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WO2008001888A1 - Method for pre-treatment of serum for analysis of sugar chain - Google Patents

Method for pre-treatment of serum for analysis of sugar chain Download PDF

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Publication number
WO2008001888A1
WO2008001888A1 PCT/JP2007/063100 JP2007063100W WO2008001888A1 WO 2008001888 A1 WO2008001888 A1 WO 2008001888A1 JP 2007063100 W JP2007063100 W JP 2007063100W WO 2008001888 A1 WO2008001888 A1 WO 2008001888A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
sugar chain
formula
sample
enzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2007/063100
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shin-Ichiro Nishimura
Yasuro Shinohara
Yoshiaki Miura
Jun-Ichi Furukawa
Yoko Kita
Akio Takimoto
Mika Nakano
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hokkaido University NUC
Shionogi and Co Ltd
Original Assignee
Hokkaido University NUC
Shionogi and Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hokkaido University NUC, Shionogi and Co Ltd filed Critical Hokkaido University NUC
Priority to EP07767887A priority Critical patent/EP2042511A4/en
Priority to US12/308,936 priority patent/US8058409B2/en
Priority to JP2008522650A priority patent/JP5192376B2/ja
Publication of WO2008001888A1 publication Critical patent/WO2008001888A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C309/00—Sulfonic acids; Halides, esters, or anhydrides thereof
    • C07C309/01—Sulfonic acids
    • C07C309/02—Sulfonic acids having sulfo groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C309/03—Sulfonic acids having sulfo groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C07C309/13—Sulfonic acids having sulfo groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton containing nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the carbon skeleton
    • C07C309/14—Sulfonic acids having sulfo groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton containing nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the carbon skeleton containing amino groups bound to the carbon skeleton
    • C07C309/15—Sulfonic acids having sulfo groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton containing nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the carbon skeleton containing amino groups bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of at least one of the amino groups being part of any of the groups, X being a hetero atom, Y being any atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/66—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood sugars, e.g. galactose

Definitions

  • the present invention relates to a reagent for treating a sample isolated from a living body and a pretreatment method prior to the sugar chain structure analysis.
  • N-glycan free enzymes such as peptide N-glycosidase F (PNGaseF)
  • PNGaseF peptide N-glycosidase F
  • a method of cleaving hydrazine and a method of chemically dehydrating hydrazine There are known a method of cleaving hydrazine and a method of chemically dehydrating hydrazine.
  • an enzymatic method can be used more favorably than a chemical method because it can be cut out without being affected by the size and structure of the sugar chain moiety in the substrate, but the sugar protein is complex.
  • the sugar chain part is surrounded by the secondary and Z or tertiary structure of the protein, and as a result, enzymatic digestion by N-type sugar chain free enzymes is often prevented.
  • Reductive alkylation can be an important pretreatment to simplify the complex tertiary structure of proteins and promote enzymatic digestion.
  • urea and a surfactant such as sodium dodecyl sulfate (SDS)
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • Fragmentation of the protein portion with a proteolytic enzyme such as trypsin is also useful as a pretreatment. Often used in combination with the above reduced alkyl group, urea And residual Z or SDS prevents trypsin digestion.
  • ALS acid-decomposable surfactant
  • a sulfonate suitable for use in the present invention is a kind of surfactant, and its use as a detergent is already known (see Patent Document 2), but it functions as a protein denaturant and will be described later. It is totally known about the action that promotes reductive alkylation and digestion by proteolytic enzymes, and can efficiently release sugar chains from sugar proteins!
  • Patent Document 1 PCT International Publication No. WO03Z102225
  • Patent Document 2 PCT International Publication No. WO03Z082811
  • a newly developed protein solubilizer, ALS is characterized by being easily decomposed by acid treatment after enzymatic digestion and easily removed.
  • the ketone body produced by the acid treatment hinders the analysis of the sugar chain.
  • An object of the present invention is to provide a new protein solubilizing agent that does not impair the excellent solubilizing ability of ALS, is stable to acids, and does not hinder sugar chain analysis.
  • Another object of the present invention is to provide a pretreatment method for analyzing a sugar chain of a glycoprotein using the protein solubilizer. Means for solving the problem
  • the present inventors have selected a compound that is stable to acid, such as ALS analogs, and various combinations of pretreatment methods such as reductive alkylation and digestion with proteolytic enzymes, We searched for a substance that can efficiently release sugar chains.
