WO2004020470A1

WO2004020470A1 - システインプロテアーゼ処理コラーゲンの製造方法およびシステインプロテアーゼ処理コラーゲン

Info

Publication number: WO2004020470A1
Application number: PCT/JP2003/002346
Authority: WO
Inventors: Koichi Morimoto; Ben'ichiro Tonomura; Takafumi Yoshikawa
Original assignee: TISSUE ENGINEERING INITIATIVE Co Ltd; Kindai University
Current assignee: TISSUE ENGINEERING INITIATIVE Co Ltd; Kindai University
Priority date: 2002-08-28
Filing date: 2003-02-28
Publication date: 2004-03-11
Anticipated expiration: 2005-02-28
Also published as: AU2003211379A8; AU2003211379A1; JPWO2004020470A1; JP4490268B2

Abstract

　本発明は、生体適合性に優れるとともに、保湿効果、止血力、細胞保持力に優れる、高機能なコラーゲンおよびその製造方法を提供することを課題とする。　本発明に係るシステインプロテアーゼ処理コラーゲンの製造方法は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンとシステインプロテアーゼとを接触させることを特徴としている。

Description

システィンプロテアーゼ処理コラーゲンの製造方法およびシスティンプロテア一ゼ処理コラーゲン技術分野

本発明は、コラーゲン、その製造方法おょぴその用途に関する。詳しくは、システィンプロテアーゼ処理コラーゲン、その製造方法おょぴその用途に関する。背景技術

動物において細胞間の結合組織や骨組織を構成する主なタンパク質であるコラ一ゲンは、化粧品、食品添加剤あるいは医療用材料などの分野において、広く利用されている。

このようなコラーゲン素材において求められる特性は、たとえば、組織再生、構築などにおける生体材料としての良好な機械的性質、生体適合性、生物学的分角早性、止血力などが挙げられる。このようなコラーゲンが発揮しうる特性に着目して、コラーゲンを含む材料として、たとえば、食品添加剤；化粧品材料；人工皮膚調製用の溶剤、止血スポンジ、骨再構成材料、軟部組織の充填材などの医療材料への適用が試みられている。

このようにコラーゲンは産業上非常に重要な生体材料となりつつあるが、その一方でさらなる生体との適合性、保湿性、止血力などの諸機能の向上が求められていた。

さらに、現在、広く利用されているコラーゲンは、子ゥシ、ブタなどの真皮または骨などから抽出精製したものが多い。し力し、たとえば、子ゥシなどの皮には毛や脂肪などが混在するためそれらを除去する前処理が必要であり、精製される酸可溶性コラーゲンの収量は 5 %程度と高くないこと、家畜間で感染し発病する原因物質を除去する工程、分析工程などが必要になってきているなど、その利用に際し、煩雑な操作が必要な場合もある。また、子ゥシの場合、 1頭から得られるコラーゲンの量が比較的少ないという課題もあった。このため、優れた機能を保持しつつ、さらに、家畜間の感染などに起因する煩雑な工程を要しない簡便な方法で生体材料等にも適用が可能で、しかも大量入手が可能なコラーゲンの出現も求められていた。

したがって、本発明は、上記のような背景技術に基づきなされたものであって、生体適合性に優れるとともに、保湿効果、止血力に優れ、また in vitroでの細胞 (胚）培養技術に優れた性質を有する、高機能なコラーゲンおよびその製造方法を提供することを課題とする。発明の開示

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究し、コラーゲンまたはァテロコラーゲンとシスティンプロテアーゼとを接触させて得られるコラーゲン（以下「システィンプロテアーゼ処理コラーゲン」ということがある。）力生体適合性に優れるとともに、保湿効果、止血力に優れることを見出し本発明を完成するに至つた。このようなシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンは、独特の網目状の会合体構造を有し、線維化が阻害されている。

すなわち、本発明の概要は以下のとおりである。

本発明に係るシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンの製造方法は、コラーゲンまたはァテロコラーゲンとシスティンプロテア一ゼとを接触させることを特徴としている。

本発明に係るシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンは、コラーゲンまたはァテロコラーゲンとシスティンプロテア一ゼとを接触して得られることを特徴としている。

前記コラーゲンまたはァテロコラーゲンは、魚類、鳥類またはほ乳類由来のコラーゲンまたはァテロコラーゲンであることが好ましく、魚類由来のコラーゲンまたはァテロコラーゲンであることがさらに好ましい。

前記システィンプロテアーゼ処理コラーゲンは、該システィンプロテアーゼ処理コラーゲン分子 1つが 3本のポリぺプチド鎖からなる 3重螺旋構造を有し、複数のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲン分子により網目状の会合体構造を形成していることが好ましい。前記システィンプロテアーゼ処理コラーゲンは、複数のシスティンプロテア一ゼ処理コラーゲン分子による 1本の線維への線維化が阻害されていることが好ましい。

前記システィンプロテアーゼ処理コラーゲンが熱により変性する温度は、 2 5 °C以上であることが好ましい。

本発明に係る化粧品は、前記システィンプロテアーゼ処理コラーゲンを含有することを特徴としている。

本発明に係る医療用材料は、前記システィンプロテアーゼ処理コラーゲンを含有することを特徴としている。

本発明に係る食品添加剤は、前記システィンプロテアーゼ処理コラーゲンを含有することを特徴としている。

本発明に係る細胞、組織または胚の培養材料は、.前記システィンプロテアーゼ処理コラーゲンを含有することを特徴としている。図面の簡単な説明

図 1は、ァテロコラーゲンの電子顕微鏡写真像（60,000倍、 50mmolZ L酢酸緩衝液、 H 4 . 0 ) の一例を示す写真である。

図 2は、システィンプロテアーゼ処理コラーゲンの電子顕微鏡写真像（60，000 倍、 50mmol/ L酢酸緩衝液、 H 4 . 0 ) の一例を示す写真である。

図 3は、ゼラチンの電子顕微鏡写真像（40,000倍）の一例を示す写真である。図 4は、細胞と細胞の間に存在する線維を形成する I型コラーゲンと細胞膜付近に存在する IV型コラーゲンの例を示す模式図である。図 4中、 1は細胞、 2 は細胞、 3は I型コラーゲン、 4は I V型コラーゲンを示す。

図 5は、精製したシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンの 7.5% S D Sポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析結果を示す写真である。

