WO2002102795A1

WO2002102795A1 - Fluorescent probes for zinc

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Publication number: WO2002102795A1
Application number: PCT/JP2002/005900
Authority: WO
Inventors: Tetsuo Nagano; Kazuya Kikuchi; Tomoya Hirano; Satoko Maruyama
Original assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Current assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Priority date: 2001-06-14
Filing date: 2002-06-13
Publication date: 2002-12-27
Anticipated expiration: 2003-12-14
Also published as: EP1403268A1; JP4309253B2; US20040235902A1; EP1403268A4; JPWO2002102795A1; US20080261314A1

Description

明細書亜鉛蛍光プローブ技術分野

本発明は、亜鉛ィォンを特異的に捕捉するための蛍光プロープに関するものである。背景技術

亜鉛はヒトの体内において鉄に次いで含量の多い必須金属元素であり、細胞内のほとんどの亜鉛ィオンは蛋白質と強固に結合して、蛋白質の構造保持や機能発現に関与している。また、細胞内にごく微量存在するフリーの亜鉛イオン（通常は μ Μレベル以下である）の生理的役割についても、種々の報告がある。特に、細胞死の一つであるアポトーシスには亜鉛ィオンが深く関わっていると考えられており、ァルツハイマー病の老人斑の形成を促進しているなどの報告もある。従来、組織内の亜鉛イオンを測定するために、亜鉛イオンを特異的に捕捉して錯体を形成し、錯体形成に伴って蛍光を発す化合物（亜鉛蛍光プローブ）が用いられている。亜鉛蛍光プローブとして、例えば、 T S Q (Reyes, J. G. , et al. , Biol. Res.， 27, 49, 1994)、 Zinquin ethyl ester (Tsuda, M. et al. , eurosci. , 17， 6678, 1997)、 Dansylaminoethylcyclen (Koike, T. et al. , J. Am. Chem. Soc. , 118， 12686, 1996)、 Newport Green (Molecular Probe 社のカタログである "Handbook of t丄 uorescent Probes and Research Chemicals" 6th Edition by Richard P. Haugland pp. 531-540)などが実用化されている。

本発明者らは、 T S Qなどの亜鉛蛍光プローブの欠点を克服した高感度な亜鉛蛍光プローブとして、環状アミン又はポリアミンを置換基として有し、亜鉛ィォンを捕捉して長波長領域の励起光で強い蛍光を発するプローブを提供しており (特開平 2000-239272号公報)、亜鉛イオンと瞬時に反応して蛍光性の錯体を形成し、生体内の亜鉛を極めて正確かつ高感度に測定できるプローブも提供している

(J. Am. Chem. Soc. , 2000, 122, 12399-12400) ₀

一方、細胞に蛍光プローブを適用するときには、細胞内に導入される蛍光プローブの濃度が細胞の種類によってばらつく場合があり、また細胞膜の厚さの違いによつて測定部位でも蛍光強度に差が生じ、膜などの疎水性の高い部分に蛍光プロープが局在してしまう可能性があるなど、測定に景響を与える要因も多い。これらの要因による測定誤差を減少させ、正確な定量的解析を行える方法としてレシオ（ratio)測定法が開発され使用されている (Kawanishi Y.， et al.， Angew. Chem. Int. Ed.， 39 (19) , 3438, 2000)。この方法は、蛍光スペクトル又は励起スぺクトルにおいて異なる 2波長での蛍光強度を測定してその比を検出する工程を含んでおり、蛍光プローブ自体の濃度や励起光強度による影響を無視できるとともに、 1つの波長で観測を行つた場合に生じる蛍光プローブ自身の局在や濃度変化、あるいは退色などによる測定誤差をなくすことができる。

例えば、カルシウムイオンの測定用の蛍光プローブとして Fura 2 (1- [6-アミノ -2- (5-カルボキシ- 2-ォキサゾリル） -5 -べンゾフラニルォキシ] -2 - (2 -ァミノ - 5 -メチルフエノキシ）ェタン- Ν, Ν, Ν' , Ν，-テトラ酢酸'ペンタカリゥム塩: Dojindo Laboratories第 21版/総合カタログ、 137〜138頁、 1998年 4月 20日発行、株式会社同仁化学研究所）が実用化されている。この化合物は、.カルシウムイオン結合により励起波長のピークが低波長側にシフトする性質を有しており、 335 nm付近で励起した場合にはカルシウムイオン濃度の上昇に伴って蛍光強度が増大するのに対して、 370〜380 nm付近で励起したときにはカルシウムイオン濃度の増加とともに蛍光強度が減少する。従って、この化合物を適当な 2波長を用いて励起し、そのときの蛍光強度の比をとることにより、プローブ濃度、光源強度、細胞の大きさなどに関係なくカルシウムィォンを正確に測定できる。

また、前記 Fura 2あるいはその類似構造ィ匕合物がカルシウムイオン以外のィォンも捕捉してしまう性質を利用し、亜鉛イオン検出への応用を検討した報告もあ 5 (Hyrc K. L. , et al. , Cell Calcium, 27 (2) , 75， 2000) ₀ しかしながら、従来、亜鉛蛍光プローブに関しては、亜鉛イオンと特異的に結合して励起スぺクトルあるいは蛍光スぺクトルのピークに十分な波長シフトを生じるプローブが開発されておらず、細胞中の亜鈴ィォンを正確に測定するためにレシオ法を利用することができなかった。発明の開示

本発明の課題は、高感度な亜鉛蛍光プローブとして利用可能な化合物又はその塩を提供するこ.とにある。より具体的には、亜鈴イオンを特異的に捕捉することができ、亜鉛イオンを捕捉することによって励起スぺクトルあるいは蛍光スぺクトルのピークに波長シフトを生じる化合物を提供することが本発明の課題である。また、本発明の課題は、亜鉛イオンをレシオ測定法により測定するための蛍光プロープとして利用可能な化合物を提供することにある。さらに本発明の別な課題は、上記の特徴を有する化合物を含む亜鉛蛍光プローブ、及ぴ該亜鉛蛍光プロ一プを用いた亜鉛イオンの測定方法を提供することにある。