  • Z is an oxygen atom or sulfur atom
  • X is an oxygen atom or —N (R 3 ) —
  • R 3 is a hydrogen atom or lower alkyl
  • R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom or hydroxy
  • M represents a monovalent cation
  • m represents an integer of 6 to 16
  • n represents an integer of 3 to 5.
  • the present invention has been completed by confirming that the sulfonate represented by the above formula can meet the above-mentioned purpose and can be widely used as a protein solubilizer.
  • the sulfonate of the present invention is useful as a protein solubilizing agent, and particularly when analyzing a sugar chain in a glycoprotein derived from a living body, a reduced alkyl group and a proteolytic enzyme are used in the first step. By performing digestion, etc., it is possible to cut out the sugar chain part efficiently with the sample strength.
  • FIG. 1 is an HPLC chromatogram when pretreated under the condition (2) in Example 3.
  • FIG. 2 is a graph comparing the amounts of total sugar chains cut out when pretreated under the conditions (1) to) of Example 3.
  • FIG. 3 is a graph showing the relative amount ratio of individual sugar chains obtained by pretreatment under conditions (3), (6), and (7).
  • FIG. 5 Draft comparing the effects of the combination of solubilizer HSD, PHL or PHM with reductive alkylation and proteolytic enzyme (trypsin) for each sugar chain peak. See Table 1 for STD, LSTD, MSTD, HSD, PHL, PHL + RA and PHM + RA.
  • the protein solubilizer of the present invention has the following formula (I)
  • the sulfonate represented by these is included.
  • Z is an oxygen atom or a sulfur atom
  • X is an oxygen atom or —N (R 3 ) —
  • R 3 is a hydrogen atom or lower alkyl
  • R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom or hydroxy
  • M represents a monovalent cation
  • m represents an integer of 6 to 16
  • n represents an integer of 3 to 5, respectively.
  • Z is an oxygen atom
  • X is an oxygen atom or —NH—
  • — (CI ⁇ R 2 ) !! — is —CH—CH (OH)
  • a compound having -CH is preferred.
  • a compound of 8 to 14 is preferably used.
  • lower alkyl includes straight or branched alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms, such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, Examples include isopentyl and n-hexyl.
  • monovalent cations include alkali metal cations, and examples include sodium, lithium, and potassium.
  • amide-type PHL and PHM are preferably combined with reductive alkylation or pretreatment with a proteolytic enzyme, which will be described later, if necessary.
  • a proteolytic enzyme which will be described later, if necessary.
  • the sugar chain analysis of the glycoprotein can be suitably carried out.
  • an ester type compound (Z and oxygen are oxygen atoms) is exemplified by For example, it can be produced according to or according to the method described in PCT International Publication No. WO03Z82811.
  • HSD sulfonic acid sodium salt
  • an amide type compound (Z is an oxygen atom, X is NH) can be easily prepared, for example, according to the following scheme.
  • these sulfonates are not limited, but are usually used at a concentration of 0.001% to 10% in a sample solution. In the case of HSD, it is usually 0.4 to 0.004%, 0.4 to 0.004% in the case of PHL, and 0.4 to 0.0004% in the case of PHM.
  • the protein solubilizer of the present invention can be added and used when carrying out reduced alkylation of a glycoprotein sample.
  • DTT dithiothreitol
  • IAA odoacetamide
  • room temperature 60 ° C. 30 minutes to 1, 2 hours anti It can be done in response.
  • the reducing agent for example, 2-mercaptoethanol, tri-n-butylphosphine
  • odoacetic acid odomethane, ethylethylene, 4-butylpyridine and the like can be used.
  • the protein solubilizer of the present invention can also be used when a sample is pretreated with a proteolytic enzyme.
  • the proteolytic enzyme to be used is not limited unless the sugar chain portion of the sample is changed. Proteins can be fragmented using peptidases (Asp-N, Glu-C, Lys-C), etc.
  • the protein solubilizer of the present invention also exhibits a promoting effect in the step of releasing sugar chains such as glycoproteins with an N-type sugar chain releasing enzyme such as PNGaseF.
  • the protein soluble additive of the present invention added in the first treatment is used as it is, as shown in the following examples. be able to.
  • the protein solubilizer of the present invention is not limited to glycoproteins, and can be widely applied to hydrolysis of protein samples.
  • trypsin, chymotrypsin, endopeptidase (Asp-N, Glu-C) described above. , Lys-C) etc. can be expected to promote reaction by adding calorie during digestion of protein samples.
  • solubilized protein can be easily prepared by adding the protein solubilizing agent of the present invention.