図 6は、システィンプロテアーゼ処理コラーゲンの α 1成分、 α 2成分およびァテロコラーゲンの _α 1成分、 a 2成分を、陽イオン交換クロマトグラフィーで測定したピークを示すチヤ一トである。

図 7は、システィンプロテアーゼ処理コラーゲン含有溶液の風乾後の光学顕微鏡による写真である。（倍率： 100倍）

図 8は、ァテ口コラーゲン含有溶液の風乾後の光学顕微鏡による写真である。 (倍率： 100倍）

図 9は、システィンプロテアーゼ処理コラーゲンの電子顕微鏡写真像（60,000 倍、 50mmolZ Lリン酸緩衝液、 H 7 . 4 ) の一例を示す写真である。

図 1 0は、ァテロコラーゲンの電子顕微鏡写真像（60,000倍、 50mmol/ Lリン酸緩衝液、 ρ Η 7 · 4 ) の一例を示す写真である。

図 1 1は、ァテロコラーゲンと、システィンプロテアーゼ処理コラーゲンのェタノールに対する相対溶解度を示すグラフである。

図 1 2は、ゥサギ耳おょぴ尾部由来についてのァテロコラーゲンおよびそのシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンの 5 % S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。

図 1 3は、ニヮトリ軟骨由来ァテロコラーゲンとそのシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンの 5 % S D S—ポリアクリルァミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。発明を実施するための最良の形態

本発明に係るシスティンプロテアーゼ処理コラーゲン（以下「C P—コラーゲン」と表記することがある。）は、コラーゲンまたはァテロコラーゲンとシスティンプロテアーゼとを接触させて得ることができる。

以下、本発明で用いるコラーゲン、ァテロコラーゲン、システィンプロテア一ゼ、システィンプロテアーゼ処理コラーゲン、その製造方法について詳説する。

コラーゲンまたはァテロコラーゲン

本発明で用いられるコラーゲンとしては、たとえば、ゥシ、ブタ、ゥサギなどのほ乳類、ニヮトリなどの鳥類などの、動物の真皮、腱、骨、筋膜など、あるいはサメ、コィ、マグロなど魚類の皮膚、鱗などに由来するコラーゲンが挙げられる。

また、本発明で用いられるァテロコラーゲンとしては、たとえば、ゥシ、ブタ、ゥサギなどのほ乳類、ニヮトリなどの鳥類などの、動物の真皮、腱、骨、筋膜な 5

ど、あるいはサメ、コィ、マグロなど魚類の皮膚、鱗などのコラーゲンが豊富に含まれる組織を原料とし、ペプシンなどにより、分子のァミノ末端おょぴカルポキシル末端のテロペプチド領域を除去したァテロコラーゲンが挙げられる。

これらのうちでは、魚類に由来するコラーゲンまたはァテロコラーゲンを好ましく用いることができる。また、コラーゲンとァテロコラーゲンのうちではァテ口コラーゲンを好ましく用いることができる。

魚類に由来するコラーゲンまたはァテロコラーゲンを用いることにより、原料を簡便、安全にかつ大量に入手可能であり、ヒトに対してより安全なシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンを得ることができる。

魚類のうちでは、具体的には、たとえば、キハダマグロなどのマグロ、コィ、ゥナギなどが挙げられ、これらのうちでは、マグロをより好ましく用いることができる。

このようなァテロコラーゲンのうちでは、熱による変性温度が、好ましくは 2 0 °C以上、より好ましくは 2 5 °C以上であるものが望ましい。

このため、魚類のうちでは、キハダマグロなどのマグロ、コィなどのァテロコラーゲンの熱変性温度が 2 5 °C以上のものを原料とすることが好ましい。このような原科を用いることにより、システィンプロテアーゼ処理コラーゲンの変性温度を、好ましくは 2 0 °C以上、より好ましくは 2 5 °C以上となるようにすることができ、たとえばタイに由来するコラーゲンの変性温度（2 0 °C程度）に比べて著しく変性温度の高いコラーゲンを得ることができる。したがって、マグロに由来するァテロコラーゲンの場合、貯蔵安定性、利用価値に優れる。さらに、マグ口の場合、漁獲量の多さ、捕獲期間の均一性などから、大量に、しかも、均一な性能でシスティンプロテアーゼ処理ァテロコラーゲンを量的に安定に得ることが可能である。

このような本発明で用いられるァテロコラーゲンは、図 1の電子顕微鏡で撮影 ( 6 0 0 0 0倍）した写真に示すように、通常、ァテロコラーゲン分子が寄り添つて 1本の線維状の会合体を形成している線維化ァテロコラーゲンであり、分子間の空間がほとんどない。なお、図 1中、ァテロコラーゲン分子は、電子顕微鏡像の縞模様をもつ部分である。また、前記ァテロコラーゲンは、通常、多種成分からなり、その構成比も、ァテロコラーゲンの原料により異なり、限定されない。

このようなァテロコラーゲンは、通常、成分、《 2成分、成分および γ 成分の少なくとも 4種の成分を含有している。なお、三重螺旋構造の構成単位である《 1成分、 2成分はともに左巻き螺旋の 1本鎖であり、その分子量が異なつており、 β成分は 2つの α成分が分子間で共有結合しているダイマー構造の成分であり、 γ成分は 3つの α成分が分子間で共有結合しているトリマー構造の成分である。ァテロコラーゲン分子は、通常、これらの成分が全体として右卷きの 3重螺旋構造を形成している。

α成分の分子量は、通常、好ましくは 90, 000〜 130， 000、成分の分子量は、通常、好ましくは 180， 000〜 260， 000、 γ成分の分子量は、通常、 270， 000〜 390， 000であることが望ましい。

なお、各成分は、公知の方法、たとえば、電気泳動などにより容易に分離させることができる。

本発明で用いられるコラーゲンまたはァテロコラーゲンは、通常、中性 ρΗの水溶液に不溶である。

このようなコラーゲンまたはァテロコラーゲンは、公知の方法により、動物または魚類から抽出可能である。たとえば、前記ほ乳類、鳥類または魚類の真皮、腱、骨、筋膜等コラーゲンが豊富に含まれる組織を、 ρΗ2〜4程度の酸性溶液に投入、溶出させ、ペプシンなどを添加して、分子末端のテロペプチド領域を除去する。その後、このァテロコラーゲンの酸性溶液に塩化ナトリウムなどの塩を加えて、ァテロコラーゲンを含む沈殿物を得ることができる。

