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WO2024194432A1 - Procédé de préparation d'un hydrogel stérile comprenant un polysaccharide réticulé, non réticulé ou leur mélange - Google Patents

Procédé de préparation d'un hydrogel stérile comprenant un polysaccharide réticulé, non réticulé ou leur mélange Download PDF

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Publication number
WO2024194432A1
WO2024194432A1 PCT/EP2024/057664 EP2024057664W WO2024194432A1 WO 2024194432 A1 WO2024194432 A1 WO 2024194432A1 EP 2024057664 W EP2024057664 W EP 2024057664W WO 2024194432 A1 WO2024194432 A1 WO 2024194432A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hydrogel
polysaccharide
ions
citrate
zinc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/EP2024/057664
Other languages
English (en)
Inventor
Romain BRUSINI
Camille VANTOU
Killian FLEGEAU
Laura Jing JING
Jimmy FAIVRE
François BOURDON
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Teoxane SA
Original Assignee
Teoxane SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Teoxane SA filed Critical Teoxane SA
Priority to CN202480033551.XA priority Critical patent/CN121152617A/zh
Priority to AU2024240643A priority patent/AU2024240643A1/en
Publication of WO2024194432A1 publication Critical patent/WO2024194432A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Pending legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
    • A61K8/73—Polysaccharides
    • A61K8/735—Mucopolysaccharides, e.g. hyaluronic acid; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0021—Intradermal administration, e.g. through microneedle arrays, needleless injectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L26/00—Chemical aspects of, or use of materials for, wound dressings or bandages in liquid, gel or powder form
    • A61L26/0009—Chemical aspects of, or use of materials for, wound dressings or bandages in liquid, gel or powder form containing macromolecular materials
    • A61L26/0023—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L26/00—Chemical aspects of, or use of materials for, wound dressings or bandages in liquid, gel or powder form
    • A61L26/0061—Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A61L26/008—Hydrogels or hydrocolloids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/06—Flowable or injectable implant compositions

Definitions

  • the present invention relates to a sterile hydrogel comprising a crosslinked polysaccharide, a non-crosslinked polysaccharide or a mixture thereof, in particular comprising a crosslinked hyaluronic acid, a non-crosslinked hyaluronic acid or a mixture thereof, and further comprising zinc and citrate ions as well as a process for its preparation.
  • Polysaccharides such as glycosaminoglycans
  • glycosaminoglycans are widely used in the medical and aesthetic fields, particularly for soft tissue filling.
  • the majority of products marketed for aesthetic applications are based on hyaluronic acid.
  • hydrogels prepared from unmodified hyaluronic acid are interesting because they have the advantage of being perfectly biocompatible.
  • hydrogels based on modified hyaluronic acid the hyaluronic acid usually being modified by crosslinking.
  • This crosslinking has the advantage of increasing the in vivo durability and resistance to in vivo degradation of the hydrogels.
  • Hydrogels based on crosslinked hyaluronic acid can be obtained by different preparation methods.
  • hydrogels capable of improving their biocompatibility profile and delivering beneficial biological effects on skin quality.
  • zinc is proving to be an element of choice. It is a micronutrient that has many beneficial biological effects as a cofactor of many enzymes, particularly those involved in the healing and extracellular matrix reconstruction processes. In addition to healing activities, anti-inflammatory and anti-infectious activities have also been associated with zinc. Zinc may therefore be of interest in reducing possible side effects due to the inflammatory response associated with the administration of hydrogels.
  • hydrogels containing zinc are not easy, as zinc can precipitate in the presence of certain salts, particularly phosphates, carbonates and/or sulfates. Its incorporation into hydrogels therefore remains difficult.
  • a need remains for the provision of a process for preparing hydrogels comprising a crosslinked and/or non-crosslinked polysaccharide and further comprising zinc, in particular at concentrations where zinc is biologically active, without precipitation of the latter.
  • the proposed process will be as respectful as possible of the properties of the hydrogels, i.e. it will cause the least possible degradation of the rheological properties of the hydrogels during heat sterilization.
  • the present invention relates to a process for preparing a sterile hydrogel comprising a crosslinked polysaccharide, a non-crosslinked polysaccharide or a mixture thereof and further comprising zinc ions, the process comprising the following steps:
  • preparing a hydrogel comprising a cross-linked polysaccharide, a non-cross-linked polysaccharide or a mixture thereof, the preparation of the hydrogel comprising the following steps:
  • a physiological saline solution preferably buffered
  • the physiological saline solution preferably buffered, comprising phosphate or carbonate or sulfate salts or their mixtures
  • citrate ions to the cross-linked polysaccharide, to the non-cross-linked polysaccharide, or to their mixture, in an amount sufficient to achieve a citrate ion concentration of at least 0.1 mM in the hydrogel,
  • the invention also relates to a process for preparing a sterile hydrogel comprising a crosslinked polysaccharide and optionally a non-crosslinked polysaccharide and further comprising zinc ions, the process comprising the following steps:
  • preparation of a hydrogel from the crosslinked polysaccharide obtained at the end of step (0) and optionally from a non-crosslinked polysaccharide comprising a step of bringing the crosslinked polysaccharide into contact with a physiological saline solution, preferably buffered, comprising phosphate or carbonate or sulfate salts or their mixtures;
  • the crosslinking reaction medium further comprises citrate ions in an amount sufficient to achieve a citrate ion concentration of at least 0.1 mM in the hydrogel, the molar ratio [citrate ions present in the reaction medium] / [zinc ions present in the reaction medium] ranging from 1 to 20; or
  • step (1) further comprises, before the step of bringing the crosslinked polysaccharide into contact with the physiological saline solution, preferably buffered, a step of adding citrate ions in a quantity sufficient to reach a citrate ion concentration of at least 0.1 mM in the hydrogel, the molar ratio [citrate ions added] / [zinc ions present in the reaction medium] ranging from 1 to 20; or
  • the physiological saline solution preferably buffered, further comprises citrate ions in an amount sufficient to achieve a citrate ion concentration of at least 0.1 mM in the hydrogel, the molar ratio [citrate ions present in the physiological saline solution, preferably buffered] / [zinc ions present in the reaction medium] ranging from 1 to 20.
  • the invention also relates to a process for preparing a sterile hydrogel comprising a crosslinked polysaccharide and optionally a non-crosslinked polysaccharide and further comprising zinc ions, the process comprising the following steps:
  • a physiological saline solution preferably buffered, comprising phosphate or carbonate or sulfate salts or their mixtures; the molar ratio [citrate ions present in the reaction medium] / [zinc ions present in the reaction medium] ranging from 1 to 20, the preparation of the reaction medium being carried out by addition of the citrate ions before any contact of the zinc ions with the physiological saline solution;
  • step (1) sterilization, preferably by heat, of the hydrogel obtained at the end of step (1) to obtain a sterile hydrogel.
  • the invention also relates to a sterile hydrogel comprising a crosslinked polysaccharide, a non-crosslinked polysaccharide or their mixture, in particular comprising a crosslinked hyaluronic acid, a non-crosslinked hyaluronic acid or their mixture, and further comprising zinc and citrate ions obtained by the methods according to the invention.
  • the invention relates to the use of citrate ions for protecting a hydrogel comprising a crosslinked polysaccharide, a non-crosslinked polysaccharide or their mixture, optionally an anesthetic agent, and in addition zinc ions, from the degradation of its rheological properties during its sterilization, preferably by heat or for preserving the stability over time of the rheological properties of a hydrogel comprising a crosslinked polysaccharide, a non-crosslinked polysaccharide or their mixture, optionally an anesthetic agent, and in addition zinc ions.
  • the invention relates to the use of a solution comprising zinc ions and citrate ions for protecting a hydrogel comprising a crosslinked and/or non-crosslinked polysaccharide.
  • crosslinked optionally an anesthetic agent, from the degradation of its rheological properties during its sterilization, preferably by heat, or to preserve the stability over time of a hydrogel comprising a crosslinked polysaccharide, a non-crosslinked polysaccharide or their mixture, optionally an anesthetic agent.
  • Fig.1 hydrogel obtained according to the method of the invention (microscope: Olympus SZX16, software: OLYMPUS Stream Start)
  • Fig.2 hydrogel excluding invention (microscope: Olympus SZX16, software: OLYMPUS Stream Start)
  • gel refers to a polymer network that is expanded throughout its volume by a fluid. This means that a gel is formed of two media, one “solid” and the other "liquid”, dispersed in each other.
  • the so-called “solid” medium consists of long polymer molecules connected to each other by weak bonds (e.g. hydrogen bonds) or by covalent bonds (crosslinking).
  • the liquid medium consists of a solvent.
  • a gel generally corresponds to a viscoelastic product that has a phase angle 5 of less than 90°, preferably less than or equal to 70°, preferably less than or equal to 45°, at 1 Hz for a deformation of 0.1% or a pressure of 1 Pa, preferably a phase angle 5 ranging from 2° to 45° or ranging from 20° to 45°.
  • hydrogel designates a gel as defined above in which the solvent constituting the liquid medium is predominantly water (for example at least 90%, in particular at least 95%, in particular at least 97%, in particular at least 98% by weight of the liquid medium) and having a pH ranging from 6.8 to 7.8.
  • injectable hydrogel refers to a hydrogel that can flow and be injected manually using a syringe equipped with a needle with a diameter ranging from 0.1 to 0.5 mm, for example a 32G, 30G, 27G, 26G, 25G hypodermic needle.
  • an "injectable hydrogel” is a hydrogel having an average extrusion force of less than or equal to 25N, preferably ranging from 5 to 25N, more preferably ranging from 8 to 15N, when measured with a dynamometer, at a speed fixed at approximately 12.5 mm/min, in syringes with an external diameter greater than or equal to 6.3 mm, with a needle with an external diameter less than or equal to 0.4 mm (27 G) and a length of 1”, at room temperature.
  • a “superficial application” means the administration, for example by mesotherapy, of a composition superficially into or onto the skin, for the treatment of the superficial layers of the skin, the epidermis and the most superficial parts of the dermis, to reduce superficial wrinkles and/or improve the quality of the skin (such as its radiance, density or structure) and/or rejuvenate the skin.
  • a “midline application” means administering a composition to the midline of the skin to treat the midline layers of the skin, as well as to reduce midline wrinkles.
  • “Deep application” means the administration of a composition into the deeper layers of the skin, the hypodermis and the deepest part of the dermis, and/or beneath the skin (above the periosteum) to “add volume,” such as for filling deep wrinkles and/or partially atrophied regions of the facial and/or body contour. So-called “volumizing” hydrogels can typically be administered for deep application.
  • a “cross-linked polysaccharide” refers to a polysaccharide that has been modified during a cross-linking reaction.
  • non-crosslinked polysaccharide refers to a polysaccharide that has not been modified with a crosslinking agent and which therefore has not undergone a crosslinking reaction.
  • crosslinking agent refers to any compound capable of introducing crosslinking between different polysaccharide chains.
  • the “molar crosslinking rate” (CR), expressed in %, means the molar ratio of the amount of crosslinking agent to the amount of polysaccharide repeating units introduced into the crosslinking reaction medium expressed per 100 moles of polysaccharide repeating units in the crosslinking medium.
  • a molar crosslinking rate of 1% means that there is one molecule of crosslinking agent introduced into the reaction medium per 100 moles of polysaccharide repeating units.
  • repeating unit of a polysaccharide refers to a structural unit consisting of one or more (usually 1 or 2) monosaccharides whose repetition produces the complete polysaccharide chain.
  • the “modification degree” (MOD) of a polysaccharide corresponds to the molar quantity of cross-linking agent linked to the polysaccharide, by one or several of its ends, expressed per 100 moles of repeating units of the polysaccharide. It can be determined by methods known to those skilled in the art such as Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy.
  • NMR Nuclear Magnetic Resonance
  • a degree of modification of 1% means that there is one molecule of crosslinking agent per 100 moles of repeating units of polysaccharide.
  • polysaccharide refers to a polymer composed of monosaccharides (preferably D-enantiomers) joined together by glycosidic bonds.
  • room temperature is meant a temperature ranging from 20 to 25°C, more particularly 21°C.
  • the Linear Viscoelastic Region corresponds to the range of hydrogel deformations from an initial elastic modulus value G' to the value of the elastic modulus G' reduced by 10% of its initial value.
  • the LVER measurement consists of an oscillatory stress scan measurement in compression mode at a given oscillation frequency to determine the linear viscoelastic region.
  • the inventors have developed three alternative processes that meet the needs expressed.
  • a hydrogel comprising a crosslinked and/or non-crosslinked polysaccharide and further comprising zinc is made possible by the addition of citrate ions during the hydrogel preparation phase.
  • a hydrogel comprising zinc
  • the preparation of a hydrogel comprising zinc is made possible by carrying out the crosslinking of the polysaccharide in a reaction medium comprising zinc ions and by adding citrate ions either during the crosslinking step or subsequently but before any contact of the zinc ions with a physiological saline solution, preferably buffered, comprising phosphate or carbonate or sulfate salts, alone or their mixtures.
  • the preparation of a hydrogel comprising zinc is made possible by carrying out the crosslinking of the polysaccharide in a reaction medium comprising zinc ions, citrate ions and a physiological saline solution, preferably buffered, comprising phosphate or carbonate salts or sulfate, alone or their mixtures, provided that the citrate ions are added before any contact of the zinc ions with the physiological saline solution.
  • citrate ions in particular citric acid or sodium citrate, or calcium citrate, or potassium citrate or magnesium citrate, to zinc makes it possible to prevent the precipitation of zinc, in particular in the presence of a physiological saline solution, preferably buffered, comprising phosphate or carbonate or sulfate salts or their mixtures.
  • hydrogels obtained by the method of the present invention thus exhibit lesser modifications of their rheological properties after sterilization (better preservation of the elastic modulus G', better preservation of the phase angle) compared to hydrogels prepared by an equivalent method without the addition of zinc and citrate ions, in particular without the addition of zinc and citrate ions in the form of a physiological saline solution, preferably buffered, comprising phosphate or carbonate or sulfate salts or their mixtures.
  • hydrogels obtained by the process of the present invention have better stability over time, that is to say that they maintain their rheological properties more effectively over time, in particular after sterilization, than hydrogels prepared by an equivalent process without the addition of zinc and citrate ions, in particular without the addition of zinc and citrate ions in the form of a physiological saline solution, preferably buffered, comprising phosphate or carbonate or sulfate salts or their mixtures, and zinc ions and citrate ions.
  • the hydrogels according to the invention have better conservation over time of their rheological properties ⁇ in particular after sterilization, and do not exhibit precipitation of zinc.
  • hydrogels obtained by the method of the present invention comprising an anesthetic agent exhibit less degradation of their rheological properties after sterilization.
  • hydrogels comprising an anesthetic agent, prepared by an equivalent process without the addition of zinc ions and citrates, in particular without the addition of zinc ions and citrates in the form of a physiological saline solution, preferably buffered, comprising phosphate or carbonate or sulfate salts or mixtures thereof.
  • the present invention thus relates to a process for preparing a sterile hydrogel comprising a crosslinked and/or non-crosslinked polysaccharide and further comprising zinc ions, the process comprising the following steps:
  • saline solution preferably buffered
  • the saline solution preferably buffered, comprising phosphate or carbonate or sulfate salts or mixtures thereof;
  • step (1) sterilization, preferably by heat, of the hydrogel obtained at the end of step (1) to obtain a sterile hydrogel.
  • step (1) preparation of the hydrogel from the crosslinked and/or non-crosslinked polysaccharide (step (1)) comprises at least the steps indicated above, the order of these steps being indifferent. Other steps can be implemented.
  • the polysaccharide may be any polymer composed of monosaccharides joined together by glycosidic bonds or mixtures thereof.
  • the polysaccharide is selected from pectin and pectic substances; chitosan; chitin; cellulose and its derivatives; agarose; glycosaminoglycans such as hyaluronic acid, heparosan, dermatan sulfate, keratan sulfate, chondroitin and chondroitin sulfate; and mixtures thereof.
  • the polysaccharide is chosen from hyaluronic acid, heparosan, chondroitin and mixtures thereof, even more preferably the polysaccharide is hyaluronic acid or one of its salts, in particular a physiologically acceptable salt such as the sodium salt, the potassium salt, the zinc salt, the calcium salt, the magnesium salt, the silver salt, the calcium salt and mixtures thereof. More particularly, the hyaluronic acid is in its acid form or in the form of sodium salt (NaHA).
  • the hydrogel can thus be a hydrogel based on hyaluronic acid and/or one of its salts.
  • the polysaccharide is hyaluronic acid or one of its salts, it has a weight average molecular mass (Mw) ranging from 0.05 to 10 MDa, preferably ranging from 0.5 to 5 MDa, for example ranging from 2 to 4 MDa or ranging from 1 to 5 MDa.
  • Mw weight average molecular mass
  • the polysaccharide may be provided in hydrated form (fully or partially hydrated), or in dry form, such as powder or fiber. When the polysaccharide is provided in hydrated form, it is typically in the form of a gel.
  • a cross-linked polysaccharide may be prepared by any method known to those skilled in the art.
  • the cross-linked polysaccharide may result from the reaction of the polysaccharide with a cross-linking agent or result from the reaction of a polysaccharide modified to allow the formation of covalent intermolecular bonds.
  • the crosslinked polysaccharide can be prepared as described in WO2010131175A1 or WO201277054A1.
  • the method of the present invention can thus comprise, before the step of preparing the hydrogel, a step of preparing a crosslinked polysaccharide.
  • the crosslinked polysaccharide is preferably a crosslinked polysaccharide whose molar crosslinking rate is less than or equal to 10%.
  • the crosslinked polysaccharide is a crosslinked polysaccharide whose molar crosslinking rate is greater than 0 and less than or equal to 6%.
  • the crosslinked polysaccharide is a crosslinked polysaccharide whose molar crosslinking rate is greater than 0 and less than or equal to 4%.
  • the crosslinked polysaccharide is a crosslinked polysaccharide whose molar crosslinking rate is greater than 0 and less than or equal to 2%, preferably less than or equal to 1%, more preferably less than or equal to 0.8%, in particular ranging from 0.1% to 0.5% (number of moles of crosslinking agent(s) per 100 moles of repeating unit of the polysaccharide(s).
  • the polysaccharide may be crosslinked by reaction of a polysaccharide that has been previously modified.
  • the polysaccharide may have been modified by introduction of functional groups capable of reacting with each other and forming covalent intermolecular bonds.
  • the polysaccharide may have been modified by grafting using a molecule allowing the subsequent crosslinking of the polysaccharide thus modified.
  • the polysaccharide may have been modified by grafting a silylated molecule, an amino acid, an amino acid derivative or a protein.
  • the polysaccharide may be crosslinked by means of a crosslinking agent.
  • the polysaccharide is preferably crosslinked by means of a crosslinking agent selected from epoxy or non-epoxy bi- or multifunctional crosslinking agents, i.e. prepared by reaction of the polysaccharide with a crosslinking agent.
  • a crosslinking agent selected from epoxy or non-epoxy bi- or multifunctional crosslinking agents, i.e. prepared by reaction of the polysaccharide with a crosslinking agent.
  • the epoxy agents mention may be made of 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE), 1,2,7,8-diepoxy-octane, 1,2-bis(2,3-epoxypropyl)-2,3-ethane (EGDGE), poly(ethylene glycol)-diglycidyl ether (PEGDE), and mixtures thereof.
  • non-epoxy agents may be cited endogenous polyamines such as spermine, spermidine and putrescine, aldehydes such as glutaraldehyde, carbodiimides and divinylsulfone, hydrazide derivatives such as adipic acid dihydrazide, bisalkoxyamines, dithiols such as polyethylene glycol dithiol and mixtures thereof.
  • endogenous polyamines such as spermine, spermidine and putrescine
  • aldehydes such as glutaraldehyde, carbodiimides and divinylsulfone
  • hydrazide derivatives such as adipic acid dihydrazide
  • bisalkoxyamines dithiols such as polyethylene glycol dithiol and mixtures thereof.
  • non-epoxy agents may be cited amino acids such as cysteine, lysine; peptides or proteins containing amino acids such as cysteine, lysine; poly(dimethylsiloxane); trimetaphosphates, such as for example sodium trimetaphosphate, calcium trimetaphosphate, or barium trimetaphosphate.
  • the crosslinking agent is an epoxy agent, preferably 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE) or polyethylene glycol diglycidyl ether.
  • BDDE 1,4-butanediol diglycidyl ether
  • the crosslinking agent is a non-epoxy agent, preferably selected from endogenous polyamines, aldehydes, carbodiimides, divinyl sulfone, amino acids, peptides and mixtures thereof.
  • the crosslinked polysaccharide is preferably a crosslinked polysaccharide having a degree of modification (MOD) of less than or equal to 10%, preferably less than or equal to 6%, preferably less than or equal to 4%, preferably less than or equal to 2%, more preferably less than or equal to 1%.
  • MOD degree of modification
  • the crosslinked polysaccharide is a crosslinked polysaccharide having a degree of modification (MOD) less than or equal to 1.8%, more preferably less than or equal to 1.5%, preferably less than or equal to 1.2%, even more preferably less than 1%.
  • the cross-linked polysaccharide may in particular be prepared by a process comprising the following steps:
  • the polysaccharide is as described above.
  • the polysaccharide is hyaluronic acid or a salt of hyaluronic acid, preferably a sodium salt.
  • the polysaccharide may be provided in dry form, such as in powder or fiber form, or in hydrated form.
  • the polysaccharide is provided in hydrated form, it is in the form of an uncrosslinked gel or a solution.
  • the polysaccharide is in hydrated form, it is an aqueous uncrosslinked gel or an aqueous solution.
  • the crosslinking agent is as described above.
  • the solvent is typically water or a mixture comprising water and an organic solvent (typically a mixture comprising at least 90% by weight of water, or at least 95% or at least 99% by weight of water relative to the total weight of the solvent).
  • an organic solvent such as an alcohol, in particular ethanol, or DMSO, may be used to solubilize the crosslinking agent, for example when it is poly(dimethylsiloxane) terminated at each end by a diglycidyl ether (CAS number: 130167-23-6), before its addition to the aqueous reaction medium.
  • the reaction medium may further comprise salts, pH adjusters, for example a Bronsted base, more preferably a hydroxide salt, such as sodium or potassium hydroxide, additional components as described below and mixtures thereof.
  • a Bronsted base may be particularly necessary when the functional groups of the crosslinking agent have an epoxide group or a vinyl group.
  • the crosslinking takes place at a pH greater than or equal to 10, more advantageously greater than or equal to 12, which requires the addition of a Bronsted base to the reaction medium, typically at a concentration of between 0.10M and 0.30M.
  • the total amount of crosslinking agent in the reaction medium typically varies from 0.001 to 0.10 mole per 1 mole of polysaccharide repeating unit, preferably from 0.001 to 0.08 mole or from 0.001 to 0.06 mole per 1 mole of polysaccharide repeating unit, preferentially from 0.001 to 0.04 mole per 1 mole of polysaccharide repeating unit, preferably from 0.001 to 0.03 mole per 1 mole of polysaccharide repeating unit, preferably 0.001 to 0.02 mole per 1 mole of polysaccharide repeating unit, more preferably from 0.001 to 0.01 mole per 1 mole of polysaccharide repeating unit, even more preferably from 0.001 to 0.005 mole per 1 mole of polysaccharide repeating unit.
  • the repeating unit is a disaccharide unit.
  • the mass concentration of polysaccharide or polysaccharide salt in the reaction medium advantageously varies from 50 to 300 mg/g of solvent, preferably from 80 to 200 mg/g.
  • Step (a1) of the process typically comprises a step of homogenization of the reaction medium. Homogenization is generally carried out by three-dimensional stirring, stirring with a mixer, stirring with blades or stirring with a spatula.
  • Step (a1) is typically carried out at a temperature ranging from 4 to 35°C, preferably ranging from 15°C to 25°C.
  • the duration of step (1) does not exceed 5 hours. It generally varies from 15 minutes to 4 hours, preferably from 30 min to 2 hours.
  • Step (a2) consists of reacting the reaction medium to obtain a crosslinked polysaccharide.
  • step (a2) is carried out directly after step (a1).
  • This step allows the polysaccharide chains to be crosslinked together.
  • the functional groups of the crosslinking agent react with functional groups present on the polysaccharides so as to bind the polysaccharide chains together and crosslink them by forming intermolecular bonds.
  • the crosslinking agent can also react with functional groups present on the same polysaccharide molecule so as to form intramolecular bonds.
  • the functional groups of the crosslinking agent react with the -OH or -COOH groups, or even -CHO, present on polysaccharides such as hyaluronic acid.
  • Crosslinked polysaccharides comprising at least one crosslinking link between two polysaccharide chains, said crosslinking link being the residue of the crosslinking agent are thus obtained.
  • Crosslinking can be carried out in the presence of several crosslinking agents.
  • the crosslinking agents can be added simultaneously or separately in time to the reaction medium.
  • Step (a2) can thus comprise repeated crosslinking steps, advantageously step (a2) comprises a single crosslinking step.
  • crosslinking is then carried out in the presence of a total amount of crosslinking agents typically ranging from 0.1 to 10 moles, or from 0.1 to 8 moles, or from 0.1 to 6 moles, or from 0.1 to 4 moles, or from 0.1 to 3 moles, or from 0.1 to 2 moles or from 0.1 to 1 mole or from 0.1 to 0.8 moles, or from 0.1 to 0.5 moles of crosslinking agents (or their salts) per 100 moles of repeating unit of the polysaccharide.