  • the soluble protein obtained in this way is not limited to the hydrolysis reaction described above, but can be suitably subjected to reductive alkylation and other arbitrary reactions.
  • sample pretreatment conditions (protocol) according to the present invention are exemplified below, but the present invention is by no means limited thereto.
  • Serum 20 ⁇ L was diluted with NH 4 HCO solution to a total volume of 50 L (no denaturant added).
  • the enzyme reaction was stopped by cupping followed by heating at 80 ° C for 15 minutes.
  • the final volume was 50 ⁇ .
  • the mixture was allowed to stand at ° C for 30 minutes.
  • IAA was added to a final concentration of 15 mM, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour in the dark. Thereafter, 400 U trypsin was added and incubated at 37 ° C for 1 hour, followed by heating at 80 ° C for 15 minutes to stop the enzyme reaction.
  • the final volume was 50.
  • Figure 1 shows the chromatogram obtained under condition (2).
  • Fig. 2 shows a comparison (equivalent to the sum of products) (relative amount when the amount of sugar chain is 1 in condition (1)). Due to differences in digestion conditions, the amount of sugar chains released by PNGaseF varied significantly.
  • the trypsin treatment (Condition 2) improved the cleavage efficiency by ⁇ 88%, and the combined use of the reduced alkyl group treatment [Condition (3)] showed an improvement of the cleavage efficiency by ⁇ 127%.
  • PNGaseF digestion of serum glycoprotein was performed after pretreatment under the following three conditions.
  • the protein solubilizer of the present invention functions as a protein denaturant and exhibits a reaction promoting effect when added during various enzyme digestions.
  • the pretreatment additive for sugar chain analysis is effective in promoting the reaction in other pretreatments in addition to cleaving the sugar chain with the N-type sugar chain releasing enzyme. As extremely useful.

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Description

明 細 書
糖鎖分析用血清前処理方法
技術分野
[0001] 自然界に広く分布している複合糖質の糖鎖は生体内の重要な構成成分であり、細 胞間の相互作用に深く関わっていることが明らかにされつつある。このため、糖鎖構 造を微量解析する技術が多く開発されている。本発明は、これら糖鎖構造解析に先 立って、生体から単離された試料を処理するための試薬、および前処理の方法に関 する。
