MD3347360T2

MD3347360T2 - Compuși utili pentru inhibarea ROR-gama-t

Info

Publication number: MD3347360T2
Application number: MDE20180692T
Authority: MD
Inventors: John Richard Morphy
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2015-09-09
Filing date: 2016-09-06
Publication date: 2020-03-31
Also published as: IL257202A; ECSP18018793A; SV2018005647A; DK3347360T3; CR20180089A; US9598431B1; KR20180031777A; AR105821A1; EA033882B1; ES2760992T3; RS59655B1; UA118824C2; CN108026112B; AU2016318593B2; PE20181274A1; JO3638B1; HUE047950T2; PH12018500504A1; EP3347360A1; TN2018000057A1

Abstract

Prezenta invenţie furnizează noi inhibitori ai ROR gama-t şi compoziţiifarmaceutice cu aceştia.

Description

Prezenta invenţie se referă la compuşi utili pentru inhibarea receptorului orfan gama-t asociat cu receptorul acidului retinoic (RORγt), la compoziţii farmaceutice, şi la compuşii pentru utilizare în metode pentru tratarea bolilor care au legătură cu activitatea RORγ.

Receptorii orfani asociaţi receptorilor acidului retinoic (ROR) sunt membri ai superfamiliei receptorilor nucleari (NR) identificaţi ca regulatori patologici importanţi în multe boli. Subfamilia ROR constă din RORα, RORβ, şi RORγ. Genele RORγ de şoarece şi umane generează două izoforme, γ1 şi γ2, cea din urmă denumită cel mai obişnuit γt. Semnalizarea RORγt, adesea ca răspuns la semnalizarea IL-23/receptorului IL-23, este necesară pentru diferenţierea celulelor T CD4+ naive într-un subset de celule T denumite Th17, care sunt distincte de celulele Th1 şi Th2 clasice, şi susţin întreţinerea acestora. Celulele Th17 produc interleukină-17A (IL-17) şi IL-17F. În plus, celulele Th17 produc un interval de alţi factori cunoscuţi pentru dirijarea răspunsurilor inflamatorii, incluzând factorul de necroză tumorală-alfa (TNF-α), interleukina-6 (IL-6), GM-CSF, CXCL1 şi CCL20. Celulele NK şi celulele limfoide native cum ar fi celulele similare inductorului de ţesut limfoid (LTi) exprimă receptorul IL-23 şi RORγt şi produc IL-17 ca răspuns la stimulare şi IL-23. Există dovada substanţială că celulele care răspund IL-23, RORγt, şi care exprimă IL-17 sunt asociate cu bolile autoimune (AI), bolile inflamatorii, şi cancerul. Astfel, inhibarea ţintită a RORγt poate fi importantă pentru reducerea patogenezei acelor boli.

Bolile AI sunt afecţiuni cronice pentru care nu există vindecare în prezent. Tratamentul bolilor AI implică de obicei o încercare de a controla procesul bolii şi de a reduce simptomele prin administrarea de medicamentaţii antiinflamatorii, antidurere, sau imunosupresive. Regretabil, utilizarea de medicaţii antiinflamatorii şi antidurere este uneori ineficientă şi utilizarea de imunosupresive conduce adesea la efecte secundare devastatoare pe termen lung. Cele mai semnificative efecte secundare ale medicamentelor imunosupresive sunt un risc crescut de infecţie şi un risc mai ridicat de cancer.

Au fost identificaţi liganzii naturali şi sintetici la RORγt. Au fost raportaţi în literatură inhibitorii cu moleculă mică împotriva RORγt pentru AI. Vezi WO 2015/017335 şi WO 2014/179564. Totuşi, prevalenţa bolillor AI cuplată cu ineficacitatea sau efectele secundare devastatoare ale tratamentelor curente necesită ca mai multe opţiuni de tratament să fie disponibile pacienţilor. Ţintirea RORγt poate prezenta un avantaj asupra terapiilor AI curente, maximizând beneficiul terapeutic prin ţintirea celulelor imune patogene în timp ce minimizează riscul de suprimare al apărărilor gazdei.

Prezenta invenţie furnizează noi compuşi care sunt inhibitori RORγt. Astfel de noi compuşi ar putea adresa necesitatea unui tratament potent, eficient al uveitei, sclerozei multiple, artritei reumatoide, bolii grefă versus gazdă, bolii Crohn, altor boli inflamatorii intestinale, cancerului, psoriazisului, şi spondilartropatiilor seronegative, cum ar fi spondiloartrita axială, spondilita anchilozantă, şi artrita psoriazică.

Prezenta invenţie furnizează un compus cu formula

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Prezenta invenţie furnizează de asemenea compuşii pentru utilizare într-o metodă pentru tratamentul psoriazisului la un pacient, cuprinzând administrarea la un pacient care are nevoie de aceasta a unui compus din prezenta invenţie, sau a unei săruri acceptabile farmaceutic a acestuia. Mai mult, prezenta invenţie furnizează compuşii pentru utilizare într-o metodă pentru tratamentul spondilartropatiilor seronegative la un pacient, cuprinzând administrarea la un pacient care are nevoie de aceasta a unui compus din prezenta invenţie, sau a unei săruri acceptabile farmaceutic a acestuia. În realizarea menţionată, spondilartropatiile seronegative sunt spondiloartrita axială, spondilita anchilozantă, sau artrita psoriazică.

Prezenta invenţie furnizează o compoziţie farmaceutică care cuprinde un compus al invenţiei, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, în combinaţie cu unul sau mai mulţi purtători, diluanţi, sau excipienţi acceptabili farmaceutic. Într-o realizare suplimentară, compoziţia cuprinde în plus unul sau mai mulţi alţi agenţi terapeutici. Într-o realizare suplimentară, prezenta invenţie furnizează o compoziţie farmaceutică pentru tratamentul psoriazisului, care cuprinde un compus al invenţiei, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, în combinaţie cu unul sau mai mulţi purtători, diluanţi, sau excipienţi acceptabili farmaceutic. În încă o altă realizare, prezenta invenţie furnizează o compoziţie farmaceutică pentru tratamentul spondilartropatiilor seronegative, care cuprind un compus al invenţiei, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, în combinaţie cu unul sau mai mulţi purtători, diluanţi, sau excipienţi acceptabili farmaceutic. În realizarea menţionată, spondilartropatiile seronegative sunt spondiloartrita axială, spondilita anchilozantă, sau artrita psoriazică.

Mai mult, prezenta invenţie furnizează un compus al invenţiei, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, pentru utilizare în terapie, în particular pentru tratamentul psoriazisului. Chiar mai mult, prezenta invenţie furnizează un compus al invenţiei, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, pentru utilizare în tratamentul psoriazisului. Într-o realizare suplimentară, prezenta invenţie furnizează utilizarea unui compus al invenţiei, sau a unei săruri acceptabile farmaceutic a acestuia, pentru fabricarea unui medicament pentru tratamentul psoriazisului.

Mai mult, prezenta invenţie furnizează un compus al invenţiei, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, pentru utilizare în terapie, în particular pentru tratamentul spondilartropatiilor seronegative. Chiar mai mult, prezenta invenţie furnizează un compus al invenţiei, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, pentru utilizare în tratamentul spondilartropatiilor seronegative. Într-o realizare suplimentară, prezenta invenţie furnizează utilizarea unui compus al invenţiei, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, pentru fabricarea unui medicament pentru tratamentul spondilartropatiilor seronegative. În realizările menţionate, spondilartro-patiile seronegative sunt de spondiloartrită axială, spondilită anchilozantă, sau artrită psoriazică.

Prezenta invenţie divulgă de asemenea intermediari şi procedee utile pentru sinteza unui compus din prezenta invenţie.

Termenul „tratarea» (sau „tratează» sau „tratament») aşa cum s-a utilizat în acest document se referă la restrângerea, încetinirea, oprirea, sau inversarea progresului sau severităţii unui simptom, afecţiuni sau tulburări existente.

Termenul „spondilartropatii» se referă la un număr de boli cronice ale articulaţiilor care implică în general coloana vertebrală şi zonele unde ligamentele şi tendoanele se ataşează de os. Spondilartropatiile sunt uneori denumite de asemenea spondiloartropatii sau spondiloartrite.

Termenul „seronegativ» se referă la o boală care este negativă pentru factorul reumatoid.

Un compus din prezenta invenţie poate reacţiona pentru a forma săruri acceptabile farmaceutic. Sărurile acceptabile farmaceutic şi metodologia comună pentru prepararea lor sunt bine cunoscute în domeniu. Vezi, de exemplu, P. Stahl, şi colab. Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, ed. a 2-a revizuită (Wiley-VCH, 2011); S.M. Berge, şi colab., „Pharmaceutical Salts», Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, nr. 1, ianuarie 1977.

