 2008). În (Haas şi colab., 2011), autorii au arătat o expresie CD127 redusă pe celulele T convenţionale şi nivelurile plasmatice de IL-7 reglate în sus, împreună cu reducerea frecvenţelor Treg - Tym recente emigrante şi a funcţiei Treg în MS, fără influenţă genetică clară (Haas şi colab., 2011).

Disecarea modului în care IL-7 îşi reglează traficul de membrană a receptorului înrudit este crucială pentru înţelegerea aprofundată a rolului lui IL-7 / IL-7R în funcţia limfocitelor. Studiile anterioare au sugerat că stimularea IL-7 a celulelor T duce la modularea în jos la suprafaţă de CD127 în 30 de minute, posibil din cauza internalizării receptorilor. În momentele ulterioare (2-6 ore), s-a demonstrat că IL-7 induce o reglare transcripţională de CD127. Cu toate acestea, dinamica reală a internalizării de CD127 şi reglarea mecanismelor de trafic de către IL-7 rămân a fi elucidate (Henriques şi colab., 2010). De asemenea, s-a sugerat că semnalizarea indusă de IL-7 este dependentă de internalizarea de CD127, şi că degradarea ulterioară a receptorilor se bazează pe activitatea JAK3 şi este mediată atât de proteazomi, cât şi de lizozomi.

Fiziopatologie

Celulele dendritice exprimă niveluri ridicate de molecule costimulatoare după maturare, cum ar fi CD80, care promovează răspunsurile imune mediate de celulele T. De asemenea, produc citokina TARC (CCL17), care induce chemotaxia în celulele T. Ca atare, celulele dendritice mature contribuie la fiziopatologia mai multor boli imuno-mediate în care sunt în joc răspunsurile celulelor T, ca de exemplu în astm, artrită reumatoidă, colită, scleroză multiplă şi uveită. Celulele dendritice mature joacă, de asemenea, un rol cheie în procesul de respingere a celulelor, ţesuturilor sau alogrefelor de organe. Prin urmare, multe strategii terapeutice vizează prevenirea maturării celulelor dendritice.

Prezenţa sau absenţa moleculelor costimulatoare pe celulele care prezintă antigen (APC), cum ar fi celulele dendritice influenţează semnificativ natura calitativă şi cantitativă a unui răspuns imun. Supraexprimarea de CD80 de către celulele dendritice determină maturarea DC şi creşte activarea celulelor T cu memorie (Bour-Jordan şi colab., 2011). Din punct de vedere mecanic, interacţiunea lui CD28 cu CD80 ocupă grupul central al sinapsei imunologice şi este colocalizată cu TCR angajat, stabilizând astfel sinapsa imună (Dustin şi Shaw, 1999) (Grakoui şi colab., 1999). Interacţiunea dintre CD28 şi CD80 generează de fapt spaţierea adecvată pentru ca TCR să interacţioneze eficient cu moleculele HLA (Shaw şi Dustin, 1997).

Scleroza multiplă (SM) este o boală inflamatorie demielinizantă a sistemului nervos central (SNC). Apariţia plăcilor demielinizante în SNC la pacienţii cu SM este asociată cu un infiltrat inflamator compus în principal din macrofage şi limfocite T. La nivel mecanic, SM este considerată o boală autoimună. SM este de obicei considerată ca o boală mediată în primul rând de celulele T CD4 +. Subseturi particulare de CD4 +: Th1 şi mai recent Th17, au fost implicate în fiziopatologia bolii. În prezent, este încă dificil să se atribuie roluri specifice fiecărei subpopulaţii Th1 şi Th17. Mai mult, inhibarea traficului de leucocite prin antagonismul alfa4 (α4)-integrină a fost acum validată ca o abordare terapeutică pentru tratamentul bolilor inflamatorii, cum ar fi SM şi boala inflamatorie intestinală (IBD), precum şi pentru tratamentul aterosclerozei (Zhi şi colab., 2014). α4β7 este exprimat pe un set mai restrâns de leucocite, inclusiv macrofage activate, subseturi de limfocite, celule NK, mastocite şi eozinofile.

IL-7 uman induce o expresie puternică a integrinelor α4 şi β7 in vitro pe limfocitele T umane şi creşte dramatic frecvenţa limfocitelor T umane care exprimă integrine α4, β7 şi α4 / β7, care sunt necesare pentru adăugarea şi reţinerea limfocitelor T în ţesuturile non-limfoide precum intestinul, creierul şi pielea (Denucci şi colab., 2009; Gorfu şi colab., 2009).

Celulele T naive sunt parţial responsabile de respingerea acută a organelor şi ţesuturilor transplantate. Aceste celule pot fi controlate de medicamentele imunosupresoare actuale (inhibitori de calcineurină) şi de anticorpi monoclonali care blochează costimularea (anti-adeziune, inhibitori CD80 / 86). Celulele T cu memorie sunt responsabile, de asemenea, de respingerea transplantului. Celulele T cu memorie se acumulează la om din cauza istoriei imune dobândite, în principal reacţii anterioare împotriva viruşilor. S-a arătat că celulele T cu memorie pot fi reactivate de aloantigeni ca urmare a „imunităţii heterologe», care este reacţia încrucişată a apărărilor noastre antivirale cu aloantigenele (Adams şi colab., 2003). Imunitatea heterologă reprezintă o barieră puternică pentru inducerea toleranţei, deoarece celulele T cu memorie, spre deosebire de celulele T naive, sunt programate să se activeze rapid, cu o cerinţă redusă pentru semnale costimulatoare. Celulele T cu memorie pot fi implicate, de asemenea, în respingerea cronică. Pe lângă rolul lor în transplantul de organe şi ţesuturi, celulele T naive şi cu memorie sunt coresponsabile, de asemenea, pentru multe boli autoimune. Acesta este cazul colitei ulcerative (Shinohara şi colab., 2011), artritei reumatoide, psoriazisului sau bolii grefă-contra-gazdă.

Bolile inflamatorii intestinale (IBD), cum ar fi colita ulcerativă (UC) şi boala Crohn (CD), sunt tulburări gastro-intestinale recidivante cronice caracterizate prin inflamaţie intestinală cronică, răspunsuri imune neregulate la microbiota intestinală şi disfuncţie a barierei epiteliale (Khor şi colab., 2011; Abraham şi Cho, 2009). Ratele de incidenţă şi prevalenţă ale IBD sunt în creştere la nivel mondial, iar aceste boli sunt asociate cu morbiditate marcată şi au un impact major asupra calităţii vieţii şi a capacităţii de muncă (Danese şi Fiocchi, 2011; Baumgart şi Sandbom, 2012). Tratamentele convenţionale actuale vizează diminuarea inflamaţiei cu utilizarea treptată a agenţilor antiinflamatori, a medicamentelor imunosupresoare şi a agenţilor biologici care vizează citokinele inflamatorii, cum ar fi factorul alfa de necroză tumorală (TNFa). O caracteristică cheie a IBD este, de asemenea, recrutarea rapidă şi persistenţa prelungită a leucocitelor la locul inflamaţiei, care este permisă de interacţiunea integrinelor cu receptorii înrudiţi, exprimate de celulele endoteliale, permiţând aderenţa şi transmigrarea celulelor (Adams şi Eksteen, 2006; Agace, 2006). Terapiile emergente vizează această intrare în intestin cu molecule anti-adeziune, vizând în special calea integrinelor α4β7 intestinale (Feagan şi colab., 2013; Sandbom şi colab., 2013)7,8. Cu toate acestea, aceste terapii nu menţin remisiunea la mai mult de jumătate dintre pacienţi, erupţii recidivante aparând într-o proporţie mare de respondenţi primari. Infecţiile oportuniste se dezvoltă, de asemenea, ca urmare a imunosupresiei generale. Astfel, un obiectiv major este de a oferi tratamente noi pentru IBD şi de a identifica markeri care determină cronicitatea, răspunsul şi recăderea IBD.

Mai mult, s-a arătat că mai multe celule maligne prezintă IL-7R. Acesta este cazul limfomului cutanat Sezary (60% dintre acestea) sau leucemie limfoblastică acută în copilărie, în care aproximativ 15% din cazuri dezvoltă mutaţia de câştig a funcţiei în CD127, făcând aceste tumori parţial dependente de IL-7 (Shochat şi colab., 2011).

Epuizarea limfocitelor T a fost o abordare imunosupresoare evidentă pentru a contracara respingerea alogrefelor sau pentru a combate autoimunitatea. Cu toate acestea, epuizarea totală a celulelor T ar putea să nu fie favorabilă pentru inducerea toleranţei imunologice. Direcţionarea subpopulaţiilor de celule T sau a celulelor T activate selectiv, fără modificarea celulelor Treg, ar putea constitui o abordare pro-tolerogenă (Haudebourg şi colab., 2009). CD127 poate fi astfel considerat ca o potenţială ţintă terapeutică atractivă pentru anticorpii monoclonali (Mab-uri) care vizează modularea răspunsurilor imune, deoarece astfel de anticorpi monoclonali ar putea avea potenţialul de epuizare a efectorului, dar nu şi a limfocitelor reglatoare. S-a presupus în consecinţă că acestea ar putea prezenta eficacitate în transplant, autoimunitate (Michel şi colab., 2008) şi tumori maligne prin antagonizarea accesului lui IL-7 la IL-7-R şi, prin aceasta, limitând funcţia şi creşterea celulelor T şi B.

O terapie cu un anticorp monoclonal împotriva celulelor CD127+ care interferează cu calea IL-7 ar putea îndeplini acest obiectiv prin eliminarea / neutralizarea celulelor T naive şi cu memorie şi / sau reducerea numărului acestora în timp ce se păstrează celulele Treg, sau prin eliminarea sau reducerea numărului de celule maligne CD127-pozitive. O terapie cu un anticorp monoclonal împotriva celulelor CD127+ ar putea acţiona totuşi ca o sabie cu două tăişuri dacă duce la activarea celulelor dendritice. Într-adevăr, CD 127 este exprimat şi de celule dendritice în asociere cu CRLF2, formând receptorul TSLP. În prezenţa TSLP, celulele dendritice se activează şi promovează răspunsurile imune mediate de celulele T. Unii anticorpi monoclonali împotriva CD127, probabil prin modificarea modului în care TSLP interacţionează cu receptorul TSLP, au proprietatea de a creşte maturarea celulelor dendritice indusă de TSLP. În consecinţă, o terapie cu un anticorp monoclonal împotriva CD127 care nu ar creşte maturarea celulelor dendritice indusă de TSLP ar prezenta un avantaj terapeutic. Ar prezenta avantajul blocadei IL7R fără dezavantajul activării celulelor dendritice într-un mediu inflamat care conţine TSLP.

Într-o publicaţie (Racapй şi colab., 2009) autorii au analizat interesul receptorului alfa IL-7 (IL7Rα) ca potenţială ţintă terapeutică în transplant. După ce au analizat expresia IL-7Rα pe diferite celule T şi celule receptive la IL-7, autorii au determinat dacă ţintirea celulelor T cu memorie care exprimă IL-7Rα ar putea prelungi supravieţuirea alogrefei la şoareci, şi au concluzionat că ţintirea IL-7 sau IL-7Rα ar cruţa în mod avantajos celulele Treg. Printre perspective, autorii au subliniat că vizarea fie a lui IL-7, fie a lui IL-7Rα în tratamentul terapeutic ar putea avea consecinţe diferite asupra supravieţuirii celulelor care exprimă CD 127 şi ar putea provoca diferite tipuri de limfopenie. S-a pus şi problema efectelor anticorpilor care ar fi direcţionaţi împotriva IL-7Rα în funcţie de anticorpi blocanţi sau neutralizanţi sau citotoxici şi din punct de vedere conceptual. Cu toate acestea, autorii nu au arătat că au obţinut şi testat astfel de anticorpi, şi au exprimat mai degrabă necesitatea unor studii suplimentare pentru a evalua relevanţa ipotezei.

Având în vedere dezavantajele abordărilor terapeutice disponibile în bolile imune şi alte boli care implică IL-7 / IL-7Rα, cum ar fi diferite tipuri de cancer, inclusiv unele tipuri de cancer de sân, este încă nevoie de alţi candidaţi la medicamente, în special pentru candidaţi activi la ţinte mai selective în scopul controlului, de exemplu, a modulării activării imune la pacienţii umani.

În acest context, anticorpii monoclonali împotriva IL-7Rα având proprietăţi antagoniste faţă de IL-7Rα au fost dezvăluiţi în WO2010/017468, şi versiunile lor umanizate în WO2011/094259 în vederea tratării bolilor autoimune precum scleroza multiplă. Se spune că anticorpii descrişi sunt antagonişti pentru legarea lui IL-7 la receptorul său şi activi împotriva expansiunii celulare de TH17 şi TH1 şi supravieţuirii celulelor despre care s-a spus că necesită interacţiune IL-7 cu receptorul CD 127. Efectul acestor anticorpi asupra maturării celulelor imune, în special a celulelor dendritice, nu a fost luat în considerare. În plus, se spune că aceşti anticorpi nu inhibă producţia de TARC indusă de TSLP (p.107 din WO2011/094259). În mod similar, anticorpii anti-CD127 raportaţi în WO2011/104687 sau în WO2013/056984, care sunt avuţi în vedere pentru utilizarea în tratamentul diabetului, lupusului, artritei reumatoide şi a altor boli autoimune, nu au fost discutate cu privire la efectul lor posibil asupra maturării celulelor dendritice, şi interacţiunea lor cu semnalizarea indusă de TSLP nu a fost raportată. În plus, aşa cum a fost publicat de Kern şi colab. (Kern şi colab., 2013; Kern şi colab., 2015) şi aşa cum se arată aici, anticorpii anti-CD127 din stadiul tehnicii induc internalizarea receptorului. Întrucât anticorpii antagonişti anti-CD 127 care induc şi internalizarea de CD127 nu reuşesc să controleze hipersensibilitatea cutanată de tip IV, în timp ce anticorpii antagonişti anti-CD127 care nu induc internalizarea o fac, s-ar putea ca procesul de internalizare să activeze calea de semnalizare, atenuând efectul antagonist al anticorpilor. În cele din urmă, anticorpii din stadiul tehnicii recunosc un epitop care nu cuprinde nicio secvenţă din situsul 2b al CD127 (adică în special din aminoacizii 109-180 din SECV. ID Nr: 22), sau în special din aminoacizii 109-173 din SECV ID Nr: 22, sau în special din aminoacizii 113-180 din SECV ID Nr: 22, sau în special din aminoacizii 113-173 din SECV ID Nr: 22); şi nu s-a demonstrat că perturbă legarea de CD127 cu lanţul yc al IL7-R.

În ciuda interesului recent pentru dezvoltarea anticorpilor CD127, eforturile s-au concentrat astfel asupra inhibării semnalizării IL-7R indusă de IL7. Cu toate acestea, TSLP şi TSLPR au fost implicaţi într-o serie de patologii. S-a demonstrat că TSLP joacă un rol în bolile pielii şi ale plămânilor (He şi Geha, 2010) şi se asociază diferitelor patologii, inclusiv boli inflamatorii ale căilor respiratorii şi dermatită atopică la om şi şoareci (Ying şi colab., 2008) (Jariwala şi colab. , 2011). În plus, s-a demonstrat că TSLP se asociază cu reglarea imunităţii şi inflamaţiei intestinale (Taylor şi colab., 2009). Alte patologii care implică TSLP şi TSLPR includ leucemia cu celule B pediatrică (van Bodegom şi colab., 2012), tulburări alergice specifice plămânilor şi pielii, boli legate de autoimunitate (Roan şi colab., 2012) şi cancerul, inclusiv cancerul de sân (Olkhanud şi colab., 2011).

Anticorpii care nu prezintă efectul creşterii maturării celulelor dendritice şi / sau care nu induc internalizarea de CD127 şi / sau care inhibă internalizarea indusă de IL7 au fost dezvăluiţi în WO 2015/189302. Acesti anticorpi, denumiţi N13B2 (anticorp himeric), N13B2-h1, N13B2-h2 şi N13B2-h3 (N13B2 umanizat) în cererea menţionată şi în continuare, au o eficienţă ridicată, în special in vivo şi, în special, s-a dovedit că au un efect rapid asupra celulelor T cu memorie efectoare, aşa cum este definit mai jos. Cu toate acestea, anticorpii menţionaţi sunt umanizaţi într-o măsură limitată şi eficienţa lor de producţie este, de asemenea, limitată. Mai mult, nu a fost raportat niciun efect de lungă durată al anticorpilor menţionaţi asupra celulelor T cu memorie efectoare.

Prezenta dezvăluire se referă la instrumente pentru proiectarea de anticorpi noi adecvaţi ca şi candidaţi terapeutici pentru administrarea la pacienţii cu sau, cu risc de boală care implică căi de semnalizare de IL-7. Conform diferitelor abordări furnizate aici, astfel de instrumente îmbunătăţesc prepararea anticorpilor destinaţi administrării la gazde umane. Astfel de instrumente cuprind în special anticorpi umanizaţi, în special monoclonali, care cuprind toate secvenţele CDR ale N13B2-h3.

Astfel de polipeptide (sau polinucleotide care codifică astfel de polipeptide) sunt furnizate în special pentru producerea de anticorpi (sau fragmente ale acestora care leagă antigenul) şi / sau ca anticorpi (sau fragmente ale acestora care leagă antigenul), în special care se leagă în mod specific de CD 127; anticorpii menţionaţi, în special anticorpii monoclonali, cuprind un domeniu variabil al lanţului greu constând din secvenţa stabilită în SECV ID Nr: 7, sau au secvenţa menţionată cu mutaţii suplimentare, în special substituirea, ştergerea sau inserarea a patru reziduuri, de preferinţă trei sau două reziduuri şi, chiar mai preferabil, un reziduu, preferabil în care mutaţiile menţionate nu sunt nici în secvenţele CDR, nici în poziţiile canonice sau Vernier ale secvenţelor cadru.

Anticorpii furnizaţi aici sunt, de preferinţă, anticorpi monoclonali, ceea ce înseamnă că o compoziţie a acestor anticorpi este omogenă, mai ales identică, în ceea ce priveşte specificitatea de legare a antigenului şi, în consecinţă, în ceea ce priveşte compoziţia regiunii variabile.

Invenţia furnizează anticorpi care împărtăşesc CDR-urile anticorpului N13B2-h3, dar au un cadru distinct de domeniu variabil al lanţului uşor. Inventatorii au arătat în mod surprinzător că anticorpii care cuprind aceleaşi CDR-uri ale domeniului variabil al lanţului uşor de N13B2-h3, adică CDR-urile cu SECV ID Nr: 9; SECV ID Nr: 10; SECV ID Nr: 11 sau SECV ID Nr: 12; în timp ce sunt umanizaţi pe scară largă, sunt produşi în măsură ridicată în comparaţie cu N13B2-h3 (de până la de 4 ori mai mult), păstrând în acelaşi timp toate caracteristicile funcţionale.

Prezenta dezvăluire oferă mijloace adecvate în acest context, cuprinzând în special anticorpi monoclonali specifici împotriva lui IL-7Rα. În exemple particulare de realizare, anticorpii menţionaţi interferează doar negativ cu calea TSLP. În consecinţă, în realizările preferate, anticorpii menţionaţi nu cresc maturarea celulelor dendritice induse de TSLP. În plus sau alternativ, în anumite exemple de realizare, anticorpii menţionaţi nu induc internalizarea de CD127 şi / sau inhibă internalizarea de CD127 indusă de IL7. În exemple particulare de realizare, anticorpii menţionaţi combină aceste proprietăţi legate de maturarea şi / sau internalizarea de DC cu activitatea antagonistă către semnalizarea de IL-7 / IL-7-R. În exemple particulare de realizare, anticorpii menţionaţi inhibă expresia indusă de IL7 a integrinelor α4, β7 şi α4 / β7 în celulele T, în special in vivo. În realizări particulare, anticorpii menţionaţi exercită o acţiune citotoxică împotriva celulelor CD127+ ţintă care îşi reduc fizic numărul (contracţia subpopulaţiei). În plus sau alternativ, în anumite exemple de realizare, anticorpii menţionaţi cuprind cel puţin 80%, de preferinţă cel puţin 84% sau, mai mult de 84%, şi chiar mai preferabil, cel puţin 85% din reziduurile umane aşa cum sunt definite în cele ce urmează. În plus sau alternativ, în anumite exemple de realizare, anticorpii menţionaţi sunt produşi cel puţin la fel de eficient ca N13B2-h3, de preferinţă cel puţin de două ori mai eficient, aşa cum este definit mai jos. În plus sau alternativ, în exemple de realizare particulare, anticorpii menţionaţi au un efect rapid şi / sau de lungă durată asupra celulelor T cu memorie efectoare.

În special, anticorpii furnizaţi aici conţin un lanţ greu variabil (VH) cuprinzând următoarele secvenţe de aminoacizi:

VHCDR1 SECV ID Nr: 1;

VHCDR2 SECV ID Nr: 2;

VHCDR3 SECV ID Nr: 3,

lanţul VH constând din secvenţa stabilită în SECV ID Nr: 7: Lanţul greu variabil menţionat este în special legat de lanţul greu constant constând din secvenţa din SECV ID Nr: 26 pentru a constitui un lanţ greu complet de anticorp.

În special, anticorpii furnizaţi aici conţin un lanţ VL care constă dintr-o secvenţă selectată din grupul constând din secvenţa cu SECV ID Nr: 9, SECV ID Nr: 10, secvenţa SECV ID Nr: 11 şi secvenţa SECV ID Nr: 12, în special secvenţa cu SECV ID Nr: 12: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSEDIYQGLAWYQQKPGKAPKLLLYSANTLHIGVPSRFSG SGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYYDYPLAFGGGTKVEIK. Lanţul uşor variabil menţionat este în special legat de lanţul uşor constant constând dintr-o secvenţă selectată din SECV ID Nr: 27 şi SECV ID Nr: 28, în special SECV ID Nr: 27, pentru a constitui un lanţ uşor complet de anticorp.

Anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului acestuia conform invenţiei, se leagă în mod specific de CD127, în special de CD127 uman, şi cuprinde:

• un lanţ uşor al anticorpului care cuprinde sau, un domeniu variabil al lanţului uşor al anticorpului constând dintr-o secvenţă selectată din grupul constând din SECV. ID Nr: 9; SECV ID Nr: 10; SECV ID Nr: 11; SECV ID Nr: 12; în special SECV ID Nr: 12; şi • un domeniu variabil al lanţului greu de anticorpi constând din secvenţa stabilită în SECV ID Nr: 7. Într-o variantă mai particulară a invenţiei, anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului acestuia, se leagă în mod specific de CD127 uman, şi cuprinde: • un domeniu variabil al lanţului uşor al anticorpului sau, un lanţ uşor al anticorpului conform invenţiei, constând în special dintr-o secvenţă selectată din grupul constând din SECV ID Nr: 9: SECV ID Nr: 10; SECV ID Nr: 11 şi SECV ID Nr: 12, în special SECV ID Nr: 12; şi • un domeniu variabil al lanţului greu de anticorpi constând din secvenţa stabilită în SECV ID Nr: 7.

Legarea de CD127

În conformitate cu invenţia, „legarea» de proteina IL-7Rα se referă la o interacţiune de tip antigen-anticorp şi cuprinde proprietăţi de „legare specifică» ale anticorpilor sau ale fragmentelor de legare a antigenului acestora, legare specifică însemnând că anticorpii sau fragmentele de legare a antigenului se leagă de proteina IL-7Rα în timp ce nu se leagă sau, se leagă cu o afinitate semnificativ mai slabă de alte proteine (de exemplu, lanţul γ al receptorului comun de citokine). Legarea specifică este, de preferinţă, definită şi / sau determinată în condiţii fiziologice, în special în ceea ce priveşte pH-ul şi conţinutul de sare al soluţiei de testare. Legarea şi specificitatea legării poate fi testată în conformitate cu testele dezvăluite în exemple şi, în special, poate fi testată prin biosenzor, Blitz, Biacore, ELISA sau Western Blot.

În realizări particulare, anticorpii furnizaţi aici vizează şi leagă lanţul alfa IL-7-R atunci când este complexat în receptorul TSLP (cu CCRF2; Număr de acces Genbank AF338733; Reche şi colab., 2001). În realizări particulare, anticorpii furnizaţi aici se leagă de CD127 ca o proteină izolată cu o constantă de afinitate (KD) egală cu sau, mai mică decât 5E-9 M, după cum se poate determina prin analiza biosenzorului, în special prin metoda Blitz. În realizări particulare, proprietăţile de legare ale anticorpilor sunt determinate sau definite folosind un antigen al CD127 uman care cuprinde secvenţele din ep1 (SECV ID Nr: 19) şi / sau ep2 (SECV ID Nr: 20). În exemple de realizare particulare, antigenul cuprinde un fragment de CD127 uman cuprinzând atât ep1, cât şi ep2 (adică antigenul cuprinde secvenţele din ep1 şi ep2 şi secvenţele intercalate ale CD127 uman). În exemple de realizare particulare, anticorpii furnizaţi aici au cel puţin aceeaşi afinitate pentru antigenul menţionat ca anticorpul N13B2-h3 dezvăluit în WO 2015/189302, şi / sau ca anticorpul N13B2-hVL6 dezvăluit aici (cu VH având secvenţa din SECV ID Nr: 7 şi VL având secvenţa din SECV ID Nr: 12), şi / sau ca anticorpul cu VH având secvenţa din SECV ID Nr: 7, şi VL cu secvenţa din SECV ID Nr: 10 sau cu secvenţa din SECV ID Nr: 11.

Metodele de testare a legării anticorpilor de ţinta lor, fie CD127 de lungime completă, izolate sau sub formă de TSLPR sau IL7R, sau un antigen al acestora ca mai sus, cuprinzând în special metoda Blitz, sunt cunoscute persoanei calificate şi sunt ilustrate în special în Figura 3, Exemplul 3 şi Exemplul 4 de aici şi în p. 14, Figurile 3, 4 şi 6 şi legendele respective, şi Exemplele 1, 2, 6, 7 din WO 2015/189302.

Absenţa maturizării crescute a celulelor dendritice induse de TSLP

Anticorpii furnizaţi aici pot lega CD127 în receptorul TSLP (adică se pot lega de CD127 atunci când se află într-un complex cu CRLF2, formând receptorul TSLP). Prin urmare, anticorpii furnizaţi aici pot interfera cu semnalizarea indusă de TSLP şi / sau mediată de receptorul TSLP. De preferinţă, anticorpii furnizaţi aici nu fac sinergie cu TSLP pentru maturarea celulelor imune, în special a celulelor dendritice. Cu alte cuvinte, anticorpii conform invenţiei nu cresc maturarea celulelor imune induse de TSLP.

Acest efect este de dorit în special la maturarea celulelor dendritice. Mijloacele de măsurare a unui astfel de efect sunt cunoscute persoanei calificate şi sunt dezvăluite în special în WO 2015/189302 la paginile 16-17 şi în Exemplul 9 al acestuia. În special, anticorpii furnizaţi aici nu cresc expresia de CD40 cu mai mult de 50%, în comparaţie cu stimularea cu TSLP singur (fără anticorp). De preferinţă, expresia de CD40 nu este mărită cu mai mult de 25%, preferabil, cu nu mai mult de 10% şi, chiar mai preferabil, cu nu mai mult de 5%. În realizări preferate în mod deosebit, expresia de CD40 nu este crescută sau, este scăzută în celulele stimulate cu TSLP şi cu anticorpii menţionaţi, în comparaţie cu celulele stimulate numai cu TSLP.

Inhibarea expresiei induse de IL7 a integrinelor α4, β7 şi α4 / β7

În realizări particulare, anticorpii furnizaţi aici inhibă expresia indusă de IL7 a integrinelor α4, β7 şi α4 / β7 in vitro. Expresia indusă de IL7 a integrinelor α4, β7 şi α4 / β7, aşa cum este utilizată aici, desemnează una sau ambele dintre creşterea nivelului de expresie a integrinelor α4 şi β7 şi creşterea numărului sau raportului de limfocite T care exprimă α4, β7 şi / sau integrine α4 / β7. Inhibarea poate fi parţială, adică nivelul de expresie al integrinelor α4, β7 şi α4 / β7 în prezenţa de IL7 este crescut peste nivelul iniţial (adică nivelul fără anticorpi şi fără IL7) în prezenţa anticorpilor, dar mai mic decât în absenţa anticorpilor; sau inhibiţia poate fi completă, adică nivelul de expresie al integrinelor α4, β7 şi α4 / β7 în prezenţa de IL7 şi a anticorpului nu este mai mare decât nivelul iniţial.

În realizări particulare, anticorpii furnizaţi aici inhibă expresia integrinelor α4, β7 şi / sau α4 / β7 in vitro, adică nivelul de expresie al integrinelor α4, β7 şi / sau α4 / β7 este mai mic în celulele tratate cu anticorpi (şi cu şi / sau fără IL7) decât în celulele netratate (adică fără anticorp sau IL7). Gradul de inhibare poate fi dependent de doză. Inhibarea expresiei poate fi mai specific definită, testată şi / sau măsurată, aşa cum se prevede în WO 2015/189302 în p. 18, în special paragraful [58] şi în Exemplul 16.

Inhibitori ai internalizării de CD127

Într-un exemplu de realizare particular, anticorpii furnizaţi aici inhibă internalizarea de CD77 indusă de IL7. Astfel, atunci când este incubat cu anticorpii menţionaţi, prezenţa lui IL7 nu induce nicio scădere a expresiei de CD127 la suprafaţa celulară, sau induce o scădere mai puţin puternică a expresiei de CD127 la suprafaţa celulară decât celulele incubate fără anticorpi. În exemple de realizare particulare, atunci când sunt incubate cu anticorpii menţionaţi, nivelul de exprimare de CD127 la suprafaţa celulară atunci când celulele sunt incubate la 37 ° C timp de 15 minute cu 5 ng / ml de IL7 este de cel puţin 80%, preferabil cel puţin 90% din nivelul expresiei la suprafaţa celulară în celule incubate fără IL7. In vitro, expresia la suprafaţa celulară este măsurată, de preferinţă, după un timp limitat, aşa cum s-a indicat mai sus. În plus, deoarece majoritatea proceselor de internalizare celulară sunt inhibate la temperatură scăzută, efectul este de obicei cel mai bine observat la temperatura fiziologică, în special la 37 ° C. Cu toate acestea, se are în vedere şi incubarea celulelor la temperatură scăzută, în special la 4 ° C.

Într-un exemplu de realizare preferat, anticorpii furnizaţi aici nu induc internalizarea de CD 127. Astfel, exprimarea de CD 127 de preferinţă în celule incubate în prezenţa anticorpilor menţionaţi nu este redusă sau, nu este redusă semnificativ, în raport cu expresia la suprafaţa celulară în celulele incubate în condiţii altfel identice, dar în absenţa anticorpului. În exemple de realizare particulare, atunci când este incubat la 37 ° C timp de 30 până la 45 de minute în prezenţa a 50 ng / ml de anticorp, nivelul de exprimare de CD127 la suprafaţa celulară este de cel puţin 80%, preferabil cel puţin 90% din nivelul său în celulele incubate în absenţa anticorpului. Acest efect poate fi observat în absenţa de IL7 (atât în celulele tratate cu anticorpi, cât şi în celulele netratate), în prezenţa de IL7, şi / sau ambele.

Cele două caracteristici legate de internalizarea de CD127 descrise mai sus (adică inhibarea internalizării induse de IL7 sau neinducerea internalizării) pot fi definite şi / sau testate în continuare aşa cum este stabilit în WO2015/189302 în special în paragrafele [59] - [63] de la paginile 19-20 şi din Figura 16 şi Exemplul 5.

Întreruperea interacţiunii lanţului CD127 - yc

Conform unei realizări particulare, anticorpii furnizaţi aici pot perturba legarea de CD127 la lanţul yc al IL7-R. Aceasta înseamnă că, în condiţii (în special condiţii chimice şi fizice) în care CD127 şi lanţul yc sunt legate împreună în absenţa anticorpului şi în special în prezenţa de IL7, prezenţa anticorpilor menţionaţi reduce semnificativ legătura specificată. În exemple de realizare particulare, în prezenţa anticorpului şi a lui IL7, CD127 nu se leagă de yc. În special, în prezenţa anticorpului şi a lui IL7, cantitatea de lanţ yc găsită asociată (sau legată la) CD127 este mai mică de 80%, preferabil mai mică de 50%, chiar mai preferabil, mai mică de 25% sau 10% din cantitatea legată în absenţa anticorpului (sau în prezenţa unui alt anticorp anti CD-127, cum ar fi MD707-13) în condiţii altfel identice, în special în prezenţa de IL7. O astfel de caracteristică a anticorpului poate fi evaluată în special prin metode de co-imunoprecipitare, bine cunoscute persoanei calificate pentru testarea interacţiunii proteinelor şi ilustrate de exemplu în WO2015/189302 în Exemplul 21. În special, celulele pot fi incubate în prezenţa sau absenţa anticorpului testat, apoi solubilizate în condiţii care permit conservarea complexelor proteice, iar lizatul rezultat poate fi supus unei imunoprecipitări anti-CD 127 şi prezenţei de γc în complexul imunoprecipitat cu conţinut de CD127 evaluat prin Western blot folosind anticorpi anti-γc (dimpotrivă, imunoprecipitarea poate fi efectuată folosind anticorpi anti-γc şi prezenţa de CD127 evaluată folosind anticorpi anti-CD127).

Antagonist faţă de interacţiunea IL7-IL7-R

Conform unui exemplu de realizare particular, o macromoleculă, în special un anticorp sau fragment de legare a antigenului acestuia, conform invenţiei, are în plus proprietăţi antagoniste faţă de interleukina 7 (IL7), astfel antagonizând accesul, adică legarea de IL7 la CD 127 pe celulele CD 127 pozitive.

„Proprietăţi antagoniste faţă de interacţiunea IL7-IL7-R" înseamnă că anticorpii sau fragmentele acestora care leagă antigenul conform invenţiei, care vizează IL7-Ralfa, au ca efect prevenirea accesibilităţii receptorului IL7 exprimat pe celulele CD127, în special celulele T efectoare umane, în special celulele T cu memorie umane, pentru partenerul său de legare IL7, în special IL7 uman. Ca urmare a legării antagonizante a lui IL7, anticorpii conform invenţiei sau fragmentele lor funcţionale duc la limfopenie prin prevenirea generării de celule T timice dependente de IL7.

Proprietăţile antagonistului pot fi în special antagonismul faţă de semnalizarea IL7-R indusă de IL7. Un antagonist al semnalizării de IL7-R indus de IL7 poate fi identificat prin măsurarea inhibării fosforilării STAT5, aşa cum este descris în exemple. Fosforilarea indusă de IL7 a lui STAT5 este un marker al activării de IL7-R şi se aşteaptă ca un anticorp care antagonizează interacţiunea lui IL7-IL7-R să scadă fosforilarea indusă de IL7 a lui STAT5.

În realizări particulare, macromolecula conform invenţiei este un antagonist al semnalizării de IL7-R indusă de IL7. Într-o variantă particulară, macromolecula din invenţie inhibă fosforilarea indusă de IL7 a lui STAT5. În realizări preferate, inhibarea fosforilării de STAT5 este mai mare de 50% la concentraţii de anticorpi mici de 55 ng / ml şi / sau inhibarea fosforilării de STAT5 este mai mare de 80% la concentraţii de anticorpi de până la 100 ng / ml. Inhibarea fosforilării de STAT5 poate fi evaluată prin metode cunoscute persoanei calificate şi, în special, prin metoda prezentată în secţiunea de exemple, în special în Exemplul 5 şi / sau în pagina 21, paragrafele [69] şi [70] şi Exemplul 3 din WO2015/189302.

Este de dorit, de asemenea, ca macromolecula din invenţie (în special anticorpul, fragmentul de legare a antigenului acestuia sau molecula mimetică a anticorpului) să inhibe activarea şi / sau să nu activeze sau să mărească activarea căilor de semnalizare de PI3-k şi / sau ERK (kinază reglată de semnal extracelulară) şi, în special, inhibă fosforilarea şi / sau nu induce sau măreşte fosforilarea de PI3-k şi / sau ERK 1 şi / sau ERK 2. În special, anticorpul, fragmentul de legare la antigen al acestuia sau molecula mimetică a anticorpilor furnizată aici şi, în special, un astfel de anticorp, fragment de legare a antigenului sau moleculă mimetică a anticorpului care este un antagonist faţă de interacţiunea IL-7 - IL-7R, nu induce activarea de PI3-k şi / sau ERK (de preferinţă a căii PI3-k şi ERK) şi, în special, nu induce fosforilarea de PI3-k şi / sau ERK 1 şi / sau ERK 2, mai ales nu induce fosforilarea de PI3-k şi ERK 1 şi ER K 2. În special, anticorpul, fragmentul de legare la antigen al acestuia sau molecula mimetică a anticorpului furnizat aici, şi în special un astfel de anticorp, fragmentul de legare la antigen al acestuia sau molecula mimetică a anticorpului care este un antagonist pentru interacţiunea IL-7 - IL-7R, inhibă activarea căilor PI3-k şi / sau ERK şi, în special, inhibă fosforilarea de PI3-k şi / sau ERK 1 şi / sau ERK 2, inhibă mai ales fosforilarea de PI3-k şi ERK 1 şi ERK 2. Activarea căilor şi / sau fosforilarea proteinelor menţionate poate fi testată prin metode cunoscute persoanei calificate şi, în special, prin Western blot, aşa cum este ilustrat în Figura 7 şi Exemplul 8.

Antagonist pentru legarea TSLP

Deoarece anticorpii furnizaţi aici se leagă de CD127 în IL7-R, aceştia se pot lega şi de CD127 în TSLPR şi, în special prin obstacole sterice şi / sau prin concurenţă pe situsuri de legare comune, pot inhiba legarea de TSLP de TSLPR. Cu alte cuvinte, anticorpii furnizaţi aici pot prezenta activitate antagonistă pentru legarea de TSLP.

Inhibitor al producţiei TARC indusă de TSLP

Într-un exemplu de realizare particular, anticorpii furnizaţi aici inhibă producţia de TARC indusă de TSLP a celulelor CD127-pozitive. După cum s-a menţionat mai sus, celulele dendritice stimulate de TSLP produc niveluri ridicate de TARC. Acest lucru poate rezulta din legarea lor la TSLPR şi acţiunea lor potenţială ca antagonişti ai legării TSLP. Într-un exemplu de realizare particular, anticorpii furnizaţi aici nu măresc maturarea celulelor dendritice (maturarea fiind determinată, de exemplu, de o expresie crescută a markerului de suprafaţă al celulelor CD40 şi / sau CD80).

Nivelul producţiei de TARC indusă de TSLP poate fi mai scăzut în celulele tratate cu TSLP împreună cu anticorpii anti-CD 127 prevăzuţi aici decât în celulele tratate numai cu TSLP. Cu alte cuvinte, anticorpii prevăzuţi aici pot fi inhibitori ai producţiei de TARC indusă de TSLP. Într-o variantă de realizare a invenţiei, anticorpii prevăzuţi aici scad nivelul producţiei de TARC. Într-un exemplu de realizare particular, nivelul producţiei de TARC în celulele tratate cu TSLP şi cu un anticorp furnizat aici este redus cu mai mult de 10%, de preferinţă mai mult de 20%, comparativ cu nivelul din celulele tratate cu TSLP singur, la concentraţii de anticorpi scăzute la 1 µg / ml. Măsurarea producţiei de TARC poate fi efectuată pe celule imune CD127-pozitive, în special celule dendritrice, dintr-o probă de sânge folosind orice metodă standard cunoscută de către persoanele calificate şi este ilustrată, de exemplu, în WO2015/189302 în Exemplul 9.

Activitate citotoxică

Într-un exemplu de realizare particular, anticorpii furnizaţi aici sunt citotoxici împotriva celulelor umane, în special a celulelor T umane care exprimă CD127. Celulele umane care exprimă CD127 ca un lanţ al receptorului IL7, care sunt ţinta anticorpilor menţionaţi, sunt în principal limfocite T şi, mai exact, sunt subpopulaţii de limfocite T efectoare, inclusiv celule T naive şi cu memorie, dar nu sunt celule T reglatoare (Treg), în special celule T naturale în repaus. Celulele T cu memorie sunt generate ca rezultat al primării antigenului şi sunt definite în principal prin caracteristicile lor funcţionale, inclusiv capacitatea de a suferi o proliferare a rechemării la reactivare şi diferenţiere în celule efector secundare şi de memorie. În mod similar, receptorul TSLP ţintit (ca un complex care include lanţul alfa IL-7-R) reglează diferenţierea limfocitelor T helper, a celulelor B şi a celulelor dendritice.

În special, anticorpii furnizaţi aici, având „activitate citotoxică împotriva celulelor T» sau proprietăţi citotoxice (anticorpi citotoxici) dau naştere la epuizare în populaţia de celule T efectoare prin uciderea acestor celule şi, prin urmare, reduc numărul acestor celule atunci când sunt administraţi. În schimb, anticorpii menţionaţi nu modifică subpopulaţia de celule T reglatoare sau nu o modifică într-o măsură semnificativă, permiţând celulelor Treg să îşi îndeplinească funcţia. În acest context, într-un exemplu de realizare particular, raportul dintre celulele T (Treg) reglatoare şi celulele T efectoare (Teff) creşte după administrarea anticorpilor menţionaţi. În special, anticorpii furnizaţi aici permit creşterea raportului menţionat de aproximativ 10% sau mai mult. În special, creşterea raportului dintre Treg şi Teff este de aproximativ 20%.

În special, anticorpii citotoxici prezintă citotoxicitate celulară dependentă de anticorpi (ADCC). Alternativ, anticorpii furnizaţi aici nu au proprietăţi ADCC. Potenţialul ADCC al anticorpilor poate fi considerat pozitiv atunci când citoxicitatea specifică este de exemplu superioară la 10%. Proprietăţile ADCC pot fi evaluate într-un test ADCC, cum ar fi testul descris în Exemplul 10 din WO2015/189302. Când anticorpul este un anticorp de şobolan, celulele efectoare utilizate în testul ADCC sunt, de preferinţă, celule LAK (killer activate de limfokine) de şobolan. Când anticorpii sunt umanizaţi, testul ADCC poate fi efectuat în special pe celulele NK umane.

Anticorpii conform invenţiei care au atât proprietăţi citotoxice, cât şi antagoniste pentru celulele CD127 pozitive permit efectele cumulative ale acestor proprietăţi cu privire la epuizarea celulelor T efectoare, în special a celulelor T cu memorie, permiţând astfel o epuizare mai puternică (epuizarea grupului de celule CD127+) şi reducerea corespunzătoare a numărului de celule T ţintă.

Paragrafele de mai sus, precum şi Exemplele descriu modul de testare a caracteristicilor funcţionale relevante dorite ale anticorpilor furnizaţi aici. Următoarele secţiuni vor detalia diverse caracteristici structurale şi posibile modificări ale anticorpilor. În lumina acestor îndrumări, persoana calificată va putea obţine anticorpi având caracteristicile structurale de mai jos împreună cu caracteristicile funcţionale dorite, în special pornind de la anticorpul N13B2-hVL6 care are caracteristicile funcţionale dorite.