背景技術
[0002] 複合糖質の糖鎖分析においては、まずタンパク質力 糖鎖を切り出す必要があり、 これには N型糖鎖遊離酵素、例えばペプチド N-グリコシダーゼ F (PNGaseF)で酵 素的に糖鎖を切断する方法と化学的に加ヒドラジン分解する方法とが知られている。 一般には、酵素的方法は基質中の糖鎖部分の大きさや構造に影響されることなく 糖鎖の切り出しが可能であるため、化学的方法よりも好適に用いられるが、糖タンパ ク質は複雑多様であり、糖鎖部分がタンパク質の二次的および Zまたは三次的構造 で囲まれている結果、 N型糖鎖遊離酵素による酵素消化が妨げられる場合も少なく ない。
[0003] そこで、 N型糖鎖遊離酵素による消化の効率を改善する目的で、還元剤や、界面 活性剤若しくはタンパク質分解酵素により、またはこれらを適宜組み合わせて試料を 前処理する方法が種々提案されて！ヽる。
還元アルキル化はタンパク質の複雑な三次的構造を単純化し酵素消化を促進する ための重要な前処理となり得る。この場合に、尿素および界面活性剤、例えばドデシ ル硫酸ナトリウム（SDS)を溶液中に添加しタンパク質の可溶ィ匕を促進することが行わ れる。しかしながら、尿素および Zまたは SDSの除去が十分でないと続く質量分析に お!、て MSシグナルが低下することが知られて!/、る。
タンパク質分解酵素、例えばトリプシンによるタンパク質部分の断片化も前処理とし て有用である。上記の還元アルキルィ匕と組み合わせて利用されることが多いが、尿素 および Zまたは SDSが残存するとトリプシン消化を妨げる。
[0004] 最近、尿素や SDSに代わる添加剤として酸分解性界面活性剤 (ALS)が新しく開 発された (特許文献 1参照)。このものをタンパク質可溶化剤として添加すると、トリプ シンや PNGaseFによる消化を促進する効果を示し、また消化反応が完了した後は 酸性条件下で分解できるのでその後の質量分析が妨害されることはない。既に下記 のスルホン酸塩 (ALS— I)が「ラピジエスト (RapiGest)SF」の商品名で製品化されて！/ヽ る。
Figure imgf000003_0001
他方、本発明で好適に使用されるスルホン酸塩は界面活性剤の一種であり、洗剤 としての用途が既に知られている (特許文献 2参照）が、タンパク質の変性剤として機 能し、後述する還元アルキル化やタンパク質分解酵素による消化を促進し、糖タンパ ク質から糖鎖を効率よく遊離させ得る作用につ 、ては全く知られて 、な!、。
特許文献 1： PCT国際公開公報 WO03Z102225号公報
特許文献 2： PCT国際公開公報 WO03Z082811号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 新しく開発されたタンパク質可溶化剤 ALSは、酵素消化が終了した後は酸処理で 容易に分解され、簡単に除去できる点が特徴である。しかしながら、検出限界を拡げ るために糖鎖を例えばアミノビリジルイ匕してラベルイ匕しその解析を行おうとする場合に は、当該酸処理により生じるケトン体が糖鎖解析上の妨げとなる。
本発明は、 ALSの優れた可溶化能を損なわず、かつ、酸にも安定で糖鎖解析上妨 げとならな 、新たなタンパク質可溶化剤を提供することを目的とする。
本発明の他の目的は、当該タンパク質可溶化剤を利用して、糖タンパク質の糖鎖 解析のための前処理方法を提供することである。 課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、 ALSの類縁体力ゝら酸に安定な化合物を選択し、還元アルキル化や タンパク質分解酵素による消化等の前処理法との組み合わせを種々検討して、糖タ ンパク質力 糖鎖を効率よく遊離させ得るものを探索した。
[0007] その結果、下式 (I)
[化 2]
Figure imgf000004_0001
(式中、 Zは酸素原子または硫黄原子; Xは酸素原子または— N(R3)—； R3は水素原 子または低級アルキル; R1および R2はそれぞれ独立して、水素原子またはヒドロキシ ； Mは 1価のカチオン； mは 6〜16の整数； nは 3〜5の整数を表す。 )
で表されるスルホン酸塩が上記目的にかなうこと、さらには広くタンパク質可溶化剤と して利用できることを確認して本発明を完成した。
発明の効果
[0008] 本発明のスルホン酸塩はタンパク質可溶化剤として有用であり、特に生体由来の糖 タンパク質中の糖鎖解析をする場合、最初の工程で本剤を用いて還元アルキルィ匕 やタンパク質分解酵素による消化等を実施することにより、試料力も糖鎖部分を効率 よく切り出すことができる。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1]実施例 3の条件 (2)で前処理した場合の HPLCクロマトグラムである。