システィンプロテアーゼ

本発明で用いることのできるシスティンプロテアーゼは、公知のシスティンプ口テアーゼであって、その種類は特に限定されないが、このうち、たとえば、システィンプロテアーゼとしては、塩基性アミノ酸量より酸性アミノ酸量が多いもの、酸性領域の水素イオン濃度において活性であるものを好ましく用いることができる。

このようなシスティンプロテアーゼとしては、ァクチニダイン [EC 3.4.22. 2346

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14]、パパイン [EC 3.4.22.2]、フイシン [EC 3.4.22.3]、ブロメライン [EC 3.4.22.32]、カテブシン B[EC 3.4.22.1 ]、カテブシン L[E C 3.4.22.15]、カテブシン S[EC 3.4.22.27]、カテブシン K[EC 3. 4.22.38]、カテブシン H[EC 3.4.22.16]、アロライン、カルシウム依存性プロテアーゼなどが挙げられる。これらのうちでは、好ましくはァクチニダイン、アロライン、ブロメライン、さらに好ましくはァクチ二ダインを用いることが望ましい。

ァクチ-ダインを用いると、特にマグロ由来のァテロコラーゲンとの接触反応を有効に行うことができ、得られるシスティンプロテアーゼ処理コラーゲン中に含まれる、 i3成分、 γ成分の含有量を著しく低減、あるいは実質的に ]3、 τ /成分を除去できる。その結果、 α成分量の多い純度の高い均一なシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンを得ることができる。また、システィンプロテアーゼ処理コラーゲン分子の成分間の共有結合は欠けていると推察される。

このようなシスティンプロテアーゼは、公知の方法により入手することができ、たとえば、化学的な合成、細菌や真菌、あるいは各種動植物の細胞または組織からの抽出、それらの培養細胞、これらに由来するシスティンプロテア一ゼの遣伝子組換体から遺伝子工学的手段により得ることができる。

-ゼ処理コラーゲン、その製造方法

本発明に係るシスティンプロテァーゼ処理コラーゲンは、前記コラーゲンまたはァテロコラーゲンと前記システィンプロテア一ゼとを接触させて得ることがでさる。

システィンプロテアーゼとコラーゲンまたはァテロコラーゲンとの接触は、溶媒中で行うことができる。溶媒中で接触させる場合、溶媒としては、たとえば、水などを用いることができる。溶媒の量は、コラーゲンまたはァテロコラーゲン 1質量部に対して、好ましくは 1〜1000質量部の範囲で用いることが望ましい。

接触に用いるシスティンプロテア一ゼの量は、コラーゲンまたはァテロコラーゲン 100質量部に対して、好ましくは 0. 1〜10質量部、より好ましくは 0. 5〜 5質量部の量であることが望ましい。システィンプロテアーゼと、コラーゲンまたはァテロコラーゲンとの接触条件として、 p H、温度、処理時間は限定されず、通常の酵素処理と同様に行うことができ、たとえば、 p Hは、たとえば、好ましくは 2 . 0〜7 . 0、さらに好ましくは 3 . 0〜5 . 0の範囲で行うことが望ましい。 p Hを一定に保っため、緩衝液中で行うことが好ましい。 p Hを上記範囲とすることにより、コラーゲンまたはァテ口コラーゲンが均一に溶解し、酵素反応が効率よく進むという効果がある。

接触温度は、たとえば、好ましくは 1 5〜 4◦ °C程度の範囲で行うことが望ましレ、。接触時間は、たとえば、好ましくは 1時間〜 5日程度の範囲で行うことが望ましい。

反応終了後、必要に応じ、 p Hを再調整する工程、酵素を失活させる工程などを経てもよい。また、不純物を除去する精製工程などを経てもよい。この場合、タンパク質あるいはぺプチドの精製、分画等のための通常の工程を経ることができ、たとえば、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、等電点沈殿、イオン交換ク口マトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどの工程を経ることができる。

このようにして得られるシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンは、好ましくはシスティンプロテアーゼ処理コラーゲン分子 1つが 3本のポリぺプチド鎖からなる 3重螺旋構造を有し、複数のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲン分子により網目状の会合体構造が形成されていることが望ましい。そして、本発明のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンは、好ましくは複数のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲン分子による 1本の線維への線維化が阻害されており、好ましくは前記ァテロコラーゲンのような線維状の会合体構造を実質的に有していない。このようなシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンは、 p Hの変化にかかわらず立体的な網目構造が安定に存在する。

なお、本明細書において、網目状とは、化学結合またはファンデルワールス結合などにより分子が連なって立体的な網目をつくり、その間に隙間ができている構造をいう。

また、本明細書において、会合体とは、同種の分子が共有結合によらないで 2 分子以上が相互作用して結合し、 1つの構造単位となっているものである。

具体的には、たとえば、図 2は本発明のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンの一例を示す電子顕微鏡写真（6 0 0 0 0倍）であるが、本発明のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンは、細い糸状の分子が不規則に結合してできた立体的な網目状の会合体を示す構造物であり、ファシット（Fabril associated collagens with interrupted triple helix) と呼ばれる 3次元構造の線維化が阻害されるコラーゲンと類似の性質を示し、形態的には基底膜に存在する I V型コラ一ゲンとも類似している構造、つまり、空間的に隙間を多く有している。なお、コラーゲンが 3重螺旋構造を有することは、公知の方法、たとえば円偏光二色スぺクトルにより容易に確認することができる。

これに対し、前述のとおり、図 1に示すように、原料となるァテロコラーゲンは、ァテロコラーゲン分子が寄り添って 1本の線維状の会合体を形成した線維化ァテロコラーゲンであり、分子間の空間がほとんどない。

このため、本発明に係るシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンでは、システィンプロテアーゼ処理コラーゲンの隙間に水分子をとりこみやすいので保水効果が高く、また、赤血球や血小板などの細胞を取り込みやすいので止血効果にも優れ、また各種細胞ゃ胚を in vitroで培養する材料として効果が高いという特異な性質を有する。