Când anticorpii sunt destinaţi administrării la subiecţi umani, este de dorit ca aceştia să prezinte o omologie cât mai puternică cu anticorpii umani, aşa cum ştie persoana de specialitate. Gradul de identitate cu un anticorp uman este măsurat ca % din reziduurile umane din secvenţa anticorpului, în special în cadrul domeniului variabil al lanţului uşor sau greu al anticorpului, adică % din reziduurile din secvenţa anticorpului, în special în cadrul domeniului variabil al lanţului uşor sau greu al anticorpului, care sunt identice la aceeaşi poziţie funcţională cu reziduul din cel mai omolog anticorp uman cunoscut, în special cadrul celui mai omolog domeniu variabil al lanţului uşor sau greu cunoscut al anticorpului uman. Această caracteristică este exprimată în general aici, ca şi în literatură, ca „anticorp A (sau secvenţa cadru a domeniului său variabil) are xx % reziduuri umane", ceea ce înseamnă că anticorpul A (sau secvenţa cadru a domeniului său variabil) are xx % din reziduurile care sunt identice în aceeaşi poziţie funcţională cu reziduurile celui mai omolog anticorp uman cunoscut (sau secvenţa cadru a domeniului său variabil). Un astfel de grad de identitate poate fi măsurat prin mijloace cunoscute persoanei calificate şi în special cu instrumentul DomainGapAlign al Sistemului Internaţional de Imunogenetică Informaţională (IMGT), aşa cum a fost clarificat în timpul sesiunii deschise a OMS INN Expert Group (aprilie 2015) De preferinţă, anticorpii furnizaţi aici au mai mult de 80%, chiar mai preferabil cel puţin 84%, mai mult de 84% şi chiar mai preferabil, cel puţin 85% identitate cu un anticorp uman, în special aşa cum se determină folosind instrumentul DomainGapAlign. Acest grad de identitate poate fi determinat numai pentru domeniul variabil al lanţului uşor sau numai pentru lanţul uşor (prin comparaţie cu un domeniu variabil al lanţului uşor de anticorp uman sau lanţ uşor) sau pentru lanţul uşor şi lanţul greu luate împreună, prin comparaţia fiecărui lanţ cu cel mai omolog lanţ de anticorp uman corespunzător şi raportând procentul cumulat de identitate. În special, domeniul variabil al lanţului uşor al anticorpului sau lanţul uşor al anticorpului conform invenţiei cuprinde cel puţin 80%, mai ales 84% şi, chiar mai ales, cel puţin 85% din reziduurile umane. Domeniile variabile ale lanţului uşor de anticorp în special furnizate aici au respectiv 84,2% (SECV ID Nr: 9); 85,3% (SECV ID Nr: 10 şi SECV ID Nr: 11) şi 86,3% (SECV ID Nr: 12) reziduuri umane. Domeniul variabil al lanţului greu de anticorp preferat furnizat aici (SECV ID NR: 7) are 90,8% reziduuri umane.

Un domeniu variabil al lanţului uşor de anticorp furnizat aici poate cuprinde până la 135 aminoacizi, preferabil până la 120 aminoacizi şi, chiar mai preferabil, până la 110 sau 107 aminoacizi. Un domeniu variabil al lanţului uşor de anticorp furnizat aici poate cuprinde cel puţin 80, preferabil cel puţin 90 şi, chiar mai preferabil, cel puţin 100 sau 106 aminoacizi. Un domeniu variabil al lanţului uşor de anticorp furnizat aici poate cuprinde 80 la 135, preferabil 90 la 120 şi, chiar mai preferabil, 105 la 110 aminoacizi.

Un lanţ uşor de anticorp furnizat aici poate cuprinde până la 250 de aminoacizi, de preferinţă până la 230 de aminoacizi şi, chiar mai preferabil, până la 214 sau 211 aminoacizi. Un lanţ uşor de anticorp prevăzut aici poate cuprinde cel puţin 150, preferabil cel puţin 190 şi, chiar mai preferabil, cel puţin 200 sau 210 aminoacizi. Un lanţ uşor de anticorp furnizat aici poate cuprinde 150 până la 250, preferabil 190 până la 230 şi, chiar mai preferabil, 210 până la 220 aminoacizi.

Aici sunt furnizate polipeptide care sunt (i) fragmente care leagă antigenul anticorpilor furnizaţi aici, în special fragmente care leagă antigenul constând sau, care cuprind un fragment al lanţurilor uşoare ale anticorpului sau ale regiunilor variabile ale lanţului uşor al anticorpului furnizate aici, un domeniu variabil al lanţului greu al anticorpului furnizat aici şi / sau (ii) molecule mimetice ale anticorpilor furnizaţi aici.

Un fragment care leagă antigenul este o polipeptidă care se leagă în mod specific de proteina CD 127 aşa cum este definită mai sus în secţiunea relevantă (paragrafele [44] până la [47]) şi cuprinde cel puţin cele trei CDR-uri ale N13B2-h3 (constând din secvenţele cu SECV ID Nr: 4 până la 6), de preferinţă un fragment din domeniile variabile ale lanţului uşor furnizate aici (cu SECV ID Nr: 9 până la 12) cuprinzând secvenţele CDR menţionate. Un fragment care leagă antigenul poate cuprinde cel puţin 40, preferabil cel puţin 50 şi, chiar mai preferabil, cel puţin 70 sau 74 de aminoacizi. Un fragment de legare a anticorpilor poate cuprinde cel mult 100, preferabil cel mult 90 şi, chiar mai preferabil, cel mult 80 sau 74 de aminoacizi. Un fragment care leagă antigenul poate cuprinde 40 până la 100, 50 până la 90 şi, preferabil, 60 până la 100 şi, chiar mai preferabil, 50 până la 70 sau 60 până la 80 aminoacizi. Un fragment de legare a antigenului, astfel cum este prevăzut aici, poate avea în special oricare dintre caracteristicile funcţionale adecvate dezvăluite în ceea ce priveşte anticorpii furnizaţi aici, în special caracteristicile dezvăluite la punctele [47] până la [62].

În consecinţă, o polipeptidă izolată furnizată aici poate consta dintr-o secvenţă de până la 250 de aminoacizi, în special până la 217, până la 214, până la 211, mai ales până la 200, până la 175, până la la 150, până la 135, până la 120, până la 107 şi chiar mai ales de până la 100, până la 90, până la 80, până la 74, până la 70, până la 60 aminoacizi.

O moleculă mimetică a anticorpului este o polipeptidă cu proprietăţi similare cu un anticorp, în special cu proprietăţi de legare similare cu CD127. Mimeticele anticorpilor pot fi, de exemplu, molecule de anticorp, afiline, afimeri, anticaline, monocorpi etc. O moleculă mimetică de anticorpi prevăzută aici poate avea în special oricare dintre caracteristicile funcţionale adecvate dezvăluite în ceea ce priveşte anticorpii furnizaţi aici, în special caracteristici dezvăluite la alineatele [47] - [62].

În special, anticorpul conform invenţiei este un anticorp umanizat, care cuprinde domenii constante derivate din domenii constante umane. În special, domeniul constant al lanţului uşor al anticorpului este derivat dintr-un domeniu constant al lanţului uşor kappa uman şi / sau domeniul constant al lanţului greu al anticorpului este derivat dintr-o regiune constantă a lanţului greu IgG1, IgG2, IgG3 sau IgG4 uman, în special din regiunea constantă a lanţului greu IgG4 uman. „Derivat din" înseamnă unele mutaţii punctuale prin substituţii de aminoacizi, cum ar fi IgG4 (S228P) sau IgG1 (E333A). Aceste mutaţii bine cunoscute de la specialiştii în domeniu modifică în general unele proprietăţi ale lanţului părinte. De exemplu, acestea duc la o imunogenitate mai mică în comparaţie cu anticorpul parental sau abrogă legarea de FcyReceptor sau evită dimerizarea anticorpului monomer sau stabilizează dimerizarea făcând anticorpii mai buni pentru utilizări terapeutice umane. Anticorpul invenţiei derivat din domeniul constant al lanţului greu şi uşor parental cuprinde sau constă din secvenţa stabilită în SECV ID Nr: 26, SECV ID Nr: 27 sau în SECV ID Nr: 28 sau respectiv un fragment al acestora. Mai particular, domeniul constant al lanţului uşor al anticorpului constând din secvenţa stabilită în SECV ID Nr: 27. În special, domeniul constant al lanţului greu al anticorpului cuprinde sau constă din secvenţa stabilită în SECV ID Nr: 26 sau un fragment al acestuia. Mai particular, domeniul constant al lanţului greu al anticorpului constă din secvenţa stabilită în SECV ID Nr: 26.

Aici sunt furnizate molecule de acid nucleic izolate care codifică o polipeptidă conform invenţiei sau un anticorp sau fragment de legare a antigenului acestuia furnizat aici. În special, moleculele de acid nucleic menţionate codifică domeniul variabil al lanţului uşor sau lanţul uşor al unui anticorp furnizat aici, în combinaţie cu molecule izolate de acid nucleic care codifică lanţul greu al unui anticorp furnizat aici, conform oricăreia dintre definiţiile furnizate aici. În special, aici este prevăzută o moleculă de acid nucleic izolată care codifică o polipeptidă cuprinzând sau constând dintr-o secvenţă selectată din grupul constând din SECV ID Nr: 9; SECV ID Nr: 10; SECV ID Nr: 11; SECV ID Nr: 12. În special, molecula de acid nucleic izolată conform invenţiei cuprinde sau constă dintr-o secvenţă selectată din grupul constând din SECV ID Nr: 15, SECV ID Nr: 16, SECV ID Nr: 17 sau SECV ID Nr: 18. În special, molecula de acid nucleic izolată menţionată este furnizată în combinaţie cu o moleculă de acid nucleic izolată care codifică un lanţ greu cuprinzând cele trei CDR-uri constând din secvenţele stabilite în SECV ID Nr: 1, SECV ID Nr: 2 şi SECV ID Nr: 3, şi codificarea unui domeniu variabil de lanţ greu constând din secvenţa stabilită în SECV ID Nr: 7, mai ales molecula de acid nucleic izolată constând din secvenţa prezentată în SECV ID Nr: 13. Într-o variantă preferată, se furnizează o combinaţie de molecule de acid nucleic care codifică un anticorp sau fragment de legare a antigenului acestuia, combinaţia menţionată cuprinzând sau constând dintr-o primă moleculă izolată de acid nucleic care cuprinde sau constă dintr-o secvenţă selectată din grupul constând din SECV ID Nr: 15, SECV ID Nr: 16 , SECV ID Nr: 17 şi SECV ID Nr: 18; şi o a doua moleculă de acid nucleic izolată care cuprinde sau constă din secvenţa SECV ID Nr: 13. Într-o altă variantă preferată, este furnizată o combinaţie de molecule de acid nucleic izolate care codifică un anticorp sau fragment de legare a antigenului acestora, combinaţia menţionată cuprinzând sau constând dintr-o primă moleculă de acid nucleic izolată cuprinzând sau constând din secvenţa SECV ID Nr: 18; şi o a doua moleculă de acid nucleic izolată cuprinzând sau constând din secvenţa SECV ID Nr: 13.

Aici sunt furnizate polinucleotide care codifică secvenţa polipeptidică a unui lanţ uşor complet, cuprinzând atât domeniul variabil, cât şi domeniul constant, adică în special polinucleotidele care codifică una dintre secvenţele SECV ID Nr: 9 la 12 şi secvenţa SECV ID Nr: 27 sau 28, în special polinucleotide care cuprind sau constau dintr-una din secvenţele SECV ID Nr: 15 până la 18 concatenate cu SECV ID Nr: 30 sau SECV ID Nr: 31. Astfel de polinucleotide sunt furnizate în special în combinaţie cu o polinucleotidă care codifică secvenţa polipeptidică a unui lanţ greu complet, cuprinzând atât domeniul variabil, cât şi domeniul constant, adică în special polinucleotidele care codifică SECV ID Nr: 7 şi secvenţa SECV ID Nr: 26, în polinucleotide particulare care conţin sau constau din SECV ID nr: 13 concatenată cu SECV ID nr: 29.

În special, moleculele de acid nucleic izolate furnizate aici pot cuprinde în mod avantajos, pe lângă o secvenţă care codifică un lanţ uşor şi opţional un lanţ greu al unui anticorp furnizat aici, în amonte de secvenţa care codifică lanţurile de anticorpi menţionate, o secvenţă care codifică o peptidă semnal care permite secreţia lanţurilor respective atunci când sunt exprimate într-o celulă de producţie. Ele pot cuprinde, de asemenea, una sau mai multe secvenţe care codifică una sau mai multe peptide marker (e) pentru detectarea şi / sau facilitarea purificării lanţurilor menţionate.

Aici este furnizat un vector pentru clonare şi / sau pentru exprimarea unei molecule de acid nucleic furnizate aici. În special, vectorul menţionat este o plasmidă adecvată pentru clonare şi / sau exprimare în celule de mamifere, care cuprinde secvenţe de reglare pentru transcriere şi exprimare. În consecinţă, aici este prevăzut un vector care cuprinde o polinucleotidă aşa cum este descris mai sus, în special o polinucleotidă aşa cum este dezvăluit în paragrafele [76] până la [78].

Mai mult, sunt furnizate aici celule sau linii celulare recombinate cu o moleculă de acid nucleic ca mai sus, în special un vector, în special o celulă sau linie celulară de mamifer sau aviar, în special aşa cum este detaliat în Figura 2. De exemplu, celulele ovariene de hamster chinezesc, modificate genetic pentru a reduce fucozilarea globală. Într-adevăr, anticorpii lipsiţi de fucosilare de bază arată o citotoxicitate mediată celular (ADCC) dependentă de anticorpi semnificativ îmbunătăţită (von Horsten şi colab., 2010). Un alt exemplu este linia celulară EB66 care are în mod natural proprietăţi scăzute de fucozilare (Olivier şi colab., 2010). Anticorpii pot fi produşi, de asemenea, în celule transfectate tranzitoriu cu o moleculă de acid nucleic ca mai sus, în special un vector, în special celule COS, în special aşa cum este detaliat în Exemplul 2.

Aici sunt asigurate metode pentru producerea unei polipeptide furnizate aici, în special un lanţ uşor de anticorp şi / sau un anticorp monoclonal, metodele menţionate cuprinzând etapa de exprimare a respectivei polipeptide, lanţ uşor de anticorp sau anticorp monoclonal (sau lanţul uşor şi opţional cel greu al unui anticorp monoclonal) în celule cuprinzând o moleculă de acid nucleic care codifică polipeptida menţionată, în condiţii care permit recuperarea polipeptidei menţionate, şi etapa de recuperare a polipeptidei menţionate. În special, anticorpii sau fragmentul lor sunt preparaţi în celule care prezintă proprietăţi scăzute de fucozilare, cum ar fi celule aviare EB66.

Aici este furnizată o compoziţie farmaceutică care cuprinde o polipeptidă (în special un domeniu variabil cu lanţ uşor de anticorp sau un lanţ uşor de anticorp) şi / sau un anticorp sau un fragment de legare la antigen sau o moleculă mimetică a anticorpului acestuia şi / sau o moleculă de acid nucleic izolată aşa cum este definită de mai sus şi un vehicul farmaceutic. Respectiva compoziţie farmaceutică poate cuprinde în mod opţional un ingredient activ diferit. Compoziţia menţionată este furnizată în special într-o formulare adecvată pentru administrare sistemică sau pentru administrare locală. În special, sunt furnizate aici compoziţii adecvate pentru administrare locală, în special pentru injecţie intramusculară sau subcutanată, pentru injectare utilizând un dispozitiv cum ar fi un autoinjector (sau stilou injector), pentru administrare transdermică, în special folosind un plasture transdermic, pentru administrare transmucozală, în special administrarea intranazală sau rectală. În special, sunt furnizate aici compoziţii adecvate pentru administrarea locală în tractul gastrointestinal (GI), în special prin administrare orală, în special pentru tratamentul bolilor intestinale, cum ar fi boala Crohn sau UC, în special compoziţii adecvate pentru administrarea în colon. În special, sunt furnizate aici compoziţii adecvate pentru administrare sistemică, în special pentru administrare parenterală sau enterală, în special pentru injecţie intravenoasă sau administrare orală. După cum ştie persoana calificată, administrarea enterică poate fi fie o administrare locală la nivelul tractului GI, fie o administrare sistemică. Ori de câte ori astfel de compoziţii farmaceutice sau utilizările lor sunt furnizate aici, trebuie înţeles că vehiculul de administrare şi utilizările lor pot fi asigurate, de exemplu atunci când o compoziţie farmaceutică injectabilă este furnizată în mod explicit, trebuie înţeles că respectiv compoziţia este furnizată ca atare, precum şi într-un dispozitiv sau în combinaţie cu un dispozitiv care permite administrarea şi / sau injecţia compoziţiei menţionate („dispozitiv de livrare»). Exemplele de dispozitive de livrare includ, dar nu se limitează la autoinjectoare, în special seringi multicamerale şi plasturi transdermici. În consecinţă, sunt furnizate aici un dispozitiv de livrare, în special un autoinjector, o pompă sau un plasture transdermic cuprinzând compoziţia menţionată, şi utilizările acestora, conform prevederilor de mai jos în legătură cu compoziţiile farmaceutice. De asemenea, sunt furnizate aici un kit care cuprinde o compoziţie farmaceutică şi un dispozitiv de administrare locală, în special un dispozitiv de administrare subcutanat, enteric sau oral, în special o seringă preumplută sau un dispozitiv fără ac, care conţine compoziţia menţionată şi / sau este adecvat pentru administrarea compoziţiei menţionate şi utilizările acesteia, după cum se prevede mai jos, în legătură cu compoziţiile farmaceutice. Compoziţia farmaceutică este furnizată sub orice formă adecvată pentru administrare, inclusiv ca soluţie, în special o soluţie apoasă sterilă, ca o suspensie, ca un solid, în special un solid liofilizat, în special pentru adsorbţia pe (sau adsorbit pe) un plasture şi / sau pentru resuspendare şi administrare ca soluţie, ca pilulă, tabletă sau altă formă solidă adecvată pentru administrare orală, în special cu eliberare întârziată sau prelungită, ca nanoparticule, de exemplu, o compoziţie cuprinzând nanoparticule cu polipeptidă adsorbită la suprafaţă, sau în interiorul nanoparticulelor menţionate, etc. Forma compoziţiei farmaceutice şi opţional natura dispozitivului de eliberare pot fi adecvate pentru livrarea ingredientului activ aşa cum este prevăzut aici sistemic sau local, adică poate fi adecvat pentru ca ingredientul activ să ajungă la celulele, ţesuturile, organele vizate într-o stare activă. În special, forma compoziţiei farmaceutice şi, opţional, natura dispozitivului de eliberare pot fi adecvate pentru livrarea în tractul GI, în special în colon. Se spune că respectiv compoziţia farmaceutică cuprinde un purtător acceptabil farmaceutic; cu toate acestea, compoziţiile farmaceutice sunt furnizate şi fără un purtător pentru utilizări şi scopuri similare, atunci când un astfel de purtător nu este necesar pentru uz farmaceutic, de exemplu dacă produsul este administrat ca un solid liofilizat pur. În special, administrarea se efectuează conform oricărui mijloc adecvat, aşa cum este descris aici pentru eliberare intenstinală, în special pentru eliberare intestinală întârziată.

Aici este prevăzută o compoziţie care cuprinde, ca ingredient activ, o polipeptidă (în special un domeniu variabil al lanţului uşor de anticorp sau lanţ uşor de anticorp) şi / sau un anticorp (în special anticorp monoclonal), fragment de legare la antigen sau moleculă mimetică a anticorpului acestuia aşa cum este definit mai sus, sau o compoziţie farmaceutică definită mai sus, într-o formulare adecvată pentru controlul supravieţuirii sau expansiunii celulelor CD127 pozitive umane, în special a celulelor efectoare CD127 pozitive umane, în special supravieţuirea sau expansiunea celulelor T cu memorie CD127+, în special celulele T cu memorie care sunt atât CD127+, cât şi CD8+, sau care sunt ambele celule CD127+ şi CD4+, atunci când sunt administrate unui pacient uman. În special, compoziţia menţionată cuprinzând anticorpul (sau alt agent ca mai sus) ca ingredient activ este într-o formulare adecvată pentru controlul diferenţierii şi / sau maturării celulelor dendritice atunci când este administrată unui pacient.

Inventatorii au arătat în mod surprinzător că o singură injecţie a anticorpului furnizat aici permite un efect susţinut, iar răspunsul inflamator este încă semnificativ redus la animalele tratate printr-o singură injecţie a anticorpilor furnizaţi până la 14 luni şi chiar până la 18 luni după injectarea singură menţionată. Administrarea, şi de preferinţă o singură administrare, a polipeptidei, în special a lanţului uşor de anticorp şi mai ales a anticorpului, a fragmentului de legare a antigenului sau a moleculei mimetice a anticorpului furnizate aici, are de preferinţă un efect rapid şi / sau de lungă durată asupra celulelor T cu memorie. Un efect rapid este observat de preferinţă în decurs de o săptămână, şi mai preferabil în decurs de 48 de ore, şi chiar mai preferabil, în decurs de o zi de la administrarea respectivei polipeptide, lanţ de anticorp sau anticorp. Un efect de lungă durată este observat, de preferinţă, cel puţin 12 luni şi, mai preferabil, cel puţin 14 luni după cea mai recentă (şi, de preferinţă, singura) administrare a polipeptidei, lanţului anticorpului sau anticorpului menţionat. Un astfel de efect este în special reversibil (în special răspunsul celulelor T poate fi restabilit prin noua vaccinare). Un astfel de efect este de preferinţă specific la antigen şi / sau răspuns şi, de preferinţă, nu este asociat cu limfodepleţie măsurabilă (adică numărul global de limfocite nu este redus la subiect, măsurat prin metode comune). Un astfel de efect poate fi altfel definit ca o ştergere clonală a celulelor T cu memorie sau ca o ştergere reversibilă specifică antigenului a memoriei T imune. Un efect al unei astfel de administrări asupra celulelor T cu memorie efectoare poate fi evaluat prin compararea nivelurilor de celule secretoare de IFN-γ (măsurate de exemplu prin ELISPOT) ca răspuns la un antigen, de exemplu tuberculină, la subiecţii vaccinaţi (în special la babuini) care au fost trataţi ulterior cu polipeptida, lanţul anticorpului sau anticorpul monoclonal furnizat aici, şi la subiecţii vaccinaţi netrataţi: se observă un efect dacă nivelul măsurat al celulelor T specifice antigenului este semnificativ mai mic (de preferinţă, mai mic cu cel puţin 10%, mai preferabil cu cel puţin 40%) la subiecţii trataţi, la momentul relevant după tratament. Un astfel de efect poate fi măsurat, de asemenea, prin evaluarea altfel a răspunsului inflamator la un antigen dat, de exemplu, o reacţie inflamatorie locală, în special dermică, ca răspuns la un antigen administrat local. Alternativ, se poate utiliza un test de tetramer MHC. Metodele de testare a unui astfel de efect sunt cunoscute persoanei calificate şi sunt ilustrate aici în special în Exemplul 6.