  • the crosslinking conditions in particular the contents of crosslinking agent, duration and temperatures as well as the weight average molecular masses (Mw) of the polysaccharide, used are interdependent.
  • crosslinking agent The lower the content of crosslinking agent, the longer the reaction time must be to obtain similar mechanical properties of the resulting crosslinked polysaccharide, and ultimately of the prepared hydrogel.
  • the lower the molar percentage of crosslinking agent the fewer reactive functions there are in the reaction medium and the lower the probability that 2 groups meet and react together, thus the longer the reaction time must be to allow the functions to react with each other and form crosslinking bonds, and thus obtain a crosslinked polysaccharide, and ultimately a hydrogel with desirable properties.
  • step (a2) can be carried out by placing the reaction medium directly obtained at the end of step (a1), at a temperature less than or equal to 30°C, preferably less than or equal to 25°C.
  • the temperature is typically greater than 0°C or greater than 5°C or even greater than 10°C.
  • step (a2) can be carried out by placing the reaction medium directly obtained at the end of step (a1) at a temperature equal to room temperature.
  • the crosslinking time is at least 1 minute, preferably at least 10 minutes, even more preferably at least 1 hour.
  • the crosslinking time is at most 5 days.
  • step (a2) can be carried out by placing the reaction medium directly obtained at the end of step (a1), at a temperature greater than 30°C, or greater than or equal to 35°C, or greater than or equal to 40°C, or greater than or equal to 45°C, or greater than or equal to 50°C.
  • the temperature is typically less than 60°C.
  • the duration of the crosslinking step is at least greater than or equal to 1 minute, preferably at least greater than or equal to 10 minutes, even more preferably at least 1 hour, preferably between 1 hour and 5 hours.
  • step (a2) can be carried out by placing the reaction medium directly obtained at the end of step (a1) at a temperature ranging from 0 to 15°C or from 1 to 10°C or from 1 to 9°C.
  • step (a2) can be carried out by placing the reaction medium directly obtained at the end of step (a1), at a pressure P less than or equal to atmospheric pressure and at a temperature T higher than the temperature of the eutectic point of the reaction medium as measured at the pressure P and lower than the temperature of the freezing point of the reaction medium as measured at the pressure P, preferably for a period of at least 1 hour.
  • the crosslinked polysaccharide-based hydrogels prepared by such a method are highly biocompatible. Indeed, the crosslinked polysaccharides can be prepared with smaller amounts of crosslinking agent, for example amounts ranging from 0.001 to 0.02 mole per 1 mole of repeating unit of the polysaccharide.
  • the freezing point temperature of the reaction medium refers to the temperature at which the mixture of the components of the reaction medium, on a macroscopic scale, solidifies, i.e. it becomes non-fluid. Below the freezing point, the mixture is in a frozen state which is characterized by the coexistence of components in solid and liquid form. The frozen state is maintained up to the eutectic point temperature of the reaction medium.
  • the eutectic point temperature of the reaction medium refers to the temperature below which the mixture of the components of the reaction medium passes from a frozen state (coexistence of liquid and solid phases) to a completely solid state, i.e. a state in which all the components of the mixture are in solid form.
  • the freezing point and the eutectic point of a mixture depend on the pressure to which the mixture is subjected, therefore the freezing point and the eutectic point are measured at pressure P.
  • the freezing point and eutectic point can be determined by differential scanning calorimetry. This method allows phase transitions to be determined. To do this, the product to be studied is gradually cooled until its phase transitions are observed.
  • the temperature T is preferably greater than or equal to -55°C and less than or equal to -5°C, preferably it ranges from -35°C to -10°C. Even more preferably, the temperature T is approximately -20°C.
  • the pressure P is preferably atmospheric pressure.
  • “Atmospheric pressure” is the pressure exerted by the air constituting the atmosphere on any surface in contact with it. It varies according to altitude. At an altitude of 0 m, the average atmospheric pressure is 101,325 Pa.
  • the pressure P is atmospheric pressure and the temperature T is greater than or equal to -55°C and less than or equal to -5°C, preferably T varies from -35°C to -10°C or is approximately -20°C.
  • the reaction medium obtained at the end of step (1) is placed for a period of at least 1 hour, preferably at least 3 hours, preferably at least 72 hours, preferably at most 27 weeks under these conditions.
  • the crosslinking step (a2) is carried out for a period ranging from 2 to 25 weeks, preferably ranging from 2 to 20 weeks or 2 to 17 weeks, even more preferably from 3 to 8 weeks or 4 to 7 weeks and at the temperature T, at the pressure P.
  • the crosslinked polysaccharide is typically in the form of a gel.
  • This gel is generally directly used in the rest of the process of the invention (step (1)).
  • the crosslinked and/or non-crosslinked polysaccharides described above are useful for implementing the methods of the invention and thus preparing hydrogels comprising a crosslinked and/or non-crosslinked polysaccharide.
  • the crosslinked or non-crosslinked polysaccharide, or their mixture will constitute the polymer network of the hydrogel.
  • the hydrogel comprising a crosslinked or non-crosslinked polysaccharide, or their mixture can thus be said to be based on a crosslinked polysaccharide, or a non-crosslinked polysaccharide, or their mixture.
  • a hydrogel comprising, as the only polysaccharide, a non-crosslinked polysaccharide is prepared from a non-crosslinked polysaccharide.
  • a hydrogel comprising, as the only polysaccharide, a crosslinked polysaccharide, is prepared from a crosslinked polysaccharide.
  • the hydrogel comprises the mixture of a crosslinked and non-crosslinked polysaccharide
  • the hydrogel is prepared from a crosslinked polysaccharide and a non-crosslinked polysaccharide.
  • the non-crosslinked polysaccharide is typically added to the crosslinked polysaccharide during the preparation of the hydrogel.
  • the method of the present invention according to method 1 comprises the preparation of a hydrogel comprising a crosslinked and/or non-crosslinked polysaccharide.
  • the preparation of the hydrogel includes the following steps:
  • a physiological saline solution preferably buffered
  • the physiological saline solution preferably buffered, comprising phosphate or carbonate or sulfate salts or mixtures thereof;
  • the physiological saline solution When the physiological saline solution is buffered, it is buffered by phosphate and/or carbonate and/or sulfate salts and generally has a physiological pH (6, 8-7, 8).
  • the buffered physiological saline solution is a buffered physiological saline solution comprising phosphate salts, preferably the buffered physiological saline solution may be a phosphate buffer.
  • the phosphate buffer may be a PBS buffer with a pH around the physiological pH (6, 8-7, 8) (CAS No: 7647-14-5, 7447-40-7).
  • the buffer is a phosphate buffer, particularly a NaH2PO4/Na2HPC>4 or KH2PO4/K2HPO4 saline buffer.
  • contacting the crosslinked and/or non-crosslinked polysaccharide with a physiological saline solution, preferably buffered, comprising phosphate or carbonate or sulfate salts or mixtures thereof may occur at different stages.
  • contacting the crosslinked and/or non-crosslinked polysaccharide with the physiological saline solution, preferably buffered may occur at the time of adjusting the concentration of crosslinked and/or non-crosslinked polysaccharide in the prepared hydrogel. This step is commonly referred to as "dilution".
  • a physiological saline solution preferably buffered, comprising phosphate or carbonate or sulfate salts or mixtures thereof is typically added during dilution.
  • the contacting of the crosslinked and/or non-crosslinked polysaccharide with the physiological saline solution, preferably buffered may occur at the time of pH adjustment or at the time of addition of one or more additional components (see below).
  • the contacting with the physiological saline solution, preferably buffered, comprising phosphate or carbonate or sulfate salts or their mixtures is carried out at least during the step of adjusting the concentration of crosslinked and/or non-crosslinked polysaccharide (dilution).
  • the amount of citrate ions added makes it possible to achieve a citrate ion concentration in the hydrogel of at least 0.1 mM and generally at most 150 mM, 100 mM, 50 mM, 20 mM or 15 mM.
  • the amount of citrate ions added makes it possible to achieve a concentration of citrate ions in the hydrogel varying from 0.1 to 150 mM or from 0.1 to 100 mM or from 0.1 to 50 mM or from 0.1 to 20 mM or from 0.1 to 15 mM or from 0.3 to 15 mM or from 0.5 to 15 mM or from 1 to 10 mM or from 1.5 to 10 mM or from 2 to 10 mM or from 3 to 10 mM or from 3 to 8 mM or from 5 to 8 mM.
  • the molar ratio of citrate ions to repeating units of the polysaccharide may vary from 0.001 to 10 or from 0.001 to 5 or from 0.001 to 4.3, preferably from 0.001 to 4, even more preferably from 0.001 to 3.
  • the polysaccharide may have been modified by the introduction of functional groups capable of reacting with each other and forming covalent intermolecular bonds.
  • the molar ratio of citrate ions / disaccharide units of hyaluronic acid varies from 0.001 to 10 or from 0.001 to 4, preferably still from 0.01 to 3, more preferably from 0.01 to 2, for example from 0.01 to 1.00 or from 0.015 to 0.500.
  • the amount of zinc ions added is such that a zinc ion concentration in the hydrogel is achieved not exceeding 20 mM, or not exceeding 7 mM, or not exceeding 5 mM, or not exceeding 3.5 mM, or not exceeding 2 mM, or not exceeding 1.6 mM, or not exceeding 1.15 mM, or not exceeding 0.8 mM.
  • the amount of zinc ions added allows to reach a zinc ion concentration in the hydrogel typically ranging from 0.10 to 20 mM or from 0.10 to 7 mM or from 0.10 to 5 mM or from 0.10 to 3.5 mM or from 0.10 to 2 mM or from 0.10 to 1.6 mM, or from 0.10 to 1.15 mM or from 0.10 to 0.8 mM.
  • the amount of zinc ions added makes it possible to achieve a zinc ion concentration in the hydrogel ranging from 0.10 to 1.6 mM, more preferably from 0.10 to 1.15 mM, even more preferably from 0.1 to 0.8 mM, preferentially from 0.3 to 0.8 mM.
  • the molar ratio of citrate ions to added zinc varies from 1 to 20, preferably from 5 to 20 or from 5 to 15 or from 6 to 15 or from 6 to 10.
  • the citrate and zinc ions may be added before or after contacting the crosslinked and/or non-crosslinked polysaccharide with the physiological saline solution, preferably buffered, comprising phosphate or carbonate or sulfate salts or mixtures thereof.
  • the citrate and zinc ions may be added sequentially, either before or after contacting the crosslinked and/or non-crosslinked polysaccharide with the physiological saline solution, preferably buffered.
  • the citrate ions may be added then the zinc ions, or the zinc ions may be added then the citrate ions.
  • the addition of the zinc ions before the addition of the citrate ions can only be done when the addition of the citrate and zinc ions is done before contacting the crosslinked and/or non-crosslinked polysaccharide with the physiological saline solution, preferably buffered.
  • the citrate and zinc ions can be added concomitantly, either before or after the step of contacting the cross-linked and/or non-cross-linked polysaccharide with the physiological saline solution, preferably buffered.
  • the addition of the citrate and zinc ions is concomitant with the contacting of the crosslinked and/or non-crosslinked polysaccharide with the physiological saline solution, preferably buffered.
  • the physiological saline solution preferably buffered, may comprise phosphate and/or carbonate and/or sulfate salts or mixtures thereof, and further comprise citrate and zinc ions.
  • the citrate ions may be added in powder form or in the form of a solution.
  • the solution may be prepared by adding citric acid to water or to a physiological saline solution, preferably buffered, for example to a buffered physiological saline solution comprising phosphate or carbonate or sulfate salts or mixtures thereof.
  • the solution may be prepared by adding sodium citrate, calcium citrate, potassium citrate or magnesium citrate to water or to a physiological saline solution, preferably buffered, for example to a buffered physiological saline solution comprising phosphate or carbonate or sulfate salts or mixtures thereof.
  • Zinc ions can be added in powder form or as a solution.
  • the solution can be prepared by adding zinc acetate and/or zinc chloride and/or zinc sulfate and/or zinc oxide and/or zinc gluconate to water.
  • the zinc and citrate ions may be added as a solution comprising zinc and citrate ions.
  • a solution comprising both citrate and zinc ions is then added during the preparation of the hydrogel.
  • the solution may be prepared by adding citric acid to water and then adding zinc salts (e.g. zinc acetate and/or zinc chloride and/or zinc sulfate and/or zinc oxide and/or zinc gluconate), preferably by adding zinc chloride.
  • the solution may be prepared by adding sodium citrate, calcium citrate, potassium citrate or magnesium citrate to water and then adding zinc salts (e.g. zinc acetate and/or zinc chloride and/or zinc sulfate and/or zinc oxide and/or zinc gluconate), preferably by adding zinc chloride.
  • the solution may be prepared by adding citric acid to a physiological saline solution, preferably buffered, followed by addition of zinc salts (e.g. zinc acetate and/or zinc chloride and/or zinc sulfate and/or zinc oxide and/or zinc gluconate).
  • zinc salts e.g. zinc acetate and/or zinc chloride and/or zinc sulfate and/or zinc oxide and/or zinc gluconate.
  • the solution may be prepared by adding sodium citrate or calcium citrate, potassium citrate or magnesium citrate to a physiological saline solution, preferably buffered, followed by addition of zinc salts (e.g. zinc acetate and/or zinc chloride and/or zinc sulfate and/or zinc oxide and/or zinc gluconate).
  • the zinc salt is zinc chloride.
  • the buffered physiological solution may be, for example, a phosphate buffer.
  • the phosphate buffer may be a PBS buffer with a pH around physiological pH (6.8-7.8) (CAS No: 7647-14-5, 7447-40-7).
  • the buffer is a phosphate buffer, particularly a saline buffer of NaH2PO4/Na2HPC>4 or KH2PO4/K2HPO4.
  • the pH of the solution can be adjusted to reach a physiological pH (6.8-7.8), for example by adding sodium hydroxide.
  • a phosphate buffer solution comprising zinc and phosphate is provided.
  • Citric acid which has a pH ranging from 6.8 to 7.8, is added during hydrogel preparation. When sodium citrate, calcium citrate, potassium citrate, or magnesium citrate is used, pH adjustment is typically not necessary.
  • the preparation of a hydrogel from the crosslinked and/or non-crosslinked polysaccharide may be carried out in a conventional manner, except that zinc ions and citrate ions are added during the preparation of the hydrogel.
  • the preparation of a hydrogel from the crosslinked and/or non-crosslinked polysaccharide may comprise one or more of the following conventional steps:
  • the conventional steps can be carried out in the following sequential manner: possible pH adjustment (1) then possible dilution (2) then possible purification (3) then possible addition of an additional component (4) then possible extrusion (5). They can also be carried out in a different order.
  • the extrusion step (5) is carried out last, when at least one of the other conventional steps is implemented. It can also be carried out several times and intercalated between the other conventional steps described.
  • the conventional steps may be performed in the following sequential manner: (1), (2), (3), (4), (5); or (2), (1), (3), (4), (5); or (2) (1), (4), (5); or (2), (4), (5); or (1), (4), (5); or (2), (4), (3), (5); or (2), (4), (1), (5); or (2), (4), (5); or (4), (2), (1); or (4), (1), (2) or (2), (3), (4), (5); or (2), (4), (1); or (1), (5), (3), (4); or (1), (5), (4); or (2), (4).
  • Steps (2), (3), (4) and (5) may be concurrent.
  • the preparation of the hydrogel may include the following sequence: (2) and (4) are carried out concomitantly.
  • Citrate ions (in powder or solution form) and zinc ions (in powder or solution form) can be added at the time of, before or after any of these steps. conventional. Typically when the addition of citrate ions in powder form is carried out, a neutralization of the effect of the citrate ions on the pH of the hydrogel can be achieved.
  • the citrate and zinc ions are preferably added in the form of a solution comprising zinc and citrate ions. The solution is as described above.
  • Citrate ions in powder form or in solution
  • zinc ions in powder form or in solution
  • steps (2) and (4) can be carried out concomitantly.
  • the citrate ions and/or the zinc ions are added before the extrusion step (5) so as to obtain a homogeneous gel.
  • the citrate ions and/or the zinc ions are advantageously added after the purification step (3).
  • the addition of the citrate ions and/or the zinc ions after the purification step ensures better control of the concentration of citrate ions and/or the zinc ions in the prepared hydrogel.
  • citrate ions and/or zinc ions are added between the purification (3) and extrusion (5) steps.
  • the citrate ions in powder form or in solution are (are) added during the dilution step (2) and/or during the step of adding at least one additional component (4), preferably during the step of adding at least one additional component (4).
  • the addition of the citrate ions and/or the zinc ions is concomitant with the step of adding at least one additional component (4).
  • the citrate ions in powder form or in solution are (are) added during the dilution step (2) and/or during the step of adding at least one additional component (4), preferably during the step of adding at least one additional component (4).
  • the addition of the citrate ions and/or the zinc ions is concomitant with the step of adding at least one additional component (4).
  • the addition of zinc ions and citrate ions preferably in the form of a solution comprising citrate and zinc ions, is concomitant with the addition of an anesthetic solution.
  • the addition of zinc ions and citrate ions is concomitant with the addition of a lubricating agent.
  • the solution comprising added zinc ions and citrate ions may comprise other components, in particular a lubricating agent, for example non-crosslinked hyaluronic acid, non-crosslinked heparosan or a mixture thereof.
  • a lubricating agent for example non-crosslinked hyaluronic acid, non-crosslinked heparosan or a mixture thereof.
  • the steps of dilution (2), addition of at least one additional component (4) and addition of citrate and/or zinc ions may be concomitant.
  • Citrate and/or zinc ions may be added after the pH adjustment step (1). Citrate ions may be added between the pH adjustment (1) and extrusion (5) steps when both steps are implemented.
  • the method of preparing the hydrogel may include a step of adjusting the pH of the hydrogel to reach the desired pH (pH of 6.8-7.8).
  • the method for preparing the hydrogel may comprise a step of diluting the crosslinked and/or non-crosslinked polysaccharide.
  • the dilution step makes it possible to adapt the concentration of crosslinked and/or non-crosslinked polysaccharide in the prepared hydrogel.
  • an aqueous solvent is added to the crosslinked and/or non-crosslinked polysaccharide, for example, a physiological saline solution, possibly buffered by the presence of salts, such as phosphate or carbonate or sulfate salts or mixtures thereof. More particularly, the added aqueous solvent has a pH around the physiological pH (6.8-7.8).
  • the concentration of polysaccharide obtained following the dilution step advantageously varies from 1 mg/g to 50 mg/g of hydrogel, more advantageously from 5 mg/g to 35 mg/g of hydrogel, even more advantageously from 10 mg/g to 30 mg/g of hydrogel.
  • the method for preparing the hydrogel may comprise at least one purification step.
  • the purification step aims to remove any undesirable impurities. These undesirable impurities may result from the crosslinking of the polysaccharide, for example from step (a2) described above.
  • Such impurities may comprise, for example, the residual crosslinking agent, in particular of the epoxy type, which has not reacted.
  • This step may also make it possible to carry out a liquid exchange, for example a buffer exchange.
  • the purification step can therefore be particularly implemented when the hydrogel comprises a cross-linked polysaccharide.
  • Purification can be carried out by dialysis or by filtration, for example by dynamic tangential filtration (“DGF” for Dynamic Cross-flow Filtration).
  • DGF dynamic tangential filtration
  • the method for preparing the hydrogel may comprise a step of adding at least one additional component.
  • the additional component may be selected from anesthetic agents, antioxidants, lubricating agents, amino acids, peptides, proteins such as collagen and silk fibroin, vitamins, elements such as silicon (for example via the addition of orthosilicic acid), minerals, nucleic acids, nucleotides or polynucleotides such as PDRN, nucleosides, coenzymes, adrenergic derivatives, sodium dihydrogen phosphate monohydrate and/or dihydrate, sodium chloride and a mixture thereof.
  • Non-crosslinked polysaccharides in particular non-crosslinked hyaluronic acid, non-crosslinked heparosan or their mixture, may be cited as an example of a lubricating agent.
  • anesthetics include, but are not limited to, Ambucaine, Amoxecaine, Amylein, Aprindine, Aptocaine, Articaine, Benzocaine, Betoxycaine, Bupivacaine, Butacaine, Butamben, Butanilicaine, Chlorobutanol, Chloroprocaine, Cinchocaine, Clodacaine, Cocaine, Cryofluorane, Cyclomethycaine, Dexivacaine, Diamocaine, Diperodon, Dyclonine, Etidocaine, Euprocine, Febuvérine, Fomocaine, Guafeca ⁇ nol, Heptacaine, Hexylcaine, Hydroxyprocaine, Hydroxytetracaine, Isobutamben, Leucinocaine, Levobupivacaine, Levoxadrol, Lidamidine, Lidocaine, Lotucaine, Menglytate, Mepivacaine, Meprylcaine
  • antioxidants include, but are not limited to, glutathione, reduced glutathione, ellagic acid, spermine, resveratrol, retinol, L-carnitine, polyols, polyphenols, flavonols, theaflavins, catechins, caffeine, ubiquinol, ubiquinone, alpha-lipoic acid and derivatives thereof, and a mixture thereof.
  • amino acids include, but are not limited to, arginine (e.g., L-arginine), isoleucine (e.g., L-isoleucine), leucine (e.g., L-leucine), lysine (e.g., L-lysine or L-lysine monohydrate), glycine, valine (e.g., L-valine), threonine (e.g., L-threonine), proline (e.g., L-proline), methionine, histidine, phenylalanine, tryptophan, cysteine, their derivatives (e.g., N-acetylated derivatives such as N-acetyl-L-cysteine), and a mixture thereof.
  • arginine e.g., L-arginine
  • isoleucine e.g., L-isoleucine
  • leucine e.g., L-leucine
  • vitamins and their salts include, but are not limited to, vitamins E, A, C, B, especially vitamins B6, B8, B4, B5, B9, B7, B12, and more preferably pyridoxine and its derivatives and/or salts, preferably pyridoxine hydrochloride.
  • Examples of minerals include, but are not limited to, zinc salts (e.g. zinc acetate, in particular dehydrated), magnesium salts, calcium salts (e.g. hydroxyapatite, in particular in bead form), potassium salts, manganese salts, sodium salts, copper salts (e.g. copper sulfate, in particular pentahydrate), optionally in a hydrated form, and mixtures thereof.
  • nucleic acids examples include, but are not limited to, adenosine, cytidine, guanosine, thymidine, cytodine, their derivatives, and a mixture thereof.
  • coenzymes coenzyme Q10, CoA, NAD, NADP, and mixtures thereof may be cited.
  • the method for preparing the hydrogel may comprise one or more extrusion steps.
  • This extrusion step makes it possible to obtain a more homogeneous hydrogel, in particular with an extrusion force that is as constant as possible, i.e., as regular as possible.
  • the extrusion step may be carried out using a sieve whose performances have a diameter of between 50 and 2000 ⁇ m. A person skilled in the art knows how to select the perforation diameter according to the desired mechanical properties of the hydrogel.
  • the method of the present invention comprises a step of sterilizing the prepared hydrogel.
  • Sterilization is preferably carried out by heat, for example in an autoclave.
  • Sterilization is generally carried out by increasing the temperature of the sterilization medium to a temperature called the “plateau temperature”, which is maintained for a determined period of time called the “plateau time”.
  • Sterilization is preferably carried out at a plateau temperature ranging from 121°C to 135°C, preferably at a plateau time ranging from 1 minute to 20 minutes with F0 > 15.
  • the sterilizing value F0 corresponds to the time required, in minutes, at 121°C, to inactivate 90% of the population of microorganisms present in the product to be sterilized.
  • sterilization can be carried out in particular by gamma ray, UV radiation or by means of ethylene oxide.
  • the hydrogel obtained at the end of the process typically has a pH ranging from 6.8 to 7.8 (physiological pH).
  • the present invention also relates to a process for preparing a sterile hydrogel comprising a crosslinked polysaccharide and optionally a non-crosslinked polysaccharide, and further comprising zinc ions, the process comprising the following steps:
  • preparation of a hydrogel from the crosslinked polysaccharide obtained at the end of step (0) and optionally from a non-crosslinked polysaccharide comprising contacting the crosslinked polysaccharide with a physiological saline solution, preferably buffered, the physiological saline solution, preferably buffered, comprising phosphate or carbonate or sulfate salts or mixtures thereof;
  • the crosslinking reaction medium further comprises citrate ions in an amount sufficient to achieve a citrate ion concentration of at least 0.1 mM in the hydrogel, the molar ratio [citrate ions present in the reaction medium] / [zinc ions present in the reaction medium] ranging from 1 to 20; or
  • step (1) further comprises, before bringing the crosslinked polysaccharide into contact with the physiological saline solution, preferably buffered, a step of adding citrate ions in a quantity sufficient to reach a citrate ion concentration of at least 0.1 mM in the hydrogel, the molar ratio [citrate ions added] / [zinc ions present in the reaction medium] ranging from 1 to 20; or
  • the physiological saline solution preferably buffered, further comprises citrate ions in an amount sufficient to achieve a citrate ion concentration of at least 0.1 mM in the hydrogel, the molar ratio [citrate ions present in the physiological saline solution, preferably buffered] / [zinc ions present in the reaction medium] ranging from 1 to 20.