なお、図 4に示すように、通常、細胞 1と細胞 2の間にコラーゲンが存在する力この場合、細胞間の中心部に前述のァテロコラーゲンのような線維を形成するコラーゲン（I型） 3が存在し、細胞間の基底膜近傍には線維会合体を形成しない 3次元構造を有する I V型コラーゲン 4が存在している。これまで、細胞間基質などから I型コラーゲンの抽出法は確立されているが、本発明者らの調査によれば、 I V型コラーゲンのような網目状の会合体構造を有する、線維化が阻害されたコラーゲンに関しては有効な調製法は確立されておらず、本発明は、新規な I V型コラーゲン様会合体を、簡便に提供する手段としても極めて有用である。また、本発明に係るシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンは、成分として、 α ΐ成分、 _α 2成分など α成分を含有し、 i3成分、 γ成分を実質的に含有していない。 α ΐ成分と _α 2成分の構成比は原料コラーゲンにより異なり、限定されないが、たとえば、好ましくは、 α 1 ： α 2 = 1 ： 1〜3 ： 1の範囲にあることが望ましい。

このような a l、 a 2成分の分子量は、通常、好ましくは 9 0， 0 0 0〜1 3 0， 0 0 0であることが望ましい。

本発明に係るシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンは、好ましくは中性 ρ Η の水溶液に溶解する。これは、原料のァテロコラーゲンが中性 ρ Ηの水溶液に不溶であることと大きく相違し、また、天然のファシットゃ I V型コラーゲンを含む各種コラーゲンが中性 ρ Ηの水溶液に不溶であることとも大きく相違している。また、本発明に係るシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンは、通常、熱変性により 3重螺旋構造が壌れるがゲル化しない。これは、一般にコラーゲンが熱変性してゼラチンとなり（3重螺旋構造が壌れている）、冷やすとゲル化するのと大きく相違する。また、図 3のゼラチンの構造の一例を示す電子顕微鏡写真（4 0 0 0 0倍）に示すように、ゼラチンでは、線維構造あるいは網目状構造は崩壊している。

すなわち、天然のファシットを含むコラーゲンや I V型コラーゲンと、本発明に係るシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンとは異なるコラーゲンである。さらに、通常、本発明に係るシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンの α 1成分、 ct 2成分は、原料となる天然のァテロコラーゲン中の α 1、ひ 2成分とは、各 α成分の表面電荷が異なっている。たとえば、図 6に示すように、本発明に係るシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンの α 1成分、 α 2成分は、通常、陽ィオン交換クロマトグラフィーで、合計 4つのピークを与えるが、その原料となつたァテロコラーゲン中の _α 1、 _α 2成分は、通常、合計 6つのピークを与え、これらのピークの溶出時間は全て異なっている。このため表面電荷が異なるものと推測することができる。

また、本発明にかかるシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンは、ァテロコラゲンと比較し、エタノールなどのアルコールに対する溶解度が著しく向上している。このため、エタノールを添加する化粧品等への溶解性に優れ、高濃度でシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンを添加することもできる。

以上のことは、太発明のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンが、原料となるコラーゲンまたはァテロコラーゲンにない性質を有し、生体物質との相互作用の起点となる機能が著しく変化したことを示すものである。

本発明に係る前記システィンプロテァーゼ処理コラーゲンは、熱により変性する温度が、好ましくは 2 5 °C以上、さらに好ましくは 2 8 °C以上であることが望ましい。このため、常温における取り扱いが容易である。前述のとおり、ァテロコラーゲンが魚類由来のものである場合、このような変性温度のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンを得るために、マグロなどを原料魚類とすることが好ましい。

本発明のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンは、架橋処理して、重合したシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンとして用いることもできる。

架橋処理は、従来公知の方法により行うことができる。たとえば、化学架橋を使用する方法、熱処理により架橋する方法、紫外線等放射線照射により架橋する方法などが挙げられる。

化学架橋で用いる架橋剤としては、たとえば、 1ーェチルー 3— （3—ジメチルァミノプロピル）カルポジィミド塩酸塩などの水溶性カルポジィミド化合物；ェピクロロヒドリン；ビスエポキシジエチレングリコーノレなどのジエポキシィ匕合物、 N a B H4などが挙げられる。架橋剤の濃度は、システィンプロテアーゼ処理コラーゲンに対して、好ましくは 1 0一³〜 1 0質量％程度で、好ましくは 5〜 4 0 °Cの範囲で、好ましくは 3〜4 8時間程度、システィンプロテアーゼ処理コラーゲンと架橋剤とを接触させることにより、架橋したシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンを得ることができる。

紫外線により架橋する場合、本発明に係るシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンに、たとえば紫外線ランプなどにより紫外線を、通常、室温で、 3〜4 8時間程度照射して、架橋したシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンを得ることができる。

熱架橋する場合は、本発明に係るシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンを、減圧下、好ましくは 1 1 0〜1 6 0 °C程度の温度で、 3〜4 8時間程度加熱して、架橋したシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンを得ることができる。

このような架橋したシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンは、耐コラゲナーゼ性、強度を向上させることができる。

なお、本発明に係るシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンは、前述の通り、エタノールなどのアルコールに対する溶解度が高く、たとえば、溶解性向上のために他の化学修飾をする必要がないが、該システィンプロテアーゼ処理コラーゲンの目的を阻害しない範囲で、必要に応じ、化学修飾されていてもよい。化学修飾の種類としては、たとえば、アシノレイ匕、ミリスチ /レイ匕、ポリエチレングリコール修飾などが挙げられる。

このうち、たとえば、ァシル化修飾であるサクシニル化したシスティンプロテァーゼ処理コラーゲンは、本発明のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンと無水コハク酸とを、リン酸緩衝液などの中性 p Hの溶媒中で反応させて得ることができる。サクシ-ル化することにより、より中性 p Hの溶媒に対する溶解度を向上させ、使用した際の肌触りを向上できる。

また、ポリエチレングリコール修飾したシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンは、塩化シァヌルで活性化したポリエチレンダリコールと反応させることにより得ることができる。

用途

本発明に係るシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンは、食品添加剤、医療材料、化粧品材料、細胞または胚の培養材料などに好適に用いることができる。たとえば、本発明のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンは、水分の取り込み性能に優れ保湿効果が高く、生体適合性に優れることから、化粧品に用いることができる。このうち、たとえば基礎化粧品などに添加して好適に用いることができる。また、炎症を起こしている皮膚に本発明のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンを含有する化粧品を塗布することにより、症状を軽減することもできる。

また、たとえば、本発明のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンは、赤血球や血小板の取り込み性能が高いので、止血効果が高く、生体適合性に優れることから、医療材料としても好適に用いることができる。