În plus, inventatorii au arătat în mod surprinzător că anticorpul furnizat aici poate avea un efect rapid, în special asupra activării celulelor T, în special asupra eliberării citokinelor de către celulele T, în special în ţesutul inflamator. Un astfel de efect este observat în special în decurs de o săptămână, şi de preferinţă în termen de 48 de ore şi, chiar mai preferabil, în decurs de 24 de ore de la administrarea anticorpului şi, în special, este observat ca o reducere a producţiei (sau eliberării) de IFNy. Un astfel de efect este observat în special local, adică la locul de administrare a anticorpului sau la locul de livrare. În special, anticorpul furnizat aici are un efect rapid, în special un efect local rapid, în special la eliberarea citokinelor de către celulele T, în special are un efect observat în 24 de ore de la administrare. Când anticorpul este administrat pentru administrare locală, dar nu direct la locul de livrare intenţionat, anticorpul poate avea un efect rapid ca mai sus la locul livrării, în aceleaşi perioade de timp de la livrare, mai degrabă decât de la administrare, care poate fi sau nu întârziat de la administrare, după cum ştie persoana calificată.

O compoziţie furnizată aici mai poate cuprinde un compus suplimentar având un efect imunomodulator terapeutic, în special asupra celulelor implicate în alergie sau autoimunitate. În scop ilustrativ, imunomodulatorii exemplari de interes sunt alţi anticorpi monoclonali care vizează celulele T, cum ar fi anticorpii anti-CD3, anti-ICOS sau anti-CD28 sau proteine recombinate sau anticorpi care vizează celule accesorii precum CTLA4Ig sau anticorpi anti-CD40.

Polipeptida, anticorpul, fragmentul de legare la antigen sau molecula mimetică a anticorpului acestuia, molecula izolată de acid nucleic, celula şi / sau compoziţia furnizată aici pot fi furnizate într-un produs combinat, care cuprinde produse suplimentare, în special un agent cu efect imunomodulator terapeutic ca mai sus, în special destinat administrării simultane, separat sau secvenţial. Aici este furnizat un produs combinat care cuprinde o polipeptidă (în special un domeniu variabil al lanţului uşor de anticorp sau lanţ uşor de anticorp) şi / sau un anticorp, fragment de legare la antigen sau moleculă mimetică a anticorpului acestuia şi / sau o moleculă izolată de acid nucleic, vector, celulă sau linie celulară şi / sau o compoziţie farmaceutică aşa cum este definită mai sus, şi care cuprinde în mod opţional:

• un agent cu efect imunomodulator terapeutic, în special destinat administrării în combinaţie, de exemplu, cu anticorpul furnizat aici, în special în care administrarea menţionată este fie simultană, fie separată în timp, şi / sau în care administrarea menţionată se face pe aceeaşi cale sau pe o cale diferită; şi / sau • un dispozitiv pentru administrarea produsului. O polipeptidă, în special un lanţ uşor de anticorp şi / sau un anticorp, în special un anticorp monoclonal şi / sau un fragment de legare la antigen sau o moleculă mimetică de anticorp şi / sau un acid nucleic, un vector, o celulă sau linie celulară şi / sau o compoziţie farmaceutică sau o compoziţie definită mai sus sunt prevăzute în special pentru utilizare la un pacient uman pentru tratarea patologiilor sau a stărilor patologice influenţate de răspunsurile imune, în special de răspunsurile celulelor T cu memorie. Astfel de afecţiuni sau patologii cuprind cele induse de respingerea transplantului, boli autoimune, boli alergice, boli respiratorii, infecţii virale cronice, boli inflamatorii cronice, în special boli inflamatorii cronice intestinale, limfom, leucemie sau alte boli canceroase, inclusiv cele care rezultă din tumori solide atunci când aceste patologiile sunt asociate cu celule CD 127 pozitive, precum şi cu calea de semnalizare IL-7, în special în cazul în care trebuie evitată o creştere a maturării celulelor dendritice. În consecinţă, inventatorii arată că utilizarea acestor agenţi poate fi avută în vedere pentru tratamentul anumitor tulburări alergice ale pielii, a bolii inflamatorii intestinale (IBD), în special a bolii Crohn (CD), sau a colitei ulcerative (UC), sau a sindromului Sjцgren primar, sau Lupusului eritematos sistemic, sau sclerozei sistemice, sau sclerozei multiple, sau diabetului de tip I, sau leucemiei limfoblastice acute (de exemplu T-ALL), sau limfomului Hodgkin, sau cancerului mamar asociat cu celule CD127 +, cancerului renal, cancerului vezical, cancerului pulmonar, cancerului pancreatic sau pentru tratamentul unui limfom cutanat cu celule T, cum ar fi limfomul Sezary, sau pentru tratamentul leucemiei limfoblastoidice acute cu mutaţie funcţională a căii IL-7-R / TSLP, sau pentru tratamentul respingerii transplantului, şi / sau a pacienţilor care au nevoie de transplant, şi / sau care urmează să fie supuşi transplantului, şi / sau care au fost supuşi transplantului. Tratamentul bolii inflamatorii intestinale (IBD), în special a bolii Crohn (CD) sau a colitei ulcerative (UC), sau a sindromului Sjögren primar sau a lupusului eritematos sistemic sau a sclerozei sistemice sau a sclerozei multiple sau a diabetului de tip I este avută în vedere în exemplele preferate de realizare. În special, invenţia se referă la polipeptida, sau la anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului, sau la molecula mimetică a anticorpului acestuia, sau la molecula izolată de acid nucleic sau la compoziţia farmaceutică conform invenţiei pentru utilizare ca medicament, mai ales pentru utilizare în prevenirea sau tratamentul respingerii transplantului de organe sau ţesuturi, sau a unei boli selectate din grupul format din boli autoimune, în special poliartrită reumatoidă, scleroză sistemică, scleroză multiplă, diabet de tip I, tiroidită autoimună, lupus eritematos sistemic, sindrom sjцgren primar şi boli inflamatorii, în special boala inflamatorie a intestinului (IBD), mai ales boala Crohn şi colita ulcerativă şi encefalomielita, şi bolile alergice, şi bolile canceroase şi bolile legate de transplant şi bolile respiratorii, de preferinţă prin administrare locală. Sunt furnizate utilizări ale polipeptidei, lanţului uşor al anticorpului sau anticorpul, fragmentul care leagă antigenul sau molecula mimetică a anticorpului acestuia în tratamentul afecţiunilor patologice care implică modificarea răspunsului imun la un pacient uman, care conduce la o stare tolerogenă dominantă sau, dimpotrivă, lipsa toleranţei în cazul în care ar fi necesar controlul nivelului răspunsului imun, precum şi distrugerea celulelor CD127 pozitive maligne. Prin „tratament" sau „tratament terapeutic» se înţelege că etapele de administrare efectuate au ca rezultat îmbunătăţirea stării clinice a unui animal sau a unui pacient uman care are nevoie de aceasta, care suferă de tulburări asociate cu calea IL-7, adică implicând activarea sau proliferarea de celule CD 127 pozitive. Un astfel de tratament vizează îmbunătăţirea stării clinice a pacientului animal sau uman, prin eliminarea sau ameliorarea simptomelor asociate cu tulburările asociate cu calea IL-7, adică implicând activarea sau proliferarea celulelor CD127 pozitive. De preferinţă, tratamentul oferit aici permite restabilirea sănătăţii. De preferinţă, tratamentul menţionat nu are efecte negative nedorite din cauza maturării crescute a celulelor imune, în special a celulelor dendritice. În anumite aspecte ale tratamentului pacienţilor, polipeptida, anticorpul, fragmentul care leagă antigenul, molecula mimetică a anticorpului, polinucleotida, celula sau linia celulară, sau compoziţia sunt furnizate, destinate şi / sau adecvate pentru utilizare pentru a epuiza celulele CD127 pozitive în timp ce se păstrează celulele CD127-negative. În anumite aspecte ale tratamentului pacienţilor, este furnizată utilizarea polipeptidei, anticorpului, fragmentului de legare a antigenului, moleculei mimetice a anticorpului, polinucleotidei, celulei sau liniei celulare, sau a compoziţiei, destinată şi / sau adecvată pentru a preveni diferenţierea şi / sau expansiunea şi / sau maturarea celulelor CD127-pozitive, în special diferenţierea, expansiunea sau maturizarea indusă de IL-7 şi / sau TSLP, având în acelaşi timp un efect redus sau deloc efect direct asupra celulelor CD 127-negative. În anumite aspecte ale tratamentului pacienţilor, este furnizată utilizarea polipeptidei, anticorpului, fragmentului de legare a antigenului, moleculei mimetice a anticorpului, polinucleotidei, celulei sau liniei celulare, sau a compoziţiei, destinată şi / sau adecvată pentru a elimina / neutraliza celulele T naive şi cu memorie prin interferenţa cu semnalizarea indusă de IL-7, păstrând în acelaşi timp celulele Treg. În anumite aspecte ale tratamentului pacienţilor, este furnizată utilizarea polipeptidei, anticorpului, fragmentului de legare a antigenului, moleculei mimetice a anticorpului, polinucleotidei, celulei sau liniei celulare, sau a compoziţiei, destinată şi / sau adecvată pentru a epuiza subpopulaţiile de limfocite, sau alte populaţii de celule care exprimă CD127 (inclusiv limfocite T şi B normale sau patologice, celule NK, celule dendritice şi alte tipuri de celule, inclusiv celule epiteliale) ca rezultat al acţiunii citotoxice a anticorpilor, posibil, dar nu exclusiv prin ADCC (Citotoxicitate celulară dependentă de anticorp) şi opţional prin CDC (Citotoxicitate dependentă de complement). De asemenea, aici este furnizată o polipeptidă, în special un lanţ uşor de anticorpi şi / sau un anticorp, fragment de legare la antigen, moleculă mimetică a anticorpului, polinucleotidă, celulă sau linie celulară, sau compoziţie definită mai sus, pentru utilizare ca ingredient activ într-o combinaţie sau regim terapeutic suplimentar la un pacient care are nevoie de aceasta. De asemenea, este prevăzută utilizarea unei polipeptide, în special a unui lanţ uşor de anticorp şi / sau a unui anticorp, fragment de legare la antigen, moleculă mimetică a anticorpului, polinucleotidă, celulă sau linie celulară, sau compoziţie definită mai sus ca ingredient terapeutic activ într-o combinaţie sau într-un regim terapeutic suplimentar la un pacient care are nevoie de aceasta. În aspectele de mai sus, utilizările avute în vedere sunt de asemenea aplicabile acizilor nucleici, vectorilor, celulelor, liniilor celulare, compoziţiilor şi compoziţiilor farmaceutice furnizate mai sus. Sunt furnizate mijloacele şi produsele menţionate mai sus şi / sau adecvate pentru utilizare în patologii precum cele induse de respingerea transplantului, boli autoimune, boli alergice, boli respiratorii, infecţii virale cronice, boli inflamatorii cronice, în special boli inflamatorii cronice intestinale, limfom, leucemie sau alte boli canceroase, inclusiv cele care rezultă din tumori solide atunci când aceste patologii sunt asociate cu celule CD127 pozitive, precum şi cu calea de semnalizare de IL-7, în special în cazul în care trebuie evitată o creştere a maturării celulelor dendritice. În consecinţă, mijloacele şi produsele menţionate sunt în special destinate şi / sau adecvate pentru tratamentul anumitor afecţiuni alergice ale pielii, a bolii inflamatorii intestinale (IBD), în special a bolii Crohn (CD), sau a colitei ulcerative (UC), sau a leucemiei limfoblastice acute (de exemplu, T -ALL), sau limfomului Hodgkin, sau cancerului de sân asociat cu celule CD127 +, cancerului renal, cancerului de vezică urinară, cancerului pulmonar, cancerului pancreatic sau pentru tratamentul unui limfom cutanat cu celule T, cum ar fi limfomul Sezary, sau pentru tratamentul leucemiei limfoblastoidice acute cu mutaţie de câştig de funcţie a căii IL-7-R / TSLP, sau pentru tratamentul respingerii transplantului, şi / sau a pacienţilor care au nevoie de transplant, şi / sau care urmează să fie supuşi transplantului, şi / sau care au fost supuşi transplantului. În special, sunt prevăzute aici utilizarea unei polipeptide, în special a unui lanţ uşor de anticorp şi / sau a unui anticorp, fragment de legare la antigen, moleculă mimetică a anticorpului, un acid nucleic, celulă, linie celulară sau compoziţie la un pacient uman pentru tratamentul de afecţiuni şi / sau patologii induse de respingerea transplantului, boli autoimune, boli alergice, boli respiratorii, infecţii virale cronice, boli inflamatorii cronice, în special boli inflamatorii cronice intestinale, limfom, leucemie sau alte boli canceroase, inclusiv cele care rezultă din tumori solide atunci când aceste patologiile sunt asociate cu celule CD127 pozitive, precum şi cu calea de semnalizare de IL7, în special în cazul în care trebuie evitată o creştere a maturizării celulelor dendritice. În consecinţă, produsele menţionate sunt în special pentru tratamentul anumitor afecţiuni alergice ale pielii, a bolii inflamatorii intestinale (IBD), în special a bolii Crohn (CD), sau a colitei ulcerative (UC), sau a leucemiei limfoblastice acute (de exemplu T-ALL), sau a limfomului Hodgkin, sau cancerului de sân asociat cu celule CD127+, cancerului renal, cancerului de vezică urinară, cancerului pulmonar, cancerului pancreatic sau pentru tratamentul unui limfom cutanat cu celule T, cum ar fi limfomul Sezary, sau pentru tratamentul leucemiei limfoblastoidice acute cu mutaţie de câştig de funcţie a căii IL7-R / TSLP, sau pentru tratamentul respingerii transplantului, şi / sau al pacienţilor care au nevoie de transplant, şi / sau care urmează să fie supuşi transplantului, şi / sau care au suferit transplantului, a unei boli autoimune, sau a unei boli alergice, sau pentru tratamentul leucemiei, cum ar fi leucemia limfoblastică acută sau pentru tratamentul limfomului, sau pentru tratamentul bolilor canceroase, sau pentru tratamentul unei infecţii virale cronice, sau pentru tratamentul boli inflamatorii, în special IBD, în special CD sau UC, sau pentru tratamentul bolilor respiratorii, sau pentru prevenirea şi / sau tratamentul simptomelor legate de transplant. În special, aici este prezentată o metodă de tratament care cuprinde administrarea unei polipeptide (în special un domeniu variabil al lanţului uşor de anticorp sau un lanţ uşor de anticorp) şi / sau un anticorp, fragment de legare la antigen, moleculă mimetică a anticorpului sau o moleculă izolată de acid nucleic, celulă şi / sau linie celulară sau o compoziţie şi / sau compoziţie farmaceutică definite mai sus la un pacient uman pentru tratamentul afecţiunilor şi / sau patologiilor induse de respingerea transplantului, de boli autoimune, boli alergice, boli respiratorii, infecţii virale cronice, boli inflamatorii cronice, în special boli inflamatorii intestinale cronice, limfom, leucemie sau alte boli canceroase, inclusiv cele care rezultă din tumori solide atunci când aceste patologii sunt asociate cu celule CD 127 pozitive, precum şi calea de semnalizare de IL-7, în special în cazul în care trebuie evitată creşterea maturării celulelor dendritice. În consecinţă, metodele menţionate sunt în special pentru tratamentul anumitor afecţiuni alergice ale pielii, a bolii inflamatorii intestinale (IBD), în special a bolii Crohn (CD), sau a colitei ulcerative (UC), sau a leucemiei limfoblastice acute (de exemplu T-ALL), sau a limfomului Hodgkin, sau cancerului de sân asociat cu celule CD127 +, cancerului renal, cancerului de vezică urinară, cancerului pulmonar, cancerului pancreatic sau pentru tratamentul unui limfom cutanat cu celule T, cum ar fi limfomul Sezary, sau pentru tratamentul leucemiei limfoblastoidice acute cu mutaţia de câştig a funcţiei a căii IL7-R / TSLP sau pentru tratamentul respingerii transplantului, şi / sau a pacienţilor care au nevoie de transplant, şi / sau care urmează să fie supuşi transplantului, şi / sau care au suferit transplantul, a unei boli autoimune sau a unei boli alergice, sau pentru tratamentul leucemiei, cum ar fi leucemia limfoblastică acutăi sau pentru tratamentul limfomului, sau pentru tratamentul bolilor canceroase, sau pentru tratamentul unei infecţii virale cronice, sau pentru tratamentul unei boli inflamatorii, în special IBD, în special CD sau UC, sau pentru tratamentul bolilor respiratorii, sau pentru prevenirea şi / sau tratamentul simptomelor legate de transplant. Inventatorii au arătat în plus că, la pacienţii cu UC, nivelurile de ARNm de IL7, CD127 şi / sau TSLPR permit prezicerea răspunsului la tratamentele imunosupresive convenţionale: respondenţii (adică pacienţii care prezintă o reducere marcată a simptomelor ca răspuns la tratament) au niveluri mai scăzute de IL- 7 şi CD127, şi niveluri mai ridicate de TLSPR decât cei care nu răspund. În consecinţă, sunt prevăzute aici metode in vivo de evaluare a probabilităţii de răspuns la tratamente imunosupresoare la pacienţi, în special la pacienţi umani cu colită ulcerativă (UC), cuprinzând măsurarea într-o probă obţinută de la pacientul menţionat a nivelului de ARNm sau proteină IL7, CD127 şi / sau TLSPR, şi concluzionând că probabilitatea de răspuns este crescută în comparaţie cu un grup de referinţă atunci când nivelul măsurat al IL7 şi / sau CD127 este mai mic decât nivelul mediu din grupul menţionat, şi / sau când nivelul măsurat al TSLPR este mai mare decât nivelul mediu din grupul menţionat. Metodele de efectuare a măsurătorilor necesare sunt cunoscute persoanei calificate şi pot implica utilizarea unui anticorp împotriva CD127, în special pentru măsurarea nivelurilor de exprimare a proteinelor din CD127. Polipeptida, în special lanţul uşor al anticorpului şi / sau anticorpul monoclonal furnizat mai sus este asigurat în special pentru utilizare în astfel de metode, şi astfel de metode sunt furnizate în special utilizând o astfel de polipeptidă, un lanţ uşor al anticorpului şi / sau anticorpul monoclonal. În special, aici este dezvăluită o metodă de selectare a unui compus din grupul constând dintr-un anticorp, un fragment de legare a antigenului acestuia şi o moleculă mimetică a anticorpului, metoda cuprinzând cel puţin una dintre următoarele etape:

i. testarea legării compusului la CD127, în special la CD127 uman, în special la o secvenţă de epitop din domeniul D1 şi / sau de la situsul 2b din domeniul D2 al lui CD127. O secvenţă de epitop din domeniul D1 şi / sau de la situsul 2b din domeniul D2 poate fi oricare dintre secvenţele de epitop descrise aici, în special aşa cum este dezvăluit în paragrafele [016], în special o secvenţă de epitop selectată din grupul format din SECV ID Nr: 32, SECV ID Nr: 33, SECV ID Nr: 34, SECV ID Nr: 35, SECV ID Nr: 36 sau SECV ID Nr: 96 şi, mai ales, SECV ID Nr: 34, SECV ID Nr: 35 şi SECV ID Nr: 96. Într-o variantă particulară a invenţiei, testul de legare poate cuprinde testarea legării compusului la o secvenţă de epitop selectată din grupul format din SECV ID Nr: 34, SECV ID Nr: 35 şi SECV ID Nr: 96, şi testarea legării compusului la o secvenţă de epitop selectată din grupul format din SECV ID Nr: 42 şi SECV ID Nr: 43. Capacitatea de legare a compusului poate fi testată prin oricare dintre metodele cunoscute în domeniu, în special metoda Blitz, cunoscută persoanei calificate şi ilustrată în special în Figura 3, Exemplul 3 şi Exemplul 4 din prezenta şi din p. 14, Figurile 3, 4 şi 6 şi legendele respective şi Exemplele 1, 2, 6, 7 din WO 2015/189302 şi / sau prin metoda Exemplului 10 descrisă aici; şi / sau

ii. testarea inhibării semnalizării de IL7-R indusă de IL-7, în special fosforilarea lui STAT5, în prezenţa compusului. Inhibarea indusă de IL7 în prezenţa compusului poate fi testată prin metoda dezvăluită în exemplul 8 şi / sau exemplul 11 de aici; şi / sau

iii. testarea activării fosfatidilinozitolului 3-kinazei în prezenţa compusului. Activarea fosfatidilinozitol 3-kinazei în prezenţa compusului poate fi testată conform metodei dezvăluite în exemplul 8 şi / sau exemplul 11 de aici; şi / sau

iv. testarea activării căii de semnalizare ERK în prezenţa compusului. Activarea căii de semnalizareERK în prezenţa compusului poate fi testată conform metodei dezvăluite în exemplul 8 şi / sau exemplul 11 de aici;

v. testarea capacităţii de legare a compusului la cel puţin o foaie beta a situsului 2b din domeniul D2 al lui CD 127, în special cel puţin la a treia foaie beta a situsului 2b, definită ca fiind nucleoacizii din SECV ID Nr: 34, şi / sau la cel puţin o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul SECV ID Nr: 35 şi SECV ID Nr: 96. Capacitatea de legare a compusului poate fi testată prin oricare dintre metodele cunoscute în domeniu, în special metoda Blitz, cunoscută persoanei calificate şi ilustrată în special în Figura 3, Exemplul 3 şi Exemplul 4 de aici şi în p. 14, Figurile 3, 4 şi 6 şi legendele respective, şi Exemplele 1, 2, 6, 7 din WO 2015/189302. şi / sau prin metoda Exemplului 10 dezvăluită aici.