  • the cross-linked polysaccharide may in particular be prepared by a process comprising the following steps:
  • step (0) comprises the preparation of a crosslinked polysaccharide from a crosslinking reaction medium comprising one or more modified polysaccharide(s), a solvent and zinc ions in an amount allowing the preparation of a hydrogel comprising at most 20 mM zinc ions.
  • the cross-linked polysaccharide may in particular be prepared by a process comprising the following steps:
  • Steps (0), (a1) and (a2) of the process according to method 2 are as described previously in the section “The crosslinked and/or non-crosslinked polysaccharide”, except that the crosslinking reaction medium further comprises zinc ions and optionally citrate ions.
  • the citrate ions are not present in the crosslinking reaction medium, they are added before the step of bringing the crosslinked polysaccharide into contact with the physiological saline solution, preferably buffered, or in the physiological saline solution, preferably buffered.
  • the polysaccharide is as described in the section “The crosslinked and/or non-crosslinked polysaccharide”.
  • the zinc ions are present in the reaction medium in an amount not to exceed a zinc ion concentration in the hydrogel of 20 mM, or 7 mM or 5 mM or 3.5 mM or 2 mM or 1.6 mM, or 1.15 mM, or 0.8 mM.
  • the zinc ions are typically present in the reaction medium in an amount not to exceed a zinc ion concentration in the hydrogel ranging from 0.10 to 20 mM or from 0.10 to 7 mM or from 0.10 to 5 mM or from 0.10 to 3.5 mM or from 0.10 to 2 mM or from 0.10 to 1.6 mM, or from 0.10 to 1.15 mM or from 0.10 to 0.8 mM.
  • the zinc ions are present in the reaction medium in an amount making it possible to achieve a zinc ion concentration in the hydrogel varying from 0.10 to 1.6 mM, more preferably from 0.10 to 1.15 mM, even more preferably from 0.1 to 0.8 mM, preferentially from 0.3 to 0.8 mM.
  • citrate ions When the citrate ions are present in the reaction medium, they are present in an amount making it possible to achieve a citrate ion concentration in the hydrogel of at least 0.1 mM and generally of at most 150 mM, 100 mM, 50 mM, 20 mM or 15 mM.
  • citrate ions are present in an amount making it possible to achieve a concentration of citrate ions in the hydrogel varying from 0.1 to 150 mM or from 0.1 to 100 mM or from 0.1 to 50 mM or from 0.1 to 20 mM or from 0.1 to 15 mM or from 0.3 to 15 mM or from 0.5 to 15 mM or from 1 to 10 mM or from 1.5 to 10 mM or from 2 to 10 mM or from 3 to 10 mM or from 3 to 8 mM or from 5 to 8 mM.
  • No covalent bond is formed between the polysaccharide and the citrate ions.
  • citrate ions When citrate ions are not present in the reaction medium, they are added before contact with the physiological saline solution, preferably buffered, or in the physiological saline solution, preferably buffered, in a quantity sufficient to reach the concentrations indicated above.
  • the molar ratio [citrate ions present in the reaction medium] / [zinc ions present in the reaction medium] or [added citrate ions] / [zinc ions present in the reaction medium] or [citrate ions present in the physiological saline solution, preferably buffered] / [zinc ions present in the reaction medium] varies from 1 to 20, preferably from 5 to 20 or from 5 to 15 or from 6 to 15 or from 6 to 10.
  • the zinc ions present in the reaction medium can result from the addition of zinc salts to the reaction medium such as zinc sulfate, zinc chloride, zinc gluconate, preferably zinc chloride.
  • the citrate ions present in the reaction medium can result from the addition of citric acid, in powder form or in the form of an aqueous solution to the reaction medium.
  • the citrate ions present in the reaction medium may result from the addition of sodium citrate, calcium citrate, potassium citrate or magnesium citrate, in powder form or in the form of an aqueous solution to the reaction medium.
  • the citrate ions are added before the step of contacting with the physiological saline solution, preferably buffered, or in the physiological saline solution, preferably buffered. They can be added in the form of a solution.
  • the solution can be prepared by adding citric acid or sodium citrate, or calcium citrate, or potassium citrate or magnesium citrate in water or in a physiological saline solution, preferably buffered, for example a saline solution, preferably buffered comprising phosphate or carbonate or sulfate salts or their mixtures.
  • the physiological saline solution, preferably buffered added during the preparation of the hydrogel includes citrate ions.
  • the crosslinked polysaccharide is typically in the form of a gel comprising zinc ions, and optionally citrate ions.
  • This gel is generally directly used in the rest of the process of the invention (step (1)).
  • the preparation of a hydrogel (step (1)) from the crosslinked polysaccharide obtained at the end of step (0) or (a2) can be carried out in a conventional manner.
  • the preparation of a hydrogel from the crosslinked polysaccharide obtained at the end of step (0) or (a2) typically comprises one or more of the following conventional steps:
  • step (2) is as described in relation to step (2) of method 1.
  • the invention also relates to a process for preparing a sterile hydrogel comprising a crosslinked polysaccharide and optionally a non-crosslinked polysaccharide and further comprising zinc ions, the process comprising the following steps: (0') preparation of a crosslinking reaction medium comprising:
  • - citrate ions in an amount sufficient to achieve a citrate ion concentration of at least 0.1 mM in the hydrogel, - zinc ions in an amount allowing the preparation of a hydrogel comprising at most 20 mM zinc ions, and
  • a physiological saline solution preferably buffered, comprising phosphate or carbonate or sulfate salts or their mixtures; the molar ratio [citrate ions present in the reaction medium] / [zinc ions present in the reaction medium] ranging from 1 to 20, the preparation of the reaction medium being carried out by addition of the citrate ions before any contact of the zinc ions with the physiological saline solution;
  • step (1) sterilization, preferably by heat, of the hydrogel obtained at the end of step (1) to obtain a sterile hydrogel.
  • step (0') comprises the preparation of a crosslinking reaction medium comprising:
  • a physiological saline solution preferably buffered, comprising phosphate or carbonate or sulfate salts or their mixtures; the molar ratio [citrate ions present in the reaction medium] / [zinc ions present in the reaction medium] ranging from 1 to 20, the preparation of the reaction medium comprising an addition of the citrate ions before any contact of the zinc ions with the physiological saline solution.
  • Step (0) of the process according to method 3 is as described previously in the section “The crosslinked and/or non-crosslinked polysaccharide”, except that the crosslinking reaction medium comprises zinc ions, citrate ions and a physiological saline solution, preferably buffered, comprising phosphate or carbonate or sulfate salts or their mixtures.
  • the preparation of a hydrogel (step (1)) from the crosslinked polysaccharide obtained at the end of step (0) can be carried out in a conventional manner.
  • the preparation of a hydrogel from the crosslinked polysaccharide obtained at the end of step (0) typically comprises one or more of the following conventional steps:
  • step (2) is as described in relation to step (2) of method 1.
  • the method of the present invention may further comprise a step of conditioning the hydrogel.
  • the conditioning of the hydrogel is typically carried out in an injection device.
  • the conditioning is preferably carried out just before the sterilization step (step (2)).
  • the sterile hydrogel may be in the form of an injection device pre-filled with the hydrogel, for example a syringe pre-filled with the hydrogel.
  • the present invention also relates to a sterile hydrogel comprising a crosslinked and/or non-crosslinked polysaccharide obtained or obtainable by the method of the present invention (method 1 or 2 or 3).
  • the sterile hydrogel comprises zinc ions and citrate ions in a molar ratio of citrate ions to zinc ions ranging from 1 to 20, the concentration of citrate ions in the hydrogel being at least 0.1 mM and the concentration of zinc in the hydrogel not exceeding 20 mM.
  • the zinc ion concentration in the hydrogel ranges from 0.10 to 20 mM or from 0.10 to 7 mM or from 0.10 to 5 mM or from 0.10 to 3.5 mM or from 0.10 to 2 mM or from 0.10 to 1.6 mM, or from 0.10 to 1.15 mM or from 0.10 to 0.8 mM.
  • the zinc ion concentration in the hydrogel ranges from 0.10 to 1.6 mM, more preferably from 0.10 to 1.15 mM, even more preferably from 0.1 to 0.8 mM, preferably from 0.3 to 0.8 mM.
  • the concentration of citrate ions in the hydrogel ranges from 0.1 to 150 mM or from 0.1 to 100 mM or from 0.1 to 50 mM or from 0.1 to 20 mM or from 0.1 to 15 mM or 0.3 to 15 mM or from 0.5 to 15 mM or from 1 to 10 mM or from 1.5 to 10 mM or from 2 to 10 mM or from 3 to 10 mM or from 3 to 8 mM or from 5 to 8 mM.
  • the sterile hydrogel obtained or obtainable by the method of the present invention has a physiological pH, Le., ranging from 6.8 to 7.8.
  • the pH of the sterile hydrogel is preferably greater than or equal to 6.9 and less than or equal to 7.4; 7.3; 7.2; 7.1 or 7.
  • the sterile hydrogel obtained by the method of the present invention (method 1 or 2 or 3) and comprising a crosslinked polysaccharide, advantageously has a phase angle 5 less than or equal to 45°, at 1 Hz for a deformation of 0.1% or a pressure of 1 Pa, preferably a phase angle 5 ranging from 2° to 45° or ranging from 20° to 45°.
  • the hydrogel obtained or obtainable by the method of the present invention is preferably an injectable hydrogel, i.e. one that can flow and be injected manually using a syringe equipped with a needle with a diameter ranging from 0.1 to 0.5 mm, for example a 32G, 30G, 27G, 26G, 25G hypodermic needle.
  • the hydrogel obtained or obtainable by the method of the present invention may comprise from 0.1 to 5% by weight, preferably from 1 to 3% by weight, of polysaccharide (total weight of polysaccharide, i.e. total weight of crosslinked and/or non-crosslinked polysaccharide, for example crosslinked and/or non-crosslinked hyaluronic acid), relative to the total weight of the hydrogel.
  • the hydrogel obtained by the method of the present invention may therefore comprise from 0.1 to 5% by weight, preferably from 1 to 3% by weight, of non-crosslinked polysaccharide (for example non-crosslinked hyaluronic acid), relative to the total weight of the hydrogel.
  • the hydrogel obtained by the method of the present invention may therefore comprise from 0.1 to 5% by weight, preferably from 1 to 3% by weight, of non-crosslinked polysaccharide (for example non-crosslinked hyaluronic acid), relative to the total weight of the hydrogel.
  • the present invention may therefore comprise from 0.1 to 5% by weight, preferably from 1 to 3% by weight, of crosslinked polysaccharide (e.g. crosslinked hyaluronic acid), relative to the total weight of the hydrogel.
  • crosslinked polysaccharide e.g. crosslinked hyaluronic acid
  • the hydrogel obtained by the method of the present invention may therefore comprise from 0.1 to 5% by weight, preferably from 1 to 3% by weight, of a mixture of non-crosslinked and crosslinked polysaccharide (e.g. non-crosslinked and/or crosslinked hyaluronic acid), relative to the total weight of the hydrogel.
  • the content of non-crosslinked polysaccharide can vary from 0.5 to 40% by weight, preferably from 1 to 40% by weight, more preferably from 5 to 30% by weight, relative to the total weight of polysaccharide (for example hyaluronic acid) present in the hydrogel.
  • the total polysaccharide concentration in the hydrogel obtained by the method of the present invention advantageously varies from 1 mg/g to 50 mg/g of hydrogel, more advantageously from 5 mg/g to 35 mg/g of hydrogel, even more advantageously from 10 mg/g to 30 mg/g of hydrogel.
  • the polysaccharide is hyaluronic acid, even more preferably sodium hyaluronate.
  • the total polysaccharide concentration in the hydrogel obtained by the method of the present invention advantageously varies from 1 mg/g to 50 mg/g of hydrogel, more advantageously from 5 mg/g to 35 mg/g of hydrogel, even more advantageously from 10 mg/g to 30 mg/g of hydrogel.
  • the polysaccharide is hyaluronic acid, even more preferably sodium hyaluronate.
  • the hydrogel comprises a crosslinked polysaccharide
  • the crosslinked polysaccharide preferably has a molar crosslinking rate of less than or equal to 10%.
  • the hydrogel comprises a crosslinked polysaccharide whose molar crosslinking rate is greater than 0 and less than or equal to 6%. Even more preferably, the hydrogel comprises a crosslinked polysaccharide whose molar crosslinking rate is greater than 0 and less than or equal to 4%.
  • the hydrogel comprises a crosslinked polysaccharide whose molar crosslinking rate is greater than 0 and less than or equal to 2%, preferably less than or equal to 1%, still preferably less than or equal to 0.8%, in particular ranging from 0.1% to 0.5% (number of moles of crosslinking agent(s) per 100 moles of repeating unit of the polysaccharide(s).
  • the crosslinked polysaccharide preferably has a degree of modification (MOD) of less than or equal to 10%, preferably less than or equal to 6%, preferably less than or equal to 4%, such that preferred less than or equal to 2%, more preferably less than or equal to 1%.
  • MOD degree of modification
  • the crosslinked polysaccharide has a degree of modification (MOD) less than or equal to 1.8%, more preferably less than or equal to 1.5%, preferably less than or equal to 1.2%, even more preferably less than 1%.
  • the hydrogel comprises an anesthetic agent.
  • the anesthetic agent may be as described above, in particular the anesthetic agent may be mepivacaine, lidocaine or a salt thereof; more particularly in the form of a hydrochloride salt; preferably in amounts ranging from 0.1 to 30 mg/ml, for example from 0.5 to 10 mg/ml or more preferably from 2 to 6 mg/ml.
  • the sterile hydrogels prepared according to the method of the invention are particularly useful for filling and/or replacing tissues, in particular soft tissues, in particular by injecting the hydrogel into the tissue. In addition to filling soft tissues, they make it possible to deliver biostimulant effects.
  • the sterile hydrogel is injected into the subject subcutaneously.
  • the hydrogel allows a slow release of zinc ions into the subject after the injection. This release of zinc ions must remain significantly lower than the toxic dose of zinc ions.
  • the subcutaneous release into the subject after the injection must be less than 0.1 mmol/day.
  • They can be injected using any of the methods known to those skilled in the art.
  • they can be administered by means of an injection device suitable for intra-epidermal and/or intradermal and/or subcutaneous and/or supra-periosteal injection.
  • the injection device can in particular be chosen from a syringe, a set of micro-syringes, a wire, a laser or hydraulic device, an injection gun, a needle-free injection device, or a micro-needle roller.
  • the sterile hydrogels prepared according to the method of the invention are preferably injected subcutaneously.
  • They may have therapeutic and/or cosmetic and/or cosmeceutical applications.
  • hydrogels can be particularly useful for compensating for tissue volume losses due to aging. They can be used in the prevention and/or cosmetic treatment of an alteration of the surface appearance of the skin.
  • hydrogels can be used in the cosmetic field to prevent and/or treat the alteration of the viscoelastic or biomechanical properties of the skin; to fill volume defects of the skin, in particular to fill wrinkles, fine lines and scars; to reduce nasolabial folds and bitterness folds; to increase the volume of the cheekbones, chin or lips; to restore the volumes of the face, in particular the cheeks, temples, the oval of the face, and the area around the eyes; to reduce the appearance of wrinkles and fine lines.
  • the present invention also relates to the cosmetic use of a hydrogel as described above for filling tissues, in particular soft tissues, in particular to compensate for losses of tissue volume due to aging.
  • the viscoelastic properties of the obtained hydrogels were measured using a rheometer (DHR-2) having a stainless steel cone (1° - 40 mm) with cone-plane geometry and an anodized aluminum peltier plane (42 mm) (air gap 24 ⁇ m).
  • the stress at the intersection of G’ and G”, T is determined at the intersection of the curves of the modules G’ and G” and is expressed in Pascal.
  • a cross-linked hyaluronic acid hydrogel is prepared from a high molecular weight hyaluronic acid 4 MDa and BDDE in a 0.25M aqueous sodium hydroxide solution (cross-linking for 72 hours at 21 °C).
  • the cross-linked polysaccharide has a cross-linking rate of 2%.
  • Phosphate buffer and a 1 N HCl solution are then added to the cross-linked polysaccharide until a pH of 7.3 ⁇ 0.5 is obtained.
  • the hydrogel obtained is homogenized using a three-dimensional stirrer.
  • the hydrogel is dialyzed.
  • the hydrogel obtained has a concentration of 15 mg of hyaluronic acid per gram of hydrogel.
  • lidocaine hydrochloride an aqueous solution of lidocaine hydrochloride to obtain 0.3% by weight of lidocaine hydrochloride relative to the weight of the final hydrogel;
  • the solution comprising zinc and citrate ions is prepared as follows. Citric acid (in powder form) is first dissolved in phosphate buffer then zinc chloride is dissolved (ZnCh powder) and finally 5M NaOH is added to adjust the pH to a physiological level. The goal is to make a solution 100 times concentrated (in zinc and citrate ions) compared to the actual concentration desired in the final hydrogel. This avoids too strong a dilution effect of the hydrogel due to the addition of the zinc and citric acid solution.
  • the solution comprising zinc and citrate ions was added at the same time as the anesthetic solution, after addition of the high molecular weight sodium hyaluronate solution.
  • the hydrogels obtained were sieved and then packaged in a syringe.
  • hydrogels were sterilized in an autoclave (plateau temperature between 121°C and 135°C with FO > 15).
  • the hydrogels have a molar crosslinking rate of 2%.
  • hydrogels prepared from a process according to the invention comprising a step of adding a solution comprising zinc ions and citrate ions exhibit lesser modifications of their rheological properties after sterilization compared to hydrogels prepared by an equivalent process without addition of such a solution.
  • a cross-linked hyaluronic acid hydrogel is prepared from a high molecular weight hyaluronic acid 4MDa and BDDE in a 0.25M aqueous sodium hydroxide solution (cross-linking for 72 hours at 21 °C).
  • the cross-linked polysaccharide has a modification rate of 2%.
  • PBS phosphate buffer and a 1 N HCl solution are then added to the cross-linked polysaccharide until a pH of 7.3 ⁇ 0.5 is obtained.
  • the hydrogel obtained is homogenized using a three-dimensional stirrer.
  • the hydrogel is dialyzed.
  • the hydrogel obtained has a concentration of 15 mg of hyaluronic acid per gram of product.
  • the solution comprising zinc and citrate ions is prepared as follows. Citric acid (in powder form) is first dissolved in phosphate buffer, then zinc chloride is dissolved (ZnCh powder) and finally 5M NaOH is added to adjust the pH to a physiological level. The aim is to make a solution concentrated 100 times (in zinc and citrate ions) compared to the actual concentration desired in the final hydrogel. This is to avoid too strong a dilution effect of the hydrogel due to the addition of the zinc and citric acid solution. The solution comprising zinc and citrate ions is added after addition of the high molecular weight sodium hyaluronate solution.
  • the hydrogels obtained were sieved and then packaged in a syringe.
  • hydrogels obtained are sterilized in an autoclave (plate temperature between 121°C and 135°C with FO > 15).
  • the hydrogels have a molar crosslinking rate of 2%.
  • hydrogels prepared from a process according to the invention comprising a step of adding a solution comprising zinc and citrate ions exhibit lesser changes in their rheological properties after sterilization compared to hydrogels prepared by an equivalent process without the addition of such a solution.
  • hydrogels prepared from a process according to the invention comprising a step of adding a solution comprising zinc and citrate ions exhibit lesser changes in their rheological properties after sterilization compared with hydrogels prepared by an equivalent process without the addition of such a solution.
  • hydrogel B4 prepared from a process according to the invention comprising a step of adding a solution comprising zinc and citrate ions, no precipitation is observed either after 3 months or after 6 months.
  • the solution containing commercial zinc citrate is prepared as follows. Zinc citrate is first dissolved in phosphate buffer and then added to 5M NaOH to adjust the pH to a physiological level. The aim is to make a solution concentrated 100 times (in zinc and citrate ions) compared to the actual concentration desired in the final hydrogel. This avoids too strong a dilution effect of the hydrogel due to the addition of the solution containing the commercial zinc citrate.
  • the solution comprising commercial zinc citrate is added after addition of the high molecular weight sodium hyaluronate solution.
  • the hydrogels obtained were sieved and then packaged in a syringe.
  • hydrogels were sterilized in an autoclave (plateau temperature between 121°C and 135°C with FO > 15).
  • the hydrogel obtained in accordance with the process according to the invention (Fig. 1 - prototype C3) is transparent.
  • a precipitate is observed immediately after sterilization of the hydrogel incorporating commercial zinc citrate (Fig. 2), which is not desirable for a hydrogel.
  • the control hydrogels C1 and according to the invention 02 tested are prepared as follows:
  • the crosslinked hyaluronic acid hydrogel is prepared from a high molecular weight hyaluronic acid 1.5 MDa and BDDE in an aqueous solution of sodium hydroxide at 0.25M (crosslinking for 72 hours at 21 °C).
  • the crosslinked polysaccharide has a modification rate of 4%.
  • PBS phosphate buffer and a 1 N HCl solution are then added to the crosslinked polysaccharide until a pH of 7.3 ⁇ 0.5 is obtained.
  • the hydrogel obtained is homogenized using a three-dimensional stirrer.
  • the hydrogel is then dialyzed.
  • the hydrogels obtained have a concentration of 23 mg of hyaluronic acid per gram of product.
  • the resulting cross-linked polysaccharide hydrogel is subsequently divided into 2.
  • lidocaine hydrochloride for hydrogel C1 and C2 an aqueous solution of lidocaine hydrochloride to obtain 0.3% by weight of lidocaine hydrochloride relative to the weight of The final hydrogel and a solution of non-crosslinked high molecular weight sodium hyaluronate as lubricant (same amount in the different mixtures);
  • hydrogel C2 a solution comprising 0.46 mM zinc ions and 2.3 mM citrate ions.
  • the solution comprising zinc and citrate ions is prepared as follows. Citric acid (in powder form) is first dissolved in phosphate buffer, then zinc chloride is dissolved (ZnCh powder) and finally 5M NaOH is added to adjust the pH to a physiological level. The aim is to make a solution concentrated 100 times (in zinc and citrate ions) compared to the actual concentration desired in the final hydrogel. This avoids too strong a dilution effect of the hydrogel due to the addition of the zinc and citric acid solution.
  • the solution comprising zinc and citrate ions is added after addition of the high molecular weight sodium hyaluronate solution.
  • the hydrogels obtained were sieved and then packaged in a syringe.
  • hydrogels are sterilized in an autoclave (plateau temperature between 121°C and 135°C with F0 > 15). No hydrogel shows precipitation.
  • a 0.2 mL dose of each of the sterilized hydrogels C1 and C2 was injected intradermally into 5 separate sites on the sides of the back of three rabbits.
  • the injection sites were observed at 24, 48, and 72 h after injection for signs of erythema and edema, then daily for up to 28 days. Signs of erythema and edema were measured using a 0-4 score scale for each injection site and for each animal. The mean overall score was determined by dividing the sum of the scores by the total number of sites evaluated.
  • the hydrogel according to the invention C2 exhibits, over the entire duration of the test, an average irritation score lower than the control hydrogel C1. This thus indicates that the hydrogel C2 prepared according to the invention exhibits a less irritating character than the control hydrogel. 3.5
  • Two cross-linked hyaluronic acid hydrogels are prepared from a high molecular weight hyaluronic acid 1.5 MDa and BDDE in a 0.25M aqueous sodium hydroxide solution (cross-linking for 1 month at -20°C).
  • the cross-linked polysaccharide has a cross-linking rate of 0.5% and.
  • Phosphate buffer and a 1 N HCl solution are then added to the cross-linked polysaccharide until a pH of 7.3 ⁇ 0.5 is obtained.
  • the hydrogel obtained is homogenized using a three-dimensional stirrer.
  • the hydrogel is dialyzed.
  • the hydrogels obtained have a concentration of 23 mg of hyaluronic acid per gram of hydrogel.
  • lidocaine hydrochloride an aqueous solution of lidocaine hydrochloride to obtain 0.3% by weight of lidocaine hydrochloride relative to the weight of the final hydrogel;
  • the solution comprising zinc and citrate ions is prepared as follows. Citric acid (in powder form) is first dissolved in phosphate buffer, then zinc chloride is dissolved (ZnCh powder) and finally 5M NaOH is added to adjust the pH to a physiological level. The aim is to make a solution concentrated 100 times (in zinc and citrate ions) compared to the actual concentration desired in the final hydrogel. This is to avoid too strong a dilution effect of the hydrogel due to the addition of the zinc and citric acid solution.
  • the solution comprising zinc and citrate ions is added at the same time as the anesthetic solution, after addition of the high molecular weight sodium hyaluronate solution.
  • the hydrogels obtained were sieved and then packaged in a syringe.
  • hydrogels were sterilized in an autoclave (plateau temperature between 121°C and 135°C with F0 > 15). After sterilization, hydrogels D1 and D2 were analyzed. No hydrogel showed precipitation. The elastic modulus G' and phase angle 5 were determined. The results are shown in Table 4 below.
  • the hydrogels have a molar crosslinking rate of 0.5%.
  • hydrogels prepared from a process according to the invention comprising a step of adding a solution comprising zinc and citrate ions exhibit lesser modifications of their rheological properties after sterilization compared to hydrogels prepared by an equivalent process without addition of such a solution.