さらに、本発明のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンは、生体適合性に優れ、食用として問題なく、食品添加剤としても好適に用いることができる。加えて、本発明のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンは、細胞外マトリツ' クスとして各種の細胞、組織あるいは胚の培養に優れた効果が期待され、また安全に用いることができ、細胞培養安定化剤として好適である。

なお、ここで「細胞」とは、外界を隔離する膜構造に囲まれ、内部に自己再生能を備えた遣伝情報とその発現機構を持つ生命体であり、多細胞生物では組織の構成単位であり、「組織」とは、特定の方向に分化し同一の機能、形態を有する細胞集団を意味し、「胚」とは、多細胞生物の個体発生初期のものを意味している。産業上の利用可能性

本発明に係るシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンは、網目状構造を有し、線維化が阻害されており、水分子あるいは赤血球等の取り込み能力に優れ、生体適合性に優れる。また、保湿効果、止血力、細胞保持力に優れる。実施例

以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は、これらの実施例により何ら制限されるものではない。

【調製例 1】

キハダマグ口皮部からのァテロコラーゲンの抽出

50 Ommol/L クェン酸緩衝液（pH2. 5) 1 10 OmL の入ったワーリンダブレンダ一に、キハダマグロ皮部 534 gを投入し粉碎した。 4°Cで 3日間撹拌後、 l O O O O X gで 30分間遠心し、 1次上澄みを得た。沈殿部分に 500 mmol/L クェン酸緩衝液（pH2. 5) 60 OmL を加え、 3時間撹拌後、 10 O O O X gで 30分間遠心し、 2次上澄みを得た。

1次および 2次上澄みを集め、ブタ 'ペプシン（シグマ社製）を最終濃度 1 0 OU/mLになるように添加して、 4°Cで 3日間撹拌した。

これに、塩ィ匕ナトリウムを 2. 5 mol/Lの濃度となるように加えて溶解させ、さらに、 4でで 1 6時間放置した後、 l O O O O X gで 30分間遠心して沈殿物を集めた。

集めた沈殿物に、 2 Ommol/Lの酢酸緩衝液（pH4. 0) を、沈殿が溶解する量を加えた。得られたァテロコラーゲン量は、 1 3 9 _g (収率 2 6%) であつた。

【実施例 1】

システィンプロテアーゼ処理コラーゲンの製造

調製例 1で得たァテ口コラーゲンを 4でで 1 0 0倍容量の 2 0 mmol/L クェン酸緩衝液 (p H 3. 0) で、 3回透析した。透析後、ァテロコラーゲンに対して、 1. 0重量⁰ /₀となるようにシスティンプロテアーゼ（ァクチニダイン）を添加した。温度を 2 0°Cにして 3日間撹拌し、粗精製物を得た。

得られた粗精製物を、陽ィオン交換ク口マトグラフィ一で精製した。詳しくは、粗精製物を 2 Ommol/Lのクェン酸緩衝液（ρ Η 3 · 5) (以下「Α液」という。）で平衡化した TSKgel SP-Toyopearl 650Mカラム（商品名：東ソー株式会社製）に注入し、 A液を 3 0 OmL流してゲルに吸着しない成分を洗浄した。次に、 1. 5mol/L塩化ナトリウムを含む 2 Ommol/Lクェン酸緩衝液（p H 3. 5) (以下

「B液」という。）を 3 0 OmL流入し、システィンプロテアーゼ処理コラーゲン

(「CPコラーゲン）ということがある。）を分画した。画分を 7. 5 % S D S - ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析したところ、分子量約 1 0万の成分のみからなることが確認できた（図 5)。得られた精製システィンプロテアーゼ処理コラーゲン 6 3 gを、蒸留水で 3回透析した後、凍結乾燥した。収率 1 1. 8%。システィンプロテアーゼ処理コラーゲンの陽イオンクロマトグラフィー分析

調製例 1で調製したァテロコラーゲンから分画した α 1、 a 2成分と、前記精製したシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンとを、それぞれ陽イオンクロマトグラフィ一で測定した。図 6に示すように、ァテロコラーゲンに含まれる α 1成分、 _α2成分は、陽イオンクロマトグラフィー等により通常 6つのピークを与えるが、本発明に係るシスティンプロテァーゼ処理コラーゲンは通常 4つのピークを与えるのみであり、また、ァテロコラーゲンとシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンの α成分は、すべて溶出時間が異なっていた。

-ゼ処理コラーゲンの電子顕微鏡撮影ァテロコラーゲンとシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンとを、それぞれ別々に 5 O mmol/L 酢酸緩衝液 ( p H 4 . 0 ) で溶解し、常法に従いセルディスクにダルタルアルデヒドを用いて固定化した。固定化したァテロコラーゲンとシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンとを、電子顕微鏡 (S-900, 10kV、株式会社日立製作所製）で倍率 6万倍で撮影した（図 1， 2 )。

その結果、ァテロコラーゲン（図 1 ) では、 3重螺旋構造が規則的に配列した典型的な線維状の会合体構造を形成していたのに対し、本発明に係るシスティンプロテアーゼ処理コラーゲン（図 2 ) は、不規則で網目状の隙間の多い会合体構造となっていることが確認できた。

この会合体構造の違レ、は、システィンプロテァーゼ処理コラーゲンのポリぺプチド主鎖末端構造が、ァテロコラーゲンのそれとは異なるためであると推測される。システィンプロテアーゼ処理コラーゲンの風乾処理試験

ァテロコラーゲンとシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンとを、それぞれ別々に 5 O mmol/L酢酸緩衝液 ( p H 4 . 0 ) で溶解し、スライドガラス上に 1 O /z L滴下し、 4 °C下で 1 6時間放置して乾燥させた。乾燥したそれぞれの試料を、光学生物顕微鏡（株式会社島津製作所製）で分析した。その結果、システィンプロテアーゼ処理コラーゲン（図 7 ) は、ァテロコラーゲン（図 8 ) よりも緻密な紋様を示すことが確認できた。また、それぞれの粘ちよう性を、表面張力（液滴重量法）によって分析したところ、システィンプロテアーゼ処理コラーゲンが、ァテロコラーゲンより粘ちよう性が高いことが確認された。

この結果、システィンプロテアーゼ処理コラーゲンは、ァテロコラーゲンと比較して、ヒト肌表面への浸透と保護に有効であることが確認された。システィンプロテァーゼ処理コラーゲンの止血性能評価