Specialistul calificat va aprecia că un compus al invenţiei, aşa cum se arată în (I), sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, este cuprinsul unui miez care conţine cel puţin doi centri chirali, cum este reprezentat prin ∗ mai jos:

Deşi prezenta invenţie are în vedere toţi enantiomerii individuali, precum şi amestecuri de enantiomeri ai compuşilor menţionaţi care includ racemaţi, compuşii preferaţi ai invenţiei sunt reprezentaţi prin (II) mai jos:

sau săruri acceptabile farmaceutic ale acestora.

Specialistul calificat va aprecia de asemenea că denumirile Cahn-Ingold-Prelog (R) sau (S) pentru toţi centrii chirali vor varia depinzând de modelele de substituţie ale compusului particular. Monoenantiomerii sau diastereomerii pot fi preparaţi începând cu reactivii chirali sau prin tehnici sintetice stereoselective sau stereospecifice. Alternativ, monoenantiomerii sau diastereomerii pot fi izolaţi din amestecuri prin tehnici standard de cromatografie sau cristalizare chirală în orice punct convenabil în sinteza compuşilor invenţiei. Monoenantiomerii compuşilor invenţiei sunt o realizare preferată a invenţiei.

Un compus din prezenta invenţie este preferabil formulat ca compoziţii farmaceutice administrate printr-o varietate de căi. Astfel de compoziţii farmaceutice şi procedee pentru prepararea acestora sunt bine cunoscute în domeniu. Vezi, de exemplu, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, şi colab., eds., a 21-a ed., Mack Publishing Co., 2005). Mai preferată în special, este o compoziţie farmaceutică care cuprinde un compus cu formula,

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia şi unul sau mai mulţi purtători sau diluanţi acceptabili farmaceutic.

O realizare preferată specială din prezenta invenţie se referă la compusul, (5'S)-N-{[5-(etilsulfonil)piridin-2-il]metil}-5'-metil-1-{(1R)-1-[2-trifluorometil)pirimidin-5-il]etil}-4',5'-dihidrospiro[piperidin-4,7'-tieno[2,3,c]piran]-2'-carboxamidă:

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

O altă realizare preferată specială din prezenta invenţie se referă la compusul,

Compuşii prezentei invenţii sunt în general eficienţi într-un interval de dozare larg. De exemplu, dozajele pe zi se situează în intervalul de la aproximativ 1 mg până la 1 g. În unele cazuri nivelurile de dozaj de sub limita inferioară a intervalului menţionat mai sus pot fi mai mult decât adecvate, în timp ce în alte cazuri, pot fi utilizate doze chiar mai mari în timp ce se menţine un profil beneficiu/risc favorabil, şi prin urmare intervalul de dozare de mai sus nu intenţionează să limiteze în nici un fel scopul invenţiei. Se va înţelege că va fi determinată de către un medic cantitatea compusului administrat de fapt, în lumina circumstanţelor relevante, incluzând afecţiunea care trebuie tratată, calea de administrare aleasă, compusul sau compuşii efectiv administraţi, vârsta, greutatea, şi răspunsul pacientului individual, şi severitatea simptomelor pacientului.

Monoizomerii, enantiomerii, şi diastereomerii pot fi separaţi sau rezolvaţi de cineva având calificare obişnuită în domeniu, în orice punct convenabil în sinteza compuşilor cu formula I, prin metode cum ar fi tehnici de cristalizare selective sau cromatografie chirală (vezi de exemplu, J. Jacques, şi colab., „Enantiomers, Racemates, and Resolutions», John Wiley & Sons, Inc., 1981, şi E.L. Eliel şi S.H. Wilen», Stereochemistry of Organic Compounds», Wiley-Interscience, 1994). Denumiţii „izomer 1» şi „izomer 2» se referă la compuşii care eluează din prima şi respectiv a doua cromatografie chirală, şi dacă cromatografia chirală este iniţiată devreme în sinteză, aceeaşi denumire este aplicată intermediarilor şi exemplelor ulterioare.

Suplimentar, anumiţi intermediari descrişi aici pot conţine una sau mai multe grupări de protecţie. Gruparea de protecţie variabilă poate fi identică sau diferită în fiecare apariţie, depinzând de condiţiile de reacţie particulare şi de transformările particulare care urmează să fie efectuate. Condiţiile de protecţie şi deprotecţie sunt bine cunoscute specialistului calificat şi sunt descrise în literatură (Vezi de exemplu „Greene's Protective Groups in Organic Synthesis», ediţia a patra, de Peter G.M. Wuts şi Theodora W. Greene, John Wiley & Sons, Inc. 2007).

Anumite abrevieri sunt definite după cum urmează: „AUC» se referă la aria de sub curbă; „BSA» se referă la albumină din ser bovin; „CFA» se referă la adjuvantul lui Freund complet; „DBA» se referă la diluat maro non-Agouti; „DCM» se referă la diclorometan; „DPBS» se referă la soluţie salină tamponată cu fosfat Dulbecco; „DMEM» se referă la mediul Eagle modificat Dulbecco; „DMSO» se referă la dimetil sulfoxid; „EC50» se referă la concentraţia efectivă la jumătatea răspunsului maxim; „EtOAc» se referă la acetat de etil; „Et2O» se referă la etil eter; „EtOH» se referă la alcool etilic sau etanol; „ee» se referă la exces enantiomeric; „Ex» se referă la exemplu; „FBS» se referă la ser fetal bovin; „G» se referă la forţa gravitaţională; „GAL» se referă la domeniul de legare ADN beta-galactosidază; „GPI» se referă la glucoză -6-fosfat izomerază; „HEC» se referă la hidroxi etil celuloză; „HEK» se referă la rinichiul embrionar uman; „HEPES» se referă la acid 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetansulfonic; „IC50» se referă la concentraţia unui agent care produce 50% din răspunsul inhibitor maxim, posibil pentru acel agent; „IL» se referă la interleukină; „IPA» se referă la alcool izopropilic sau izopropanol; „Kd» se referă la constanta de disociere; „Ki» se referă la constanta de inhibare; „MeOH» se referă la metil alcool sau metanol; „MEM» se referă la mediul esenţial minim; „PBMC» se referă la celulele mononucleare din sângele periferic; „PBS» se referă la soluţie salină tamponată cu fosfat; „Prep» se referă la preparare; „RAR se referă la receptor al acidului retinoic; şi „RPMI» se referă la institutul Roswell Park Memorial. „Rt» se referă la timpul de retenţie; „SCX» se referă la schimbul puternic de cationi; „SFC» se referă la cromatografia în fluid supercritic; şi „THF» se referă la tetrahidrofuran.

Compuşii prezentei invenţii, sau sărurile acestora, pot fi preparaţi printr-o varietate de proceduri cunoscute în domeniu, unele din acestea fiind ilustrate în preparările şi exemplele de mai jos. Etapele de sinteză specifice pentru fiecare din căile descrise pot fi combinate în diferite moduri pentru a prepara compuşii invenţiei, sau sărurile acestora. Produsele fiecărei etape de mai jos pot fi recuperate prin metode convenţionale bine cunoscute în domeniu, incluzând extragerea, evaporarea, precipitarea, cromatografierea, filtrarea, triturarea, şi cristalizarea. Reactivii şi materiile prime sunt cu uşurinţă disponibile cuiva având calificare obişnuită în domeniu.

Următoarele preparări şi exemple ilustrează mai departe invenţia şi reprezintă sinteza tipică a compuşilor din prezenta invenţie.

Preparări şi Exemple

Preparare 1

1-(3-Tienil)propan-2-onă

Se suspendă acid 2-(3-tienil)acetic (26,5 g, 146,5 mmol) în anhidridă acetică (87,9 mL, 913 mmol,) şi se adaugă 1-metilimidazol (7,57 g, 91,3 mmol). Se agită amestecul de reacţie timp de 4 ore la temperatura camerei sub azot. Se răceşte amestecul de reacţie până la 0°C, se adaugă apă (150 mL), şi se agită timp de 1 oră. Se diluează soluţia cu EtOAc (300 mL) şi se spală succesiv cu 2 M NaOH (2×200 ml), apă (200 mL) şi saramură (200 mL). Se separă faza extractelor organice, se usucă pe sulfat de sodiu, se filtrează, şi se concentrează până la uscare pentru a obţine compusul din titlu (28,16 g, 77%) ca un ulei galben. 1H RMN (400,13 MHz, CDCl3) δ 2,14 (s 3H), 3,7 (s, 2H), 6,94 (d, J= 5,1 Hz, 1H), 7,08 (bs, 1H), 7,29-7,26 (m, 1H).