  • the hydrogel prepared from a process according to the invention comprising a step of adding a solution comprising zinc and citrate ions (D2) exhibits lesser changes in its rheological properties after sterilization compared with the hydrogel prepared by an equivalent process without the addition of such a solution (D1).
  • D2 prepared from a process according to the invention comprising a step of adding a solution comprising zinc and citrate ions, no precipitation is observed after 6 months.
  • Two non-crosslinked hyaluronic acid hydrogels at 20 mg/g are prepared from a high molecular weight hyaluronic acid 1.5 MDa in a buffer solution.
  • the solution comprising zinc added to hydrogel E1 is prepared as follows. Zinc chloride is dissolved (ZnCh powder) in phosphate buffer and finally 5M NaOH is added to adjust the pH to a physiological level.
  • the solution comprising zinc and citrate ions added into the E2 hydrogel is prepared as follows. Citric acid (in powder form) is first dissolved in phosphate buffer, then zinc chloride is dissolved (ZnCh powder) and finally 5M NaOH is added to adjust the pH to a physiological level. The aim is to make a solution concentrated 100 times (in zinc and citrate ions) compared to the actual concentration desired in the final hydrogel. This is to avoid too strong a dilution effect of the hydrogel due to the addition of the zinc and citric acid solution.
  • hydrogel prepared from a process according to the invention comprising a step of adding a solution comprising zinc and citrate ions does not exhibit precipitation after sterilization unlike the hydrogel prepared by an equivalent process without addition of citrate ions.
  • Three cross-linked hyaluronic acid hydrogels are prepared from a high molecular weight hyaluronic acid 1.5 MDa and BDDE in a 0.25M aqueous sodium hydroxide solution (cross-linking for 3 hours at 52°C).
  • the cross-linked polysaccharide has a cross-linking rate of 8.7%.
  • Phosphate buffer and a 1 N HCl solution are then added to the cross-linked polysaccharide until a pH of 7.3 ⁇ 0.5 is obtained.
  • the hydrogel obtained is homogenized using a three-dimensional stirrer.
  • the hydrogel is dialyzed.
  • the hydrogels obtained have a concentration of 23 mg of hyaluronic acid per gram of hydrogel.
  • lidocaine hydrochloride an aqueous solution of lidocaine hydrochloride to obtain 0.3% by weight of lidocaine hydrochloride relative to the weight of the final hydrogel;
  • the solution comprising zinc and citric acid is prepared as follows. Citric acid (in powder form) is first dissolved in phosphate buffer, then zinc chloride is dissolved (ZnCh powder) and finally 5M NaOH is added to adjust the pH to a physiological level. The aim is to make a solution concentrated 100 times (in zinc and citrate ions) compared to the actual concentration desired in the final hydrogel. This is to avoid too strong a dilution effect of the hydrogel due to the addition of the zinc and citric acid solution.
  • the solution comprising zinc and sodium citrate is prepared as follows. Sodium citrate (in powder form) is first dissolved in phosphate buffer and then zinc chloride is dissolved (ZnCh powder).
  • the solution containing zinc and citrate ions (from citric acid or sodium citrate) is added at the same time as the anesthetic solution, after addition of the high molecular weight sodium hyaluronate solution.
  • the hydrogels obtained were sieved and then packaged in a syringe.
  • hydrogels were sterilized in an autoclave (plateau temperature between 121°C and 135°C with FO > 15).
  • hydrogels prepared from a method according to the invention comprising a step of adding a solution comprising zinc and citrate ions exhibit lesser changes in their rheological properties after sterilization compared to hydrogels prepared by an equivalent method without the addition of such a solution.
  • hydrogel F3 comprising a step of adding a solution comprising zinc and citrate ions originating from sodium citrate exhibits lesser changes in its rheological properties after sterilization compared to hydrogels prepared by a method comprising zinc and citrate ions originating from citric acid.

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Abstract

La présente invention concerne un hydrogel stérile comprenant un polysaccharide réticulé, un polysaccharide non réticulé ou leur mélange, en particulier comprenant un acide hyaluronique réticulé, un acide hyaluronique non réticulé ou leur mélange, et comprenant en outre du zinc et des ions citrates ainsi que son procédé de préparation.

Description

Procédé de préparation d’un hydrogel stérile comprenant un polysaccharide réticulé, non réticulé ou leur mélange
DOMAINE DE L’INVENTION
La présente invention concerne un hydrogel stérile comprenant un polysaccharide réticulé, un polysaccharide non réticulé ou leur mélange, en particulier comprenant un acide hyaluronique réticulé, un acide hyaluronique non réticulé ou leur mélange, et comprenant en outre du zinc et des ions citrates ainsi que son procédé de préparation.
ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE
Les polysaccharides, tels que les glycosaminoglycanes, sont largement utilisés dans les domaines médical et esthétique, notamment pour le comblement des tissus mous. En particulier, la majorité des produits commercialisés pour des applications esthétiques sont à base d’acide hyaluronique. Pour améliorer la qualité de la peau, les hydrogels préparés à partir d’acide hyaluronique non modifié sont intéressants car ils présentent l’avantage d’être parfaitement biocompatibles.
Il est également possible d’utiliser des hydrogels à base d’acide hyaluronique modifié, l’acide hyaluronique étant habituellement modifié par réticulation. Cette réticulation présente l’avantage d’augmenter la durabilité in vivo et la résistance à la dégradation in vivo des hydrogels. Des hydrogels à base d’acide hyaluronique réticulé peuvent être obtenus par différents procédés de préparation.
Aujourd’hui, les besoins sont de plus en plus forts pour la mise à disposition d’hydrogels capables d’améliorer leur profil de biocompatibilité et de délivrer des effets biologiques bénéfiques pour la qualité de la peau. Dans un tel contexte, le zinc s’avère être un élément de choix. Il s’agit d’un micronutriment qui présente de nombreux effets biologiques bénéfiques en tant que cofacteur de nombreuses enzymes, notamment impliquées dans les processus de cicatrisation et de reconstruction de la matrice extracellulaire. Outre des activités cicatrisantes, des activités anti-inflammatoires et antiinfectieuses ont également été associées au zinc. Le zinc peut donc s’avérer intéressant pour diminuer les éventuels effets secondaires dus à la réponse inflammatoire associée à l’administration des hydrogels.
Cependant la préparation d’hydrogels comprenant du zinc n’est pas aisée, le zinc pouvant précipiter en présence de certains sels notamment de phosphates, de carbonates et/ou de sulfates. Son incorporation au sein des hydrogels demeure donc difficile. Ainsi, un besoin demeure pour la mise à disposition d’un procédé permettant de préparer des hydrogels comprenant un polysaccharide réticulé et/ou non réticulé et comprenant en outre du zinc, en particulier à des concentrations où le zinc est biologiquement actif, sans précipitation de ce dernier. De manière avantageuse, le procédé proposé sera le plus respectueux possible des propriétés des hydrogels, c’est-à-dire qu’il entrainera le moins de dégradations possibles des propriétés rhéologiques des hydrogels lors de la stérilisation à la chaleur.
BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION
La présente invention porte sur un procédé de préparation d’un hydrogel stérile comprenant un polysaccharide réticulé, un polysaccharide non réticulé ou leur mélange et comprenant en outre des ions zinc, le procédé comprenant les étapes suivantes :
(1) préparation d’un hydrogel comprenant un polysaccharide réticulé, un polysaccharide non réticulé ou leur mélange, la préparation de l’hydrogel comprenant les étapes suivantes :
- mise en contact du polysaccharide réticulé, du polysaccharide non réticulé, ou de leur mélange, avec une solution physiologique saline, de préférence tamponnée, la solution physiologique saline, de préférence tamponnée, comprenant des sels de phosphate ou de carbonate ou de sulfate ou leurs mélanges,
- addition d’ions citrates au polysaccharide réticulé, au polysaccharide non réticulé, ou à leur mélange, en une quantité suffisante pour atteindre une concentration en ions citrates d’au moins 0,1 mM dans l’hydrogel,
- addition d’ions zinc au polysaccharide réticulé, au polysaccharide non réticulé, ou à leur mélange, en une quantité suffisante pour atteindre une concentration en ions zinc d’au plus 20 mM dans l’hydrogel, l’addition des ions citrates et des ions zinc étant réalisée dans un ratio molaire [ions citrates] / [ions zinc] allant de 1 à 20, et à la condition que l’addition des ions zinc ne soit pas réalisée avant l’addition des ions citrates lorsque la mise en contact avec la solution physiologique saline, de préférence, tamponnée, est réalisée avant l’addition des ions citrates ;
(2) stérilisation, de préférence à la chaleur, de l’hydrogel obtenu à l’issue de l’étape (1) pour obtenir un hydrogel stérile comprenant un polysaccharide réticulé, un polysaccharide non réticulé ou leur mélange et comprenant en outre des ions zinc. L’invention porte également sur un procédé de préparation d’un hydrogel stérile comprenant un polysaccharide réticulé et éventuellement un polysaccharide non réticulé et comprenant en outre des ions zinc, le procédé comprenant les étapes suivantes :
(0) préparation d’un polysaccharide réticulé à partir d’un milieu réactionnel de réticulation comprenant un ou plusieurs polysaccharide(s), un ou plusieurs agent(s) réticulant, un solvant et des ions zinc en une quantité permettant la préparation d’un hydrogel comprenant au plus 20 mM d’ions zinc ;
(1) préparation d’un hydrogel à partir du polysaccharide réticulé obtenu à l’issue de l’étape (0) et éventuellement d’un polysaccharide non réticulé, la préparation de l’hydrogel comprenant une étape de mise en contact du polysaccharide réticulé avec une solution physiologique saline, de préférence tamponnée, comprenant des sels de phosphate ou de carbonate ou de sulfate ou leurs mélanges ;
(2) stérilisation, de préférence à la chaleur, de l’hydrogel obtenu à l’issue de l’étape (1) pour obtenir un hydrogel stérile ; dans lequel :
- le milieu réactionnel de réticulation comprend en outre des ions citrates en une quantité suffisante pour atteindre une concentration en ions citrate d’au moins 0,1 mM dans l’hydrogel, le ratio molaire [ions citrates présents dans le milieu réactionnel] / [ions zinc présents dans le milieu réactionnel] allant de 1 à 20 ; ou
- l’étape (1) comprend en outre, avant l’étape de mise en contact du polysaccharide réticulé avec la solution physiologique saline, de préférence tamponnée, une étape d’addition d’ions citrates en une quantité suffisante pour atteindre une concentration en ions citrates d’au moins 0,1 mM dans l’hydrogel, le ratio molaire [ions citrates ajoutés] / [ions zinc présents dans le milieu réactionnel] allant de 1 à 20 ; ou
- la solution physiologique saline, de préférence tamponnée, comprend en outre des ions citrates en une quantité suffisante pour atteindre une concentration en ions citrates d’au moins 0,1 mM dans l’hydrogel, le ratio molaire [ions citrates présents dans la solution physiologique saline, de préférence tamponnée] / [ions zinc présents dans le milieu réactionnel] allant de 1 à 20.
L’invention porte également sur un procédé de préparation d’un hydrogel stérile comprenant un polysaccharide réticulé et éventuellement un polysaccharide non réticulé et comprenant en outre des ions zinc, le procédé comprenant les étapes suivantes :
(0') préparation d’un milieu réactionnel de réticulation comprenant :
- un ou plusieurs polysaccharide(s), - un ou plusieurs agent(s) réticulant,
- des ions citrates en une quantité suffisante pour atteindre une concentration en ions citrate d’au moins 0,1 mM dans l’hydrogel,
- des ions zinc en une quantité permettant la préparation d’un hydrogel comprenant au plus 20 mM d’ions zinc, et
- une solution physiologique saline, de préférence tamponnée, comprenant des sels de phosphate ou de carbonate ou de sulfate ou leurs mélanges ; le ratio molaire [ions citrates présents dans le milieu réactionnel] / [ions zinc présents dans le milieu réactionnel] allant de 1 à 20, la préparation du milieu réactionnel étant réalisée par addition des ions citrates avant tout contact des ions zinc avec la solution physiologique saline ;
(0) préparation d’un polysaccharide réticulé à partir du milieu réactionnel obtenu à l’issue de l’étape (0’) ;
(1) préparation d’un hydrogel à partir du polysaccharide réticulé obtenu à l’issue de l’étape (0) et éventuellement d’un polysaccharide non réticulé ;
(2) stérilisation, de préférence à la chaleur, de l’hydrogel obtenu à l’issue de l’étape (1) pour obtenir un hydrogel stérile.
L’invention porte également sur un hydrogel stérile comprenant un polysaccharide réticulé, un polysaccharide non réticulé ou leur mélange, en particulier comprenant un acide hyaluronique réticulé, un acide hyaluronique non réticulé ou leur mélange, et comprenant en outre du zinc et des ions citrates obtenu par les procédés selon l’invention.
L’invention porte sur l’utilisation des ions citrates pour protéger un hydrogel comprenant un polysaccharide réticulé, un polysaccharide non réticulé ou leur mélange, éventuellement un agent anesthésiant, et en outre des ions zinc, de la dégradation de ses propriétés rhéologiques lors de sa stérilisation, de préférence par la chaleur ou pour préserver la stabilité dans le temps des propriétés rhéologiques d’un hydrogel comprenant un polysaccharide réticulé, un polysaccharide non réticulé ou leur mélange, éventuellement un agent anesthésiant, et en outre des ions zinc.
Enfin, l’invention porte sur l’utilisation d’une solution comprenant des ions zinc et des ions citrates pour protéger un hydrogel comprenant un polysaccharide réticulé et/ou non réticulé, éventuellement un agent anesthésiant, de la dégradation de ses propriétés rhéologiques lors de sa stérilisation, de préférence par la chaleur, ou pour préserver la stabilité dans le temps d’un hydrogel comprenant un polysaccharide réticulé, un polysaccharide non réticulé ou leur mélange, éventuellement un agent anesthésiant.
D’autres aspects de l’invention sont tels que décrits ci-dessous et dans les revendications.
FIGURES
Fig.1 : hydrogel obtenu selon le procédé de l’invention (microscope : : Olympus SZX16, le logiciel : OLYMPUS Stream Start)
Fig.2 : hydrogel hors invention (microscope : Olympus SZX16, le logiciel : OLYMPUS Stream Start)
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Définitions
Le terme « gel » désigne un réseau de polymères qui est dilaté dans tout son volume par un fluide. Cela signifie qu'un gel est formé de deux milieux, l’un « solide » et l’autre « liquide », dispersés l'un dans l'autre. Le milieu dit « solide » est constitué des longues molécules polymères connectées entre elles par des liaisons faibles (par exemple des liaisons hydrogène) ou par des liaisons covalentes (réticulation). Le milieu liquide est constitué d’un solvant. Un gel correspond généralement à un produit viscoélastique qui possède un angle de phase 5 inférieur 90°, de préférence inférieur ou égal à 70°, de préférence inférieur ou égal à 45°, à 1 Hz pour une déformation de 0,1 % ou une pression de 1 Pa, de préférence un angle de phase 5 allant de 2° à 45° ou allant de 20° à 45°.
Le terme « hydrogel » désigne un gel tel que défini ci-dessus dans lequel le solvant constituant le milieu liquide est majoritairement de l'eau (par exemple au moins 90%, en particulier au moins 95%, notamment au moins 97%, notamment au moins 98% en poids du milieu liquide) et présentant un pH allant de 6,8 à 7,8.
Le terme « hydrogel injectable » désigne un hydrogel qui peut s’écouler et être injecté manuellement au moyen d’une seringue munie d'une aiguille de diamètre allant de 0,1 à 0,5 mm, par exemple d’une aiguille hypodermique de 32G, 30 G, 27 G, 26 G, 25 G. Préférentiellement, un « hydrogel injectable » est un hydrogel présentant une force d’extrusion moyenne inférieure ou égale à 25N, de préférence allant de 5 à 25 N, encore de préférence allant de 8 à 15 N, lors d’une mesure avec un dynamomètre, à une vitesse fixe d’environ 12,5 mm/min, dans des seringues de diamètre externe supérieur ou égal à 6,3 mm, avec une aiguille de diamètre externe inférieur ou égal à 0,4 mm (27 G) et de longueur 1 ”, à température ambiante.
Une « application superficielle » désigne l’administration, par exemple par mésothérapie, d’une composition superficiellement dans la peau, ou sur la peau, pour le traitement des couches superficielles de la peau, de l’épiderme et des parties les plus superficielles du derme, pour réduire les rides superficielles et/ou améliorer la qualité de la peau (telle que son éclat, sa densité ou sa structure) et/ou rajeunir la peau.
Une « application médiane » désigne l’administration d’une composition dans la partie médiane de la peau pour traiter les couches médianes de la peau, ainsi que pour réduire les rides médianes.
Une « application profonde » désigne l’administration d’une composition dans les couches les plus profondes de la peau, l’hypoderme et la partie la plus profonde du derme, et/ou sous la peau (au-dessus du périoste) pour « apporter du volume », tels que pour le comblement des rides les plus profondes et/ou des régions partiellement atrophiées du contour du visage et/ou du corps. Les hydrogels dit « volumateur » peuvent typiquement être administrés pour une application profonde.
Un « polysaccharide réticulé » désigne un polysaccharide modifié au cours d’une réaction de réticulation.
A contrario, un « polysaccharide non réticulé » désigne un polysaccharide non modifié avec un agent réticulant et qui donc n’a pas subi de réaction de réticulation.
Le terme « agent réticulant » désigne tout composé capable d’introduire une réticulation entre différentes chaines de polysaccharide.
Le « taux de réticulation molaire » (TR), exprimé en %, désigne le rapport molaire de la quantité d’agent réticulant par rapport à la quantité d’unité de répétition du polysaccharide introduite dans le milieu réactionnel de réticulation exprimé pour 100 moles d’unités de répétition du polysaccharide dans le milieu de réticulation. Par exemple, un taux de réticulation molaire de 1 % signifie qu’il y a une molécule d’agent réticulant introduite dans le milieu réactionnel pour 100 moles d’unités de répétition de polysaccharide.
L’expression « unité de répétition » d’un polysaccharide désigne un motif structurel constitué d’un ou plusieurs (généralement 1 ou 2) monosaccharides dont la répétition produit la chaîne de polysaccharide complète.
Le « degré de modification » (MOD) d’un polysaccharide, tel que l’acide hyaluronique, correspond à la quantité molaire d’agent réticulant liée au polysaccharide, par une ou plusieurs de ses extrémités, exprimée pour 100 moles d’unités de répétition du polysaccharide. Il peut être déterminé par des méthodes connues de l’homme du métier telle que la spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN). Par exemple, un degré de modification de 1% signifie qu’il y a une molécule d’agent réticulant pour 100 moles d’unités de répétition de polysaccharide.
Le terme « polysaccharide » désigne un polymère composé de monosaccharides (préférentiellement des énantiomères D) joints entre eux par des liaisons glycosidiques. Par « température ambiante », il est entendu une température allant de 20 à 25°C, plus particulièrement 21 °C.
Le domaine de viscoélasticité linéaire (Linear ViscoElastic Region ou LVER) correspond à la gamme de déformations de l’hydrogel allant d’une valeur initiale de module élastique G' jusqu’à la valeur du module élastique G’ diminué de 10% de sa valeur initiale. La mesure du LVER consiste en une mesure de balayage à contrainte oscillatoire en mode compression à une fréquence d’oscillation donnée pour déterminer la région viscoélastique linéaire.
Procédés
Les inventeurs ont mis au point trois procédés alternatifs répondant aux besoins exprimés.
Selon une première variante (méthode 1), la préparation d’un hydrogel comprenant un polysaccharide réticulé et/ou non réticulé et comprenant en outre du zinc est rendue possible par l’addition d’ions citrates lors de la phase de préparation de l’hydrogel.
Selon une deuxième variante (méthode 2), lorsque l’hydrogel comprend un polysaccharide réticulé, la préparation d’un hydrogel comprenant du zinc est rendue possible en conduisant la réticulation du polysaccharide dans un milieu réactionnel comprenant des ions zinc et en ajoutant des ions citrates soit durant l’étape de réticulation soit ultérieurement mais avant tout contact des ions zinc avec une solution physiologique saline, de préférence tamponnée, comprenant des sels de phosphate ou de carbonate ou de sulfate, seuls ou leurs mélanges.
Selon une troisième variante (méthode 3), lorsque l’hydrogel comprend un polysaccharide réticulé, la préparation d’un hydrogel comprenant du zinc est rendue possible en conduisant la réticulation du polysaccharide dans un milieu réactionnel comprenant des ions zinc, des ions citrates et une solution physiologique saline, de préférence tamponnée, comprenant des sels de phosphate ou de carbonate ou de sulfate, seuls ou leurs mélanges, à la condition que les ions citrates soient ajoutés avant tout contact des ions zinc avec la solution physiologique saline.
Il a été observé que l’addition d’ions citrates, en particulier d’acide citrique ou de citrate de sodium, ou de citrate de calcium, ou de citrate de potassium ou de citrate de magnésium, au zinc permet de prévenir la précipitation du zinc, notamment en présence d’une solution physiologique saline, de préférence tamponnée, comprenant des sels de phosphate ou de carbonate ou de sulfate ou leurs mélanges.
De manière inattendue, il a été observé que le procédé proposé (variantes 1 , 2 et 3) permet par ailleurs de protéger efficacement l’hydrogel d’une dégradation de ses propriétés rhéologiques lors de la stérilisation, en particulier lors de la stérilisation par la chaleur. Les hydrogels obtenus par le procédé de la présente invention présentent ainsi des modifications moindres de leur propriétés rhéologiques après stérilisation (meilleure préservation du module élastique G’, meilleure préservation de l’angle de phase) par rapport à des hydrogels préparés par un procédé équivalent sans addition d’ions zinc et citrates, en particulier sans addition d’ions zinc et citrates sous forme d’une solution physiologique saline, de préférence tamponnée, comprenant des sels de phosphate ou de carbonate ou de sulfate ou leurs mélanges.
De manière inattendue, cet effet de protection se prolonge dans le temps. Les hydrogels obtenus par le procédé de la présente invention présentent une meilleure stabilité dans le temps, c’est-à-dire qu’ils maintiennent plus efficacement dans le temps leurs propriétés rhéologiques, notamment après stérilisation, que des hydrogels préparés par un procédé équivalent sans addition d’ions zinc et citrates, en particulier sans addition d’ions zinc et citrates sous forme d’une solution physiologique saline, de préférence tamponnée, comprenant des sels de phosphate ou de carbonate ou de sulfate ou leurs mélanges, et des ions zinc et des ions citrates. En effet, les hydrogels selon l’invention présentent une meilleure conservation dans le temps de leurs propriétés rhéologiques± notamment après stérilisation, et ne présentent pas de précipitation du zinc.
Par ailleurs, il est connu que la présence additionnelle d’anesthésiant dans un hydrogel lors de la stérilisation, de préférence à la chaleur, entraine des dégradations des propriétés rhéologiques des hydrogels à base de polysaccharide réticulé et/ou non réticulé, en particulier des hydrogels à base d’acide hyaluronique réticulé et/ou non réticulé. L’addition des ions citrates et zinc permet de limiter ces effets. Les hydrogels obtenus par le procédé de la présente invention comprenant un agent anesthésiant présentent des dégradations moindres de leur propriétés rhéologiques après stérilisation par rapport à des hydrogels, comprenant un agent anesthésiant, préparés par un procédé équivalent sans addition d’ions zinc et citrates, en particulier sans addition d’ions zinc et citrates sous forme d’une solution physiologique saline, de préférence tamponnée, comprenant des sels de phosphate ou de carbonate ou de sulfate ou leurs mélanges.
METHODE 1
La présente invention porte ainsi sur un procédé de préparation d’un hydrogel stérile comprenant un polysaccharide réticulé et/ou non réticulé et comprenant en outre des ions zinc, le procédé comprenant les étapes suivantes :
(1) préparation d’un hydrogel comprenant un polysaccharide réticulé et/ou non réticulé, la préparation de l’hydrogel comprenant les étapes suivantes :
- mise en contact d’un polysaccharide réticulé et/ou non réticulé avec une solution physiologique saline, de préférence tamponnée, la solution saline, de préférence tamponnée, comprenant des sels de phosphate ou de carbonate ou de sulfate ou leurs mélanges ;
- additions d’ions zinc et d’ions citrates au polysaccharide réticulé et/ou non réticulé dans un ratio molaire ions citrates/ ions zinc allant de 1 à 20 et en une quantité suffisante pour atteindre une concentration en ions citrates d’au moins 0,1 mM dans l’hydrogel et une concentration en ions zinc d’au plus 20 mM dans l’hydrogel, à la condition que l’addition des ions zinc ne soit pas réalisée avant l’addition des ions citrates lorsque la mise en contact avec la solution physiologique saline est réalisée avant l’addition des ions citrates ;
(2) stérilisation, de préférence à la chaleur, de l’hydrogel obtenu à l’issue de l’étape (1) pour obtenir un hydrogel stérile.
Il est entendu que la préparation de l’hydrogel à partir du polysaccharide réticulé et/ou non réticulé (étape (1)) comprend au moins les étapes indiquées ci-dessus, l’ordre de ces étapes étant indifférent. D’autres étapes peuvent être mises en œuvre.