1 0週令のォス Wistar ラットをエーテルで導入麻酔し、抱水クロラールの腹腔内投与により麻酔し、脾臓の先端を一部削除および 1 8 Gの注射針で穿針をして出血させた。出血部位にシスティンプロテアーゼ処理コラーゲン、ァテロコラ一ゲンをそれぞれ置き、止血させた。それぞれの試験群における止血に要した平均時間は、ァテロコラーゲンで 8 6秒、システィンプロテアーゼ処理コラーゲンで 3 9秒、コラーゲン止血剤（市販品）で 9 1秒であつた。

コントロールは無処置とした。止血までの時間（秒）を測定した結果を表 1に示す。この結果、システィンプロテアーゼ処理コラーゲンは、ァテロコラーゲンや市販品コラーゲン止血剤の半分以下の時間（秒）で有意に止血できることが示され、著しい止血性能の向上が確認された。皮下埋入試験

1 0週令のォス Wistar ラットをエーテルで導入麻酔し、抱水クロラールの腹腔内投与により麻酔し、背部に皮膚切開を入れ、皮下に 2 0 mg のシスティンプ口テアーゼ処理コラーゲン、ァテロコラーゲンをそれぞれ一塊にして埋入した。 4週間後の埋入した部位を切開したところ、システィンプロテアーゼ処理コラーゲン、ァテロコラーゲンは吸収され、肉眼では確認できなかった。また、組織の炎症や癒着などの異物反応は肉眼では確認できなかった。

表 1 止血効果

>300は， 300秒経っても止血されないことを示す. N D =not done 中性 pHの緩衝液で調製したシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンとァテロコラーゲンの評価

調製例 1で製造したァテロコラーゲンと、前記システィンプロテアーゼ処理コラーゲンとの、中性 pHにおける超分子構造の形態学的特徴を下記の通り評価した。

走査型電子顕微鏡観察のために中性 p Hに緩衝能を有する溶液を用意した。溶液条件： 50 mmol/Lリン酸緩衝液 (pH7. 4)

走査型電子顕微鏡撮影のため、各 1. Omg/mLのシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンとァテロコラーゲンを上記溶液にてそれぞれ透析した。 24ゥエルプレートの各ゥエルにセルディスクを入れ、そのゥエルに透析後の各試料溶液を加えて、 4°Cにてー晚放置後、ダルタルアルデヒドでコラーゲン自己会合物をセルディスクに固定化した。

それぞれのコラーゲン透析試料を走査型電子顕微鏡（Hitachi S-900) にて 6万倍にて撮影した。各透析溶液のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンとァテロコラーゲン自己会合物の異なる pHの緩衝液で処理した写真を図 9、 10に示す。図 1、図 2、図 9、図 10の電子顕微鏡写真から、ァテロコラーゲン自己会合物は pH (4. 0〜7. 4)が異なっても線維構造を形成することが確認された。システィンプロテアーゼ処理コラーゲンは、この pH範囲において線維構造を形成せず立体的な網目構造を形成することが確認された。

コラーゲン自己会合物の超分子構造の違いは、システィンプロテアーゼ処理コラーゲンとァテロコラーゲン分子の自己会合に関係するアミノ酸配列などが影響していると推定される。なぜなら、システィンプロテアーゼ処理コラーゲンはシスティンプロテアーゼにより限定加水分解を受けているからである。

これらの結果から、システィンプロテアーゼ処理コラーゲンは PH4.0〜7. 4の範囲内で立体的な網目構造を保持し、また、ァテロコラーゲンと異なる超分子構造体であることが確認された。システィンプロテアーゼ処理コラーゲンのェタノールに対する溶解度

調製例 1で製造したァテロコラーゲンと、前記システィンプロテアーゼ処理コラーゲンとのエタノールに対する溶解度を評価した。

これらコラーゲンを 2 Ommol/L酢酸緩衝液（pH4. 0) に溶解し、 1. 0% のシスティンプロテァーゼ処理コラーゲン溶液とァテロコラーゲン溶液を調製した。

各システィンプロテアーゼ処理コラーゲン溶液とァテロコラーゲン溶液に、ェタノールを最終濃度が 0、 10、 1 5、 20、 40、 60、 80% (VV) になるように加えて混和した。 4 で 1時間放置後、 10、 O O O X gで 30分間遠心して上清を分離した。上清に含まれるコラーゲン濃度を 21 O nmの吸光度を測定して求めた。

0 %ェタノール濃度でのシスティンプロテアーゼ処理コラーゲン上清溶液とァテロコラーゲン上淸溶液の 210 nmの吸光度を 100%として、各エタノール濃度での吸光度の相対比（％) を計算した。すなわち、ここでは、相対比は溶解度に正比例するものとして表される。図 11にその結果を示す。

図 1 1から明らかなように、ァテロコラーゲン溶液は 15%エタノール濃度で' の相対比は 55%であるが、同エタノール濃度でのシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンの相対比は 100%であり、システィンプロテアーゼ処理コラーゲンは 0%と 15%エタノール濃度での溶解度が変わらないことが確認できた。さらに、 20%エタノール濃度での相対比は、ァテロコラーゲンで僅か 6%であるがシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンでは 80%であった。溶解度 50%を与えるエタノール濃度は、ァテロコラーゲンとシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンで約 10%の差が示された。

これらの結果から、システィンプロテアーゼ処理コラーゲンは、ァテロコラーゲンに比して、.エタノールに対する溶解度がきわめて高いことが確認された。この結果は、システィンプロテアーゼ処理コラーゲンがァテロコラーゲンとは異なる表面構造をもつことが原因であると考えられる。

また、エタノールに対する溶解度が高いことは、下記のような優位性を有する。すなわち、たとえば、化粧品では、エタノールを添加する場合が多く、エタノールに対する溶解度が高ければ、それだけ高濃度でシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンを添加できる。したがって、システィンプロテアーゼ処理コラーゲンを添加する効果をより高めることができる。

また、本発明に係るシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンは、このように特殊な化学修飾をしていなくても、ェタノールに対する溶解性が高く、化学修飾による性質劣化の心配がない。なお、たとえば、システィンプロテアーゼ処理コラ一ゲンをァシル化修飾してエタノールに対する？容解度を高めることも可能であり、この場合、濃度がより高まるため、肌触りがより滑らかとなり、粉っぽい感じが少なくなり、化粧品としてより有効なものとなると推定される。