Preparare 2

1-(3 -Tienil)propan-2-ol

Se adaugă MeOH uscat (63 mL) la borohidrură de sodiu (1,61 g, 41,67 mmol) şi se răceşte amestecul de reacţie la -10 °C în timp ce se adăugă MeOH. Se răceşte mai departe la -20°C şi se adaugă o soluţie de 1-(3-tienil)propan-2-onă (4,92 g, 33,34 mmol) în MeOH uscat (26,7 mL) în picătură peste 40 minute şi se agită timp de 1,5 ore la -20°C, apoi la temperatura camerei timp de 17 ore. Se răceşte soluţia la -5°C (temperatura internă) şi se stinge cu o soluţie saturată de clorură de amoniu (15 ml) apoi cu HCl 1N (15 mL). Se adaugă apă (30 mL) şi EtOAc (100 mL). Se concentrează amestecul sub presiune redusă până la 1/3 din volumul total. Se extrage amestecul cu EtOAc (2×100 mL). Se combină extrasele organice şi se usucă pe sulfat de magneziu, se filtrează, şi se concentrează până la uscare pentru a da compusul din titlu (4,74 g, 100%). Spectrul de masă (m/z): 125 (M-OH+H), 164,8 (M+Na).

Preparare alternativă 2a

Se adaugă borohidrură de sodiu (7,06 g, 182,8 mmol) în porţii în 30 minute la 0°C la o soluţie de 1-(3-tienil)propan-2-onă (28,16 g, 140,6 mmol) în MeOH (282 mL) şi se agită la temperatura camerei peste noapte. Se concentrează până la uscare, se diluează cu EtOAc (200 mL) şi se spală cu o soluţie saturată de clorură de amoniu (150 mL). Se extrage stratul apos cu EtOAc (2×200 mL). Se combină extractele organice, se usucă pe sulfat de sodiu, se filtrează, şi se concentrează sub presiune redusă. Se purifică reziduul prin cromatografie intermitentă pe gel de siliciu eluând cu MeOH: DCM (0:100 până la 5:95) pentru a da compusul din titlu (12,85 g, 64%) ca un ulei roşu pal. Spectrul de masă (m/z): 125 (M-OH+H).

Preparare 3

(2S)-1-(3-Tienil)propan-2-ol

Se dizolvă 3-bromotiofenă (6,88 g, 42,2 mmol) în THF anhidru (10 mL) şi toluen (100 mL). Se răceşte la -78°C. La aceasta se adaugă prin seringă sec-butillitiu (1,3 mol/L în ciclohexan, 34 mL, 44 mmol) peste 15 minute. Se menţine temperatura la < -60°C, se agită 10 minute, apoi se adaugă (2S)-2-metiloxiran (4,9 g, 84,4 mmol) în picătură. După 5 minute, se adaugă bor trifluorură dietil eterat (5,3 mL, 42 mmol) peste 15 minute printr-o pâlnie de picurare. Se menţine temperatura la < -55°C. După ce adăugarea este completă, se agită la -78°C timp de 2 ore. Se stinge la -78°C cu bicarbonat de sodiu saturat, se adaugă Et2O, şi se încălzeşte la temperatura ambiantă. Se spală cu bicarbonat de sodiu saturat (2×), urmat de saramură saturată. Se usucă stratul organic peste sulfat de sodiu, se filtrează, şi se concentrează sub presiune redusă. Se purifică prin cromatografie intermitentă pe gel de siliciu, eluând cu 15% EtOAc/hexani pentru a da compusul din titlu (3,85 g, 64,2%). Se repurifică fracţiunile amestecate pentru a da o cantitate totală a compusului din titlu (4,29 g, 71,5%) ca un lichid incolor. 1H RMN (400,13 MHz, CDCl3) δ 7,28-7,26 (dd, J=2,9, 5,0, 1H), 7,03-7,01 (m, 1H), 6,96 (dd, J=1,2, 4,9, 1H), 4,04-3,95 (m, 1H), 2,83-2,68 (m, 2H), 1,63 (s, 1H), 1,22 (d, J= 6,2, 3H), SAU [α]20D +25,50 (c 1,00, CHCl3),

Preparare 4

(5'S)-5'-Metil-4',5'-dihidrospiro[piperidin-4,7'-tieno[2,3-c]piran]

Se dizolvă terţ-butil 4-oxopiperidin-1-carboxilat (6,50 g, 32,6 mmol) şi (2S)-1-(3-tienil)propan-2-ol (4,64g, 32,6 mmol) în DCM (100 mL). Se adaugă acid trifluoroacetic (20 mL, 264,5 mmol). Se agită amestecul la temperatura ambiantă 18 ore. Se concentrează amestecul sub presiune redusă, şi apoi se adaugă apă şi Et2O. Se spală stratul organic cu apă, se combină spălările apoase, şi apoi se ajustează pH-ul la bazic cu carbonat de sodiu solid. Se saturează stratul apos cu clorură de sodiu solidă, apoi se spală stratul apos cu EtOAc (5×). Se combină straturile de EtOAc, se spală cu saramură, se usucă cu sulfat de sodiu, se filtrează, şi se concentrează sub presiune redusă pentru a da compusul din titlu (4,61g, 63%) ca un ulei galben pal. Spectrul de masă (m/z): 224,2 (M+H).

Preparare 5

(5'S)-5'-metil-4',5'-dihidro-1H-spiro[piperidin-4,7'-tieno[2,3-c]piran]-1-carboxilat de terţ-butil

Se dizolvă (5'S)-5'-metil-4',5'-dihidrospiro[piperidin-4,7'-tieno[2,3-c]piran] (10,39 g, 46,53 mmol) în DCM (100 mL). Se adaugă di-terţ-butil dicarbonat (11,52 mL, 51,18 mmol) în picătură şi se agită amestecul la temperatura ambiantă pentru 1,5 ore. Se adaugă suplimentar di-terţ-butil dicarbonat (2,00 mL, 9,17 mmol) şi se agită 30 minute, apoi se concentrează sub presiune redusă. Se adaugă imidazol (2,21 g, 32,5 mmol) pentru a distruge excesul de di-terţ-butil dicarbonat (Synthesis, 2001, nr. 4, 550). Se adaugă Et2O şi se spală cu saramură. Se usucă stratul organic peste sulfat de sodiu, se filtrează şi se concentrează sub presiune redusă. Se purifică prin cromatografie intermitentă pe gel de siliciu, eluând cu 10% EtOAc/hexani. Se repurifică prin cromatografie intermitentă pe gel de siliciu, eluând cu 15% EtOAc/hexani pentru a da compusul din titlu (12,92 g, 86%) ca un ulei incolor. 1H RMN (400,13 MHz, d6-DMSO) δ 7,33 (d, J=5,1 , 1H), 6,77 (d, J=5,1 , 1H), 3,92-3,72 (m, 3H), 3,15-2,91 (s, 2H), 2,62 (dd, J=15,8, 3,0, 1H), 2,30 (dd, J=15,8, 10,6, 1H), 2,1 (m, 1H), 1,76-1,63 (m, 2H), 1,51-1,40 (m, 1H), 1,38 (s, 9H), 1,24 (d, J=6,2, 3H), 100% ee pe baza cromatografiei SFC, lux amiloză-2, 5 mL/min, 225 nm, Rt = 1,75 min, SAU [α]20D +82,1 (c 1,00, CHCl3).

Preparare 6

5'-metil-4',5'-dihidro-1H-spiro[piperidin-4,7'-tieno[2,3-c]piran]-1-carboxilat de terţ-butil

Se adaugă acid trifluoroacetic (34,16 mL, 451,8 mmol) în picătură la 0°C la o soluţie de 1-(3-tienil)propan-2-ol (12,85 g, 90,35 mmol) şi terţ-butil 4-oxopiperidin-1-carboxilat (23,40 g, 117,5 mmol) în DCM uscat (135 mL) şi se menţine agitarea la temperatura camerei pentru 17 ore. Se concentrează amestecul până la uscare, se diluează reziduul cu MeOH, şi apoi se îndepărtează solventul sub presiune redusă. Se ia reziduul în MeOH şi se purifică prin cromatografie cu schimb de ioni. Se combină straturile care conţin produsul dorit şi se concentrează sub presiune redusă coevaporându-l cu toluen (3×) pentru a da un solid oranj pal de 5-metilspiro[4,5-dihidrotieno[2,3-c]piran-7,4'-piperidină] brut. Se adaugă 4-dimetilaminopiridină (2,23 g, 18,07 mmol) şi trietilamină (37,8 mL, 271,1 mmol) în picătură la o soluţie de 5-metilspiro[4,5-dihidrotieno[2,3-c]piran-7,4'-piperidină] (20,18 g, 90,35 mmol) în DCM uscat (90,35 mL) răcit la 0°C. La aceasta se adaugă în picătură o soluţie de di-terţ-butil dicarbonat (30,49 g, 135,5 mmol,) în DCM uscat (27,1 mL). Se agită la temperatura camerei peste noapte. Se adaugă apă (100 mL), se extrage stratul apos cu DCM (3×100 mL), se spală cu saramură (100 mL), şi se concentrează sub presiune redusă. Se purifică prin cromatografie intermitentă pe gel de siliciu, eluând cu EtOAc: izo-hexan (0:100 până la 20:80). Se coevaporează reziduul cu DCM (3×) pentru a da compusul din titlu (27,64 g, 92,7%) ca un solid alb. Spectrul de masă (m/z): 346 (M+Na)