[図 2]実施例 3の条件 (1)〜 )で前処理した場合に切り出された全糖鎖量を比較した グラフである。
[図 3]条件 (3)、（6)、（7)による前処理により得られた個々の糖鎖の相対的量比を表した グラフである。
[図 4]可溶化剤 HSD (ラウリン酸 2 ヒドロキシ— 3—スルホプロピル）、 PHL (2 ヒド 口キシ一 3 ラウルアミド 1 プロパンスルホン酸ナトリウム）または PHM (2-ヒドロ キシ— 3 ミリストアミド 1 プロパンスルホン酸ナトリウム）と、還元アルキル化およ びタンパク質分解酵素処理を組み合わせた場合に遊離される全糖鎖量を比較した グラフである。
[図 5]糖鎖ピークごとに、可溶化剤 HSD、 PHLまたは PHMと、還元アルキル化およ びタンパク質分解酵素（トリプシン）による処理との組み合わせの影響を比較したダラ フである。 STD、 LSTD、 MSTD、 HSD、 PHL、 PHL+RAぉょびPHM+RAは表 1を参照。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 本発明のタンパク質可溶化剤は下式 (I)
[化 3]
Figure imgf000005_0001
で表されるスルホン酸塩を含む。
式中、 Zは酸素原子または硫黄原子; Xは酸素原子または— N(R3)—； R3は水素原 子または低級アルキル; R1および R2はそれぞれ独立して、水素原子またはヒドロキシ ； Mは 1価のカチオン； mは 6〜16の整数； nは 3〜5の整数をそれぞれ表す。中でも、 Zが酸素原子、 Xが酸素原子または— NH―、—（CI^R2) !!—が— CH— CH (OH)
2
-CH一である化合物が好ましぐ mは 8〜14の化合物が好適に使用される。
2
ここで、低級アルキルとは直鎖若しくは分枝鎖を有する炭素数 1から 6のアルキル基 を包含し、メチル、ェチル、プロピル、イソプロピル、 n—ブチル、 sec—ブチル、 tert ーブチル、 n—ペンチル、イソペンチル、 n—へキシル等が例示される。また、 1価の カチオンとしてはアルカリ金属カチオンを包含し、ナトリウム、リチウム、カリウム等が例 示される。
[0011] 本発明により提供されるタンパク質可溶化剤としては、アミド型の PHLおよび PHM が好ましぐ要すれば後述する還元アルキル化やタンパク質分解酵素による前処理 等と適宜組み合わせ、 N型糖鎖遊離酵素で処理すれば、糖タンパク質の糖鎖解析を 好適に実施することができる。
[0012] 当該スルホン酸塩 (I)中、エステル型 (Zおよび酸素が酸素原子）の化合物は、例え ば PCT国際公開公報 WO03Z82811号に記載された方法に従い、または準じて製 造することができる。
[0013] また、例えば下記のスルホン酸ナトリウム塩 (HSD)は市販品として入手することもで きる。
[化 4]
Figure imgf000006_0001
ラウリン酸 2-ヒドロキシ- 3-スルホプロピル（HSD)
[0014] また、アミド型化合物 (Zが酸素原子、 Xが NH)は、例えば下式スキームに従って容 易に調製することができる。
[化 5]
Figure imgf000006_0002
低級アルキルアミド (R3が低級アルキル基)型の場合は上記アンモニア水（NH 3 aq) に代えて低級アルキルァミンと反応させればょ ヽ。生成物はエステル型の場合と同様 に、通常、再結晶により精製することができる。
[0015] これらスルホン酸塩はタンパク質可溶化剤として使用する場合、制限はされないが 、通常、試料溶液中 0.001 %から 10 %の濃度で使用される。 HSDの場合は、通常、 0.4〜0.004%、 PHLの場合は 0.4〜0.004 %、 PHMの場合は 0.4〜0.0004 %で使用 することができる。
本発明のタンパク質可溶化剤は、糖タンパク質試料の還元アルキルィ匕を実施する 際に添加して使用することができる。還元アルキルィ匕について特に制限はなぐ例え ば、後記実施例に記載のとおり、還元剤としてはジチオトレイトール (DTT)、アルキ ル化剤としてはョード酢酸アミド (IAA)を用い、室温〜 60°Cで 30分から 1、 2時間反 応させて実施することができる。その他、還元剤としては例えば、 2-メルカプトエタノ ール、トリ- n-ブチルホスフィン、アルキル化剤としてはョード酢酸、ョードメタン、ェチ レンィミン、 4-ビュルピリジン等を使用することができる。
[0016] 試料をタンパク質分解酵素で前処理する場合にも本発明のタンパク質可溶化剤を 用いることができる。特に、糖タンパク質の糖鎖解析を目的とする場合は、試料の糖 鎖部分が変化しなければ使用するタンパク質分解酵素に制限はなぐ例えば後記実 施例で使用したトリプシンの他、キモトリブシン、エンドべプチダーゼ (Asp-N、 Glu-C 、 Lys-C)等を使用してタンパク質を断片化できる。
