MD3350223T2

MD3350223T2 - Anticorpi care se leagă specific la TL1A

Info

Publication number: MD3350223T2
Application number: MDE20180714T
Authority: MD
Inventors: Lynn Dorothy Poulton; Matthew Pollard; Anthony G Doyle; Bridget Ann Cooksey; Vanya Pande; Adam William Clarke
Original assignee: Cephalon Inc
Priority date: 2015-09-18
Filing date: 2016-09-16
Publication date: 2020-09-30
Also published as: TW201722990A; EP3350223B1; EP3350223A1; RS60703B1; CA2997015A1; CN108137693A; US10138296B2; IL257761B2; TWI703158B; PT3350223T; BR112018005407A2; MA52643A; BR122021002400A8; IL257761A; HRP20201323T1; SMT202000500T1; DK3350223T3; JP2018528773A; PH12018500580B1; US20220185902A1

Abstract

Sunt dezvăluiţi anticorpii variaţi exprimaţi recombinant care au afinitate crescută pentru TL1A şi potenţă crescută în comparaţie cu anticorpul mamă de la care au fost obţinuţi. Anticorpii inhibă interacţiunea dintre TL1A şi receptorul de deces 3 (DR3). Anticorpii sau compoziţia lor pot fi folosiţi pentru a trata unul sau mai multe dintre următoarele: astm, BPOC, fibroză pulmonară, fibroză chistică, boală inflamatorie a intestinului, boală gastrointestinală asociată cu fibroză chistică, boala Crohn, colită, colită ulceroasă, sindrom de colon iritabil. , esofagită eozinofilică, dermatită atopică, eczemă, sclerodermie, artrită sau artrită reumatoidă.

Description

TRIMITERE LA O LISTĂ DE SECVENŢE

Această cerere include o listă de secvenţe depusă electronic ca fişier text denumit TL1A_ST25, creat pe 18 septembrie 2015 cu o dimensiune de 89.000 de octeţi. Lista de secvenţe face parte din descrierea brevetului.

DOMENIUL INVENTIEI

Această dezvăluire se referă în general la domeniul ingineriei anticorpilor. Mai specific, această dezvăluire se referă la variante de anticorpi care se leagă în mod specific la TL1A şi care inhibă interacţiunea dintre TL1A şi receptorul de deces 3 (DR3). În unele aspecte, anticorpii inhibă, de asemenea, interacţiunea dintre TL1A şi receptorul capcană 3 (DcR3). Anticorpii au o putere îmbunătăţită în raport cu anticorpul părinte de la care au fost derivate variantele.

BAZELE INVENŢIEI

Ligandul 1A similar TNF (TL1A, syn. membru 15 al superfamiliei TNF (TNFSF15); TL1 şi VEGI) este un membru al superfamiliei factorului de necroză tumorală, care este exprimat de celulele prezentatoare de antigen (incluzând celule dendritice, celule B şi macrofage), celule T CD4+ şi CD8+ şi celule endoteliale. TL1A poate fi exprimat pe suprafaţa celulei sau secretat ca o citokină solubilă. Receptorul pentru TL1A, Receptor de deces 3 (DR3) este exprimat de o varietate de celule, incluzând celule T CD4+ şi CD8+, celule NK, celule NKT şi celule T (Treg) care reglează FOXP3+ şi celule limfoide înnăscute de tip 2 şi tip 3 (ILC2 şi ILC3).

TL1A poate lega, de asemenea, un receptor capcană (DcR3), care este un inhibitor competitiv al DR3. DcR3 acţionează, de asemenea, ca receptor capcană pentru un ligand de Fas (Fas-L) şi proteină inductibilă asemănătoare limfotoxinei care concurează cu glicoproteina D pentru legarea mediatorului de intrare a herpesvirusului pe celulele T (LIGHT). Prin urmare, DcR3 este un agent de reglare important al mai multor căi de transducţie a semnalului.

Calea de semnalizare TL1A/DR3 a fost implicată în mai multe sisteme biologice, care sunt asociate cu boli umane. De exemplu, s-a demonstrat că TL1A joacă un rol în imunitatea, angiogeneza şi homeostaza a ţesuturilor de barieră. De asemenea, s-a demonstrat că inhibarea interacţiunii TL1A cu DR3 promovează un beneficiu terapeutic în mai multe stări mediate imun, cum ar fi encefalomielita autoimună experimentală (EAE; un model de scleroză multiplă), colita, colita ulceroasă, boala Crohn, boala inflamatorie intestinală, boala de piele, astmul şi artrita.

În consecinţă, compuşii care inhibă activitatea TL1A sunt de dorit, de exemplu, pentru utilizările lor terapeutice, profilactice, diagnostice şi prognostice.

REZUMATUL INVENŢIEI

Prezenta invenţie se referă la un anticorp recombinant aşa cum este definit în revendicări. Este descris în prezenta un anticorp recombinant care cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 15, o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 28, o regiune variabilă a lanţului greu CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 17, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 29, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 19, şi o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 30, cu condiţia ca, atunci când regiunea variabilă a lanţului greu cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1, regiunea variabilă a lanţului uşor nu cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2.

În unele aspecte, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 16, şi o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 22. În unele aspecte, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 21, şi o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 20. În unele aspecte, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 16, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 23, şi o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 22. În unele aspecte, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 16, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 24, şi o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 22. În unele aspecte, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 16, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 25, şi o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 22. În unele aspecte, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 16, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 26, şi o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 22. În unele aspecte, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 21 şi o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 22. În unele aspecte, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 21, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 24, şi o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 22. În unele aspecte, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 21, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 25, şi o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 22. În unele aspecte, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 21, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 26, şi o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 22. În unele aspecte, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 21, şi o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 27.

Prezenta invenţie este un anticorp recombinant care se leagă specific la TL1A care cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 4.

De asemenea este redat aici un anticorp recombinant (conform prezentei invenţii şi celor descrise aici) care cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 sau SECV ID NR: 3 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 14, cu condiţia ca, atunci când regiunea variabilă a lanţului greu cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1, regiunea variabilă a lanţului uşor nu cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2. În unele aspecte, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1, şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 4. În unele aspecte, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3, şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2. În unele aspecte, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1, şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 5. În unele aspecte, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1, şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 6. În unele aspecte, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1, şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 7. În unele aspecte, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1, şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 8. În conformitate cu invenţia, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3, şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 4. În unele aspecte, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3, şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 6. În unele aspecte, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3, şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 7. În unele aspecte, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3, şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 8. În unele aspecte, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3, şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 10.

Anticorpul din prezenta invenţie cuprinde un lanţ greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 60 şi un lanţ uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 61.

Astfel de anticorpi recombinanţi (din prezenta invenţie şi cei descrişi aici) sunt preferabil cu lungime întreagă, şi sunt preferabil monoclonali. Astfel de anticorpi recombinanţi se leagă la TL1A cu afinitate crescută în raport cu un anticorp având o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2. Astfel de anticorpi recombinanţi au o putere crescută în raport cu un anticorp având o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2. Potenţa crescută poate fi de cel puţin aproximativ 10-ori mai mare în raport cu potenţa unui anticorp având o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2. Potenţa crescută poate fi de cel puţin aproximativ 12-ori mai mare în raport cu potenţa unui anticorp având o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2. Potenţa crescută poate fi de cel puţin aproximativ 13-ori mai mare în raport cu potenţa unui anticorp având o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2. Potenţa crescută poate fi de cel puţin aproximativ 15-ori mai mare în raport cu potenţa unui anticorp având o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2. Potenţa crescută poate fi de cel puţin aproximativ 20-ori mai mare în raport cu potenţa unui anticorp având o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2. Potenţa crescută poate fi de cel puţin aproximativ 25-ori mai mare în raport cu potenţa unui anticorp având o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2. Potenţa crescută poate fi de cel puţin aproximativ 27-ori mai mare în raport cu potenţa unui anticorp având o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2. Potenţa crescută poate fi de cel puţin aproximativ 40-ori mai mare în raport cu potenţa unui anticorp având o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2. Creşterea ca număr de ori a potenţei poate fi determinată conform cu o analiză de putere a caspazei în celule TF-1 indusă de TL1A.

Astfel de anticorpi recombinanţi pot cuprinde o regiune constantă a lanţului greu de IgG1 uman, o regiune constantă a lanţului greu de IgG2 uman, sau o regiune constantă a lanţului greu de IgG4 uman, sau oricare alotipuri ale acestora. Regiunea constantă a lanţului greu de IgG1 uman poate cuprinde SECV ID NR: 42, sau SECV ID NR: 43 (IgG1 uman ΔK), sau SECV ID NR: 44 (IgG1 uman cu YTE), sau SECV ID NR: 64 (IgG1 uman cu YTE şi ΔK), sau SECV ID NR: 63 (IgG1 uman cu L234A, L235A, G237A) sau SECV ID NR: 62 (IgG1 uman cu L234A, L235A, G237A şi ΔK), sau SECV ID NR: 65 (IgG1 uman cu L235A şi G237A) sau SECV ID NR: 66 (IgG1 uman cu L235A, G237A şi ΔK). Regiunea constantă a lanţului greu de IgG2 uman poate cuprinde SECV ID NR: 67, sau SECV ID NR: 70 (IgG2 uman ΔK), sau SECV ID NR: 71 (IgG2 uman cu A330S, P331S), sau SECV ID NR: 68 (IgG2 uman cu A330S, P331S şi ΔK). Regiunea constantă a lanţului greu de IgG4 uman poate cuprinde SECV ID NR: 45, sau SECV ID NR: 46 (IgG4 uman cu S228P şi ΔK), sau SECV ID NR: 47 (IgG4 uman cu S228P şi YTE), sau SECV ID NR: 69 (IgG4 uman cu S228P, YTE şi ΔK). Se va înţelege că un lanţ greu de IgG4 ar putea fi utilizat fără substituţia stabilizatoare S228P (de exemplu, IgG4 numai cu YTE individual, sau IgG4 cu YTE şi ΔK, sau IgG4 numai cu ΔK individual).

Anticorpii recombinanti (conform prezentei invenţii şi cei descrişi aici) pot cuprinde o regiune constantă a lanţului uşor lambda uman sau un alotip al acestuia. Regiunea constantă lambda a lanţului uşor uman poate cuprinde SEQ ID NR: 48.

Astfel de anticorpi recombinanti se leagă de TL1A umană şi se pot lega la TL1A de un primat non-uman sau TL1A de un mamifer non-uman, cum ar fi un şoarece, şobolan, cobai, pisică, câine, iepure sau porc.

Astfel de anticorpi recombinanti pot fi utilizaţi într-o metodă pentru tratarea unei boli a tractului respirator, o metodă pentru tratarea unei boli gastrointestinale, o metodă de tratare a unei boli de piele sau o metodă de tratare a artritei sau pot fi utilizaţi în tratamentul unei boli a tractului respirator, unei boli gastro-intestinale, a unei boli de piele sau a artritei sau poate fi utilizat la fabricarea unui medicament pentru tratamentul unei boli a tractului respirator, a unei boli gastro-intestinale, unei boli de piele sau a artritei. Boala tractului respirator poate cuprinde una sau mai multe dintre astm, boală pulmonară obstructivă cronică (BPOC), fibroză pulmonară, sarcoidoză pulmonară, rinită alergică sau fibroză chistică. Boala gastrointestinală poate cuprinde una sau mai multe dintre boli inflamatorii intestinale, boala Crohn, colită, colită ulceroasă, esofagită eozinofilică sau sindrom de colon iritabil sau o boală sau stare gastrointestinală asociată cu fibroza chistică. Artrita poate cuprinde artrita reumatoidă. Boala de piele poate cuprinde una sau mai multe dintre dermatită atopică, eczemă şi sclerodermie.

Subiecţii umani, subiecţii primate non-umane sau subiecţii mamifere non-umane care au nevoie de astfel de tratamente pot fi trataţi cu anticorpii sau cu o compoziţie care cuprinde anticorpii, de exemplu, prin administrarea anticorpilor sau a compoziţiei acestora la un subiect. Administrarea poate fi parenterală, de exemplu, subcutanată şi/sau intravenoasă.

Astfel de anticorpi recombinanti pot fi utilizaţi intr-o metoda pentru detectarea TL1A la suprafaţa celulelor mononucleare din sânge periferic (PBMC-uri). Metodele cuprind contactarea unui anticorp care se leagă de TL1A aşa cum este descris sau exemplificat aici cu PBMC-uri obţinute de la un subiect şi detectarea anticorpului legat la TL1A pe suprafaţa PBMC-urilor. Metodele pot cuprinde suplimentar cuantificarea nivelului de TL1A pe PBMC-uri. Metodele pot cuprinde suplimentar obţinerea PBMC-urilor de la subiect.

Astfel de anticorpi recombinanti pot fi utilizaţi într-o metodă pentru detectarea TL1A în serul din sânge. Metodele cuprind contactarea unui anticorp care se leagă de TL1A aşa cum este descris sau exemplificat aici cu serul de sânge obţinut de la un subiect şi detectarea anticorpului legat la TL1A în ser. Metodele pot cuprinde suplimentar cuantificarea nivelului de TL1A în serul din sânge. Metodele pot cuprinde suplimentar obţinerea serului din sângele obţinut de la subiect. Metodele pot cuprinde suplimentar obţinerea de sânge de la subiect.

Sunt redate polinucleotide care codifică una sau mai multe dintre o regiune variabile a lanţului greu şi o regiune variabilă a lanţului uşor ale unor astfel de anticorpi (conform prezentei invenţii şi a celor descrise aici). Polinucleotidele pot codifica suplimentar o regiune constantă a lanţului greu şi/sau o regiune constantă a lanţului uşor.

În unele aspecte, o polinucleotidă cuprinde o secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului greu a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3, de exemplu, o secvenţă de acizi nucleici care cuprinde SECV ID NR: 51 sau SECV ID NR: 58. În unele aspecte, polinucleotida cuprinde o secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului uşor a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2, de exemplu, o secvenţă de acizi nucleici care cuprinde SECV ID NR: 50. În unele aspecte, polinucleotida cuprinde o secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului uşor a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 4, de exemplu, o secvenţă de acizi nucleici care cuprinde SECV ID NR: 52 sau SECV ID NR: 59. În unele aspecte, polinucleotida cuprinde o secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului uşor a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 6, de exemplu, o secvenţă de acizi nucleici care cuprinde SECV ID NR: 54. În unele aspecte, polinucleotida cuprinde o secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului uşor a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 7, de exemplu, o secvenţă de acizi nucleici care cuprinde SECV ID NR: 55. În unele aspecte, polinucleotida cuprinde o secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului uşor a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 8, de exemplu, o secvenţă de acizi nucleici care cuprinde SECV ID NR: 56. În unele aspecte, polinucleotida cuprinde o secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului uşor a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 10, de exemplu, o secvenţă de acizi nucleici care cuprinde SECV ID NR: 57.

În unele aspecte, polinucleotida cuprinde o secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului greu a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1, de exemplu, o secvenţă de acizi nucleici care cuprinde SECV ID NR: 49. În unele aspecte, polinucleotida cuprinde o secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului uşor a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 4, de exemplu, o secvenţă de acizi nucleici care cuprinde SECV ID NR: 52. În unele aspecte, polinucleotida cuprinde o secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului uşor a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 5, de exemplu, o secvenţă de acizi nucleici care cuprinde SECV ID NR: 53. În unele aspecte, polinucleotida cuprinde o secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului uşor a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 6, de exemplu, o secvenţă de acizi nucleici care cuprinde SECV ID NR: 54. În unele aspecte, polinucleotida cuprinde o secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului uşor a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 7, de exemplu, o secvenţă de acizi nucleici care cuprinde SECV ID NR: 55. În unele aspecte, polinucleotida cuprinde o secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului uşor a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 8, de exemplu, o secvenţă de acizi nucleici care cuprinde SECV ID NR: 56.

Sunt redaţi vectori care cuprind una sau mai multe astfel de polinucleotide. Sunt redate celule transformate cu una sau mai multe astfel de polinucleotide sau astfel de vectori. Celulele transformate pot fi de mamifere şi de preferinţă sunt celule gazdă de exprimare la un mamifer, cum ar fi celulele CHO, celulele NS0 sau celulele HEK293.

SCURTĂ DESCRIERE A DESENELOR

Figura 1 arată poziţiile şi identităţile fiecăreia dintre substituţiile unice de aminoacizi efectuate în regiunile CDR1 sau CDR2 sau în resturile de aminoacizi selectate adiacent la CDR2 a lanţului greu variabil al anticorpului părinte(320-179). Regiunile în casetă reprezintă CDR-urile conform sistemului de numerotare AbM.

Figura 2 arată poziţiile şi identităţile fiecăreia dintre substituţiile unice de aminoacizi efectuate în regiunile CDR1 sau CDR3 ale lanţului uşor variabil a anticorpului părinte(320-179). Regiunile în casetă reprezintă CDR-urile conform sistemului de numerotare AbM.

Figura 3 arată o aliniere a lanţurilor grele ale variantei anticorpului anti-TL1A.

Figura 4 arată o aliniere a lanţurilor uşoare ale anticorpului de legătură anti-TL1A.

Figura 5 arată o comparaţie a fazei de disociere a TL1A a variantelor anticorpilor anti-TL1A, măsurată prin SPR.

Figura 6 arată rezultatele analizelor de putere a caspazei celulelor TF-1 cu variante ale anticorpilor TL1A.

Figura 7 prezintă rezultatele analizelor de putere a caspazei celulelor TF-1 folosind diferiţi anticorpi TL1A în comparaţie cu anticorpul părinte, 320-179.

Figura 8 arată că anticorpul 320-587 are o putere TL1A superioară într-o analiză de putere a caspazei celulelor TF-1, comparativ cu alţi anticorpi anti-TL1A publicaţi, în mai multe experimente diferite.

Figura 9 arată diferiţi anticorpi anti-TL1A care inhibă legarea TL1A la DR3, în comparaţie cu un izotip martor măsurat în format ELISA.

Figura 10 arată că anticorpul părinte, 320-179, nu inhibă legarea TL1A la DcR3 în timp ce varianta ale anticorpilor anti-TL1A inhibă interacţiunea TL1A-DcR3.

Figura 11 arată că anticorpul 320-587 reacţionează încrucişat şi se leagă la TL1A de diferite specii; anticorpul legat de TL1A de la toate speciile testate.

Figura 12 arată rezultatele administrării anticorpului 320-587 la un model de colită indusă de TNBS la şobolan, demonstrând că anticorpul ameliorează semnificativ simptomele colitei

Figura 13 arată că anticorpul 320-587 detectează TL1A umană secretată din PBMC-uri umane stimulate cu complecşi imuni, într-un test ELISA.

Figura 14 arată că anticorpul 320-587 detectează o populaţie de PBMC-uri umane care exprimă membrana TL1A pe suprafaţa lor, într-un test de citometrie în flux.

Figura 15 arată că şobolanii cu astm acut indus de OVA trataţi cu anticorp 320-587 au eozinofile reduse semnificativ în lichidul de lavaj bronhoalveolar (BALF).