本発明者らは上記の課題を解決すベく鋭意研究を行つた結果、下記の一般式 (I) で表される化合物が亜鉛イオンを特異的に捕捉することができ、亜鉛イオンを捕捉することによって励起スぺクトルのピークに顕著な波長シフトを生じること、及び該化合物を用いてレシオ法により亜鉛ィオンを極めて正確に測定できることを見出した。本努明はこれらの知見を基にして完成されたものである。

すなわち、本発明は、下記の一般式 (I) ：

(I)

〔式中、 R¹は水素原子、アルキル基、アルコキシ基、又はヒドロキシ基を示し R²は下記の式 (A) ：

(式中、 X¹、 X²、 X³、及ぴ X⁴はそれぞれ独立に永素原子、アルキル基、又は²-ピリジルメチル基を示し、 m及ぴ nはそれぞれ独立に 0又は 1を示す _) で表される基を示し； Yは単結合又は- CO-を示し； R³はカルボキシ置換ァリール基、カルボキシ置換へテロアリール基、ベンゾチアゾール -2-ィル基、又は 5-ォキソ -2-チォキソ- 4 -ィミダゾリジニリデンメチル基を示す〕で表される化合物又はその塩が提供される。

この発明の好ましい態様によれば、 mが 0又は 1であり、 nが 0である上記の化合物又はその塩； X¹及ぴ X²がともに 2-ピリジルメチル基であり、 mが 1である場合には X³が水素原子である上記の化合物又はその塩； Yが単結合である上記の化合物又はその塩； R¹がメトキシ基である上記の化合物又はその塩； R³がカルボキシ置換ァリール基又はカルポキシ置換へテロアリール基である上記の化合物又はその塩；ァリール環又はへテロアリール環上に置換する力ルポキシル基が保護某を有している上記の化合物又はその塩；保護基を有するカルボキシル基がメトキシカルボニル基又はァセトキシメチルォキシカルボニル基である上記の化合物又はその塩が提供される。

特に好ましい態様によれば、

mが 1であり、 n力 S 0であり、 X¹及び X²がともに 2-ピリジルメチル基であり、 X³ が水素原子であり、 Yが単結合であり、 R¹がメトキシ基であり、が P-カルボキシフエニル基である上記の化合物又はその塩；

mが 1であり、 nが 0であり、 X¹及ぴ X²がともに 2-ピリジルメチル基であり、 X³ が水素原子であり、 Yが単結合であり、 R¹がメトキシ基であり、が 5-カルボキシォキサゾール- 2-ィル基である上記の化合物又はその塩；

m力 S 0であり、 n力 S 0であり、 X¹及び X²がともに 2 -ピリジルメチル基であり、 Y が単結合であり、 R¹がメトキシ基であり、が 5-カルボキシォキサゾール- 2 -ィル基である上記の化合物又はその塩；

mが 1であり、 n力 S 0であり、 X¹及ぴ X²がともに 2-ピリジルメチル基であり、 X³ が水素原子であり、 Yが単結合であり、 R¹がメトキシ基であり、 R³が P-ァセトキシメチルォキシカルポユルフェニル基である上記の化合物又はその塩；

mが 1であり、 nが 0であり、 X¹及ぴ X²がともに 2 -ピリジルメチル基であり、 X³ が水素原子であり、 Yが単結合であり、 R¹がメトキシ基であり、が 5-ァセトキシメチルォキシカルボニルォキサゾ一ル- 2-ィル基である上記の化合物又はその塩；及ぴ

mが 0であり、 n力 S 0であり、 X¹及ぴ X²がともに 2-ピリジルメチル基であり、 Y が単結合であり、 R¹がメトキシ基であり、が 5-ァセトキシメチルォキシカルボ -ルォキサゾール- 2-ィル基である上記の化合物又はその塩

が提供される。

別の観点からは、上記の化合物又はその塩を含む亜鉛蛍光プローブ；上記の化合物又はその塩と亜鉛イオンとにより形成された亜鉛錯体；及ぴ上記の化合物又はその塩を含む亜鉛イオンの測定用試薬が本発明により提供される。

さらに別の観点からは、亜鉛イオンの測定方法であって、下記の工程：

(a)上記の化合物又はその塩と亜鉛イオンとを反応させる工程；及び

(b)上記工程 (a)で生成した亜鉛錯体の蛍光強度を測定する工程

を含む方法；及び測定をレシオ法により行う上記の方法が提供される。

また、亜鉛イオンの測定方法であって、下記の工程：

(a)カルボキシル基が保護された上記の化合物又はその塩を細胞内に取り込ませる工程； -

(b)細胞内に取り込まれた該化合物又はその塩の加水分解により生じた化合物又はその塩（ただしそのカルボキシル基は保護基を有しない）と亜鉛イオンとの反応により生じた亜鉛錯体の蛍光強度を測定する工程

を含む方法；及び測定をイメージングにより行う上記の方法が提供される。図面の簡単な説明

第 1図は、本発明の化合物（化合物（11) ) における亜鉛イオンの濃度に依存した励起スぺクトル変化を示す。

第 2図は、化合物 (11)における亜鉛ィォン及び他の金属ィオンを用いたレシオ測定の結果を示す。図中、（A)は亜鉛イオン添加によるレシオ変化を示し、（B)は亜鉛以外の金属イオンを添加した場合のレシオ変化を示す。

第 3図は、本発明の化合物のスペクトル特性を示した図である。 a)化合物（14) の UVスぺクトル変化、 b)化合物（14)の蛍光波長を 495 nmに固定した時の励起スベクトル、 c)化合物（11)の UVスぺクトル変化、 d)化合物（11)の蛍光波長を 530 nm に固定した時の励起スぺクトルを示す。