Preparare alternativă 6a

Se adaugă acid trifluoroacetic (20,17 mL, 266,72 mmol) în picătură la 0°C la o soluţie de 1-(3-tienil)propan-2-ol (4,74 g, 33,34 mmol) şi terţ-butil 4-oxopipendine-1-carboxilat (7,80 g, 38,34 mmol) în DCM uscat (100 mL) şi se agită la temperatura camerei peste noapte. Se concentrează amestecul până la uscare şi se diluează reziduul cu MeOH. Se purifică materialul brut prin cromatografie cu schimb de ioni. Se combină straturile care conţin produsul dorit şi se concentrează sub presiune redusă coevaporând cu DCM (3×) pentru a da 5-metilspiro[4,5-dihidrotieno[2,3-c]piran-7,4'-piperidină] brut (8,17 g). Se adaugă 4-dimetilaminopiridină (0,831 g, 6,67 mmol) şi trietilamină (9,29 mL, 66,68 mmol) la o soluţie de 5-metilspiro[4,5-dihidrotieno[2,3-c]piran-7,4'-piperidină] (8,17 g) în DCM uscat (66,7 mL) răcit la 0°C. La aceasta se adaugă în picătură o soluţie de di-terţ-butil dicarbonat (18,19 g, 83,35 mmol,) în DCM uscat (16,7 mL). Se agită la temperatura camerei pentru 3 zile. Se adaugă apă (60 mL), se extrage stratul apos cu DCM (3× 50 mL), se spală cu saramură (20 mL), se filtrează printr-un separator de fază, şi se concentrează sub presiune redusă. Se purifică reziduul prin cromatografie intermitentă pe gel de siliciu, eluând cu EtOAc: izo-hexan (0:100 până la 20:80). Se coevaporează reziduul cu DCM (2×) pentru a da compusul din titlu (9,41 g, 80%). Spectrul de masă (m/z): 346 (M+Na)

Preparare 7

Acid 1-(terţ-butoxicarbonil)-5'-metil-4',5'-dihidrospiro[piperidin-4,7'-tieno[2,3-c]piran]-2'-carboxilic

Se dizolvă 5'-metil-4',5'-dihidro-1H-spiro[piperidin-4,7'-tieno[2,3-c]piran]-1-car-boxilat de terţ-butil (7,16 g, 21,71 mmol) în THF (108,5 mL) şi se răceşte la -78°C. La aceasta se adaugă butillitiu (2,5 M în hexani, 13 mL, 32,56 mmol) în picătură peste 20 minute şi se agită amestecul încă 30 minute suplimentare după ce adăugarea este completă. Se barbotează în CO2 prin canulă şi se menţine agitarea la această temperatură timp de 1 oră cu adăugarea continuă de CO2. Se permite ca reacţia să se încălzească până la 0°C în 2 ore cu adăugare continuă de CO2 şi se stinge cu grijă cu apă (80 mL). Se toarnă amestecul de reacţie în apă şi se extrage stratul apos cu Et2O (100 mL). Se spală faza organică cu 2 N NaOH (3× 15 mL) şi apă (50 mL). Se acidulează stratul apos cu 2 N HCl (3Ч) la pH= 6, şi se extrage cu EtOAc. Se combină extractele organice şi se spală cu saramură (50 mL), se usucă pe sulfat de magneziu, se filtrează, şi se concentrează sub presiune redusă pentru a obţine compusul din titlu (7,89 g, 97%) ca un solid alburiu. Spectrul de masă (m/z): 390 (M+Na).

Preparare 8

Acid 1-(terţ-butoxicarbonil)-4',5'-dihidrospiro[piperidin-4,7'-tieno[2,3-c]piran]-2'-carboxilic

Se dizolvă 4',5'-dihidro-1H-spiro[piperidin-4,7'-tieno[2,3-c]piran]-1-carboxilat de terţ-butil (preparat cum s-a descris în J. Med. Chem., 2011, 54, (8), pp 2687-2700 şi WO2011060035) (10 g, 32,32 mmol) în THF (100 mL) şi se răceşte la -78°C. La aceasta se adaugă butillitiu (22,22 mL, 35,55 mmol) în picătură peste 15 minute şi se agită amestecul încă 15 minute suplimentare după ce adăugarea este completă. Se barbotează în CO2 prin canulă şi se permite ca amestecul să se încălzească la temperatura camerei cu adăugare continuă de CO2. După 2 ore, se răceşte amestecul până la 0°C, şi se adaugă apă urmată de Et2O. Se alcalinizează stratul apos cu 1 N NaOH şi se spală stratul organic cu 1 N NaOH (3×). Se combină spălările bazei şi acidularea la pH 2 cu 5 N HCl. Se spală stratul apos cu EtOAc (3×), se combină extractele organice, şi se spală cu saramură. Se usucă pe sulfat de sodiu, se filtrează, şi se concentrează sub presiune redusă pentru a da compusul din titlu (11,11 g, 97,27%) ca un solid alb. Spectrul de masă (m/z): 352,2 (M-H).

Preparare 9

Acid (5'S)-1-terţ-butoxicarbonil)-5'-metil-4',5'dihidrospiro[piperidin-4,7'-tieno[2,3-c]piran]-2'-carboxilic

Se dizolvă (5'S)-5'-metil-4',5'-dihidro-1H-spiro[piperidin-4,7'-tieno[2,3-c]piran]-1-carboxilat de terţ-butil (11,19 g, 34,60 mmol) în THF anhidru (200 mL) şi se răceşte la -78°C. Se adaugă n-butillitiu (21 mL, 34,64 mmol) în picătură peste 20 minute. După ce adăugarea este completă, se agită la -78°C pentru 20 minute, apoi se barbotează în gaz de CO2 prin canulă pentru 60 minute. Se încălzeşte amestecul la temperatura camerei cu adăugare continuă de CO2. După agitare 1 oră la temperatura camerei, se stinge cu apă (3 mL) şi se concentrează sub presiune redusă până la 25% din volum. Se adaugă Et2O şi apă. Se spală cu apă (2×) şi se combină spălările apoase. Se ajustează pH-ul la acidic cu HCl 1N. Se saturează stratul apos cu clorură de sodiu şi extract cu EtOAc (2×). Se combină extractele de EtOAc, se spală cu saramură, se usucă pe sulfat de sodiu, se filtrează, şi se concentrează sub presiune redusă pentru a da compusul din titlu (13,40 g, 100%) ca o spumă albă. Spectrul de masă (m/z): 366 (M-H).

Preparare 10

5-(Etilsulfanil)piridin-2-carbonitril

Se dizolvă 5-bromopiridin-2-carbonitril (49,42 g, 270,1 mmol) şi carbonat de potasiu (113,5 g, 821,2 mmol) în 1-metil-2-pirolidinonă (280 mL) şi se adaugă etantiol (26,4 mL, 356 mmol) în porţii în 30 minute astfel încât temperatura să rămână sub 50°C. Se răceşte reacţia la temperatura camerei şi se agită peste noapte. Se diluează cu EtOAc (1200 mL) şi apă (2200 mL). Se colectează stratul organic şi se spală cu saramură (3×300 mL), se usucă stratul organic peste sulfat de sodiu, se filtrează, şi se concentrează sub presiune redusă pentru a da compusul din titlu (44,87 g, 100%) ca un solid alburiu. 1H RMN (400,13 MHz, d6-DMSO) δ 8,63 (s, 1H), 7,93 (s, 2H), 3,17 (q, J=7,3, 2H), 1,29 (t, J=7,3, 3H).

Preparare 11

5-(Etilsulfonil)piridin-2-carbonitril

Se dizolvă 5-(etilsulfanil)piridin-2-carbonitril (44,36 g, 270,1 mmol) în DCM anhidru (540 mL) şi se răceşte la -20°C. Se adaugă 3-cloroperoxiacid benzoic (130 g, 565,0 mmol) în porţii de 10-12 grame într-o oră, menţinând temperatura internă între 0°C şi -10°C. Se agită amestecul de reacţie într-o baie rece, permiţând să se încălzească la temperatura camerei peste noapte. Se spală cu 1 N NaOH (1 L), apă, 1 N NaOH (2×500 mL), şi saramură. Se usucă stratul organic peste sulfat de sodiu, se filtrează, şi se concentrează sub presiune redusă pentru a da compusul din titlu (49,52 g, 93%) ca un solid alb. 1H RMN (400,13 MHz, d6-DMSO) δ 9,20 (d, J=1,9, 1H), 8,56 (dd, J=2,0, 8,1, 1H), 8,36 (d, J=8,1, 1H), 3,52 (q, J=7,3, 2H), 1,16 (t, J=7,5, 3H).