Figurile 16A la 16D arată tratamentul la cobai cu astm acut indus de OVA trataţi cu anticorp 320-587 au avut îmbunătăţiri ale (fig. 16A) eozinofilelor BALF, (Fig. 16B) macrofagelor BALF, (Fig. 16C) hipersensibilităţii căilor aeriene după reacţie astmatică precoce şi (Fig. 16D) magnitudinii reacţiei astmatice precoce.

Figurile 17A la 17E arată tratamentul şobolanilor cu astm cronic indus de OVA trataţi cu anticorp 320-587 au avut îmbunătăţiri ale (fig. 17A) eozinofilelor BALF, (fig. 17B) macrofagelor BALF, (fig. 17C) BALF IL-13, ( Fig. 17D) hiperplaziei cu celule goblet, aşa cum au fost evaluate prin reactivitatea PAS şi (Fig. 17E) îngroşarea mucoasei, aşa cum a fost evaluată din secţiuni colorate cu H&E.

Figura 18 ilustrează doza de ovalbumină necesară obstrucţiei căilor respiratorii duble.

Figura 19 arată că tratamentul şobolanilor cu colită indusă de TNBS tratată cu anticorp 320-587 a avut îmbunătăţiri ale fibrozei din zona ulcerului.

Figurile 20A la 20E arată o comparaţie a şobolanilor având colită indusă de TNBS cu colită indusă de DNBS, tratată cu anticorp 320-587 şi a efectelor la 7 şi 14 zile, pe raportul greutate/lungime al colonului (Fig. 20A), (Fig. 20B) fibroza colonului (Fig. 20C) infiltratului în colon şi (Fig. 20D) distrugerii colonului. Fig. 20E arată secţiuni reprezentative ale zonei ulcerului la 7 şi 14 zile.

Figurile 21A la 21C arată tratamentul şobolanilor care au tratament pentru colita indusă de DSS cu anticorp 320-587 au avut îmbunătăţiri în (Fig. 21A) modificarea greutăţii în timpul administrării DSS, (Fig. 21B) scorul clinic în timpul administrării DSS şi (Fig. 21C) raportul dintre greutatea şi lungimea colonului

Figura 22 prezintă modificări ale citokinelor intraperitoneale induse de TL1A ca răspuns la tratamentul cu 320-587.

DESCRIEREA DETALIATĂ A INVENŢIEI

Pe parcursul descrierii şi a revendicărilor sunt utilizaţi mai mulţi termeni referitori la unele aspecte ale dezvăluirii. Astfel de termeni trebuie să li se atribuie sensul obişnuit în domeniu, cu excepţia cazului în care se indică altfel. Alţi termeni definiţi în mod specific trebuie să fie interpretaţi într-o manieră în concordanţă cu definiţia dată aici.

Termenii ʺsubiectʺ şi ʺpacientʺ sunt utilizaţi în mod interschimbabil şi includ orice animal. Mamiferele sunt preferate, incluzând mamifere de companie (de exemplu, pisică, câine) şi mamiferele de fermă (de exemplu, porc, cal, vacă), precum şi rozătoare, inclusiv şoareci, iepuri şi şobolani, cobai şi alte rozătoare. Primatele non-umane, cum ar fi maimuţele cynomolgus, sunt mai preferate, iar fiinţele umane sunt deosebit de preferate.

O moleculă precum un anticorp a fost "izolată" dacă a fost modificată şi/sau scoasă din mediul său natural de mâna unei fiinţe umane.

Aşa cum se utilizează aici, formele singulare ʺunʺ, ʺoʺ, şi ʺ-ulʺ includ referirile la plural, cu excepţia cazului în care se specifică în mod expres altfel.

"Specificitate" în contextul interacţiunilor anticorp-antigen nu este în mod necesar o denumire absolută, ci poate constitui un termen relativ care semnifică gradul de selectivitate a unui anticorp pentru o celulă antigen-pozitivă comparativ cu o celulă antigen-negativă. Specificitatea unui anticorp pentru o celulă antigen-pozitivă este mediată de regiunile variabile ale anticorpului şi, de obicei, de regiunile determinante ale complementarităţii (CDR-uri) ale anticorpului. Un construct poate avea de la aproximativ 100 până la aproximativ 1000 de ori specificitate pentru celulele antigen-pozitive în comparaţie cu celulele antigen-negative.

Aşa cum este utilizat aici, termenul "recombinant" include expresia de la gene obţinute prin inginerie genetică sau în alt mod prin manipulare de laborator.

Dezvăluirea redă variante ale anticorpilor anti-TL1A cuprinzând o regiune variabilă a lanţului greu şi/sau a lanţului uşor a anticorpului 320-179 modificat recombinant, care variante de anticorpi se leagă în mod specific la TL1A. Aceste variante ale anticorpului 320-179 inhibă capacitatea TL1A de a interacţiona cu DR3 şi, în unele aspecte, de asemenea, cu DcR3 şi, inhibă în plus semnalizarea indusă de interacţiunea TL1A cu DR3. Aceşti anticorpi au o putere crescută în raport cu anticorpul 320-179. Aceşti anticorpi au o afinitate crescută pentru TL1A în raport cu anticorpul 320-179.

Potenţa crescută poate fi de cel puţin aproximativ 10-ori mai mare în raport cu potenţa unui un anticorp având o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2. Potenţa crescută poate fi de cel puţin aproximativ 12-ori mai mare în raport cu potenţa unui anticorp având o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2. Potenţa crescută poate fi de cel puţin aproximativ 13-ori mai mare în raport cu potenţa unui anticorp având o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2. Potenţa crescută poate fi de cel puţin aproximativ 15-ori mai mare în raport cu potenţa unui anticorp având o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2. Potenţa crescută poate fi de cel puţin aproximativ 20-ori mai mare în raport cu potenţa unui anticorp având o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2. Potenţa crescută poate fi de cel puţin aproximativ 25-ori mai mare în raport cu potenţa unui anticorp având o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2. Potenţa crescută poate fi de cel puţin aproximativ 27-ori mai mare în raport cu potenţa unui anticorp având o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2. Potenţa crescută poate fi de cel puţin aproximativ 40-ori mai mare în raport cu potenţa unui anticorp având o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2. Creşterea ca număr de ori a potenţei poate fi determinată, de exemplu, prin măsurarea eliberării caspazei în apoptoza indusă de TL1A într-o analiză de celule TF-1.

Variantele de anticorpi 320-179 (din prezenta invenţie şi cei descrişi aici) sunt exprimaţi recombinant, şi se leagă specific la TL1A. Anticorpul părinte, 320-179, cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2. În unele aspecte, o variantă a anticorpului 320-179 cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 sau SECV ID NR: 3 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 14, cu condiţia ca, atunci când regiunea variabilă a lanţului greu cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1, regiunea variabilă a lanţului uşor nu cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2. Varianta anticorpului 320-179 este capabilă să inhibe interacţiunea dintre TL1A şi DR3. Varianta anticorpului 320-179 are o putere crescută în raport cu anticorpul 320-179 şi/sau are o afinitate crescută pentru TL1A în raport cu anticorpul 320-179.

În unele aspecte, regiunea variabilă a lanţului greu cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1, şi regiunea variabilă a lanţului uşor cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 4. În unele aspecte, regiunea variabilă a lanţului greu cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3, şi regiunea variabilă a lanţului uşor cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2. În unele aspecte, regiunea variabilă a lanţului greu cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1, şi regiunea variabilă a lanţului uşor cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 5. În unele aspecte, regiunea variabilă a lanţului greu cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1, şi regiunea variabilă a lanţului uşor cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 6. În unele aspecte, regiunea variabilă a lanţului greu cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1, şi regiunea variabilă a lanţului uşor cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 7. În unele aspecte, regiunea variabilă a lanţului greu cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1, şi regiunea variabilă a lanţului uşor cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 8. În conformitate cu invenţia, regiunea variabilă a lanţului greu cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3, şi regiunea variabilă a lanţului uşor cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 4. În unele aspecte, regiunea variabilă a lanţului greu cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3, şi regiunea variabilă a lanţului uşor cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 6. În unele aspecte, regiunea variabilă a lanţului greu cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3, şi regiunea variabilă a lanţului uşor cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 7. În unele aspecte, regiunea variabilă a lanţului greu cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3, şi regiunea variabilă a lanţului uşor cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 8. În unele aspecte, regiunea variabilă a lanţului greu cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3, şi regiunea variabilă a lanţului uşor cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 10.

Aşa cum este descris mai sus, varianta anticorpului 320-179 din prezenta invenţie cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3, şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 4, şi se leagă specific la TL1A. În unele aspecte, regiunea variabilă a lanţului greu cu SECV ID NR: 3 este unită la o regiune constantă a lanţului greu a IgG1(ΔK) uman (de exemplu, SECV ID NR: 43) astfel încât lanţul greu cuprinde SECV ID NR: 60. În unele aspecte, regiunea variabilă a lanţului uşor cu SECV ID NR: 4 este unită la o regiune constantă lambda a lanţului uşor uman (de exemplu, SECV ID NR: 48) astfel încât lanţul uşor cuprinde SECV ID NR: 61. Varianta anticorpului 320-179 este capabilă să inhibe interacţiunea dintre TL1A şi DR3. Varianta de anticorp are o putere crescută în raport cu anticorpul 320-179 şi/sau are o afinitate crescută pentru TL1A în raport cu anticorpul 320-179.

În unele aspecte, variantele de anticorpi 320-179 (din prezenta invenţie şi cei descrişi aici) sunt exprimaţi recombinant şi se leagă specific la TL1A, şi cuprind o regiune variabilă a lanţului greu CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 15, o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 28, şi o regiune variabilă a lanţului greu CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 17. Anticorpii pot cuprinde o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 29, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 19, şi o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 30. În aspecte în care regiunea variabilă a lanţului greu cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1, regiunea variabilă a lanţului uşor preferabil, nu cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2. Aceste variante de anticorpi 320-179 sunt capabile să inhibe interacţiunea dintre TL1A şi DR3. Aceste variante de anticorpi 320-179 au o putere crescută în raport cu anticorpul 320-179 şi/sau au o afinitate crescută pentru TL1A în raport cu anticorpul 320-179.

În unele aspecte, anticorpii se leagă specific la TL1A şi cuprind o regiune variabilă a lanţului greu CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 15, o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 16, o regiune variabilă a lanţului greu CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 17, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 18, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 19, şi o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 22.

În unele aspecte, anticorpii se leagă specific la TL1A şi cuprind o regiune variabilă a lanţului greu CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 15, o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 16, o regiune variabilă a lanţului greu CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 17, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 23, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 19, şi o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 22.

În unele aspecte, anticorpii se leagă specific la TL1A şi cuprind o regiune variabilă a lanţului greu CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 15, o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 16, o regiune variabilă a lanţului greu CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 17, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 24, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 19, şi o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 22.

În unele aspecte, anticorpii se leagă specific la TL1A şi cuprind o regiune variabilă a lanţului greu CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 15, o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 16, o regiune variabilă a lanţului greu CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 17, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 25, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 19, şi o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 22.

În unele aspecte, anticorpii se leagă specific la TL1A şi cuprind o regiune variabilă a lanţului greu CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 15, o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 21, o regiune variabilă a lanţului greu CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 17, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 18, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 19, şi o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 20.

În unele aspecte, anticorpii se leagă specific la TL1A şi cuprind o regiune variabilă a lanţului greu CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 15, o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 16, o regiune variabilă a lanţului greu CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 17, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 26, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 19, şi o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 22.

În conformitate cu invenţia, anticorpul se leagă specific la TL1A şi cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 15, o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 21, o regiune variabilă a lanţului greu CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 17, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 18, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 19, şi o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 22.

În unele aspecte, anticorpii se leagă specific la TL1A şi cuprind o regiune variabilă a lanţului greu CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 15, o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 21, o regiune variabilă a lanţului greu CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 17, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 24, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 19, şi o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 22.

În unele aspecte, anticorpii se leagă specific la TL1A şi cuprind o regiune variabilă a lanţului greu CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 15, o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 21, o regiune variabilă a lanţului greu CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 17, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 25, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 19, şi o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 22.

În unele aspecte, anticorpii se leagă specific la TL1A şi cuprind o regiune variabilă a lanţului greu CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 15, o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 21, o regiune variabilă a lanţului greu CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 17, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 26, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 19, şi o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 22.

În unele aspecte, anticorpii se leagă specific la TL1A şi cuprind o regiune variabilă a lanţului greu CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 15, o regiune variabilă a lanţului greu CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 21, o regiune variabilă a lanţului greu CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 17, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 18, o regiune variabilă a lanţului uşor CDR2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 19, şi o regiune variabilă a lanţului uşor CDR3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 27.

De asemenea sunt descrişi anticorpi care se leagă specific la TL1A, şi cuprind o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 şi o regiune variabilă a lanţului uşor, cu condiţia ca regiunea variabilă a lanţului uşor să nu cuprindă secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2. În unele aspecte, anticorpii se leagă specific la TL1A, şi cuprind o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3 şi o regiune variabilă a lanţului uşor sau un lanţ uşor. Regiunea variabilă a lanţului uşor poate cuprinde în plus o regiune constantă lambda.

În unele aspecte, anticorpii se leagă specific la TL1A, şi cuprind o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2 şi o regiune variabilă a lanţului greu, cu condiţia ca regiunea variabilă a lanţului greu să nu cuprindă secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1. În unele aspecte, anticorpii se leagă specific la TL1A, şi cuprind o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 4 şi o regiune variabilă a lanţului greu. În unele aspecte, anticorpii se leagă specific la TL1A, şi cuprind o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 5 şi o regiune variabilă a lanţului greu. În unele aspecte, anticorpii se leagă specific la TL1A, şi cuprind o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 6 şi o regiune variabilă a lanţului greu. În unele aspecte, anticorpii se leagă specific la TL1A, şi cuprind o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 7 şi o regiune variabilă a lanţului greu. În unele aspecte, anticorpii se leagă specific la TL1A, şi cuprind o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 8 şi o regiune variabilă a lanţului greu. În unele aspecte, anticorpii se leagă specific la TL1A, şi cuprind o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 9 şi o regiune variabilă a lanţului greu. În unele aspecte, anticorpii se leagă specific la TL1A, şi cuprind o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 10 şi o regiune variabilă a lanţului greu. În unele aspecte, anticorpii se leagă specific la TL1A, şi cuprind o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 11 şi o regiune variabilă a lanţului greu. În unele aspecte, anticorpii se leagă specific la TL1A, şi cuprind o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 12 şi o regiune variabilă a lanţului greu. În unele aspecte, anticorpii se leagă specific la TL1A, şi cuprind o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 13 şi o regiune variabilă a lanţului greu. În unele aspecte, anticorpii se leagă specific la TL1A, şi cuprind o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 14 şi o regiune variabilă a lanţului greu, cu condiţia ca, dacă regiunea variabilă a lanţului uşor cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2, regiunea variabilă a lanţului greu să nu cuprindă secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1. Regiunea variabilă a lanţului greu poate cuprinde în plus o regiune constantă a lanţului greu, incluzând oricare o secvenţă de aminoacizi a regiunii constante a lanţului greu al IgG1, IgG2, sau IgG4 descrisă sau exemplificată aici.

Variantele anticorpilor 320-179 se leagă specific la TL1A. Anticorpii se leagă la TL1A uman, şi se pot lega la una sau mai multe dintre TL1A de maimuţă cynomolgus, TL1A de şoarece, TL1A de şobolan, TL1A de cobai, TL1A de pisică, TL1A de câine, TL1A de porc, sau TL1A de iepure. În unele aspecte, anticorpii se pot lega la TL1A de multiple specii diferite, de exemplu, dacă epitopul este comun. În unele aspecte, TL1A uman cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 31, SECV ID NR: 32, sau SECV ID NR: 33. În unele aspecte, TL1A de maimuţă cynomolgus cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 34. În unele aspecte, TL1A de şoarece cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 35. În unele aspecte, TL1A de şobolan cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 36. În unele aspecte, TL1A de cobai cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 37. În unele aspecte, TL1A de pisică cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 38. În unele aspecte, TL1A de porc cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 39. În unele aspecte, TL1A de iepure cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 40. În unele aspecte, TL1A de câine cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 41.

Variantele anticorpilor 320-179 (din prezenta invenţie şi cei descrişi aici) au o afinitate de legare pentru un epitop de pe TL1A care include o constantă de disociere de echilibru (KD), care poate fi măsurată conform unei analize de excludere cinetică, cum ar fi o analiză KINEXA® (Sapidyne Instruments Inc., Boise, ID).

KD pentru legarea TL1A determinată dintr-o analiză de excludere cinetică este preferabil, mai mică de aproximativ 1000 pM. În unele aspecte, KD pentru legarea TL1A determinată dintr-o analiză de excludere cinetică este mai mică de aproximativ 500 pM, sau mai mică de aproximativ 400 pM, sau mai mică de aproximativ 300 pM, sau mai mică de aproximativ 200 pM. În unele aspecte preferate, KD pentru legarea TL1A determinată dintr-o analiză de excludere cinetică este mai mică de aproximativ 100 pM.

KD pentru legarea TL1A determinată dintr-o analiză de excludere cinetică poate fi de la aproximativ 10 pM la aproximativ 100 pM. KD pentru legarea TL1A determinată dintr-o analiză de excludere cinetică poate fi de la aproximativ 25 pM la aproximativ 75 pM. KD pentru legarea TL1A determinată dintr-o analiză de excludere cinetică poate fi de la aproximativ 30 pM la aproximativ 60 pM. KD pentru legarea TL1A determinată dintr-o analiză de excludere cinetică poate fi de la aproximativ 30 pM la aproximativ 50 pM. KD pentru legarea TL1A determinată dintr-o analiză de excludere cinetică poate fi de la aproximativ 35 pM la aproximativ 50 pM. The KD pentru legarea TL1A determinată dintr-o analiză de excludere cinetică poate fi de la aproximativ 36 pM la aproximativ 46 pM. KD pentru legarea TL1A determinată dintr-o analiză de excludere cinetică poate fi de la aproximativ 38 pM la aproximativ 44 pM. KD pentru legarea TL1A determinată dintr-o analiză de excludere cinetică poate fi de la aproximativ 39 pM la aproximativ 43 pM. KD pentru legarea TL1A determinată dintr-o analiză de excludere cinetică poate fi de la aproximativ 40 pM la aproximativ 45 pM. KD pentru legarea TL1A determinată dintr-o analiză de excludere cinetică poate fi de la aproximativ 35 pM la aproximativ 42 pM. KD pentru legarea TL1A determinată dintr-o analiză de excludere cinetică poate fi de aproximativ 40 pM. KD pentru legarea TL1A determinată dintr-o analiză de excludere cinetică poate fi de aproximativ 41 pM. KD pentru legarea TL1A determinată dintr-o analiză de excludere cinetică poate fi de aproximativ 42 pM. Analiza de excludere cinetică poate utiliza molecula de anticorp sau molecula de TL1A ca partenerul de legare constant, şi cealaltă moleculă ca titrant.