Le polysaccharide réticulé et/ou non réticulé
Le polysaccharide peut être tout polymère composé de monosaccharides joints entre eux par des liaisons glycosidiques ou leurs mélanges. De préférence, le polysaccharide est choisi parmi la pectine et les substances pectiques; le chitosan; la chitine; la cellulose et ses dérivés; l’agarose; les glycosaminoglycanes tels que l’acide hyaluronique, l’héparosane, le dermatane sulfate, le kératane sulfate, la chondroïtine et la chondroïtine sulfate; et leurs mélanges. De manière encore plus préférée, le polysaccharide est choisi parmi l’acide hyaluronique, l’héparosane, la chondroïtine et leurs mélanges, encore plus préférentiellement le polysaccharide est l’acide hyaluronique ou un de ses sels, en particulier un sel physiologiquement acceptable tel que le sel de sodium, le sel de potassium, le sel de zinc, le sel de calcium, le sel de magnésium, le sel d’argent, le sel de calcium et les mélanges de ceux-ci. Plus particulièrement, l’acide hyaluronique est sous sa forme acide ou sous forme de sel de sodium (NaHA). L’hydrogel peut ainsi être un hydrogel à base d’acide hyaluronique et/ou d’un de ses sels.
De préférence, si le polysaccharide est l’acide hyaluronique ou un de ses sels, il a une masse moléculaire moyenne en poids (Mw) allant de 0,05 à 10 MDa, préférentiellement allant de 0,5 à 5 MDa, par exemple allant de 2 à 4 MDa ou allant de 1 à 5 MDa.
Le polysaccharide peut être fourni sous forme hydratée (totalement ou partiellement hydratée), ou sous forme sèche, telle que sous forme de poudre ou de fibres. Lorsque le polysaccharide est fourni sous forme hydratée, il se présente typiquement sous forme de gel.
Un polysaccharide réticulé peut être préparé par toute méthode connue de l’homme du métier.
Le polysaccharide réticulé peut résulter de la réaction du polysaccharide avec un agent réticulant ou résulter de la réaction d’un polysaccharide modifié pour permettre la formation de liaisons intermoléculaires covalentes.
Par exemple, le polysaccharide réticulé peut être préparé tel que décrit dans W02010131175A1 ou WO201277054A1.
Le procédé de la présente invention peut ainsi comprendre, avant l’étape de préparation de l’hydrogel, une étape de préparation d’un polysaccharide réticulé.
Le polysaccharide réticulé est de préférence un polysaccharide réticulé dont le taux de réticulation molaire est inférieur ou égal à 10%. Préférentiellement, le polysaccharide réticulé est un polysaccharide réticulé dont le taux de réticulation molaire est supérieur à 0 et inférieur ou égal à 6%. Encore plus préférentiellement, le polysaccharide réticulé est un polysaccharide réticulé dont le taux de réticulation molaire est supérieur à 0 et inférieur ou égal à 4%. De manière encore plus préférée, le polysaccharide réticulé est un polysaccharide réticulé dont le taux de réticulation molaire est supérieur à 0 et inférieur ou égal à 2%, de préférence inférieur ou égal à 1 %, encore préférentiellement inférieur ou égal à 0,8%, notamment allant de 0,1% à 0,5% (nombre de moles d’agent(s) réticulant pour 100 moles d’unité de répétition du ou des polysaccharides).
Le polysaccharide peut être réticulé par réaction d’un polysaccharide ayant été au préalable modifié. Le polysaccharide peut avoir été modifié par introduction de groupements fonctionnels capables de réagir entre eux et former des liaisons intermoléculaires covalentes. Le polysaccharide peut avoir été modifié par greffage au moyen d’une molécule permettant la réticulation ultérieure du polysaccharide ainsi modifié. Par exemple, le polysaccharide peut avoir été modifié par greffage d’une molécule silylée, d’un acide aminé, d’un dérivé d’acide aminé ou d’une protéine.
Le polysaccharide peut être réticulé au moyen d’un agent réticulant. Le polysaccharide est de préférence réticulé au moyen d’un agent réticulant choisi parmi les agents réticulant bi- ou multi-fonctionnels époxydiques ou non époxydiques, c’est-à-dire préparé par réaction du polysaccharide avec un agent réticulant. Parmi les agents époxydiques peuvent être cités le 1 ,4-butanediol diglycidyl éther (BDDE), le 1 ,2,7,8-diépoxy-octane, le 1 ,2-bis(2,3-époxypropyl)-2,3-éthane (EGDGE), le poly(éthylèneglycol)-diglycidyl éther (PEGDE), et leurs mélanges. Parmi les agents non époxydiques peuvent être cités les polyamines endogènes telles que la spermine, la spermidine et la putrescine, les aldéhydes tel que le glutaraldéhyde, les carbodiimides et la divinylsulfone, les dérivés d’hydrazide tel que l’acide adipique dihydrazide, les bisalkoxyamines, les dithiols tels que le polyéthylène glycol dithiol et leurs mélanges. Parmi les agents non époxydiques peuvent être cités les acides aminés tels que la cystéine, la lysine ; des peptides ou protéines contenant des acides aminés tels que la cystéine, la lysine ; le poly(diméthylsiloxane); des trimétaphosphates, comme par exemple le trimétaphosphate de sodium, le trimétaphosphate de calcium, ou encore le trimétaphosphate de barium.
Dans certains modes de réalisation, l’agent réticulant est un agent époxydique, de préférence le 1 ,4-butanediol diglycidyl éther (BDDE) ou le polyéthylèneglycol-diglycidyl éther. Préférentiellement l’agent réticulant est le 1 ,4-butanediol diglycidyl éther (BDDE). Dans certains modes de réalisation, l’agent réticulant est un agent non époxydique, de préférence choisi parmi les polyamines endogènes, les aldéhydes, les carbodiimides, la divinylsulfone, les acides aminés, les peptides et leurs mélanges.
Le polysaccharide réticulé est de préférence un polysaccharide réticulé présentant un degré de modification (MOD) inférieur ou égal à 10%, de préférence inférieur ou égal à 6%, de préférence inférieur ou égal à 4%, de manière préférée inférieur ou égal à 2%, de manière plus préférée inférieur ou égal à 1%. Avantageusement, le polysaccharide réticulé est un polysaccharide réticulé présentant un degré de modification (MOD) inférieur ou égal à 1 ,8%, de manière plus préférée inférieur ou égal à 1 ,5%, préférentiellement inférieur ou égal à 1 ,2%, encore plus préférentiellement inférieur à 1 %.
Le polysaccharide réticulé peut en particulier être préparé par un procédé comprenant les étapes suivantes :
(a1) préparer un milieu réactionnel de réticulation comprenant un ou plusieurs polysaccharide(s), un ou plusieurs agent(s) réticulant et un solvant ; et
(a2) faire réagir le milieu réactionnel pour obtenir un polysaccharide réticulé.
Le polysaccharide est tel que décrit ci-dessus. De préférence, le polysaccharide est l’acide hyaluronique ou un sel d’acide hyaluronique, de préférence un sel de sodium.
Dans l’étape (a1), le polysaccharide peut être fourni sous forme sèche, telle que sous forme de poudre ou de fibres, ou sous forme hydratée. Lorsque le polysaccharide est fourni sous forme hydratée, il se trouve sous forme d’un gel non réticulé ou d’une solution. En particulier, lorsque le polysaccharide est sous forme hydratée, il s’agit d’un gel non réticulé aqueux ou d’une solution aqueuse.
L’agent réticulant est tel que décrit ci-dessus.
Le solvant est typiquement de l’eau ou un mélange comprenant de l’eau et un solvant organique (typiquement un mélange comprenant au moins 90% en poids d’eau, ou au moins 95% ou au moins 99% en poids d’eau par rapport au poids total du solvant). Par exemple, un solvant organique tel qu’un alcool, en particulier l’éthanol, ou le DMSO, peut être utilisé pour solubiliser l’agent réticulant, par exemple lorsqu’il s’agit du poly(diméthylsiloxane) terminé à chaque extrémité par un diglycidyl éther (numéro CAS : 130167-23-6), avant son addition au milieu réactionnel aqueux.
Le milieu réactionnel peut en outre comprendre des sels, des ajusteurs de pH, par exemple une base de Bronsted, plus préférentiellement un sel d’hydroxyde, tel que l’hydroxyde de sodium ou de potassium, des composants additionnels tels que décrits ci-après et leurs mélanges. L’addition d’une base de Bronsted peut être tout particulièrement nécessaire lorsque les groupements fonctionnels de l’agent réticulant présentent un groupement époxyde ou un groupement vinyle. Dans ces cas, la réticulation a lieu à un pH supérieur ou égal à 10, plus avantageusement supérieur ou égal à 12, ce qui requiert l’addition d’une base de Bronsted au milieu réactionnel, typiquement à une concentration comprise entre 0,10M et 0,30M. La quantité totale d’agent réticulant dans le milieu réactionnel varie typiquement de 0,001 à 0,10 mole pour 1 mole d’unité de répétition du polysaccharide, de préférence de 0,001 à 0,08 mole ou de 0,001 à 0,06 mole pour 1 mole d’unité de répétition du polysaccharide, préférentiellement de 0,001 à 0,04 mole pour 1 mole d’unité de répétition du polysaccharide, de manière préférée de 0,001 à 0,03 mole pour 1 mole d’unité de répétition du polysaccharide, de manière préférée 0,001 à 0,02 mole pour 1 mole d’unité de répétition du polysaccharide, de manière plus préférée de 0,001 à 0,01 mole pour 1 mole d’unité de répétition du polysaccharide, de manière encore plus préférée de 0,001 à 0,005 mole pour 1 mole d’unité de répétition du polysaccharide. Lorsque le polysaccharide est un glycosaminoglycane tel qu’un acide hyaluronique, l’unité de répétition est une unité disaccharidique.
La concentration massique en polysaccharide ou en sel de polysaccharide dans le milieu réactionnel varie avantageusement de 50 à 300 mg/g de solvant, de préférence de 80 à 200 mg/g.
L’étape (a1) du procédé comprend typiquement une étape d’homogénéisation du milieu réactionnel. L’homogénéisation est généralement réalisée par agitation tridimensionnelle, agitation avec un mélangeur, agitation avec pales ou agitation à la spatule.
L’étape (a1) est typiquement réalisée à une température allant de 4 à 35°C, de préférence allant de 15°C à 25°C. De préférence, la durée de l’étape (1) n’excède pas 5 heures. Elle varie généralement de 15 minutes à 4 heures, de préférence de 30 min à 2 heures.
L’étape (a2) consiste à faire réagir le milieu réactionnel pour obtenir un polysaccharide réticulé. Avantageusement, l’étape (a2) est réalisée directement après l’étape (a1).
Cette étape permet de réticuler les chaines polysaccharidiques entre elles. Les groupes fonctionnels de l’agent réticulant réagissent avec des groupements fonctionnels présents sur les polysaccharides de sorte à lier les chaines polysaccharidiques entre elles et à les réticuler en formant des liaisons intermoléculaires. L’agent réticulant peut également réagir avec des groupements fonctionnels présents sur une même molécule de polysaccharide de sorte à former des liaisons intramoléculaires. Notamment, les groupements fonctionnels de l’agent réticulant réagissent avec les groupes -OH ou - COOH, ou encore -CHO, présents sur les polysaccharides tels que l’acide hyaluronique. Des polysaccharides réticulés comprenant au moins un lien de réticulation entre deux chaines polysaccharidiques, ledit lien de réticulation étant le résidu de l’agent réticulant sont ainsi obtenus. La réticulation peut être réalisée en présence de plusieurs agents réticulant. Lorsque la réticulation est réalisée en présence de plusieurs agents réticulant, les agents réticulant peuvent être ajoutés de manière simultanée ou séparée dans le temps au milieu réactionnel. L’étape (a2) peut ainsi comprendre des étapes de réticulation répétées, avantageusement l’étape (a2) comprend une seule étape de réticulation. La réticulation est alors réalisée en présence d’une quantité totale d’agents réticulant allant typiquement de 0,1 à 10 moles, ou de 0,1 à 8 moles, ou de 0,1 à 6 moles, ou de 0,1 à 4 moles, ou de 0,1 à 3 moles, ou de 0,1 à 2 moles ou de 0,1 à 1 mole ou de 0,1 à 0,8 mole, ou de 0,1 à 0,5 mole d’agents réticulant (ou leurs sels) pour 100 moles d’unité de répétition du polysaccharide. Les conditions de réticulation, en particulier les teneurs en agent réticulant, durée et températures ainsi que les masses moléculaires moyennes en poids (Mw) du polysaccharide, utilisées sont interdépendantes.
Plus la teneur en agent réticulant est faible, plus la durée de réaction doit être longue pour obtenir des propriétés mécaniques analogues du polysaccharide réticulé résultant, et in fine de l’hydrogel préparé. Autrement dit, plus le pourcentage molaire en agent réticulant est faible, moins il y a de fonctions réactives dans le milieu réactionnel et plus la probabilité que 2 groupes se rencontrent et réagissent ensemble est faible, ainsi plus la durée de réaction doit être longue pour permettre aux fonctions de réagir entre elles et former des liens de réticulation, et ainsi obtenir un polysaccharide réticulé, et in fine un hydrogel avec des propriétés souhaitables.
Dans certains modes de réalisation, l’étape (a2) peut être réalisée en plaçant le milieu réactionnel directement obtenu à l’issue de l’étape (a1), à une température inférieure ou égale à 30°C, de préférence inférieure ou égale à 25°C. La température est typiquement supérieure à 0°C ou supérieure à 5°C ou encore supérieure à 10°C. De manière encore plus préférée, l’étape (a2) peut être réalisée en plaçant le milieu réactionnel directement obtenu à l’issue de l’étape (a1) à une température égale à la température ambiante. Lorsque l’étape (a2) est réalisée à une température inférieure ou égale à 30°C et supérieure à 0°C, la durée de réticulation est d’au moins 1 minute, de préférence d’au moins 10 minutes, de manière encore plus préférée d’au moins 1 heure. De préférence, la durée de réticulation est d’au plus 5 jours.
Dans certains modes de réalisation, l’étape (a2) peut être réalisée en plaçant le milieu réactionnel directement obtenu à l’issue de l’étape (a 1 ), à une température supérieure à 30°C, ou supérieure ou égale à 35°C, ou supérieure ou égale à 40°C, ou supérieure ou égale à 45°C, ou supérieure ou égale à 50°C. La température est typiquement inférieure à 60°C. Lorsque la température est supérieure à 30°C, la durée de l’étape de réticulation est au moins supérieure ou égale à 1 minute, de préférence au moins supérieure ou égale à 10 minutes, de manière encore plus préférée au moins 1 heure, de préférence comprise entre 1 heure et 5 heures.
Dans certains modes de réalisation, l’étape (a2) peut être réalisée en plaçant le milieu réactionnel directement obtenu à l’issue de l’étape (a1) à une température allant de 0 à 15°C ou de 1 à 10°C ou de 1 à 9°C.
Dans certains modes de réalisation, l’étape (a2) peut être réalisée en plaçant le milieu réactionnel directement obtenu à l’issue de l’étape (a1), à une pression P inférieure ou égale à la pression atmosphérique et à une température T supérieure à la température du point eutectique du milieu réactionnel telle que mesurée à la pression P et inférieure à la température du point de congélation du milieu réactionnel telle que mesurée à la pression P, de préférence pendant une durée d’au moins 1 heure. Les hydrogels à base de polysaccharide réticulé préparés par un tel procédé sont hautement biocompatibles. En effet, les polysaccharides réticulés peuvent être préparés avec des quantités moindres d’agent réticulant, par exemples des quantités allant de 0,001 à 0,02 mole pour 1 moled’unité de répétition du polysaccharide.
La température du point de congélation du milieu réactionnel désigne la température à laquelle le mélange des composants du milieu réactionnel, à l’échelle macroscopique, se solidifie, c’est-à-dire qu’il devient non fluide. En dessous du point de congélation, le mélange est dans un état de congélation qui se caractérise par la coexistence de composants sous forme solide et liquide. L’état de congélation est maintenu jusqu’à la température du point eutectique du milieu réactionnel.
La température du point eutectique du milieu réactionnel désigne la température en dessous de laquelle le mélange des composants du milieu réactionnel passe d’un état congelé (coexistence de phases liquides et solides) à un état complètement solide, c’est- à-dire un état dans lequel tous les composants du mélange sont sous forme solide. Le point de congélation et le point eutectique d’un mélange dépendent de la pression à laquelle le mélange est soumis donc le point de congélation et le point eutectique sont mesurés à la pression P.
Le point de congélation et le point eutectique peuvent être déterminés par calorimétrie différentielle à balayage. Cette méthode permet de déterminer les transitions de phase. Pour cela, le produit à étudier est progressivement refroidi jusqu’à observer ses transitions de phases. La température T est de préférence supérieure ou égale à -55°C et inférieure ou égale à -5°C, de préférence elle va de -35°C à -10°C. De manière encore plus préférée, la température T est d’environ -20°C.
La pression P est de préférence, la pression atmosphérique. La « pression atmosphérique » est la pression qu'exerce l’air constituant l’atmosphère sur une surface quelconque en contact avec elle. Elle varie en fonction de l’altitude. A une altitude de 0m, la pression moyenne atmosphérique est de 101 325 Pa. De préférence, la pression P est la pression atmosphérique et la température T est supérieure ou égale à -55°C et inférieure ou égale à -5°C, de préférence T varie de -35°C à -10°C ou est d’environ - 20°C.
De préférence, lors de l’étape (a2) de réticulation, lorsque la température T est supérieure ou égale à -55°C et inférieure ou égale à -5°C, le milieu réactionnel obtenu à l’issue de l’étape (1) est placé pendant une durée d’au moins 1 heure, de préférence d’au moins 3 heures, de préférence d’au moins 72 heures, de préférence d’au plus 27 semaines dans ces conditions. De préférence, l’étape (a2) de réticulation est conduite pendant une durée allant de 2 à 25 semaines, de préférence allant de 2 à 20 semaines ou 2 à 17 semaines, de manière encore plus préférée de 3 à 8 semaines ou 4 à 7 semaines et à la température T, à la pression P.
A l’issue de l’étape (a2), le polysaccharide réticulé se présente typiquement sous forme de gel. Ce gel est généralement directement engagé dans la suite du procédé de l’invention (étape (1)).
Les polysaccharides réticulés et/non réticulés décrits précédemment sont utiles pour la mise en œuvre des procédés de l’invention et ainsi préparer des hydrogels comprenant un polysaccharide réticulé et/ou non réticulé. Le polysaccharide réticulé, ou non réticulé, ou leur mélange, va constituer le réseau de polymères de l’hydrogel. L’hydrogel comprenant un polysaccharide réticulé, ou non réticulé, ou leur mélange peut ainsi être dit être à base d’un polysaccharide réticulé, ou d’un polysaccharide non réticulé, ou de leur mélange. Un hydrogel comprenant, comme seul polysaccharide, un polysaccharide non réticulé, est préparé à partir d’un polysaccharide non réticulé. Un hydrogel comprenant, comme seul polysaccharide, un polysaccharide réticulé, est préparé à partir d’un polysaccharide réticulé. Lorsque l’hydrogel comprend le mélange d’un polysaccharide réticulé et non réticulé, l’hydrogel est préparé à partir d’un polysaccharide réticulé et d’un polysaccharide non réticulé. Le polysaccharide non réticulé est typiquement ajouté au polysaccharide réticulé au cours de la préparation de l’hydrogel. Préparation de l’hydrogel (étape (1))
Le procédé de la présente invention selon la méthode 1 comprend la préparation d’un hydrogel comprenant un polysaccharide réticulé et/ou non réticulé.
La préparation de l’hydrogel comprend les étapes suivantes :
- mise en contact du polysaccharide réticulé et/ou non réticulé avec une solution physiologique saline, de préférence tamponnée, la solution physiologique saline, de préférence tamponnée, comprenant des sels de phosphate ou de carbonate ou de sulfate ou leurs mélanges ;
- addition d’ions zinc et citrates au polysaccharide réticulé et/ou non réticulé dans un ratio molaire ions citrates / ions zinc allant de 1 à 20 et en une quantité suffisante pour atteindre une concentration en ions citrates d’au moins 0,1 mM dans l’hydrogel et une concentration en ions zinc d’au plus 20 mM dans l’hydrogel, à la condition que l’addition des ions zinc ne soit pas réalisée avant l’addition des ions citrates lorsque la mise en contact du polysaccharide réticulé et/ou non réticulé avec la solution physiologique saline, de préférence tamponnée, est réalisée avant l’addition des ions citrates.
Lorsque la solution physiologique saline est tamponnée, elle est tamponnée par des sels de phosphate et/ou carbonate et/ou sulfate et présente généralement un pH physiologique (6, 8-7, 8). Généralement, la solution physiologique saline tamponnée est une solution physiologique saline tamponnée comprenant des sels de phosphate, de préférence la solution physiologique saline tamponnée peut être un tampon phosphate. Le tampon phosphate peut être un tampon PBS avec un pH autour du pH physiologique (6, 8-7, 8) (CAS No: 7647-14-5, 7447-40-7). Préférentiellement, le tampon est un tampon phosphate, particulièrement un tampon de solution saline de NaH2PO4/Na2HPC>4 Ou de KH2PO4/K2HPO4.
Lors de la préparation d’un hydrogel, la mise en contact du polysaccharide réticulé et/ou non réticulé avec une solution physiologique saline, de préférence tamponnée, comprenant des sels de phosphate ou de carbonate ou de sulfate ou leurs mélanges peut se produire à différentes étapes. Par exemple, la mise en contact du polysaccharide réticulé et/ou non réticulé avec la solution physiologique saline, de préférence tamponnée, peut se produire au moment de l’ajustement de la concentration en polysaccharide réticulé et/ou non réticulé dans l’hydrogel préparé. Cette étape est communément désignée « dilution ». Ainsi, lors de la préparation de l’hydrogel, une solution physiologique saline, de préférence tamponnée, comprenant des sels de phosphate ou de carbonate ou de sulfate ou leurs mélanges est typiquement ajoutée lors de la dilution. De manière alternative ou complémentaire, la mise en contact du polysaccharide réticulé et/ou non réticulé avec la solution physiologique saline, de préférence tamponnée, peut se produire au moment de l’ajustement du pH ou encore au moment de l’addition d’un ou plusieurs composants additionnels (voir ci-après).
De préférence, dans le procédé de la présente invention, la mise en contact avec la solution physiologique saline, de préférence tamponnée, comprenant des sels de phosphate ou de carbonate ou de sulfate ou leurs mélanges se fait au moins lors de l’étape d’ajustement de la concentration en polysaccharide réticulé et/ou non réticulé (dilution).
La quantité d’ions citrates ajoutée permet d’atteindre une concentration en ions citrates dans l’hydrogel d’au moins 0,1 mM et généralement d’au plus 150 mM, 100 mM, 50mM, 20 mM ou 15 mM. De préférence, la quantité d’ions citrates ajoutée permet d’atteindre une concentration en ions citrates dans l’hydrogel variant de 0,1 à 150 mM ou de 0,1 à 100 mM ou de 0,1 à 50 mM ou de 0,1 à 20 mM ou de 0,1 à 15 mM ou de 0,3 à 15 mM ou de 0,5 à 15 mM ou de 1 à 10 mM ou de 1 ,5 à 10 mM ou de 2 à 10 mM ou de 3 à 10 mM ou de 3 à 8 mM ou encore de 5 à 8 mM.
Le ratio molaire ions citrates / unités de répétition du polysaccharide peut varier de 0,001 à 10 ou de 0,001 à 5 ou de 0,001 à 4,3, préférentiellement de 0,001 à 4, encore plus préférentiellement de 0,001 à 3. Le polysaccharide peut avoir été modifié par introduction de groupements fonctionnels capables de réagir entre eux et former des liaisons intermoléculaires covalentes.
Par exemple, le ratio molaire ions citrates / unités disaccharidique d’acide hyaluronique varie de 0,001 à 10 ou de 0,001 à 4, préférentiellement encore de 0,01 à 3, plus préférentiellement de 0,01 à 2, par exemple de 0,01 à 1 ,00 ou de 0,015 à 0,500.
La quantité d’ions zinc ajoutée permet d’atteindre une concentration en ions zinc dans l’hydrogel n’excédant pas 20 mM, ou n’excédant pas 7 mM ou n’excédant pas 5 mM ou n’excédant pas 3,5 mM ou n’excédant pas 2 mM ou n’excédant pas 1 ,6 mM, ou n’excédant pas 1 ,15 mM, ou n’excédant pas 0,8 mM. La quantité d’ions zinc ajoutée permet d’atteindre une concentration en ions zinc dans l’hydrogel allant typiquement de 0,10 à 20 mM ou de 0,10 à 7 mM ou de 0,10 à 5 mM ou de 0,10 à 3,5 mM ou de 0,10 à 2 mM ou de 0,10 à 1 ,6mM, ou de 0,10 à 1 ,15 mM ou de 0,10 à 0,8 mM. Dans certains modes de réalisation, la quantité d’ions zinc ajoutée permet d’atteindre une concentration en ions zinc dans l’hydrogel allant de 0,10 à 1 ,6 mM, de manière plus préférée de 0,10 à 1 ,15 mM, de manière encore plus préférée de 0,1 à 0,8 mM, préférentiellement de 0,3 à 0,8 mM.