本発明のタンパク質可溶化剤はさらに、 N型糖鎖遊離酵素、例えば PNGaseFによ り糖タンパク質力ゝら糖鎖を遊離させる工程においても、促進効果を発揮する。上記の 還元アルキルィ匕ゃタンパク質分解酵素による前処理と組み合わせて行う場合には、 以下の実施例に示す通り、最初の処理において添加した本発明のタンパク質可溶ィ匕 剤をそのまま継続して使用することができる。
[0017] なお、本発明のタンパク質可溶化剤は糖タンパク質に限らず、広くタンパク質試料 の加水分解に応用可能であり、例えば、上記のトリプシン、キモトリブシン、エンドべ プチダーゼ (Asp-N、 Glu-C, Lys-C)等を用いるタンパク質試料の消化の際に添カロ することにより、反応促進効果が期待できる。
また、本発明のタンパク質可溶化剤を添加することにより、可溶化されたタンパク質 を容易に調製することができる。こうして得られた可溶ィ匕タンパク質は、上記の加水分 解反応に限らず、還元アルキル化やその他任意の反応を好適に実施することができ る。
[0018] 本発明による試料の前処理条件 (プロトコール)を以下に例示するが、本発明は決 してこれに限定されるものではない。 典聊前麵 3 令血清の前処理プロトコ一ル <*
0.04% PHL 溶液
( 最終濃度 0,02·½(νϊ/ν) )
Figure imgf000008_0001
上記のスキーム中に示したとおり、 0.4%HSD溶液を 0.04%PHL溶液で置き換えて ちょい。
実施例
実施例 1 アミド型可溶剤 PHLの合成
[化 7]
Figure imgf000008_0002
PHL
3 クロ口一 2 ヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリウム（1.97 g、 10 mmol)を 12. 5% アンモニア水溶液に溶解し室温で終夜攪拌した。反応溶液をエバポレーターで濃縮 することでアンモニアを除去し、 3 -ァミノ 2 ヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリウ ムを得た。 3 ァミノ一 2 ヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリウム（177 mg、 1 mmol) を水（10 mL)に溶解し、 NaHCO 3 (84 mg、 1 mmol)および塩化ラウロイル（231 μ L、 1 mmol)をカ卩ぇ室温で 2時間反応した。反応終了後、反応液にヮコーゲル 50C18 (2 cm3)をカ卩えることでィ匕合物を吸着させ、カラムに充填したのち水 50mLでよく洗浄し、 メタノール（10 mL)で溶出した。溶出液を冷却することにより PHL (2-ヒドロキシ -3-ラ ウルアミド- 1-プロパンスルホン酸ナトリウム； 1- Propanesulfonic acid, 2- hydroxy- 3- lau ramido)を結晶として得た。 MALDI— TOF— MSによる解析により、目的物の [M + Na]+ィォンをm/z : 381. 75に観柳』した。
[0020] 実施例 2 アミド型可溶剤 PHMの合成
[化 8]
Figure imgf000009_0001
塩ィ匕ラウロイルのかわりに塩ィ匕ミリストイルをもち 、て上記と同様の方法により反応を おこなうことで PHM (2-ヒドロキシ- 3-ミリストアミド- 1-プロパンスルホン酸ナトリウム； 1- Propanesulfonic acid, 2- hydroxy- 3- myristamido)を調製した。 MALDI— TOF— M Sによる解析により、目的物の [M+H]+イオンを mZz:409. 84に観測した。
[0021] 実施例 3 HSDによる糖鎖遊離促進効果
本発明のタンパク質可溶化剤 HSDの効果を確認するため、還元アルキル化 (DTT および IAA)およびタンパク質分解酵素（トリプシン）による消化と組み合わせて、 PN GaseFによる N型糖鎖の切り出し効率に及ぼす影響を比較した。
具体的には以下の条件 (1)から (7)について、それぞれ n= 3とし、記載した方法で血 清を処理して遊離する糖鎖を比較した。
[0022] 条件 (1)
血清 20 μ Lを NH HCO溶液で希釈し、全量を 50 Lとした (変性剤の添加無し)。
4 3
条件 (2)
血清 20 μ Lを NH HCO溶液で希釈し、 400 Uトリプシンをカ卩えて 37°Cで 1時間イン
4 3
キュペートし、続いて 80°Cで 15分間加熱することにより、酵素反応を停止した。最終 液量 50 μしとした。
条件 (3) 血清 20 /z Lを NH HCO溶液で希釈し、 DTTを終濃度 lOmMとなるように加え、 60
4 3