Variantele anticorpilor 320-179 anti-TL1A (din prezenta invenţie şi cei descrişi aici) sunt preferabil, capabile de legarea la celule TL1A-pozitive. Anticorpul se poate lega la o celulă TL1A-pozitivă cu o valoare EC50 mai mică de aproximativ 100 nM. Anticorpul se poate lega la o celulă TL1A-pozitivă cu o valoare EC50 mai mică de aproximativ 75 nM. Anticorpul se poate lega la o celulă TL1A-pozitivă cu o valoare EC50 mai mică de aproximativ 50 nM. Anticorpul se poate lega la o celulă TL1A-pozitivă cu o valoare EC50 mai mică de aproximativ 30 nM. Anticorpul se poate lega la o celulă TL1A-pozitivă cu o valoare EC50 mai mică de aproximativ 25 nM. Anticorpul se poate lega la o celulă TL1A-pozitivă cu o valoare EC50 mai mică de aproximativ 20 nM. Anticorpul se poate lega la o celulă TL1A-pozitivă cu o valoare EC50 mai mică de aproximativ 18 nM. Anticorpul se poate lega la o celulă TL1A-pozitivă cu o valoare EC50 mai mică de aproximativ 15 nM. Anticorpul se poate lega la o celulă TL1A-pozitivă cu o valoare EC50 mai mică de aproximativ 13 nM. Anticorpul se poate lega la o celulă TL1A-pozitivă cu o valoare EC50 mai mică de aproximativ 10 nM.

Variantele anticorpilor 320-179 (din prezenta invenţie şi cei descrişi aici) sunt preferabil monoclonale, şi mai preferabil sunt anticorpi cu lungime întreagă care cuprind două lanţuri grele şi două lanţuri uşoare. În unele aspecte, anticorpii cuprind derivaţi sau fragmente sau porţiuni ale anticorpilor care reţin specificitatea de legare la antigen, şi de asemenea preferabil, păstrează cea mai mare parte sau întreaga afinitate, a moleculei de anticorp părinte 320-179 (de exemplu, pentru TL1A). De exemplu, derivaţi pot cuprinde cel puţin o regiune variabilă (fie o regiune variabilă a lanţului greu fie a lanţului uşor). Alte exemple de derivaţi şi fragmente de anticorpi includ, fără limitare, anticorpi cu specificitate poliepitopică, anticorpi bispecifici, anticorpi multi-specifici, diacorpi, molecule cu un singur lanţ, precum şi molecule FAb, F(Ab')2, Fd, Fabc, şi Fv, anticorpi cu un singur lanţ (Sc), anticorpi Fv cu un singur lanţ (scFv), lanţuri uşoare de individuale de anticorp, lanţuri grele individuale de anticorp, fuziuni între lanţurile de anticorpi şi alte molecule, monomeri sau dimeri de lanţuri grele, monomeri sau dimeri de lanţuri uşoare, dimeri constând a unui lanţ greu şi unul uşor şi a alţi multimeri. Anticorpii Fv cu un singur lanţ pot fi multi-valenţi. Toate izotipurile de anticorp pot fi utilizate pentru a produce derivaţi, fragmente şi porţiuni de anticorpi. Derivaţii, fragmentele şi/sau porţiunile de anticorpi, pot fi produse recombinant şi exprimate de orice tip de celule, procariote sau eucariote.

Într-un anticorp cu lungime întreagă, fiecare lanţ greu este format dintr-o regiune variabilă a lanţului greu (prescurtată aici ca HCVR sau VH) şi o regiune constantă a lanţului greu. Regiunea constantă a lanţului greu este formată din trei domenii, CH1, CH2 şi CH3. Fiecare lanţ uşor este format dintr-o regiune variabilă a lanţului uşor (prescurtată aici ca LCVR sau VL) şi o regiune constantă a lanţului uşor. Regiunea constantă a lanţului uşor este formată dintr-un singur domeniu, CL. Regiunile VH şi VL pot fi subdivizate în continuare în regiuni cu hipervariabilitate, denumite regiuni de determinare a complementarităţii (CDR), alterante cu regiuni mai conservate, denumite regiuni cadru (FR). Fiecare VH şi VL este compusă din trei CDR-uri şi patru FR-uri, dispuse de la amino-terminal la carboxi-terminal în următoarea ordine: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Tipic, proprietăţile de legare la antigen ale unui anticorp sunt mai puţin susceptibile să fie perturbate de modificări ale secvenţelor FR decât de modificări ale secvenţelor CDR. Moleculele de imunoglobulină pot fi de orice tip (de exemplu, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA şi IgY), de clasă (de exemplu, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 şi IgA2) sau subclasă.

Variantele de anticorpi 320-179 (din prezenta invenţie şi cei descrişi aici) sunt pe complet umani. Anticorpii complet umani sunt aceia în care întreaga moleculă este umană sau altfel de origine umană sau include o secvenţă de aminoacizi identică cu o formă umană a anticorpului. Anticorpii complet umani îi includ pe cei obţinuţi dintr-o bibliotecă a genelor V umane, de exemplu, unde genele umane care codifică regiuni variabile de anticorpi sunt exprimate recombinant. Anticorpi complet umani pot fi exprimaţi în alte organisme (de exemplu, şoareci şi tehnologie xeno-şoarece) sau celule de la alte organisme transformate cu gene care codifică anticorpi umani. Anticorpii complet umani pot include totuşi resturi de aminoacizi care nu sunt codificate de secvenţe umane, de exemplu, mutaţii introduse de mutaţii aleatorii sau direcţionate pe situs.

În unele aspecte, varianta de anticorpi 320-179 poate cuprinde cadre proteice derivate de non-imunoglobulină. De exemplu, se poate face referire la (Ku & Schutz, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6552-6556) care descrie un pachet cu patru elice proteice de citocrom b562 având două bucle randomizate pentru a crea CDR-uri, care au a fost selectate pentru legarea antigenului.

Varianta de anticorpi 320-179 (din prezenta invenţie şi cei descrişi aici) pot cuprinde modificări sau fragmente post-translaţionale, care pot afecta activitatea sau stabilitatea anticorpilor. Aceste modificări sau fragmente includ, dar nu se limitează la, fragmente metilate, acetilate, glicozilate, sulfatate, fosforilate, carboxilate şi amidate şi alte fragmente bine cunoscute în domeniu. Fragmentele includ orice grupare chimică sau combinaţii de grupări care se găsesc în mod obişnuit pe molecule de imunoglobulină în natură sau adăugate în alt fel la anticorpi de sistemele de exprimare recombinante, inclusiv sisteme de exprimare procariote şi eucariote.

Exemple de modificări ale lanţului secundar avute în vedere în dezvăluire includ modificări ale grupărilor amino, cum ar fi prin alchilarea reductivă prin reacţia cu o aldehidă urmată de reducerea cu NaBH4; amidinarea cu metilacetimidat; acilarea cu anhidridă acetică; carbamoilarea grupărilor amino cu cianat; trinitrobenzilarea grupărilor amino cu acid 2, 4, 6-trinitrobenzen sulfonic (TNBS); acilarea grupărilor amino cu anhidridă succinică şi anhidridă tetrahidrofalică; şi piridoxilarea lizinei cu piridoxal-5-fosfat urmată de reducerea cu NaBH4.

Gruparea de guanidină a resturilor de arginină poate fi modificată prin formarea unor produse heterociclice de condensare cu reactivi cum ar fi 2,3-butanediona, fenilglioxalul şi glioxalul. Gruparea carboxilică poate fi modificată prin activarea carbodiimidei prin intermediul formării de O-acilizouree urmată de derivatizarea ulterioară, de exemplu, la o amidă corespunzătoare. Grupările sulfhidril pot fi modificate prin metode precum carboximetilarea cu acid iodoacetic sau iodoacetamidă; oxidarea cu acid performic la acidul cisteic; formarea de disulfuri amestecate cu alţi compuşi tiolici; reacţia cu maleimidă, anhidridă maleică sau alte maleimide substituite; formarea unor derivaţi mercurici folosind benzoat 4-cloromercuric, acid 4-cloromercurifenilsulfonic, clorură de fenilmercur, 2-cloromercur-4-nitrofenol şi alte mercurii; carbamoilarea cu cianat la pH alcalin. Resturile de triptofan pot fi modificate, de exemplu, prin oxidarea cu N-bromosuccinimidă sau alchilarea inelului indolic cu bromură de 2-hidroxi-5-nitrobenzil sau halogenuri de sulfenil. Pe de altă parte, resturile de tirozină pot fi modificate prin nitrare cu tetranitrometan pentru a se forma un derivat de 3-nitrotirozină. Modificarea inelului de imidazol al unui reste de histidină poate fi realizată prin alchilarea cu derivaţi ai acidului iodoacetic sau N-carbetoxilare cu dietilpirocarbonat.

Varianta de anticorpi 320-179 (din prezenta invenţie şi cei descrişi aici) pot include modificări care modulează timpul de înjumătăţire şi biodistribuţia serică, incluzând, fără limitare, modificări care modulează interacţiunea anticorpului cu receptorul neonatal Fc (FcRn), un receptor cu un rol cheie în protejarea IgG de catabolism şi în menţinerea unei concentraţii serice ridicate de anticorpi. Modificările de modulare a duratei de înjumătăţire serice pot apărea în regiunea Fc a IgG1, IgG2 sau IgG4, inclusiv substituţia triplă a M252Y/S254T/T256E (substituţiile ʺYTEʺ, cu numerotare conform sistemului de numerotare EU (Edelman, G.M. et al. (1969) Proc. Natl. Acad. USA 63, 78-85)), aşa cum este descris în brevetul US Nr. 7,083,784. Alte substituţii pot apărea la poziţiile 250 şi 428, a se vedea, de exemplu, brevetul US 7,217,797, precum şi în poziţiile 307, 380 şi 434, a se vedea, de exemplu, Publ. PCT Nr. WO 00/042072. Exemple de substituţii de aminoacizi în domeniul constant, care modulează legarea la receptorii de Fc şi funcţia ulterioară mediată de aceşti receptori, incluzând legarea FcRn şi timpul de înjumătăţire seric, sunt descrise în Publ. U.S. Nr. 2009/0142340, 2009/0068175, şi 2009/0092599. Anticorpii din orice clasă pot avea lizina C-terminal a lanţului greu omisă sau eliminată pentru a reduce heterogenitatea (ΔK). Substituţia S228P (numerotarea EU) în IgG4 umană poate stabiliza schimbul de braţe-Fab anticorp in vivo (Labrin et al. (2009) Nature Biotechnology 27:8; 767-773), iar această substituţie poate fi prezentă în acelaşi timp ca modificări YTE şi/sau ΔK.

Varianta de anticorpi 320-179 cuprinde domenii constante umane. Domeniile constante ale lanţului greu sunt de preferat domeniile constante ale IgG1, IgG2 sau IgG4 uman. Domeniile constante ale lanţului uşor sunt de preferat domenii constante lambda umane. Un domeniu lambda uman adecvat cuprinde SECV ID NR: 48.

Regiunile constante ale lanţului greu de IgG1 uman, care pot fi utilizate cu variantele de anticorpi 320-179, pot fi selectate dintre IgG1 uman (SECV ID NR: 42), IgG1 uman (ΔK) (SECV ID NR: 43), IgG1 uman 252Y/254T/256E (SECV ID NR: 44), IgG1 uman 252Y/254T/256E (ΔK) (SECV ID NR: 64), IgG1 uman L234A/L235A/G237A (SECV ID NR: 63), IgG1 uman L234A/L235A/G237A (ΔK) (SECV ID NR: 62), IgG1 uman L235A/G237A (SECV ID NR: 65), şi IgG1 uman L235A/G237A (ΔK) (SECV ID NR: 66). Regiunile constante ale lanţului greu de IgG2 uman care pot fi utilizate cu variantele de anticorpi 320-179 pot fi selectate dintre IgG2 uman cu sau fără ΔK (SECV ID NR: 67 şi SECV ID NR: 70) şi IgG2 uman A330S/P331S cu sau fără (ΔK) (SECV ID NR: 71 şi SECV ID NR: 68). Regiunile constante ale lanţului greu de IgG4 uman care pot fi utilizate cu variantele de anticorpi 320-179 pot fi selectate dintre IgG4 uman S228P (SECV ID NR: 45), IgG4 uman S228P (ΔK) (SECV ID NR: 46), IgG4 uman 228P/252Y/254T/256E (SECV ID NR: 47), şi IgG4 uman 228P/252Y/254T/256E (ΔK) (SECV ID NR: 69).

Variantele anticorpi 320-179 pot fi marcate, legate sau conjugate cu orice fragmente chimice sau de biomolecule. Anticorpii etichetaţi îşi pot găsi utilizarea în aplicaţii de terapeutice, de diagnostic sau de cercetare fundamentală. Astfel de etichete/conjugaţi pot fi detectabile, cum ar fi fluorocromi, sonde electrochemiluminescente, puncte cuantice, radioetichete, enzime, proteine fluorescente, proteine luminiscente şi biotină. Etichetele/conjugaţii pot fi agenţi chimioterapeutici, toxine, izotopi şi alţi agenţi utilizaţi pentru tratarea stărilor, cum ar fi uciderea celulelor canceroase. Agenţii chimioterapeutici pot fi oricare dintre aceia care sunt adecvaţi pentru scopul pentru care este utilizat anticorpul.

Anticorpii pot fi derivatizaţi prin grupări cunoscute de protecţie/blocare pentru a preveni clivajul proteolitic sau pentru a spori activitatea sau stabilitatea.

Secvenţe de polinucleotide care codifică anticorpii (conform prezentei invenţii şi cele descrise aici) şi subdomeniile lor (de exemplu, FR-uri şi CDR-uri) sunt caracterizate în dezvăluire. Polinucleotidele includ, dar nu sunt limitate la, ARN, ADN, ADNc, hibrizi de ARN şi ADN şi catene simple, duble sau triple de ARN, ADN sau hibrizi ai acestora. Polinucleotidele pot cuprinde o secvenţă de acizi nucleic care codifică regiunea variabilă a lanţului greu şi/sau regiunea variabilă a lanţului uşor a unei variante a anticorpului 320-179 aşa cum este descris sau exemplificat aici. Complementele secvenţelor de polinucleotide sunt de asemenea incluse în scopul dezvăluirii.

O polinucleotidă poate cuprinde o secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului greu a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3. O polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 51.

O polinucleotidă poate cuprinde o secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului greu a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1. O polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 49.

O polinucleotidă poate cuprinde o secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului uşor a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2. O polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 50.

O polinucleotidă poate cuprinde o secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului uşor a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 4. O polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 4 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 52.

O polinucleotidă poate cuprinde o secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului uşor a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 5. O polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 5 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 53.

O polinucleotidă poate cuprinde o secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului uşor a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 6. O polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 6 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 54.

O polinucleotidă poate cuprinde o secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului uşor a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 7. O polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 7 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 55.

O polinucleotidă poate cuprinde o secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului uşor a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 8. O polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 8 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 56.

O polinucleotidă poate cuprinde o secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului uşor a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 10. O polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 10 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 57.

În unele aspecte, o polinucleotidă cuprinde o primă secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului greu a unui anticorp şi o a doua secvenţă de acizi nucleici care codifică un o regiune variabilă a lanţului uşor a unui anticorp. O primă secvenţă de acizi nucleici poate codifica o regiune variabilă a lanţului greu a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2. O polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 51 şi o polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 50.

O primă secvenţă de acizi nucleici poate codifica o regiune variabilă a lanţului greu a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 4. O polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 51 şi o polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 4 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 52.

O primă secvenţă de acizi nucleici poate codifica o regiune variabilă a lanţului greu a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 6. O polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 51 şi o polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 6 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 54.

O primă secvenţă de acizi nucleici poate codifica o regiune variabilă a lanţului greu a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 7. O polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 51 şi o polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 7 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 55.

O primă secvenţă de acizi nucleici poate codifica o regiune variabilă a lanţului greu a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 8. O polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 51 şi o polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 8 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 56.

O primă secvenţă de acizi nucleici poate codifica o regiune variabilă a lanţului greu a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 10. O polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 51 şi o polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 10 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 57.

O primă secvenţă de acizi nucleici poate codifica o regiune variabilă a lanţului greu a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 4. O polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 49 şi o polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 4 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 52.

O primă secvenţă de acizi nucleici poate codifica o regiune variabilă a lanţului greu a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 5. O polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 49 şi o polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 5 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 53.

O primă secvenţă de acizi nucleici poate codifica o regiune variabilă a lanţului greu a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 6. O polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 49 şi o polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 6 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 54.

O primă secvenţă de acizi nucleici poate codifica o regiune variabilă a lanţului greu a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 7. O polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 49 şi o polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 7 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 55.

O primă secvenţă de acizi nucleici poate codifica o regiune variabilă a lanţului greu a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 8. O polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 49 şi o polinucleotidă care codifică secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 8 poate cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 56.

În unele aspecte, o polinucleotidă cuprinde o primă secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului greu a unui anticorp şi o a doua secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune constantă a lanţului greu. În aspecte preferate, o polinucleotidă cuprinde o primă secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului greu a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3 şi o a doua secvenţă de acizi nucleici care codifică an IgG1(ΔK) o regiune constantă a lanţului greu din SECV ID NR: 43, de exemplu, o polinucleotidă care cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 58.

În unele aspecte, o polinucleotidă cuprinde o primă secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului uşor a unui anticorp şi o a doua secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune constantă a lanţului uşor. În aspecte preferate, o polinucleotidă cuprinde o primă secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului uşor a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 4 şi o a doua secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune constantă lambda a lanţului uşor din SECV ID NR: 48, de exemplu, o polinucleotidă care cuprinde secvenţa de acizi nucleici din SECV ID NR: 59.

Orice dintre polinucleotidele descrise sau exemplificate aici pot fi cuprinse într-un vector. Astfel, vectorii care cuprind polinucleotide sunt redaţi ca parte a dezvăluirii. Vectorii pot fi vectori de expresie. Sunt astfel redaţi vectori de expresie recombinanţi care conţin o secvenţă care codifică o polipeptidă de interes. Vectorul de expresie poate conţine una sau mai multe secvenţe suplimentare, cum ar fi, dar fără a se limita la secvenţe de reglare, un marker de selecţie, o etichetă de purificare sau un semnal de poliadenilare. Astfel de elemente de reglare pot include un promotor transcripţional, potenţiatori, situsuri de legare ribozomale ARNm sau secvenţe care controlează terminarea transcripţiei şi a translaţiei.

Vectori de expresie, în special vectori de expresie de mamifere, pot include unul sau mai multe elemente netranscrise, cum ar fi o origine a replicării, un promotor şi potenţator adecvat legat la gena care trebuie exprimată, alte secvenţe netranscrise de flancare 5' sau 3', secvenţe netranslatate 5' sau 3' (cum ar fi situsurile necesare de legare a ribozomului), un situs de poliadenilare, situsri donoare şi acceptoare de matisare sau secvenţe de terminare transcripţională. Poate fi, de asemenea, încorporată o origine a replicării care conferă capacitatea de replicare într-o gazdă specifică.