Le ratio molaire ions citrates/zinc ajouté varie de 1 à 20, de préférence de 5 à 20 ou de 5 à 15 ou de 6 à 15 ou de 6 à 10.
Les ions citrates et zinc peuvent être ajoutés avant ou après la mise en contact du polysaccharide réticulé et/ non réticulé avec la solution physiologique saline, de préférence tamponnée, comprenant des sels de phosphate ou de carbonate ou de sulfate ou leurs mélanges. Les ions citrates et zinc peuvent être ajoutés séquentiellement, que ce soit avant ou après la mise en contact du polysaccharide réticulé et/ non réticulé avec la solution physiologique saline, de préférence tamponnée. Par exemple, les ions citrates peuvent être ajoutés puis les ions zinc, ou les ions zinc peuvent être ajoutés puis les ions citrates. Néanmoins, l’addition des ions zinc avant l’addition des ions citrates ne peut se faire que lorsque l’addition des ions citrates et zinc est réalisée avant la mise en contact du polysaccharide réticulé et/ non réticulé avec la solution physiologique saline, de préférence tamponnée. De manière alternative, les ions citrates et zinc peuvent être ajoutés concomitamment, que ce soit avant ou après l’étape de mise en contact du polysaccharide réticulé et/ non réticulé avec la solution physiologique saline, de préférence tamponnée.
Dans d’autres modes de réalisation, l’addition des ions citrates et zinc est concomitante à la mise en contact du polysaccharide réticulé et/ non réticulé avec la solution physiologique saline, de préférence tamponnée. Dans ce cas, la solution physiologique saline, de préférence tamponnée peut comprendre des sels de phosphate et/ou de carbonate et/ou de sulfate ou leurs mélanges, et comprendre en outre des ions citrates et zinc.
Les ions citrates peuvent être ajoutés sous forme de poudre ou sous forme d’une solution. La solution peut être préparée par addition d’acide citrique dans de l’eau ou dans une solution physiologique saline, de préférence tamponnée, par exemple dans une solution physiologique saline tamponnée comprenant des sels de phosphate ou de carbonate ou de sulfate ou leurs mélanges. La solution peut être préparée par addition de citrate de sodium, de citrate de calcium, de citrate de potassium ou de citrate de magnésium dans de l’eau ou dans une solution physiologique saline, de préférence tamponnée, par exemple dans une solution physiologique saline tamponnée comprenant des sels de phosphate ou de carbonate ou de sulfate ou leurs mélanges.
Les ions zinc peuvent être ajoutés sous forme de poudre ou sous forme d’une solution. La solution peut être préparée par addition d’acétate de zinc et/ou de chlorure de zinc et/ou de sulfate de zinc et/ou d’oxyde de zinc et/ou de gluconate de zinc dans de l’eau.
De manière préférée, les ions zinc et citrates peuvent être ajoutés sous forme d’une solution comprenant des ions zinc et citrates. Une solution comprenant à la fois des ions citrates et zinc est alors ajoutée lors de la préparation de l’hydrogel. La solution peut être préparée par addition d’acide citrique dans de l’eau puis addition de sels de zinc (ex. : acétate de zinc et/ou chlorure de zinc et/ou sulfate de zinc et/ou oxyde de zinc et/ou gluconate de zinc), de préférence par addition de chlorure de zinc. La solution peut être préparée par addition de citrate de sodium, de citrate de calcium, de citrate de potassium ou de citrate de magnésium dans de l’eau puis addition de sels de zinc (ex. : acétate de zinc et/ou chlorure de zinc et/ou sulfate de zinc et/ou oxyde de zinc et/ou gluconate de zinc), de préférence par addition de chlorure de zinc. De manière alternative, la solution peut être préparée par addition d’acide citrique dans une solution physiologique saline, de préférence tamponnée, puis addition de sels de zinc (ex. : acétate de zinc et/ou chlorure de zinc et/ou sulfate de zinc et/ou oxyde de zinc et/ou gluconate de zinc). De manière alternative, la solution peut être préparée par addition de citrate de sodium ou de citrate de calcium, de citrate de potassium ou de citrate de magnésium dans une solution physiologique saline, de préférence tamponnée, puis addition de sels de zinc (ex. : acétate de zinc et/ou chlorure de zinc et/ou sulfate de zinc et/ou oxyde de zinc et/ou gluconate de zinc). De préférence, le sel de zinc est le chlorure de zinc. La solution physiologique tamponnée peut être par exemple un tampon phosphate. Le tampon phosphate peut être un tampon PBS avec un pH autour du pH physiologique (6, 8-7, 8) (CAS No: 7647-14-5, 7447-40-7). Préférentiellement le tampon est un tampon phosphate, particulièrement un tampon de solution saline de NaH2PO4/Na2HPC>4 Ou de KH2PO4/K2HPO4. Au besoin, le pH de la solution peut être ajustée pour atteindre un pH physiologique (6, 8-7, 8), par exemple au moyen d’addition de soude. Ainsi, dans certains modes de réalisation, une solution tampon phosphate comprenant du zinc et de l’acide citrique, dont le pH varie de 6,8 à 7,8, est ajoutée lors de la préparation de l’hydrogel. Lorsque du citrate de sodium, du citrate de calcium, du citrate de potassium ou du citrate de magnésium est employé, il n’est typiquement pas nécessaire d’ajuster le pH.
La préparation d’un hydrogel à partir du polysaccharide réticulé et/ou non réticulé peut être réalisée de manière conventionnelle, à la différence près que des ions zinc et des ions citrates sont ajoutés lors de la préparation de l’hydrogel. Ainsi, la préparation d’un hydrogel à partir du polysaccharide réticulé et/ou non réticulé peut comprendre une ou plusieurs des étapes conventionnelles suivantes :
- Ajustement du pH (1) ;
Dilution (2) ;
Purification (3) ;
- Addition d’au moins un composant additionnel (4) ; Extrusion (5).
Ces étapes bien connues de l’homme du métier peuvent être telles que décrites ci-après. Elles peuvent être au moins pour partie concomitantes.
Les étapes conventionnelles peuvent être réalisées de la manière séquentielle suivante : éventuel ajustement du pH (1) puis éventuelle dilution (2) puis éventuelle purification (3) puis éventuelle addition d’un composant additionnel (4) puis éventuelle extrusion (5). Elles peuvent être également réalisées dans un ordre différent. Avantageusement, l’étape d’extrusion (5) est réalisée en dernier lieu, lorsqu’au moins une des autres étapes conventionnelles est mise en œuvre. Elle peut aussi être effectuée à plusieurs reprises et s’intercaler entre les autres étapes conventionnelles décrites.
Par exemple, les étapes conventionnelles peuvent être réalisées de la manière séquentielle suivante : (1), (2), (3), (4), (5) ; ou (2), (1), (3), (4), (5); ou (2) (1), (4), (5) ; ou (2), (4), (5) ; ou (1), (4), (5) ; ou (2), (4), (3), (5) ; ou (2), (4), (1), (5) ; ou (2), (4), (5) ; ou (4), (2), (1) ; ou (4), (1), (2) ou (2), (3), (4), (5) ; ou (4), (2), (3), (5) ; ou (2), (4), (1) ; ou (1), (5), (3), (4) ; ou (1), (5), (4) ; ou (2), (4). Les étapes (2), (3), (4) et (5) peuvent être concomitantes. Par exemple, la préparation de l’hydrogel, peut comprendre la séquence suivante : (2) et (4) sont réalisées de manière concomitante.
Les ions citrates (sous forme de poudre ou en solution) et zinc (sous forme de poudre ou en solution) peuvent être ajoutés au moment de, avant ou après l’une de ces étapes conventionnelles. Typiquement lorsque l’ajout d’ions citrates sous forme de poudre est réalisé, une neutralisation de l’effet des ions citrates sur le pH de l’hydrogel peut être réalisée. Les ions citrates et zinc sont de préférence ajoutés sous forme d’une solution comprenant des ions zinc et citrates. La solution est telle que décrite ci-dessus.
Les ions citrates (sous forme de poudre ou en solution) et/ou les ions zinc (sous forme de poudre ou en solution) sont ajoutés de préférence lors de l’étape (2) ou (4), préférentiellement lors de l’étape (4). Les étapes (2) et (4) peuvent être réalisées concomitamment.
Dans une variante, les ions citrates et/ou les ions zinc sont ajoutés avant l’étape d’extrusion (5) de façon à obtenir un gel homogène.
Lorsqu’une étape de purification (3) est mise en œuvre, les ions citrates et/ou les ions zinc sont avantageusement ajoutés après l’étape de purification (3). L’addition des ions citrates et/ou les ions zinc après l’étape de purification assure un meilleur contrôle de la concentration en ions citrates et/ou les ions zinc dans l’hydrogel préparé.
De préférence, les ions citrates et/ou les ions zinc sont ajoutés entre les étapes de purification (3) et d’extrusion (5).
L’addition des ions citrates et zinc peut être réalisée après l’étape de dilution (2) ou lors de l’étape de dilution (2), par exemple les ions citrates peuvent être ajoutés dans le solvant aqueux de dilution.
De préférence, les ions citrates sous forme de poudre ou en solution (avantageusement la solution comprenant des ions citrates) et/ou les ions zinc sont (est) ajouté(e)(s) lors de l’étape de dilution (2) et/ou lors de l’étape d’addition d’au moins d’un composant additionnel (4), préférentiellement lors de l’étape d’addition d’au moins d’un composant additionnel (4). En particulier, dans certains modes de réalisation, l’addition des ions citrates et/ou des ions zinc (avantageusement de la solution comprenant des ions citrates et zinc) est concomitante à l’étape d’addition d’au moins un composant additionnel (4).
De préférence, les ions citrates sous forme de poudre ou en solution (avantageusement la solution comprenant des ions citrates) et/ou les ions zinc sont (est) ajouté(e)(s) lors de l’étape de dilution (2) et/ou lors de l’étape d’addition d’au moins d’un composant additionnel (4), préférentiellement lors de l’étape d’addition d’au moins d’un composant additionnel (4). En particulier, dans certains modes de réalisation, l’addition des ions citrates et/ou des ions zinc (avantageusement de la solution comprenant des ions citrates et zinc) est concomitante à l’étape d’addition d’au moins un composant additionnel (4).
En particulier, dans certains modes de réalisation, l’addition des ions zinc et des ions citrates, de préférence sous forme d’une solution comprenant des ions citrates et zinc, est concomitante à l’addition d’une solution d’anesthésiant.
En particulier, dans certains modes de réalisation, l’addition des ions zinc et des ions citrates, de préférence sous forme d’une solution comprenant des ions citrates et zinc, est concomitante à l’addition d’un agent lubrifiant.
Dans certains modes de réalisation, la solution comprenant des ions zinc et des ions citrates ajoutée peut comprendre d’autres composants, en particulier un agent lubrifiant, par exemple de l’acide hyaluronique non réticulé, de l’héparosan non réticulé ou leur mélange.
Les étapes de dilution (2), d’addition d’au moins d’un composant additionnel (4) et d’addition des ions citrates et/ou zinc peuvent être concomitantes.
Les ions citrates et/ou zinc peuvent être ajoutés après l’étape de d'ajustement du pH (1). Les ions citrates peuvent être ajoutés entre les étapes de d'ajustement du pH (1) et d’extrusion (5) lorsque ces deux étapes sont mises en œuvre.
Ajustement du pH (1)
Le procédé de préparation de l’hydrogel peut comprendre une étape d’ajustement du pH de l’hydrogel pour atteindre le pH désiré (pH de 6, 8-7, 8).
Dilution (2)
Le procédé de préparation de l’hydrogel peut comprendre une étape de dilution du polysaccharide réticulé et/ou non réticulé. L’étape de dilution permet d’adapter la concentration en polysaccharide réticulé et/ou non réticulé dans l’hydrogel préparé. En particulier, un solvant aqueux est ajouté au polysaccharide réticulé et/ou non réticulé, par exemple, une solution physiologique saline, possiblement tamponnée par la présence de sels, tels que des sels phosphates ou de carbonate ou de sulfate ou leurs mélanges. Plus particulièrement, le solvant aqueux ajouté a un pH autour du pH physiologique (6, 8-7, 8). La concentration en polysaccharide obtenue suite à l’étape de dilution varie avantageusement de 1 mg/g à 50 mg/g d’hydrogel, plus avantageusement de 5 mg/g à 35 mg/g d’hydrogel, encore plus avantageusement de 10 mg/g à 30 mg/g d’hydrogel. Purification (3)
Le procédé de préparation de l’hydrogel peut comprendre au moins une étape de purification. L’étape de purification vise à éliminer les éventuelles impuretés indésirables. Ces impuretés indésirables peuvent résulter de la réticulation du polysaccharide, par exemple de l’étape (a2) décrite ci-avant. De telles impuretés peuvent comprendre, par exemple, l’agent de réticulation résiduel, en particulier de type époxydique, qui n’aurait pas réagi. Cette étape peut également permettre d’effectuer un échange de liquide, par exemple un échange de tampon.
L’étape de purification peut donc tout particulièrement être mise en œuvre lorsque l’hydrogel comprend un polysaccharide réticulé.
La purification peut être réalisée par dialyse ou encore par filtration, par exemple par filtration tangentielle dynamique (« DGF » pour Dynamic Cross-flow Filtration).
Addition de composants additionnels (4)
Le procédé de préparation de l’hydrogel peut comprendre une étape d’ajout d’au moins un composant additionnel. Le composant additionnel peut être choisi parmi les agents anesthésiants, les antioxydants, les agents lubrifiants, les acides aminés, les peptides, les protéines telles que le collagène et la fibroïne de soie, les vitamines, les éléments tels que le silicium (par exemple via l’addition d’acide orthosilicique), les minéraux, les acides nucléiques, les nucléotides ou polynucléotides tels que le PDRN, les nucléosides, les co-enzymes, les dérivés adrénergiques, le dihydrogénophosphate de sodium mono- hydraté et/ou di-hydraté, le chlorure de sodium et un de leurs mélanges.
Les polysaccharides non réticulés, en particulier l’acide hyaluronique non réticulé, l’héparosan non réticulé ou leur mélange, peuvent être cités à titre d’exemple d’agent lubrifiant.
Des exemples d’anesthésiants incluent de manière non limitative l’Ambucaïne, l’Amoxécaïne, l’Amyléine, l’Aprindine, l’Aptocaïne, l’Articaïne, la Benzocaine, la Bétoxycaïne, la Bupivacaïne, la Butacaïne, le Butamben, la Butanilicaïne, le Chlorobutanol, la Chloroprocaïne, la Cinchocaïne, la Clodacaïne, la Cocaïne, la Cryofluorane, la Cyclométhycaïne, la Dexivacaïne, la Diamocaïne, le Dipérodon, la Dyclonine, l’Etidocaïne, l’Euprocine, la Fébuvérine, la Fomocaïne, le Guafécaïnol, l’Heptacaïne, l’Hexylcaïne, l’Hydroxyprocaïne, l’Hydroxytétracaïne, l’Isobutamben, la Leucinocaïne, la Lévobupivacaïne, le Lévoxadrol, le Lidamidine, la Lidocaine, la Lotucaïne, le Menglytate, la Mépivacaïne, la Méprylcaïne, la Myrtécaïne, l’Octacaïne, l’Octodrine, l’Oxétacaïne, l’Oxybuprocaïne, la Paréthoxycaïne, la Paridocaïne, la Phénacaïne, la Pipérocaïne, la Piridocaïne, le Polidocanol, la Pramocaïne, la Prilocaïne, la Procaine, la Propanocaïne, la Propipocaine, la Propoxycaïne, la Proxymétacaïne, la Pyrrocaïne, la Quatacaïne, la Quinisocaïne, la Risocaïne, la Rodocaïne, la Ropivacaïne, la Tétracaïne, la Tolycaïne, la Trimécaïne, et un de leurs sels, en particulier un sel de chlorhydrate, ou un mélange de ceux-ci. De préférence, l’hydrogel selon l’invention comprend un agent anesthésiant tel que défini ci-dessus et en particulier la lidocaine, la mépivacaïne ou l’un de leurs sels tel que le chlorhydrate.
Des exemples d’antioxydants incluent de manière non limitative le glutathion, le glutathion réduit, l’acide ellagique, la spermine, le resvératrol, le rétinol, la L-carnitine, les polyols, les polyphénols, les flavonols, les théaflavines, les catéchines, la caféine, l’ubiquinol, l’ubiquinone, l’acide alpha-lipoïque et leurs dérivés, et un mélange de ceux- ci.
Des exemples d’acides aminés incluent de manière non limitative l’arginine (e.g., L- arginine), l’isoleucine (e.g., L-isoleucine), la leucine (e.g., L-leucine), la lysine (e.g., L- lysine ou L-lysine monohydratée), la glycine, la valine (e.g., L-valine), la thréonine (e.g., L-thréonine), la proline (e.g., L-proline), la méthionine, l’histidine, la phénylalanine, le tryptophane, la cystéine, leurs dérivés (e.g., dérivés N-acétylés comme la N-acétyl-L- cystéine) et un mélange de ceux-ci.
Des exemples de vitamines et de leurs sels incluent de manière non limitative les vitamines E, A, C, B, spécialement les vitamines B6, B8, B4, B5, B9, B7, B12, et mieux la pyridoxine et ses dérivées et/ou sels, de préférence le chlorhydrate de pyridoxine.
Des exemples de minéraux incluent de manière non limitative les sels de zinc (par exemple l’acétate de zinc, notamment déshydraté), les sels de magnésium, les sels de calcium (par exemple l’hydroxyapatite, notamment sous forme de bille), les sels de potassium, les sels de manganèse, les sels de sodium, les sels de cuivre (par exemple le sulfate de cuivre, notamment pentahydraté), éventuellement sous une forme hydratée, et les mélanges de ceux-ci.
Des exemples d’acides nucléiques incluent de manière non limitative l’adénosine, la cytidine, la guanosine, la thymidine, la cytodine, leurs dérivés et un mélange de ceux-ci. En tant que co-enzymes, la coenzyme Q10, la CoA, le NAD, le NADP, et les mélanges de ceux-ci peuvent être cités.
En tant que dérivés d’adrénaline, l’adrénaline, la noradrénaline et un mélange de ceux- ci, peuvent être cités. Extrusion (5)
Le procédé de préparation de l’hydrogel peut comprendre une ou plusieurs étapes d’extrusion. Cette étape d’extrusion permet d’obtenir un hydrogel plus homogène, en particulier avec une force d’extrusion la plus constante possible, e., la plus régulière possible. Par exemple, l’étape d’extrusion peut être réalisée au moyen d’un tamis dont les performations présentent un diamètre compris entre 50 et 2000 pm. L’homme du métier sait sélectionner le diamètre de perforation en fonction des propriétés mécaniques de l’hydrogel recherchées.
Stérilisation de l’hydrogel (étape (2))
Le procédé de la présente invention comprend une étape de stérilisation de l’hydrogel préparé. La stérilisation est réalisée de préférence par la chaleur, par exemple en autoclave. La stérilisation est généralement effectuée en augmentant la température du milieu de stérilisation jusqu’à une température dite « température au plateau », qui est maintenue pendant une durée déterminée dite « durée au plateau ». La stérilisation est de préférence réalisée à une température au plateau allant de 121 °C à 135°C, de préférence à une durée au plateau allant de 1 minute à 20 minutes avec F0 > 15. La valeur stérilisatrice F0 correspond au temps nécessaire, en minutes, à 121 °C, pour inactiver 90% de la population de microorganismes présente dans le produit à stériliser. Alternativement, la stérilisation peut être notamment réalisée par radiation aux rayons gamma, UV ou au moyen oxyde d’éthylène.
L’hydrogel obtenu à l’issue du procédé présente typiquement un pH allant de 6,8 à 7,8 (pH physiologique).
METHODE 2
La présente invention porte également sur un procédé de préparation d’un hydrogel stérile comprenant un polysaccharide réticulé et éventuellement un polysaccharide non réticulé, et comprenant en outre des ions zinc, le procédé comprenant les étapes suivantes :
(0) préparation d’un polysaccharide réticulé à partir d’un milieu réactionnel de réticulation comprenant un ou plusieurs polysaccharide(s), un ou plusieurs agent(s) réticulant, un solvant et des ions zinc en une quantité permettant la préparation d’un hydrogel comprenant au plus 20 mM d’ions zinc ;
(1) préparation d’un hydrogel à partir du polysaccharide réticulé obtenu à l’issue de l’étape (0) et éventuellement d’un polysaccharide non réticulé, la préparation de Tl l’hydrogel comprenant la mise en contact du polysaccharide réticulé avec une solution physiologique saline, de préférence tamponnée, la solution physiologique saline, de préférence tamponnée, comprenant des sels de phosphate ou de carbonate ou de sulfate ou leurs mélanges ;
(2) stérilisation, de préférence à la chaleur, de l’hydrogel obtenu à l’issue de l’étape (1) pour obtenir un hydrogel stérile ; dans lequel :
- le milieu réactionnel de réticulation comprend en outre des ions citrates en une quantité suffisante pour atteindre une concentration en ions citrates d’au moins 0,1 mM dans l’hydrogel, le ratio molaire [ions citrates présents dans le milieu réactionnel] / [ions zinc présents dans le milieu réactionnel] allant de 1 à 20 ; ou
- l’étape (1) comprend en outre, avant la mise en contact du polysaccharide réticulé avec la solution physiologique saline, de préférence tamponnée, une étape d’addition d’ions citrates en une quantité suffisante pour atteindre une concentration en ions citrate d’au moins 0,1 mM dans l’hydrogel, le ratio molaire [ions citrates ajoutés] / [ions zinc présents dans le milieu réactionnel] allant de 1 à 20 ; ou
- la solution physiologique saline, de préférence tamponnée, comprend en outre des ions citrates en une quantité suffisante pour atteindre une concentration en ions citrates d’au moins 0,1 mM dans l’hydrogel, le ratio molaire [ions citrates présents dans la solution physiologique saline, de préférence tamponnée] / [ions zinc présents dans le milieu réactionnel] allant de 1 à 20.
Le polysaccharide réticulé peut en particulier être préparé par un procédé comprenant les étapes suivantes :
(a1) préparer un milieu réactionnel de réticulation comprenant un ou plusieurs polysaccharide(s), un ou plusieurs agent(s) réticulant, un solvant, des ions zinc en une quantité permettant la préparation d’un hydrogel comprenant au plus 20 mM d’ions zinc et éventuellement des ions citrates en une quantité suffisante pour atteindre une concentration en ions citrates d’au moins 0,1 mM dans l’hydrogel ; et
(a2) faire réagir le milieu réactionnel pour obtenir un polysaccharide réticulé.
Lorsque le polysaccharide réticulé est préparé à partir d’un polysaccharide préalablement modifié par introduction de groupements fonctionnels capables de réagir entre eux et former des liaisons intermoléculaires covalentes (c’est-à-dire en absence d’agent réticulant), l’étape (0) comprend la préparation d’un polysaccharide réticulé à partir d’un milieu réactionnel de réticulation comprenant un ou plusieurs polysaccharide(s) modifiés, un solvant et des ions zinc en une quantité permettant la préparation d’un hydrogel comprenant au plus 20 mM d’ions zinc.
Le polysaccharide réticulé peut en particulier être préparé par un procédé comprenant les étapes suivantes :
(a1) préparer un milieu réactionnel de réticulation comprenant un ou plusieurs polysaccharide(s) modifiés, un solvant, des ions zinc en une quantité permettant la préparation d’un hydrogel comprenant au plus 20 mM d’ions zinc et éventuellement des ions citrates en une quantité suffisante pour atteindre une concentration en ions citrates d’au moins 0,1 mM dans l’hydrogel ; et
(a2) faire réagir le milieu réactionnel pour obtenir un polysaccharide réticulé.
Les étapes (0), (a1) et (a2) du procédé selon la méthode 2 sont telles que décrites précédemment dans la section « Le polysaccharide réticulé et/ou non réticulé », à la différence que le milieu réactionnel de réticulation comprend en outre des ions zinc et éventuellement des ions citrates. Lorsque les ions citrates ne sont pas présents dans le milieu réactionnel de réticulation, ils sont ajoutés avant l’étape de mise en contact du polysaccharide réticulé avec la solution physiologique saline, de préférence tamponnée ou dans la solution physiologique saline, de préférence tamponnée. Le polysaccharide est tel que décrit dans la section « Le polysaccharide réticulé et/ou non réticulé ».
Les ions zinc sont présents dans le milieu réactionnel en une quantité permettant de ne pas excéder une concentration en ions zinc dans l’hydrogel de 20mM, ou de 7 mM ou de 5 mM ou de 3,5 mM ou de 2 mM ou de 1,6mM, ou de 1 ,15 mM, ou de 0,8 mM. Les ions zinc sont typiquement présents dans le milieu réactionnel en une quantité permettant d’atteindre une concentration en ions zinc dans l’hydrogel variant de 0,10 à 20mM ou de 0,10 à 7 mM ou de 0,10 à 5 mM ou de 0,10 à 3,5 mM ou de 0,10 à 2 mM ou de 0,10 à 1 ,6mM, ou de 0,10 à 1 ,15 mM ou de 0,10 à 0,8 mM. Dans certains modes de réalisation, les ions zinc sont présents dans le milieu réactionnel en une quantité permettant d’atteindre une concentration en ions zinc dans l’hydrogel variant de 0,10 à 1 ,6 mM, de manière plus préférée de 0,10 à 1 ,15 mM, de manière encore plus préférée de 0,1 à 0,8 mM, préférentiellement de 0,3 à 0,8 mM.