第 4図は、本発明の化合物のスペクトル特性を示した図である。 a)化合物（15) の励起波長を 325 nmに固定した時の蛍光スぺクトル、 b)化合物（15)の蛍光波長を 445 nmに固定した時の励起スぺクトルを示す。

第 5図は、化合物（13)を使用した場合の細胞内の亜鉛イオン濃度の変化を、蛍光顕微鏡にて 340皿と 380 nmで励起したときの蛍光強度比の変化により示した図である。矢印（ 1 )の時点において硫酸亜 150 Μとピリチオン 15 μ Μを添カ卩し、矢印（2)の時点で ΤΡΕΝ 400 μ Μを添加した。

第 6図は、化合物 (13)を使用した場合の細胞の透過光像及び蛍光強度比の変化を示した図である。（a)は透過光像、（b)は刺激前、（c)は硫酸亜鉛とピリチオンを用いて細胞内亜鉛イオン濃度を上昇させた後、（d)は TPENを用いて細胞内亜鉛ィオン濃度を下降させた後の結果を示す。発明を実施するための最良の形態

本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例え ¾アルコキシ基など）のアルキル部分は、例えば、炭素数 1〜： 12個、好ましくは炭素数 1〜6個、好ましくは炭素数 1〜 4個の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として低級アルキル基（炭素数 1〜6個のアルキル基）が好ましい。低級アルキル基としては、例えば、メチル基、ェチル基、 n—プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、 n—プチノレ基、 s e c—プチル基、イソブチノレ基、 t e r t—プチル基、シクロプロピルメチル基、 n—ペンチル基、 n—へキシル基などを挙げることができる。 R¹が示すアルキル基としてはメチル基が好ましく、 R¹が示すアルコキシ基としてはメトキシ基が好ましい。特に好ましいのはメトキシ基である。 R²における X¹、 X²、 X³、及び X⁴が示すアルキル基としてはメチル基が好ましい。

R³が示すカルボキシ置換ァリール基におけるァリール基としては、単環性又は縮合環性のァリ一ル基を用、ることができ、例えばフエ -ル基又はナフチル基などが好ましい。特に好ましいのはフヱニル基である。 R³が示す'カルボキシ置換へテロァリール基におけるへテロアリール基としては、単環性又は縮合環性のへテロアリ一ノレ基を用いることができる。ヘテロァリール基に含まれるヘテロ原子の個数及ぴ種類は特に限定されないが、例えば、窒素原子、酸素原子、及びィォゥ原子からなる群から選ばれるヘテロ原子を 1〜 4個、好ましくは 1〜 3個、より好ましくは 1又は 2個含んでいてもよい。ヘテロァリール基を構成するへテロァリ一ル化合物として、例えばォキサゾーノレ、ィミダゾーノレ、チアゾ一ノレ、ベンゾォキサゾール、ベンゾイミダゾール、又はべンゾチアゾールなどを例示することができるが、これらに限定されることはない。ヘテロァリール基としてはォキサゾリル基が好ましい。

R³が示すカルボキシ置換ァリール基又はカルボキシ置換へテロアリール基において、了リ一ノレ環又はへテロァリール環上に置換するカルボキシル基の個数は特に限定されないが、好ましくは 1〜 2個、特に好ましくは 1個である。ァリール環又はへテロァリール環上に置換するカルボキシル基は保護基を有していてもよい。力ルポキシル基の保護基については、例えば、プロテクティブ'グループス · イン ·オーガニック -シンセシス (Protective Groups in Organic Synthesis) グリーン（T. W. Greene) 著、ジョン 'ワイリー 'アンド 'サンズ 'インコーポレイテッド（John Wiley & Sons, Inc. ) (1981年）などを参照することができる。保護基を有するカルボキシル基の好ましい例としては、エステル類、特にアルコキシカルボ二ル基を挙げることができる。アルコキシカルボニル基の特に好ましい例としてメトキシカルポ二ル基を挙げることができる。また、膜透過性を高めたい場合には、カルボキシル基の保護基としてァセトキシメチル基を用レ、、保護基を有する力ルボキシル基をァセトキシメチルォキシカルボニル基とすることが特に好ましい。ァリール環又はへテロァリール環上に置換するカルボキシル基の, 位置は特に限定されないが、ァリール基としてフエ二ル基を用いる場合にはパラ位が好ましい。

式 (A)で表される基において、 mが 0又は 1であり、 nが 0であることが好まし V、。この場合、 X¹及ぴ X²がともに 2-ヒ。リジルメチル基であることが好ましく、 m が 1である場合には X³が水素原子であることが好ましレ、。 Yは単結合又は -CO-を示すが、 Yが単結合であることが好ましい。 Yが単結合を示す場合には、 R³がカルポキシ置換ァリール基又はカルポキシ置換へテロアリール基であることが好ましく、より具体的には R³がカルポキシ置換フエニル基又はカルポキシ置換ォキサゾリル基であることが好ましい。

上記一般式（I)で表される本発明の化合物は酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、 p-トルエンスルホン酸塩、シユウ酸塩、クェン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニゥム塩、又はトリェチルァミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほ力 \グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。本発明の化合物又はその塩は水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。上記一般式 (I)で表される本発明の化合物は、置換基の種類によ.り、 1個又は 2 個以上の不斉炭素を有する場合があるが、 1個又は 2個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や 2個以上の不斉炭素に基づくジァステレオ異^"生体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。 ·

本発明の上記一般式 (I)で表される化合物の代表的化合物の製造方法を、下記のスキームに示す。本明細書の実施例には、このスキームに記載した製造方法がより詳細かつ具体的に示されている。従って、当業者は、これらの説明を基にして反応原料、反応条件、及び反応試薬などを適宜選択し、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることによって、上記一般式 (I)で表される本発明の化合物をいずれも製造することができる。