Vectorii pot fi utilizaţi pentru a transforma oricare dintr-o gamă largă de celule gazdă bine cunoscute de o persoană de specialitate în domeniu, şi de preferinţă celule gazdă capabile să exprime anticorpi. Vectorii includ fără limitare, plasmide, fagemide, cosmide, bacmide, cromozomi artificiali bacterieni (BAC-uri), cromozomi artificiali de drojdie (YAC-uri) şi baculovirusuri, precum şi alţi vectori bacterieni, eucariotci, de drojdie şi virali. Celulele gazdă adecvate includ fără limitare celulele CHO, celulele NS0, celulele HEK293 sau orice linie celulară stabilă eucariotă cunoscută sau produsă şi includ, de asemenea, bacterii, drojdie şi celule de insecte.

Anticorpii pot fi, de asemenea, produşi de celulele hibridom; metodele de producere a hibridoamelor fiind bine cunoscute şi stabilite în domeniu.

Dezvăluirea redă, de asemenea, compoziţii cuprinzând variantele de anticorpi 320-179 (conform invenţiei şi cele descrise aici). Compoziţiile pot cuprinde oricare dintre anticorpii descrişi şi/sau exemplificaţi aici şi un purtător acceptabil, cum ar fi un purtător acceptabil farmaceutic. Purtătorii adecvaţi includ orice mediu care nu interferează cu activitatea biologică a anticorpului şi, de preferinţă, nu este toxic pentru o gazdă căreia i se administrează. Compoziţiile pot fi formulate pentru administrare la un subiect sub orice formă de dozare adecvată.

Variantele de anticorpi 320-179 (conform prezentei invenţii şi cele descrise aici) pot fi utilizate pentru a trata o boală a tractului respirator, o boală gastrointestinală, artrita sau o boală de piele la un subiect. Astfel, dezvăluirea redă metode de tratament. În general, metodele cuprind administrarea unei variante de anticorp 320-179, sau o compoziţie acestuia, unui subiect care are nevoie de tratament pentru o boală a tractului respirator, o boală gastrointestinală, artrita sau o boală de piele, astfel încât boala tractului respirator, boala gastrointestinală, artrita sau boala de piele este tratată. Varianta de anticorp 320-179 poate cuprinde orice anticorp descris sau exemplificat aici. Administrarea poate cuprinde administrarea subcutanată a anticorpului. Administrarea poate cuprinde administrarea intravenoasă a anticorpului. Subiectul este de preferinţă o fiinţă umană. Subiectul poate fi un primat non-uman, cum ar fi o maimuţă cynomolgus, sau poate fi un mamifer cum ar fi un şoarece, şobolan, cobai, pisică, porc, iepure sau câine.

În aspecte în care trebuie tratată o boală a tractului respirator, metodele cuprind administrarea unei variante de anticorp 320-179 sau a unei compoziţii a acestuia la un subiect care are nevoie de tratament pentru o boală a tractului respirator. Boala tractului respirator poate cuprinde una sau mai multe dintre astm, boală pulmonară obstructivă cronică (BPOC), fibroză pulmonară, sarcoidoză pulmonară, rinită alergică sau fibroză chistică. Astfel, de exemplu, în unele aspecte, metodele cuprind administrarea unei variante de anticorp 320-179, sau a unei compoziţii a acestuia, unui subiect care are nevoie de tratament pentru astm, astfel încât astmul este tratat la subiect. În unele aspecte, metodele cuprind administrarea unei variante de anticorp 320-179, sau a unei compoziţii a acestuia, unui subiect care are nevoie de tratament pentru BPOC, astfel încât BPOC este tratată la subiect. În unele aspecte, metodele cuprind administrarea unei variante de anticorp 320-179, sau a unei compoziţii a acestuia, unui subiect care are nevoie de tratament pentru fibroza pulmonară, astfel încât fibroza pulmonară este tratată la subiect. În unele aspecte, metodele cuprind administrarea unui anticorp de variantă 320-179 sau a unei compoziţii a acestuia la un subiect care are nevoie de tratament pentru sarcoidoza pulmonară, astfel încât sarcoidoza pulmonară este tratată la subiect. În unele aspecte, metodele cuprind administrarea unei variante de anticorp 320-179, sau a unei compoziţii a acestuia, unui subiect care are nevoie de tratament pentru rinita alergică, astfel încât rinita alergică este tratată la subiect. În unele aspecte, metodele cuprind administrarea unei variante de anticorp 320-179, sau a unei compoziţii a acestuia, unui subiect care are nevoie de tratament pentru fibroza chistică, astfel încât fibroza chistică este tratată la subiect.

În aspecte în care trebuie tratată o boală gastrointestinală, metodele cuprind administrarea unei variante de anticorp 320-179 sau a unei compoziţii a acesteia la un subiect care are nevoie de tratament pentru o boală gastrointestinală. Boala gastrointestinală poate cuprinde una sau mai multe boli inflamatorii intestinale (IBD), boala Crohn, colită, colită ulceroasă, sindrom de colon iritabil (IBS), esofagită eozinofilică sau o boală sau stare gastrointestinală asociată cu fibroza chistică. Astfel, de exemplu, în unele aspecte, metodele cuprind administrarea unei variante de anticorp de 320-179, sau a unei compoziţii a acesteia, la un subiect care are nevoie de tratament pentru IBD, astfel încât IBD-ul este tratat la subiect. În unele aspecte, metodele cuprind administrarea unei variante de anticorp 320-179, sau a unei compoziţii a acesteia, la un subiect care are nevoie de tratament pentru boala Crohn, astfel încât boala Crohn este tratată la subiect. În unele aspecte, metodele cuprind administrarea unei variante de anticorp 320-179, sau a unei compoziţii a acesteia, la un subiect care are nevoie de tratament pentru colită, astfel încât colita este tratată la subiect. În unele aspecte, metodele cuprind administrarea unei variante de anticorp 320-179, sau a unei compoziţii a acesteia, la un subiect care are nevoie de tratament pentru colita ulceroasă, astfel încât colita ulceroasă este tratată la subiect. În unele aspecte, metodele cuprind administrarea unei variante de anticorp 320-179, sau a unei compoziţii a acesteia, la un subiect care are nevoie de tratament pentru IBS, astfel încât IBS-ul este tratat la subiect. În unele aspecte, metodele cuprind administrarea unei variante de anticorp 320-179, sau a unei compoziţii a acesteia, la un subiect care are nevoie de tratament pentru esofagita eozinofilică, astfel încât esofagita eozinofilică este tratată la subiect. În unele aspecte, metodele cuprind administrarea unei variante de anticorp 320-179, sau a unei compoziţii a acesteia, la un subiect care are nevoie de tratament pentru o boală gastrointestinală sau o afecţiune asociată cu fibroza chistică, astfel încât boala gastrointestinală sau starea asociată cu fibroza chistică este tratată în subiect.

În aspecte în care trebuie să fie tratată artrita, metodele cuprind administrarea unei variante de anticorp 320-179, sau a unei compoziţii a acesteia, la un subiect care are nevoie de tratament pentru artrită. Artrita poate cuprinde artrita reumatoidă. Astfel, de exemplu, în unele aspecte, metodele cuprind administrarea unei variante de anticorp 320-179, sau a unei compoziţii a acesteia, la un subiect care are nevoie de tratament pentru artrita reumatoidă, astfel încât artrita reumatoidă este tratată la subiect.

În aspecte în care trebuie să fie tratată o boală de piele, metodele cuprind administrarea unei variante de anticorp 320-179, sau a unei compoziţii a acesteia, la un subiect care are nevoie de tratament pentru o boală de piele. Boala de piele poate cuprinde una sau mai multe dintre dermatită atopică, eczemă, sau sclerodermie. Astfel, de exemplu, în unele aspecte, metodele cuprind administrarea unei variante de anticorp 320-179, sau a unei compoziţii a acesteia, la un subiect care are nevoie de tratament pentru dermatita atopică, astfel încât dermatita atopică este tratată la subiect. În unele aspecte, metodele cuprind administrarea unei variante de anticorp 320-179, sau a unei compoziţii a acesteia, la un subiect care are nevoie de tratament pentru eczemă, astfel încât eczema este tratată la subiect. În unele aspecte, metodele cuprind administrarea unei variante de anticorp 320-179, sau a unei compoziţii a acesteia, la un subiect care are nevoie de tratament pentru sclerodermie, astfel încât sclerodermia este tratată la subiect.

Variantele de anticorpi 320-179 descrise sau exemplificate aici se pot utiliza pentru prepararea unui medicament pentru utilizarea în tratamentul unei boli a tractului respirator. Variantele de anticorpi 320-179 descrise sau exemplificate aici se pot utiliza pentru prepararea unui medicament pentru utilizarea în tratamentul unei boli gastrointestinale. Variantele de anticorpi 320-179 descrise sau exemplificate aici se pot utiliza pentru prepararea unui medicament pentru utilizarea în tratamentul artritei. Variantele de anticorpi 320-179 descrise sau exemplificate aici se pot utiliza pentru prepararea unui medicament pentru utilizarea în tratamentul unei boli de piele. Variantele de anticorpi 320-179 descrise sau exemplificate aici se pot utiliza pentru prepararea unui medicament pentru utilizarea în tratamentul oricăreia dintre astm, COPD, fibroză pulmonară, sarcoidoză pulmonară, rinită alergică, fibroză chistică, boală inflamatorie intestinală, boala Crohn, colită, colită ulceroasă, sindrom de intestin iritabil, esofagită eozinofilică, o boală gastrointestinală sau o stare asociată cu fibroza chistică, artrita, artrita reumatoidă, dermatita atopică, eczema, sau sclerodermia.

Variantele de anticorpi 320-179 descrise sau exemplificate aici pot fi pentru utilizarea în tratamentul unei boli a tractului respirator. Variantele de anticorpi 320-179 descrise sau exemplificate aici pot fi pentru utilizarea în tratamentul unei boli gastrointestinale. Variantele de anticorpi 320-179 descrise sau exemplificate aici pot fi pentru utilizarea în tratamentul astmului. Variantele de anticorpi 320-179 descrise sau exemplificate aici pot fi pentru utilizarea în tratamentul unei boli de piele. Variantele de anticorpi 320-179 descrise sau exemplificate aici pot fi pentru utilizarea în tratamentul COPD-ului. Variantele de anticorpi 320-179 descrise sau exemplificate aici pot fi pentru utilizarea în tratamentul fibrozei pulmonare. Variantele de anticorpi 320-179 descrise sau exemplificate aici pot fi pentru utilizarea în tratamentul sarcoidozei pulmonare. Variantele de anticorpi 320-179 descrise sau exemplificate aici pot fi pentru utilizarea în tratamentul rinitei alergice. Variantele de anticorpi 320-179 descrise sau exemplificate aici pot fi pentru utilizarea în tratamentul fibrozei chistice. Variantele de anticorpi 320-179 descrise sau exemplificate aici pot fi pentru utilizarea în tratamentul bolii intestinale inflamatorii. Variantele de anticorpi 320-179 descrise sau exemplificate aici pot fi pentru utilizarea în tratamentul bolii Crohn. Variantele de anticorpi 320-179 descrise sau exemplificate aici pot fi pentru utilizarea în tratamentul colitei. Variantele de anticorpi 320-179 descrise sau exemplificate aici pot fi pentru utilizarea în tratamentul of colită ulceroasă. Variantele de anticorpi 320-179 descrise sau exemplificate aici pot fi pentru utilizarea în tratamentul esofagitei eozinofilice. Variantele de anticorpi 320-179 descrise sau exemplificate aici pot fi pentru utilizarea în tratamentul unei boli gastrointestinale sau a unei stări asociate cu fibroza chistică. Variantele de anticorpi 320-179 descrise sau exemplificate aici pot fi pentru utilizarea în tratamentul sindromului de intestin iritabil. Variantele de anticorpi 320-179 descrise sau exemplificate aici pot fi pentru utilizarea în tratamentul artritei reumatoide. Variantele de anticorpi 320-179 descrise sau exemplificate aici pot fi pentru utilizarea în tratamentul dermatitei atopice. Variantele de anticorpi 320-179 descrise sau exemplificate aici pot fi pentru utilizarea în tratamentul eczemei. Variantele de anticorpi 320-179 descrise sau exemplificate aici pot fi pentru utilizarea în tratamentul sclerodermiei.

De asemenea, este redată o metodă in vitro pentru detectarea TL1A într-un eşantion de ţesut izolat de la un subiect, cuprinzând contactul cu anticorpul conform oricăreia dintre revendicările 1-19 cu un eşantion de ţesut izolat de la un subiect pentru a forma un complex anticorp-TL1A şi detectarea complexului din eşantionul de ţesut.

O variantă a anticorpului 320-179 poate fi utilizată pentru a se detecta celule TL1A-pozitive, de exemplu, într-un eşantion de ţesut obţinut de la un subiect. Anticorpii pot fi utilizaţi pentru a se detecta celule mononucleare TL1A-pozitive din sânge periferic (PBMC-uri), de exemplu, PBMC-uri obţinute de la un subiect. Anticorpii pot fi utilizaţi pentru a se detecta TL1A în serul din sânge. Astfel de metode pot fi efectuate in vivo, ex vivo, in vitro, sau in situ. În general, metodele cuprind contactarea oricăreia dintre variantele de anticorpi 320-179 descrise sau exemplificate aici cu un ţesut sau celulă, de exemplu, PBMC-uri, izolate de la un subiect pentru a forma un complex de anticorp-TL1A şi detectare complexului în ţesut sau pe celulă. Anticorpul poate fi etichetat cu o etichetă detectabilă. Anticorpul poate fi detectat cu un anticorp secundar care este etichetat cu o etichetă detectabilă. Ţesutul poate cuprinde sau poate fi un fluid biologic precum sângele sau serul din sânge. Ţesutul poate cuprinde sau poate fi un ţesut al tractului respirator, cum ar fi ţesutul pulmonar, sputa, lichidul de spălare bronhoalveolară, ţesutul gastrointestinal sau fluidul de lavaj gastrointestinal. Ţesutul poate cuprinde sau poate fi piele sau ţesut dermic. Ţesutul poate cuprinde sau poate fi un ţesut al oricărei articulaţii din corp. Metoda poate cuprinde suplimentar izolarea ţesutului de subiect. Astfel de metode pot fi cantitative, de exemplu, prin cuantificarea nivelului de TL1A în ţesut, prin cuantificarea nivelului de celule TL1A-pozitive sau prin cuantificarea nivelului de TL1A de pe celule sau cuantificând nivelului de TL1A în ser.

Dezvăluirea se referă, de asemenea, la kituri care cuprind oricare dintre variantele de anticorpi 320-179 descrise şi exemplificate aici. Kiturile pot fi utilizate pentru a furniza anticorpi şi alţi agenţi pentru utilizare în metode de diagnostic, cercetare fundamentală sau metode terapeutice, printre altele. În unele aspecte, kiturile cuprind oricare sau mai multe dintre variantele de anticorpi 320-179 descrise sau exemplificate aici şi instrucţiuni pentru utilizarea unuia sau mai multor anticorpi într-o metodă pentru tratarea unei boli a tractului respirator, într-o metodă pentru tratarea unei boli gastrointestinale, sau într-o metodă pentru tratarea artritei.

Exemplele care urmează sunt redate pentru a descrie dezvăluirea mai în detaliu. Acestea sunt destinate să ilustreze, nu să limiteze, dezvăluirea. Referirea la variantele 320-179, altele decât 320-587, sunt incluse în scopuri de referinţă.

Exemplul 1

Materiale si metode

Poziţiile aminoacizilor din aceste exemple sunt numerotate conform sistemului de numerotare Kabat. CDR-urile sunt definite în conformitate cu metoda AbM a sistemului de definire a CDR pe parcursul acestui document.

1.1. Generarea de pachete de variante. Secvenţele de aminoacizi cu regiune variabilă a lanţului greu şi uşor ale anticorpului 320-179 (SECV ID NR: 1 şi respectiv 2) au fost utilizate ca şabloane pentru proiectarea variantelor punctuale. 320-179 a fost descris anterior în Publ. U.S. Nr. 2014/0255302 (VH este SECV ID NR: 186 şi VL este SECV ID NR: 199 în această publicaţie) ca 320-179 (descrisă de asemenea ca C320-179). Acest anticorp a avut proprietăţi biofizice favorabile, a fost un inhibitor potent al TL1A şi a avut un profil scăzut de imunogenitate prevăzută scăzută.

Variantele de anticorpi din 320-179 au fost obţinute prin înlocuirea unuia dintr-un grup de nouă aminoacizi reprezentativi - A, S, Q, D, H, K, L, W, Y - câte unul de fiecare dată la una din fiecare poziţie de aminoacid CDR (aşa cum este definit de nomenclatura AbM) în CDR1 din lanţul uşor (CDR-L1), CDR3 din lanţul uşor (CDR-L3), CDR1 din lanţul greu (CDR-H1) şi CDR2 din lanţul greu (CDR-H2). Variantele de anticorpi, care încorporează A, S, Q, D, H, K, L, W, Y, au fost de asemenea obţinute în poziţia 59 şi 60 în lanţul greu variabil şi în poziţia 79 în lanţul uşor variabil. O listă completă a tuturor variantelor de anticorpi cu substituţie unică generate este prezentată în Figurile 1 (lanţ greu variabil) şi, respectiv, (lanţ uşor variabil).

1.2. Construcţia unor vectori de exprimare a anticorpilor. Variante de regiune variabilă au fost generate prin translaţia inversă a secvenţelor de aminoacizi în secvenţe de ADN care au fost ulterior sintetizate de novo prin asamblarea oligonucleotidelor sintetice. Variantele de VH au fost subclonate într-un vector de exprimare de mamifer care conţine o regiune constantă umană pentru a produce lanţuri grele de anticorpi cu lungime întreagă (CH1 a lanţului greu uman de IgG1, balama, domenii CH2 şi CH3) (de exemplu, UniProt Nr. P01857). În mod similar, variante de VL au fost subclonate într-un vector de exprimare de mamifer care conţine o regiune constantă lambda a lanţului uşor uman pentru a produce lanţuri de lambda de anticorp cu lungime întreagă (SwissProt Nr. P0CG05.1). În unele cazuri, lanţul greu cu şi, separat, lanţul uşor, lungime întreagă au fost translatate înapoi în secvenţe de ADN şi ulterior sintetizat de novo prin asamblarea oligonucleotidelor sintetice.