Preparare 12

clorhidrat de 1-[5-(Etilsulfonil)piridin-2-il]metanamină

Se divide 5-(etilsulfonil)piridin-2-carbonitril (49,52 g, 252,4 mmol) în trei porţii de 16,5 g. Sub N2, într-o sticlă Parr de 2250 mL, se adaugă 10% Pd/C (1,65 g, 15,5 mmol) în vas şi se umezeşte cu MeOH(750 mL). Se adaugă la aceasta 5-(etil-sulfonil)piridin-2-carbonitril (16,5 g, 84,09 mmol) dizolvat în MeOH (750 mL). Se adaugă la aceasta HCl (6N apoasă, 17,1 ml, 102,6 mmol). Se sigilează sticla, se curăţă cu N2, se curăţă cu H2, şi se presurizează până la 68,9 kPa la temperatura camerei timp de 3 ore. Se curăţă cu N2, şi apoi se filtrează amestecul. Se repetă cu porţiile rămase de 5-(etilsulfonil)piridin-2-carbonitril. Se combină toate filtratele şi se concentrează sub presiune redusă pentru a da compusul din titlu (59,61 g, 99%) ca un bej solid. Spectrul de masă (m/z): 201 (M+H-HCl).

Preparare 13

2'-({[5-(etilsulfonil)piridin-2-il]metil}carbamoil)-5'-metil-4',5'-dihidro-1H-spiro[piperidin-4,7'-tieno[2,3,c]piran]-1-carboxilat de terţ-butil

Se dizolvă acid 1-[5-(etilsulfonil)piridin-2-il]metanamină clorhidrat (3,1 g, 13 mmol), 1-(terţ-butoxicarbonil)-5'-metil-4',5'-dihidrospiro[piperidin-4,7'-tieno[2,3-c]pi-ran]-2'-carboxilic (3,9 g, 10 mmol) în DCM anhidru (52 mL). Se răceşte la 0°C şi se adaugă trimetilamină (10 mL, 73 mmol) în picătură urmată de 1,67 M soluţie de 2,4,6-tripropil-1,3,4,2,4,6-trioxatrifosforinan-2,4,6-trioxid (8,6 g, 14 mmol) în EtOAc. Se permite ca amestecul să se încălzească la temperatura camerei şi se agită peste noapte. Se adaugă cu grijă apă (50 mL) şi se agită 10 minute la temperatura camerei. Se extrage stratul apos cu DCM (2×), apoi se combină extractele organice. Se spală extractele organice cu saramură, se usucă pe sulfat de sodiu, se filtrează, şi se concentrează sub presiune redusă. Se purifică materialul brut prin cromatografie pe gel de siliciu, eluând cu un gradient de 50% până la 100% EtOAc/hexani pentru a da compusul din titlu (4,89 g, 83%) ca o spumă galbenă. Spectrul de masă (m/z): 550 (M+H).

Preparare 14

(5'S)-2'-({[5-(etilsulfonil)piridin-2-il]metil}carbamoil)-5'-metil-4',5'-dihidro-1H-spiro[piperidin-4,7'-tieno[2,3,c]piran]-1-carboxilat de terţ-butil

Se dizolvă clorhidrat de 1-[5-(etilsulfonil)piridin-2-il]metanamină (2,86 g, 10,5 mmol), acid (5'S)-1-terţ-butoxicarbonil)-5'-metil-4',5'dihidrospiro[piperidin-4,7'-tieno[2,3-c]piran]-2'-carboxilic (3,50 g, 9,52 mmol), şi 1-hidroxibenzotriazol (1,44 g, 10,5 mmol) în THF anhidru (100 mL) şi dimetilformamidă (50 mL). Se adaugă N,N-diizopropiletilamină (4,98 mL, 28,6 mmol) urmată de clorhidrat de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimidă şi se lasă să se agite la temperatura camerei peste noapte. Se concentrează sub presiune redusă la ∼40% din volum, apoi se adaugă EtOAc. Se spală cu bicarbonat de sodiu saturat (2×), apă (2×), saramură (2×), se usucă stratul organic peste sulfat de sodiu, se filtrează, şi se concentrează sub presiune redusă. Se cromatografiază pe gel de siliciu cu 80% EtOAc/hexani pentru a da compusul din titlu (4,51 g, 86%) ca o spumă gri. Spectrul de masă (m/z): 550 (M+H).

Preparare 15

Diclorhidrat de N-{[5-(Etilsulfonil)piridin-2-il]metil}-5'-metil-4',5',dihidrospiro[piperidin-4,7'-tieno[2,3,c]piran]-2'-carboxamidă

Se dizolvă 2'-({[5-(etilsulfonil)piridin-2-il]metil}carbamoil)-5'-metil-4',5'-dihidro-1H-spiro[piperidin-4,7'-tieno[2,3,c]piran]-1-carboxilat de terţ-butil (0,95 g, 1,68 mmol) în MeOH (10 mL) şi se adaugă 4 M HCl în dioxan (4,5 mL, 18 mmol). Se agită la temperatura camerei timp de 1 oră, apoi se concentrează sub presiune redusă pentru a da compusul din titlu (0,86 g, 100%) ca un solid alb. Spectrul de masă (m/z): 450 (M+H-2HCl).

Preparare 16

Diclorhidrat de (5'S)-N-{[5-(Etilsulfonil)piridin-2-il]metil}-5'-metil-4',5',dihidrospiro[piperidin-4,7'-tieno[2,3,c]piran]-2'-carboxamidă

Se dizolvă (5'S)-2'-({[5-(etilsulfonil)piridin-2-il]metil}carbamoil)-5'-metil-4',5'-dihidro-1H-spiro[piperidin-4,7'-tieno[2,3-c]piran]-1-carboxilat terţ-butil mmol (1,14 g, 2,0 mmol) în 1,4 dioxan (10 mL) şi MeOH (5 mL). Se adaugă 4 M HCl în dioxan (5,0 mL, 20 mmol) şi se agită la temperatura camerei timp de 2 ore. Se concentrează până la aproximativ 10 mL, apoi se adaugă Et2O şi se agită viguros peste noapte. Se adaugă hexani, se filtrează, şi se clăteşte cu hexani pentru a da compusul din titlu (0,99 g, 91%) ca un solid galben deschis. Spectrul de masă (m/z): 450 (M+H-2HCl).

Preparare 17

1-[2-(Trifluorometil)pirimidin-5-il]etanol

Se dizolvă 2-(trifluorometil)pirimidin-5-carbaldehidă (11,31 mmol, 1,992 g) în THF (56,56 mL), se răceşte la 0°C, şi se adaugă încet bromură de metilmagneziu (3 M în Et2O) (33,94 mmol, 11,31 mL). Se permite ca reacţia să se încălzească la temperatura camerei şi se agită 2,5 ore. Se stinge reacţia cu HCl 1N. Se adaugă EtOAc şi se spală cu HCl 1N. Se usucă organicele pe sulfat de sodiu, se filtrează, şi se concentrează sub presiune redusă pentru a da compusul din titlu (1,663g, 76,5%). Spectrul de masă (m/z): 193,0 (M+H).

Preparare 18

5-(1-Bromoetil)-2-(trifluorometil)pirimidină

Se dizolvă 1-[2-(trifluorometil)pirimidin-5-il]etanol (8,655 mmol, 1,663 g) şi trifenilfosfină (12,98 mmol, 3,405 g) în DCM (86,55 mL) şi se adaugă N-bromo-succinimidă (12,98 mmol, 2,311 g) la temperatura camerei. După trei ore, se concentrează reacţia sub presiune redusă. Se purifică reziduul rezultat prin cromatografie pe gel de siliciu, eluând cu 10% EtOAc / hexani pentru a da compusul din titlu (1,641 g, 74,34%). 1H RMN (400,13 MHz, d6-DMSO) δ 9,26 (s, 2H), 5,63 (q, J= 7,0 Hz, 1H), 2,09 (d, J= 7,0 Hz, 3H).

Exemplul 1

N-{[5-(Etilsulfonil)piridin-2-il]metil}-5'-metil-1-{1-[2-(trifluorometil)pirimidin-5-il]etil}-4',5'-dihidrospiro[piperidin-4,7'tieno[2,3-C]piran]-2'-carboxamidă

Se dizolvă diclorhidrat de N-{[5-(etilsulfonil)piridin-2-il]metil}-5'-metil-4',5',dihidrospiro[piperidin-4,7'-tieno[2,3,c]piran]-2'-carboxamidă (1,12 g, 2,31 mmol) în acetonitril (11,6 mL) şi diizopropiletilamină (2,42 mL, 13,9 mmol) şi se adaugă 5-(1-bromoetil)-2-(trifluorometil)pirimidină (0,71 g, 2,77 mmol). Se încălzeşte amestecul la 60°C timp de 90 de minute, apoi se răceşte la temperatura ambiantă şi se concentrează sub presiune redusă. Se dizolvă amestecul brut în MeOH (5 mL), apoi se încarcă pe o coloană de 50 g SCX. Se colorează cu MeOH (150 mL) şi apoi se eluează produsul cu 2 N amoniac/MeOH (150 mL). Se concentrează spălările cu amoniac/MeOH sub presiune redusă la o spumă portocalie. Se cromatografiază materialul brut prin cromatografie pe gel de siliciu, eluând cu un gradient de 100% DCM până la 95% DCM/MeOH pentru a da compusul din titlu (1,54 g, 43%). Spectrul de masă (m/z): 624 (M+H).