さらに、化粧品、医療用材料等において、水に難溶な他の化合物を溶解させる場合、溶剤としてエタノール含量の比率が高くなるが、その場合でも、十分量のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンを共存させることが可能である。

そして、システィンプロテアーゼ処理コラーゲンは溶解度が高いため、高濃度のェタノール水溶液中でも均一に分散させて試料を調製することが可能となる。よって、多様な分野で利用することが可能である。さらに、エタノール中にシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンを添加して溶媒を蒸発させることにより、均一に分散した固形物を得ることができる。これは、多層フィルムの形成等に利用可能である。ーゼ処理コラーゲンの水分蒸発量

調製例 1で製造したァテロコラーゲンと、前記システィンプロテアーゼ処理コラーゲンとの水分蒸発量を評価した。

まず、下記の 3つの溶液を調製した。

コント口ール： 20 mmol/L酢酸緩衝液（pH4. 0)、

ァテロコラーゲン： 20 mmol/L酢酸緩衝液 (pH4. 0 ) に溶解した 0. 5 % ァテロコラーゲン溶液、

-ゼ処理コラーゲン： 20 mmolL酢酸緩衝液 (pH4.

0) に溶解した 0. 5%CP-コラーゲン溶液

各溶液につき、ゥエル直径 1 6 mm (2. 0 mm²) の 24ゥエル'プラスチックプレート（I CN社製、 L i b r o) を 1枚づっ用意し、その重量（風袋）を測定した。それぞれのプラスチックプレートの各ゥエルに、同じ溶液を 200 μ L加えてその重量を電子天秤で測定した。具体的には風袋重量との差から、それぞれのプレートに加えた溶液の重量（mg) を計算して求めた。

各プレートを 22°C、湿度 50 %〜 60 %の保温庫に入れて、そのまま 1 1時間、 13時間、 14時間、 18時間、 22時間、 30時間、 37時間静置した。各時間毎に各プレートの重量を電子天枰にて測定して、風袋重量とタンパク質濃度の捕正を行い水分蒸発量を求めた。具体的には、 0時間に加えたァテロコラ一ゲンとシスティンプロテアーゼ処理コラーゲン (CPコラーゲン）の溶液重量から、タンパク質重量（0.5mgZmL) を差し引き、それぞれの水量 W (0) とした。ァテロコラーゲンとシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンの W (0) 力 S コントロールの W (0) と等しくなるように係数を求め、それぞれの補正係数で各時間の W (t) を補正し W ^£(t) を算出した。次に、各時間の溶液重量 W' (t) から W (0) を引き算して dW '(t) を計算した。 37時間放置後のコントロールの重量変化 dW(37)を 100%として、各時間の溶液の重量変化 dW'(t)の相対比

(%) (=dW*(t) X 100÷dW(37)を計算して、放置時間（時間）と水分蒸発相対比（％) の推移を評価した。つまり、コントロールの 37時間後の蒸発量を 100として、すべてをその相対値として表した。

その結果を表 2に示す。

¾2から明らかなように、ァテロコラーゲンはコントロールに対して、水分蒸発の抑制効果は 13時間後の 6%から徐々に低下し、 18時間以降はコントロールとほとんど差がないことが示された。つまり、時間経過に伴い、水分蒸発抑制効果は失われる結果であった。一方、システィンプロテアーゼ処理コラーゲンは、 13時間後のコントロールに対して 10%も水分蒸発量が抑制されていることが示された。さらに驚くべきことに、この著しい水分蒸発抑制効果は 22時間経過後でも 10. 5 %であり、水分蒸発抑制効果は長時間持続することが初めて確認された。この実験結果より、システィンプロテアーゼ処理コラーゲンの水分保持力は、ァテロコラーゲンのそれと大きく異なることが明確となった。

く前記「13時間の6%」の算出法 >

表の数値を 13時間で比べて、コントロールは 37. 4%, ァテロコラーゲンは 35. 3%, システィンプロテアーゼ処理コラーゲンは 33. 6%である。前記 6%とは、蒸発量変化の差である 2 · 1 (=37. 4一 35. 3) を分子とし、 37. 4を分母とした場合の割合を示している。表 2 放置時間に対する相対的な水分蒸発量変化

【調製例 2】

ゥサギの耳および尾からのァテロコラーゲンの抽出

ゥサギの耳 5. 45gと尾部 18. 2 gをそれぞれ細かに細断して、 O.lmol/L 酢酸水溶液 10 OmLを加えて、ヮーリングブレンダ一にて粉碎した。 4°Cにて 3日間撹拌後、 10，O O OX gにて 30分間遠心し各試料の一次上清を得た。さらに沈澱部分に 10 OmLの 10 Ommol/L酢酸水溶液を加えて、撹拌後、同様に遠心して二次上清を得た。

これら一次、二次上清を集めて、それぞれの試料溶液にブタ ·ペプシン（シグマネ土製）を最終濃度 3 OU/mLになるように添カ卩し、 4°Cにて 3日間撹拌した。同条件で遠心後の上清全量に対して、最終濃度 2. 5mol/Lになるように塩化ナトリウムを加えて溶解し、 4°Cにて 1時間放置後、 10，000 Xgで 30分間遠心して沈澱を集めた。沈澱を 2 Ommol/L酢酸緩衝液 (pH4.0) を適量加えて溶解し、これらを耳由来ァテロコラーゲン試料と尾部由来ァテロコラーゲン試料とした。

【実施例 2】

ゥサギ耳由来と尾部由来システィンプロテアーゼ処理コラーゲンの調製

調製例 2にて得たゥサギ耳おょぴ尾のァテロコラーゲンの一部をそれぞれ別々の蓋付き容器に移した。

システィンプロテアーゼ（ァクチ-ダイン）は、 5mmol/L ジチオスレィトールと lmmol/LEDTAを含む 2 Ommol/Lリン酸緩衝液（pH 6.5 )中で 25°C, 1時間放置して活性ィ匕した。各ァテロコラーゲン試料溶液に 3. 0% (w/v) 活性化ァクチニダインとなるように添加した。 20°Cにて 7日間撹拌し粗生成物を得た。