OCH,

12

4 12

H₂CH₃

上記一般式 (I)で表される本発明の化合物又はその塩は、亜鉛蛍光プローブとして有用である。上記一般式 (I)で表される本発明の化合物又はその塩は、亜鈴ィォンを捕捉して亜鈴錯体を形成すると、励起スぺクトルのピークに顕著な波長シフトを生じる。この波長シフトは、亜鉛イオン濃度に応じて通常は約 20 nm程度までの範囲で観測でき、他の金属イオン（例えばナトリウムイオン、カルシウムィオン、カリウムイオン、又はマグネシウムイオンなど）の影響を受けずに亜鉛ィオンに特異的な波長シフトとして観測できる。従って、本発明の化合物を亜鉛蛍光プローブとして用い、適当な異なる 2波長を選択して励起し、その時の蛍光強度の比を測定することにより、亜鉛イオンをレシオ法によって測定することが可能になる。異なる 2波長は、一方の波長において励起した場合に亜鉛イオン濃度の上昇に伴って蛍光強度が増大し、かつ他方の波長において励起した場合には亜鉛イオン濃度の上昇とともに蛍光強度が減少するように選択することができる。レシオ法については Mason W. T. の著書（Mason W. T. in Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity, Second Edition, Edited by Mason W. T. , Academic Press)などに詳細に記載されており、本明細書の実施例にも本発明の化合物を用いた測定方法の具体例を示した。

また、上記一般式（I)で表される本発明の化合物又はその塩は亜鉛イオンを特異的に捕捉することができ、極めて錯体形成が速やかであるという特徴を有している。従って、上記一般式 (I)で表される本発明の化合物又はその塩は、生細胞や生組織中の亜鉛ィォンを生理条件下で測定するための亜鉛蛍光プロ一ブとして極めて有用である。なお、本明細書において用いられる「測定」という用語については、定量及ぴ定性を含めて最も広義に解釈すべきものである。

本発明の亜鉛蛍光プ口ーブの使用方法は特に限定されず、従来公知の亜鉛プロープと同様に用いることが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、ァセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムァミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに上記一般式 (I)で表される化合物及ぴその塩からなる群から選ばれる物質を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、適宜選択された異なる 2波長により励起して、それぞれの蛍光強度を測定すればよい。

例えば、上記スキーム中の化合物 11の励起波長は 354 nm、蛍光波長は 532 nm であり、 20 ¾1で亜鉛蛍光プローブとして用いると 20 程度の濃度までの亜鉛イオンを捕捉し、亜鉛イオンの濃度に依存して励起スぺクトルのピークが 20 nm 程度ブルーシフトする。従って、この化合物をプローブとして用いる場合には、励起波長として例えば 335 nm及び 354 nmを用い、それぞれの励起波長における蛍光強度を求めて比を算出すればよい。なお、本発明の亜鉛蛍光プローブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、 pH調節剤などの添加物と組み合わせることができる。実施例 .

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。実施例中化合物番号は、上記のスキーム中の化合物番号に対応している。例 1

ィ匕合物（2)を Journal of Organometalic Chemistry, 2000, 611, pp. 586-592 に記載の方法に従って合成した。化合物（2) 4. 7 g (29腿 ol)をエタノール 150 ml に溶かし炭酸ナトリウム 12 g (0. 12 mol)と 2 -（クロロメチル）ピリジン塩酸塩 9. 6 g (58 mmol)を加え、 1日加熱還流した。エタノールを減圧下留去し、 2 N水酸化ナトリウム水溶液に懸濁した後、ジクロロメタンで抽出した。飽和食塩水で洗浄後、炭酸カリウムで乾燥し、ジクロロメ'タンを減圧下留去した。残渣をアルミナカラムにて精製して化合物（3) 9. 9 gを得た（収率：定量的)。

褐色油状物質.

¾ -顧 R (CDC1₃， 300 MHz)： 8. 55 (m, 2H) , 7. 64 (m, 2H) , 7. 42 (d, 2H, J = 9. 0) , 7. 16 (m, 2H) , 5. 80 (br, 1H)， 3. 87 (s, 4H) , 3. 23 (t, 2H, J = 6. 0) , 2. 71 (t, 2H， J = 6. 0) 化合物（3) 1. 1 gをジクロロメタン 25 mlに溶かし、トリフルォロ酢酸 25 ml に氷冷下滴下した。室温で 1時間撹拌し、 45°Cでトリフルォロ酢酸を減圧下に留去した。残留物に 2N水酸化ナトリゥム水溶液 25 ml を加え、ジクロロメタンで抽出し、飽和責塩水で洗浄後、炭酸力リゥムで乾燥した。ジクロロメタンを減圧下留去し、残渣をアルミナカラムで精製して化合物（4) 0.64 gを得た（収率 85%)。褐色油状物質。

¾- MR (CDC1₃ , 300 MHz)： 8.54 (m, 2H), 7.65 (m, 2H), 7.50 (d, 2H, J = 7.8), 7.15 (m, 2H)， 3.85 (s， 4H), 2.80 (t， 2H, J - 6.0), 2.66 (t， 2H, J = 6.0), 1.42 (br， 2H)

2, 5 -ジメトキシブロモベンゼン（5) 7.0 ml (47讓 0；!)を 160 mlのジクロ口メタンに溶かした溶液に、アルゴン下- 78°Cで塩ィヒチタン（IV) 13 ml (0.12 mol)、続いてジクロロメチルメチルエーテル 8.2 ml (0.14 mol)を加え、 - 78°Cで 1時間撹拌した。反応液を氷水 600 mlに少しずつ加えた後にジクロロメタンで抽出した。ジクロロメタン層を飽和炭酸水素ナトリゥム水溶液、水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。ジクロロメタンを減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精製して化合物（6) 9.9 gを得た（収率 87%)。