Exemplul 2

(5S')-N-{[5-(Etilsulfonil)piridin-2-il]metil}-5'-metil-1-{(1S)-1-[2-(trifluorometil)piri-midin-5-il]etil}-4',5'-dihidrospiro[piperidin-4,7'tieno[2,3-C]piran]-2'-carboxamidă

Exemplul 3

(5S')-N-{[5-(Etilsulfonil)piridin-2-il]metil}-5'-metil-1-{(1R)-1-[2-(trifluorometil)piri-midin-5-il]etil}-4',5'-dihidrospiro[piperidin-4,7'tieno[2,3-C]piran]-2'-carboxamidă

Exemplul 4

Izomer 1 (5R')-N-{[5-(Etilsulfonil)piridin-2-il]metil}-5'-metil-1-{1-[2-(trifluoro-metil)pirimidin-5-il]etil}-4',5'-dihidrospiro[piperidin-4,7'tieno[2,3-C]piran]-2'-carboxamidă

Exemplul 5

Izomer 2 (5R')-N-{[5-(Etilsulfonil)piridin-2-il]metil}-5'-metil-1-{1-[2-(trifluoro-metil)pirimidin-5-il]etil}-4',5'-dihidrospiro[piperidin-4,7'tieno[2,3-C]piran]-2'-carboxamidă

Se dizolvă N-{[5-(etilsulfonil)piridin-2-il]metil}-5'-metil-1-{1-[2-(trifluorometil)piri-midin-5-il]etil}-4',5'-dihidrospiro[piperidin-4,7'tieno[2,3-C]piran]-2'-carboxamidă (1,28 g, 2,05 mmol) în MeOH (58,5 mL). Se separă prin cromatografie chirală prin coloană SFC [AD-IC (30 x 250 mm, 5 µ) şi se eluează cu 50% IPA (20 mM NH3) la 120 mL/minut cu o injecţie de 4,5 mL (200 mg) la fiecare 10 minute pentru a da Exemplul 5, izomer 2 (5R')-N-{[5-(etilsulfonil)piridin-2-il]metil}-5'-metil-1-{1-[2-(trifluorometil)piri-midin-5-il]etil}-4',5'-dihidrospiro[piperidin-4,7'tieno[2,3-C]piran]-2'-carboxamidă şi se amestecă fracţiunile care conţin Exemplul 2, (5S')-N-{[5-(etilsulfonil)piridin-2-il]metil}-5'-metil-1-{(1S)-1-[2-(trifluorometil)pirimidin-5-il]etil}-4',5'-dihidrospiro[piperidin-4,7'-tieno[2,3-C]piran]-2'-carboxamidă, Exemplul 3, (5S')-N-{[5-(etilsulfonil)piridin-2-il]metil}-5'-metil-1-{(1R)-1-[2-(trifluorometil)pirimidin-5-il]etil}-4',5'-dihidrospiro[piperi-din-4,7'tieno[2,3-C]piran]-2'-carboxamidă şi Exemplul 4, izomer 1 (5R')-N-{[5-(etil-sulfonil)piridin-2-il]metil}-5'-metil-1-{1-[2-(trifluorometil)pirimidin-5-il]etil}-4',5'-dihidro-spiro[piperidin-4,7'tieno[2,3-C]piran]-2'-carboxamidă. Se concentrează fracţiunile amestecate şi se dizolvă acestea în MeOH (55,5 mL). Se separă amestecul prin cromatografie chirală prin coloană SFC [OJ-H (30 x 250 mm, 5 µ) şi se eluează cu 22% MeOH (20 mM NH3) la 160 mL/minut, cu o injecţie de 5,0 mL la fiecare 5 minute pentru a da Exemplul 4, izomer 1 (5R')-N-{[5-(etilsulfonil)piridin-2-il]metil}-5'-metil-1-{1-[2-(trifluorometil)pirimidin-5-il]etil}-4',5'-dihidrospiro[piperidin-4,7'tieno[2,3-C]piran]-2'-carboxamidă şi un amestec din Exemplul 3, (5S')-N-{[5-(etilsulfonil)piridin-2-il]metil}-5'-metil-1-{(1R)-1-[2-(trifluorometil)pirimidin-5-il]etil}-4',5'-dihidrospiro[piperidin-4,7'tieno[2,3-C]piran]-2'-carboxamidă şi Exemplul 2, (5S')-N-{[5-(etilsulfonil)piridin-2-il]metil}-5'-metil-1-{(1S)-1-[2-(trifluorometil)pirimidin-5-il]etil}-4',5'-dihidrospiro[piperidin-4,7'tieno[2,3-C]piran]-2'-carboxamidă. Se concentrează fracţiunile amestecate şi se dizolvă acestea în MeOH (30,0 mL). Se separă amestecul prin cromatografie chirală prin coloană SFC [AD-H (50 x 250 mm, 5 µ) şi se eluează cu 50% IPA (20 mM NH3) la 200 mL/min, cu injecţie de 3,0 mL la fiecare 32 minute pentru a da Exemplul 2, (5S')-N-{[5-(etilsulfonil)piridin-2-il]metil}-5'-metil-1-{(1S)-1-[2-(trifluorometil)pirimidin-5-il]etil}-4',5'-dihidrospiro[piperidin-4,7'tieno[2,3-C]-piran]-2'-carboxamidă şi Exemplul 3, (5S')-N-{[5-(etilsulfonil)piridin-2-il]metil}-5'-metil-1-{(1R)-1-[2-(trifluorometil)pirimidin-5-il]etil}-4',5'-dihidrospiro[piperidin-4,7'tieno[2,3-C]piran]-2'-carboxamidă. Se concentrează fiecare set de fracţiuni pure, apoi se dizolvă produsele separate în acetonitril (0,6 mL), se adaugă apă, se congelează la -78°C, şi se liofilizează pentru a da Exemplul 2, 0,214 g, 16%, 99,5% ee, Rt = 2,94 minute, spectrul de masă (m/z): 624 (M+H). Exemplul 3, 0,203 g, 15%, 98,9% ee, Rt = 2,75 minute, spectrul de masă (m/z): 624 (M+H). Exemplul 4, 0,251 g, 17%, 98,3% ee, Rt = 4,75 minute, spectrul de masă (m/z): 624 (M+H). Exemplul 5, 0,272 g, 18%, 100% ee, Rt = 4,33 minute, spectrul de masă (m/z): 624 (M+H). Condiţii analitice: SFC (220 nm UV), coloană: AD-IC 30 x 250 mm, 5 µ, fază mobilă: 50% IPA (20 mM NH3). Condiţii analitice LC chirale: SFC (225 nm UV), coloană Chirocel OJ-H, 20% MeOH (0,2% izopropilamină)/CO2, 5 mL/min.

Preparare alternativă a Exemplului 2

şi Preparare alternativă a Exemplului 3

Se dizolvă diclorhidrat de (5S')-N-{[5-(etilsulfonil)piridin-2-il]metil}-5'-metil-4',5',dihidrospiro[piperidin-4,7'-tieno[2,3,c]piran]-2'-carboxamidă (28,28 g, 58,19 mmol) în acetonitril (280 mL) şi diizopropiletilamină (50 mL, 290,9 mmol) şi se adaugă 5-(1-bromoetil)-2-(trifluorometil)pirimidină (0,71 g, 2,77 mmol), apoi se agită la temperatura ambiantă peste noapte. Se concentrează sub presiune redusă, apoi se dizolvă amestecul brut în DCM şi se purifică cu cromatografie pe gel de siliciu eluând cu 100% EtOAc pentru a da amestecul de compuşi din titlu. Se separă prin cromatografie chirală cu coloană [Chiralpak IA (8 x 40,5 cm, 225 nm) şi se eluează cu 40% acetonitril/60% izopropilalcool (cu 0,2% dimetiletilamină) la 400 mL/minut, cu injecţie de 20 mL (2000 mg). Se concentrează fiecare diastereomer sub presiune redusă, apoi se dizolvă în etanol fierbinte (250 mL), se filtrează fierbinte, apoi se lasă să se răcească la temperatura ambiantă, şi se clăteşte cu etanol rece. Solidul se usucă într-un cuptor cu vid la 55°C pentru a da Exemplul 2, 9,94 g, 27%, 90,8 % ee, Rt = 3,93 minute, spectrul de masă (m/z): 624 (M+H) şi Exemplul 3, 9,42 g, 26%, 98,8% ee, Rt = 9,25 minute, spectrul de masă (m/z): 624 (M+H)) ca material cristalin. Condiţii analitice: Coloană Chiralpak IA (4,6 x 150 mm, 225 nm) şi se eluează cu 40% acetonitril/60% izopropilalcool (cu 0,2% dimetiletilamină) la 1 mL/minut.