1.3. Exprimarea variantelor de anticorpi. Anticorpii au fost produşi prin co-transfectarea lanţurilor grele şi uşoare ale unor anticorpi în celule EXPI293® (Life Technologies, Carlsbad, CA). În ziua dinainte de transfecţie, a fost determinat numărul de celule necesare pentru experiment. Pentru fiecare transfecţie de 20 ml, au fost necesare 3,6 × 107 celule în 20 ml de mediu de exprimare EXPI293®. În ziua anterioară transfecţiei, celulele au fost însămânţate la o densitate de 0,9 × 106 celule viabile/mL şi incubate peste noapte la 37°C într-o în aer atmosferă umidificată cu 8% CO2 pe un agitator orbital care se roteşte la 200 rpm. În ziua transfecţiei, au fost determinate numărul de celule şi viabilitatea folosind un numărător automatizat de celule. Au fost utilizate numai culturi cu> 98% celule viabile. Pentru fiecare transfecţie de 20 ml, fost preparaţi complecşi lipidă-ADN au prin diluarea a 10 µg de ADN cu lanţ greu şi 10 µg de ADN cu lanţ uşor în mediu seric OPTI-MEM® (Life Technologies, Carlsbad, CA) I redus (Cat. nr. 31985-062) la un volum total de 1,0 ml. 54 µL de reactiv EXPIFECTAMINE® 293 (Life Technologies, Carlsbad, CA) a fost diluat în mediu OPTI-MEM® I până la un volum total de 1,0 ml. Ambele flacoane au fost amestecate uşor şi incubate timp de 5 minute la temperatura camerei. După incubare, ADN-ul diluat a fost amestecat cu reactiv EXPIFECTAMINE® 293 diluat şi amestecul de ADN- reactiv EXPIFECTAMINE® 293 şi incubat încă 20 de minute suplimentare la temperatura camerei pentru a permite formarea complecşilor de ADN- reactiv EXPIFECTAMINE® 293. După incubare, s-au adăugat 2 mL de complex de ADN- reactiv EXPIFECTAMINE® 293 în fiecare tub de bioreactor de 50 ml (TPP Techno Plastic Products AG). La tubul martor negativ, s-au adăugat 2 ml de mediu OPTI-MEM® (Life Technologies, Carlsbad, CA) I în locul complexului de ADN- reactiv EXPIFECTAMINE® 293. Celulele au fost incubate într-un incubator la 37°C în aer cu o atmosferă umidificată de 8% CO2 pe un agitator orbital care se roteşte la 200 rpm. Aproximativ 16-18 ore după transfecţie, în fiecare bioreactor s-au adăugat 100 µL de amplificator de transfecţie EXPIFECTAMINE® 293 1 şi 1,0 ml de amplificator de transfecţie EXPIFECTAMINE® 293 2. Anticorpii au fost recoltaţi la aproximativ 72 de ore după transfecţie.

1.4. Purificarea variantelor de anticorpi. Fiecare variantă de anticorp a fost exprimată în celule EXPI293® în 20 ml de cultură celulară. Culturile s-au răsturnat în tuburi falcon de 50 ml la 3000 x g timp de 20 minute, iar supernatantele s-au filtrat folosind un filtru de 0,22 µm (Corning). Supernatantele au fost purificate folosind un robot Gilson ASPEC GX274. Pe scurt, cartuşele SPE (Agilent, 12131014) ambalate cu 1,2 ml de răşină MABSELECT SURE® proteină A (GE Healthcare BioSciences AB Uppsala, Suedia) au fost pre-echilibrate cu 3 volume de coloane de 1X PBS. Peste coloane au fost trecute 18 ml de supernatant urmate de o spălare cu PBS de 1 x 4 ml. Fiecare coloană a fost pre-eluată cu 0,9 ml de acid citric 0,1 M, pH 2,9. Anticorpii purificaţi s-au eluat cu 2 mL acid citric 0,1 M, pH 2,9 Anticorpii s-au desalinizat în Sшrensens PBS (59,5 mM KH2PO4, 7,3 mM Na2HPO4.2H2O, 145,4 mM NaCl (pH ∼5,8)) folosind coloane PD-10 (GE Healthcare).

1.5. Exprimarea anticorpului şi legarea antigenului, determinată prin SPR. Utilizând un cip cu senzor CM5 (GE Healthcare) Proteina A (Pierce) a fost cuplată la suprafaţa cipului folosind un kit de cuplare de amină (GE Healthcare). Proteina A a fost cuplată pe celula de curgere 1 şi 2 (sau alternativ 3 şi 4) folosind un BIACORE® T200. Supernatantele din celulele EXPI-293® care conţin anticorp sau alternativ anticorpi purificaţi (aşa cum este descris la 1.4) au fost trecute pe suprafaţa celulei de curgere 2, în timp ce tamponul (HBS-EP) a fost trecut peste celula de curgere 1. Cantitatea de supernatant sau proteină purificată (precum şi concentraţia) injectată în timpul etapei de captare a variat între treceri şi este specificată în antetul Tabelele 3-11. La sfârşitul injecţiei supernatantului sau anticorpului purificat a fost măsurată modificarea unităţilor de răspuns. Această valoare a fost raportată ca nivel de captare în tabelele 3-11. Pentru a se determina dacă anticorpul a legat TL1A, TL1A a fost apoi trecut peste celulele de curgere 1 şi 2 şi unităţile de răspuns au fost măsurate înainte de sfârşitul injecţiei de TL1A (faza de asociere). Această valoare este etichetată ca nivel de legare TL1A (precoce) în tabelele 3-11. Unităţile de răspuns au fost măsurate înainte de sfârşitul fazei de disociere. Această valoare este etichetată ca nivel de legare TL1A (târziu) în Tabelele 3-11 şi este o măsură a cantităţii de anticorpi care s-a pierdut de pe suprafaţa cipului ca rezultat al disocierii complexului TL1A - anticorp. Senzorgramele au fost efectuate de două ori (celula de curgere 2 este scăzută din celula de curgere 1 şi un semnal de tampon). Deoarece a existat un număr mare de variante de anticorpi supuse unui screening, acestea au fost supuse screeningului pe diferite treceri (Tabelele 3-11). În fiecare caz (cu excepţia trecerii 3), anticorpul părinte, 320-179 a fost inclus în trecere, în scop de comparaţie. Un rezumat al condiţiilor utilizate în fiecare trecere este redat mai jos:

Tabelul 1.

Trecere # Supernatant Proteină Nivel de captură aproximativ (RU) Conc. TL1A eşantion (ug/mL) TL1A Nivel de legare (Precoce) moment de timp TL1A Nivel de legare (Târziu) moment de timp Note 1 x 400 10 59 590 Anticorp diluat la 2 ug/mL, timp captură variabil 2 x 1000 10 44 220 Supernatant diluat în tampon de trecere, timpi captură variabili 2 x 400 10 44 590 Anticorp diluat 2 ug/mL, timp captură variabil 3 x variabil 10 59 590 Supernatant diluat în tampon de trecere, 60 s captură 4 x 500 5 44 220 Anticorp diluat la 2 ug/mL în tampon de trecere 5 x 100 5 44 220 Supernatant diluat în tampon de trecere, 6 x variabil 5 44 170 Anticorp diluat la 2 ug/mL în tampon de trecere şi capturat timp de 45 s 7* x 400 5 44 220 Anticorp diluat la aprox. 2 ug/mL 8 x 400 5 44 590 Anticorp diluat la 2 ug/mL, timp captură variabil 9 x 400 5 44 590 Anticorp diluat la 2 ug/mL, timp captură variabil * Această trecere a fost efectuată pe un Biacore® A100

Legarea anti-TL1A la diferite specii TL1A a fost de asemenea determinată folosind SPR. Anticorpul anti-TL1A a fost capturat pe suprafaţa unei proteine A. TL1A de la oricare dintre un om, şobolan, şoarece, iepure, cobai, porc, câine, pisică sau maimuţă cynomolgus au fost făcuţi să curgă pe suprafaţă şi au fost măsurate unităţile de răspuns.

1.6. Producţia de TL1A. TL1A uman a fost produs în sistemul de exprimare EXPI293® de mamifer, folosind un construct de exprimare a ADN care codifică domeniul extracelular (ECD) al TL1A uman cu o etichetă HIS şi FLAG localizată la N-terminal. Alte forme de specii de TL1A au fost generate pe baza listării secvenţelor în bazele de date listate public. Acestea sunt rezumate mai jos:

Tabelul 2.

Specie TL1A Bază de date publică de referinţă SECV ID NR: Uman UniProt: O95150 31 Maimuţă Cynomolgus SECV ID NR: 125 din 34 Publ US. No. 2014/0255302 Şoarece UniProt: Q5UBV8 35 Şobolan UniProt: Q8K3Y7 36 Cobai UniProt: H0VFN8 37 Pisică NCBI: XP_003995828,1 38 Porc UniProt: I3LL00 39 Iepure UniProt: G1T1T1 40 Câine UniProt: J9P221 41

Supernatantul de cultură care conţine proteina TL1A secretată a fost recoltat prin centrifugare la 2000 x g timp de 10 minute pentru a se îndepărta celulele. Proteina TL1A a fost purificată din supernatant folosind o coloană HISTRAP® HP de la (GE Healthcare). Proteina eluată a fost schimbată cu tampon în PBS folosind o coloană HILOAD® 16/60 Superdex 200 grad prep (GE Healthcare) şi fracţiunea de ∼70 kDa a fost separată prin filtrare pe gel pe o coloană HILOAD® 26/60 SUPERDEX® 200 de grad prep (GE Healthcare).

1.7. Analiza de putere al liniei celulare TF-1. Pentru a se determina care anticorpi anti-TL1A neutralizează funcţional activitatea biologică a TL1A, anticorpii au fost testaţi în ceea ce priveşte capacitatea lor de a neutraliza apoptoza indusă de TL1A într-o linie de celule TF-1. Linia de celule eritroleucemice umane TF-1 (ATCC: CRL-2003) a fost menţinută în cultură în condiţii standard. Celulele TF-1 (7,5 x 104/godeu) au fost incubate în plăci cu margini negre cu 96 de godeuri (Greiner) cu TL1A umană 100 ng/ml şi cicloheximidă 10 pg/ml pentru a induce apoptoza. Anticorpii de testare la o concentraţie de 10 µg/ml (66,7 nM) sau mai puţin s-au adăugat pe plăci şi s-au incubat timp de 4 până la 5 ore. Inducerea apoptozei a fost apoi analizată folosind kitul Homogeneous Caspases (Roche) conform instrucţiunilor producătorului.

Datele au fost normalizate prin exprimarea ca procent de apoptoză maximă (niveluri de apoptoză obţinute de TL1A uman plus cicloheximidă în absenţa anticorpului anti-TL1A).

1.8. Selectivitatea receptorului anticorpilor conducători. TL1A se leagă atât de receptorul său de semnalizare înrudit, DR3, cât şi la un receptor capcană, DcR3, care serveşte, de asemenea, ca receptor capcană pentru membrii familiei TNF Fas-L şi LIGHT. Anticorpii au fost evaluaţi în ceea ce priveşte capacitatea lor de a inhiba legarea TL1A la receptorii săi într-o ELISA de competiţie. Chimera DR3/Fc (R&D Systems) sau Chimera DcR3/Fc (R&D Systems) a fost depusă ca acoperire pe o placă cu 96 de godeuri (Maxisorp, Nunc) la o concentraţie de 2µg/ml. Anticorpii de test diluaţi în serie au fost preincubaţi timp de 30 de minute cu 1µg/ml TL1A uman biotinilat cu un singur situs, apoi s-au adăugat la godeurile acoperite cu DR3/Fc sau DcR3/Fc. TL1A legat a fost detectat folosind peroxidază streptavidină-hrean 1:2000 (BD Pharmingen). Datele au fost normalizate prin exprimare ca procent din legarea maximă a TL1A la receptor în absenţa anticorpului anti-TL1A.

1.9. Analiza de excludere cinetică. Acest test măsoară concentraţia liberă a unuia dintre partenerii de legare fără a perturba echilibrul. Soluţiile pot fi preparate în afara liniei, folosind proteine nemodificate în soluţie, iar măsurările de afinitate pot fi citite la zile după amestecare pentru a se asigura că echilibrul a fost atins. Într-un test de excludere cinetică, un interactant (termen cu care este denumit un partener de legătură constant, sau CBP) este menţinut la o concentraţie constantă, în timp ce celălalt (denumit prin termenul de titrant) este diluat în serie. Testele de excludere cinetică pot fi utilizate pentru a se determina constanta de disociere (KD) şi afinitatea unei interacţiuni anticorp-antigen. Într-o analiză de excludere cinetică tipică, titrantul este imobilizat în perle (de exemplu, perle Sepharose sau PMMA) şi este utilizat pentru a capta CBP liber în soluţie. O sondă etichetată secundară este apoi utilizată pentru a cuantifica cantitatea de CBP capturat. Analiza de excludere cinetică este trecută în revistă în Darling, RK et al. (2004) ASSAY şi Drug Development Technol. 2(6):647-57.

Componentele au fost combinate şi lăsate să atingă echilibrul. Analiza de excludere cinetică a fost apoi utilizată pentru a măsura fracţia liberă a CBP. Curbele de echilibru cu concentraţii multiple de CBP au fost analizate folosind instrumentul de analiză n-curbei n din software-ul KinExA® Pro (versiunea 4.1.11, Sapidyne) pentru a se obţine determinări robuste ale KD. Interacţiunea 320-587 pentru TL1A umană a fost examinată utilizând două orientări: (1) CBP este 320-587, titrant este TL1A şi (2) CBP este TL1A, titrant este 320-587.

Exemplul 2

Rezultate experimentale

2.1. Selectarea variantelor TL1A de legare cu o rată echivalentă sau îmbunătăţită în raport cu C320-179. Variantele de anticorp 320-179 au fost construite şi exprimate aşa cum a fost descris mai sus. Supernatante de EXPI293® (Life Technologies Corp.) ale fiecărei variante au fost analizate prin BIACORE® (GE Healthcare) şi datele obţinute au fost comparate cu cele ale anticorpului 320-179 parental. În unele experimente, anticorpii au fost purificaţi folosind cromatografia proteinei A (a se vedea 1.4) şi anticorpii purificaţi au fost utilizaţi în experimente BIACORE® (GE Healthcare). Tabelele 3-11 prezintă nivelul de exprimare a fiecărei variante, împreună cu legarea sa la TL1A la un moment precoce şi târziu. În testările ulterioare (tabelul 10 şi 11) s-au testat variante de anticorp care conţin mai mult de o substituţie de aminoacid.

Tabelul 3. Experiment SPR - Trecere 1 - Anticorpi anti-TL1A care se leagă la TL1A.

* indică anticorpi care au fost selectaţi pentru analiza de testare a potenţei.

Anticorp Substituţie VH în raport cu 320-179 Substituţie VL în raport 320-179 Nivel captare Nivel de legare TL1A (Precoce) Nivel de legare TL1A (Târziu) Anticorp purificat 320-179 Nici una Nici una 410 140 117 320-184* Nici una L79A 414 141 118 320-185* Nici una L79S 401 137 114 320-186* Nici una L79Q 398 136 113 320-187* Nici una L79D 388 134 112 320-188* Nici una L79H 397 136 113 320-189* Nici una L79K 393 130 107 320-190* Nici una L79W 395 136 113 320-191* Nici una L79Y 408 140 117

Tabelul 4. Experiment SPR - Trecere 2 - Anticorpi anti-TL1A care se leagă la TL1A.

Anticorp Substituţie VH în raport cu 320-179 Substituţie VL în raport cu 320-179 Nivel de captare Nivel de legare TL1A (Precoce) Nivel de legare TL1A (Târziu) Nivel de captare Nivel de legare TL1A (Precoce) Nivel de legare TL1A (Târziu) Supernatant Anticorp purificat 320-179 Nici una Nici una 1133 287 261 410 140 117 320-192 Nici una T24A 960 238 218 - - - 320-193 Nici una T24S 990 249 227 409 103 91 320-194 Nici una T24Q 974 247 226 398 76 64 320-195 Nici una T24D 992 249 227 - - - 320-196 Nici una T24H 995 250 228 - - - 320-197 Nici una T24K 1017 255 232 401 105 94 320-198* Nici una T24L 1023 262 241 - - - 320-199 Nici una T24W 1050 251 233 404 97 85 320-200 Nici una T24Y 1027 251 231 320-201* Nici una S25A 990 274 252 393 73 57 320-202* Nici una S25Q 1034 234 214 - - - 320-203 Nici una S25D 977 61 24 407 65 35 320-204 Nici una S25H 1003 193 155 - - - 320-205* Nici una S25K 1025 290 271 401 70 51 320-206 Nici una S25L 1000 257 235 - - - 320-207* Nici una S25W 1022 268 243 - - - 320-208 Nici una S25Y 1034 222 199 - - - 320-209* Nici una S26A 1007 222 200 - - - 320-210 Nici una S26Q 1033 225 202 - - - 320-211* Nici una S26D 1025 206 164 392 80 64 320-212 Nici una S26H 1013 226 205 - - - 320-213* Nici una S26K 1052 218 194 422 79 65 320-214 Nici una S26L 1038 221 196 - - - 320-215 Nici una S26W 1021 220 199 - - - 320-216 Nici una S26Y 1010 171 147 - - - 320-217 Nici una S27A 1076 258 235 - - - 320-218 Nici una S27Q 1081 239 218 412 92 80 320-219* Nici una S27D 1061 243 220 - - - 320-220 Nici una S27H 1049 253 230 - - - 320-221 Nici una S27K 1063 225 207 413 99 89 320-222 Nici una S27L 1037 156 96 - - - 320-223 Nici una S27W 1061 143 66 - - - 320-224 Nici una S27Y 1055 198 153 - - - 320-225 Nici una S27aA 1066 267 243 - - - 320-226* Nici una S27aQ 1035 250 228 - - - 320-227 Nici una S27aD 1022 242 218 - - - 320-228 Nici una S27aH 1072 259 235 - - - 320-229* Nici una S27aK 1057 268 251 - - - 320-230 Nici una S27aL 1087 245 223 - - - 320-231 Nici una S27aW 1078 271 243 - - - 320-232 Nici una S27aY 1051 261 235 - - - 320-233 Nici una D27bA 1118 255 235 409 48 16 320-234 Nici una D27bS 1089 262 239 - - - 320-235 Nici una D27bQ 1110 256 236 - - - 320-236 Nici una D27bH 1085 254 232 415 5 6 320-237 Nici una D27bK 1073 240 221 398 10 8 320-238 Nici una D27bL 1106 221 191 - - - 320-239 Nici una D27bW 1079 212 163 - - - 320-240 Nici una D27bY 1089 230 196 - - - 320-241* Nici una I27cA 1092 179 122 - - - 320-242 Nici una I27cS 1076 124 49 - - - 320-243 Nici una I27cQ 1065 71 26 - - - 320-244* Nici una I27cD 1083 21 20 - - - 320-245* Nici una I27cH 1084 59 26 - - - 320-246 Nici una I27cK 1089 32 23 - - - 320-247 Nici una I27cL 1078 205 162 - - - 320-248 Nici una I27cW 1110 96 30 - - - 320-249 Nici una I27cY 1096 77 28 - - - 320-250 Nici una G28A 1104 180 115 - - - 320-251 Nici una G28S 1085 134 50 - - -

Tabelul 5. Experiment SPR - Trecere 3 - Anticorpi anti-TL1A care se leagă la TL1A. * indică anticorpi care au fost selectaţi pentru analiza de testare a potenţei.