Metoda mai poate cuprinde oricare dintre etapele opţionale următoare sau cel puţin una dintre etapele opţionale următoare:

vi. testarea legării lui CD127, în special a lui CD127 uman, la lanţul comun yc al receptorilor citokinici în prezenţa compusului. Legarea lui CD127 la lanţul comun de yc al receptorilor citokinici în prezenţa compusului poate fi evaluată în special prin metode de co-imunoprecipitare, bine cunoscute persoanei calificate pentru testarea interacţiunii proteinelor, şi ilustrate, de exemplu, în WO2015/189302 în Exemplul 21. În special, celulele pot fi incubate în prezenţa sau absenţa compusului testat, apoi solubilizate în condiţii care permit conservarea complexelor proteice, iar lizatul rezultat poate fi supus unei imunoprecipitări anti-CD 127 şi prezenţei de yc în complexul imunoprecipitat care conţine CD127 evaluat prin western blot folosind anticorpi anti-yc (invers, imunoprecipitarea poate fi efectuată folosind anticorpi anti-yc şi prezenţa de CD 127 evaluată folosind anticorpi anti-CD 127); şi / sau

vii. testarea internalizării CD127, în special a lui CD127 uman şi / sau a internalizării induse de IL7 a lui CD127 în prezenţa compusului. Internalizarea de CD127, definită aici în paragrafele [51] până la [53], poate fi definită şi / sau testată în continuare, aşa cum se prevede în WO2015/189302 în special în paragrafele [59] - [63] de la paginile 19-20 şi din Figura 16 şi Exemplul 5; şi / sau

viii. testarea maturării celulelor dendritice induse de TSLP în prezenţa compusului. Maturarea celulelor dentritice indusă de TSLP este definită în paragrafele [47] şi [48] de aici. Mijloacele de măsurare a unui astfel de efect sunt cunoscute persoanei calificate şi sunt dezvăluite în special în WO 2015/189302 la paginile 16-17 şi în Exemplul 9 al acestuia. În special, mijloacele de măsurare a unui astfel de efect cuprind măsurarea expresiei de CD40 între celulele stimulate cu compusul şi celulele stimulate numai cu TSLP (fără compus).

Într-un exemplu particular de realizare a metodei, este selectat compusul care se leagă în mod specific de CD127, în special CD127 uman, care este un antagonist al semnalizării de IL7-R indus de IL7, care nu induce activarea fosfatidilinozitol 3-kinazei şi / sau calea de semnalizare ERK. Într-o realizare mai particulară a metodei, este selectat compusul care se leagă în mod specific de CD127, în special CD127 uman, care este un antagonist al semnalizării de IL7-R indus de IL7 şi care nu induce activarea fosfatidilinozitol 3-kinazei şi nu induce activarea căii de semnalizare ERK.

În special, aici este prezentată o metodă pentru producerea unui anticorp sau a unui fragment de legare a antigenului acestuia din invenţie, care este crescut împotriva lui CD127, posibil crescut dintr-o imunizare a unui animal neuman, cum ar fi şobolanii LOU / C tulpina Igk1a disponibilă la universitatea Louvain, Belgia). Imunizarea poate fi efectuată folosind un fragment din secvenţa de aminoacizi din SECV ID Nr: 22, şi în special un fragment din SECV ID Nr: 22 care cuprinde o secvenţă de epitop aşa cum este definită aici, şi în special SECV ID Nr: 35 şi / sau SECV ID Nr: 96, ca imunogen. Hibridomul poate fi obţinut prin fuzionarea celulelor mononucleare de splină cu imunocitomul de şobolan LOU IR983F. Hibridomul poate fi examinat în funcţie de capacitatea anticorpilor monoclonali secretaţi de a se lega de o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul format din SECV ID Nr: 22, SECV ID Nr: 35 şi SECV ID Nr: 96, în special SECV ID Nr: 35 şi / sau SECV ID Nr: 96. Prin urmare, invenţia cuprinde şi un compus imunogen, respectivul compus imunogen fiind un fragment din secvenţa de aminoacizi din SECV ID Nr: 22, în special un fragment cuprinzând cel puţin o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul SECV ID Nr: 32, SECV ID Nr: 33, SECV ID Nr: 34, SECV ID Nr: 35 şi SECV ID Nr: 96, în special SECV Nr: 34, SECV ID Nr: 35 şi SECV ID Nr: 96, mai ales SECV ID Nr: 96. Într-o variantă particulară a invenţiei, compusul imunogen este o peptidă liniară, în special o peptidă liniară care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID Nr: 96, mai ales o peptidă liniară. cuprinzând sau constând din, preferabil constând din, secvenţa de aminoacizi din SECV ID Nr: 35.

Scurtă descriere a desenelor

Figura 1. Secvenţe de aminoacizi ale anticorpilor furnizaţi aici

Panoul A. Secvenţa lanţului greu (VH). CDR-urile sunt în caractere aldine.

Panoul B. Secvenţa lanţurilor uşoare umanizate (LH) derivate din N13B2. CDR-urile sunt în caractere aldine. N13B2-VL3 cuprinde reziduuri originale ale cadrului de N13B2-h3 în poziţiile 48 şi 87 (subliniat); N13B2-VL4-V48L şi N13B2-VL5-F87Y cuprind reziduul cadru umanizat corespunzător şi N13B2-VL6-V48L-F87Y cuprinde ambele reziduuri cadru umanizate.

Figura 2. Producerea de anticorpi - transfecţie stabilă Au fost efectuate trei loturi de producţie diferite pentru fiecare dintre anticorpii menţionaţi în celulele CHO-M în conformitate cu metode comune, utilizând medii fără ser disponibile în comerţ, iar titrurile obţinute în experimentele tipice, măsurate printr-un test ELISA, sunt raportate aici. Axa orizontală reprezintă timpul de cultură, în zile, în timp ce axa verticală reprezintă titrurile de anticorpi obţinute, în µg / ml. Figura 3. Legarea la CD127 Legarea anticorpilor indicaţi de CD127 recombinant a fost testată prin ELISA conform metodei detaliate în Exemplul 3. Axa orizontală reprezintă concentraţia anticorpului în ng / ml, iar axa verticală reprezintă densitatea optică la 450 nm, în unităţi arbitrare. Figura 4. Inhibarea fosforilării STAT5 Inhibarea fosforilării STAT5 de către anticorpii indicaţi a fost testată prin citofluorometrie conform metodei detaliate în Exemplul 5. Procentul de celule CD3+ colorate cu anticorpi pSTAT5 este raportat în panoul A (axa orizontală: concentraţia anticorpului în ng / ml) şi media de intensitate a fluorescenţei (în unităţi arbitrare) a semnalului pSTAT5 pentru celulele CD3+ este raportată în panoul B.

Figura 5. Efect asupra celulelor T cu memorie

Panoul A. Răspuns DTH (zona sub curbă a curbelor eritemului) la babuin după injecţia cu N13B2. Hipersensibilitatea de tip întârziat ca răspuns la o provocare de tuberculină a fost testată la babuini vaccinaţi, după administrarea de N13B2 (n = 7 babuini) sau excipient (n = 4 babuini), prin măsurarea reacţiei dermice conform metodei detaliate în Exemplul 6. Axa verticală reprezintă aria sub curba eritemului, în unităţi arbitrare. Valorile sunt raportate pentru reacţiile intradermice efectuate la momentele date, indicate în zile pe axa orizontală, înainte sau după administrarea de N13B2 sau excipient (administrat în ziua 0). „Post-BCG» corespunde rezultatelor reacţiei cutanate efectuate după o nouă vaccinare cu BCG (nd = nedeterminată).\tab Controlul excipientului nu a fost determinat în zilele 150 şi 180 şi „post-BCG» (nd). Panoul B. Răspuns DTH (zona de sub curbă a curbei eritemului) la babuin după injecţia umanizată cu N13B2. Hipersensibilitatea de tip întârziat ca răspuns la provocarea tuberculinei a fost testată la babuini vaccinaţi, după administrarea de N13B2 umanizat (AA892BB, 32257, V915GQ, 33874) sau tampon, prin măsurarea reacţiei dermice conform metodei detaliate în Exemplul 6. Axa verticală reprezintă zona sub curba eritemului, în unităţi arbitrare. Valorile sunt raportate pentru reacţiile intradermice efectuate înainte de administrarea de N13B2 umanizat sau tampon („IDR1", prima bară din stânga pentru fiecare babuin), la 4 ore după administrarea de N13B2 umanizat sau tampon („IDR2", a doua bară din stânga), la una , două şi trei luni („IDR3-5", a treia până la a cincea bară de la stânga) şi patru luni („IDR6", a şasea bară de la stânga, numai pentru V915GA) după administrarea de N13B2 sau tampon umanizat şi după o nouă vaccinare cu BCG („IDR7», ultima bară din stânga). Panoul C. IFNγ ELISPOT efectuat pe PBMC din sânge la babuinul vaccinat cu BCG provocat cu tuberculină şi tratat cu N13B2 umanizat.\tab Frecvenţa celulelor T specifice AG după provocarea cu tuberculină a fost testată la babuini vaccinaţi după administrarea de N13B2 (AA892BB, 32257, V915GQ, 33874) sau tampon umanizat, prin testul IFNγ ELISPOT conform metodei detaliate în Exemplul 6. Axa verticală reprezintă frecvenţa spotului pentru 100.000 de celule. Valorile sunt raportate pentru Elispot fără antigen (fără Ag, bare din stânga) sau cu antigen tuberculinic (bare din dreapta) efectuate înainte de administrarea de N13B2 umanizat sau tampon (prima bară din stânga pentru fiecare grup de bare), la 4 zile după administrarea de N13B2 umanizat sau tampon („IDR2"), la una, două şi trei luni („IDR3-5") şi patru luni („IDR6", numai pentru V915GA) după administrarea de N13B2 umanizat sau tampon şi după o nouă vaccinare cu BCG (ultima bară din stânga, punctată). Figura 6. Exprimarea de IL-7, CD127 şi TSLP la pacienţii cu IBD Nivelurile de expresie ARNm ale IL-7, CD127 (formă solubilă de IL-7Rα) şi TSLP (lungime completă) au fost măsurate conform metodei detaliate în Exemplul 7 în probe de ţesut de la subiecţi martori sănătoşi (martor non-IBD), sănătoşi şi cu probe de biopsie de colon bolnav (inflamat) de la pacienţi cu colită ulcerativă activă (UC) care nu au răspuns (sau nu au mai răspuns) la tratamentul antiinflamator şi în probe de la pacienţi cu UC cu boală în repaus - adică au fost vindecaţi sau erau în remisie la momentul prelevării (Răspunsuri). Axa verticală reprezintă unităţi relative de fluorescenţă. Valoarea este reprezentată grafic pentru fiecare eşantion dintr-un grup dat, bara orizontală reprezentând valorile medii pentru grup şi barele de eroare reprezintă abaterea standard. "*" denotă o valoare p <0,05; "**" o valoare p <0,01; „****» o valoare p <0,0001. Figura 7. Inhibarea căilor de semnalizare CD127 Efectul diferiţilor anticorpi CD127 anti-umani asupra activării căilor de semnalizare a fost evaluat prin Western Blot aşa cum este detaliat în Exemplul 8. Figura reprezintă rezultate reprezentative de la 6 donatori diferiţi. „Fără IL-7" corespunde unei probe care nu a fost stimulată de IL-7. „C" corespunde unei probe martor, stimulată cu IL-7 în absenţa anticorpului anti-CD 127. Liniile orizontale la stânga petei reprezintă migrarea markerului de greutate moleculară indicat. Săgeţile din dreapta petei indică migrarea de STAT5 fosforilat cu tirozină, PI3-k p55 tirosină 199-fosforilată, Akt fosforilat, ERK 1/2 fosforilat şi, ca referinţă de încărcare, GAPDH. Figura 8. Suprimarea eliberării de citokine a celulelor T din biopsiile de UC Panoul A. Producţia de IFNγ prin probe de biopsie UC crescute ex-vivo. Panoul B. Producţia de IFNγ prin probe de biopsie CD crescute ex-vivo.\tab În ambele panouri, probele au fost obţinute şi tratate conform detaliilor din Exemplul 9. Fiecare simbol reprezintă o probă de la un pacient, cultivat cu IgG („Ctrl Ab") sau cu anticorp anti-CD127 („aIL-7Rα"). Simbolurile conectate sunt probe asociate de la acelaşi pacient. ** p <0,01 cu testul perechilor potrivite a lui Wilcoxon. Producţia de IFNγ a fost semnificativ inhibată de mAb anti-IL7Rα. Rezultate similare au fost observate pentru probele de biopsie de CD.\tab Figura 9. mAb-uri de IL-7Rα anti-uman şi semnale agoniste Efectul diferiţilor anticorpi CD127 anti-umani asupra activării căilor de semnalizare STAT5, PI3K şi ERK a fost evaluat prin Western Blot aşa cum este detaliat în Exemplul 11. Figura 9A arată de la una din şapte celule donatoare diferite în absenţa lui IL7 exogen recombinant uman. Panoul A. „mediu» corespunde unei probe fără anticorp CD127 anti-uman. „Fără IL7" înseamnă că cele patru probe nu au fost stimulate cu IL-7. Trei probe au fost pretratate cu 10 µg / ml dintr-un mAb anti IL-7Rα (N13B2-hVL6 sau MD707-13-G4 sau 1A11-G1).\tab

Panoul B. Cuantificarea de pI3K şi pERK corectate la expresia GAPDH şi normalizate la condiţii de control a mediului (n = 7 donatori diferiţi). Axa verticală reprezintă expresia normalizată la control. Valoarea este reprezentată grafic pentru fiecare eşantion dintr-un singur grup, bara orizontală reprezentând valoarea medie pentru grup şi barele de eroare reprezentând abaterea standard.

Figura 10. Efectul mAb-urilor anti-IL7-Rα asupra activării căii IL7 Cuantificarea semnalului fosfo-STAT5 a fost corectată la expresia GADPH şi normalizată la condiţii de control a mediului. PBMC-urile au fost pretratate cu 10 µg / ml dintr-un mAb anti-IL7-Rα (N13B2-hVL6 sau MD707-13-G4 sau 1A11) şi apoi incubate timp de 10 minute la 37 ° C cu 5ng / ml IL7 uman. Cuantificările semnalului fosfo-STAT5 au fost corectate la expresia GAPDH (n = 7 donatori diferiţi). Linia punctată reprezintă starea cu mediu singur, fără tratament. Valoarea este reprezentată grafic pentru fiecare eşantion dintr-un singur grup, bara orizontală reprezentând valoarea medie pentru grup şi barele de eroare reprezentând abaterea standard. "*" denotă o valoare p <0,05 între grupurile indicate.

Figura 11. MAb-uri anti-IL7-Rα duale agonist / antagonist induc modificări transcripţionale Analiza secvenţelor ARN ale PBMC-urilor umane (n = 7) incubate timp de 3,5 ore (1) cu 5ng / ml IL7 uman, (2) fără IL7, (3,4,5) cu 5ng / ml IL7 uman şi diferite mAb-uri anti- IL7-Rα umane ((3): 10 µg / ml N13B2-hVL6; (4): 10 µg / ml MD707-13-Ig4; (5): 10 µg / ml 1A11).

Panou A. Harta termică a expresiei celor 93 de gene exprimate în mod diferenţial (False Discovery Rate/ Rata de descoperire falsă (FDR) 5%, n-ori schimbare (FD)> 2) între stimularea cu IL7 şi condiţiile de control.

Panoul B. Cuantificarea profilului median al celor trei clustere induse de IL7 în condiţii stimulate, de control şi IL7, şi mAb-uri IL7-Rα anti-umane.

Panoul C. Diagrama Venn a analizei secvenţelor de ARN a PBMC--urilor umane (n = 7) incubate fără IL-7 timp de 3,5 ore cu diferite mAb-uri anti-umane IL-7Rα (10 µg / ml de N13B2-hVL6, 10 µg / mL MD707-13-Ig4 # 1, sau 10 µg / ml 1A11). Diagrama Venn a celor 481 de gene exprimate diferenţial (FDR 5%, FC> 1,5) comparând mAb-urile IL-7Rα anti-umane şi condiţiile de control a mediului. Dimensiunea cercului este proporţională cu numărul de gene pentru fiecare categorie.

Exemple

Exemplul 1. Umanizarea lanţurilor uşoare

Următorul lanţ greu a fost utilizat în toate experimentele raportate aici, cu excepţia cazului în care s-a prevăzut altfel, N13B2 umanizat_VH, secvenţă de nucleotide (SECV ID Nr: 13):\tab N13B2 umanizat_VH, secvenţă de aminoacizi (SECV ID Nr: 7): vezi Figura 1A.

Următoarele secvenţe de nucleotide optimizate au fost utilizate pentru producerea lanţurilor uşoare de anticorpi (ale căror secvenţe de aminoacizi sunt furnizate în Figura 1B):

N13B2-h3 (SECV ID Nr: 14): N13B2hVL3 (SECV ID Nr: 15): N13B2hVL4 (SECV ID Nr: 16): N13B2hVL5 (SECV ID Nr: 17): N13B2hVL6 (SECV ID Nr: 18):

Fiecare secvenţă VL a fost obţinută prin sinteza genei, inserată într-un vector de clonare (pUC57) cu extremităţile BsiWI 5' şi 3' şi adăugarea unei secvenţe Kozak (GCCACC) înainte de ATG. Ca vector de expresie, a fost utilizată plasmida de expresie pFuseCLIg-hk (Invivogen), conţinând domeniul constant CLkappa al IgG1 uman.

Fiecare plasmidă de clonare (VL-pUC57-Genscript) a fost digerată de enzima de restricţie BsiWI pentru a extrage inserţia VL (400 bp). Inserţia purificată a fost ligată în plasmida de expresie pFuseCLIg-hk linearizată prin digestie BsiWI şi defosforilată. Clonele pozitive, care au fragmente VL inserate în orientarea corectă înaintea domeniilor constante umane, au fost amplificate şi purificate prin Midiprep-fără endotoxină (Macherey-Nagel) pentru etapa de transfecţie. Lanţul greu a fost clonat într-o manieră similară, domeniul constant constând în SECV ID NR: 26.

Exemplul 2. Producerea de lanţuri uşoare umanizate

Pentru anticorpii anti-CD 127 umanizaţi testaţi, transfecţia şi selecţia clonelor stabile au fost făcute conform metodelor convenţionale. Au fost preparaţi şi testaţi trei supernatanţi pentru fiecare anticorp care corespund unui raport diferit de transfecţie a lanţului greu (HC) şi lanţurilor uşoare (LC): 2: 1, 1: 1.3 şi 1: 2 HC: LC. Titrurile obţinute sunt raportate în Figura 2, obţinute în urma producţiei în celule CHO însămânţate la 300 000 celule / ml; fără antibiotice, în conformitate cu metodele convenţionale: titrul a fost testat de ELISA pe IgG anti-uman imobilizat (Fc) al anticorpului corespunzător şi revelaţia a fost efectuată cu un mAb kappa anti-uman de şoarece plus anticorpi anti-şoarece marcaţi cu peroxidază prin colorimetrie la 450nm folosind substrat TMB.

Producţia de N13B2-h3 şi N13B2-hVL6 a fost testată, de asemenea, în experimente de transfecţie tranzitorie. Cu o zi înainte de transfecţie, celulele COS au fost însămânţate la 100 000 de celule / godeu în placa P12 cu mediu completat (DMEM SVF10% (Hiclon) + PS 1% + Glu 1%) şi incubate la 37 ° C, 5% CO2. În ziua transfecţiei, celulele COS au fost utilizate la o confluenţă de 50 până la 90%. Au fost spălate cu PBS şi păstrate cu 500 µl în mediu complet. 0,6 µg variantă VH + 0,4 µg variantă VL au fost amestecate în 200 µl mediu OptiMEM şi s-a adăugat 1 µl de reactiv Plus (Invitrogen) (incubaţie 15 minute la temperatura camerei). S-au adăugat 3,5 µl lipofectamină LTX (Invitrogen) + 100 µl în amestec şi s-au incubat 25 minute la temperatura camerei. Întregul amestec a fost depus picătură cu picătură pe celulele COS şi s-a incubat 48 ore la 37%, 5% CO2. După 48 de ore, supernatanţii au fost recoltaţi şi centrifugaţi (1500 rpm 10min 4 ° C). Supernatanţii au fost cuantificaţi cu ELISA Nr: TH-MO-43. Testul de activitate a fost realizat cu ELISA TH-MO-44.

Exemplul 3. Legarea la CD127 - Elisa

Pentru sandwich-ul ELISA, anticorpul anti-IgG de măgar (specific Fc) a fost acoperit la 1,2 µg / ml pe placa P96 şi s-au adăugat anticorpi purificaţi pentru a măsura concentraţia în funcţie de gama standard. După incubare şi spălare, s-au adăugat anticorpi de şoarece, specifici pentru kappa, (Effimune, clonă NaM76-5F3) plus anticorpi anti-şoarece umani-măgar marcat cu peroxidază (Jackson Immunoresearch, referinţă 715-036-151), şi s-au relevat prin metode convenţionale .

Pentru testul ELISA de activitate, hCD127 recombinant (Sino Biologicals, Beijing, China; referinţă 10975-H08H) a fost imobilizat pe plastic la 1 µg / ml şi s-au adăugat diluţii de anticorp anti-CD 127 pentru a măsura legarea. După incubare şi spălare, s-au adăugat anticorpi de şoarece anti-umani lanţul uşor (specific kappa) plus anticorpi anti-şoarece măgar marcaţi cu peroxidază şi dezvăluiţi prin colorimetrie la 450 nm folosind substrat TMB prin metode convenţionale.