°Cで 30分間静置した.次に、 IAAを終濃度 15mMとなるように加え、遮光下で室温下 に 1時間放置した。その後、 400 Uトリプシンをカ卩えて 37°Cで 1時間インキュベートし、 続いて 80°Cで 15分間加熱することにより、酵素反応を停止した。最終液量を 50 しと した。
[0023] 条件 (4)
血清 50 μ Lを 2% SDS及び 2% 2—メルカプトエタノールを含む等量のトリス塩酸緩衝 液で希釈し、 95°Cで 5分間静置した。次に、等量の 8 %トリトン Xを加えた。
条件 (5)
血清 20 μ Lを NH HCO溶液で希釈し、 ALS— I及び DTTをそれぞれ終濃度 0.1%
4 3
及び 10mMとなるようにカ卩えて、 60°Cで 30分間静置した。次に、 IAAを終濃度 15 mMと なるように加え、遮光下で室温下に 1時間放置した。最終液量を 50 μしとした。
条件 (6)
血清 20 μ Lを NH HCO溶液で希釈し、 HSD及び DTTをそれぞれ終濃度 0.2 %
4 3
及び 10 mMとなるようにカ卩えて、 60°Cで 30分間静置した。次に、 IAAを終濃度 15mMと なるように加え、遮光下で室温下に 1時間放置した。最終液量を 50 μしとした。
[0024] 条件 (7)
血清 20 μ Lを NH HCO溶液で希釈し、 HSD及び DTTをそれぞれ終濃度 0.2 %
4 3
及び 10 mMとなるように加え、 60°Cで 30分間静置した.次に、 IAAを終濃度 15 mMと なるように加え，遮光下で室温下に 1時間放置した.その後、 400Uトリプシンを加え、 3 7°Cで 1時間インキュベートし、続いて 80°Cで 15分間加熱することにより酵素反応を停 止した。最終液量を 50 しとした。
上記の条件 (1)から (7)の方法で血清を処理した後、それぞれに 2 U〔条件 (4)のみ 5 U]の PNGaseFをカ卩えて 37°Cで 24時間インキュベートし、糖鎖切り出し反応を行った 。切り出された糖鎖について、プロナーゼ消化をして力 カラムで精製し 2-アミノビリ ジンによる蛍光標識を行った後、 ODSカラムを用いて HPLC分析を行った。
条件 (2)で得られたクロマトグラムを図 1に示す。
[0025] 条件 (1)〜 )で前処理した試料につき、切り出された全糖鎖量 (ピーク #1〜#14の面 積の総和に相当）の比較〔条件 (1)の場合の糖鎖量を 1としたときの、相対量〕を図 2に 示す。消化条件の違いにより、 PNGaseFによって遊離される糖鎖の量は顕著に異な つた。トリプシン処理 (条件 2)は切断効率を〜 88%改善し、さらに還元アルキルィ匕処理 を併用する〔条件 (3)〕ことで〜 127%の切断効率の改善を認めた。タンパク質可溶化剤 として SDS〔条件 (4)〕、 ALS— I〔条件 (5)〕、 HSD〔条件 (6)〕を用い、還元アルキルィ匕 処理と併用した場合の切断効率の改善は、それぞれ〜 63 %、〜75 %、〜104 %であり 可溶化剤の種類により消化効率は異なった。タンパク質可溶化剤としての有用性を 初めて評価した HSDは、検討した可溶化剤の中で最も効率的に糖鎖を遊離できるこ と力示された。更にトリプシン処理、還元アルキル化、 HSD処理を組み合わせる〔条 件 (7)〕ことで最大の切断効率 (〜134%の改善)を認めた。
[0026] 糖鎖遊離効率が高力つた条件 (3)、（6)、（7)の 3つの消化条件によって切り出される 糖鎖の定量的プロファイルを主要な 14個のピークについて比較した（図 3)。定量的 プロファイルは三者で比較的良く似た結果が得られた力 トリプシン処理をカ卩えな 、 場合〔条件 (6)〕、ピーク #5〜#14の相対値が低い傾向が認められたため、トリプシン消 化をカ卩えな 、場合には PNGaseFの基質となり難 、タンパク質が存在することが示唆 された。
[0027] 実施例 4 HSD、 PHLおよび PHMの比較
HSD、 PHLおよび PHMにっき、還元アルキル化（DTTおよび IAA)およびタンパ ク質分解酵素（トリプシン）による消化と組み合わせて、 PNGaseFによる N型糖鎖の 切り出し効率に及ぼす影響を検討した。具体的には、以下の 3つの条件で下処理し た後に血清糖タンパク質の PNGaseF消化を行った。
(1)血清 20 μ Lに、 4 μ Lの lOOmM重炭酸水素アンモ-ゥム (pH〜7.8)、 16 μ Lの可 溶化剤（0.4% HSDまたは 0.04% PHLまたは 0.004% PHM)を添加し、 60°Cで 30分静 し 7こ。