-膽 (CDC1₃, 300 MHz): 10.40 (s, 1H), 7.34 (s, 1H), 7.25 (s， 1H), 3.91 (s, 3H), 3.90 (s, 3H) 化合物（6) 5.0 gをニトロメタン 130 mlに溶かし、塩化亜鈴を飽和させた二トロメタン 80 ml、続いて 1.0 M,三塩化ホゥ素ジクロロメタン溶液 60 mlをカロえ、室温で 4 時間撹拌した。さらに 1.0 M三塩化ホウ素ジクロロメタン溶液 20 ml を加え、室温で 2時間撹拌した。反応液に水：メタノール =1： 1を 100 ml加え、室温で 30分間撹拌した後、ジクロロメタンで抽出した。ジクロロメタン層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。ジクロロメタンを減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムにより精製して化合物（7) 3.5 gを得た（収率 74%)。 ¾ -腿 (CDC1₃, 300 MHz)： 10.72 (s, 1H)， 9.85 (s， 1H), 7.28 (s, 1H), 6.98 (s, 1H), 3.91 (s, 3H) - 化合物（7) 2.0 g (8.7腿 ol)と 4-ブロモメチル安息香酸メチルエステル 2.8 g (12膽 ol)を 100 ml ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、炭酸力リウム 4.8 g (35應 ol)を加え 100°Cで 2時間撹拌した。室温まで冷却後、酢酸ェチル 300ml に溶かし、水及ぴ飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。酢酸ェチルを減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムにより精して化合物 (8) 1.9 g を得た（収率 58%)。

¾-應 R (CDC1₃， 300 MHz)： 10.47 (s， 1H)， 8.09 (d, 2H， J = 8.0) , 7.50 (d， 2H， J = 8.0)， 7.37 (s, 1H)， 7,30 (s, 1H), 5.20 (s， 2H)， 3.94 (s， 3H)， 3.91 (s, 3H) 化合物（8) 1.9 g (5.0應 ol) を 75 mlのジメチルホルムアミドに溶かした溶液に KF- Alumina (Bull. Chem. Soc. Jpn. , 1983, 56, 1885- 1886に示す方法で合成） 2.9 gを加え、 100°Cで 3時間撹拌した。反応液を濾過した後、酢酸ェチルを加え、水及び飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸ェチルを減圧下に留去し、残渣をシリカゲルカラムにより精製して化合物（9) 0.66 gを得た（収率 36%) o .

¾ -應 R (CDC1₃， 300 MHz)： 8.11 (d, 2H, J = 8.2)， 7.89 (d, 2H, J二 8.2), 7.75 (s, 1H), 7.08 (s, 1H), 7.08 (s, 1H)， 3.95 (s, 3H), 3.95 (s, 3H) 化合物（4) 0.33 g (1.3膽 ol) を 1,4-ジォキサン 20 mlに溶かした溶液に、ィ匕合物（9) 0.16 g (0.44 mmol) 、ナトリゥム— t-ブトキシド 89 mg (0.92腿 ol)、 [1， 1'_ビス（ジフエニルホスフイノ）フエ口セン]パラジウム（II)ジク口リド 15 mg (0.020 mmol)、 1, -ビス（ジフエニルホスフイノ）フエ口セン 23 mg (0.042 脆 ol)を加え、 100°Cで 1時間撹拌した。反応液に少量の水を加えた後、炭酸水素ナトリゥム水溶液とジク口口メタンを加え、不溶物をグラスフィルタ一で濾去した。濾液をジクロロメタンで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した。ジクロロメタンを減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムで精製して化合物（10) 0.39 g を得た（収率 32%)。

黄色固体

¾ -腿 (CDC1₃， 300 MHz)： 8.54 (m, 2H) , 8.05 (d, 2H， J = 8.6), 7.80 (d, 2H， J = 8.6)， 7.64 (m, 2H)， 7.53 (d, 2H， J = 7.3), 7.14 (m, 2H), 7.01 (s， 1H), 6.90 (s， 1H)， 6.64 (s， 1H) , 3.96 (s, 3H) , 3.96 (s, 3H) , 3.93 (s, 4H) , 3.28 (t, 2H, J - 5.5), 2.96 (t, 2H， J = 5.5)

MS (FAB)： 523 (M⁺+l) ' メタノール 25 mlに 1.0 gの水酸化カリゥムを溶かし、この溶液に化合物（10) 63 mg (0.12應 ol)を溶解して 40°Cで 12時間撹拌した。メタノールを減圧下に留去した後、残渣を 100 mlの水に溶解した。この溶液に塩酸を加えて酸性にした後、水酸化ナトリゥム水溶液を pH 7.0になるまで加え、析出した固体を濾取し、化合物（11) 43 mgを得た（収率 70°/。)。得られた化合物（11)は酢酸ェチル /n-へキサンにて再結晶して精製した。

黄色固体。

-丽 R (CDC1₃, 300 MHz)： 8.61 (m, 2H)， 7.94 (d, 2H, J = 9.0), 7, 65 (d, 2H, J = 9.0)， 7.65 (m, 2H), 7.54 (d, 2H, J = 7.3), 7.20 (m, 2H), 6.89 (s, 1H), 6.81 (s, 1H)， 6.59. (s, 1H), 3.96 (s, 3H)， 3.94 (s, 4H), 3.33 (t, 2H, J =5.5)， 2.98 (t, 2H， J = 5.5), 1.57 (br， 1H) 化合物（7) 0.56 g (2.4膽 ol)を 10 mlのジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、ェチノレ 2-ク口ロメチノレオキサゾ一 A^- 5-カノレポキシレート（J. Biol. Chem. , 1985, 260, 3440- 3450に示す方法で合成） 0.46 g (2.4 mmol)、炭酸カリウム 1.3 g (9.7 腿 ol)を加え、 100°Cで 1.5時間撹拌した。反応液を 2 N塩酸にて中和した後、酢酸ェチルで抽出し、有機層を水及び飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリゥムで乾燥後、酢酸ェチルを減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精製して化合物 (12) 0.51 g (1.4 mmol)を得た。収率 57 ₀