Au fost obţinute următoarele valori ED50 (concentraţia necesară pentru a atinge 50% din semnalul maxim):

Tabelul 1. Valoarea ED50 (în ng/ml) pentru legarea la CD127 a anticorpilor

ED50 (ng / ml) N13B2-h3 16,8 N13B2-hVL3 15,1 N13B2-hVL4 12,6 N13B2-hVL5 14,8 N13B2-hVL6 9,5

Stabilitatea anticorpilor a fost studiată prin incubarea anticorpilor timp de 7, 14 sau 30 de zile la 4 ° C, 25 ° C şi 42 ° C. Legarea anticorpilor de CD127 a fost încă excelentă chiar şi după 30 de zile de incubaţie. Valorile ED50 determinate prin ELISA după 30 de zile de incubaţie sunt raportate în tabelul 2.

Masa 2. Valoarea ED50 (în ng/ml) pentru legarea la CD127 a anticorpilor, după 30 de zile de incubaţie la temperatura indicată.

ED50 (ng / ml) N13B2-hVL6 d7 la 4 ° C 55,31 N13B2-hVL6 d7 la 25 ° C 47,83 N13B2-hVL6 d7 la 42 ° C 56,16 N13B2-hVL6 d14 la 4 ° C 62,75 N13B2-hVL6 d14 la 25 ° C 52,58 N13B2-hVL6 d14 la 42 ° C 40,62 N13B2-hVL6 d30 la 4 ° C 46,98 N13B2-hVL6 d30 la 25 ° C 40,19 N13B2-hVL6 d30 la 42 ° C 58,69

Exemplul 4. Legarea la CD127 - Blitz

Această metodă a fost efectuată cu un Blitz (Forte Bio, C22-2 Nr: 61010-1).

hCD127 recombinant (Sino Biologicals, Beijing, China; referinţă 10975-H08H) / proteină recombinantă (Sino Biological Cat: 11612-H08H) a fost imobilizată la 50 µg / ml prin fragment Fc în biosenzor Fc (AHC) lgG anti-uman (Forte Bio, 18-5063) timp de 30 de secunde. Apoi, anticorpii anti-CD 127 au fost adăugaţi la 20 µg / ml (concentraţie de saturaţie) pentru o perioadă de asociere de 120 de secunde, urmată de o perioadă de disociere a anticorpului anti-CD 127 în tampon cinetic timp de 120 de secunde. Analiza datelor a fost făcută cu software-ul Blitz pro 1.2, care a calculat constanta de asociere (ka) şi constanta de disociere (kd) şi a determinat constanta de afinitate KD (ka / kd). Rezultatele sunt raportate în Tabelul 3.

Tabelul 3. Analiza afinităţii prin Blitz a anticorpilor anti-CD127 asupra proteinei recombinante CD127 umane

Asociere (ka) (1 / Ms) Disociere (kd) (1 / s) Afinitate (KD) (M) N13B2-h3 1,15e6 2,67e-3 2,33e-9 N13B2-hVL3 1,27e6 4,47e-3 3,51e-9 N13B2-hVL4 1,04e6 2,81e-3 2,71e-9 N13B2-hVL5 1,01e6 2,66e-3 2,63e-9 N13B2-hVL6 1,05e6 2,66e-3 2,53e-9

Exemplul 5. Inhibarea fosforilării STAT5

Pentru a testa inhibarea de IL7R în testul funcţional, anticorpul a fost incubat cu PBMC uman timp de 30 min la 37 ° C, înainte de stimularea cu IL7 (AbD Serotec, ref PHP046) la 0,1ng / ml timp de 15 min la 37 ° C. Reacţia a fost oprită la 4 ° C şi spălată cu tampon Perm Wash înainte de fixare cu kitul Cytofix / Cytoperm (BD Bioscience, ref 554722) timp de 15 min. la 4 ° C. Celulele au fost spălate şi colorate cu anti-CD3 marcat cu FITC (BD Bioscience, ref 557694) timp de 30 minute la 4 ° C. Apoi, celulele au fost permeabilizate în incubarea Perm Buffer III (BD Bioscience, ref 558050) timp de 30 minute la 4 ° C. După spălare cu PBS BSA1% Azide 0,1%, celule au fost colorate cu anticorp anti-pStat5 marcat Alexa-647 (BD Bioscience, ref 612599) timp de 30 minute la temperatura camerei. Probele au fost analizate pe citofluorometru BD CantoII. hPBMC-CD3 + cu fosforilarea indusă de IL7 a lui pStat5, în timp ce, fără IL7, nu avem fosforilare. Rezultatele sunt raportate în Figura 4 şi în tabelul de mai jos, afişând ED50, adică concentraţia anticorpului indicat pentru a ajunge la 50% din semnal în acest test.

Tabelul 4. Inhibarea fosforilării de STAT5 de către anticorpii anti-CD127

IC50-MFI (ng / ml) N13B2-h3 21,5 N13B2-hVL3 27,2 N13B2-hVL4 16,1 N13B2-hVL5 27,3 N13B2-hVL6 16,8

Acest experiment a confirmat că modificarea liniei germinale şi modificarea reziduurilor structurale prin aminoacid umanizat nu a modificat activitatea biologică a anticorpului anti-CD 127. Toate variantele testate (N13B2-h3, N13B2-hVL3, N13B2-hVL4, N13B2-hVL5, N13B2-hVL6) ar putea inhiba fosforilarea de Stat5 după stimularea de IL7 pe hPBMC, la fel ca loturile de referinţă produse anterior de N13B2. Concentrându-ne pe N13B2-hVL6 (cel mai umanizat şi cel mai optimizat), s-a observat că a fost capabil să îşi menţină activitatea biologică în inhibarea fosforilării de Stat5, în aceeaşi măsură ca referinţa N13B2-h3. Mai mult, această variantă a fost foarte stabilă după 14 zile de incubaţie la 42 ° C, 25 ° C sau 4 ° C, nu a indus formarea de agregate şi şi-a menţinut activitatea de legare.

Exemplul 6. Efect asupra celulelor T cu memorie

Model de hipersensibilitate de tip întârziat indus de tuberculină

Babuinii au fost imunizaţi intradermic de două ori cu un vaccin cu bacil Calmette-Guerin (0,1 ml; 2-8 105 CFU; Sanofi Pasteur MSD, Lyon, Franţa) în regiunea superioară a piciorului, cu 4 şi 2 săptămâni înainte de testul de piele de hipersensibilitate de tip întârziat (DTH). Reacţiile intradermice (IDR) au fost efectuate cu injecţii intradermice de 2000 sau 1000 UI de derivat proteic purificat de tuberculină (PPD; Symbiotics Corporation, San Diego, CA). Soluţie salină (0,1 ml) a fost utilizată ca martor negativ. Răspunsurile cutanate la locurile de injecţie au fost măsurate folosind un şubler pătrat de cel puţin doi observatori şi au fost considerate pozitive cu diametrul > 4 mm. A doua IDR a fost efectuată după o perioadă de spălare de trei săptămâni şi animalele au primit o injecţie intravenoasă de 10 mg / kg de N13B2 (n = 7) sau 10 mg / kg (V915GA, AA892BB, 32257, 33874) (n = 4) de umanizat N13B2 sau echivalentul excipientului de volum (n = 4). IDR suplimentare au fost efectuate în fiecare lună după injectare. După o perioadă de spălare, unii babuini (trataţi anterior cu N13B2) au fost imunizaţi din nou intradermic de două ori cu un BCG urmat de un nou IDR. Media lecturii a fost înregistrată şi reprezentată grafic pentru fiecare punct de timp. Pentru a compara condiţii experimentale multiple, răspunsurile eritemului au fost cuantificate ca suprafaţă sub curbă (AUC) utilizând software-ul Graph Pad Prism pentru calcul (Figura 5A şi B).

Elispot

Frecvenţa celulelor T specifice Ag a fost urmată cu un test ELISPOT IFN-g (kit de ELISPOT IFN-g primat neuman; R&D Systems, Minneapolis, MN) pe PBMC proaspăt izolat restimulat cu tuberculină, conform instrucţiunilor producătorului.

Pe scurt, anticorpul de captură (sisteme de cercetare şi dezvoltare, numărul de catalog SEL961) a fost adăugat în fiecare godeu al plăcilor filtrante Elispot MultiScreen® HTS (Merck Millipore) şi incubat o noapte la 4 ° C. După trei spălări, s-a adăugat tampon de blocare şi placa a fost incubată 2 ore la temperatura ambiantă. Babuinii PBMC au fost extrasa proaspăt din sângele babuinilor prin centrifugare cu gradient Ficoll (GE Healthcare Life Science, Paris, Franţa). Celulele roşii din sânge au fost apoi lizate şi celulele spălate înainte de reconstituire la o concentraţie adecvată în mediul de cultură (mediul TexMacs suplimentat cu penicilină-streptomicină (Gibco)) cu purificare sau nu de derivat proteic de tuberculină. Placa a fost incubată la 37 ° C şi 5% CO2 timp de 18-24 ore. După trei spălări cu tampon de spălare, s-a adăugat anticorp de detectare (R&D systems, număr de catalog SEL961) şi s-a incubat la 4 ° C timp de 24 de ore. Streptavidin-AP (R&D systems, număr de catalog SEL002) a fost adăugat după trei spălări şi s-a incubat două ore la temperatura ambiantă timp de 2 ore. S-au făcut trei spălări. BCIP / NBT (R&D systems, număr de catalog SEL002) au fost adăugate şi puse în întuneric timp de 30 de minute. Au fost necesare mai multe spălări cu tampon de spălare şi unul cu apă deionizată (Figura 5C).

Animale

Babuini (Papio anubis; 7-14 kg) au fost obţinuţi de la Centrul Naţional de Cercetare Ştiinţifică, Centrul de Primatologie (Rousset, Franţa). Animalele au fost adăpostite la unitatea de animale mari a unităţii INSERM 1064. Studiile pe animale au fost aprobate de Comitetul de etică naţional francez.

Rezultate

Într-un prim experiment, un prim IDR cu tuberculină a fost efectuat pe babuini vaccinaţi cu BCG care nu au primit tratament în acel moment (ziua -30). După o perioadă de spălare de o lună, a fost efectuat un al doilea IDR în 4 ore şi în fiecare lună după injecţie i.v. de 10 mg / Kg de N13B2 (bare albe). Un ultim IDR a fost efectuat după o nouă vaccinare cu BCG (14 luni după injectarea anticorpului). Animalele de control (bare negre) au primit un volum similar de excipient i.v. şi au fost provocate cu acelaşi protocol. Rezultatele au arătat că anticorpul himeric anti-IL7Ra a indus o protecţie pe termen foarte lung (până la 14 luni) după o singură administrare. Răspunsul a fost recuperat numai după o nouă vaccinare.

Într-un alt experiment, un prim IDR cu tuberculină a fost efectuat pe babuini vaccinaţi cu BCG (bare punctate - de exemplu IDR1 pentru V915GA). După o perioadă de spălare de o lună, a fost efectuat un al doilea IDR în 4 ore şi în fiecare lună după injectarea i.v. a 10 mg / Kg de N13B2 umanizat (bare solide - de exemplu IDR2-6 pentru V915GA). Un ultim IDR a fost efectuat după o nouă vaccinare cu BCG şi tuberculină (bare punctate - de exemplu IDR7 pentru V915GA). Animalele de control (bare negre) au primit un volum similar de excipient i.v. şi au fost provocate cu acelaşi protocol. Rezultatele au arătat că N13B2 umanizat a indus şi o protecţie pe termen lung după o singură administrare în 3 din 4 babuini evaluaţi. Animalul „33874» a răspuns iniţial imediat după injectarea anticorpului, dar răspunsul s-a recuperat spontan o lună mai târziu.

PBMC din sânge au fost re-stimulate ex vivo cu tuberculină. Un prim elispot IFNy cu sau fără tuberculină a fost efectuat pe babuini vaccinaţi cu BCG (bare punctate). Un al doilea elispot IFNy a fost efectuat la 4 zile după injectare cu 10 mg / Kg de N13B2 umanizat (bare umplute). Noi ELISPOT au fost apoi efectuate în fiecare lună la fiecare nouă IDR cu tuberculină in vivo. Un ultim elispot IFNy a fost efectuat după o nouă vaccinare cu BCG (bare punctate). Rezultatele au arătat că administrarea de N13B2 umanizată a indus ştergerea celulelor T cu memorie specifică antigenului la animalele care răspund pe termen lung. Babuinul „33874" nu a arătat reducerea semnificativă a celulelor T cu memorie specifice tuberculinei în paralel cu lipsa protecţiei pe termen lung în modelul DTH. După o nouă vaccinare cu BCG, animalele care au răspuns pe termen lung au prezentat o frecvenţă crescută a celulelor T cu memorie specifică antigenului care se recuperează la nivelul bazal (înainte de injecţia mAb), şi acest lucru este asociat cu recuperarea răspunsului DTH in vivo. În total, aceste rezultate au demonstrat că protecţia pe termen lung indusă de N13B2 umanizat este asociată cu ştergerea celulelor T cu memorie specifice antigenului, care explică efectul pe termen lung al medicamentului.

Exemplul 7. Exprimarea de IL-7, CD127 şi TSLP la pacienţii cu IBD

Date brute despre expresia de ARNm obţinute aşa cum sunt detaliate în Planell şi colab. Gut 2013 au fost analizate după cum este detaliat în legenda din Figura 6.

Exemplul 8. Calea de semnalizare de PBMC uman stimulată cu anticorpi anti-CD127 plus IL7

Căile de semnalizare IL7 au fost studiate din lizatele PBMC umane incubate 30 min la 37 ° C cu 10 µg / ml de anticorpi CD127 solubili anti-umani şi stimulate cu IL7 (AbD Serotec, ref PHP046) la 5 ng / ml timp de 10 min la 37 ° C. Western Blot s-au efectuat în condiţii de reducere cu 20 µg proteină de lizat celular în geluri de poliacrilamidă 7,5% şi s-au şters pe membrane de nitroceluloză (GeHealthcare). Bloturile au fost saturate cu 5% soluţie salină tampon BSA-Tris (TBS) şi s-au dezvăluit cu anticorp Phospho-Stat5, Phospho-PI3-Kinase p85, Phospho-Akt şi Phospho-ERK1 / 2 (tehnologie de semnalizare celulară) la 1/1000 în 1 % BSA-TBS (peste noapte la 4 ° C) urmat de anticorp policlonal de capră anti-iepure marcat cu peroxidază de hrean (Cell Signaling Technology) la 1/2000 timp de 1 oră la temperatura camerei sau cu anticorp GAPDH (Santa Cruz) la 1/1000 în 1% BSA-TBS (peste noapte la 4 ° C) urmat de anticorp policlonal de capră anti- şoarece marcat cu peroxidază de hrean (Jackson Immunoresearch) la 1/2000 timp de 1 oră la temperatura camerei. Membranele au fost dezvăluite prin chemiluminescenţă utilizând sistemul de imagine LAS-3000 (Fujifilm). Următorii anticorpi CD127 anti-umani au fost astfel testaţi: N13B2-h3 şi N13B2-hVL6 (ambii anticorpi anti-situs 1 / 2b, dezvăluiţi aici); MD707-13-G4 („anticorp anti-situs 1", dezvăluit în brevetul de invenţie int. WO2013/056984) şi 1A11 (dezvăluit în brevetul GSK WO2011/094259).

Exemplul 9. Efect asupra eliberării de citokine a celulelor T în ţesutul IBD

Biopsiile de la pacienţii cu IBD pot fi utilizate ca model inflamator al bolii ex-vivo şi s-a demonstrat aici că eliberează spontan niveluri ridicate de citokine proinflamatorii după 24 de ore de cultură (UC: IFNγ, 130 ± 19 pg / ml; IL-6 , 4042 ± 529 pg / ml; IL-8, 25626 ± 1640 pg / ml - CD: IFNγ, 180 ± 38 pg / ml; IL-6, 3653 ± 734 pg / ml; IL-8, 15540 ± 2452 pg / ml [medii ± sem pentru UC şi, respectiv, CD]).

mAb anti-CD 127 a fost aplicat la 10 µg / ml în acest test de cultură de organe utilizând probe chirurgicale prelevate din mucoasa colonică inflamată a 20 de pacienţi cu IBD (10 cu boala Crohn şi 10 cu colită ulcerativă, şi cultura a fost efectuată la 37 ° C pentru 24 de ore în mediu cu 10 µg / ml de mAb martor IgG sau mAb IL-7Rα blocant anti-uman (a se vedea detaliile privind eşantionarea şi condiţiile de cultură de mai jos). O probă de control pereche de la fiecare pacient a fost prelevată şi cultivată în aceleaşi condiţii, cu control IgG în locul anticorpului anti-CD 127. Concentraţia citokinelor a fost măsurată prin ELISA (aşa cum este detaliat mai jos) în supernatantul probelor de cultură ex-vivo.

Producţia de IFNγ prin probe de biopsie UC cultivate ex-vivo a fost semnificativ inhibată de mAb anti-IL7Rα. Rezultate similare au fost observate pentru unele probe de biopsie de CD care secretă o cantitate mare de IFNγ.

Prelevare şi cultură de organe ex-vivo

Dacă s-a folosit ţesut de rezecţie a mucoasei, fragmente mici de dimensiunea biopsiei au fost tăiate cu foarfeca. Apoi, biopsiile sau fragmentele de dimensiunea biopsiei au fost plasate în 300 µl mediu HL-1 fără ser (Lonza, Cambridge BioScience, Marea Britanie) suplimentat cu L-Glutamină, 100 U / ml penicilină, 100 µg / ml streptomicină şi 50 µg / ml gentamicină. Explanele mucoasei au fost incubate timp de 24 de ore la 37 ° C şi 5% CO2. Anticorpul respectiv testat (N13B2) sau controlul IgG utilizat la 10 µg / ml a fost adăugat în mediu la începutul timpului de incubare. În cele din urmă, supernatantul şi materialul de biopsie au fost congelaţi şi stocaţi la -70 ° C pentru analize viitoare.

Test imunosorbent legat de enzime (ELISA)

Producţia de citokine în supernatantul de biopsie a fost măsurată prin test imunosorbent legat de enzime (ELISA). IFN-y recombinant uman de la ImmunoTools (# 31673539, Friesoythe, Germania) a fost utilizat în conformitate cu instrucţiunile producătorului.

Exemplul 10. Comparaţia anticorpilor anti-IL7-Rα anti-umani în legătură cu caracterizarea epitopului lor:

Analiza spectrometriei de masă: profilarea anticorpilor utilizând micromatrice de peptide

Micromatricele peptidice de la PepStar™ Technologies cuprind peptide sintetice purificate derivate din antigeni sau alte surse care sunt imobilizate chimioselectiv şi covalent pe o suprafaţă de sticlă. Un fragment linker hidrofil optimizat este introdus între suprafaţa sticlei şi secvenţa peptidică derivată din antigen pentru a evita falsele negative cauzate de obstacole sterice. Din motive tehnice, toate peptidele conţin o glicină C-terminală. Experimentele de profilare a probelor au fost efectuate pe o bibliotecă de peptide constând din 52 de peptide. Lista completă a peptidelor este prezentată mai jos:

Tabelul 5. Lista peptidelor utilizate în testele de micromatricepeptidice

SECV ID Secvenţă SECV ID Secvenţă SECV ID Secvenţă 44 ESGYAQNGDLEDAEL 62 FIETKKFLLIGKSNI 80 HDVAYRQEKDENKWT 45 AQNGDLEDAELDDYS 63 KKFLLIGKSNICVKV 81 YRQEKDENKWTHVNL 46 DLEDAELDDYSFSCY 64 LIGKSNICVKVGEKS 82 KDENKWTHVNLSSTK ' 47 AELDDYSFSCYSQLE 65 SNICVKVGEKSLTCK 83 KWTHVNLSSTKLTLL 48 DYSFSCYSQLEVNGS 66 VKVGEKSLTCKKIDL 84 VNLSSTKLTLLQRKL 49 SCYSQLEVNGSQHSL 67 EKSLTCKKIDL TTIV 85 STKLTLLQRKLQPAA 50 QLEVNGSQHSLTCAF 68 TCKKIDL TTIVKPEA 86 TLLQRKLQPAAMYEI 51 NGSQHSLTCAFEDPD 69 IDLTTIVKPEAPFDL 87 RKLQPAAMYEIKVRS 52 HSLTCAFEDPDVNTT 70 TIVKPEAPFDLSVIY 88 PAAMYEIKVRSIPDH 53 CAFEDPDVNTTNLEF 71 PEAPFDLSVIYREGA 89 YEIKVRSIPDHYFKG 54 DPDVNTTNLEFEICG 72 FDLSVIYREGANDFV 90 VRSIPDHYFKGFWSE 55 NTTNLEFEICGALVE 73 VIYREGANDFVVTFN 91 PDHYFKGFWSEWSPS 56 LEFEICGALVEVKCL 74 EGANDFVVTFNTSHL 92 FKGFWSEWSPSYYFR 57 ICGALVEVKCLNFRK 75 DFVVTFNTSHLQKKY 93 WSEWSPSYYFRTPEI 58 LVEVKCLNFRKLQEI 76 TFNTSHLQKKYVKVL 94 SPSYYFRTPEINNSS 59 KCLNFRKLQEIYFIE 77 SHLQKKYVKVLMHDV 95 YFRTPEINNSSGEMD 60 FRKLQEIYFIETKKF 78 KKYVKVLMHDVAYRQ 61 QEIYFIETKKFLLIG 79 XVLMHDVAYRQEKDE

Un total de 4 probe au fost incubate pe diapozitive cu micromatrice folosind un format Multiwell. Pentru anticorpul N13B2-h3VL6 şi cealaltă probă (MD707-13, HAL şi 1A11), s-au aplicat 6 concentraţii diferite (10 µg / ml; 2 µg / ml; 1 µg / ml; 0,1 µg / ml; 0,01 µg / ml; 0,001 µg / ml). Diluţiile de probe seriale au fost incubate timp de 1 oră la 30 ° C pe o lamelă de micromatrice cu mai multe godeuri, conţinând 21 mini-matrice individuale (1 mini-matrice per diluare de probă). După incubarea probei, s-a adăugat un anticorp anti-IgG secundar uman la 1 µg / ml şi s-a lăsat să reacţioneze timp de 1 oră. O incubare de control suplimentară aplicând numai anticorpul secundar a fost efectuată în paralel pe aceeaşi lamă de micromatrice pentru a evalua legarea fals-pozitivă la peptide. După spălare şi uscare, diapozitivul a fost scanat cu un scaner laser de înaltă rezoluţie la 635 nm pentru a obţine profiluri de intensitate a fluorescenţei. Imaginile rezultate au fost cuantificate pentru a produce o valoare medie a pixelilor pentru fiecare peptidă. Imaginile au fost cuantificate pentru a produce o valoare medie a pixelilor pentru fiecare peptidă. Anticorpul secundar marcat anti-IgG uman a fost marcat cu Cy5 la 1 µg / ml.