Anticorp Substituţie VH în raport cu 320-179 Substituţie VL în raport cu 320-179 Nivel de captare Nivel de legare TL1A (Precoce) Nivel de legare TL1A (Târziu) Supernatant 320-252 Nici una G28Q 996 20 9 320-253 Nici una G28D 1073 6 6 320-254 Nici una G28H 1021 17 8 320-255 Nici una G28K 842 24 8 320-256 Nici una G28L 1055 30 10 320-257 Nici una G28W 981 83 18 320-258 Nici una G28Y 823 9 6 320-259 Nici una A29S 824 194 179 320-260 Nici una A29Q 836 182 165 320-261 Nici una A29D 956 86 29 320-262 Nici una A29H 891 209 190 320-263* Nici una A29K 848 121 123 320-264 Nici una A29L 831 199 184 320-265 Nici una A29W 1057 168 69 320-266 Nici una A29Y 934 218 192 320-267* Nici una G30A 1148 299 297 320-268 Nici una G30S 392 28 7 320-269 Nici una G30Q 764 126 93 320-270 Nici una G30D 511 9 5 320-271 Nici una G30H 1067 106 30 320-272 Nici una G30K 935 5 5 320-273 Nici una G30L 710 4 4 320-274 Nici una G30W 796 12 7 320-275 Nici una G30Y 751 44 10 320-276 Nici una L31A 1273 244 215 320-277* Nici una L31S 1741 387 361 320-278* Nici una L31Q 1696 389 374 320-279 Nici una L31D 561 144 128 320-280* Nici una L31H 881 228 211 320-281 Nici una L31K 321 22 6 320-282 Nici una L31W 811 75 16 320-283 Nici una L31Y 317 2 3 320-284 Nici una G32A 374 1 2 320-285 Nici una G32S 400 1 2 320-286 Nici una G32Q 576 1 4 320-287 Nici una G32D 339 0 2 320-288 Nici una G32H 422 1 3 320-289 Nici una G32K 463 1 3 320-290 Nici una G32L 361 1 2 320-291 Nici una G32W 414 2 3 320-292 Nici una G32Y 423 111 94 320-293 Nici una V33A 421 104 86 320-294 Nici una V33S 419 79 61 320-295 Nici una V33Q 414 109 94 320-296 Nici una V33D 428 118 104 320-297* Nici una V33H 420 95 77 320-298 Nici una V33K 416 114 100 320-299 Nici una V33L 420 51 13 320-300 Nici una H34W 417 111 95 320-301 Nici una H34Y 456 108 96 320-302* Nici una H34A 423 99 74 320-303 Nici una H34S 408 71 32 320-304 Nici una H34Q 401 103 82 320-305 Nici una H34D 424 34 10 320-306 Nici una H34K 452 147 133 320-307* Nici una H34L 873 216 200 320-308 Nici una H34W 458 106 73 320-309 Nici una H34Y 255 47 40 320-310 Nici una Q89A 348 70 62 320-311 Nici una Q89S 0 0 0

Tabelul 6. Experiment SPR - Trecere 4 - Anticorpi anti-TL1A care se leagă la TL1A.

Anticorp Substituţie VH în raport cu 320-179 Substituţie VL în raport cu 320-179 Nivel de captare Nivel de legare TL1A (Precoce) Nivel de legare TL1A (Târziu) Anticorp purificat 320-179 Nici una Nici una 616 177 163 320-312 Nici una Q89D 529 10 10 320-313* Nici una Q89H 502 141 132 320-314* Nici una Q89K 598 165 158 320-315 Nici una Q89L 515 85 82 320-316 Nici una Q89W 535 65 62 320-317 Nici una Q89Y 570 86 83 320-318* Nici una S90A 578 160 149 320-319 Nici una S90Q 523 18 14 320-320 Nici una S90D 534 31 17 320-321 Nici una S90H 491 16 13 320-322 Nici una S90K 450 17 14 320-323 Nici una S90W 490 14 13 320-324 Nici una S90Y 528 13 12 320-325 Nici una Y91A 491 95 83 320-326* Nici una Y91S 550 126 120 320-327 Nici una Y91Q 493 130 119 320-328* Nici una Y91H 542 155 146 320-329 Nici una Y91K 600 9 11 320-330 Nici una Y91L 600 139 119 320-331* Nici una Y91W 615 173 176 320-332 Nici una D92A 531 66 44 320-333 Nici una D92S 559 95 67 320-334 Nici una D92Q 543 15 14 320-335 Nici una D92H 581 15 14 320-336 Nici una D92K 484 11 11 320-337 Nici una D92L 475 21 15 320-338 Nici una D92W 548 9 11 320-339 Nici una D92Y 509 10 11 320-340 Nici una G93A 548 145 132 320-341 Nici una G93S 560 149 135 320-342 Nici una G93Q 560 152 139 320-343 Nici una G93D 545 121 90 320-344 Nici una G93H 529 117 87 320-345* Nici una G93K 637 163 154 320-346 Nici una G93L 526 126 107 320-347 Nici una G93W 560 149 130 320-348 Nici una G93Y 541 144 127 320-349 Nici una T94A 556 112 88 320-350 Nici una T94S 502 130 118 320-351 Nici una T94Q 553 112 83 320-352 Nici una T94D 568 101 63 320-353 Nici una T94H 558 97 73 320-354 Nici una T94K 536 53 30 320-355 Nici una T94L 526 102 76 320-356 Nici una T94W 486 109 86 320-357 Nici una T94Y 563 119 91 320-358 Nici una L95A 501 82 50 320-359 Nici una L95S 503 57 27 320-360 Nici una L95Q 554 86 53 320-361* Nici una L95D 477 12 11 320-362 Nici una L95H 522 8 9 320-363 Nici una L95Y 566 17 16 320-364 Nici una S95aA 516 124 109 320-365 Nici una S95aQ 536 141 128 320-366 Nici una S95aD 487 62 31 320-367 Nici una S95aH 595 119 116 320-368 Nici una S95aK 602 50 26 320-369 Nici una S95aL 503 89 60 320-370 Nici una S95aW 570 66 39 320-371 Nici una S95aY 576 92 70

Tabelul 7. Experiment SPR - Run 5 - Anticorpi anti-TL1A care se leagă la TL1A.

Anticorp Substituţie VH în raport cu 320-179 Substituţie VL în raport cu 320-179 Nivel de captare Nivel de legare TL1A (Precoce) Nivel de legare TL1A (Târziu) Supernatant 320-179 Nici una Nici una 83 11 10 320-372 Nici una A96S 106 1 0 320-373 Nici una A96Q 99 -1 -1 320-374 Nici una A96D 98 1 0 320-375 Nici una A96H 108 -2 -1 320-376 Nici una A96K 98 3 1 320-377 Nici una A96L 101 -1 -1 320-378 Nici una A96W 105 -1 -1 320-379 Nici una A96Y 105 3 1 320-380 Nici una L97A 104 1 1 320-381 Nici una L97S 97 3 1 320-382 Nici una L97Q 106 0 0 320-383 Nici una L97D 102 3 1 320-384 Nici una L97H 98 3 2 320-385 Nici una L97K 108 1 1 320-386 Nici una L97W 104 1 0 320-387 Nici una L97Y 97 11 10 320-388 G26A Nici una 110 14 13 320-389 G26S Nici una 105 12 11 320-390 G26Q Nici una 100 12 11 320-391 G26D Nici una 106 14 13 320-392 G26H Nici una 109 12 11 320-393 G26K Nici una 100 12 11 320-394 G26L Nici una 106 13 12 320-395 G26W Nici una 104 13 12 320-396 G26Y Nici una 104 12 11 320-397 Y27A Nici una 109 12 12 320-398 Y27S Nici una 110 12 11 320-399 Y27Q Nici una 105 10 10 320-400 Y27D Nici una 106 11 11 320-401 Y27H Nici una 100 11 10 320-402 Y27L Nici una 98 11 10 320-403 Y27W Nici una 84 11 10 320-404 T28A Nici una 84 11 10 320-405 T28S Nici una 79 10 9 320-406 T28Q Nici una 82 8 7 320-407 T28D Nici una 88 12 11 320-408 T28H Nici una 81 13 12 320-409 T28K Nici una 83 10 10 320-410 T28L Nici una 86 11 10 320-411 T28W Nici una 82 10 9 320-412 T28Y Nici una 89 10 9 320-413 F29A Nici una 89 9 8 320-414 F29S Nici una 78 7 7 320-415 F29Q Nici una 85 5 4 320-416 F29D Nici una 81 9 8 320-417 F29H Nici una 85 9 8 320-418 F29K Nici una 85 10 9 320-419 F29L Nici una 83 11 9 320-420 F29W Nici una 85 11 10 320-421 F28Y Nici una 81 9 8 320-422 T30A Nici una 80 10 9 320-423 T30S Nici una 86 10 10 320-424 T30Q Nici una 86 11 10 320-425 T30D Nici una 89 14 12 320-426 T30H Nici una 84 10 9 320-427 T30K Nici una 88 11 10 320-428 T30L Nici una 88 11 10 320-429 T30W Nici una 90 12 11 320-430 T30Y Nici una 85 6 6 320-431 S31A Nici una 85 6 6

Tabelul 8. Experiment SPR - Trecere 6 - Anticorpi anti-TL1A care se leagă la TL1A.

Anticorp Substituţie VH în raport cu 320-179 Substituţie VL în raport cu 320-179 Nivel de captare Nivel de legare TL1A (Precoce) Nivel de legare TL1A (Târziu) Anticorp purificat 320-179 Nici una Nici una 449 111 102 320-432 S31Q Nici una 466 116 106 320-433 S31D Nici una 412 90 83 320-434 S31K Nici una 473 125 113 320-435 S31L Nici una 384 92 83 320-436 S31W Nici una 525 129 118 320-437 S31Y Nici una 501 119 109 320-438 Y32A Nici una 468 126 116 320-439 Y32S Nici una 464 119 108 320-440 Y32Q Nici una 408 108 97 320-441 Y32D Nici una 388 80 67 320-442 Y32H Nici una 490 124 113 320-443* Y32K Nici una 438 114 103 320-444 Y32L Nici una 458 107 95 320-445* Y32W Nici una 442 116 106 320-446 D33A Nici una 469 18 8 320-447 D33S Nici una 503 37 13 320-448 D33Q Nici una 482 7 6 320-449 D33H Nici una 483 76 59 320-450 D33K Nici una 536 1 3 320-451 D33L Nici una 497 19 8 320-452 D33W Nici una 445 84 78 320-453 D33Y Nici una 449 111 104 320-454 134A Nici una 189 43 37 320-455 I34S Nici una 144 27 23 320-456 I34Q Nici una 214 52 46 320-457 I34D Nici una 55 6 4 320-458 I34H Nici una 239 59 53 320-459 I34K Nici una 93 20 17 320-460 I34L Nici una 441 114 105 320-461 I34W Nici una 465 87 82 320-462 I34Y Nici una 373 58 52 320-463* N35A Nici una 462 102 101 320-464* N35S Nici una 600 130 124 320-465 N35Q Nici una 476 92 78 320-466 N35D Nici una 360 93 86 320-467 N35H Nici una 350 44 24 320-468 N35K Nici una 200 2 2 320-469 N35L Nici una 315 69 61 320-470 N35W Nici una 329 2 3 320-471 N35Y Nici una 312 3 4 320-472 Nici una S90L 467 23 10 320-473 Nici una Y91D 453 69 55 320-474 Nici una L95K 596 2 4 320-475 Nici una L95W 727 8 8 320-476 Y27K Nici una 560 128 118 320-477* S31H Nici una 576 148 136 320-478 A60L Nici una 379 85 77 320-479 A60W Nici una 277 61 54 320-480 A60Y Nici una 319 79 73 320-483 W50A Nici una 492 4 6 320-484 W50S Nici una 555 3 6 320-485 W50Q Nici una 460 3 5 320-486 W50D Nici una 178 1 2 320-487 W50H Nici una 237 2 3 320-488 W50K Nici una 293 1 2 320-489 W50L Nici una 337 4 5 320-490 W50Y Nici una 393 14 8 320-491 L51S Nici una 356 85 76

Tabelul 9. Experiment SPR - Trecere 7 - Anticorpi anti-TL1A care se leagă la TL1A.

Anticorp Substituţie VH în raport cu 320-179 Substituţie VL în raport cu 320-179 Nivel de captare Nivel de legare TL1A (Precoce) Nivel de legare TL1A (Târziu) Anticorp purificat 320-179 Nici una Nici una 301 61 56 320-492 L51Q Nici una 439 89 82 320-493 L51D Nici una 242 48 46 320-494 L51H Nici una 811 150 138 320-495 L51K Nici una 466 84 77 320-496 L51W Nici una 581 93 87 320-497 N52A Nici una 727 135 125 320-498 N52S Nici una 485 90 82 320-499 N52Q Nici una 551 122 113 320-500 N52D Nici una 472 69 53 320-501 N52H Nici una 533 118 108 320-502 N52K Nici una 659 88 59 320-503 N52W Nici una 484 41 6 320-504 N52Y Nici una 500 88 65 320-505 P52aA Nici una 570 118 110 320-506 P52aS Nici una 444 97 89 320-507 P52aQ Nici una 181 27 24 320-508 P52aD Nici una 203 19 12 320-509 P52aH Nici una 290 52 47 320-510 P52aK Nici una 289 44 33 320-511 P52aL Nici una 581 106 98 320-512 P52aW Nici una 746 126 118 320-513 P52aY Nici una 585 99 90 320-514 N53A Nici una 516 96 88 320-515 N53S Nici una 375 73 67 320-516 N53Q Nici una 461 92 86 320-517 N53D Nici una 493 55 50 320-518 N53H Nici una 882 169 153 320-519 N53K Nici una 993 217 196 320-520 N53L Nici una 1016 174 162 320-521 N53W Nici una 830 166 152 320-522 N53Y Nici una 693 141 129 320-523 S54A Nici una 476 88 82 320-524 S54Q Nici una 292 55 49 320-525 S54D Nici una 437 33 17 320-526 S54H Nici una 672 134 124 320-527 S54K Nici una 578 146 136 320-528 S54L Nici una 829 121 108 320-529 S54W Nici una 605 94 83 320-530 S54Y Nici una 425 77 67 320-531 G55A Nici una 331 66 61 320-532 G55S Nici una 648 10 7 320-533 G55Q Nici una 441 93 86 320-534 G55D Nici una 647 109 102 320-535 G55H Nici una 637 126 115 320-536 G55K Nici una 553 115 105 320-537 G55L Nici una 717 133 123 320-538 G55W Nici una 318 54 49 320-539 N56A Nici una 859 172 159 320-540 N56S Nici una 500 100 92 320-541 N56Q Nici una 504 94 84 320-542 N56D Nici una 839 97 86 320-543 N56H Nici una 597 138 126 320-544 N56K Nici una 690 120 112 320-545 N56L Nici una 518 109 100 320-546 N56W Nici una 341 67 61 320-547* N56Y Nici una 318 77 75 320-548 T57A Nici una 335 74 68 320-549 T57S Nici una 269 50 45 320-550 T57Q Nici una 635 112 103 320-551 T57D Nici una 280 44 36 320-552 T57H Nici una 595 104 97 320-553 T57K Nici una 494 84 78 320-554 T57L Nici una 506 66 51 320-555 T57W Nici una 674 62 30 320-556 T57Y Nici una 634 100 90 320-557 G58A Nici una 378 26 6 320-558 G58S Nici una 463 3 2 320-559 G58Q Nici una 535 9 5 320-560 G58D Nici una 907 36 9 320-561 G58H Nici una 539 14 6 320-562 G58K Nici una 326 2 1 320-563 G58L Nici una 258 2 2 320-564 G58W Nici una 345 72 67 320-565 G58Y Nici una 545 43 12 320-566 Y59A Nici una 720 120 110 320-567 Y59S Nici una 590 96 86 320-568 Y59Q Nici una 688 115 107 320-569 Y59D Nici una 408 79 73 320-570 Y59H Nici una 435 79 72 320-571 Y59K Nici una 394 78 72 320-572 A60S Nici una 459 98 90 320-573 A60Q Nici una 338 67 62 320-574 A60D Nici una 693 140 130 320-575 A60H Nici una 581 121 110 320-576 A60K Nici una 479 90 83 320-577 L51A Nici una 479 98 90 320-578 L51Y Nici una 415 83 77 320-579 N52L Nici una 214 46 41 320-580 G55Y Nici una 261 51 47 320-581 Y59L Nici una 337 70 65 320-582 Y59W Nici una 453 67 52

Tabelul 10. Experiment SPR - Trecere 8 - Anticorpi anti-TL1A care se leagă la TL1A. * indică anticorpi care au fost selectaţi pentru analiza de testare a potenţei.

Anticorp Substituţie VH în raport cu 320-179 Substituţie VL în raport cu 320-179 Nivel de captare Nivel de legare TL1A (Precoce) Nivel de legare TL1A (Târziu) Anticorp purificat 320-179 Nici una Nici una 402 98 86 320-583* Nici una G30A, Y91W 404 108 103 320-584* Nici una L31S, Y91W 399 103 98 320-585* Nici una L31Q, Y91W 406 116 109 320-586* Nici una H34L, Y91W 405 108 103 320-587* N56Y Y91W 402 123 122 320-588* N56Y G30A 409 128 123 320-589* N56Y L31S 399 120 109 320-590* N56Y L31Q 405 130 121 320-591* N56Y H34L 399 132 124 320-592* N56Y G30A, Y91W 408 128 129 320-593* N56Y L31S, Y91W 405 126 124 320-594* N56Y L31Q, Y91W 407 134 132 320-595* N56Y H34L, Y91W 403 129 128

Tabelul 11. Experiment SPR - Run 9 - Anticorpi anti-TL1A care se leagă la TL1A.

Anticorp Substituţie VH în raport cu 320-179 Substituţie VL în raport cu 320-179 Nivel de captare Nivel de legare TL1A (Precoce) Nivel de legare TL1A (Târziu) Anticorp purificat 320-179 Nici una Nici una 402 108 98 320-596 Nici una Y91F 405 95 85 320-597 Nici una L31Q, Y91F 401 115 105 320-598 Nici una H34L, Y91F 403 112 101 320-599 Nici una L31S, Y91F 411 113 103 320-600 Nici una G30A, Y91F 399 111 104 320-601* N56Y Y91F 409 121 120 320-602 N56Y L31Q, Y91F 399 131 125 320-603 N56Y H34L, Y91F 394 126 118 320-605 N56Y G30A, Y91F 399 125 120 320-611* N56Y Y91W, G93K 397 125 127 320-612 Nici una Y91W, G93Y 400 126 120 320-613* N56Y Y91W, G93Y 408 135 131 320-614 N56Y G93K 401 122 111 320-615 N56Y G93Y 393 113 108 320-616 N56Y G93A 396 120 112

Anticorpii care au avut niveluri de captare similare sau mai bune decât 320-179, precum şi valori ale nivelului de legare a TL1A (timpuriu) şi ale nivelului de legare a TL1A (târziu) care au fost într-un interval similar au fost preluaţi în continuare în analize de testare a potenţei. Aceste variante sunt indicate prin umbrire în Tabelele 3-11. O comparaţie a ratei măsurate prin SPR pentru mai mulţi dintre anticorpi este prezentată în figura 5. Mai mulţi anticorpi au disociat cu o viteză mai mică decât cea a anticorpului parental 320-179.

2.2 Anticorpi anti-TL1A cu putere îmbunătăţită în analiza pe bază de celule. Pentru a se evalua dacă rata îmbunătăţită s-a corelat cu un anticorp purificat cu putere crescută, s-au efectuat variante în analiza activităţii caspazei induse de TL1A în celule TF-1. Anticorpii potenţi acţionează prin legarea la TL1A şi inhibarea activării TL1A a receptorului de DR3. Acest receptor declanşează o cale de apoptoză în care sunt activate caspazele şi pot fi detectate folosind reactivi comerciali. În fiecare experiment, varianta de anticorp a fost comparată cu 320-179 în ceea ce priveşte numărul de ori de îmbunătăţire a potenţei. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 12.