Difracţie cu raze X, Exemplul 3

Se montează un singur cristal pe o fibră subţire MiTeGen la 23°C. Se colectează datele utilizând o sursă de radiaţie CuKα (λ = 1,54178 Е) şi un Bruker D8 pe bază de difractometru goniometru cu 3 cercuri, echipat cu un detector de zonă SMART 6000CCD (Bruker-AXS. SHELXTL (V2013 6,2) Madison, Wisconsin, SUA). Se efectuează rafinarea celulei şi reducerea datelor utilizând programul SAINT V8.32b (Sheldrick, G.M., (2008), SHELXS-97, Acta Cryst. A64, 112-122). Se indexează celula unitară care are parametrii monoclinici de a = 10,1624(2) Å, b = 9,9080(2) Å, c = 15,1085(3) Å, şi α = 90°, β = 100,6879(14)°, γ = 90°. Volumul celulei de structură cristalină este 1494,87(5) Å3. Densitatea calculată a structurii este 1,386 g/cm3 la 23°C. Se rezolvă structura prin metode directe (Sheldrick, G.M., (2008), SHELXS-97, Acta Cryst. A64, 112-122). Toţi parametrii atomici au fost rafinaţi în mod independent. Alegerea grupului spaţial, care este P21, este confirmată prin convergenţa cu succes a întregii matrice a celor mai mici pătrate, rafinate pe F2 (Sheldrick, G. M., (2013), SHELXL-2013, Program pentru rafinamentul structurii cristaline, (Institute fur anorg chemie, Gottingen, Germania) cu o acceptanţă finală de corespondenţă de 1,088. Factorul rezidual final, R1, este = 0,0771 şi cea mai mare diferenţă între maxim şi minim după ciclul de rafinament final a fost de 0,315 şi respectiv de -0,333 (e.A-3). Parametrul structurii absolute a fost rafinat până la 0,072(17).

Structura din Exemplul 3 este determinată şi structura moleculară este consistentă cu cea prezentată pentru Exemplul 3. Ar trebui să se observe că structura cristalului este de calitate ridicată şi stabileşte stereochimia absolută a centrilor chirali din Exemplul 3, C5 ca (S) şi C1 ca (R) din gruparea piperdină prin utilizarea contribuţiei anormale de împrăştiere a atomilor grei (sulf) în structură. Configuraţia absolută este determinată din structura cristalină pentru a fi configuraţia (5'S)-N-{[5-(etilsulfonil)piridin-2-il]metil}-5'-metil-1-{(1R)-1-[2-(trifluorometil)pirimidin-5-il]etil}-4',5'-dihidrospiro[piperidin-4,7'-tieno[2,3-c]piran]-2'-carboxamidei.

Teste biologice

Inhibitori de legare RORa, b, şi g

Receptorul orfan alfa asociat cu RAR uman etichetat His (hRORa), receptorul orfan beta asociat cu RAR uman (hRORb), şi receptorul orfan gama asociat cu RAR uman (hRORg) sunt utilizaţi pentru testele de legare competiţionale receptor-ligand, pentru a determina valorile Ki. Procedurile tipice sunt furnizate mai jos.

Testele de legare competiţionale ale receptorilor sunt rulate într-un tampon realizat din DPBS (1 L) (Hyclone #SH30028,03), fracţiunea 2,2 g BSA v (Roche #9048-46-8), 100 mL glicerol (Fischer #56-81-5) şi 40 mL DMSO (grad reactiv). Godeurile finale conţin 20 µg/mL aprotinin şi 20 µg/mL leupeptin şi 10 µM Pefabloc. De obicei, testele de legare ale receptorilor includ liganzi etichetaţi radio, cum ar fi 7 nM [3H]-25-hidroxicolesterol pentru legare alfa, 20 nM [3H]-3-[[4-[[3-(2,6-diclorofenil)-5-izopropil-izoxazol-4-il]metoxi]-N,2-dimetil-anilino]metil]acid benzoic pentru legare beta, şi 6 nM [3H]-25-hidroxicolesterol pentru legare gama, şi 0,5 µg receptor RORa, 0,03 µg receptor RORb, sau 0,13 µg receptor RORg pe godeu. Testele sunt de obicei rulate în format cu 96 de godeuri. Compuşii competiţionali testaţi se adaugă în diferite concentraţii care variază de la aproximativ 0,4 nM până la 25 µM. Legarea nespecifică este determinată în prezenţa a 250 nM 25-hidroxicolesterol pentru legarea RORa şi RORg, 250 nM acid 3-[[4-[[3-(2,6-diclorofenil)-5-izopropil-izoxazol-4-il]metoxi]-N,2-dimetil-anilino]metil]benzoic pentru legarea RORb. Mostra, eticheta şi soluţiile receptor sunt combinate într-o placă de test cu 96 de godeuri (Costar 3632) şi incubate peste noapte la temperatura camerei, apoi se adaugă la fiecare reacţie 25 µl perle (Amersham YSi (2-5 micron) de cupru Spa Beads etichetate His, #RPNQ0096) pentru o concentraţie de perle finală de 1 mg/godeu. Plăcile sunt amestecate timp de 30 minute pe un agitator orbital la temperatura camerei. După o incubare de 4 ore, plăcile sunt citite într-un numărător Wallac MICROBETA®.

Datele sunt utilizate pentru a calcula o valoare IC50 estimată utilizând o corespondenţă logistică cu patru parametri. Kd pentru acidul [3H]-25-hidroxicolesterol pentru RORa şi RORg, şi [3H]-3-[[4-[[3-(2,6-diclorofenil)-5-izopropil-izoxazol-4-il]metoxi]-N,2-dimetil-anilino]metil]benzoic pentru legarea RORb, este determinată prin legarea de saturaţie. Valorile IC50 pentru compuşi sunt convertite la Ki utilizând ecuaţia Cheng-Prushoff.

Rezultatele următorilor compuşi exemplificaţi sunt prezentate în Tabelul 2 mai jos.

Tabelul 2

# Exemplu Ki a RORa (nM) Ki a RORb (nM) Ki a RORg (nM) 1 >20,400 >12500 12,0 ± 7,3, n=2 2 >20,400 >12500 6,24 + 0,73, n=2 3 >20,400 >12500 16,6 ± 8,8, n=5 4 >20,400 2190 148 + 40, n=2 5 >20,400 407 153 + 25, n=2

Medie ± SEM; SEM = eroare standard a mediei

Aceste rezultate demonstrează că compuşii din Tabelul 2 sunt selectivi pentru

RORg versus RORa şi RORb.

Test receptor-reporter HEK293 RORg GAL4

Ca un indicator al activităţii agoniste inverse, un test receptor reporter (RORg-GAL4/pGL4,31) al receptorului orfan gama asociat cu RAR (RORg) este efectuat în celule HEK293. Celulele HEK293 sunt cotransfectate utilizând reactivul Fugene™. O plasmidă reporter care conţine un domeniu de legare GAL4 şi un promotor adenoviral minimal în amonte de o genă luciferază licurici, este cotransfectată cu o plasmidă care exprimă constitutiv un domeniu de legare al ligandului RORg uman fuzionat la domeniul de legare ADN GAL4 al drojdiei. Celulele sunt transfectate în flacoane T150 cm2 în mediu MEM fără FBS. După 18 ore de incubare, celulele transfectate sunt tripsinizate, placate în 9 plăci cu 6 godeuri de microtitrare în mediu 3:1 DMEM-F12 care conţine 10% FBS, incubate pentru 4 ore şi apoi expuse la diferite concentraţii ale compuşilor testaţi care variază de la aproximativ 0,05 nM până la 10 µM. După 18 ore de incubăre cu compuşi, celulele sunt lizate şi activitatea luciferază este cuantificată utilizând tehnici standard. Datele sunt potrivite cu o logistică de corespondenţă cu 4 parametri pentru a determina valorile IC50.

Rezultatele următorilor compuşi exemplificaţi sunt prezentate în Tabelul 3 mai jos.

Tabelul 3

# Exemplu hIC50 (nM) 1 56,5 ± 39,4, n=2 2 45,8 ± 8,5, n=4 3 21,8 ± 7,03, n=7 4 97,9 ± 5,1, n=2 5 59,5 ± 1,3, n=2

Medie ± SEM; SEM = eroare standard a mediei

Aceste rezultate demonstrează că compuşii din Tabelul 3 sunt agonişti inverşi pentru receptorul RORg uman.