Tampoane şi soluţii. Tamponul utilizat a fost tampon TBS incluzând 0,05% Tween20 (JPT) şi Tampon de testare T20 (Pierce, SuperBlock TBS T20, # 37536). Achiziţia şi analiza s-au efectuat folosind micromatrice peptidice (JPT Peptide Technologies GmbH, Berlin, Germania; lotul 2668, cameră de incubaţie cu multi-godeuri, Axon Genepix Scanner 4200AL. Micromatricele au fost scanate folosind un scaner de fluorescenţă de înaltă rezoluţie. Pentru toate măsurătorile efectuate satările laser şi rezoluţia aplicată au fost identice. Imaginile rezultate au fost analizate şi cuantificate folosind software-ul de recunoaştere spot GenePix (Molecular Devices). Pentru fiecare spot, a fost extrasă intensitatea medie a semnalului (între 0 şi 65535 unităţi arbitrare).

Pentru evaluarea ulterioară a datelor, au fost determinate aşa-numitele valori MMC2. MMC2 este egal cu valoarea medie a tuturor celor trei instanţe din micromatrice, cu excepţia cazului în care coeficientul de variaţie (CV) - deviaţia standard împărţit la valoarea medie - este mai mare de 0,5. În acest caz, media celor mai apropiate două valori (MC2) este atribuită lui MMC2.

Analiza deuteriului

Folosind sistemul HDX-2 (Waters S.A./N.V.; Zellik, Belgia), CD127 uman recombinant şi 0 sau 1 echivalent molar de mAb au fost amestecate şi diluate în 99,9% D2O, 10mM fosfat de sodiu, 100mM NaCI, pH 6,8 până la un Conţinut final de D2O de 90% şi o concentraţie complexă de CD127 sau CD127 / mAb de 27,5 µM. Schimbul de hidrogen-deuteriu a fost efectuat la 20,0 ° C timp de 30 de minute. Schimbul a fost stins printr-o diluţie 1: 1 (v / v) a probelor cu fosfat de sodiu 100mM, guanidină 4M · HCI, TCEP 0,4M, pH 2,3, la 1,0 ° C, rezultând un pH final de 2,5. După 2 minute, probele stinse au fost încărcate pe managerul HDX pentru digestia directă a pepsinei la 20,0 ° C (Enzimat BEH Pepsină, 2,1 x 30 mm; 5 µm), urmat de desalinizare (Acquity BEH C18 Vanguard 2,1 mm x 5 mm; 1,7 µm ) şi separare în fază inversă (Acquity BEH C18 1,0 mm x 100 mm; 1,7 µM) utilizând un gradient de la 5% -40% 0,2% acid formic în acetonitril (pH 2,5) timp de 10 min la un debit de 40 µl / min la 0,0 ° C. Analiza spectrometriei de masă a fost efectuată pe un spectrometru de masă Waters Xevo G2-XS ESI-Q-TOF în modul ion pozitiv, cu corecţie blockspray. S-au utilizat condiţii uşoare de sursă (temperatură: 90 ° C, tensiune capilară: 2,5kV, con de eşantionare: 30V, debit de gaz de desolvatare: 800 l / oră, temperatură de desolvatare: 250 ° C) pentru a minimiza schimbul înapoi, asigurând în acelaşi timp desolvatarea corectă (73). Identificarea peptidelor a fost asistată de disocierea indusă de coliziune colectată în modul MSE, utilizând PLGS 3.0.2 şi UNIFI 1.8. Incorporarea deuteriului a fost determinată în DynamX 3.0. Figurile structurale au fost preparate folosind PyMOL 1.8.2.3 (Schrödinger LLC, Cambridge, MA, SUA) din PDB ID 3DI3 (19). Fosfatul de sodiu monobazic şi dibazic, clorura de sodiu, clorhidratul de guanidină, clorhidratul de Tris (2-carboxietil) fosfină (TCEP), 50% hidroxid de sodiu şi acid formic au fost achiziţionate de la Sigma Aldrich (Schnelldorf, Germania) la cea mai mare puritate disponibilă. Solvenţii de clasă LC-MS au fost obţinuţi din Biosolve Chimie (Dieuze, Franţa), oxid de deuteriu (99,9% D) şi 20% clorură de deuteriu în oxid de deuteriu (99,96% D) de la Cambridge Isotope Laboratories (Andover, MA, SUA), acid clorhidric 37% de la VWR International (Fontenay-sous-Bois, Franţa) şi digestie de citocrom C de bovină de la Thermo Fisher Scientific (Germering, Germania). Filtrele ultra-centrifuge Amicon (0,5 ml; limită 10 kDa) au fost obţinute de la Merck Millipore (Molsheim, Franţa).

Rezultate

Caracterizarea epitopului prin matrice liniară de peptide a diferitelor mAb-uri anti-IL7Ra a identificat două tipuri de mAb-uri antagoniste: (1) mAb-uri care se leagă de regiunea (situsul-1) de interacţiune cu IL-7, aşa cum a fost descris anterior de alte două grupuri (clona 1A11 în WO/2011/094259 şi clona HAL descrisă în WO/2011/104687) şi incluzând MD707-13, şi (2) un mAb, adică N13B2-h3VL6 al prezentei invenţii, care leagă atât situsul-1, cât şi un epitop care se suprapune domeniului prevăzut (situsul-2b) de heterodimerizare între IL-7Rα şi subunităţi de lanţ γ (Walsh 2012).

N13B2-h3VL6 şi MD707-13 cu afinităţi ridicate şi similare (liantul la situsul-1 / 2b cu o KD de 2,10-10M şi un liant la situsul-1 cu un KD similar de 5,10-10M) au fost exprimate recombinant cu un izotip IgC4 Fc uman (care conţine mutaţia articulaţiei S228P pentru a preveni schimbul de braţ Fab) şi comparate cu un alt mAb situs-1 descris anterior cu afinitate similară, clona 1A11, descrisă în WO/2011/094259 (KD de 6,10-10M) şi exprimat recombinant cu un izotip Fc IgG1 uman ca fiind dezvoltat în clinică (NCT02293161). Analiza epitopului conformaţional utilizând schimb de hidrogen deuteriu cu spectrometrie de masă (HDX-MS) a confirmat observaţiile anterioare şi a demonstrat că anticorpul invenţiei, adică N13B2-h3VL6 (situs-1 / 2b mAb), protejat de încorporarea deuteriului în mai multe peptide ale situsului-1, dar şi la o peptidă care se suprapune peste situsul-2b, în timp ce celelalte două mAb (MD707-13 şi 1A11) împiedică în mod semnificativ încorporarea deuteriului numai în peptidele de la situsul-1 (Datele nu sunt prezentate).

Anticorpul invenţiei a fost singurul care a recunoscut un epitop conformaţional localizat pe situsul 1 din Domeniul 1 şi un epitop conformaţional localizat pe situsul 2b al lui CD127 uman.

Exemplul 11. Compararea anticorpilor IL-7Rα anti-umani pentru capacitatea lor de a fi agonişti şi / sau antagonişti ai căii IL-7.

Western Blot

PBMC-urile umane proaspăt izolate au fost incubate timp de 30 de minute la 37 ° C cu 10 ug / ml de mAbs anti-umane IL-7Rα şi apoi cultivate singure sau cu 5 ng / ml de IL-7 uman recombinant (AbDSerotec) timp de 10 minute la 37 ° C . După oprirea reacţiilor pe gheaţă, lizatele celulare au fost preparate cu tampon RIPA (cu Cocktail inhibitor de protează). Proteinele (15 µg) au fost resoluţionate în condiţii de reducere pe geluri de poliacrilamidă 7,5% şi imobilizate pe membrane de nitroceluloză (GeHealthcare) folosind metode standard. Blot-urile au fost spălate cu soluţie salină tampon BSA-Tris 5% şi incubate cu anticorpi specifici Phospho-STAT 5, Phospho-PI3K p55 sau Phospho-ERK în 1% BSA-TBS (peste noapte la 4 ° C), urmat de un anticorp policlonal marcat cu peroxidază de hrean de capră anti-iepure (Cell Signaling Technology) timp de 1 oră la temperatura camerei. Alternativ, petele au fost colorate folosind un anticorp GAPDH (Santa Cruz) în 1% BSA-TBS (peste noapte la 4 ° C), urmat de anticorp policlonic de capră anti-şoarece marcat cu peroxidază de hrean (Jackson Immunoresearch) timp de 1 oră la temperatura camerei. Membranele au fost descoperite prin chemiluminiscenţă utilizând un sistem de imagistică LAS-3000 (Fujifilm).

Secvenţierea ARN

PBMC umane proaspăt izolate au fost incubate cu 10 µg / ml mAb-uri IL-7Rα anti-umane (30 min la 37 ° C) şi apoi cultivate singure sau cu 5 ng / ml IL-7 uman recombinant (AbDSerotec) timp de 3 ore la 37 ° C. Reacţiile au fost oprite pe gheaţă şi peletele celulare resuspendate în tampon RLT (Qiagen) conţinând 1% β mercaptoetanol în apă fără RNază / DNază şi stocate la -80 ° C. ARN a fost extras folosind un mini kit de extracţie ARN conform instrucţiunilor producătorului (Qiagen). Calitatea şi cantitatea de ARN au fost evaluate prin spectrometrie în infraroşu (Nanodrop) şi bioanalizator Agilent (Agilent RNA 6000 Pico Kit). Bibliotecile Smart-Seq2 au fost preparate de Broad Technology Labs şi secvenţiate de Broad Genomics Platform conform protocolului SmartSeq2 cu unele modificări. Pe scurt, ARN-ul total a fost purificat folosind mărgele de ARN-SPRI, poliA + mARN a fost transcris invers către ADNc, iar ADNc amplificat a fost supus fragmentării bazate pe transpozon care a folosit indexarea duală pentru codul de bare pentru fiecare fragment din fiecare transcript convertit cu o combinaţie de coduri de bare specifice la fiecare probă. Secvenţierea a fost efectuată ca 2x25bp cu capăt împerecheat, cu 8 cicluri suplimentare pentru fiecare indice. Datele au fost separate prin cod de bare şi aliniate folosind Tophat versiunea 2.0.10 cu setările implicite. Transcrierile au fost cuantificate prin conducta de calcul Broad Technology Labs utilizând versiunea Cuffquant 2.2.1. Pe scurt, datele au fost procesate prin CuffNorm dacă 50% din citiri au fost aliniate, şi dacă cel puţin 100.000 de perechi au fost aliniate pe eşantion. Normalizarea a folosit setările implicite, inclusiv normalizarea „geometrică» şi informaţiile privind nivelul de expresie ca valori FPKM transformate în log2 (Fragmente pe kilobază de transcriere la milion de fragmente cartografiate) au fost utilizate pentru analizele ulterioare. Pentru identificarea genelor diferenţiale, modelarea liniară cu estimarea relaţiei medie-varianţă (limma-tendinţă) cu procedura statistică empirică Bayes a fost efectuată folosind pachetul limma din R. Genes cu Benjamini şi Hochberg, valoarea p ajustată <5% şi modificarea pliului (FC) > 1,5 au fost considerate ca exprimate diferenţial. Pentru reprezentarea expresiei genelor, analiza componentelor principale (PCA) şi gruparea au fost efectuate în R v3.3.2 folosind pachetele ade4/adegraphics şi respectiv pheatmap. Semnificaţia biologică a genelor selectate a fost evaluată utilizând pachetul R clusterProfiler. Au fost selectate categorii de ontologie genică (GO) îmbogăţite cu o rată de descoperire falsă (FDR) <5% şi cu cel puţin cinci gene reprezentate. Datele ARN-seq pot fi accesate sub numărul de acces GEO GSE.

Rezultate

Căi de semnalizare STAT5, PIK3 şi ERK

MAb-urile IL-7Rα anti-umane (N13B2-h3VL6, MD707-13, 1A11 şi HAL) au fost apoi comparate pentru capacitatea lor de a activa sau bloca căile de semnalizare STAT5, PI3K şi ERK asociate anterior cu semnalizarea de IL-7R (Figurile 9 şi 10) . Aşa cum s-a ilustrat anterior (vezi de exemplu Figura 7), IL-7 induce o fosforilare STAT5 puternică pe PBMC-urile umane şi toate mAb-urile testate sunt inhibitori puternici ai acestei fosforilări STAT5 (vezi Figura 7). În contrast, şi aşa cum este ilustrat în Figurile 9 şi 10, inventatorii au constatat că, în timp ce IL-7 induce o fosforilare PI3K variabilă şi nu induce fosforilarea ERK, anticorpii din stadiul tehnicii (şi anume MD707-13, 1A11 şi HAL) induc semnificativ fosforilarea ERK şi într-o măsură mai mică, semnalul PI3K, chiar şi în absenţa de IL-7 exogen, contrar anticorpului conform invenţiei. Aceste constatări arată că anticorpii anti-umani IL-7Rα din stadiul tehnicii au proprietăţi parţiale de agonist şi, prin urmare, sunt consideraţi ca mAb-uri dubli agonist / antagonist pentru IL-7R uman. Dimpotrivă, un anticorp conform invenţiei, şi în special N13B2-h3VL6, are numai proprietăţi antagoniste pentru IL-7R uman.

Inventatorii au evaluat dacă anticorpii cu proprietăţi de agonist / antagonist ar putea furniza un semnal agonist eficient capabil să modifice celulele T umane. Transcriptomii PBMC-urilor umane incubate timp de 3,5 ore fără IL-7 uman exogen, cu IL-7 uman şi cu IL-7 şi un anticorp (MD707-13, 1A11 situs-1 (respectiv IgG4 # 1 sau IgG1 # 2) sau N13B2 -hVL6 situs-1 / 2b (IgG4)) au fost analizate prin secvenţierea următoarei generaţii bazate pe ARN (ARN-SEQ). Un total de 481 de gene au fost exprimate diferenţial în PBMC umane incubate cu mAb anti-IL-7Rα uman, comparativ cu condiţiile de control, în timp ce un total de 334 de gene au fost exprimate diferenţial numai cu stimulare IL-7 umană, în comparaţie cu condiţiile de control.\tab Analiza diagramei Venn (Figura 11C) a identificat 61 de gene comune exprimate diferenţial cu cele trei mAb-uri fără nicio îmbogăţire a ontologiei genei GoMiner. În ciuda a 61 de gene comune, anticorpul invenţiei induce doar 31 de modificări genetice semnificative fără îmbogăţirea ontologiei genice. În contrast, cei doi anticorpi din stadiul tehnicii induc o modificare transcripţională importantă a transcriptomului PBMC uman, cu 245 gene exprimate diferenţial induse de mAb situsul-1 IgG4 # 1 şi 237 gene exprimate diferenţial induse de mAb situsul-1 IgG1 # 2. 78 de gene exprimate diferenţial erau comune între aceste două mAb-uri de situs-1, dar aceste gene nu sunt exprimate diferenţial atunci când PBMC-urile sunt stimulate cu N13B2-hVL6.

Analiza componentelor principale (PCA) a semnăturii IL-7 arată că genele exprimate diferenţial induse de anticorpii din stadiul tehnicii sunt puternic diferite de genele exprimate diferenţial induse de IL-7. Îmbogăţirea ontologiei genei GoMiner sugerează că ambii anticorpi din stadiul tehnicii modifică funcţiile PBMC biologice, cum ar fi activarea leucocitelor, proliferarea, migraţia, chemotaxia, secreţia de citokine şi răspunsurile inflamatorii asociate cu calea MAPK / ERK.

Dintre cele 334 de gene exprimate diferenţial cu IL7 în comparaţie cu starea de control, 93 de gene au fost exprimate diferenţial cu o schimbare de n-ori ridicată (> 2) şi au fost separate în 3 clustere distincte prin analiza hărţii termice (Figura 11A). Primul grup de gene reglate în jos, evaluat prin îmbogăţirea ontologiei genetice, a fost implicat în principal în diferenţierea leucocitelor şi apoptoză, un al doilea grup de gene puternic reglate în sus a fost asociat cu aderenţa, diferenţierea şi activarea leucocitelor, iar un al treilea grup de gene reglate în sus avea ontologie genică mixtă. Interesant este că toate mAb-urile testate (atât situs-1, fie situs-1 / 2b) au prezentat efecte similare prin prevenirea modificării cluster-1 şi cluster-2, dar fără impact asupra lui cluster-3 (Figura 11B).

În total, analizele transcripţionale au confirmat că, în ciuda faptului că mAb-urile anti-IL-7Rα situs-1 şi situs-1 / 2b anti-umane împărtăşeau proprietăţi antagoniste similare, cele două mAb-uri situs-1 descrise în stadiul tehnicii au indus modificări transcripţionale semnificative ale PBMC-urilor umane compatibile cu activarea celulelor T şi răspunsurile inflamatorii induse de calea MAPK / ERK.

MAb IL-7Rα anti-uman situs-1 / 2b al invenţiei, adică N13B2-hVL6, a indus o modificare transcripţională mai mică a PBMC-urilor umane, comparativ cu cele două mAb-uri situs-1 descrise în stadiul tehnicii.

Lipsa de mAb anti-IL-7Rα specifică şi „numai antagonistă» pentru speciile mai mari a împiedicat verificarea acestui efect la primate sau la oameni. Inventatorii au constatat că proprietăţile agoniste / antagoniste ale mAb-urilor anti-IL-7Rα depind de epitopul specific vizat, deoarece anticorpii de ultimă generaţie care leagă domeniul de interacţiune IL-7 situs-1 par să aibă atât proprietăţi agoniste / antagoniste, în timp ce anticorpul conform invenţiei care leagă domeniul de dimerizare al lui IL-7Rα / γc (situsul 2b) prezintă o activitate antagonistă strictă. Inventatorii sugerează că anticorpul invenţiei ar putea perturba dimerizarea de IL-7Rα / yc necesară pentru internalizarea şi semnalizarea receptorilor. Anticorpii „numai antagonişti» împotriva IL-7R au prevenit inflamaţia pielii mediată de celulele T cu memorie pe termen lung la primate, chiar şi după stimularea cronică a antigenului, fără a induce limfopenie sau deficienţe funcţionale sau metabolice ale celulelor T policlonale.

S-a demonstrat că IL-7 induce semnale proliferative şi anti-apoptotice prin semnalizarea de IL-7R în principal prin activarea căii JAK / STAT. Semnalizarea de IL-7R este considerată, de asemenea, a implica calea PI3K / AKT, dar acest lucru a fost observat în liniile celulare imortalizate transformate sau în timocitele primare, şi aceste semnale nu au fost detectabile în limfocitele T umane periferice naive sau cu memorie (Watanabe, J. Exp. Med, 1998). Mai multe rapoarte au sugerat, de asemenea, că semnalizarea de IL-7R ar putea amplifica fosforilarea ERK fie în limfocitele T, fie în subseturile de celule pro-B (Deshpande P. I. Immunol, 2013; Fleming HE şi Paige CJ, Immunity, 2001). Rolul acestor căi în semnalizarea IL-7R în celulele T mature şi umane este mai puţin clar. Folosind PBMC-uri umane primare proaspăt izolate (majoritatea compuse din limfocite T şi B, monocite şi celule NK) de la voluntari sănătoşi, stimulaţi cu o concentraţie mare de IL-7 uman recombinant (5000 pg / ml, în timp ce concentraţia în ser este de ∼ 5 pg / ml în condiţii non-limfopenice Wong H-L, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2008)), inventatorii au confirmat că IL-7 a indus fosforilarea STAT5 reproductibilă. Activarea semnalului PI3K a fost mai variabilă, şi nu au observat nici o fosforilare ERK. În timp ce toate mAb-urile anti-IL7Rα utilizate în acest studiu au fost inhibitori puternici ai pSTAT5 indus de IL-7 şi au prezentat proprietăţi antagoniste transcripţionale similare, s-a constatat că două mAb-uri situs-1 din stadiul tehnicii au indus semnale agoniste PI3K / ERK şi importante modificări transcripţionale asociate cu activarea celulelor T şi răspunsuri inflamatorii induse de calea MAPK / ERK. Aceste proprietăţi agoniste / antagoniste duale opuse ale unor mAb-uri nu sunt unice, deoarece alte ţinte precum IL-4, IL-6R, IL-15, CD28, CD38, CD40 sau HER2 au demonstrat activităţi similare după endocitoza / internalizarea receptorului.

De asemenea, heterodimerizarea acestui situs 2b cu TSLPR a fost confirmată recent şi s-a demonstrat că este pregătită pentru semnalizarea receptorilor, aşa cum s-a prevăzut deja pentru IL-7Rα şi lanţul γ (Verstraete K., Nature Communications, 2017). Interesant este că situsul de heterodimerizare prevăzut între lanţul IL-7Rα / γ şi IL-7Rα / TSLPR se suprapune, sugerând un mecanism comun de semnalizare mediate de heterodimerizare între ambii receptori.