Lorsque les ions citrates sont présents dans le milieu réactionnel, ils sont présents en une quantité permettant d’atteindre une concentration en ions citrates dans l’hydrogel d’au moins 0,1 mM et généralement d’au plus 150 mM, 100 mM, 50mM, 20 mM ou 15 mM. De préférence, ils sont présents en une quantité permettant d’atteindre une concentration en ions citrates dans I’hydrogel variant de 0,1 à 150 mM ou de 0,1 à 100 mM ou de 0,1 à 50 mM ou de 0,1 à 20 mM ou de 0,1 à 15 mM ou de 0,3 à 15 mM ou de 0,5 à 15 mM ou de 1 à 10 mM ou de 1 ,5 à 10 mM ou de 2 à 10 mM ou de 3 à 10 mM ou de 3 à 8 mM ou encore de 5 à 8 mM. Aucune liaison covalente n’est formée entre le polysaccharide et les ions citrates.
Lorsque les ions citrates ne sont pas présents dans le milieu réactionnel, ils sont ajoutés avant la mise en contact avec la solution physiologique saline, de préférence tamponnée, ou dans la solution physiologique saline, de préférence tamponnée, en une quantité suffisante pour atteindre les concentrations indiquées ci-dessus.
Le ratio molaire [ions citrates présents dans le milieu réactionnel] / [ions zinc présents dans le milieu réactionnel] ou [ions citrates ajoutés]/[ions zinc présents dans le milieu réactionnel] ou [ions citrates présents dans la solution physiologique saline, de préférence tamponnée] / [ions zinc présents dans le milieu réactionnel] varie de 1 à 20, de préférence de 5 à 20 ou de 5 à 15 ou de 6 à 15 ou de 6 à 10.
Les ions zinc présents dans le milieu réactionnel peuvent résulter de l’addition de sels de zinc au milieu réactionnel tels que le sulfate de zinc, chlorure de zinc, le gluconate de zinc, préférentiellement le chlorure de zinc.
Les ions citrates présents dans le milieu réactionnel peuvent résulter de l’addition d’acide citrique, sous forme de poudre ou sous forme d’une solution aqueuse au milieu réactionnel.
Les ions citrates présents dans le milieu réactionnel peuvent résulter de l’addition de citrate de sodium, de citrate de calcium, de citrate de potassium ou de citrate de magnésium, sous forme de poudre ou sous forme d’une solution aqueuse au milieu réactionnel.
Lorsque les ions citrates ne sont pas présents dans le milieu réactionnel, ils sont ajoutés avant l’étape de mise en contact avec la solution physiologique saline, de préférence tamponnée, ou dans la solution physiologique saline, de préférence tamponnée. Ils peuvent être ajoutés sous forme d’une solution. La solution peut être préparée par addition d’acide citrique ou de citrate de sodium, ou de citrate de calcium, ou de citrate de potassium ou de citrate de magnésium dans de l’eau ou dans une solution physiologique saline, de préférence tamponnée, par exemple une solution saline, de préférence tamponnée comprenant des sels de phosphate ou de carbonate ou de sulfate ou leurs mélanges. Dans d’autres modes de réalisation, la solution physiologique saline, de préférence tamponnée ajoutée lors de la préparation de l’hydrogel comprend des ions citrates.
A l’issue de l’étape (0) ou (a2), le polysaccharide réticulé se présente typiquement sous forme d’un gel comprenant des ions zinc, et éventuellement des ions citrates. Ce gel est généralement directement engagé dans la suite du procédé de l’invention (étape (1)).
La préparation d’un hydrogel (étape (1)) à partir du polysaccharide réticulé obtenu à l’issue de l’étape (0) ou (a2) peut être réalisée de manière conventionnelle. En particulier, la préparation d’un hydrogel à partir du polysaccharide réticulé obtenu à l’issue de l’étape (0) ou (a2) comprend typiquement une ou plusieurs des étapes conventionnelles suivantes :
- Ajustement du pH (1);
Dilution (2);
Purification (3);
- Addition d’au moins un composant additionnel (4);
Extrusion (5).
Ces étapes bien connues de l’homme du métier peuvent être telles que décrites ci-avant en relation avec la méthode 1 . Elles peuvent être mises en œuvre selon les manières séquentielles décrites précédemment.
La stérilisation (étape (2)) est telle que décrite en relation avec l’étape (2) de la méthode 1.
METHODE 3
L’invention porte également sur un procédé de préparation d’un hydrogel stérile comprenant un polysaccharide réticulé et éventuellement un polysaccharide non réticulé et comprenant en outre des ions zinc, le procédé comprenant les étapes suivantes : (0') préparation d’un milieu réactionnel de réticulation comprenant :
- un ou plusieurs polysaccharide(s),
- un ou plusieurs agent(s) réticulant,
- des ions citrates en une quantité suffisante pour atteindre une concentration en ions citrate d’au moins 0,1 mM dans l’hydrogel, - des ions zinc en une quantité permettant la préparation d’un hydrogel comprenant au plus 20 mM d’ions zinc, et
- une solution physiologique saline, de préférence tamponnée, comprenant des sels de phosphate ou de carbonate ou de sulfate ou leurs mélanges ; le ratio molaire [ions citrates présents dans le milieu réactionnel] / [ions zinc présents dans le milieu réactionnel] allant de 1 à 20, la préparation du milieu réactionnel étant réalisée par addition des ions citrates avant tout contact des ions zinc avec la solution physiologique saline ;
(0) préparation d’un polysaccharide réticulé à partir du milieu réactionnel obtenu à l’issue de l’étape (0’) ;
(1) préparation d’un hydrogel à partir du polysaccharide réticulé obtenu à l’issue de l’étape (0) et éventuellement d’un polysaccharide non réticulé ;
(2) stérilisation, de préférence à la chaleur, de l’hydrogel obtenu à l’issue de l’étape (1) pour obtenir un hydrogel stérile.
Lorsque le polysaccharide réticulé est préparé à partir d’un polysaccharide préalablement modifié par introduction de groupements fonctionnels capables de réagir entre eux et former des liaisons intermoléculaires covalentes (c’est-à-dire en absence d’agent réticulant), l’étape (0’) comprend la préparation d’un milieu réactionnel de réticulation comprenant :
- un ou plusieurs polysaccharide(s) préalablement modifiés,
- des ions citrates en une quantité suffisante pour atteindre une concentration en ions citrate d’au moins 0,1 mM dans l’hydrogel,
- des ions zinc en une quantité permettant la préparation d’un hydrogel comprenant au plus 20 mM d’ions zinc, et
- une solution physiologique saline, de préférence tamponnée, comprenant des sels de phosphate ou de carbonate ou de sulfate ou leurs mélanges ; le ratio molaire [ions citrates présents dans le milieu réactionnel] / [ions zinc présents dans le milieu réactionnel] allant de 1 à 20, la préparation du milieu réactionnel comprenant une addition des ions citrates avant tout contact des ions zinc avec la solution physiologique saline.
Les composants du milieu réactionnel sont tels que décrits précédemment. L’étape (0) du procédé selon la méthode 3 est telle que décrite précédemment dans la section « Le polysaccharide réticulé et/ou non réticulé », à la différence que le milieu réactionnel de réticulation comprend des ions zinc, des ions citrates et une solution physiologique saline, de préférence tamponnée, comprenant des sels de phosphate ou de carbonate ou de sulfate ou leurs mélanges .
La préparation d’un hydrogel (étape (1)) à partir du polysaccharide réticulé obtenu à l’issue de l’étape (0) peut être réalisée de manière conventionnelle. En particulier, la préparation d’un hydrogel à partir du polysaccharide réticulé obtenu à l’issue de l’étape (0) comprend typiquement une ou plusieurs des étapes conventionnelles suivantes :
- Ajustement du pH (1);
Dilution (2);
Purification (3);
- Addition d’au moins un composant additionnel (4);
Extrusion (5).
Ces étapes bien connues de l’homme du métier peuvent être telles que décrites ci-avant en relation avec la méthode 1 . Elles peuvent être mises en œuvre selon les manières séquentielles décrites précédemment.
La stérilisation (étape (2)) est telle que décrite en relation avec l’étape (2) de la méthode 1.
MÉTHODE 1 OU 2 OU 3 : Etape optionnelle
Le procédé de la présente invention (méthode 1 ou 2 ou 3) peut en outre comprendre une étape de conditionnement de l’hydrogel. Le conditionnement de l’hydrogel est typiquement réalisé dans un dispositif d’injection. Le conditionnement est de préférence réalisé juste avant l’étape de stérilisation (étape (2)). Ainsi, l’hydrogel stérile peut se présenter sous forme d’un dispositif d’injection pré-rempli avec l’hydrogel, par exemple une seringue pré-remplie avec l’hydrogel.
Hydrogel stérile
La présente invention porte également sur un hydrogel stérile comprenant un polysaccharide réticulé et/ou non réticulé obtenu ou susceptible d’être obtenu par le procédé de la présente invention (méthode 1 ou 2 ou 3). L’hydrogel stérile comprend des ions zinc et des ions citrates dans un ratio molaire ions citrates/ions zinc allant de 1 à 20, la concentration en ions citrates dans l’hydrogel étant d’au moins 0,1 mM et la concentration en zinc dans l’hydrogel n’excédant pas 20 mM.
De préférence, la concentration en ions zinc dans l’hydrogel varie de 0,10 à 20mM ou de 0,10 à 7 mM ou de 0,10 à 5 mM ou de 0,10 à 3,5 mM ou de 0,10 à 2 mM ou de 0,10 à 1 ,6 mM, ou de 0,10 à 1 ,15 mM ou de 0,10 à 0,8 mM. Dans certains modes de réalisation, la concentration en ions zinc dans l’hydrogel varie de 0,10 à 1 ,6 mM, de manière plus préférée de 0,10 à 1 ,15 mM, de manière encore plus préférée de 0,1 à 0,8 mM, préférentiellement de 0,3 à 0,8 mM.
De préférence, la concentration en ions citrates dans l’hydrogel varie 0,1 à 150 mM ou de 0,1 à 100mM ou de 0,1 à 50 mM ou de 0,1 à 20 mM ou de 0,1 à 15 mM ou 0,3 à 15 mM ou de 0,5 à 15 mM ou de 1 à 10 mM ou de 1 ,5 à 10 mM ou de 2 à 10 mM ou de 3 à 10 mM ou de 3 à 8 mM ou encore de 5 à 8 mM.
L’hydrogel stérile obtenu ou susceptible d’être obtenu par le procédé de la présente invention (méthode 1 ou 2 ou 3) a un pH physiologique, Le., allant de 6,8 à 7,8. Le pH de l’hydrogel stérile est de préférence supérieur ou égal à 6.9 et inférieur ou égal à 7,4 ; 7,3 ; 7,2 ;7,1 ou 7.
L’hydrogel stérile obtenu par le procédé de la présente invention (méthode 1 ou 2 ou 3) et comprenant un polysaccharide réticulé, possède avantageusement un angle de phase 5 inférieur ou égal à 45°, à 1 Hz pour une déformation de 0,1% ou une pression de 1 Pa, de préférence un angle de phase 5 allant de 2° à 45° ou allant de 20° à 45°.
L’hydrogel obtenu ou susceptible d’être obtenu par le procédé de la présente invention est de préférence un hydrogel injectable, c’est-à-dire qui peut s’écouler et être injecté manuellement au moyen d’une seringue munie d'une aiguille de diamètre allant de 0,1 à 0,5 mm, par exemple d’une aiguille hypodermique de 32G, 30 G, 27 G, 26 G, 25 G. L’hydrogel obtenu ou susceptible d’être obtenu par le procédé de la présente invention peut comprendre de 0,1 à 5% en poids, de préférence de 1 à 3% en poids, de polysaccharide (poids total de polysaccharide, c’est-à-dire poids total de polysaccharide réticulé et/ou non réticulé, par exemple d’acide hyaluronique réticulé et/ou non réticulé), par rapport au poids total de l’hydrogel. Ainsi, lorsque l’hydrogel comprend, comme seul polysaccharide, un polysaccharide non réticulé, l’hydrogel obtenu par le procédé de la présente invention peut donc comprendre de 0, 1 à 5% en poids, de préférence de 1 à 3% en poids, de polysaccharide non réticulé (par exemple d’acide hyaluronique non réticulé), par rapport au poids total de l’hydrogel. Lorsque l’hydrogel comprenant, comme seul polysaccharide, un polysaccharide réticulé, l’hydrogel obtenu par le procédé de la présente invention peut donc comprendre de 0, 1 à 5% en poids, de préférence de 1 à 3% en poids, de polysaccharide réticulé (par exemple d’acide hyaluronique réticulé), par rapport au poids total de l’hydrogel. Lorsque l’hydrogel comprend le mélange d’un polysaccharide réticulé et non réticulé, l’hydrogel obtenu par le procédé de la présente invention peut donc comprendre de 0,1 à 5% en poids, de préférence de 1 à 3% en poids, d’un mélange de polysaccharide non réticulé et réticulé (par exemple d’acide hyaluronique non réticulé et/ou réticulé), par rapport au poids total de l’hydrogel. En particulier, la teneur en polysaccharide (par exemple en acide hyaluronique) non réticulé peut varier de 0,5 à 40% en poids, préférentiellement de 1 à 40% en poids, plus préférentiellement de 5 à 30% en poids, par rapport au poids total de polysaccharide (par exemple d’acide hyaluronique) présent dans l’hydrogel.
La concentration en polysaccharide totale dans l’hydrogel obtenu par le procédé de la présente invention varie avantageusement de 1 mg/g à 50 mg/g d’hydrogel, plus avantageusement de 5 mg/g à 35 mg/g d’hydrogel, encore plus avantageusement de 10 mg/g à 30 mg/g d’hydrogel. Préférablement le polysaccharide est de l’acide hyaluronique, encore plus préférentiellement du hyaluronate de sodium.
La concentration en polysaccharide totale dans l’hydrogel obtenu par le procédé de la présente invention varie avantageusement de 1 mg/g à 50 mg/g d’hydrogel, plus avantageusement de 5 mg/g à 35 mg/g d’hydrogel, encore plus avantageusement de 10 mg/g à 30 mg/g d’hydrogel. Préférablement le polysaccharide est de l’acide hyaluronique, encore plus préférentiellement du hyaluronate de sodium.
Lorsque l’hydrogel comprend un polysaccharide réticulé, le polysaccharide réticulé présente de préférence un taux de réticulation molaire inférieur ou égal à 10%. Préférentiellement, l’hydrogel comprend un polysaccharide réticulé dont le taux de réticulation molaire est supérieur à 0 et inférieur ou égal à 6%. Encore plus préférentiellement, l’hydrogel comprend un polysaccharide réticulé dont le taux de réticulation molaire est supérieur à 0 et inférieur ou égal à 4%. De manière encore plus préférée, l’hydrogel comprend un polysaccharide réticulé dont le taux de réticulation molaire est supérieur à 0 et inférieur ou égal à 2%, de préférence inférieur ou égal à 1 %, encore préférentiellement inférieur ou égal à 0,8%, notamment allant de 0,1 % à 0,5% (nombre de moles d’agent(s) réticulant pour 100 moles d’unité de répétition du ou des polysaccharides).
Lorsque l’hydrogel comprend un polysaccharide réticulé, le polysaccharide réticulé présente de préférence un degré de modification (MOD) inférieur ou égal à 10%, de préférence inférieur ou égal à 6%, de préférence inférieur ou égal à 4%, de manière préférée inférieur ou égal à 2%, de manière plus préférée inférieur ou égal à 1%. Avantageusement, le polysaccharide réticulé présente un degré de modification (MOD) inférieur ou égal à 1 ,8%, de manière plus préférée inférieur ou égal à 1 ,5%, préférentiellement inférieur ou égal à 1 ,2%, encore plus préférentiellement inférieur à 1 %.
Dans certains modes de réalisation, l’hydrogel comprend un agent anesthésiant. L’agent anesthésiant peut être tel que décrit ci-dessus, en particulier l’agent anesthésiant peut être la mépivacaïne, la lidocaine ou un de leurs sels ; plus particulièrement sous forme d’un sel de chlorhydrate ; préférablement dans des quantités allant de 0,1 à 30 mg/ml, par exemple de 0,5 à 10 mg/ml ou plus préférentiellement de 2 à 6 mg/ml.
Les hydrogels stériles préparés selon le procédé de l’invention sont tout particulièrement utiles pour le comblement et/ou le remplacement de tissus, en particulier de tissus mous, notamment par injection de l’hydrogel dans le tissu. Outre le comblement des tissus mous, ils permettent de délivrer des effets biostimulants.
Dans certains modes de réalisation, l’hydrogel stérile est injecté chez le sujet en sous- cutané. Idéalement, l’hydrogel permet une libération lente des ions zinc chez le sujet après l’injection. Cette libération des ions zinc doit rester nettement inférieure à la dose toxique des ions zinc. Par exemple, pour un hydrogel contenant des ions zinc, la libération sous-cutanée chez le sujet après l’injection doit être inférieure à 0,1 mmol/jour. Ils peuvent être injectés en utilisant l’un quelconque des modes connus de l'homme du métier. Notamment, ils peuvent être administrés au moyen d'un dispositif d'injection adapté à une injection intra-épidermique et/ou intradermique et/ou sous-cutanée et/ou supra-périostée. Le dispositif d'injection peut notamment être choisi parmi une seringue, un ensemble de micro-seringues, un fil, un dispositif laser ou hydraulique, un pistolet d'injection, un dispositif d'injection sans aiguille, ou un rouleau à micro-aiguilles.
Les hydrogels stériles préparés selon le procédé de l’invention sont de préférence injectés en sous-cutané.
Ils peuvent concerner des applications profondes, des applications médianes et/ou des applications superficielles.
Ils peuvent avoir des applications thérapeutiques et/ou cosmétiques et/ou cosméceutiques.
Dans le domaine cosmétique, les hydrogels peuvent tout particulièrement être utiles pour compenser des pertes de volume des tissus dues au vieillissement. Ils peuvent être utilisés dans la prévention et/ou le traitement cosmétique d’une altération de l’aspect de surface de la peau. Par exemple, les hydrogels peuvent être utilisés dans le domaine cosmétique pour prévenir et/ou traiter l’altération des propriétés viscoélastiques ou biomécaniques de la peau ; pour combler des défauts volumiques de la peau, notamment pour combler des rides, des ridules et des cicatrices ; pour atténuer les sillons naso-géniens et plis d’amertumes ; pour augmenter le volume des pommettes, du menton ou des lèvres ; pour rétablir les volumes du visage, notamment des joues, des tempes, de l’ovale du visage, et du pourtour de l’œil ; pour réduire l’apparition des rides et ridules.
La présente invention porte également sur l’utilisation cosmétique d’un hydrogel tel que décrit précédemment pour le comblement des tissus, en particulier des tissus mous, en particulier pour compenser des pertes de volume des tissus dues au vieillissement.
Les exemples qui suivent sont donnés à titre illustratif, mais ne doivent en aucun cas être considérés comme limitatifs de la présente invention.
EXEMPLES
1. Matériels
- Hyaluronate de sodium non réticulé
- BDDE (Sigma Aldrich)
- Acide citrique (Sigma Aldrich) (CAS No : 5949-29-1)
- Citrate de sodium (Sigma Aldrich) (CAS No : 6132-04-3)
- Chlorure de zinc (Sigma Aldrich) (CAS No : 7646-85-7)
- Zinc citrate commercial (Thermo Fisher) (CAS 5990-32-9)
- NaOH 0,25M
- HCl 1 M
- Tampon Phosphate PBS (BBraun),
- Chlorhydrate de Lidocaine
- Agitateur tridimensionnel
- Rhéomètre DHR-2
- Dynamomètre et banc d’essai
- Homogénéisateur Broyeur à palettes
- Poche stérile en polyéthylène 2. Méthodes
Mesure des propriétés viscoélastiques
Les propriétés viscoélastiques des hydrogels obtenus ont été mesurées en utilisant un rhéomètre (DHR-2) ayant un cône en acier inoxydable (1 ° - 40 mm) à géométrie cône- plan et un plan peltier en aluminium anodisé (42 mm) (entrefer 24 pm).
0,5 g d’hydrogel stérilisé est déposé entre le plan peltier et ledit cône. Puis un balayage en contraintes est effectué à 1 Hz et 25°C. Le module élastique G’, le module visqueux G” et l’angle de phase 5 sont reportés pour une contrainte de 5 Pa. Les mesures sont réalisées dans le domaine linéaire LVER.
La contrainte au croisement de G’ et G”, T, est déterminée au croisement des courbes des modules G’ et G” et est exprimée en Pascal.
3. Exemples
3.1 Exemple 1a
Un hydrogel d’acide hyaluronique réticulé est préparé à partir d’un acide hyaluronique de haut poids moléculaire 4 MDa et du BDDE dans une solution aqueuse de soude à 0,25M (réticulation pendant 72 heures à 21 °C). Le polysaccharide réticulé présente un taux de réticulation de 2%. Du tampon phosphate et une solution d’HCI 1 N sont ensuite ajoutés au polysaccharide réticulé jusqu’à obtenir un pH de 7,3 ± 0,5. L’hydrogel obtenu est homogénéisé au moyen d’un agitateur tridimensionnel. L’hydrogel est dialysé. L’hydrogel obtenu présente une concentration de 15 mg d'acide hyaluronique par gramme d’hydrogel.
Aux hydrogels obtenus, sont ensuite ajoutées :
- une solution de hyaluronate de sodium de haut poids moléculaire en tant que lubrifiant (même quantité dans les différents mélanges) ;
- une solution aqueuse de chlorhydrate de lidocaine pour obtenir 0,3% en poids de chlorhydrate de lidocaine par rapport au poids de l’hydrogel final ;
- éventuellement une solution comprenant du zinc et des ions citrates.
La solution comprenant du zinc et des ions citrates est préparée comme suit. L'acide citrique (sous forme de poudre) est d'abord dissout dans du tampon phosphate puis le chlorure de zinc est dissout (poudre de ZnCh) et enfin du NaOH 5M est ajouté pour ajuster le pH à un niveau physiologique. L'objectif est de faire une solution concentrée 100 fois (en zinc et en ions citrates) par rapport à la concentration réelle souhaitée dans l’hydrogel final. Cela permet d'éviter un trop fort effet de dilution de l’hydrogel dû à l'ajout de la solution de zinc et d’acide citrique.
La solution comprenant du zinc et des ions citrates est ajoutée au même moment que la solution d'anesthésiant, et ce après addition de la solution de hyaluronate de sodium de haut poids moléculaire. Les hydrogels obtenus ont été tamisés puis conditionnés en seringue.
Enfin, les hydrogels obtenus ont été stérilisés à l’autoclave (température au plateau comprise entre 121 °C et 135°C avec FO > 15).
Après stérilisation, les hydrogels A1-A6 ont été analysés. Aucun hydrogel ne présente une précipitation. Le module élastique G’ et l’angle de phase 5 ont été déterminés. Les résultats sont présentés dans le Tableau 1 ci-dessous.
Les hydrogels présentent un taux de réticulation molaire de 2%.
Figure imgf000039_0001
Tableau 1
1 AG’ (%)= (G’ après stérilisation - G’ avant stérilisation)/(G’ avant stérilisation) *100
2 A 5 (%)= (5 après stérilisation - 5 avant stérilisation)/( 5 avant stérilisation) *100 * il a été considéré que 1 mL d’hydrogel pèse un gramme.
Il est observé que les hydrogels préparés à partir d’un procédé selon l’invention comprenant une étape d’addition d’une solution comprenant des ions zinc et des ions citrates présentent des modifications moindres de leurs propriétés rhéologiques après stérilisation par rapport à des hydrogels préparés par un procédé équivalent sans addition d’une telle solution.
3.2 Exemple 1b
Un hydrogel d’acide hyaluronique réticulé est préparé à partir d’un acide hyaluronique de haut poids moléculaire 4MDa et du BDDE dans une solution aqueuse de soude à 0,25M (réticulation pendant 72 heures à 21 °C). Le polysaccharide réticulé présente un taux de modification de 2%. Du tampon phosphate PBS et une solution d’HCI 1 N sont ensuite ajoutée au polysaccharide réticulé jusqu’à obtenir un pH de 7,3 ± 0,5. L’hydrogel obtenu est homogénéisé au moyen d’un agitateur tridimensionnel. L’hydrogel est dialysé. L’hydrogel obtenu présente une concentration de 15 mg d'acide hyaluronique par gramme de produit.
Aux hydrogels obtenus, sont ensuite ajoutées :
- une solution de hyaluronate de sodium de haut poids moléculaire non réticulé en tant que lubrifiant (même quantité dans les différents mélanges) ;
- éventuellement une solution comprenant du zinc et des ions citrates.
La solution comprenant du zinc et des ions citrates est préparée comme suit. L'acide citrique (sous forme de poudre) est d'abord dissout dans du tampon phosphate puis le chlorure de zinc est dissout (poudre de ZnCh) et enfin du NaOH 5M est ajouté pour ajuster le pH à un niveau physiologique. L'objectif est de faire une solution concentrée 100 fois (en zinc et en ions citrates) par rapport à la concentration réelle souhaitée dans l’hydrogel final. Cela permet d'éviter un trop fort effet de dilution de l’hydrogel dû à l'ajout de la solution de zinc et d’acide citrique. La solution comprenant du zinc et des ions citrates est ajoutée après addition de la solution de hyaluronate de sodium de haut poids moléculaire.