Test de viabilitate ELISA şi Cell TiterGlo pentru secreţia de PBMC IL-17

Celule PBMC sunt izolate din straturile tampon de sânge integral prin combinarea mai întâi a straturilor tampon proaspete cu volume egale de soluţie salină tamponată cu fosfat. Treizeci şi cinci mL de PBS/soluţie de strat tamponat sunt apoi uşor suprapuse pe 15 mL de Ficoll în tuburi conice de 50 mL. După centrifugare timp de 30 minute la 500×g (cu accelerare şi decelerare lentă) stratul superior de plasmă este eliminat şi stratul celulelor de-a lungul interfeţei Ficoll este colectat şi unificat. Fiecare tub de 250 mL este umplut până la vârf cu mediu RPMI-1640 la temperatura camerei. Tuburile sunt centrifugate pentru 10 minute la 500×G (cu accelerare şi decelerare lentă), mediul este îndepărtat prin aspirare, şi etapa de spălare este repetată. Celulele sunt resuspendate în mediu Recovery Cell Culture Freezing de gheaţă rece de la Life Technologies (număr de catalog 12648-010) pe gheaţă. Concentraţia de celule este ajustată până la 66,7 milioane celule/mL. Celulele sunt congelate lent la -1°C/minut în fiole cu 100 milioane de celule şi depozitate în azot lichid.

Stimulare de secreţie IL-17 şi adăugarea compusului

PBMC sunt dezgheţate prin resuspendare cu 1 mL de mediu complet (RPMI-1640 care conţine 30 mM HEPES, 100 unităţi/mL penicilină, 100 µg/mL streptomicină, 3,25 mM L-Glutamină, 0,2 µM beta-mercaptoetanol, şi 10% FBS) urmată de adăugarea în picătură a 2 mL, 4 mL, 8 mL, şi 16 mL de mediu complet cu răsucire uşoară. Celulele sunt centrifugate 5 minute şi peletul celular este resuspendat în mediu complet. Grupuri de celule sunt rupte prin rularea soluţiei celulare printr-o seringă cu ac de calibru 23, şi un filtru celular de 40 µM. Se adaugă o sută de mii de celule pe godeu la o cultură de ţesut de polistiren cu 384 godeuri, tratată cu plăci cu fund plat într-un total de 30 µL. Cocktailul de stimulare care conţine anticorpi CD3 antiumani, anticorpi CD28 antiumani, IL-23 şi compuşi preparaţi în mediu complet, se adaugă la celule simultan într-un volum total de 30 µL. Concentraţia finală de stimulanţi adăugaţi este de 160 ng/mL, 500 ng/mL, şi 5 ng/mL pentru anticorpii anti-CD3, anticorpii anti-CD28, şi respectiv IL-23 şi de 0,3% pentru DMSO. Plăcile sunt etanşate cu film de etanşare AERASEAL® şi incubate 48 ore la 37°C, 95% umiditate, şi 5% CO2.

După perioada de incubare, plăcile sunt centrifugate la 200×g cinci minute. Supernatanţii sunt diluaţi 1:1 cu volum egal 1% BSA/PBS şi testaţi pentru IL-17 cu o trusă ELISA IL-17 umană de la R&D System (catalog #D317E) în conformitate cu protocolul furnizat cu trusa, cu o excepţie - este utilizat substratul colorimetric OPD (diclorhidrat o-fenilenediamină, Sigma Cat #P6912) în locul unui substrat furnizat în trusă. Absorbanţa la 492 nm este măsurată cu cititorul de placă multi-etichetă Envision. Valorile A492 sunt convertite în concentraţie de IL-17 pe baza curbei standard IL-17, aşa cum se arată mai jos:

Valorile IC50 pentru inhibarea secreţiei de IL-17 sunt calculate pe baza valorilor convertite utilizând o corespondenţă standard cu 4 parametri, cu inhibarea maximă determinată din valorile medii ale godeurilor fără stimulanţi şi compuşi adăugaţi, şi inhibarea minimă din valorile medii ale godeurilor cu stimulanţi singuri şi fără compuşi adăugaţi.

Volume egale de reactiv de testare a viabilităţii celulare Cell TITERGLO® (Promega Cat# G7573) se adaugă la celulele rămase pe plăci, şi după o incubare de cincisprezece minute cu agitare uşoară la temperatura camerei, luminiscenţa este măsurată cu cititorul de placă multietichetă Envision. Procentajul de moarte celulară este calculat prin setarea activităţii 100% (moarte celulară) la zero unităţi de luminiscenţă şi activitate minimă (număr max de celule viabile) ca media unităţilor de luminiscenţă ale godeurilor care conţin stimulanţi singuri şi nu au compuşi adăugaţi. Valorile IC50 sunt calculate utilizând o corespondenţă standard cu patru parametri.

Rezultatele următorilor compuşi exemplificaţi sunt prezentate în Tabelul 4 mai jos.

Tabelul 4

# Exemplu ELISA hPBMC IL-17 (nM) Viabilitate Cell TiterGlo (EC50) 1 77,3 >1,0 µM 2 33,7 ± 33,1, n=6 >1,0 µM 3 20,0 ± 12,6, n=12 >1,0 µM 4 106 >1,0 µM 5 30,5 ± 29,3, n=4 >1,0 µM

Medie ± SEM; SEM = eroare standard a mediei

Aceste rezultate arată că compuşii din Tabelul 4 inhibă secreţia de IL-17 stimulată de anti-CD3/anti-CD28/IL-23 în PBMC-uri fără efect citotoxic măsurabil.

Model de artrită indusă de glucoză-6-fosfat izomerază (GPI):

Modelul de artrită indusă GPI este adaptat de la K. Iwanami şi colab. Arthritis Rheumatism 58, 754-763, 2008 şi D. Schubert şi colab. J Immunology 172, 4503-4509, 2004. Şoarecii (şoareci DBA/1 masculi cu vârsta de 8-9 săptămâni) (Harlan) sunt repartizaţi aleator în grupuri de tratament pe baza greutăţii corporale colectate pe zi de imunizare (ziua 0). Pe zi de imunizare (ziua 0), un amestec 1:1 (v:v) de GPI uman recombinant (diluat până la 4 mg/mL în PBS, Gibco) şi de adjuvant Freund complet (CFA, Sigma) este amestecat cu un omogenizator de mare viteză (Omni) pentru 40 minute într-o cameră rece. O concentraţie finală de 2 mg/mL GPI este obţinută în emulsie. Şoarecii sunt injectaţi la baza cozii (2 situsuri de injecţie, subcutanate, 100 µL pe fiecare situs) cu emulsie GPI. Compuşii testaţi sunt dozaţi oral începând în aceeaşi zi cu imunizarea (ziua 0). Începând cu ziua 0, fiecare labă este notată pentru severitatea umflării articulaţiei pe baza unui sistem de notare de la 0 până la 3 (Vezi K. Iwanami şi colab. Arthritis Rheumatism 58, 754-763, 2008). Scorurile clinice reprezintă scorul total al tuturor celor 4 labe (scor maxim = 12). Scorurile clinice sunt evaluate pe zile 0, 2, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, şi 21.

AUC este calculată printr-o metodă trapezoidă pentru scorul clinic în timp, din ziua de imunizare (ziua 0) până în ziua 21. Valorile p testate au fost derivate din testul t Student.

Tratamentele cu Exemplul 3 (1000 mg/Kg) şi vehicul (1% HEC, 0,25% Polisorbat 80, şi 0,05% Antifoam în apă purificată) (n=8/grup) sunt iniţiate în ziua 0 şi administrate oral, o dată zilnic. Exemplul 3 reduce severitatea umflării labei şi menţine mai scăzută media scorurilor clinice prin cursul bolii, în comparaţie cu grupul tratat cu vehicul. Acest efect conduce la 75% reducere în scorul clinic AUC, o măsură cumulativă a umflării labei în timp, care este statistic semnificativă în comparaţie cu grupul tratat cu vehicul aşa cum se arată în Tabelul 5.

Tabelul 5

Tratament Scor clinic AUC (medie ± SEM) Vehicul 87,70 ± 4,88 Exemplul 3 22,20 ± 8,68*; Valorile sunt prezentate ca medie ± SEM. *p<0,05 vs. vehicul (test t Student). SEM = eroare standard a mediei

Claims

1. Un compus cu formula

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia. 2. Compusul conform revendicării 1 cu formula

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia. 3. Compusul din revendicările 1 sau 2 cu formula

4. O compoziţie farmaceutică cuprinzând un compus conform oricăreia dintre revendicările 1 până la 3, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, în combinaţie cu unul sau mai mulţi purtători, diluanţi, sau excipienţi acceptabili farmaceutic.

5. Compoziţia farmaceutică în conformitate cu revendicarea 4 care cuprinde unul sau mai mulţi alţi agenţi terapeutici.

6. Un compus conform oricăreia dintre revendicările 1 până la 3, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, pentru utilizare în terapie.

7. Un compus conform oricăreia dintre revendicările 1 până la 3, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, pentru utilizare în tratamentul psoriazisului.

8. Un compus conform oricăreia dintre revendicările 1 până la 3, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, pentru utilizare în tratamentul spondilartropatiilor seronegative.

9. Un compus, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, pentru utilizare în conformitate cu revendicarea 8 în tratamentul spondiloartritei axiale, spondilitei anchilozante, sau artritei psoriazice.