¾ -腿（CDC1₃， 300 MHz) ：

7.89 (s, 1H)， 7.83 (s， 1H)， 7.49 (s, 1H) , 7.12 (s, 1H)， 4.44 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 3.96 (s, 3H), 1.42 (t, 3H, J = 7.1 Hz)

MS (EI)： 364, 366 化合物（4) 0.20 g (0.83 mmol)を 1,4-ジォキサン 10 mlに溶かした溶液に、ィ匕合物（12) 0.10 g (0.27 腿。1)、ナトリゥム- 1一ブトキシド 54 mg (0.56 mmol), [1, 1'-ビス（ジフエニルホスフイノ）フエ口セン]パラジウム（II)ジクロリド 5 mol%、 1， 1，-ビス（ジフエニルホスフイノ）フエ口セン 10mol%を加え、アルゴン気流下 80°Cで 2時間撹拌した。反応液を減圧下留去し、 NHシリカゲル力ラムで精製して化合物（13) 5.0 mg (9.5讓 ol)を得た。黄色オイル状物質。収率 3.5 %₀ ¾—匪 R (CDC1₃， 300 MHz)： 8.53 (d, 2H， J = 5.0 Hz), 7.84 (s， 1H) , 7.63 (m, 2H), 7.51 (d, 2H， J = 7.9 Hz), 7.43 (s, 1H), 7.14 (m, 2H), 6.90 (s, 1H), 6.59 (s, 1H), 5.39 (brs, 1H), 4.41 (q, 2H, J = 7.1 Hz) , 3.97 (s, 3H), 3.91 (s, 4H)， 3.24 (t， 2H, J = 5.9 Hz), 2.95 (t, 2H, J = 5.9 Hz), 1.41 (t， 3H， J = 7.1 Hz)

¹³C-NMR (75 MHz, CDC1₃)： 159.23， 157.86, 157.46, 153.11, 149.10, 145.82, 141.48, 140.17, 140.06, 136.40, 135.63, 123.03, 122.12, 115.68, 111.29, 100.55, 91.86， 61.47, 60. 0, 56.00, 52.31, 41.04, 14.31

HRMS (FAB⁺) Calcd for (M+H+) m/z 528.2247, Found 528.2255 化合物（4) 0.20 g (0.83 mmol)を 1, 4-ジォキサン 10 mlに溶かした溶液に、ィヒ合物（12) 0.10 g (0.27 腿 ol)、ナトリゥム- 1-プトキシド 54 mg (0.56 mmol), [1，1，-ビス（ジフエニルホスフイノ）フエ口セン]パラジウム（II)ジクロリド 5 mol°/_e、 1， 1，-ビス（ジフエ二ホスフイノ）フエ口セン 10mol°/。をカ卩え、ァノレゴン気流下 80°Cで 2時間撹拌した。反応液に数 mlのメタノールを加えて室温にて 15分撹拌した後、 2 N塩酸にて中和し減圧下留去した。残渣を逆相 HPLCで精製して化合物（14) 20 mg (40 nmol)を得た。黄色オイル状物質。収率 I⁵ %。これを塩酸塩として沈殿させ、測定に用いた。

¾一 NMR (CD₃0D， 300 MHz)： 8.79 (d, 2H， J = 5.9 Hz), 8.48 (m, 2H)， 8.10 (d，

2H, J = 7.8 Hz), 7.92 (s, 1H), 7.90 (m, 2H), 7.56 (s， 1H), 7.19 (s， 1H)， 6.89

(s, 1H), 4.41 (s， 4H)， 3.95 (s, 3H),' 3.52 (ΐ, 2H), 3.05 (t, 2H)

^1SC-顯 R (75 fflz, CD₃0D)： 160.27, 158.60, 154.03, 153.50, 148.54, 147.49,

143.68, 141.32, 141.15, 140.30, 135.87， 125.72, 125.61, 117.79, 112.59,

102.36, 92.55, 58.99， 56.71, 53.98, 40.18

HRMS (FAB⁺) Calcd for (M+H⁺) m/z 500.1934, Found 5Q0.1936 ジ—（2 -ピコリル）ァミン 0.20 g (0.96 mmol)を 1， 4—ジォキサン 10 ml に溶力、した溶液に、化合物（12) 0.10 g (0.27謹 ol)、ナトリゥム- -ブトキシド 54 mg (0.56腿 ol)、 [1, -ビス（ジフエニルホスフイノ）フエ口セン]パラジウム（II)ジクロリド 5mol%、l， 1，一ビス（ジフエ-ルホスフイノ）フエ口セン lOmol。/。をカロえ、アルゴン気流下 100。Cで 3.5時間撹拌した。反応液に数 mlのメタノールを加えて室温にて 15分撹拌した後、 2 N塩酸にて中和し減圧下留去した。残渣を逆相 HPLC で精製して化合物（14) 2 mg (4.4 nmol)を得た。黄色オイル状物質。収率 1.6 %。これを塩酸塩として沈殿させ、測定に用いた。

丽 R (CD₃0D, 300 MHz)： 8.76 (d, 2H, J = 5.1 Hz), 8.39 (m, 2H), 7.99 (d, 2H， J = 8.4 Hz), 7.83 (s, 1H), 7.82 (m, 2H), 7.46 (s， 1H), 7.39 (s, 1H), 7.22 (s, 1H), 4.88 (s, 4H), 3.72 (s， 3H) 例 2 ：化合物（11)の蛍光特性