Les hydrogels obtenus ont été tamisés puis conditionnés en seringue.
Enfin, les hydrogels obtenus sont stérilisés à l’autoclave (température au plateau comprise entre 121 °C et 135°C avec FO > 15).
Après stérilisation, les hydrogels B1-B4 ont été analysés. Aucun hydrogel ne présente une précipitation. Le module élastique G’, l’angle de phase 5 et la contrainte au croisement de G’ et G”, T ont été déterminés. Les résultats sont présentés dans le Tableau 2 ci-dessous.
Les hydrogels présentent un taux de réticulation molaire de 2%.
Figure imgf000041_0001
Tableau 2
1 AG’ (%)= (G’ après stérilisation - G’ avant stérilisation)/(G’ avant stérilisation) *100
2 A 5 (%)= (5 après stérilisation - 5 avant stérilisation)/( 5 avant stérilisation) *100
* il a été considéré que 1mL d’hydrogel pèse un gramme.
Il est observé que les hydrogels préparés à partir d’un procédé selon l’invention comprenant une étape d’addition d’une solution comprenant du zinc et des ions citrates présentent des modifications moindres de leurs propriétés rhéologiques après stérilisation par rapport à des hydrogels préparés par un procédé équivalent sans addition d’une telle solution.
Par ailleurs, il a été observé que l’addition d’une solution comprenant du zinc et des ions citrates permet de préserver la structure des hydrogels de la dégradation au cours du temps (tableau 3).
Figure imgf000042_0001
Tableau 3
1 AG’ (%)= (G’ T3mois - G’ T0)/(G’ TO) *100
2AG’ (%)= (G’ T6mois - G’ T0)/(G’ T0) *100
Après 3 mois et 6 mois à 40°C, les hydrogels préparés à partir d’un procédé selon l’invention comprenant une étape d’addition d’une solution comprenant du zinc et des ions citrates présentent des modifications moindres de leurs propriétés rhéologiques après stérilisation par rapport à des hydrogels préparés par un procédé équivalent sans addition d’une telle solution. Pour l’hydrogel B4 préparé à partir d’un procédé selon l’invention comprenant une étape d’addition d’une solution comprenant du zinc et des ions citrates aucune précipitation n’est observée ni au bout de 3 mois, ni au bout de 6 mois.
3.3 Exemple 2
Pour comparaison, un hydrogel selon l’exemple 1 b est réalisé avec l’incorporation de 0,47g de zinc citrate commercial (sous forme de poudre, ratio molaire ions citrates/ions zinc dans l’hydrogel = 0,667) dans du tampon.
La solution comprenant du zinc citrate commercial est préparée comme suit. Le zinc citrate est d'abord dissout dans du tampon phosphate puis est ajouté à du NaOH 5M pour ajuster le pH à un niveau physiologique. L'objectif est de faire une solution concentrée 100 fois (en zinc et en ions citrates) par rapport à la concentration réelle souhaitée dans l’hydrogel final. Cela permet d'éviter un trop fort effet de dilution de l’hydrogel dû à l'ajout de la solution comprenant le zinc citrate commercial.
La solution comprenant du zinc citrate commercial est ajoutée après addition de la solution de hyaluronate de sodium de haut poids moléculaire.
Les hydrogels obtenus ont été tamisés puis conditionnés en seringue.
Enfin, les hydrogels obtenus ont été stérilisés à l’autoclave (température au plateau comprise entre 121 °C et 135°C avec FO > 15).
Les résultats des hydrogels observés au microscope sont présentés aux figures 1 et 2. Le microscope utilisé est : Olympus SZX16, le logiciel : OLYMPUS Stream Start.
L’hydrogel obtenu en accord avec le procédé selon l’invention (Fig. 1 - prototype C3) est transparent.
Un précipité est observé dès sortie de la stérilisation de l’hydrogel incorporant du zinc citrate commercial (Fig. 2), ce qui n’est pas souhaitable pour un hydrogel.
3.4 Exemple 3
Une étude conduite par le laboratoire d’analyses médicales NAMSA, selon la norme ISO 10993-23 « Biological Evaluation of Medical Devices, Part 23 (2021) : Tests for Irritations », a permis d’évaluer le potentiel irritant des hydrogels selon l’invention après injection intradermique dans des lapins.
Les hydrogels contrôle C1 et selon l’invention 02 testés sont préparés comme suit : L’hydrogel d’acide hyaluronique réticulé est préparé à partir d’un acide hyaluronique de haut poids moléculaire 1 ,5MDa et du BDDE dans une solution aqueuse de soude à 0,25M (réticulation pendant 72 heures à 21 °C). Le polysaccharide réticulé présente un taux de modification de 4%. Du tampon phosphate PBS et une solution d’HCI 1 N est ensuite ajoutée au polysaccharide réticulé jusqu’à obtenir un pH de 7,3 ± 0,5. L’hydrogel obtenu est homogénéisé au moyen d’un agitateur tridimensionnel. L’hydrogel est par la suite dialysé. Les hydrogels obtenus présentent une concentration de 23 mg d'acide hyaluronique par gramme de produit.
L’hydrogel à base d’un polysaccharide réticulé obtenu est par la suite divisé en 2.
Aux hydrogels obtenus, sont ensuite ajoutées :
- pour l’hydrogel C1 et C2 une solution aqueuse de chlorhydrate de lidocaine pour obtenir 0,3% en poids de chlorhydrate de lidocaine par rapport au poids de I’hydrogel final et une solution de hyaluronate de sodium de haut poids moléculaire non réticulé en tant que lubrifiant (même quantité dans les différents mélanges) ;
- pour I’hydrogel C2, une solution comprenant 0,46 mM d’ions zinc et 2,3 mM d’ions citrates.
La solution comprenant du zinc et des ions citrates est préparée comme suit. L'acide citrique (sous forme de poudre) est d'abord dissout dans du tampon phosphate puis le chlorure de zinc est dissout (poudre de ZnCh) et enfin du NaOH 5M est ajouté pour ajuster le pH à un niveau physiologique. L'objectif est de faire une solution concentrée 100 fois (en zinc et en ions citrates) par rapport à la concentration réelle souhaitée dans I’hydrogel final. Cela permet d'éviter un trop fort effet de dilution de I’hydrogel dû à l'ajout de la solution de zinc et d’acide citrique.
La solution comprenant du zinc et des ions citrates est ajoutée après addition de la solution de hyaluronate de sodium de haut poids moléculaire.
Les hydrogels obtenus ont été tamisés puis conditionnés en seringue.
Enfin, les hydrogels obtenus sont stérilisés à l’autoclave (température au plateau comprise entre 121 °C et 135°C avec F0 > 15). Aucun hydrogel ne présente une précipitation.
Une dose de 0,2 mL de chacun des hydrogels stérilisés C1 et C2 est injectée en intradermique dans 5 sites distincts sur les côtés du dos de trois lapins. Les sites d’injection sont observés à 24, 48 et 72h après injection pour les signes d’érythème et d’œdème, puis de façon journalière jusqu’à 28 jours. Les signes d’érythème et d’œdème ont été mesurés via une échelle de score de 0-4 pour chaque site d’injection et pour chaque animal. La moyenne de score global a été déterminée en divisant la somme des scores par le nombre total de sites évaluées.
L’hydrogel selon l’invention C2 présente, sur toute la durée du test, une moyenne de score d’irritation inférieure à l’hydrogel C1 contrôle. Cela indique ainsi que l’hydrogel C2 préparé selon l’invention présente un caractère moins irritant que l’hydrogel contrôle. 3.5 Exemple 4
Deux hydrogels d’acide hyaluronique réticulé sont préparés à partir d’un acide hyaluronique de haut poids moléculaire 1.5 MDa et du BDDE dans une solution aqueuse de soude à 0,25M (réticulation pendant 1 mois à -20°C). Le polysaccharide réticulé présente un taux de réticulation de 0.5% et. Du tampon phosphate et une solution d’HCI 1 N est ensuite ajoutée au polysaccharide réticulé jusqu’à obtenir un pH de 7,3 ± 0,5. L’hydrogel obtenu est homogénéisé au moyen d’un agitateur tridimensionnel. L’hydrogel est dialysé. Les hydrogels obtenus présentent une concentration de 23 mg d'acide hyaluronique par gramme d’hydrogel.
Aux hydrogels obtenus, sont ensuite ajoutées :
- une solution de hyaluronate de sodium de haut poids moléculaire en tant que lubrifiant (même quantité dans les différents mélanges) ;
- une solution aqueuse de chlorhydrate de lidocaine pour obtenir 0,3% en poids de chlorhydrate de lidocaine par rapport au poids de l’hydrogel final ;
- éventuellement une solution comprenant du zinc et des ions citrates.
La solution comprenant du zinc et des ions citrates est préparée comme suit. L'acide citrique (sous forme de poudre) est d'abord dissout dans du tampon phosphate puis le chlorure de zinc est dissout (poudre de ZnCh) et enfin du NaOH 5M est ajouté pour ajuster le pH à un niveau physiologique. L'objectif est de faire une solution concentrée 100 fois (en zinc et en ions citrates) par rapport à la concentration réelle souhaitée dans l’hydrogel final. Cela permet d'éviter un trop fort effet de dilution de l’hydrogel dû à l'ajout de la solution de zinc et d’acide citrique.
La solution comprenant du zinc et des ions citrates est ajoutée au même moment que la solution d'anesthésiant, et ce après addition de la solution de hyaluronate de sodium de haut poids moléculaire.
Les hydrogels obtenus ont été tamisés puis conditionnés en seringue.
Enfin, les hydrogels obtenus ont été stérilisés à l’autoclave (température au plateau comprise entre 121 °C et 135°C avec F0 > 15). Après stérilisation, les hydrogels D1 et D2 ont été analysés. Aucun hydrogel ne présente une précipitation. Le module élastique G’ et l’angle de phase 5 ont été déterminés. Les résultats sont présentés dans le Tableau 4 ci-dessous.
Les hydrogels présentent un taux de réticulation molaire de 0,5%.
Figure imgf000046_0001
Tableau 4
1 AG’ (%)= (G’ après stérilisation - G’ avant stérilisation)/(G’ avant stérilisation) *100
2 A 5 (%)= (5 après stérilisation - 5 avant stérilisation)/( 5 avant stérilisation) *100
* il a été considéré que 1 mL d’hydrogel pèse un gramme.
Il est observé que les hydrogels préparés à partir d’un procédé selon l’invention comprenant une étape d’addition d’une solution comprenant du zinc et des ions citrates présentent des modifications moindres de leurs propriétés rhéologiques après stérilisation par rapport à des hydrogels préparés par un procédé équivalent sans addition d’une telle solution.
Par ailleurs, il a été observé que l’addition d’une solution comprenant du zinc et des ions citrates permet de préserver la structure des hydrogels de la dégradation au cours du temps (tableau 5).
Figure imgf000047_0001
Tableau 5
1 AG’ (%)= (G’ T6mois - G’ TO)/(G’ TO) *100
Après 6 mois à 40°C, l’hydrogel préparé à partir d’un procédé selon l’invention comprenant une étape d’addition d’une solution comprenant du zinc et des ions citrates (D2) présente des modifications moindres de ses propriétés rhéologiques après stérilisation par rapport à l’hydrogel préparé par un procédé équivalent sans addition d’une telle solution (D1). Pour l’hydrogel D2 préparé à partir d’un procédé selon l’invention comprenant une étape d’addition d’une solution comprenant du zinc et des ions citrates aucune précipitation n’est observée au bout de 6 mois.
3.6 Exemple 5
Deux hydrogels d’acide hyaluronique non réticulé à 20 mg/g sont préparés à partir d’un acide hyaluronique de haut poids moléculaire 1.5 MDa dans une solution tampon.
La solution comprenant du zinc ajouté à l’hydrogel E1 est préparée comme suit. Le chlorure de zinc est dissout (poudre de ZnCh) dans du tampon phosphate et enfin du NaOH 5M est ajouté pour ajuster le pH à un niveau physiologique.
La solution comprenant du zinc et des ions citrates ajouté dans l’hydrogel E2 est préparée comme suit. L'acide citrique (sous forme de poudre) est d'abord dissout dans du tampon phosphate puis le chlorure de zinc est dissout (poudre de ZnCh) et enfin du NaOH 5M est ajouté pour ajuster le pH à un niveau physiologique. L'objectif est de faire une solution concentrée 100 fois (en zinc et en ions citrates) par rapport à la concentration réelle souhaitée dans l’hydrogel final. Cela permet d'éviter un trop fort effet de dilution de l’hydrogel dû à l'ajout de la solution de zinc et d’acide citrique.
Enfin, les hydrogels obtenus ont été stérilisés à l’autoclave (température au plateau comprise entre 121 °C et 135°C avec F0 > 15).
Figure imgf000048_0001
Tableau 6
* il a été considéré que 1 mL d’hydrogel pèse un gramme.
Il est observé que l’hydrogel préparé à partir d’un procédé selon l’invention comprenant une étape d’addition d’une solution comprenant du zinc et des ions citrates ne présente pas de précipitation après stérilisation contrairement à l’hydrogel préparé par un procédé équivalent sans addition d’ions citrates.
3.7 Exemple 6
Trois hydrogels d’acide hyaluronique réticulé sont préparés à partir d’un acide hyaluronique de haut poids moléculaire 1.5 MDa et du BDDE dans une solution aqueuse de soude à 0,25M (réticulation pendant 3 heures à 52°C). Le polysaccharide réticulé présente un taux de réticulation de 8.7%. Du tampon phosphate et une solution d’HCI 1 N est ensuite ajoutée au polysaccharide réticulé jusqu’à obtenir un pH de 7,3 ± 0,5. L’hydrogel obtenu est homogénéisé au moyen d’un agitateur tridimensionnel. L’hydrogel est dialysé. Les hydrogels obtenus présentent une concentration de 23 mg d'acide hyaluronique par gramme d’hydrogel.
Aux hydrogels obtenus, sont ensuite ajoutées :
- une solution de hyaluronate de sodium de haut poids moléculaire en tant que lubrifiant (même quantité dans les différents mélanges) ;
- une solution aqueuse de chlorhydrate de lidocaine pour obtenir 0,3% en poids de chlorhydrate de lidocaine par rapport au poids de l’hydrogel final ;
- éventuellement une solution comprenant du zinc et du sodium citrate.
- éventuellement une solution comprenant du zinc et de l’acide citrique. La solution comprenant du zinc et de l’acide citrique est préparée comme suit. L'acide citrique (sous forme de poudre) est d'abord dissout dans du tampon phosphate puis le chlorure de zinc est dissout (poudre de ZnCh) et enfin du NaOH 5M est ajouté pour ajuster le pH à un niveau physiologique. L'objectif est de faire une solution concentrée 100 fois (en zinc et en ions citrates) par rapport à la concentration réelle souhaitée dans l’hydrogel final. Cela permet d'éviter un trop fort effet de dilution de l’hydrogel dû à l'ajout de la solution de zinc et d’acide citrique.
La solution comprenant du zinc et du sodium citrate est préparée comme suit. Le sodium citrate (sous forme de poudre) est d'abord dissout dans du tampon phosphate puis le chlorure de zinc est dissout (poudre de ZnCh).
La solution comprenant du zinc et des ions citrates (provenant de l’acide citrique ou du sodium citrate) est ajoutée au même moment que la solution d'anesthésiant, et ce après addition de la solution de hyaluronate de sodium de haut poids moléculaire.
Les hydrogels obtenus ont été tamisés puis conditionnés en seringue.
Enfin, les hydrogels obtenus ont été stérilisés à l’autoclave (température au plateau comprise entre 121 °C et 135°C avec FO > 15).
Après stérilisation, les hydrogels F1 - F3 ont été analysés. Aucun hydrogel ne présente une précipitation. Le module élastique G’ et l’angle de phase 5 ont été déterminés. Les résultats sont présentés dans le Tableau 7 ci-dessous.
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000050_0001
Tableau 7
1 AG’ (%)= (G’ après stérilisation - G’ avant stérilisation)/(G’ avant stérilisation) *100
2 A 5 (%)= (5 après stérilisation - 5 avant stérilisation)/( 5 avant stérilisation) *100
* il a été considéré que 1mL d’hydrogel pèse un gramme.
Il est observé que les hydrogels préparés à partir d’un procédé selon l’invention comprenant une étape d’addition d’une solution comprenant du zinc et des ions citrates présentent des modifications moindres de leurs propriétés rhéologiques après stérilisation par rapport à des hydrogels préparés par un procédé équivalent sans addition d’une telle solution. De plus l’hydrogel F3 comprenant une étape d’addition d’une solution comprenant du zinc et des ions citrates provenant du citrate de sodium présente des modifications moindres de ses propriétés rhéologiques après stérilisation par rapport à des hydrogels préparés par un procédé comprenant du zinc et des ions citrates provenant de l’acide citrique.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d’un hydrogel stérile comprenant un polysaccharide réticulé, un polysaccharide non réticulé ou leur mélange et comprenant en outre des ions zinc, le procédé comprenant les étapes suivantes :
(1) préparation d’un hydrogel comprenant un polysaccharide réticulé, un polysaccharide non réticulé ou leur mélange, la préparation de l’hydrogel comprenant les étapes suivantes :
- mise en contact du polysaccharide réticulé, du polysaccharide non réticulé, ou de leur mélange, avec une solution physiologique saline, de préférence tamponnée, la solution physiologique saline, de préférence tamponnée, comprenant des sels de phosphate ou de carbonate ou de sulfate ou leurs mélanges,
- addition d’ions citrates au polysaccharide réticulé, au polysaccharide non réticulé, ou à leur mélange, en une quantité suffisante pour atteindre une concentration en ions citrates d’au moins 0,1 mM dans l’hydrogel,
- addition d’ions zinc au polysaccharide réticulé, au polysaccharide non réticulé, ou à leur mélange, en une quantité suffisante pour atteindre une concentration en ions zinc d’au plus 20 mM dans l’hydrogel, l’addition des ions citrates et des ions zinc étant réalisée dans un ratio molaire [ions citrates] / [ions zinc] allant de 1 à 20, et à la condition que l’addition des ions zinc ne soit pas réalisée avant l’addition des ions citrates lorsque la mise en contact avec la solution physiologique saline, de préférence tamponnée, est réalisée avant l’addition des ions citrates ;
(2) stérilisation, de préférence à la chaleur, de l’hydrogel obtenu à l’issue de l’étape (1) pour obtenir un hydrogel stérile comprenant un polysaccharide réticulé, un polysaccharide non réticulé ou leur mélange et comprenant en outre des ions zinc.
2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel l’addition des ions citrates et l’addition des ions zinc sont réalisées après l’étape de mise en contact avec la solution physiologique saline, de préférence tamponnée.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 dans lequel l’addition des ions citrates et l’addition des ions zinc sont réalisées de manière concomitante, les ions citrates et les ions zinc étant ajoutés sous forme d’une solution comprenant des ions zinc et des ions citrates.
4. Procédé selon la revendication 3 dans lequel la solution est une solution physiologique saline tamponnée, de préférence un tampon phosphate, comprenant des ions zinc et des ions citrates.
5. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 dans lequel l’étape (1) de préparation d’un hydrogel comprend une ou plusieurs des étapes conventionnelles suivantes :
- Ajustement du pH;
Dilution;
Purification;
- Addition d’au moins un composant additionnel;
Extrusion.
6. Procédé de préparation d’un hydrogel stérile comprenant un polysaccharide réticulé et éventuellement un polysaccharide non réticulé et comprenant en outre des ions zinc, le procédé comprenant les étapes suivantes :
(0) préparation d’un polysaccharide réticulé à partir d’un milieu réactionnel de réticulation comprenant un ou plusieurs polysaccharide(s), un ou plusieurs agent(s) réticulant, un solvant et des ions zinc en une quantité permettant la préparation d’un hydrogel comprenant au plus 20 mM d’ions zinc ;
(1) préparation d’un hydrogel à partir du polysaccharide réticulé obtenu à l’issue de l’étape (0) et éventuellement d’un polysaccharide non réticulé, la préparation de l’hydrogel comprenant une étape de mise en contact du polysaccharide réticulé avec une solution physiologique saline, de préférence tamponnée comprenant des sels de phosphate ou de carbonate ou de sulfate ou leurs mélanges ;
(2) stérilisation, de préférence à la chaleur, de l’hydrogel obtenu à l’issue de l’étape (1) pour obtenir un hydrogel stérile ; dans lequel :
- le milieu réactionnel de réticulation comprend en outre des ions citrates en une quantité suffisante pour atteindre une concentration en ions citrate d’au moins 0,1 mM dans l’hydrogel, le ratio molaire [ions citrates présents dans le milieu réactionnel] / [ions zinc présents dans le milieu réactionnel] allant de 1 à 20 ; ou - l’étape (1) comprend en outre, avant l’étape de mise en contact du polysaccharide réticulé avec la solution physiologique saline, de préférence tamponnée, une étape d’addition d’ions citrates en une quantité suffisante pour atteindre une concentration en ions citrates d’au moins 0,1 mM dans l’hydrogel, le ratio molaire [ions citrates ajoutés] / [ions zinc présents dans le milieu réactionnel] allant de 1 à 20 ; ou
- la solution physiologique saline, de préférence tamponnée, comprend en outre des ions citrates en une quantité suffisante pour atteindre une concentration en ions citrates d’au moins 0,1 mM dans l’hydrogel, le ratio molaire [ions citrates présents dans la solution physiologique saline, de préférence tamponnée] / [ions zinc présents dans le milieu réactionnel] allant de 1 à 20.
7. Procédé de préparation d’un hydrogel stérile comprenant un polysaccharide réticulé et éventuellement un polysaccharide non réticulé et comprenant en outre des ions zinc, le procédé comprenant les étapes suivantes :
(0') préparation d’un milieu réactionnel de réticulation comprenant :
- un ou plusieurs polysaccharide(s),
- un ou plusieurs agent(s) réticulant,
- des ions citrates en une quantité suffisante pour atteindre une concentration en ions citrate d’au moins 0,1 mM dans l’hydrogel,
- des ions zinc en une quantité permettant la préparation d’un hydrogel comprenant au plus 20 mM d’ions zinc, et
- une solution physiologique saline, de préférence tamponnée, comprenant des sels de phosphate ou de carbonate ou de sulfate ou leurs mélanges ; le ratio molaire [ions citrates présents dans le milieu réactionnel] / [ions zinc présents dans le milieu réactionnel] allant de 1 à 20, la préparation du milieu réactionnel étant réalisée par addition des ions citrates avant tout contact des ions zinc avec la solution physiologique saline ;
(0) préparation d’un polysaccharide réticulé à partir du milieu réactionnel obtenu à l’issue de l’étape (0’) ;
(1) préparation d’un hydrogel à partir du polysaccharide réticulé obtenu à l’issue de l’étape (0) et éventuellement d’un polysaccharide non réticulé ;
(2) stérilisation, de préférence à la chaleur, de l’hydrogel obtenu à l’issue de l’étape (1) pour obtenir un hydrogel stérile.
8. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7 dans lequel le polysaccharide est un acide hyaluronique.
9. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8 dans lequel la solution physiologique saline est une solution physiologique saline tamponnée comprenant des sels de phosphate, de préférence un tampon phosphate.
10. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 9 dans lequel l’étape (1) comprend en outre une étape d’addition d’un agent anesthésiant.
11. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 10 comprenant en outre une étape de conditionnement de l’hydrogel, de préférence dans un dispositif d’injection, après l’étape (1) et avant l’étape (2).
12. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 11 dans lequel la stérilisation est une stérilisation à la chaleur, de préférence réalisée en autoclave.
13. Hydrogel stérile comprenant un polysaccharide réticulé, un polysaccharide non réticulé ou leur mélange, en particulier un acide hyaluronique réticulé, un acide hyaluronique non réticulé ou leur mélange, et comprenant en outre du zinc et des ions citrates obtenu par le procédé selon l’une des revendications 1 à 12.
14. Hydrogel selon la revendication 13 comprenant en outre un agent anesthésiant.
15. Utilisation des ions citrates pour protéger un hydrogel comprenant un polysaccharide réticulé, un polysaccharide non réticulé ou leur mélange, éventuellement un agent anesthésiant, et en outre des ions zinc, de la dégradation de ses propriétés rhéologiques lors de sa stérilisation, de préférence par la chaleur.
16. Utilisation des ions citrates pour préserver la stabilité dans le temps des propriétés rhéologiques d’un hydrogel comprenant un polysaccharide réticulé, un polysaccharide non réticulé ou leur mélange, éventuellement un agent anesthésiant, et en outre des ions zinc.
17. Utilisation d’une solution comprenant des ions zinc et des ions citrates pour protéger un hydrogel comprenant un polysaccharide réticulé et/ou non réticulé, éventuellement un agent anesthésiant, de la dégradation de ses propriétés rhéologiques lors de sa stérilisation, de préférence par la chaleur.
18. Utilisation d’une solution comprenant des ions zinc et des ions citrates pour préserver la stabilité dans le temps d’un hydrogel comprenant un polysaccharide réticulé, un polysaccharide non réticulé ou leur mélange et éventuellement un agent anesthésiant.
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