(2)血清 20 μ Lに、 4 μ Lの lOOmM重炭酸水素アンモ-ゥム (pH〜7.8)、 16 μ Lの可 溶化剤（0.04% PHLまたは 0.004% PHM)を添カ卩し、 8 μ Lの 50mM DTTを添カ卩し、 8 0°Cで 15分間過熱した。 5 μ Lの 135mMョードアセトアミド (IAA)水溶液を添カ卩し、遮 光下に室温で 1時間静置した。 [0028] (3)血清 20 μ Lに、 4 μ Lの lOOmM重炭酸水素アンモ-ゥム (pH〜7.8)、 16 μ Lの可 溶化剤（0.4% HSDまたは 0.04% PHLまたは 0.004% PHM)を添加し、 8 μ Lの 50mM DTTを添カ卩し、 80°Cで 15分間過熱した。 5 μ Lの 135mMョードアセトアミド (IAA)水 溶液を添加し、遮光下に室温で 1時間静置した。さらに、 5 Lのトリプシン (400 U)を 添加し、 37°Cで 1時間インキュベートした。トリプシンを 80°Cで 15分間加熱して失活し た。
上記 (1)〜(3)の各前処理を施した血清試料に、それぞれ 2 Uの PNGaseFを添加し 、 37°Cで 24時間インキュベートした後、 90°Cで 15分加熱することによって PNGaseFを 失活し、全ての試料の容量を lOOmM重炭酸アンモ-ゥムによって 200 μ Lに調整し た。
[0029] 各条件下の PNGaseF消化後、それぞれの試料のうち 50 μ Lをとり、 20 μ gのプロ ナーゼで消化した後に、糖鎖画分をバイオゲル P-4カラムで精製した。糖鎖は定法 に従いピリジルァミノ化し、セフアデックス G-15カラムにより過剰の試薬力も分離した 。試薬を減圧留去後に、 500 μ Lの Η Οに溶解し、そのうち 5 μ Lを HPLCに注入し
2
た。糖鎖の定量は確立されている逆相 HPLCにより行い、主要な 14個の糖鎖のピー クについて得られた面積から、各消化条件下における遊離効率（図 4)と定量的な糖 鎖プロファイル (図 5)を比較した (各 Ν=3)。
[0030] 各条件の一覧表を以下に示す。
[表 1]
Figure imgf000012_0001
DTT； ジチオトレイ ト";ル yp ; トリプシン 各 ιν=3 ！ AA - ョ""卜 酸尸ミ 卜 [0031] その結果、（1)、（2)、（3)いずれの消化条件下においても、可溶化剤の種類および濃 度の違いは消化効率、定量的プロファイルのいずれにも有意な差を与えな力つた。 従って、 PHLおよび PHMは、糖タンパク質の PNGaseF消化における遊離効率を、 少なくとも HSDと同等に改善することが明らかになった。
産業上の利用可能性
[0032] 本発明のタンパク質可溶化剤は、タンパク質変性剤として機能し、各種酵素消化に お!ヽて添加すると反応促進効果を発現する。特に糖タンパク質の糖鎖分析を行う場 合は、 N型糖鎖遊離酵素による糖鎖の切断の他、その他の前処理においても反応促 進効果を発揮するので、糖鎖分析の前処理添加剤として極めて有用である。

Claims

請求の範囲
一般式 (I) :
Figure imgf000014_0001
(式中、 Zは酸素原子または硫黄原子; Xは酸素原子または— N(R3)—； R3は水素原 子または低級アルキル; R1および R2はそれぞれ独立して、水素原子またはヒドロキシ ； Mは 1価のカチオン； mは 6〜16の整数； nは 3〜5の整数を表す。）
で示される塩を含有するタンパク質可溶化剤。
一般式 (I) :
[化 2]
Figure imgf000014_0002
(式中、 Z、 X、 R\ R2、 M、 m、および nは請求項 1と同じ。 )
で示される塩を含有するタンパク質可溶ィ匕剤の存在下で、試料を N型糖鎖遊離酵素 で処理する工程を含む、糖タンパク質の糖鎖遊離方法。
以下の工程：
1)一般式 (I) :
[化 3]
Figure imgf000014_0003
(式中、 Z、 X、 R\ R M、 m、および nは請求項 1と同じ。 )
で示される塩を含有するタンパク質可溶化剤の存在下、試料にっ 、て還元アルキル 化処理を行う工程、
2)タンパク質分解酵素で処理する工程、および
3) N型糖鎖遊離酵素で処理する工程、 を包含する糖タンパク質の糖鎖遊離方法。
[4] N型糖鎖遊離酵素としてペプチド N-グリコシダーゼ Fを用いる、請求項 2または 3に 記載の方法。
[5] 請求項 1に記載のタンパク質可溶化剤の存在下で、試料をタンパク質分解酵素で 処理するタンパク質の加水分解方法。
[6] タンパク質分解酵素として、トリプシン、キモトリブシン、リジルエンドべプチダーゼ、 エンドプロティナーゼ Glu-C、またはエンドプロティナーゼ Asp-Nを用いる、請求項 3 または 5に記載の方法。
[7] 請求項 1に記載のタンパク質可溶化剤の添カ卩により可溶化されたタンパク質を製造 する方法。
[8] 下式
[化 4]
Figure imgf000015_0001
または
[化 5]
Figure imgf000015_0002
で表されるスルホン酸ナトリウム塩。
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