化合物 (11)の蛍光特性を調べた。化合物 (11)を 100 KM HEPES緩衝液 (pH 7.4、 0.4% DMS0を共溶媒として含有）に 20 μ Mとなるように溶解して励起スぺクトルを測定した。

測定条件 "

日立 F- 4500蛍光測定装置

スリット： Ex、 Em 2. 5 nm

スキャン速度： 240 nm/min

ホトマル電圧： 950 V

測定温度： 25°C

亜鉛イオンの添加前及ぴ亜鉛イオン（20 μ M ZnS0₄)添加後の化合物（11)の蛍光特性を下記表 1に示す。表 1

亜鉛イオンと配位することによつて化合物（11)には約 20 nmの波長シフトが認められた。化合物（11) 20 Mにおいて亜鉛イオンの濃度変化に対する励起スぺクトルを第 1図に示す。亜鉛イオン濃度に依存して励起スぺクトルの極大波長が低波長側にシフトした。例 3 ：化合物 (11)のレシオ測定

100 mM HEPES緩衝液 (pH 7. 4)中で、化合物（11)の 20 溶液に 20 μ Μになるまで ZnS0₄を添加した。蛍光波長 530 nmに固定したときの励起波長 335 nmと 354 nmにおける蛍光強度のレシオ変化を示す（第 2図 (A) )。 100 mM HEPES緩衝液（pH 7. 4)中で、化合物（11) の 20 μ Μ溶液に 400 μ Μになるまでナトリウムイオン、力ルシゥムイオン、カリウムイオン、又はマグネシゥムイオンを添加した。蛍光波長 530 nmに固定したときの励起波長 335 nmと 354 nmにおける蛍光強度のレシオ変化を示す（第 2·図 (B) )。亜鉛イオンを添加した場合には亜鉛イオンの濃度依存的にレシオが変^ f匕するが、他のイオンを加えた場合にはレシオの変化がみられないことから、化合物（11)が亜鉛イオンに対して高い選択性を示すことが分かつた。例 4 ：化合物（14)及ぴ（15)の蛍光特性とレシオ測定

化合物（14)及び (15)について例 2及ぴ例 3と同様の方法により蛍光特性の確認とレシオ測定を行った。亜鉛イオンの添加前及ぴ亜鉛イオン（20 i M ZnS0₄) 添加後の化合物 (14)及ぴ (15)の蛍光特性を下記表 2に示す。表 2

化合物（11)と同様に、亜鉛イオンと配位することによって化合物（14)及び (15) には約 30nmの波長シフトが認められた。同時にナトリゥムイオン、カルシウムィオン、カリウムイオン、又はマグネシウムイオンの添加ではレシオの変化が観察されず、亜鉛イオンに対して高い選択性を示すことが確認された。例 5 ：化合物（14)及び（15)のスぺクトル測定

lOOmM HEPES緩衝液 (pH 7. 4) 中で、 15 μ Μの化合物（14)の溶液に 15 μ Μになるまで ZnS0₄を添カ卩し、例 2の測定条件でスペクトルを測定した。このとき、ィ匕合物（11)も同様にスぺクトルを測定し対照とした。第 3図に、 a)化合物（14)の UV スぺクトル変化、 b)化合物（14)の蛍光波長を 495nmに固定したときの励起スぺクトル、 c)化合物（11)の UVスぺクトル変化、 d)化合物（11)の蛍光波長を 530 nmに固定した時の励起スぺクトルを示す。また、 100 HEPES緩衝液 (pH 7. 4) 中で、 10 μ Mの化合物（15)溶液に 200 Μになるまで ZnS0₄を添加し、例 2の測定条件でスペクトルを測定した。第 4図に、 a)化合物（15)の励起波長を 325nmに固定したときの蛍光スぺクトル、 b)化合物（15)の蛍光波長を 445nmに固定したときの励起スぺクトルを示す。

亜鉛ィオンの添加により化合物（14)では 365nm、化合物（11)では 354nmの吸光度が減少し、化合物（14)、（11)とも 335nmに吸光度が増加した (図 3 a)、 c) )。同時に亜鈴ィオンの添加により化合物（14)では 365nm、化合物（11)では 354nmで励起したときの蛍光が減少した（図 3 b)、 d) ) また、亜鉛イオンの添加により化合物（15)では 495nmの蛍光が減少し 445nmの蛍光が増加（図 4 a) ) する一方、亜鉛ィオンの添加により 355nmで励起したときの蛍光強度が減少し 325nmで励起したときの蛍光強度が増加（図 4b) )した。以上より化合物 (14)及び (15)が化合物（11) と同様レシオ法による亜鉛ィオンの測定に使用できることが確認された。例 6 ：化合物（13)による生細胞中の亜鉛イオン測定

生きた細胞内の亜鉛ィォン濃度の変化をイメージングによって測定した。マク口ファージ（MW264. 7) を、 10 Mの化合物（13)を含む PBSバッファ一中で室温下 30分ィンキュベ一トし、細胞外液を化合物（13)を含まない PBSバッファーに置換した後、蛍光顕微鏡にて 340 進と 380 nmで励起したときの蛍光強度のレシオ変化を観察した。第 5図に示すように、測定開始から 5分後にピリチオン（亜鉛選択的ィオノフォア）と ZnS0₄をそれぞれ 10 μ Μ、 150 μ Μになるように細胞外液に加えた（第 5図、矢印 1 )。さらに 15分後に ΤΡΕΝ (膜透過性亜鉛キレーター）を 400 χ Μになるように細胞外液に加えた（第 5図、矢印 2 )。細胞の透過光像及び蛍光強度比の変ィ匕を擬似カラー表示した画像を第 6図に示す。