Tabelul 12. Analiza potenţei caspazei induse de TL1A în celule TF-1: Inhibare cu anticorpi anti-TL1A.

Anticorp Substituţie VH în raport cu 320-179 Substituţie VL în raport cu 320-179 Anticorp IC50 (µg/mL) 320-179 IC50 (µg/mL) Nr. ori îmbunătăţire 320-184 Nici una L79A 0,010 0,030 3 320-185 Nici una L79S 0,020 0,030 2 320-186 Nici una L79Q 0,030 0,030 1 320-187 Nici una L79D 0,020 0,040 2 320-188 Nici una L79H 0,010 0,040 4 320-189 Nici una L79K 0,110 0,040 0 320-190 Nici una L79W 0,020 0,040 2 320-191 Nici una L79Y 0,020 0,040 2 320-198 Nici una T24L 0,010 0,010 1 320-201 Nici una S25A 0,005 0,010 2 320-202 Nici una S25Q 0,010 0,010 1 320-205 Nici una S25K 0,020 0,030 2 320-207 Nici una S25W 0,007 0,020 3 320-209 Nici una S26A 0,040 0,020 1 320-211 Nici una S26D 0,010 0,030 3 320-213 Nici una S26K 0,070 0,030 0 320-219 Nici una S27D 0,020 0,030 2 320-226 Nici una S27aQ 0,030 0,020 1 320-229 Nici una S27aK 0,040 0,060 2 320-241 Nici una I27cA 0,020 0,010 1 320-244 Nici una I27cD 5,030 0,010 0 320-245 Nici una I27cH 0,540 0,010 0 320-263 Nici una A29K 0,003 0,010 3 320-267 Nici una G30A 0,010 0,040 4 320-277 Nici una L31S 0,003 0,010 3 320-278 Nici una L31Q 0,010 0,020 2 320-280 Nici una L31H 0,006 0,020 3 320-297 Nici una V33H 0,005 0,020 4 320-302 Nici una H34A 0,010 0,020 2 320-307 Nici una H34L 0,010 0,040 4 320-313 Nici una Q89H 0,020 0,030 2 320-314 Nici una Q89K 0,020 0,030 2 320-318 Nici una S90A 0,020 0,050 3 320-326 Nici una Y91S 0,030 0,050 2 320-328 Nici una Y91H 0,020 0,020 1 320-331 Nici una Y91W 0,002 0,020 10 320-345 Nici una G93K 0,020 0,010 1 320-361 Nici una L95D 0,010 0,010 1 320-443 Y32K Nici una 0,060 0,060 1 320-445 Y32W Nici una 0,030 0,060 2 320-463 N35A Nici una 0,020 0,050 3 320-464 N35S Nici una 0,030 0,050 2 320-477 S31H Nici una 0,030 0,040 1 320-547 N56Y Nici una 0,004 0,040 10 320-583 Nici una G30A, Y91W 0,003 0,080 27 Anticorp Substituţie VH în raport cu 320-179 Substituţie VL în raport cu 320-179 Anticorp IC50 (µg/mL) 320-179 IC50 (µg/mL) Nr. ori îmbunătăţire 320-584 Nici una L31S, Y91W 0,008 0,080 10 320-585 Nici una L31Q, Y91W 0,003 0,040 13 320-586 Nici una H34L, Y91W 0,002 0,050 25 320-587 N56Y Y91W 0,001 0,040 40 320-588 N56Y G30A 0,004 0,020 5 320-589 N56Y L31S 0,020 0,020 1 320-590 N56Y L31Q 0,006 0,020 3 320-591 N56Y H34L 0,002 0,020 10 320-592 N56Y G30A, Y91W 0,003 0,020 7 320-593 N56Y L31S, Y91W 0,004 0,060 15 320-594 N56Y L31Q, Y91W 0,005 0,060 12 320-595 N56Y H34L, Y91W 0,003 0,060 20 320-601 N56Y Y91F 0,002 0,020 10 320-611 N56Y Y91W, G93K 0,005 0,040 8 320-613 N56Y Y91W, G93Y 0,010 0,040 4

** Anumiţi anticorpi cu număr de ori de îmbunătăţire mai mare de 10 ori îmbunătăţire a potenţei au fot trecuţi prin n=7 analize. Rezultatele au fost în concordanţă cu datele prezentate în acest tabel. Figura 7 arată n=4 replicări ale unora dintre anticorpii cu putere îmbunătăţită în comparaţie cu 320-179.

Aşa cum s-a demonstrat în tabelul 12 şi în figura 6, unii dintre anticorpi cu o singură substituţie testaţi au o putere superioară comparativ cu 320-179. Dintre toate variantele de anticorpi cu o singură substituţie testate, două au avut o îmbunătăţire mai mare de 10 ori a potenţei în comparaţie cu 320-179. Aceste variante au fost 320-331 (care a conţinut o substituţie Y91W în lanţul uşor variabil) şi 320-547 (care a conţinut o substituţie N56Y în lanţul greu variabil) (Figura 6). Acest rezultat este neaşteptat, deoarece tipic CDR3 al VH a anticorpului este implicat predominant în legarea anticorpilor, în schimb, substituţia N56Y despre care s-a identificat că are influenţă substanţială asupra legării, se găseşte în CDR2 al VH a anticorpului. Când s-au obţinute variante care încorporează fie Y91W din VL fie separat N56Y în VH cu alte substituţii care au îmbunătăţit potenţa, s-au obţinut anticorpi cu o putere ridicată. Când substituţia VL Y91W a fost combinată cu substituţia VH N56Y într-un singur anticorp, 320-587, numărul de ori de îmbunătăţire a potenţei comparativ cu 320-179 a fost 40. Figura 7 arată patru experimente repetate diferite care demonstrează creşterea potenţei a patru anticorpi 320-587, 320-591, 320-592, şi 320-601 comparativ cu 320-179. Secvenţele acestor anticorpi cu o putere îmbunătăţită în comparaţie cu 320-179 sunt prezentate în figura 3 (lanţ greu variabil) şi în figura 4 (lanţ uşor variabil).

S-a efectuat o comparaţie a potenţei 320-587 în comparaţie cu alţi anticorpi anti-TL1A descrişi anterior. Aceşti anticorpi descrişi anterior includ anticorpul 1681N descris în brevetul US Nr. 8,642,741 (VH este SECV ID NR: 18; VL este SECV ID NR. 26), anticorpul VH5/VL1 din Publ. U.S. Nr. 2014/0308271 (VH este SECV ID NR: 24; VL este SECV ID NR: 17), 1B4 umanizat aşa cum este descris în Brevetul U.S. Nr. 8,263,743 (VH este SECV ID NR: 74; VL este SECV ID NR: 75) şi 320-168 (de asemenea denumit C320-168) aşa cum este descris în Publ. U.S. Nr. 2014/0255302A1 (VH este SECV ID NR: 181; VL este SECV ID NR: 194).

Figura 8 arată că 320,587 are o putere superioară în analiza pe bază de celule în comparaţie cu aceşti anticorpi descrişi anterior, ceea ce îl face cel mai potent anticorp anti-TL1A descris.

2.3. Analize de concurenţă ale receptorilor DR3 şi DcR3. Anticorpii care au prezentat o putere crescută comparativ cu 320-179 au fost analizaţi în ceea ce priveşte capacitatea lor de a inhiba legarea TL1A la receptorul său de semnalizare înrudit, DR3 sau un receptor capcană, DcR3. Toţi anticorpii anti-TL1A testaţi au dovedit inhibarea legării TL1A la DR3, în comparaţie cu un martor izotip (Figura 9). Acest lucru confirmă faptul că anticorpii inhibă activitatea TL1A prin blocarea interacţiunii TL1A-DR3.

În experimentele anterioare descrise în Publ. U.S. Nr. 2014/0255302A1 (Exemplul 4), anticorpul 320-179 (320-179) a fost testat în analiza de concurenţă al receptorilor şi s-a arătat că inhibă selectiv legarea TL1A la DR3 prin nu la DcR3 (Figura 10). În experimentele prezentate aici în Figura 10, se arată din nou că 320-179 nu inhibă interacţiunea TL1A-DcR3. Aceasta este în contrast cu anticorpii îmbunătăţiţi anti-TL1A testaţi. Anticorpii cu putere îmbunătăţită în analiza celulară TF-1 (descrisă în secţiunea 2.2), incluzând anticorpul 320-587, au inhibat consecvent interacţiunea TL1A-DcR3.

În rezumat, anticorpul parental 320-179 a fost capabil să inhibe interacţiunea TL1A-DR3, dar nu şi interacţiunea TL1A-DcR3. Mai mulţi anticorpi cu putere îmbunătăţită, cum ar fi 320-267 (VH este Secv id nr: 1; VL este Secv id nr: 11), 320-277 (VH este SECV ID NR: 1, VL este SECV ID NR 12), 320-278 (VH este SECV ID NR 1; VL este SECV ID NR 13) şi 320-591 (VH este SECV ID NR: 3, VL este SECV ID NR 9)) au inhibat interacţiunea TL1a-DR3, dar nu şi interacţiunea TL1A-DcR3. Mai mulţi anticorpi cu putere îmbunătăţită, cum ar fi 320-331, 320-547, 320-583, 320-584, 320-585, 320-586, 320-587 şi variante ale acestor anticorpi, sunt capabili să inhibe atât interacţiunea TL1A-DR3 cât şi TL1A-DcR3.

2.4. Reactivitatea încrucişată între specii a 320-587 a fost testată în ceea ce priveşte capacitatea sa de a se lega la TL1A produsă recombinant din diferite specii. Anticorpul a legat de TL1A de la toate speciile testate (Figura 11). Legarea 320-587 la TL1A uman, de şobolan, cobai, câine, pisică, maimuţă cynomolgus a avut o rată de disociere lentă, ceea ce indică o interacţiune cu afinitate înaltă. Anticorpul a legat TL1A de şoarece şi iepure şi a avut o rată de disociere rapidă.

2.5. Modele de eficacitate pre-clinică pentru testarea anticorpilor anti-TL1A în următoarele modele de boală la animale:

Astm: astm indus de alergeni - o rozătoare (şoarece, şobolan sau cobai) este sensibilizată prin injectarea intradermică de ovalbumină (OVA), în special OVA derivată din ouăle de găină, plus alum şi apoi provocată cel puţin 2 săptămâni mai târziu prin aerosoli de OVA nebulizată, provocând simptome similare celor astmatice, incluzând hiperreactivitate a căilor respiratorii, influx de eozinofile şi producţia crescută de citokine (de exemplu, Hylkema et al., 2002, Clin. Exp. Immunol. 129:390-96). Un astfel de model ar putea fi modificat prin provocarea repetată pentru a prezenta un profil de boală mai cronic cu remodelarea căilor respiratorii şi inducerea fibrozei crescute (de exemplu, Bos et al., 2007, Eur. Respir. J. 30:653-661). De asemenea, pot fi utilizaţi alergeni alternativi, cum ar fi acarianul de praf de casă (de exemplu, Lambert et al., 1998, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 157:1991-9). Alternativ, un primat non-uman (de exemplu, macac cynomolgus) poate fi sensibilizat şi provocat cu un antigen de mediu, cum ar fi Ascaris suum, ceea ce conduce la hiperreactivitate a căilor respiratorii, influx de eozinofile şi creşterea producţiei de citokine (de exemplu, Wegner et al., 1991, J. Allergy Clin. Immunol,87:835-41).

BPOC: inflamaţia căilor respiratorii indusă de inhalarea de fum - rozătoare (şoarece, şobolan sau cobai) vor fi expuse la fum de ţigară de 3-7 ori pe săptămână timp de cel puţin 4 săptămâni provocând o boală pulmonară similară cu BPOC, caracterizată prin acumularea pulmonară de neutrofile, creşterea producţiei de citokine inflamatorii, fibroza pulmonară şi hipertensiunea pulmonară (de exemplu, Davis et al. (2012) PLoS One 7:e33304). O formă mai severă de boală poate fi indusă prin includerea unei infecţii bacteriene sau virale repetate în plămâni în timpul expunerii la fum (de exemplu, Li et al. (2012) Biol. Pharm. Bull. 35:1752-60). Rozătoarele cu BPOC indusă de fum vor fi tratate cu anticorpi anti-TL1A şi examinate în ceea ce priveşte eficacitatea tratamentului.

Fibroza pulmonară: fibroza pulmonară indusă de bleomicină - rozătoare (şoarece, şobolan sau cobai) vor fi tratate cu bleomicină fie prin instilare intratraheală/intranazală fie prin injecţie intravenoasă o dată sau de două ori pe săptămână timp de cel puţin 3 săptămâni. Acest tratament induce fibroză pulmonară semnificativă şi stabilă (de exemplu, Pinart et al. (2009) Resp. Physiol. Neurobiol. 166:41-46). Rozătoarele cu fibroză pulmonară indusă de bleomicină vor fi tratate cu anticorpi anti-TL1A şi supuse unui screening de eficacitate a tratamentului.

Fibroza chistică: modelul de dihor knockout CFTR - dihorii homozigoţi pentru knockout a genelor sau mutaţiile cunoscute legate de boală, ale CFTR (gena cauzativă în fibroza chistică) dezvoltă spontan o boală similară fibrozei chistice, caracterizată prin obstrucţia cu mucus a căilor respiratorii, atelectază, pneumonie interstiţială şi infecţii pulmonare repetate cu o colonizare progresivă a bacteriilor pulmonare (de exemplu, Sun et al. (2014) Am. J. Respir. Celulă Mol. Biol. 50:502-12). Dihorii CFTR-/- vor fi trataţi cu anticorpi anti-TLla şi şi supuşi unui screening în ceea ce priveşte eficacitatea tratamentului.

Sindrom de intestin iritabil: Hipersensibilitate viscerală indusă de stres - Stresul va fi indus la şobolani fie prin separare neonatală-maternă (de exemplu, Coutinho et al. (2002) Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 282:G307-16) fie restricţionarea adulţilor (de exemplu, Shen et al. (2010) J. Neurogastroenterol. Motil. 16:281-90). Este de aşteptat ca aceasta să producă motilitate alterată a colonului şi hipersensibilitate viscerală similară celei observate la pacienţii cu IBS. Şobolanii stresaţi vor fi trataţi cu anticorpi anti-TL1A şi supuşi unui screening în ceea ce priveşte eficacitatea tratamentului.

Artrita reumatoidă: artrita indusă de colagen - rozătoare (şoarece, şobolan sau cobai) vor fi imunizate şi stimulate cu colagen în adjuvant. Animalele dezvoltă umflarea bilaterală a piciorului şi eritem, infiltrat inflamator în zona articulaţiei şi afectarea articulaţiilor (de exemplu, Bendele et al. (1999) Toxicol. Pathol. 27:134-42). Rozătoarele cu artrită indusă de colagen vor fi tratate cu anticorpi anti-TL1A şi supuse unui screening în ceea ce priveşte eficacitatea tratamentului.

Esofagită eozinofilică: Esofagită eozinofilică indusă de Asp Aspergillus fumigatus. Şoareci expuşi la instilare intranazală repetată cu A. fumigatis dezvoltă eozinofilie esofagiană marcată, displazie epitelială şi hiperplazie şi granule de eozinofile libere (de exemplu, Mishra et al. (2001) J. Clin. Invest. 107:83-90). În mod similar, expunerea repetată la aerosol de ovalbumină pe o perioadă de două săptămâni provoacă la cobai sensibilizaţi eozinofilie esofagiană cu infiltrarea atât a eozinofilelor cât şi a celulelor mast în stratul epitelial (de exemplu, Liu et al. (2015) Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 308:G482-488). Şoarecii sau cobaii cu esofagită eozinofilică vor fi trataţi cu anticorpi anti-TL1A şi supuşi unui screening în ceea ce priveşte eficacitatea tratamentului.

2.6. Utilizarea anticorpilor TL1A în detectarea eşantioanelor care conţin anticorpi TL1A din dezvăluire poate fi utilizată pentru a detecta TL1A în eşantioane umane. 320-587 a fost utilizat pentru a se detecta TL1A uman secretat de PBMC-uri umane stimulate cu complecşi imuni (Figura 13) în format ELISA. 320-587 a fost, de asemenea, utilizat pentru a se detecta o populaţie de PBMC-uri umane care exprimă membrana TL1A pe suprafaţa lor în experimente de citometrie în flux (Figura 14).

2.7. Măsurători de afinitate ale anticorpului anti-TL1A care se leagă la TL1A uman prin analiză de excludere cinetică. Timpul necesar atingerii echilibrului cu 320-587 ca CBP: În primul rând, s-a măsurat rata Kon pentru interacţiunea 320-587/TL1A. Pe scurt, s-a preparat o soluţie prin amestecarea 320-587 şi TL1A, şi au fost îndepărtate alicote în diferite momente de timp, în decurs de 3 ore. 320-587 liber a fost captat prin trecerea soluţiei pe o coloană cu umplutură de perle de Sepharose acoperite cu 20 µg/mL TL1A. 320-587 captat a fost detectat cu un anticorp anti-uman conjugat Alexa Fluor® 647 (0,5 µg/mL). Această analiză a fost repetat de două ori, cu obţinerea unor rate Kon de 8,35 x 105 Ms-1 şi 7,45 x 105 Ms-1, cu o rată medie Kon de 7,90 x 105 Ms-1. Rata Kon a fost apoi utilizată pentru a se estima perioada de timp necesară pentru a se atinge echilibrul la diferite concentraţii de 320-587 folosind instrumentul de curbă de legare teoretică furnizat pe website-ul (www.Sapidyne.com <http://www.Sapidyne.com/>).

Determinarea KD cu 320-587 ca CBP. CBP, 320-587, a fost diluat în tampon de analiză (DPBS suplimentat cu 1 mg/ml BSA) până la concentraţii finale de 15, 50 şi 150 pM. Titrantul, TL1A uman a fost diluat în tampon de analiză pentru a se crea o serie de concentraţii de 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000 şi 3000 pM. Folosind timpul pentru atingerea echilibrului determinat mai sus, curbele care au conţinut fie 50, fie 150 pM 320-587 au fost lăsate să ajungă la echilibru într-un incubator la 25°C timp de 2 zile. Curbele care au conţinut 15 pM 320-587 au fost lăsate să ajungă la echilibru într-un incubator la 25°C timp de 3 zile. După perioada de echilibrare, fracţia liberă de 320-587 din fiecare reacţie a fost cuantificată aşa cum este descris mai sus. Valorile KD au fost determinate folosind analiza curbei n a curbelor de echilibru generate cu 15, 50 şi 150 pM 320-587.

Timpul necesar pentru a se atinge echilibrul cu TL1A ca CBP: Timpul pentru atingerea echilibrului în această orientare a fost estimat folosind Kon pentru interacţiunea 320-587/TL1A, determinată aşa cum este descris la 2.8 de mai sus. În acest format, fracţia liberă de TL1A a fost captată trecând soluţia pe o coloană cu umplutură de perle de PMMA acoperite cu 30 µg/mL 320-587. TL1A captat a fost detectat cu un anticorp anti 6x-his DyLight 650 (0,75 µg/mL). Această analiză a fost repetată de două ori, cu obţinerea unor rate Kon de 6,11 x 105 Ms-1 şi 5,74 x 105 Ms-1, cu o rată Kon medie de 5,93 x 105 Ms-1.