ゥサギ耳由来と尾部由来システィンプロテアーゼ処理コラーゲンの精製

調製したゥサギ由来システィンプロテアーゼ処理コラーゲン（耳由来と尾部由来）とァクチ-ダインは、陰イオン交換ゲルを用いるパッチ法にて分離精製した。詳しくは、酵素反応粗生成物に 20 mmol/L酢酸緩衝液 (pH4.0) にて平衡化した TSKgel DEAE-Toyopearl 650Cゲル（東ソ一株式会社製）を適量添加して、

25 °Cにて 1時間放置後、 10，O O O X gにて 30分間遠心して上清にシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンを得た。

この粗精製物を 5 % S D S ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析した結果、図 12に示すように、得られたゥサギ由来のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンは、 α鎖のみからなる分子量約 10万の成分のみから成ることが確認できた。得られたゥサギ耳および尾部由来の精製システィンプロテアーゼ処理コラ一ゲンは蒸留水に 3回透析した後、凍結乾燥した。

【実施例 3】

ゥシ酸可溶性コラーゲン（タイプ I) 由来システィンプロテアーゼ処理コラーゲンの調製

市販品のゥシ酸可溶性コラーゲン（タイプ I) (ナカライテスタ、品番 #093 50 34) が 1.0mg/mL濃度になるよう 2 Ommol/L酢酸緩衝液 (pH4.0) を加えて溶解した。あらかじめ 5 mmol/Lジチオスレィトールと l mmol/LE D T Aを含む 2 0 mmol/Lリン酸緩衝液（pH 6 . 5 )で 2 5 °Cで 1時間放置して活性ィ匕したシスティンプロテアーゼ（ァクチ-ダイン）を、ゥシ酸可溶性コラーゲン試料溶液に 1 · 0 % (w/v ) となるように添加した。 2 0 °Cにて 7日間撹拌し粗生成物を得た。

ゥシ酸可溶性コラーゲン由来システィンプロテァーゼ処理コラーゲンの精製

前述のようにして調製したゥシ由来システィンプ口テアーゼ処理コラーゲンとァクチニダインを、陰イオン交換ゲルを用いるカラム法にて分離精製した。

詳しくは、 2 0 mmol/L 酢酸緩衝液（pH 4 . 0 ) にて平衡化した TSKgel

DEAE-Toyopearl 650Cゲル（東ソ一株式会社製）をつめたカラムに、酵素反応粗生成物を流してゥシ由来 CP-コラーゲンを分画した。

この粗精製物を 5 % S D S ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析した結果、 J3鎖と γ鎖のない分子量約 1 0万の _α鎖成分のみから成ることが確認できた。

【実施例 4】

ニヮトリ由来ァテロコラーゲンの調製

ニヮトリの軟骨 9 3 gを細断して、 0 . 5 mol/L酢酸水溶液 1 0 0 O mLを加えて、ワーリンダブレンダ一にて粉碎した。 4 °Cにて 2日間撹拌後、 1 0， 0 0 0 X gにて 3 0分間遠心して上清を集めた。上清溶液にブタ ·ペプシン（シグマ社製）を最終濃度 3 0 U/mLになるように添カ卩し、 3 0 °Cにて 3日間撹拌した。同条件で遠心後の上清全量に対して、最終濃度 2 . 5 mol/Lになるように塩化ナトリウムを加えて溶解して 1時間放置後、 1 0， 0 0 0 X gで 3 0分間遠心して沈澱を集めた。沈澱を 2 0 mmol/L酢酸緩衝液 (pH 5 . 0 ) を適量加えて溶解し、これらを-ヮトリ由来ァテロコラーゲン試料とした。

ニヮトリ由来システィンプロテアーゼ処理コラーゲンの調製

前述のようにして得たニヮトリのァテロコラーゲン溶液に前述のように活性化したシスティンプロテアーゼ（ァクチ-ダイン）を 3 . 0 %(w/v)になるように添加した。 3 0 °Cにて 3日間撹拌し粗生成物を得た。この粗精製物を 5 % S D S— ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析した結果、図 1 3に示すように、鎖のない分子量約 9万〜 1 3万の ο;鎖成分のみから成ることが示された。

Claims

請求の範囲

1 . コラーゲンまたはァテロコラーゲンとシスティンプロテア一ゼとを接触させる、システィンプロテアーゼ処理コラーゲンの製造方法。

2 . 前記コラーゲンまたはァテロコラーゲンが、魚類、鳥類またはほ乳類由来のァテロコラーゲンであることを特徴とする請求項 1に記載のシスティンプロテァーゼ処理コラーゲンの製造方法。

3 . 前記コラーゲンまたはァテロコラーゲンが、魚類由来のァテロコラーゲンであることを特徴とする請求項 1または 2に記載のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンの製造方法。

4 . コラーゲンまたはァテ口コラーゲンとシスティンプロテア一ゼとを接角虫して得られるシスティンプロテアーゼ処理コラーゲン。

5 . 前記コラーゲンまたはァテロコラーゲンが、魚類、鳥類またはほ乳類由来のァテロコラーゲンであることを特徴とする請求項 4に記載のシスティンプロテァーゼ処理コラーゲンの製造方法。

6 . 前記コラーゲンまたはァテロコラーゲンが、魚類由来のァテロコラーゲンであることを特徴とする請求項 4または 5に記載のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲン。

7 . 前記システィンプロテアーゼ処理コラーゲンが、該システィンプロテア一ゼ処理コラーゲン分子 1つが 3本のポリぺプチド鎖からなる 3重螺旋構造を有し、複数のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲン分子により網目状の会合体構造を形成していることを特徴とする請求項 4〜 6のいずれかに記載のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲン。

8 . 前記システィンプロテアーゼ処理コラーゲンが、複数のシスティンプロテァーゼ処理コラーゲン分子による 1本の線維への線維化が阻害されていることを特徴とする請求項 4〜 7のいずれかに記載のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲン。

9 . 前記システィンプロテアーゼ処理コラーゲンが熱により変性する温度が、 2 5 °C以上であることを特徴とする請求項 4〜 8のいずれかに記載のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲン。

1 0 . 請求項 4〜 9のいずれかに記載のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンを含有する化粧品。

1 1 . 請求項 4〜9のいずれかに記載のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンを含有する医療用材料。

1 2 . 請求項 4〜 9のいずれかに記載のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンを含有する食品添加剤。

1 3 . 請求項 4〜 9のいずれかに記載のシスティンプロテアーゼ処理コラーゲンを含有する細胞、組織または胚の培養材料。