S-a constatat că testul de inhibare a lui pSTAT5 in vitro nu a fost predictiv pentru eficacitatea anticorpilor anti-IL-7R in vivo. Într-un raport anterior, un alt mAb anti-IL7Rα a prevenit pSTAT5 indus in vitro şi ex vivo de IL-7 la primate, dar nu a protejat de inflamaţia creierului într-un model experimental de encefalită autoimună la marmotă (EAE) (Dunham J., J. Neuroimmune. Pharmacol, 2016).

IL-7 a fost bine descris în menţinerea grupului de limfocite T naive şi cu memorie periferice la şoareci. Cu toate acestea, la primate, importanţa lui IL-7 în menţinerea homeostazei periferice a celulelor T ar putea fi, prin urmare, mai puţin evidentă şi / sau mecanismele redundante ar putea explica diferenţa dintre specii.

Aceste date au arătat că proprietăţile antagoniste ale mAb-urilor anti-IL-7Rα şi eficacitatea in-vivo nu sunt legate doar de prevenirea legării de IL-7 şi de inhibarea de pSTAT5. Aceste date au arătat că anticorpul invenţiei care vizează şi situsul de heterodimerizare al receptorului (situsul 2b), este „numai antagonist» şi are ca rezultat o eficacitate mai mare a răspunsurilor inhibitoare ale celulelor T in vivo.

Direcţionarea de IL7R cu anticorpi „numai antagonici» are potenţialul de a regla supravieţuirea şi acumularea celulelor T cu memorie specifică antigenului şi, prin urmare, ar putea promova prevenirea recăderii pe termen lung în bolile autoimune şi inflamatorii.

Referinţe

Abraham, C. & Cho, J. H. Inflammatory Bowel Disease. New England Journal of Medicine 361, 2066-2078 (2009).

Adams, D. H. & Eksteen, B. Aberrant homing of mucosal T cells and extra-intestinal manifestations of inflammatory bowel disease. Nat. Rev. Immunol. 6, 244-251 (2006).

Agace, W. W. Tissue-tropic effector T cells: generation and targeting opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 682-692 (2006). Albuquerque AS, Cortesão CS, Foxall RB, Soares RS, Victorino RM, Sousa AE. Rate of increase in circulating IL-7 and loss of IL-7Ralpha expression differ in HIV-1 and HIV-2 infections: two lymphopenic diseases with similar hyperimmune activation but distinct outcomes. J Immunol. 2007 Mar 1;178(5):3252-9. PubMed PMID: 17312174.

Baumgart, D. C. & Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet 380, 1590-1605 (2012).

Broux, B., Hellings, N., Venken, K., Rummens, J.-L., Hensen, K., Van Wijmeersch, B., and Stinissen, P. (2010). Haplotype 4 of the multiple sclerosis-associated interleukin-7 receptor alpha gene influences the frequency of recent thymic emigrants. Genes Immun. 11, 326-333.

Chothia, C., and Lesk, A.M. (1987). Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 196, 901-917.

Chothia C, Lesk AM, Gherardi E, Tomlinson IM, Walter G, Marks JD, Llewelyn MB, Winter G. Structural repertoire of the human VH segments. J Mol Biol. 1992 Oct 5;227(3):799-817.

Clark LA, Demarest SJ, Eldredge J, Jarpe MB, Li Y, Simon K, van Vlijmen HW. Influence of canonical structure determining residues on antibody affinity and stability. J Struct Biol. 2014 Feb;185(2):223-7. doi: 10.1016/j.jsb.2013.08.009. PubMed PMID: 23994046

Danese, S. & Fiocchi, C. Ulcerative colitis. N. Engl. J. Med. 365, 1713-1725 (2011).

Denucci, C.C., Mitchell, J.S., şi Shimizu, Y. (2009). Integrin function in T-cell homing to lymphoid and nonlymphoid sites: getting there and staying there. Crit. Rev. Immunol. 29, 87-109.

Feagan, B. G. şi colab. Vedolizumab as Induction and Maintenance Therapy for Ulcerative Colitis. New England Journal of Medicine 369, 699-710 (2013).

Deshpande, P., Cavanagh, M.M., Le Saux, S., Singh, K., Weyand, C.M., şi Goronzy, J.J. (2013). IL-7- and IL-15-mediated TCR sensitization enables T cell responses to self-antigens. J. Immunol. Baltim. Md 1950 190, 1416-1423.

Dunham, J., Lee, L.-F., Driel, N. van, Laman, J.D., Ni, I., Zhai, W., Tu, G.-H., Lin, J.C., Bauer, J., Hart, B.A. 't, şi colab. (2016). Blockade of CD127 Exerts a Dichotomous Clinical Effect in Marmoset Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Neuroimmune Pharmacol. 11, 73-83.

Fleming, H.E., şi Paige, C.J. (2001). Pre-B Cell Receptor Signaling Mediates Selective Response to IL-7 at the Pro-B to Pre-B Cell Transition via an ERK/MAP Kinase-Dependent Pathway. Immunity 15, 521-531.

Gorfu, G., Rivera-Nieves, J., şi Ley, K. (2009). Role of beta7 integrins in intestinal lymphocyte homing and retention. Curr. Mol. Med. 9, 836-850.

Haas, J., Korporal, M., Schwarz, A., Balint, B., şi Wildemann, B. (2011). The interleukin-7 receptor α chain contributes to altered homeostasis of regulatory T cells in multiple sclerosis. Eur. J. Immunol. 41, 845-853.

Haudebourg, T., Poirier, N., şi Vanhove, B. (2009). Depleting T-cell subpopulations in organ transplantation. Transpl. Int. Off. J. Eur. Soc. Organ Transplant. 22, 509-518.

He, R., şi Geha, R.S. (2010). Thymic stromal lymphopoietin. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1183, 13-24.

Henriques, C.M., Rino, J., Nibbs, R.J., Graham, G.J., şi Barata, J.T. (2010). IL-7 induces rapid clathrin-mediated internalization and JAK3-dependent degradation of IL-7Ralpha in T cells. Blood 115, 3269-3277.

Kabat, E.A., Wu, T.T., Reid-Miller, M., Perry, H.M. şi Gottesman, K.S. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest (DIANE publishing, 1992).

Kern, B., Kraynov, E., Lee, L.-F., Ray, R. (2013). Receptor occupancy and internalization of an anti-IL-7 receptor antibody. Cytokine 63, 276-277.

Kern B, Li W, Bono C, Lee LF, Kraynov E. Receptor occupancy and blocking of STAT5 signaling by an anti-IL-7 receptor α antibody in cynomolgus monkeys. Cytometry B Clin Cytom. 2016 Mar;90(2):191-8.

Khor, B., Gardet, A. & Xavier, R. J. Genetics and pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature 474, 307-317 (2011).

Lei, L., Zhang, Y., Yao, W., Kaplan, M.H., şi Zhou, B. (2011). Thymic Stromal Lymphopoietin Interferes with Airway Tolerance by Suppressing the Generation of Antigen-Specific Regulatory T Cells. J. Immunol. 186, 2254-2261.

Mazzucchelli, R., Hixon, J.A., Spolski, R., Chen, X., Li, W.Q., Hall, V.L., Willette-Brown, J., Hurwitz, A.A., Leonard, W.J., şi Durum, S.K. (2008). Development of regulatory T cells requires IL-7Ralpha stimulation by IL-7 or TSLP. Blood 112, 3283-3292.

McElroy CA, Dohm JA, Walsh ST. Structural and biophysical studies of the human IL-7/IL-7Ralpha complex. Structure. 2009 Jan 14;17(1):54-65. doi: 10.1016/j.str.2008.10.019.

McElroy CA, Holland PJ, Zhao P, Lim JM, Wells L, Eisenstein E, Walsh ST. Structural reorganization of the interleukin-7 signaling complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Feb 14;109(7):2503-8. doi: 10.1073/pnas.1116582109

Michel, L., Berthelot, L., Pettrй, S., Wiertlewski, S., Lefrиre, F., Braudeau, C., Brouard, S., Soulillou, J.-P., and Laplaud, D.-A. (2008). Patients with relapsing-remitting multiple sclerosis have normal Treg function when cells expressing IL-7 receptor alpha-chain are excluded from the analysis. J. Clin. Invest. 118, 3411-3419.

Planell N, Lozano JJ, Mora-Buch R, Masamunt MC, Jimeno M, Ordбs I, Esteller M, Ricart E, Piquй JM, Panes J, Salas A. Transcriptional analysis of the intestinal mucosa of patients with ulcerative colitis in remission reveals lasting epithelial cell alterations. Gut. 2013 Jul;62(7):967-76. doi: 10.1136/gutjnl-2012-303333

Racapй, M., Vanhove, B., Soulillou, J.-P., şi Brouard, S. (2009). Interleukin 7 receptor alpha as a potential therapeutic target in transplantation. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz.) 57, 253-261.

Reche PA, Soumelis V, Gorman DM, Clifford T, Liu Mr, Travis M, Zurawski SM, Johnston J, Liu YJ, Spits H, de Waal Malefyt R, Kastelein RA, Bazan JF. Human thymic stromal lymphopoietin preferentially stimulates myeloid cells. J Immunol. 2001 Jul 1;167(1):336-43

Roan, F., Bell, B.D., Stoklasek, T.A., Kitajima, M., Han, H., şi Ziegler, S.F. (2012). The multiple facets of thymic stromal lymphopoietin (TSLP) during allergic inflammation and beyond. J. Leukoc. Biol. 91, 877-886.

Rochman, Y., Kashyap, M., Robinson, G.W., Sakamoto, K., Gomez-Rodriguez, J., Wagner, K.-U., şi Leonard, W.J. (2010). Thymic stromal lymphopoietin-mediated STAT5 phosphorylation via kinases JAK1 and JAK2 reveals a key difference from IL-7-induced signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 19455-19460.

Sandborn, W. J. şi colab. Vedolizumab as Induction and Maintenance Therapy for Crohn's Disease. New England Journal of Medicine 369, 711-721 (2013).

Shochat C, Tal N, Bandapalli OR, Palmi C, Ganmore I, te Kronnie G, Cario G, Cazzaniga G, Kulozik AE, Stanulla M, Schrappe M, Biondi A, Basso G, Bercovich D, Muckenthaler MU, Izraeli S. Gain-of-function mutations in interleukin-7 receptor-α (IL7R) in childhood acute lymphoblastic leukemias. J Exp Med. 2011 May 9;208(5):901-8. doi: 10.1084/jem.20110580. Erratum in: J Exp Med. 2011 May 9;208(5):preceding 901. J Exp Med. 2011 Jun 6;208(6):1333

Taylor, B.C., Zaph, C., Troy, A.E., Du, Y., Guild, K.J., Comeau, M.R., şi Artis, D. (2009). TSLP regulates intestinal immunity and inflammation in mouse models of helminth infection and colitis. J. Exp. Med. 206, 655-667.

Van Bodegom, D., Zhong, J., Kopp, N., Dutta, C., Kim, M.-S., Bird, L., Weigert, O., Tyner, J., Pandey, A., Yoda, A., şi colab. (2012). Differences in signaling through the B-cell leukemia oncoprotein CRLF2 in response to TSLP and through mutant JAK2. Blood 120, 2853-2863.

Verstraete, K., Peelman, F., Braun, H., Lopez, J., Van Rompaey, D., Dansercoer, A., Vandenberghe, I., Pauwels, K., Tavernier, J., Lambrecht, B.N., şi colab. (2017). Structure and antagonism of the receptor complex mediated by human TSLP in allergy and asthma. Nat. Commun. 8.

Walsh ST. Structural insights into the common γ-chain family of cytokines and receptors from the interleukin-7 pathway. Immunol Rev. 2012 Nov;250(1):303-16

Watanabe, M., Ueno, Y., Yajima, T., Okamoto, S., Hayashi, T., Yamazaki, M., Iwao, Y., Ishii, H., Habu, S., Uehira, M., şi colab. (1998). Interleukin 7 transgenic mice develop chronic colitis with decreased interleukin 7 protein accumulation in the colonic mucosa. J. Exp. Med. 187, 389-402.

Watanabe, N., Wang, Y.-H., Lee, H.K., Ito, T., Wang, Y.-H., Cao, W., şi Liu, Y.-J. (2005a). Hassall's corpuscles instruct dendritic cells to induce CD4+CD25+ regulatory T cells in human thymus. Nature 436, 1181-1185.

Wong, H.-L., Pfeiffer, R.M., Fears, T.R., Vermeulen, R., Ji, S., şi Rabkin, C.S. (2008). Reproducibility

Ying, S., O'Connor, B., Ratoff, J., Meng, Q., Fang, C., Cousins, D., Zhang, G., Gu, S., Gao, Z., Shamji, B., şi colab. (2008). Expression and cellular provenance of thymic stromal lymphopoietin and chemokines in patients with severe asthma and chronic obstructive pulmonary disease. J. Immunol. Baltim. Md 1950 181, 2790-2798.

Zhi, K., Li, M., Zhang, X., Gao, Z., Bai, J., Wu, Y., Zhou, S., Li, M., şi Qu, L. (2014). α4β7 Integrin(LPAM-1) is upregulated at atherosclerotic lesions and is involved in atherosclerosis progression. Cell. Physiol. Biochem. Int. J. Exp. Cell. Physiol. Biochem. Pharmacol. 33, 1876-1887

Zhong, J., Sharma, J., Raju, R., Palapetta, S.M., Prasad, T.S.K., Huang, T.-C., Yoda, A., Tyner, J.W., van Bodegom, D., Weinstock, D.M., şi colab. (2014). TSLP signaling pathway map: a platform for analysis of TSLP-mediated signaling. Database J. Biol. Databases Curation 2014, bau007.

LISTA SECVENŢELOR

<110> IME IMUNOTERAPEUTICA

<120> Anticorpi şi polipeptide îndreptate împotriva CD127

<130> B12201A

<150> EP 16306655.8 <151> 2016-12-09

<160> 96

<170> Brevet În versiunea 3.5

<210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 1

<210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 2

Gly

<210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 3

<210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 4

<210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 5

<210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 6

<210> 7 <211> 122 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 7

<210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 8

<210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 9

<210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 10

<210> 11 <211> 107 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 11

<210> 12 <211> 107 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 12

<210> 13 <211> 366 <212> ADN <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 13

<210> 14 <211> 321 <212> ADN <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 14

<210> 15 <211> 321 <212> ADN <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 15

<210> 16 <211> 321 <212> ADN <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 16

<210> 17 <211> 321 <212> ADN <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 17

<210> 18 <211> 321 <212> ADN <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 18

<210> 19 <211> 31 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 19

<210> 20 <211> 31 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 20

<210> 21 <211> 459 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 21

<210> 22 <211> 219 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 22

<210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 23

<210> 24 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 24

<210> 25 <211> 4 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 25

<210> 26 <211> 327 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 26

<210> 27 <211> 107 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 27

<210> 28 <211> 106 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 28

<210> 29 <211> 984 <212> ADN <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 29

<210> 30 <211> 325 <212> ADN <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 30

<210> 31 <211> 322 <212> ADN <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 31

<210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 32

<210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 33

<210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 34

<210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 35

<210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 36

<210> 37 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 37

<210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 38

<210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 39

<210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 40

<210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 41

<210> 42 <211> 5 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 42

<210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 43

<210> 44 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 44

<210> 45 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 45

<210> 46 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 46

<210> 47 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 47

<210> 48 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 48

<210> 49 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 49

<210> 50 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 50

<210> 51 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 51

<210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 52

<210> 53 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 53

<210> 54 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 54

<210> 55 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 55

<210> 56 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 56

<210> 57 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 57

<210> 58 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 58

<210> 59 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 59

<210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 60

<210> 61 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 61

<210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 62

<210> 63 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 63

<210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 64

<210> 65 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 65

<210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 66

<210> 67 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 67

<210> 68 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 68

<210> 69 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 69

<210> 70 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 70

<210> 71 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 71

<210> 72 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 72

<210> 73 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 73

<210> 74 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 74

<210> 75 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 75

<210> 76 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 76

<210> 77 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 77

<210> 78 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 78

<210> 79 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 79

<210> 80 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 80

<210> 81 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 81

<210> 82 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 82

<210> 83 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 83

<210> 84 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 84

<210> 85 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 85

<210> 86 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 86

<210> 87 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 87

<210> 88 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 88

<210> 89 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 89

<210> 90 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 90

<210> 91 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 91

<210> 92 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 92

<210> 93 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 93

<210> 94 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 94

<210> 95 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 95

<210> 96 <211> 8 <212> PRT <213> Secvenţă artificială

<220> <223> Secvenţă sintetică

<400> 96

Claims (15)

1. Un anticorp sau un fragment al acestuia care leagă antigenul, care se leagă în mod specific de CD127, în special de CD127 uman, cuprinzând: - un lanţ uşor al anticorpului care cuprinde sau un domeniu variabil al lanţului uşor al anticorpului constând dintr-o secvenţă selectată din grupul constând din SECV ID Nr: 9; SECV ID Nr: 10; SECV ID Nr: 11; SECV ID Nr: 12; în special SECV ID Nr: 12; şi - un domeniu variabil al lanţului greu de anticorpi constând din secvenţa stabilită în SECV ID Nr: 7.

2. Anticorp sau fragment de legare a antigenului acestuia conform revendicării 1, în care anticorpul menţionat este un anticorp monoclonal umanizat, în special în care domeniul constant al lanţului uşor al anticorpului este derivat dintr-un domeniu constant al lanţului uşor kappa uman, în special în care domeniul constant al lanţului uşor constă din secvenţa SECV ID Nr: 27 sau 28, şi în care domeniul constant al lanţului greu al anticorpului este derivat dintr-un domeniu constant al lanţului greu IgG1, IgG2, IgG3 sau IgG4 uman, în special dintr-un domeniu constant al lanţului greu IgG4 uman, în special în care domeniul constant al lanţului greu al anticorpului constă din secvenţa cu SECV ID Nr: 26.

3. Anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului acestuia conform revendicării 1 sau 2, în care lanţul uşor al anticorpului cuprinde sau, domeniul variabil al lanţului uşor al anticorpului constă din SECV ID Nr: 12.\tab

4. Anticorp sau fragment de legare a antigenului acestuia conform oricăreia dintre revendicările 1 la 3, care este un antagonist al semnalizării de IL-7R indus de IL-7 şi care nu induce activarea fosfatidilinozitol 3-kinazei şi / sau a căii de semnalizare ERK.\tab

5. Anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului acestuia conform oricăreia dintre revendicările 1 la 4, care recunoaşte un epitop cuprinzând o secvenţă preluată de la situsul 2b al CD127 şi / sau perturbă legarea de CD127 la lanţul comun yc al receptorilor de citokine, în special care a recunoscut cel puţin a treia foaie beta a situsului 2b de CD 127.\tab

6. Anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului acestuia conform oricăreia dintre revendicările 1 la 5, care nu induce internalizarea de CD127 şi / sau inhibă internalizarea indusă de IL7 a lui CD127.\tab

7. Anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului acestuia conform oricăreia dintre revendicările 1 la 6, care nu măreşte maturarea celulelor dendritice indusă de TSLP.\tab

8. Anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului acestuia conform oricăreia dintre revendicările 1 la 7, care are un efect de lungă durată şi / sau un efect rapid, în special care are un efect local rapid.\tab 9. Anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului acestuia conform oricăreia dintre revendicările 1 la 8, care se leagă în mod specific la CD127 uman cu o constantă de afinitate KD mai mică de 5E-

9 M, după cum se poate determina prin analiza biosenzorului.

10. Combinaţie de molecule de acid nucleic izolate care codifică un anticorp sau un fragment de legare a antigenului acestuia conform oricăreia dintre revendicările de la 1 la 9, în special o primă moleculă de acid nucleic izolată care cuprinde sau constă dintr-o secvenţă selectată din grupul constând din SECV ID Nr: 15, SECV ID Nr: 16, SECV ID Nr: 17 şi SECV ID Nr: 18; şi o a doua moleculă de acid nucleic izolată cuprinzând sau constând din secvenţa SECV ID Nr: 13.\tab

11. Compoziţie farmaceutică cuprinzând anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului acestuia conform oricăreia dintre revendicările 1 la 9 şi / sau combinaţia de molecule izolate de acid nucleic conform revendicării 10 şi un vehicul farmaceutic.\tab

12. Compoziţie farmaceutică conform revendicării 11, care este adecvată pentru administrare locală, în special pentru administrare locală subcutanată, enterică sau orală, mai ales pentru livrare în colon.\tab

13. Kit care cuprinde o compoziţie farmaceutică conform revendicării 11 sau revendicării 12 şi un dispozitiv de administrare adecvat pentru administrare locală, în special un dispozitiv de administrare subcutanată, enterică sau orală, dispozitivul menţionat cuprinzând mai ales o seringă preumplută sau un dispozitiv fără ac.\tab

14. Anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului acestuia conform oricăreia dintre revendicările 1 la 9, sau combinaţia de molecule izolate de acid nucleic conform revendicării 10 sau compoziţia farmaceutică conform revendicării 11 sau 12, pentru utilizare ca medicament.\tab

15. Anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului acestuia conform oricăreia dintre revendicările 1 la 9, sau combinaţia de molecule izolate de acid nucleic conform revendicării 10 sau compoziţia farmaceutică conform revendicării 11 sau 12, pentru utilizare conform revendicării 14 în prevenirea sau tratamentul respingerii transplantului de organe sau de ţesuturi, sau a unei boli selectate din grupul format din boli autoimune, în special poliartrită reumatoidă, scleroză sistemică, scleroză multiplă, diabet de tip I, tiroidită autoimună, lupus eritematos sistemic, sindrom sjцgren primar şi boli inflamatorii, în special boală inflamatorie intestinală (IBD), mai ales boala Crohn şi colită ulcerativă, şi encefalomielită şi boli alergice şi boli canceroase, şi boli legate de transplant şi boli respiratorii.