視野内にある 6個のマクロファージいずれでも、ピリチオンと ZnS0₄の添加後にレシオの上昇、 TPENの添加後にレシオの低下が観察された。産業上の利用可能性

本発明の化合物は亜鉛測定のための蛍光プローブとして有用である。本発明の化合物は亜 l&イオンとの錯体を形成すると励起スぺクトルのピークに波長シフトが生じるので、異なる 2種類の励起波長を用いて亜^ &イオンをレシオ法により正確に測定できる。レシオ法による亜鉛イオン濃度の測定では、蛍光プローブ自体の濃度や励起光強度による影響を無視できるとともに、蛍光プローブ自身の局在や濃度変化、あるいは退色などによる測定誤差をなくすことができるため、本発明の化合物は生体内における亜鉛ィォンを正確に測定するためのプローブとして極めて有用である。

Claims

請求の範囲

1 . 下記の一般式（I)

〔式中、 R¹は水素原子、アルキル基、アルコキシ基、又はヒドロキシ基を示し； R²は下記の式 (A) ：

(式中、 X¹、 X²、 1\ 及び X⁴はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、又は 2 -ピリジルメチル基を示'し、 m及ぴ nはそれぞれ独立に 0又は 1を示す）で表される基を示し； Yは単結合又は- CO-を示し； R³はカルポキシ置換ァリール基、力ルポキシ置換へテロアリール基、ベンゾチアゾール -2-ィル基、又は 5-ォキソ -2-チォキソ- 4 -ィミダゾリジニリデンメチル基を示す〕で表される化合物又はその塩。

2 . m力 S 0又は 1であり、 n力 S 0である請求の範囲第 1項に記載の化合物又はその

3 . X¹及ぴ X'²がともに 2-ピリジルメチル基であり、 m力 S 1である場合には X³が水素原子である請求の範囲第 2項に記載の化合物又はその塩。

4 . Y が単結合である請求の範囲第 1項ないし第 3項のいずれか 1項に記載の化合物又はその塩。

5 . R¹がメトキシ基である請求の範囲第 1項ないし第 4項のいずれか 1項に記載の化合物又はその塩。

6 . R³がカルボキシ置換ァリール基又はカルボキシ置換へテロアリール基である請求の範囲第 1項ないし第 5項のいずれか 1項に記載の化合物又はその塩。

7 . ァリール環又はへテロァリール環上に置換する力ルポキシル基が保護基を有している請求の範囲第 6項に記載の化合物又はその塩。

8 . 保護基を有するカルボキシル基がメトキシカルボニル基又はァセトキシメチルォキシカ ^ボニル基である請求の範囲第 7項に記載の化合物又はその塩。

9 . m力 S 1であり、 n力 S 0であり、 X¹及ぴ X²がともに 2-ピリジルメチル基であり、 X^sが水素原子であり、 Yが単結合であり、 R¹がメトキシ基であり、 R³が P-カルボキシフエニル基である請求の範囲第 1項に記載の化合物又はその塩。

1 0 . m.が 1であり、 n力 S Oであり、 X¹及ぴ X²がともに 2-ピリジルメチル基であり、 X³が水素原子であり、 Yが単結合であり、 R¹がメトキシ基であり、が 5 -力ルポキシォキサゾール- 2-ィル基である請求の範囲第 1項に記載の化合物又はその塩。

1 1 . mが 0であり、 nが 0であり、 X¹及ぴ X²がともに 2-ピリジルメチル基であり、 Yが単結合であり、 R¹がメトキシ基であり、が 5-カルボキシォキサゾール - 2-ィル基である請求の範囲第 1項に記載の化合物又はその塩。

1 2 . mが 1であり、 nが 0であり、 X¹及ぴ X²がともに 2-ピリジルメチル基であり、 X³が水素原子であり、 Yが単結合であり、 R¹がメトキシ基であり、 R³が p -ァセトキシメチルォキシカルポニルフエ-ル基である請求の範囲第 1項に記載の化合物又はその塩。

1 3 . m力であり、 nが 0であり、 X¹及ぴ X²がともに 2 -ピリジルメチル基であり、 X³が水素原子であり、 Yが単結合であり、がメトキシ基であり、が 5-ァセトキシメチルォキシカルポニルォキサゾ一ル- 2 -ィル基である請求の範囲第 1 項に記載の化合物又はその塩。

1 4 . m力 S 0であり、 nが 0であり、 X¹及び X²がともに 2-ピリジルメチル基であり、 Yが単結合であり、 R¹がメトキシ基であり、 R³が 5 -ァセトキシメチルォキシカルボニルォキサゾール -2-ィル基である請求の範囲第 1項に記載の化合物又はその塩。

1 5 . 請求の範囲第 1項ないし第 1 4項のいずれか 1項に記載の化合物又はその塩を含む亜鉛蛍光プローブ。

1 6 . 請求の範囲第 1項ないし第 1 4項のいずれか 1項に記載の化合物又はその塩と亜鉛イオンとにより形成された亜鈴錯体。

1 7 . 請求の範囲第 1項ないし第 1 4項のいずれか 1項に記載の化合物又はその塩を含む亜鈴ィオンの測定用試薬。

1 8 . 亜鉛イオンの測定方法であって、下記の工程：

(a)請求の範囲第 1項ないし第 1 4項のいずれか 1項に記載の化合物又はその塩と亜鉛ィオンとを反応させる工程；及ぴ

を含む方法。

1 9 . 測定をレシオ法により行う請求の範囲第 1 8項に記載の方法。

2 0 . 亜鉛イオンの測定方法であって、下記の工程：

(a)請求の範囲第 7項又は第 8項に記載の化合物又はその塩を細胞内に取り込ませる工程；

(b)細胞内に取り込まれた該化合物又はその塩の加水分解により生じた請求の範囲第 6項に記載の化合物又はその塩（ただしそのカルボキシル基は保護基を有しない）と亜鉛イオンとの反応により生じた亜鉛錯体の蛍光強度を測定する工程を含む方法。

2 1 . 測定をィメージングにより行う請求の範囲第 2 0項に記載の方法。