Determinarea KD cu TL1A ca CBP: CBP-ul, TL1A uman, a fost diluat în tampon de analiză până la concentraţii finale de 30, 100 şi 300 pM. Titrantul, 320-587, a fost diluat în tampon de analiză pentru a se crea o serie de concentraţii de 0,05, 0,15, 0,5, 1,5, 5, 15, 50, 150, 500, 1500 şi 5000 pM.

Folosind timpul necesar pentru atingerea echilibrului determinat mai sus, toate curbele au fost lăsate să ajungă la echilibru într-un incubator la 25°C timp de 3 zile. După perioada de echilibrare, fracţia liberă de TL1A din fiecare reacţie a fost cuantificată aşa cum este descris mai sus. Valorile KD au fost determinate folosind analiza curbei n a curbelor de echilibru generate cu 30, 100 şi 300 pM TL1A.

S-a observat o bună concordanţă între cele două metode KinExA, precum şi o eroare % relativ scăzută. Valoarea KD pentru interacţiunea TL1A cu 320-587 a fost determinată folosind 320-587, ca CBP a fost 40,97 ± 8,33 pM (Tabelul 13), în timp ce KD obţinut folosind TL1A ca CBP a fost 41,52 ± 13,5 pM (Tabelul 14).

Tabelul 13. Afinitate: Perle de Sepharose acoperite cu TL1A; 320-587 ca CBP.

Nr. analiză: KD (pM) % Eroare 1 40,43 4,57 2 52,03 5,61 3 46,31 4,76 4 32,42 3,74 5 33,66 3,9 Media 40,97 SD 8,33 %CV 20

Tabelul 14. Afinitate: Perle de PMMA acoperite cu 320-587; TL1A ca CBP.

Nr. analiză: KD (pM) % Error 1 33,39 5,33 2 57,1 5,51 3 34,07 3,9 Media 41,52 SD 13,5 %CV 33

3.0. Modele de eficacitate preclinică pentru testarea anticorilor anti-TLla.

3.0.1. Astm.

Astm acut indus de ovalbumină la şobolani. Şobolani Brown-Norvegia au fost sensibilizaţi cu OVA prin injecţie i.p. în ziua 0, apoi provocaţi cu aerosol de OVA zilnic în zilele 35-42. Şobolanii au fost trataţi cu anticorp 320-587 sau vehicul prin injecţie i.v. în zilele 14, 21, 28 şi 35. Lichidul de spălare bronhoalveolară (BALF) a fost analizat în ceea ce priveşte celulele totale şi diferenţiale în ziua 43. S-a constatat că tratamentul reduce semnificativ eozinofilele BALF (Figura 15).

Astm cronic indus de ovalbumină la şobolani. Şobolanii au fost sensibilizaţi cu OVA plus alum prin injecţie i.p. în zilele 0 şi 7 şi apoi provocaţi cu aerosol de OVA de două ori pe săptămână timp de 3 săptămâni începând din ziua 14 până în ziua 31 şi în 5 zile consecutive din zilele 37 până la 42. Animalele au fost tratate cu anticorp 320-587 sau vehicul i.v. în zilele 24, 29, 34 şi 39. BALF a fost evaluată în ceea ce priveşte celulele totale şi diferenţiale şi un panou de citokine în ziua 43. Secţiuni de plămân au fost colorate cu hematoxilină şi eozină (H&E) şi cu acid periodic Schiff (PAS) şi analizate în ceea ce priveşte o serie de patologii. Tratamentul cu 320-587 a scăzut semnificativ eozinofile şi macrofage BALF (Figura 17A şi 17B), IL-4 şi IL-13 BALF (figura 17C), hiperplazia celulelor goblet (figura 17D) şi grosimea stratului epitelial bronşic (figura 17E), comparativ cu vehiculul.

Astm acut indus de ovalbumină acută la cobai. Cobai Dunkin Hartley masculi au fost sensibilizaţi la ovalbumină şi ulterior au fost supuşi unei intervenţii chirurgicale pentru instalarea unui cateter cu balon pentru măsurarea funcţiei pulmonare şi a reacţiilor astmatice precoce şi târzii. În ziua 16, 20, 24 şi 28, animalele au fost tratate i.p. cu anticorp 320-587 sau vehicul. Provocarea cu aerosol de ovalbumină (0,05-0,1%) a fost efectuată la 30 de minute după ultimul tratament. Receptivitatea căilor respiratorii (AHR) la histamină a fost măsurat la 24 ore înainte de provocare, la 6 ore după provocare (direct după reacţia astmatică precoce) şi 24 ore după provocare (direct după reacţia astmatică târzie). Natura şi dimensiunea reacţiilor astmatice precoce şi târzii a fost, de asemenea, înregistrată prin înregistrarea online a funcţiei pulmonare pe întreaga perioadă de 24 de ore. Animalele au fost sacrificate la 25 ore după provocare şi s-a efectuat un lavaj bronhoalveolar. BALF a fost evaluat în ceea ce priveşte celulele totale şi diferenţiale. Tratamentul cu 320-587 a scăzut semnificativ atât eozinofilele, cât şi macrofagele în BALF (Figura 16A şi 16B), şi de asemenea a ameliorat AHR după reacţia astmatică precoce (Figura 16C) şi amploarea generală a reacţiei astmatice precoce (Figura 16D), comparativ cu un vehicul.

Astm cronic indus de ovalbumină la cobai. Cobai Dunkin Hartley masculi au fost sensibilizaţi la ovalbumină, şi după 4 săptămâni au fost provocaţi cu ovalbumină, săptămânal, timp de 12 săptămâni. Provocarea cu ovalbumină (0,05-0,5%) a fost efectuată prin inhalarea unei soluţii aerosolizate până la observarea obstrucţiei căilor respiratorii. Animalele au fost tratate i.p. cu anticorp 320-587 sau vehiculul la fiecare 5 zile, începând cu săptămâna 8 a provocărilor cu ovalbumină. A fost măsurată funcţia căilor respiratorii prin receptivitatea căilor respiratorii la histamină, înainte de provocarea iniţială, cu 24 de ore înaintea provocării finale şi 6 ore după provocarea finală. Deşi nu s-a observat niciun efect asupra AHR indus de provocarea cu histamină, anticorpul 320-587 a scăzut semnificativ răspunsul alergic la OVA, deoarece au fost necesare doze de OVA în creştere progresivă pentru a induce obstrucţia căilor respiratorii (Figura 18).

Se consideră că diferenţele efectului terapeutic al anticorpului observate la modelele acute şi cronice de astm la cobai, ar fi în funcţie de modelul în sine. Se consideră că, în modelul cronic, gradul de AHR scade în timp şi, în consecinţă, devine mai puţin receptiv la tratament. În stadiul tehnicii, modelul acut este utilizat în general pentru a se observa efectele compusului asupra receptivităţii căilor respiratorii, şi modelul cronic este în general utilizat pentru a se observa efectele compusului asupra remodelării căilor respiratorii. Evaluările de remodelare sunt în curs de desfăşurare. Cu toate acestea, a fost surprinzător să se observe că anticorpii care au un impact asupra răspunsului la alergen - deşi anticorpul nu a avut un impact substanţial absolut asupra AHR (răspuns la histamină) în acest stadiu, a scăzut semnificativ răspunsul alergic direct la antigen.

3.0.2. Boala inflamatorie intestinală

Colită indusă de TNBS la şobolani: Şobolanii au fost trataţi cu o singură doză de acid trinitrobenzensulfonic în etanol prin instilarea intrarectală a dozei. Animalele martor au primit numai un volum echivalent de etanol. Pe o perioadă de 7 zile, animalele au dezvoltat colită focală caracterizată prin ulceraţia colonului cu infiltrat inflamator şi grade diferite de fibroză (de exemplu, Wirtz et al. (2007) Nat. Protoc. 2:541-546). Administrarea 320-587 a redus semnificativ mai mulţi indicatori de boală incluzând grosimea colonului (figura 12A), numărul şi severitatea aderenţelor (figura 12B) şi numărul şi gravitatea stricturilor (figura 12C) conducând la o boală semnificativ mai uşoară decât aceea a animalelor tratate fie cu un vehicul fie cu un anticorp irelevant potrivit ca izotip (Figura 12D). Scăderea fibrozei colonului (Figura 19) a fost, de asemenea, observată la animale tratate cu 320-587.

Comparaţia bolii după 7 şi 14 zile în colita indusă de DNBS la şobolani. Colita a fost indusă aşa cum este descris mai sus folosind acid dinitrobenzensulfonic (DNBS) în loc de TNBS, şi şobolanii utilizaţi în experimentele DNBS au fost şobolani Wistar. Animalele au fost tratate cu anticorp 320-587 sau vehiculul i.v. în zilele 1 şi 8. Grupurile au fost evaluate în ceea ce priveşte colita în zilele 7 şi 14 post-DNBS şi severitatea bolii a fost comparată între cele două momente de timp. Tratamentul cu anticorp 320-587 a avut un efect limitat în ziua 7, dar în ziua 14, animalele tratate cu anticorp 320-587 au arătat o îmbunătăţire semnificativă a greutăţii şi lungimii colonului (Figura 20A), fibrozei (Figura 20B), infiltratului inflamator (Figura 20C) şi a lezării colonului (figura 20D). Secţiunile reprezentative ale colonului din zona ulcerului (Figura 20E) arată extinderea reparaţiei şi a reducerii fibrozei la 14 zile. La ambele 7 şi 14 zile, animalele tratate cu vehicul au prezentat un infiltrat inflamator şi fibroză extensive, cu pierderi semnificative de arhitectură intestinală. În schimb, animalele tratate cu 320-587 au prezentat un infiltrat inflamator, fibroză şi pierderea arhitecturii intestinale semnificative la 7 zile, dar aceste efecte sunt în mare parte inversate la 14 zile.

Se consideră că diferenţele observate în ceea ce priveşte efectele terapeutice ale anticorpilor observate la modelele TNBS şi DNBS provin din utilizarea diferitelor tulpini de şobolani (Sprague-Dawley pentru TNBS faţă de Wistar pentru DNBS). Fiecare tulpină de şobolan are diferenţe în ceea ce priveşte răspunsurile lor la provocările imunologice, astfel încât cinetica răspunsului lor în aceste modele, se crede că este diferită. De asemenea, TNBS şi DNBS sunt diferite structural şi se crede că induc variaţii în starea bolii.

Colită cronică (21 de zile) indusă de DSS la şobolani. Şobolanilor li s-a administrat sulfat de sodiu dextran (DSS) la o concentraţie de 5% gr/v în apă potabilă timp de 7 zile, apoi 2% gr/v în apă potabilă în continuare, pentru încă 14 zile. Animalele au dezvoltat diaree, inflamaţie colonică difuză, hiperplazie a celulelor goblet şi leziuni şi ulceraţii ale epitelialului criptelor (de exemplu Randhawa et al. (2014) Korean J. Physiol. Pharmacol. 18:279-88). Şobolanii au fost trataţi cu anticorp 320-587 sau vehicul prin injecţie intravenoasă în zilele 5, 12 şi 19. Animalele au fost cântărite şi evaluate în ceea ce priveşte boala clinică (diaree şi sânge ocult) zilnic, şi greutatea şi lungimea colonului au fost evaluate în ziua 21. Tratamentul cu anticorp 320-587 a inversat semnificativ încetinirea determinată de creşterea în greutate indusă de DSS (Figura 21A), a ameliorat semnele clinice ale bolii (Figura 21B) şi a îmbunătăţit greutatea şi lungimea colonului (Figura 21C).

Inducerea citokinelor intraperitoneale prin TL1A umană recombinantă. Injecţia intraperitoneală cu TL1A recombinant de şoarece poate induce producerea de citokine inflamatorii, cum ar fi IL-5. În acest studiu, şoarecii au primit o singură doză fie de anticorp 320-587 fie de vehicul, apoi o oră mai târziu au fost trataţi cu 40 µg/şoarece de TL1A recombinant uman (rhTL1A). La şase ore după dozarea rhTL1A, s-a efectuat un lavaj peritoneal şi s-a analizat fluidul peritoneal în ceea ce priveşte citokinele şi chemokinele printr-o analiză multiplex. Tratamentul cu anticorp 320-587 a scăzut semnificativ concentraţiile peritoneale de citokine G-CSF, IL-1b, IL-5, IL-6, IL-17, şi chemokine IP-10, KC, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b, MIP-2 (Figura 22).

Dezvăluirea nu este limitată la modalităţile de realizare descrise şi exemplificate mai sus, ci este capabilă de variaţiuni şi modificări în cadrul scopului revendicărilor anexate.

LISTA DE SECVENŢE

<110> Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd

<120> Anticorpi care se leagă specific la TL1A

<130> 185704-3019

<160> 71

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 119

<212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8 <211> 111 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10 <211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220> <221> Xaa <222> (32)..(32) <223> G sau A

<220> <221> Xaa <222> (33)..(33) <223> L sau S sau Q

<220> <221> Xaa <222> (36)..(36) <223> H sau L

<220> <221> Xaa <222> (93)..(93) <223> Y sau F sau W

<400> 14

<210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 17

<210> 18

<211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 18

<210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 19

<210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 20

<210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 21

<210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 22

<210> 23 <211> 14 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

<210> 24 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 24

<210> 25 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 25

<210> 26 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 26

<210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 27

<210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<221> Xaa

<222> (8)..(8) <223> N sau Y

<400> 28

<210> 29 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220> <221> Xaa <222> (10)..(10) <223> G sau A

<220> <221> Xaa <222> (11)..(11) <223> L sau S sau Q

<220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> H sau L

<400> 29

<210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Y sau W sau F

<400> 30

<210> 31 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 31

<210> 32 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 32

<210> 33 <211> 210 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 33

<210> 34 <211> 180 <212> PRT <213> Macaca fascicularis

<400> 34

<210> 35 <211> 180 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 35

<210> 36 <211> 180 <212> PRT <213> Rattus norvegicus

<400> 36

<210> 37 <211> 179 <212> PRT <213> Cavia porcellus

<400> 37

<210> 38 <211> 180 <212> PRT <213> Felis catus

<400> 38

<210> 39 <211> 180 <212> PRT <213> Sus scrofa

<400> 39

<210> 40 <211> 179 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus

<400> 40

<210> 41 <211> 180 <212> PRT <213> Canis familiaris

<400> 41

<210> 42 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 42

<210> 43 <211> 329 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 43

<210> 44 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 44

<210> 45 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 45

<210> 46 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 46

<210> 47 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 47

<210> 48 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 48

<210> 49 <211> 357 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 49

<210> 50 <211> 333 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 50

<210> 51 <211> 357 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 51

<210> 52 <211> 333 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 52

<210> 53 <211> 333 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 53

<210> 54

<211> 333

<212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 54

<210> 55 <211> 333 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 55

<210> 56 <211> 333 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 56

<210> 57 <211> 333 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 57

<210> 58 <211> 1344 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 58

<210> 59 <211> 648 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 59

<210> 60 <211> 448 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 60

<210> 61 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 61

<210> 62 <211> 329 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 62

<210> 63 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 63

<210> 64 <211> 329 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64

<210> 65 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 65

<210> 66 <211> 329 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 66

<210> 67 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 67

<210> 68 <211> 325 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 68

<210> 69 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 69

<210> 70 <211> 325 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 70

<210> 71 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 71

Claims

1. Anticorp recombinant care se leagă specific la ligandul 1A similar cu TNF (TL1A) şi cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 4.

2. Anticorp recombinant conform revendicării 1, în care anticorpul cuprinde o regiune constantă a lanţului greu a IgG1 uman, în care, opţional, regiunea constantă a lanţului greu a IgG1 uman cuprinde SECV ID NR: 42, SECV ID NR: 43, SECV ID NR: 44, SECV ID NR: 62, SECV ID NR: 63, SECV ID NR: 64, SECV ID NR: 65, sau SECV ID NR: 66.

3. Anticorp recombinant conform revendicării 1, în care anticorpul cuprinde o regiune constantă a lanţului greu a IgG4 uman, în care opţional regiunea constantă a lanţului greu a IgG4 cuprinde SECV ID NR: 45, SECV ID NR: 46, SECV ID NR: 47, sau SECV ID NR: 69.

4. Anticorp recombinant conform revendicării 1, în care anticorpul cuprinde regiunea constantă a lanţului greu a IgG2 uman, în care opţional regiunea constantă a lanţului greu a IgG2 uman cuprinde SECV ID NR: 67, SECV ID NR: 68, SECV ID NR: 70, sau SECV ID NR: 71.

5. Anticorp recombinant conform revendicării 1, în care anticorpul cuprinde o regiune constantă lambda a lanţului uşor uman.

6. Anticorp recombinant conform revendicării 5, în care anticorpul recombinant cuprinde un lanţ uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 61.

7. Anticorp recombinant conform revendicării 2 sau 6, în care anticorpul recombinant cuprinde un lanţ greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 60.

8. Compoziţie, care cuprinde anticorpul recombinant conform oricăreia dintre revendicările 1-7 şi un purtător acceptabil farmaceutic.

9. Anticorp recombinant conform oricăreia dintre revendicările 1-7, pentru utilizarea în tratamentul unei boli a tractului respirator, astmului, COPD-ului, sarcoidozei pulmonare, rinitei alergice, fibrozei pulmonare, fibrozei chistice, bolii gastrointenstinale, bolii inflamatorii intestinale, colitei, colitei ulceroase, esofagitei eozinofilice, bolii gastrointestinale asociată cu fibroza chistică, sindromului de intestin iritabil, bolii Crohn, artritei, artritei reumatoide, bolii de piele, dermatitei atopice, eczemei, sau sclerodermiei.

10. Anticorp recombinant conform oricăreia dintre revendicările 1-7, pentru utilizarea în tratamentul astmului.

11. Metodă in vitro pentru detectarea TL1A (i) pe suprafaţa celulelor mononucleare de sânge periferic (PBMC-uri), care cuprinde contactarea anticorpului conform oricăreia dintre revendicările 1-7 cu PBMC-uri izolate de la un subiect, detectarea anticorpului legat la TL1A pe suprafaţa PBMC-urilor şi, opţional, cuantificarea nivelului de TL1A pe PBMC-uri, (ii) în ser de sânge, care cuprinde contactarea anticorpului conform oricăreia dintre revendicările 1-7 cu serul de sânge obţinut de la un subiect, detectarea anticorpului legat la TL1A în ser şi, opţional, cuantificarea nivelului de TL1A în serul din sânge sau (iii) într-un eşantion de ţesut izolat de la un subiect, care cuprinde contactarea anticorpului conform oricăreia dintre revendicările 1-7 cu ţesut izolat de la un subiect pentru a se forma un complex anticorp-TLlA, şi detectarea complexului în ţesut.

12. Celulă transformată care exprimă anticorpul conform oricăreia dintre revendicările 1-7.

13. Polinucleotidă având o secvenţă de acizi nucleici care codifică un anticorp conform revendicării 1, care cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 3 şi o a doua secvenţă de acizi nucleici care codifică o regiune variabilă a lanţului uşor a unui anticorp care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 4.